JP4550133B2 - 腫瘍細胞の成長を阻害するための方法および製薬学的組成物 - Google Patents
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Description
P.)ら (1995) Curr. Opin. Genet. Dev. 5:571-576)に概説される。)多数の転写因子が脂肪細胞分化において誘導され(C/EBPα、C/EBPβおよびADD1/SREBP1)、そしてある程度までこの過程に影響を及ぼす(フレイタグ(Freytag,
S.O.)ら (1994) Genes Dev. 8:1654-63;キム(Kim, J.B.)とシュピーゲルマン(Spiegelman, B.M.) (1996)
Genes Dev. 10:1096-1107;リン(Lin, F.T.)とレーン(Lane, M.D.) (1994) PNAS USA
91:8757-61;サミュエルソン(Samuelsson, L.)ら (1991) EMBO J. 10:3787-93;トントノス(Tontonoz,
P.)ら (1993) Mol Cell Biol 13:4753-9;ウメク(Umek, R.M.)ら (1991) Science 251:288-92;ウ(Wu,
C.L.)ら (1995) Mol Cell Biol 15:253646;イェ(Yeh, W.C.)ら (1995) Genes Dev. 9:168-81)。
(コルネリウス(Cornelius, P.)ら (1994)Annu. Rev. Nutr. 14:99-129 トントノス(Tontonoz, P.)ら (1995)Curr. Opin. Genet. Dev. 5:571-576) フレイタグ(Freytag, S.O.)ら (1994)Genes Dev. 8:1654-63 キム(Kim, J.B.)とシュピーゲルマン(Spiegelman,B.M.) (1996) Genes Dev. 10:1096-1107 リン(Lin, F.T.)とレーン(Lane, M.D.)(1994) PNAS USA 91:8757-61 サミュエルソン(Samuelsson, L.)ら (1991)EMBO J. 10:3787-93 トントノス(Tontonoz, P.)ら (1993) MolCell Biol 13:4753-9 ウメク(Umek, R.M.)ら (1991) Science251:288-92 ウ(Wu, C.L.)ら (1995) Mol CellBiol 15:253646 イェ(Yeh, W.C.)ら (1995) GenesDev. 9:168-81
H.G.) (1993) BioEssays Vol.15(5):309-15に概説される)。3個の特性がこれら2つのクラスを区別する。第一に、タイプIIレセプターはリガンドの非存在下にそれらの応答性要素に結合することが可能である(ダム(Damm)ら
(1989) Nature 339:593-597;サップ(Sap)ら、Nature 340:242-244;デ・テ(De The)ら (1990)
Nature 343:177-180)。一方、リガンド結合はタイプIレセプター−hsp90複合体を解離させるのに必要とされ、そしてこれゆえにDNA結合を間接的に制御する。第二に、タイプIIレセプターは、タイプIレセプターにより必要とされる3ヌクレオチドにより常に分離されるパリンドロームに配置された半部位(half-sites)とは対照的に、直接反復として配置される半部位から成る応答性要素を結合しかつこれによりトランスに活性化する。最後に、タイプIIレセプターはホモダイマーとしてそれらのそれぞれの結合部位に結合しないが、しかし、高親和性結合のために補助因子RXR(例えばRXRα、RXRβ、RXRγ)を必要とする(ユ(Yu)ら
(1991) Cell 67:1251-1266;バッジ(Bugge)ら (1992) EMBO J. 11:1409-1418;クリーヴァー(Kliewer)ら
(1992) Nature 355:446-449;ライト(Leid)ら (1992) Cell 68:377-395;マークス(Marks)ら (1992)
EMBO J. 11:1419-1435;チャン(Zhang)ら (1992) Nature 355:441-446)。タイプIIレセプター間の相互作用はC末端ドメイン中のある領域を必要とする(ユ(Yu)ら
(1991) Cell 67:1251-1266;クリーヴァー(Kliewer)ら (1992) Nature 355:446-449;ライト(Leid)ら
(1992) Cell 68:377-395;マークス(Marks)ら (1992) EMBO J. 11:1419-1435)。結合後に、標的遺伝子(すなわち特定のDNA配列を伴う遺伝子)の転写活性が、レセプターヘテロダイマーに結合されたリガンドの機能として高められる。
ストゥンネンバーク(Stunnenberg, H.G.) (1993)BioEssays Vol.15(5):309-15 ダム(Damm)ら (1989) Nature339:593-597 サップ(Sap)ら、Nature 340:242-244 デ・テ(De The)ら (1990) Nature343:177-180) ユ(Yu)ら (1991) Cell67:1251-1266 バッジ(Bugge)ら (1992) EMBO J.11:1409-1418 クリーヴァー(Kliewer)ら (1992) Nature355:446-449 ライト(Leid)ら (1992) Cell68:377-395 マークス(Marks)ら (1992) EMBO J.11:1419-1435 チャン(Zhang)ら (1992) Nature355:441-446 ユ(Yu)ら (1991) Cell67:1251-1266 クリーヴァー(Kliewer)ら (1992) Nature355:446-449 ライト(Leid)ら (1992) Cell68:377-395 マークス(Marks)ら (1992) EMBO J.11:1419-1435)
本発明は、PPARγの活性化が、活発に増殖するPPARγ発現細胞、とりわけ形質転換された脂肪前駆細胞の終末分化(terminal differentiation)による成長停止の誘導において重要な役割を演じるという知見を基礎とする。
PPARγアゴニストでの治療に対するある望まれない副作用を回避するもしくは最小限にするためには、PPARγアゴニストが、PPARα、PPARδもしくはRaR依存性の転写の同一レベルの活性化に必要とされるより最低1桁より小さい濃度でPPARγ依存性の転写を活性化することが、主題の方法のある態様で望ましいであろう。
Spring Harbor Laboratory Press):1989);DNA Cloning、第IおよびII巻(グローヴァー(D.N. Glover)編、1985);Oligonucleotide
Synthesis(ガイト(M.J. Gait)編、1984);マリス(Mullis)ら 米国特許第4,683,195号;Nucleic Acid
Hybridization(ヘイムズ(B.D. Hames)とヒギンズ(S.J. Higgins)編 1984);Transcription And
Translation(ヘイムズ(B.D. Hames)とヒギンズ(S.J. Higgins)編 1984);Culture Of Animal Cells(フレッシュニー(R.I.
Freshney)、アラン R.リス インク(Alan R. Liss, Inc.)、1987);Immobilized Cells And Enzymes(IRL プレス(IRL
Press)、1986);パーバル(B. Perbal)、A Practical Guide To Molecular Cloning (1984);専門書、Methods
In Enzymology(アカデミック プレス インク(Academic
Press, Inc.)、ニューヨーク);Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(ミラー(J.H. Miller)とカロス(M.P.
Calos)編、1987、コールドスプリングハーバー ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory));Methods In
Enzymology、Vol.154および155(ウ(Wu)ら編)、Immunochemical Methods In Cell And Molecular
Biology(メイヤー(Mayer)とウォーカー(Walker)編、アカデミック
プレス(Academic Press)、ロンドン、1987);Handbook Of Experimental Immunology、第I〜IV巻(ヴァイル(D.M.
Weir)とブラックウェル(C.C. Blackwell)編、1986);Manipulating the Mouse Embryo、(コールドスプリングハーバー ラボラトリー プレス(Cold
Spring Harbor Laboratory Press)、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、1986)を参照。
Molecular Cloning, ALaboratory Manual、第2版、サンブルック(Sambrook)、フリッチュ(Fritsch)とマニアティス(Maniatis)により編(コールドスプリングハーバー ラボラトリー プレス(ColdSpring Harbor Laboratory Press):1989) DNA Cloning、第IおよびII巻(グローヴァー(D.N.Glover)編、1985) Oligonucleotide Synthesis(ガイト(M.J.Gait)編、1984)
終末分化の誘導はある悪性病変の慣習的化学療法に対する有望な代替物を表わす。「分化療法(differentiation therapy)」として知られる原則は、癌細胞は発達の未熟な段階で止められるようであるという観察結果を基礎とする。ある腫瘍細胞が、インビトロおよびインビボの双方で、処理されない腫瘍細胞と同じくらい迅速には増殖しない、例えば見かけ上の静止表現型に復帰する細胞に最終的に分化するよう誘導され得ることが立証されている。細胞の終末分化を誘導することが既知の一群の作用物質はレチノイドである。骨髄球系統の細胞の分化および悪性形質転換で重要な役割を演じるレチン酸レセプターα(RARα)が急性前骨髄球性(promyelocytic)白血病(APML)での介入の標的として使用されている(ウォレル(Warrel,
R.P.)ら、(1993) N. Engl. J. Med. 329:177-189)。全transレチン酸を用いる分化療法はこの疾患の治療の標準となっている。
ウォレル(Warrel, R.P.)ら、(1993) N.Engl. J. Med. 329:177-189
(1994) Am. J. Pathol. 144:1121-1134)。
スレーカンタイア(Sreekantaiah)ら (1994)Am. J. Pathol. 144:1121-1134
P.)ら (1994)、Genes & Dev. 8:1224-34;チュー(Zhu)ら (1993) J. Biol. Chem.
268:26817-20)のようなその変異体も企図されている。
ブラッサン(Braissant, O.)らEndocrinology 137(1):354-66 トントノス(Tontonoz, P.)ら (1994)、Genes& Dev. 8:1224-34 チュー(Zhu)ら (1993) J. Biol. Chem.268:26817-20
「白血病」という用語は当業者により認知されており、そして、血液および骨髄での白血球およびそれらの前駆体のゆがまされた増殖および発達を特徴とする血液形成器官の進行性悪性疾患を指す。
一局面において、本発明は、PPARγ応答性の過剰増殖性細胞をPPARγアゴニストと接触させることによる、当該細胞の増殖を阻害しそして/もしくは形質転換された表現型を復帰する方法を特色とする。一般に、当該方法は、過剰増殖性細胞の分化を促進するのに有効なPPARγアゴニストのある量と病的に過剰増殖性の細胞を接触させる段階を包含する。本方法は、培養物中の細胞で、例えばインビトロもしくはエクスビボで実施され得るか、または、例えばインビボの治療プロトコルの一部として動物被験体に存在する細胞で実施され得る。この治療計画はヒトもしくは他の動物被験体で実施され得る。PPARγアゴニストに応答してのインビボでの形質転換された細胞の終末分化の誘導は、化学療法の慣習的な高度に毒性の計画に対する代替を表わす。
C.)ら、(1994) 上記に概説される)。
スレーカンタイア(Sreekantaiah, C.)ら、(1994)
L.) (1991) Crit Rev. in Oncol./Hematol. 11:267-97に概説される)。主題の方法により治療されうるリンパ性悪性病変は、B系統ALLおよびT系統ALLを包含する急性リンパ芽球性白血病(ALL)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、前リンパ球性(prolymphocytic)白血病(PLL)、有毛状細胞性白血病(HLL)およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症(WM)を包含するがしかしこれらに限定されない。本発明の治療方法により企図される悪性リンパ腫の付加的な形態は、非ホジキンリンパ腫およびその変異型、末梢T細胞リンパ腫、成人T細胞白血病/リンパ腫(ATL)、皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)、大型顆粒球性リンパ性白血病(LGF)ならびにホジキン病を包含するがしかしこれらに限定されない。
ヴァイクス(Vaickus, L.) (1991) CritRev. in Oncol./Hematol. 11:267-97
Pharm. Bull 30(10)3580-3600は、チアゾリジンジオン誘導体に関し、そして多様なTZDおよびTZD様類似物についての商業的供給源/合成スキームを記述し、これらは本発明の方法の実施で有用でありうる。
(1983) J. Biol. Chem. 258:11713-18)。
フィッツパトリック(Fitzpatrick)とワイヴァルダ(Wyvalda)(1983) J. Biol. Chem. 258:11713-18
ヒラタ(Hirata)ら (1994) PNAS USA91:11192-96
スミス(Smith, W.) (1989) Biochem.J. 259:315-24
好ましくは、A1は式(a)、(b)もしくは(c):
式中:
R4およびR5はそれぞれ独立に、水素原子、アルキル基、または置換もしくは未置換のアリール基を表わすか、あるいは、R4およびR5がそれぞれ隣接する炭素原子に結合される場合には、それらが結合される炭素原子と一緒になったR4およびR5はベンゼン環を形成し、その中で
R4およびR5により表わされる各炭素原子は一緒に置換もしくは未置換で;また、式(a)の部分にあってもよく;そして、Xは酸素もしくはイオウを表わす。
式中、R6およびR7はそれぞれ独立に、水素、ハロゲン、置換もしくは未置換のアルキルもしくはアルコキシを表わす。好ましい態様において、R6およびR7は水素を表わす。
95/35108号;日本国特許公開第69383/92;ならびに、米国特許第5,523,314;5,521,202;5,510,360;5,498,621;5,496,621;5,494,927;5,480,896;5,478,852;5,468,762;5,464,856;5,457,109;4,287,200;4,340,605;4,438,141;4,444,779;4,461,902;4,572,912;4,687,777;4,703,052;4,725,610;4,873,255;4,897,393;4,897,405;4,918,091;4,948,900;5,002,953;5,061,717;5,120,754;5,132,317;5,194,443;5,223,522;5,232,925および5,260,445号に開示される。
(1995) JBC 270:30765;ミヌッチ(Minucci)ら (1996) PNAS 93:1803;ヘンブリー(Hembree)ら (1996)
Cancer Res 56:1794;キザキ(Kizaki)ら (1996) Blood 87:1977;レモッテ(Lemotte)ら (1996) Eur
J Biochem 236:328;ならびに、米国特許第5,552,271;5,466,861;5,514,821号;PCT公開WO 96/05165;WO
96/20914;WO 94/15901;WO 93/21146号;および欧州特許公開EP 0694301号を参照)。
アプフェル(Apfel)ら (1995) JBC270:30765 ミヌッチ(Minucci)ら (1996) PNAS93:1803 ヘンブリー(Hembree)ら (1996) CancerRes 56:1794 キザキ(Kizaki)ら (1996) Blood87:1977 レモッテ(Lemotte)ら (1996) Eur JBiochem 236:328
別の局面において、本発明は、1種もしくはそれ以上の製薬学的に許容できる担体(添加物)および/もしくは希釈剤と一緒に処方される、治療上有効な量のPPARγおよび/もしくはRXRアゴニストならびに/またはMAPキナーゼ阻害剤の1種もしくはそれ以上を含む製薬学的に許容できる組成物を提供する。下に詳細に記述されるように、本発明の製薬学的組成物は、以下、すなわち(1)経口投与、例えば飲薬(水性もしくは非水性の溶液もしくは懸濁液)、錠剤、巨丸、粉末、顆粒、ペースト(paste);(2)例えば滅菌の溶液もしくは懸濁液のような、例えば皮下、筋肉内もしくは静脈内注入による非経口投与;(3)例えば皮膚に適用されるクリーム、軟膏もしくはスプレーのような局所適用;(4)例えばペッサリー、クリームもしくは泡沫のような膣内もしくは直腸内;または(5)例えば当該化合物を含有する水性エアゾル、リポソーム製剤もしくは固形粒子のようなエアゾル、に適合されたものを包含する固体もしくは液体の形態での投与のため特別に処方されてよい。 本明細書で使用されるところの「治療上有効な量」という句は、いずれかの医学的治療に適用可能な合理的な利益/危険比で動物の細胞の少なくとも亜分画の増殖を阻害することおよび/もしくは分化を誘導することにより何らかの所望の治療効果を生じさせるのに有効である、PPARγおよび/もしくはRXRアゴニスト(1種もしくは複数)、物質、またはある化合物を含む組成物のその量を意味する。
ベルジュ(Berge)ら (1977) "PharmaceuticalSalts"、J. Pharm. Sci. 66:1-19
agent);(8)カオリンおよびベントナイト粘土のような吸着剤;(9)タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよびそれらの混合物のような滑沢剤;ならびに(10)着色剤のいずれかのような、1種もしくはそれ以上の製薬学的に許容できる担体と混合される。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合には、当該製薬学的組成物は緩衝剤もまた含んでよい。類似の型の固体組成物は、ラクトースまたは乳糖のような賦形剤、ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどを使用する軟および硬充填ゼラチンカプセル中の充填物としてもまた使用されてよい。
なお別の局面において、PPARγのRNAおよび/もしくはタンパク質の発現の検出が、過形成性および新生物の細胞の障害を検出および/もしくは表現型分類する(phenotype)のに有用な診断方法を提供し得る。例えば、付属として付けられる実施例で記述されるように、PPARγは、平滑筋肉腫、線維肉腫、血管肉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍(MPNS)もしくは悪性線維性組織球腫(MFH)のような他の形態の軟組織肉腫で見出される検出できないレベルの発現と対照的に、脂肪肉腫で選択的に発現されることが見出される(図10Bを参照)。従って、PPARγは、他の組織学的型の軟組織肉腫と脂肪細胞腫瘍を区別するためのマーカーであるようである。
Instruments Corp.)、カリフォルニア州フラートン)中で27,000rpmで15℃で16時間遠心分離し得る。遠心分離後、チューブ内容物をデカンテーションし、チューブから液体を排出し、そして澄明なRNAペレットを含有する底部0.5cmを剃刀の刃で切り離す。ペレットをフラスコに移し、そして20mlの10mMトリス−塩酸、pH7.5、1mMEDTA、5%サルコシルおよび5%フェノールに溶解する。この溶液をその後、塩化ナトリウムを0.1Mにし、そして40mlの1:1のフェノール:クロロホルム混合物とともに振とうする。RNAを、0.2M酢酸ナトリウムpH5.5の存在下にエタノールで水相から沈殿させ、そして遠心分離により収集する。細胞起源からRNAを単離するいずれかの他の方法をこの方法の代わりに使用してよい。コムチンスキ(Chomczynski)法(米国特許第4,843,155号に記述される)のような他のmRNA単離プロトコルが公知である。
(1988) Science 241:1077-1080;およびナカザワ(Nakazawa)ら (1994) PNAS 91:360-364を参照)のプローブ/プライマーを利用する。具体的に説明する一態様において、当該方法は、(i)患者から細胞のサンプルを収集すること、(ii)核酸(例えばmRNA)をサンプルの細胞から単離すること、(iii)核酸サンプル(もしくは場合によってはそれ由来のcDNA調製物)を、転写物(存在する場合)の少なくとも一部分のハイブリダイゼーションおよび増幅が起こるような条件下でPPARγ転写物に特異的にハイブリダイゼーションする1種もしくはそれ以上のプライマーと接触させること、そして(iv)増幅産物の存在もしくは非存在を検出すること、の段階を包含する。
別の局面では、本発明はPPARγ応答性の過剰増殖性細胞の増殖を阻害する抗新生物形成性作用物質、例えば上述された方法で使用され得る作用物質の同定方法を特色とする。以下の薬物スクリーニングアッセイのいずれかにおいて、PPARγの選択的結合/活性化が、分化スクリーニング、例えば、PPARγが例えばPPARα、PPARδ、RxRレセプターなどにより置き換えられることを除き同一である近接(side-by-side)アッセイにより試験化合物を試験する(run)ことにより評価され得ることが真価をみとめられることができる。こうしたアッセイは、レセプターのPPARγ亜型に選択的である化合物を選択するのに使用され得る。
off)化合物を同定することを含んで成り、ここで、置き換えられたリガンドの量の統計学的に有意の差異は、その試験化合物がPPARγに特異的に結合することを示す(レーマン(Lehmann)ら
(1995) J. Biol. Chem. 270:12953-56を参照)。甲状腺ホルモンレセプターへのリガンド結合を分析するのに普遍的に使用されるようなスキャッチャード分析が、リガンド結合の程度を決定するのに使用されてよい(アレンビー(Allenby)ら
(1993) PNAS USA、90:30-4;バナー(Banner)ら、Annal. Biochem. 200:163-70)。細胞を基礎とするアッセイは、その場合、作動的、拮抗的および偶然の結合の間を識別するための機能的アッセイを提供する。
レーマン(Lehmann)ら (1995) J. Biol.Chem. 270:12953-56 アレンビー(Allenby)ら (1993) PNASUSA、90:30-4 バナー(Banner)ら、Annal. Biochem.200:163-70
(i)実験手順
細胞培養、トランスフェクションおよびプラスミド
PPARγ2、PPARγ1、PPARγ−M2、PPARγ−M1のウイルス発現ベクター(トントノス(Tontonoz, P.)ら (1994) 上記;トントノス(Tontonoz, P.)ら (1994) Cell
79:1147-56)および3xwt−E2F−ルシフェラーゼ(クレック(Krek, W.)ら (1993) Science 262:1557-60)構築物の調製は既に記述された。PPARγ2−CDのcDNA(アミノ酸1〜494をコードする)を、PCRによりPPARγ2のcDNAから増幅し、そしてpBabe−Puroレトロウイルス発現ベクターに挿入した。
トントノス(Tontonoz, P.)ら (1994)Cell 79:1147-56 クレック(Krek, W.)ら (1993) Science262:1557-60
W.S.)ら (1993) PNAS USA 90:8392-6)10μgのpBabe由来の発現ベクターを用いるリン酸カルシウム沈殿法により80%集密でトランスフェクションした。トランスフェクション48時間後にウイルスの上清を収集し、そして、NIH−3T3細胞を50%集密で等しい力価の組換えウイルスに感染させた。上清を、10%普遍的(cosmic)仔ウシ血清(ハイクローン(Hyclone))および4μg/mlのポリブレンを含有するDMEM中の細胞に適用した。感染24時間後に細胞を分割し、そして10%仔ウシ血清および2μg/mlのピューロマイシンを含有するDMEM中でプレート培養して、感染した細胞を選択した。空ベクター、または野生型もしくは突然変異体の形態のPPARγのcDNAを含有するウイルス発現ベクターに感染したNIH−3T3細胞系、ならびに、HIB1Bおよび3T3−F442A細胞系を、10%普遍的仔ウシ血清を含有するDEME中で培養した。ピオグリタゾン(5−[4−[2−(5−エチル−2−ピリジル)−エトキシ]ベンジル]−2,4−チアゾリジンジオン)(アップジョン(Uphohn))をDMSOに溶解し、そして細胞培養実験で使用した。
ピア(Pear, W.S.)ら (1993) PNASUSA 90:8392-6
全RNAをイソチオシアン酸グアニジン抽出(シャーグウィン(Chirgwin,
J.M.)ら (1979) Biochemistry 18:5294-9)により培養された細胞から単離した。ホルムアミドおよびホルムアルデヒド中で変性されたRNAを、記述されたように(マニアティス(Maniatis,
T.)ら (1989) コールドスプリングハーバー ラボラトリー プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー)ホルムアルデヒド含有アガロースゲルを通して電気泳動した。ウェスタンブロット分析のため、細胞抽出物を記述されたように(マニアティス(Maniatis,
T.)ら (1989) コールドスプリングハーバー ラボラトリー プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー)調製し、ブロッティングし、そして適切な抗体(アップステイト バイオテック インク(Upstate
Biotech. Inc.))でプロービングした。
シャーグウィン(Chirgwin, J.M.)ら(1979) Biochemistry 18:5294-9 マニアティス(Maniatis,T.)ら (1989) コールドスプリングハーバー ラボラトリー プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)
BrdU取り込み実験を、供給元(ベーリンガー マンハイム バイオケミカル(Boehringer
Mannheim Biochemical))により提供されるプロトコルに記述されたように実施した。簡潔には、カバーガラス上で成長された細胞を10μMのBrdUで1時間標識した。サンプルを洗浄し、そしてエタノール−グリシン緩衝液で固定しかつ抗BrdUモノクローナル抗体とともにインキュベーションした。抗マウスIg−アルカリホスファターゼとのインキュベーション、次いで基質反応の後に、結合された抗BrdU抗体を光学顕微鏡検査(light
microscopy)により可視化した。
細胞成長に対するPPARγ活性化の影響を研究するため、われわれはレトロウイルストランスフェクション系を使用してNIH−3T3細胞中でPPARγを発現させた。この系は、われわれが数千の細胞中で比較的等しいレベルで異所遺伝子を発現することを可能にする。PPARγは2種のアイソフォーム、PPARγ1およびPPARγ2を有し、これらは代替スプライシングにより形成される異なるN末端を有する(トントノス(Tontonoz, P.)ら (1994) 上記;チュー(Zhu, Y.)ら (1993) J. Biol. Chem.
268:26817-20)。NIH−3T3線維芽細胞を、PPARγ1もしくは2をコードするcDNAを含有するレトロウイルス発現ベクター(NIH−PPARγ)、または空ベクター(NIH−ベクター)に感染させて安定細胞系を創製した。NIH−PPARγ細胞は、ノーザン分析により測定されたように、分化された脂肪細胞で観察された内因性のPPARγのレベルのおよそ1/3を発現した(データは示されない)。
トントノス(Tontonoz, P.)ら (1994) 上記;チュー(Zhu,Y.)ら (1993) J. Biol. Chem. 268:26817-20
レーマン(Lehmann, J.M.)ら (1995) J.Biol. Chem. 270:12953-6
J.M.)ら (1995) 上記)の添加は、NIH−PPARγ細胞の細胞成長に対する同一程度の阻害を発揮することが見出された(図2C)。明らかな細胞傷害性の影響は、われわれがこれらの化合物を使用した濃度で観察されなかった。
表1:正常NIH−PPARγ細胞、F442A前脂肪細胞および形質転換されたHIB1B細胞での細胞周期離脱の発生におけるPPARγの活性化の影響を示す。
成長停止に必要なPPARγの構造的要件のいくつかを決定するため、NIH−3T3細胞を、野生型もしくは多様な突然変異体の形態のPPARγのcDNAを含有するレトロウイルス発現ベクターに感染させた。指数的に成長する細胞を5日間ピオグリタゾンで処理し、そして細胞数を測定した。図3に示されるように、PPARγ1およびPPARγ2双方のリガンド活性化は類似の成長停止を誘導した。われわれは、PPARγ2のN末端の127アミノ酸を欠くPPARγの対立遺伝子(PPARγ−M1)もまた検査した。以前の研究は、この対立遺伝子が脂肪形成の誘導に関して野生型よりも活性であることを示している(トントノス(Tontonoz,
P.)とシュピーゲルマン(Spiegelman, B.M.) (1994) Cell 79:1147-56)。PPARγ−M1を含有するNIH−3T3細胞(NIH−M1)での成長阻害は、野生型のPPARγ1もしくはPPARγ2を異所性に発現する細胞より高くさえあった。PPARγのDNA結合および転写活性化ドメインが細胞成長に対するその影響に必要とされるかどうかを検討するため、NIH−3T3細胞を2種の突然変異体の形態のPPARγ、すなわち、DNA結合ドメイン中に2個の点突然変異を含有するPPARγ−M2、および全部の核レセプターのC末端領域に配置される活性化ドメイン(AF−2)を欠くC末端を欠失されたPPARγ−CD(マンゲルスドルフ(Mangelsdorf)とエヴァンス(Evans)、1995により概説される)に感染させた。NIH−M2細胞は、位置156および159でDNA結合ドメインのシステイン残基がセリンに変化されているPPARγ2レセプターを発現し;NIH−CD細胞は、保存されたC末端トランス活性化ドメインを欠く短くされた形態のPPARγ2を発現する。かように、ピオグリタゾン処理は、NIH−M2およびNIH−CD細胞の細胞成長および脂肪形成に何らかの影響を有しなかった。ピオグリタゾンでの処理は、NIH−ベクター細胞での細胞成長の約10%の減少を引き起こした。細胞数を、5μMのピオグリタゾンなしでもしくはこれでの5日の処理後に測定した。処理されたプレートでの細胞数の減少を、処理されない対照プレートに対する相対的変化として表わした。このデータは最低3回の独立した実験の平均を表わす。これらの結果は、PPARγ1および2双方が細胞周期離脱を刺激し得ることを立証する。これらのデータは、DNA結合タンパク質および転写因子としてのPPARγの活性が細胞成長に対するその影響に必要とされることもまた示唆する。
トントノス(Tontonoz, P.)とシュピーゲルマン(Spiegelman,B.M.) (1994) Cell 79:1147-56
われわれは、PPARγの活性化がPPARγを異所性に発現する正常線維芽細胞の細胞周期離脱につながることを示した。PPARγの活性化が形質転換された細胞に対し同一の影響を有するかどうかを試験するため、われわれはモデル系としてSV40ラージT抗原(SV40LT)で形質転換されたHIB1B細胞を使用した。大量のPPARγ1を発現するHIB1B細胞を、脂肪細胞特異的なaP2プロモーターの制御下にSV40LTを構成的に発現するトランスジェニックマウスの褐色脂肪腫瘍から樹立した(ロス(Ross, S.R.)ら (1992) PNAS USA 89:7561-5)。指数的に成長するHIB1B細胞をピオグリタゾンで処理し、細胞数を測定し、そして、BrdU取り込み実験を実施して細胞周期の進行に対するPPARγ活性化の影響を評価した。図2A、2Cおよび図3に示されるように、ピオグリタゾンもしくはBRL49653によるPPARγの活性化はこれらの細胞の成長を強く抑制した。新たに合成されたDNAへのBrdU取り込みもまた、ピオグリタゾンでの5日の処理後に85%減少した(表1)。これらの結果は、PPARγの活性化がSV40LTに駆動される(driven)形質転換を克服し得、そして、HIB1B細胞での細胞周期離脱を引き起こし得ることを示す。
ロス(Ross, S.R.)ら (1992) PNASUSA 89:7561-5
細胞の終末分化
(i)実験手順
組織サンプルおよび細胞遺伝学
正常ヒト組織、脂肪肉腫および他の軟組織肉腫を、ボストンのブリガム アンド ウイメンズ病院(Brigham and Women’s Hospital)での手術症例から得た。全組織サンプルは切除されたサンプルの均一かつ生存可能な部分から病理学者により採取され、そして摘出10分以内に凍結した。各軟組織肉腫のヘマトキシリンおよびエオシン染色された切片が単一の病理学者(C.F.)により再検査され、そして組織学的型、段階(grade)、分裂活性および外科的縁に従って分類した。組織学的分類は、慣習的診断基準(エンツィンガー(Enzinger)95、フレッチャー(Fletcher) CDM 95
1043-1096)を使用する形態学的パターン認識を単に基礎とした。分裂活性の計数を0.120mm2の高倍率視野の大きさで実施し、そして腫瘍の大部分の細胞領域からの最低50の高倍率視野を計数した。細胞遺伝学的分析のため、腫瘍をコラゲナーゼで解離させ(disaggregated)、そしてT25フラスコ中での3〜7日の培養後に収穫した(フレッチャー(Fletcher)ら、1990、Cancer
Res)。分裂中期の細胞の収穫およびスライド作成の方法は既に記述された(CR)。分裂中期細胞を、トリプシン−ギムザ(シーブライト(Seabright)
(1971) Lancet)およびキナクリンマスタード結合(フレッチャー(Fletcher) (1991) Am J Path)により分析した。
エンツィンガー(Enzinger)95、フレッチャー(Fletcher) CDM 951043-1096 フレッチャー(Fletcher)ら、1990、CancerRes シーブライト(Seabright)(1971) Lancet フレッチャー(Fletcher)(1991) Am J Path
全RNAを、イソチオシアン酸グアニジウム抽出および塩化セシウム遠心分離(シャーグウィン(Chirgwin, J.M.)ら (1979) Biochemistry 18:5294-5299)により腫瘍および正常ヒト組織から調製した。RNAをホルムアルデヒド−アガロースゲルを通して電気泳動し、バイオトランス(BioTrans)ナイロンメンブレン(ICN)にブロッティングし、そして製造元により指図されたようにハイブリダイゼーションさせた。cDNAプローブは、最低109cpm/μgの非活性までランダムプライミング法により[α−32P]−dCTPで標識した。
シャーグウィン(Chirgwin, J.M.)ら(1979) Biochemistry 18:5294-5299
一次脂肪肉腫細胞を、既に(フレッチャー(Fletcher, J.A.)ら
(1991) NEJM 324:436-443)およびその中の参考文献に記述されたように、選択された新たに収穫された腫瘍から単離した。一次細胞を最低細胞2×105個/mlの密度でプレート培養し、そして、60mm皿中、15%普遍的仔ウシ血清(ハイクローン(Hyclone))および5μg/mlインスリンを含有するRPMI中で培養した。ピオグリタゾン(アップジョン(Upjohn))、トログリタゾン(ワーナー・ランバート(Warner-Lambert))、BRL49653(BIOMOL)およびLG268(リガンド ファーマシューティカルズ(Ligand
Pharmaceuticals))をDMSOに溶解し、そして5μl未満の体積で細胞に適用した。NIH−PPARγおよびNIH−ベクター細胞は、記述されたように(トントノス(Tontonoz,
P.)ら、(1994) 上記)レトロウイルス感染により生じさせた。分化された細胞を中性脂肪についてオイルレッド−Oで染色した(グリーン(Green, H.)とケヒンデ(Kehinde,
O.) (1974) Cell 1:113-116)。BrdU標識を、製造元の説明書に従って標識キット(ベーリンガー マンハイム(Boehringer
Mannheim))を使用して実施した。
フレッチャー(Fletcher,J.A.)ら (1991) NEJM 324:436-443 グリーン(Green, H.)とケヒンデ(Kehinde,O.) (1974) Cell 1:113-116
GAL4−PPARγ発現ベクターをPPARγにより構築した。CV−1細胞を、10%樹脂−炭ストリップ(resin-chacoal-stripped)仔ウシ血清を含有するDMEM中で培養した。トランスフェクションを、製造元の説明書に従ったDOTAP(ベーリンガー マンハイム(Boehringer
Mannheim))を使用するリポフェクション法により、10%樹脂−炭ストリップウシ胎児血清を含有するフェノールレッドを含まないDMEM中で実施した。2時間後にリポソームを除去し、そして細胞を、示されたようにチアゾリジンジオンの存在もしくは非存在下で追加の40時間培養した。ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼアッセイを既に記述されたように(フォーマン(Forman,
B.M.)ら、(1995) Cell 83:803-812)実施した。
フォーマン(Forman, B.M.)ら、(1995)Cell 83:803-812
PPARγはマウスおよびラットの脂肪組織中で高レベルで発現される(トントノス(Tontonoz,
P.)ら (1994) Nucleic Acids Res. 22:5628-5634;ブラッサン(Braissant, O.)ら、(1996) 上記)。ヒトでのこのレセプターの組織分布を決定するため、われわれは、多様なヒト組織から調製されたRNAのノーザン分析を実施した。図4に示されるように、ヒトPPARγは脂肪組織で最高レベルで、また、肺および腎を包含するいくつかの他の組織でずっとより低いレベルで発現される。他の組織サンプルのいずれかもまた脂肪細胞を含有したかどうかを決定するため、このブロットを、脂肪細胞特異的結合タンパク質aP2のcDNAともまたハイブリダイゼーションさせた。心および筋のサンプルは有意の量のaP2のmRNAを含有することがみられ得、これらの組織での少なくとも若干の低レベルのPPARγ発現が少数の脂肪細胞の存在から生じることを示唆する。
トントノス(Tontonoz, P.)ら(1994) Nucleic Acids Res. 22:5628-5634
腫瘍形成は、分化された表現型の開始および維持の原因である遺伝子の不活性化もしくはダウンレギュレーションを頻繁に伴う。PPARγが脂肪細胞の分化過程で中心的役割を演じるようであるため、われわれは、一連のヒト脂肪肉腫でのPPARγの発現を検査した。この系列は、脂肪肉腫の3種の主要な組織学的亜型、すなわち、十分な分化/脱分化、粘液様/円形細胞、および多形態性のそれぞれから調製されたRNAを包含した。各腫瘍の組織学的および細胞遺伝学的特徴を表2に与える。ほとんどの部分について、十分分化された/脱分化された腫瘍は環状染色体および巨大マーカー染色体を表わし、粘液様/円形細胞の脂肪肉腫は特徴的なt(12;16)(Q13p11)転座を表わし、そして多形態性の形態は複雑な転位を表わした。驚くべきことに、分化におけるそれらの封鎖にもかかわらず、検査された各脂肪肉腫は正常な脂肪のものに匹敵するレベルのPPARγのRNAを発現することが見出された(図5A)。これらの結果は、全部でない場合は大部分の脂肪肉腫がPPARγ発現の誘導後の分化過程の一点で形質転換されたことを示唆する。対照的に、PPARγのRNAは、平滑筋肉腫、線維肉腫、血管肉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍(MPNS)、もしくは悪性線維性組織球腫(MFH)を包含する、検査されたいずれの他の型の軟組織肉腫でも有意のレベルで発現されなかった(図5B)。かように、PPARγは、脂肪肉腫を他の組織学的型の軟組織肉腫と区別するための感受性のマーカーであるようである。
表2:それらの組織学、細胞遺伝学的特徴、分裂指数、および一次細胞培養物を基礎とした多様な脂肪肉腫腫瘍の分類
一過性トランスフェクション実験を実施してヒトPPARγの活性化のプロフィールを特徴づけした。トランスフェクションされた細胞中の内因性レセプターからの妨害を排除するため、異種応答要素により転写を活性化し得たキメラhPPARγレセプターを利用した(フォーマン(Forman, B.M.)ら、(1995) 上記)。hPPARγのリガンド結合ドメインに連結された酵母のGAL4 DNA結合ドメインを含有する融合タンパク質発現ベクターを構築した。この構築物を、その後、GAL4上流活性化配列を含有するレポータープラスミドとともにCV−1細胞にコトランスフェクションした。チアゾリジンジオン抗糖尿病薬は、最近、マウスのPPARγ相同物のリガンド活性化体と同定されている。図6に示されるように、チアゾリジンジオンBRL49653、トログリタゾンおよびピオグリタゾンはヒトPPARγの効果的な活性化体であり、また、それらの相対的能力はインビボでのインスリン感作剤としてのそれらの能力に対応する(BRL>トログリタゾン>ピオグリタゾン)。
上記)。PPARγがこれらの腫瘍中で一貫して発現されるという観察結果は、悪性細胞は、PPARγ経路を最大に活性化することにより分化プログラムを完了することを余儀なくさせられるかも知れないという可能性を生じさせた。この可能性を取り扱うために、3種のヒト脂肪肉腫から単離された一次細胞をインビトロで培養した(材料および方法を参照)。一次細胞株LS857およびLS175は十分分化された腫瘍由来であり、また、LS707は粘液様腫瘍由来であった(表2を参照)。高段階の(high-grade)多形態性の脂肪肉腫細胞は分化の研究を可能にするのに十分な数に増殖し得なかった。一次平滑筋肉腫細胞系LM203を対照として培養した。これらの培養物が悪性腫瘍由来細胞から成ったことを確認するため、細胞遺伝学的分析を実施した。表2に示されるように、各培養物中の細胞の核型は親脂肪肉腫に特徴的であった。十分分化された脂肪肉腫は、頻繁に環状染色体および巨大マーカー染色体を含有する一方、粘液様脂肪肉腫はt(12:16)転座を特徴とする(フレッチャー(Fletcher,
J.A.)ら、(1991) 上記)。
クロザ(Crozat, A.)ら、(1993) Nature363:640-644
(1994) 上記)。われわれは、能力のある細胞のPPARγおよびRXR特異的リガンド双方への同時の曝露がPPARγのリガンド単独より強い脂肪形成シグナルを提供するかも知れないと仮定した。RXR特異的リガンドLG268の脂肪細胞分化を促進する能力を、レトロウイルスベクターからPPARγを発現するNIH−3T3線維芽細胞(トントノス(Tontonoz,
P.)ら (1994) 上記)を使用して検討した。われわれは既に、野生型NIH−3T3細胞がRXRαを発現するがしかしPPARγを発現しないことを示した。表3に示されるように、50nMのLG268での7日間の集密NIH−PPARγ細胞の処理は、1μMのピオグリタゾン単独での7日の処理でみられたものに匹敵する脂肪細胞分化の有意の刺激をもたらした。双方の活性化体への同時の曝露は相加的影響をもたらした。LG268はNIH−ベクター細胞に対し影響を有さず、この化合物の脂肪形成活性が、ピオグリタゾンのものと同様、PPARγの存在に依存することを示す。類似の結果が、PPARγおよびRXRα双方を発現する前脂肪細胞の細胞系3T3−L1および3T3−F442Aで得られた(データは示されない)。ノーザン分析は、ピオグリタゾンおよびLG268が、NIH−PPARγ細胞での脂肪細胞特異的遺伝子aP2およびアジプシンの誘導に対する相加的影響を有したことを確認した(図8)。脂肪細胞の遺伝子発現の誘導は、類似の条件下でNIH−ベクター細胞で観察されなかった。
表3:ピオグリタゾン単独、LG268単独もしくは組み合わせの非存在もしくは存在下で培養された、トランスフェクションされないNIH細胞(NIH−ベクター)もしくはレトロウイルスベクターからPPARγを発現するNIH細胞(NIH−PPARγ)における脂肪細胞分化の変化。脂肪細胞分化の程度を脂質含有細胞のパーセントとして示す。
表4:ピオグリタゾンの存在もしくは非存在下でのヒト脂肪肉腫細胞(LS857)の一次培養物の成長停止誘導におけるピオグリタゾンの影響。脂肪細胞分化の程度を脂質含有細胞のパーセントとして示す。増殖の程度をBrdUを取り込んだ細胞の数により示す。
(i)実験手順
ヌードマウスの研究
HIB1B細胞(動物あたり細胞2×106個)を24匹の雄性ヌードマウス(7週のNCRw/w)の上背部に皮下に注入した。注入13日後にマウスをトログリタゾン(粉末飼料との0.2%混合物)で処理した。腫瘍体積(mm3で測定される)の発達を、処理されない対照と比較して、トログリタゾン処理後14、19および26日に測定した。各点は、示された時間間隔の間、トログリタゾンで処理されたもしくは処理されない12匹のマウス(最後の点を除く、ここでn=11)からの平均±標準偏差(SD)を表わす。
腫瘍の大きさの変化を評価するため、各動物群について11〜12例からの平均(SD)を検査して、統計学的に有意の差異を検出する85%の見込み(chance)を確実にした(両側検体t検定を仮定する)。
表5 処理されない対照(群1)と比較した、トログリタゾンで処理されたHIB1B細胞を既に移植されたヌードマウス(群2)の腫瘍体積(平均(SD))。
図11は、多様なヒト癌細胞系でのPPARγ亜型の発現を立証するノーザンブロットを表わす。ノーザンブロットは、示されたような多様な細胞系からの全RNAを用いて実施した。RNAの負荷は等しくなく、かつ、比較できない。
われわれは、HL−60ヒト骨髄性白血病細胞系の増殖および分化に対するPPARγアゴニストの影響を検討した。5日の処理後のHL−60細胞数を示す図12は、PPARγアゴニストが細胞増殖の用量依存性の阻害を引き起こし得ることを立証する。簡潔には、HL−60細胞を細胞5000個/ウェルで24穴プレート中で培養し、そして変動する濃度のLG268およびピオグリタゾンで処理した。5日後にアリコートを取り出し、そしてコールターカウンターを介して細胞数を測定するのに使用した。主題のグラフで提供される値は三重の(triplicate)測定の平均値である。
図14は、ヒト前立腺癌細胞系PC3に対するLG268(「化合物268」)およびピオグリタゾン(「pio」)の影響を描くグラフである。簡潔には、PC3細胞を細胞2000個/ウェルで96穴プレートで培養し、そして変動する濃度のLG268およびピオグリタゾンで処理した。5日後に、生存率を、薬物で誘導される阻害の程度を決定するために臭化3−(4,5−ジメチルチアゾル−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウム(MTT)アッセイにより評価した。MTTアッセイは、代謝的に活性の細胞による臭化テトラゾリウムの切断を基礎とし、定量的な青色を生じる。
(i)実験手順
化学的試薬および細胞系
ピオグリタゾンはアップジョン カンパニー(Upjohn Co.)、ミネソタ州カルマズー、により提供された。トログリタゾンおよびPD147275(M2)はパーク・デービス/ワーナー
・ランバート(Parke-Davis/Warner-Lambert)、ミネソタ州アナーバーから得た。15−デオキシ−Δ12,14−プロスタグランジンJ2およびPD098059はそれぞれケイマン ケミカル(Cayman
Chemical)およびニュー イングランド バイオラブス(New England Biolabs)からであった。LG268はリガンド ファーマシューティカルズ(Ligand
Pharmaceuticals)、カリフォルニア州ラホヤから得た。
細胞系ZR−75−1、MCF−7、BT−20、SK−BR3をATCCから得、そして示唆された培地中で培養した。21NT、21PTおよび21MT[バンド(Band, V.)ら、Cancer Research 50:7351-7357 (1990)]細胞はα−培地[バンド(Band,
V.)ら、Genes, Chromosomes & Cancer 48-58 (1989)]中で成長させた。分化アッセイのため、細胞を、10%普遍的仔ウシ血清(ハイクローン(Hyclone))、2mML−グルタミン、2mMピルビン酸ナトリウム、0.1mM非必須アミノ酸、5μg/mlのインスリン、2.8μMヒドロコルチゾン、および、21MTについては1μg/mlヒツジプロラクチンを含有するα−MEM中で培養した。細胞は48時間ごとに再飼養した(refed)。処理後7〜10日に全RNAを単離し、そして細胞を固定しかつオイルレッドO[グリーン(Greene,
H.)*ケヒンデ(Kehinde, O.)、Biochemistry 18:5294-5299 (1979)]もしくはナイルレッドで染色した。成長アッセイのため、指数的に成長する細胞を、細胞500個/ウェルで24穴プレート中で培養した。1日後、細胞を、10%炭ストリップFBS(ハイクローン(Hyclone))、2mML−グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、0.1mM非必須アミノ酸、5μg/mlのインスリン、1mMデキサメサゾンを含有するα−MEMで処理した。細胞を36〜48時間ごとに再飼養した。処理後3および7日に3H−チミジン(2μCi/ml)を細胞に18〜24時間添加し、そしてDNA中の取り込みをシンチレーション計数により検出した。クローン原性アッセイのため、ベヒクル(DMSO)もしくは10μMトログリタゾンの存在下に分化培地中で7〜10日の培養後に細胞をトリプシン処理し、トリパンブルー排除(exclusion)を用いて計数した。細胞をプレートあたり細胞103個で10cm2プレートで再培養した。15日後に培養物をクリスタルバイオレットで染色した。
バンド(Band, V.)ら、CancerResearch 50:7351-7357 (1990) バンド(Band, V.)ら、Genes,Chromosomes & Cancer 48-58 (1989) グリーン(Greene, H.)*ケヒンデ(Kehinde,O.)、Biochemistry 18:5294-5299 (1979)
全RNAを培養された細胞および組織からイソチオシアン酸グアニジン抽出[シャーグウィン(Chirgwin, J.M.)ら、Biochemistry 18:5294-5299 (1979)]により単離した。RNAをホルムアミドおよびホルムアルデヒド中で変性させ、そして、記述されたように[マニアティス(Maniatis,
T.)ら Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版(コールドスプリングハーバー ラボラトリー プレス(Cold
Spring Harbor Laboratory Press)、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー(1989))]ホルムアルデヒドを含有するアガロースゲル中で電気泳動した。RNAを、製造元により指図されたように、バイオトランス(BioTrans)ナイロン(ICN ファーマシューティカルズ(ICN
Pharmaceuticals))に移し、そしてメンブレンを架橋し(cross-linked)、ハイブリダイゼーションし、そして洗浄した。RNAの等しい負荷を、臭化エチジウム染色およびヒト酸性リボソームリンタンパク質PO(26B40)[ラボラダ(Laborada,
J.) Nucleic Acids Res. 19:3998 (1991)]のcDNAへのハイブリダイゼーションにより確実にし、また、アクチンcDNAプローブをランダムプライミング法[フィンバーグ(Finberg
A.P.)とフォーゲルシュティーン(Vogelstien, B.A.)ら、Anal. Biochem 137:266-267 (1984)]により最低109cpm/μgの比活性までα−32PdCTP(6000Ci/mmol)で標識した。
シャーグウィン(Chirgwin,J.M.)ら、Biochemistry 18:5294-5299 (1979) マニアティス(Maniatis, T.)らMolecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版(コールドスプリングハーバー ラボラトリー プレス(Cold SpringHarbor Laboratory Press)、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー(1989)) ラボラダ(Laborada, J.)Nucleic Acids Res. 19:3998 (1991) フィンバーグ(Finberg A.P.)とフォーゲルシュティーン(Vogelstien,B.A.)ら、Anal. Biochem 137:266-267 (1984)
MT細胞からの全細胞抽出物について、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)およびタンパク質イムノブロットを、記述されたように[フー(Hu, E.)ら Science 274:2100-2103 (1996)]実施した。PPARγに対する抗体は既に記述されている[同じ箇所]。活性化されたリン酸化されたMAPキナーゼに対する抗体をプロメガ(Promega)から得、そして推奨されるように使用した。ポリクローナルウサギ抗ヒトPPARγ抗血清を、親和性精製されたグルタチオン−Sトランスフェラーゼ−完全長ヒトPPARγ融合タンパク質に対し生じさせた。
フー(Hu, E.)ら Science274:2100-2103 (1996)
PPARγが病的な乳房の発達で機能しうるかどうかを検討するため、われわれは最初に多様な乳房上皮癌細胞系でのmRNAレベルでの発現を検査した。対照として、われわれは、最高レベルのPPARγのmRNAを有することが既知の脂肪組織のRNAサンプルを負荷した(図15)ところが、半分が有意の発現を示し、レベルは脂肪でみられるものの10%から40%まで変動した。全てエストロゲンレセプター陰性の、これらの細胞系のうち3種はルース・セイガー(Ruth Sager)博士の研究室により乳房の浸潤性かつ管内の癌と診断された単一患者から開発された系列を表わす[バンド(Band,
V.)ら、Cancer Research 50:7351-5357 (1990)]。21NTおよび21PT細胞は原発性腫瘍由来であった一方、21MT細胞は、この同一の患者が肺に転移した乳癌を再発した場合の胸水由来であった。原発性および転移性双方の乳房細胞系がPPARγを発現する一方、21MT細胞は最高レベルを発現し、それは脂肪組織でみられたものの30%に達した。
バンド(Band, V.)ら、CancerResearch 50:7351-5357 (1990)
正常乳房上皮での、および原発性乳房腫瘍からのPPARγ発現の測定は、正常乳房中に含有される大量の脂肪により妨害されうる。この脂肪は原発性乳房腫瘍から完全に分離するのが困難である。この理由から、われわれは、肺に転移していた疾患を伴う4例の異なる患者を研究した。外科的に切除された転移性乳房腫瘍を正常の周囲の肺から完全に分離し、そしてノーザンブロッティングによりPPARγのmRNA発現について分析した。図15に示されるように、これらのサンプルのそれぞれは陽性であり、脂肪でみられるPPARγのmRNAのレベルのおよそ10%を示した。
duct)(矢印3)ならびに隣接する正常脂肪細胞(矢印4)の極度の褐色の核染色を立証した(図16c〜d)。免疫前血清は、乳癌、正常乳房組織、脂肪細胞もしくは肺の肺細胞の核染色を示さなかった(データは示されない)。
悪性乳房細胞でのPPARγの活性化の影響を決定するため、TZDリガンドを、上で論考された21PTおよび21MT細胞に適用した。21PT細胞を2種の異なるPPARγリガンド、ピオグリタゾンおよびトログリタゾンで7日間処理した場合、細胞は、丸まりかつオイルレッドOで染色される中性脂肪で満たす形態の転換を経験した(図17a)。これらの細胞と対照的に、小さな程度の形態の転換のみが、それがより高レベルのPPARγのmRNAを発現した(図15)という事実にもかかわらず、21MT細胞系で観察された(図17c)。
S.A.)らCell 83:813-810 (1995);トントノス(Tontonoz, P.)ら Proceedings National Academy
of Sciences of the USA 94:237-241 (1997)]を使用した。この化合物はまた、図3bで脂質についてのナイルレッド染色で具体的に説明されるように21PT細胞での有意の脂質蓄積も刺激する。対照的に、MSと命名される、PPARγに対し親和性を有しないトログリタゾンの代謝物(サルティエル(A.
Saltiel)、私信)はこの応答を誘導しない(図17b)。かように、PPARγの活性化は、悪性乳房細胞系での劇的な形態の転換および脂質蓄積を刺激し得る。しかしながら、高レベルのPPARγを発現する最低1種の乳癌細胞系(21MT)は、レセプター活性化のこの結果に対する相対的抵抗性を具体的に説明する。
クリーヴァー(Kliewer,S.A.)らCell 83:813-810 (1995) トントノス(Tontonoz, P.)らProceedings National Academy of Sciences of the USA 94:237-241 (1997)
Z.)ら Science 256:526-529 (1994)]。このmRNA発現は、ベヒクルで処理された細胞でほとんど検出不可能であるが、しかしピオグリタゾン処理により誘導される。逆に、その発現が悪性のマーカーとして使用されている2種の遺伝子、ケラチン19(K19)およびムチン−1(Muc−1)[レギンバルド(Regimbald,
L.H.)ら Cancer Research 56:4244-4249 (1995)]は、ピオグリタゾンもしくはLG268のいずれかでの処理により抑制される。若干のマーカー(Muc−1およびK19)は、それらがPPARγの活性化に対するのとほぼ同じくらいRXR刺激に対し感受性であるが、しかし、双方のレセプターの同時の活性化は、PPARγ単独のこの(おそらく最大の)刺激の上に付加的でない。これらの結果は、PPARγ/RXRヘテロダイマーの活性化が正常の非悪性の表現型により特徴的な遺伝子発現の変化を引き起こすことを示す。
ブラン(Brun, R.P.)ら、Genes& Development 10:974-984 (1996) ゾウ(Zou, Z.)ら Science256:526-529 (1994) レギンバルド(Regimbald,L.H.)ら Cancer Research 56:4244-4249 (1995)
成長を2段階クローン原性アッセイでもまた検討した。これらの同一の細胞を最初に15日間トログリタゾンもしくはベヒクル(DMSO)で処理した。それらをその後トリプシン処理し、そして同一培地中に低密度でプレート培養したか、もしくは他の条件に「乗り換えた(crossed-over)」。プレート培養された細胞数の同等性および細胞の生存率を、細胞を計数すること、およびそれらのトリパンブルーを排除する能力を検査することにより確実にした。クローン原性の成長を2週間進行させた。図18cに示されるように、前処理および処理双方の間ベヒクル中にあった細胞は、最も夥しい最大かつ最も高密度のコロニーを発生した。処理前および処理後双方の間トログリタゾンに曝露された細胞は、大きさがより小さい最少のコロニーを示し、また、より少なく密にもまた染色していた。興味深いことに、対照培地で前処理されそしてその後トログリタゾン中に「乗り換えられた」細胞はコロニー数および密度の若干の減少を示した一方、トログリタゾンで前処理されそしてその後対照培地中に遊離された細胞は、リガンドに継続的に保たれたものと本質的に同等のクローン原性の成長の著しい低下を有する。これらの結果は、PPARγの活性化がクローン原性の細胞成長を低下させることを示し、そしてまた、この影響は一旦発生されればリガンドの除去により直ちに復帰されないことも示唆する。
Chem 272:5128-5132 (1997);キャンプ(Camp)ら、J Biol Chem 272:10811-10816 (1997)]は、最近、MAPキナーゼがPPARγをセリン112で直接リン酸化し得、また、このリン酸化された形態のレセプターは大きく低下された転写活性および分化を促進するより小さい能力を有することを示した。われわれは、従って、21MT細胞に存在する高い内因性MAPキナーゼ活性がそれらの乏しい応答を説明し得るかどうかを求めた(asked)。図19aに示されるように、これらの細胞へのMAPキナーゼ(MEK)阻害剤PD098059の適用は、ベヒクルで処理された細胞に関して脂質蓄積の増大を引き起こした。さらに、トログリタゾン単独で処理された細胞のわずか10%がオイルレッドOで染色した一方、トログリタゾンおよびPD098059の組み合わせは細胞の少なくとも半分に脂質を蓄積させた。図19cは、PD098059がこれらの細胞での活性化されたMAPキナーゼのレベルを低下させたことを具体的に説明する。これらのデータに一致して、PD098059で処理された細胞は、リン酸化されない、より活性の形態のPPARγのより多くを示し、これらは、MAPキナーゼのリン酸化された形態より速い電気泳動での移動性を有することが示されている[フー(Hu,
E.)ら、Science 274:2100-2103 (1996)]。
フー(Hu, E.)ら Science274:2100-2103 (1996) アダムス(Adams)ら、J Biol Chem272:5128-5132 (1997) キャンプ(Camp)ら、J Biol Chem272:10811-10816 (1997)
ゾウ(Zou, Z.)ら Science256:526-529 (1994)
D.)ら Hybridoma 3:223-232 (1984)]。Muc−1の厳密な機能は既知でないとは言え、癌腫でのその高発現は、おそらくその大きな大きさおよび大きな負の電荷により、細胞と細胞、および細胞と細胞外マトリックスの接触を低下させる。腫瘍の進行でのMuc−1の直接の役割はMuc−1 −/−マウスで立証されており、ここで、乳房組織中でポリオームミドルT抗原により誘発された腫瘍は、対照マウスに比較してMuc−1が不完全なマウスで有意により遅い成長速度を有することが見出された[スパイサー(Spicer,
A.P.)ら、J B C 270:30093-30101 (1995)]。
クフェ(Kufe, D.)ら Hybridoma3:223-232 (1984) スパイサー(Spicer, A.P.)ら、J B C270:30093-30101 (1995)
E.)ら Science 274:2100-2103 (1996)]および他者[アダムス(Adams)ら、J Biol Chem 272:5128-5132
(1997);キャンプ(Camp)ら、J Biol Chem 272:10811-10816 (1997)]は、最近、PPARγがMAPキナーゼによるリン酸化の直接の標的であり、また、この修飾がこのレセプターの転写および脂肪形成の活性の劇的な低下をもたらすことを示した。乳癌を包含する多くの癌がMAPキナーゼの上昇されたレベルおよび/もしくは活性を伴っている[シヴァマラン(Sivamaran,
V.S.)ら、Journal Clinical Investigation 99:1478-1483 (1997)]ため、これが悪性病変の過程でPPARγの機能を封鎖している可能性があり、そしてまた合成化合物でのこのレセプターの活性化の有効性を制限もするかも知れないという懸念が存在する。21MT細胞系での研究はMAPキナーゼ阻害剤とのトログリタゾンの相乗効果を示し、このタンパク質キナーゼがこれらの細胞でPPARγの機能を調節し得ることを強く示唆する。
フー(Hu, E.)ら Science274:2100-2103 (1996) アダムス(Adams)ら、J BiolChem 272:5128-5132 (1997) キャンプ(Camp)ら、J BiolChem 272:10811-10816 (1997) シヴァマラン(Sivamaran, V.S.)ら、JournalClinical Investigation 99:1478-1483 (1997)
当業者は、わずかに慣例の実験を使用して、本明細書に記述された本発明の特定の態様に対する多くの同等物をはっきりと理解することができるか、もしくは確かめることが可能であることができる。こうした同等物は以下の請求の範囲により包含されることが意図される。
Claims (11)
- PPARγのmRNAもしくはPPARγタンパク質の存在を検出することを含んで成る、過剰増殖性細胞のサンプルでの脂肪肉腫の検出する方法であって、サンプルの細胞中のPPARγのmRNAもしくはタンパク質の存在が前記サンプル中の脂肪肉腫細胞の存在を検出する、方法。
- 前記サンプルが、軟組織の過形成もしくは新形成から得られる生検である、請求項1記載の方法。
- (a)(i)PPARγタンパク質、および
(ii)試験化合物を含有する反応混合物を形成する工程;
(b)試験化合物とPPARγタンパク質の相互作用を検出する工程、
(c)PPARγタンパク質に特異的に結合する工程(b)の試験化合物をPPARγ応答性の過剰増殖性細胞と接触させる工程; および
(d)前記形質転換されたPPARγ応答性の過剰増殖性細胞の成長を阻害する工程(c)からの作用物質を同定する工程、
を含んで成る、PPARγ応答性の過剰増殖性細胞の成長を阻害する作用物質を同定するための試験化合物のスクリーニングのためのアッセイ。 - 反応混合物が、細胞ライセートおよび精製されたタンパク質調製物から成る群から選択される細胞を含まない混合物である、請求項3に記載のアッセイ。
- 反応混合物がPPARγタンパク質を発現する全細胞である、請求項3に記載のアッセイ。
- 工程(a)および(b)が、
(i)a.PPARγポリペプチド、および
b.PPARγポリペプチドに応答性の1種もしくはそれ以上の転写調節要素と影響を及ぼす連結にあるレポーター遺伝子を含有するレポーター遺伝子構築物を含有する細胞を提供すること;
(ii)その細胞を試験化合物と接触させる工程;および
(iii)レポーター遺伝子の発現を測定する工程、
を含んで成る、請求項3に記載のアッセイ。 - アッセイが、最低100個の異なる試験化合物の多様なライブラリーについて反復される、請求項3に記載のアッセイ。
- 試験化合物が、小さな有機分子および天然の産物の抽出物から成る群から選択される、請求項3に記載のアッセイ。
- PPARγ応答性の過剰増殖性細胞が形質転換された脂肪細胞である、請求項3に記載のアッセイ。
- 前記PPARγ応答性の過剰増殖性細胞の成長の阻害剤として同定される1種もしくはそれ以上の化合物の製薬学的調製物を調製する工程をさらに含んで成る、請求項3に記載のアッセイ。
- 前記PPARγ応答性の過剰増殖性細胞が形質転換された脂肪細胞である、請求項10に記載のアッセイ。
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