KR100263137B1 - 오판 수용체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 도 1, 도 13a 또는 도 14b의 아미노산 서열, 또는 도 1, 도 13a 또는 도 14a의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열, 또는 이들 서열과 기능적으로 유사한 아미노산 서열을가지는 ERβ인 수용체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 수용체를 지정하는 DNA 서열에 관한 것이다. 본 발명의 수용체는 전립선암 또는 난소암, 양성 전립막과형성, 중추신경계 질병, 골다공증, 심혈과 질병의 치료에 사용하는 분자를 분리하는데 유용하며, 에스트로겐 및 다른 호르몬 효과에 대해 물질을 시험하는데 유용하다.
Description
세포에게 레티논산, 비타민 D, 스테로이드 호르몬 및 갑상선 호르몬과 같은 분자에 대한 반응성을 부여하는 핵 수용체 거대군이 알려졌다. 많은 연구 끝에 이들 핵 수용체 거대군의 일원들을 "호르몬 반응 요소"(HRE)라고 불리는 분리된 시스-작용 요소에 직접 결합함에 의해 유전자 전사를 활성하시키거나 및/또는 억제한다는 것을 알게 되었다. 이러한 HRE는 반복되며 일치하는 팰랜드롬 형의 6개의 누클레오타이드 DNA 모티브들로 이루어진다는 것 역시 알려졌다. 이들 HRE의 특성은 방향, 이들 사이의 공간적 격리, 하프 사이트(즉, 펠린드롬 서열의 절반)에 의해 결정된다(Umenesono K. 등, 1991 Cell 65, 1255-1266)
DNA의 특이적 결합은 2개의 아연 핑거를 포함하여 모든 핵 수용체에서 보존되어 있는 독특한 DNA 결합 부위에 의해 매개된다. 제1 아연 핑거의 C-말단 염기에서의 3개의 아미노산("P-박스"라고 알려져 있음)은 하프 사이트의 누클레오타이드 서열을 인식하는데 중요하다. 핵 수용체 거대군의 일원들은 이 P-박스에 있는 아미노산 서열에 따라 다르게 분류되었다.
핵 수용체 거대군의 모든 일원은 극도로 다양화된 N-말단 부분을 가지고, 보존된 서열의 "패치"를 몇개 포함하는, 리간드 결합 부분도 가진다.
특징적인 수용체와 구조적으로 관련이 있기 때문에 핵 수용체라고 생각되나 리간드가 밝혀지지 않은 분자를 "오판 수용체(orphan receptor)라고 하며, 많은 오판 수용체가 밝혀져 있다(예를 들어 Evan R.M, (1988) Secinece 240, 889-895 및 O'Malley, B. (1990) Mol. Endocrinol. 4 363-359).
본 발명은 세포의 핵 수용체(nuclear receptor)에 관한 것이다.
도 1은 ERβ의 아미노산 서열과 그것을 지정하는 유전자의 누클레오타이드서열을 나타낸다.
도 2a는 ERβ와 다른 수용체들의 진화를 보여주는 계통발생학적 트리이다.
도 2b는 ERβ와 다른 특정 수용체들 사이에 일치성을 나타낸다.
도 2c는 rERβ, rERα, mErα와 hERα에서의 리간드 결합 부분에서의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 2d rERβ, rERα, mERα와 hERα에서의 DNA 결합 부분에서의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 3a는 본 발명의 수용체의 한 클론인 클론 29가 강하게 발현된 전립선의 감광 필름이다.
도 3b는 전립선의 기포 상피(e)에서 클론 29 신호가 강하게 나타나는 암상(darkfield) 이미지이다. 스트로마는 상대적으로 신호가 약하다.
도 3c는 상피에서의 은 입자를 보여주는 크레실 바이올렛 역염색에서의 양극화 이미지이다. 스트로마는 상대적으로 입자가 적다.
막대는 도 3a에서는 0.7mm, 도 3b에서는 200㎛ 도 3c에서는 30㎛를 표시한다.
도 4a는 다양한 발생단계에서의 난포에서(몇몇은 화살표로 표시되어 있음) 클론 29가 강하게 발현된 난소의 감광 필름이다. 세포조직 사이의 조직(화살표 머리)에서는 신호가 낮다.
도 4b는 초기(1), 2기(2), 3기(3) 및 성숙기(4)의 난포의 과립세포에서 클론 29 신호가 강하게 나타나는 암상(darkfield) 이미지이다. 세포조직 사이의 조직(it)에서는 신호가 낮다.
도 4c는 과립세포(gc)에서의 은 입자를 보여주는 양극화 이미지이다.
난모세포(oc)와 cainterna(ti)에서는 명확한 신호가 없다.
막대는 도 4a에서는 0.9mm, 도 4b에서는 140㎛ 도 4c에서는 50㎛를 표시한다.
도 5a는 클로닝된 ERβ의 리간드 결합의 포화에 대한 분석 결과이다.
도 5b는 클로닝된 ERβ의 리간드 결합 특이성을 나타낸다.
도 5c는 ERβ와 결합하는 E2를 나타낸다.
도 6는 클로닝된 ERβ의 전사 활성을 나타낸다.
도 7과 7a는 다양한 리간드에 의한, 클로닝된 ERβ의 촉진을 나타낸다.
도 8은 레트 에스트로겐 수용체의 발현에서, RT-PCR 실험 결과를 나타낸다.
도 9는 사람 ERβ(hERβ)의 발현에서, RT-PCR 실험 결과를 나타낸다.
도 10a는125I-E2에 대한 hERα와 hERβ의 결합을 비교한 Hill plot이다.
도 10b는125I-E2에 대한 hERα와 rERβ의 결합을 비교한 Scatchard plot이다.
도 11a는 다양한 리간드에 대한 hERα와 rERβ의 상대적인 결합친화력을 나타낸다.
도 11b는 도 11a를 자세히 나타낸 것이다.
도 12는 다양한 에스트로겐 수용체를 배열한 것이다.
도 13a는 사람 ERβ의 아미노산 서열이다.
도 13b는 사람 ERβ의 DNA 서열이다.
도 14a는 mERβ의 아미노산 서열이다.
도 14b는 쥐 ERβ의 DNA 서열이다.
도 15는 다양한 파이토에스트로겐에 대한 본 발명의 수용체의 리간드 결합친화성을 나타낸다.
A. 레트 ERβ의 클로닝
1. PCR-증량화 및 상보적 DNA 클로닝
핵 수용체군의 일원들에서 DNA-결합 부분(P-박스)와 리간드 결합 부분(Ti-스트레치)의 매우 잘 보존된 서열에 따라, 미리 디제너레이션된 프라이머(DBE 1, 2, 3과 WAK/FAK)를 설계하였다 (Enmark, E., Kainu., Pelto-Huikko, M., ＆ Gustafsson, J-Å(1994)Biochem. Biophys. Res. Commun. 204, 49-56). Enmark, E., Kainu, T., Pelto-Huikko, M., ＆ Gustafsson, J-Å(1994) Biochem, Biophys. Res. Commun. 204, 49-56에 기재된 PCR 반응에, 래트의 전립선 총 RNA로부터 역전사된 단일 스트랜드의 상보적인 DNA를 프라이머로 사용하였다. 얻어진 증식 결과물을 2% 저온 멜팅 아가로스 젤에서 분리하고, 400-700 bp 사이의 DNA 생산물을 젤에서 분리한 후, TA 클로닝 벡터(Invitrogen)에 연결하였다. 선택적으로 RP-I/RP-2과 DBD66-100/DBD210-238 프라이머를, Hirose T., Fikimoto, W., Yamaai, T., Kim, K. H., Matsuura, H., ＆ Jetten., A.M. (1994) Mo1. Endocrinol. 8, 1668-1677; Chang C., Lopes. Da silva, S., Ideta, R., Lee, Y., Yeh, S., Burbach, J.P.H (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 6040-6044에 기재된 바와 같이 핵 수용체의 DNA 결합 부분에 정확하게 위치시켰다. (DBD-WAK/FAK 세트)에서 얻었은 462 bp의 클론 29은, 이미 래트의 자궁으로부터 클로닝된(Koike, S., Sakai, M., ＆ Nuramatsu, M. (1987) Nucleic Acids Res 15, 2499-2513) 레트 에스트로겐 수용체 cDNA(65%)와 65% 정도로 높은 일치성(homology)을 보였다. 클론 29의 DNA 서열에 의해 예상되는 아미노산 잔기들은 DNA-결합 부분, 힌지(hinge) 부위 및 핵수용체 군의 새로운 일원의 리간드 결합 부분 개시부의 일부에서 이 DNA 단편이 지정된다는 것을 추측케 한다. 도 1에 기재된 두 개의 PCR 프라이머를 이용하여 엄격한(stringent) 조건에서 쥐의 전립선 cDNA 라이브러리(Clontech gt10)을 스크리닝하여 새로운 수용체의 힌지 부위로 이루어지는 204 bp의 프루브를 만들었으며, 이것은 0.9㎏, 1.8kb, 2.5kb 및 5-6kb인 4개의 강한 양성 클론을 얻은데 이용되었다. 2.5kb의 클론의 서열을 밝혔으며, 도 1은 양쪽 스트랜드에 대한 형광 터미네이터(Applied Biosystems)를 사용한 사이클 시퀀싱에 의한 core facility(CyberGene AB), 일련의 내부 프라이머 및 클론 29의 추론적인 아미노산 서열을 이용하여 밝힌 누클레오타이드 서열을 나타낸다. 누클레오타이드 319에 위치한 프래임 내부 정지코돈 뒤로, 서열에서 두 개의 ATG 코돈이 누클레오타이드 424와 448에 위치하며, 이것은 이들이 개시 코돈으로 기능할 수 있을 것임을 의미한다. 이 오픈리딩 프레임은 계산된 분자량이 54.2 kDa이며 아미노산 잔기가 485개인 단백질을 지정한다.
토끼 마상세포 용형물에서 클론 29의 cRNA로부터 시험관에 번역에 의해 합성한 이 단백질은 SDS-PAGE 젤에서, 약 57 kDa으로 이동하는 두 개의 단백질 밴드를 나타내었다. 두 개의 단백질 밴드가 나타나는 것은 아마도 단백질 합성에서 두 개의 ATG코돈을 사용하기 때문일 것이다. 클론 29단백질의 아미노산 서열은 핵 수용체 군의 일원의 특징적인 형태인(Tasi, M-J., ＆ O'Malley, B.W (1994) Ann. Rev. Biochem. 63, 451-486; Hard, R., ＆ Gustafsson, J-Å (1993) Acc. Chem. Res. 26, 644-650; Laudet, V., Hanni, C., Coli, J., Catzeflis, F., ＆ Stehelin, D (1992) EMBL J. 11, 1003-1012), 특징적인 아연 모듈 DNA-결합 부분, 힌지 부위 및 추측되는 리간드 결합 부분을 보인다.
단백질 서열을 핵 수용체의 군의 몇몇 대표적인 일원과 비교하여 나타낸 도 2에서, 클론 29 단백질은 자궁으로부터 클로닝된 래트 에스트로겐 수용체(ERα)(Koike, S., Sakai, M., Muramastsu, M. (1987) Nucleic. Acid Res. 15, 2499-1513)과 DNA-결합 부분(아미노산 서열 103-167)에서 95% 동일하다(Griffiths, K., Davies, P., Eaton, C.I., Harper, M.E., Turkes, a., ＆ Knabbe, C. (Raven press), pp.83-125). 핵 수용체의 DNA-결합 부분 내에서 많은 기능적 특성이 밝혀졌다(Hard, T., ＆ Gustafsson, J-Å (1993) Acc. Chem. Res. 26, 644-650; Ziliacus, J., Carstedt-Duke, J., Gustafsson, J-Å ＆ Wright, A.P.H. (1994) Proc. Natl. Acad, Sci. USA 91-4175-4179). P-박스는 반응 요소 내의 코어 half-site를 인식하는 누클레오타이드 서열을 특정하며, D-박스는 수용체 단량체간의 이량화를 매개한다. 클론 29 단백질의 P-박스의 서열 EGCKA와 D-박스의 서열 PATNQ는 각각 ERα에서의 대응되는 박스와 동일하며(Hard, T., ＆ Muramatsu, M. (1987) Nucleic. Acid Res. 15, 2499-1513), 따라서 클론 29 단백질이 ERE 서열에 결합할 것이라고 예측된다.
클론 29 단백질(아미노산 잔기 259-457)의 리간드 결합 부위라고 추정되는 부분(LBD)은 래트 ERα와 가장 가까운 일치성을 나타내나(도 2), ERR1과 ERR2 단백질(Giguere, V., Yang, N.m Segui, P., ＆ Evans R.M(1988) Nature 331, 91-94)과의 일치성은 상당히 낮다.
LBD와, 사람, 마우스, 초파리 에스트로겐 수용체와의 일치성은 약 55% 정도이나, 다른 스테로이드 수용체의 LBD와의 일치성은 별로 크지 않다(도 2). 사람 ERα의 시스테인 잔기 530은 에스트로겐 친화성 정도의 공유결합 부위로 동정되었다(Harlow, K.W., Smith K.N., katzenellenbogen, J.A., Greene, G.L., ＆ katzenellenbogen, B.S(1989) J. Biol. Chem, 264, 17476-17485). 흥미롭게도, 클론 29 단백질(시스테인-436)뿐 아니라 마우스, 레트 및 초파리의 ERα도 대등되는 위치에 시스테인 잔기를 가진다. 또, 사람 ERα-LBD(Asp 333, Gly 427)의 리간드 결합 포켓에 가깝거나 그것의 일부인 다른 2개의 아미노산 잔기도 클론 29 단백질의 LBD(Asp 333, Gly 427)와 다양한 종의 ERα의 LBD(20, 21)에서 보존되어 있다. ERα에서의 TAF-2의 리간드 의존적 트랜스-활성 기능이 밝혀졌다(Danielian, P.S., White, R., Lees, J.A., ＆ Parker, M.G. (1992) EMBO J. 11, 1025-1033). 이것은 다른 전사 인자와의 접촉과 관련이 있으며, 이로 인해 표적 유전자의 전사를 활성화시키는데 영향을 준다고 보여지며, 클론 29 단백질(아미노산 잔기 441-457)이 거의 완전히 보존되어 있다. 스테로이드 호르몬 수용체는 인단백질이며(Kuiper, G., ＆ Brinkmann, A.O. 91994) Mol, Cell, Endocrinol, 100, 103-107), ERα의 LBD와 N-말단 부분에서 밝혀진 여러 개의 포스포릴화 자리(Arnold. S.F., Obourn, J.D., Jaffe, H., ＆ Notides. A.C. (1995) Mol. Endocrinol. 9. 24-33; Le Goff, P., Montano, M.M
, Schodin, J.D., ＆ Katzenellenbogen, B.S. (1994) J. Biol. Chem, 269, 4458-4466)가 클론 29 단백질에서 보존된다( Ser 30과 42, Tyr 443). 클론 29 단백질은 485개의 아미노산 잔기로 구성되며, 사람, 마우스 및 레트의 ERα는 590-600개의 아미노산 잔기로 구성된다. 주요 차이점은 클론 29 단백질에서는 N-말단이 103개로, 다른 수용체 단백질에서의 185-190개에 비해 훨씬 짧다는 점이다. 또, ERα의 C-말단 끝에 있는, 보존되지 않으며 F-부분으로 불리는 것이 클론 29 단백질에서는 15개의 아미노산 잔기만큼 짧다. 2.6kb의 양성 클론의 cDNA 인서트를 pBluescript(Stratagene, 상표명)의 EcoR1 자리에 서브클로닝시켰다. 양쪽 스트랜드에 대한 형광 터미네이터(Applied Biosystems)와 일련의 내부 프라이머를 이용하여 사이클 시퀀싱에 의해 클론 29의 완전한 DNA 서열을 (CyberGene AB) 결정하였다.
도 2c와 2d는 각각 래트, 마우스 및 사람의 ERα'와, ERβ의 리간드 및 DNA 결합 부분을 비교한 것이다.
2. 포화 리간드 결합 분석 및 리간드경쟁 연구
큰론 29의 cDNA를 pBluescript의 T7 프로모터의 아래쪽에 서브클로닝시켜 p29-T7을 얻었다. TnT-커플링된 망상세포 용혈물 시스템(Promega)을 이용하여 시험관 내에서 클론 29의 단백질을 합성하였다. 번역방은 혼합물을 TEDGMo 완충액(40mm Tris/HCl, pH 7.4, 1mM EDTA, 10%(v/v) 글리세롤, 10mM Na2Mo4, 10mM DTT)으로 5배 희석하고 이 혼합물 0.1ml을 200배의 과량의 E2가 있거나 없는 조건에서 0.3-6.2nM{2, 4, 6, 7-3H]-17β-에스트라올(NEN-Dupont ; Ci/mmol)와 함께 8℃에서 16시간 두었다.
도 5a는 클론 29단백질의, 포화 리간드 분석 결과를 나타낸다. 클론 29 단백질을 포함하는 망상세포 용혈물을 0.3-6.2nM 사이의 6 종류의 농도의 [3H] E2와 반응시켰다. 방사능이 없는 200 배의 E2를 첨가한 튜브에 대해서도 동일한 조건으로 실험하였다. 결합된 리간드 및 자유 리간드를 덱스트라-코팅된 활성탄 분석에 의해 분리하였다. Scatchard 플라트에서 얻은 기울기로부터 Kd(0.6nM)을 계산하였으며(r=0.93), 횡좌표에 외삽하여 결합 자리 갯수를 얻었다 (Bmax+1400 fmol/ml, 희석되지 않은 번역 혼합물).
리간드 경쟁 연구를 위해, 희석된 망상세포 용혈물을 0, 5, 50, 500 또는 5000 nM의 비방사선 E2, 에스트로겐, 에스티리올, 테스토스테론, 프로게스테론, 코르티코스테론, 5α-안드로스탄-3β, 17β-디올, 5α-안드로스탄-3α, 17β-디올 및 다이에틸스틸베스트롤(DCES)의 존재하에서, 5nM(2,4,6,7-3H]-17β-에스트라디올과 함께 8℃에서 16시간 두었다. 클론 29 단백질을 포함하는 망상세포 용혈물을 0.3-6.2 nM 사이의 6 종류의 농도의 [3H] E2와 반응시켰다. 결합된 리간드 및 자유리간드를 덱스트란으로 코팅된 활성탄 분석에 의해 분리하였다(Ekman, P., Barrack, E.R., Greene, G,L., Jensen, E,V., ＆ Walsh, P.C (1983) J. Clin Endocrinol Metab. 57, 166-176).
도 5B는 클론 29 단백질의 리간드 결합 특이성을 나타낸다. 클론 29 단백질을 포함하는 망상세포 용혈물을 5nM [3H] E2, 표시된 배수의 경쟁인자와 함께 16시간 동안 평형화시켰다. 데이터는 표지되지 않은 E2, 테스토스테론(T), 프로게스테론(prog), 코르티 코스테론(cortico), 5α-안드로스탄-3β, 17β-디올(β-AD) 및 에스트리올(E3) 존재하에서의 [3H] E2 결합을 나타낸다. 경쟁인자가 없을 때의 [3H] E2 결합을 100%로 잡았다.
3. 제자리(in-situ) 하이브리디제이션
Dagerlind Å., Friberg, K., Bean, A.J., ＆ Hokfelt, T(1992) Histochemistry 98, 39-49)의 방법에 따라, 제자리 하이브리디제이션를 실시하였다. 간단하게 요약하면, 누클레오타이드 994-1041 ; 1981-2031에 지향되는 2개의 올리고누클레오타이드 프로브를, 말단 데옥시누클레오티딜트랜스퍼레이즈(Amersham, 영국)를 사용하여 3'-말단에33P-dATP에 연결시켰다. 이 연구에는 다 자란 암컷 및 수컷 Sprague-Dawley 래트(2-3개월, n=10)를 사용하였다. 래트를 죽이고 빨리 조직을 절개한 후 드라이 아이스로 얼렸다. Microm HM 500 저온유지장치에서 14㎛로 조직을 잘랐으며, Probe-on 유리 슬라이드(Fisher Scientific. PA. 미국) 위에서 해동시켰다. 슬라이드를 사용하기 전까지 -20℃에서 보관하였다. 습기찬 상자에서, 50% 포름아미드 4xSSC(1xSSC=0.15M NaCl, 0.015M 사이트레이트), Denhardt(0.02% BSA, 0.02% Ficoll, 0.02% PVP), 1% 사프코실(sarkosyl) 0.02M 소디움포스 페이트(pH7.0), 10% 덱스트란설페이트, 500㎍/ml 연어 정자 DNA, 200mM DTT를 함유하는 하이브리디제이션 용액에서, 슬라이드를 프로브 1X106cpm과 반응시켰다. 연속하여 슬라이드를 55℃에서 60분간 1x SSC로 4회 씻고, 55℃에서 1x SSC로 한번 더 씻은 후 상온으로 천천히 냉각시켰다. 증류수로 옮기고 30초동안 50%, 95% 에탄올로 가볍게 탈수시키고, 공기로 건조시키고, Amersham β-man 자동감광기 필름으로 15-30일 동안 덮어두었다. 선택적으로, 슬라이드를 Kodak NTB2 핵추적 유화액(증류수로 1:1로 희석)에 담그고, 4℃에서 30-60일동안 노출시켰다. 마지막으로 시편을 크레실 바이올렛으로 염색하였다.
암컷 및 수컷 래트 모두의 생식관에서 클론 29가 강하게 발현되었으나, 래트의 다른 기관에서는 발현이 매우 낮거나 제자리 하이브리디제이션으로 검출될 수 없는 수준 이하였다(관찰되지 않음). 수컷 생식기관에서는 전립선 섬에서 높게 발현되었으나(도 3), 고환, 부정란(epididymis) 소낭 생식기관에서는 발현이 매우 낮았다(관찰되지 않음). 적신 단편에서는, 전립선 상피세포(분비 기포)에서는 발현이 선명하게 관찰되었으나, 스트로마의 섬유아세포와 평편 근세포에서는 발현이 낮았다(도 3), 암컷 생식기관에서는 난소에서 발현이 관찰되었고(도 4), 자궁과 질에서는 나타나지 않았다. 적신 단편(dipped segment)에서는, 초기, 2차 및 성숙 소낭의 과립막세포층에서는 발현이 선명하게 관찰되었으나, 원시 소낭 및 나모세포 및 황체에서는 완전히 음성이었다. 난소의 세포내 조직에서는 약하게 발현되었다. 안티-센스 올리고누클레오타이드 프로브를 사용했을 때도 비슷한 결과를 얻었다. 하이브리디제이션 동안 각각의 표지되지 않은 올리고누클레오타이드 프로브를 100배 더 첨가한 경우, 모든 신호가 없어졌다.'
4. CHO 세포에서의 트랜스 작용 분석
클론 29의 2.6kb 단편을 발현백터 pCMv5(Andersson, S., Davis, l.L., Dahlback, H., ＆ Russell, D,W. (1989) J. Biol Chem. 264, 8222-8229)의 EcoR1 자리에 삽입하여 발현 벡터 pCMV29을 만들었다. pERE-ALP 리포터 구조물은 이자 알칼리 포스파테이즈 유전자(Berger, J., Hauber, J., Hauber, R., Geiger, R., ＆ Cullen, B.R. 1988 Gene 66, 1-10)의 분비형과 비텔로게닌 프로모터 에스트로겐 반응 요소(ERE)에 의해 치환되는 글루코코르티코이드 반응 요소를 가지는 MMTV-LTR을 포함한다.
CHO-K1 세포를 5% FCS와 2mM L-글루타민을 함유하는 Ham F12 배지(덱스트란으로 코팅된 활성탄으로 처리됨)에 섞어, 웰당 1.7x10개로 12-웰 플레이트에 깔았다. 24시간 후에, 리포펙타민(Gibco)을 사용하여 시약제조회사의 지시에 따라 250ng의 pERE-ALP 벡터와 50ng pCMV29로 세포를 형질주입(trnasfection)시켰다. 5시간 배양한 후, 세포를 씻고, 5% 혈청 치환물과 2mM L-글루타민과 겐타마이신+호르몬 50㎍/ml을 함유하여 페놀-레드가 없는 Coon's F-12 (SRC 3000, Tissue Culture Service Ltd., Botolph Claydon, Buckingham, 영국) 0.5ml을 다시 넣었다. 48시간 후 화학발광분석법으로, 배지를 알칼린 포스파테이즈(ALP) 활성에 대해 분석하였다. 세포 배양액 10㎕을 분석 완충액(10mM pH10.0 1mM MgCl20.5mM CSPD (Tropix Inc. Boston, 미국)200㎕과 혼합한 후 37℃에서 20시간 배양한 후, 마이크로플레이트 발광분석기(Luminoskan; Labsystems, Finland)에서 1초 동안 총 측정량을 측정하였다. ERE-리포터의 ALP 활성만을 1로 잡았다.
5. 클론 29 단백질의 리간드 결합 특성과 트랜스-활성 기능
클론 29 단백질과 래트 ERα가 DBD와 LBD에서 매우 일치한다는 점을 근거로 하여, 클론 29 단백질은 새로운 ER을 지정할 것이고 가정하였다. 뿐만 아니라, 클론 29 RNA가 높게 발현되는 래트의 전립선과 난소의 생물학적 효과는 잘 알려져 있다 (Griffiths, K., Davies, P., Eaton, C. I., Harper, M. E., Tukes A., ＆ Peeling, W.B. (1991) in Endocrine Dependent Tumours, eds, Voigt, K-D, ＆ Knabbe, C. (Raven press), pp. 83-125; Richards, J.S (1994) Endocrine Rev 15, 725-745; Habenicht, U-F., Tunn, U.W., Senge, Th., Schroder, R.H., Schweikert, H.U., M Bartsch, G., ＆ E1 Etreby, M.F.(1993) J.Steroid Bichem. Molec. Biol, 44, 557-563). 시험관에서 합성된 클론 29 단백질의 스테로이드 결합 특성을 분석하기 위하여, 표지되지 않은 200배의 E2 존재하 및 부존재하에서, 망상세포 용혈물과 0.3-6.0 nM 사이에서 농도를 높인 [3H] E2을 반응시켰다. 포화도의 선형 변형은 K5(해리상수)=0.6nM이며 E2에 대한 1군의 결합 자리가 있음을 나타낸다. (도 5a, 5b). 스테로이드 결합 특성은 0.5, 50, 500 및 5000nM의 표지되지 않은 경쟁물질의 존재하에서 망상세포 용혈물을 5nM [3H] E2와 반응시켜 측정하였다. 경쟁곡선은 에스트로겐만이 결합에 대해 효과적으로 [3H] E2와 경쟁하는 에스트로겐 수용체가 존재한다는 것을 나타낸다.(도 5b). 0.6배의 표지되지 않은 E2에 의해 비결합의 50%가 억제되고, 다이에틸스틸베스트롤, 에스트리올, 에스트로겐, 5α-안드로스탄-3β, 17β-디올은 각각 5배, 15배, 50 배 및 150배 사용했을 때 경쟁 물질로 덜 효과적이었다. 테스토스테론, 프로게스테론, 코르티코스테론, 5α-안드로스탄-3α, 17β-디올은 1000배 정도로 고농도로 사용하였을 때도 경쟁물질로써 효과가 없었다. 측정된 해리 상수와 스테로이드 결합 특이성은 래트와 사람 전립선, 래트 과립막 세포, 래트 강소낭(antral follicles) 및 래트의 전체 난소조직에서의 ERs에 대한 이전의 보고와 잘 일치한다(Ekman, p., Barrack, E.R., Greene, G.L., Jensen, E.Vl, ＆ Walsh, P.C (1983) J. Clin. Endocrinol Metab. 57, 166-176; van Beurden-Lamers, W.M.O., Brinkmann, A.O., Nulder, E., ＆ van der Molen, H. (1974) Biochem. J 140, 494-502; Judolo, G.B., Elder, M.G., ＆ Nyatt, L.(1984) J. Endocrinol. 102, 83-91; kawashima, M., ＆ Greenwald, G.S.(1993) Biology of Reprod. 48 172-179).
클론 29 단백질을 포화량의 [3H] E2로 표지시키고 수트로스 밀도 그래디언트에서 분석하였을 대 특이적인 결합 방사성에 대한 단일 피크가 관찰되었다. 이 복합체의 침강계수는 약 7S였고, 0.4M NaCl 존재하에서는 4S로 변하였다(모이지 않음). 클론 29 단백질의 전사조절 특성을 조사하기 위하여, CHO 세포에 클론 29 단백질 발현 벡터 및/또는 에스트로겐-반응성 리포터 유전자 구조물을 형질주입시켰다. 세포를 E2 부존재하(클론 29), 100nM E2 존재하(클론 29+E2) 100 nM E2와 12μM Tamoxifen 존재하(클론 29+E2/Tam)에서 배양하였다. 추가된 세포외적인 E2가 없는 경우 클론 29 단백질은 상당한 전사 활성을 나타냈으며, 100nM E2을 첨가한 경우 그 활성은 더 증가할 수 있었다(도 6). 안티에스트로겐인 Tamoxifen을 동시에 10배 첨가한 경우 E2에 이해 향상된 활성의 일부가 억제되었다 (도 6). 클론 29 단백질의 본질적(constitutive) 전사 활성은 항-에스트로겐인 ICI-1624384에 의해 억제될 수 있다. 야생의 마우스와 사람의 ERs은 전사의 본질적 활성제라는 것과 이전사 활성은 E2를 첨가하면 더 향상된다는 것이 이미 알려져 있다 (Txukerman, M., Xiao-Kun Zhang, Hermann, T., Wills, K, N., Graupner, G., ＆ Phal, M.(1990) New Bioloist 2, 613-620; Lees, J.A., Fawell, S.E., ＆ Parker, M.G.(1989) Nucl. Acids Res. 17, 5477-5488). 클론 29 단백질의 전사 활성에 대한 E2 농도의 영향을 더 자세히 조사하고자, E2 농도를 높이면서 일시적 형질주입 시험을 실시하였다. CHO 세포에 ERE-리포터 플라즈미드와 클론 29 단백질 발현 플라즈미드를 형질주입 시켰다. 세포를, 농도를 점차 높인 E2(0.1-1000 nM), 에스트론(E1 1000nM), 5α-안드로스탄-3β, 17β-디올(3β-AD, 1000 nM)와 함께 또는 리간드 없이 반응시켰다. 기재된 대로 알칼린 포스파테이즈(ALP)를 측정하였다. 활성은 리간드가 없는 경우(대조구)를 1로 하였다. 그림은 3회의 독립적인 실험에서 얻은 상대적인 ALP-활성(+-SD)을 나타낸다. 클론 29 단백질은 0.1 nM E2에서 반응이 나타나기 시작하였으며, 1nm과 10nM 사이의 E2에서 최고의 촉진을 나타내었다(도 7). 최고 촉진 인자는 2.6±0.5배 (평균±Sd. n=9)였다. E2뿐 아니라 에스트론, 5α-안드로스탄-3β, 17β-디올드, 그 농도가 높은 한 전사 활성을 촉진시켰다(도 7). 덱사메사손, 테스토스테론, 프로게스테론, 5α-안드로스탄-3α, 17β-디올, 갑상선 호르몬과 모든-트랜스-레티논산은 시험한 가장 높은 농도인 1000 nM에서도 클론 29 단백질의 전사 활성을 자극하지 않았다(보이지 않음). 공-형질주입 실험의 결과는 도 5에 나타난 클론 29 단백질의 리간드 결합 및 특이성 결과와 일치한다. 대조구 실험에서, 야생형의 사람 ERα은 E2이 없는 경우에도 전사 활성을 보였으며, E2를 첨가한 경우 활성은 증가하지 않았다(보이지 않음).
6. RT-PCR에 의한 래트 ER 발현의 검출
래트 ERα 와 ERβ 발현의 조직 특이성은, 역전소효소 폴리머레이즈 체인 반응(RT-PCR)로 알아보았다. 그 결과를 도 8에 나타낸다.
B. 사람 ERβ의 분리
1. 사람의 ERβ (hERβ)을 사람의 난소로부터 클로닝하였다. 다양한 세포에서의 hERβ 발현의 조직 특이성 역시 RT-PCR로 알아보았다. 그 결과를 도 9에 나타낸다. 사람의 제정맥(umbilical vein) 상피세포(HUVEC)에서는 hERβ의 mRNA가 매우 높은 정도로 발현되나, 같은 세포에서 hERα는 검출되지 않았음에 주목해야 할 것이다. 사람의 골암(osteosarcoma) 세포주(HOS-D4)에서는 hERα에 비해 hERβ가 더 많이 발현되었다.
Ⅰ. 사람의 ERβ(hERβ)을 클로닝하였다. 다양한 세포에서의 hERβ 발현의 조직 특이성 역시 RT-PCR로 알아보았다. 그 결과를 도 9에 나타낸다. 사람의 제정맥의 상피세포(HUVEC)에서는 hERβ의 mRNA가 매우 높은 정도로 발현되나, 같은 세포에서 hERα는 검출되지 않았음에 주목해야 할 것이다. 사람의 골암 세포주(HOS-D4)에서는 hERα에 비해 hERβ가 더 많이 발현되었다.
hERβ의 일부 DNA 서열을 도 10에 나타내고, 유추된 아미노산 서열을 도 11에 나타낸다.
고환으로부터의 사람의 ERβ 클로닝
상업적으로 판매되는 사람 고환으로부터 얻은 cDNA(Clontech, HL1161x)을 래트 ERβcDNA을 프로브로 사용하여 스크리닝하였다. 약 106개의 재조합체를 스크리닝하여 1개의 양성 클론을 얻었다. 이 클론의 서열을 밝혀 1156bp의 인서트를 가진다는 것을 알았다(도 13a, 13b). 이것은 래트 ERβ에 전체적으로 90% 일치성을 가지는 수용체의 번역 부분의 대부분에 해당하며, 따라서 사람의 ERβ 형태를 나타낸다고 추론된다.
그러나 클로닝된 hERβ은 래트와 비교할 때, N-말단에 약 47개 아미노산, C-말단에 61개 아미노산이 부족하다. 동일한 리이브러리를 더 스크리닝한 결과 성공하지 못하였다. 따라서 나머지 부분을 얻기 위해 PCR 기술을 이용하였다. 4개의 올리고누클레오타이드를 합성하였다. 두 개의 올리고누클레오타이드는 각각 래트 ERβ의 개시 메티오닌과 중지 코돈에 가까운 아미노산에 대한 가능한 모든 코돈을 가지며, 두 개의 특이적 올리고누클에오타이드는 사람 고환 라이브러리에서 분리한 클론의 서열을 포함하며, 이 클론의 양쪽 끝으로부터 약 100bp에 위치한다. 이들 올리고누틀레오타이드의 N-말단과 C-말단 쌍을 PCR하여 특별한 밴드를 얻었으며, 이것을 서브클로닝한 후 서열을 밝혔다. 원래의 cDNA 클론과 겹치는 이들 새로운 클론들의 일부는 이것과 동일하다. 따라서, 오픈리딩플래임 전체에 대한 펩타이드와 DNA 서열을 만들수 있었다 (도 13a, 13b).
사람 ERβ와 래트 ERβ를 비교하였을 때, 수용체는 N-말단에서 79.6%, DNA-결합부분에서 98.5%, 힌지에서 85.6%, 리간드 결합 및 F-부분에서 91.6% 일치하였다. 이들 수치는 래트와 사람의 ERα를 비교하였을 때 얻어지는 수치와 매우 일치한다.
노던 블랏으로 분석한 결과, 사람 ERβ는 고환과 난소에서 발현됨을 알게되었다. 그러나 전립선에서는 래트에서보다 더 낮은 정도로 발현하였다. 사람 ERα가 염색체 6q25에 위치하는데 비해, PCR 결과 사람 ERβ 유전자는 염색체 14로 매핑되었으며 FISH 기술을 사용한 결과 14Q22-23으로 매핑되었다.
2. 사람 ERα와 래트 ERβ의 리간드 결합 친화력 비교
결합 포화 실험과 결합 경쟁 실험을 통해 에스트로겐 수용체인 사람 ERα(hERα)와 래트 ERβ(rERβ)의 리간드 친화성을 알아보았다. 제조업자(Promega)의 지시에 따라 비-방사성 아미노산의 존재하에서, 토끼 망상세포 용혈물에서 시험관내 실험으로 hERα와 rERβ의 수용체 서브타입의 cDNA를 번역하였다.
모든 실험에서 방사성 리간드로 16α-[125I]-17β-에스트라디올([125I]-E2) (NEX-144, New England Nuclear)을 사용하였다. 결합 실험은 Salomaonsson M, Carsson B. Haggblad J.J. Steroid Biochem. Molec. Biol. Vol. 50, No. 5/6 pp. 313-18, 1994에 기재된 바와 같이 실시하였다. 간단히 요약하면, [125I]-E2와 에스트로겐 수용체를 4℃에서 16-18시간 배양하였다. Sephadex G25 칼럼에서 자유[125I]-E2로부터 단백질에 결합된 [125I]-E2를 분리함으로써 배양을 중지시켰다. 감마 계수기로 용출물의 방사성을 측정하였다.
경쟁 실험에서는 비-방사성 리간드를 DMSO로 희석하고, 약 100-200pM의 [125I]-E2와 혼합하고, 평행하게 정제하고, hERα와 rERβ를 첨가하였다. 결합 완충액에서의 DMSO의 최종 농도는 2%였다.
실험에서 사용된 완충액 조건은 다음과 같다:
Hepes (pH=7.5) 20mM, KCI 150mM, EDTA 1mM, 글리세롤 (8.7%), 모노티오글리세롤 6mM, Na3MO410mM.
3. 평형 결합 포화실험 (Kd 결정)
ERs과 여러 농도의 [125I]-E2를 혼합하고 앞에서 기재된 바와 같이 배양한 후, 첨가된 [125I]-E2로부터 결합 [125I]-E2를 뺌에 의해 자유 [125I]-E2를 계산하였다. 결합 데이터를 Hill 플라트와 Scatchard 플라트로 분석하였다 (도 11). 평형 결합 결과를 표 1에 나타낸다. [125I]-E2에 대한 겉보기 Kd값은 두 개의 ER에서 달랐으며, Kd(hERα):Kd(rERβ)=1:4 이다.
[표 1]
두 개의 서브 타입의 [125I]-E2에 대한 평형 해리 상수
4. 경쟁 실험(IC50결정)
위에서와 같이 실험하였다. IC50값은 b=(bmax-bmin)/(1+(I/IC50)s))+bmin(I는 첨가되는 결합 저해제의 농도이고, IC50는 최고 결합의 절반에 결합하게 하는 저해제의 양이며, S는 기울기 인자이다)로 표시되는 매계변수식을 사용하여 얻었다.
자유 [125I]-E2의 농도는 배양 말기에 웰에서 얻은 시료를 취하고, 취한 전체 방사능에서 결합 방사능을 빼서 얻었다.
위의 평형 결합 실험에 의하면 [125I]-E2의 Kd값은 두 개의 ER에서 달랐고, Ki 값(Cheng-Prusoff 식, Ki=IC50)/(1+L/Kd) (L은 자유 [125I]-E2은 실험디는 화합물로부터 계산되었다. RBA(Relative Binding Affinity) 계산을 위해 두 방법이 이용되었다. RBA 값은 IC50값이나 Ki값으로부터 얻어졌다. 두 방법 모두에서 기준값(100%)으로 16α-브로모-에스트라디올의 값을 사용하였다. 두 방법에서 모두 비슷한 결과를 얻었으며, 결과를 표 12에 나타낸다. 그림에서 "4OH-Tam"은 4-하이드록시-tamoxifen을, "DES"은 다이에틸스틸베스트롤을, "hexestr"은 헥사스트롤을, "ICI-164384"은 ICI plc 화합물 No. 164382를, "17β-E2"는 17β-에스트라디올을, "16a-B-E2"는 16α-브로모-에스트라디올을, "Ralox"는 Raloxifen을, "17a-E2"는 17α 디올을 나타낸다.
결과는 ERα과 ERβ이 상당히 다른 리간드 결합 친화력을 가진다는 것을 보여준다. 즉, [125I]-E2에 대한 겉보기 Kd 값이, 두 개의 ER에서 약 4배 차이가 났다 (Kd(hERα):Kd(hERβ)가 약 1:4). 조사된 몇몇 화합물에서는 ER에 대한 [125I]-E2의 결합에 대한 경쟁에서 상당히 다른 양상을 보여주었다. 어떤 화합물은 hERβ에 비해 hERα에 결합하는 [125I]-E2의 상당히 강력한 저해제였으며, 다른 것들은 hERα보다는 hERβ에 대한 [125I]-E2에 대해 보다 강력한 저해제라는 것이 밝혀졌다.
본 발명자들은 뜻밖에도, 알려진 에스트로겐 수용체 ERα와 관련이 있으며, 따라서 ERβ로 명명된 새로운 오판 수용체를 처음 쥐에서 발견하였다 (쥐에서는 특히 rERβ로 명명됨). 본 명세서에서 "ERβ"는 hERβ 또는 rERβ 또는 관련된 수용체를 지칭한다. rERβ의 누클레오타이드 서열 및 아미노산 서열을 밝혔으며, 도 1에 기재된 바와 같다. 본 발명자들을 사람의 ERβ 즉, "hERβ"을 동정하였으며, 그것의 아미노산, DNA 서열은 각각 도 13a, 도 13b에 기재되어 있다.
본 발명의 첫째 측면으로, 도 1, 도 13a, 도 16a에 기재된 아미노산 서열을 가지거나 이들과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는, 새로운 핵 수용체(이하 "ERβ"이라고 한다)가 제공된다. 분리된 수용체는 심혈관 질병, 중추신경제 질환이나 증상 또는 골다공증, 전립선암 또는 전립말 과형성과 같은 질병이나 증상의 치료에 사용될 수 있는 물질을 찾는데 유용하다.
본 발명의 수용체는 화학물질을 에스트로겐 활성에 대해 시험하는데도 유용할 것이다. 사람과 동물의 생식에 대한 환경에 관련된 다양한 화학물질의 영향에 대한 관심이 커지고 있다.
조류, 어류, 파충류 및 몇몇 포유류의 생식 능력에 대한 위협은 사람에게도 비슷한 영향을 미칠 것이라고 제안되었다. 태아기 중 중요한 시기동안 특정 화학물질에 노출되는 것이 생식기관 및 면역계와 신경계의 발달에 나쁜 영향을 준다는 신뢰할 만한 증거들이 드러나고 있다. 공해가 심한 지역에서 살고 있는 조류와 바다표범들의 예에서 볼 수 있듯이, 실제 야생 생태에서의 영향과 사람에게서 가정되는 영향을, 태아기에 약리적인 에스트로겐, 다이에틸스틸베스트롤(DES), "에스트로겐성" 화학물질 등에 노출되었을때 야기되는 사람의 생식능력과 조합하여 볼때 사람과 동물 모두의 생식 능력에 위협이 된다는 것을 예상할 수 있었다. 생체에서 에스트로겐 유사물로 역할을 하거나 사람의 에토크린 계를 파괴한다고 알려져 있거나 그런 의심이 가는 화학물질 중에는 이미 환경에 해로운 물질로 밝혀진 것들이 있다. 사람과 동물의 생식기능을 잠재적으로 파괴한다고 알려진 이들 화학 물질들로는 다이엘드린, 엔도설판스, 클로르단스, 엔트린스, 앨드린, DDT와 같은 염소화된 유기화합물, 몇몇 PCB, Bisphenol A, 프탈레이트 및 노닐페놀과 같은 플라스틱 방향성 탄화수소들이 있다. 사람에 대한 이들의 잠정적 효과는 환경적 에스트로겐에 대한 노출이 늘어나기 때문에, 사실은 고등생물이 많은 양의 에스트로겐에 노출될 때와 비슷한 방법으로 고등 생물이 태아기 동안 화학물질에 노출되기 때문이라고 생각된다.
이러한 영향은 예를들어 성적 특성의 혼동 및 생식능력의 약화 등에 의해 명확해 진다. 사람의 경우 유방암과 기타 호르몬에 관련된 질병의 위험이 높아간다는 것 역시 그러한 영향의 하나라고 거론되어 왔다. 또한 이론적인 "에스트로겐" 영향에 대해, 환경 오염물이 에스트로겐 경로이외의 호르몬 경로에도 영향을 미칠것이라고 주장되었다 -p,p'-DDE(DDT의 주요 대사산물, 사람에서도 마찬기지임)가 명백한 항 안드로겐 제제라는 것도 알려졌다. (Kelce W.R. 등 Nature 199,375:581-585)-, 그러나 이러한 문제에 대한 역학적 연구는 현재로는 설명하기 어렵다. 그럼에도 불구하고, 이러한 잠재적인 호르몬 파괴적 화학물질에 대한 정부기관이나 산업계의 역활 요구하는 의견이 커지고 있다.
본 발명의 수용체인 ERβ과 고전적인 에스트로겐 수용체 사이의 유사성으로 인해 ERβ는 화학물질이 에스트로겐 효과를 가지는지를 시험하는데 이용될 수 있을 것이다.
도 1, 도 13a, 도 14a에 표시된 서열과 기능적으로 유사한 아미노산 서열을, 다양한 포유동물 종으로부터 얻을 수 있을 것이다.
본 출원의 목적을 위해서, 도 1, 도 13a, 도 14a에 기재된 서열과 89% 이상, 바람직하게는 95% 이상 동일한 서열을 도 1, 도 13a, 도 14a의 서열과 실질적으로 동일한 서열이라고 한다.
본 발명의 또다른 측면은, 본 발명의 첫째 측면에 따른 핵 수용체를 지정하는 DNA 서열을 제공하는 것이다. 바람직하게는, 그러한 DNA 서열은 도 1, 도 13b, 도 14b에 기재된 서열이거나, ERβ의 기능을 가지는 단백질이나 폴리펩타이드를 지정하는 DNA 서열이다.
ERβ는 레트 에스트로겐 수용체와, 특히 그것의 DNA 결합 부분에서 매우 동질적이라는 점에서 특징이 있다. ERβ는 아주 일부의 조직에서만 분포한다고 보여진다. 암컷 래트의 경우 난소에만, 수컷 레트의 경우 전립선과 고환에만 존재하는 것으로 나타났다. 이들 조직이 에스트로겐의 전형적인 표적이므로, ERβ는 몇몇 에스트로겐 효과를 매개할 것이다.
ERα와 ERβ의 리간드 특이성이 다르다는 점을 기초로 각 수용체에 대한 선택적인 약제를 설계할 수 있을 것이다.
아래에서 본 발명의 핵 수용체 ERβ과 그것을 생산하는 방법 및 그 기능에 대한 실험을 도면 도 1내지 도 15을 참고하여 자세히 설명할 것이나, 이것은 단지예일 뿐이다.
본 발명의 수용체인 ERβ과 고전적인 에스트로겐 수용체 사이의 유사성으로 인해 ERβ는 화학물질이 에스트로겐 효과를 가지는지를 시험하는데 이용될 수 있을 것이다.
ERα와 ERβ의 리간드 특이성이 다르다는 점을 기초로 각 수용체에 대한 선택적인 약제를 설계할 수 있을 것이다.
Claims (12)
- 도 1, 도 13a 또는 도 14a의 아미노산 서열을 가지는 분리된 에스트로겐 수용체(ERβ).
- 제 1항에 따른 수용체를 지정하는 DNA 서열.
- 제 2항에 있어서, 상기 DNA 서열이 도 1, 도 13b 또는 도 14b의 DNA 서열을 지정하는 DNA 서열.
- 제 1항에 따른 수용체를 분자에 노출시키고, 그 분자에 대한 상기 수용체의 결합을 결정하는 것으로 이루어지는, ERβ와 결합하는 분자를 시험관내에서 결정하는 방법.
- 제 2항 또는 제 3항에 따른 DNA 서열을 분자에 노출시키고, 그 분자에 대한 상기 DNA의 결합을 결정하는 것으로 이루어진, ERβ와 결합하는 분자를 시험관내에서 결정하는 방법.
- 제 1항에 따른 수용체를 분자에 노출시키고, 그 분자에 대한 상기 수용체의 결합을 결정하는 것으로 이루어지는, ERα 및 ERβ 특이적인 질병 또는 증상을 치료하는 데 유용한 분자를 시험관내에서 결정하는 방법.
- 제 2항 또는 제 3항에 따른 DNA 서열을 분자에 노출시키고, 그 분자에 대한 상기 DNA의 결합을 결정하는 것으로 이루어지는, ERα 및 ERβ 특이적인 질병 도는 증상을 치료하는데 유용한 분자를 시험관내에서 결정하는 방법.
- 제 1항에 따른 수용체를 분자에 노출시키고, 그 분자에 대한 상기 수용체의 결합을 결정하는 것으로 이루어지는, 전립선암 또는 난소암, 양성 전립막과형성, 중추 신경계 질병, 골다공증, 심혈관 질병의 치료에 유용한 분자를 시험관내에서 결정하는 방법.
- 제 2항 또는 제 3항에 따른 DNA 서열을 분자에 노출시키고, 그 분자에 대한 상기 DNA의 결합을 결정하는 것으로 이루어지는, 전립선암 또는 난소암, 양성 전립막과 형성, 중추신경계 질병, 골다공증, 심혈관 질병의 치료에 유용한 분자를 시험관내에서 결정하는 방법.
- 시험 화합물이 ERα 및 ERβ에 대한 결합을 시험관내에서 비교하는 것으로 이루어지지 약물의 설계방법.
- 제1 항에 따른 수용체를 물질에 노출시키고, 그 물질에 대한 상기 수용체의 결합을 결정하는 것으로 이루어지는, 물질의 에스트로겐 또는 다른 호르몬 효과를 시험관내에서 시험하는 방법.
- 제 2항 또는 제 3항에 따른 DNA 서열을 물질에 노출시키고, 그 물질에 대한 상기 DNA의 결합을 결정하는 것으로 이루어지는, 물질의 에스트로겐 또는 다른 호르몬 효과를 시험관내에서 시험하는 방법.
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