JP3131649B2 - オーファン レセプター - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、細胞核レセプターおよびその使用に関す
る。
る。
細胞に、レチノイド酸(retinoid acid)、ビタミン
D、ステロイドホルモンおよび甲状腺ホルモンのような
分子に対する応答性を付与する、各レセプターの大きな
ファミリーが同定されている。広範な研究により、核レ
セプターのこのスーパーファミリーのメンバーが、「ホ
ルモン応答エレメント(hormone response elements:HR
E)」と呼ばれる個々別々のcis−作用エレメントへの直
接的結合を介して、遺伝子転写を活性化および/または
抑制していることが示されている。これらのHREは、コ
ンセンサスのパリンドローム性6ヌクレオチドのDNAモ
チーフの繰返しを含むことが示されている。HREの特異
性は、ハーフサイト(halfsite)(即ち、パリンドロー
ム配列の半分)の配向、およびそれらの間のスペーシン
グによって決定される(ウメネソノ ケー.(Umeneson
o K.)ら、1991 Cell 65、1255−1266)。
D、ステロイドホルモンおよび甲状腺ホルモンのような
分子に対する応答性を付与する、各レセプターの大きな
ファミリーが同定されている。広範な研究により、核レ
セプターのこのスーパーファミリーのメンバーが、「ホ
ルモン応答エレメント(hormone response elements:HR
E)」と呼ばれる個々別々のcis−作用エレメントへの直
接的結合を介して、遺伝子転写を活性化および/または
抑制していることが示されている。これらのHREは、コ
ンセンサスのパリンドローム性6ヌクレオチドのDNAモ
チーフの繰返しを含むことが示されている。HREの特異
性は、ハーフサイト(halfsite)(即ち、パリンドロー
ム配列の半分)の配向、およびそれらの間のスペーシン
グによって決定される(ウメネソノ ケー.(Umeneson
o K.)ら、1991 Cell 65、1255−1266)。
特異的DNA結合は、2つの亜鉛フィンガーを含む高度
に保存されたDNA結合ドメインによって仲介され、該ド
メインは、このように発見された全ての核レセプターの
間で保存されている。最初の亜鉛フィンガー(「P−ボ
ックス」として公知)のC−末端塩基での3個のアミノ
酸は、ハーフサイトのヌクレオチド配列の認識に重要で
ある。核レセプター・スーパーファミリーのメンバー
は、Pボックス内のアミノ酸配列に基づいて、種々のグ
ループに分類されている。
に保存されたDNA結合ドメインによって仲介され、該ド
メインは、このように発見された全ての核レセプターの
間で保存されている。最初の亜鉛フィンガー(「P−ボ
ックス」として公知)のC−末端塩基での3個のアミノ
酸は、ハーフサイトのヌクレオチド配列の認識に重要で
ある。核レセプター・スーパーファミリーのメンバー
は、Pボックス内のアミノ酸配列に基づいて、種々のグ
ループに分類されている。
核レセプター・スーパーファミリーの全メンバーはま
た、高変異性(hypervariable)N−末端ドメインおよ
び、保存配列の幾つかの「パッチ(patch)」を含むリ
ガンド結合ドメインも含む。これらの1つは、「Ti−ド
メイン」と呼ばれている。
た、高変異性(hypervariable)N−末端ドメインおよ
び、保存配列の幾つかの「パッチ(patch)」を含むリ
ガンド結合ドメインも含む。これらの1つは、「Ti−ド
メイン」と呼ばれている。
核レセプターであると考えられる分子は、特徴付けが
なされたレセプターに構造的に関連しているので、それ
に対するリガンドは同定されていないが、「オーファン
レセプター(orphan receptor)」と呼ばれている。
多くのそのようなオーファン レセプターが、同定され
ている(例えば、エヴァンス アール.エム.(Evans
R.M.)、(1988)Science 240、889−895およびオマリ
ー,ビー.(O'Malley,B.)、(1990)Mol.Endocrinol.
4 363−369を参照のこと)。
なされたレセプターに構造的に関連しているので、それ
に対するリガンドは同定されていないが、「オーファン
レセプター(orphan receptor)」と呼ばれている。
多くのそのようなオーファン レセプターが、同定され
ている(例えば、エヴァンス アール.エム.(Evans
R.M.)、(1988)Science 240、889−895およびオマリ
ー,ビー.(O'Malley,B.)、(1990)Mol.Endocrinol.
4 363−369を参照のこと)。
我々は現在、予期せずして、先ずラットで新しいオー
ファン レセプターを同定し、それは公知のエストロゲ
ン・レセプターERαに関連しており、それを“ERβ”
(特に、ラットにおける“rERβ”)と名付けた。本明
細書で、“Erβ”は、レセプターhERβまたはrERβ或い
は関連するレセプターを指すものとして使用する。rER
βのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は決定されて
おり、図1に示す。我々はまた、ヒトErβつまり“hER
β”も同定し、そのアミノ酸DNA配列を図13Aおよび図13
Bにそれぞれ示す。
ファン レセプターを同定し、それは公知のエストロゲ
ン・レセプターERαに関連しており、それを“ERβ”
(特に、ラットにおける“rERβ”)と名付けた。本明
細書で、“Erβ”は、レセプターhERβまたはrERβ或い
は関連するレセプターを指すものとして使用する。rER
βのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は決定されて
おり、図1に示す。我々はまた、ヒトErβつまり“hER
β”も同定し、そのアミノ酸DNA配列を図13Aおよび図13
Bにそれぞれ示す。
本発明の1つの局面に従えば、図1、図13Aまたは図1
6Aのアミノ酸配列または図1、図13Aまたは図16Aに示さ
れるアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列あるいは
その配列に機能的に類似するアミノ酸配列を有し、これ
以降“ERβ”と称する、新規なエストロゲン・レセプタ
ー関連核レセプターが提供される。単離されたレセプタ
ーは、心臓血管疾患、中枢神経系疾患のような疾患また
は状態、或いは骨粗鬆症、前立腺癌または良性の前立腺
過形成の状態の治療に使用するための分子の検索に特に
有用であり得る。
6Aのアミノ酸配列または図1、図13Aまたは図16Aに示さ
れるアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列あるいは
その配列に機能的に類似するアミノ酸配列を有し、これ
以降“ERβ”と称する、新規なエストロゲン・レセプタ
ー関連核レセプターが提供される。単離されたレセプタ
ーは、心臓血管疾患、中枢神経系疾患のような疾患また
は状態、或いは骨粗鬆症、前立腺癌または良性の前立腺
過形成の状態の治療に使用するための分子の検索に特に
有用であり得る。
本発明のレセプターはまた、エストロゲン活性に関す
る環境中の化学物質をテストするために使用しても良
い。環境に放出される種々の化学物質のヒトや動物の生
殖への影響に関する関心がますます大きくなっている。
鳥、魚、は虫類および幾種かの哺乳動物の生殖能力に対
する脅威が明白となってきており、ヒトにおける類似の
影響が問題提起されている。胎児期の重要な期間中に特
定の化学物質に曝されることは、生殖器や免疫系および
神経系の発生を歪めるかもしれないことを示す実質的な
証拠が現在出てきている。高度に汚染された地域に棲息
する例えば鳥やアザラシに見られる実際の野生生物への
影響と、ヒトにおいて問題提起された影響との間の可能
性のある類似に基づき、製薬的エストロゲンであるジエ
チルスチルベストロール(DES)に出生前に暴露される
ことによる文献記載されたヒト生殖効果と組合せると、
「エストロゲン性」化学物質は、動物とヒトの両方の生
殖能力を脅かすものと問題提起されている。ヒトの体に
エストロゲン類似物(mimic)として作用する、または
別の様式でヒト内分泌系を障害するものとして知られ或
いは疑われている化学物質の中に、環境有害物質として
既に認定されている幾つかのものがある。動物およびヒ
トの生殖機能の破壊の可能性のある原因として言及され
ている化学物質の中に、ジエルドリン、エンドスルファ
ン類(endosulfans)、クロルダン類、エンドリン類(e
ndrins)、アルドリン、DDTおよび幾つかのPCB類のよう
な塩化有機化合物、ビスフェノールA(Bisphenol
A)、フタレート類およびノニルフェノールのようなプ
ラスチック、および芳香族炭化水素がある。ヒトに対し
て問題提起された影響の幾つかは、環境中エストロゲン
類にますます暴露されていることによるものと示唆され
ている−実際、高い用量のエストロゲンに暴露されると
きと同様の様式で高等生物が胎生期に反応する化学物質
にますます曝されている。それらの影響は、例えば、性
的特性の動揺および生殖能力の障害によって明示され
る。ヒトにおいて、乳癌および他のホルモン関連疾患の
増大するリスクも、可能性のある影響として議論されて
いる。さらに、文献に記載された「エストロゲン性」の
影響に対して、環境中の汚染物質も、エストロゲン経路
とは別のホルモン経路に作用し得ることが最近実証され
ている−DDTの主たる代謝物(ヒトにおいても)である
p,p′−DDEがかなりの抗アンドロゲン剤であることが示
されている(ケルセ ダブリュ.アール.(Kelce W.
R.)ら、Nature 1995 375:581−585)。しかしながら、
これらの問題に対する疫学的研究は、現在のところ解釈
に困窮している。にもかかわらず、これらのホルモンを
混乱させる可能性のある化学物質に反対するますます増
大する意見と、政府機関および企業が行動することへの
非常に明白な大衆的および環境的要求がある。本発明の
レセプター、Erβおよび古典的エストロゲン・レセプタ
ーとの間の類似性に鑑みて、Erβは、化学物質のエスト
ロゲン的影響をテストするのに使用し得る。
る環境中の化学物質をテストするために使用しても良
い。環境に放出される種々の化学物質のヒトや動物の生
殖への影響に関する関心がますます大きくなっている。
鳥、魚、は虫類および幾種かの哺乳動物の生殖能力に対
する脅威が明白となってきており、ヒトにおける類似の
影響が問題提起されている。胎児期の重要な期間中に特
定の化学物質に曝されることは、生殖器や免疫系および
神経系の発生を歪めるかもしれないことを示す実質的な
証拠が現在出てきている。高度に汚染された地域に棲息
する例えば鳥やアザラシに見られる実際の野生生物への
影響と、ヒトにおいて問題提起された影響との間の可能
性のある類似に基づき、製薬的エストロゲンであるジエ
チルスチルベストロール(DES)に出生前に暴露される
ことによる文献記載されたヒト生殖効果と組合せると、
「エストロゲン性」化学物質は、動物とヒトの両方の生
殖能力を脅かすものと問題提起されている。ヒトの体に
エストロゲン類似物(mimic)として作用する、または
別の様式でヒト内分泌系を障害するものとして知られ或
いは疑われている化学物質の中に、環境有害物質として
既に認定されている幾つかのものがある。動物およびヒ
トの生殖機能の破壊の可能性のある原因として言及され
ている化学物質の中に、ジエルドリン、エンドスルファ
ン類(endosulfans)、クロルダン類、エンドリン類(e
ndrins)、アルドリン、DDTおよび幾つかのPCB類のよう
な塩化有機化合物、ビスフェノールA(Bisphenol
A)、フタレート類およびノニルフェノールのようなプ
ラスチック、および芳香族炭化水素がある。ヒトに対し
て問題提起された影響の幾つかは、環境中エストロゲン
類にますます暴露されていることによるものと示唆され
ている−実際、高い用量のエストロゲンに暴露されると
きと同様の様式で高等生物が胎生期に反応する化学物質
にますます曝されている。それらの影響は、例えば、性
的特性の動揺および生殖能力の障害によって明示され
る。ヒトにおいて、乳癌および他のホルモン関連疾患の
増大するリスクも、可能性のある影響として議論されて
いる。さらに、文献に記載された「エストロゲン性」の
影響に対して、環境中の汚染物質も、エストロゲン経路
とは別のホルモン経路に作用し得ることが最近実証され
ている−DDTの主たる代謝物(ヒトにおいても)である
p,p′−DDEがかなりの抗アンドロゲン剤であることが示
されている(ケルセ ダブリュ.アール.(Kelce W.
R.)ら、Nature 1995 375:581−585)。しかしながら、
これらの問題に対する疫学的研究は、現在のところ解釈
に困窮している。にもかかわらず、これらのホルモンを
混乱させる可能性のある化学物質に反対するますます増
大する意見と、政府機関および企業が行動することへの
非常に明白な大衆的および環境的要求がある。本発明の
レセプター、Erβおよび古典的エストロゲン・レセプタ
ーとの間の類似性に鑑みて、Erβは、化学物質のエスト
ロゲン的影響をテストするのに使用し得る。
図1、図13Aまたは図14Aに示される配列と機能的に類
似するアミノ酸配列は、種々の哺乳動物種に由来するも
のであって良い。
似するアミノ酸配列は、種々の哺乳動物種に由来するも
のであって良い。
図1、図13Aまたは図14Aに示される配列と約89%より
多く同一であるアミノ酸配列は、本出願の目的のために
実質的に同じアミノ酸配列である。好ましくは、アミノ
酸配列は、図1、図13Aまたは図14Aに示される配列と約
95%より多く同一である。
多く同一であるアミノ酸配列は、本出願の目的のために
実質的に同じアミノ酸配列である。好ましくは、アミノ
酸配列は、図1、図13Aまたは図14Aに示される配列と約
95%より多く同一である。
本発明の他の局面に従えば、本発明の最初の局面に従
う核レセプターをコードするDNA配列が提供される。好
ましくは、そのDNA配列は、図1、図13Aまたは図14Aに
示されるもの、或いはERβの機能を有するタンパク質ま
たはポリペプチドをコードするDNA配列である。
う核レセプターをコードするDNA配列が提供される。好
ましくは、そのDNA配列は、図1、図13Aまたは図14Aに
示されるもの、或いはERβの機能を有するタンパク質ま
たはポリペプチドをコードするDNA配列である。
ERβは、ラットのエストロゲン・レセプターと、特に
そのDNA結合ドメインが非常に相同である点でユニーク
である。ERβは、非常に限定された組織分布を有するよ
うに見える。雌ラットでは、それは卵巣にのみ存在する
ように見え、雄ラットでは、前立腺および精巣に存在す
るように見える。これらの組織は、エストロゲン作用の
古典的標的物であるので、ERβはエストロゲンの幾つか
の効果を仲介するかもしれないと推論できる。
そのDNA結合ドメインが非常に相同である点でユニーク
である。ERβは、非常に限定された組織分布を有するよ
うに見える。雌ラットでは、それは卵巣にのみ存在する
ように見え、雄ラットでは、前立腺および精巣に存在す
るように見える。これらの組織は、エストロゲン作用の
古典的標的物であるので、ERβはエストロゲンの幾つか
の効果を仲介するかもしれないと推論できる。
ERαおよびERβの異なるリガンド特異性は、いずれか
のレセプターに選択的である薬学的物質をデザインする
のに活用し得る。特に、リガンド特異性の相違は、閉経
後の女性の心臓血管疾患または骨粗鬆症を特に標的とす
る薬剤を開発するのに使用し得る。
のレセプターに選択的である薬学的物質をデザインする
のに活用し得る。特に、リガンド特異性の相違は、閉経
後の女性の心臓血管疾患または骨粗鬆症を特に標的とす
る薬剤を開発するのに使用し得る。
本発明の核レセプターであるERβ、その産生方法、お
よびその機能に関するテストは、添付の図面である図1
〜15を参照して実施例のみにより説明される。図面に関
しては: 図1は、ERβのアミノ酸配列およびそれをコードする
遺伝子のヌクレオチド配列を示す; 図2Aは、ERβおよび他のレセプターの進化を示す系統
樹である; 図2Bは、ERβおよび特定の他のレセプターにおける種
々のドメイン間の相同性を示す; 図2Cは、rERβ、rERα、mERαおよびhERαのリガンド
結合ドメインにおけるアミノ酸配列の整列である; 図2Dは、rERβ、rERα、mERαおよびhERαのDNA結合
ドメインにおけるアミノ酸配列の整列である; 図3Aは、本発明のレセプターのクローンであるクロー
ン29の強い発現を示す前立腺のフィルム・オートラジオ
グラフである; 図3Bは、前立腺腺胞の上皮におけるクローン29に関す
る顕著なシグナルを示す暗視野像である。支質(strom
a)は、より弱いシグナルを示す; 図3Cは、上皮上の銀粒を示すクレシルバイオレット対
比染色された切片の双極像(bipolarization image)で
あるが、支質の含む粒はより少ない; 棒は、図3Aに関しては0.7mm、図3Bに関しては200μ
m、図3Cに関しては30μmを示す; 図4Aは、種々の顕色段階での、卵胞中のクローン29の
強い発現(幾つかのは、矢印で示してある)を示す卵巣
のフィルム・オートラジオグラフである。間質組織(矢
頭)は低いシグナルを示す; 図4Bは、一次(1)、二次(2)、三次(3)および
成熟(4)卵胞の顆粒細胞中のクローン29の高い発現を
示す暗視野像を示す。低いシグナルは、間質組織(it)
に存在する; 図4Cは、顆粒細胞(gc)中の強いシグナルを示す卵巣
の双極像であるが、卵母細胞(oc)およびカインテルナ
(cainterna)(ti)は明白なシグナルを欠いている; 棒は、図4Aに関しては0.9mm、図4Bに関しては140μ
m、図4Cに関しては50μmを示す; 図5Aは、クローニングされたERβの飽和リガンド結合
分析の結果を示す; 図5Bは、クローニングされたERβのリガンド結合の特
異性を示す; 図5Cは、ERβによるE2結合を示す; 図6は、クローニングされたERβによる転写の活性化
を示す; 図7および7Aは、クローニングされたERβによる種々
のリガンドによる刺激を示す; 図8は、ラットのエストロゲン・レセプター発現に関
するRT−PCR実験の結果を示す; 図9は、ヒトErβ(hERβ)の発現に関するRT−PCR実
験の結果を示す; 図10Aは、hERαおよびrERβによる125I−E2の結合を
比較するヒルプロット(Hill plot)である; 図10Bは、hERαおよびrERβによる125I−E2の結合を
比較するスキャッチャードプロット(Scatchard plot)
である; 図11Aは、hERαおよびrERβの種々のリガンドに関す
る比較結合親和性を示す; 図11Bは、図12Aの詳細である; 図12は、種々のエストロゲン・レセプターの整列であ
る; 図13Aは、ヒトERβのアミノ酸配列を示す; 図13Bは、ヒトErβのDNA配列を示す; 図14Aは、mERβのアミノ酸配列を示す; 図14Bは、マウスErβのDNA配列を示す;および 図15は、本発明のERによる種々のフィトエストロゲン
(phytoestrogen)に関するリガンド結合親和性を示
す。
よびその機能に関するテストは、添付の図面である図1
〜15を参照して実施例のみにより説明される。図面に関
しては: 図1は、ERβのアミノ酸配列およびそれをコードする
遺伝子のヌクレオチド配列を示す; 図2Aは、ERβおよび他のレセプターの進化を示す系統
樹である; 図2Bは、ERβおよび特定の他のレセプターにおける種
々のドメイン間の相同性を示す; 図2Cは、rERβ、rERα、mERαおよびhERαのリガンド
結合ドメインにおけるアミノ酸配列の整列である; 図2Dは、rERβ、rERα、mERαおよびhERαのDNA結合
ドメインにおけるアミノ酸配列の整列である; 図3Aは、本発明のレセプターのクローンであるクロー
ン29の強い発現を示す前立腺のフィルム・オートラジオ
グラフである; 図3Bは、前立腺腺胞の上皮におけるクローン29に関す
る顕著なシグナルを示す暗視野像である。支質(strom
a)は、より弱いシグナルを示す; 図3Cは、上皮上の銀粒を示すクレシルバイオレット対
比染色された切片の双極像(bipolarization image)で
あるが、支質の含む粒はより少ない; 棒は、図3Aに関しては0.7mm、図3Bに関しては200μ
m、図3Cに関しては30μmを示す; 図4Aは、種々の顕色段階での、卵胞中のクローン29の
強い発現(幾つかのは、矢印で示してある)を示す卵巣
のフィルム・オートラジオグラフである。間質組織(矢
頭)は低いシグナルを示す; 図4Bは、一次(1)、二次(2)、三次(3)および
成熟(4)卵胞の顆粒細胞中のクローン29の高い発現を
示す暗視野像を示す。低いシグナルは、間質組織(it)
に存在する; 図4Cは、顆粒細胞(gc)中の強いシグナルを示す卵巣
の双極像であるが、卵母細胞(oc)およびカインテルナ
(cainterna)(ti)は明白なシグナルを欠いている; 棒は、図4Aに関しては0.9mm、図4Bに関しては140μ
m、図4Cに関しては50μmを示す; 図5Aは、クローニングされたERβの飽和リガンド結合
分析の結果を示す; 図5Bは、クローニングされたERβのリガンド結合の特
異性を示す; 図5Cは、ERβによるE2結合を示す; 図6は、クローニングされたERβによる転写の活性化
を示す; 図7および7Aは、クローニングされたERβによる種々
のリガンドによる刺激を示す; 図8は、ラットのエストロゲン・レセプター発現に関
するRT−PCR実験の結果を示す; 図9は、ヒトErβ(hERβ)の発現に関するRT−PCR実
験の結果を示す; 図10Aは、hERαおよびrERβによる125I−E2の結合を
比較するヒルプロット(Hill plot)である; 図10Bは、hERαおよびrERβによる125I−E2の結合を
比較するスキャッチャードプロット(Scatchard plot)
である; 図11Aは、hERαおよびrERβの種々のリガンドに関す
る比較結合親和性を示す; 図11Bは、図12Aの詳細である; 図12は、種々のエストロゲン・レセプターの整列であ
る; 図13Aは、ヒトERβのアミノ酸配列を示す; 図13Bは、ヒトErβのDNA配列を示す; 図14Aは、mERβのアミノ酸配列を示す; 図14Bは、マウスErβのDNA配列を示す;および 図15は、本発明のERによる種々のフィトエストロゲン
(phytoestrogen)に関するリガンド結合親和性を示
す。
A.ラットERβのクローニング 1.PCR−増幅および相補的DNAクローニング 核レセプター・ファミリーのメンバーの最も高度に保
存された配列であるDNA結合ドメイン(P−ボックス)
およびリガンド結合ドメイン(Ti−ストレッチ)に従っ
て、1セットの同義性プライマー(DBD 1,2,3およびWAK
/FAK)を、予めデザインした(エンマルク,イー.(En
mark,E.)、カイヌ,ティー.(Kainu,T.),ペルト−
フィッコ,エム.(Pelto−Huikko,M.)、およびグスタ
フソン,ジェイ−アー(Gustafsson,J−Å)、(1994)
Biochem.Biophys.Res.Commun.204,49−56)。ラット前
立腺のトータルRNAから逆転写された一本鎖の相補的DNA
は、エンマルク,イー.(Enmark,E.)、カイヌ,ティ
ー.(Kainu,T.)、ペルト−フィッコ,エム.(Pelto
−Huikko,M.)およびグスタフソン,ジェイ−アー(Gus
tafsson,J−Å)、(1994)Biochem.Biophys.Res.Commu
n.204,49−56に記載されるように、PCR反応においてプ
ライマーとともに使用した。増幅産物は、2%低融解ア
ガロースゲル上で分離し、400bp〜700bpのDNA産物をゲ
ルから単離し、TAクローニング・ベクター(インヴィト
ロゲン(Invitrogen))に連結した。選択肢として、我
々は、ヒロセ,ティー.(Hirose T.)、ヒジモト,ダ
ブリュ.(Fijimoto,W.)、ヤマアイ,ティー.(Yamaa
i,T.)、キム,ケー.エイチ.(Kim,K.H.)、マツウ
ラ,エイチ.(Matsuura,H.)、およびジェッテン,エ
イ.エム(Jetten,A.M)(1994)Mol.Endocrinol.8,166
7−1677およびチャン,シー.(Chang,C.)、ロペス
ダ シルヴァ,エス.(Lopes Da Silva,S.)、イデ
タ,アール.(Ideta,R.)、リー,ワイ.(Lee,Y.)、
イェー,エス.(Yeh,S.)、およびバーバッハ,ジェ
イ.ピー.エイチ(Burbach,J.P.H)(1994)Proc.Nat
l.Acad.Sci.91,6040−6044にそれぞれ正確に記載される
ように、核レセプターのDNA結合ドメイン中のRP−I/RP
−2およびDBD66−100/DBD210−238プライマー・セット
も使用した。462bpの長さを有するクローン番号29(DBD
−WAK/FAKセットを用いて得た)は、ラット子宮から既
にクローニングされていたラットのエストロゲン・レセ
プターcDNA(65%)[(コイケ,エス.(Koike,S.)、
サカイ,エム.(Sakai,M.)およびムラマツ,エム.
(Muramatsu,M.)(1987)Nucleic Acids Res 15,2499
−2513)]と高い相同性(65%)を示した。クローン29
DNA配列より推定されるアミノ酸残基は、このDNAフラ
グメントが、核レセプター・ファミリーの新規なメンバ
ーのDNA結合ドメインの一部、ヒンジ領域およびリガン
ド結合ドメインの開始部をコードすることを示唆した。
新規なレセプターのヒンジ領域からなる204bpのプロー
ブを生ずるために2つのPCRプライマー(図1)を使用
し、そのプローブを使用してラット前立腺cDNAライブラ
リー(クロンテック(Clontech)gt10)をストリンジェ
ントな条件下でスクリーニングし、サイズがそれぞれ0.
9kb、1.8kb、2.5kbおよび5−6kbの4つの強い陽性クロ
ーンを得た。2.5kbのクローンが配列決定され、図1
は、両方のストランドに対して蛍光ターミネーター(ア
プライドバイオシステムズ(Applied Biosystems))を
クローン29の1シリーズの内部プライマーとともに用い
たサイクル配列決定によりコア・ファシリティ(サイバ
ージーン・エービー(CyberGene AB))中に決定された
ヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。2つ
のインフレームATGコドンは、ヌクレオチド424とヌクレ
オチド448に位置し、ヌクレオチド319でインフレーム停
止コドンに先行され、このことは、それらが可能性のあ
る開始コドンであることを示唆する。オープンリーディ
ングフレームは、54.2kDaの計算分子量を有する485アミ
ノ酸残基(最初のメチオニンから数えて)のタンパク質
をコードしている。ウサギ網状赤血球ライゼート中でク
ローン29cRNAからインビトロ翻訳により合成されたタン
パク質を分析すると、SDS−PAGEゲル上で約57kDaに移動
するダブレットのタンパク質バンドが明らかに示され
(データは示されていない)、オープンリーディングフ
レームを確認した。タブレットのタンパク質バンドは恐
らく、タンパク質合成の開始のための両ATGコドンの使
用によって生じる。クローン29のタンパク質のアミノ酸
配列は、特徴的な亜鉛モジュールのDNA結合ドメイン、
ヒンジ領域および推定リガンド結合ドメインを示し、そ
れらは核レセプター・ファミリーのメンバーの特徴であ
る(ツァイ,エム−ジェイ.(Tsai,M−J.)、およびオ
マリー,ビー.ダブリュ(O'Malley,B.W)(1994)Ann
u.Rev.Biochem.63,451−486;ハード,ティー.(Hr
d,T.)およびグスタフソン,ジェイ.エー.(Gustafss
on,J−Å)(1993)Acc.Chem.Res.26,644−650;ラウデ
ット,ヴィ.(Laudet,V.)、ハンニ,シー.(Hnn
i,C.)、コリ,ジェイ.(Coli,J.)、カッツェフリ
ス,エフ.(Catzeflis,F.)、およびステヘリン,ディ
ー(Stehelin,D)(1992)EMBL J.11,1003−1012)。
存された配列であるDNA結合ドメイン(P−ボックス)
およびリガンド結合ドメイン(Ti−ストレッチ)に従っ
て、1セットの同義性プライマー(DBD 1,2,3およびWAK
/FAK)を、予めデザインした(エンマルク,イー.(En
mark,E.)、カイヌ,ティー.(Kainu,T.),ペルト−
フィッコ,エム.(Pelto−Huikko,M.)、およびグスタ
フソン,ジェイ−アー(Gustafsson,J−Å)、(1994)
Biochem.Biophys.Res.Commun.204,49−56)。ラット前
立腺のトータルRNAから逆転写された一本鎖の相補的DNA
は、エンマルク,イー.(Enmark,E.)、カイヌ,ティ
ー.(Kainu,T.)、ペルト−フィッコ,エム.(Pelto
−Huikko,M.)およびグスタフソン,ジェイ−アー(Gus
tafsson,J−Å)、(1994)Biochem.Biophys.Res.Commu
n.204,49−56に記載されるように、PCR反応においてプ
ライマーとともに使用した。増幅産物は、2%低融解ア
ガロースゲル上で分離し、400bp〜700bpのDNA産物をゲ
ルから単離し、TAクローニング・ベクター(インヴィト
ロゲン(Invitrogen))に連結した。選択肢として、我
々は、ヒロセ,ティー.(Hirose T.)、ヒジモト,ダ
ブリュ.(Fijimoto,W.)、ヤマアイ,ティー.(Yamaa
i,T.)、キム,ケー.エイチ.(Kim,K.H.)、マツウ
ラ,エイチ.(Matsuura,H.)、およびジェッテン,エ
イ.エム(Jetten,A.M)(1994)Mol.Endocrinol.8,166
7−1677およびチャン,シー.(Chang,C.)、ロペス
ダ シルヴァ,エス.(Lopes Da Silva,S.)、イデ
タ,アール.(Ideta,R.)、リー,ワイ.(Lee,Y.)、
イェー,エス.(Yeh,S.)、およびバーバッハ,ジェ
イ.ピー.エイチ(Burbach,J.P.H)(1994)Proc.Nat
l.Acad.Sci.91,6040−6044にそれぞれ正確に記載される
ように、核レセプターのDNA結合ドメイン中のRP−I/RP
−2およびDBD66−100/DBD210−238プライマー・セット
も使用した。462bpの長さを有するクローン番号29(DBD
−WAK/FAKセットを用いて得た)は、ラット子宮から既
にクローニングされていたラットのエストロゲン・レセ
プターcDNA(65%)[(コイケ,エス.(Koike,S.)、
サカイ,エム.(Sakai,M.)およびムラマツ,エム.
(Muramatsu,M.)(1987)Nucleic Acids Res 15,2499
−2513)]と高い相同性(65%)を示した。クローン29
DNA配列より推定されるアミノ酸残基は、このDNAフラ
グメントが、核レセプター・ファミリーの新規なメンバ
ーのDNA結合ドメインの一部、ヒンジ領域およびリガン
ド結合ドメインの開始部をコードすることを示唆した。
新規なレセプターのヒンジ領域からなる204bpのプロー
ブを生ずるために2つのPCRプライマー(図1)を使用
し、そのプローブを使用してラット前立腺cDNAライブラ
リー(クロンテック(Clontech)gt10)をストリンジェ
ントな条件下でスクリーニングし、サイズがそれぞれ0.
9kb、1.8kb、2.5kbおよび5−6kbの4つの強い陽性クロ
ーンを得た。2.5kbのクローンが配列決定され、図1
は、両方のストランドに対して蛍光ターミネーター(ア
プライドバイオシステムズ(Applied Biosystems))を
クローン29の1シリーズの内部プライマーとともに用い
たサイクル配列決定によりコア・ファシリティ(サイバ
ージーン・エービー(CyberGene AB))中に決定された
ヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を示す。2つ
のインフレームATGコドンは、ヌクレオチド424とヌクレ
オチド448に位置し、ヌクレオチド319でインフレーム停
止コドンに先行され、このことは、それらが可能性のあ
る開始コドンであることを示唆する。オープンリーディ
ングフレームは、54.2kDaの計算分子量を有する485アミ
ノ酸残基(最初のメチオニンから数えて)のタンパク質
をコードしている。ウサギ網状赤血球ライゼート中でク
ローン29cRNAからインビトロ翻訳により合成されたタン
パク質を分析すると、SDS−PAGEゲル上で約57kDaに移動
するダブレットのタンパク質バンドが明らかに示され
(データは示されていない)、オープンリーディングフ
レームを確認した。タブレットのタンパク質バンドは恐
らく、タンパク質合成の開始のための両ATGコドンの使
用によって生じる。クローン29のタンパク質のアミノ酸
配列は、特徴的な亜鉛モジュールのDNA結合ドメイン、
ヒンジ領域および推定リガンド結合ドメインを示し、そ
れらは核レセプター・ファミリーのメンバーの特徴であ
る(ツァイ,エム−ジェイ.(Tsai,M−J.)、およびオ
マリー,ビー.ダブリュ(O'Malley,B.W)(1994)Ann
u.Rev.Biochem.63,451−486;ハード,ティー.(Hr
d,T.)およびグスタフソン,ジェイ.エー.(Gustafss
on,J−Å)(1993)Acc.Chem.Res.26,644−650;ラウデ
ット,ヴィ.(Laudet,V.)、ハンニ,シー.(Hnn
i,C.)、コリ,ジェイ.(Coli,J.)、カッツェフリ
ス,エフ.(Catzeflis,F.)、およびステヘリン,ディ
ー(Stehelin,D)(1992)EMBL J.11,1003−1012)。
核レセプター・ファミリーの幾つかの代表的メンバー
とのタンパク質配列比較(図2)は、クローン29タンパ
ク質が、子宮からクローニングした(コイケ,エス.
(Koike,S.)、サカイ,エム(Sakai,M)、およびムラ
マツ,エム.(Muramatsu,M.)Nucleic.Acids Res.15,2
499−2513)ラットのエストロゲン・レセプター(ER
α)に最も関連し、DNA−結合ドメイン(アミノ酸残基1
03−167)(グリフィスス,ケー.(Griffiths,K.)、
デヴィーズ,ピー.(Davies,P.)、イートン,シー.
アイ.(Eaton,C.I.)、ハーパー,エム.イー.(Harp
er M.E.)、タークス,エー.(Turkes,A.)、およびピ
ーリング,ダブリュ.ビー.(Peeling,W.B.)(1991)
Endocrine Dependent Tumours,ヴォイト,ケー−ディ
ー.(Voigt,K−D.)およびクナッベ,シー(Knabbe,
C.)編、(ラーベンプレス(Raven Press)),pp.83−1
25)中に95%同一性があることを示した。
とのタンパク質配列比較(図2)は、クローン29タンパ
ク質が、子宮からクローニングした(コイケ,エス.
(Koike,S.)、サカイ,エム(Sakai,M)、およびムラ
マツ,エム.(Muramatsu,M.)Nucleic.Acids Res.15,2
499−2513)ラットのエストロゲン・レセプター(ER
α)に最も関連し、DNA−結合ドメイン(アミノ酸残基1
03−167)(グリフィスス,ケー.(Griffiths,K.)、
デヴィーズ,ピー.(Davies,P.)、イートン,シー.
アイ.(Eaton,C.I.)、ハーパー,エム.イー.(Harp
er M.E.)、タークス,エー.(Turkes,A.)、およびピ
ーリング,ダブリュ.ビー.(Peeling,W.B.)(1991)
Endocrine Dependent Tumours,ヴォイト,ケー−ディ
ー.(Voigt,K−D.)およびクナッベ,シー(Knabbe,
C.)編、(ラーベンプレス(Raven Press)),pp.83−1
25)中に95%同一性があることを示した。
多くの機能的特徴が、核レセプターのDNA−結合ドメ
イン内に同定されている(ハード,ティー.(Hrd,
T.)、およびグスタフソン,ジェイ.アー.(Gustafss
on,J.Å.)(1993)Acc.Chem.Res.26,644−650および
ジリアクス,ジェイ.(Zilliacus,J.)、カールステッ
ト−デューク,ジェイ.(Carlstedt−Duke,J.)、グス
タフソン,ジェイ.アー.(Gustafsson,J.Å.)、お
よびライト,エー.ピー.エイチ.(Wright,A.P.H.)
(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,4175−4179)。い
わゆるP−ボックスは、応答エレメント内にコアのハー
フサイトのヌクレオチド配列認識を特定するが、D−ボ
ックスは、レセプター・モノマー間のダイマー化を仲介
する。クローン29タンパク質のP−ボックスおよびD−
ボックス配列であるEGCKAおよびPATNQはそれぞれ、ERα
(ハード,ティー.(Hrd,T.)、およびグスタフソ
ン,ジェイ.アー.(Gustafsson,J.Å.)(1993)Ac
c.Chem.Res.26,644−650およびコイケ,エス.(Koike,
S.)、サカイ,エム.(Sakai,M.)およびムラマツ,エ
ム.(Muramatsu,M.)Nucleic.Acids Res.15,2499−251
3)中の対応するボックスに同一であり、従って、クロ
ーン29タンパク質がERE配列に結合することを予測させ
る。
イン内に同定されている(ハード,ティー.(Hrd,
T.)、およびグスタフソン,ジェイ.アー.(Gustafss
on,J.Å.)(1993)Acc.Chem.Res.26,644−650および
ジリアクス,ジェイ.(Zilliacus,J.)、カールステッ
ト−デューク,ジェイ.(Carlstedt−Duke,J.)、グス
タフソン,ジェイ.アー.(Gustafsson,J.Å.)、お
よびライト,エー.ピー.エイチ.(Wright,A.P.H.)
(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,4175−4179)。い
わゆるP−ボックスは、応答エレメント内にコアのハー
フサイトのヌクレオチド配列認識を特定するが、D−ボ
ックスは、レセプター・モノマー間のダイマー化を仲介
する。クローン29タンパク質のP−ボックスおよびD−
ボックス配列であるEGCKAおよびPATNQはそれぞれ、ERα
(ハード,ティー.(Hrd,T.)、およびグスタフソ
ン,ジェイ.アー.(Gustafsson,J.Å.)(1993)Ac
c.Chem.Res.26,644−650およびコイケ,エス.(Koike,
S.)、サカイ,エム.(Sakai,M.)およびムラマツ,エ
ム.(Muramatsu,M.)Nucleic.Acids Res.15,2499−251
3)中の対応するボックスに同一であり、従って、クロ
ーン29タンパク質がERE配列に結合することを予測させ
る。
クローン29タンパク質の推定リガンド結合ドメイン
(LBD)(アミノ酸残基259−457)は、ラットERαのLBD
に最も近い相同性を示すが(図2)、ヒトERR1およびER
R2タンパク質(ギグエレ,ヴィ.(Giguere,V.)、ヤ
ン,エヌ.(Yang,N.)、セグイ,ピー.(Segui,
P.)、およびエヴァンス,アール.エム.(Evans,R.
M.)(1988)Nature 331,91−94)との相同性はかなり
より低い。ヒト、マウスおよびアフリカツメガエルのエ
ストロゲン・レセプターとでは、LBD中の相同性も約55
%であるが、他のステロイド・レセプターのLBDとの相
同性は有意ではない(図2)。ヒトERα中のシステイン
残基530は、エストロゲン親和性標識の共有結合部位と
して同定されている(ハーロウ,ケー.ダブリュ.(Ha
rlow,K.W.)、スミス,ディー.エヌ.(Smith,D.
N.)、カッツェンレンボーゲン,ジェイ.エー.(Katz
enellenbogen,J.A.)、グリーン,ジー.エル.(Green
e,G.L.)、およびカッツェンレンボーゲン,ビー.エ
ス.(Katzenellenbogen,B.S.)(1989)J.Biol.Chem.2
64,17476−17485)。興味深いことに、クローン29タン
パク質(システイン−436)並びにマウス、ラットおよ
びアフリカツメガエルのERαは、対応する位置にシステ
イン残基を有する。さらに、ヒトERα−LBDのリガンド
結合ポケットに近接している又は一部分であると記載さ
れている2つの他のアミノ酸残基(Asp 426およびGly 5
21)は、クローン29タンパク質のLBD(Asp 333およびGl
y 427)および様々な種由来のERαのLBD(20,21)中に
保存されている。ERα中に同定されたリガンド依存性ト
ランス活性化機能TAF−2(ダニエリアン,ピー.エ
ス.(Danielian,P.S.)、ホワイト,アール.(White,
R.)、リーズ,ジェイ.エー.(Lees,J.A.)、および
パーカー,エム.ジー.(Parker,M.G.)(1992)EMBO
J.11,1025−1033)は、他の転写因子との接触に関連
し、よって標的遺伝子の転写の活性化に影響すると信じ
られており、クローン29タンパク質に殆ど完全に保存
(アミノ酸残基441−457)されている。ステロイドホル
モン・レセプターは、リンタンパク質であり(クイパ
ー,ジー.(Kuiper,G.)、およびブリンクマン,エ
ー.オー.(Brinkmann,A.O.)(1994)Mol.Cell.Endoc
rinol.100,103−107)、ERαのN−末端ドメインおよび
LBDに同定されている幾つかのリン酸化部位(アーノル
ド,エス.エフ.(Arnold,S.F.)、オバーン,ジェ
イ.ディー.(Obourn,J.D.)、ジャッフェ,エイチ.
(Jaffe,H.)、およびノチズ,エー.シー.(Notides,
A.C.)(1995)Mol.Endocrinol.9,24−33およびルゴッ
フ,ピー.(Le Goff,P.)、モンタノ,エム.エム.
(Montano,M.M.)、ショーディン,ディー.ジェイ.
(Shodin,D.J.)およびカッツェンレンボーゲン,ビ
ー.エス(Katzenellenbogen,B.S)(1994)J.Biol.Che
m.269,4458−4466)はクローン29タンパク質に保存(Se
r 30および42、Tyr 443)されている。クローン29タン
パク質は、485アミノ酸残基からなるが、ヒト、マウス
およびラットからのERαは、590−600アミノ酸残基から
なる。主たる相違点は、クローン29タンパク質中のかな
りより短いN−末端ドメインであり、即ち、他のレセプ
タータンパク質中の185−190アミノ酸残基と比較して10
3アミノ酸残基である。さらに、ERαのC−末端での非
保存性のいわゆるF−ドメインは、クローン29タンパク
質中で15アミノ酸残基短い。2.6kbの陽性クローンのcDN
A挿入物を、pブルースクリプト(商標)(ストラタジ
ーン(Stratagene))のEcoR1部位にサブクローニング
した。クローン29の完全なDNA配列は、両ストランドに
対して蛍光ターミネーター(アプライドバイオシステム
ズ(Applied Biosystems))を1シリーズの内部プライ
マーとともに用いたサイクル配列決定により決定した
(サイバージーンエービー(CyberGene AB))。
(LBD)(アミノ酸残基259−457)は、ラットERαのLBD
に最も近い相同性を示すが(図2)、ヒトERR1およびER
R2タンパク質(ギグエレ,ヴィ.(Giguere,V.)、ヤ
ン,エヌ.(Yang,N.)、セグイ,ピー.(Segui,
P.)、およびエヴァンス,アール.エム.(Evans,R.
M.)(1988)Nature 331,91−94)との相同性はかなり
より低い。ヒト、マウスおよびアフリカツメガエルのエ
ストロゲン・レセプターとでは、LBD中の相同性も約55
%であるが、他のステロイド・レセプターのLBDとの相
同性は有意ではない(図2)。ヒトERα中のシステイン
残基530は、エストロゲン親和性標識の共有結合部位と
して同定されている(ハーロウ,ケー.ダブリュ.(Ha
rlow,K.W.)、スミス,ディー.エヌ.(Smith,D.
N.)、カッツェンレンボーゲン,ジェイ.エー.(Katz
enellenbogen,J.A.)、グリーン,ジー.エル.(Green
e,G.L.)、およびカッツェンレンボーゲン,ビー.エ
ス.(Katzenellenbogen,B.S.)(1989)J.Biol.Chem.2
64,17476−17485)。興味深いことに、クローン29タン
パク質(システイン−436)並びにマウス、ラットおよ
びアフリカツメガエルのERαは、対応する位置にシステ
イン残基を有する。さらに、ヒトERα−LBDのリガンド
結合ポケットに近接している又は一部分であると記載さ
れている2つの他のアミノ酸残基(Asp 426およびGly 5
21)は、クローン29タンパク質のLBD(Asp 333およびGl
y 427)および様々な種由来のERαのLBD(20,21)中に
保存されている。ERα中に同定されたリガンド依存性ト
ランス活性化機能TAF−2(ダニエリアン,ピー.エ
ス.(Danielian,P.S.)、ホワイト,アール.(White,
R.)、リーズ,ジェイ.エー.(Lees,J.A.)、および
パーカー,エム.ジー.(Parker,M.G.)(1992)EMBO
J.11,1025−1033)は、他の転写因子との接触に関連
し、よって標的遺伝子の転写の活性化に影響すると信じ
られており、クローン29タンパク質に殆ど完全に保存
(アミノ酸残基441−457)されている。ステロイドホル
モン・レセプターは、リンタンパク質であり(クイパ
ー,ジー.(Kuiper,G.)、およびブリンクマン,エ
ー.オー.(Brinkmann,A.O.)(1994)Mol.Cell.Endoc
rinol.100,103−107)、ERαのN−末端ドメインおよび
LBDに同定されている幾つかのリン酸化部位(アーノル
ド,エス.エフ.(Arnold,S.F.)、オバーン,ジェ
イ.ディー.(Obourn,J.D.)、ジャッフェ,エイチ.
(Jaffe,H.)、およびノチズ,エー.シー.(Notides,
A.C.)(1995)Mol.Endocrinol.9,24−33およびルゴッ
フ,ピー.(Le Goff,P.)、モンタノ,エム.エム.
(Montano,M.M.)、ショーディン,ディー.ジェイ.
(Shodin,D.J.)およびカッツェンレンボーゲン,ビ
ー.エス(Katzenellenbogen,B.S)(1994)J.Biol.Che
m.269,4458−4466)はクローン29タンパク質に保存(Se
r 30および42、Tyr 443)されている。クローン29タン
パク質は、485アミノ酸残基からなるが、ヒト、マウス
およびラットからのERαは、590−600アミノ酸残基から
なる。主たる相違点は、クローン29タンパク質中のかな
りより短いN−末端ドメインであり、即ち、他のレセプ
タータンパク質中の185−190アミノ酸残基と比較して10
3アミノ酸残基である。さらに、ERαのC−末端での非
保存性のいわゆるF−ドメインは、クローン29タンパク
質中で15アミノ酸残基短い。2.6kbの陽性クローンのcDN
A挿入物を、pブルースクリプト(商標)(ストラタジ
ーン(Stratagene))のEcoR1部位にサブクローニング
した。クローン29の完全なDNA配列は、両ストランドに
対して蛍光ターミネーター(アプライドバイオシステム
ズ(Applied Biosystems))を1シリーズの内部プライ
マーとともに用いたサイクル配列決定により決定した
(サイバージーンエービー(CyberGene AB))。
図2Cおよび図2Dは、ErβのリガンドおよびDNA結合ド
メインを、ラット、マウスおよびヒトErαと比べて、そ
れぞれ比較している。
メインを、ラット、マウスおよびヒトErαと比べて、そ
れぞれ比較している。
2.飽和リガンド結合分析およびリガンド競合研究: クローン29 cDNAを、pブルースクリプト中のT7プロ
モーターの下流にサブクローニングしてp29−77を得
た。クローン29タンパク質を、TnT−カップリングした
網状赤血球ライゼート・システム(プロメガ(Promeg
a))を用いてインビトロで合成した。翻訳反応混合物
を、TEDGMo緩衝液(40mm Tris/HCl,pH 7.4,1mM EDTA,10
%(v/v)グリセロール,10mM Na2MoO4,10mM DTT)で5
倍に希釈し、0.1mlアリコートを、0.3−6.2nM[2,4,6,7
−3H]−17β−エストラジオール(NEN−デュポン;比
放射能85Ci/mmol)とともに、200倍過剰の非標識E2の存
在下または非存在下に、16時間8℃にてインキュベート
した。
モーターの下流にサブクローニングしてp29−77を得
た。クローン29タンパク質を、TnT−カップリングした
網状赤血球ライゼート・システム(プロメガ(Promeg
a))を用いてインビトロで合成した。翻訳反応混合物
を、TEDGMo緩衝液(40mm Tris/HCl,pH 7.4,1mM EDTA,10
%(v/v)グリセロール,10mM Na2MoO4,10mM DTT)で5
倍に希釈し、0.1mlアリコートを、0.3−6.2nM[2,4,6,7
−3H]−17β−エストラジオール(NEN−デュポン;比
放射能85Ci/mmol)とともに、200倍過剰の非標識E2の存
在下または非存在下に、16時間8℃にてインキュベート
した。
図5Aは、クローン29タンパク質の飽和リガンド分析の
結果を示す。クローン29タンパク質を含む網状赤血球ラ
イゼートを、0.3〜6.0nMの6つの濃度の[3H]E2ととも
にインキュベートした。並行する試験管は、さらに200
倍に非放射性E2を含んでいた。結合したリガンドと遊離
のリガンドを、デキストラン被覆チャーコール・アッセ
イで分離した。Kd(0.6nM)は、Scatchardプロットの直
線の傾き(r=0.93)から計算し、結合部位の数は、横
軸の切片(Bmax=1400fmol/ml稀釈していない翻訳混合
物)から推測した。
結果を示す。クローン29タンパク質を含む網状赤血球ラ
イゼートを、0.3〜6.0nMの6つの濃度の[3H]E2ととも
にインキュベートした。並行する試験管は、さらに200
倍に非放射性E2を含んでいた。結合したリガンドと遊離
のリガンドを、デキストラン被覆チャーコール・アッセ
イで分離した。Kd(0.6nM)は、Scatchardプロットの直
線の傾き(r=0.93)から計算し、結合部位の数は、横
軸の切片(Bmax=1400fmol/ml稀釈していない翻訳混合
物)から推測した。
リガンド競合研究のために、希釈した網状赤血球ライ
ゼートを、5nM[2,4,6,7−3H]−17β−エストラジオー
ルとともに、0、5、50、500または5,000nMの非放射性
E2、エストロン、エストリオール、テストステロン、プ
ロゲステロン、コルチコステロン、5α−アンドロスタ
ン−3β,17β−ジオール、5α−アンドロスタン−3
α,17β−ジオールおよびジエチルスチルベストロール
(DCES)のいずれかの存在下に、16時間8℃にてインキ
ュベートした。結合または非結合のステロイドを、デキ
ストラン被覆チャーコール・アッセイ(エクマン,ピ
ー.(Ekman,P.)、バラック,イー.アール.(Barrac
k,E.R.)、グリーン,ジー.エル.(Greene,G.L.)、
ジェンセン,イー.ヴィ.(Jensen,E.V.)、およびウ
ォルシュ,ピー.シー.(Walsh,P.C)(1983)J.Clin.
Endocrinol Metab.57,166−176)で分離した。
ゼートを、5nM[2,4,6,7−3H]−17β−エストラジオー
ルとともに、0、5、50、500または5,000nMの非放射性
E2、エストロン、エストリオール、テストステロン、プ
ロゲステロン、コルチコステロン、5α−アンドロスタ
ン−3β,17β−ジオール、5α−アンドロスタン−3
α,17β−ジオールおよびジエチルスチルベストロール
(DCES)のいずれかの存在下に、16時間8℃にてインキ
ュベートした。結合または非結合のステロイドを、デキ
ストラン被覆チャーコール・アッセイ(エクマン,ピ
ー.(Ekman,P.)、バラック,イー.アール.(Barrac
k,E.R.)、グリーン,ジー.エル.(Greene,G.L.)、
ジェンセン,イー.ヴィ.(Jensen,E.V.)、およびウ
ォルシュ,ピー.シー.(Walsh,P.C)(1983)J.Clin.
Endocrinol Metab.57,166−176)で分離した。
図5Bは、クローン29タンパク質によるリガンド結合の
特異性を示す。クローン29タンパク質を含む網状赤血球
ライゼートを、5nM[3H]E2および表示される倍過剰の
競合物とともに16時間平衡化した。データは、非標識E
2、テストステロン(T)、プロゲステロン(porg)、
コルチコステロン(cortico)、エストロン(E1)、ジ
エチルスチルベストロール(DES)、5α−アンドロス
タン−3α,17β−ジオール(3α−AD)、5α−アン
ドロスタン−3β,17β−ジオール(3β−AD)および
エストリオール(E3)の存在下での、[3H]E2結合を示
す。競合物の非存在下での[3H]E2結合を、100%にセ
ットしていた。
特異性を示す。クローン29タンパク質を含む網状赤血球
ライゼートを、5nM[3H]E2および表示される倍過剰の
競合物とともに16時間平衡化した。データは、非標識E
2、テストステロン(T)、プロゲステロン(porg)、
コルチコステロン(cortico)、エストロン(E1)、ジ
エチルスチルベストロール(DES)、5α−アンドロス
タン−3α,17β−ジオール(3α−AD)、5α−アン
ドロスタン−3β,17β−ジオール(3β−AD)および
エストリオール(E3)の存在下での、[3H]E2結合を示
す。競合物の非存在下での[3H]E2結合を、100%にセ
ットしていた。
3.In−siteハイブリダイゼーション: in−siteハイブリダイゼーションを、既に記載(ダガ
ーリンド,アー.(Dagerling Å.)、フリベルク,ケ
ー.(Friberg,K.)、ビーン,エー.ジェイ.(Bean,
A.J.)およびヘックフェルト,ティー.(Hkfelt,
T)(1992)Histochemistry 98,39−49)されているよ
うに行った。簡単に述べると、ヌクレオチド994−1041
およびヌクレオチド1981−2031に対する2つのオリゴヌ
クレオチド・プローブをそれぞれ、ターミナルデオキシ
ヌクレオチジルトランスフェラーゼ(アマーシャム(Am
ersham)、イギリス)を用いて33P−dATPで3′−末端
標識した。成熟した雄および雌のsprague−Dawleyラッ
ト(2〜3ヶ月齢、n=10)を、この研究のために使用
した。ラットを屠殺し、組織を直ちに切り出し、ドライ
アイス上で凍らせた。組織を、Microm HM500低温維持装
置の中で14μmに切片化し、Probe−Onスライドグラス
(フィッシャーサイエンティフィック(Fisher Scienti
fic)、ペンシルベニア州、米国)上に解凍した。スラ
イドグラスを、使用するまで−20℃で保存した。スライ
ドグラスを、湿潤した箱内で42℃にて18時間、50%ホル
ムアミド、4 x SSC(1 x SSC=0.15M NaCl,0.015 Mクエ
ン酸ナトリウム)、1 xデンハルト(0.02%BSA,0.02%F
icoll、0.02%PVP)、1%サルコシル、0.02 Mリン酸ナ
トリウム(pH 7)、10%デキストラン硫酸、500μg/ml
サケ精子DNAおよび200mM DTTを含むハイブリダイゼーシ
ョン溶液中で、1 x 106cpmプローブとともにインキュベ
ートした。続いて、1 x SSC中でスライドグラスを、SSC
を4回変えて55℃にて60分間すすぎ、最後に1 x SSC中
で、55℃から始めてゆっくりと室温に冷やし、蒸留水に
移し、50%および95%エタノール中で簡単にそれぞれ30
秒間脱水し、風乾し、アマーシャム(Amersham)のβ−
マン・オートラジオグラフィ・フィルムで15〜30日間覆
った。或いは、スライドグラスを、Kodak NTB2核トラッ
ク乳濁液(蒸留水で1:1に希釈)中に浸漬し、30〜60日
間4℃に曝した。最後に、切片をクレシルバイオレット
で染色した。
ーリンド,アー.(Dagerling Å.)、フリベルク,ケ
ー.(Friberg,K.)、ビーン,エー.ジェイ.(Bean,
A.J.)およびヘックフェルト,ティー.(Hkfelt,
T)(1992)Histochemistry 98,39−49)されているよ
うに行った。簡単に述べると、ヌクレオチド994−1041
およびヌクレオチド1981−2031に対する2つのオリゴヌ
クレオチド・プローブをそれぞれ、ターミナルデオキシ
ヌクレオチジルトランスフェラーゼ(アマーシャム(Am
ersham)、イギリス)を用いて33P−dATPで3′−末端
標識した。成熟した雄および雌のsprague−Dawleyラッ
ト(2〜3ヶ月齢、n=10)を、この研究のために使用
した。ラットを屠殺し、組織を直ちに切り出し、ドライ
アイス上で凍らせた。組織を、Microm HM500低温維持装
置の中で14μmに切片化し、Probe−Onスライドグラス
(フィッシャーサイエンティフィック(Fisher Scienti
fic)、ペンシルベニア州、米国)上に解凍した。スラ
イドグラスを、使用するまで−20℃で保存した。スライ
ドグラスを、湿潤した箱内で42℃にて18時間、50%ホル
ムアミド、4 x SSC(1 x SSC=0.15M NaCl,0.015 Mクエ
ン酸ナトリウム)、1 xデンハルト(0.02%BSA,0.02%F
icoll、0.02%PVP)、1%サルコシル、0.02 Mリン酸ナ
トリウム(pH 7)、10%デキストラン硫酸、500μg/ml
サケ精子DNAおよび200mM DTTを含むハイブリダイゼーシ
ョン溶液中で、1 x 106cpmプローブとともにインキュベ
ートした。続いて、1 x SSC中でスライドグラスを、SSC
を4回変えて55℃にて60分間すすぎ、最後に1 x SSC中
で、55℃から始めてゆっくりと室温に冷やし、蒸留水に
移し、50%および95%エタノール中で簡単にそれぞれ30
秒間脱水し、風乾し、アマーシャム(Amersham)のβ−
マン・オートラジオグラフィ・フィルムで15〜30日間覆
った。或いは、スライドグラスを、Kodak NTB2核トラッ
ク乳濁液(蒸留水で1:1に希釈)中に浸漬し、30〜60日
間4℃に曝した。最後に、切片をクレシルバイオレット
で染色した。
クローン29の明らかな発現が、雄および雌両方のラッ
トの生殖路に観察されたが、他の全てのラット組織では
発現は非常に低いか又はin−siteハイブリダイゼーショ
ンによる検出レベル以下であった(示されていない)。
雄の生殖器では、前立腺で高い発現が見られた(図3)
が、精巣、精巣上体および精嚢では非常に低い発現が観
察された(示されていない)。浸漬した切片では、前立
腺上皮細胞(分泌腺胞)で発現は明確に見てとれたが、
支質(stroma)中の平滑筋細胞および線維芽細胞で発現
は低かった(図3)。雌の生殖器では、発現は卵巣に見
られた(図4)が、子宮および膣では陰性であった(示
されていない)。浸漬切片では、高い発現が、一次、二
次および成熟卵胞の顆粒膜細胞層でみられた(図4)
が、原始卵胞、卵母細胞および黄体は完全に陰性に見え
た。卵巣の間質細胞には、低い発現が見られた。使用し
た両方のアンチセンスのオリゴヌクレオチド・プローブ
とも、同様の結果を生じた。100倍過剰のそれぞれの非
標識オリゴヌクレオチド・プローブをハイブリダイゼー
ション反応の間に加えると、全てのシグナルを消した。
トの生殖路に観察されたが、他の全てのラット組織では
発現は非常に低いか又はin−siteハイブリダイゼーショ
ンによる検出レベル以下であった(示されていない)。
雄の生殖器では、前立腺で高い発現が見られた(図3)
が、精巣、精巣上体および精嚢では非常に低い発現が観
察された(示されていない)。浸漬した切片では、前立
腺上皮細胞(分泌腺胞)で発現は明確に見てとれたが、
支質(stroma)中の平滑筋細胞および線維芽細胞で発現
は低かった(図3)。雌の生殖器では、発現は卵巣に見
られた(図4)が、子宮および膣では陰性であった(示
されていない)。浸漬切片では、高い発現が、一次、二
次および成熟卵胞の顆粒膜細胞層でみられた(図4)
が、原始卵胞、卵母細胞および黄体は完全に陰性に見え
た。卵巣の間質細胞には、低い発現が見られた。使用し
た両方のアンチセンスのオリゴヌクレオチド・プローブ
とも、同様の結果を生じた。100倍過剰のそれぞれの非
標識オリゴヌクレオチド・プローブをハイブリダイゼー
ション反応の間に加えると、全てのシグナルを消した。
4.CHO細胞でのトランス活性化分析: 発現ベクターpCMV5(アンダーソン,エス.(Anderss
on,S.)、デイビス,ディー.エル.(Davis,D.L.)、
ダールバック,エイチ.(Dahlbck,H.)、イェルンボ
ール,エイチ.(Jrnvall,H.)、およびラッセル,
ディー.ダブリュ.(Russel,D.W.)(1989)J.Biol.Ch
em.264,8222−8229)のEcoR I部位に2.6kbのクローン29
フラグメントを挿入することによって、発現ベクターpC
MV29を構築した。pERE−ALPレポーター構築物は、分泌
形態の胎盤アルカリ性ホスファターゼ遺伝子(バーガ
ー,ジェイ.(Berger,J.)、ハウバー,ジェイ.(Hau
ber,J.)、ハウバー,アール.(Hauber,R.)、ガイガ
ー,アール.(Geiger,R.)およびクレン,ビー.アー
ル.(Cullen,B.R.)(1988)Gene 66,1−10)および、
グルココルチコイド応答エレメントがヴィテロゲニン・
プロモーター・エストロゲン応答エレメント(ERE)で
置き換えられたMMTV−LTRを含む。
on,S.)、デイビス,ディー.エル.(Davis,D.L.)、
ダールバック,エイチ.(Dahlbck,H.)、イェルンボ
ール,エイチ.(Jrnvall,H.)、およびラッセル,
ディー.ダブリュ.(Russel,D.W.)(1989)J.Biol.Ch
em.264,8222−8229)のEcoR I部位に2.6kbのクローン29
フラグメントを挿入することによって、発現ベクターpC
MV29を構築した。pERE−ALPレポーター構築物は、分泌
形態の胎盤アルカリ性ホスファターゼ遺伝子(バーガ
ー,ジェイ.(Berger,J.)、ハウバー,ジェイ.(Hau
ber,J.)、ハウバー,アール.(Hauber,R.)、ガイガ
ー,アール.(Geiger,R.)およびクレン,ビー.アー
ル.(Cullen,B.R.)(1988)Gene 66,1−10)および、
グルココルチコイド応答エレメントがヴィテロゲニン・
プロモーター・エストロゲン応答エレメント(ERE)で
置き換えられたMMTV−LTRを含む。
CHO−K1細胞を、5%FCS(デキストラン被覆チャーコ
ール処理されていた)および2mM Lグルタミンを含有す
るフェノールレッドを含まないHam F12培地中、ウェル
当り約1.7 x 105細胞で、12ウェル・プレートに播い
た。24時間後、リポフェクタミン(lipofectamine)
(ギブコ(Gibco))を製造元の指示に従って使用し、2
50ng pERE−ALPベクターおよび50ng pCMV29を用いてト
ランスフェクトした。インキュベーションの5時間後、
5%血清代替物(SRC 3000、ティシューカルチャーサー
ビスイズ リミテッド、ボトルフクレイドン(Botolph
Claydon)、バッキンガム、イギリス)、2mM Lグルタミ
ンおよび50μg/mlゲンタマイシン+ホルモン類を表示さ
れるように含む0.5mlのフェノールレッドを含まないク
ーンF−12培地で洗浄し再培養した(refed)。48時間
後、培地を化学発光アッセイによりアルカリ性ホスファ
ターゼ(ALP)活性について検定した。細胞培養培地10
μlアリコートを、200μlアッセイ緩衝液(10mMジエ
タノールアミンpH 10.0、1mM MgCl2および0.5mM CSPD
(トロピックスインコーポレーティッド(Tropix In
c.)、ボストン、米国))と混合し、マイクロプレート
・ルミノメーター(ルミノスキャン(Luminoskan);ラ
ブシステムズ(Labsystems),フィンランド)中で積分
測定(integral measurement)を1秒間測定する前に、
20分間37℃にてインキュベートした。ERE−レポーター
単独のALP活性を1にセットした。
ール処理されていた)および2mM Lグルタミンを含有す
るフェノールレッドを含まないHam F12培地中、ウェル
当り約1.7 x 105細胞で、12ウェル・プレートに播い
た。24時間後、リポフェクタミン(lipofectamine)
(ギブコ(Gibco))を製造元の指示に従って使用し、2
50ng pERE−ALPベクターおよび50ng pCMV29を用いてト
ランスフェクトした。インキュベーションの5時間後、
5%血清代替物(SRC 3000、ティシューカルチャーサー
ビスイズ リミテッド、ボトルフクレイドン(Botolph
Claydon)、バッキンガム、イギリス)、2mM Lグルタミ
ンおよび50μg/mlゲンタマイシン+ホルモン類を表示さ
れるように含む0.5mlのフェノールレッドを含まないク
ーンF−12培地で洗浄し再培養した(refed)。48時間
後、培地を化学発光アッセイによりアルカリ性ホスファ
ターゼ(ALP)活性について検定した。細胞培養培地10
μlアリコートを、200μlアッセイ緩衝液(10mMジエ
タノールアミンpH 10.0、1mM MgCl2および0.5mM CSPD
(トロピックスインコーポレーティッド(Tropix In
c.)、ボストン、米国))と混合し、マイクロプレート
・ルミノメーター(ルミノスキャン(Luminoskan);ラ
ブシステムズ(Labsystems),フィンランド)中で積分
測定(integral measurement)を1秒間測定する前に、
20分間37℃にてインキュベートした。ERE−レポーター
単独のALP活性を1にセットした。
5.クローン29タンパク質のリガンド結合特異性およびト
ランス活性化機能: クローン29タンパク質とDBDおよびLBD中のラットERα
との記載された高い相同性に基づいて、クローン29タン
パク質は新規なERをコードするかもしれないと仮説立て
られた。さらに、クローン29 RNAの高い発現を示すラッ
トの前立腺および卵巣に対するエストロゲンの生物学的
効果は周知である(グリフィスス,ケー.(Griffiths,
K.)、デビーズ,ピー.(Davies,P.)、イートン,シ
ー.アイ.(Eaton,C.I.)、ハーパー,エム.イー.
(Harper,M.E.)、タークス,エー.(Turkes,A.)、お
よびピーリング,ダブリュ.ビー.(Peeling,W.B.)
(1991)Endocrine Dependent Tumours、ヴォイト,ケ
ー−ディー.(Voight,K−D.)、およびクナッベ,シ
ー.(Knabbe,C.)(ラーベンプレス)(Raven Press)
pp 83−125、リチャーズ,ジェイ.エス(Richards,J.
S)(1994)Endocrine Rev.15,725−745;およびハーベ
ニッヒト,ユー−エフ.(Habenicht,U−F.)、トゥ
ン,ユー.ダブリュ.(Tunn,U.W.)、センゲ,ティー
エイチ.(Senge,Th.)、シュローダー,アール.エイ
チ.(Schroder,R.H.)、シュワイカート,エイチ.ユ
ー.(Schweikert,H.U.)、バーチ,ジー.(Bartsch,
G.)、およびエルエトレビ,エム.エフ.(El Etreby,
M.F.)(1993)J.Steroid Biochem.Molec.Biol.44,557
−563)。インビトロで合成されたクローン29タンパク
質のステロイド結合性を分析するために、網状赤血球ラ
イゼートを、200倍モル過剰の非標識E2の存在下または
非存在下に、増大する濃度(0.3−0.6nM)の[3H]E2と
ともに、8℃にて16時間インキュベートした。飽和デー
タの直線的変換は、0.6nMのKd(解離定数)を有する、E
2に関する結合部位の単一な集団を明らかにした(図5A
およびC)。ステロイド結合特異性は、0.5、50、500お
よび5,000nMの非標識競合物の存在下に、5nM[3H]E2と
ともに、網状赤血球ライゼートをインキュベートするこ
とによって測定した。エストロゲンのみが結合に関して
[3H]E2と十分に競合した(図5B)ので、得られた競合
曲線は、エストロゲン・レセプターであることを示して
いる。特異的結合の50%阻害は、0.6倍過剰の非標識E2
によって起きた;ジエチルスチルベストロール、エスト
リオール、エストロン、5α−アンドロスタン−3β,1
7β−ジオールは競合物として、5、15、50、150倍それ
ぞれ効果がより低かった。使用した最も高い濃度(1000
倍過剰)でも、テストステロン、プロゲステロン、コル
チコステロンも、5α−アンドロスタン−3α,17β−
ジオールも、十分な競合物ではなかった。測定された解
離定数およびステロイド結合特異性は、ラットおよびヒ
トの前立腺、ラット顆粒膜細胞、ラット腔小胞および全
ラット卵巣組織のERに関して既に報告されたデータ(エ
ックマン,ピー.(Ekman,P.)、バラック,イー.アー
ル.(Barrack,E.R.)、グリーン,ジー.エル.(Gree
ne,G.L.)、ジェンセン,イー.ヴィ.(Jensen,E.
V.)、およびウォルシュ,ピー.シー.(Walsh,P.C.)
(1983)J.Clin.Endocrinol.Metab.57,166−176;ヴァン
バーテン−ラマーズ,ダブリュ.エム.オー.(van Be
urden−Lamers,W.M.O.)、ブリンクマン,エー.オー.
(Brinkmann,A.O.)、ムルダー,イー.(Mulder,
E.),およびヴァンデルモレン,エイチ.(van der Mo
len,H.)(1974)Biochem.J 140,495−502;クドロ,ジ
ー.ピー.(Kudolo,G.B.)、エルダー,エム.ジー.
(Elder,M.G.)およびミアット,エル.(Myatt,L.)
(1984)J.Endocrinol.102,83−91;およびカワシマ,エ
ム.(Kawashima,M.)、およびグリーンワルド,ジー.
エス.(Greenwald,G.S.)(1993)Biology of Reprod.
48 172−179)と良く一致する。
ランス活性化機能: クローン29タンパク質とDBDおよびLBD中のラットERα
との記載された高い相同性に基づいて、クローン29タン
パク質は新規なERをコードするかもしれないと仮説立て
られた。さらに、クローン29 RNAの高い発現を示すラッ
トの前立腺および卵巣に対するエストロゲンの生物学的
効果は周知である(グリフィスス,ケー.(Griffiths,
K.)、デビーズ,ピー.(Davies,P.)、イートン,シ
ー.アイ.(Eaton,C.I.)、ハーパー,エム.イー.
(Harper,M.E.)、タークス,エー.(Turkes,A.)、お
よびピーリング,ダブリュ.ビー.(Peeling,W.B.)
(1991)Endocrine Dependent Tumours、ヴォイト,ケ
ー−ディー.(Voight,K−D.)、およびクナッベ,シ
ー.(Knabbe,C.)(ラーベンプレス)(Raven Press)
pp 83−125、リチャーズ,ジェイ.エス(Richards,J.
S)(1994)Endocrine Rev.15,725−745;およびハーベ
ニッヒト,ユー−エフ.(Habenicht,U−F.)、トゥ
ン,ユー.ダブリュ.(Tunn,U.W.)、センゲ,ティー
エイチ.(Senge,Th.)、シュローダー,アール.エイ
チ.(Schroder,R.H.)、シュワイカート,エイチ.ユ
ー.(Schweikert,H.U.)、バーチ,ジー.(Bartsch,
G.)、およびエルエトレビ,エム.エフ.(El Etreby,
M.F.)(1993)J.Steroid Biochem.Molec.Biol.44,557
−563)。インビトロで合成されたクローン29タンパク
質のステロイド結合性を分析するために、網状赤血球ラ
イゼートを、200倍モル過剰の非標識E2の存在下または
非存在下に、増大する濃度(0.3−0.6nM)の[3H]E2と
ともに、8℃にて16時間インキュベートした。飽和デー
タの直線的変換は、0.6nMのKd(解離定数)を有する、E
2に関する結合部位の単一な集団を明らかにした(図5A
およびC)。ステロイド結合特異性は、0.5、50、500お
よび5,000nMの非標識競合物の存在下に、5nM[3H]E2と
ともに、網状赤血球ライゼートをインキュベートするこ
とによって測定した。エストロゲンのみが結合に関して
[3H]E2と十分に競合した(図5B)ので、得られた競合
曲線は、エストロゲン・レセプターであることを示して
いる。特異的結合の50%阻害は、0.6倍過剰の非標識E2
によって起きた;ジエチルスチルベストロール、エスト
リオール、エストロン、5α−アンドロスタン−3β,1
7β−ジオールは競合物として、5、15、50、150倍それ
ぞれ効果がより低かった。使用した最も高い濃度(1000
倍過剰)でも、テストステロン、プロゲステロン、コル
チコステロンも、5α−アンドロスタン−3α,17β−
ジオールも、十分な競合物ではなかった。測定された解
離定数およびステロイド結合特異性は、ラットおよびヒ
トの前立腺、ラット顆粒膜細胞、ラット腔小胞および全
ラット卵巣組織のERに関して既に報告されたデータ(エ
ックマン,ピー.(Ekman,P.)、バラック,イー.アー
ル.(Barrack,E.R.)、グリーン,ジー.エル.(Gree
ne,G.L.)、ジェンセン,イー.ヴィ.(Jensen,E.
V.)、およびウォルシュ,ピー.シー.(Walsh,P.C.)
(1983)J.Clin.Endocrinol.Metab.57,166−176;ヴァン
バーテン−ラマーズ,ダブリュ.エム.オー.(van Be
urden−Lamers,W.M.O.)、ブリンクマン,エー.オー.
(Brinkmann,A.O.)、ムルダー,イー.(Mulder,
E.),およびヴァンデルモレン,エイチ.(van der Mo
len,H.)(1974)Biochem.J 140,495−502;クドロ,ジ
ー.ピー.(Kudolo,G.B.)、エルダー,エム.ジー.
(Elder,M.G.)およびミアット,エル.(Myatt,L.)
(1984)J.Endocrinol.102,83−91;およびカワシマ,エ
ム.(Kawashima,M.)、およびグリーンワルド,ジー.
エス.(Greenwald,G.S.)(1993)Biology of Reprod.
48 172−179)と良く一致する。
クローン29タンパク質を飽和用量の[3H]E2で標識
し、ショ糖密度勾配で分析したとき、特異的結合した放
射能の単一ピークが観察された。この複合体の沈降定数
は約7Sで、それは0.4M NaClの存在下に4Sに移動した
(示されていない)。クローン29タンパク質の転写調節
特性を調べるために、CHO細胞をクローン29タンパク質
発現ベクターおよび/またはエストロゲン応答性レポー
ター遺伝子構築物でトランスフェクトする、同時トラン
スフェクション実験を行った。細胞を、E2(クローン2
9)の非存在下、または100nM E2(クローン29+E2)の
存在下、または100mM E2および12μMタモキシフェン
(Tamoxifen)(クローン29+E2/Tam)の存在下に、イ
ンキュベートした。外部から加えるE2がなければ、クロ
ーン29タンパク質は、かなりの転写活性を示し、その活
性は100nM E2を添加するとさらに増大し得る(図6)。
10倍過剰のアンチエストロゲンであるタモキシフェンを
同時に加えると、E2で刺激される活性を部分的に抑制し
た(図6)。クローン29タンパク質の構成性転写活性
は、抗エストロゲンICI−1624384によって抑制され得た
(示されていない)。野生型マウスおよびヒトのERは、
転写の構成性活性化因子であり、転写活性はE2添加によ
りさらに刺激され得ることが、既に示されている(トゥ
クスカーマン,エム.(Txukerman,M.)、キシアオ−ク
ン ツァン(Xiao−Kun Zhang)、ハーマン,ティー(H
ermann,T.)、ウィルス,ケー.エヌ.(Wills,K.
N.)、グラウプナー,ジー.(Graupner,G.)、および
ファル,エム.(Phal,M.)(1990)New Biologist 2,6
13−620およびリーズ,ジェイ.エー.(Lees,J.A.)、
ファウェル,エス.イー.(Fawell,S.E.)、およびパ
ーカー,エム.ジー.(Parker,M.G.)(1989)Nuc.Aci
ds Res.17,5477−5488)。どの濃度のE2がクローン29タ
ンパク質転写活性に影響するのかについてさらに洞察を
得るために、一時的(transient)トランスフェクト実
験を、増大する濃度のE2の存在下に行った。CHO細胞
を、ERE−レポーター・プラスミドおよびクローン29タ
ンパク質発現プラスミドで一時的にトランスフェクトし
た。細胞を、増大する濃度のE2(0.1−1000nM)、エス
トロン(E1,1000nM)、5α−アンドロスタン−3β,17
β−ジオール(3β−AD,1000nM)とともに、又はいか
なるリガンドも加えずに、インキュベートした。アルカ
リ性ホスファターゼ活性(ALP)を記載されるように測
定し、リガンド非存在下(コントロール)の活性を1に
セットした。図は、3つの独立実験からの比較ALP−活
性(±SD)を示す。クローン29タンパク質は、0.1nM E2
で反応し始め、1nm〜10nMのE2で最大刺激が観察された
(図7)。最大刺激因子は、E2非存在下のインキュベー
ションに比較して、2.6±0.5倍(平均値±SD.n=9)で
あった。E2に加えて、エストロンおよび5α−アンドロ
スタン−3β,17β−ジオールもまた、より高い濃度で
はあるが、転写活性を刺激し得た(図7)。デキサメタ
ゾン、テストステロン、プロゲステロン、5α−アンド
ロスタン−3α,17β−ジオール、甲状腺ホルモンおよ
び全トランス−レチノイン酸は、テストされた最も高い
濃度(1000nM)の場合でも、クローン29タンパク質の転
写活性を刺激できなかった(示されていない)。同時ト
ランスフェクション実験の結果は、図5に示されるクロ
ーン29タンパク質のリガンド結合および特異性データと
一致する。コントロールの実験では、野生型ヒトERαも
E2の非存在下に転写活性を示し、その活性は、E2の添加
により増大できた(示されていない)。
し、ショ糖密度勾配で分析したとき、特異的結合した放
射能の単一ピークが観察された。この複合体の沈降定数
は約7Sで、それは0.4M NaClの存在下に4Sに移動した
(示されていない)。クローン29タンパク質の転写調節
特性を調べるために、CHO細胞をクローン29タンパク質
発現ベクターおよび/またはエストロゲン応答性レポー
ター遺伝子構築物でトランスフェクトする、同時トラン
スフェクション実験を行った。細胞を、E2(クローン2
9)の非存在下、または100nM E2(クローン29+E2)の
存在下、または100mM E2および12μMタモキシフェン
(Tamoxifen)(クローン29+E2/Tam)の存在下に、イ
ンキュベートした。外部から加えるE2がなければ、クロ
ーン29タンパク質は、かなりの転写活性を示し、その活
性は100nM E2を添加するとさらに増大し得る(図6)。
10倍過剰のアンチエストロゲンであるタモキシフェンを
同時に加えると、E2で刺激される活性を部分的に抑制し
た(図6)。クローン29タンパク質の構成性転写活性
は、抗エストロゲンICI−1624384によって抑制され得た
(示されていない)。野生型マウスおよびヒトのERは、
転写の構成性活性化因子であり、転写活性はE2添加によ
りさらに刺激され得ることが、既に示されている(トゥ
クスカーマン,エム.(Txukerman,M.)、キシアオ−ク
ン ツァン(Xiao−Kun Zhang)、ハーマン,ティー(H
ermann,T.)、ウィルス,ケー.エヌ.(Wills,K.
N.)、グラウプナー,ジー.(Graupner,G.)、および
ファル,エム.(Phal,M.)(1990)New Biologist 2,6
13−620およびリーズ,ジェイ.エー.(Lees,J.A.)、
ファウェル,エス.イー.(Fawell,S.E.)、およびパ
ーカー,エム.ジー.(Parker,M.G.)(1989)Nuc.Aci
ds Res.17,5477−5488)。どの濃度のE2がクローン29タ
ンパク質転写活性に影響するのかについてさらに洞察を
得るために、一時的(transient)トランスフェクト実
験を、増大する濃度のE2の存在下に行った。CHO細胞
を、ERE−レポーター・プラスミドおよびクローン29タ
ンパク質発現プラスミドで一時的にトランスフェクトし
た。細胞を、増大する濃度のE2(0.1−1000nM)、エス
トロン(E1,1000nM)、5α−アンドロスタン−3β,17
β−ジオール(3β−AD,1000nM)とともに、又はいか
なるリガンドも加えずに、インキュベートした。アルカ
リ性ホスファターゼ活性(ALP)を記載されるように測
定し、リガンド非存在下(コントロール)の活性を1に
セットした。図は、3つの独立実験からの比較ALP−活
性(±SD)を示す。クローン29タンパク質は、0.1nM E2
で反応し始め、1nm〜10nMのE2で最大刺激が観察された
(図7)。最大刺激因子は、E2非存在下のインキュベー
ションに比較して、2.6±0.5倍(平均値±SD.n=9)で
あった。E2に加えて、エストロンおよび5α−アンドロ
スタン−3β,17β−ジオールもまた、より高い濃度で
はあるが、転写活性を刺激し得た(図7)。デキサメタ
ゾン、テストステロン、プロゲステロン、5α−アンド
ロスタン−3α,17β−ジオール、甲状腺ホルモンおよ
び全トランス−レチノイン酸は、テストされた最も高い
濃度(1000nM)の場合でも、クローン29タンパク質の転
写活性を刺激できなかった(示されていない)。同時ト
ランスフェクション実験の結果は、図5に示されるクロ
ーン29タンパク質のリガンド結合および特異性データと
一致する。コントロールの実験では、野生型ヒトERαも
E2の非存在下に転写活性を示し、その活性は、E2の添加
により増大できた(示されていない)。
6.RT−PCRによるラットER発現の検出 ラットのERβおよびERα発現の組織特異性を、逆転写
酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)を用いて決定し
た。実験の結果を、図8に示す。
酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)を用いて決定し
た。実験の結果を、図8に示す。
B.ヒトErβの単離 1.ヒト型のErβ(hERβ)も、ヒト卵巣からクローニン
グした。種々の細胞におけるhERβ発現の組織特異性
も、RT−PCR技法を用いて決定した。結果を、図9に示
す。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)では、非常に高い
レベルのhERβのmRNAがあるが、同じ細胞でhERαは検出
されないことが注目される。さらに、ヒト骨肉腫細胞系
(HOS−D4)では、hERβはhERαと比較して、より多い
量で発現されることが見い出される。
グした。種々の細胞におけるhERβ発現の組織特異性
も、RT−PCR技法を用いて決定した。結果を、図9に示
す。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)では、非常に高い
レベルのhERβのmRNAがあるが、同じ細胞でhERαは検出
されないことが注目される。さらに、ヒト骨肉腫細胞系
(HOS−D4)では、hERβはhERαと比較して、より多い
量で発現されることが見い出される。
I.ヒト型のERβ(hERβ)も、クローニングされてい
る。種々の細胞中でのhERβ発現の組織特異性も、RT−P
CR技法を用いて決定した。結果を図9に示す。ヒト臍帯
静脈内皮細胞(HUVEC)では、非常に高いレベルのhERβ
のmRNAがあるが、同じ細胞でhERαは検出されないこと
が注目される。さらに、ヒト骨肉腫細胞系(HOS−D4)
では、hERβはhERαと比較して、より多い量で発現され
ることが見い出される。
る。種々の細胞中でのhERβ発現の組織特異性も、RT−P
CR技法を用いて決定した。結果を図9に示す。ヒト臍帯
静脈内皮細胞(HUVEC)では、非常に高いレベルのhERβ
のmRNAがあるが、同じ細胞でhERαは検出されないこと
が注目される。さらに、ヒト骨肉腫細胞系(HOS−D4)
では、hERβはhERαと比較して、より多い量で発現され
ることが見い出される。
hERβの部分的DNA配列を図10に示し、誘導アミノ酸配
列を図11に示す。
列を図11に示す。
精巣からのヒトErβのクローニング 市販のヒト精巣由来のcDNA(クロンテック(Clontec
h)、商品番号HL1161x)を、ラットErβ cDNAのリガン
ド結合ドメインを含むフラグメントをプローブとして用
いてスクリーニングした。約106個の組換え体をスクリ
ーニングし、1個の陽性クローンを得た。このクローン
の配列決定をすると、挿入物は1156bpであることが見い
出された(図13Aおよび13B)。これは、ラットErβと全
体として90.0%の相同性を有するレセプターの翻訳領域
の殆どに対応し、故に、ヒト型のErβを示すものと推定
される。
h)、商品番号HL1161x)を、ラットErβ cDNAのリガン
ド結合ドメインを含むフラグメントをプローブとして用
いてスクリーニングした。約106個の組換え体をスクリ
ーニングし、1個の陽性クローンを得た。このクローン
の配列決定をすると、挿入物は1156bpであることが見い
出された(図13Aおよび13B)。これは、ラットErβと全
体として90.0%の相同性を有するレセプターの翻訳領域
の殆どに対応し、故に、ヒト型のErβを示すものと推定
される。
しかしながら、クローニングされたhERβは(ラット
配列と比較して)、N−末端で約47アミノ酸およびC−
末端で61アミノ酸を欠いている。同じライブラリーをさ
らにスクリーニングしても、不成功であった。よって、
残りの部分を得るために、PCR技法を用いた。オリゴヌ
クレオチドについて合成したのは:ラットErβの開始メ
チオニンと停止コドンに隣接するアミノ酸に関する全て
の可能性のあるコドンをそれぞれ含む2個の同義性オリ
ゴヌクレオチド、並びに、ヒト精巣ライブラリーから単
離されたクローンで、このクローンのそれぞれの末端か
ら約100bpに位置する配列を含む2個の特異的オリゴヌ
クレオチドである。オリゴのN−末端およびC−末端の
ペアを用いたPCRは、特異的バンドを生じ、それらをサ
ブクローニングして配列決定した。オリジナルcDNAクロ
ーンとオーバーラップするこれら新しいクローンの部分
は、これと同一である。従って、オープンリーディング
フレーム全体に対応するペプチドおよびDNA配列を構築
することは可能であった(図13Aおよび13B)。
配列と比較して)、N−末端で約47アミノ酸およびC−
末端で61アミノ酸を欠いている。同じライブラリーをさ
らにスクリーニングしても、不成功であった。よって、
残りの部分を得るために、PCR技法を用いた。オリゴヌ
クレオチドについて合成したのは:ラットErβの開始メ
チオニンと停止コドンに隣接するアミノ酸に関する全て
の可能性のあるコドンをそれぞれ含む2個の同義性オリ
ゴヌクレオチド、並びに、ヒト精巣ライブラリーから単
離されたクローンで、このクローンのそれぞれの末端か
ら約100bpに位置する配列を含む2個の特異的オリゴヌ
クレオチドである。オリゴのN−末端およびC−末端の
ペアを用いたPCRは、特異的バンドを生じ、それらをサ
ブクローニングして配列決定した。オリジナルcDNAクロ
ーンとオーバーラップするこれら新しいクローンの部分
は、これと同一である。従って、オープンリーディング
フレーム全体に対応するペプチドおよびDNA配列を構築
することは可能であった(図13Aおよび13B)。
ヒトErβをラットErβと比較するとき、このレセプタ
ーはN−末端ドメインにおいて79.6%同一であり、DNA
−結合ドメインにおいては98.5%、ヒンジでは85.6%、
およびリガンド結合とF−ドメインでは91.6%同一であ
る。これらの数値は、Erαのラット形態とヒト形態とを
比較するとき見い出されているものと非常に良くマッチ
する。
ーはN−末端ドメインにおいて79.6%同一であり、DNA
−結合ドメインにおいては98.5%、ヒンジでは85.6%、
およびリガンド結合とF−ドメインでは91.6%同一であ
る。これらの数値は、Erαのラット形態とヒト形態とを
比較するとき見い出されているものと非常に良くマッチ
する。
ノーザン・ブロットを用いたヒトErβ発現の研究によ
ると、精巣および卵巣で発現が示されている。しかしな
がら、前立腺での発現は、ラットで見い出されるものよ
りも低く見える。
ると、精巣および卵巣で発現が示されている。しかしな
がら、前立腺での発現は、ラットで見い出されるものよ
りも低く見える。
ヒトErβ遺伝子は、PCTを使うと染色体14に、FISH技
法を使うと領域14q22−2にマッピングされるが、ヒトE
rβ遺伝子は染色体6q25にマッピングされる。
法を使うと領域14q22−2にマッピングされるが、ヒトE
rβ遺伝子は染色体6q25にマッピングされる。
2.hERαおよびrERβのリガンド結合親和性の比較 2つのエストロゲン・レセプターであるヒトErα(卵
巣)(hERα)およびラットErβ(rERβ)のリガンド親
和性を、結合飽和実験および結合競合実験でテストし
た。
巣)(hERα)およびラットErβ(rERβ)のリガンド親
和性を、結合飽和実験および結合競合実験でテストし
た。
レセプター・サブタイプhERαおよびrERβのcDNAを、
製造元(プロメガ(Promega))の指示に従って、非放
射性アミノ酸の存在下に、ウサギ網状赤血球ライゼート
中でインビトロ翻訳した。
製造元(プロメガ(Promega))の指示に従って、非放
射性アミノ酸の存在下に、ウサギ網状赤血球ライゼート
中でインビトロ翻訳した。
全ての実験で使用された放射性リガンドは、16α−[
125I]−17β−エストラジオール([125I]−E2)(NE
X−144、ニューイングランドニュクリアー(New Englan
d Nuclear))であった。結合実験の方法は、既に記載
されている:サロモンソン,エム(Salomonsson M)、
カールソン,ビー.(Carlsson B)、ハグブラッド ジ
ェイ.ジェイ.(Haggblad J.J.)、Steroid Biochem.M
olec.Biol.Vol.50,No.5/6 pp.313−18,1994。簡単に述
べると、エストロゲン・レセプターを、平衡になるまで
[125I]−E2とともにインキュベートする(16−18時
間、+4℃にて)。セファデックスG25カラム上で遊離
の[125I]−E2から、タンパク質結合[125I]−E2を分
離して、インキュベーションを止めた。溶出液の放射能
を、ガンマカウンターで測定する。
125I]−17β−エストラジオール([125I]−E2)(NE
X−144、ニューイングランドニュクリアー(New Englan
d Nuclear))であった。結合実験の方法は、既に記載
されている:サロモンソン,エム(Salomonsson M)、
カールソン,ビー.(Carlsson B)、ハグブラッド ジ
ェイ.ジェイ.(Haggblad J.J.)、Steroid Biochem.M
olec.Biol.Vol.50,No.5/6 pp.313−18,1994。簡単に述
べると、エストロゲン・レセプターを、平衡になるまで
[125I]−E2とともにインキュベートする(16−18時
間、+4℃にて)。セファデックスG25カラム上で遊離
の[125I]−E2から、タンパク質結合[125I]−E2を分
離して、インキュベーションを止めた。溶出液の放射能
を、ガンマカウンターで測定する。
競合実験では、非放射性リガンドをDMSOに希釈し、[
125I]−E2(約100−200pM)と混合し、並行にアリコー
トし、最後にhERαまたはrERβを添加した。結合緩衝液
中のDMSOの最終濃度は、2%であった。
125I]−E2(約100−200pM)と混合し、並行にアリコー
トし、最後にhERαまたはrERβを添加した。結合緩衝液
中のDMSOの最終濃度は、2%であった。
実験で使用された緩衝液は、以下の組成のものであっ
た:Hepes(pH=7.5)20mM、KCl 150mM、EDTA 1mM、グリ
セロール(8.7%)、モノチオグリセロール6mM、Na3MO4
10mM。
た:Hepes(pH=7.5)20mM、KCl 150mM、EDTA 1mM、グリ
セロール(8.7%)、モノチオグリセロール6mM、Na3MO4
10mM。
3.平衡結合飽和実験(Kd−測定) ある範囲の濃度の[125I]−E2を、ER:sと混合し、上
記のようにインキュベートし、加えた[125I]−E2から
結合[125I]−E2を引き算して、遊離の[125I]−E2を
決定した。結合データを、HillプロットおよびScatchar
dプロットによって分析した(図11)。平衡結合の結果
を、表1に示す。[125I]−E2に関する見かけのKd値
は、2つのER:s間で異なり、おおよそ4の係数を有し
た;Kd(hERα):Kd(rERβ)=1:4。
記のようにインキュベートし、加えた[125I]−E2から
結合[125I]−E2を引き算して、遊離の[125I]−E2を
決定した。結合データを、HillプロットおよびScatchar
dプロットによって分析した(図11)。平衡結合の結果
を、表1に示す。[125I]−E2に関する見かけのKd値
は、2つのER:s間で異なり、おおよそ4の係数を有し
た;Kd(hERα):Kd(rERβ)=1:4。
4.競合実験(IC50決定) 実験を、上記のように行った。IC50値は、4つのパラ
メーターの論理分析;b=((bmax−bmin)/(1+(I/
IC50)s))+bminを適用して得られ、式中、Iは結合
阻害の添加濃度であり、IC50は最大結合の半分を阻害す
る濃度であり、Sは勾配因子である。[125I]−E2の遊
離の濃度は、インキュベーションの終わりにウェルから
アリコートをサンプリングし、サンプルした全放射能か
ら結合放射能を引き算して決定した。
メーターの論理分析;b=((bmax−bmin)/(1+(I/
IC50)s))+bminを適用して得られ、式中、Iは結合
阻害の添加濃度であり、IC50は最大結合の半分を阻害す
る濃度であり、Sは勾配因子である。[125I]−E2の遊
離の濃度は、インキュベーションの終わりにウェルから
アリコートをサンプリングし、サンプルした全放射能か
ら結合放射能を引き算して決定した。
平衡結合実験(上記)は、[125I]−E2に関するKd値
が2つのER:s間で異なることを示したので、Ki値を調べ
られた化合物に関して[Cheng−Prusoff式:Ki=IC50/
(1+L/Kd)、(式中、Lは遊離の[125I]−E2)か
ら]計算した。RBA(Relative Binding Affinity;相対
結合親和性)を計算するために2つのアプローチを使用
した。RBA値は、IC50値またはKi値のいずれかを用いて
誘導した。両アプローチで、化合物16α−ブロモ−エス
トラジオールに関する値を、参照値(100%)として選
択した。両アプローチとも、同様の結果を与えた。結果
を、図12に要約する。これらの図において、“4−OH−
Tam"=4−ヒドロキシ−タモキシフェン;“DES"=ジエ
チルスチルベストロール;“Hexestr"=ヘキセストロー
ル;“ICI−164384"=ICI plc化合物no.164382;“17β
−E2"=17β−エストラジオール;“16a−B−E2"=16
α−ブロモ−エストラジオール;“Ralox"=ラロキシフ
ェン;および“17a−E2"=17αジオール。
が2つのER:s間で異なることを示したので、Ki値を調べ
られた化合物に関して[Cheng−Prusoff式:Ki=IC50/
(1+L/Kd)、(式中、Lは遊離の[125I]−E2)か
ら]計算した。RBA(Relative Binding Affinity;相対
結合親和性)を計算するために2つのアプローチを使用
した。RBA値は、IC50値またはKi値のいずれかを用いて
誘導した。両アプローチで、化合物16α−ブロモ−エス
トラジオールに関する値を、参照値(100%)として選
択した。両アプローチとも、同様の結果を与えた。結果
を、図12に要約する。これらの図において、“4−OH−
Tam"=4−ヒドロキシ−タモキシフェン;“DES"=ジエ
チルスチルベストロール;“Hexestr"=ヘキセストロー
ル;“ICI−164384"=ICI plc化合物no.164382;“17β
−E2"=17β−エストラジオール;“16a−B−E2"=16
α−ブロモ−エストラジオール;“Ralox"=ラロキシフ
ェン;および“17a−E2"=17αジオール。
結果は、ErαおよびErβが有意に異なるリガンド結合
親和性を有すること−[125I]−E2に関する見かけのKd
値が2つのER間で、係数が約4[(Kd(hERα):Kd(rE
Rβ)1:4]異なることを示した。調べられた幾つかの
化合物は、ER類に対する[125I]−E2結合の競合に有意
な相違を示した。ある化合物は、rERβに比較してhERα
への[125I]−E2結合のより強力な阻害剤であることが
見い出されたが、他のものは、hERαよりもrERβへの[
125I]−E2結合のより強力な阻害剤であることが見い出
された。
親和性を有すること−[125I]−E2に関する見かけのKd
値が2つのER間で、係数が約4[(Kd(hERα):Kd(rE
Rβ)1:4]異なることを示した。調べられた幾つかの
化合物は、ER類に対する[125I]−E2結合の競合に有意
な相違を示した。ある化合物は、rERβに比較してhERα
への[125I]−E2結合のより強力な阻害剤であることが
見い出されたが、他のものは、hERαよりもrERβへの[
125I]−E2結合のより強力な阻害剤であることが見い出
された。
フロントページの続き (31)優先権主張番号 9607532.0 (32)優先日 平成8年4月11日(1996.4.11) (33)優先権主張国 イギリス(GB) (31)優先権主張番号 9609576.5 (32)優先日 平成8年5月8日(1996.5.8) (33)優先権主張国 イギリス(GB) (72)発明者 エンマルク エヴァ スウェーデン国 エス−141 86 ヒュ ディンゲ ノヴム カロリンスカ イン スティテュート センター フォー バ イオテクノロジー アンド デパートメ ント オブ メディカル ヌトリション (以下番地の表示なし) (72)発明者 グスタフソン ヤン−アケ スウェーデン国 エス−141 86 ヒュ ディンゲ ノヴム カロリンスカ イン スティテュート センター フォー バ イオテクノロジー アンド デパートメ ント オブ メディカル ヌトリション (以下番地の表示なし) (56)参考文献 Nucleic Acids Res earch,15(1987)p.2499−2513 (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C12N 15/09 ZNA C07K 14/705 C12P 21/02 C12Q 1/68 G01N 33/15 BIOSIS(DIALOG) GenBank/EMBL/DDBJ(G ENETYX)
Claims (17)
- 【請求項1】図1のアミノ酸配列を有する単離されたエ
ストロゲンレセプター(ERβ)。 - 【請求項2】図1のアミノ酸配列と95%より多く同一で
あるアミノ酸配列を有する単離されたエストロゲンレセ
プター(ERβ)。 - 【請求項3】図13Aのアミノ酸配列を有する単離された
エストロゲンレセプター(ERβ)。 - 【請求項4】図13Aのアミノ酸配列と89%より多く同一
であるアミノ酸配列を有し、ERαよりもHUVEC及びHOS D
4細胞中でより多い量で発現する単離されたエストロゲ
ンレセプター(ERβ)。 - 【請求項5】図14Aのアミノ酸配列を有する単離された
エストロゲンレセプター(ERβ)。 - 【請求項6】図14Aのアミノ酸配列と95%より多く同一
であるアミノ酸配列を有する単離されたエストロゲンレ
セプター(ERβ)。 - 【請求項7】哺乳動物細胞に由来する請求項1〜6のい
ずれかに記載のエストロゲンレセプター。 - 【請求項8】ラットまたはヒトの細胞に由来する請求項
7に記載のエストロゲンレセプター。 - 【請求項9】請求項1〜8のいずれかに記載のエストロ
ゲンレセプターをコードする単離されたDNA配列。 - 【請求項10】DNA配列が図1、図13Bまたは図14Bに示
されるものの1つである請求項9に記載のDNA配列。 - 【請求項11】図1の994−1041のヌクレオチドを含む
オリゴヌクレオチドプローブに、ストリンジェントな条
件下、ハイブリダイズすることができる単離された核酸
配列であって、請求項1〜8のいずれかに記載のエスト
ロゲンレセプターをコードする核酸配列。 - 【請求項12】図1の1981−2031のヌクレオチドを含む
オリゴヌクレオチドプローブに、ストリンジェントな条
件下、ハイブリダイズすることができる単離された核酸
配列であって、請求項1〜8のいずれかに記載のエスト
ロゲンレセプターをコードする核酸配列。 - 【請求項13】請求項1〜8のいずれかに記載のエスト
ロゲンレセプターと結合する分子を決定するアッセイに
おける、請求項1〜8のいずれかに記載のエストロゲン
レセプター、請求項9又は10に記載のDNA配列または請
求項11又は12に記載の核酸配列の使用。 - 【請求項14】ERβ特異的疾患または状態又は請求項1
〜8のいずれかに記載のエストロゲンレセプターに関連
する疾患または状態の治療に使用するための分子を決定
するアッセイにおける、請求項1〜8のいずれかに記載
のエストロゲンレセプター、請求項9又は10に記載のDN
A配列又は請求項11又は12に記載の核酸配列の使用。 - 【請求項15】前立腺または卵巣の癌、良性前立腺過形
成、中枢神経系の疾患、骨粗鬆症、または心臓血管疾患
の治療に使用するための分子を決定するアッセイにおけ
る、請求項1〜8のいずれかに記載のエストロゲンレセ
プター、請求項9又は10に記載のDNA配列又は請求項11
又は12に記載の核酸配列の使用。 - 【請求項16】供試化合物のERαおよび請求項1〜8の
いずれかに記載のエストロゲンレセプターへの結合を比
較することを包含する薬剤デザイン方法。 - 【請求項17】物質の可能性のあるエストロゲン性また
は他のホルモン性の効果のテストにおける請求項1〜8
のいずれかに記載のエストロゲンレセプターの使用。
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GBGB9518272.1A GB9518272D0 (en) | 1995-09-08 | 1995-09-08 | Orphan receptor |
GBGB9605550.4A GB9605550D0 (en) | 1996-03-15 | 1996-03-15 | Orphan receptor |
GB9605550.4 | 1996-03-15 | ||
GB9607532.0 | 1996-04-11 | ||
GBGB9607532.0A GB9607532D0 (en) | 1996-04-11 | 1996-04-11 | Orphan receptor |
GBGB9609576.5A GB9609576D0 (en) | 1996-05-08 | 1996-05-08 | Orphan receptor |
GB9609576.5 | 1996-05-08 | ||
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