JP2018507840A - Ｓｍａｄタンパク質を含む自己免疫疾患治療用組成物、Ｓｍａｄタンパク質を含む融合タンパク質、これを製造するためのベクター、及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、Ｓｍａｄタンパク質を含む自己免疫疾患治療用組成物及び融合タンパク質に関し、これを利用したループス腎炎、及びリウマチ性関節炎を含む自己免疫疾患の予防、改善または治療方法を提供する。【選択図】図１２

Description

本発明は、Ｓｍａｄタンパク質を含む自己免疫疾患治療用組成物及び融合タンパク質に関し、ループス腎炎及びリウマチ性関節炎を含む自己免疫疾患に対する予防及び治療方法を提供する。

ヒトの免疫系は、人体に侵入した外部抗原から身体を保護する役目をするが、自己寛容性（ｓｅｌｆ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）によって自分の組織を攻撃しない。しかし、免疫系の自己寛容性の損傷に起因して免疫細胞が自己遺伝子によって正常に発現されるタンパク質を攻撃対象として認識することによって、抗体を生成するか、またはＴ細胞反応を起こして、正常組織を破壊することを自己免疫であると言い、具体的な症状を自己免疫疾患であると言う。

１９８０年代中盤にＭｏｓｍａｎｎ等は、補助Ｔリンパ球（ｈｅｌｐｅｒ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、Ｔｈ）をサイトカイン分泌様相によってＴｈ１とＴｈ２という２つの細胞集団に分けられると提案した（Ｍｏｓｍａｎｎ ＴＲ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３６：２３４８−２３５７、１９８６）。その後、Ｔｈ１細胞は、ＩＦＮ−γを分泌し、マクロファージ等を活性化して細胞性免疫反応を誘導し、Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５等を分泌し、体液性免疫反応に関与するものと知られた。

また、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞の不均衡に起因してＴｈ１への分化が過度に進行されれば、炎症性自己免疫疾患が誘発されると知られた。しかし、ＩＦＮ−γやＩＦＮ受容体が欠乏されたマウスが、リウマチ性関節炎と多発性硬化症のような自己免疫疾患を起こすことが報告され、Ｔｈ１／Ｔｈ２パラダイムに対する疑問が提起された（Ｉｎｆａｎｔｅ−Ｄｕａｒｔｅ Ｃ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６５：６１０７−６１１５、２０００）。また、ＩＬ−１２とＩＬ−２３に関する研究で、自己免疫疾患を起こすにあたって、Ｔｈ１細胞よりＩＬ−２３によって誘導されるＴｈ１７細胞がさらに重要であることが明らかにされた（Ｍｕｒｐｈｙ ＫＭ、ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２（１２）：９３３−４４、２００２；Ｃｕａ ＤＪ、ｅｔ ａｌ．、４２１（６９２４）：７４４−８、２００３；Ｌａｎｇｒｉｓｈ ＣＬ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０１（２）：２３３−４０、２００５）。

Ｔｈ１７細胞は、ＩＬ−２３によって誘導されるＴ細胞群がＩＬ−１７サイトカインを分泌することから命名され、Ｔｈ１またはＴｈ２とは独立的な細胞であることが明らかにされた。最近には、ＲＯＲγｔというＴｈ１７細胞の転写因子が明らかにされ、Ｔｈ１７細胞の信号伝達体系や転写過程等が判明された。

また、Ｔｈ１７細胞がＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｒｅｇ（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ）細胞とは異なって、自己免疫疾患で見られる炎症反応の最前方で関与し、炎症反応の信号を最大化させて、疾病の進行を加速化するものと知られている。これによって、Ｔｈ１７細胞活性の抑制を標的とする自己免疫疾患の治療剤の開発が大きく重視されている。

全身性紅斑性ループス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ、ＳＬＥ）は、外部から人体を防御する免疫系の異常によって皮膚、関節、腎臓、肺、神経等様々な臓器に炎症を起こす慢性自己免疫疾患であり、特に腎臓を侵犯し、腎臓機能の低下により発生する全身性紅斑性ループスの深刻な余病がループス腎炎（ｌｕｐｕｓ ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ、ＬＮ）である。

ループス腎炎の疾病発現には、多くの免疫的、非免疫的要因が寄与するが、核（ｎｕｃｌｅｕｓ）と内因性抗原（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ａｎｔｉｇｅｎ）に対抗する病原性自己抗体の生成と糸球体免疫沈着（ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｅ ｄｅｐｏｓｉｔｓ）の形成、そして多段階補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）の活性化によってループス腎炎が発病される。

リウマチ性関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ、ＲＡ）は、多発性関節炎を特徴とする慢性炎症性自己免疫疾患であって、関節内にある滑膜（ｓｙｎｏｖｉｕｍ）に炎症が起き、血液内の白血球が関節に集中される。その結果、関節液（ｊｏｉｎｔｆｌｕｉｄ）が増加し、関節が腫れて痛みが現われ、炎症性滑膜組織が徐々に生長し、骨と軟骨に食い込んで、関節の形態が変形されるため、関節を動かすのに障害が発生する。

関節の進行的な損傷と心血管疾患等の全身性余病を特徴とする自己免疫疾患であるリウマチ性関節炎は、環境的、遺伝的要素によるシトルリン化（ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｉｏｎ）を通じて免疫寛容の損失をもたらす。シトルリンに対する反応は、Ｔ細胞とＢ細胞で観察され、二次的にリンパ組織や骨髄で現われ、リウマチ性関節炎の関節内滑膜炎は、多様な炎症細胞と炎症物質によってポジティブなフィードバックループ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｆｅｅｄｂａｃｋ ｌｏｏｐ）を形成するので、持続的な炎症を誘発し、多様な全身性な余病を引き起こすことができる。

ループス腎炎とリウマチ性関節炎の治療法は、極的に変化し、新しい薬剤が持続的に開発され、単一方式と組合方式が適用される等、多様な治療方法が研究されているが、このような持続的な研究にもかかわらず、ループス腎炎と及びリウマチ性関節炎の完治的治療は難しいことが現況である。

したがって、本発明者は、免疫体系の信号伝達に関与する特定のタンパク質群を利用して、標的特異性に優れ、細胞毒性がなく、副作用が最小化された自己免疫疾患治療方法を提供しようとした。

本発明は、前述した従来技術の問題点を解決するために、ループス腎炎またはリウマチ性関節炎を含む自己免疫疾患に対する根本的な治療方法を提供することを目的とする。

本発明の一態様によれば、Ｓｍａｄタンパク質またはＳｍａｄ転写調節ドメイン（Ｓｍａｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）タンパク質を有効成分として含む自己免疫疾患予防または治療用組成物が提供される。

一実施例において、前記Ｓｍａｄタンパク質は、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ４、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ６、Ｓｍａｄ７及びＳｍａｄ８よりなる群から１つ以上選択され得る。

一実施例において、前記組成物は、Ｓｍａｄ３タンパク質またはＳｍａｄ３転写調節ドメインタンパク質を有効成分として含むことができる。

一実施例において、前記Ｓｍａｄ３タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列で構成され、前記Ｓｍａｄ３転写調節ドメインタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列で構成され得る。

一実施例において、前記Ｓｍａｄ３タンパク質は、配列番号２の核酸配列によって暗号化され、前記Ｓｍａｄ３転写調節ドメインタンパク質は、配列番号４の核酸配列によって暗号化され得る。

一実施例において、前記自己免疫疾患は、全身性紅斑性ループス、リウマチ性関節炎、敗血症性ショック、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、潰瘍性大腸炎、涙腺炎、アルツハイモ疾患、脳卒中、動脈硬化症、血管再狭窄、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、ダムマジン、結膜炎、乾癬、全身性炎症反応症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性多発関節炎、混合結合組織症、シェーグレン症候群、通風、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、糖尿性網膜症、多発性硬化症、クローン病、慢性甲状腺炎、セリアック病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、ウイルス疾患、細菌性疾患、放射線による障害、動脈硬化、血管腫、血管線維腫、再灌流傷害及び心臓肥大症よりなる群から１つ以上選択され得る。

本発明の他の態様によれば、Ｓｍａｄタンパク質またはＳｍａｄ転写調節ドメインタンパク質、及びタンパク質運搬ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）を含む自己免疫疾患予防または治療用融合タンパク質が提供される。

一実施例において、前記Ｓｍａｄタンパク質は、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ４、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ６、Ｓｍａｄ７及びＳｍａｄ８よりなる群から１つ以上選択され得る。

一実施例において、前記融合タンパク質は、Ｓｍａｄ３タンパク質またはＳｍａｄ３転写調節ドメインタンパク質、及びタンパク質運搬ドメインを含むことができる。

一実施例において、前記Ｓｍａｄ３タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列で構成され、前記Ｓｍａｄ３転写調節ドメインタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列で構成され得る。

一実施例において、前記Ｓｍａｄ３タンパク質は、配列番号２の核酸配列によって暗号化され、前記Ｓｍａｄ３転写調節ドメインタンパク質は、配列番号４の核酸配列によって暗号化され得る。

一実施例において、前記タンパク質運搬ドメインは、Ｈｐｈ−１、Ｓｉｍ−２、Ｔａｔ、ＶＰ２２、Ａｎｔｐ（ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）、Ｐｅｐ−１（ｐｅｐｔｉｄｅ−１）、ＰＴＤ−５（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ−５）、７Ｒ、９Ｒ、１１Ｒ及びＣＴＰ（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅ）よりなる群から１つ以上選択され得る。

一実施例において、前記タンパク質運搬ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列で構成され得る。

一実施例において、前記タンパク質運搬ドメインは、配列番号６の核酸配列によって暗号化され得る。

一実施例において、前記融合タンパク質は、配列番号７または配列番号９のアミノ酸配列で構成され得る。

一実施例において、前記融合タンパク質は、配列番号８または配列番号１０の核酸配列によって暗号化され得る。

一実施例において、前記自己免疫疾患は、全身性紅斑性ループス、リウマチ性関節炎、敗血症性ショック、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、潰瘍性大腸炎、涙腺炎、アルツハイモ疾患、脳卒中、動脈硬化症、血管再狭窄、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、ダムマジン、結膜炎、乾癬、全身性炎症反応症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性多発関節炎、混合結合組織症、シェーグレン症候群、通風、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、糖尿性網膜症、多発性硬化症、クローン病、慢性甲状腺炎、セリアック病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、ウイルス疾患、細菌性疾患、放射線による障害、動脈硬化、血管腫、血管線維腫、再灌流傷害及び心臓肥大症よりなる群から１つ以上選択され得る。

本発明の他の態様によれば、前記融合タンパク質を有効成分として含む自己免疫疾患予防または治療用組成物が提供される。

本発明の他の態様によれば、薬剤学的有効量のＳｍａｄ３−ＰＴＤコンジュゲート、Ｓｍａｄ３（ＭＨ１）−ＰＴＤコンジュゲート、またはその薬剤学的に許容可能な塩を有効成分として含有する自己免疫疾患予防または治療用薬剤学的組成物が提供される。

本発明の他の態様によれば、前記融合タンパク質を暗号化する核酸配列を含む発現ベクターが提供される。

本発明の他の態様によれば、前記融合タンパク質を暗号化する外因性の核酸配列を過発現する組換え宿主細胞が提供される。

本発明の他の態様によれば、前記発現ベクターによって形質転換された組換え宿主細胞が提供される。

一実施例において、前記宿主細胞は、微生物、動物細胞、植物細胞、動物から由来した培養細胞、または植物から由来した培養細胞であることができる。

本発明の他の態様によれば、前記発現ベクターで宿主細胞を形質転換する段階と；前記宿主細胞を培養し、前記融合タンパク質を発現させる段階と；を含む融合タンパク質の製造方法が提供される。

本発明は、自己免疫疾患の発病に関与する信号経路の明確な理解に基づいて効果的にループス腎炎またはリウマチ性関節炎を含む自己免疫疾患を抑制または治療する方法を提供し、これと関連した多様な疾患の治療、予防、診断またはその研究等に有用に活用され得る。

本発明の効果は、前述した効果に限定されるものではなく、本発明の詳細な説明または特許請求範囲に記載された発明の構成から推論可能なすべての効果を含むものと理解すべきである。

図１は、Ｓｍａｄ３（ＭＨ１）ドメインのＳｍａｄ３の転写活性化における役目を確認したものである。Ｓｍａｄ３がノックダウン（ｋｎｏｃｋ−ｄｏｗｎ）されたＳＮＵ−４８４細胞にＳＢＥ４（Ｓｍａｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ ４）ルシフェラーゼレポータープラスミドとＳｍａｄ２、Ｓｍａｄ２（ＭＨ１）、Ｓｍａｄ２（ＭＨ２）、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ３（ＭＨ１）、Ｓｍａｄ３（ＭＨ２）、及びＳｍａｄ３（ＭＨ１）の突然変異型遺伝子を一緒に形質注入し、ルシフェラーゼ活性を確認した。 図２は、本発明の一実施例による融合タンパク質であるｔＳｍａｄ２とｔＳｍａｄ３の機能的差異を比較したものである。（ａ）は、Ｓｍａｄ２の構造及び融合タンパク質であるＳｍａｄ２の派生物を示し、（ｂ）は、融合タンパク質を精製した結果であり、（ｃ）は、Ｓｍａｄ３がノックダウンされたＳＮＵ−４８４細胞にＳＢＥ４ルシフェラーゼレポータープラスミドとｔＳｍａｄ２、ｔＳｍａｄ２（ＭＨ１）、ｔＳｍａｄ３、ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）、及びｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）の突然変異型融合タンパク質を処理し、ルシフェラーゼ活性を確認した結果である。 図３は、本発明の一実施例による融合タンパク質であるｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）が抗−ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激されたＴ細胞活性化によって発現されるＩＬ−２の発現抑制効果を示したものである。（ａ）は、Ｓｍａｄ３の構造及び融合タンパク質であるＳｍａｄ３の派生物を示し、（ｂ）は、融合タンパク質を精製した結果である。（ｃ）、（ｄ）は、融合タンパク質の濃度及び時間によるＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞内伝達結果を示す。（ｅ）は、融合タンパク質のＨｅＬａ細胞核内の伝達結果を示す。（ｆ）は、融合タンパク質が抗−ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激されたＴ細胞活性化によって発現されるＩＬ−２の発現抑制結果を示す。（ｇ）、（ｈ）は、融合タンパク質が抗−ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激されたＴ細胞活性化とそれによる信号伝達経路には影響を及ぼさないことを確認したものである。（ｉ）、（ｊ）は、融合タンパク質が抗−ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激されたＴ細胞活性化によるＮＦＡＴ及びＮＦ−κＢの転写を抑制できることを確認したものである。 図４は、本発明の一実施例による融合タンパク質であるｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）のネズミの脾臓細胞での細胞毒性を測定したものである。（ａ）は、ｔＳｍａｄ３またはｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）をネズミの脾臓細胞に多様な濃度で処理し、１時間後、（ｂ）は、４８時間後の細胞毒性を測定した結果を示す。 図５は、本発明の一実施例による融合タンパク質であるｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）が抗−ＣＤ３／ＣＤ２８で刺激されたＴ細胞活性化によって発現されるＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１７Ａ、及びＩＬ−１０の発現に対する調節効果を示す。 図６は、本発明の一実施例による融合タンパク質であるｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）の転写調節効果及び未成熟Ｔ細胞の各Ｔｈ細胞への分化調節効果を示したものである。（ａ）〜（ｄ）は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に下位にルシフェラーゼを有するＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１７Ａ、及びＩＬ−１０レポータープラスミド及び野生型Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ３、ＲＯＲγｔ、及びＦｏｘｐ３遺伝子を核内に注入した後、ｔＳｍａｄ３またはｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）融合タンパク質を処理し、ルシフェラーゼ活性を観察したものである。（ｅ）〜（ｈ）ｔＳｍａｄ３またはｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）が、未成熟Ｔ細胞が各Ｔｈ細胞に分化することを調節できるかについてＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１７Ａ、及びＩＬ−１０の発現を分析したものである。 図７及び図８は、本発明の一実施例による融合タンパク質であるｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）が脾臓、リンパ節、胸腺、及び腎臓組織にあるＣＤ４＋Ｔ細胞に伝達されるかを観察したものである。（ａ）は、ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）をＣ５７ＢＬ／６ネズミの腹腔に２００μｇ／ｍｏｕｓｅの濃度で注射し、４８時間後に各組織から分離したＣＤ４＋Ｔ細胞に伝達されたｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）をフローサイトメトリーを通じて観察したものである。（ｂ）は、蛍光顕微鏡を通じて観察したものである。（ｃ）は、組織学的側面からヘマトキシリン−エオジン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ＆ｅｏｓｉｎ）染色法で観察したものである。 図７及び図８は、本発明の一実施例による融合タンパク質であるｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）が脾臓、リンパ節、胸腺、及び腎臓組織にあるＣＤ４＋Ｔ細胞に伝達されるかを観察したものである。（ａ）は、ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）をＣ５７ＢＬ／６ネズミの腹腔に２００μｇ／ｍｏｕｓｅの濃度で注射し、４８時間後に各組織から分離したＣＤ４＋Ｔ細胞に伝達されたｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）をフローサイトメトリーを通じて観察したものである。（ｂ）は、蛍光顕微鏡を通じて観察したものである。（ｃ）は、組織学的側面からヘマトキシリン−エオジン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ＆ｅｏｓｉｎ）染色法で観察したものである。 図９は、本発明の一実施例による融合タンパク質であるｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）のループス腎炎動物モデルでの疾患予防効果を示したものである。（ａ）、（ｂ）は、遺伝子操作されたループス腎炎マウスが１３週になったときから３０週まで１週間に３回ずつ各々Ｓｏｌｕ−Ｍｅｄｒｏｌ（７ｍｇ／ｋｇ）、ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）−Ｈｉｇｈ（２００μｇ／ｍｏｕｓｅ）またはｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）−Ｌｏｗ（５０μｇ／ｍｏｕｓｅ）濃度で腹腔注射し、蛋白尿と生存率を測定した。（ｃ）は、３０週齢の各グループのネズミで糸球体腎炎に対するｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）の処理効果を分析したものである。（ｄ）は、糸球体免疫沈着の形成に対するｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）の処理効果を共焦点顕微鏡を利用して分析したものである。（ｅ）は、血清内の炎症性サイトカインであるＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、及びＩＬ−１７の発現量を測定したものである。（ｆ）は、各グループのネズミの脾臓のサイズを確認した結果である。（ｇ）は、フローサイトメトリーを利用して各グループのネズミの脾臓から分離した脾臓細胞でのＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋、ＣＤ４＋ＩＬ−４＋、ＣＤ４＋ＩＬ−１７Ａ＋、及びＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞の発現量を分析したものである。（ｈ）は、抗−ＤＮＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３の血清での濃度を分析したものである。 図１０は、本発明の一実施例による融合タンパク質であるｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）のループス腎炎動物モデルでの治療効果を現わしたのである。（ａ）、（ｂ）は、遺伝子操作されたループス腎炎マウスが２３週になったときから３０週まで１週間に３回ずつ各々Ｓｏｌｕ−Ｍｅｄｒｏｌ（７ｍｇ／ｋｇ）、ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）−Ｈｉｇｈ（２００μｇ／ｍｏｕｓｅ）またはｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）−Ｌｏｗ（５０μｇ／ｍｏｕｓｅ）濃度で腹腔注射し、蛋白尿と生存率を測定した。（ｃ）は、３０週齢の各グループのネズミで糸球体腎炎に対するｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）の処理効果を分析したものである。（ｄ）は、糸球体免疫沈着の形成に対するｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）の処理効果を共焦点顕微鏡を利用して分析したものである。（ｅ）は、血清内の炎症性サイトカインであるＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、及びＩＬ−１７の発現量を測定したものである。（ｆ）は、各グループのネズミの脾臓のサイズを確認した結果であり、（ｇ）は、フローサイトメトリーを利用して各グループのネズミの脾臓から分離した脾臓細胞でのＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋、ＣＤ４＋ＩＬ−４＋、ＣＤ４＋ＩＬ−１７Ａ＋、及びＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞の発現量を分析したものである。（ｈ）は、抗−ＤＮＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３の血清での濃度を分析したものである。 図１１は、本発明の一実施例による融合タンパク質であるｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）のリウマチ性関節炎動物モデルでの疾患予防効果を示したものである。（ａ）は、ｃｏｌｌａｇｅｎを注射し、リウマチ性関節炎を誘発させた後、０週から７週まで１週間に３回ずつ各々ＭＴＸ（３５ｍｇ／ｋｇ）、ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）（２００μｇ／ｍｏｕｓｅ）または突然変異型ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）（２００μｇ／ｍｏｕｓｅ）濃度で腹腔注射し、ａｒｔｈｒｉｔｉｓｓｃｏｒｅが好転される治療効果を示した結果である。（ｂ）は、８週齢の各グループのネズミの足厚さの腫れ程度に対するｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）の処理効果を確認した結果である。（ｃ）は、各グループのネズミの脾臓から分離した脾臓細胞の細胞数と炎症性サイトカインであるＩＦＮ−γ及びＩＬ−１７Ａの発現量を分析した結果である。 図１２は、本発明の一実施例による融合タンパク質であるｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）のリウマチ性関節炎動物モデルでの治療効果を分析したものである。（ａ）は、ｃｏｌｌａｇｅｎを注射し、リウマチ性関節炎を誘発させた後、４週から８週まで１週間に３回ずつ各々ＭＴＸ（３５ｍｇ／ｋｇ）、ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）（２００μｇ／ｍｏｕｓｅ）またはｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）（５０μｇ／ｍｏｕｓｅ）濃度で腹腔注射し、ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｓｃｏｒｅが好転される治療効果を示したものである。（ｂ）は、８週齢の各グループのネズミの膝関節での炎症細胞浸潤、滑膜細胞増殖、及び骨侵食に対するｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）の処理効果を組織病理学的方法を利用して分析したものである。（ｃ）は、ネズミの膝関節で炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、及びＩＬ−６の発現量を免疫組織化学的方法を利用して分析したものである。（ｄ）は、血清内の炎症性サイトカインであるＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、及びＩＬ−１７の発現を測定したものである。（ｅ）は、各グループのネズミの脾臓のサイズを確認したものである。（ｆ）は、フローサイトメトリーを利用して各グループのネズミの脾臓から分離した脾臓細胞でのＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋、ＣＤ４＋ＩＬ−４＋、ＣＤ４＋ＩＬ−１７Ａ＋、及びＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞の発現量を分析したものである。 図１３は、ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）をネズミの皮膚組織に局所投与し、浸透されるか否かを分析したものである。ネズミの皮膚に局所的に３０分間ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）を処理した後、６時間、１２時間、２４時間、及び４８時間が経過した後、共焦点顕微鏡を利用して観察したものである。

以下では、添付の図面を参照して本発明を説明する。しかし、本発明は、いろいろな異なる形態で具現され得、したがって、ここで説明する実施例に限定されるものではない。そして、図面で本発明を明確に説明するために説明と関系ない部分は省略し、明細書全体にわたって類似の部分に対しては、類似の図面符号を付与した。

或る部分が任意の構成要素を「含む」というとき、これは、特に反対される記載がない限り、他の構成要素を除外するものではなく、他の構成要素をさらに具備できることを意味する。

別途定義されない限り、分子生物学、微生物学、タンパク質精製、タンパク質工学、及びＤＮＡ配列分析及び当業者の能力範囲内で組換えＤＮＡ分野で頻繁に使用される通常的な技術によって行われることができる。前記技術は、当業者に知られており、多くの標準化された教材及び参照著書に記述されている。

本明細書に別途定義されていなければ、使用されたすべての技術及び科学用語は、当業界における通常の技術者が通常的に理解するような意味を有する。

本明細書に含まれる用語を含む多様な科学的辞書がよく知られており、当業界で利用可能である。本明細書に説明されたものと類似または等価である任意の方法及び物質が本願の実行または試験に使用されるものと発見されるが、いくつかの方法及び物質が説明されている。当業者が使用する脈絡によって、多様に使用され得るので、特定の方法学、プロトコル及び試薬に本発明が制限されるものではない。

本明細書で使用されるように、単数型は、文脈が明確に別途指示しなければ、複数の対象を含む。また、別途指示されていなければ、核酸は、それぞれ左側から右側、５’から３’方向に書かれ、アミノ酸配列は、左側から右側、アミノからカルボキシル方向に書かれる。

以下、本発明をさらに詳しく説明する。
本発明の一態様は、Ｓｍａｄタンパク質またはＳｍａｄ転写調節ドメイン（Ｓｍａｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）タンパク質を有効成分として含む自己免疫疾患予防または治療用組成物を提供する。

一実施例において、前記Ｓｍａｄタンパク質は、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ４、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ６、Ｓｍａｄ７及びＳｍａｄ８よりなる群から１つ以上選択され得る。

前記自己免疫疾患は、個体自分の組織に対して起き、指定された非−悪性疾患または障害である。

すべての正常個体において最も重要な特性のうち１つは、自己（ｓｅｌｆ）を構成している抗原物質に対しては、有害に反応しない一方で、非自己（ｎｏｎ−ｓｅｌｆ）抗原に対しては、これを認識し反応して除去できる。自己抗原に対する生体の無反応を免疫学的無反応性（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｕｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ）または寛容（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）と言う。しかし、自己寛容を誘導または維持するにあたって、異常が生じれば、自己抗原に対して免疫反応が起きるようになり、その結果、自分の組織を攻撃する現象が発生し、前記過程によって発生する疾患を自己免疫疾患と言う。

前記自己免疫疾患は、自分の臓器組織やその成分に対して抗体が生産される炎症性疾患であって、多数の組織と臓器に慢性的な全身性炎症を起こす疾病を総称できる。

一実施例において、前記自己免疫疾患は、全身性紅斑性ループス、リウマチ性関節炎、敗血症性ショック、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、潰瘍性大腸炎、涙腺炎、アルツハイモ疾患、脳卒中、動脈硬化症、血管再狭窄、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、ダムマジン、結膜炎、乾癬、全身性炎症反応症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性多発関節炎、混合結合組織症、シェーグレン症候群、通風、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、糖尿性網膜症、多発性硬化症、クローン病、慢性甲状腺炎、セリアック病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、ウイルス疾患、細菌性疾患、放射線による障害、動脈硬化、血管腫、血管線維腫、再灌流傷害及び心臓肥大症よりなる群から１つ以上選択され得るが、前記自己免疫疾患の疾病的特性または発病機作を共有する場合であれば、特に制限されない。

前記「予防」は、動物の病理学的細胞の発生または細胞の損傷、消失の程度の減少を意味する。予防は、完全なものであってもよく、または部分的なものであってもよい。この場合には、個体内の病理学的細胞の発生または異常免疫作用等が前記自己免疫疾患の予防及び治療用組成物を使用しない場合と比較して現象する現象を意味できる。

また、前記「治療」は、治療しようとする対象または細胞の天然過程を変更させるために臨床的に介入するすべての行為を意味し、臨床病理状態が進行される間にまたはこれを予防するために行うことができる。目的する治療効果は、疾病の発生または再発を予防するか、症状を緩和させるか、疾病によるすべての直接または間接的な病理学的結果を低下させるか、転移を予防するか、疾病進行速度を減少させるか、疾病状態を軽減または一時的緩和させるか、予後を改善させることを含むことができる。すなわち、前記治療は、前記組成物によって自己免疫疾患の症状が好転されるかまたは完治されるすべての行為を包括するものと解釈され得る。

前記Ｓｍａ及びＭａｄ関連タンパク質（Ｓｍａｄ）は、特定遺伝子の活性はもちろん、細胞成長及び増殖を調節する進化的に保存された細胞内媒介因子のファミリである。Ｓｍａｄは、転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）シグナリング経路の一部としてこれらの機能を行い、このような経路は、細胞外部から核にシグナルを伝達できる。

ＴＧＦ−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β）ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙは、細胞の増殖、分化、細胞死滅、移動、及び発生のような多様な生理的過程を調節するサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）である。ＴＧＦ−β ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙには、ＴＧＦ−βｓ、ａｃｔｉｎｓ、ｎｏｄａｌｓ、及びＢＭＰｓ（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）を含んで多様な機能を有するサイトカインが含まれる。ＴＧＦ−β ｆａｍｉｌｙには、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、及びＴＧＦ−βの３種類のｉｓｏｆｏｒｍがある。ＴＧＦ−β１は、ＴＧＦ−β２及びＴＧＦ−β３とは異なって、主に免疫体系で発現され得る。

ＴＧＦ−β１によるシグナリングは、タイプＩ及びＩＩ受容体−媒介されたリン酸化によって開始され得る。活性化されたＴＧＦ−β１受容体Ｉは、Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３（Ｒ−Ｓｍａｄ）をこれらのＣ末端でリン酸化させ、これは、抑制性Ｓｍａｄ６及びＳｍａｄ７（Ｉ−Ｓｍａｄ）によって拮抗され得る。

リン酸化後、Ｒ−Ｓｍａｄは、Ｓｍａｄ４（Ｃｏ−Ｓｍａｄ）と複合体を形成し、核に転位され、細胞外遺伝子転写を活性化させることができる。また、Ｒ−Ｓｍａｄは、ＭＡＰＫによってＮ−末端ＭＨ１とＣ−末端ＭＨ２ドメインを連結させるリンカー領域でリン酸化され得る。ＢＭＰは、特異的細胞内シグナリング連鎖反応を利用してＲ−ＳｍａｄＳ（Ｓｍａｄ１、５、８）、Ｃｏ−Ｓｍａｄ（Ｓｍａｄ４）及びＩ−ＳｍａｄＳ（Ｓｍａｄ６、７）を通じて遺伝子を標的化させることができる。

Ｓｍａｄ７は、ＴＧＦ−βシグナリングの公知された細胞間拮抗剤であり、これは、ＴＧＦ−β−誘導された転写反応を抑制し、一方、Ｓｍａｄ６は、ＴＧＦ−β及びＢＭＰ（骨形成タンパク質、ＴＧＦ−βスーパーファミリの一員）の公知された抑制剤である。

すなわち、前記Ｓｍａｄタンパク質は、転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）シグナリング経路の一部であって、前記シグナリング経路を制御することによって、Ｔｈ細胞の不均衡による炎症反応を抑制できる。

特に、本発明者は、Ｓｍａｄ３またはＳｍａｄ３転写調節ドメインとタンパク質運搬ドメインを含む新規融合タンパク質が炎症細胞であるＴｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ１７細胞の機能を制御して分化を抑制し、前記炎症細胞を調節する調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の機能を誘導して分化を促進させることによって、ループス腎炎またはリウマチ性関節炎を含む自己免疫疾患に対する予防及び治療効果を示すことができることを確認した。

また、前記組成物は、Ｓｍａｄ３タンパク質またはＳｍａｄ３転写調節ドメインタンパク質を有効成分として含むことができる。前記転写調節ドメインは、Ｓｍａｄ３の転写活性化において重要なドメイン（Ｓｍａｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ、ＭＨ１）であって、ＤＮＡ結合部位を含むことができる。すなわち、前記Ｓｍａｄタンパク質は、全体の完全なタンパク質ではない、前記転写調節ドメインだけでターゲット遺伝子のプロモーターに結合でき、同一の転写調節機能を行うことができる（図１及び図２）。

一実施例において、前記Ｓｍａｄ３タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列で構成され、前記Ｓｍａｄ３転写調節ドメインタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列で構成され得る。また、前記Ｓｍａｄ３タンパク質は、配列番号２の核酸配列によって暗号化され、前記Ｓｍａｄ３転写調節ドメインタンパク質は、配列番号４の核酸配列によって暗号化され得る。

本発明の他の態様によれば、Ｓｍａｄタンパク質またはＳｍａｄ転写調節ドメインタンパク質、及びタンパク質運搬ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）を含む自己免疫疾患予防または治療用融合タンパク質が提供される。

すなわち、前記融合タンパク質は、タンパク質運搬ドメインを含むので、Ｓｍａｄタンパク質またはＳｍａｄ転写調節ドメインタンパク質を核内に容易に伝達させることができ、転写調節効果が著しく改善され得る。

前記タンパク質運搬ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ、ＰＴＤ）は、疎水性が強い短いペプチドで一緒に融合されたタンパク質やＤＮＡ及びＲＮＡ等の生理活性分子を細胞内に効果的に伝達でき、多様な種類のタンパク質運搬ドメインが当該技術分野に知られている。前記タンパク質運搬ドメインは、細胞質だけでなく、核内にも生理活性分子を運搬できるため、前記Ｓｍａｄタンパク質を核内に効果的に伝達できる。

すなわち、細胞膜は、細胞内への大分子の流入を遮断でき、従来、多数の治療法において少なくとも１つの細胞膜の通過が必須に要求された。古典的な小分子（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）薬剤は、タンパク質機能を調節する能力を有する膜透過性分子の偶然な発見に基づく。すなわち、小分子は、優勢な治療学的パラダイムに維持されているにもかかわらず、合理的な薬物設計が困難であるため、ターゲットに対する特異性が充分でないか、副作用及び毒性を誘発できる。

一方、小分子より機能的特性が著しく優れたタンパク質等の大分子は、分子、細胞及び構造データを基盤とする合理的薬物設計によって製造され得るにもかかわらず、細胞膜に対する透過性が低い短所がある。

したがって、前記タンパク質医薬品は、前記タンパク質運搬ドメインと結合され、細胞膜を透過でき、細胞内にエフェクター分子を輸送できるタンパク質運搬ドメインは、カーゴ分子の細胞吸収を促進することによって、薬物の設計で活用度がさらに増加している。

前記タンパク質運搬ドメインは、配列によって両親媒性（極性及び非極性末端の両方を有するものを意味）または陽イオン性（純粋な正に荷電された原子を含有するか、これと関連したものを意味）に巨大分子に対する非−浸潤性伝達を可能にし、「トロヤン（Ｔｒｏｊａｎ）ペプチド」、「膜転位配列」または「細胞透過性タンパク質（ＣＰＰ）」と指称されることもできる。前記タンパク質運搬ドメインは、前記Ｓａｍｄタンパク質またはＳｍａｄ転写調節ドメインタンパク質が細胞膜を透過して伝達され得るようにするところ、ＮＦＡＴ、ＮＦ−κＢ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４及びＩＬ−１７Ａの転写抑制、炎症性サイトカインの分泌抑制及び炎症細胞の分化抑制効果が十分に具現され得る。

前記タンパク質運搬ドメインは、ＨＩＶ−１のＴＡＴタンパク質を細胞培養培地に添加すれば、前記タンパク質が細胞内に導入されることが発見され、最初に知られ（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．、１９８８、Ｆｒａｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．、１９８８）、その後、細胞膜を透過して細胞内に導入する能力を有するショウジョウ蝿のアンテナペディアホメオ転写因子（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ（Ａｎｔｐ）ｈｏｍｅｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ、Ｊｏｌｉｏｔ ｅｔ ａｌ．、１９９１）及び単純ヘルペスウイルス−１ ＤＮＡ結合タンパク質ＶＰ２２（ｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘ−ｖｉｒｕｓ−１ ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ＶＰ２２、Ｅｌｌｉｏｔ ｅｔ ａｌ．、１９９７）が明らかにされたことがある。今まで知られた多数のタンパク質運搬ドメインは、陽イオンを呈しており、陰イオンであるＤＮＡと相互作用して細胞内エンドサイトーシスを促進し、ＤＮＡを細胞内に伝達し、遺伝子の伝達効率を増加させるものと知られたことがあるが（Ｇｒａｔｔｏｎ Ｊ．Ｐ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．９（３）、３５７−３６２、２００３）、以外にも、改良された形態の多様なタンパク質運搬ドメインが開発されている。

一実施例において、前記タンパク質運搬ドメインは、Ｈｐｈ−１、Ｓｉｍ−２、Ｔａｔ、ＶＰ２２、Ａｎｔｐ（ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）、Ｐｅｐ−１（ｐｅｐｔｉｄｅ−１）、ＰＴＤ−５（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ−５）、７Ｒ、９Ｒ、１１Ｒ及びＣＴＰ（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅ）よりなる群から１つ以上選択され得るが、従来に広く知られているか、特定分子の細胞膜内の透過を促進できる限り、その種類が特に制限されない。

一実施例において、前記タンパク質運搬ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列で構成され得、配列番号６の核酸配列によって暗号化され得る。

また、前記融合タンパク質は、配列番号７または配列番号９のアミノ酸配列で構成され得、配列番号８または配列番号１０の核酸配列によって暗号化され得る。

本発明の他の態様によれば、前記融合タンパク質を有効成分として含む自己免疫疾患予防または治療用組成物が提供される。

すなわち、前記融合タンパク質は、前記タンパク質運搬ドメインと結合されているので、細胞膜に対する透過効果に優れており、核内に容易に導入され得るので、他の転写因子との相互作用を通じて多様な遺伝子の発現を効果的に調節できる。

特に、前記融合タンパク質は、Ｓｍａｄタンパク質またはその転写調節ドメインを含むので、ＮＦＡＴ、ＮＦ−κＢ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４及びＩＬ−１７Ａの転写または活性を抑制でき、炎症細胞であるＴｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ１７細胞の機能を制御して分化を抑制し、前記炎症細胞を調節するＴｒｅｇ細胞の機能を誘導して分化を促進させることによって、ループス腎炎またはリウマチ性関節炎を含む自己免疫疾患に対する予防及び治療効果を保有できる。

本発明の他の態様によれば、薬剤学的有効量のＳｍａｄ３−ＰＴＤコンジュゲート、Ｓｍａｄ３（ＭＨ１）−ＰＴＤコンジュゲート、またはその薬剤学的に許容可能な塩を有効成分として含有する自己免疫疾患予防または治療用薬剤学的組成物が提供される。

前記自己免疫疾患治療用薬剤学的組成物は、経口的伝達、非経口的伝達の形態で投与され得る。すなわち、前記自己免疫疾患治療用薬学組成物は、全身または局所投与でき、前記投与は、経口投与及び非経口投与を含むことができる。

前記自己免疫疾患治療用薬学組成物は、適切な投与形態を提供するように適合な量の薬学的に許容されるビヒクルまたは担体とともに剤形化され得る。したがって、前記自己免疫疾患治療用薬学組成物は、薬学組成物の製造に使用される担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含むことができる。

前記担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアガム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレートまたは鉱物油が挙げられるが、これに限定されるものではない。

また、前記組成物は、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾル等の経口型剤形、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液の形態で製剤化して使用できる。

前記経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等が含まれ、このような固形製剤は、前記Ｓｍａｄ３−ＰＴＤコンジュゲートまたはＳｍａｄ３（ＭＨ１）−ＰＴＤコンジュゲートと少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、カルシウムカーボネート、スクロース、ラクトース、またはゼラチン等を混合して調剤し得る。また、前記賦形剤以外に、マグネシウムスチレート、タルクのような潤滑剤が使用され得る。

前記経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤等が使用され得、単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に、さまざまな賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤等が含まれることができる。

前記非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が使用され得る。前記非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステルが使用され得る。前記坐剤の基剤としては、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリンジ、グリセロゼラチンが使用され得る。

本発明の他の態様によれば、前記融合タンパク質を暗号化する核酸配列を含む発現ベクターが提供される。

前記ベクターは、連結されている核酸断片を運搬するのに利用される核酸分子を意味する。前記ベクターは、バクテリア、プラスミド、ファージ、コスミド、エピゾーム、ウイルス及び挿入可能なＤＮＡ断片（すなわち、相同的組換えによって宿主細胞ゲノム内に挿入可能な断片）が使用され得るが、これに限定されない。前記プラスミドは、ベクターの一種であって、内部に追加的にＤＮＡ断片を連結させることができる環状の二重鎖ＤＮＡループを意味する。また、ウイルスベクターは、追加的なＤＮＡをウイルスゲノム内に連結させることができる。

前記発現ベクターは、作動可能に連結された目的タンパク質を暗号化する遺伝子の発現を指示できるベクターを意味する。一般的に、組換えＤＮＡ技術の使用において発現ベクターは、プラスミド形態であるため、用語「プラスミド」及び「ベクター」が相互交換的に使用され得る。しかし、ウイルスベクターのように同一の機能を行う他の形態の発現ベクターをも含むことができる。

例えば、前記発現ベクターは、ｐＥＴ−３ａ−ｄ、ｐＥＴ−９ａ−ｄ、ｐＥＴ−１１ａ−ｄ、ｐＥＴ−１２ａ−ｃ、ｐＥＴ−１４ｂ、ｐＥＴ−１５ｂ、ｐＥＴ−１６ｂ、ｐＥＴ−１７ｂ、ｐＥＴ−１７ｘｂ、ｐＥＴ−１９ｂ、ｐＥＴ−２０ｂ（＋）、ｐＥＴ−２１ａ−ｄ（＋）、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）、ｐＥＴ−２３ａ−ｄ（＋）、ｐＥＴ−２４ａ−ｄ（＋）、ｐＥＴ−２５ｂ（＋）、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）、ｐＥＴ−２７ｂ（＋）、ｐＥＴ−２８ａ−ｃ（＋）、ｐＥＴ−２９ａ−ｃ（＋）、ｐＥＴ−３０ａ−ｃ（＋）、ｐＥＴ−３０Ｅｋ／ＬＩＣ、ｐＥＴ−３０Ｘａ／ＬＩＣ、ｐＥＴ−３１ｂ（＋）、ｐＥＴ−３２ａ−ｃ（＋）、ｐＥＴ−３２Ｅｋ／ＬＩＣ、ｐＥＴ−３２Ｘａ／ＬＩＣ、ｐＥＴ−３３ｂ（＋）、ｐＥＴ−３４ｂ（＋）、ｐＥＴ−３５ｂ（＋）、ｐＥＴ−３６ｂ（＋）、ｐＥＴ−３７ｂ（＋）、ｐＥＴ−３８ｂ（＋）、ｐＥＴ−３９ｂ（＋）、ｐＥＴ−４０ｂ（＋）、ｐＥＴ−４１ａ−ｃ（＋）、ｐＥＴ−４１Ｅｋ／ＬＩＣ、ｐＥＴ−４２ａ−ｃ（＋）、ｐＥＴ−４３．１ａ−ｃ（＋）、ｐＥＴ−４３．１Ｅｋ／ＬＩＣ、ｐＥＴ−４４ａ−ｃ（＋）、ｐＲＳＥＴＡ、ｐＲＳＥＴＢ、ｐＲＳＥＴＣ、ｐＥＳＣ−ＨＩＳ、ｐＥＳＣ−ＬＥＵ、ｐＥＳＣ−ＴＲＰ、ｐＥＳＣ−ＵＲＡ、ＧａｔｅｗａｙｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２、ｐＡＯ８１５、ｐＧＡＰＺＡ、ｐＧＡＰＺＢ、ｐＧＡＰＺＣ、ｐＧＡＰαＡ、ｐＧＡＰαＢ、ｐＧＡＰαＣ、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ６Ａ、ｐＰＩＣ６Ｂ、ｐＰＩＣ６Ｃ、ｐＰＩＣ６αＡ、ｐＰＩＣ６αＢ、ｐＰＩＣ６αＣ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＹＣ２／ＣＴ、ｐＹＤ１ＹｅａｓｔＤｉｓｐｌａｙＶｅｃｔｏｒ、ｐＹＥＳ２、ｐＹＥＳ２／ＣＴ、ｐＹＥＳ２／ＮＴＡ、ｐＹＥＳ２／ＮＴＢ、ｐＹＥＳ２／ＮＴＣ、ｐＹＥＳ２／ＣＴ、ｐＹＥＳ２．１、ｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＦＬＤ１、ＰｉｃｈｉａＰｉｎｋＴＭ、ｐ４２７−ＴＥＦ、ｐ４１７−ＣＹＣ、ｐＧＡＬ−ＭＦ、ｐ４２７−ＴＥＦ、ｐ４１７−ＣＹＣ、ＰＴＥＦ−ＭＦ、ｐＢＹ０１１、ｐＳＧＰ４７、ｐＳＧＰ４６、ｐＳＧＰ３６、ｐＳＧＰ４０、ＺＭ５５２、ｐＡＧ３０３ＧＡＬ−ｃｃｄＢ、ｐＡＧ４１４ＧＡＬ−ｃｃｄＢ、ｐＡＳ４０４、ｐＢｒｉｄｇｅ、ｐＧＡＤ−ＧＨ、ｐＧＡＤＴ７、ｐＧＢＫＴ７、ｐＨＩＳ−２、ｐＯＢＤ２、ｐＲＳ４０８、ｐＲＳ４１０、ｐＲＳ４１８、ｐＲＳ４２０、ｐＲＳ４２８、ｙｅａｓｔｍｉｃｒｏｎＡｆｏｒｍ、ｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、ｐＲＳ４０６、ｐＹＪ４０３、ｐＹＪ４０４、ｐＹＪ４０５またはｐＹＪ４０６であることができるが、これに限定されるものではない。

一方、前記発現ベクターは、宿主細胞内に導入され、前記導入されたベクターによって形質転換された宿主細胞は、前記融合タンパク質を生産できる。この際、前記ベクターは、宿主生物体によって認知されるプロモーターを含むことができる。

前記プロモーターは、ＳＢＥ４、３ＴＰ、ＰＡＩ−１、ｐ１５、ｐ２１、ＣＡＧＡ１２、ｈＩＮＳ、Ａ３、ＮＦＡＴ、ＮＦＫＢ、ＡＰ１、ＩＦＮＧ、ＩＬ４、ＩＬ１７Ａ、ＩＬ１０、ＧＰＤ、ＴＥＦ、ＡＤＨ、ＣＹＣ、ＩＮＵ１、ＰＧＫ１、ＰＨＯ５、ＴＲＰ１、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＧＵＴ２、ｔａｃ、Ｔ７、Ｔ５、ｎｍｔ、ｆｂｐ１、ＡＯＸ１、ＡＯＸ２、ＭＯＸ１及びＦＭＤ１プロモーターよりなる群から選択され得るが、宿主細胞または発現条件等多様な変数を考慮して異にすることができる。

前記融合タンパク質を暗号化する核酸配列は、前記プロモーター配列と作動可能に連結され得る（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）。前記「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」は、１つの核酸断片が他の核酸断片と結合され、その機能または発現が他の核酸断片によって影響を受けることを意味する。すなわち、前記融合タンパク質を暗号化する遺伝子は、ベクター内にあるプロモーターと作動可能に連結され、発現が調節され得る。

一方、前記発現ベクターは、追加的な調節配列をさらに含むことができる。前記調節配列は、ファージＭＳ−２のレプリカーゼ遺伝子のシャイン・ダルガノ配列及びバクテリオファージラムダのｃＩＩのシャイン・ダルガノ配列であることができるが、これに限定されるものではない。

また、前記発現ベクターは、形質転換された宿主細胞を選別するのに必要な適切なマーカー遺伝子を含むことができる。前記マーカー遺伝子は、抗生剤抵抗性遺伝子または蛍光タンパク質遺伝子であることができ、前記抗生剤抵抗性遺伝子は、ヒグロマイシン抵抗性遺伝子、カナマイシン抵抗性遺伝子、クロラムフェニコール抵抗性遺伝子及びテトラサイクリン抵抗性遺伝子で構成された群から選択され得るが、これに限定されるものではない。前記蛍光タンパク質遺伝子は、酵母−強化緑色蛍光タンパク質（ｙｅａｓｔ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ｙＥＧＦＰ）遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＦＰ）遺伝子、青色蛍光タンパク質（ｂｌｕｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＦＰ）遺伝子、及び赤色蛍光タンパク質（ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎ ｔｐｒｏｔｅｉｎ；ＲＦＰ）遺伝子で構成された群から選択され得るが、これに限定されるものではない。

本発明の他の態様によれば、前記融合タンパク質を暗号化する外因性の核酸配列を過発現する組換え宿主細胞が提供され、前記発現ベクターによって形質転換された組換え宿主細胞が提供される。

前記宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）は、形質転換によって代謝操作され得る。前記宿主細胞は、発現ベクターによる形質転換が容易な細胞を指称するものであって、遺伝工学的方法によって形質転換され、特定の遺伝子を効率的に発現できれば、その種類は、特に制限されない。

一実施例において、前記宿主細胞は、微生物、動物細胞、植物細胞、動物から由来した培養細胞、または植物から由来した培養細胞であることができるが、これに限定されるものではない。前記適合な宿主細胞は、自然的に発生するかまたは野生型宿主細胞であることができ、または変化した宿主細胞であることができる。前記野生型宿主細胞（ｗｉｄｅ−ｔｙｐｅ ｈｏｓｔｃｅｌｌ）は、組換え方法によって遺伝的に変化されない宿主細胞であることができる。

前記「代謝操作された（ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」または「代謝操作（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」は、微生物でアルコールまたはタンパク質のような所望の代謝産物の生産のために、生合成遺伝子、オペロンと関連された遺伝子、及びこれら核酸配列の制御要素（ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）の合理的経路デザインとアセンブリーを伴うことができる。

前記「代謝操作された」は、遺伝子操作と適切な培養条件を利用した転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）、翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）、タンパク質安定性（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）とタンパク質機能性（ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）の調節と最適化による代謝流れ（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｆｌｕｘ）の最適化をさらに含むことができる。生合成遺伝子は、宿主に外来性であるか、突然変異誘発（ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）または内因性宿主細胞で異種発現制御配列との関連によって変形されることによって、宿主（例えば、微生物）に異種性であることができる。適切な培養条件は、培養培地ｐＨ、イオン強度、栄養含量等の条件、温度、酸素、二酸化炭素、窒素含量、湿度、及び前記微生物の物質代謝作用による化合物の生産を可能にするその他培養条件を含むことができる。宿主細胞として機能できる微生物に適合な培養条件は、当該技術分野に広く知られている。

したがって、前記「代謝操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」または「変形された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）」宿主細胞は、遺伝物質を選択された宿主または親微生物内に導入し、細胞生理と生化学を変形または変更することによって生産され得る。遺伝物質の導入を通じて、親微生物は、新しい性質、例えば、新しい細胞内の代謝産物またはさらに多い量の細胞内の代謝産物を生産する能力を獲得できる。

例えば、遺伝物質の親微生物内への導入は、化学物質を生産する新しいか、または変形された能力をもたらすことができる。親微生物に導入した遺伝物質は、化学物質生産のための生合成の経路に関与する１つ以上の酵素をコーディングする遺伝子または遺伝子の一部を含み、これら遺伝子の発現または発現調節のための追加構成要素、例えば、プロモーター配列を含むこともできる。

前記「変化された宿主細胞（ａｌｔｅｒｅｄ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」は、遺伝的に設計された宿主細胞を意味し、ここで目的タンパク質は、発現の水準に生成されるか、発現の水準よりさらに大きい水準に生成されるか、本質的に同一の成長条件の下で成長する未変化されたまたは野生型宿主細胞内での目的タンパク質の発現の水準より大きい発現の水準に発現され得る。「変形宿主細胞（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」は、目的タンパク質を暗号化する遺伝子を過発現するように遺伝的に設計される野生型または変化された宿主細胞を意味する。前記変形宿主細胞は、野生型または変化された母宿主細胞よりさらに高い水準に目的タンパク質を発現できる。

一方、前記「形質転換」は、前記ベクターを微生物内に運搬する方法を意味し、形質転換しようとする細胞が原核細胞である場合には、ＣａＣｌ_２方法（Ｃｏｈｅｎ、Ｓ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｃ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９：２１１０−２１１４（１９７３））、ハナハン方法（Ｃｏｈｅｎ、Ｓ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９：２１１０−２１１４（１９７３）；及びＨａｎａｈａｎ、Ｄ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６６：５５７−５８０（１９８３））及び電気穿孔方法（Ｄｏｗｅｒ、Ｗ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１６：６１２７−６１４５（１９８８））等によって実施され得る。

形質転換しようとする細胞が真核細胞である場合には、微細注入法（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｍ．Ｒ．、Ｃｅｌｌ、２２：４７９（１９８０））、カルシウムホスフェート沈降法（Ｇｒａｈａｍ、Ｆ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６（１９７３））、電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ、Ｅ．ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯＪ．、１：８４１（１９８２））、リポソーム−媒介形質感染法（Ｗｏｎｇ、Ｔ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ、１０：８７（１９８０））、ＤＥＡＥ−デキストラン処理法（Ｇｏｐａｌ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：１１８８−１１９０（１９８５））、及び遺伝子銃（bombardment）（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８７：９５６８−９５７２（１９９０））等を利用して実施できるが、これに限定されるものではない。

酵母のような真菌の形質転換の場合には、一般的にリチウムアセテート（Ｌｉｔｈｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ、Ｒ．Ｄ．Ｇｉｅｔｚ、Ｙｅａｓｔ １１、３５５３６０（１９９５））及び熱衝撃（Ｋｅｉｓｕｋｅ Ｍａｔｓｕｕｒａ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｖｏｌ．１００、５；５３８−５４４（２００５））を利用した形質転換法と電気穿孔法（Ｎｉｎａ ＳｋｏｌｕｃｋａＡｓｉａｎ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ、９４−９８（２０１１））によって実施され得るが、これに限定されるものではない。

本発明の他の態様によれば、前記発現ベクターで宿主細胞を形質転換する段階と；前記宿主細胞を培養し、前記融合タンパク質を発現させる段階と；を含む融合タンパク質の製造方法が提供される。

前記形質転換された宿主細胞は、バッチ、フェドバッチまたは連続発酵条件の下で培養され得、前記宿主細胞は、形質転換によって前記融合タンパク質を発現できるので、前記培養された宿主細胞から前記融合タンパク質を収得できる。

この際、古典的なバッチ発酵方法は、閉鎖的なシステムを使用でき、前記培養媒質は、発酵が実行される前に製造され、前記媒質に有機体を接種し、前記媒質にどんな成分の添加もなしに発酵が起きることができる。特定の場合で、成長媒質の前記炭素源内容物ではない、前記ｐＨ及び酸素含量は、バッチ方法の中に変化し得る。バッチシステムの前記代謝物及び細胞バイオマスは、絶えず発酵が停止するまで変化し得る。バッチシステムで、細胞は、停止された遅延期から高度成長の対数期にわたって進行し、成長率が減少するか、停止した最終的に静止期に至ることができる。一般的な期間で、対数期の前記細胞は、大部分のタンパク質を作ることができる。

標準バッチシステムの変形は、「フェドバッチ発酵」システムである。前記システムで、栄養（例えば、炭素源、窒素源、Ｏ_２、及び通常的に、他の栄養）は、これらの培養物の濃度が限界値未満に低下するときに添加され得る。フェドバッチシステムは、異化生成物の抑制が細胞の代謝を抑制し、媒質が媒質内で栄養素を制限された量で有することが好ましいとき、有用であることができる、フェドバッチシステムにおいての実際栄養濃度の測定は、ｐＨ、溶存酸素及びＣＯ_２のような廃ガスの部分圧のような測定可能な因子の変化に基づいて予測され得る。バッチ及びフェドバッチ発酵は、一般的なシステムとして当業界に広く知られている。

継続的発酵は、定義された培養媒質が続いて生反応器（ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）に添加され、条件化された媒質の同一の量が過程中に同時に除去される開放システムである。継続的発酵は、一般的に細胞が初めには対数期の成長にある一定の高密度の培養物を維持できる。継続的発酵は、細胞成長または最後の生成物濃度に影響を及ぼす１つの因子または任意の数の因子の操作が可能である。

例えば、炭素源または窒素源のような制限栄養素は、固定された速度で、すべての他のパラメーターは、適当に維持され得る。他のシステムで、多くの成長に影響を与える因子は、培地濁度によって測定される細胞濃度が一定に維持される間に、続いて変化できる。継続的システムは、一定の状態の成長条件を維持しようとする。したがって、媒質が抜け出ることによる細胞損失は、発酵での細胞成長速度に対抗して均衡が取られることができる。生成物形成の速度を最大化する技術だけでなく、継続的発酵過程中に栄養素及び成長因子を維持する方法は、当業界系に知られている。

本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明の記載内容に基づいて各構成の種類、導入比率等を変化させて適用でき、前記変形にもかかわらず、同等な技術的効果が具現される場合であれば、本発明の技術的思想に包括されると言える。

以下、実施例を通じて、本発明をさらに詳述するが、下記実施例によって本発明が制限されないことは自明である。

実験例１：Ｓｍａｄ３（ＭＨ１）ドメインの転写活性役目確認
Ｓｍａｄ３（ＭＨ１）ドメインがＳｍａｄ３の転写活性化において重要な役目を行うかを確認するために、Ｓｍａｄ３がノックダウン（ｋｎｏｃｋ−ｄｏｗｎ）されたＳＮＵ−４８４細胞にＳＢＥ４（Ｓｍａｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ ４）ルシフェラーゼレポータープラスミドとＳｍａｄ２、Ｓｍａｄ２（ＭＨ１）、Ｓｍａｄ２（ＭＨ２）、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ３（ＭＨ１）、Ｓｍａｄ３（ＭＨ２）、及びＳｍａｄ３（ＭＨ１）の突然変異型遺伝子を一緒に形質注入し、ルシフェラーゼ活性を確認した。

また、ＳＮＵ−４８４細胞にＳＢＥ４ルシフェラーゼレポータープラスミドと組換え融合タンパク質であるｔＳｍａｄ２、ｔＳｍａｄ２（ＭＨ１）、ｔＳｍａｄ３、ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）、及び突然変異型ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）を処理し、ルシフェラーゼ活性を確認した。

その結果、Ｓｍａｄ２は、Ｓｍａｄ２（ＭＨ１）ドメイン内に３０個のアミノ酸がＤＮＡ結合β−ヘアピン（ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ β−ｈａｉｒｐｉｎ）のまっすぐ前方に位置し、Ｓｍａｄ２が目的する遺伝子に結合しないように妨害する構造を有するので、ＳＢＥ４ルシフェラーゼの活性には影響を及ぼさないが、Ｓｍａｄ３（ＭＨ１）ドメインは、Ｓｍａｄ３の転写活性機能を充分に行った（図１及び図２）。

実験例２：Ｓｍａｄの転写調節ドメインとタンパク質運搬ドメインを含む組換え融合タンパク質の製造
タンパク質運搬ドメイン（ＰＴＤ）であるＨｐｈ−１（配列番号６）をＳｍａｄ３（配列番号２）の転写調節ドメインであるＳｍａｄ３（ＭＨ１）（配列番号４）とｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングし、組換え融合ＤＮＡであるｔＳｍａｄ３（配列番号８）及びｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）（配列番号１０）を製作した。前記組換え融合ＤＮＡをＢＬ２１ ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＰＬ大腸菌菌週（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）に形質転換させた。前記形質転換菌株を培養した後、１ｍＭ ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、Ｄｕｃｈｅｆａ）を入れ、３７℃で５時間タンパク質の発現を誘導した。その後、細胞を分離し、分解用緩衝液（１０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ及びｐＨ８．０）に溶解させた後、粉砕器で細胞を分解した。融合タンパク質は、タンパク質の前方部分に人為的に結合させておいた６個のヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）を利用してＮｉ−ＮＴＡビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）と結合させた。

カラム（ＨｉｓＴｒａｐ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｃｏｌｕｍｎｓ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にタンパク質を投入し、洗浄用緩衝液（３０ｍＭイミダゾール、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ及びｐＨ８．０）で充分に洗浄し、溶出用緩衝液（２５０ｍＭ イミダゾール、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ及びｐＨ８．０）でタンパク質を分離した。

ＰＤ−１０ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を利用して緩衝液を１０％グリセロールＰＢＳで置換し、イミダゾールとＮａＣｌを除去した。ＳＰビーズ（ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ^ＴＭ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を利用して収得されたタンパク質に存在するＬＰＳのようなエンドトキシンを除去した。

これをさらに結合用緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）で結合させた後、カラムに入れ、溶出用緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）でタンパク質を分離した。最後に、ＰＤ−１０ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５を通じてＮａＣｌを除去し、緩衝液を１０％グリセロールＰＢＳで置換した後、最終的に収得されたタンパク質（配列目録第５配列、組換え融合タンパク質）は、実験前まで−８０℃で保管した（図２、図３ａ及び図３ｂ）。

実験例３：ｔＳｍａｄ３及びｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）組換え融合タンパク質の細胞内伝達確認
３−１．ウェスタンブロットを利用して細胞内伝達確認
Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を利用して実験例２のｔＳｍａｄ３及びｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）を濃度別（０、０．１、０．５、１、２及び５μＭ）または時間別（０、１、２、４、６、１２、２４及び４８ｈ）に組換え融合タンパク質とともに培養し、ウェスタンブロットでタンパク質伝達可否を確認した。

その結果、ｔＳｍａｄ３及びｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）組換え融合タンパク質は、濃度に比例して伝達され、４８時間経過後にも、細胞培養液内でタンパク質の構造が変わらずに持続的に伝達された（図３ｃ及び図３ｄ）。

３−２．抗体を利用して細胞の核まで伝達されるか否かを確認
前記ｔＳｍａｄ３及びｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）組換え融合タンパク質５μＭを１時間ＨｅＬａ細胞とともに培養し、ＰＢＳで洗浄した後、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を利用して細胞に間隙を形成した。前記間隙を通じて蛍光標識抗体を前記組換え融合タンパク質に結合させた。ＤＡＰＩ染色剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用して細胞の核を染色した後、蛍光顕微鏡を通じて蛍光の位置を確認し、組換え融合タンパク質が伝達された位置を確認した。

その結果、ｔＳｍａｄ３及びｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）組換え融合タンパク質は、核内に効果的に伝達された（図３ｅ）。

実験例４：ｔＳｍａｄ３及びｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）組換え融合タンパク質の細胞毒性確認
大腸菌菌株から発現して得たタンパク質でＬＰＳが完全に除去され、細胞毒性が現われないか確認するために細胞毒性テストを行った。ネズミの脾臓細胞に多様な濃度のタンパク質を伝達した後、生きている細胞に存在するデヒドロゲナーゼによって発色する基質であるＷＳＴ−８を入れ、培養した。

その結果、ｔＳｍａｄ３及びｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）組換え融合タンパク質の濃度と関系なく、タンパク質を処理しない細胞と比較して全然毒性が現われなかった（図４）。

実験例５：ｔＳｍａｄ３及びｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）組換え融合タンパク質の転写調節及び未成熟Ｔ細胞のＴＨ細胞への分化調節効果確認
５−１．脾臓細胞でＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１０の生成調節
６〜８週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６ネズミの脾臓から脾臓細胞を分離し、前記ｔＳｍａｄ３またはｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）を１時間処理し、組換え融合タンパク質を細胞内に伝達した。前記細胞を抗−ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及び抗−ＣＤ２８（１μｇ／ｍｌ、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で刺激した後、７２時間培養した。その後、培養液に存在するサイトカインの量をＥＬＩＳＡを利用して測定した。

その結果、ｔＳｍａｄ３またはｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）を処理した場合、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１０発現量が調節された（図３ｆ及び図５）。また、Ｔ細胞活性化の指標となるＣＤ６９の発現量をＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を利用して確認した結果、ｔＳｍａｄ３またはｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）は、Ｔ細胞でのＣＤ６９の発現には影響を及ぼさなかった（図３ｇ）。

５−２．細胞内信号伝達タンパク質のリン酸化
前記ｔＳｍａｄ３及びｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）融合タンパク質が細胞内多様な信号伝達体系と関連したタンパク質のチロシンリン酸化に関与するかを確認するために、ウェスタンブロットを利用した。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞にｔＳｍａｄ３及びｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）をそれぞれ２μＭを１時間処理した後、抗−ＣＤ３（２．５μｇ／ｍｌ）及び抗−ＣＤ２８（２．５μｇ／ｍｌ）で刺激を与え、ＺＡＰ−７０、ｐ３８、ＪＮＫ及びＥＲＫのチロシンリン酸化可否を観察した。

その結果、ｔＳｍａｄ３及びｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）は、これらのリン酸化には影響を及ぼさなかった（図３ｈ）。
５−３．ＪｕｒｋａｔＴ細胞でのＮＦＡＴ及びＮＦ−κＢ転写因子の抑制効果確認
前記ｔＳｍａｄ３及びｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）融合タンパク質が抗−ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）及び抗−ＣＤ２８（１μｇ／ｍｌ）で刺激されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞活性化によって活性化されたＮＦＡＴ及びＮＦ−κＢの転写を抑制するかを確認した。Ｔ細胞が活性化されれば、ＮＦＡＴ及びＮＦ−κＢの転写が活性化され、下位の遺伝子であるＩＬ−２が活性化されるため、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を利用した。まず、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞に下位にルシフェラーゼを有するＮＦＡＴ及びＮＦ−κＢレポータープラスミドを電気穿孔法（ｅｌｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を利用して核内に注入し、抗−ＣＤ３及び抗−ＣＤ２８で刺激されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞にｔＳｍａｄ３及びｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）組換え融合タンパク質を処理した。

その結果、ｔＳｍａｄ３及びｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）組換え融合タンパク質を処理した場合、ＮＦＡＴ及びＮＦ−κＢの転写活性が効果的に抑制された（図３ｉ及び図３ｊ）。

５−４．ｔＳｍａｄ３及びｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）組換え融合タンパク質の転写調節効果確認
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に下位にルシフェラーゼを有するＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１７Ａ、及びＩＬ−１０レポータープラスミドと野生型Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ３、ＲＯＲγｔ、及びＦｏｘｐ３遺伝子を核内に注入した後、前記ｔＳｍａｄ３またはｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）融合タンパク質を処理した。

その結果、ｔＳｍａｄ３及びｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）組換え融合タンパク質は、それぞれの転写活性を効果的に調節した（図６ａ−ｄ）。

５−５．未成熟Ｔ細胞のＴＨ細胞への分化調節効果確認
６〜８週年齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６ネズミの脾臓から脾臓細胞を分離した後、ＭＡＣＳ（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）を利用してどんな抗原にも露出しない状態であるＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ６２Ｌ＋未成熟ＣＤ４ Ｔ細胞を分離した。未成熟ＣＤ４ Ｔ細胞に前記ｔＳｍａｄ３またはｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）を濃度別に１時間処理した後、抗−ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）及び抗−ＣＤ２８（１μｇ／ｍｌ）で刺激し、各ＴＨ細胞に分化できるサイトカインを一緒に入れ、７２時間培養した。

Ｔｈ１細胞に分化させるためにＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ）及び抗−ＩＬ−４（５μｇ／ｍｌ）を添加し、Ｔｈ２細胞に分化させるために、ＩＬ−４（４０ｎｇ／ｍｌ）及び抗−ＩＦＮ−γ（５μｇ／ｍｌ）を添加し、Ｔｈ１７細胞に分化させるために、ＴＧＦ−β１（５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（３０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−２１（１００ｎｇ／ｍｌ）、抗−ＩＬ−４（５μｇ／ｍｌ）、及び抗−ＩＦＮ−γ（５μｇ／ｍｌ）を添加し、Ｔｒｅｇ細胞に分化させるために、ＴＧＦ−β１（５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）、抗−ＩＬ−４（５μｇ／ｍｌ）、及び抗−ＩＦＮ−γ（５μｇ／ｍｌ）を添加した。７２時間経過後、培養液に存在するサイトカインの量をＥＬＩＳＡを利用して測定した。

その結果、Ｔｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ１７細胞の代表的なサイトカインであるＩＦＮ−γ、ＩＬ−１３、及びＩＬ−１７Ａの発現量が著しく抑制され、一方、Ｔｒｅｇ細胞の代表的なサイトカインであるＩＬ−１０の発現量は、著しく増加した。前記結果から、ｔＳｍａｄ３またはｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）融合タンパク質が炎症細胞であるＴｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ１７細胞の機能を制御し、このような炎症細胞を調節するＴｒｅｇ細胞の機能を誘導できることが確認された（図６ｅ〜図６ｈ）。

実験例６：ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）組換え融合タンパク質の生体内伝達効果確認
前記ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）融合タンパク質が脾臓、リンパ節、胸腺、及び腎臓組織にあるＣＤ４＋Ｔ細胞に伝達する効果を確認するために、ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）をＣ５７ＢＬ／６ネズミの腹腔に２００μｇ／ｍｏｕｓｅの濃度で注射し、４８時間後に各組織から分離したＣＤ４＋Ｔ細胞に伝達されたｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）をフローサイトメトリー、蛍光顕微鏡及び組織学的分析を通じて確認した。
その結果、ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）は、脾臓、リンパ節、胸腺、及び腎臓組織にあるＣＤ４＋Ｔ細胞に効果的に伝達された（図７及び図８）。

実験例７：ループス腎炎動物モデルでのｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）組換え融合タンパク質の予防及び治療効果確認
７−１．ループス腎炎動物モデルでの蛋白尿及び生存率測定
前記ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）融合タンパク質のループス腎炎動物モデルでの予防及び治療効果を確認するために、遺伝子操作された（ＮＺＢ／ＮＺＷ）Ｆ１雌性ネズミを使用して行った。

ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）の自己免疫疾患予防効果を確認するためのループス腎炎動物モデルでは、ループス腎炎にかかったネズミが１３週になったときから３０週まで、治療効果を確認するためのループス腎炎動物モデルでは、ループス腎炎にかかったネズミが２３週になったときから３０週まで１週間に３回ずつ各々Ｓｏｌｕ−Ｍｅｄｒｏｌ（７ｍｇ／ｋｇ）、ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）−Ｈｉｇｈ（２００μｇ／ｍｏｕｓｅ）またはｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）−Ｌｏｗ（５０μｇ／ｍｏｕｓｅ）濃度で腹腔注射し、蛋白尿と生存率を測定した。

蛋白尿は、実験期間中に１週間に２回測定し、下記点数によって定量化した。
（０：なし、１＋：≦１００ｍｇ／ｄＬ、２＋：≦３００ｍｇ／ｄＬ、３＋：≦１，０００ｍｇ／ｄＬ、４＋：１，０００ｍｇ／ｄＬ．）
その結果、ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）組換え融合タンパク質は、対照群と比較したとき、蛋白尿の改善に対する肯定的な効果が顕著し、実験期間中にｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）が投与されたネズミが死んだ事例も発見されなかった（図９ａ、図９ｂ、図１０ａ及び図１０ｂ）。

７−２．ループス腎炎動物モデルでの組織病理学的測定
ループス腎炎がかかったネズミの腎臓で前記ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）融合タンパク質の組織学的評価のために３０週齢のネズミを犠牲させた後、腎臓を４％パラホルムアルデヒド溶液で固定させ、パラフィンに包埋した後、ＰＡＳ（ｐｅｒｉｏｄｉｃ ａｃｉｄ−Ｓｃｈｉｆｆ）染色を通じて糸球体腎炎を確認した。組織病理学的測定は、２人の病理学者によって測定され、下記点数によって定量化した。
（０：染色されない、１：弱い染色、２：普通染色、３：強い染色）
その結果、ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）を処理したグループと対照群グループを比較したとき、糸球体損傷及び管損傷の程度が改善され、血管損傷が現われなかった（図９ｃ及び図１０ｃ）。

７−３．ループス腎炎動物モデルでの免疫蛍光染色
ループス腎炎は、糸球体免疫沈着の形成が腎臓の病因に重要な役目をするため、前記ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）融合タンパク質によって糸球体免疫沈着の形成が抑制されるかどうかを確認するために、共焦点顕微鏡を利用して確認した。免疫蛍光染色測定は、２人の病理学者によって測定され、下記点数によって定量化した。
（０：染色されない、１：弱い染色、２：普通染色、３：強い染色）
その結果、対照群でのＩｇＧの沈着は、免疫蛍光によって検出され、糸球体腎炎が現われたが、ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）を処理したグループでは、ＩｇＧが少なく検出され、前記結果からｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）がＩｇＧの沈着を抑制し、免疫複合媒介性腎臓の機能が悪化しないようにすることを確認できた（図９ｄ及び図１０ｄ）。

７−４．ループス腎炎動物モデルでの血清内の炎症性サイトカイン分析
前記ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）融合タンパク質によって血清内の炎症性サイトカインの発現量が抑制されるかどうかを確認するためにＥＬＩＳＡを利用した。

その結果、ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）を処理したグループと対照群グループを比較したとき、炎症性サイトカインであるＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、及びＩＬ−１７の発現量が著しく抑制され、一方、ＩＬ−１０の発現量は、著しく増加された（図９ｅ及び図１０ｅ）。

７−５．ループス腎炎動物モデルでのＴ細胞の分析
前記ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）融合タンパク質によるループス腎炎動物モデルでのＴ細胞の変化を確認するために、フローサイトメトリーを利用して各グループのネズミから分離した脾臓細胞でのＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋、ＣＤ４＋ＩＬ−４＋、ＣＤ４＋ＩＬ−１７Ａ＋、及びＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞の発現量を分析した。

その結果、Ｔｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ１７細胞の発現量が著しく抑制されたが、Ｔｒｅｇ細胞の発現量は、著しく増加した。すなわち、ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）融合タンパク質は、炎症細胞であるＴｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ１７細胞の機能を制御する一方、炎症細胞を調節するＴｒｅｇ細胞の機能を誘導できることが確認された（図９ｆ、図９ｇ、図１０ｆ及び図１０ｇ）。

７−６．ループス腎炎動物モデルでの抗−ＤＮＡ及び自己抗体測定
前記ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）融合タンパク質の血清での抗−ＤＮＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３の自己抗体の生成に対する効果を調べるために、Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ ＭＡＰ Ｍｏｕｓｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ ｋｉｔを利用して確認した。

その結果、ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）を処理したグループと対照だねグループを比較したとき、抗−ＤＮＡの生産が抑制され、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３の発現が著しく減少された一方で、ＩｇＧ１の生産量は、著しい差異が現われなかった（図９ｈ及び図１０ｈ）。

実験例８：リウマチ性関節炎動物モデルでのｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）組換え融合タンパク質の予防及び治療効果確認
８−１．リウマチ性関節炎動物モデルでの関節炎重症度測定
リウマチ性関節炎動物モデルでのｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）組換え融合タンパク質の予防及び治療効果を確認するために７〜８週齢の雄性ＤＢＡ／１マウス（ＳＬＣ、Ｓｈｉｚｏｋａ、Ｊａｐａｎ）を利用した。ＣＦＡ（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｄ'ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ）と牛（ｂｏｖｉｎｅ）のｔｙｐｅ ＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎを１：１の質量比で混合した抗原溶液２００μｇを真皮内に注射した。２週後、同一の方法及び容量で再注射した。

ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）の予防効果を確認するためのリウマチ性関節炎動物モデルでは、ネズミの年齢を基準として８週（処理時点０週）目に一番目のタイプ２のコラーゲン抗原を注射し、１０週（処理時点２週）目に、二番目のコラーゲン抗原を再注射し、８週（処理時点０週）目からｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）を投与し始め、１５週（処理時点７週）目まで７週間治療した。

治療効果を確認するためのリウマチ性関節炎動物モデルでネズミの年齢を基準として８週（処理時点０週）目に一番目のタイプ２のコラーゲン抗原を注射し、１０週（処理時点２週）目、二番目のコラーゲン抗原を再注射し、関節炎の誘発が確認された１２週（処理時点４週）目からｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）を投与し始め、１６週（処理時点８週）目まで４週間治療した。１週間に３回ずつ負の対照群と正の対照群は、生理食塩水を腹腔注射し、処理群は、それぞれメトトレキサート（ＭＴＸ、３５ｍｇ／ｋｇ）、ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）−Ｈｉｇｈ（２００μｇ／ｍｏｕｓｅ）、ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）−Ｌｏｗ（５０μｇ／ｍｏｕｓｅ）または突然変異型ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）（２００μｇ／ｍｏｕｓｅ）を腹腔注射し、関節炎の重症度を測定した。

関節炎の重症度は、実験期間中に１週間に２回目視で足の発赤と浮腫及び奇形の発生有無を観察し、各時期別に関節炎重症度を測定し、下記点数によって定量化した。
（０：負の対照群を基準として正常の場合、１：足の中心部や足指、足首、膝関節のうち１つの部位に軽度の炎症所見（発赤、浮腫）がある場合、２：複数の部位に重症度の関節炎が発生した場合、３：足全体を侵犯する重症の炎症が観察される場合、４：Ｓｃｏｒｅ ３の炎症によって結果的に強直（ａｎｋｙｌｏｓｉｓ）や関節動きの消失が誘発された状態）
その結果、ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）を処理したグループと対照群グループを比較したとき、何も処理しない対照群は、浮腫と発赤のような明確な関節炎の症状を示した一方で、ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）を腹腔注射して投与したとき、関節炎重症度及び足の厚さが投与量に比例して減少した（図１１ａ、図１１ｂ及び図１２ａ）。

８−２．リウマチ性関節炎動物モデルでの組織病理学的測定
前記ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）融合タンパク質の治療効果を検証するために、リウマチ性関節炎にかかったネズミの滑膜及び関節周囲組織での炎症細胞の浸透、滑膜細胞の過多形成及び部分的な骨の損傷程度を分析した。

このためにネズミを犠牲させた後、関節組織は、中性のホルマリン緩衝溶液で固定し、蟻酸（ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ）で脱石灰化過程を経た後、パラフィンに固定し、Ｈ＆Ｅ染色を行った。また、リウマチ性関節炎の病態生理に関与する炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、及びＩＬ−６と関節の損傷及び変形程度を確認するために免疫化学染色を行った。組織病理学的測定は、２人の病理学者によって測定され、下記点数によって定量化した。
（０：染色されない、１：弱い染色、２：普通染色、３：強い染色）
関節炎部位に組織学的染色を実施した結果、対照群グループは、炎症細胞の浸透、滑膜細胞の過多形成、及び部分的な骨の損傷が観察されたが、ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）を投与したときは、病理学的変化が顕著に減少した（図１２ｂ及び図１２ｃ）。

８−３．リウマチ性関節炎動物モデルでの脾臓細胞及び血清内の炎症性サイトカイン分析
前記ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）融合タンパク質によってネズミの脾臓から分離した脾臓細胞及び血清内の炎症性サイトカインの発現量が抑制されるかどうかを確認するためにＥＬＩＳＡを利用した。

その結果、ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）を処理したグループと対照群グループを比較したとき、炎症性サイトカインであるＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、及びＩＬ−１７の発現量が著しく抑制された一方で、ＩＬ−１０の発現量は著しく増加した（図１１ｃ、図１１ｄ、図１１ｅ及び図１２ｄ）。

８−４．リウマチ性関節炎動物モデルでのＴ細胞の分析
リウマチ性関節炎動物モデルで前記ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）融合タンパク質によるＴ細胞の変化を確認するために、フローサイトメトリーを利用して各グループのネズミから分離した脾臓細胞でのＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋、ＣＤ４＋ＩＬ−４＋、ＣＤ４＋ＩＬ−１７Ａ＋、及びＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞の発現量を分析した。

その結果、Ｔｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ１７細胞の発現が著しく抑制された一方で、Ｔｒｅｇ細胞の発現は著しく増加された。すなわち、ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）融合タンパク質は、炎症細胞であるＴｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ１７細胞の機能は制御し、炎症細胞を調節するＴｒｅｇ細胞の機能を誘導するものと確認された（図１２ｅ及び図１２ｆ）。

実験例９：ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）組換え融合タンパク質の皮膚組織での局所投与による伝達効果確認
実験例１のｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）組換え融合タンパク質をネズミの皮膚組織に局所投与し、浸透されるかどうかを確認するために、ネズミの背中の皮膚に局所的に３０分間ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）を処理した後、６時間、１２時間、２４時間、及び４８時間が経過した後、共焦点顕微鏡を利用して観察した。

その結果、ｔＳｍａｄ３（ＭＨ１）融合タンパク質は、時間が経過するにつれて、皮膚の表皮層を通過して真皮層まで効果的に伝達された（図１３）。

実験例１０：組換え融合タンパク質の急性毒性実験
大韓実験動物センターから供給された６週齢の特定病原体不在（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ、ＳＰＦ）ＳＤ系ラットを使用して急性毒性実験を実施した。
各グループ当たり２匹ずつの動物に実験例２の融合タンパク質を１ｇ／ｋｇの容量で１回経口投与した後、動物の斃死可否、臨床症状及び体重変化を観察し、血液学的検査と血液生化学的検査を実施し、剖検し、目視で腹腔臓器と胸腔臓器の異常可否を観察した。

その結果、実験物質を投与したすべての動物で特異な臨床症状を有するか、斃死された動物はなく、体重変化、血液検査、血液生化学検査及び剖検所見等でも、毒性変化は観察されなかった。したがって、本発明の実験例１の組換え融合タンパク質は、ラットでそれぞれ１ｇ／ｋｇまでも毒性を示さなく、経口投与最小致死量（ＬＤ５０）が１ｇ／ｋｇ以上の安全な物質として確認された。

実験例１１：タンパク質運搬ドメイン置換による自己免疫疾患治療効果確認
実験例２で使用されたタンパク質運搬ドメインＨｐｈ−１（配列番号６）をＳｉｍ−２（ＡＫＡＡＲＱＡＡＲ）、Ｔａｔ（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）、ＶＰ２２（ＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＥＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＲＲＰＶＤ）、Ａｎｔｐ（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）、Ｐｅｐ−１（ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ）、ＰＴＤ−５（ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ）、７Ｒ（ＲＲＲＲＲＲＲ）、９Ｒ（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ）、１１Ｒ（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲＲ）及びＣＴＰ（ＹＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ）で置換し、実験例３、実験例５、実験例６、実験例７、実験例８の実験を繰り返した。

実験結果、前記Ｓｍａｄ３タンパク質またはＳｍａｄ転写調節ドメインタンパク質は、Ｈｐｈ−１と融合された場合と同一に細胞内に効果的に伝達され、転写調節効果及び未成熟Ｔ細胞に対する分化調節効果が同一に具現された。

さらに、動物モデルでの疾病改善効果も同一に確認されたので、前記Ｓｍａｄ３タンパク質またはＳｍａｄ３転写調節ドメインタンパク質は、タンパク質運搬ドメインの種類と関係なく、自己免疫疾患に対する治療効果を保有できる。

前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須な特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形が可能であることを理解できる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的でないものと理解しなければならない。例えば、単一型に説明されている各構成要素は、分散して実施されてもよく、同様に分散したものと説明されている構成要素も結合された形態で実施され得る。

本発明の範囲は、後述する特許請求範囲によって示され、特許請求範囲の意味及び範囲そしてその均等概念から導出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。

Claims (25)

1. Ｓｍａｄタンパク質またはＳｍａｄ転写調節ドメイン（Ｓｍａｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）タンパク質を有効成分として含む自己免疫疾患予防または治療用組成物。
2. 前記Ｓｍａｄタンパク質は、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ４、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ６、Ｓｍａｄ７及びＳｍａｄ８よりなる群から１つ以上選択される、請求項１に記載の組成物。
3. Ｓｍａｄ３タンパク質またはＳｍａｄ３転写調節ドメインタンパク質を有効成分として含む、請求項２に記載の組成物。
4. 前記Ｓｍａｄ３タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列で構成され、前記Ｓｍａｄ３転写調節ドメインタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列で構成される、請求項３に記載の組成物。
5. 前記Ｓｍａｄ３タンパク質は、配列番号２の核酸配列によって暗号化され、前記Ｓｍａｄ３転写調節ドメインタンパク質は、配列番号４の核酸配列によって暗号化される、請求項３に記載の組成物。
6. 前記自己免疫疾患は、全身性紅斑性ループス、リウマチ性関節炎、敗血症性ショック、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、潰瘍性大腸炎、涙腺炎、アルツハイモ疾患、脳卒中、動脈硬化症、血管再狭窄、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、ダムマジン、結膜炎、乾癬、全身性炎症反応症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性多発関節炎、混合結合組織症、シェーグレン症候群、通風、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、糖尿性網膜症、多発性硬化症、クローン病、慢性甲状腺炎、セリアック病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、ウイルス疾患、細菌性疾患、放射線による障害、動脈硬化、血管腫、血管線維腫、再灌流傷害及び心臓肥大症よりなる群から１つ以上選択される、請求項１に記載の組成物。
7. Ｓｍａｄタンパク質またはＳｍａｄ転写調節ドメインタンパク質と、
   タンパク質運搬ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）とを含む、自己免疫疾患予防または治療用融合タンパク質。
8. 前記Ｓｍａｄタンパク質は、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、Ｓｍａｄ４、Ｓｍａｄ５、Ｓｍａｄ６、Ｓｍａｄ７及びＳｍａｄ８よりなる群から１つ以上選択される、請求項７に記載の融合タンパク質。
9. Ｓｍａｄ３タンパク質またはＳｍａｄ３転写調節ドメインタンパク質と、
   タンパク質運搬ドメインとを含む、請求項８に記載の融合タンパク質。
10. 前記Ｓｍａｄ３タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列で構成され、前記Ｓｍａｄ３転写調節ドメインタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列で構成される、請求項９に記載の融合タンパク質。
11. 前記Ｓｍａｄ３タンパク質は、配列番号２の核酸配列によって暗号化され、前記Ｓｍａｄ３転写調節ドメインタンパク質は、配列番号４の核酸配列によって暗号化される、請求項９に記載の融合タンパク質。
12. 前記タンパク質運搬ドメインは、Ｈｐｈ−１、Ｓｉｍ−２、Ｔａｔ、ＶＰ２２、Ａｎｔｐ（ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）、Ｐｅｐ−１（ｐｅｐｔｉｄｅ−１）、ＰＴＤ−５（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ−５）、７Ｒ、９Ｒ、１１Ｒ及びＣＴＰ（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐｅｐｔｉｄｅ）よりなる群から１つ以上選択される、請求項７に記載の融合タンパク質。
13. 前記タンパク質運搬ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列で構成される、請求項７に記載の融合タンパク質。
14. 前記タンパク質運搬ドメインは、配列番号６の核酸配列によって暗号化される、請求項７に記載の融合タンパク質。
15. 配列番号７または配列番号９のアミノ酸配列で構成される、請求項７に記載の融合タンパク質。
16. 配列番号８または配列番号１０の核酸配列によって暗号化される、請求項７に記載の融合タンパク質。
17. 前記自己免疫疾患は、全身性紅斑性ループス、リウマチ性関節炎、敗血症性ショック、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、潰瘍性大腸炎、涙腺炎、アルツハイモ疾患、脳卒中、動脈硬化症、血管再狭窄、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、ダムマジン、結膜炎、乾癬、全身性炎症反応症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性多発関節炎、混合結合組織症、シェーグレン症候群、通風、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、糖尿性網膜症、多発性硬化症、クローン病、慢性甲状腺炎、セリアック病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、ウイルス疾患、細菌性疾患、放射線による障害、動脈硬化、血管腫、血管線維腫、再灌流傷害及び心臓肥大症よりなる群から１つ以上選択される、請求項７〜１６のいずれかに記載の融合タンパク質。
18. 請求項７〜１６のいずれかに記載の融合タンパク質を有効成分として含む、自己免疫疾患予防または治療用組成物。
19. 薬剤学的有効量のＳｍａｄ３−ＰＴＤコンジュゲート、Ｓｍａｄ３（ＭＨ１）−ＰＴＤコンジュゲート、またはその薬剤学的に許容可能な塩を有効成分として含有する自己免疫疾患予防または治療用薬剤学的組成物。
20. 請求項７〜１６のいずれかに記載の融合タンパク質を暗号化する核酸配列を含む発現ベクター。
21. 請求項７〜１６のいずれかに記載の融合タンパク質を暗号化する外因性の核酸配列を過発現する組換え宿主細胞。
22. 請求項２０に記載の発現ベクターによって形質転換された宿主細胞。
23. 微生物、動物細胞、植物細胞、動物から由来した培養細胞、または植物から由来した培養細胞である、請求項２１に記載の宿主細胞。
24. 微生物、動物細胞、植物細胞、動物から由来した培養細胞、または植物から由来した培養細胞である、請求項２２に記載の宿主細胞。
25. 請求項２０に記載の発現ベクターで宿主細胞を形質転換する段階と；
    前記宿主細胞を培養し、前記融合タンパク質を発現させる段階と；を含む融合タンパク質の製造方法。