JP2002533111A

JP2002533111A - ヒトメラノコルチン１受容体タンパク質のスプライス変化体をコードするｄｎａ分子

Info

Publication number: JP2002533111A
Application number: JP2000591058A
Authority: JP
Inventors: ハワード，アンドリユー・デイー; マクニール，ダグラス・ジエイ; フアン・デル・プルーフ，レオナルドス・ハー・テー
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 1999-12-16
Publication date: 2002-10-08
Also published as: WO2000039147A1; DE69930873D1; EP1140968A1; CA2357036A1; DE69930873T2; EP1140968B9; EP1140968A4; US6693184B1; EP1140968B1; ATE323106T1; ES2260948T3

Abstract

(57)【要約】本発明は、Ｇタンパク質共役受容体のロドプシンサブファミリーに属するメラノコルチン−１受容体タンパク質（ＭＣ−Ｒ１）のスプライス変化体をコードするＤＮＡ分子、ＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質をコードするＤＮＡ分子を含む組換えベクター、ＭＣ−Ｒ１Ｂをコードする組換えベクターを含む組換え宿主細胞、そのようなＤＮＡ分子によってコードされるヒトＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質、および本明細書中に開示されているＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質の選択的なアゴニストおよびアンタゴニストを同定する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（関連出願に対する相互参照）本出願は、米国特許出願第６０／１１３，４０１号（１９９８年１２月２３日
出願：これはこれにより参考として援用される）に対する優先権を主張する。

【０００２】（発明の分野）本発明は、Ｇタンパク質共役受容体のロドプシンサブファミリーに属するメラ
ノコルチン−１受容体（ＭＣ−Ｒ１）タンパク質のスプライス変化体をコードす
るＤＮＡ分子、ＭＣ−Ｒ１スプライス変化体タンパク質をコードするＤＮＡ分子
を含む組換えベクター、ＭＣ−Ｒ１スプライス変化体をコードする組換えベクタ
ーを含む組換え宿主細胞、そのようなＤＮＡ分子によってコードされるヒトＭＣ
−Ｒ１タンパク質、ならびに本明細書を通して開示されているＭＣ−Ｒ１スプラ
イス変化体タンパク質の選択的なアゴニストおよびアンタゴニストを同定する方
法に関する。

【０００３】（発明の背景）メラノコルチン受容体は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）のロドプシン
サブファミリーに属する。５種の異なるサブタイプが知られている。これらのメ
ラノコルチン受容体は、プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）遺伝子から誘導
されるα、βまたはγ−メラノサイト刺激ホルモン（α−ＭＳＨ、β−ＭＳＨま
たはγ−ＭＳＨ）などのペプチドに結合して、そのようなペプチドによって活性
化される。広範囲の生理学的機能がメラノコルチンペプチドおよびその受容体に
よって媒介されていると考えられている。

【０００４】ＣｏｎｅおよびＭｏｕｎｔｊｏｙの米国特許第５，５３２，３４７号（１９９
６年７月２日発行）には、ＭＣ−１Ｒ（これはまたα−ＭＳＨ−Ｒとして当分野
では知られている）をコードするヒトおよびマウスのＤＮＡ分子が開示されてい
る。

【０００５】ＣｏｎｅおよびＭｏｕｎｔｊｏｙの米国特許第５，８４９，８７１号（１９９
８年１２月１５日発行）には、ヒトおよびマウスのＭＣ−１Ｒが開示され、特許
請求されている。前段落に記されているように、発現したヒトタンパク質は３１
７個のアミノ酸残基を含む。

【０００６】Ｍｏｕｎｔｊｏｙ他（１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５７：１２４８〜１２５
１）には、ヒトＭＣ−１ＲおよびヒトＭＣ−２ＲのＤＮＡ分子およびその随伴タ
ンパク質が記載されている。

【０００７】Ｃｈｈａｊｌａｎｉ他（１９９２、ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ、３０９：４１
７〜４２０）にも、ヒトＭＣ１−Ｒをコードするオープンリーディングフレーム
を含むヒトＤＮＡ分子が開示されている。

【０００８】Ｃｏｎｅ他（１９９６、ＲｅｃｅｎｔＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＨｏｒｍｏ
ｎｅＲｅｓｅａｒｃｈ、５１：２８７〜３１８）は、ＭＣ−Ｒ１からＭＣ−Ｒ
５までの知られている哺乳動物メラノコルチン受容体の状態を概説している。

【０００９】Ｊａｃｋｓｏｎ（１９９７、ＨｕｍａｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉ
ｃｓ、６：１６１３〜２４）およびＫｏｐｐｕｌａ他（１９９７、Ｈｕｍａｎ
Ｍｕｔａｔｉｏｎ、９：３０〜３６）は、ヒトＭＣ−Ｒ１のＡ型のコード配列に
おける多型の存在および潜在的な重要性を概説している。

【００１０】化合物のインビボでのデータを化合物のインビトロでの生化学的活性と相関さ
せることは望ましい。

【００１１】１つまたは２つ以上のヒトメラノコルチン受容体タンパク質をインビトロで活
性化する化合物を選択することもまた望ましい。

【００１２】メラノコルチン受容体の活性を調節することによって病態生理学的プロセスを
もたらす新しい薬物を発見し、その後、ヒトの臨床試験を行うことはさらに望ま
しい。

【００１３】本発明は、ヒトＭＣ−Ｒ１のスプライス変化体を発現する単離された核酸分子
、このような核酸分子を収容する組換えベクター、ヒトＭＣ−Ｒ１のこのような
別の形態および／または生物学的活性等価体を発現する組換え宿主細胞、ならび
にこれらのヒトＭＣ−Ｒ１タンパク質の薬理学的性質を開示することによってこ
のような要求を検討して達成する。

【００１４】（発明の要旨）本発明は、本明細書中においてＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質として示されるヒトメ
ラノコルチン−１受容体タンパク質の新規な変化体をコードする単離された核酸
分子（ポリヌクレオチド）に関する。本発明の核酸分子は実質的に他の核酸を含
まない。このような単離された核酸分子は、本明細書中ではＭＣ−Ｒ１Ａとして
も示されている以前に開示されたヒトＭＣ−Ｒ１と比較した場合、さらに６５個
のアミノ酸残基を有する細胞内ドメインを含むＭＣ−Ｒ１タンパク質をコードす
る。従って、本発明は、新規なヒトＭＣ−Ｒ１タンパク質を発現するｍＲＮＡを
コードする単離された核酸分子（ポリヌクレオチド）に関する。このようなＤＮ
Ａ分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配
列番号１１、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２および
配列番号２５として本明細書中に開示されているヌクレオチド配列を含むＤＮＡ
分子を含むが、これらに決して限定されない。

【００１５】本発明はまた、ヒトＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質の新規な変化体をコードするオー
プンリーディングフレーム内に少なくとも１つのイントロンを含むヒトのゲノム
クローンを表す単離された核酸分子に関する。従って、本発明は、新規なヒトＭ
Ｃ−Ｒ１タンパク質変化体をコードするｍＲＮＡ分子を生成するためにスプライ
シングされるＲＮＡ分子をコードする単離された核酸分子（ポリヌクレオチド）
に関する。このようなＤＮＡ分子は、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２
１および配列番号２４として本明細書中に開示されているヌクレオチド配列を含
むＤＮＡ分子を含むが、これらに決して限定されない。この目的に対して、本発
明はまた、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２１および配列番号２４とし
て示されているＤＮＡ分子のそれぞれから生じるそれぞれのｍＲＮＡ分子にも関
する。

【００１６】本発明の単離された核酸分子は、既知のＭＣ−Ｒ１に対して、６５アミノ酸の
ＣＯＯＨ末端伸長部をコードする３’伸長部をオープンリーディングフレームに
含む。従って、本発明は、この６５アミノ酸のＣＯＯＨ末端伸長部をコードする
既知ＭＣ−Ｒ１のスプライス変化体をコードする単離された核酸分子（ＤＮＡお
よびＲＮＡの両方）に関する。ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡおよびｍＲＮＡ
を含む本発明の核酸分子の全体が、本明細書中では「ＭＣ−Ｒ１スプライス変化
体」として示されている。これにより、６５アミノ酸のＣＯＯＨ末端伸長部をコ
ードするこのさらなる３’エキソンと一緒にメラノコルチン１受容体活性を有す
るタンパク質をコードする開示された核酸分子が識別される。このような単離さ
れた核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号
９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８
、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４および配列番号２
５を含むが、これらに決して限定されない。

【００１７】本発明はまた、新規なヒトＭＣ−Ｒ１を発現するｍＲＮＡをコードするＭＣ−
Ｒ１スプライス変化体の生物学的に活性なフラグメントまたは変異体に関する。
本明細書中に開示されているＭＣ−Ｒ１スプライス変化体のそのような生物学的
に活性なフラグメントおよび／または変異体はいずれも、野生型ＭＣ−Ｒ１タン
パク質の薬理学的性質を少なくとも実質的に模倣し、かつ配列番号２７として開
示されているＣＯＯＨ末端のアミノ酸伸長部の少なくとも一部を含むタンパク質
またはタンパク質フラグメントのいずれかをコードする。任意のそのようなポリ
ヌクレオチドは、ヌクレオチドの置換、欠失、付加、アミノ末端短縮およびカル
ボキシ末端短縮（必ずしもこれらに限定されない）を含み、その結果、このよう
な変異体は、診断、治療または予防に使用されるタンパク質またはタンパク質フ
ラグメントを発現するｍＲＮＡをコードし、ＭＣ−Ｒ１Ｂ機能のアゴニストおよ
び／またはアンタゴニストに関するスクリーニングに有用である。

【００１８】本発明のこの部分の好ましい態様は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、
配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番
号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号
２４および配列番号２５、本発明のＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質の完全なオープンリ
ーディングフレームを含む核酸分子として示される。

【００１９】本発明の単離された核酸分子は、ゲノムＤＮＡおよび相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ
）などの一本鎖（コード鎖または非コード鎖）または二本鎖であり得るデオキシ
リボ核酸分子（ＤＮＡ）、ならびに合成された一本鎖ポリヌクレオチドなどの合
成ＤＮＡを含むことができる。本発明の単離された核酸分子はまた、リボ核酸分
子（ＲＮＡ）を含むことができる。

【００２０】本発明はまた、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号
９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８
、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４および配列番号２
５に示されている単離された核酸分子（これに限定されない）を含む本明細書中
に開示されている実質的に精製された核酸分子を含む組換えベクターおよび組換
え宿主（原核生物および真核生物の両方）に関する。

【００２１】本発明はまた、本発明の核酸によってコードされるタンパク質を含む組換え宿
主細胞（原核生物細胞および真核生物細胞の両方ならびに安定的な形質転換細胞
および一過性の形質転換細胞の両方）の細胞膜画分に関する。このような細胞膜
画分は、ＣＯＯＨ末端伸長部を含む野生型または変異型のいずれかのヒトメラノ
コルチン−１受容体タンパク質を、内在性レベルを実質的に上回るレベルで含み
、従って、本明細書中に記載されている様々なアッセイにおいて有用である。

【００２２】本発明はまた、図５Ａ〜５Ｆ２に開示され、かつ配列番号２、配列番号４、配
列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号
１７、配列番号２０、配列番号２３および配列番号２６に示されているアミノ酸
配列を含むヒトメラノコルチン−１受容体タンパク質のＣＯＯＨ末端変化体の実
質的に精製された形態に関する。これらのＭＣ−Ｒ１タンパク質は、既知のヒト
ＭＣ−Ｒ１と比較した場合、ＣＯＯＨ末端に６５アミノ酸の伸長部を含み、本明
細書中を通してＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質またはＭＣ−Ｒ１スプライス変化体タン
パク質として示されている。

【００２３】本発明はまた、本明細書中に開示されているヒトＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質の生
物学的に活性なフラグメントおよび／または変異体に関する。これらは、アミノ
酸の置換、欠失、付加、アミノ末端短縮およびカルボキシ末端短縮（必ずしもこ
れらに限定されない）を含み、その結果、これらの変異体は、診断、治療または
予防に使用されるタンパク質またはタンパク質フラグメントをもたらし、ＭＣ−
Ｒ１Ｂ機能のアゴニストおよび／またはアンタゴニストに関するスクリーニング
に有用である。

【００２４】本発明はまた、野生型の脊椎動物ＭＣ−Ｒ１Ｂの活性を調節する化合物を同定
するアッセイにおいて有用な融合タンパク質を発現する融合構築物である単離さ
れた核酸分子に関する。本発明のこの部分の好ましい態様には、グルタチオンＳ
−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＭＣ−Ｒ１Ｂ融合構築物が含まれるが、これ
に限定されない。この融合構築物は、当業者に知られている方法によって、ＧＳ
Ｔ遺伝子のカルボキシ末端におけるインフレーム融合物としてのヒトＭＣ−Ｒ１
Ｂの細胞内ドメイン、またはＧＳＴのアミノ末端に融合されたＭＣ−Ｒ１Ｂの細
胞外および膜貫通リガンド結合ドメイン、または免疫グロブリン遺伝子に融合さ
れたＭＣ−Ｒ１Ｂの細胞外および膜貫通ドメインのいずれかを含むが、これらに
限定されない。可溶性の組換えＧＳＴ−ＭＣ−Ｒ１Ｂ融合タンパク質を、バキュ
ロウイルス発現ベクター（ｐＡｃＧ２Ｔ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用するＳ
ｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ２１）昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ）を含む様々な発現システムで発現させることができる。

【００２５】従って、本発明は、本明細書中に開示されているヒトＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質
および生物学的等価体の発現方法、このような遺伝子産物を用いるアッセイ、こ
のような受容体タンパク質を発現するＤＮＡ構築物を含む組換え宿主細胞、なら
びにこのようなアッセイにより同定された化合物であって、ＭＣ−Ｒ１Ｂ活性の
アゴニストまたはアンタゴニストとして作用する化合物に関する。

【００２６】本発明はまた、ヒト型のＭＣ−Ｒ１Ｂまたはその生物学的活性フラグメントの
いずれかに応答して惹起されたポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体に
関する。

【００２７】図５Ａ〜５Ｆに示され、そして配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番
号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２
０、配列番号２３および配列番号２６に示されるヒトＭＣ−Ｒ１Ｂの新規形態、
あるいはヒトＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質のヒトＭＣ−Ｒ１Ｂフラグメント、変異体
または誘導体をコードする単離された核酸分子を提供することは本発明の目的で
ある。任意のそのようなポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの置換、欠失、付加
、アミノ末端短縮およびカルボキシ末端短縮（必ずしもこれらに限定されない）
を含み、その結果、このような変異体は、診断、治療または予防に使用されるタ
ンパク質またはタンパク質フラグメントを発現するｍＲＮＡをコードし、脊椎動
物のＭＣ−Ｒ１Ｂ機能のアゴニストおよび／またはアンタゴニストに関するスク
リーニングに有用である。

【００２８】本発明のさらなる目的は、上記段落で示された核酸分子によってコードされる
ヒトＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質またはタンパク質フラグメントを提供することであ
る。

【００２９】本発明のさらなる目的は、これらのヒトＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質またはその生
物学的等価体をコードする核酸配列を含む組換えベクターおよび組換え宿主細胞
を提供することである。

【００３０】本発明の目的は、図５Ａ〜５Ｆに示され、そして配列番号２、配列番号４、配
列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号
１７、配列番号２０、配列番号２３および配列番号２６に示されるタンパク質（
これに限定されない）を含むヒトＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質のいずれかの実質的に
精製された形態を提供することである。

【００３１】本発明の目的は、本明細書中に開示されているヒトＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質の
生物学的に活性なフラグメントおよび／または変異体を提供することである。こ
れらは、アミノ酸の置換、欠失、付加、アミノ末端短縮およびカルボキシ末端短
縮（必ずしもこれらに限定されない）を含み、その結果、これらの変異体は、診
断、治療または予防に使用されるタンパク質またはタンパク質フラグメントを提
供する。

【００３２】本発明の受容体タンパク質の調節因子を選択するために、ＭＣ−Ｒ１Ｂに基づ
くアッセイを提供することもまた本発明の目的である。このようなアッセイは、
好ましくは、ＭＣ−Ｒ１ＢをコードするＤＮＡ分子が宿主細胞にトランスフェク
ションまたは形質転換され、そしてこの組換え宿主細胞が、本明細書中に記載さ
れている様々なアッセイで使用する前にＭＣ−Ｒ１Ｂを発現させるために十分な
時間にわたって生育させられる、細胞に基づくアッセイである。

【００３３】あるいは、ＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質をコードするＤＮＡベクターでトランスフ
ェクションされたそのような細胞から得られる実質的に精製された膜画分を利用
するアッセイである。その結果、既知のＭＣ−Ｒ１Ｂリガンドに関連している試
験化合物の結合を調べることができる。この目的のために、ＭＣ−Ｒ１Ｂ活性の
調節因子を選択するアッセイにおいて使用される、ＭＣ−Ｒ１ＢをコードするＤ
ＮＡ分子でトランスフェクションまたは形質転換された宿主細胞から得られる膜
調製物を提供することはさらなる目的である。

【００３４】ＭＣ−Ｒ１Ｂに基づくインフレーム融合構築物、このような融合構築物の発現
方法、本明細書中に開示されている生物学的等価体、関連するアッセイ、このよ
うな構築物を発現する組換え細胞、ならびに脊椎動物ＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質を
コードする核酸および発現タンパク質を使用することによって同定されたアゴニ
スト化合物および／またはアンタゴニスト化合物を提供することもまた本発明の
目的である。

【００３５】本明細書中で使用されている「ＭＣ−Ｒ１スプライス変化体」および／または
「ＭＣ−Ｒ１Ｂスプライス変化体」は、配列番号２７において識別される６５ア
ミノ酸のＣＯＯＨ末端伸長部をコードする３’エキソンセグメントを含む核酸分
子であって、メラノコルチン−１受容体活性を有するタンパク質をコードする核
酸分子をいう。そのような核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、
配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番
号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号
２４および配列番号２５を含むが、これらに限定されない。

【００３６】本明細書中で使用されている「ＭＣ−Ｒ１Ｂ」および／または「ＭＣ−Ｒ１ス
プライス変化体タンパク質」は、本明細書中に開示されているＭＣ−Ｒ１スプラ
イス変化体の核酸分子から翻訳されるタンパク質をいう。このようなヒトＭＣ−
Ｒ１Ｂタンパク質は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列
番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番
号２３および配列番号２６を含むが、これらに限定されない。

【００３７】本明細書中で使用されている「ＧＰＣＲ」は、「Ｇタンパク質共役受容体」を
示す。

【００３８】用語「単離された」および「精製された」は、核酸、タンパク質、膜画分で、
他の同様な成分を実質的に含まないものを示すために交換可能に使用される。

【００３９】本明細書中で使用されている場合は常に、用語「哺乳動物宿主」は、ヒトを含
む任意の哺乳動物を示す。

【００４０】（図面の簡単な説明）図１は、ヒトＭＣ−Ｒ１配列の概略図を示す。ＭＣ−Ｒ１ＭＯ（ＧｅｎＢａｋ
アクセション番号Ｘ６５６３４）およびＭＣ−Ｒ１ＣＨ（ＧｅｎＢａｋアクセシ
ョン番号Ｘ６７５９４）もまた、ここでＭＣ−Ｒ１Ａ遺伝子として示される。ｍ
ｃ１−８（１個のイントロンを含む）のヌクレオチド配列は配列番号２１に開示
されている。示されたＥＳＴは実施例１に記載される。

【００４１】図２は、ヒトＭＣ−Ｒ１遺伝子の選択的スプラシングを示す。ＭＣ−Ｒ１Ａの
ｃＤＮＡは当分野で知られている通りである。ＭＣ−Ｒ１遺伝子のイントロン接
合部は、例えば、配列番号２１（ｍｃ１−８）に示されている通りである。ＭＣ
−Ｒ１ＢのｃＤＮＡは、アミノ酸３１８のＳｅｒ残基から始まる６５アミノ酸の
伸長部をコードするさらなるエキソンを遺伝子の３’末端に示す。ＭＣ−Ｒ１Ａ
はＴｒｐ−３１７残基を含むが、ＭＣ−Ｒ１ＢはＣｙｓ−３１７残基を含む。Ｍ
Ｃ−Ｒ１ＡおよびＭＣ−Ｒ１Ｂの暗四角は、膜貫通ドメインをコードするｃＤＮ
Ａ部分を表し、ＭＣ−Ｒ１遺伝子の暗四角は、ＭＣＲ１Ｂタンパク質をコードす
る２つのエキソンを表す。

【００４２】図３は、ゲノムクローンｍｃ１−８のＤＮＡ配列を示す（配列番号２１）。大
文字はエキソン領域を表し、小文字のヌクレオチドはＭＣ−Ｒ１遺伝子の１個の
イントロンを表す。

【００４３】図４Ａ〜図４Ｂは、ｍｃ１−８ゲノムクローンのＤＮＡ配列および推定アミノ
酸配列を、Ａ型（配列番号４５および配列番号４６）およびＢ型（配列番号２１
および配列番号２３）として示す。これらは、スプライシングされた形態である
ＭＣＲ１−ＡおよびＭＣ−Ｒ１Ｂを例示する。

【００４４】図５Ａ〜図５Ｆは、ヒトの様々なＭＣ−Ｒ１ＡクローンおよびＭＣＲ１Ｂクロ
ーンのアミノ酸配列のクラスター配列比較を示す。

【００４５】（発明の詳細な説明）本発明は、ＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質として示されるヒトのメラノコルチン−１
受容体変化体タンパク質をコードする単離された核酸分子（ポリヌクレオチド）
に関する。本発明の核酸分子は、他の核酸を実質的に含まない。大部分のクロー
ニング目的のためには、ＤＮＡが好ましい核酸である。

【００４６】本発明は、ＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質として示される、ＭＣ−Ｒ１の新規なスプ
ライス変化体を発現するｍＲＮＡをコードする単離された核酸分子（ポリヌクレ
オチド）に関する。これらのＤＮＡ分子は、下記に開示されるヌクレオチド配列
を含む。

【００４７】

【化１】

【００４８】上記に例示されている単離されたＤＮＡ分子は、さらなる６５アミノ酸（残基
３１８〜３８２；配列番号２７）ならびにＭＣ−Ｒ１Ａタンパク質のＴｒｐ−３
１７残基の代わりにＣｙｓ−３１７残基の置換をコードするオープンリーディン
グフレームを含むクローンであるヒトＭＣ−Ｒ１Ｂの多型体をコードする。より
詳細には、配列番号１、３、５、７、９、１１および１３は、ヌクレオチド１〜
ヌクレオチド１１４６のオープンリーディングフレームを有し、ヌクレオチド１
１４７〜１１４９の「ＴＡＧ」終結コドンを有する１１４９ヌクレオチドを含む
ｃＤＮＡを表す。これらのオープンリーディングフレームは、図５Ａ〜図５Ｆに
示され、そして配列番号２、４、６、８、１０、１２および１４にそれぞれ示さ
れているように、長さが３８２アミノ酸のヒトＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質をコード
する。

【００４９】本発明はまた、ＭＣ−Ｒ１Ｂのゲノムクローン、これらのクローンの予想され
るオープンリーディングフレーム、およびそれぞれのゲノムクローンのそれぞれ
のｍＲＮＡ分子から翻訳されるＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質に関する。本明細書は、
ｍｃ１−３（配列番号１５）、ｍｃ１−６（配列番号１８）、ｍｃ１−６（配列
番号２１）、ｍｃ１−９（配列番号２４）に開示されているＭＣ−Ｒ１多型変化
体を例示しているが、必ずしもこれらに限定されない。これらのＤＮＡ分子は、
ヌクレオチド９５１〜１３３１のイントロンを有する１５３０ヌクレオチドを含
むヒトＭＣ−Ｒ１Ｂゲノムクローンを表す（実施例１を参照のこと）。これらの
各ゲノムクローンのそれぞれのオープンリーディングフレームは、配列番号１６
（ｍｃ１−３）、配列番号１９（ｍｃ１−６）、配列番号２２（ｍｃ１−６）お
よび配列番号２５（ｍｃ１−９）に開示されている。これらのオープンリーディ
ングフレームはそれぞれ、配列番号１７（ｐｒｏ−ｍｃ１−３）、配列番号２０
（ｐｒｏ−ｍｃ１−６）、配列番号２３（ｐｒｏ−ｍｃ１−６）および配列番号
２５（ｐｒｏ−ｍｃ１−９）に開示されているような３８２アミノ酸を含む推定
的なタンパク質をコードする。

【００５０】本発明はまた、新規なヒトＭＣ−Ｒ１Ｂを発現するｍＲＮＡをコードするＭＣ
−Ｒ１スプライス変化体の生物学的に活性なフラグメントまたは変異体に関する
。本明細書中に開示されているＭＣ−Ｒ１スプライス変化体のそのような生物学
的に活性なフラグメントおよび／または変異体はいずれも、野生型ＭＣ−Ｒ１の
薬理学的性質を少なくとも実質的に模倣し、かつ配列番号２７として開示されて
いるＣＯＯＨ末端アミノ酸伸長部の少なくとも一部をコードするタンパク質また
はタンパク質フラグメントのいずれかをコードする。そのようなポリヌクレオチ
ドはいずれも、ヌクレオチドの置換、欠失、付加、アミノ末端短縮およびカルボ
キシ末端短縮（必ずしもこれらに限定されない）を含み、その結果、そのような
変異体は、診断、治療または予防に使用されるタンパク質またはタンパク質フラ
グメントを発現するｍＲＮＡをコードし、ＭＣ−Ｒ１Ｂ機能のアゴニストおよび
／またはアンタゴニストに関するスクリーニングに有用である。

【００５１】本発明のこの部分の好ましい態様は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、
配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番
号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号
２４および配列番号２５、本発明のＭＣ−Ｒ１タンパク質の完全なオープンリー
ディングフレームを含むヒト核酸分子として示される。

【００５２】本発明の単離された核酸分子は、ゲノムＤＮＡおよび相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ
）などの一本鎖（コード鎖または非コード鎖）または二本鎖であり得るデオキシ
リボ核酸分子（ＤＮＡ）、ならびに合成された一本鎖ポリヌクレオチドなどの合
成ＤＮＡを含むことができる。本発明の単離された核酸分子はまた、リボ核酸分
子（ＲＮＡ）、特に、ｍｃ１−３（配列番号１５）、ｍｃ１−６（配列番号１８
）、ｍｃ１−６（配列番号２１）、ｍｃ１−９（配列番号２４）、ならびにそれ
らのそれぞれのオープンリーディングフレームである配列番号１６（ｍｃ１−３
）、配列番号１９（ｍｃ１−６）、配列番号２２（ｍｃ１−６）および配列番号
２５（ｍｃ１−９）に開示されているようなヒトＭＣ−Ｒ１スプライス変化体ゲ
ノムクローンから生じるｍＲＮＡを含むことができる。

【００５３】特定のアミノ酸をコードする様々なコドンにおいて相当量の重複性が存在する
ことが知られている。従って、本発明はまた、下記に示されているように、同一
アミノ酸の最終的な翻訳物をコードする別のコドンを含むＲＮＡをコードするそ
のようなＤＮＡ配列に関する。Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵＣ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドンＵＧＣ、ＵＧＵＤ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドンＧＡＣ、ＧＡＵＥ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：コドンＧＡＡ、ＧＡＧＦ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドンＵＵＣ、ＵＵＵＧ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドンＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＵＨ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドンＣＡＣ、ＣＡＵＩ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドンＡＵＡ、ＡＵＣ、ＡＵＵＫ＝Ｌｙｓ＝リシン：コドンＡＡＡ、ＡＡＧＬ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドンＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵ
ＵＭ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドンＡＵＧＮ＝Ａｓｐ＝アスパラギン：コドンＡＡＣ、ＡＡＵＰ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドンＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＵＱ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドンＣＡＡ、ＣＡＧＲ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドンＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、Ｃ
ＧＵＳ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドンＡＧＣ、ＡＧＵ、ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ、ＵＣＵ
Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン：コドンＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＵＶ＝Ｖａｌ＝バリン：コドンＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、ＧＵＵＷ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドンＵＧＧＹ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドンＵＡＣ、ＵＡＵ。

【００５４】従って、本発明は、同一のタンパク質を発現する異なるＤＮＡ分子をもたらし
得るコドン重複性を開示する。本明細書の目的のために、１つまたは複数のコド
ンが置換された配列は、縮重変化体として定義される。発現タンパク質の最終的
な物理的性質を実質的に変化させないＤＮＡ配列または翻訳タンパク質のいずれ
かにおける変異体もまた本発明の範囲に含まれる。例えば、ロイシンのバリンへ
の置換、リジンのアルギニンへの置換、またはグルタミンのアスパラギンへの置
換は、ポリペプチドの機能性における変化を生じさせ得ない。

【００５５】ペプチドをコードするＤＮＡ配列を変化させて、天然のペプチドの性質とは異
なる性質を有するペプチドをコードするようにできることが知られている。ＤＮ
Ａ配列を変化させる方法には、部位特異的変異誘発が含まれるが、これに限定さ
れない。変化させられる性質の例には、基質の酵素親和性またはリガンドの受容
体親和性の変化が含まれるが、これらに限定されない。

【００５６】実施例に概略されている手法（これに限定されない）を含む様々な手法のいず
れかを使用して、ヒトＭＣ−Ｒ１スプライス変化体をクローニングすることがで
きる。このような方法を下記に示すが、それらに限定されない：（１）ＲＡＣＥＰＣＲクローニング技術（Ｆｒｏｈｍａｎ他、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：８９９８〜９００２）。５’ＲＡＣＥおよ
び／または３’ＲＡＣＥを、全長のｃＤＮＡ配列を作製するために行うことがで
きる。この方法には、ヒトＭＣ−Ｒ１ＢのｃＤＮＡをＰＣＲ増幅するために、遺
伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用することが含まれる。この
ような遺伝子特異的プライマーは、多数の公開された核酸データーベースおよび
タンパク質データベースのいずれかを検索することにより同定された発現配列標
識（ＥＳＴ）ヌクレオチド配列を同定することによって設計される；（２）ヒト
ＭＣ−Ｒ１Ｂを含有するｃＤＮＡライブラリーを適切な発現ベクターシステムに
おいて構築した後でのヒトＭＣ−Ｒ１ＢのｃＤＮＡの直接的な機能的発現；（３
）バクテリオファージまたはプラスミドのシャトルベクターにおいて構築された
ヒトＭＣ−Ｒ１Ｂ含有ｃＤＮＡライブラリーの、ヒトＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質の
アミノ酸配列から設計された標識縮重オリゴヌクレオチドプローブによるスクリ
ーニング；（４）バクテリオファージまたはプラスミドのシャトルベクターにお
いて構築されたヒトＭＣ−Ｒ１Ｂ含有ｃＤＮＡライブラリーの、ヒトＭＣ−Ｒ１
Ｂタンパク質をコードする部分ｃＤＮＡによるスクリーニング。この部分ｃＤＮ
Ａは、ヒトＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質に関連する他のキナーゼに関して知られてい
るアミノ酸配列から縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計することによりヒ
トＭＣ−Ｒ１ＢのＤＮＡフラグメントの特異的なＰＣＲ増幅によって得られる；
（５）バクテリオファージまたはプラスミドのシャトルベクターにおいて構築さ
れたヒトＭＣ−Ｒ１Ｂ含有ｃＤＮＡライブラリーの、哺乳動物ＭＣ−Ｒ１Ｂタン
パク質に相同的な部分ｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドによるスクリーニング
。この方法はまた、上記に記載されているようにＥＳＴとして同定されたヒトＭ
Ｃ−Ｒ１ＢのｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を行うために遺伝子に特異的なオリゴヌクレ
オチドプライマーを使用することを含むことができる；あるいは（６）ヒトＭＣ
−Ｒ１Ｂをコードする全長型のヌクレオチド配列を単離するために、全長のｃＤ
ＮＡを知られているＲＡＣＥ技術によって作製することができるように、あるい
は、コード領域の一部を、プローブとして使用するためのコード領域の一部を作
製して単離するこれらの同じ知られているＲＡＣＥ技術によって作製して、多数
のタイプのｃＤＮＡライブラリーおよび／またはゲノムライブラリーのいずれか
をスクリーニングすることができるように、テンプレートとして配列番号１を使
用して５’および３’の遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを設計すること。

【００５７】他のタイプのライブラリー、ならびに他の細胞タイプまたは種タイプから構築
されたライブラリーが、ＭＣ−Ｒ１ＢをコードするＤＮＡまたはＭＣ−Ｒ１Ｂホ
モログを単離するために有用であることが当業者には容易に明らかである。他の
タイプのライブラリーには、ヒトの他の細胞から得られるｃＤＮＡライブラリー
が含まれるが、これに限定されない。

【００５８】好適なｃＤＮＡライブラリーは、ＭＣ−Ｒ１Ｂ活性を有する細胞または細胞株
から調製できることもまた当業者には容易に明らかである。ヒトＭＣ−Ｒ１Ｂを
コードするｃＤＮＡを単離するためのｃＤＮＡライブラリーを調製する際に使用
される細胞または細胞株の選択は、そのような目的のために利用できる任意の知
られているアッセイを使用して、細胞に結合したＭＣ−Ｒ１Ｂの活性を最初に測
定することによって行うことができる。

【００５９】ｃＤＮＡライブラリーの調製は、当分野でよく知られている標準的な技術によ
って行うことができる。よく知られているｃＤＮＡライブラリー構築技術は、例
えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：
ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ；ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋに見出され得る。相補的ＤＮＡライブラリーはまた、Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（これら
に限定されない）を含む多数の市販元から得ることができる。

【００６０】ＭＣ−Ｒ１ＢをコードするＤＮＡはまた、好適なゲノムＤＮＡライブラリーか
ら単離できることもまた当業者には容易に明らかである。ゲノムＤＮＡライブラ
リーの構築は、当分野でよく知られている標準的な技術によって行うことができ
る。よく知られているゲノムＤＮＡライブラリー構築技術はＳａｍｂｒｏｏｋ他
（上記）に見出され得る。

【００６１】ヒトＭＣ−Ｒ１Ｂ遺伝子を好ましい方法のいずれかで単離するために、ヒトＭ
Ｃ−Ｒ１Ｂまたは相同的なタンパク質のアミノ酸配列またはＤＮＡ配列が必要と
なる場合がある。これを達成するために、ＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質または相同的
なタンパク質を精製して、部分アミノ酸配列を自動化された配列決定装置によっ
て決定することができる。全アミノ酸配列を決定することは必要ないが、６アミ
ノ酸〜８アミノ酸の２つの領域の一次配列を、部分的なヒトＭＣ−Ｒ１ＢのＤＮ
ＡフラグメントをＰＣＲ増幅するために決定することができる。好適なアミノ酸
配列が一旦同定されると、それらをコードし得るＤＮＡ配列が合成される。遺伝
子コードは縮重しているために、２つ以上のコドンを、特定のアミノ酸をコード
するために使用することができる。従って、アミノ酸配列は、類似するＤＮＡオ
リゴヌクレオチドの集団のいずれかによってコードされ得る。この集団の１つの
成分だけがヒトＭＣ−Ｒ１Ｂの配列と同一であるが、集団の他の成分は、ミスマ
ッチを伴うＤＮＡオリゴヌクレオチドが存在する場合でも、ヒトＭＣ−Ｒ１Ｂの
ＤＮＡにハイブリダイゼーションすることができる。ミスマッチしたＤＮＡオリ
ゴヌクレオチドは、ヒトＭＣ−Ｒ１ＢのＤＮＡに対して依然として十分にハイブ
リダイゼーションすることができ、ヒトＭＣ−Ｒ１ＢをコードするＤＮＡの同定
および単離を可能にする。あるいは、発現配列の一部領域のヌクレオチド配列を
、１つまたは複数の利用可能なゲノムデータベースを検索することによって同定
することができる。遺伝子に特異的なプライマーを使用して、任意のｃＤＮＡラ
イブラリーまたはｃＤＮＡ集団から目的とするｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を行うこと
ができる。ＰＣＲに基づく反応において使用される適切なヌクレオチド配列は、
ヒトＭＣ−Ｒ１Ｂをコードする全長配列を作製するための重複している５’ＲＡ
ＣＥ産物および３’ＲＡＣＥ産物を単離する目的で、あるいは、１つまたは複数
のｃＤＮＡ型ライブラリーまたはゲノム型ライブラリーをスクリーニングするプ
ローブとして使用されるヒトＭＣ−Ｒ１Ｂをコードするヌクレオチド配列の一部
を単離して、ヒトＭＣ−Ｒ１ＢまたはヒトＭＣ−Ｒ１Ｂ様タンパク質をコードす
る全長配列を単離するために、本明細書中に記載されている同定されたＭＣ−Ｒ
１Ｂスプライス変化体のいずれかから得ることができる。

【００６２】本発明には、ストリンジェント条件下で、様々な記載されたＭＣ−Ｒ１Ｂスプ
ライス変化体（すなわち、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、
配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列
番号１８、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４および配
列番号２５）のヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションするＤＮＡ配列が含
まれる。例として、しかし限定としてではなく、高ストリンジェントな条件を使
用する手法を下記に示す：ＤＮＡを含むフィルターのプレハイブリダイゼーショ
ンが、６ＸＳＳＣ、５Ｘデンハルト溶液および１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子Ｄ
ＮＡから構成される緩衝液中において６５℃で２時間〜一晩行われる。フィルタ
ーは、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび５〜２０Ｘ１０^６ｃｐｍの^３ ^２Ｐ標識プローブを含有するプレハイブリダイゼーション混合物中において６５
℃で１２時間〜４８時間ハイブリダイゼーションされる。フィルターの洗浄が、
２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含有する溶液において３７℃で１時間行われる。
この後、０．１ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける洗浄が５０℃で４５分間行わ
れ、その後、オートラジオグラフィーが行われる。高ストリンジェントな条件を
使用する他の手法には、５ＸＳＳＣ、５Ｘデンハルト溶液、５０％ホルムアミド
において４２℃で１２時間〜４８時間行われるハイブリダイゼーション工程、あ
るいは０．２ＸＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳにおいて６５℃で３０分間〜６０分間
行われる洗浄工程のいずれかが含まれる。

【００６３】高ストリンジェントなハイブリダイゼーションを行うために前記の手法で言及
された試薬は当分野ではよく知られている。これらの試薬の詳しい組成は、例え
ば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ；ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋに見出され得る。前記に加えて、使用され得る高ストリンジェントな他
の条件が当分野ではよく知られている。

【００６４】本発明はまた、図５Ａ〜図５Ｆに開示され、そして配列番号２、配列番号４、
配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番
号１７、配列番号２０、配列番号２３および配列番号２６に示されているアミノ
酸配列を含むヒトＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質の実質的に精製された形態に関する。
これらのＭＣ−Ｒ１タンパク質は、既知のヒトＭＣ−Ｒ１と比較した場合、６５
アミノ酸の伸長部をＣＯＯＨ末端に含み、本明細書中を通してＭＣ−Ｒ１Ｂタン
パク質として示される。例示されるアミノ酸配列を下記に示す。

【００６５】

【化２】式中、Ｍ＝Ｍｅｔ（メチオニン）、Ｆ＝Ｐｈｅ（フェニルアラニン）、Ｌ＝Ｌｅ
ｕ（ロイシン）、Ｉ＝Ｉｌｅ（イソロイシン）、Ｖ＝Ｖａｌ（バリン）、Ｓ＝Ｓ
ｅｒ（セリン）、Ｐ＝Ｐｒｏ（プロリン）、Ｔ＝Ｔｈｒ（トレオニン）、Ａ＝Ａ
ｌａ（アラニン）、Ｙ＝Ｔｙｒ（チロシン）、Ｈ＝Ｈｉｓ（ヒスチジン）、Ｑ＝
Ｇｌｎ（グルタミン）、Ｎ＝Ａｓｎ（アスパラギン）、Ｋ＝Ｌｙｓ（リシン）、
Ｄ＝Ａｓｐ（アスパラギン酸）、Ｅ＝Ｇｌｕ（グルタミン酸）、Ｃ＝Ｃｙｓ（シ
ステイン）、Ｗ＝Ｔｒｐ（トリプトファン）、Ｒ＝Ａｒｇ（アルギニン）および
Ｇ＝Ｇｌｙ（グリシン）。

【００６６】これらのＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質は、既知のヒトＭＣ−Ｒ１と比較した場合、
６５アミノ酸の伸長部をＣＯＯＨ末端に含み、本明細書中を通してＭＣ−Ｒ１Ｂ
タンパク質として示される。より詳細には、ＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質のアミノ酸
残基３１７はＣｙｓであるが、既知のＭＣ−Ｒ１Ａタンパク質のＣＯＯＨ末端ア
ミノ酸残基３１７はＴｒｐである。本明細書中に開示されているＭＣ−Ｒ１Ｂタ
ンパク質のアミノ酸残基３１８から３８２位のＣＯＯＨ末端アミノ酸までのアミ
ノ酸配列は、配列番号２７に示されている通りであり、下記に示す：

【００６７】

【化３】

【００６８】本発明はまた、配列番号２として示されているアミノ酸配列を含むこれらのヒ
トＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質の生物学的に活性なフラグメントおよび／または変異
体に関する。これらは、アミノ酸の置換、欠失、付加、アミノ末端短縮およびカ
ルボキシ末端短縮（必ずしもこれらに限定されない）を含み、その結果、これら
の変異体は、診断、治療または予防に使用されるタンパク質またはタンパク質フ
ラグメントをもたらし、ＭＣ−Ｒ１Ｂ機能のアゴニストおよび／またはアンタゴ
ニストに関するスクリーニングに有用である。

【００６９】本発明の様々な好ましい態様は、図５Ａ〜図５Ｆに開示され、そして配列番号
２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列
番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３および配列番号２６に示
されているようなヒトＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質タンパク質を表す。これらはすべ
て、配列番号２７に示されているような６５アミノ酸の伸長部を含む。

【００７０】本発明はまた、アミノ酸の欠失、付加または置換を有するが、ＭＣ−Ｒ１Ｂと
実質的に同じ活性を依然として保持している改変されたＭＣ−Ｒ１Ｂポリペプチ
ドに関する。一アミノ酸の様々な置換は、通常、タンパク質の生物学的活性を変
化させないことが一般に受け入れられている（例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢ
ｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＧｅｎｅ、Ｗａｔｓｏｎ他、１９８７、第４版、
ＴｈｅＢｅｎｊａｍｉｎ／ＣｕｍｍｉｎｇｓＣｏ．，Ｉｎｃ．、２２６頁；
およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ＆Ｗｅｌｌｓ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４
：１０８１〜１０８５を参照のこと）。従って、本発明には、一アミノ酸の置換
が生じ、そしてこのタンパク質が野生型のＭＣ−Ｒ１Ｂと実質的に同じ生物学的
活性を保持している単離された核酸分子および発現したＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質
が含まれる。本発明にはまた、２個以上のアミノ酸が置換され、そしてこのタン
パク質が野生型のＭＣ−Ｒ１Ｂと実質的に同じ生物学的活性を保持している単離
された核酸分子および発現したＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質も含まれる。特に、本発
明には、上記に記載される置換が保存的な置換である実施形態が含まれる。特に
、本発明は、上記に記載される置換がＭＣ−Ｒ１Ｂのリガンド結合ドメインにお
いて生じていない実施形態が含まれる。

【００７１】ＭＣ−Ｒ１Ｂを宿主細胞において発現させた後、ＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質を回
収して、活性形態のＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質を得ることができる。いくつかのＭ
Ｃ−Ｒ１Ｂタンパク質精製手法を利用することができ、これらは使用に適してい
る。組換えＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質は、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー
、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト吸着クロマトグラフ
ィーおよび疎水相互作用クロマトグラフィーの様々な組合せによって、あるいは
それらを個々に適用することによって細胞溶解物および細胞抽出物から精製する
ことができる。さらに、組換えＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質は、全長のＭＣ−Ｒ１Ｂ
タンパク質またはＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質のポリペプチドフラグメントに特異的
なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いて作製された免疫アフィ
ニティーカラムを使用して他の細胞タンパク質から分離することができる。

【００７２】本発明はまた、野生型の脊椎動物ＭＣ−Ｒ１Ｂ活性を調節する化合物を同定す
るアッセイにおいて有用な融合タンパク質を発現する融合構築物である単離され
た核酸分子に関する。本発明のこの部分の１つの態様には、グルタチオンＳ−ト
ランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＭＣ−Ｒ１Ｂ融合構築物が含まれるが、これに限
定されない。この融合構築物は、当業者に知られている方法によって、ＧＳＴ遺
伝子のカルボキシ末端におけるインフレーム融合物としてのＭＣ−Ｒ１Ｂの細胞
内ドメイン、あるいはＧＳＴ遺伝子または免疫グロブリン遺伝子に融合させたＭ
Ｃ−Ｒ１Ｂの細胞外リガンド結合ドメインおよび膜貫通リガンド結合ドメインの
いずれかを含むが、これらに限定されない。組換えＧＳＴ−ＭＣ−Ｒ１Ｂ融合タ
ンパク質は、バキュロウイルス発現ベクター（ｐＡｃＧ２Ｔ）（Ｐｈａｒｍｉｎ
ｇｅｎ）を使用するＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ２１）
昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む様々な発現システムで発現させること
ができる。

【００７３】本発明はまた、本発明の核酸を含む組換え宿主細胞（原核生物細胞および真核
生物の両方、ならびに安定的な形質転換細胞および一過性の形質転換細胞の両方
）から得られる細胞膜画分に関する。このような細胞膜画分は、野生型または変
異型のいずれかのＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質を、内在性レベルを実質的に上回るレ
ベルで含み、従って、本明細書中に記載されている様々なアッセイにおいて有用
である。

【００７４】本発明はまた、本明細書中に開示されている実質的に精製された核酸分子を含
む組換えベクターおよび組換え宿主（原核生物および真核生物の両方）に関する
。ＭＣ−Ｒ１Ｂスプライス変化体の全体または一部をコードする本発明の核酸分
子は、受容体を含む「組換えＤＮＡ分子」を得るために、他のＤＮＡ分子（すな
わち、ＭＣ−Ｒ１Ｂが本来結合していないＤＮＡ分子）と結合させることができ
る。本発明の新規なＤＮＡ配列は、ＭＣ−Ｒ１Ｂまたは機能的等価体をコードす
る核酸を含むベクターに挿入することができる。このようなベクターはＤＮＡま
たはＲＮＡから構成され得る。大部分のクローニング目的のためには、ＤＮＡベ
クターが好ましい。代表的なベクターには、ＭＣ−Ｒ１Ｂをコードし得るプラス
ミド、改変されたウイルス、バクテリオファージおよびコスミド、酵母人工染色
体、ならびにエピソームまたは組み込み型ＤＮＡの他の形態が含まれる。特定の
遺伝子移動または他の使用に適切なベクターを決定することは十分に当業者の範
囲内である。

【００７５】この目的のために、本発明にはまた、ＭＣ−Ｒ１Ｂ遺伝子を含むベクター、そ
のようなベクターを含む宿主細胞、ならびにＭＣ−Ｒ１Ｂ遺伝子を宿主細胞に導
入する工程、およびＭＣ−Ｒ１Ｂが産生されるような適切な条件下でその宿主細
胞を培養する工程を含む実質的に純粋なＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質を作製する方法
も含まれる。そのようにして産生されたＭＣ−Ｒ１Ｂは、従来の方法で宿主細胞
から集めることができる。従って、本発明はまた、本明細書中に開示されている
ＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質および生物学的等価体の発現方法、このような遺伝子産
物を用いるアッセイ、このような受容体タンパク質を発現するＤＮＡ構築物を含
む組換え宿主細胞、ならびにこのようなアッセイにより同定された化合物であっ
て、ＭＣ−Ｒ１Ｂ活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する化合物
に関する。

【００７６】上記に記載された方法で得られ、クローニングされたＭＣ−Ｒ１ＢのｃＤＮＡ
は、好適なプロモーターおよび他の適切な転写調節エレメントを含む発現ベクタ
ー（ｐｃＤＮＡ３．ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＲ２．１、ｐＢｌｕｅＢａ
ｃＨｉｓ２またはｐＬＩＴＭＵＳ２８など）に分子クローニングすることによっ
て組換え発現させることができ、組換えＭＣ−Ｒ１Ｂを産生させるために原核生
物または真核生物の宿主細胞に移すことができる。そのような操作に関する技術
は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（上記）に記載されており、実施例の節に詳しく議論さ
れ、そして当業者にはよく知られ、容易に利用することができる。

【００７７】様々な哺乳動物発現ベクターを、組換えＭＣ−Ｒ１Ｂを哺乳動物細胞において
発現させるために使用することができる。発現ベクターは、本明細書中では、適
切な宿主におけるクローニングされたＤＮＡの転写およびそのｍＲＮＡの翻訳に
必要とされるＤＮＡ配列として定義される。そのようなベクターを使用して、細
菌、らん藻、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞などの様々な宿主において真核
生物のＤＮＡを発現させることができる。特別に設計されたベクターは、細菌−
酵母または細菌−動物細胞などの宿主間でＤＮＡを移動させることができる。適
切に構築された発現ベクターは、宿主細胞における自律的な複製に必要な複製起
点、選択マーカー、一定数の有用な制限酵素部位、高コピー数に関する能力、お
よび活性なプロモーターを含まなければならない。プロモーターは、ＲＮＡポリ
メラーゼをＤＮＡに結合させて、ＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列として定義
される。強力なプロモーターは、ｍＲＮＡを高頻度に開始させるものである。発
現ベクターには、クローニングベクター、改変されたクローニングベクター、特
別に設計されたプラスミドまたはウイルスが含まれ得るが、これらに限定されな
い。組換えＭＣ−Ｒ１Ｂの発現に好適と考えられる市販の哺乳動物発現ベクター
には、ｐｃＤＮＡ３．ｎｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＬＩＴＭＵＳ２
８、ｐＬＩＴＭＵＳ２９、ｐＬＩＴＭＵＳ３８およびｐＬＩＴＭＵＳ３９（Ｎｅ
ｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌｏａｂｓ）、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡＩａｍｐ
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１
ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ
５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３
）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅ
ｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１
９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣ
Ｃ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０）およびｌＺＤ３５（ＡＴ
ＣＣ３７５６５）が含まれるが、これらに限定されない。

【００７８】また、様々な細菌発現ベクターを、組換えＭＣ−Ｒ１Ｂを細菌細胞において発
現させるために使用することができる。組換えＭＣ−Ｒ１Ｂの発現に好適と考え
られる市販の細菌発現ベクターには、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、
ｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、λｇｔ１１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および
ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれるが、これらに限定されない
。

【００７９】さらに、様々な菌類細胞発現ベクターを、組換えＭＣ−Ｒ１Ｂを菌類細胞にお
いて発現させるために使用することができる。組換えＭＣ−Ｒ１Ｂの発現に好適
と考えられる市販の菌類細胞発現ベクターには、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ）およびＰｉｃｈｉａ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれるが
、これらに限定されない。

【００８０】また、様々な昆虫細胞発現ベクターを、組換え受容体を昆虫細胞において発現
させるために使用することができる。ＭＣ−Ｒ１Ｂの組換え発現に好適と考えら
れる市販の昆虫細胞発現ベクターには、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩおよびｐＢｌｕ
ｅＢａｃＨｉｓ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ならびにｐＡｃＧ２Ｔ（Ｐｈａｒｍ
ｉｎｇｅｎ）が含まれるが、これらに限定されない。

【００８１】ＭＣ−Ｒ１ＢＤＮＡの発現はまた、インビトロで産生させた合成ｍＲＮＡを使
用して行うことができる。合成ｍＲＮＡは、カエルの卵母細胞へのマイクロ注入
（これに限定されない）を含む細胞型システムにおいて効率的に翻訳されるだけ
でなく、小麦胚芽抽出物および網状赤血球抽出物（これらに限定されない）を含
む様々な無細胞システムで効率的に翻訳することができる。カエルの卵母細胞へ
のマイクロ注入が好ましい。

【００８２】最適なレベルのＭＣ−Ｒ１ＢをもたらすＭＣ−Ｒ１ＢのｃＤＮＡ配列を決定す
るために、ＭＣ−Ｒ１Ｂの全長のオープンリーディングフレームを含むｃＤＮＡ
フラグメント、ならびにタンパク質の特定のドメインのみまたはタンパク質の再
配置されたドメインをコードするｃＤＮＡ部分を含む様々な構築物（これらに限
定されない）を含むｃＤＮＡ分子を構築することができる。すべての構築物は、
ＭＣ−Ｒ１ＢのｃＤＮＡの５’非翻訳領域および／または３’非翻訳領域を含ま
ないように、あるいはそのような非翻訳領域のすべてまたは一部を含むように設
計することができる。ＭＣ−Ｒ１Ｂの発現レベルおよび活性は、このような構築
物を単独または組み合わせて適切な宿主細胞に導入した後で測定することができ
る。一過性のアッセイで最適な発現をもたらすＭＣ−Ｒ１ＢのｃＤＮＡカセット
を決定した後、このＭＣ−Ｒ１ＢのｃＤＮＡ構築物は、（組換えウイルスを含む
）様々な発現ベクターに移される。このような発現ベクターには、哺乳動物細胞
、植物細胞、昆虫細胞、卵母細胞、細菌および酵母細胞に対する発現ベクターが
含まれるが、これらに限定されない。

【００８３】従って、本発明の別の態様には、ＭＣ−Ｒ１ＢをコードするＤＮＡ配列を含有
し、かつ／または発現するように操作された宿主細胞が含まれる。そのような組
換え宿主細胞は、ＭＣ−Ｒ１Ｂまたは生物学的等価形態を産生させるために好適
な条件下で培養することができる。組換え宿主細胞は原核生物または真核生物で
あり得る。これには、大腸菌などの細菌、酵母などの菌類細胞、ヒト、ウシ、ブ
タ、サルおよび齧歯類を起源とする細胞株（これらに限定されない）を含む哺乳
動物細胞、ならびにショウジョウバエおよびカイコから得られる細胞株（これら
に限定されない）を含む昆虫細胞が含まれるが、これらに限定されない。従って
、ＭＣ−Ｒ１Ｂ様タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターは、ＭＣ−
Ｒ１Ｂを組換え宿主細胞において発現させるために使用することができる。組換
え宿主細胞は原核生物または真核生物であり得る。これには、大腸菌などの細菌
、酵母などの菌類細胞、ヒト、ウシ、ブタ、サルおよび齧歯類を起源とする細胞
株（これらに限定されない）を含む哺乳動物細胞、ならびにショウジョウバエお
よびカイコから得られる細胞株（これらに限定されない）を含む昆虫細胞が含ま
れるが、これらに限定されない。例えば、昆虫発現システムの１つは、バキュロ
ウイルス発現ベクター（ｐＡｃＧ２Ｔ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と組み合わせた
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ２１）昆虫細胞（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ）を利用する。また、好適と考えられる市販の哺乳動物種には、Ｌ
細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ⁻）（ＡＴＣＣＣＣＬ１．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ１．２）、Ｓａｏｓ−２（ＡＴＣＣＨＴＢ−８５）、２９３（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣＣＣＬ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴ
ＣＣＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣＣＣＬ６１）、３Ｔ３（Ａ
ＴＣＣＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬ
ａ（ＡＴＣＣＣＣＬ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−
Ｃ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣＣＣＬ１７１）およ
びＣＰＡＥ（ＡＴＣＣＣＣＬ２０９）が含まれるが、これらに限定されない。
発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合および
エレクトロポレーション（これらに限定されない）を含む多数の技術のいずれか
によって宿主細胞に導入することができる。発現ベクターを含む細胞は、ＭＣ−
Ｒ１Ｂタンパク質を産生しているかどうかを明らかにするために個々に分析され
る。ＭＣ−Ｒ１Ｂを発現する細胞の同定は、抗ＭＣ−Ｒ１Ｂ抗体との免疫学的反
応性、標識されたリガンドの結合、および宿主細胞に結合しているＭＣ−Ｒ１Ｂ
活性の存在（これらに限定されない）を含むいくつかの手段によって行うことが
できる。

【００８４】本明細書中に記載されているアッセイは、タンパク質精製スキームと同様に、
ＭＣ−Ｒ１Ｂの発現を導く発現ベクターで一過性または安定的にトランスフェク
ションまたは形質転換された細胞を用いて行うことができる。発現ベクターは、
形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合およびエレクトロポレー
ション（これらに限定されない）を含む多数の技術のいずれかによって宿主細胞
に導入することができる。形質転換は、ＤＮＡの取り込みから生じる標的細胞に
対する遺伝子的変化を包含することを意味する。トランスフェクションは、ＭＣ
−Ｒ１Ｂを試験細胞に導入するために当分野で知られている任意の方法を含むこ
とを意味する。例えば、トランスフェクションには、リン酸カルシウムまたは塩
化カルシウムによって媒介されるトランスフェクション、リポフェクション、Ｍ
Ｃ−Ｒ１Ｂを含むレトロウイルス構築物による感染、およびエレクトロポレーシ
ョンが含まれる。発現ベクターを含む細胞は、ヒトＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質を産
生しているかどうかを明らかにするために個々に分析される。ヒトＭＣ−Ｒ１Ｂ
を発現する細胞の同定は、抗ヒトＭＣ−Ｒ１Ｂ抗体との免疫学的反応性、標識さ
れたリガンドの結合、および宿主細胞に結合するヒトＭＣ−Ｒ１Ｂ活性の存在（
これらに限定されない）を含むいくつかの手段によって行うことができる。

【００８５】ＭＣ−Ｒ１Ｂに対して親和性を示す化合物の結合特異性は、クローニングされ
た受容体を発現する組換え細胞またはこのような細胞から得られる膜に対する化
合物の親和性を測定することによって明らかにされる。クローニングされた受容
体の発現、およびＭＣ−Ｒ１Ｂに結合する化合物のスクリーニング、またはこの
ような細胞もしくはこのような細胞から調製された膜に対するＭＣ−Ｒ１Ｂの知
られている放射能標識されたリガンドの結合を阻害する化合物のスクリーニング
により、ＭＣ−Ｒ１Ｂに対して大きな親和性を有する化合物を迅速に選択する方
法が得られる。そのようなリガンドは、必ずしも放射能標識する必要はなく、結
合した放射能標識化合物と置換させるために使用され得るか、または機能アッセ
イにおける活性化因子として使用され得る非放射性の化合物でもあり得る。上記
の方法で同定された化合物は、ＭＣ−Ｒ１Ｂのアゴニストまたはアンタゴニスト
であると考えられ、ペプチド、タンパク質または非タンパク質性有機分子であり
得る。

【００８６】メラノコルチン受容体は、ＧＰＣＲのロドプシンサブファミリーに属する。し
かし、ＭＣ−Ｒ１Ｂは、すべての他の受容体と共通した特徴をいくつか有し、大
部分の他のＧＰＣＲには存在していない特徴をいくつか有する。このような特徴
には、ＴＭ１におけるＥＮモチーフ、ＴＭ２とＴＭ３との間またはＴＭ４とＴＭ
５との間のループにＣｙｓが存在しないこと、ＴＭ５におけるＭｘｘｘｘｘｘｘ
Ｙモチーフ、およびＴＭ７におけるＤＰｘｘＹモチーフが含まれる。すべてのメ
ラノコルチン受容体は、ロドプシンサブファミリーの他のメンバーに存在する細
胞外ループにＣｙｓ残基を有していないため、らせん間のジスルフィド結合（例
えば、ＴＭ３およびＴＭ５の頂部付近のＣｙｓ残基間）は、大部分の他のＧＰＣ
Ｒにおけるループ間ジスルフィド結合と同じ機能を果たしていると考えられる。
従って、本発明は、ＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの
発現を調節する化合物ならびにＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質の機能をもたらす化合物
のスクリーニング方法に関する。他の受容体のアゴニストおよびアンタゴニスト
を同定する方法が当分野ではよく知られており、そのような方法はＭＣ−ＲＩＢ
のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するために適合させることができる。
例えば、Ｃａｓｃｉｅｒｉ他（１９９２、Ｍｏｌｅｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４
１：１０９６〜１０９９）は、ラットのニューロキニン受容体に対するアゴニス
ト結合を阻害する物質、従って、ニューロキニン受容体の潜在的なアゴニストま
たはアンタゴニストである物質を同定するための方法を記載している。この方法
は、ラットのニューロキニン受容体を含む発現ベクターでＣＯＳ細胞をトランス
フェクションすること、ニューロキニン受容体を発現させるために十分な時間に
わたってトランスフェクション細胞を生育させること、トランスフェクション細
胞を集めて、ニューロキニン受容体の知られている放射能標識されたアゴニスト
を含むアッセイ緩衝液に細胞をそのような物質の存在下または非存在下のいずれ
かで再懸濁すること、その後、ニューロキニン受容体の放射能標識された知られ
ているアゴニストのニューロキニン受容体に対する結合を測定することを含む。
知られているアゴニストの結合量が、そのような物質の存在下において、そのよ
うな物質の非存在下よりも少ない場合、その物質は、ニューロキニン受容体の潜
在的なアゴニストまたはアンタゴニストである。ＭＣ−Ｒ１Ｂに対するアゴニス
トまたはアンタゴニストなどの物質の結合が測定される場合、そのような結合は
、標識された物質またはアゴニストを用いることによって測定することができる
。そのような物質またはアゴニストは、当分野で知られている都合のよい方法の
いずれかで、例えば、放射能的に、蛍光的に、酵素的に標識することができる。

【００８７】従って、ＭＣ−Ｒ１Ｂに対する親和性を有する化合物の結合特異性は、クロー
ニングされた受容体を発現する組換え細胞またはこのような細胞から得られる膜
に対する化合物の親和性を測定することによって明らかにされる。クローニング
された受容体の発現、およびＭＣ−Ｒ１Ｂに結合する化合物のスクリーニング、
またはこのような細胞もしくはこのような細胞から調製された膜に対するＭＣ−
Ｒ１Ｂの知られている放射能標識されたリガンドの結合を阻害する化合物のスク
リーニングにより、ＭＣ−Ｒ１Ｂに対して大きな親和性を有する化合物を迅速に
選択する効果的な方法が得られる。そのようなリガンドは、必ずしも放射能標識
する必要はないが、結合した放射能標識化合物と置換するために使用され得るか
、または機能アッセイにおける活性化因子として使用され得る非放射性の化合物
でもあり得る。上記の方法により同定された化合物は、ＭＣ−Ｒ１Ｂのアゴニス
トまたはアンタゴニストであると考えられ、ペプチド、タンパク質または非タン
パク質性有機分子であり得る。化合物は、ＭＣ−Ｒ１ＢをコードするＤＮＡまた
はＲＮＡの発現を増大または弱めることによって、あるいはＭＣ−Ｒ１Ｂ受容体
タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用することによって調節
することができる。ＭＣ−Ｒ１ＢをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現あるい
はその生物学的機能を調節するこのような化合物は、様々なアッセイにより検出
することができる。そのようなアッセイは、発現または機能の変化が存在するか
どうかを測定する単純な「ｙｅｓ／ｎｏ」アッセイであってもよい。アッセイは
、試験サンプルの発現または機能を、基準サンプルにおける発現または機能のレ
ベルと比較することによって定量化することができる。ＭＣ−Ｒ１Ｂ、ＭＣ−Ｒ
１Ｂに対する抗体、または改変されたＭＣ−Ｒ１Ｂを含むキットを、そのような
使用に関して知られている方法によって作製することができる。

【００８８】従って、本発明は、組換えシステムにおけるＭＣ−Ｒ１Ｂの発現方法、ならび
にＭＣ−Ｒ１Ｂのアゴニストおよびアンタゴニストの同定方法に関する。標的受
容体と特異的に相互作用する潜在的な薬物を同定するために化合物がスクリーニ
ングされる場合、同定された化合物が標的受容体に対してできる限り特異的であ
ることを確保しなければならない。このためには、標的受容体と類似する、でき
る限り広範囲の受容体に対して化合物をスクリーニングすることが必要である。
従って、受容体Ａと相互作用する潜在的な薬物である化合物を同定するためには
、その化合物が受容体Ａ（「プラス標的」）と相互作用して、受容体Ａを介して
望ましい薬理学的作用をもたらすことを確実にすることが必要であるだけでなく
、その化合物が、受容体Ｂ、Ｃ、Ｄなど（「マイナス標的」）と相互作用しない
ことを明らかにすることもまた必要である。一般に、スクリーニングプログラム
の一部として、できる限り多くのマイナス標的を有することが重要である（Ｈｏ
ｄｇｓｏｎ、１９９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：９７３〜９８０
を参照のこと）。ＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質およびこの受容体タンパク質をコード
するＤＮＡ分子は、他のＧタンパク質共役受容体と特異的に相互作用する化合物
を同定することを目的とするスクリーニングにおいて「マイナス標的」として使
用できる点でさらなる有用性を有している。ＧＰＣＲに対する相同性のために、
本発明のＭＣ−Ｒ１Ｂは、ＧＰＣＲと同じように機能して、類似した生物学的活
性を有すると考えられる。それらは、霊長類において、その後、ヒトの臨床試験
においてメラノコルチン活性プロセスを同定するために、ヒトにおける生物学的
および生理学的な作用を理解する際に有用である。より注目され得ることに、霊
長類において効果的な新規な抗肥満剤を同定するために、ＭＣ−Ｒ１Ｂのアゴニ
ストが同定され、食物摂取、体重増加および代謝速度に対するその作用について
評価されている。それらはまた、特に、同定されたリガンドの特異性を試験する
ことに関して、アカゲザルメラノコルチンのアゴニストおよびアンタゴニストを
調べるために使用することができる。

【００８９】この目的のために、本発明は、一部が、ＭＣ−Ｒ１Ｂ受容体の活性を調節する
物質の同定方法に関する。この方法は、（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配
列番号１２、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３および
配列番号２６に示されているアミノ酸配列を含むＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質（これ
らに限定されない）を含むＭＣ−Ｒ１Ｂ受容体タンパク質の存在下および非存在
下で試験物質と一緒にすること；および（ｂ）ＭＣ−Ｒ１Ｂ受容体タンパク質の存在下および非存在下における試験物
質の作用を測定して比較することを含む。

【００９０】さらに、いくつかの具体的な実施形態が、ＭＣ−Ｒ１Ｂ受容体タンパク質の発
現を導く発現ベクターと組み合わせて当業者によって利用され得る様々なタイプ
のスクリーニングアッセイまたは選択アッセイを明らかにするために本明細書中
に開示されている。他の受容体のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するた
めの方法が当分野でよく知られており、そのような方法は、ＭＣ−Ｒ１Ｂのアゴ
ニストおよびアンタゴニストを同定するために適合させることができる。従って
、これらの実施形態は、限定としてではなく、例として示される。この目的のた
めに、本発明には、ＭＣ−Ｒ１Ｂの調節因子（アゴニストおよびアンタゴニスト
など）が同定され得るアッセイが含まれる。従って、本発明には、物質がＭＣ−
Ｒ１Ｂの潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを明らかにす
る方法が含まれる。この方法は、（ａ）細胞内におけるＭＣ−Ｒ１Ｂの発現を導く発現ベクターで細胞をトラン
スフェクションまたは形質転換して、試験細胞を得ること；（ｂ）ＭＣ−Ｒ１Ｂを発現させるために十分な時間にわたって試験細胞を生育
させること；（ｃ）細胞を物質の存在下および非存在下においてＭＣ−Ｒ１Ｂの標識された
リガンドに曝すこと；（ｄ）ＭＣ−Ｒ１Ｂに対する標識リガンドの結合を測定することを含み、この場合、標識リガンドの結合量が、物質の存在下において、物質の非
存在下のときよりの少ない場合、その物質は、ＭＣ−Ｒ１Ｂの潜在的なアゴニス
トまたはアンタゴニストである。

【００９１】この方法の工程（ｃ）が行われる条件は、タンパク質−リガンド相互作用の研
究のために当分野で典型的に使用されている条件である：例えば、生理学的ｐＨ
；ＰＢＳのような広く使用されている緩衝液により、あるいは組織培養培地にお
いて表される条件などの塩条件；約４℃〜約５５℃の温度。試験細胞は集められ
、物質および標識リガンドの存在下で再懸濁することができる。上記方法の改変
において、工程（ｃ）は、細胞を集めて再懸濁するのではなく、むしろ、細胞を
基体（例えば、組織培養プレート）に結合させたまま、放射能標識された知られ
ているアゴニストおよびそのような物質を細胞と接触させる点で改変される。

【００９２】本発明はまた、物質がＭＣ−Ｒ１Ｂに結合し得るかどうか、すなわち、その物
質がＭＣ−Ｒ１Ｂの潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを
明らかにする方法に関する。この方法は、（ａ）細胞内におけるＭＣ−Ｒ１Ｂの発現を導く発現ベクターで細胞をトラン
スフェクションまたは形質転換して、試験細胞を得ること；（ｂ）試験細胞を物質に曝すこと；（ｃ）ＭＣ−Ｒ１Ｂに対する物質の結合量を測定すること；（ｄ）試験細胞におけるＭＣ−Ｒ１Ｂに対する物質の結合量を、ＭＣ−Ｒ１Ｂ
でトランスフェクションされていないコントロール細胞に対する物質の結合量と
比較することを含み、この場合、物質の結合量が、コントロール細胞と比較して試験細胞において大
きい場合、その物質はＭＣ−Ｒ１Ｂに結合し得る。その後、その物質が実際にア
ゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかの決定が、例えば、下記に記載さ
れるプロミスカスＧタンパク質の使用を含むアッセイなどの機能アッセイを使用
することによって行われる。

【００９３】この方法の工程（ｂ）が行われる条件は、タンパク質−リガンド相互作用の研
究のために当分野で典型的に使用されている条件である：例えば、生理学的ｐＨ
；ＰＢＳのような広く使用されている緩衝液により、あるいは組織培養培地にお
いて表される条件などの塩条件；約４℃〜約５５℃の温度。試験細胞は集められ
、物質の存在下で再懸濁することができる。

【００９４】Ｃｈｅｎ他（１９９５、ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、
２２６：３４９〜３５４）は、Ｇタンパク質共役受容体をコードする発現ベクタ
ー、およびＬａｃＺ遺伝子に融合させたｃＡＭＰ応答エレメントを有するプロモ
ーターを含む別の発現ベクターでトランスフェクションされた組換え細胞を利用
する比色測定アッセイを記載している。過剰発現させたＧタンパク質共役受容体
の活性が、β−Ｇａｌの発現およびＯＤ測定として測定される。従って、本発明
のこの部分の別の態様には、物質がＭＣ−Ｒ１Ｂの潜在的なアゴニストまたはア
ンタゴニストであるかどうかを明らかにするための非放射能的な方法が含まれ、
この方法は、（ａ）ＭＣ−Ｒ１Ｂをコードする発現ベクターで細胞をトランスフェクション
または形質転換して、試験細胞を得ること；（ｂ）ＬａｃＺのような比色測定用遺伝子に融合させたｃＡＭＰ誘導プロモー
ターを含む発現ベクターで工程（ａ）の試験細胞をトランスフェクションまたは
形質転換すること；（ｃ）ＭＣ−Ｒ１Ｂを発現させるために十分な時間にわたってトランスフェク
ション細胞を生育させること；（ｄ）トランスフェクション細胞を集めて、ＭＣ−Ｒ１Ｂの知られているアゴ
ニストの存在下ならびに／または試験化合物の存在下および非存在下の両方で細
胞を再懸濁すること；（ｅ）知られているアゴニストおよび試験化合物の過剰発現させたＭＣ−Ｒ１
Ｂに対する結合を、ｃＡＭＰ誘導プロモーターからの発現を測定する比色測定ア
ッセイによって測定して、知られているアゴニストの存在下、ならびに未知の物
質の存在下および非存在下における発現レベルを比較し、その結果、未知の物質
がＭＣ−Ｒ１Ｂの潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するかど
うかを明らかにすることを含む。

【００９５】アゴニストまたはアンタゴニストを同定するさらなる方法は下記を含むが、そ
れらに決して限定されない：Ｉ．（ａ）ＭＣ−Ｒ１Ｂの発現を導く第１の発現ベクター、プロミスカスＧタ
ンパク質の発現を導く第２の発現ベクターで細胞をトランスフェクションまたは
形質転換して、試験細胞を得ること；（ｂ）試験細胞を、ＭＣ−Ｒ１Ｂのアゴニストと考えられる物質に曝すこと；（ｃ）細胞におけるイノシトールリン酸のレベルを測定すること、この場合、アゴニストと考えられる物質の非存在下における細胞内のイノシトー
ルリン酸レベルと比較して、細胞内のイノシトールリン酸レベルの増大は、その
物質がＭＣ−Ｒ１Ｂのアゴニストであることを示す。

【００９６】ＩＩ．（ａ）ＭＣ−Ｒ１Ｂの発現を導く請求項３の第１の発現ベクターおよび
プロミスカスＧタンパク質の発現を導く第２の発現ベクターで細胞をトランスフ
ェクションまたは形質転換して、試験細胞を得ること；（ｂ）試験細胞を、ＭＣ−Ｒ１Ｂのアゴニストと考えられる物質に曝すこと；（ｃ）工程（ｂ）に引き続き、あるいは工程（ｂ）と同時に、試験細胞を、Ｍ
Ｃ−Ｒ１Ｂのアンタゴニストと考えられる物質に曝すこと；（ｄ）細胞内のイノシトールリン酸のレベルを測定すること；この場合、アンタゴニストと考えられる物質の非存在下における細胞内のイノシ
トールリン酸レベルと比較して、アンタゴニストと考えられる物質の存在下にお
ける細胞内のイノシトールリン酸レベルの低下は、その物質がＭＣ−Ｒ１Ｂのア
ンタゴニストであることを示す。

【００９７】ＩＩＩ．工程（ａ）の第１および第２の発現ベクターが、そのＣ末端において
プロミスカスＧタンパク質に融合したキメラなＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質を発現す
る単一の発現ベクターに置換されているＩＩの方法。

【００９８】上記の方法は、試験細胞を物質に曝すよりもむしろ、膜を試験細胞から調製す
ることができ、そのような膜を物質に曝すことができる点で改変することができ
る。細胞ではなく、膜を利用するそのような改変は当分野ではよく知られており
、例えば、Ｈｅｓｓ他、１９９２、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．
Ｃｏｍｍ．１８４：２６０〜２６８に記載されている。従って、本発明の別の実
施形態には、物質がＭＣ−Ｒ１Ｂに結合し、かつ／またはＭＣ−Ｒ１Ｂの潜在的
なアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを明らかにする方法であって
、試験細胞から得られる膜調製物が試験細胞の代わりに利用される方法が含まれ
る。そのような方法は下記を含み、上記に記されているような生理学的条件を使
用することができる：（ａ）細胞内におけるＭＣ−Ｒ１Ｂの発現を導く発現ベクターで細胞をトラン
スフェクションまたは形質転換して、試験細胞を得ること；（ｂ）試験細胞からＭＣ−Ｒ１Ｂを含む膜を調製して、リガンドが膜内のＭＣ
−Ｒ１Ｂに結合するような条件のもとで膜をＭＣ−Ｒ１Ｂのリガンドに曝すこと
；（ｃ）工程（ｂ）に引き続き、あるいは工程（ｂ）と同時に、試験細胞から得
られた膜を物質に曝すこと；（ｄ）物質の存在下および非存在下において膜内のＭＣ−Ｒ１Ｂに対するリガ
ンドの結合量を測定すること；（ｅ）物質の存在下および非存在下において膜内のＭＣ−Ｒ１Ｂに対するリガ
ンドの結合量を比較し、この場合、物質の存在下における膜内のＭＣ−Ｒ１Ｂに
対するリガンドの結合量の減少は、その物質がＭＣ−Ｒ１Ｂに結合し得ることを
示す。

【００９９】本発明はまた、物質がＭＣ−Ｒ１Ｂに結合し得るかどうかを明らかにする方法
に関する。この方法は、（ａ）細胞内におけるＭＣ−Ｒ１Ｂの発現を導く発現ベクターで細胞をトラン
スフェクションまたは形質転換して、試験細胞を得ること；（ｂ）試験細胞からＭＣ−Ｒ１Ｂを含む膜を調製して、試験細胞から得られた
膜を物質に曝すこと；（ｃ）試験細胞から得られた膜内のＭＣ−Ｒ１Ｂに対する物質の結合量を測定
すること；（ｄ）試験細胞から得られた膜内のＭＣ−Ｒ１Ｂに対する物質の結合量を、Ｍ
Ｃ−Ｒ１Ｂでトランスフェクションされていないコントロール細胞から得られた
膜に対する物質の結合量と比較することを含み、この場合、試験細胞から得られた膜内のＭＣ−Ｒ１Ｂに対する物質の結
合量が、コントロール細胞から得られた膜に対する物質の結合量よりも大きい場
合、その物質はＭＣ−Ｒ１Ｂに結合し得る。

【０１００】本発明の好ましい実施形態は、様々な濃度の未標識リガンドの存在下、^１２５Ｉで標識されたＮＤＰ−α−ＭＳＨを標識リガンドとして使用して様々なリガン
ドの結合親和性を決定することである。第２メッセンジャー経路の活性化を、様
々な濃度のアゴニストによって誘発された細胞内ｃＡＭＰを測定することによっ
て明らかにすることができる。

【０１０１】本発明はまた、ＭＣ−Ｒ１Ｂの形態またはその生物学的に活性なフラグメント
のいずれかに応答して惹起されたポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体
に関する。ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、例えば、配列番号
２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列
番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３および配列番号２６に開
示されているようなＭＣ−Ｒ１ＢまたはＭＣ−Ｒ１Ｂの一部に由来する合成ペプ
チド（通常は、長さが約９アミノ酸〜約２５アミノ酸）に対して惹起させること
ができる。ＭＣ−Ｒ１Ｂに対する単一特異性抗体が、ＭＣ−Ｒ１Ｂに対して反応
し得る抗体を含有する哺乳動物の抗血清から精製されるか、あるいはＫｏｈｌｅ
ｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７
）の技術を使用して、ＭＣ−Ｒ１Ｂと反応し得るモノクローナル抗体として調製
される。本明細書中で使用される単一特異性抗体は、ＭＣ−Ｒ１Ｂに対する一様
な結合特性を有する単一抗体種または多重抗体種として定義される。本明細書中
で使用される一様な結合は、上記に記載されているように、特異的な抗原または
エピトープに結合する抗体種（ＭＣ−Ｒ１Ｂと結合する抗体など）の能力をいう
。ＭＣ−Ｒ１Ｂに特異的な抗体は、免疫アジュバントを用いて、あるいは免疫ア
ジュバントを用いることなく、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウ
マなどの動物を、適切な濃度のＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質またはＭＣ−Ｒ１Ｂの一
部から作製された合成ペプチドで免疫化することにより惹起される。

【０１０２】免疫前の血清が、最初の免疫化の前に採取される。各動物に、ＭＣ−Ｒ１Ｂタ
ンパク質が、約０．１μｇ〜約１０００μｇの間で許容可能な免疫アジュバント
とともに投与される。そのような許容可能なアジュバントには、フロイント完全
アジュバント、フロイント不完全アジュバント、アルム沈殿物、Ｃｏｒｙｎｅｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍｐａｒｖｕｍおよびｔＲＮＡを含む油中水型エマルションが
含まれるが、これらに限定されない。最初の免疫化は、皮下（ＳＣ）、腹腔内（
ＩＰ）またはその両方のいずれかによる多数部位における、好ましくはフロイン
ト完全アジュバントにおけるＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質またはそのペプチドフラグ
メントからなる。各動物は、抗体力価を測定するために、定期的（好ましくは、
毎週）に採血される。動物には、最初の免疫化の後、追加免疫注射を施すことが
でき、あるいは施さなくてもよい。追加免疫注射を受けるそのような動物は、一
般に、等量のＭＣ−Ｒ１Ｂを含むフロイント不完全アジュバントが同じ経路で投
与される。追加免疫注射は、最大の力価が得られるまで約３週間の間隔で行われ
る。各追加免疫による免疫化の約７日後、または一回の免疫化後のほぼ毎週、動
物は採血され、血清が採取され、一部が約−２０℃で保管される。

【０１０３】ＭＣ−Ｒ１Ｂと反応し得るモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、同系交配マウス
（好ましくは、Ｂａｌｂ／ｃ）をＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質で免疫化することによ
って調製される。マウスは、約１ｍｇ〜約１００ｍｇ（好ましくは、約１０ｍｇ
）のＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質を含む、上記に議論された受容可能なアジュバント
の等容量に配合された約０．５ｍｌの緩衝液または生理食塩水を用いてＩＰ経路
またはＳＣ経路で免疫化される。フロイント完全アジュバントが好ましい。マウ
スは、０日目に最初の免疫化が行われ、約３週間〜約３０週間そのままにされる
。免疫化されたマウスは、約１ｍｇ〜約１００ｍｇのＭＣ−Ｒ１Ｂを含む緩衝液
（リン酸緩衝化生理食塩水など）の１回または複数回の追加免疫による免疫化が
静脈内（ＩＶ）経路によって行われる。抗体陽性マウスから得られるリンパ球が
、好ましくは脾臓のリンパ球が、当分野で知られている標準的な手法により脾臓
を免疫化マウスから摘出することによって得られる。ハイブリドーマ細胞が、安
定なハイブリドーマの形成を可能にする条件下で脾臓のリンパ球を適切な融合パ
ートナー（好ましくは、メラノーマ細胞）と混合することによって得られる。融
合パートナーには、マウスのメラノーマであるＰ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１；ＭＰ
Ｃ−１１；Ｓ−１９４およびＳｐ２／０が含まれるが、これらに限定されず、Ｓ
ｐ２／０が好ましい。抗体産生細胞およびメラノーマ細胞は、約３０％〜約５０
％の濃度のポリエチレングリコール（約１０００の分子量）において融合させら
れる。融合したハイブリドーマ細胞は、当分野で知られている手法により、ヒポ
キサンチン、チミジンおよびアミノプテリンが補充されたダルベッコ改変イーグ
ル培地（ＤＭＥＭ）における成長によって選択される。上清液が、約１４日目、
１８日目および２１日目の生育陽性ウエルから採取され、ＭＣ−Ｒ１Ｂを抗原と
して使用する固相免疫放射アッセイ（ＳＰＩＲＡ）などの免疫アッセイによって
抗体産生についてスクリーニングされる。培養液もまた、ｍＡｂのイソ型を決定
するためにウフタロニー沈殿アッセイで試験される。抗体陽性ウエルから得られ
るハイブリドーマ細胞は、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎの軟寒天技術（１９７３、軟寒
天技術、ＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉ
ｃａｔｉｏｎｓ、ＫｒｕｓｅおよびＰａｔｅｒｓｏｎ編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰ
ｒｅｓｓ）などの技術によってクローニングされる。

【０１０４】モノクローナル抗体は、抗原刺激した４日後に約２ｘ１０^６個〜約６ｘ１０^６個のハイブリドーマ細胞を初期の抗原刺激Ｂａｌｂ／ｃマウスに注射（マウスあ
たり約０．５ｍｌ）することによってインビボで産生される。腹水が細胞移入の
約８日後〜１２日後に採取され、モノクローナル抗体が当分野で知られている技
術によって精製される。

【０１０５】抗ＭＣ−Ｒ１ＢｍＡｂのインビトロ産生は、約２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ
Ｍにおいてハイブリドーマを生育させて、十分な量の特異的なｍＡｂを得ること
によって行われる。ｍＡｂは、当分野で知られている技術によって精製される。

【０１０６】腹水またはハイブリドーマ培養液の抗体力価は、沈殿、受動的凝集、酵素結合
免疫吸着抗体（ＥＬＩＳＡ）技術および放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）技術（これ
らに限定されない）を含む様々な血清学的アッセイまたは免疫学的アッセイによ
って測定される。同様のアッセイを使用して、体液または組織抽出物および細胞
抽出物におけるＭＣ−Ｒ１Ｂの存在が検出される。

【０１０７】単一特異性抗体の上記に記載された産生方法は、ＭＣ−Ｒ１Ｂのペプチドフラ
グメントまたは全長のＭＣ−Ｒ１Ｂに特異的な抗体を作製するために使用できる
ことは当業者には容易に明らかである。

【０１０８】ＭＣ−Ｒ１Ｂ抗体のアフィニティーカラムは、例えば、抗体がアガロースゲル
ビーズ支持体との共有結合を形成するようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テルで事前に活性化されたゲル支持体であるＡｆｆｉｇｅｌ−１０（Ｂｉｏｒａ
ｄ）に抗体を付加することによって作製される。次いで、抗体を、スペーサーア
ームとのアミド結合を介してゲルに結合させる。その後、残存する活性化エステ
ルを１ＭのエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）で処理する。カラムは、非結合抗
体または外来タンパク質を除くために、水で洗浄され、続いて０．２３Ｍのグリ
シンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で洗浄される。その後、カラムはリン酸緩衝化生理食
塩水（ｐＨ７．３）で平衡化され、全長のＭＣ−Ｒ１ＢまたはＭＣ−Ｒ１Ｂタン
パク質フラグメントを含む細胞培養上清または細胞抽出物がゆっくりカラムに流
される。その後、カラムは、光学密度（Ａ_２８０）がバックグラウンドにまで低
下するまでリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄され、その後、タンパク質が０．２３
Ｍのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）で溶出される。精製されたＭＣ−Ｒ１Ｂタ
ンパク質は、その後、リン酸緩衝化生理食塩水に対して透析される。

【０１０９】本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、組換えタンパク質および抗体を使用して、
ＭＣ−Ｒ１Ｂをスクリーニングし、そのレベルを測定することができる。該組換
えタンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子および抗体は、ＭＣ−Ｒ１Ｂの検出およ
びタイピングに適したキットの形成に有用である。そのようなキットは、少なく
とも１つの容器を密閉的（ｃｌｏｓｅｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ）に収容するの
に適した区画化された担体を含むことになろう。該担体は更に、試薬（例えば、
組換えＭＣ−Ｒ１Ｂ、またはＭＣ−Ｒ１Ｂの検出に適した抗ＭＣ−Ｒ１Ｂ抗体）
を含むであろう。また、該担体は、標識抗原または酵素基質などの検出手段を含
有していてもよい。

【０１１０】医薬上許容される担体の混合などの公知方法に従い、ＭＣ−Ｒ１Ｂのモジュレ
ーターを含む医薬上有用な組成物を製剤化することができる。製剤化のそのよう
な担体および方法の具体例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔ
ｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。有効な投与に適した医薬上許容
される組成物を形成させるためには、そのような組成物は、該タンパク質、ＤＮ
Ａ、ＲＮＡ、修飾ＭＣ−Ｒ１ＢまたはＭＣ−Ｒ１Ｂのアゴニストもしくはアンタ
ゴニスト（チロシンキナーゼのアクチベーターまたはインヒビターを含む）の有
効量を含有するであろう。

【０１１１】本発明の治療用または診断用組成物は、障害を治療または診断するのに十分な
量で個体に投与する。該有効量は、個体の状態、体重、性別、年齢などの種々の
因子によって様々となりうる。他の因子には、投与様式が含まれる。

【０１１２】該医薬組成物は、皮下、局所、経口および筋肉内などの種々の経路により個体
に投与することができる。

【０１１３】「化学誘導体」なる語は、通常は該基礎分子の一部ではない追加的な化学的部
分を含有する分子を意味する。そのような部分は、該基礎分子の溶解性、半減期
、吸収性などを改善しうる。あるいは、該部分は、該基礎分子の望ましくない副
作用を減弱させたり、あるいは該基礎分子の毒性を減少させうる。そのような部
分の具体例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃ
ｉｅｎｃｅｓなどの種々の刊行物に記載されている。

【０１１４】本明細書に開示する方法に従い同定した化合物は、適当な投与量で単独で使用
することができる。あるいは、他の物質の同時投与または連続的投与が望ましい
であろう。

【０１１５】本発明はまた、本発明の新規治療方法において使用するための、適当な局所、
経口、全身および非経口医薬製剤を提供するという目的を有する。本発明に従い
同定された化合物を有効成分として含有する組成物は、通常の投与用ビヒクル中
の多種多様な治療用剤形で投与することができる。例えば、該化合物は、錠剤、
カプセル剤（それぞれは時限放出（ｔｉｍｅｄｒｅｌｅａｓｅ）および徐放製
剤を含む）、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、液剤、懸濁剤、シ
ロップ剤、乳剤などの経口剤形として又は注射により投与することができる。同
様に、それらを、静脈内（ボーラスおよび注入の両方）、腹腔内、皮下、局所（
閉塞（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）の存在下または不存在下）または筋肉内形態として
投与することも可能であり、それらはすべて、薬学分野の当業者によく知られた
形態を用いることが可能である。

【０１１６】本発明の化合物を単独１日量で投与したり、あるいは合計１日量を、２、３ま
たは４分割量で毎日投与するのが有利かもしれない。さらに、本発明のための化
合物は、適当な鼻腔内ビヒクルの局所的使用により鼻腔内形態で、または当業者
によく知られた経皮皮膚パッチの形態を使用して経皮経路により投与することが
できる。もちろん、経皮デリバリーシステムの形態で投与する場合には、該投与
量の投与は、該投与計画の全体にわたり、断続的なものではなく連続的なものと
なるであろう。

【０１１７】別々の投与製剤中の２以上の活性剤での併用療法の場合には、それらの活性剤
を同時に投与したり、あるいはそれらのそれぞれを、別々にずらした時点で投与
することができる。

【０１１８】本発明の化合物を使用する投与計画は、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別
および医学的状態；治療する状態の重症度；投与経路；患者の腎、肝および心臓
血管機能；および使用するその個々の化合物を含む種々の因子に応じて選択され
る。通常の技量を有する医師または獣医は、該状態の進行の予防、抑制または停
止に必要な薬物の有効量を容易に決定し、処方することができる。毒性を伴うこ
となく効力を与える範囲内の薬物濃度を最適に正確に得るためには、標的部位に
対する薬物のアベイラビリティーの動態論に基づく計画が必要である。これは、
薬物の分布、平衡および消失に関する考慮を含む。

【０１１９】以下の実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明を限定するもの
ではない。

【０１２０】実施例１ヒトＭＣ−Ｒ１スプライス変化体の単離および特徴づけ発現配列標識（ＥＳＴ）の同定−Ｇｅｎｂａｎｋデータベースを、Ｔｂｌａｓ
ｔｎ検索プログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
、２１５：４０３〜４１０）をヒトメラノコルチン受容体タンパク質のアミノ酸
配列とともに使用してモニターした。５つの基準化されたプール化ｃＤＮＡライ
ブラリーに由来するヒトＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋアクセション＃ＡＩ１２３００
０；ｄｂＥＳＴＩｄ＃１８８１５４４；ＧｅｎＢａｎｋｇｉ：３５３８７６
６；クローンＩｄ：Ｉｍａｇｅ：１５０９８８７（３’）、１９９７年８月１８
日寄託）が有意な相同性スコアとともに同定された。ＥＳＴＡＩ１２３０００
は、ヒトＭＣ−Ｒ１遺伝子の３’末端に対する配列同一性（ＤＮＡレベルで＞９
０％）を示した。ＥＳＴＡＡ１２３０００のヌクレオチド配列を下記に示す：

【０１２１】

【化４】

【０１２２】ヒトＭＣ−Ｒ１遺伝子の３’末端に対して類似した配列同一性を有するさらな
るＥＳＴが続いて１９９８年１０月１３日に寄託された。このＥＳＴのＧｅｎＢ
ａｎｋアクセション番号は＃ＡＩ１８７８９２（ｄｂＥＳＴＩｄ＃８２６１０
２；ＧｅｎＢａｎｋｇｉ：１７７４１０１；クローンＩｄ：Ｉｍａｇｅ：６２
５９８４（３’））である。ＥＳＴＡＡ１８７８９２のヌクレオチド配列を下
記に示す：

【０１２３】

【化５】

【０１２４】ＧｅｎＢａｎｋのｄｂＥＳＴサブ集団のさらなる検索により、ヒトＭＣ−Ｒ１
Ｒに対する配列同一性を有する２つの他のヒトＥＳＴが同定された。最初のもの
は、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号＃ＡＡ４３１３９７のもとで利用すること
ができ、ヒト精巣ｍＲＮＡから単離され、１９９７年５月２２日に登録された（
ｄｂＥＳＴＩｄ＃１０７５９６８；ＧｅｎＢａｎｋｇｉ：２１１５１０５；
クローンＩｄ：Ｉｍａｇｅ：７８２１３３（３’））。ＥＳＴＡＡ４３１３９
７のヌクレオチド配列を下記に示す：

【０１２５】

【化６】

【０１２６】別のＥＳＴが、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号＃ＡＡ７７８２９５のもとで
利用することができ、ヒト胎児心臓ｍＲＮＡから単離され、１９９８年２月５日
にデータベースに登録された（ｄｂＥＳＴＩｄ＃１０７５９６８；ＧｅｎＢａ
ｎｋｇｉ：２１１５１０５；クローンＩｄ：Ｉｍａｇｅ：７８２１３３（３’
））。ＥＳＴＡＡ４３１３９７のヌクレオチド配列を下記に示す：

【０１２７】

【化７】

【０１２８】色素ターミネーターサイクル配列決定用反応物（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ−
ＡＢＩ）を使用する両鎖のＤＮＡ配列決定により、３７７ＡＢＩＰｒｉｓｍサ
イクル配列決定装置で分析したとき、このＥＳＴが、３８２アミノ酸を含むＭＣ
−Ｒ１Ｂタンパク質として本明細書中に開示されているヒトＭＣ−Ｒ１遺伝子の
選択的スプライシング形態の一部を表していることが示唆された。３１７個のア
ミノ酸を含む以前に記載されたＭＣ−Ｒ１タンパク質はＭＣ−Ｒ１Ａと呼ばれる
（Ｍｏｕｎｔｊｏｙ他、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５７：１２４８〜１２５
１［米国特許第５，５３２，３４７号もまた参照のこと］；Ｃｈｈａｉｊｌａｎ
ｉおよびＷｉｌｂｅｒｇ、１９９２、ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ、３０９：４１
７〜４２０）。図１には、ＭＣ−Ｒ１Ａ遺伝子およびＭＣ−Ｒ１Ｂ遺伝子に関連
してこれらのＥＳＴの配列比較が示されている。

【０１２９】ヒトゲノムＤＮＡからのＭＣ−Ｒスプライシング変化体（ＭＣ−Ｒ１Ｂ）のク
ローニング−タッチダウンＰＣＲを、剪断化ヒトゲノムＤＮＡ（０．５ｍｇ；Ｃ
ｌｏｎｅｔｅｃｈ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ）を用いてＧｅｎｅＡｍｐ９７０
０ＰＣＲシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ
）で行った。

【０１３０】

【化８】の２つのセンスプライマーをヒトＭＣ−１ＲＡ（同上）の発表された配列に基づ
いて設計した。

【０１３１】

【化９】のアンチセンスプライマーをＥＳＴＡＩ１２３０００から得た。Ａｄｖａｎｔ
ａｇｅｃＤＮＡＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、Ｃ
Ａ）を、本質的には製造者の説明書に従ってＰＣＲ反応において使用した。２つ
の例外は、５％ＤＭＳＯをＰＣＲ反応物に加えたこと、および下記に記載される
ＰＣＲサイクルを行ったことであった：１）９４℃で１分間、２）９４℃で３０
秒間、７２℃で３分間の５サイクル、３）９４℃で３０秒間、７０℃で３分間の
５サイクル、４）９４℃で３０秒間、６８℃で３分間の２０サイクル。ＢＩＧ
ＤＹＥターミネーターサイクル配列決定用反応物（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、
ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）を使用するＰＣＲ産物のその後の配列決定およ
び３７７ＡＢＩＰｒｉｓｍサイクル配列決定装置（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ
、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）での分析により、隠れた３８１ｂｐのイント
ロンがヒトＭＣ−Ｒ１遺伝子のＴＧＡ停止コドンの（Ｃ末端のＴｒｐ−３１７残
基における）すぐ上流に存在することが明らかにされた。目印としてのスプライ
ス接合部のコンセンサス配列（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ他、１９９０、Ｍｅｔｈ．Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．１８３：２５２〜２７８）を使用してこのイントロンを記載する
ヌクレオチド境界は下記の通りである。Ｔｒｐのトリプレットコドンの最初の２
塩基を形成する保存されたコンセンサスなスプライスドナー部位（Ａ／Ｃ）ＡＧ
／ｇｔ（ヌクレオチド９５０〜９５２）が見出された。

【０１３２】図２には、ＭＣ−Ｒ１の２つのヒト型形態の選択的なスプライシングが示され
ている。発現タンパク質のＣＯＯＨ末端領域が、ヒトＭＣ−Ｒ１Ｂをコードする
様々なゲノムクローンで同定されたスプライス接合部ととも示されている。

【０１３３】図３には、ヒトＭＣ−Ｒ１Ｂをコードする代表的なゲノムクローン、ゲノムク
ローンｍｃ１−８のＤＮＡ配列（配列番号２１）が示されている。大文字はエキ
ソン領域を表し、小文字はＭＣ−Ｒ１遺伝子の１個のイントロンを表している。
保存されたコンセンサスなスプライスアクセプター部位ｃａｇ／Ｒがヌクレオチ
ド１３３０〜１３３２において同定された。このスプライス接合部の形成は、Ｔ
Ｇをもたらすドナーと、Ｃをもたらすアクセプターとから生じ、（ＭＣ−Ｒ１Ａ
のＣ末端アミノ酸のＴｒｐの代わりに）Ｃｙｓのトリプレットコドンを形成する
。さらなる６５アミノ酸（Ｃｙｓ置換に対するＴｒｐ−３１７を含まない）をも
たらす新規なコード配列が、このスプライシング事象の結果として生じる。

【０１３４】図４Ａ〜図４Ｂには、ｍｃ１−８のＭＣ−Ｒ１Ａ型およびＭＣ−Ｒ１Ｂ型のア
ミノ末端部分のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列、５’および３’のスプラ
イス接合部配列、ならびにＭＣ−Ｒ１ＡおよびＭＣ−Ｒ１Ｂのカルボキシ末端部
分のそれぞれのアミノ酸配列が示されている。

【０１３５】次いで、重複ＰＣＲを行い、この新規なカルボキシル末端を含むイントロンを
含まない連続したオープンリーディングフレーム（３８２アミノ酸）を作製した
。それぞれがもう一方のエキソンの小さな一部を含むエキソンＩおよびＩＩに対
するＰＣＲ産物を作製した。エキソンＩに対するプライマーは下記の通りであっ
た：

【０１３６】

【化１０】および

【０１３７】

【化１１】これにはＥｃｏＲＩ部位および最適な翻訳に必要なＫｏｚａｋ配列（ＧＣＣ
ＧＣＣ）が含まれた。エキソンＩＩに対するプライマーは下記の通りであった：

【０１３８】

【化１２】および

【０１３９】

【化１３】これはＮｏｔＩ部位を含む。その後、ＭＣ１様オープンリーディングフレームを
、エキソンＩおよびＩＩのテンプレートと、プライマーｍｃ１−ｌｉｋｅ−１ｆ
およびｍｃ１−ｌｉｋｅ−２ｒとから作製した。ＭＣ１様ＯＲＦフラグメントを
ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化して、ゲル精製し、ｐｃＤＮＡ３ベクターに連
結して、大腸菌ＳＣＳ１株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）
に形質転換した。４つの例示されたゲノムクローン（ｍｃ１−３、ｍｃ１−６、
ｍｃ１−８およびｍｃ１−９）のそれぞれを、上記に記載された方法を使用して
単離した。

【０１４０】ヒト精巣ｍＲＮＡからのＭＣ−Ｒスプライシング変化体（ＭＣ−Ｒ１Ｂ）のク
ローニング−ＭＣ−Ｒ１Ｂをコードする全長のｃＤＮＡをヒト精巣ポリ（Ａ）^＋ｍＲＮＡ（２５名の男性白人のプール）から単離した。１ｍｇの精巣ｍＲＮＡを
使用するＲＴ−ＰＣＲを、ＭＭＬＶ逆転写酵素を用いたＡｄｖａｎｔａｇｅＲ
ＴｆｏｒＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ）を
使用して、本質的には製造者の説明書に従って行った。その後、ＰＣＲを、Ａｄ
ｖａｎｔａｇｅｃＤＮＡＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＰａｌｏＡｌ
ｔｏ、ＣＡ）を用いて、本質的には製造者の説明書に従って行った（サイクル条
件：９４℃で１分間、６０℃で２分間、７２℃で２分間、７２℃で１０分間）。
用いた順方向センスプライマー（これにはＥｃｏＲＩ制限部位およびＫｏｚａｋ
則に基づいて最適化した開始配列が加えられている）は、

【０１４１】

【化１４】であり、逆方向アンチセンスプライマーは、

【０１４２】

【化１５】であった。増幅産物をアガロースゲルで精製し、ＥｃｏＲＩで消化して、哺乳動
物発現ベクターｐｃＤＮＡ−３．１（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結した
。この方法を用いて、それ以外のｃＤＮＡクローンと同様にＭＣ−Ｒ１ＥＳＴｃ
１１を同定した。

【０１４３】実施例２ヒトＭＣ−Ｒ１Ｂの一過性発現１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ）、Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）
およびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を補充した１２５ｍｌのダル
ベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を含む４つの８００
ｍｌトリプルフラスコ（ＮａｌｇｅＮｕｎｃ）にＣＯＳ７細胞を接種して、４
日間インキュベーションした。各フラスコの細胞を、培地を捨て、３０ｍｌのト
リプシン／ＥＤＴＡ（０．０５％、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を各フラスコに加え、
フラスコを室温で２分間インキュベーションすることによって集めた。その後、
トリプシン溶液を除き、フラスコを３７℃で１０分間インキュベーションし、３
０ｍｌのＤＭＥＭを加えて、細胞を集めた。細胞を１０００ｒｐｍで８分間ペレ
ット化し、Ｍｇ^＋＋およびＣａ^＋＋を含まないダルベッコＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ／
ＢＲＬ）で２回洗浄した。細胞を計数して、Ｍｇ^＋＋およびＣａ^＋＋を含まない
ＰＢＳの１ｍｌあたり１．２Ｘ１０^７個の密度に再懸濁した。ＤＮＡをエレクト
ロポレーションによって細胞に導入した；０．８５ｍｌの細胞を氷冷した０．４
ｃｍキュベット（ＢｉｏＲａｄ）中で２０μｇのＭＣ−Ｒ１発現プラスミドと混
合した。溶液を、０．２６ｋＶ、９６０μＦＤに設定されたＢｉｏＲａｄ社のＧ
ｅｎｅＰｕｌｓａｒエレクトロポレーターでエレクトロポレーションした。３
０個のエレクトロポレーション物から得られる細胞を１リットルのＤＭＥＭにま
とめ、トリプルフラスコあたり１２５ｍｌで分配し、３７℃でインキュベーショ
ンした。３日後、各フラスコの培地を捨て、細胞を、Ｍｇ^＋＋およびＣａ^＋＋を
含まないダルベッコＰＢＳの１００ｍｌで洗浄し、酵素を含まない解離緩衝液（
Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）の３０ｍｌを加えた。室温で１０分間インキュベーション
した後、細胞を集め、４℃において１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、１
５ｍｌの膜緩衝液（プロテイナーゼ阻害剤を含む１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．
４）に再懸濁した。５００ｘプロテイナーゼ阻害剤溶液は、２μｇ／ｍｌのロイ
ペプチン（Ｓｉｇｍａ）、５μＭのホスホラミドン（Ｓｉｇｍａ）、２０μｇ／
ｍｌのバシトラシン、２．５μｇ／ｍｌのアプロチニン（Ｓｉｇｍａ）、および
０．０５ＭのＡＥＢＳＦ（Ｐｅｆａｂｌｏｃ）を含む。細胞をモーター駆動ダン
スの１０ストロークで破砕して、ホモジネートを５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチュー
ブに移し、４℃において２２００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を５０ｍ
ｌの遠心分離チューブに移し、Ｓｏｒｖａｌｌ社のＲＣ５Ｂ遠心分離器において
１８Ｋで２０分間遠心分離した。膜を０．６ｍｌの膜緩衝液に再懸濁して、１８
ゲージの注射針に２回、そして２５ゲージの注射針に５回通し、小分けして液体
窒素で凍結し、必要とされるまで−８０℃で保存した。

【０１４４】実施例３ヒトＭＣ−Ｒ１Ｂの薬理学的性質メラノコルチン放射性リガンド結合アッセイ−結合緩衝液（総容量＝２５０μ
ｌ）は、ＭＢＢ（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．２）、２ｍＭのＣａＣｌ_２、１
ｍＭのＭｇＣｌ_２）、０．１％ＢＳＡ、ヒトＭＣ−Ｒ１Ｂ受容体を発現する細胞
から調製された粗製膜、２００ｐＭの［^１２５Ｉ］−ＮＤＰ−α−ＭＳＨ（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍＣｏｒｐ．）、およびＤＭＳＯに溶解した増大濃度の未標識試験
化合物（ＤＭＳＯ最終濃度＝２％）を含有した。反応物を、振とうすることなく
１時間インキュベーションし、その後、９６ウエルフィルタープレート（Ｐａｃ
ｋａｒｄＣｏｒｐ．）でろ過した。フィルターをＴＮＥ緩衝液（５０ｍＭのＴ
ｒｉｓ（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で３回洗浄
し、乾燥し、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ−２０を使用してＴｏｐｃｏｕｎｔシンチレ
ーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）で計数した。５０％阻害濃度（ｎＭ単位
で与えられるＩＣ_５０）は、ＭＣ−Ｒ１を発現する細胞の膜に対する結合の５０
％を置換する未標識のメラノコルチンペプチドの濃度として定義される。非特異
的な結合を２μＭの未標識ＮＤＰαＭＳＨ（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ）の存在下で測定した。ＭＣ−Ｒ１Ｂを一過性に発現するＣＯＳ−
７細胞は、大きな親和性および特異性で［^１２５Ｉ］−ＮＤＰ−α−ＭＳＨと結
合した（１μＭの未標識ＮＤＰ−αＭＳＨの非存在下および存在下で認められた
結合差として定義される特異的な結合は総結合の＞９０％であった）。特異性が
ほとんどない結合または非特異的な結合がｓｈａｍトランスフェクションＣＯＳ
−７細胞で認められた。下記の表１に示されているように、いくつかのメラノコ
ルチン由来ペプチド（アミノ酸配列は一文字のＩＵＰＡＣ表記で下記に定義され
る）は、［^１２５Ｉ］−ＮＤＰ−α−ＭＳＨの結合を置換した。このことは、Ｍ
Ｃ−Ｒ１Ｂの発現によりもたらされた大きな親和性の結合部位が存在することを
強く示している。

【０１４５】

【表１】

【０１４６】ｃＡＭＰ機能的受容体アッセイ−環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）形成の受容体媒介刺
激を、ＭＣ−１ＲＢ発現プラスミドでトランスフェクションされたＣＯＳ−７細
胞でアッセイした。ＭＣ−１ＲＢを発現する細胞を、ＣａおよびＭｇを含まない
リン酸塩緩衝化生理食塩水（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈ
ｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で洗浄することによって組織培養フラスコから解離させ
て、酵素を含まない解離緩衝液（ＳｐｅｃｉａｌｔｙＭｅｄｉａ、Ｌａｖｅｌ
ｌｅｔｔｅ、ＮＪ）とともに５分間インキュベーションした後に分離した。細胞
を遠心分離によって集め、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＭｇ
Ｃｌ_２、１ｍＭのグルタミン、および１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを加え
たアール平衡塩溶液（ＥＢＳＳ）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａ
ｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で再懸濁した。細胞を計数して２〜４ｘ１０^６／
ｍｌに希釈した。ホスホジエステラーゼ阻害剤の３−イソブチル−１−メチルキ
サンチンを０．６ｍＭの濃度で加えた。試験ペプチドを、上記の添加物および１
０％のＤＭＳＯを含むＥＢＳＳで希釈した；０．１容量の化合物を０．９容量の
細胞に加えた。室温で４０分間インキュベーションした後、細胞を１００℃で５
分間のインキュベーションによって溶解して、蓄積したｃＡＭＰを放出させた。
ｃＡＭＰを、Ａｍｅｒｓｈａｍ社（ＡｒｌｉｎｇｔｏｎＨｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ
）のｃＡＭＰ検出アッセイ（ＲＰＡ５５６）を用いて細胞溶解物の一部で測定し
た。未知の化合物から生じるｃＡＭＰの産生量を、１００％のアゴニストと定義
されたαＭＳＨに応答して産生されたｃＡＭＰの産生量と比較する。

【０１４７】以前の研究（Ｍｏｕｎｔｊｏｙ他、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５７：１２
４８〜１２５１［米国特許第５，５３２，３４７号もまた参照のこと］；Ｃｈｈ
ａｊｌａｎｉおよびＷｉｋｂｅｒｇ、１９９２、ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ、３
０９：４１７〜４２０）は、メラノコルチンのアゴニストによるＭＣ−Ｒ１Ａイ
ソ型の活性化は、Ｇタンパク質を膜結合型アデニル酸シクラーゼの活性化に共役
させることによって細胞内ｃＡＭＰ産生を上昇させることを表している。ＣＯＳ
−７における一時的なＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質の発現はまた、αＭＳＨ、ＭＴ−
ＩＩ、ＳＨＵ−９１１９、γＭＳＨ、ＮＤＰ−αＭＳＨおよびβＭＳＨを含むい
くつかのメラノコルチンアゴニストまたは混合されたアゴニスト／アンタゴニス
トによって特異的に誘発される細胞内ｃＡＭＰ形成の増大をもたらす（ｓｈａｍ
トランスフェクションＣＯＳ−７細胞で測定されたバックグラウンドと比較した
場合、最大のアゴニスト濃度において約３倍）。この結果は、ＭＣ−Ｒ１Ｂのｃ
ＤＮＡにより、メラノコルチン類の機能的な受容体がコードされていることを示
している。ｃＡＭＰ応答を誘発する上記ペプチドの効き目のおおよその強さ順序
は、ＭＴ−ＩＩ＞ＮＤＰ−ＭＳＨ＞ＳＨＵ−９１１９＞αＭＳＨ＞βＭＳＨ＞γ
ＭＳＨであった。

【０１４８】本発明は、本明細書中に記載されている特定の実施形態によって範囲が限定さ
れるものではない。実際、本明細書中に記載されている改変に加えて、本発明の
様々な改変が、上記の記載から当業者には明らかになる。そのような改変は、添
付された請求項の範囲に含まれるものとする。

【０１４９】様々な刊行物が本明細書中に引用されているが、それらの開示は、その全体が
参考として援用される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトＭＣ−Ｒ１配列の概略図を示す。ＭＣ−Ｒ１ＭＯ（ＧｅｎＢａｋアクセシ
ョン番号Ｘ６５６３４）およびＭＣ−Ｒ１ＣＨ（ＧｅｎＢａｋアクセション番号
Ｘ６７５９４）もまた、ここでＭＣ−Ｒ１Ａ遺伝子として示される。

【図２】ヒトＭＣ−Ｒ１遺伝子の選択的スプラシングを示す。

【図３】ゲノムクローンｍｃ１−８のＤＮＡ配列を示す（配列番号２１）。大文字はエ
キソン領域を表し、小文字のヌクレオチドはＭＣ−Ｒ１遺伝子の１個のイントロ
ンを表す。

【図４Ａ】ｍｃ１−８ゲノムクローンのＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を、Ａ型（配
列番号４５および配列番号４６）およびＢ型（配列番号２１および配列番号２３
）として示す。これらは、スプライシングされた形態であるＭＣＲ１−Ａおよび
ＭＣ−Ｒ１Ｂを例示する。

【図４Ｂ】ｍｃ１−８ゲノムクローンのＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を、Ａ型（配
列番号４５および配列番号４６）およびＢ型（配列番号２１および配列番号２３
）として示す。

【図５Ａ】ヒトの様々なＭＣ−Ｒ１ＡクローンおよびＭＣＲ１Ｂクローンのアミノ酸配列
のクラスター配列比較を示す。

【図５Ｂ】ヒトの様々なＭＣ−Ｒ１ＡクローンおよびＭＣＲ１Ｂクローンのアミノ酸配列
のクラスター配列比較を示す。

【図５Ｃ】ヒトの様々なＭＣ−Ｒ１ＡクローンおよびＭＣＲ１Ｂクローンのアミノ酸配列
のクラスター配列比較を示す。

【図５Ｄ】ヒトの様々なＭＣ−Ｒ１ＡクローンおよびＭＣＲ１Ｂクローンのアミノ酸配列
のクラスター配列比較を示す。

【図５Ｅ】ヒトの様々なＭＣ−Ｒ１ＡクローンおよびＭＣＲ１Ｂクローンのアミノ酸配列
のクラスター配列比較を示す。

【図５Ｆ】ヒトの様々なＭＣ−Ｒ１ＡクローンおよびＭＣＲ１Ｂクローンのアミノ酸配列
のクラスター配列比較を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｑ 1/02 5/00 Ａ (72)発明者マクニール，ダグラス・ジエイアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065−0907、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者フアン・デル・プルーフ，レオナルドス・ハー・テーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065−0907、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA63 CA04 DA02 EA04 GA14 HA12 HA15 4B063 QA01 QA18 QQ20 QR59 QR60 QR69 QR77 QR80 QS24 QS28 QS38 QX07 4B065 AA90X AA93Y AB01 AC14 CA24 CA46 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA50 DA76 DA86 EA50 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号２７に示されるアミノ酸配列のカルボキシ末端領域
を含むヒトメラノコルチン１受容体タンパク質をコードする精製された核酸分子
。
【請求項２】前記核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配
列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号
１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２
４および配列番号２５からなる群から選択される、請求項１に記載の精製された
核酸分子。
【請求項３】ヒトＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質をコードする精製された核酸分
子であって、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０
、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３お
よび配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコ
ードする精製された核酸分子。
【請求項４】組換え宿主細胞においてヒトＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質を発現
させるための発現ベクターであって、請求項１に記載されるアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡ分子を含む発現ベクター。
【請求項５】真核生物の発現ベクターである、請求項４に記載の発現ベク
ター。
【請求項６】原核生物の発現ベクターである、請求項４に記載の発現ベク
ター。
【請求項７】組換えヒトＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質を発現する宿主細胞であ
って、請求項４に記載される発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】組換えヒトＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質を発現する宿主細胞であ
って、請求項５に記載される発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項９】組換えヒトＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質を発現する宿主細胞であ
って、請求項６に記載される発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】前記ヒトＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質が前記発現ベクターから
過剰発現される、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項１１】前記ヒトＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質が前記発現ベクターから
過剰発現される、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１２】前記ヒトＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質が前記発現ベクターから
過剰発現される、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１３】組換えヒトＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質を含む、請求項１０に
記載される宿主細胞から得られる細胞膜画分。
【請求項１４】組換えヒトＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質を含む、請求項１１に
記載される宿主細胞から得られる細胞膜画分。
【請求項１５】組換えヒトＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質を含む、請求項１２に
記載される宿主細胞から得られる細胞膜画分。
【請求項１６】ヒトＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質をコードする精製された核酸
分子であって、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１
０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３
および配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるタンパク質
をコードする精製された核酸分子。
【請求項１７】配列番号２７に示されるカルボキシ末端アミノ酸ドメイン
含む精製されたヒトメラノコルチン１受容体タンパク質。
【請求項１８】配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列
番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番
号２３および配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求
項１７に記載の精製されたヒトメラノコルチン１受容体タンパク質。
【請求項１９】物質がヒトＭＣ−Ｒ１Ｂに結合し得るかどうかを明らかに
する方法であって、（ａ）請求項４に記載される発現ベクターで細胞をトランスフェクションする
ことによって試験細胞を提供すること；（ｂ）前記試験細胞を前記物質に曝すこと；（ｃ）ＭＣ−Ｒ１Ｂに対する前記物質の結合量を測定すること；（ｄ）前記試験細胞におけるＭＣ−Ｒ１Ｂに対する前記物質の結合量を、ＭＣ
−Ｒ１Ｂでトランスフェクションされていないコントロール細胞に対する前記物
質の結合量と比較することを含む方法。
【請求項２０】物質がＭＣ−Ｒ１Ｂを活性化し得るかどうかを明らかにす
る方法であって、（ａ）請求項４に記載される発現ベクターで細胞をトランスフェクションする
ことによって試験細胞を提供すること；（ｂ）前記試験細胞を前記物質に曝すこと；（ｃ）蓄積した細胞内ｃＡＭＰの量を測定すること；（ｄ）前記物質に応答した前記試験細胞におけるｃＡＭＰの量を、前記物質に
曝されていない試験細胞におけるｃＡＭＰの量と比較することを含む方法。
【請求項２１】ＭＣ−Ｒ１Ｂ受容体活性を調節する物質を同定する方法で
あって、（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配
列番号１２、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３および
配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＭＣ−Ｒ１Ｂ受容体
タンパク質の存在下および非存在下で試験物質と一緒にすること；および（ｂ）ＭＣ−Ｒ１Ｂ受容体タンパク質の存在下および非存在下における前記試
験物質の作用を測定して比較することを含む方法。
【請求項２２】物質がＭＣ−Ｒ１Ｂの潜在的なアゴニストまたはアンタゴ
ニストであるかどうかを明らかにする方法であって、（ａ）細胞内におけるＭＣ−Ｒ１Ｂの発現を導く請求項４に記載される発現ベ
クターで細胞をトランスフェクションまたは形質転換して、試験細胞を得ること
；（ｂ）ＭＣ−Ｒ１Ｂを発現させるために十分な時間にわたって前記試験細胞を
生育させること；（ｃ）前記物質の存在下および非存在下でＭＣ−Ｒ１Ｂの標識リガンドに前記
細胞を曝すこと；（ｄ）ＭＣ−Ｒ１Ｂに対する前記標識リガンドの結合を測定することを含み：この場合、前記標識リガンドの結合量が、前記物質の存在下において、前記物質
の非存在下のときよりも少ない場合、前記物質は、ＭＣ−Ｒ１Ｂの潜在的なアゴ
ニストまたはアンタゴニストである、方法。
【請求項２３】物質がＭＣ−Ｒ１Ｂに結合し得るかどうかを明らかにする
方法であって、（ａ）細胞内におけるＭＣ−Ｒ１Ｂの発現を導く請求項４に記載される発現ベ
クターで細胞をトランスフェクションまたは形質転換して、試験細胞を得ること
；（ｂ）前記試験細胞を前記物質に曝すこと；（ｃ）ＭＣ−Ｒ１Ｂに対する前記物質の結合量を測定すること；（ｄ）前記試験細胞におけるＭＣ−Ｒ１Ｂに対する前記物質の結合量を、ＭＣ
−Ｒ１Ｂでトランスフェクションされていないコントロール細胞に対する前記物
質の結合量と比較することを含み：この場合、前記物質の結合量が、コントロール細胞と比較して前記試験細胞にお
いて大きい場合、前記物質はＭＣ−Ｒ１Ｂに結合し得る、方法。
【請求項２４】物質がＭＣ−Ｒ１Ｂに結合し得るかどうかを明らかにする
方法であって、（ａ）細胞内におけるＭＣ−Ｒ１Ｂの発現を導く請求項４に記載される発現ベ
クターで細胞をトランスフェクションまたは形質転換して、試験細胞を得ること
；（ｂ）前記試験細胞からＭＣ−Ｒ１Ｂを含む膜を調製して、リガンドが前記膜
内のＭＣ−Ｒ１Ｂに結合するような条件下で前記膜をＭＣ−Ｒ１Ｂのリガンドに
曝すこと；（ｃ）工程（ｂ）に引き続き、あるいは工程（ｂ）と同時に、前記試験細胞か
ら得られた膜を物質に曝すこと；（ｄ）前記物質の存在下および非存在下において前記膜内のＭＣ−Ｒ１Ｂに対
する前記リガンドの結合量を測定すること；（ｅ）前記物質の存在下および非存在下において前記膜内のＭＣ−Ｒ１Ｂに対
する前記リガンドの結合量を比較することを含み：この場合、前記物質の存在下における前記膜内のＭＣ−Ｒ１Ｂに対する前記リガ
ンドの結合量の減少は、前記物質がＭＣ−Ｒ１Ｂに結合し得ることを示す、方法
。
【請求項２５】物質がＭＣ−Ｒ１Ｂに結合し得るかどうかを明らかにする
方法であって、（ａ）細胞内におけるＭＣ−Ｒ１Ｂの発現を導く請求項４に記載される発現ベ
クターで細胞をトランスフェクションまたは形質転換して、試験細胞を得ること
；（ｂ）前記試験細胞からＭＣ−Ｒ１Ｂを含む膜を調製して、前記試験細胞から
得られた膜を前記物質に曝すこと；（ｃ）前記試験細胞から得られた膜内のＭＣ−Ｒ１Ｂに対する前記物質の結合
量を測定すること；（ｄ）前記試験細胞から得られた膜内のＭＣ−Ｒ１Ｂに対する前記物質の結合
量を、ＭＣ−Ｒ１Ｂでトランスフェクションされていないコントロール細胞から
得られた膜に対する前記物質の結合量と比較することを含み：この場合、前記試験細胞から得られた膜内のＭＣ−Ｒ１Ｂに対する前記物質の結
合量が、前記コントロール細胞から得られた膜に対する前記物質の結合量よりも
大きい場合、前記物質はＭＣ−Ｒ１Ｂに結合し得る、方法。
【請求項２６】ＭＣ−Ｒ１Ｂのアゴニストを同定する方法であって、（ａ）ＭＣ−Ｒ１Ｂの発現を導く請求項４に記載される第１の発現ベクターお
よびプロミスカスＧタンパク質の発現を導く第２の発現ベクターで細胞をトラン
スフェクションまたは形質転換して、試験細胞を得ること；（ｂ）ＭＣ−Ｒ１Ｂのアゴニストと考えられる物質に前記試験細胞を曝すこと
；（ｃ）細胞内のイノシトールリン酸のレベルを測定することを含み：この場合、アゴニストと考えられる前記物質の非存在下における細胞内のイノシ
トールリン酸レベルと比較して、細胞内のイノシトールリン酸レベルの増大は、
前記物質がＭＣ−Ｒ１Ｂのアゴニストであることを示す、方法。
【請求項２７】ＭＣ−Ｒ１Ｂのアンタゴニストを同定する方法であって、（ａ）ＭＣ−Ｒ１Ｂの発現を導く請求項４に記載される第１の発現ベクターお
よびプロミスカスＧタンパク質の発現を導く第２の発現ベクターで細胞をトラン
スフェクションまたは形質転換して、試験細胞を得ること；（ｂ）ＭＣ−Ｒ１Ｂのアゴニストである物質に前記試験細胞を曝すこと；（ｃ）工程（ｂ）に引き続き、あるいは工程（ｂ）と同時に、ＭＣ−Ｒ１Ｂの
アンタゴニストと考えられる物質に前記試験細胞を曝すこと；（ｄ）細胞内のイノシトールリン酸のレベルを測定することを含み：この場合、アンタゴニストと考えられる前記物質の非存在下における細胞内のイ
ノシトールリン酸レベルと比較して、アンタゴニストと考えられる前記物質の存
在下における細胞内のイノシトールリン酸レベルの低下は、前記物質がＭＣ−Ｒ
１Ｂのアンタゴニストであることを示す、方法。
【請求項２８】工程（ａ）の第１および第２の発現ベクターが、そのＣ末
端においてプロミスカスＧタンパク質に融合したキメラなＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク
質を発現する単一の発現ベクターにより置換されている、請求項２７に記載され
るＭＣ−Ｒ１Ｂのアンタゴニストを同定する方法。
【請求項２９】ＭＣ−Ｒ１Ｂタンパク質に特異的に結合する抗体であって
、ＭＣ−Ｒ１Ｂ受容体タンパク質は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配
列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１７、配列番
号２０、配列番号２３および配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配
列を含む、抗体。