SE500453C2 - Ett in vitro förfarande för utvärdering av en substans effekter - Google Patents

Ett in vitro förfarande för utvärdering av en substans effekter

Info

Publication number
SE500453C2
SE500453C2 SE9102901A SE9102901A SE500453C2 SE 500453 C2 SE500453 C2 SE 500453C2 SE 9102901 A SE9102901 A SE 9102901A SE 9102901 A SE9102901 A SE 9102901A SE 500453 C2 SE500453 C2 SE 500453C2
Authority
SE
Sweden
Prior art keywords
cells
solvent
hormone
receptors
containers
Prior art date
Application number
SE9102901A
Other languages
English (en)
Other versions
SE9102901D0 (sv
SE9102901L (sv
Inventor
Stefan Nilsson
Maarten Oesterlund
Karin Heeroma
Original Assignee
Karobio Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=20383927&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SE500453(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Karobio Ab filed Critical Karobio Ab
Priority to SE9102901A priority Critical patent/SE500453C2/sv
Publication of SE9102901D0 publication Critical patent/SE9102901D0/sv
Priority to PCT/SE1992/000698 priority patent/WO1993007290A1/en
Priority to DE69221629T priority patent/DE69221629T2/de
Priority to AT92921468T priority patent/ATE156862T1/de
Priority to EP92921468A priority patent/EP0607268B1/en
Priority to AU27735/92A priority patent/AU657171B2/en
Priority to JP5506843A priority patent/JP2698476B2/ja
Priority to CA002120604A priority patent/CA2120604C/en
Priority to US08/211,487 priority patent/US5578445A/en
Priority to DK92921468.2T priority patent/DK0607268T3/da
Priority to ES92921468T priority patent/ES2104945T3/es
Publication of SE9102901L publication Critical patent/SE9102901L/sv
Priority to NO19941246A priority patent/NO310439B1/no
Priority to FI941611A priority patent/FI103672B1/sv
Publication of SE500453C2 publication Critical patent/SE500453C2/sv
Priority to GR970402995T priority patent/GR3025354T3/el

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

35 ßgskgivning gv uppfinningen Föreliggande uppfinning är inriktad på ett in vitro förfaran- de för utvärdering av en receptorbindande testsubstans anta- gonistiska kontra agonistiska effekter på en utvald typ av celler som innehåller endogena intracellulära hormonrecepto- rer. Förfarandet utförs så a) att ett prov av nämnda celler, i ett definierat första medium som uttömts på hormon, fördelas i flera separata odlingsbehållare, såsom mikrotiterbrunnar, b) att behållarna enligt a) inkuberas i en temperatur- och fuktreglerad kammare under en lämplig tidsperiod för upprät- tande av stabil celltillväxt, c) att efter b), det förbrukade första mediet ersätts med ett definierat andra medium som uttömts på hormon, d) att de lika behandlade behållarna enligt b) indelas i fyra grupper, dltill d4, som var och en omfattar minst en behålla- re, i respektive fall, a* till di, een varje behållare behand- las i de efterföljande stegen,_ e) er: till behållaren: dl sättes nämnda testsubstans, löst i ett första lösnings- medel, vid en känd koncentration, dz sättes en referenssubstans, vilken är känd som antingen en antagonist eller en agonist, löst i ett andra lösningsmedel, vid en koncentration som är känd att resultera i en distinkt cellulär respons som valts för analys, da sättes nämnda första lösningsmedel och nämnda andra lös- ningsmedel, 10 15 20 25 30 35 d° sättes nämnda testsubstans, löst i nämnda första lösnings- Vmedel, vid samma koncentration som användes för dfl och nämnda referenssubstans, löst i nämnda andra lösningsmedel, vid I »samma koncentration som användes för_d2, varvid det första lösningsmedlet och det andra lösningsmedlet är samma eller olika, och mängden av det första lösningsmed- let och mängden av det andra lösningsmedlet inte överskrider en nivå som är känd för att vara skadlig för cellerna, f) att alla behållarna dl till d4 inkuberas i en temperatur-, och fuktreglerad kammare under en tidsperiod som är till- räcklig för att substanserna skall påverka cellerna till en sådan grad att en distinkt cellulär respons som valts för analys uppnås, g) att de inkuberade behållarna enligt f) alla analyseras med avseende på magnituden av den valda cellulära responsen som resulterar från hormon/receptor-interaktion, och h) att nämnda testsubstans antagonistiska kontra agonistiska effekter på nämnda utvalda typ av celler utvärderas från en jämförelse mellan de analyserade magnituderna av den valda cellulära responsen som erhållits för nämnda grupper dl till Sålunda är förfarandet inriktat på utvärdering av en test- substans, vilken man vet binder till intracellulära hormon- receptorer. Det finns två möjligheter, nämligen att test- substansens effekter är okända eller att de intracellulära hormonreceptorernas egenskaper är okända. Testsubstansens bindning till de intracellulära hormonreceptorerna hos en utvald typ av celler kan bekräftas genom välkända metoder inom teknikområdet, t ex bindningsstudier. 10 15 20 25 30 35 _4 Uttrycket “celler som innehåller endogena intracellulära hormonreceptorer" avses betyda att intracellulära hormon- receptorer kodas av cellernas omanipulerade genom, i motsats till det fall där generna för hormonreceptorerna har trans- fekterats in i celler.
I en utföringsform av uppfinningen sättes det första lös- ningsmedlet och det andra lösningsmedlet som användes vardera :in var och en av benåliarna a* :in a“, i ae mängder sam användes för behållarna i grupp dl respektive grupp dz. I detta fall elimineras den eventuella effekten av olika mäng- der lösningsmedel i behållarna.
I en annan utföringsform av uppfinningen är cellerna av den valda typen förankringsberoende celler. Sådana celler har använts i den experimentella delen av föreliggande beskriv- ning.
I ännu en annan utföringsform av uppfinningen omfattar be- hållarna dl i gruppen dl ökande koncentrationer av nämnda testsubstans. I detta fall blir det möjligt att samtidigt utvärdera testsubstansens effekter vid olika koncentrationer.
I ytterligare en annan utföringsform av uppfinningen omfattar behâllarna dz i gruppen dz ökande koncentrationer av nämndai 'referenssubstans. I detta fall blir det möjligt att utvärdera referenssubstansens effekter vid olika koncentrationer.
I ytterligare en annan utföringsform av uppfinningen härstam- mar cellerna av den valda typen från däggdjursben, -hjärta, -bröst eller -lever. I en föredragen utföringsform härstammar cellerna av den valda typen från humant ben, hjärta, bröst, lever eller endometrium.
I en ytterligare utföringsform av uppfinningen utförs för- farandet på minst två valda typer av celler, vilka härstammar från olika typer av vävnader, varigenom utvärdering av den 10 15 20 25 30 “35 5 valda testsubstansens mönster av antagonistiska kontra ago- nistiska effekter på nämnda typer av vävnader möjliggörs. Vid utveckling av läkemedel är det av största vikt att kunna utvärdera en vald testsubstans mönster av antagonistiska kontra agonistiska effekter på olika typer av vävnader. I ett föredraget fall av denna utföringsform härstammar typen av vävnader från minst två medlemmar ur den grupp som består av däggdjurs och särskilt humant ben, hjärta, bröst, lever och I endometrium.
I en föredragen utföringsform av uppfinningen innehåller cellerna av den valda typen receptorer som är medlemmar av den grupp som består av steroidhormonreceptorer, thyroidea- hormonreceptorer och vitamin D-receptorer.
I en ytterligare utföringsform är steroidhormonreceptorerna valda bland östrogenreceptorer och glukokortikoidreceptorer.
I ytterligare en annan utföringsform av uppfinningen är magnituden av den för analys valda cellulära responsen mäng- den av en specifik proteinprodukt, vars genexpression styrs av hormon/receptorinteraktion. Den specifika proteinprodukten är företrädesvis en extracellulär proteinprodukt, och är i en utföringsform en endogen proteinprodukt.
Den valda cellulära responsen som resulterar från hormon/-I receptorinteraktion behöver inte vara den uttryckta mängden av en proteinprodukt, utan kan vara exempelvis ökningen eller minskningen av cellproliferationshastigheten.
Vidare kan mängden av en uttryckt proteinprodukt analyseras med hjälp av en enzymatisk analys eller en kommersiell immu- nologisk analys som utnyttjar antikroppar vilka är specifikt riktade mot den valda proteinprodukten. Exempel på konventio- nella analyser är ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) och RIA (Radio Immunological Assay), men andra analyser är V också kända inom teknikområdet. 10 15 20 25 30 35 Tillämpning av uppfinningen på celler som innehåller endogena intra-cellulära steroid- och thyroideahormonrgceptorg;.
Steroid- och thyroideahormoner har en gemensam verknings-_ imekanism på cellnivå. De flesta av oliganderade receptorer är nukleära proteiner, med undantag för glukokortikoidreceptorn som anses vara cytoplasmisk. Receptorerna kan indelas i tre domäner: en domän binder till hormonet, en domän binder till DNA och den tredje domänen tycks vara viktig för interaktion med andra proteiner, Verkningsmekanismen är följande: hormo- 'net.kommer in i cellen, antingen genom passiv diffusion eller genom andra mekanismer, och binder till receptorn. Efter det att liganden bundits till receptorn undergår receptorn en konformationsförändring, och blir aktiverad. Detta möjliggör för receptorn att binda till specifika DNA-sekvenser, så kallade hormonresponselement, vilka är belägna i närheten av de hormonellt reglerade generna. Receptorn interagerar med transkriptionsfaktorer för att reglera expressionen av gener. Det finns vissa transkriptionsfaktorer som återfinns' i alla celler, och därtill finns det transkriptionsfaktorer som är celltyp-specifika. Regleringen kan vara negativ eller positiv beroende på promotoromgivningen och kollektionen av transkriptionsfaktorer som finns i cellen. Det som bestämmer om en hormonellt reglerad gen skall uttryckas eller ej i en cell är inte endast närvaron av hormon och receptor, utan också cellspecifika transkriptionsfaktorer.
'Föreliggande uppfinning har att göra med celler som har endogena intracellulära receptorer, i motsats till EP-A-0 287 653, där generna för hormonreceptorer är transient transfekterade i hormonreceptornegativa celler.
Sålunda, genom att testa hormonagonister och -antagonister i en cell-linje som härstammar från en vävnad som är av intresse för den specifika indikationen, är det möjligtv att förutspå effekten in vivo på cellnivå. 10 Steroid- och thyroideahormonanaloger har använts i läkemedel under en lång tid. Användningen av dessa typer av föreningar ger ofta upphov till biverkningar på grund av deras brist på vävnadsselektivitet. Det finns ett behov av förbättrade __ föreningar med selektiv effekt. Antiöstrogener, såsom tamox- ifen, används vid behandling av bröstcancer. Många bröst- cancrar är beroende av östrogener för tillväxt och genom att blockera receptorn med antiöstrogener hämmas tumörtillväxten.
Användningen av tamoxifen är emellertid förknippad med en förekomst av nya primära tumörer på andra ställen, såsom endometrium och lever. Detta resulterar från tamoxifenets östrogenaktivitet på dessa ställen.
Hormonersättningsterapi, vilket betyder administrering av östrogener till kvinnor efter klimakteriet, förhindrar osteo- poros. Denna terapi är emellertid inte accepterad i vissa länder på grund av den ökade risken för bröstcancer. En benselektiv östrogenanalog skulle ge en avsevärt förbättrad osteoporosterapi.
Exempel på sådana gener som uttrycker genprodukter, vilka kan mätas för bestämning av en testförenings antagonistiska kontra agonistiska effekter vid förfarandet enligt uppfin- ningen, uppräknas nedan. Dessa gener kan antingen vara posi- tivt eller negativt reglerade av hormoner och detta kan förekomma i endast vissa celltyper.
Gener som regleras av östrogener: progesteronreceptor katepsin D TPA pS2 urokinas LDL-receptor alkaliskt fosfatas 10 15 20 25 30 IGF“I IGF II TGF, alfa EGF-receptor jun (transkriptionsfaktor) fos (transkriptionsfaktor) myc ' Gener som regleras av glukokortikoider: tyrosin-amin-transferas (tat) kollagen osteokalcin- NaKATPas kcllagenas urokihas Gen som regleras av vitamin D3: osteokalcin Gener som regleras av thyroideahormoner: NaKATPas_ beta-adrenergaAreceptorer tillväxthormon (Yaffe and Samuels, 1984, JBC 260, 6284-6291) LTSH (thyroid stimulating hormone) (Shupnik et al., 1985, JBC 260, 2900-2903) ~ malic enzyma (æawle et al., 1991, siøcnemistry 20, 3486-3492) S14("spot14") (Liaw and Towle, 1984, JBC 259, 7253-7260) alpha myosin heavy chain (Izumo et al., 1984, Science 231, 591-600) beta mycsin heavy chain (Izumo et al., 1984, Science 231,_ 9 597-soo) 10 15 20 25 30 35 9» _ ~ , Exgggiment som utförts med användning ag fiögfagandet enligt uppfinningen est- och referenssubstanser agonist: öštradiol (E¿) (Sigma, produkt Nr E 1132) Partiell antagonist: tamoxifen (Tam) (en gåva från Örion 1 Corporation Farmos, Åbo, Finland) LY 117018 (en gåva från Eli Lilly, USA; en non-steroid bensotiofen, Endocrinology 113 (1983) 611-617) Antagonist: Lösningsmedel: 0,01% - o,s%'i etanol för öscraaiol A 0,01% f 0,5% i etanol för tamoxifen 0,01% - 0,5% i etanol för LY 117018 Media: Coon's medium utan fenolrött (till- verkat av Statens Veterinärmedicinska Anstalt, Uppsala, Sverige, i enlighet med instruktioner givna i SIGMA-kata- Första medium (A): logen) + 10% fetalt kalvserum (FCS) [2 ggr uttömt på hormon med dextran-över- draget kol (2xDCC)] + 1% icke-essentiella aminosyror (från Gibco-BRL)- Andra medium (B): Coonfs medium utan fenolrött + 1% FCS (2xDCC) 10 15 20 25 30 35 10 + 5% serumsubstitut (köpt från Dr. 9 Alan Preston, Med. Vet. supplies limi- ted, Botolth Clayton, Buckingham, MK 18 2LR, u.x.) “ Ham's F12 utan fenolrött (tillverkat av Statens veterinärmedicinska Anstalt, Uppsala, Sverige, i enlighet »med instruktioner givna i produktkata- logen från GIBCO BRL) I Första medium (C): + 1% Fcs (zxocc) + 5% serumsubstitut (från Dr. Alan Preston) QS2 Två experiment utfördes med användning av de humana bröstcan- -cerceilinjerna nerv (nwcc ars 22) resp. zu vs-1(Aæcc car? 1500). Den för analys valda cellulära responsen var mängden uttryckt protein pS2, vars expression regleras av östrogen- receptorn. Agonisten östradiol användes som en referenssub- stans och effekterna av den partiella antagonisten tamoxifen utvärderades. Mängden pS2 som utsöndrats i mediet bestämdes med hjälp av en kommersiell RIA (ELSA PS2 från CIS Bio- iindustries, Gif-sur-Yvette, Frankrike).
Utförande av förfarandet förklaras av praktiska skäl samti- digt för de två cell-linjerna. _ Da 1: Prover av cellerna ZR75-1 (8xl05 celler) resp. MCF7 (4xl05 celler), fördelades i petriskålar av plast (lämpliga för odling av däggdjursceller). Cellerna suspenderades i det första mediet (A). Fyra skålar per cellinje användes. Dessa 10 15 20 25 30 35 Vien petriskål/cellinje 11 petriskålar inkuberades vid 37'C och St C02 i en temperatur- och fuktreglerad kammare. - Det första mediet utbyttes mot det andra mediet. Följande_ _ hormontillsättningar gjordes: ingen hormontillsättning en petriskål/cellinje - + 10 nn östradiol (82) en petriskål/cellinje - + 100 nn tamoxifen (Tam) 9 en petriskål/cellinje - + 10 nM östradiol + 100 nM tamoxifen Petrískålarna inkuberades i den temperatur- och fuktreglerade kammaren under samma betingelser som ovan.
Dag 7:- 48 timmar efter hormontillsättningen undersöktes antalet celler och deras morfologi. Medium från varje petriskål över- fördes till Eppendorf-rör och centrifugerades 7 minuter vid» _1000 varv per min (Eppendorfcentrifug). Mängden pS2 i medie- proverna analyserades med hjälp av en kommersiell pS2 RIA (ELSA PS2) . i Resultat: V De relativa mângderna av Q§2 som utsöndrats i mediet (mängden 252 som utsöndrats från resggktive cellinjer utan tillsatt hormon es v” e . ma: zLLLi-v - ingen hormontillsättning 1 1 +z2(1o nu) 1,39 ~ 3,130 + Tam(100nM) 1,36 3,78 »æzuonm + -æamuoonny 0,74 1 triumf, f* 'xšäxm-*Åraaåivasfls salsa-Aer t* vf; - 15A 20 25 30 35 m1*';;,,,>¥f?g,w33¿,,;i flg*_wz;lf,°ü,_ä*irn§1w 'få “Wi .ia-lf l> 'mw *m4- -:s~'*š',;a¿~'ï it.- 'k-a» 4.- ~ _ _ fi. a - f 12 Man kan se att graden av induktion av pS2-expression från ZR- 75-1-celler är högre än den för MCF7-celler, 1 närvaro av enbart Ez (3,7x respektive 1,4x) eller enbart Tam (3,8x res- pektive 1,4x). Det faktum att tamoxifen kan fungera som en agonist i humana bröstcancerceller, särskilt vid låga koncen- trationer (< 10* M) och i frånvaro av Ez eller fenolrött 1 odlingsmediet, är tidigare känt (se Br. J. Cancer (1989), 52: 727-vas, aan cancer nes. (1988), gg: 3693-3691). Detta kända faktum bekräftas med förfarandet enligt uppfinningen. I när- varo av både 82«och Tam i odlingsmediet inhiberas emellertid expressionen av pS2 till samma nivå (eller lägre) som 1 från- varo av hormontillsättning. Detta gäller för både ZR-75-1- och MCF7-celler.
Man kan fastställa att pS2 kan induceras av Ez i bröstcancer- cell-linjerna MCF7 och ZR-75-1. Därtill kan man fastställa att 10” M tamoxifen fungerar som agonist i de båda cell- linjerna MCF7 och ZR-75-1 i frånvaro av Ez. Vidare fungerar 104 M tamoxifen som en antagonist i närvaro av 10* M Ez. V Kategsin D Experimentet utfördes med användning av den humana bröstcan- cercell-linjen MCF7 (ATCC HTB 22). Den för analys valda cellulära responsen var mängden uttryckt katepsin D (Cath D), vars expression regleras av östrogenreceptorn. Agonisten östradiol användes som en referenssubstans och effekterna av 1 den partiella antagonisten tamoxifen respektive antagonisten LY 117018 utvärderades. Därtill utvärderades effekterna i närvaro av både östradiol och tamoxifen, samt effekterna av både östradiol och LY 117018. Den mängd Cath D som utsöndrats i mediet bestämdes med hjälp av en kommersiell RIA (ELSA- CATH-D från CIS Bioindustries, Gif-sur-Yvette, Frankrike).
Utförande av förfarandet är som följer: 10 15 20 25 30 35 13 Qaflall Ett prov av cell-linjen MCF7 (4x10* celler) fördelades Vi petriskålar av plast (lämpliga för Odling av däqgdjurs- celler). Cellerna suspenderades i det första mediet (C).
Petriskålarna inkuberades vid 375C øch 5% C0¿iiien temperatur- och fuktreglerad kammare.
Qâ9_2¿ .Det första mediet (C) utbyttes mot det andra mediet, som bestød av färskt första medium (C). Följande hormontillsätt- ningar gjordes: ingen hormontillsättning + 10 nn östradiol (Så) ' - - + 100 nu tamoxifen (Tan) + 4- två petriskâlar/hormontillsättning 100 nu LY 117018 10 nn östradiol + 100 nä tamoxifen V " - + 10 nn östradiol + 100 nn 'Lv 117018 W av Petriskâlarna inkuberades i den temperatur- och fuktreglerade kammaren under sama betingelser som ovan. a I 2 72 timar efter hormontillsättningen utfördes visuell inspek- tion av antalet celler och deras morfologi. Medium från varje petriskâl överfördes till Eppendorf-rör och centrifuqerades A 7 minuter vid 1000 varv per minut (Eppendorf-centrifug).
Mängden Cath D i medieproverna analyserades med hjälp av den kommersiella Cath D RIA (ELSA-CATH D). 10 20 25 30 35 i ' V" t ïïí-le.”lfle.i.°ïaàå*“~..nräklïi 'f-'Qfia fin; i* .ß- -“ - > - '* - w 1. ingen hormontillsättning V 1 2. + s, (10 nn) “ 2,22 3. + ram (100 nu) 1,23 4. + 1.2 112010 (100 nn) A 0,00 s. + a, (10 nu) + 'ram (100 nu) 1 2,43 's. + az (10:01) + 1.1' 112010 (100 nu) '- 0,16 Man kan se att LY 117018 fungerar som en antagonist både i frånvaro och i närvaro av Ez (jämför raderna 1, 4 och 6), medan Tam uppvisar svag agonism i frånvaro av Ez (jämför raderna 1 och 3) och ingen antagonism i närvaro av Ez (jämför raderna 2 och 5). Det är tidigare känt att tamoxifen är en partiell agonist i bröst, särskilt vid låga koncentrationer (< 10* M) och i frånvaro av Ez eller fenolrött i odlingsmedi- et (såsom redan angivits i experimentet med pS2). Anledningen till att Tam inte fungerar som en antagonist i närvaro av EZ i detta experiment jämfört med pS2-experimentet kan bero på det faktum att de två experimenten inte har samma försöksupplägg- ning. En intressantare förklaring kan vara att den mekanism som ligger till grund för förmågan hos östrogenreceptorn att reglera expressionen av generna Cath D respektive pS2, skil- vjer sig avsevärt, vilket kan förklara varför 100 nu Tam (i närvaro av 10 n!! Ez) var tillräckligt* för nedreglering av pS2 ' men inte Cath D (se Br.J. Cancer (1989), 52: 727-738).^_ Man kan dra den slutsatsen att Cath D kan induceras av Ez i bröstcancercell-linjen MCF7, och att IOJ M tamoxifen fungerar som en svag agonist i frånvaro av Ez. Därtill fungerar inte (104 M tamoxifen som en antagonist i närvaro av 10* H E21 Slutligen verkade 10” M LY 117018 som en östrogen antagonist både i frånvaro och i närvaro av 10* M Ez. 15 20 25 30 35 , ~w ' f» w H1. ~ . .s v ~ > _' . , , i ,, ., , ' ”šgiíšwmøa.ílq2.fllïfrr=.sf.sl_m«fdwfi.xø'f_,,pßra.«ëu.vfldnkdefflc; äfz.<flf....f*.;. ~=..@..-.>- m *_ o" a t» «~~. 1 .~ » 15 Experimentet utfördes med användning av en reportercell-linje (ZR 75-AF) som hade konstruerats genom en stabil transfektion av den humana bröstcancercell-linjen ZR 75-1 (ATCC CRL 1500) med en plasmid som omfattar ERE (estrogen responsive element) och Alk. phos. (alkaliskt fosfatas) som reporterprotein. en för analys valda cellulära responsen var sålunda mängden uttryckt Aik. phos., vars expression regleras av östrogen- receptorn. Bxpressionen av Alk. phos. studeras i närvaro av olika koncentrationer av agonisten östradiol, antagonisten tamoxifen och i närvaro av både östradiol och tamoxifen.
V Mängden Alk. phos. som utsöndrats i mediet bestämdes genom en kemoluminiscensmetod baserad på AMPPD (dinatrium-3-[4- metoxi-spíro[1,2-dioxitan-3,2'-tricyklo[3.3.l]dekan]-4fyl]- fenylfosfat) (Tropix Inc, USA) som substrat.
Förfarandet utfördes på följande sätt: Da 1: Ett prov av cellerna ZR 75-AP fördelades i petriskålar av plast (lämpliga för odling av däggdjursceller). Cellerna Vsuspenderades i det första mediet (A). Dessa petriskålar inkuberades vid 37°C och 5% C02 i en temperatur- och fukt- reglerad kammare. l Da 4: Ett prov av cellerna ZR 75-AF (4xl0' celler/brunn) fördelades i en mikrotiterplatta med 96 brunnar. Cellerna suspenderades i färskt första medium (A). Plattan inkuberades vid 37'C och 5% CO¿í.en temperatur- och fuktreglerad kammare. 10 15 Desam 16 Det första mediet (A) utbyttes mot det andra mediet (B).
Följande hormontíllsättningar gjordes: Experiment 1: 3 brunnar/hormon 'VI V! Il II I! V! Experiment 2: 3 brunnar/hormon 'N H W +++++++++++++ ingen hormontillsättning 10-." M ösnraaicn (sz) 104* M sz 1o'*° M sz 10* M s! 10-8 M m2 10” M sz ++++++ ingenlhormontillsättning rl0'w M Tamoxifen (Tam) 10'9 M ram. 10* M Tam 10” M ram 10* M 'ram sno-f' M ram 1nM 1nM 1nM 1nM lnM lnM 1nM + l0'm M Tam + 10'° M 'ram + 1o°° M ram + 10-' M 'ram + 1045 M 'ram + 5x10¿ M Tam 48 timmar efter hormontillsättningen undersöktes antalet celler och deras morfologi. Medium från varje brunn över- fördes till Eppendorf-rör och inkuberades vid 65'C under 10 minuter. Den relativa mängden av Alk. phos. bestämdes sedan genom en kemoluminiscensanalys (Tropix Inc., USA).
..,-.M..._.,.,.,..,.~«~<--- , m, _.. . 10 15 20 25 11 .a 8 f 'd_*2 , 111112- 8 ' ' V - ' ' a den Alk. ghgs, som utsöngratg gtgg gg;gggg¿11g§t§nLnQ_92§ gägdgt 1), ^ . V a 'v v ingen hormontíllsättningv 1 + 1042 M 22 , 1 1,05 + 10-” M 82 1,12 + 10-” n 82 3,26 -+ 10* M az 5,61 + 10* M az 6,85 + 10” M sz 1,90 Egggriment 2: Den relativa mängden av Alk. ghosa som utsönd- rats i mediet i närvaro av olika koncentrationer av Tan och olika koncentrationer av gam i närvaro av ln! Ez (mängden Alk. ghos. som utsöndrats utan hormontillsättníng ges värdet 1) relativ mägd av ¿;k. ghgs. ~ _82 +1nn s, 1 ingen Tam-tillsättning 1 ' 8,97 + 10-1” u ram 1,13 d 9,50 + 10-9 11 ram 1,08 9,12 + 10-8 11 ram 1,21 10,28 *+ 10-7 11 'ram 1,80 1,51 + 10-” n man 3,11 3,65 + sno-f' 1. 'ram 2,81 2,62 Man kan se att graden av induktion av värmestabilt Alk. phos. från reportercell-linjen ZR 75-AP beror på koncentrationen av Ez. En ökad utsöndring av Alk. phos. kan redan ses vid l0'm M 82. Vid 10” M Ez nås induktionsgraden 7,9; Tamoxífen (IOJ H) fungerar ensam som en svag agonist. En maximal agonisteffekt nås vid 104 M Tamoxífen. Såsom här tidigare angivits är det tidigare känt att Tamoxífen kan fungera som en agonist 1 10 15 18 humana bröstcancerceller i frånvaro av Ez eller fenolrött i odlingsmediet. I närvaro av både Tamoxifen och Ez (1 nn) inhiberas expressionen av Alk._phos. av Tamoxifenkoncentra- tioner som överskrider 104 M. Maximal inhibering nås vid 10* M Tamoxifen. I V ' Man kan fastställa att Aik. phos. kan induceras av 82 i reportercell-linjen ZR 75-AF. Vidare kan man fastställa att Tamoxifen i en koncentration av 10* M fungerar som en agonist i frånvaro av EZ. Därtill fungerar Tamoxifen vid en koncentra- tion av 10* M som en antagonist i närvaro av 10* H Ez.
För att studera effekterna av ligander på thyroideahormon- receptorn i lever utfördes följande experiment: En reporterkonstruktion, som innehöll en thyroideahormon > (T3)-reglerad promotor och en gen som kodar för en utsönd- ringsbar form av alkaliskt fosfatas, transfekterades i »humana Hep G2-leverceller. T3 sattes till cellerna och mäng- den alkaliskt fosfatas bestämdes. Enligt preliminära resultat observerades en ökad reporterproteinproduktion efter till- sättning av T3.

Claims (3)

1. LS TO ZAIEEQBBAY 1. In vitro förfarande för utvärdering av en receptorbindan- de testsubstans mönster av antagonistiska kontra agonistiska effekter på minst två utvalda typer av celler som innehåller endogena intracellulära hormonreceptorer och som harstammar från olika typer av vävnader, V ' A k ä n n e t e c k n a t därav, att följande förfarande- steg a)-h) utförs separat för varje utvald typ av celler: a) att ett prov av nämnda celler, i ett definierat första medium som uttömts på hormon, fördelas i flera separata odlingsbehållare, såsom mikrotiterbrunnar, b) att behållarna enligt a) inkuberas i en temperatur- och fuktreglerad kammare under en lämplig tidsperiod för upprät- tande av stabil celltillväxt, ' V c) att efter b), det förbrukade första mediet ersätts med ett definierat andra medium som uttömts på hormon, d) att de lika behandlade behållarna enligt b) indelas i fyra grupper, dl till dy, som var och en omfattar minst en p behållare, i respektive fall, dl till d4, och varje behållare behandlas i de efterföljande stegen, ' A e) att till behållaren: df sättes nämnda testsubstans, löst i ett första lösnings- medel, vid en känd koncentration, dz sättas en referenssubstans, vilken är känd som antingen en antagonist eller en agonist, löst i ett andra lösningsmedel, vid en koncentration som är känd att resultera i en distinkt cellulär respons som valts för analys, 10 15 20 V25 30 35 läåfiääâ&¿§%åä@fimæ$m2au@ww»F 20 d3 sättes nämnda första lösningsmedel och nämnda andra lös- ningsmedel, d“sättes nämnda testsuöstans, löst i nämnda första lösnings- medel, vid samma koncentration som användes för d', och nämnda referenssubstans, löst i nämnda andra lösningsmedel, vid samma koncentration som användes för dz, 3 varvid det första lösningsmedlet och det andra lösningsmed- let är samma eller olika, och mängden av det första lös- ningsmedlet och mängden av det andra lösningsmedlet inte överskrider en nivå som är känd för att vara skadlig för cellerna, f) att alla behållarna dl till d4 inkuberas i en temperatur- och fuktreglerad kammare under en tidsperiod som är till- räcklig för att substanserna skall påverka cellerna till en sådan grad att en distinkt cellulär respons som valts för analys uppnås, g) att de inkuberade behållarna enligt f) alla analyseras med avseende på magnituden av den valda cellulära responsen Vsom resulterar från hormon/receptor-interaktion, och h) att nämnda testsubstans antagonistiska kontra agonistiska effekter på nämnda utvalda typ av celler utvärderas från en' jämförelse mellan de analyserade magnituderna av den valda cellulära responsen som erhållits för nämnda grupper dl till a" och de för varje utvald typ av celler erhållna resultaten bildar tillsammans den receptorbindande testsubstansens mönster av antagonistiska kontra agonistiska effekter på de utvalda olika typerna av vävnadsceller.
2. Förfarande enligt kravet 1, vari nämnda första lösnings-' medel och nämnda andra lösningsmedel båda sätts till var 10 15 20 25 30 35 2/ och en av behållarna d't4ll dfl i de mängder som användes för behållarna i gruppen di respektive gruppen dz.
3.-Förfarande enligt kravet 1, vari cellerna av de utvalda typerna är förankringsberoende celler. 4; Förfarande enligt kravet 1, vari behållarna d' i gruppen ch omfattar ökande koncentrationer av nämnda testsubstans. 5. Förfarande enligt kravet 1, vari behållarna dz i gruppen di omfattar ökande koncentrationer av nämnda referenssub- stans. I I 6. Förfarande enligt kravet 1, vari cellerna av de utvalda typerna härstammar från däggdjurs-ben, -hjärta, -bröst, -lever eller -endometrium. 7. Förfarande enligt kravet 6, vari cellerna av den utvalda typen härstammar från humant ben, hjärta, bröst, lever eller endometrium. 8. Förfarande enligt kravet l, vari cellerna av de utvalda typerna innehåller receptorer som är medlemmar i den grupp som består av steroidhormonreceptorer, thyroideahormon- receptorer och vitamin D-receptorer. 9. Förfarande enligt kravet 8, vari steroidhormonrecepto- rerna är valda bland östrogenreceptorer och glukokortikoid- IQCGPCOI 81' . 10. Förfarande enligt kravet 1, vari magnituden av den cellulära respons som valts för analys är mängden av en specifik proteinprodukt, vars genexpression regleras av hormon/receptorinteraktion. _ 11. Förfarande enligt kravet 10, vari den specifika protein- produkten är en extracellulär proteinprodukt. 312. Förfarande enligt kravet. 10 eller 11, vari den specifika proteinprodukten är en endogen proteinprodukt. p
SE9102901A 1991-10-07 1991-10-07 Ett in vitro förfarande för utvärdering av en substans effekter SE500453C2 (sv)

Priority Applications (14)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE9102901A SE500453C2 (sv) 1991-10-07 1991-10-07 Ett in vitro förfarande för utvärdering av en substans effekter
DK92921468.2T DK0607268T3 (da) 1991-10-07 1992-10-06 In vitro fremgangsmåde til evaluering af virkningerne af et stof
ES92921468T ES2104945T3 (es) 1991-10-07 1992-10-06 Un metodo in vitro para evaluar los efectos de una sustancia.
AU27735/92A AU657171B2 (en) 1991-10-07 1992-10-06 An (in vitro) method of evaluating the effects of a substance
US08/211,487 US5578445A (en) 1991-10-07 1992-10-06 In vitro method of evaluating the effects of a substance
AT92921468T ATE156862T1 (de) 1991-10-07 1992-10-06 In vitro verfahren zur bewertung von effekten einer substanz
EP92921468A EP0607268B1 (en) 1991-10-07 1992-10-06 An in vitro method of evaluating the effects of a substance
PCT/SE1992/000698 WO1993007290A1 (en) 1991-10-07 1992-10-06 An in vitro method of evaluating the effects of a substance
JP5506843A JP2698476B2 (ja) 1991-10-07 1992-10-06 物質の効果を評価するインビトロ法
CA002120604A CA2120604C (en) 1991-10-07 1992-10-06 An in vitro method of evaluating the effects of a substance
DE69221629T DE69221629T2 (de) 1991-10-07 1992-10-06 In vitro verfahren zur bewertung von effekten einer substanz
NO19941246A NO310439B1 (no) 1991-10-07 1994-04-06 In vitro fremgangsmåte for evaluering av et stoffs virkninger
FI941611A FI103672B1 (sv) 1991-10-07 1994-04-07 Förfarande för utvändning in vitro av verkningarna av ett ämne
GR970402995T GR3025354T3 (en) 1991-10-07 1997-11-12 AN -i(IN VITRO) METHOD OF EVALUATING THE EFFECTS OF A SUBSTANCE.

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE9102901A SE500453C2 (sv) 1991-10-07 1991-10-07 Ett in vitro förfarande för utvärdering av en substans effekter

Publications (3)

Publication Number Publication Date
SE9102901D0 SE9102901D0 (sv) 1991-10-07
SE9102901L SE9102901L (sv) 1993-04-08
SE500453C2 true SE500453C2 (sv) 1994-06-27

Family

ID=20383927

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SE9102901A SE500453C2 (sv) 1991-10-07 1991-10-07 Ett in vitro förfarande för utvärdering av en substans effekter

Country Status (14)

Country Link
US (1) US5578445A (sv)
EP (1) EP0607268B1 (sv)
JP (1) JP2698476B2 (sv)
AT (1) ATE156862T1 (sv)
AU (1) AU657171B2 (sv)
CA (1) CA2120604C (sv)
DE (1) DE69221629T2 (sv)
DK (1) DK0607268T3 (sv)
ES (1) ES2104945T3 (sv)
FI (1) FI103672B1 (sv)
GR (1) GR3025354T3 (sv)
NO (1) NO310439B1 (sv)
SE (1) SE500453C2 (sv)
WO (1) WO1993007290A1 (sv)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5461065A (en) * 1993-10-15 1995-10-24 Eli Lilly And Company Methods for inhibiting endometriosis
US6516294B1 (en) 1999-07-01 2003-02-04 The Regents Of The University Of California Nuclear receptor for 1α,25-dihydroxyvitamin D3 useful for selection of vitamin D3 ligands and a method therefor
US20020001797A1 (en) * 2000-06-30 2002-01-03 Mitsuko Ishihara Method for detecting endocrine disrupting action of a test substance
US20080085912A1 (en) * 2006-10-06 2008-04-10 Unitech Pharmaceuticals, Inc. Isoxazole derivatives and methods of treating diseases

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4859585A (en) * 1986-04-17 1989-08-22 Trustees Of Tufts College In-vitro methods for identifying compositions which are agonists and antagonists of estrogens
US5071773A (en) * 1986-10-24 1991-12-10 The Salk Institute For Biological Studies Hormone receptor-related bioassays
US5266464A (en) * 1988-02-10 1993-11-30 Ict Pharmaceuticals, Inc. Method of screening for protein inhibitors and activators
US5091518A (en) * 1989-11-16 1992-02-25 The Salk Institute For Biological Studies Beta retinoic acid response elements compositions and assays

Also Published As

Publication number Publication date
FI103672B (sv) 1999-08-13
SE9102901D0 (sv) 1991-10-07
US5578445A (en) 1996-11-26
EP0607268A1 (en) 1994-07-27
JP2698476B2 (ja) 1998-01-19
ATE156862T1 (de) 1997-08-15
AU657171B2 (en) 1995-03-02
AU2773592A (en) 1993-05-03
ES2104945T3 (es) 1997-10-16
JPH07500184A (ja) 1995-01-05
CA2120604C (en) 1999-08-17
SE9102901L (sv) 1993-04-08
DE69221629T2 (de) 1998-01-22
EP0607268B1 (en) 1997-08-13
DK0607268T3 (da) 1997-09-08
FI103672B1 (sv) 1999-08-13
FI941611A (sv) 1994-04-07
WO1993007290A1 (en) 1993-04-15
CA2120604A1 (en) 1993-04-15
DE69221629D1 (de) 1997-09-18
NO310439B1 (no) 2001-07-02
FI941611A0 (sv) 1994-04-07
NO941246D0 (no) 1994-04-06
NO941246L (no) 1994-04-06
GR3025354T3 (en) 1998-02-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhu et al. Estrogen and thyroid hormone interaction on regulation of gene expression.
Kawai et al. Growth hormone stimulates adipogenesis of 3T3-L1 cells through activation of the Stat5A/5B-PPARγ pathway
Heikkilä et al. Wnt-4 deficiency alters mouse adrenal cortex function, reducing aldosterone production
Lecka-Czernik et al. Activation of peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) by rosiglitazone suppresses components of the insulin-like growth factor regulatory system in vitro and in vivo
Astudillo et al. Increased adipogenesis of osteoporotic human‐mesenchymal stem cells (MSCs) characterizes by impaired leptin action
Sasano et al. In situ estrogen production and its regulation in human breast carcinoma: from endocrinology to intracrinology
Yamamoto et al. Cross-talk between bone morphogenic proteins and estrogen receptor signaling
Wang et al. Presence and possible role of vascular endothelial growth factor in thyroid cell growth and function
Watson et al. The dynamic and elusive membrane estrogen receptor-α
Miyoshi et al. Mutual regulation of follicle-stimulating hormone signaling and bone morphogenetic protein system in human granulosa cells
Kim et al. Involvement of cholesterol-rich lipid rafts in interleukin-6-induced neuroendocrine differentiation of LNCaP prostate cancer cells
Yu et al. Progesterone receptor expression during prostate cancer progression suggests a role of this receptor in stromal cell differentiation
Santen et al. Adaptive hypersensitivity to estrogen: mechanism for superiority of aromatase inhibitors over selective estrogen receptor modulators for breast cancer treatment and prevention.
Yang et al. Expression and activity of C/EBPβ and δ are upregulated by dexamethasone in skeletal muscle
Haisenleder et al. Gonadotropin subunit and gonadotropin-releasing hormone receptor gene expression are regulated by alterations in the frequency of calcium pulsatile signals
Nguyen et al. Acute regulation of translation initiation by gonadotropin-releasing hormone in the gonadotrope cell line LβT2
Matemba et al. Regulation of osteoclastogenesis by gap junction communication
Haisenleder et al. Pulsatile gonadotropin-releasing hormone stimulation of gonadotropin subunit transcription in rat pituitaries: evidence for the involvement of Jun N-terminal kinase but not p38
Walker et al. Developmental profiles of neuroendocrine gene expression in the preoptic area of male rats
Kotula-Balak et al. The meaning of non-classical estrogen receptors and peroxisome proliferator-activated receptor for boar Leydig cell of immature testis
CA2688480A1 (en) Use of fibroblast growth factor 7 (fgf7) and of the receptor fgfr2b as biomarkers
SE500453C2 (sv) Ett in vitro förfarande för utvärdering av en substans effekter
Park et al. Novel roles of luteinizing hormone (LH) in tissue regeneration-associated functions in endometrial stem cells
Bilsland et al. A rapid method for the quantification of mouse hippocampal neurogenesis in vivo by flow cytometry: validation with conventional and enhanced immunohistochemical methods
Volentine et al. Epidermal growth factor in the germinal disc and its potential role in follicular development in the chicken

Legal Events

Date Code Title Description
NUG Patent has lapsed