KR101490586B1 - Ｒｃａｎ３을 활성화시키는 항산화제의 신규 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Rcan3를 활성화시키는 항산화제의 신규 용도에 관한 것으로, 자세하게는 Rcan3 유전자 발현을 증가시키는 활성을 갖는 항산화제; 항산화제를 세포에 처리하는 단계를 포함하는 Rcan3 유전자 발현을 증가시키는 방법; 및 Rcan3 단백질을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 항산화제는 Rcan3의 유전자 발현을 효과적으로 증대시킬 수 있는 신규 용도를 가지므로, 이를 이용하여 Rcan3 단백질을 용이하게 증폭시킬 수 있고, 이렇게 증폭된 Rcan3 단백질은 칼시뉴린 경로를 억제할 수 있어 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있는 면역 억제제로서 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 상기 Rcan3 단백질은 천연 단백질로서 독성 및 부작용도 없어 장기간 안심하고 사용할 수 있으며, 체내에 대해 안정한 효과가 있다.

Description

Ｒｃａｎ３을 활성화시키는 항산화제의 신규 용도{Novel Use of antioxidant for enhancing Rcan3 activity}

본 발명은 Rcan3을 활성화시키는 항산화제의 신규 용도에 관한 것으로, 자세하게는 Rcan3 유전자 발현을 증가시키는 활성을 갖는 항산화제; 항산화제를 세포에 처리하는 단계를 포함하는 Rcan3 유전자 발현을 증가시키는 방법; 및 Rcan3 단백질을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

면역 반응은 생체의 내부 환경이 외부 인자에 대하여 방어하는 현상을 말한다. 이러한 면역 시스템은 박테리아 및 바이러스와 같은 병원성 외래 미생물의 인식 및 제거에 의한 감시 및 방어 메카니즘과 함께 발달되어 왔다. 따라서 생체는 자신의 세포 또는 조직(자기-항원)을 외래 미생물(비자기-항원)과 구별하고, 자기-항원에 대해서 반응하지 않거나, 또한 반응하였다 하여도 면역 기능을 나타내지 않는다(면역관용).

면역 질환은 신체의 면역 방어의 부적당한 활성화를 특징으로 한다. 이때 면역 반응은 감염성 침입자(infectious invader)를 표적으로 하는 대신에, 신체 자체의 조직 또는 이식된 조직을 표적으로 삼아 손상시킨다. 면역계의 표적이 되는 조직은 질환에 따라 달라진다. 예를 들어, 염증성 피부병(inflammatory dermatoses)에서는 면역 반응은 피부를 표적으로 한다. 염증성 피부병은 수백만의 사람들에게 영향을 미치며, 아토피 피부염(atopic dermatitis), 건선(psoriasis), 괴저 농피증(pyoderma gangrenosum), 편평태선(lichen planus), 장미증(rosacea) 및 지루피부염(seborrheic dermatitis)과 같은 이상을 포함한다. 피부 이외의 다른 기관을 표적으로 하는 면역염증성 질환은 천식(asthma), 알레르기성 안내 염증 질환(allergic intraocular inflammatory diseases), 관절염(arthritis), 당뇨병(diabetes), 용혈빈혈(hemolytic anaemia), 염증성 장(bowel) 또는 위장(gastrointestinal) 질환(예를 들면, 크론병 및 궤양성 대장염(ulcerative colitis)), 다발경화증, 중증근육무력증(myasthenia gravis), 소양증(pruritis)/염증, 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 경화(cirrhosis), 및 전신홍반루푸스(systemic lupus erythematosus)와 같은 이상을 포함한다.

면역 질환의 현재의 치료법은 전형적으로 면역 억제제(immunosuppressive agents)에 의존하고 있다. 면역억제제란 항원의 작용에 대하여 숙주가 항체를 만드는 능력(체액성 면역반응) 또는 세포성 면역반응을 일으키는 능력을 저하시키거나 차단하기 위해 사용되는 다양한 물질들을 말한다. 이러한 면역억제제는 장기이식분야 뿐만 아니라 루푸스, 류마티스 관절염 등과 같은 자가면역질환과, 아토피, 알러지 등의 피부과민 반응에도 유용하게 사용될 수 있다. 우수한 면역억제제는 면역반응의 불균형을 조절할 수 있어야 하고, 인체에 대한 안전성이 확보되어야 하며, 장기간 치료시에 질환의 재발 발생 빈도가 낮아야 한다(Wollenberg 2008).

한편, 칼시뉴린(calcineurin)은 칼슘 및 칼모듈린 의존적으로 활성화되는 탈인산화 효소이고, 활성 중심을 갖는 칼시뉴린 A 서브유닛(CaNA) 및 조절 인자인 칼시뉴린 B 서브유닛 (CaNB)을 포함하는 복합체이다. 칼시뉴린은, 자가 저해 도메인에 의해 활성중심과 기질과의 회합이 저해되고 있기 때문에 통상적으로는 세포 내에서 비활성 형태로 존재한다. 세포 내 칼슘 농도가 상승하면 칼시뉴린의 구조가 변화하면서 자가 저해 도메인이 개방되어 (활성 형태) 기질이 활성 중심에 회합할 수 있게 된다. 또한, 칼슘 농도가 감소하면 칼시뉴린은 다시 비활성 형태로 돌아간다. 이러한 칼시뉴린은 뇌에 특히 많은 점에서 단백질인산화효소와 길항하여 신경전달물질 방출의 조절, 혹은 시냅스 후부 수용체나 이온채널의 활성조절, 또는 시냅스가소성에 관여하고 있는 것으로 시사되고 있다. 또한 림프구에서는 림포카인유전자 발현의 활성화에 관여하고 있다.

따라서 칼시뉴린을 억제할 수 있는 칼시뉴린 억제제(Calcineurin inhibitor)는 1980년 중반 이후부터 기본적인 면역억제제로서 사용되어왔으며, 칼시뉴린 억제제는 칼시뉴린을 블로킹함으로써 T 세포 및 비만세포의 활성을 억제할 수 있다.

그러나 이러한 칼시뉴린 억제제들은 독성으로 장기적인 신장 장애, 고혈압, 고지혈증과 같은 부작용을 동반할 수 있어, 면역 질환의 치료를 위한 개선된 치료제 및 방법이 여전히 요구되고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 면역질환을 부작용 없이 효과적으로 치료할 수 있는 물질을 연구하던 중, 칼시뉴린을 조절할 수 있는 천연 단백질로서 Rcan3(regulator of calcineurin 3)이 면역질환을 효과적으로 치료할 수 있음을 확인하였으며, 특정 항산화제가 이러한 Rcan3 유전자 발현을 월등히 증대시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 특허출원 제2009-0044519호

따라서 본 발명의 목적은 Rcan3 유전자 발현을 증가시키는 활성을 갖는 항산화제를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 항산화제를 세포에 처리하는 단계를 포함하는 실험관(in vitro) 내에서 Rcan3 유전자 발현을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 Rcan3 단백질을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 Rcan3 유전자 발현을 증가시키는 활성을 갖는 항산화제를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항산화제는 레바미피드(rebamipide) 또는 폴리페놀 화합물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리페놀 화합물은 프로안토시아니딘(proanthocyanidin)일 수 있다.

또한, 본 발명은 항산화제를 세포에 처리하는 단계를 포함하는 실험관(in vitro) 내에서 Rcan3 유전자 발현을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항산화제는 레바미피드(rebamipide) 또는 폴리페놀 화합물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리페놀 화합물은 프로안토시아니딘(proanthocyanidin)일 수 있다.

또한, 본 발명은 Rcan3 단백질을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 Rcan3는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 항산화제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항산화제는 Rcan3의 유전자 발현 또는 Rcan3의 단백질 활성을 증가시키는 효과를 가질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항산화제는 레바미피드(rebamipide) 또는 폴리페놀 화합물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리페놀 화합물은 프로안토시아니딘(proanthocyanidin)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역질환은 류마티스 관절염 (Rheumatoid Arthritis), 천식 (Asthma), 피부염 (Dermititis), 건선 (Psoriasis), 낭섬유증 (Cystic Fibrosis), 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증 (Post transplantation late and chronic solid organ rejection), 다발성 경화증 (Multiple Sclerosis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 하시모토 갑상선(Hashimoto thyroiditis), 다발성근염(polymyositis), 경피증(scleroderma), 아디슨병(Addison disease), 백반증(vitiligo), 악성빈혈(pernicious anemia), 사구체신염(glomerulonephritis) 및 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 염증성장질환 (Inflammatory Bowel Dieseses), 자가면역성 당뇨 (Autoimmune Diabetes), 당뇨 망막증 (Diabetic retinopathy), 비염 (Rhinitis), 혀혈-재관류 손상 (Ischemia-reperfusion injury), 혈관성형술후 재협착 (Post-angioplasty restenosis), 만성 폐색성 심장 질환 (Chronic obstructive pulmonary diseases; COPD), 그레이브병 (Graves disease), 위장관 알러지 (Gastrointestinal allergies), 결막염 (Conjunctivitis), 죽상경화증 (Atherosclerosis), 관상동맥질환 (Coronary artery disease), 협심증 (Angina), 암 전이 및 소동맥 질환으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 항산화제는 Rcan3의 유전자 발현을 효과적으로 증대시킬 수 있는 신규 용도를 가지므로, 이를 이용하여 Rcan3 단백질을 용이하게 증폭시킬 수 있고, 이렇게 증폭된 Rcan3 단백질은 칼시뉴린 경로를 억제할 수 있어 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있는 면역 억제제로서 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 상기 Rcan3 단백질은 천연 단백질로서 독성 및 부작용도 없어 장기간 안심하고 사용할 수 있으며, 체내에 대해 안정한 효과가 있다.

도 1은 항산화제인 GSPE(grape seed proanthocyanidin extracts)의 세포 처리에 따른 Rcan3 유전자 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 2는 관절염 동물모델(CIA)에 항산화제(GSPE) 주입에 따른 Rcan3 단백질 발현 정도를 면역조직화학적 염색법(immunohistochemical staining)을 통해 확인한 것이다.
도 3은 관절염이 유발된 마우스 모델을 대상으로 Rcan3 및 MOCK(대조군) 벡터를 주입 후 시간에 따른 관절염 지수를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 관절염이 유발된 마우스 모델을 대상으로 Rcan3 및 MOCK(대조군) 벡터를 주입 후 염증 및 관절파괴 정도를 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 관절염이 유발된 마우스 모델을 대상으로 Rcan3 및 MOCK(대조군) 벡터를 주입 후 파골세포 분화 억제 정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 관절염이 유발된 마우달 모델을 대상으로 Rcan3 및 MOCK(대조군) 벡터를 주입 후 TH17 세포 및 Treg 세포의 발달 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 Rcan3 과발현이 Rcan3, IL-17, Foxp3, RORT 전사인자의 발현에 미치는 영향을 분석한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 Rcan3(Regulator of calcineurin 3) 유전자 발현을 증가시키는 활성을 갖는 항산화제에 관한 것이다.

본 발명은 항산화제가 Rcan3 유전자 발현을 월등히 증대시킬 수 있음을 최초로 규명하였으며, 따라서 본 발명은 Rcan3 유전자 발현을 증가시키는 항산화제의 신규 용도를 제공함에 그 특징이 있다.

Rcan3(Regulator of calcineurin 3)은 우리 몸속에 존재하는 천연 단백질로서 칼시뉴린 경로를 억제할 수 있는 조절자로서의 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, Calcipressin-3로도 불린다. 상기에서 살펴본 바와 같이, 칼시뉴린을 억제할 수 있는 물질은 면역억제제로서 기능할 수 있으므로, 이러한 Rcan3 단백질은 칼시뉴린을 억제함으로써 면역을 억제할 수 있는 특징을 갖는다.

본 발명자들은 부작용 없이 면역질환 치료를 위한 새로운 면역 조절제를 개발하기 위하여 Rcan3에 주목하였으며, 항산화제가 이러한 Rcan3 유전자 발현을 증가시킬 수 있다는 사실을 처음으로 규명하였다.

본 발명에서 Rcan3 유전자 발현을 증가시킬 수 있는 상기 항산화제는 특별히 그 종류를 한정하는 것은 아니나, 바람직하게는 레바미피드(rebamipide) 또는 폴리페놀 화합물일 수 있으며, 상기 폴리페놀 화합물은 프로안토시아니딘(proanthocyanidin)일 수 있다.

프로안토시아니딘(proanthocyanidin)은 자유 라디칼 소거능, 항산화 활성, 항박테리아, 항바이러스, 항암, 항염증, 지질과산화 억제, 혈소판 응집 억제와 같은 다양한 생리활성을 가진 폴리페놀 화합물의 일종으로서, 강력한 항산화 활성으로 가장 잘 알려져 있으며, 항산화 능력이 비타민 E 보다 20배, 비타민 C 보다 50배 높은 것으로 보고되어 있다. 이러한 프로안토시아니딘은 vitis속인 포도와 머루 등에 다량 함유되어 있으며, 과육보다는 과피와 씨에 많이 함유되어 있고, 과피보다는 씨에 많이 함유되어 있다.

본 발명의 하기 실시예에서는 포도씨 추출물 유래 프로안토시아니딘을 세포에 처리한 경우, 대조군(무처리군)과 비교하여 프로안토시아니딘 처리군이 Rcan3 유전자 발현률이 약 2.3배 증대되는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 항산화제인 프로안토시아니딘이 Rcan3 유전자 발현을 증대시키는 효과가 있다는 사실을 입증할 수 있었다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 항산화제를 세포에 처리하는 단계를 포함하는 실험관(in vitro) 내에서 Rcan3 유전자 발현을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 상기 단계에서 처리할 수 있는 항산화제는 특별히 그 종류를 한정하는 것은 아니나, 바람직하게는 레바미피드(rebamipide) 또는 폴리페놀 화합물일 수 있으며, 상기 폴리페놀 화합물은 프로안토시아니딘(proanthocyanidin)일 수 있다.

본 발명에서 사용하는 프로안토시아니딘은 특별히 그 종류를 한정하는 것은 아니며, 일반적으로 시중에서 판매되는 프로안토시아니딘을 구입하여 사용할 수 있으며, 또는 실험실에서 직접 제조하여 사용할 수도 있다.

프로안토시아니딘을 직접 제조하여 사용하고자 하는 경우, 건조한 포도씨 또는 산머루씨를 막자사발을 이용하여 분쇄하여 분말화시킨 후, 70% 아세톤을 가하여 4시간 내지 24시간 추출하고 여과하여 농축시킴으로써 제조할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 Rcan3 단백질을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

보다 상세하게 본 발명에서는 Rcan3 유전자에 의해 발현되는 Rcan3 단백질이 우리 몸속에 존재하는 천연 단백질로서 칼시뉴린 경로를 억제할 수 있는 조절자로서의 역할을 할 수 있으므로, 이러한 Rcan3 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물이 면역질환을 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있음을 그 특징으로 한다.

그러므로 본 발명은 Rcan3 단백질을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있으며, 나아가 본 발명의 조성물에는 항산화제를 추가로 더 포함할 수 있다. 상기 항산화제는 Rcan3의 유전자 발현 또는 Rcan3의 단백질 활성을 증가시키는 역할을 한다.

본 발명에서 Rcan3의 유전자 발현 또는 Rcan3의 단백질 활성을 증가시킬 수 있는 상기 항산화제는 특별히 그 종류를 한정하는 것은 아니나, 바람직하게는 레바미피드(rebamipide) 또는 폴리페놀 화합물일 수 있으며, 상기 폴리페놀 화합물은 프로안토시아니딘(proanthocyanidin)일 수 있다.

본 발명에서 Rcan3 단백질은 Rcan3의 아미노산 서열을 갖는 단백질로서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하되, 이에 한정되지 않고 상기의 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 표시되는 단백질을 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 "상동성"이란 야생형(wild type) 단백질의 아미노산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

본 기술 분야의 당업자라면 이러한 인위적인 변형에 의해 90% 이상의 상동성이 유지되고 본 발명에서 단백질 활성을 보유하는 한 균등한 단백질임을 쉽게 이해할 것이다.

본 발명의 Rcan3 단백질은 활성을 보유하는 한 이들의 아미노산 서열 변이체를 포함할 수 있다. 여기서 변이체란 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다.

이러한 변이체는 야생형과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 기능적 상동체 또는 물리 화학적 성질을 증가 또는 감소시키는 변형을 가지는 단백질을 포함한다. 바람직하게는 단백질의 물리 화학적 성질이 변형된 변이체이다. 예를 들어, 온도, 수분, pH, 전해질, 환원당, 가압, 건조, 동결, 계면장력, 광선, 동결과 해동의 반복, 고농도 조건 등의 물리적 요인과 산, 알카리, 중성염, 유기용매, 금속이온, 산화환원제, 프로티아제 등의 화학적 요인의 외부 환경에 대한 구조적 안정성이 증대된 변이체이다. 또한 아미노산 서열상의 변이로 효소 활성이 증대된 변이체일 수 있다.

본 발명의 Rcan3 단백질은 포스포릴화, 글리코실화, 단백 분해 절단 등을 포함한 해독 후 변형을 포함하는 개념이다.

이러한, 본 발명의 Rcan3 단백질은 인간 조직으로부터 직접 분리하여 제조하거나, 화학적으로 합성하거나, 유전자 재조합 기술을 이용하여 얻을 수도 있다. 세포 또는 조직에 함유된 Rcan3 단백질의 분리 및 정제는 많은 공지 방법에 의해 실시할 수 있다. 이들 방법의 예로는 염 침전 및 용매 침전과 같은 용해성을 이용한 방법, 투석, 한외여과, 겔여과 및 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동과 같은 분자량의 차이를 이용하는 방법, 이온 교환 컬럼 크로마토그래피와 같은 전하의 차이를 이용하는 방법, 역상 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 친수성의 차이를 이용하는 방법, 등전점 포커싱 전기영동과 같은 등전점의 차이를 이용하는 방법 등을 예시할 수 있다.

또한 Rcan3 단백질은 화학적으로 합성할 수 있다. 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당 분야에 널리 공지된 폴리펩타이드 합성법을 이용하여 얻을 수 있다. 펩타이드는 통상의 단계적인 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법을 이용하여 제조할 수 있다. 특히, 바람직한 폴리펩타이드의 제조방법은 고체상 합성방법(solid phase syntheses)을 이용하는 것이다. Rcan3은 보호된 아미노산간의 응축반응(condensation reaction)에 의하여 통상의 고체상 방법으로, C-말단으로부터 시작하여 그 서열에 따라 순차적으로 진행하면서 합성할 수 있다. 응축 반응 후 보호기 및 C-말단 아미노산이 연결된 담체를 산분해(acid decomposition) 또는 아미놀리시스(aminolysis)와 같은 공지의 방법에 의해 제거할 수 있다. 상기 언급된 펩타이드 합성법은 관련 서적에 상세히 기술되어 있다(Gross and Meienhofer's, The Peptides, vol 2., Academic Press (1980)).

또한 Rcan3 단백질은 유전자 재조합 기술을 이용하여 얻을 수도 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우, Rcan3 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 벡터를 숙주세포로 형질전환하여 Rcan3 단백질이 발현되도록 숙주세포를 배양한 뒤, 숙주세포로부터 Rcan3 단백질을 회수하는 과정으로 수득할 수 있다. 단백질은 선택된 숙주 세포에서 발현시킨 후, 분리 및 정제를 위해 통상적인 생화학 분리 기술, 예를 들어 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 원심분리, 초음파파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등을 이용할 수 있으며, 통상적으로 순도가 높은 단백질을 분리하기 위하여 이들을 조합하여 이용한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 Rcan3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에서 상기 Rcan3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 자연에서 분리되거나 인위적으로 합성 변형된 것일 수 있는데, Rcan3 단백질을 암호화하는 염기서열은 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실 또는 삽입에 의해 변형될 수 있으며, 이러한 변형에 의해 발현된 단백질은 이의 생물학적 작용성에 유의한 변화를 포함하지 않아야 한다. 상기한 변형은 이종의 상동성 유전자로의 변형을 포함한다.

따라서 Rcan3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하되, 이에 한정되지 않고 상기의 핵산서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열로 표시되는 것을 특징으로 한다.

바람직하게는, 본 발명의 Rcan3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 이를 발현하는 벡터에 작동가능하게 연결된 재조합 발현벡터의 형태로 제공될 수 있다. Rcan3 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 당업계에 공지된 플라스미드, 파지, 코스미드, 바이러스벡터 또는 기타 매개체를 의미한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.

Rcan3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터/인핸서 서열과 같은 발현 조절 서열 및 기타 전사, 해독 또는 프로세싱에 필요한 서열들과 함께 결합될 수 있다. 조절 서열은 뉴클레오타이드의 구성적 발현(constitutive expression)을 지시하는 것뿐만이 아니라 조직-특이적 조절 및/또는 유도성 서열을 포함한다. 발현 벡터의 설계는 트랜스펙션시킬 숙주 세포, 목적하는 발현 수준 등과 같은 요소에 의해 결정될 수 있다.

본 발명의 Rcan3 단백질을 발현하는 발현벡터는 비바이러스성 벡터 또는 바이러스성벡터를 사용할 수 있다.

상기 비바이러스성 벡터로는 플라스미드가 대표적이다. 플라스미드 발현 벡터는 사람에게 사용할 수 있는 FDA의 승인된 유전자 전달방법으로 사람 세포에 직접적으로 플라스미드 DNA를 전달하는 방법으로, 플라스미드 DNA는 바이러스 벡터와는 달리 균질하게 정제될 수 있는 장점이 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 플라스미드 발현 벡터로는 당업계에 공지된 포유동물 발현 플라스미드를 사용할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 pRK5(유럽특허 제307,247호), pSV16B(국제특허공개 제91/08291호) 및 pVL1392(PharMingen) 등이 대표적이다.

또한 본 발명의 Rcan3 단백질을 발현하는 발현벡터로 바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 바이러스 벡터는 예를 들어, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노바이러스-연관 바이러스, 허피스바이러스(herpes virus) 및 아비폭스바이러스(avipoxvirus) 등이 포함된다. 바이러스 벡터는 다음의 기준을 충족해야 한다: (1) 목적하는 세포에 감염할 수 있어야 하며 이에 따라 적합한 숙주 범위를 갖는 바이러스 벡터가 선택되어야 하고, (2) 전달된 유전자가 적절한 기간 동안 세포에서 보존되고 발현될 수 있어야 하며, (3) 벡터가 숙주에 안전해야 한다.

상기 레트로바이러스 벡터는 바이러스 유전자가 모두 제거되었거나 또는 변경되어 비-바이러스 단백질이 바이러스 벡터에 의해 감염된 세포 내에서 만들어지도록 제작된 것이다. 유전자 요법을 위한 레트로바이러스 벡터의 주요 장점은 다량의 유전자를 복제세포 내에 전달하고, 세포 DNA 내로 전달된 유전자를 정확하게 통합하며, 유전자 형질 감염 후 연속적인 감염이 유발되지 않는 것이다. FDA에서 인증 받은 레트로바이러스 벡터는 PA317 암포트로픽 레트로바이러스 패키지 세포를 이용하여 제조한 것이다(Miller, A.D. and Buttimore, C., Molec. Cell Biol., 6:2895-2902, 1986).

비-레트로바이러스 벡터로는 상기에서 언급한 바와 같은 아데노바이러스가 있다. 아데노바이러스의 주요 장점은 다량의 DNA 단편(36kb 게놈)을 운반하고, 매우 높은 역가로 비-복제세포를 감염시킬 수 있는 능력이 있다는 것이다. 또한, 허피스 바이러스도 사람 유전자 요법을 위해 유용하게 사용될 수 있다(Wolfe, J.H., et al., Nature Genetics,1:379-384, 1992). 이외에도, 공지된 적절한 바이러스 벡터가 본 발명의 약학적 조성물에 사용될 수 있다.

세포 내로 유전자 전달을 위해 사용할 수 있는 다른 바이러스 벡터로는 뮤린 백혈병 바이러스(MLV), JC, SV40, 폴리오마, 엡스타인-바르 바이러스 파필로마 바이러스, 백시니아, 폴리오바이러스, 헤르페스 바이러스, 신드비스 바이러스, 렌티 바이러스, 기타 사람 및 동물 바이러스가 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 발현벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세포에 도입할 수 있다. 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 세포 내로 도입할 수 있다(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988).

한편 본 발명에서 제공하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약제학적 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명에서 상기 "면역질환"은 포유류 면역계의 구성성분들이 포유류의 병리상태를 야기하거나, 매개하거나 또는 기타 공헌하는 질환을 의미한다. 또한, 면역 반응의 자극 또는 중단이 그 질병의 진행에 보상적인 효과를 갖는 질환을 모두 포함할 수 있는데, 본 발명에서는 과민성 면역반응으로 인해 야기되는 질환들을 포함할 수 있다. 이러한 면역질환의 예로는 이에 제한되지는 않으나, 자가면역질환; 염증성질환; 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection)질환 등을 모두 포함할 수 있다.

또한, 모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중의 하나는 자기(self)를 구성하고 있는 항원물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 비자기(non-self) 항원들에 대해서는 이를 인식하고 반응하여 제거할 수 있는 능력을 가지고 있다. 이처럼 자기항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라고 한다. 그러나 이러한 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하는데 이러한 과정에 의해 발생되는 질환을 "자가면역질환"이라고 한다.

본 발명에서 "염증성 질환"이란 염증유발인자 또는 방사선조사 등 유해한 자극으로 인해 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 분비되는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1(interleukin-1), IL-6, 프로스타글란딘(prostagladin), 루코트리엔(luecotriene) 또는 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 염증유발물질(염증성 사이토카인)에 의해 유발되는 질환을 말한다.

본 발명에서 "이식편대숙주질환(graft-versus-host disease, GVHD)"은 동종이식 때 주입되는 공여자(供與者)의 말초 혈액이나 골수내의 T림프구를 환자의 몸에서 남의 것으로 인식하여 면역 반응이 일어나는 질환을 말한다. 즉, 수혈된 살아 있는 림프구에 의해 유발되며 면역 반응으로 인해 간 기능 이상, 피부 병변, 황달, 설사, 발열, 범혈구감소증 등의 증상이 나타나는 질환을 말한다.

본 발명에서 "치료"란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 치료란 용어는 "치료하는"이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 면역질환의 "치료" 또는 "치료요법"은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:

(1) 면역질환의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴,

(2) 면역질환의 확산을 예방함, 즉, 전이를 예방함,

(3) 면역질환을 경감시킴.

(4) 면역질환의 재발을 예방함, 및

(5) 면역질환의 증상을 완화함(palliating)

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분인 Rcan3 단백질 또는 Rcan3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 이외에, 당업계의 공지된 담체 및 희석제와 함께 적절한 제형으로 투여될 수 있으며, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여, 예를 들면, 정맥 내 주사, 근육 내 주사, 복강 내 주사, 피하주사, 좌제 등의 제형을 가질 수 있다. 본 발명의 치료제가 경구로 투여될 때, 치료제는 정제, 캡슐, 입자, 분말, 환제, 트로키, 내액제, 현탁제, 유화제, 또는 시럽 등의 제형으로 투여될 수 있다.

상기 제형들은 약제학적 조성물에 통상적으로 사용되는 적당한 부형제, 충전물, 결합제, 습윤제, 분해제, 윤활제, 계면활성제, 분산제, 완충액, 방부제, 용해보조제, 소독제, 감미료, 향신료, 진통제, 안정화제, 등장액제 등을 이용한 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

상기 기술된 각각의 제형은 약학적으로 허용되는 담체 또는 첨가제를 포함할 수 있다. 상기 담체 또는 첨가제의 구체적인 예로는 물, 약학적으로 허용되는 유기용매, 콜라겐, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리딘, 카복시비닐 중합체, 알긴산 나트륨, 수용성 덱스트란, 카복시메틸 나트륨 녹말, 펙틴, 잔탄 고무, 아라비아 고무, 카제인, 겔라틴, 한천, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸글리콜, 바셀린, 파라핀, 스테아릴 알코올, 스테아린산, 인간 혈청 알부민, 만니톨, 소비톨 및 젖산 등이 있다. 한 개 또는 그 이상의 첨가제가 조제 형태에 따라 선택되거나 또는 적절히 조합될 수 있다. 더 나아가, 유전자요법 치료제 투여방법으로는, 정맥내, 동맥내 투여와 같은 통상적인 전신투여 이외에 표적세포로의 국소적 투여가 행해질 수 있으며, 카테터 기술 및 외과적 수술과 조합된 투여 방법이 사용될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 치료효과를 나타낼 수 있는 면역질환으로는, 류마티스 관절염 (Rheumatoid Arthritis), 천식 (Asthma), 피부염 (Dermititis), 건선 (Psoriasis), 낭섬유증 (Cystic Fibrosis), 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증 (Post transplantation late and chronic solid organ rejection), 다발성 경화증 (Multiple Sclerosis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren syndrome), 하시모토 갑상선(Hashimoto thyroiditis), 다발성근염(polymyositis), 경피증(scleroderma), 아디슨병(Addison disease), 백반증(vitiligo), 악성빈혈(pernicious anemia), 사구체신염(glomerulonephritis) 및 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 염증성장질환 (Inflammatory Bowel Dieseses), 자가면역성 당뇨 (Autoimmune Diabetes), 당뇨 망막증 (Diabetic retinopathy), 비염 (Rhinitis), 혀혈-재관류 손상 (Ischemia-reperfusion injury), 혈관성형술후 재협착 (Post-angioplasty restenosis), 만성 폐색성 심장 질환 (Chronic obstructive pulmonary diseases; COPD), 그레이브병 (Graves disease), 위장관 알러지 (Gastrointestinal allergies), 결막염 (Conjunctivitis), 죽상경화증 (Atherosclerosis), 관상동맥질환 (Coronary artery disease), 협심증 (Angina), 암 전이 및 소동맥 질환 등을 들 수 있되, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 Rcan3 단백질 또는 Rcan3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 약제학적으로 유효한 양으로 포함할 수 있다.

본 발명에서 "약제학적으로 유효한 양"이란, 치료하고자 하는 면역질환에 대해 완화, 억제, 호전 및/또는 완치효과를 나타내는 유효성분의 양을 말한다. 본 발명의 Rcan3 단백질 또는 Rcan3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 예를 들면, 치료적으로 유효한 투여량은, 초기에는 세포배양을 통한 시험관내 분석을 사용하여 결정할 수 있으며, 동물모델에서 실험을 수행하여 혈중 Rcan3 단백질의 농도 범위가 세포배양에서 결정된 IC50(시험관내 분석, 약물 처리 시, 배양세포의 50%에 대한 치사량의 테스트 화합물의 농도)을 통하여 결정할 수 있다. 당 분야에서 과도한 실험을 거치지 않고도 치료에 유효한 양을 결정할 수 있을 것이며, 이러한 정보를 이용하여 인간에서 유용한 투여량을 더욱 정확하게 결정 할 수 있다. 본 발명의 하기 실시예에서는 관절염 유도 마우스에 100 mg/kg의 양으로 복강 내 피하 주사하였다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 면역질환의 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한 상기 Rcan3 단백질 또는 Rcan3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. Rcan3 단백질 또는 Rcan3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 면역질환의 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한 용도로 이용될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 포유동물에게 치료상 유효량의 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 상기 약제학적으로 유효한 양과 동일한 개념이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

항산화제 처리에 따른 Rcan3 유전자 발현 분석

먼저, 마우스에서 비장을 적출하여 단세포를 분리한 후, 이들 세포에 Hanlim Pharm.co.,LTD.에서 구입한 항산화제인 GSPE(grape seed proanthocyanidin extracts)를 10μg/ml의 농도로 2시간 전처리하였다. 2시간 뒤, anti-CD3 2ug/ml-coated plate에 이들 세포를 옮겨 분주하고 약 15시간 배양 뒤 세포를 수거하여 Tri reagent 처리하였다. 이들 세포에서 분리한 RNA를 Illumina TotalPrep RNA amplification kit를 사용하여 biotinylated complimentary RNA를 생성하고 이것으로 Illumina BeadChip array를 수행하였다. 이를 통해 얻은 microarray data는 BeadStudio gene expression module 3.2를 이용하여 분석하였다.

그 결과 도 1에서 나타낸 바와 같이, 대조군(무처리군)과 비교하여 항산화제인 GSPE(grape seed proanthocyanidin extracts)을 처리한 실험군에서 Rcan3 유전자 발현율이 약 2.3배 증대되는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 항산화제가 Rcan3 유전자 발현을 증대시키는 효과가 있다는 사실을 입증할 수 있었다.

< 실시예 2>

항산화제 처리에 따른 Rcan3 단백질 발현 측정( in vivo )

<2-1> 관절염 동물모델에 항산화제 주입

관절염 마우스 모델 (collagen-induced arthritis: 이하 간단하게 CIA'라 함)을 제조하기 위해 6주령의 수컷 DBA/1J 마우스에 제2형 콜라겐(bovine type Ⅱ collagen: 이하 간단하게 CⅡ'라 함)과 CFA(complete freud's adjuvant) 각각을 100μl 씩 혼합하여 피내주사로 1차 면역하였다. 이렇게 관절염을 유도한 CIA에 100 mg/kg의 GSPE(grape seed proanthocyanidin extracts)를 일주일에 두 번씩 18일 동안, 복강 내 피하 주사하였다. 대조군은 항산화제인 GSPE(grape seed proanthocyanidin extracts) 대신 비히클(saline)을 주사하였다.

<2-2> 항산화제 처리에 따른 Rcan3 단백질 발현 정도 측정

본 발명의 항산화제(GSPE) 처리에 따른 관절염의 치료 효과를 알아보기 위하여, 상기 실시예<2-1>을 통해 제조된 마우스(항산화제가 주입된 관절염 마우스)를 희생하여 관절(tibiotalar joint)에서 Rcan3 단백질 발현 정도를 면역조직화학적 염색법(immunohistochemical staining)을 통해 측정하였다.

자세하게는 상기의 마우스 군의 관절을 채취 후, 4% 중성완충포르말린에 고정하고 EDTA로 뼈를 탈회시킨 다음 파라핀에 포매한 후 관절 조직을 7um 두께의 절편을 만들어 슬라이드에 부착하였다. 조직에 Rcan3에 대한 first antibody를 4°C, overnight 반응시켰다. 그 다음 biotinylated secondary linking antibody와 결합하고, streptavidinperoxidase complex를 1시간 동안 반응시켰다. 이후 DAB chromogen을 사용하여 발색하였다. 이들 조직을 광학현미경으로 분석하였다.

그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 항산화제인 GSPE(grape seed proanthocyanidin extracts)을 처리한 실험군에서 Rcan3 단백질이 두드러지게 발현된 것을 육안으로 확인할 수 있었다.

< 실시예 3>

Rcan3 과발현 벡터 주입에 따른 관절염 완화( in vivo )

나아가 본 발명자들은 상기 실시예들을 통해 항산화제의 처리가 Rcan3의 발현 및 활성을 증폭 및 촉진시킬 수 있는 활성이 있음을 확인하였고, 따라서 이러한 Rcan3가 면역질환을 치료할 수 있는 효과가 있는지 하기 실험들을 통해 확인하였다. 이를 위해, 관절염 동물모델 유도 후 8일 뒤에 hydrodynamic 방법을 이용하여 Mock 벡터 또는 Rcan3 과발현 벡터를 정맥주사 하였고, 첫 번째 벡터 주입 후 8일 뒤 electroporation 방법을 이용하여 양 발에 Mock 벡터 또는 Rcan3 과발현 벡터를 추가 주입하였다.

그 결과 도 3에서 나타낸 바와 같이, Mock 벡터 주입군에 비해, Rcan3 과발현 벡터를 주입한 군의 경우, 관절염의 증상이 현저히 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 4>

Rcan3 과발현 벡터 주입에 따른 염증 및 연골파괴 완화( in vivo )효과

Rcan3의 염증 및 연골파괴 완화 효과를 알아보기 위하여, 관절염 유발 3주 뒤에 Mock 벡터와 Rcan3 과발현 벡터를 주입한 마우스를 각각 희생하여 마우스 관절을 채취하였다. 이후, 채취한 마우스 관절을 10% 중성완충포르말린에 고정하고 EDTA로 뼈를 탈회시킨 뒤, 파라핀에 포매한 후 관절 조직을 7um 두께의 절편을 만들어 slide에 부착하였다. 기본염색을 진행하기 전에 자일렌을 이용하여 탈 파라핀 과정을 통과한 후, 에탄올을 고농도에서 저농도까지 함수시켰다. 염색과정은 헤마톡실린과 에오진 염색을 진행하며 연골에 포함된 프로테오글리건(proteoglycans)을 감지할 수 있는 Safrnin O과 톨루이딘 블루(Toluidine blue) 방법을 사용하였다.

그 결과, 도 4에서 나타낸 바와 같이, Mock 벡터 주입군에 비해 Rcan3 과발현 벡터를 처리한 실험군에서 염증 및 연골파괴의 정도가 완화된 것을 육안으로 확인할 수 있었다.

< 실시예 5>

Rcan3 과발현 벡터 주입에 따른 파골세포 분화 억제 효과( in vivo )

Rcan3의 파골세포 분화 억제 효과를 알아보기 위하여, 관절염 유발 3주 뒤에 Mock 벡터와 Rcan3 과발현 벡터를 주입한 마우스를 각각 희생하여 골수에서 골수유도래 단핵세포(bone marrow-derived monocytes)를 분리하였다.

자세하게는 상기의 마우스 군의 골수 채취 후, 채취한 세포에 M-CSF를 처리 후 3일간 배양하여 파골세포 전구체 생성을 유도하였다. 3일 뒤 생성된 파골세포 전구체의 배지 교환 후, M-CSF 및 RANKL을 자극하여 3일간 배양하였다. 10% 포름알데하이드(formaldehyde)로 고정한 후 TRAP 염색을 통해 파골세포 분화 정도를 비교분석하였다.

그 결과 도 5에서 나타낸 바와 같이, Mock 벡터 주입군을 대조군이라 할 때,대조군과 비교하여 Rcan3 과발현 벡터를 처리한 실험군에서 파골세포의 분화가 억제된 것을 육안으로 확인할 수 있었다.

< 실시예 6>

Rcan3 과발현 벡터 주입에 따른 Th17 및 Treg 세포 발달 조절 효과( in vivo )

관절염 유발 3주 뒤에 Mock 벡터와 Rcan3 과발현 벡터를 주입한 마우스를 각각 희생하여 비장을 채취하였다.

자세하게는 상기의 마우스 군의 비장 채취 후, 비장을 이용하여 OCT compound를 포매 시킨 후 액화질소 급속 냉각된 조직을 냉동 절편기를 이용하여 7μm 두께로 slide에 부착하고, 아세톤으로 고정 후 10% 정상 염소 혈청으로 30분간 비특이적 반응을 차단하였다. 그 후, FITC-labeled anti-CD4 Ab (Biolegend), PE-labeled anti-Foxp3 Ab (eBiosciences), PE-labeled anti-IL-17 Ab (eBiosciences), Allophycocyanin-labeled anti-CD25 Ab (eBiosciences)를 PBS (pH 7.5)에 1:100로 희석 후 4℃에서 하룻밤 반응하였다. PBS로 수세 후, streptavidin cy-3 상온에서 2시간 반응시킨 후 공초점 현미경으로 분석하였다.

그 결과 도 6에서 나타낸 바와 같이, Mock 벡터 주입군에 비해 Rcan3 과발현 벡터를 처리한 실험군의 경우, 병인성 세포인 IL-17+인 세포의 수가 감소한 것으로 나타난 반면, 면역 조절 T 세포인 Foxp3+세포의 수는 유의하게 증가하였음을 육안으로 확인할 수 있었다.

< 실시예 7>

Rcan3 과발현을 통한 전사인자 발현 조절

Murine T lymphoma 세포주인 LBRM-33에 Mock 벡터와 Rcan3 과발현 벡터를 형질주입하여 Th17 분화 자극 조건 (anti-CD3 0.5 μg/ml, anti-CD28 1 μg/ml, anti-IFN-γ 2 μg/ml, anti-IL-4 2 μg/ml, TGF-β 2 ng/ml, IL-6 20 ng/ml) 하에 48시간 배양하였다. 48 시간 뒤, 세포에서 RNA 분리 후 cDNA를 합성하여 Rcan3, IL-17, Foxp3, RORγT 전사인자의 발현을 실시간 PCR(real-time PCR) 방법으로 관찰하였으며, 이때 PCR을 위해 사용한 프로브는 하기 기재된 바와 같다.

PCR 수행 시 사용한 프로브

Rcan3 probe는 Applied Biosystems 사에서 구입한 것을 사용하였다.

IL-17: 5‘CCT CAA AGC TCA GCG TGT CC3’ (sense)

5‘-GAG CTC ACT TTT GCG CCA AG-3’ (antisense)

Foxp3: 5‘GGC CCT TCT CCA GGA CAG A3’ (sense)

5‘-GCT GAT CAT GGC TGG GTT GT-3’ (antisense)

RORγT: 5‘TGT CCT GGG CTA CCC TAC TG3’ (sense)

5‘-GTG CAG GAG TAG GCC ACA TT-3’ (antisense)

그 결과 도 7에서 나타낸 바와 같이, Rcan3 과발현 벡터를 처리한 실험군에서 IL-17과 RORγT의 발현은 감소된 반면 Foxp3의 발현은 증가하였음을 육안으로 확인할 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

CIA: 관절염 마우스 모델
GSPE: grape seed proanthocyanidin extracts

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Novel Use of antioxidant for enhancing Rcan3 activity <130> PN1204-135 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Rcan3 amino acid sequence <400> 1 Met Leu Arg Asp Ser Leu Lys Ser Trp Asn Asp Ser Gln Ser Asp Leu 1 5 10 15 Cys Ser Ser Asp Gln Glu Glu Glu Glu Glu Met Val Phe Gly Glu Asn 20 25 30 Glu Asp Gly Leu Glu Glu Met Met Asp Leu Ser Asp Leu Pro Thr Ser 35 40 45 Leu Phe Ala Cys Ser Val His Glu Ala Val Phe Glu Val Gln Glu Gln 50 55 60 Lys Glu Arg Phe Glu Ala Leu Phe Thr Leu Tyr Asp Asp Gln Val Thr 65 70 75 80 Phe Gln Leu Phe Lys Ser Phe Arg Arg Val Arg Ile Asn Phe Ser Lys 85 90 95 Pro Glu Ala Ala Ala Arg Ala Arg Ile Glu Leu His Glu Ser Glu Phe 100 105 110 His Gly Arg Lys Leu Lys Leu Tyr Phe Ala Gln Val Gln Val Ser Gly 115 120 125 Glu Ala Arg Asp Lys Ser Tyr Leu Leu Pro Pro Gln Pro Thr Lys Gln 130 135 140 Phe Leu Ile Ser Pro Pro Ala Ser Pro Pro Val Gly Trp Lys Gln Ser 145 150 155 160 Glu Asp Ala Met Pro Val Ile Asn Tyr Asp Leu Leu Cys Ala Val Ser 165 170 175 Lys Leu Gly Pro Gly Glu Lys Tyr Glu Leu His Ala Gly Thr Glu Ser 180 185 190 Thr Pro Ser Val Val Val His Val Cys Glu Ser Glu Thr Glu Glu Glu 195 200 205 Glu Asp Thr Lys Asn Pro Lys Gln Lys Ile Thr Gln Thr Arg Arg Pro 210 215 220 Glu Ala Pro Thr Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Asp Cys Ala Leu 225 230 235 <210> 2 <211> 762 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rcan3 DNA sequence <400> 2 aagcttggat ccgaattcga gaagatgctc cgagacagcc tgaaatcttg gaatgacagc 60 cagtcagacc tctgtagcag cgaccaggag gaggaagagg agatggtctt cggtgaaaat 120 gaggacggac tggaagagat gatggaccta agtgacctgc ccacctcact ctttgcttgc 180 agtgtccatg aagcagtgtt tgaggtccaa gagcaaaagg agaggtttga ggccctgttc 240 accctctacg atgaccaggt cacattccag ttgttcaaga gctttcgcag agtgaggatc 300 aacttcagca agcccgaggc tgcggcaaga gcgcggatag agctccacga gagtgagttc 360 cacggacgga agctgaagct ctacttcgca caggtgcagg tgtccgggga ggcccgggac 420 aagtcctact tactgccacc acaacccacc aagcagttcc tcatctcccc tcccgcctca 480 ccccccgtgg ggtggaagca gagtgaagat gcgatgccag tgatcaacta tgacctgctc 540 tgcgctgtct ccaagctggg cccaggggag aaatacgaac tgcacgcggg aaccgagtcc 600 acccccagtg tggtggtgca cgtctgtgag agcgaaactg aagaggaaga agacacaaaa 660 aatccaaaac agaaaatcac gcagacgcgg cgcccggagg ctcccacggc ggcactgagt 720 gagcggctgg actgtgcact ctgagcggct ctcgagtcta ga 762

Claims (14)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 프로안토시아니딘(proanthocyanidin)을 세포에 처리하는 단계를 포함하는 실험관(in vitro) 내에서 Rcan3 유전자 발현을 증가시키는 방법.
5. 삭제
6. 삭제
7. Rcan3 유전자 또는 단백질, 및 프로안토시아니딘(proanthocyanidin)을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
8. 제7항에 있어서,
   상기 Rcan3는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
9. 삭제
10. 제7항에 있어서,
    상기 프로안토시아니딘(proanthocyanidin)은 Rcan3의 유전자 발현 또는 Rcan3의 단백질 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
11. 삭제
12. 삭제
13. 제7항에 있어서,
    상기 Rcan3 유전자는 Rcan3 유전자가 작동 가능하게 연결된 발현 벡터 내에 함유된 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
14. 삭제

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