DE69232486T2

DE69232486T2 - Intron/Exon Struktur der Genen von den menschlichen und Maus Beta 3 adrenergischen Rezeptoren

Info

Publication number: DE69232486T2
Application number: DE1992632486
Authority: DE
Inventors: Laurent Emorine; Clara Nahmias-Kaminski; A. Donny Strosberg
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1992-12-01
Filing date: 1992-12-01
Publication date: 2002-10-31
Anticipated expiration: 2012-12-02
Also published as: EP0600136B1; EP0600136A1; DE69232486D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft das vollständige Gen, das β3-adrenerge Rezeptorpolypeptide der Maus und menschlichen Ursprungs codiert, wobei die Polypeptide ein Verfahren zur Untersuchung der Wirkungen verschiedener chemischer Mittel auf den β3-adrenergen Rezeptor und die daran gekoppelte Adenylatcyclase sowie hormonempfindliche Lipasen ermöglichen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ebenfalls Antikörper, Vektoren, Nukleotidsonden, Zellwirte, welche mit Genen, die für Polypeptide codieren, welche die Aktivität eines β3-adrenergen Rezeptors aufweisen, transformiert sind.
In der Vergangenheit wurden zwei Hauptklassen von adrenergen Rezeptoren als die α-adrenergen Rezeptoren und die β-adrenergen Rezeptoren identifiziert. Diese adrenergen Rezeptoren erzeugen verschiedene Reaktionen an Effektororganen wie z. B. dem Auge, dem Herz, Arteriolen, Venen, Lungen, Magen, Darm, Gallenblase, Niere, Haut, Milz, Leber und Pankreas, um nur einige wenige zu nennen. Diese spezifischen Rezeptoren wurden über die Wirkungen von bestimmten synthetischen Agonisten, welche die biologische Funktion der Rezeptoren stimulieren, und Antagonisten, welche die biologische Funktion adrenerger Rezeptoren blockieren, definiert.
Innerhalb der zwei Klassen von adrenergen Rezeptoren wurden vier Untertypen, α1, α2, β1 und β2, dieser Rezeptoren für Catecholamine identifiziert. Siehe Coteccia et al., P. N. A. S., 85, Seiten 7159-7163 (1988); Kobilka et al., Science 238, Seiten 650-656 (1987); Frielle et al., P. N. A. S., 84, Seiten 7920-7924 (1987); und Emorine et al., P. N. A. S., 84 Seiten 6995-6999 (1987). Arzneimittel, welche einen oder mehrere dieser Rezeptoruntertypen selektiv blockieren oder stimulieren, werden in der klinischen Medizin häufig verwendet. Trotz der Effizienz dieser Arzneimittel produzieren viele bei Individuen aufgrund ihrer Wechselwirkung mit anderen Rezeptoruntertypen Nebenwirkungen. Zur Identifizierung der verschiedenen Arzneimittel, welche auf die Rezeptoruntertypen einwirken, siehe Goodman und Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8. Ausgabe, MacMillan Publishing Co., Inc. (1990).
Die Analyse der Gene dieser Rezeptoren zeigt, dass alle Untertypen der Rezeptoren zu der Familie der integralen Membranrezeptoren gehören, welche ausgeprägte Homologien zeigen, wobei diese Homologien insbesondere in den 7 Transmembranregionen vorliegen. Diese Rezeptoren sind an regulatorische Proteine gekoppelt, welche G-Proteine genannt werden, die in der Lage sind, Moleküle von Guanosintriphosphat (GTP) zu binden.
Die G-Proteine weisen die Fähigkeit auf, strukturell und funktional zwischen Rezeptoren und Enzymen, welche die Produktion intrazellulärer Mediatoren katalysieren, wie z. B. Adenylatcyclase, Guanylatcyclase, die Phospholipasen und die Kinasen, oder zwischen Rezeptoren und Ionenkanälen zu vermitteln. Somit weisen die G-Proteine die Fähigkeit auf, den Fluss von Ionen, wie z. B. Calcium-, Kalium-, Natrium- und Wasserstoffionen, zu regulieren.
Die oben erwähnten Untertypen der Rezeptoren sind im Stand der Technik als die "R&sub7;G-Familie" bekannt, wie von Emorine et al., Proc. NATO Adv. Res. Workshop (1988) beschrieben wird. Die R&sub7;G-Familie umfasst Acetylcholinmuscarinsäurerezeptoren, Serotoninrezeptoren, die Rezeptoren für Neuropeptide, Substanz K, Angiotensin II und die Sichtrezeptoren für die Opsine, wie von Dixon et al., Annual Reports in Medicinal Chemistry, Seiten 221-233, Herausgeber Seamon, K. B., Food and Drug Administration, Bethesda, Md. (1988) und Emorine et al., supra, beschrieben wird.
Kürzlich wurde ein dritter Untertyp des β-adrenergen Rezeptors, welcher β3-adrenerger Rezeptor genannt wird, bei Menschen und bei Nagetieren identifiziert und charakterisiert, wobei das Polypeptid keine Rezeptoraktivität aufweist, die zu der der β1- oder β2-adrenergen Rezeptoren ähnlich ist. Dieser "neue" β3-Rezeptor beim Menschen wurde identifiziert und sequenziert, wie in der französischen Anmeldung Nr. 8900918, angemeldet am 25. Januar 1989, und der PCT/FR90/00054, welche zu der US-Anmeldung Nr. 07/721,571 führten, die am 25. Januar 1990 angemeldet wurde, beschrieben wird, auf welche hierin vollinhaltlich Bezug genommen wird, wonach dieser 402 Aminosäuren enthält, wobei er in der Lage ist, Adenylatcyclase in Gegenwart eines Agonisten zu aktivieren, wobei die Aktivität in der Reihenfolge der Agonisten von Salbutamol, BRL 28410, BRL 37344 zu (1)-Isoproterenol ansteigt. Antikörper, die gegen das Polypeptid des β3-adrenergen Rezeptors gerichtet sind, wurden ebenfalls offenbart. Der β3-Rezeptor wurde dadurch identifiziert, dass er in einem pharmakologischen Vergleich der Aktivierung von Adenylatcyclase in Gegenwart von Agonisten und der Reaktion gegenüber verschiedenen Antagonisten von dem β1-adrenergen Rezeptor und dem β2-adrenergen Rezeptor verschieden war.
In ähnlicher Weise wurde der β3-adrenerge Rezeptor der Maus identifiziert und kloniert, wie in der französischen Anmeldung Nr. 9100320, angemeldet am 14. Januar 1991, und der PCT/FR92/00023, angemeldet am 15. Januar 1992, beschrieben wird, auf welche hierin ebenfalls vollinhaltlich Bezug genommen wird. Siehe ebenfalls Nahmias et al., Embo J., 10, Seiten 3721-3727 (1991). Der β3-adrenerge Rezeptor der Maus codiert ein Polypeptid mit 388 Aminosäureresten, welches die Merkmale einschließt, die für β-adrenerge Rezeptoren charakteristisch sind, wie z. B. die konservierten Aminosäuren, die als für die Catecholaminbindung entscheidend in dem β2-adrenergen Rezeptor identifiziert wurden. Siehe Strader et al., FASEB J. 3, Seiten 1825-1832 (1989).
Ein pharmakologischer Vergleich des β3-adrenergen Rezeptors der Maus mit dem menschlichen Gegenstück zeigt, dass diese Rezeptoren eine ähnliche Reaktivität aufweisen. Beispielsweise kann der β3-adrenerge Rezeptor der Maus durch CGP 12177A, Oxprenolol und Pindolol aktiviert werden, während er eine geringe Stereoselektivität und eine charakteristische Reihenfolge bei der Wirksamkeit von vollständigen Agonisten zeigt, welche ähnlich zu der des menschlichen ist.
Jedoch existieren Unterschiede zwischen dem β3-adrenergen Rezeptor der Maus und dem menschlichen β3-adrenergen Rezeptor, welche möglicherweise auf den strukturellen Unterschieden beruhen, die zwischen diesen zwei Rezeptoren bei den Transmembrandomänen, welche an der Ligandenbindung beteiligt sind, beobachtet werden, in welchen 12 Substitutionen auftreten.
Die Thermogenese und Lipolyse in braunen und weißen Fettgeweben befinden sich unter der Kontrolle dieses Untertyps des β3-adrenergen Rezeptors, wie von Arch et al., Proc. Nutr. Sci., 48, Seiten 215-223 (1989); Arch et al., In Obesity, John Wiley & Sons Ltd., London (1991); und Zaagsma et al., Trends Pharmacol. Sci., 11, Seiten 3-7 (1990) beschrieben wird. Neben den Fettgeweben wurde die Expression des β3-adrenergen Rezeptors ebenfalls von verschiedenen anderen Geweben wie beispielsweise Geweben des Verdauungstrakts, von dem Oesophagus bis zum Kolon, und in den Gallenblase berichtet. Siehe z. B. Bond et al., Br. J. Pharmacol., 95 Seiten 723-734 (1988); Coleman et al., British Journal of Pharmacology Proc. Supl., 90, 40 (1987); Bianchetti et al., Br. J. Pharmacol., 100, Seiten 831-839 (1990); Granneman et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 256, Seiten 421-425 (1991) und Krief et al., J. Clin. Invest., (1993) (im Druck). Von diesem Untertyp des β3-adrenergen Rezeptors wurde vorgeschlagen, dass er durch Catecholamine an der Regulation des Energiehaushalts des Körpers von der Aufnahme im Darm bis zu der Lagerung und Mobilisierung im Fettgewebe teilnimmt.
Faktoren wie z. B. Temperatur, Ernährung oder Fasten und Stress beeinflussen den Hormonstatus des Körpers, wodurch sie gewebespezifische adaptive Modifikationen des Energiehaushalts induzieren, welche teilweise aus einer Regulation der Empfindlichkeit von zellulären β3- adrenergen Rezeptoren resultieren können. Es wurde weiterhin gezeigt, dass β-adrenerge Agonisten, Glucocorticoide und mehrere andere Mittel die Dichte des β3-adrenergen Rezeptors, die Ansprechempfindlichkeit und die mRNA-Spiegel modulieren können. Die molekularen Determinanten, welche für die Regulation des zellulären β3-adrenergen Rezeptors verantwortlich sind, können möglicherweise entweder auf dem Rezeptor selbst oder bei seinem Gen oder der mRNA gefunden werden. Beispielsweise können posttranslationale Modifikationen des Rezeptors in der dritten intrazytoplasmatischen Schleife oder in dem carboxyterminalen Schwanz die Kopplung des β-adrenergen Rezeptors an Adenylatcyclase modulieren. Faktoren, welche auf die Gentranskriptionsgeschwindigkeit des β-adrenergen Rezeptors oder auf die mRNA-Stabilität einwirken, können ebenfalls die zelluläre adrenerge Ansprechempfindlichkeit durch ein Modifizieren der Expressionsniveaus des β-adrenergen Rezeptors modulieren.
Die β3-adrenergen Rezeptoren wurden sequenziert und identifiziert, wie auch pharmakologisch mit anderen bekannten Rezeptoren der Maus und der Menschen verglichen. Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen des β3-adrenergen Rezeptors, welche ausgehend von den Nukleotidsequenzen der genomischen Gene des Menschen und der Maus vorhergesagt wurden, zeigte Unterschiede in den carboxyterminalen Regionen der Rezeptoren. Obwohl diese Unterschiede evolutionären, mit den Spezies in Zusammenhang stehenden Variationen zugeschrieben werden konnten, wurde kürzlich von den vorliegenden Erfindern entdeckt, dass die gesamte Codierungssequenz für den früher berichteten β3-adrenergen Rezeptor der Maus und des Menschen nicht vollständig war. Die Gene, welche für β1 und β2 codieren, umfassen ein Exon, und man dachte, dass das Gen des β3-adrenergen Rezeptors, als es anfangs identifiziert wurde, ebenfalls nur ein Exon umfasse. Jedoch wurde kürzlich und unerwartet entdeckt, dass im Gegensatz zu den Genen der β1- und β2-adrenergen Rezeptoren die Gene für den β3-adrenergen Rezeptor des Menschen und der Maus mehrere Exons umfassen. Die Identifizierung der Introns und Exons bei den β3-adrenergen Rezeptoren der Maus und des Menschen und somit des gesamten Gens selbst erlaubt eine vollständige Charakterisierung dieses Rezeptors, welche dabei helfen wird, empfindlichere genetisch hergestellte Produkte wie z. B. Nukleotidsonden, polyclonale und monoclonale Antikörper und dergleichen für Arzneimitteltests und diagnostische Zwecke bereitzustellen, und ermöglicht das Verständnis der von dem β3-adrenergen Rezeptor regulierten Expression in verschiedenen Geweben.

ZUSAMMENFASSUNG DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG

Somit ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine isolierte und gereinigte Nukleinsäuresequenz bereitzustellen, welche die Nukleotidsequenz aus Fig. 1 und Fig. 2 umfasst.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Polypeptide mit β3-adrenerger Rezeptoraktivität in Säugetieren bereitzustellen, wobei die Polypeptide von den vollständigen Genen des β3-adrenergen Rezeptors des Menschen und der Maus codiert werden.
Eine spezielle Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die vollständigen Aminosäure- und Nukleotidsequenzen wie auch die Intron/Exon-Organisation für den β3-adrenergen Rezeptor des Menschen und der Maus bereitzustellen, wobei die Charakterisierungen der Moleküle nicht nur dafür nützlich sind, den β3-adrenergen Rezeptor in unterschiedlichen Spezies zu detektieren, sondern ebenfalls für ein Testen von neuen Arzneimitteln zur Regulation von β3-adrenergen Rezeptoraktivitäten.
Noch eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Nukleotidsonden bereitzustellen, die in der Lage sind, mit den Genen zu hybridisieren, welche die Polypeptide mit β3-adrenerger Aktivität in Säugetieren codieren, um diesen Rezeptor in unterschiedlichen Säugetierspezies zu detektieren und um die Variationen bei den Expressionsniveaus des β3-Rezeptors in Säugetierzellen zu messen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, polyclonale und monoclonale Antikörper, welche die gesamte Sequenz des β3-adrenergen Rezeptors in Säugetieren erkennen, wobei die Antikörper den β1-adrenergen Rezeptor oder den β2-adrenergen Rezeptor nicht erkennen, zum Nachweisen und für diagnostische Zwecke bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, rekombinante Vektoren zum Klonieren und zur Expression der β3-adrenergen Rezeptorproteine in Säugetieren bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen Zellwirt bereitzustellen, welcher die Regulationselemente umfasst, welche die Expression der Nukleotidsequenz, welche die Polypeptide der β3-adrenergen Rezeptoren codiert, in Säugetieren möglich machen.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 stellt die Nukleotidsequenz, die Aminosäureübersetzung und die Intron/Exon-Organisation des menschlichen β3-adrenergen Rezeptorgens dar.
Fig. 2 stellt die Nukleotidsequenz, die Aminosäureübersetzung und die Intron/Exon-Organisation des β-adrenergen Rezeptorgens der Maus dar.
Fig. 3 ist die vollständige Aminosäuresequenz für den menschlichen β3-adrenergen Rezeptor.
Fig. 4 ist die vollständige Aminosäuresequenz für den β3-adrenergen Rezeptor der Maus.
Fig. 5 ist eine schematische Darstellung des mRNA-Spleißens des β-adrenergen Rezeptors des Menschen und der Maus.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung verschiedene genetisch hergestellte Produkte wie z. B. Nukleotidsonden, monoclonale und polyclonale Antikörper zum Testen auf eine Vielzahl von chemischen Mitteln einschließlich Arzneimitteln, Liganden und dergleichen, welche die Regulation von β3-adrenergen Rezeptoren beeinflussen können, zur Verfügung. Darüber hinaus ist es bei diesem Testverfahren wichtig, die vollständige Sequenz des β3-Rezeptorgens zu haben, da Elemente in der Promotorregion, in der Intron/Exon-Region und in der untranslatierten 3'-Region die Expression von β3 beeinflussen können. Durch ein Testen von Arzneimitteln, welche die Expressionsniveaus des β3-adrenergen Rezeptors erhöhen und/oder erniedrigen können, können verschiedene Krankheiten wie beispielsweise Fettsucht, Diabetes und Hyperlipidämie und dergleichen unter Kontrolle gebracht werden.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ebenfalls ein Verfahren zur in vitro-Diagnose von Krankheiten zur Verfügung, die mit dem Energiehaushalt zusammenhängen, welche Krankheiten durch Anomalien bei der Aktivität des β3-adrenergen Rezeptors diagnostiziert werden können.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Vektoren, die Gene enthalten, welche für Polypeptide codieren, die in Säugetieren eine β3-adrenerge Rezeptoraktivität aufweisen, wie auch Zellwirte, die mit Genen transformiert sind, welche für die oben erwähnten Polypeptide codieren, bereit.
Mit Säugetieren ist irgendeine Klasse von höheren Wirbeltieren gemeint, welche den Menschen und alle anderen Tiere, die ihre Jungen mit Milch ernähren, die von Milchdrüsen sezerniert wird, und welche eine Haut aufweisen, die gewöhnlich mehr oder weniger durch Haare bedeckt ist, einschließlich Affen, Mäuse, Ratten, Menschen und dergleichen umfasst.
Jedes Säugetierpolypeptid, das eine β3-adrenerge Rezeptoraktivität zeigt, ist ein Teil der vorliegenden Erfindung, aber bevorzugte Polypeptide codieren die Aminosäuresequenzen, die in den Fig. 3 und 4 angegeben sind.
Variationen der Polypeptide sind ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst, unter der Voraussetzung, dass die Polypeptidvarianten ihre β3-adrenerge Rezeptoraktivität nicht verlieren. Irgendeine Technik, die im Stand der Technik bekannt ist, kann verwendet werden, um diese Polypeptidvarianten bereitzustellen, einschließlich nukleotidvermittelter Mutagenese, oligonukleotidvermittelter "loop out"-Mutagenese, einer Mutagenese unter Einführung von Linkem und dergleichen. Diese Verfahren sind wohlbekannt und werden beispielsweise von Sambrook et al. in Molecular Cloning A Laboratory Manual, zweite Ausgabe, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989) beschrieben.
Neben Polypeptiden umfasst die vorliegende Erfindung ebenfalls jede Nukleotidsequenz von β3-adrenergen Rezeptoren in Säugetieren. Eine bevorzugte Ausführungsform dieser Nukleotidsequenzen ist in den Fig. 1 und 2 dargestellt. Varianten der Nukleotidsequenz sind in der vorliegenden Erfindung ebenfalls umfasst, einschließlich Mutationen und Punktsubstitutionen unter Verwendung der oben beschriebenen Mutageneseverfahren, vorausgesetzt, dass diese Variationen die β3-adrenerge Rezeptoraktivität nicht signifikant verändern.
Diese Nukleotide können durch irgendein Syntheseverfahren, das im Stand der Technik bekannt ist, hergestellt werden. Beispiele für diese Verfahren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, das automatisierte β-Cyanoethylphosphoramiditverfahren, das in Bioorganic Chemistry, 4, Seiten 274-325 (1986) beschrieben wird, wobei das Verfahren zur Herstellung einer Nukleotidsequenz geeignet ist, die ein Maximum von 200 Nukleotiden enthält, und jene, die in P. N. A. S., 80, Seiten 7461-7465 (1983) für Nukleotide, die länger sind als 200, beschrieben werden.
Neben der Synthese von Nukleotiden betrifft die vorliegende Erfindung ebenfalls die Reinigung von Nukleotiden aus genomischer DNA oder zellulärer RNA aus irgendeinem Säugetiergewebe, welches den β3-adrenergen Rezeptor exprimiert, einschließlich Fett-, Muskel-, Leber-, Darm-, Gallenblasengeweben und dergleichen. mRNA kann dann durch die Verfahren, die in Sambrook et al., Molecular Cloning, supra, beschrieben werden, isoliert werden und cDNA daraus synthetisiert werden.
Die Nukleotidsequenzen oder Fragmente von diesen können in einem Plasmid, Cosmid oder einem Vektor von Phagentyp kloniert und/oder exprimiert werden. Somit umfasst die vorliegende Erfindung ebenfalls rekombinante Vektoren, welche verwendet werden können, um den β3-adrenergen Rezeptor in einer Vielzahl von Wirtsmikroorganismen zu klonieren oder zu exprimieren. Die verschiedenen Vektoren umfassen pBr322, pUC18/pUC19, pUC119, p5P64/p5P65, pGEM-3/pGEM-4, pGEM-32, πAN13, Bluescript M13, λgt10, λ22001, λDASH, λFIX, C2RB, pWE15 und dergleichen, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Ein bevorzugter Vektor umfasst ein HindII-PstI-Fragment der genomischen DNA, das aus der Maus stammt, welches ca. 5,5 Kilobasen aufweist und die Gesamtheit des Gens, das für den β3-adrenergen Rezeptor in der Maus codiert, einschließlich der Promotorregion und des Exons 1, des Exons 2 und des Exons 3 enthält, wobei das Fragement in eine HindII-PstI-Stelle von pUC18 eingefügt wurde. Das Plasmid wurde in E. coli (JM101) transformiert. Dieser Vektor (030 B315-I) wurde am 1. Dezember 1992 unter der Nr. I-1272 bei der C. N. C. M., Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 Rue du Docteur Roux, Paris, Frankreich, hinterlegt.
Ein zweiter bevorzugter Vektor umfasst ein BglII-Fragment einer genomischen DNA, die vom Menschen stammt, mit ca. 4,5 Kilobasen und welche die Gesamtheit des Gens, das für den β3-adrenergen Rezeptor in Menschen codiert, einschließlich der Promotorregion und des Exons 1 und des Exons 2 enthält, wobei das Fragment in eine BamHI-Stelle von pUC18 eingefügt wurde. Das Plasmid wurde dann in E. coli (JM101) transformiert. Dieser Vektor (119 B315-III) wurde am 1. Dezember 1992 unter der Nr. I-1273 bei der C. N. C. M., Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 Rue du Docteur Roux, Paris, Frankreich, hinterlegt.
Zur Expression enthält der Vektor an wenigstens einer seiner Stellen, die zur Replikation nicht wesentlich sind, Elemente, die notwendig sind, um die Expression des Polypeptids der vorliegenden Erfindung in einem Zellwirt zu fördern. Beispielsweise kann ein Promotor, welcher von der RNA-Polymerase des Zellwirts erkannt wird, verwendet werden. Jeder Promotor, welcher eine Expression erreicht, kann verwendet werden, es ist aber bevorzugt, einen induzierbaren Promotor und, wenn nötig, eine Signal- und eine Ankersequenz zu verwenden. In eukaryotischen Zellen können die regulatorischen Elemente zur Expression den endogenen Promotor für die adrenergen Rezeptoren oder virale Promotoren wie z. B. jene des SV40-Virus oder Rous-Sarcomavirus umfassen, während für eine bakterielle Expression die regulatorischen Elemente das Laktoseoperon, das Tryptophanoperon und dergleichen umfassen können.
Zellwirte, welche durch irgendeinen der oben beschriebenen Vektoren transformiert wurden, sind von der vorliegenden Erfindung ebenfalls umfasst. Jeder Zellwirt, der in der Lage ist, irgendein β3-adrenerges Rezeptorpolypeptid aus Säugetieren oder Fragmente davon zu exprimieren, ist von der vorliegenden Erfindung umfasst. Diese Zellwirte umfassen jegliche eukaryotischen oder prokaryotischen Zellen, einschließlich Bakterien wie z. B. E. coli, Hefe, CHO- Zellen und dergleichen. Es ist interessant festzustellen, dass, wenn die gesamte Intron/Exon- Sequenz des β3-adrenergen Rezeptors der Maus oder des Menschen in einer Vielzahl von eukaryotischen Zellwirten einschließlich CHO- und L-Zellen exprimiert wird, das Spleißen des Gens korrekt stattfindet.
Die rekombinanten Vektoren und die Zellwirte, welche mit diesen Vektoren transformiert sind, sind nützliche Werkzeuge, um leicht und einfach verschiedene Nukleotidsonden zu erzeugen.
Diese Nukleotidsonden können ebenfalls aus den Nukleotidsequenzen, wie oben diskutiert, über Synthese- und Reinigungstechniken hergestellt werden und dann mit einem nachweisbaren Marker markiert werden. Jeder nachweisbare Marker kann verwendet werden, um die spezifische interessierende Nukleotidsequenz zu markieren, wie beispielsweise ¹&sup4;C, ³²P, Enzymmarker und dergleichen. Die Markierungsbedinungen für die Sequenzen sind im Stand der Technik wohlbekannt, und als Referenz können solche Techniken verwendet werden, die von Sambrook et al., Molecular Cloning, supra, beschrieben werden.
Insbesondere ist es vorteilhaft, eine Sonde mit voller Länge mit der Nukleotidsequenz, wie sie in den Fig. 1 und 2 definiert ist, zu verwenden, um eine genomische oder cDNA-Bibliothek von verschiedenen Säugetierspezies zu sondieren, um den interessierenden verwandten β3- adrenergen Rezeptor zu erhalten. Ein Fragment der Nukleotidsonde kann ebenfalls erzeugt werden.
Eine Nukleotidsonde ist ebenfalls nützlich, um die Variationen bei den Expressionsniveaus des β3-adrenergen Rezeptors in Säugetierzellen zu messen, da veränderte Expressionsniveaus aus spezifischen Anomalien in verschiedenen Säugetiergeweben resultieren können. Insbesondere können die Nukleotidsonden derart produziert werden, dass diese mit spezifischen Sequenzen des β3-adrenergen Rezeptorgens reagieren. Somit können, selbst wenn dieser Rezeptor in der spezifischen Säugetierspezies vorliegt, die getestet wird, die Ligandenbindungsstellen oder andere funktionale Regionen in der Sequenz eine Anomalie enthalten, die durch die Verwendung solcher Sonden festgestellt werden kann.
Die Nukleotidsonden, welche zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen DNA-Sonden, RNA-Sonden, synthetische Oligonukleotidsonden, Thioestersonden und dergleichen. Tandemsonden können ebenfalls verwendet werden. Die Tandemsonden können konstruiert werden, indem zwei oder mehrere typspezifische β3-adrenerge Rezeptornukleotidsequenzen innerhalb eines einzigen Vektors kovalent verbunden werden. Eine Mischung der oben erwähnten Sonden ist für Nachweiszwecke ebenfalls beabsichtigt.
Die Bedingungen, welche zur Hybridisierung und zum Waschen der Oligonukleotidsonden zum Feststellen des Vorliegens des β3-adrenergen Rezeptors benötigt werden, können in Abhängigkeit von dem Typ der verwendeten Sonde unterschiedlich sein. Empirisch bestimmte Formeln, welche in der Literatur verfügbar sind, erlauben die Abschätzung der Dissoziationstemperatur des Oligonukleotids. Die Hybridisierung der Oligonukleotide hängt ebenfalls von mehreren Faktoren ab, welche die Länge der Sonde und den GC-Gehalt beinhalten. Die Hybridisierungsbedingungen werden somit entsprechend den verwendeten Sonden eingestellt, und diese gehören zu dem Fachwissen eines Fachmanns.
Die markierten Hybride werden dann nachgewiesen, was von dem Typ der markierten Sonde, die verwendet wurde, abhängt. Beispielsweise wird eine enzymatisch markierte Sonde einen enzymatischen Nachweis erfordern, während, wenn eine radioaktive Markierung verwendet wird, Gamma- oder Betazähler oder eine Autoradiographie verwendet werden können.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Antikörper, die gegen die Polypeptide des β3- adrenergen Rezeptors in Säugetieren gerichtet sind. Diese Antikörper sind für den β3- adrenergen Rezeptor und weder für den β1- noch den β2-adrenergen Rezeptor spezifisch. Diese Antikörper können hergestellt werden, indem das β3-adrenerge Rezeptorprotein oder ein Polypeptid von diesem in ein Tier injiziert wird. Die Antikörper, welche durch die Immunreaktion erzeugt werden, können durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, gewonnen und gereinigt werden. Neben ihrer Verwendung zum Nachweis und für diagnostische Zwecke in vitro, können die Antikörper der vorliegenden Erfindung ebenfalls verwendet werden, um verwandte Rezeptoren in halbgereinigter Form über deren Befestigung an einem festen Träger, wie beispielsweise Gelkügelchen, zu reinigen.
Monoklonale Antikörper können durch das bekannte Verfahren hergestellt werden, das von Köhler und Milstein, Nature, 256, Seite 495 (1975) beschrieben wird. Diese Antikörper sind nützlich, um die Menge und das Vorliegen des β3-adrenergen Rezeptors in einer Vielzahl von Säugetierspezies zu diagnostizieren. Somit kann die Menge und das Vorliegen dieses Rezeptors wichtig sein, um Krankheiten zu diagnostizieren, die mit Energieanomalien in einer Vielzahl von Säugetiergeweben zusammenhängen.
Obwohl der direkte Nachweis des β3-adrenergen Rezeptorpolypeptids durch die Verwendung von genetisch hergestellten Produkten, wie sie oben beschrieben sind, möglich ist, sind diese Produkte in der Verwendung nicht nur darauf beschränkt, das Vorliegen von β3-Rezeptoren bei verschiedenen Spezies nachzuweisen. Ein Testen von verschiedenen Arzneimitteln zur Behandlung von Fettsucht, Fettdiabetes, Hyperlipidämien und dergleichen liegt im Umfang der vorliegenden Erfindung, durch Verwendung der oben erwähnten Nukleotidsonden, β3-adrenergen Rezeptoren und anti-Rezeptor-Antikörper.
Ein Verfahren zum Untersuchen der Affinität eines β3-adrenergen Rezeptorpolypeptids für ein oder mehrere chemische Mittel wie z. B. Arzneimittel, Liganden und dergleichen, ist ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Um die Auswirkungen verschiedener chemischer Mittel zu untersuchen, wird eine Kultivierung einer transformierten Wirtszelle, die eine Sequenz aufweist, welche das gesamte β3-adrenerge Rezeptorgen codiert, unter Bedingungen durchgeführt, welche die Expression eines solchen Gens erlauben. Das Expressionsprodukt, welches an der Oberfläche des transformierten Zellwirts exponiert sein kann oder in dem Zytoplasma der Wirtszelle vorliegen kann, wird dann verwendet, um eine Vielzahl von Liganden, Arzneimitteln und chemischen Mitteln zu testen, indem diese Mittel mit dem transformierten Zellwirt in Kontakt gebracht werden. Eine Affinitätsreaktion zwischen dem transformierten Zellwirt und dem spezifischen Mittel wird dann nachgewiesen.
Die transformierten Wirtszellen, welche die Polypeptidsequenz des β3-adrenergen Rezeptors enthalten, können ebenfalls verwendet werden, um intrazelluläre Reaktionen auf verschiedene chemische Mittel zu testen.
Insbesondere ist es im Stand der Technik bekannt, dass eine Vielzahl von Hormonen, sowohl Peptid- als auch Nichtpeptidhormone, ihre zellulären Wirkungen über eine Wechselwirkung mit Zelloberflächenrezeptoren ausübt, die an Guanidinnukleotid-bindende Proteine oder G-Proteine gekoppelt sind. Die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren vermitteln eine Vielzahl von intrazellulären Reaktionen, wobei die ursprüngliche Spezifität gewöhnlich auf der Stufe des Zelloberflächenrezeptors festgelegt wird. Die Diversität der zellulären Reaktionen resultiert aus der unterschiedlichen Kopplung des Rezeptors an verschiedene G-Proteine, welche jeweils ein unterschiedliches intrazelluläres Effektorsystem stimulieren. Der mit dem G-Protein verknüpfte Rezeptor kann eine Vielzahl von Agonisten binden, welche das G-Protein stimulieren, das an den Rezeptor gekoppelt ist. Die Aktivierung des stimulatorischen G-Proteins führt wiederum zu einer Stimulierung von Adenylatcyclase und somit zu einer Erhöhung der cAMP-Spiegel in den Zellen. Der β3-adrenerge Rezeptor weist die Fähigkeit auf, mit dem G-Protein zu koppeln, und somit können die Wirkungen verschiedener Agonisten, um das stimulatorische G-Protein zu aktivieren, was die cAMP-Spiegel in der Zelle erhöht, ebenfalls unter Verwendung der transformierten Zellwirte der vorliegenden Erfindung getestet werden.
Es ist außerordentlich wichtig, dass die vollständige Gensequenz verwendet wird, um die oben angegebenen Untersuchungen durchzuführen, da bekannt ist, dass die zusätzlichen Sequenzen, welche in der vorliegenden Erfindung beschrieben werden, die Regulation dieser Rezeptoren bewirken und insbesondere die Expression des Rezeptors beeinflussen. Somit kann es beispielsweise, um spezifische Liganden und Arzneimittel zu testen, welche in einem Mittel hilfreich sein können, um die Fettsucht zu verringern (da der β3-adrenerge Rezeptor bei Fettsucht-Patienten in niedrigen Mengen vorliegt), notwendig sein, die Menge des vorliegenden β3-Rezeptors zu erhöhen. Die RNA-Expressionsniveaus des β3-adrenergen Rezeptors können durch zusätzliche Sequenzen reguliert werden, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben und charakterisiert werden, wie beispielsweise die Sequenzen, die in der Promotorregion, der Intron/Exon-Region und der untranslatierten 3'-Region vorliegen. Somit kann ein Mittel, von dem man findet, dass es die Transkription von β3-Rezeptoren erhöht, zu einer Behandlung von Fettsucht und Diabetes führen.
Die Klonierung und ursprüngliche Sequenzierung der genomischen Gene des β3-adrenergen Rezeptors des Menschen und der Maus wurden vorher beschrieben. Nahmias et al., THE EMBO JOURNAL, Band 16, Nr. 12, Seiten 3721-3727 (1991) und Emorine et al., Science, Band 245, Seiten 1118-1121 (1989). Auf diese beiden Referenzen wird hiermit vollinhaltlich Bezug genommen. Um eine bessere Einsicht in die Mechanismen auf der Grundlage der regulierten Expression des β3-adrenergen Rezeptors sowohl beim Menschen als auch bei der Maus zu erhalten, wurden weitere Untersuchungen unternommen. Durch ein Vergleichen des β3-adrenergen Rezeptorgens und der PCR-amplifizierten cDNA-Sequenzen wurde das Vorliegen von Introns, welche die codierenden und die untranslatierten 3'-Regionen des β3-adrenergen Rezeptorgens des Menschen und der Maus unterbrachen, festgestellt.
Eine Nukleotidsequenzierung wurde mit einem 2,5 kb-SphI-BglII-Fragment, welches die gesamten untranslatierten 3'-Regionen des menschlichen Gens abdeckte, und einem 2,2 kb- XhoI-BglII-Fragment, welches die gesamte untranslatierte 3'-Region der genomischen β3- Gene der Maus abdeckte, nach Einfügung dieser Fragmente in beiden Orientierungen in M13- Klonierungsvektoren durchgeführt. Einzelne Subklone wurden dann durch das standardmäßige Kettenabbruchverfahren sequenziert. Die verwendeten Primer waren Oligonukleotide, die Schritt für Schritt während des Verlaufs der Sequenzbestimmung synthetisiert wurden.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Identifizierung von zwei Exons bei Menschen und drei Exons bei Mäusen, welche die gesamte Gensequenz des β3- adrenergen Rezeptors enthalten. Bei Menschen codiert ein großes 1,4 kb-Exon die ersten 402 Aminosäurereste, während das zweite Exon mit 700 Basenpaaren die Sequenz für die sechs carboxyterminalen Reste des β3-adrenergen Rezeptors wie auch die vollständige untranslatierte 3'-Region der mRNA des β3-adrenergen Rezeptors codiert.
Bei Mäusen gibt es drei Exons. Das erste Exon codiert 388 Aminosäurereste des β3-adrenergen Rezeptors; ein zweites Exon mit 68 Basenpaaren codiert für die 12 carboxyterminalen Reste des β3-adrenergen Rezeptors, und das dritte Exon mit ca. 600 bis 700 Basenpaaren mit zwei Akzeptorspleißstellen codiert für die untranslatierte 3'-Region der mRNA des β3-adrenergen Rezeptors. In Fettgeweben von Mäusen erzeugt ein alternatives Spleißen an den zwei Spleißstellen, die in dem dritten Exon gefunden werden, zwei β3-adrenerge Transkripte. Das kürzere Transkript ist das Haupttranskript, das im weißen Fettgewebe gefunden wird, während das längere Transkript in braunem Fettgewebe leicht überwiegt.
Somit ist die Aminosäuresequanz für den menschlichen β3-adrenergen Rezeptor 6 Aminosäuren länger als vorher gedacht, während die Maussequenz 12 Aminosäuren länger ist als vorher berichtet wurde. Die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen wie auch das Spleißen der mRNA sind in den Fig. 1 bis 5 für den β3-adrenergen Rezeptor des Menschen und der Maus dargestellt.
Die Lokalisierung der mRNA-Transkriptionsstartstellen wurde durch eine S&sub1;-Nukleasekartierung durchgeführt, und die mRNA-Transkriptionsstartstellen für sowohl die β3-adrenerge Rezeptor-mRNA der Maus als auch des Menschen wurden dann in einer Region zwischen 150 bis 190 Nukleotiden stromaufwärts von dem ATG-Translationsstartcodon lokalisiert. Bei der Maus existiert eine zweite mRNA-Startregion weiter stromaufwärts. Weiter stromaufwärts von den mRNA-cap-Stellen wurden Glucocorticoidreaktionselemente in der unmittelbaren Nähe von Erkennungssequenzen für den Transkriptionsfaktor AP-1 gefunden. Die inhibitorischen Wirkungen von Glucocorticoiden auf die mRNA-Spiegel des β3-adrenergen Rezeptors könnten aus Wechselwirkungen des Glucocorticoidrezeptors mit c-fos- und c-jun-Produkten resultieren, welche den Transkriptionsfaktior AP-1 aufbauen.
Somit wurden die vollständigen Gene einschließlich der Promotorregion, der Intron/Exon- Region und der untranslatierten 3'-Region, welche für die β3-adrenergen Rezeptoren codieren, wie auch die mRNA-Transkriptionsstartstellen erhalten. Dieser Fund ist nicht nur für den Nachweis und für diagnostische Zwecke von äußerster Wichtigkeit, sondern ebenfalls, um Arzneimittel zu erhalten, die bei der Regulation der β3-Expression im Gewebe nützlich sind. Somit erlaubt die Verwendung von alternativen Promotoren und/oder Spleißstellen eine gewebespezifische Regulation der β3-adrenergen Expression.

BEISPIEL 1

Isolierung und Sequenzierung des β3-AR-Gens der Maus

Alle Methoden, die für die Verfahren mit rekombinanter DNA verwendet wurden, stammen aus Ausubel et al., Science 245, Seiten 1118-1121 (1987). Ein 1,3 kb-NcoI-BamHI-DNA-Fragment, welches die gesamte codierende Region des menschlichen β3-AR-Gens umfasste (Emorine et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene publishing Associates and Wiley InterScience, New York (1989)) wurde als eine Sonde verwendet, um eine genomische Mausbibliothek NIH 3T3 im Lambda FIXTMII-Vektor (Stratagene) zu screenen. Die Nitrocellulosereplikafilter der Bibliothek wurden für 16 Stunden bei 42ºC in einem Puffer, welcher 8 mM Tris- HCl (pH 7,5), 40% Formamid, 4 · SSC, 5 · Denhardt's, 0,2% SDS, 50 mM Natriumphosphat und 100 ug/ml wärmedenatuierte Lachs-Sperma-DNA enthielt, vorhybridisiert. Die Hybridisierung wurde für 16 Stunden bei 42ºC in demselben Puffer durchgeführt, welcher die Sonde (2 · 10&sup6; c.p.m./ml) enthielt, welche durch ein Zufallsprimingverfahren bis zu einer spezifischen Aktivität von 10&sup9; c.p.m./ug mit ³²P markiert wurde. Abschließende Wäschen fanden bei 45ºC in 0,1 · SSC und 0,05% SDS statt.
Ein 2 kb BglII-BamHI-Restriktionsfragment, das mit der Sonde hybridisierte, wurde in beiden Orientierungen in M13mp18 subkloniert. Zusammenhängende (nested) Deletionen wurden mit der Exonuklease III erzeugt, und eine Sequenzierung wurde durch das Dideoxykettenabbruchverfahren unter Verwendung von [α-³&sup5;S]dATP (800 Ci/mmol, Amersham) und Thermophilus aquaticus (Taq)-Polymerase (Taquence kit, USB) durchgeführt. Eine Sequenzanalyse wurde unter Verwendung der CIT12-Computersoftwareeinrichtungen (Universität Paris V, Paris, Frankreich) durchgeführt.

BEISPIEL 2

DNA-Sonde und Hybridisierungsanalyse

Ein 310 bp-DNA-Fragment ("A43"), welches dem N-Terminus des β3-adrenergen Rezeptors der Maus entsprach, wurde durch eine Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung einer Matrize von 5 ng des Lambda-Klons, welcher das β3-adrenerge Rezeptorgen der Maus enthielt, hergestellt. 30 Amplifikationszyklen bei 93ºC für 1,5 Minuten, 55ºC für 2 Minuten und 72ºC für 2 Minuten wurden unter Verwendung von 2,5 U Tag-Polmerase (Cetus) in 100 ul Puffer, welcher 10 mM Tris-HCl (pH 8,4), 3 mM MgCl&sub2;, 0,05% TWEEN 20, 0,05% NP40, 10 % Dimethylsulfoxid, 5% Formamid, 125 uM jedes Deoxynukleotidtriphosphats und 125 pM jedes Primers enthielt, durchgeführt. Sinn (5'-GCTCCGTGGCCTCACGAGAA-3')- und Gegensinn (5'-CCCAACGGCCAGTGGCCAGTCAGCG-3')-Primer entsprachen den Aminosäuren 2 bis 8 bzw. 98 bis 106 der menschlichen β3-adrenergen Rezeptorsequenz. Das amplifizierte 310 bp-DNA- Fragment wurde durch Elektrophorese über ein Acrylamidgel gereinigt. Durch Zufallspriming wurde dieses bis zu einer spezifischen Aktivität von 10&sup9; c.p.m./ug mit ³²P markiert und als eine Sonde bei Southern and Northern Blot-Experimenten verwendet.
Für die Southern Blot-Hybridisierungsanalyse wurden Verdaus der genomischen DNA (10 ug) mit einzelnen Restriktionsenzymen durchgeführt, und die Proben wurden auf einem 0,8%igen Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen und auf Nylonfilter (Hybond N +, Amersham) geblottet. Vorhybridisierungs- und Hybridisierungsverfahren wurden wie oben beschrieben durchgeführt, und abschließende Wäschen fanden bei 45ºC in 0,1 · SSC, 0,05% SDS statt.
Für die Northern Blot-Analyse wurde die gesamte RNA, die aus der Maus oder aus kultivierten Zellen extrahiert wurde, in Glyoxal-DMSO denaturiert, einer Elektrophorese auf einem 1%igen Agarosegel unterzogen und auf eine Nylonmembran (Hybond N +, Amersham) überführt. Eine Vorhybridisierung und Hybridisierung wie auch die Wäsche wurden wie oben beschrieben durchgeführt, außer dass die Hybridisierung in Gegenwart von 10% Dextransulfat durchgeführt wurde.

BEISPIEL 3

In situ-Hybridisierung

Für die chromosomale Lokalisation des β3-adrenergen Rezeptorgens in der Maus wurde eine in situ-Hybridisierung mit Metaphasestadien (metaphase spreads) von Concavalin A-stimulierten Lymphozyten aus einer männlichen WMP-Maus durchgeführt, bei welcher alle Autosomen außer der Nummer 19 in Form von metazentrischen Ganz-Arm-Translokationen vorlagen. Für eine Lokalisation des β3-adrenergen Rezeptorgens des Menschen wurden Metaphasestadien aus Phytohämagglutinin-stimulierten menschlichen Lymphozyten verwendet. In beiden Fällen wurden die Lymphozyten für 72 Stunden bei 37ºC kultiviert, wobei 5-Bromdeoxyuridin (60 ug/ml) für die letzten 7 Stunden der Kultivierung zugegeben wurde.
Spezifische Sonden waren das 310 bp-A43-Fragment des β3-adrenergen Rezeptorgens der Maus und ein 206 bp (AccI-ApaLI)-DNA-Fragment, welches die dritte intrazytoplasmatische Schleife des menschlichen β3-adrenergen Rezeptors umfasste. Diese Fragmente wurden in den pUC19-Plasmidvektor subkloniert, durch Nick-Translation bis zu einer spezifischen Aktivität von 10&sup8; d.p.m./ug Tritium-markiert und bei einer Endkonzentration von 25 ng/ml der Hybridisierungslösung verwendet. Eine Hybridisierung mit Metaphasestadien, Wäschen nach der Hybridisierung, Emulsionsautoradiographie, R-Bandenbestimmung und Silberkornanalyse wurden durchgeführt, wie von Mattei et al., HUMAN GENETICS, 69, Seiten 268-271 (1985) beschrieben wird.

BEISPIEL 4

Konstruktion, Zellkultur und Transfektionen

Zur Expression in eukaryotischen Zellen wurde ein 1365 bp-NarI-BamHI-Restriktionsfragment aus dem β3-adrenergen Rezeptorgen der Maus unter der Kontrolle des SV40-Early-Promotors in einen Plasmidvektor eingefügt, welcher die untranslatierte 3'-Region des Gens für das Hepatitis-B-Oberflächenantigen und das Dihydrofolatreduktase (DHFR)-Gen der Maus als einen selektierbaren Marker enthielt, wie von Larsky et al., Biotechnology, 2, Seiten 527-530 (1984) beschrieben wird. Das resultierende Konstrukt enthielt 15 bp der untranslatierten 5'-Region, 1164 bp der codierenden Region und 186 bp der nichtcodierenden 3'-Region des β3-adrenergen Rezeptorgens der Maus.
CHO-Zellen, denen DHFR fehlte, wurden in Ham's F12-Medium (Seromed), das mit 10% fötalem Kalbsserum, 2 mM L-Gutamin, 15 ug/ml Glycin, 9,5 ug/ml Hypoxanthin und 1,46 ug/ml Thymidin ergänzt war, wachsen gelassen. Eine Transfektion mit 5 ug des Expressionsvektors wurde durch das Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren durchgeführt, wie es von Tate et al., EUR. J. Biochem., 196, Seiten 357-361 (1991), beschrieben wird. Stabile Transformanten, welche das DHFR-Gen exprimierten, wurden auf die Expression des β-adrenergen Rezeptors durch Stimulation der cAMP-Akkumulation mit 1 uM (-)-Isoproterenol hin gescreent. Ein Klon, welcher die höchste Stimulierung ergab, wurde durch Grenzverdünnung subkloniert und wird als CHO-Moβ3' bezeichnet.

BEISPIEL 5

Isolieren und Sequenzieren des menschlichen β3-AR-Gens

Ähnliche Verfahren, wie sie in den obigen Beispielen angegeben sind, um das β3-adrenerge Rezeptorgen der Maus zu isolieren und zu sequnzieren, wurden bei der Isolation des menschlichen β3-adrenergen Rezeptorgens verwendet. Eine menschliche genomische Bibliothek wurde mit den vollständigen Codierungsregionen des Gens für den β1-adrenergen Rezeptor des Truthahns, Yarden et al., P. N. A. S., 83, 6795 (1986), und des menschlichen Gens für den β2- adrenergen Rezeptor, Emorine et al., P. N. A. S., 84, 6995 (1987), gescreent. Die Bibliothek wurde in den BamHI-Stellen des EMBL4-Vektors aus nach der Größe ausgewählten (15 bis 20 kb) Fragmenten der menschlichen Plazenta-DNA, die partiell mit Sau3a verdaut wurde, konstruiert. Für die Plaque-Reinigung wurden Sonden eines 1,3 kb-NcoI-AhaI-Restriktionsfragments des menschlichen β2-adrenergen Rezeptors und das 1,8 kb-Fragment des β1-adrenergen Rezeptors des Truthahns verwendet, Yarden et al., P. N. A. S., 83, 6795 (1986).
Von 43 positiven Klonen trugen zwei das Gen, das für den menschlichen β1-adrenergen Rezeptor codiert, und weitere zwei das Gen für β2-adrenergen Rezeptor.
Eine Familie mit 14 homologen Klonen, die aus einer Gruppe mit 6 identischen Klonen, einer zweiten Gruppe mit 3 identischen Klonen und einer dritten Gruppe mit 2 identischen Klonen und 3 unabhängigen Klonen bestand, zeigte Sequenzen, die mit beiden Sonden in einem 2,1 kb-BamHI- und BglII-Fragment homolog waren. Von einem Klon wurde dieses 2,1 kb- Fragment sequenziert, indem die Verfahren verwendet wurden, die von Sanger et al., P. N. A. S., 74, 5463 (1977), als das Kettenabbruchverfahren beschrieben wurden. Dieses Fragment wurde vollständig sequenziert, und es wurde gezeigt, dass es ein Gen enthielt, das für ein Polypeptid mit 402 Aminosäuren mit einer vorhergesagten Größe von 42.881 Dalton codierte.

BEISPIEL 6

Bestimmung der Nukleotidsequenz

2,5 kb-SphI-BgLII- und 2,2 kb-XhoI-BglII-Fragmente, welche die vollständigen untranslatierten 3'-Regionen der genomischen β3-AR-Gene des Menschen bzw. der Maus abdeckten, wurden in beiden Orientierungen in M13 eingefügt, und einzelne Subklone wurden durch das Standard-Terminationsverfahren sequenziert (Taquence DNA sequencing kit, USB, Ohio). Die Primer waren Oliogonukleotide, die Schritt für Schritt während des Verlaufs der Sequenzbestimmung synthetisiert wurden.

BEISPIEL 7

PCR-erzeugte cDNA

Die gesamte RNA wurde aus eingefrorenen-pulverisierten Geweben präpariert und für 1 Stunde bei 37ºC mit 0,3 U RNase-freier DNase I (Promega, Wisconsin) pro ug Nukleinsäure in 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM MgCl&sub2;, in Gegenwart von 2 U/ml Plazenta RNase-Inhibitor verdaut. 0,25 ug RNA wurden dann mit 400 U reverser Transkriptase des Maloney-Mausleukämievirus (Gibco BRL) in 20 ul PCR-Puffer behandelt, welcher 67 mM Tris-HCl, pH 8,4, 6,7 mM MgCl&sub2;, 6,7 mM EDTA, 10 mM β-2-Mercaptoethanol, 16 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; und 0,1 mg/ml Gelatine, die 0,4 mM jedes dNTP, 10 mM zufällige Hexanukleotide und 2 U/ml RNase-Inhibitor enthielt. Eine Kontrolle ohne reverse Transkriptase wurde ebenfalls laufen gelassen, um sicherzustellen, dass die Amplifikation der Nukleotidsequenz nicht von der restlichen genomischen DNA ausging. 80 ul PCR-Puffer, die 2,5 U Thermophylus aquaticus-Polymerase (Perkin-Elmer- Cetus), 125 nM von jedem der Sinn- und Gegensinnoligonukleotidprimer, welche die folgenden Sequenzen enthielten:
125 mM jedes dNTP und 10% (v/v) Dimethylsulfoxid enthielten, wurde zu den cDNA-Proben zugegeben, welche 29 Zyklen bei Temperaturen von 92ºC, 1 Minute, 57ºC, 1,5 Minuten, 72ºC, 1,5 Minuten unterzogen wurden, worauf eine 7-minütige Verlängerung bei 72ºC in einem Thermocycler (LEP-PREM) folgte.

BEISPIEL 8

Bestimmung der mRNA-Transkriptionsstartstellen

Für eine Kartierung mit Nuklease S1 wurde einzelsträngige DNA von einem M13-Subklon der β3-AR-Genpromotorregion der Maus (Fragment BglII-NarI) als Matrize zur Synthese der Sonde verwendet. Nach einer Polymerisation in Gegenwart von α[³²P]-dATP wurde die DNA mit Alw NI verdaut, und die einzelsträngige Sonde (380 Nukleotide, einschließlich 310 Basen von dem β3-AR-Gen plus 70 Basen aus M13) wurde auf denaturierenden 6%igen Polyacrylamidgelen, die 7 M Harnstoff enthielten, isoliert. Die Sonde (10&sup5; c.p.m.) und die gesamte RNA (50 ug) wurden in 30 ul 40 mM Pipes-Puffer, pH 6,4, welcher 0,4 M NaCl, 1 mM EDTA und 70% Formamid enthielt, gemischt und für 10 Minuten bei 85º denaturiert. Nach der Hybridisierung (14 bis 16 Stunden bei 30ºC) wurden die Proben für 30 Minuten bei 37ºC mit 100 bis 200 Einheiten S1-Nuklease in 400 ul 50 mM Natriumacetat, pH 4,8, 280 mM NaCl, 4,5 mM ZnSO&sub4; verdaut. Nach einer Inkubation für 10 Minuten bei 65ºC wurden die Proben mit Phenol extrahiert, durch Ethanolfällung konzentriert und auf Sequenziergelen mit 6% Acrylamid, 7 M Harnstoff analysiert.
Für die Primer-Verlängerung wurde das Oligonukleotid A74 (36-mer) mit der folgenden Sequenz:
mit T4-Polynukleotidkinase markiert und mit 50 ug der gesamten RNA in 30 ul 20 mM Tris- HCl, pH 8, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM Dithiothreitol und 0,1 mM EDTA für 14 bis 16 Stunden bei 37ºC hybridisiert (5 · 10&sup5; c.p.m.). Nukleinsäuren wurden mit Ethanol ausgefällt und für 90 Minuten bei 42ºC nach einer erneuten Suspendierung in 25 ul 50 mM Tris-HCl, pH 8,3, 8 mM MgCl&sub2;, 30 mM KCl, welcher 0,5 mM jedes dNTP, 50 Einheiten Plazenta-RNase-Inhibitor und 40 Einheiten reverse Transkriptase des Vogelmyeloblastosevirus enthielt, inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 1 ul von sowohl 0,5 M EDTA als auch pankreatischer RNase A (1 mg/ml) beendet, und eine Inkubation für 30 Minuten bei 37ºC wurde durchgeführt. Nach einer Phenolextraktion und einer Ethanolfällung in Gegenwart von Ammoniumacetat (2 M Endkonzentration) wurden die Proben auf Sequenziergelen mit 6% Acrylamid, 7 M Harnstoff analysiert.

BEISPIEL 9

Expression des gesamten menschlichen β3-adrenergen Rezeptors

Zur Expression in eukaryotischen Zellen wurde ein 3,7 kb-SmaI-BglII-Restriktionsfragment aus dem menschlichen β3-adrenergen Rezeptorgen unter der Kontrolle des SV40-Early-Promotors in einen Plasmidvektor eingefügt, welcher ebenfalls das Dihydrofolatreduktase (DHFR)-Gen der Maus als einen selektierbaren Marker enthielt, wie von Larsky et al., Biotechnology, 2, Seiten 527-530 (1984) beschrieben wird. Das resultierende Konstrukt enthielt 4 bp der untranslatierten 5'-Region, die gesamte Intron/Exon-Sequenz des menschlichen β3-Rezeptorgens mit seiner eigenen untranslatierten 3'-Region.
CHO-Zellen oder L-Zellen (in welchen das Spleißen des Gens stattfinden kann), welchen DHFR fehlt, wurden in Ham's F12-Medium (Seromed) wachsen gelassen, das mit 10% fötalem Kalbsserum, 2 mM L-Glutamin, 15 ug/ml Glycin, 9,5 ug/ml Hypoxanthin und 1,46 ug/ml Thymidin ergänzt war. Eine Transfektion mit 5 ug des Expressionsvektors wurde durch das Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren durchgeführt, wie von Tate et al., EUR. J. Biochem., 196, Seiten 357-361 (1991), beschrieben wird. Stabile Transformanten, welche das DHFR-Gen exprimierten, wurden im Hinblick auf die Expression des β-adrenergen Rezeptors durch Stimulation der cAMP-Akkumulation mit 1 uM (-)-Isoproterenol gescreent.

BEISPIEL 10

Testen von verschiedenen Chemikalien auf eine Affinität für den β3-adrenergen Rezeptor

Präkonfluente Zellen (5 · 10&sup5;) wurden für 20 Minuten bei 37ºC in 0,5 ml Hank's-Puffer, welcher 20 mM HEPES (pH 7,4), 1 mM Ascorbinsäure, 1 mM Isobutylmethylxanthin und verschiedene Konzentrationen an Agonisten wie z. B. BRL 37344, (-)-Isoproterenol und (-)-Norepinephrin enthielt, inkubiert. Nach einem Kochen für 5 Minuten und einem Zentrifugieren bei 4.000 UpM für 10 Minuten bei 4ºC wurde die Menge an erzeugtem cAMP gemessen, indem das cAMP-Testkit von Amersham verwendet wurde. Inhibitionsstudien für eine cAMP-Akkumulation wurden durchgeführt, indem Zellen für 10 Minuten bei 37ºC mit einem Antagonisten wie z. B. Propanolol, ICI 118551 und CGP 20712A vor der Zugabe von 5 nM (-)-Isoproterenol vorinkubiert wurden. Die Mischung wurde für weitere 20 Minuten inkubiert. Eine Computeranalyse der Daten wurde unter Verwendung des Graph-PAD-Programms (Copyright 1987 von M. J. Motulsky) durchgeführt.

Claims

1. Isolierte und gereinigte Nukleinsäuresequenz, umfassend die Nukleotidsequenz von Fig. 1, die einen β3-adrenergen Rezeptor codiert.

2. Isolierte und gereinigte Nukleinsäuresequenz, umfassend die Nukleotidsequenz von Fig. 2, die einen β3-adrenergen Rezeptor codiert.

3. Isolierte und gereinigte Nukleinsäuresequenz, die die in den Fig. 1 oder 2 aufgeführten Intronsequenzen enthält.

4. Rekombinanter Vektor für Klonierung oder Expression, wobei der Vektor aus der Gruppe eines Plasmids, Cosmids und Phagens ausgewählt ist und die Nukleotidsequenz nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 umfasst.

5. Wirtszelle, die durch einen rekombinanten Vektor nach Anspruch 4 transformiert ist und die Regulationselemente umfasst, die die Expression der Nukleotidsequenz nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 erlauben.

6. Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 5, wobei die Wirtszelle eine eukaryotische Zelle ist.

7. Transformierte Wirtszelle nach Anspruch 6, wobei die eukaryotische Zelle eine CHO-Zelle oder eine L-Zelle ist.

8. Nukleotidsonde, die die Nukleotidsequenz von Fig. 1 oder 2 enthält, wobei die Nukleotidsonde in der Lage ist, mit dem einem β3-adrenergen Rezeptor codierenden Gen zu hybridisieren.

9. Nukleotidsonde nach Anspruch 8, wobei die Nukleotidsonde in der Lage ist, mit einer komplementären Sequenz zu hybridisieren unter solchen Hybridisierungsbedingungen, dass sie mit den Genen oder der mRNA von β1- oder β2-adrenergen Rezeptoren nicht hybridisiert.

10. Verfahren zur Herstellung eines β3-adrenergen Rezeptors, das die Schritte umfasst:

(a) eine Wirtszelle mit einem rekombinanten Vektor, der die Nukleinsequenzen nach Anspruch 1 oder 2 enthält, zu transformieren;

(b) die transformierte Wirtszelle in einem Kulturmedium zu züchten und

(c) das durch die Zellen produzierte Polypeptid zu gewinnen.

11. Nukleotidsonde nach den Ansprüchen 8 und 9, wobei die Sonde verwendet wird, um funktionelle Abnormalitäten in dem Gen des β3-adrenergen Rezeptors zu detektieren.

12. Nukleotidsonde nach den Ansprüchen 8 und 9, wobei die Sonde verwendet wird, um funktionelle Abnormalitäten in der Sequenz des β3-adrenergen Rezeptors zu detektieren.