KR101853923B1

KR101853923B1 - Smad 단백질을 포함하는 자가 면역 질환 치료용 조성물, Smad 단백질을 포함하는 융합 단백질, 이를 제조하기 위한 벡터, 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR101853923B1
Application number: KR1020160008782A
Authority: KR
Inventors: 이상규; 박성동; 이상원; 문진희
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2016-01-25
Filing date: 2016-01-25
Publication date: 2018-05-02
Also published as: US20190315820A1; US20170210783A1; WO2017131258A1; US20190338001A1; KR20170088644A; US10544196B2; JP2018507840A

Abstract

본 발명은 Smad 단백질을 포함하는 자가 면역 질환 치료용 조성물 및 융합 단백질에 관한 것으로, 이를 이용한 루푸스 신염, 및 류마티스 관절염을 비롯한 자가 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료 방법을 제공한다.

Description

Smad 단백질을 포함하는 자가 면역 질환 치료용 조성물, Smad 단백질을 포함하는 융합 단백질, 이를 제조하기 위한 벡터, 및 이의 제조 방법{A COMPOSITION CONTAINING SMAD PROTEIN FOR TREATMENT OF AUTOIMMUNE DISEASES, A FUSION PROTEIN COMPRISING SMAD PROTEIN, A EXPRESSION VECTOR AND A METHOD FOR PREPARING THE SAME}

본 발명은 Smad 단백질을 포함하는 자가 면역 질환 치료용 조성물 및 융합 단백질에 관한 것으로, 루푸스 신염 및 류마티스 관절염을 비롯한 자가 면역 질환에 대한 예방 및 치료 방법을 제공한다.

인간의 면역계는 인체에 침입한 외부 항원으로부터 신체를 보호하는 역할을 하나, 자기 관용성(self tolerance)으로 인해 자기 조직을 공격하지 않는다. 그러나 면역계의 자기 관용성의 손상으로 인해 면역세포가 자신의 유전자에 의해 정상적으로 발현되는 단백질을 공격대상으로 인식함으로써 항체를 생성하거나 T 세포 반응을 일으켜서 정상조직을 파괴하는 것을 자가 면역이라고 하며, 구체적인 증상을 자가 면역 질환이라고 한다.

1980년대 중반 Mosmann 등은 보조 T 림프구(helper T lymphocyte, Th)를 사이토카인 분비 양상에 따라 Th1 과 Th2 라는 두 세포집단으로 나눌 수 있다고 제안하였다(Mosmann TR, et al., J Immunol., 136:2348-2357, 1986). 이후 Th1 세포는 IFN-γ 를 분비하며 대식세포 등을 활성화하여 세포성 면역반응을 유도하고, Th2 세포는 IL-4, IL-5 등을 분비하며 체액성 면역반응에 관여하는 것으로 알려졌다.

또한, Th1 세포와 Th2 세포의 불균형으로 인해 Th1 으로의 분화가 과도하게 진행되면 염증성 자가면역질환이 유발된다고 알려졌다. 그러나, IFN-γ나 IFN 수용체가 결핍된 생쥐가 류마티스 관절염과 다발성 경화증과 같은 자가면역질환을 일으킨다는 것이 보고되면서 Th1/Th2 패러다임에 대한 의문이 제기되었다(Infante-Duarte C, et al., J Immunol., 165: 6107- 6115, 2000). 또한, IL-12와 IL-23에 관한 연구에서, 자가면역질환을 일으키는데 Th1 세포보다 IL-23 에 의해 유도되는 Th17 세포가 더 중요하다는 것이 밝혀졌다(Murphy KM, et al., Nat Rev Immunol 2(12):933-44, 2002; Cua DJ, et al., 421(6924):744-8, 2003; Langrish CL, et al., J Exp Med 201(2):233-40, 2005).

Th17 세포는 IL-23 에 의해 유도되는 T 세포군이 IL-17 사이토카인을 분비하기 때문에 명명되었으며, Th1 또는 Th2 와는 독립적인 세포라는 것이 밝혀졌다. 최근에는 RORγt라는 Th17세포의 전사인자가 밝혀져서 Th17 세포의 신호전달체계나 전사 과정 등이 규명되었다.

또한, Th17 세포가 Th1, Th2, Treg(regulatory T cell) 세포와는 달리 자가면역질환에서 보이는 염증반응의 최전방에서 관여하여 염증 반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화키는 것으로 알려지고 있다. 이에 따라, Th17 세포 활성의 억제를 표적으로 한 자가면역질환의 치료제 개발이 크게 부각되고 있다.

전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus, SLE)는 외부로부터 인체를 방어하는 면역계의 이상으로 인해 피부, 관절, 신장, 폐, 신경 등 여러 장기에 염증을 일으키는 만성 자가 면역 질환이며, 특히 신장을 침범하여 신장 기능의 저하로 발생되는 전신성 홍반성 루푸스의 심각한 합병증이 루푸스 신염(lupus nephritis, LN)이다.

루푸스 신염의 질병발현에는 많은 면역적, 비면역적 요인들이 기여하지만, 핵(nucleus)과 내인성 항원(endogenous antigen)에 대항하는 병원성 자가항체의 생성과 사구체 면역 침착(glomerular immune deposits)의 형성, 그리고 다단계 보체(complement)의 활성화로 인해 루푸스 신염이 발병된다.

류마티스 관절염(rheumatoid arthritis, RA)은 다발성 관절염을 특징으로 하는 만성 염증성 자가 면역 질환으로 관절 안에 있는 활막(synovium)에 염증이 생기면서 혈액내의 백혈구들이 관절로 집중된다. 그 결과 관절액(jointfluid)이 증가하여 관절이 부으면서 통증이 나타나며, 염증성 활막 조직들이 점차 자라나 뼈와 연골을 파고들어 관절의 모양이 변형되므로, 관절을 움직이는 데 장애가 발생한다.

관절의 진행적인 손상과 심혈관 질환 등의 전신적 합병증을 특징으로 하는 자가 면역 질환인 류마티스 관절염은 환경적, 유전적 요소에 의한 시트룰린화(citrullination)를 통해 면역 관용의 손실을 결과한다. 시트룰린에 대한 반응은 T 세포와 B 세포에서 관찰되고, 이차적으로 림프 조직이나 골수에서 나타나며, 류마티스 관절염의 관절 내 활막염은 다양한 염증세포와 염증물질에 의해서 양의 궤한회로(positive feedback loop)를 형성하므로 지속적인 염증을 유발하고 다양한 전신적인 합병증을 야기할 수 있다.

루푸스 신염과 류마티스 관절염의 치료법은 극적으로 변화하여 새로운 약제들이 지속적으로 개발되고 단일방식과 조합방식이 적용되는 등 다양한 치료 방법이 연구되고 있으나, 이와 같은 지속적인 연구에도 불구하고 루푸스 신염과 및 류마티스 관절염의 완치적 치료는 어려운 실정이다.

따라서 본 발명자들은 면역 체계의 신호 전달에 관여하는 특정의 단백질 군을 이용하여 표적 특이성이 우수하고, 세포 독성이 없어 부작용이 최소화된 자가 면역 질환 치료 방법을 제공하고자 하였다.

본 발명은 전술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 루푸스 신염 또는 류마티스 관절염을 비롯한 자가 면역 질환에 대한 근본적인 치료 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, Smad 단백질 또는 Smad 전사 조절 도메인(Smad transcription modulation domain) 단백질을 유효성분으로 포함하는 자가 면역 질환 예방 또는 치료용 조성물이 제공된다.

일 실시예에 있어서, 상기 Smad 단백질은 Smad1, Smad2, Smad3, Smad4, Smad5, Smad6, Smad7 및 Smad8로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 Smad3 단백질 또는 Smad3 전사 조절 도메인 단백질을 유효성분으로 포함할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 Smad3 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되고, 상기 Smad3 전사 조절 도메인 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 Smad3 단백질은 서열번호 2의 핵산 서열에 의해 암호화되고, 상기 Smad3 전사 조절 도메인 단백질은 서열번호 4의 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 자가 면역 질환은 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 패혈증성 쇼크, 알러지성 천식, 알러지성 비염, 아토피성 피부염, 궤양성 대장염, 누선염, 알츠하이머 질환, 뇌졸중, 동맥경화증, 혈관 재협착, I형 당뇨병, II형 당뇨병, 담마진, 결막염, 건선, 전신성염증반증후군, 다발성근염, 피부근염, 결절성 다발관절염, 혼합결합 조직증, 쉐그렌증후군, 통풍, 파킨슨병, 근위축성측색경화증, 당뇨성망막증, 다발성경화증, 크론병, 만성 갑상선염, 세리아크병, 중증근무력증, 심상성천포창, 바이러스질환, 세균성질환, 방사선에 의한 장해, 동맥경화, 혈관종, 혈관섬유종, 재관류장해 및 심장비대증으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, Smad 단백질 또는 Smad 전사 조절 도메인 단백질, 및 단백질 운반 도메인(protein transduction domain)을 포함하는 자가 면역 질환 예방 또는 치료용 융합 단백질이 제공된다.

일 실시예에 있어서, 상기 융합 단백질은 Smad3 단백질 또는 Smad3 전사 조절 도메인 단백질, 및 단백질 운반 도메인을 포함할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 단백질 운반 도메인은 Hph-1, Sim-2, Tat, VP22, Antp(antennapedia), Pep-1(peptide-1), PTD-5(protein transduction domain-5), 7R, 9R, 11R 및 CTP(cytoplasmic transduction peptide)로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 단백질 운반 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 단백질 운반 도메인은 서열번호 6의 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 7 또는 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열번호 8 또는 서열번호 10의 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 자가 면역 질환 예방 또는 치료용 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 약제학적 유효량의 Smad3-PTD 컨쥬게이트, Smad3(MH1)-PTD 컨쥬게이트, 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 함유하는 자가 면역 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터가 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 융합 단백질을 암호화하는 외인성의 핵산 서열을 과발현하는 재조합 숙주 세포가 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 발현 벡터에 의해 형질 전환된 재조합 숙주 세포가 제공된다.

일 실시예에 있어서, 상기 숙주 세포는 미생물, 동물세포, 식물세포, 동물에서 유래한 배양세포, 또는 식물에서 유래한 배양세포일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 발현 벡터로 숙주 세포를 형질 전환하는 단계; 및 상기 숙주 세포를 배양하여 상기 융합 단백질을 발현시키는 단계;를 포함하는 융합 단백질의 제조 방법이 제공된다.

본 발명은 자가 면역 질환의 발병에 관여하는 신호 경로의 명확한 이해를 바탕으로 효과적으로 루푸스 신염 또는 류마티스 관절염을 비롯한 자가 면역 질환 을 억제 또는 치료하는 방법을 제공하며, 이와 관련한 다양한 질환의 치료, 예방, 진단 또는 그 연구 등에 유용하게 활용될 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 Smad3(MH1) 도메인의 Smad3의 전사 활성화에 있어서의 역할을 확인한 것이다. Smad3가 넉-다운(knock-down) 된 SNU-484 세포에 SBE4(Smad binding element4) 루시퍼레이즈 리포터 플라스미드와 Smad2, Smad2(MH1), Smad2(MH2), Smad3, Smad3(MH1), Smad3(MH2), 및 Smad3(MH1)의 돌연변이형 유전자를 함께 형질 주입하여 루시퍼레이즈 활성을 확인하였다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합 단백질인 tSmad2와 tSmad3의 기능적 차이를 비교한 것이다. (a)는 Smad2의 구조 및 융합 단백질인 Smad2의 파생물을 나타내고, (b)는 융합 단백질들을 정제한 결과이며, (c)는 Smad3가 넉-다운 된 SNU-484 세포에 SBE4 루시퍼레이즈 리포터 플라스미드와 tSmad2, tSmad2(MH1), tSmad3, tSmad3(MH1), 및 tSmad3(MH1)의 돌연변이형 융합 단백질을 처리하여 루시퍼레이즈 활성을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 융합 단백질인 tSmad3(MH1)이 항-CD3/CD28으로 자극된 T 세포 활성화에 의해 발현되는 IL-2의 발현 억제 효과를 나타낸 것이다. (a)는 Smad3의 구조 및 융합 단백질인 Smad3의 파생물을 나타내고, (b)는 융합 단백질들을 정제한 결과이다. (c, d)는 융합 단백질의 농도 및 시간에 따른 Jurkat T 세포 내 전달 결과를 나타낸다. (e)는 융합 단백질의 HeLa 세포 핵 내 전달 결과를 나타낸다. (f)는 융합 단백질이 항-CD3/CD28으로 자극된 T 세포 활성화에 의해 발현되는 IL-2의 발현 억제 결과를 나타낸다. (g, h)는 융합 단백질이 항-CD3/CD28으로 자극된 T 세포 활성화와 그로 인한 신호 전달 경로에는 영향을 미치지 않음을 확인한 것이다. (i, j)는 융합 단백질이 항-CD3/CD28으로 자극된 T 세포 활성화에 의한 NFAT 및 NF-κB의 전사를 억제할 수 있음을 확인한 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합 단백질인 tSmad3(MH1)의 쥐의 비장 세포에서의 세포 독성을 측정한 것이다. (a)는 tSmad3 또는 tSmad3(MH1)을 쥐의 비장 세포에 다양한 농도로 처리하고 1 시간 후, (b)는 48 시간 후의 세포 독성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합 단백질인 tSmad3(MH1)이 항-CD3/CD28으로 자극된 T 세포 활성화에 의해 발현되는 IFN-γ, IL-4, IL-17A, 및 IL-10의 발현에 대한 조절 효과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 융합 단백질인 tSmad3(MH1)의 전사 조절 효과 및 미성숙 T 세포의 각 Th 세포로의 분화 조절 효과를 나타낸 것이다. (a - d)는 HEK293T 세포에 하위에 루시퍼레이즈를 갖는 IFN-γ, IL-4, IL-17A, 및 IL-10 리포터 플라스미드 및 야생형 T-bet, GATA3, RORγt, 및 Foxp3 유전자를 핵 내 주입한 후, tSmad3 또는 tSmad3(MH1) 융합 단백질을 처리하여 루시퍼레이즈 활성을 관찰한 것이다. (e - h) tSmad3 또는 tSmad3(MH1)이 미성숙 T 세포가 각 Th 세포로 분화되는 것을 조절할 수 있는지 IFN-γ, IL-4, IL-17A, 및 IL-10의 발현을 분석한 것이다.
도 7 및 도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 융합 단백질인 tSmad3(MH1)이 비장, 림프절, 흉선, 및 신장 조직에 있는 CD4+ T 세포에 전달되는지 관찰한 것이다. (a)는 tSmad3(MH1)을 C57BL/6 쥐의 복강에 200 μg/mouse의 농도로 주사하고 48 시간 후에 각 조직으로부터 분리한 CD4+ T 세포에 전달된 tSmad3(MH1)을 유세포 분석기를 통해 관찰한 것이다. (b)는 형광현미경을 통해 관찰한 것이다. (c)는 조직학적 측면에서 해마톡실 & 에오신(hematoxylin & eosin) 염색법으로 관찰한 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합 단백질인 tSmad3(MH1)의 루푸스 신염 동물 모델에서의 질환 예방 효과를 나타낸 것이다. (a, b)는 유전자 조작된 루푸스 신염 마우스가 13주 되었을 때부터 30주까지 1주일에 3번씩 각각 Solu-Medrol(7 mg/kg), tSmad3(MH1)-High (200 μg/mouse) 또는 tSmad3(MH1)-Low (50 μg/mouse) 농도로 복강 주사하고 단백뇨와 생존률을 측정하였다. (c)는 30주된 각 그룹의 쥐에서 사구체 신염에 대한 tSmad3(MH1)의 처리 효과를 분석한 것이다. (d)는 사구체 면역 침착의 형성에 대한 tSmad3(MH1)의 처리 효과를 공초점 현미경을 이용하여 분석한 것이다. (e)는 혈청 내의 염증성 사이토카인인 IFN-γ, IL-6, IL-10, 및 IL-17의 발현량을 측정한 것이다. (f)는 각 그룹의 쥐의 비장의 크기를 확인한 결과이다. (g)는 유세포 분석기를 이용하여 각 그룹의 쥐의 비장으로부터 분리한 비장세포에서의 CD4+IFN-γ+, CD4+IL-4+, CD4+IL-17A+, 및 CD4+Foxp3+ 세포의 발현양을 분석한 것이다. (h)는 항-DNA, IgG1, IgG2a, IgG2b, 및 IgG3의 혈청에서의 농도를 분석한 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 융합 단백질인 tSmad3(MH1)의 루푸스 신염 동물 모델에서의 치료 효과를 나타낸 것이다. (a, b)는 유전자 조작된 루푸스 신염 마우스가 23주 되었을 때부터 30주까지 1주일에 3번씩 각각 Solu-Medrol(7 mg/kg), tSmad3(MH1)-High(200 μg/mouse) 또는 tSmad3(MH1)-Low(50 μg/mouse) 농도로 복강 주사하고 단백뇨와 생존률을 측정하였다. (c)는 30주된 각 그룹의 쥐에서 사구체 신염에 대한 tSmad3(MH1)의 처리 효과를 분석한 것이다. (d)는 사구체 면역 침착의 형성에 대한 tSmad3(MH1)의 처리 효과를 공초점 현미경을 이용하여 분석한 것이다. (e)는 혈청 내의 염증성 사이토카인인 IFN-γ, IL-6, IL-10, 및 IL-17의 발현량을 측정한 것이다. (f)는 각 그룹의 쥐의 비장의 크기를 확인한 결과이며, (g)는 유세포 분석기를 이용하여 각 그룹의 쥐의 비장으로부터 분리한 비장세포에서의 CD4+IFN-γ+, CD4+IL-4+, CD4+IL-17A+, 및 CD4+Foxp3+ 세포의 발현량을 분석한 것이다. (h)는 항-DNA, IgG1, IgG2a, IgG2b, 및 IgG3의 혈청에서의 농도를 분석한 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 융합 단백질인 tSmad3(MH1)의 류마티스 관절염 동물 모델에서의 질환 예방 효과를 나타낸 것이다. (a)는 collagen을 주사하여 류마티스 관절염을 유발시킨 후 0주부터 7주까지 1주일에 3번씩 각각 MTX(35 mg/kg), tSmad3(MH1)(200 μg/mouse) 또는 돌연변이형 tSmad3(MH1)(200 μg/mouse) 농도로 복강 주사하고 arthritis score가 호전되는 치료효과를 나타낸 결과이다. (b)는 8주된 각 그룹의 쥐의 발두께 붓기 정도에 대한 tSmad3(MH1)의 처리 효과를 확인한 결과이다. (c)는 각 그룹의 쥐의 비장으로부터 분리한 비장세포의 세포수와 염증성 사이토카인인 IFN-γ 및 IL-17A의 발현량을 분석한 결과이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합 단백질인 tSmad3(MH1)의 류마티스 관절염 동물 모델에서의 치료 효과를 분석한 것이다. (a)는 collagen을 주사하여 류마티스 관절염을 유발시킨 후 4주부터 8주까지 1주일에 3번씩 각각 MTX(35 mg/kg), tSmad3(MH1)(200 μg/mouse) 또는 tSmad3(MH1)(50 μg/mouse) 농도로 복강 주사하고 arthritis score가 호전되는 치료 효과를 나타낸 것이다. (b)는 8주된 각 그룹의 쥐의 무릎 관절에서의 염증 세포 침윤, 활막 세포 증식, 및 뼈 침식에 대한 tSmad3(MH1)의 처리 효과를 조직병리학적 방법을 이용하여 분석한 것이다. (c)는 쥐의 무릎 관절에서 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6의 발현양을 면역조직화학적 방법을 이용하여 분석한 것이다. (d)는 혈청 내의 염증성 사이토카인인 IFN-γ, IL-6, IL-10, 및 IL-17의 발현을 측정한 것이다. (e)는 각 그룹의 쥐의 비장의 크기를 확인한 것이다. (f)는 유세포 분석기를 이용하여 각 그룹의 쥐의 비장으로부터 분리한 비장세포에서의 CD4+IFN-γ+, CD4+IL-4+, CD4+IL-17A+, 및 CD4+Foxp3+ 세포의 발현양을 분석한 것이다.
도 13은 tSmad3(MH1)을 쥐의 피부 조직에 국소 투여하여 침투되는지 분석한 것이다. 쥐의 피부에 국소적으로 30 분간 tSmad3(MH1)을 처리한 후 6 시간, 12 시간, 24 시간, 및 48 시간이 경과한 후에 공초점 현미경을 이용하여 관찰한 것이다.

이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.

달리 정의되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 공학, 및 DNA 서열 분석 및 당업자의 능력 범위 안에서 재조합 DNA 분야에서 흔히 사용되는 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술들은 당업자에게 알려져 있고, 많은 표준화된 교재 및 참고저서에 기술되어 있다.

본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다.

본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용가능하다. 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법학, 프로토콜 및 시약으로 본 발명이 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수형은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면 복수의 대상을 포함한다. 또한, 달리 지시된 바가 없으면, 핵산은 각각 왼쪽에서 오른쪽, 5'에서 3' 방향으로 씌여지고, 아미노산 서열은 왼쪽에서 오른쪽, 아미노에서 카르복실 방향으로 씌여진다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 일 측면은 Smad 단백질 또는 Smad 전사 조절 도메인(Smad transcription modulation domain) 단백질을 유효성분으로 포함하는 자가 면역 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 자가 면역 질환은 개체 자신의 조직에 대해 일어나고 지정된 비-악성 질환 또는 장애이다.

모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중의 하나는 자기(self)를 구성하고 있는 항원물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 비자기(non-self) 항원들에 대해서는 이를 인식하고 반응하여 제거할 수 있다. 자기항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라고 한다. 그러나 자기관용을 유도 또는 유지함에 있어서 이상이 생기면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 그 결과 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하는데 상기 과정에 의해 발생되는 질환을 자가 면역 질환이라고 한다.

상기 자기 면역 질환은 자신의 장기조직이나 그 성분에 대해 항체가 생산되는 염증성 질환으로서, 다수의 조직과 장기에 만성적인 전신적 염증을 일으키는 질병을 총칭할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 자가 면역 질환은 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 패혈증성 쇼크, 알러지성 천식, 알러지성 비염, 아토피성 피부염, 궤양성 대장염, 누선염, 알츠하이머 질환, 뇌졸중, 동맥경화증, 혈관 재협착, I형 당뇨병, II형 당뇨병, 담마진, 결막염, 건선, 전신성염증반증후군, 다발성근염, 피부근염, 결절성 다발관절염, 혼합결합 조직증, 쉐그렌증후군, 통풍, 파킨슨병, 근위축성측색경화증, 당뇨성망막증, 다발성경화증, 크론병, 만성 갑상선염, 세리아크병, 중증근무력증, 심상성천포창, 바이러스질환, 세균성질환, 방사선에 의한 장해, 동맥경화, 혈관종, 혈관섬유종, 재관류장해 및 심장비대증으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있으나, 상기 자가 면역 질환의 질병적 특성 또는 발병 기작을 공유하는 경우라면 특별히 제한되지 않는다.

상기 “예방”은 동물의 병리학적 세포의 발생 또는 세포의 손상, 소실의 정도의 감소를 의미한다. 예방은 완전할 수 있으며 또는 부분적일 수도 있다. 이 경우에는 개체 내의 병리학적 세포의 발생 또는 비정상적인 면역 작용 등이 상기 자가 면역 질환의 예방 및 치료용 조성물을 사용 하지 않은 경우와 비교하여 감소하는 현상을 의미할 수 있다.

또한, 상기 “치료”는 치료하고자 하는 대상 또는 세포의 천연 과정을 변경시키기 위하여 임상적으로 개입하는 모든 행위를 의미하며, 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위하여 수행할 수 있다. 목적하는 치료 효과는 질병의 발생 또는 재발을 예방하거나, 증상을 완화시키거나, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키거나, 전이를 예방하거나, 질병 진행 속도를 감소시키거나, 질병 상태를 경감 또는 일시적 완화시키거나, 예후를 개선시키는 것을 포함할 수 있다. 즉, 상기 치료는 상기 조성물에 의해 자가 면역 질환의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 포괄하는 것으로 해석될 수 있다.

상기 Sma 및 Mad 관련 단백질(Smad)은 특정 유전자의 활성은 물론 세포 성장 및 증식을 조절하는 진화적으로 보존된 세포 내 매개인자의 패밀리이다. Smad는 전환 성장 인자 베타(TGF-β) 시그널링 경로의 일부로서 이들의 기능을 수행하며, 이러한 경로는 세포 외부로부터 핵으로 시그널을 전달할 수 있다.

TGF-β(transforming growth factor-β) superfamily는 세포의 증식, 분화, 세포사멸, 이동, 그리고 발생과 같은 다양한 생리적 과정을 조절하는 사이토카인(cytokine)이다. TGF-β superfamily에는 TGF-βs, actins, nodals, 그리고 BMPs(bone morphometric proteins)를 포함하여 다양한 기능을 가진 사이토카인들이 포함된다. TGF-β family에는 TGF-β1, TGF-β2, 그리고 TGF-β3 세 종류의 isoform이 있다. TGF-β1은 TGF-β2 그리고 TGF-β3와는 달리 주로 면역체계에서 발현될 수 있다.

TGF-β1에 의한 시그널링은 타입 I 및 II 수용체-매개된 인산화에 의해 개시될 수 있다. 활성화된 TGF-β1 수용체 I은 Smad2 및 Smad3(R-Smad)를 이들의 C 말단에서 인산화시키며, 이는 억제성 Smad 6 및 Smad7(I-Smad)에 의해 길항될 수 있다.

인산화 후, R-Smad는 Smad4(Co-Smad)와 복합체를 형성하여 핵으로 전위되고, 세포 외 유전자 전사를 활성화시킬 수 있다. 또한, R-Smad는 MAPK에 의해 N-말단 MH1과 C-말단 MH2 도메인을 연결시키는 링커 영역에서 인산화될 수 있다. BMP는 특이적 세포내 시그널링 연쇄반응을 이용하여 R-SmadS(Smad1,5,8), Co-Smad(Smad4) 및 I-SmadS(Smad6,7)을 통해 유전자를 표적화시킬 수 있다.

Smad7는 TGF-β 시그널링의 공지된 세포간 길항제이며, 이는 TGF-β-유도된 전사 반응을 억제하며, 반면 Smad6은 TGF-β 및 BMP(골 형성 단백질, TGF-β 슈퍼 패밀리의 일원)의 공지된 억제제이다.

즉, 상기 Smad 단백질은 전환 성장 인자 베타(TGF-β) 시그널링 경로의 일부로서, 상기 시그널링 경로를 제어함으로써 Th 세포의 불균형에 따른 염증반응을 억제할 수 있다.

특히, 본 발명자들은 Smad3 또는 Smad3 전사 조절 도메인과 단백질 운반 도메인을 포함하는 신규 융합 단백질이 염증 세포인 Th1, Th2, 및 Th17 세포의 기능을 제어하여 분화를 억제하고, 상기 염증 세포를 조절하는 조절 T 세포(Treg)의 기능을 유도하여 분화를 촉진시킴으로써 루푸스 신염 또는 류마티스 관절염을 비롯한 자가 면역 질환에 대한 예방 및 치료 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.

또한, 상기 조성물은 Smad3 단백질 또는 Smad3 전사 조절 도메인 단백질을 유효성분으로 포함할 수 있다. 상기 전사 조절 도메인은 Smad3의 전사 활성화에 있어서 중요한 도메인(Smad transcription modulation domain, MH1)으로서 DNA 결합 부위를 포함할 수 있다. 즉, 상기 Smad 단백질은 전체의 온전한 단백질이 아닌, 상기 전사 조절 도메인만으로 타겟 유전자의 프로모터에 결합할 수 있으며 동일한 전사 조절 기능을 수행할 수 있다(도 1 및 도 2).

일 실시예에 있어서, 상기 Smad3 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되고, 상기 Smad3 전사 조절 도메인 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성될 수 있다. 또한, 상기 Smad3 단백질은 서열번호 2의 핵산 서열에 의해 암호화되고, 상기 Smad3 전사 조절 도메인 단백질은 서열번호 4의 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다.

즉, 상기 융합 단백질은 단백질 운반 도메인을 포함하므로, Smad 단백질 또는 Smad 전사 조절 도메인 단백질을 핵 내로 용이하게 전달시킬 수 있으며, 전사 조절 효과가 현저하게 개선될 수 있다.

상기 단백질 운반 도메인(protein transduction domain, PTD)은 소수성이 강한 짧은 펩타이드로 함께 융합된 단백질이나 DNA 및 RNA 등의 생리활성분자를 세포 내로 효과적으로 전달할 수 있으며, 다양한 종류의 단백질 운반 도메인이 당해 기술 분야에 알려져 있다. 상기 단백질 운반 도메인은 세포질뿐만 아니라 핵 안으로도 생리활성분자를 운반할 수 있기 때문에, 상기 Smad 단백질을 핵 내로 효과적으로 전달할 수 있다.

즉, 세포막은 세포 내로의 대분자의 유입을 차단할 수 있으며, 종래 대다수의 치료법에 있어서 적어도 하나의 세포 막의 통과가 필수적으로 요구되었다. 고전적인 소분자(small molecule) 약제는 단백질 기능을 조절하는 능력을 갖는 막 투과성 분자의 우연한 발견에 기반한다. 즉, 소분자는 우세한 치료학적 패러다임으로 유지되고 있음에도 불구하고, 합리적인 약물 설계가 곤란하므로 타겟에 대한 특이성이 미흡하거나, 부작용 및 독성을 유발할 수 있다.

반면, 소분자 보다 기능적 특성이 현저하게 우수한 단백질 등의 대분자는 분자, 세포 및 구조 데이터를 기반으로 하는 합리적 약물 설계에 의하여 제조될 수 있음에도 불구하고, 세포막에 대한 투과성이 낮은 단점이 있다.

따라서, 상기 단백질 의약품은 상기 단백질 운반 도메인과 결합되어 세포막을 투과할 수 있으며, 세포 내로 이펙터 분자를 수송할 수 있는 단백질 운반 도메인은 카고 분자의 세포 흡수를 촉진함에 따라 약물의 설계에서 활용도가 더욱 증가하고 있다.

상기 단백질 운반 도메인은 서열에 따라 양친매성(극성 및 비극성 말단 둘 모두를 갖는 것을 의미) 또는 양이온성(순수 양으로 하전된 원자를 함유하거나 이와 관련된 것을 의미)으로 거대분자에 대한 비-침윤성 전달을 가능하게 하며, "트로얀(Trojan) 펩티드", "막 전위 서열" 또는 "세포 투과성 단백질(CPP)"로 지칭될 수도 있다. 상기 단백질 운반 도메인은 상기 Samd 단백질 또는 Smad 전사 조절 도메인 단백질이 세포막을 투과하여 전달될 수 있도록 하는 바, NFAT, NF-κB, IFN-γ, IL-4 및 IL-17A의 전사 억제, 염증성 사이토카인의 분비 억제 및 염증 세포의 분화 억제 효과가 충분하게 구현될 수 있다.

상기 단백질 운반 도메인은 HIV-1의 TAT 단백질을 세포배양 배지에 첨가하면 상기 단백질이 세포 내로 도입되는 것이 발견되어 최초로 알려졌으며(Green et al., 1988, Frankel et al., 1988), 이후 세포막을 투과하여 세포 내로 도입하는 능력을 가진 초파리의 안테나피디아 호메오 전사인자(Drosophila Antennapedia(Antp) homeotic transcription factor, Joliot et al., 1991) 및 허피스 심플렉스 바이러스-1 DNA 결합단백질 VP22(herpessimplex-virus-1 DNA-binding protein VP22, Elliot et al., 1997)도 밝혀진 바 있다. 지금까지 알려진 다수의 단백질 운반 도메인은 양이온을 띄고 있으며, 음이온인 DNA와 상호작용하여 세포 내 이입을 촉진하고 DNA를 세포 내로 전달하여 유전자의 전달 효율을 증가시키는 것으로 알려진 바 있으나(Gratton J.P., Nature Medicine. 9(3), 357-362, 2003), 이외에도 개량된 형태의 다양한 단백질 운반 도메인이 개발되고 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 단백질 운반 도메인은 Hph-1, Sim-2, Tat, VP22, Antp(antennapedia), Pep-1(peptide-1), PTD-5(protein transduction domain-5), 7R, 9R, 11R 및 CTP(cytoplasmic transduction peptide)로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있으나, 종래에 널리 알려졌거나 특정 분자의 세포막 내 투과를 촉진할 수 있는 한 그 종류가 특별히 제한되지 않는다.

일 실시예에 있어서, 상기 단백질 운반 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성될 수 있으며, 서열번호 6의 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다.

또한, 상기 융합 단백질은 서열번호 7 또는 서열번호 9의 아미노산 서열로 구성될 수 있으며, 서열번호 8 또는 서열번호 10의 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다.

즉, 상기 융합 단백질은 상기 단백질 운반 도메인과 결합되어 있으므로 세포막에 대한 투과 효과가 우수하며, 핵 내로 용이하게 도입될 수 있으므로 다른 전사인자와의 상호작용을 통해 다양한 유전자의 발현을 효과적으로 조절할 수 있다.

특히, 상기 융합 단백질은 Smad 단백질 또는 그의 전사 조절 도메인을 포함하므로, NFAT, NF-κB, IFN-γ, IL-4 및 IL-17A의 전사 또는 활성을 억제할 수 있으며 염증 세포인 Th1, Th2, 및 Th17 세포의 기능을 제어하여 분화를 억제하고, 상기 염증 세포를 조절하는 Treg 세포의 기능을 유도하여 분화를 촉진시킴으로써 루푸스 신염 또는 류마티스 관절염을 비롯한 자가 면역 질환에 대한 예방 및 치료 효과를 보유할 수 있다.

상기 자가 면역 질환 치료용 약제학적 조성물은 경구적 전달, 비경구적 전달의 형태로 투여될 수 있다. 즉, 상기 자가 면역 질환 치료용 약학 조성물은 전신 또는 국소 투여할 수 있으며, 상기 투여는 경구 투여 및 비경구 투여를 포함할 수 있다.

상기 자가 면역 질환 치료용 약학 조성물은 적절한 투여 형태를 제공하도록 적합한 양의 약학적으로 허용되는 비히클 또는 담체와 함께 제형화될 수 있다. 따라서, 상기 자가 면역 질환 치료용 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화 하여 사용할 수 있다.

상기 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 Smad3-PTD 컨쥬게이트 또는 Smad3(MH1)-PTD 컨쥬게이트와 적어도 하나 이상의 부형제, 예컨대, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 또는 젤라틴 등을 혼합하여 조제할 수 있다. 또한, 상기 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제가 사용될 수 있다.

상기 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 사용될 수 있으며, 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

상기 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 사용될 수 있다. 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르가 사용될 수 있다. 상기 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴이 사용될 수 있다.

상기 벡터는 연결되어 있는 핵산 단편을 운반하는 데 이용되는 핵산 분자를 의미한다. 상기 벡터는 박테리아, 플라스미드, 파지, 코스미드, 에피솜, 바이러스 및 삽입가능한 DNA 단편(즉, 상동재조합에 의해 숙주 세포 게놈 안으로 삽입 가능한 단편)이 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 플라스미드는 벡터의 일종으로서 내부에 추가적으로 DNA 단편을 연결시킬 수 있는 환형의 이중 가닥 DNA 루프를 의미한다. 또한, 바이러스 벡터는 추가적인 DNA를 바이러스 게놈 안에 연결시킬 수 있다.

상기 발현 벡터는 작동 가능하도록 연결된 목적 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터를 의미한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술의 사용에서 발현 벡터는 플라스미드 형태이므로, 용어 플라스미드 및 벡터가 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 바이러스 벡터와 같이 동일한 기능을 수행하는 다른 형태의 발현 벡터들도 포함할 수 있다.

예컨대, 상기 발현 벡터는 pET-3a-d, pET-9a-d, pET-11a-d, pET-12a-c, pET-14b, pET-15b, pET-16b, pET-17b, pET-17xb, pET-19b, pET-20b(+), pET-21a-d(+), pET-22b(+), pET-23a-d(+), pET-24a-d(+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET-28a-c(+), pET-29a-c(+), pET-30a-c(+), pET-30 Ek/LIC, pET-30 Xa/LIC, pET-31b(+), pET-32a-c(+), pET-32 Ek/LIC, pET-32 Xa/LIC, pET-33b(+), pET-34b(+), pET-35b(+), pET-36b(+), pET-37b(+), pET-38b(+), pET-39b(+), pET-40b(+), pET-41a-c(+), pET-41 Ek/LIC, pET-42a-c(+), pET-43.1a-c(+), pET-43.1 Ek/LIC, pET-44a-c(+), pRSETA, pRSETB, pRSETC, pESC-HIS, pESC-LEU, pESC-TRP, pESC-URA, Gateway pYES-DEST52, pAO815, pGAPZ A, pGAPZ B, pGAPZ C, pGAPα A, pGAPα B, pGAPα C, pPIC3.5K, pPIC6 A, pPIC6 B, pPIC6 C, pPIC6α A, pPIC6α B, pPIC6α C, pPIC9K, pYC2/CT, pYD1 Yeast Display Vector, pYES2, pYES2/CT, pYES2/NT A, pYES2/NT B, pYES2/NT C, pYES2/CT, pYES2.1, pYES-DEST52, pTEF1/Zeo, pFLD1, PichiaPink^TM , p427-TEF, p417-CYC, pGAL-MF, p427-TEF, p417-CYC, PTEF-MF, pBY011, pSGP47, pSGP46, pSGP36, pSGP40, ZM552, pAG303GAL-ccdB, pAG414GAL-ccdB, pAS404, pBridge, pGAD-GH, pGAD T7, pGBK T7, pHIS-2, pOBD2, pRS408, pRS410, pRS418, pRS420, pRS428, yeast micron A form, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pYJ403, pYJ404, pYJ405 또는 pYJ406일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 상기 발현 벡터는 숙주 세포 내로 도입되고, 상기 도입된 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포는 상기 융합 단백질을 생산할 수 있다. 이 때, 상기 벡터는 숙주 생물체에 의해 인지되는 프로모터를 포함할 수 있다.

상기 프로모터는 SBE4, 3TP, PAI-1, p15, p21, CAGA12, hINS, A3, NFAT, NFKB, AP1, IFNG, IL4, IL17A, IL10, GPD, TEF, ADH, CYC, INU1, PGK1, PHO5, TRP1, GAL1, GAL10, GUT2, tac, T7, T5, nmt, fbp1, AOX1, AOX2, MOX1 및 FMD1 프로모터로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 숙주 세포 또는 발현 조건 등 다양한 변수를 고려하여 달리할 수 있다.

상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 상기 프로모터 서열과 작동 가능하게 연결될(operably linked) 수 있다. 상기 "작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 의미한다. 즉, 상기 융합 단백질을 암호화하는 유전자는 벡터 내에 있는 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 발현이 조절될 수 있다.

한편, 상기 발현 벡터는 추가적인 조절 서열을 더 포함할 수 있다. 상기 조절 서열은 파지 MS-2의 레플리카아제 유전자의 샤인-달가노 서열 및 박테리오파지 람다의 cⅡ의 샤인-달가노 서열일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 발현 벡터는 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는데 필요한 적절한 마커 유전자를 포함할 수 있다. 상기 마커 유전자는 항생제 저항성 유전자 또는 형광 단백질 유전자일 수 있으며, 상기 항생제 저항성 유전자는 히그로마이신 저항성 유전자, 카나마이신 저항성 유전자, 클로람페니콜 저항성 유전자 및 테트라사이클린 저항성 유전자로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 형광 단백질 유전자는 효모-강화 녹색 형광 단백질(yeast-enhanced green fluorescent protein; yEGFP) 유전자, 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein; GFP) 유전자, 청색 형광 단백질(blue fluorescent protein; BFP) 유전자, 및 적색 형광 단백질(red fluorescent protein; RFP) 유전자로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 융합 단백질을 암호화하는 외인성의 핵산 서열을 과발현하는 재조합 숙주 세포가 제공되고, 상기 발현 벡터에 의해 형질 전환된 재조합 숙주 세포가 제공된다.

상기 숙주 세포(host cell)는 형질 전환에 의해 대사 조작될 수 있다. 상기 숙주 세포는 발현 벡터에 의한 형질 전환이 용이한 세포를 지칭하는 것으로 유전 공학적 방법에 의해 형질 전환되어 특정의 유전자를 효율적으로 발현할 수 있으면 그 종류는 특별히 제한되지 않는다.

일 실시예에 있어서, 상기 숙주 세포는 미생물, 동물세포, 식물세포, 동물에서 유래한 배양세포, 또는 식물에서 유래한 배양세포일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 적합한 숙주 세포는 자연적으로 발생하거나 또는 야생형 숙주 세포일 수 있고, 또는 변화된 숙주 세포일 수 있다. 상기 야생형 숙주 세포(wide-type host cell)는 재조합 방법에 의해 유전적으로 변화되지 않은 숙주 세포일 수 있다.

상기 “대사 조작된(metabolically engineered)" 또는 "대사 조작(metabolic engineering)"은 미생물에서 알코올 또는 단백질과 같은 원하는 대사산물의 생산을 위하여, 생합성 유전자, 오페론과 연관된 유전자, 그리고 이들 핵산 서열의 제어 요소(control elements)의 합리적 경로 디자인과 어셈블리를 수반할 수 있다.

상기 "대사 조작된"은 유전자 조작과 적절한 배양 조건을 이용한 전사(transcription), 번역(translation), 단백질 안정성(protein stability)과 단백질 기능성(protein functionality)의 조절과 최적화에 의한 대사 흐름(metabolic flux)의 최적화를 더욱 포함할 수 있다. 생합성 유전자는 숙주에 외래성이거나, 돌연변이유발(mutagenesis), 재조합(recombination) 또는 내인성 숙주 세포에서 이종 발현 제어 서열과의 연관에 의해 변형됨으로써, 숙주(예컨대, 미생물)에 이종성일 수 있다. 적절한 배양 조건은 배양 배지 pH, 이온 강도, 영양 함량 등의 조건, 온도, 산소, 이산화탄소, 질소 함량, 습도, 및 상기 미생물의 물질대사 작용에 의한 화합물의 생산을 가능하게 하는 기타 배양 조건을 포함할 수 있다. 숙주 세포로서 기능할 수 있는 미생물에 적합한 배양 조건은 당해 기술 분야에 널리 알려져 있다.

따라서, 상기 "대사 조작된(engineered)" 또는 "변형된(modified)" 숙주 세포는 유전 물질을 선택된 숙주 또는 부모 미생물 내로 도입하여 세포 생리와 생화학을 변형하거나 변경함으로써 생산될 수 있다. 유전 물질의 도입을 통하여, 부모 미생물은 새로운 성질, 예를 들면, 새로운 세포 내 대사산물 또는 더욱 많은 양의 세포 내 대사산물을 생산하는 능력을 획득할 수 있다.

예컨대, 유전 물질의 부모 미생물 내로의 도입은 화학 물질을 생산하는 새롭거나 변형된 능력을 초래할 수 있다. 부모 미생물에 도입된 유전 물질은 화학 물질 생산을 위한 생합성 경로에 관여하는 하나 이상의 효소를 코딩하는 유전자 또는 유전자의 일부를 포함하고, 이들 유전자의 발현 또는 발현 조절을 위한 추가 구성요소, 예를 들면, 프로모터 서열을 포함할 수도 있다.

상기 "변화된 숙주 세포(altered host cell)"는 유전적으로 설계된 숙주 세포를 의미하며, 여기서 목적 단백질은 발현의 수준으로 생성되거나 발현의 수준보다 더 큰 수준으로 생성되거나 본질적으로 동일한 성장 조건 하에서 성장하는 미변화된 또는 야생형 숙주 세포내에서의 목적 단백질의 발현의 수준보다 큰 발현의 수준으로 발현될 수 있다. "변형 숙주 세포(modified host cell)"은 목적 단백질을 암호화하는 유전자를 과발현하도록 유전적으로 설계되는 야생형 또는 변화된 숙주 세포를 의미한다. 상기 변형 숙주 세포는 야생형 또는 변화된 모 숙주 세포보다 더 높은 수준으로 목적 단백질을 발현할 수 있다.

한편, 상기 “형질 전환”은 상기 벡터를 미생물 내로 운반하는 방법을 의미하며, 형질 전환 하고자 하는 세포가 원핵세포인 경우에는, CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110- 2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다.

형질 전환 하고자 하는 세포가 진핵세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell. Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990))등을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

효모와 같은 진균의 형질 전환의 경우에는, 일반적으로 리튬 아세테이트(Lithium acetate, R.D. Gietz, Yeast 11, 355360(1995)) 및 열 충격(Keisuke Matsuura, Journal of Bioscience and Bioengineering, Vol. 100, 5;538-544(2005))을 이용한 형질 전환법과 전기천공법(Nina SkoluckaAsian, Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 94-98(2011))에 의해 실시될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 형질 전환된 숙주 세포는 배치, 공급-배치 또는 연속 발효 조건 하에서 배양될 수 있으며, 상기 숙주 세포는 형질 전환에 의해 상기 융합 단백질을 발현할 수 있으므로 상기 배양된 숙주 세포로부터 상기 융합 단백질을 수득할 수 있다.

이 때, 고전적인 배치 발효 방법은 폐쇄적인 시스템을 사용할 수 있고, 상기 배양 매질은 발효가 실행되기 전에 제조되며, 상기 매질에 유기체를 접종하고, 상기 매질에 어떠한 성분의 첨가도 없이 발효가 일어날 수 있다. 특정한 경우에서, 성장 매질의 상기 탄소원 내용물이 아닌, 상기 pH 및 산소 함량은 배치 방법 동안 변화될 수 있다. 배치 시스템의 상기 대사물 및 세포 바이오매스는 끊임없이 발효가 정지될 때까지 변화할 수 있다. 배치 시스템에서, 세포는 정지된 지체 상에서 고도성장 로그 상에 걸쳐 진척하고, 성장율이 감소되거나 멈춘 최종적으로 정지 상에 이를 수 있다. 일반적인 기간에서, 로그 상의 상기 세포는 대부분의 단백질을 만들 수 있다.

표준 배치 시스템의 변형은 "공급-배치 발효" 시스템이다. 상기 시스템에서, 영양(예를 들면, 탄소원, 질소원, O₂, 및 통상적으로, 다른 영양)은 이들의 배양물의 농도가 한계치 미만으로 떨어질 때 첨가될 수 있다. 공급-배치 시스템은 이화 생성물 억제가 세포의 대사를 억제하고, 매질이 매질 내에서 영양소를 제한된 양으로 갖는 것이 바람직할 때 유용할 수 있다, 공급-배치 시스템에서의 실제 영양 농도의 측정은 pH, 용존 산소 및 CO₂와 같은 폐기가스의 부분압과 같은 측정 가능한 인자의 변화에 기초하여 예측될 수 있다. 배치 및 공급-배치 발효는 일반적인 시스템으로서 당업계에 널리 알려져 있다.

계속적 발효는 정의된 배양 매질이 계속해서 생반응기(bioreactor)에 첨가되고, 조건화된 매질의 동일한 양이 과정 동안 동시에 제거되는 개방 시스템이다. 계속적 발효는 일반적으로 세포가 처음에는 로그 상 성장에 있는 일정한 고 밀도의 배양물을 유지할 수 있다. 계속적 발효는 세포 성장 또는 마지막 생성물 농도에 영향을 미치는 하나의 인자 또는 임의의 수의 인자의 조작이 가능할 수 있다.

예를 들어, 탄소원 또는 질소원과 같은 제한 영양소는 고정된 속도로, 모든 다른 파라미터는 적당하게 유지될 수 있다. 다른 시스템에서, 많은 성장에 영향을 주는 인자는 배지 탁도에 의해 측정되는 세포 농도가 일정하게 유지되는 동안, 계속해서 변화할 수 있다. 계속적 시스템은 일정한 상태의 성장 조건을 유지하려고 한다. 따라서, 매질이 빠져나가는 것에 의한 세포 손실은 발효에서의 세포 성장 속도에 대항하여 균형이 맞을 수 있다. 생성물 형성의 속도를 최대화하는 기술뿐만 아니라, 계속적 발효 과정 동안 영양소 및 성장인자를 유지하는 방법은 당업계에 알려져 있다.

본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 본 발명의 기재내용에 기초하여 각 구성의 종류, 도입 비율 등을 변화시켜 적용할 수 있을 것이며, 상기 변형에도 불구하고 동등한 기술적 효과가 구현되는 경우라면, 본 발명의 기술적 사상에 포괄된다고 할 것이다.

이하 실시예를 통해, 본 발명을 더욱 상술하나 하기 실시예에 의해 본 발명이 제한되지 아니함은 자명하다.

실험예 1 : Smad3(MH1) 도메인의 전사 활성 역할 확인

Smad3(MH1) 도메인이 Smad3의 전사 활성화에 있어서 중요한 역할을 수행하는지 확인하기 위해, Smad3가 넉다운(knock-down) 된 SNU-484 세포에 SBE4(Smad binding element4) 루시퍼레이즈 리포터 플라스미드와 Smad2, Smad2(MH1), Smad2(MH2), Smad3, Smad3(MH1), Smad3(MH2), 및 Smad3(MH1)의 돌연변이형 유전자를 함께 형질 주입하여 루시퍼레이즈 활성을 확인하였다.

또한, SNU-484 세포에 SBE4 루시퍼레이즈 리포터 플라스미드와 재조합 융합 단백질인 tSmad2, tSmad2(MH1), tSmad3, tSmad3(MH1), 및 돌연변이형 tSmad3(MH1)을 처리하여 루시퍼레이즈 활성을 확인하였다.

그 결과, Smad2는 Smad2(MH1) 도메인 안에 30개의 아미노산이 DNA 결합 β-머리핀(DNA-binding β-hairpin) 바로 앞에 위치하여 Smad2가 목적하는 유전자에 결합하지 못하게 방해하는 구조를 가지므로 SBE4 루시퍼레이즈의 활성에는 영향을 끼치지 못하는 반면, Smad3(MH1) 도메인은 Smad3의 전사 활성 기능을 충분히 수행하였다(도 1 및 도 2).

실험예 2 : Smad의 전사 조절 도메인과 단백질 운반 도메인을 포함하는 재조합 융합 단백질의 제조

단백질 운반 도메인(PTD)인 Hph-1(서열번호 6)을 Smad3(서열번호 2)의 전사 조절 도메인인 Smad3(MH1)(서열번호 4)과 pET-28a(+) 벡터(Novagen)에 클로닝하여 재조합 융합 DNA인 tSmad3(서열번호 8) 및 tSmad3(MH1)(서열번호 10)을 제작하였다. 상기 재조합 융합 DNA를 BL21 CodonPlus(DE3)-RIPL 대장균 균주(Invitogen)에 형질전환 시켰다. 상기 형질전환 균주를 배양한 후 1 mM IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, Duchefa)를 넣고 37 ℃에서 5시간 동안 단백질의 발현을 유도하였다. 그 후, 세포를 분리하여 분해용 완충액(10 mM 이미다졸, 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl 및 pH 8.0)에 용해시킨 후 분쇄기로 세포를 분해하였다. 융합 단백질은 단백질 앞 부분에 인위적으로 결합시켜 놓은 6개의 히스티딘(Histidine)을 이용하여 Ni-NTA 비드(Qiagen)와 결합시켰다.

컬럼(HisTrap chromatography columns, Bio-Rad)에 단백질을 투입하고 세척용 완충액(30 mM 이미다졸, 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl 및 pH 8.0)으로 충분히 세척하였으며, 용출용 완충액(250 mM 이미다졸, 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl 및pH 8.0)으로 단백질을 분리하였다.

PD-10 Sephadex G-25(GE Healthcare)를 이용하여 완충액을 10% 글리세롤 PBS로 치환하여 이미다졸과 NaCl을 제거하였다. SP 비드(SP SepharoseTM Fast Flow, GE Healthcare)를 이용하여 수득된 단백질에 존재하는 LPS와 같은 엔도톡신을 제거하였다.

이를 다시 결합용 완충액(50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, pH 6.0)으로 결합시킨 후 컬럼에 넣고 용출용 완충액(50 mM NaH2PO4, 2 M NaCl, pH 6.0)으로 단백질을 분리하였다. 마지막으로 PD-10 Sephadex G-25를 통하여 NaCl을 제거하고 완충액을 10% 글리세롤 PBS로 치환한 후 최종적으로 수득된 단백질(서열목록 제5서열, 재조합 융합 단백질)은 실험 전까지 -80℃에서 보관하였다(도 2, 도 3a 및 도 3b).

실험예 3 : tSmad3 및 tSmad3(MH1) 재조합 융합 단백질의 세포 내 전달 확인

3-1. 웨스턴 블롯을 이용하여 세포 내 전달 확인

Jurkat T 세포를 이용하여 실험예 2의 tSmad3 및 tSmad3(MH1)을 농도별(0, 0.1, 0.5, 1, 2 및 5 μM) 또는 시간별(0, 1, 2, 4, 6, 12, 24 및 48 h)로 재조합 융합 단백질과 함께 배양하고 웨스턴 블롯으로 단백질 전달 여부를 확인하였다.

그 결과, tSmad3 및 tSmad3(MH1) 재조합 융합 단백질은 농도에 비례하여 전달되었으며, 48시간 경과 후에도 세포 배양액 내에서 단백질의 구조가 변하지 않고 지속적으로 전달되었다(도 3c 및 도 3d).

3-2. 항체를 이용하여 세포의 핵까지 전달되는지 여부 확인

상기 tSmad3 및 tSmad3(MH1) 재조합 융합 단백질 5 μM을 1시간 동안 HeLa 세포와 함께 배양을 하고 PBS로 씻어 준 후 0.2% Triton X-100(Sigma-Aldrich)을 이용하여 세포에 간극을 형성하였다. 상기 간극을 통하여 형광 표지 항체를 상기 재조합 융합 단백질에 결합시켰다. DAPI 염색제(Invitrogen)를 이용하여 세포의 핵을 염색한 후, 형광현미경을 통해서 형광의 위치를 확인하여 재조합 융합 단백질이 전달된 위치를 확인하였다.

그 결과, tSmad3 및 tSmad3(MH1) 재조합 융합 단백질은 핵 내로 효과적으로 전달되었다(도 3e).

실험예 4 : tSmad3 및 tSmad3(MH1) 재조합 융합 단백질의 세포 독성 확인

대장균 균주로부터 발현하여 얻은 단백질에서 LPS가 완전히 제거되고 세포 독성이 나타나지 않는지 확인하기 위해 세포독성 테스트를 수행하였다. 쥐의 비장세포에 다양한 농도의 단백질을 전달한 후 살아있는 세포에 존재하는 디하이드로제네이스에 의해 발색하는 기질인 WST-8을 넣어 배양하였다.

그 결과, tSmad3 및 tSmad3(MH1) 재조합 융합 단백질의 농도와 관계없이, 단백질을 처리하지 않은 세포와 비교하여 전혀 독성이 나타나지 않았다(도 4).

실험예 5 : tSmad3 및 tSmad3 (MH1) 재조합 융합 단백질의 전사 조절 및 미성숙 T 세포의 TH 세포로의 분화 조절 효과 확인

5-1. 비장세포에서 IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-17A 및 IL-10의 생성 조절

6 내지 8 주령 암컷 C57BL/6 쥐의 비장에서 비장세포를 분리하고 상기 tSmad3 또는 tSmad3(MH1)을 1시간 동안 처리하여 재조합 융합 단백질을 세포 내로 전달하였다. 상기 세포를 항-CD3(1 μg/ml, BD Pharmingen) 및 항-CD28(1 μg/ml, BD Pharmingen)으로 자극한 후 72시간 동안 배양하였다. 그 후 배양액에 존재하는 사이토카인의 양을 ELISA를 이용하여 측정하였다.

그 결과, tSmad3 또는 tSmad3(MH1)을 처리한 경우 IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-17A 및 IL-10 발현양이 조절되었다(도 3f 및 도 5). 또한, T 세포 활성화의 지표가 되는 CD69의 발현양을 FACS Calibur(BD Biosciences)를 이용하여 확인한 결과, tSmad3 또는 tSmad3(MH1)은 T 세포에서의 CD69의 발현에는 영향을 미치지 않았다(도 3g).

5-2. 세포 내 신호 전달 단백질의 인산화

상기 tSmad3 및 tSmad3(MH1) 융합 단백질이 세포 내 다양한 신호 전달 체계와 관련한 단백질의 타이로신 인산화에 관여하는지 확인하기 위해 웨스턴 블롯을 이용하였다. Jurkat T 세포에 tSmad3 및 tSmad3(MH1)을 각각 2 μM을 1시간 동안 처리한 후 항-CD3(2.5 μg/ml) 및 항-CD28(2.5 μg/ml)으로 자극을 주고 ZAP-70, p38, JNK 및 ERK의 타이로신 인산화 여부를 관찰하였다.

그 결과, tSmad3 및 tSmad3(MH1)은 이들의 인산화에는 영향을 미치지 않았다(도 3h).

5-3. Jurkat T 세포에서의 NFAT 및 NF-κB 전사인자의 억제 효과 확인

상기 tSmad3 및 tSmad3(MH1) 융합 단백질이 항-CD3(1 μg/ml) 및 항-CD28(1 μg/ml)으로 자극된 Jurkat T 세포 활성화에 의해 활성화된 NFAT 및 NF-κB의 전사를 억제하는지 확인하였다. T 세포가 활성화되면 NFAT 및 NF-κB의 전사가 활성화되어 하위의 유전자인 IL-2가 활성화되기 때문에 루시퍼레이즈 리포터 유전자를 이용하였다. 먼저 Jurkat T 세포에 하위에 루시퍼레이즈를 갖는 NFAT 및 NF-κB 리포터 플라스미드를 전기천공법(elctroporation)을 이용하여 핵 내 주입 하였으며, 항-CD3 및 항-CD28으로 자극된 Jurkat T 세포에 tSmad3 및 tSmad3(MH1) 재조합 융합 단백질을 처리하였다.

그 결과, tSmad3 및 tSmad3(MH1) 재조합 융합 단백질을 처리한 경우 NFAT 및 NF-κB의 전사 활성이 효과적으로 억제되었다(도 3i 및 도 3j).

5-4. tSmad3 및 tSmad3(MH1) 재조합 융합 단백질의 전사 조절 효과 확인

HEK293T 세포에 하위에 루시퍼레이즈를 갖는 IFN-γ, IL-4, IL-17A, 및 IL-10 리포터 플라스미드와 야생형 T-bet, GATA3, RORγt, 및 Foxp3 유전자를 핵 내 주입한 후, 상기 tSmad3 또는 tSmad3(MH1) 융합 단백질을 처리하였다.

그 결과, tSmad3 및 tSmad3(MH1) 재조합 융합 단백질은 각각의 전사 활성을 효과적으로 조절하였다(도 6a-d).

5-5. 미성숙 T 세포의 TH 세포로의 분화 조절 효과 확인

6 내지 8 주령 암컷 C57BL/6 쥐의 비장에서 비장세포를 분리한 후 MACS(magnetic cell sorting)를 이용하여 어떠한 항원에도 노출되지 않은 상태인 CD4+CD25-CD62L+ 미성숙 CD4 T 세포를 분리하였다. 미성숙 CD4 T 세포에 상기 tSmad3 또는 tSmad3(MH1)을 농도별로 1시간 동안 처리한 후, 항-CD3(1 μg/ml) 및 항-CD28(1 μg/ml)으로 자극하고 각 TH 세포로 분화할 수 있는 사이토카인을 함께 넣고 72시간 동안 배양하였다.

Th1 세포로 분화시키기 위하여 IL-12(10 ng/ml) 및 항-IL-4(5 μg/ml)를 첨가하였고, Th2 세포로 분화시키기 위하여 IL-4(40 ng/ml) 및 항-IFN-γ(5 μg/ml)를 첨가하였고, Th17 세포로 분화시키기 위하여 TGF-β1(5 ng/ml), IL-6(30 ng/ml), IL-21(100 ng/ml), 항-IL-4(5 μg/ml), 및 항-IFN-γ(5 μg/ml)를 첨가하였으며, Treg 세포로 분화시키기 위하여 TGF-β1(5 ng/ml), IL-2(50 U/ml), 항-IL-4(5 μg/ml), 및 항-IFN-γ(5 μg/ml)를 첨가하였다. 72시간 경과 후 배양액에 존재하는 사이토카인의 양을 ELISA를 이용하여 측정하였다.

그 결과, Th1, Th2, 및 Th17 세포의 대표적인 사이토카인인 IFN-γ, IL-13, 및 IL-17A의 발현양이 현저하게 억제되었으며, 반면에 Treg 세포의 대표적인 사이토카인인 IL-10의 발현양은 현저하게 증가되었다. 상기 결과로부터 tSmad3 또는 tSmad3(MH1) 융합단백질이 염증 세포인 Th1, Th2, 및 Th17 세포의 기능은 제어하고, 이와 같은 염증 세포를 조절하는 Treg 세포의 기능을 유도할 수 있다는 것이 확인되었다(도 6e-h).

실험예 6 : tSmad3(MH1) 재조합 융합 단백질의 생체 내 전달 효과 확인

상기 tSmad3(MH1) 융합 단백질이 비장, 림프절, 흉선, 및 신장 조직에 있는 CD4+ T 세포에 전달되는 효과를 확인하기 위해 tSmad3(MH1)을 C57BL/6 쥐의 복강에 200 μg/mouse의 농도로 주사하고 48 시간 후에 각 조직으로부터 분리한 CD4+ T 세포에 전달된 tSmad3(MH1)을 유세포 분석기, 형광현미경 및 조직학적 분석을 통해 확인하였다.

그 결과, tSmad3(MH1)은 비장, 림프절, 흉선, 및 신장 조직에 있는 CD4+ T 세포에 효과적으로 전달되었다(도 7 및 도 8).

실험예 7 : 루푸스 신염 동물모델에서의 tSmad3 (MH1) 재조합 융합 단백질의 예방 및 치료 효과 확인

7-1. 루푸스 신염 동물모델에서의 단백뇨 및 생존율 측정

상기 tSmad3(MH1) 융합 단백질의 루푸스 신염 동물모델에서의 예방 및 치료 효과를 확인하기 위해 유전자 조작된(NZB/NZW)F1 암컷 쥐를 사용하여 수행하였다.

tSmad3(MH1)의 자가 면역 질환 예방 효과를 확인하기 위한 루푸스 신염 동물모델에서는 루푸스 신염에 걸린 쥐가 13주가 되었을 때부터 30주까지, 치료 효과를 확인하기 위한 루푸스 신염 동물모델에서는 루푸스 신염에 걸린 쥐가 23주가 되었을 때부터 30주까지 1주일에 3번씩 각각 Solu-Medrol(7 mg/kg), tSmad3(MH1)-High(200 μg/mouse) 또는 tSmad3(MH1)-Low(50 μg/mouse) 농도로 복강 주사하고 단백뇨와 생존율을 측정하였다.

단백뇨는 실험 기간 동안 1주일에 2번 측정하였으며 하기 점수에 따라 정량화하였다.

(0 = 없음, 1+ = ≤100 mg/dL, 2+ = ≤300 mg/dL, 3+ = ≤1,000 mg/dL, 4+ = 1,000 mg/dL.)

그 결과, tSmad3(MH1) 재조합 융합 단백질은 대조군과 비교하였을 때 단백뇨의 개선에 대한 긍정적인 효과가 현저하였으며, 실험 기간 동안 tSmad3(MH1)이 투여된 쥐가 죽은 사례도 발견되지 않았다(도 9a, 도 9b, 도 10a 및 도 10b).

7-2. 루푸스 신염 동물모델에서의 조직병리학적 측정

루푸스 신염이 걸린 쥐의 신장에서 상기 tSmad3(MH1) 융합 단백질의 조직학적 평가를 위해 30주된 쥐를 희생시킨 후, 신장을 4% 파라포름알데하이드 용액으로 고정시키고 파라핀에 포매한 후, PAS(periodic acid-Schiff) 염색을 통해 사구체 신염을 확인하였다. 조직 병리학적 측정은 2명의 병리학자에 의해서 측정 되었으며 하기 점수에 따라 정량화하였다.

(0 = 염색되지 않음, 1 = 약한 염색, 2 = 보통 염색, 3 = 강한 염색)

그 결과, tSmad3(MH1)을 처리한 그룹과 대조군 그룹을 비교하였을 때, 사구체 손상 및 관 손상의 정도가 개선되었고, 혈관 손상이 나타나지 않았다(도 9c 및 도 10c).

7-3. 루푸스 신염 동물모델에서의 면역형광 염색

루푸스 신염은 사구체 면역 침착의 형성이 신장의 병인에 중요한 역할을 하기 때문에 상기 tSmad3(MH1) 융합 단백질에 의해서 사구체 면역 침착의 형성이 억제되는지를 확인하기 위해 공초점 현미경을 이용하여 확인하였다. 면역형광 염색 측정은 2명의 병리학자에 의해서 측정 되었으며 하기 점수에 따라 정량화하였다.

그 결과, 대조군에서의 IgG의 침착은 면역형광에 의해 검출되어 사구체 신염이 나타난 반면, tSmad3(MH1)을 처리한 그룹에서는 IgG가 적게 검출되었으며, 상기 결과로부터 tSmad3(MH1)이 IgG의 침착을 억제하여 면역복합 매개성 신장의 기능이 악화되지 않도록 하는 것을 확인할 수 있었다(도 9d 및 도 10d).

7-4. 루푸스 신염 동물모델에서의 혈청내의 염증성 사이토카인 분석

상기 tSmad3(MH1) 융합 단백질에 의해서 혈청내의 염증성 사이토카인의 발현양이 억제되는지를 확인하기 위해 ELISA를 이용하였다.

그 결과, tSmad3(MH1)을 처리한 그룹과 대조군 그룹을 비교 하였을 때, 염증성 사이토카인인 IFN-γ, IL-6, 및 IL-17의 발현양이 현저하게 억제되었으며, 반면에 IL-10의 발현양은 현저하게 증가되었다(도 9e 및 도 10e).

7-5. 루푸스 신염 동물모델에서의 T 세포의 분석

상기 tSmad3(MH1) 융합 단백질에 의한 루푸스 신염 동물모델에서의 T 세포의 변화를 확인하기 위해, 유세포 분석기를 이용하여 각 그룹의 쥐에서 분리된 비장세포에서의 CD4+IFN-γ+, CD4+IL-4+, CD4+IL-17A+, 및 CD4+Foxp3+ 세포의 발현양을 분석하였다.

그 결과, Th1, Th2, 및 Th17 세포의 발현양이 현저하게 억제되었으나, Treg 세포의 발현양은 현저하게 증가되었다. 즉, tSmad3(MH1) 융합단백질은 염증 세포인 Th1, Th2, 및 Th17 세포의 기능을 제어하는 반면, 염증 세포를 조절하는 Treg 세포의 기능을 유도할 수 있음이 확인되었다(도 9f, 도 9g, 도 10f 및 도 10g).

7-6. 루푸스 신염 동물모델에서의 항-DNA 및 자가항체 측정

상기 tSmad3(MH1) 융합 단백질의 혈청에서의 항-DNA, IgG1, IgG2a, IgG2b, 및 IgG3의 자가항체의 생성에 대한 효과를 알아보기 위해 Milliplex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping kit를 이용하여 확인하였다.

그 결과, tSmad3(MH1)을 처리한 그룹과 대조군 그룹을 비교 하였을 때, 항-DNA의 생산이 억제되고, IgG2a, IgG2b, 및 IgG3의 발현이 현저하게 감소된 반면, IgG1의 생산량은 현저한 차이가 나타나지 않았다(도 9h 및 도 10h).

실험예 8 : 류마티스 관절염 동물모델에서의 tSmad3 (MH1) 재조합 융합 단백질의 예방 및 치료 효과 확인

8-1. 류마티스 관절염 동물모델에서의 관절염 중증도 측정

류마티스 관절염 동물모델에서의 tSmad3(MH1) 재조합 융합 단백질의 예방 및 치료 효과를 확인하기 위해 7 내지 8주 된 수컷의 DBA/1 마우스(SLC, Shizoka, Japan)을 이용하였다. CFA(Complete Freud's adjuvant)와 소(bovine)의 type II collagen을 1:1의 질량비로 섞은 항원용액 200 μg을 진피 내 주사하였다. 2주 후 동일한 방법 및 용량으로 재 주사하였다.

tSmad3(MH1)의 예방 효과를 확인하기 위한 류마티스 관절염 동물모델에서는 쥐 나이를 기준으로 8주(처리 시점 0주)째에 첫 번째 타입2의 콜라겐 항원을 주사하였고, 10주(처리 시점 2주)째, 두 번째 콜라겐 항원을 재 주사 하였으며, 8주(처리 시점 0주)째부터 tSmad3(MH1)을 투여하기 시작하여 15주(처리 시점 7주)째까지 7주 동안 치료하였다.

치료 효과를 확인하기 위한 류마티스 관절염 동물모델에서 쥐 나이를 기준으로 8주(처리 시점 0주)째에 첫 번째 타입2의 콜라겐 항원을 주사하였고, 10주(처리 시점 2주)째, 두 번째 콜라겐 항원을 재 주사 하였으며, 관절염의 유발이 확인된 12주(처리 시점 4주)째부터 tSmad3(MH1)을 투여하기 시작하여 16주(처리 시점 8주)째까지 4주 동안 치료하였다. 1주일에 3번씩 음의 대조군과 양의 대조군은 생리식염수를 복강 주사하였고, 처리군은 각각 메토트렉세이트(MTX,35 mg/kg), tSmad3(MH1)-High(200 μg/mouse), tSmad3(MH1)-Low (50 μg/mouse) 또는 돌연변이형 tSmad3(MH1) (200 μg/mouse)을 복강 주사하고 관절염의 중증도를 측정하였다.

관절염의 중증도는 실험 기간 동안 1주일에 2번 육안으로 발의 발적과 부종 및 기형의 발생 유무를 관찰하여 각 시기별 관절염 중증도를 측정하였으며, 하기 점수에 따라 정량화하였다.

(0 = 음의 대조군을 기준으로 하며 정상인 경우, 1 = 발의 중심부나 발가락, 발목, 무릎 관절 중 하나의 부위에 경도의 염증소견(발적, 부종)이 있는 경우, 2 = 여러 부위에 중증도의 관절염이 발생한 경우, 3 = 발 전체를 침범하는 중증의 염증이 관찰되는 경우, 4 = Score 3의 염증에 의해서 결과적으로 강직(ankylosis)이나 관절 움직임의 소실이 유발된 상태)

그 결과, tSmad3(MH1)을 처리한 그룹과 대조군 그룹을 비교 하였을 때, 아무 것도 처리하지 않은 대조군은 부종과 발적과 같은 명확한 관절염의 증세를 보인 반면, tSmad3(MH1)을 복강 주사하여 투여 했을 때 관절염 중증도 및 발의 두께가 투여량에 비례하여 감소하였다(도 11a, 도 11b 및 도 12a).

8-2. 류마티스 관절염 동물모델에서의 조직병리학적 측정

상기 tSmad3(MH1) 융합 단백질의 치료 효과를 검증하기 위해 류마티스 관절염에 걸린 쥐의 활막 및 관절 주위 조직에서의 염증 세포의 침투, 활막 세포의 과다 형성 및 부분적인 뼈의 손상 정도를 분석하였다.

이를 위하여 쥐를 희생시킨 후, 관절 조직은 중성의 포르말린 완충 용액에서 고정하였으며, 포름산(formic acid)에서 탈석회화 과정을 거친 다음 파라핀에 고정하여 H&E 염색을 수행하였다. 또한, 류마티스 관절염의 병태생리에 관여하는 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6와 관절의 손상 및 변형 정도를 확인하기 위하여 면역화학염색을 수행하였다. 조직 병리학적 측정은 2명의 병리학자에 의해서 측정 되었으며 하기 점수에 따라 정량화하였다.

관절염 부위에 조직학적 염색을 실시한 결과, 대조군 그룹은 염증 세포의 침투, 활막 세포의 과다 형성, 및 부분적인 뼈의 손상이 관찰되었으나, tSmad3(MH1)을 투여 했을 때는 병리학적 변화가 현저히 감소되었다(도 12b 및 도 12c).

8-3. 류마티스 관절염 동물모델에서의 비장세포 및 혈청내의 염증성 사이토카인 분석

상기 tSmad3(MH1) 융합 단백질에 의해서 쥐의 비장으로부터 분리한 비장 세포 및 혈청내의 염증성 사이토카인의 발현양이 억제되는지를 확인하기 위해 ELISA를 이용하였다.

그 결과, tSmad3(MH1)을 처리한 그룹과 대조군 그룹을 비교 하였을 때, 염증성 사이토카인인 IFN-γ, IL-6, 및 IL-17의 발현양이 현저하게 억제된 반면, IL-10의 발현양은 현저하게 증가되었다(도 11c, 도 11d, 도 11e 및 도 12d).

8-4. 류마티스 관절염 동물모델에서의 T 세포의 분석

류마티스 관절염 동물모델에서 상기 tSmad3(MH1) 융합 단백질에 의한 T 세포의 변화를 확인하기 위해, 유세포 분석기를 이용하여 각 그룹의 쥐에서 분리된 비장세포에서의 CD4+IFN-γ+, CD4+IL-4+, CD4+IL-17A+, 및 CD4+Foxp3+ 세포의 발현량을 분석하였다.

그 결과, Th1, Th2, 및 Th17 세포의 발현이 현저하게 억제된 반면, Treg 세포의 발현은 현저하게 증가되었다. 즉, tSmad3(MH1) 융합단백질은 염증 세포인 Th1, Th2, 및 Th17 세포의 기능은 제어하고, 염증 세포를 조절하는 Treg 세포의 기능을 유도하는 것으로 확인되었다(도 12e 및 도 12f).

실험예 9 : tSmad3 (MH1) 재조합 융합 단백질의 피부 조직에서의 국소 투여에 의한 전달 효과 확인

실험예 1의 tSmad3(MH1) 재조합 융합 단백질을 쥐의 피부 조직에 국소 투여하여 침투되는지를 확인하기 위해, 쥐의 등 피부에 국소적으로 30 분간 tSmad3(MH1)을 처리한 후 6 시간, 12 시간, 24 시간, 및 48 시간이 경과한 후에 공초점 현미경을 이용하여 관찰하였다.

그 결과, tSmad3(MH1) 융합 단백질은 시간이 경과함에 따라 피부의 표피층을 통과하여 진피층까지 효과적으로 전달되었다(도 13).

실험예 10 : 재조합 융합 단백질의 급성 독성 실험

대한실험공급센터에서 공급받은 6 주령의 특정병원체부재(specific pathogen-free, SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성 독성 실험을 실시하였다.

각 그룹당 2 마리씩의 동물에 실험예 2의 융합 단백질을 1 g/㎏의 용량으로 1회 경구 투여 후, 동물의 폐사여부, 임상증상 및 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 강장기와 흉강 장기의 이상 여부를 관찰하였다.

그 결과, 실험 물질을 투여한 모든 동물에서 특이할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사 및 부검과 소겸등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 따라서 본 발명의 실험예 1의 재조합 융합 단백질은 랫트에서 각각 1 g/㎏까지도 독성을 나타내지 않으며, 경구 투여 최소치사량(LD₅₀)이 1 g/㎏이상인 안전한 물질로 확인되었다.

실험예 11 : 단백질 운반 도메인 치환에 따른 자가 면역 질환 치료 효과 확인

실험예 2에서 사용된 단백질 운반 도메인 Hph-1(서열번호 6)을 Sim-2(AKAARQAAR), Tat(YGRKKRRQRRR), VP22(DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVD), Antp(RQIKIWFQNRRMKWKK), Pep-1(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV), PTD-5(RRQRRTSKLMKR), 7R(RRRRRRR), 9R(RRRRRRRRR), 11R(RRRRRRRRRRR) 및 CTP(YGRRARRRRRR)로 치환하고, 실험예3, 실험예 5, 실험예 6, 실험예 7, 실험예 8의 실험을 반복하였다.

실험 결과, 상기 Smad3 단백질 또는 Smad 전사 조절 도메인 단백질은 Hph-1와 융합된 경우와 동일하게 세포 내로 효과적으로 전달되었으며, 전사 조절 효과 및 미성숙 T 세포에 대한 분화 조절효과가 동일하게 구현되었다.

뿐만 아니라, 동물모델에서의 질병 개선 효과 역시 동일하게 확인되었으므로, 상기 Smad3 단백질 또는 Smad3 전사 조절 도메인 단백질은 단백질 운반 도메인의 종류와 무관하게 자가 면역 질환에 대한 치료 효과를 보유할 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의해 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Yonsei University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> A COMPOSITION CONTAINING SMAD PROTEIN FOR TREATMENT OF AUTOIMMUNE DISEASES, A FUSION PROTEIN COMPRISING SMAD PROTEIN, A EXPRESSION VECTOR AND A METHOD FOR PREPARING THE SAME <130> 2015-PP-12301 <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 425 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Smad3 <400> 1 Met Ser Ser Ile Leu Pro Phe Thr Pro Pro Ile Val Lys Arg Leu Leu 1 5 10 15 Gly Trp Lys Lys Gly Glu Gln Asn Gly Gln Glu Glu Lys Trp Cys Glu 20 25 30 Lys Ala Val Lys Ser Leu Val Lys Lys Leu Lys Lys Thr Gly Gln Leu 35 40 45 Asp Glu Leu Glu Lys Ala Ile Thr Thr Gln Asn Val Asn Thr Lys Cys 50 55 60 Ile Thr Ile Pro Arg Ser Leu Asp Gly Arg Leu Gln Val Ser His Arg 65 70 75 80 Lys Gly Leu Pro His Val Ile Tyr Cys Arg Leu Trp Arg Trp Pro Asp 85 90 95 Leu His Ser His His Glu Leu Arg Ala Met Glu Leu Cys Glu Phe Ala 100 105 110 Phe Asn Met Lys Lys Asp Glu Val Cys Val Asn Pro Tyr His Tyr Gln 115 120 125 Arg Val 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Claims

Smad3 MH1 전사 조절 도메인(transcription modulation domain) 및 단백질 운반 도메인(protein transduction domain)을 포함하는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 자가 면역 질환 예방 또는 치료용 조성물.
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 Smad3 MH1 전사 조절 도메인은 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 조성물.
제1항에 있어서,
상기 Smad3 MH1 전사 조절 도메인은 서열번호 4의 핵산 서열에 의해 암호화되는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 자가 면역 질환은 전신성 홍반성 루푸스, 또는 류마티스 관절염인 조성물.
Smad3 MH1 전사 조절 도메인, 및
단백질 운반 도메인(protein transduction domain)을 포함하는 자가 면역 질환 예방 또는 치료용 융합 단백질.
삭제
삭제
제7항에 있어서,
상기 Smad3 MH1 전사 조절 도메인은 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 융합 단백질.
제7항에 있어서,
상기 Smad3 MH1 전사 조절 도메인은 서열번호 4의 핵산 서열에 의해 암호화되는 융합 단백질.
제7항에 있어서,
상기 단백질 운반 도메인은 Hph-1, Sim-2, Tat, VP22, Antp(antennapedia), Pep-1(peptide-1), PTD-5(protein transduction domain-5), 7R, 9R, 11R 및 CTP(cytoplasmic transduction peptide)로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 융합 단백질.
제7항에 있어서,
상기 단백질 운반 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성된 융합 단백질.
제7항에 있어서,
상기 단백질 운반 도메인은 서열번호 6의 핵산 서열에 의해 암호화되는 융합 단백질.
제7항에 있어서,
서열번호 9의 아미노산 서열로 구성된 융합 단백질.
제7항에 있어서,
서열번호 10의 핵산 서열에 의해 암호화되는 융합 단백질.
제7항, 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 자가 면역 질환은 전신성 홍반성 루푸스, 또는 류마티스 관절염인 융합 단백질.
삭제
약제학적 유효량의 Smad3(MH1)-PTD 컨쥬게이트, 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효 성분으로 함유하는 자가 면역 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제7항, 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
제7항, 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 암호화하는 외인성의 핵산 서열을 과발현하는 재조합 숙주 세포.
제20항의 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포.
제21항에 있어서,
미생물, 동물세포, 식물세포, 동물에서 유래한 배양세포, 또는 식물에서 유래한 배양세포인 숙주 세포.
제22항에 있어서,
미생물, 동물세포, 식물세포, 동물에서 유래한 배양세포, 또는 식물에서 유래한 배양세포인 숙주 세포.
제20항의 발현 벡터로 숙주 세포를 형질 전환하는 단계; 및
상기 숙주 세포를 배양하여 상기 융합 단백질을 발현시키는 단계;를 포함하는 융합 단백질의 제조 방법.