DE69930873T2

DE69930873T2 - Dna-moleküle kodierende spleissvarianten des humanen melanocortin-1-rezeptorproteins

Info

Publication number: DE69930873T2
Application number: DE69930873T
Authority: DE
Inventors: D. Andrew Rahway HOWARD; J. Douglas Rahway MACNEIL; H. Leonardus Rahway VAN DER PLOEG
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 1999-12-16
Publication date: 2007-03-15
Anticipated expiration: 2019-12-17
Also published as: CA2357036A1; ES2260948T3; JP2002533111A; WO2000039147A1; EP1140968A4; ATE323106T1; EP1140968B9; EP1140968B1; EP1140968A1; US6693184B1; DE69930873D1

Description

Querverweis zu verwandten Anmeldungen
Die vorliegende Anmeldung beansprucht die Priorität zur US-Serien-Nr. 60/113 401, angemeldet am 23. Dezember 1998.
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Moleküle, welche für Spleissvarianten des Melanocortin 1-Rezeptorproteins (MC-R1), das zur Rhodopsin-Unterfamilie von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren gehört, codieren, rekombinante Vektoren, umfassend DNA-Moleküle, weiche für MC-R1-Spleissvariantenproteine codieren, rekombinante Wirtszellen, welche einen rekombinanten Vektor enthalten, der für MC-R1-Spleissvarianten codiert, die von dem DNA-Molekül codierten humanen MC-R1-Proteine und Verfahren zur Identifizierung selektiver Agonisten und Antagonisten von MC-R1-Spleissvariantenproteinen, die in dieser Beschreibung offenbart werden.
Hintergrund der Erfindung
Melanocortin-Rezeptoren gehören zur Rhodopsin-Unterfamilie von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs). Fünf verschiedene Subtypen sind bekannt. Diese Melanocortin-Rezeptoren binden an Peptide, wie z.B. die melanozytenstimulierenden Hormone α, β oder γ (α-, β-, γ-MSH), die von dem Proopiomelanocortin (POMC)-Gen abgeleitet sind, und werden durch diese aktiviert. Man nimmt an, dass ein breites Spektrum physiologischer Funktionen durch Melanocortin-Peptide und deren Rezeptoren vermittelt wird.
US-Patent Nr. 5,532,347, erteilt am 2. Juli 1996 an Cone und Mountjoy, offenbart und beansprucht Human- und Maus-DNA-Moleküle, welche für MC-R1 (auch im Stand der Technik als α-MSH-R bekannt) codieren. Das exprimierte humane Protein enthält 317 Aminosäuren.
US-Patent Nr. 5,849,871, erteilt am 15. Dezember 1998 an Cone und Mountjoy, offenbart und beansprucht Human- und Maus-MC-R1. Wie im vorhergehenden Absatz festgestellt, enthält das exprimierte humane Protein 317 Aminosäurereste.
Mountjoy et al. (1992, Science 257: 1248–1251) beschreiben DNA-Moleküle und das begleitende Protein für Human-MC-R1 und Human-MC-R2.
Chhajlani et al. (1992, FEBS Letters 309: 417–420) offenbaren ebenfalls ein humanes DNA-Molekül, umfassend einen offenen Leserahmen, der für Human-MC-R1 codiert.
Cone et al. (1996, Recent Progress in Hormone Research 51: 287–318) geben einen Überblick über bekannte Säuger-Melanocortin-Rezeptoren von MC-R1 bis MC-R5.
Jackson (1997, Human Molecular Genetics 6: 1613–24) und Koppula et al. (1997, Human Mutation 9: 30–36) geben einen Überblick über das Auftreten und die potentielle Bedeutung von Polymorphismen innerhalb der codierenden Sequenz der Human-MC-R1-Form A.
Es ist wünschenswert, in vivo-Daten mit biochemischer Aktivität von Verbindungen in vitro zu korrelieren.
Es ist auch wünschenswert, Verbindungen zu selektionieren, welche ein oder mehrere Human-Melanocortin-Rezeptorprotein(e) in vitro aktivieren.
Es ist ferner wünschenswert, neue Arzneiwirkstoffe aufzufinden, welche pathophysiologische Prozesse durch Modulation von Melanocortin-Rezeptoraktivität beeinflussen, gefolgt von klinischen Versuchen an Menschen.
Die vorliegende Erfindung betrifft und erfüllt diese Anforderungen durch Offenbarung isolierter Nukleinsäuremoleküle, welche Spleissvarianten von Human-MC-R1 exprimieren, rekombinanter Vektoren, welche diese Nukleinsäuremoleküle beherbergen, rekombinanter Wirtszellen, welche diese alternativen Formen von Human-MC-R1 und/oder biologisch aktive Äquivalente exprimieren, und pharmakologischer Eigenschaften dieser Human-MC-R1-Proteine.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Reihe isolierter Nukleinsäuremoleküle (Polynukleotide), welche für neue Varianten des Human-Melanocortin 1-Rezeptorproteins codieren, hier als MC-R1B-Proteine bezeichnet. Die Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung sind im Wesentlichen frei von anderen Nukleinsäuren. Diese isolierten Nukleinsäuremoleküle codieren für ein MC-R1-Protein, welches eine intrazelluläre Domäne mit zusätzlichen 65 Aminosäureresten im Vergleich zu dem früher offenbarten Human-MC-R1, hier auch als MC-R1A bezeichnet, enthält. Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung isolierte Nukleinsäuremoleküle (Polynukleotide), welche für eine mRNA codieren, die ein neues Human-MC-R1-Protein exprimiert, wobei diese DNA-Moleküle einschließen, jedoch keineswegs beschränkt sind auf, DNA-Moleküle, welche die hier als SEQ-ID-Nr. 1, SEQ-ID-Nr. 3, SEQ-ID-Nr. 5, SEQ-ID-Nr. 7, SEQ-ID-Nr. 9, SEQ-ID-Nr. 11, SEQ-ID-Nr. 13, SEQ-ID-Nr. 16, SEQ-ID-Nr. 19, SEQ-ID-Nr. 22 und SEQ-ID-Nr. 25 offenbarte Nukleotidsequenz umfassen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche humane genomische Klone repräsentieren, die mindestens ein einziges Intron innerhalb des offenen Leserahmens, der für neue Varianten von Human-MC-R1B-Protein codiert, umfassen. Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung isolierte Nukleinsäuremoleküle (Polynukleotide), welche für ein RNA-Molekül codieren, welches gespleisst wird, um ein mRNA-Molekül zu bilden, das für eine neue Human-MC-R1-Proteinvariante codiert, wobei diese DNA-Moleküle einschließen, jedoch keineswegs beschränkt sind auf, DNA-Moleküle, welche die hier als SEQ-ID-Nr. 15, SEQ-ID-Nr. 18, SEQ-ID-Nr. 21 und SEQ-ID-Nr. 24 offenbarte Nukleotidsequenz umfassen. Diesbezüglich betrifft die vorliegende Erfindung auch das jeweilige mRNA-Molekül, welches von jedem der DNA-Moleküle, die als SEQ-ID-Nr. 15, SEQ-ID-Nr. 18, SEQ-ID-Nr. 21 und SEQ-ID-Nr. 24 dargestellt sind, gebildet wird.
Die isolierten Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung umfassen eine 3'-Verlängerung in dem offenen Leserahmen, welche für eine COOH-terminale Verlängerung von 65 Aminosäuren gegenüber bekanntem MC-R1 codiert. Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung isolierte Nukleinsäuremoleküle, sowohl DNA- als auch RNA-Moleküle, die für eine Spleissvariante von bekanntem MC-R1 codieren, welche für diese COOH-terminale Verlängerung von 65 Aminosäuren codiert. Die Gesamtheit der Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung, einschließlich genomischer DNA, cDNA, RNA und mRNA, wird hier als "MC-R1-Spleissvarianten" bezeichnet werden, womit ein offenbartes Nukleinsäuremolekül identifiziert wird, welches für ein Protein mit Melanocortin 1-Rezeptoraktivität codiert, in Kombination mit diesem zusätzlichen 3'-Exon, welches für eine COOH-terminale Verlängerung von 65 Aminosäuren codiert. Diese isolierten Nukleinsäuremoleküle umfassen, sind jedoch keineswegs beschränkt auf, SEQ-ID-Nr. 1, SEQ-ID-Nr. 3, SEQ-ID-Nr. 5, SEQ-ID-Nr. 7, SEQ-ID-Nr. 9, SEQ-ID-Nr. 11, SEQ-ID-Nr. 13, SEQ-ID-Nr. 15, SEQ-ID-Nr. 16, SEQ-ID-Nr. 18, SEQ-ID-Nr. 19, SEQ-ID-Nr. 21, SEQ-ID-Nr. 22, SEQ-ID-Nr. 24 und SEQ-ID-Nr. 25.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch biologisch aktive Fragmente oder Mutanten von MC-R1-Spleissvarianten, welche für mRNA, exprimierend einen neuen Human-MC-R1, codieren. Jedes solche biologisch aktive Fragment und/oder solche Mutante der hier offenbarten MC-R1-Spleissvarianten wird entweder für ein Protein oder ein Proteinfragment codieren, welches mindestens im Wesentlichen die pharmakologischen Eigenschaften eines Wildtyp-MC-R1-Proteins nachbildet und mindestens einen Teil der COOH-terminalen Aminosäure verlängerung, offenbart als SEQ-ID-Nr. 27, umfasst. Jedes solche Polynukleotid schließt ein, ist jedoch nicht notwendigerweise beschränkt auf, Nukleotidsubstitutionen, -deletionen, -additionen, aminoterminale Verkürzungen und carboxyterminale Verkürzungen, so dass diese Mutationen für mRNA codieren, welche ein Protein oder Proteinfragment von diagnostischem, therapeutischem oder prophylaktischem Nutzen exprimieren, und zum Screenen hinsichtlich Agonisten und/oder Antagonisten der MC-R1B-Funktion von Nutzen sein würden.
Ein bevorzugter Aspekt dieses Teils der vorliegenden Erfindung ist angegeben als SEQ-ID-Nr. 1, SEQ-ID-Nr. 3, SEQ-ID-Nr. 5, SEQ-ID-Nr. 7, SEQ-ID-Nr. 9, SEQ-ID-Nr. 11, SEQ-ID-Nr. 13, SEQ-ID-Nr. 15, SEQ-ID-Nr. 16, SEQ-ID-Nr. 18, SEQ-ID-Nr. 19, SEQ-ID-Nr. 21, SEQ-ID-Nr. 22, SEQ-ID-Nr. 24 und SEQ-ID-Nr. 25, humane Nukleinsäuremoleküle, welche den vollständigen offenen Leserahmen für die MC-R1B-Proteine der vorliegenden Erfindung umfassen.
Die isolierten Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung können ein Desoxyribonukleinsäuremolekül (DNA), wie z.B. genomische DNA und komplementäre DNA (cDNA), welche einzelsträngig (codierender oder nicht-codierender Strang) oder doppelsträngig sein kann, sowie synthetische DNA, wie z.B. ein synthetisiertes einzelsträngiges Polynukleotid, umfassen. Das isolierte Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung kann auch ein Ribonukleinsäuremolekül (RNA) umfassen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch rekombinante Vektoren und rekombinante Wirte, sowohl prokaryotisch als auch eukaryotisch, welche die im Wesentlichen gereinigten Nukleinsäuremoleküle, die in dieser Beschreibung offenbart werden, enthalten, einschließlich der, jedoch nicht beschränkt auf die, isolierten Nukleinsäuremoleküle wie in SEQ-ID-Nr. 1, SEQ-ID-Nr. 3, SEQ-ID-Nr. 5, SEQ-ID-Nr. 7, SEQ-ID-Nr. 9, SEQ-ID-Nr. 11, SEQ-ID-Nr. 13, SEQ-ID-Nr. 15, SEQ-ID-Nr. 16, SEQ-ID-Nr. 18, SEQ-ID-Nr. 19, SEQ-ID-Nr. 21, SEQ-ID-Nr. 22, SEQ-ID-Nr. 24 und SEQ-ID-Nr. 25 angegeben.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch subzelluläre Membranfraktionen der rekombinanten Wirtszellen (sowohl prokaryotische als auch eukaryotische und sowohl stabil als auch transient transformierte Zellen), welche die von den Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung codierten Proteine enthalten. Diese subzellulären Membranfraktionen werden entweder Wildtyp- oder Mutantenformen der humanen Melanocortin 1-Rezeptorproteine, welche die COOH-terminate Verlängerung umfassen, in Niveaus enthalten, die wesentlich über den endogenen Niveaus liegen, und somit in verschiedenen Assays, die in dieser Patentbeschreibung beschrieben werden, von Nutzen sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine im wesentlichen gereinigte Form der COOH-terminalen Varianten von Human-Melanocortin 1-Rezeptorprotein, welche die in 5A–5F offenbarten und in SEQ-ID-Nr. 2, SEQ-ID-Nr. 4, SEQ-ID-Nr. 6, SEQ-ID-Nr. 8, SEQ-ID-Nr. 10, SEQ-ID-Nr. 12, SEQ-ID-Nr. 14, SEQ-ID-Nr. 17, SEQ-ID-Nr. 20, SEQ-ID-Nr. 23 und SEQ-ID-Nr. 26 angegebenen Aminosäuresequenzen umfassen. Diese MC-R1-Proteine umfassen eine 65 Aminosäuren lange Verlängerung am COOH-Terminus im Vergleich zu bekanntem humanen MC-R1 und werden in dieser Patentbeschreibung durchgehend als MC-R1B-Proteine oder MC-R1-Spleissvariantenproteine bezeichnet.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch biologisch aktive Fragmente und/oder Mutanten der humanen MC-R1B-Proteine, die in dieser Patentbeschreibung offenbart werden, einschließlich, jedoch nicht notwendigerweise beschränkt auf, Aminosäuresubstitutionen, -deletionen, -additionen, aminoterminale Verkürzungen und carboxyterminale Verkürzungen, so dass diese Mutationen Proteine oder Proteinfragmente von diagnostischem, therapeutischem oder prophylaktischem Nutzen ergeben und zum Screenen hinsichtlich Agonisten und/oder Antagonisten der MC-R1B-Funktion von Nutzen wären.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche Fusionskonstrukte sind, die Fusionsproteine exprimieren, von Nutzen in Assays zur Identifizierung von Verbindungen, welche Wildtyp-Vertebraten-MC-R1B-Aktivität modulieren. Ein bevorzugter Aspekt dieses Teils der Erfindung umfasst, ist jedoch nicht beschränkt auf, Glutathion S-Transferase(GST)-MC-R1B-Fusionskonstrukte, welche einschließen, jedoch nicht beschränkt sind auf, entweder die intrazelluläre Domäne von Human-MC-R1B als Fusion im Leserahmen am Carboxyterminus des GST-Gens oder die extrazelluläre und Transmembran-Ligandenbindungsdomäne von MC-R1B fusioniert mit dem Aminoterminus von GST oder die extrazelluläre und Transmembran-Domäne von MC-R1B fusioniert mit einem Immunglobulin-Gen nach Verfahren, die einem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet bekannt sind. Lösliche rekombinante GST-MC-R1B-Fusionsproteine können in verschiedenen Expressionssystemen, einschließlich Spodoptera frugiperda (Sf21)-Insektenzellen (Invitrogen), unter Verwendung eines Baculovirus-Expressionsvektors (pAcG2T, Pharmingen) exprimiert werden.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Expression der hier offenbarten humanen MC-R1B-Proteine und biologischen Äquivalente, Assays unter Verwendung dieser Genprodukte, rekombinante Wirtszellen, die DNA-Konstrukte umfassen, welche diese Rezeptorproteine exprimieren, und durch diese Assays identifizierte Verbindungen, welche als Agonisten oder Antagonisten von MC-R1B-Aktivität wirken.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch polyklonale und monoklonale Antikörper, die als Reaktion auf entweder die humane Form eines MC-R1B-Proteins oder ein biologisch aktives Fragment davon induziert wurden.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines isolierten Nukleinsäuremoleküls, welches für eine neue Form von Human-MC-R1B oder Human-MC-R1B-Fragmente, Mutanten oder Derivate der humanen MC-R1B-Proteine, wie angegeben in 5A–5F und SEQ-ID-Nr. 2, SEQ-ID-Nr. 4, SEQ-ID-Nr. 6, SEQ-ID-Nr. 8, SEQ-ID-Nr. 10, SEQ-ID-Nr. 12, SEQ-ID-Nr. 14, SEQ-ID-Nr. 17, SEQ-ID-Nr. 20, SEQ-ID-Nr. 23 und SEQ-ID-Nr. 26, codiert. Ein beliebiges solches Polynukleotid schließt ein, ist jedoch nicht notwendigerweise beschränkt auf, Nukleotidsubstitutionen, -deletionen, -additionen, aminoterminale Verkürzungen und carboxyterminale Verkürzungen, so dass diese Mutationen für mRNA codieren, die ein Protein oder Proteinfragment von diagnostischem, therapeutischem oder prophylaktischem Nutzen exprimieren, und zum Screenen hinsichtlich Agonisten und/oder Antagonisten der Vertebraten-MC-R1B-Funktion von Nutzen sein würden.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung der Human-MC-R1B-Proteine oder -Proteinfragmente, welche von den im vorhergehenden Abschnitt genannten Nukleinsäuremolekülen codiert werden.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung rekombinanter Vektoren und rekombinanter Wirtszellen, welche eine Nukleinsäuresequenz, codierend für diese humanen MC-R1B-Proteine oder biologische Äquivalente davon, umfassen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer im Wesentlichen gereinigten Form irgendeines der humanen MC-R1B-Proteine, einschließlich der, jedoch nicht beschränkt auf die, in 5A–5F und SEQ-ID-Nr. 2, SEQ-ID-Nr. 4, SEQ-ID-Nr. 6, SEQ-ID-Nr. 8, SEQ-ID-Nr. 10, SEQ-ID-Nr. 12, SEQ-ID-Nr. 14, SEQ-ID-Nr. 17, SEQ-ID-Nr. 20, SEQ-ID-Nr. 23 und SEQ-ID-Nr. 26 angegebenen Proteine.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von biologisch aktiven Fragmenten und/oder Mutanten der hier offenbarten Human-MC-R1B-Proteine, einschließlich, jedoch nicht notwendigerweise beschränkt auf, Aminosäuresubstitutionen, -deletionen, -additionen, aminoterminale Verkürzungen und carboxyterminale Verkürzungen, so dass diese Mutationen Proteine oder Proteinfragmente von diagnostischem, therapeutischem oder prophylaktischem Nutzen liefern.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist auch die Bereitstellung von MC-R1B-basierten Assays, um hinsichtlich Modulatoren dieses Rezeptorproteins zu selektionieren. Diese Assays sind vorzugsweise zell-basierte Assays, wobei ein DNA-Molekül, das für MC-R1B codiert, in eine getestete Wirtszelle transfiziert oder transformiert wird, wobei man diese rekombinante Wirtszelle vor der Verwendung in verschiedenen hier beschriebenen Assays für eine ausreichende Zeit wachsen lässt, um MC-R1B zu exprimieren.
Eine Alternative ist ein Assay, bei dem im Wesentlichen gereinigte Membranfraktionen aus einer solchen transfizierten Wirtszelle mit einem DNA-Vektor, der für das MC-R1B-Protein codiert, verwendet werden, so dass die Bindung von Testverbindungen im Verhältnis zu einem bekannten MC-R1B-Liganden getestet werden kann. Diesbezüglich ist eine weitere Aufgabe die Bereitstellung von Membranpräparationen aus Wirtszellen, die mit einem für MC-R1B codierenden DNA-Molekül transfiziert oder transformiert wurden, zur Verwendung in Assays, um hinsichtlich Modulatoren von MC-R1B-Aktivität zu selektionieren.
Ebenfalls eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von MC-R1B-basierten Fusionskonstrukten im Leserahmen, Verfahren zur Expression dieser Fusionskonstrukte, hier offenbarten biologischen Äquivalenten, damit in Bezug stehenden Assays, rekombinanten Zellen, welche diese Konstrukte exprimieren, und agonistischen und/oder antagonistischen Verbindungen, welche durch die Verwendung der für Vertebraten-MC-R1B-Protein codierenden Nukleinsäure identifiziert wurden, sowie von dem exprimierten Protein.
Wie hier verwendet, beziehen sich "MC-R1-Spleissvarianten" und/oder "MC-R1B-Spleissvarianten" auf ein Nukleinsäuremolekül, welches für ein Protein mit Melanocortin 1-Rezeptoraktivität codiert, welches ein 3'-Exonsegment umfasst, das für eine COOH-terminate Verlängerung von 65 Aminosäuren, die in SEQ-ID-Nr. 27 identifiziert wurde, codiert. Solche Nukleinsäuremoleküle umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, SEQ-ID-Nr. 1, SEQ-ID-Nr. 3, SEQ-ID-Nr. 5, SEQ-ID-Nr. 7, SEQ-ID-Nr. 9, SEQ-ID-Nr. 11, SEQ-ID-Nr. 13, SEQ-ID- Nr. 15, SEQ-ID-Nr. 16, SEQ-ID-Nr. 18, SEQ-ID-Nr. 19, SEQ-ID-Nr. 21, SEQ-ID-Nr. 22, SEQ-ID-Nr. 24 und SEQ-ID-Nr. 25.
Wie hier verwendet, bezieht sich "MC-R1B" und/oder "MC-R1-Spleissvariantenproteine" auf die Proteine, die von den hier offenbarten MC-R1-Spleissvarianten-Nukleinsäuremolekülen translatiert werden. Diese humanen MC-R1B-Proteine umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, SEQ-ID-Nr. 2, SEQ-ID-Nr. 4, SEQ-ID-Nr. 6, SEQ-ID-Nr. 8, SEQ-ID-Nr. 10, SEQ-ID-Nr. 12, SEQ-ID-Nr. 14, SEQ-ID-Nr. 17, SEQ-ID-Nr. 20, SEQ-ID-Nr. 23 und SEQ-ID-Nr. 26.
Wie hier verwendet, bedeutet "GPCR" – G-Protein-gekoppelter Rezeptor –.
Die Begriffe "isoliert" und "gereinigt" werden austauschbar verwendet, um eine Nukleinsäure, ein Protein, eine Membranfraktion und dgl. zu bezeichnen, welches) im Wesentlichen frei von anderen ähnlichen Komponenten ist.
Der Begriff "Säugerwirt", wann immer er hier verwendet wird, wird sich auf jeden Säuger, einschließlich eines Menschen, beziehen.
Kurzbeschreibung der Figuren
1 zeigt eine schematische Darstellung der Human-MC-R1-Sequenzen, MC-R1MO (GenBank Hinterlegungs-Nr. X65634) und MC-R1CH (GenBank Hinterlegungs-Nr. X67594) werden hier auch als MC-R1A-Gene bezeichnet. Die Nukleotidsequenz von mc1-8 (einschließlich eines einzigen Introns) ist in SEQ-ID-Nr. 21 offenbart. Die dargestellten EST sind in Beispielsabschnitt 1 beschrieben.
2 zeigt die alternative Spleissung des Human-MC-R1-Gens. Die MC-R1A-cDNA ist wie im Stand der Technik bekannt. Die MC-R1-Gen-Intron-Verbindungsstellen sind wie beispielsweise in SEQ-ID-Nr. 21 gezeigt (mc1-8). Die MC-R1B-cDNA zeigt das zusätzliche Exon am 3'-Ende des Gens, welches für eine 65-Aminosäuren-Verlängerung codiert, beginnend mit dem Ser-Rest bei Aminosäure 318. MC-R1A enthält einen Trp-317-Rest, während MC-R1B einen Cys-317-Rest enthält. Die dunklen Kästchen für MC-R1A und MC-R1B repräsentieren Abschnitte der cDNA, welche für Transmembran-Domänen codieren, während die dunklen Kästchen des MC-R1-Gens die beiden Exons repräsentieren, welche für das bzw. die MCR1B-Protein(e) codieren.
3 zeigt die DNA-Sequenz des genomischen Klons mc1-8 (SEQ-ID-Nr. 21). Große Buchstaben repräsentieren Exonbereiche, während kleinbuchstabige Nukleotide das einzige Intron des MC-R1-Gens repräsentieren.
4A–4B zeigen die DNA- und abgeleitete Aminosäuresequenz des genomischen mc1-8-Klons als Form A (SEQ-ID-Nrn. 45 und 46) und Form B (SEQ-ID-Nrn. 21 und 23), die gespleisste Formen MCR1-A und MC-R1B illustrieren.
5A–5F zeigen die Cluster-Zuordnung von Aminosäuresequenzen verschiedener humaner MC-R1A- und MC-R1B-Klone.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte Nukleinsäuremoleküle (Polynukleotide), welche für Human-Melanocortin 1-Rezeptorvariantenproteine, bezeichnet als MC-R1B-Proteine, codieren. Die Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung sind im Wesentlichen frei von anderen Nukleinsäuren. Für die meisten Klonierungszwecke ist DNA eine bevorzugte Nukleinsäure.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Reihe isolierter Nukleinsäuremoleküle (Polynukleotide), codierend für mRNA, welche neue Spleissvarianten von MC-R1, als MC-R1B-Proteine bezeichnet, exprimiert. Diese DNA-Moleküle umfassen die im folgenden offenbarten Nukleotidsequenzen. 1. MC-R1ESTc11

2. MC-R1ESTC11.6
3. MC-R1ESTc12

4. MC-R1ESTc2
5. MC R1ESTc4

6. MC-R1ESTc5
7. MC-R1ESTc6
8. mc1-3 (genomisch)

9. mc1-3 (offener Leserahmen)

10. mc1-6 (genomisch)
11. mc1-6 (offener Leserahmen)
12. mc1-8 (genomisch)

13. mc1-8 (offener Leserahmen)

14. mc-1-9 (genomisch)
15. mc1-8 (offener Leserahmen)
Die oben beispielhaft dargestellten isolierten DNA-Moleküle codieren für. Polymorphismen von Human-MC-R1B, Klone, die einen offenen Leserahmen, welcher für zusätzliche 65 Aminosäuren codiert (von Rest 318 bis 382; SEQ-ID-Nr. 27), sowie eine Substitution eines Cys-317-Rests für den Trp-317-Rest des MC-R1A-Proteins umfassen. Spezieller repräsentieren SEQ-ID-Nrn. 1, 3, 5, 7, 9, 11 und 13 cDNA-Klone, welche 1149 Nukleotide enthalten, mit einem offenen Leserahmen von Nukleotid 1 bis Nukleotid 1146, mit einem "TAG"-Terminationscodon von den Nukleotiden 1147-1149. Diese offenen Leserahmen codieren für ein humanes MC-R1B-Protein von 382 Aminosäuren Länge, wie in 5A–5F gezeigt und in SEQ-ID-Nr. 2, 4, 6, 8, 10, 12 bzw. 14 dargestellt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch genomische MC-R1B-Klone, die vorausgesagten offenen Leserahmen für diese Klone und das MC-R1B-Protein, das von dem jeweiligen mRNA-Molekül eines jeden genomischen Klons translatiert wird. Diese Patentbeschreibung gibt beispielhaft an, ist jedoch notwendigerweise beschränkt auf, polymorphe MC-R1-Variationen wie sie in mc1-3 (SEQ-ID-Nr. 15), mc1-6 (SEQ-ID-Nr. 18), mc1-6 (SEQ-ID-Nr. 21), mc1-9 (SEQ-ID-Nr. 24) offenbart sind. Diese DNA-Moleküle repräsentieren humane genomische MC-R1B-Klone, welche 1530 Nukleotide enthalten, mit einem Intron von Nukleotid 951-1331 (siehe Beispielsabschnitt 1). Der jeweilige offene Leserahmen eines jeden dieser genomischen Klone ist offenbart in SEQ-ID-Nr. 16 (mc1-3), SEQ-ID-Nr. 19 (mc1-6), SEQ-ID-Nr. 22 (mc1-6) und SEQ-ID-Nr. 25 (mc1-9). Jeder dieser offenen Leserahmen codiert für ein mutmaßliches Protein, umfassend 382 Aminosäuren, wie offenbart in SEQ-ID-Nr. 17 (pro-mc1-3), SEQ-ID-Nr. 20 (pro-mc1-6), SEQ-ID-Nr. 23 (pro-mc1-6) und SEQ-ID-Nr. 25 (pro-mc1-9).
Die vorliegende Erfindung betrifft auch biologisch aktive Fragmente oder Mutanten von MC-R1-Spleissvarianten, codierend für mRNA, die ein neues humanes MC-R1B exprimiert. Jedes solche biologisch aktive Fragment und/oder jede solche Mutante der hier offenbarten MC-R1-Spleissvarianten wird entweder für ein Protein oder ein Proteinfragment codieren, welches mindestens teilweise die pharmakologischen Eigenschaften eines Wildtyp-MC-R1-Proteins nachbildet und mindestens einen Teil der COOH-terminalen Aminosäureverlängerung, offenbart als SEQ-ID-Nr. 27, umfasst. Jedes solches Polynukleotid umfasst, ist jedoch notwendigerweise beschränkt auf, Nukleotidsubstitutionen, -deletionen, -additionen, aminoterminale Verkürzungen und carboxyterminale Verkürzungen, so dass diese Mutationen für mRNA codieren, die ein Protein oder Proteinfragment von diagnostischem, therapeutischem oder prophylaktischem Nutzen exprimiert, und zum Screenen hinsichtlich Agonisten und/oder Antagonisten der MC-R1-Funktion nützlich sein würden.
Ein bevorzugter Aspekt dieses Teils der vorliegenden Erfindung ist dargestellt als SEQ-ID-Nr. 1, SEQ-ID-Nr. 3, SEQ-ID-Nr. 5, SEQ-ID-Nr. 7, SEQ-ID-Nr. 9, SEQ-ID-Nr. 11, SEQ-ID-Nr. 13, SEQ-ID-Nr. 15, SEQ-ID-Nr. 16, SEQ-ID-Nr. 18, SEQ-ID-Nr. 19, SEQ-ID-Nr. 21, SEQ-ID-Nr. 22, SEQ-ID-Nr. 24 und SEQ-ID-Nr. 25, humane Nukleinsäuremoleküle, welche den vollständigen offenen Leserahmen für die MC-R1-Proteine der vorliegenden Erfindung umfassen.
Die isolierten Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung können ein Desoxyribonukleinsäuremolekül (DNA), wie z.B. genomische DNA oder komplementäre DNA (cDNA), welche einzelsträngig (codierender oder nicht-codierender Strang) oder doppelsträngig sein kann, sowie synthetische DNA, wie z.B. ein synthetisiertes einzelsträngiges Polynukleotid, einschließen. Das isolierte Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung kann auch ein Ribonukleinsäuremolekül (RNA) einschließen, insbesondere ein mRNA-Molekül, erzeugt von einem genomischen Klon einer humanen MC-R1-Spleissvariante wie offenbart in mc1-3 (SEQ-ID-Nr. 15), mc1-6 (SEQ-ID-Nr. 18), mc1-6 (SEQ-ID-Nr. 21), mc1-9 (SEQ-ID-Nr. 24) und deren jeweilige offene Leserahmen, SEQ-ID-Nr. 16 (mc1-3), SEQ-ID-Nr. 19 (mc1-6), SEQ-ID-Nr. 22 (mc1-6) und SEQ-ID-Nr. 25 (mc1-9).
Es ist bekannt, dass es ein erhebliche Ausmaß an Redundanz in den verschiedenen Codons gibt, welche für spezielle Aminosäuren codieren. Deshalb betrifft diese Erfindung auch diejenigen DNA-Sequenzen, welche für RNA codieren, die alternative Codons umfassen, welche für die schließliche Translation der identischen Aminosäure codieren, wie im folgenden gezeigt:
A = Ala = Alanin: Codons GCA, GCC, GCG, GCU
C = Cys = Cystein: Codons UGC, UGU
D = Asp = Asparaginsäure: Codons GAC, GAU
E = Glu = Glutaminsäure: Codons GAA, GAG
F = Phe = Phenylalanin: Codons UUC, UUU
G = Gly = Glycin: Codons GGA, GGC, GGG, GGU
H = His = Histidin: Codons CAC, CAU
I = Ile = Isoleucin: Codons AUA, AUC, AUU
K = Lys = Lysin: Codons AAA, AAG
L = Leu = Leucin: Codons UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CUU
M = Met = Methionin: Codon AUG
N = Asp = Asparagin: Codons AAC, AAU
P = Pro = Prolin: Codons CCA, CCC, CCG, CCU
Q = Gln = Glutamin: Codons CAA, CAG
R = Arg = Arginin: Codons AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU
S = Ser = Serin: Codons AGC, AGU, UCA, UCC, UCG, UCU
T = Thr = Threonin: Codons ACA, ACC, ACG, ACU
V = Val = Valin: Codons GUA, GUC GUG, GUU
W = Trp = Tryptophan: Codon UGG
Y = Tyr = Tyrosin: Codons UAC, UAU
Deshalb offenbart die vorliegende Erfindung eine Codon-Redundanz, welche zu unterschiedlichen DNA-Molekülen, die ein identisches Protein exprimieren, führen kann. Für die Zwecke dieser Patentbeschreibung wird eine Sequenz, die einen oder mehrere ersetzte(n) Codons) trägt, als Degenerationsvariante definiert werden. Ebenfalls vom Umfang der Erfindung umfasst sind Mutationen, entweder in der DNA-Sequenz oder dem translatierten Protein, welche die letztlichen physikalischen Eigenschaften des exprimierten Proteins nicht wesentlich ändern. Beispielsweise mag eine Substitution von Leucin durch Valin, Lysin durch Arginin oder Glutamin durch Asparagin keine Änderung der Funktionalität des Polypeptids verursachen.
Es ist bekannt, dass DNA-Sequenzen, die für ein Peptid codieren, verändert werden können, um für ein Peptid mit Eigenschaften zu codieren, welche sich von denjenigen des natürlich vorkommenden Peptids unterscheiden. Verfahren zur Veränderung der DNA-Sequenzen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, stellengerichtete Mutagenese. Beispiele geänderter Eigenschaften umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Veränderungen der Affinität eines Enzyms für ein Substrat oder eines Rezeptors für einen Liganden.
Irgendeines aus einer Vielfalt von Verfahren kann zur Klonierung einer Human-MC-R1-Spleissvariante eingesetzt werden, einschließlich des, jedoch nicht beschränkt auf das, in den Beispielsabschnitten ausgeführte(n) Verfahren(s). Diese Verfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, (1) eine RACE-PCR-Klonierungstechnik (Frohman et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998–9002). 5'- und/oder 3'-RACE kann durchgeführt werden, um eine cDNA-Sequenz voller Länge zu erzeugen. Diese Strategie beinhaltet die Verwendung von genspezifischen Oligonukleotid-Primern für die PCR-Amplifizierung von humaner MC-R1B-cDNA. Diese genspezifischen Primer werden konstruiert durch Identifizierung einer Expressionssequenzmarkierungs („expressed sequence tag"; EST)-Nukleotidsequenz, welche mittels Durchmusterung einer Anzahl öffentlich verfügbarer Nukleinsäure- und Protein-Datenbanken identifiziert wurde; (2) direkte funktionelle Expression der Human-MC-R1B-cDNA nach der Konstruktion einer Human-MC-R1B-enthaltenden cDNA-Bank in einem geeigneten Expressionsvektorsystem; (3) Screenen einer Human-MC-R1B-enthaltenden cDNA-Bank, die in einem Bakteriophagen- oder Plasmid-Shuttle-Vektor konstruiert wurde, mit einer markierten degenerierten Oligonukleotid-Sonde, die anhand der Aminosäuresequenz des humanen MC-R1B-Proteins konstruiert wurde; (4) Screenen einer Human-MC-R1B-enthaltenden cDNA-Bank, die in einem Bakteriophagen- oder Plasmid-Shuttle-Vektor konstruiert wurde, mit einer partiellen cDNA, welche für das humane MC-R1B-Protein codiert. Diese partielle cDNA wird erhalten durch die spezifische PCR-Amplifizierung humaner MC-R1B-DNA-Fragmente durch die Konstruktion degenerierter Oligonukleotid-Primer anhand der Aminosäuresequenz, welche für andere Kinasen bekannt ist, die mit dem humanen MC-R1B-Protein verwandt sind; (5) Screenen einer Human-MC-R1B-enthaltenden cDNA-Bank, die in einem Bakteriophagen- oder Plasmid-Shuttle-Vektor konstruiert wurde, mit einer partiellen cDNA oder einem Oligonukleotid mit Homologie zu einem Säuger-MC-R1B-Protein. Diese Strategie kann auch beinhalten die Verwendung genspezifischer Oligonukleotid-Primer für die PCR-Amplifizierung humaner MC-R1B-cDNA, identifiziert als ein EST wie oben beschrieben; oder (6) Konstruktion von genspezifischen 5'- und 3'-Oligonukleotiden unter Verwendung von SEQ-ID-Nr. 1 als Matrize, so dass entweder die Volllängen-cDNA durch bekannte RACE-Techniken erzeugt werden kann oder ein Teil der codierenden Region mit den selben bekannten RACE-Techniken erzeugt werden kann, um einen Abschnitt der codierenden Region zu erzeugen und zu isolieren, für die Verwendung als Sonde zum Screenen eines von zahlreichen Typen von cDNA-Banken und/oder genomischen Banken, um eine Volllängen-Version der Nukleotidsequenz, welche für humanes MC-R1B codiert, zu isolieren.
Für Fachleute auf dem Gebiet ist unschwer ersichtlich, dass andere Typen von Banken, sowie Banken, die von anderen Zelltypen oder Speziestypen erstellt wurden, zur Isolierung einer für Human-MC-R1B codierenden DNA oder eines Human-MC-R1B-Homologen geeignet sein kann. Andere Typen von Banken schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, cDNA-Banken, die von anderen humanen Zellen erhalten wurden.
Für Fachleute auf dem Gebiet ist auch unschwer ersichtlich, dass geeignete cDNA-Banken aus Zellen oder Zelllinien, die MC-R1B-Aktivität aufweisen, hergestellt werden können. Die Selektion von Zellen oder Zelllinien zur Verwendung bei der Herstellung einer cDNA-Bank, um eine für Human-MC-R1B codierende cDNA zu isolieren, kann erfolgen, indem zuerst die zell-assoziierte MC-R1B-Aktivität unter Verwendung irgendeines für einen solchen Zweck verfügbaren bekannten Assays gemessen wird.
Die Herstellung von cDNA-Banken kann nach im Stand der Technik wohlbekannten Standardverfahren durchgeführt werden. Wohlbekannte Techniken zur Konstruktion einer cDNA-Bank sind beispielsweise in Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, zu finden. Banken komplementärer DNA können auch aus zahlreichen kommerziellen Quellen erhalten werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Clontech Laboratories Inc. und Stratagene.
Es ist auch für Fachleute auf dem Gebiet unschwer ersichtlich, dass DNA, die für Human-MC-R1B codiert, aus einer geeigneten genomischen DNA-Bank isoliert werden kann. Die Konstruktion genomischer DNA-Banken kann nach im Stand der Technik wohlbekannten Standardverfahren durchgeführt werden. Wohlbekannte Techniken zur Konstruktion einer genomischen DNA-Bank sind in Sambrook et al., oben, zu finden.
Zur Klonierung des Human-MC-R1B-Gens mit einem der bevorzugten Verfahren mag die Aminosäuresequenz oder DNA-Sequenz von Human-MC-R1B oder eines homologen Proteins erforderlich sein. Um dies zu erreichen, kann das MC-R1B-Protein oder ein homologes Protein gereinigt und eine partielle Aminosäuresequenz mit automatischen Sequenatoren bestimmt werden. Es ist nicht erforderlich, die vollständige Aminosäuresequenz zu bestimmen, sondern die lineare Sequenz von zwei Regionen von 6 bis 8 Aminosäuren kann für die PCR-Amplifizierung eines partiellen Human-MC-R1B-DNA-Fragments bestimmt werden. Nachdem geeignete Aminosäuresequenzen identifiziert wurden, werden die DNA-Sequenzen, welche in der Lage sind, dafür zu codieren, synthetisiert. Nachdem der genetische Code degeneriert ist, kann mehr als ein Codon für die Codierung einer speziellen Aminosäure verwendet werden und deshalb kann die Aminosäuresequenz von irgendeinem aus einem Satz ähnlicher DNA-Oligonukleotide codiert werden. Nur ein Mitglied des Satzes wird mit der humanen MC-R1B-Sequenz identisch sein, aber andere in dem Satz werden sogar in Anwesenheit von DNA-Oligonukleotiden mit Fehlpaarungen zur Hybridisierung mit Human-MC-R1B-DNA in der Lage sein. Die fehlgepaarten DNA-Oligonukleotide könnten immer noch ausreichend mit der Human-MC-R1B-DNA hybridisieren, um die Identifizierung und Isolierung von für Human-MC-R1B codierender DNA zu erlauben. Alternativ kann die Nukleotidsequenz einer Region einer exprimierten Sequenz mittels Durchsuchung von einer oder mehreren verfügbaren genomischen Datenbanken) identifiziert werden. Genspezifische Primer können zur Durchführung einer PCR-Amplifizierung einer cDNA von Interesse aus entweder einer cDNA-Bank oder einer Population von cDNAs verwendet werden. Eine geeignete Nukleotidsequenz zur Verwendung in einem PCR-basierten Verfahren kann von irgendeiner der hier beschriebenen identifizierten MC-R1B-Spleissvarianten erhalten werden, entweder für den Zweck der Isolierung überlappender 5'- und 3'-RACE-Produkte zur Erzeugung einer Volllängen-Sequenz, die für Human-MC-R1B codiert, oder zur Isolierung eines Abschnitts der Nukleotidsequenz, welche für Human-MC-R1B codiert, zur Verwendung als Sonde, um eine oder mehrere cDNA-Banken) oder genomische Banken) zu screenen, um eine Volllängen-Sequenz, codierend für Human-MC-R1B oder Human-MC-R1B-ähnliche Proteine, zu isolieren.
Von der vorliegenden Erfindung umfasst werden DNA-Sequenzen, welche mit den Nukleotidsequenzen der verschiedenen beschriebenen MC-R1B-Spleissvarianten (d.h. SEQ-ID-Nr. 1, SEQ-ID-Nr. 3, SEQ-ID-Nr. 5, SEQ-ID-Nr. 7, SEQ-ID-Nr. 9, SEQ-ID-Nr. 11, SEQ-ID-Nr. 13, SEQ-ID-Nr. 15, SEQ-ID-Nr. 16, SEQ-ID-Nr. 18, SEQ-ID-Nr. 19, SEQ-ID-Nr. 21, SEQ-ID-Nr. 22, SEQ-ID-Nr. 24 und SEQ-ID-Nr. 25) unter stringenten Bedingungen hybridisieren. Ein Beispiel und keine Beschränkung ist ein Verfahren unter Verwendung von Bedingungen hoher Stringenz wie folgt: Eine Vorhybridisierung von Filtern, die DNA enthalten, wird 2 h lang bis über Nacht bei 65°C in einem Puffer durchgeführt, der aus 6 × SSC, 5 × Denhardts Lösung und 100 μg/ml denaturierter Lachssperma-DNA besteht. Die Filter werden 12 bis 48 h lang bei 65°C in einer Vorhybridisierungsmischung hybridisiert, die 100 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA und 5–20 × 10⁶ CpM an ³²P-markierter Sonde enthält. Das Waschen der Filter erfolgt bei 37°C für 1 h in einer Lösung, die 2 × SSC, 0,1 % SDS enthält. Dem folgt ein Waschschritt in 0,1 × SSC, 0,1 % SDS bei 50°C für 45 Minuten vor der Autoradiographie. Andere Verfahren unter Verwendung von Bedingungen hoher Stringenz würden entweder einen Hybridisierungsschritt, der in 5 × SSC, 5 × Denhardts Lösung, 50 % Formamid bei 42°C für 12 bis 48 h lang durchgeführt wird, oder einen Waschschritt, der in 0,2 × SSPE, 0,2 % SDS bei 65°C für 30 bis 60 Minuten durchgeführt wird, beinhalten.
Reagenzien, die in den vorstehenden Verfahren zur Durchführung einer hochstringenten Hybridisierung genannt sind, sind im Stand der Technik wohlbekannt. Details der Zusammensetzung dieser Reagenzien sind in beispielsweise Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, zu finden. Neben den obigen sind andere Bedingungen hoher Stringenz, welche verwendet werden können, im Stand der Technik wohlbekannt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch im Wesentlichen gereinigte Formen des Human-MC-R1B-Proteins, welche die in 5A–5F offenbarten und in SEQ-ID-Nr. 2, SEQ-ID-Nr. 4, SEQ-ID-Nr. 6, SEQ-ID-Nr. 8, SEQ-ID-Nr. 10, SEQ-ID-Nr. 12, SEQ-ID-Nr. 14, SEQ-ID-Nr. 17, SEQ-ID-Nr. 20, SEQ-ID-Nr. 23 und SEQ-ID-Nr. 26 angegebenen Aminosäuresequenzen umfassen. Diese MC-R1-Proteine umfassen eine 65-Aminosäuren-Verlängerung am COOH-Terminus im Vergleich zu bekanntem humanen MC-R1 und werden in dieser Patentbeschreibung durchgehend als MC-R1B-Proteine bezeichnet. Die beispielhaften Aminosäuresequenzen sind im folgenden aufgelistet: 1. MC-R1ESTc11
2. MC-R1ESTC11.6
3. MC-R1ESTc12
4. MC-R1ESTc2
5. MC R1ESTc4
6. MC-R1ESTc5
7. MC-R1ESTc6
8. pro mc1-3
9. pro mc1-6
10. pro mc1-8
11. pro mc-1-9
wobei M = Met (Methionin), F = Phe (Phenylalanin), L = Leu (Leucin), 1 = Ile (Isoleucin), V = Val (Valin), S = Ser (Serin), P = Pro (Prolin), T = Thr (Threonin), A = Ala (Alanin), Y = Tyr (Tyrosin), H = His (Histidin), Q = Gln (Glutamin), N = Asn (Asparagin), K = Lys (Lysin), D = Asp (Asparaginsäure), E = Glu (Glutaminsäure), C = Cys (Cystein), W = Trp (Tryptophan), R = Arg (Arginin) und G = Gly (Glycin).
Diese MC-R1B-Proteine umfassen eine 65 Aminosäuren lange Verlängerung am COOH-Terminus im Vergleich zu bekanntem Human-MC-R1 und werden in dieser Patentbeschreibung durchgehend als MC-R1B-Proteine bezeichnet. Spezieller ist der Aminosäurerest 317 der MC-R1B-Proteine Cys, wohingegen der COOH-terminale Aminosäurerest 317 von bekannten MC-R1A-Proteinen Trp ist. Von Aminosäurerest 318 bis zu der COOH-terminalen Aminosäure bei 382 der hier offenbarten MC-R1B-Proteine ist die Aminosäuresequenz wie in SEQ-ID-Nr. 27 angegeben, wie nachstehend gezeigt:
SQD RALVSWDVKS LGGSVCQELL PQQPQEKGLC DQKASSTALQ RLLQKEVKSL PQAKGPGLQE PP (SEQ-ID-Nr. 27).
Die vorliegende Erfindung betrifft auch biologisch aktive Fragmente und/oder Mutanten dieser Human-MC-R1B-Proteine, umfassend die als SEQ-ID-Nr. 2 angegebene Aminosäuresequenz, einschließlich, jedoch nicht notwendigerweise beschränkt auf, Aminosäuresubstitutionen, -deletionen, -additionen, aminoterminale Verkürzungen und carboxyterminale Verkürzungen, so dass diese Mutationen Proteine oder Proteinfragmente von diagnostischem, therapeutischem oder prophylaktischem Nutzen ergeben und zum Screenen hinsichtlich Agonisten und/oder Antagonisten der MC-R1B-Funktion geeignet sein würden.
Verschiedene bevorzugte Aspekte der Erfindung repräsentieren Human-MC-R1B-Proteine wie in 5A–5F offenbart und angegeben als SEQ-ID-Nr. 2, SEQ-ID-Nr. 4, SEQ-ID-Nr. 6, SEQ-ID-Nr. 8, SEQ-ID-Nr. 10, SEQ-ID-Nr. 12, SEQ-ID-Nr. 14, SEQ-ID-Nr. 17, SEQ-ID-Nr. 20, SEQ-ID-Nr. 23 und SEQ-ID-Nr. 26, von denen alle die 65 Aminosäuren lange COOH-terminale Verlängerung wie in SEQ-ID-Nr. 27 angegeben umfassen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch modifizierte MC-R1B-Polypeptide, welche Aminosäuredeletionen, -additionen oder -substitutionen aufweisen, aber immer noch im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie MC-R1B behalten. Es ist allgemein akzeptiert, dass einzelne Aminosäuresubstitutionen üblicherweise nicht die biologische Aktivität eines Proteins ändern (siehe z. B. Molecular Biology of the Gene, Watson et al., 1987, 4. Auflage, The Benjamini/Cummings Publishing Co., Inc., S. 26, und Cunningham & Wells, 1989, Science 244: 1081–1085). Dementsprechend umfasst die vorliegende Erfindung isolierte Nukleinsäuremoleküle und exprimierte MC-R1B-Proteine, wobei eine Aminosäuresubstitution erzeugt wird und dieses Protein im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie Wildtyp-MC-R1B behält. Die vorliegende Erfindung umfasst auch isolierte Nukleinsäuremoleküle und exprimierte MC-R1B-Proteine, wobei zwei oder mehr Aminosäuresubstitutionen erzeugt werden, wobei dieses Protein im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie Wildtyp-MC-R1B behält. Insbesondere umfasst die vorliegende Erfindung Ausführungs-formen, bei denen die oben beschriebenen Substitutionen konservative Substitutionen sind. Insbesondere umfasst die vorliegende Erfindung Ausführungsformen, bei denen die oben beschriebenen Substitutionen nicht in der liganden-bindenden Domäne von MC-R1B stattfinden.
Nach der Expression von MC-R1B in einer Wirtszelle kann MC-R1B-Protein gewonnen werden, um MC-R1B-Protein in aktiver Form bereit zu stellen. Mehrere MC-R1B-Protein-Reinigungsverfahren sind verfügbar und für die Anwendung geeignet. Rekombinantes MC-R1B-Protein kann aus Zelllysaten und -extrakten durch verschiedene Kombinationen von oder individuelle Anwendung von Salzfraktionierung, Ionenaustauschchromatographie, Größenausschlusschromatographie, Hydroxylapatit-Adsorptionschromatographie und Chromatographie mit hydrophober Wechselwirkung gereinigt werden. Darüber hinaus kann rekombinantes MC-R1B-Protein von anderen zellulären Proteinen mit Hilfe einer Immunaffinitätssäule, die mit monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern, spezifisch für Volllängen-MC-R1B-Protein oder Polypeptidfragmente von MC-R1B-Protein, hergestellt wurde, abgetrennt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche Fusionskonstrukte sind, die Fusionsproteine exprimieren, von Nutzen in Assays zur Identifizierung von Verbindungen, welche Wildtyp-Vertebraten-MC-R1B-Aktivität modulieren. Ein Aspekt dieses Teils der Erfindung umfasst, ist jedoch nicht beschränkt auf, Glutathion S-Transferase (GST)-MC-R1B-Fusionskonstrukte, welche einschließen, jedoch nicht beschränkt sind auf, entweder die intrazelluläre Domäne von MC-R1B als Fusion im Leserahmen am Carboxyterminus des GST-Gens oder die extrazelluläre und Transmembran-Ligandenbindungsdomäne von MC-R1B, fusioniert an GST oder ein Immunglobulin-Gen nach Verfahren, die einem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet bekannt sind. Rekombinante GST-MC-R1B-Fusionsproteine können in verschiedenen Expressionssystemen, einschließlich Spodoptera frugiperda (Sf21)-Insektenzellen (Invitrogen) unter Verwendung eines Baculovirus-Expressionsvektors (pAcG2T, Pharmingen), exprimiert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch subzelluläre Membranfraktionen von den rekombinanten Wirtszellen (sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Zellen und sowohl stabil als auch transient transformierte Zellen), welche die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung enthalten. Diese subzellulären Membranfraktionen werden entweder Wildtyp- oder Mutantenformen von MC-R1B-Proteinen auf Niveaus umfassen, welche wesentlich über den endogenen Niveaus liegen, und somit in verschiedenen Assays, die in dieser Patentbeschreibung beschrieben werden, von Nutzen sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch rekombinante Vektoren und rekombinante Wirte, sowohl prokaryotisch als auch eukaryotisch, welche die in dieser Patentbeschreibung offenbarten, im wesentlichen gereinigten Nukleinsäuremoleküle enthalten. Die Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung, für partielle oder vollständige MC-R1B-Spleissvarianten codierend, können mit anderen DNA-Molekülen, d.h. DNA-Molekülen, mit denen die MC-R1B natürlicherweise nicht verknüpft sind, verknüpft sein, um "rekombinante DNA-Moleküle" zu bilden, welche den Rezeptor enthalten. Die neuen DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung können in Vektoren eingeführt werden, welche Nukleinsäuren umfassen, die für ein MC-R1B oder ein funktionelles Äquivalent codieren. Diese Vektoren können DNA oder RNA umfassen; für die meisten Klonierungszwecke sind DNA-Vektoren bevorzugt. Typische Vektoren umfassen Plasmide, modifizierte Viren, Bakteriophagen und Cosmide, künstliche Hefechromosomen und andere Formen von episomaler oder integrierter DNA, welche für ein MC-R1B codieren können. Es liegt ohne weiteres innerhalb der Fähigkeiten des Durchschnittsfachmanns, einen geeigneten Vektor für einen speziellen Gentransfer oder eine andere Verwendung zu bestimmen.
Diesbezüglich umfasst die vorliegende Erfindung auch Vektoren, die ein MC-R1B-Gen enthalten, Wirtszellen, welche die Vektoren enthalten, und Verfahren zur Herstellung von im Wesentlichen reinem MC-R1B-Protein, umfassend die Schritte der Einführung des MC-R1B-Gens in eine Wirtszelle und Kultivierung der Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen, so dass MC-R1B hergestellt wird. Das so hergestellte MC-R1B kann aus den Wirtszellen auf üblichen Wegen geerntet werden. Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung auch Verfahren zur Expression des MC-R1B-Proteins und hier offenbarter biologischer Äquivalente, Assays unter Verwendung dieser Genprodukte, rekombinante Wirtszellen, die DNA-Konstrukte umfassen, welche diese Rezeptorproteine exprimieren, und Verbindungen, die mittels dieser Assays identifiziert wurden, welche als Agonisten oder Antagonisten von MC-R1B-Aktivität fungieren.
Die klonierte MC-R1B-cDNA, welche mit den oben beschriebenen Verfahren erhalten wurde, kann durch molekulare Klonierung in einen Expressionsvektor (z.B. pcDNA3.neo, pcDNA3.1, pCR2.1, pBlueBacHis2 oder pLITMUS28), enthaltend einen geeigneten Promotor und andere geeignete regulatorische Transkriptionselemente, rekombinant exprimiert und in prokaryotische oder eukaryotische Wirtszellen transferiert werden, um rekombinantes MC-R1B zu produzieren. Techniken für solche Manipulationen sind in Sambrook et al., oben, beschrieben zu finden, sind ausführlich im Beispielsabschnitt erörtert und wohlbekannt und für den Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet unschwer verfügbar.
Eine Vielzahl von Säuger-Expressionsvektoren kann zur Expression von rekombinantem MC-R1B in Säugerzellen verwendet werden. Expressionsvektoren sind hier definiert als DNA-Sequenzen, welche für die Transkription klonierten DNA und die Translation ihrer mRNAs in einem geeigneten Wirt erforderlich sind. Solche Vektoren können zur Expression von eukaryotischer DNA in einer Vielfalt von Wirten, wie z.B. Bakterien, blaugrünen Algen, Pflanzenzellen, Insektenzellen und Tierzellen, verwendet werden. Speziell konstruierte Vektoren erlauben das Shuttling von DNA zwischen Wirten wie Bakterien-Hefe oder Bakterien-Tierzellen. Ein geeignet konstruierter Expressionsvektor sollte enthalten: einen Replikationsursprung für autonome Replikation in Wirtszellen, selektierbare Marker, eine begrenzte Anzahl geeigneter Restriktionsenzymstellen, ein Potential für eine hohe Kopienzahl und aktive Promotoren. Ein Promotor ist definiert als eine DNA-Sequenz, welche RNA-Polymerase zur Bindung an DNA und zur Initiierung von RNA-Synthese veranlasst. Ein starker Promotor ist einer, welcher die Initiierung von mRNAs mit hoher Frequenz veranlasst. Expressionsvektoren können einschließen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Klonierungsvektoren, modifizierte Klonierungsvektoren, speziell konstruierte Plasmide oder Viren. Im Handel erhältliche Säuger-Expressionsvektoren, welche für die rekombinante MC-R1B-Expression geeignet sein mögen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, pcDNA3.neo (Invitrogen), pcDNA3.1 (Invitrogen), pCl-neo (Promega), pLITMUS28, pLITMUS29, pLITMUS38 und pLITMUS39 (New England Biolabs), pcDNAl, pcDNAlamp (Invitrogen), pcDNA3 (Invitrogen), pMC1neo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) und IZD35 (ATCC 37565).
Auch eine Vielzahl bakterieller Expressionsvektoren kann zur Expression von rekombinantem MC-R1B in Bakterienzellen verwendet werden. Im Handel erhältliche bakterielle Expressionsvektoren, welche für die rekombinante MC-R1B-Expression geeignet sein mögen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, pCR2.1 (Invitrogen), pET11a (Novagen), Lambda gt11 (Invitrogen) und pKK223-3 (Pharmacia).
Darüber hinaus kann eine Vielfalt von Pilzzell-Expressionsvektoren zur Expression von rekombinantem MC-R1B in Pilzzellen verwendet werden. Im Handel erhältliche Pilzzell-Expressionsvektoren, welche für die rekombinante MC-R1B-Expression geeignet sein mögen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, pYES2 (Invitrogen) und Pichia-Expressionsvektor (Invitrogen).
Auch eine Vielfalt von Insektenzell-Expressionsvektoren kann zur Expression von rekombinantem Rezeptor in Insektenzellen verwendet werden. Im Handel erhältliche Insektenzell-Expressionsvektoren, welche für die rekombinante Expression von MC-R1B geeignet sein mögen, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, pBlueBacIII und pBlueBacHis2 (Invitrogen) und pAcG2T (Pharmingen).
Die Expression von MC-R1B-DNA kann auch unter Verwendung von in vitro hergestellter synthetischer mRNA durchgeführt werden. Synthetische mRNA kann effizient in verschiedenen zellfreien Systemen translatiert werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Weizenkeimextrakte und Retikulozytenextrakte, sowie effizient in zellbasierten Systemen translatiert werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Mikroinjektion in Froschoozyten, wobei die Mikroinjektion in Froschoozyten bevorzugt ist.
Zur Feststellung der MC-R1B-cDNA-Sequenz(en), welche optimale Niveaus an MC-R1B ergibt/ergeben, können cDNA-Moleküle, welche das folgende einschließen, jedoch nicht darauf beschränkt sind, konstruiert werden: ein cDNA-Fragment, enthaltend den vollständigen offenen Leserahmen für MC-R1B, sowie verschiedene Konstrukte, welche Abschnitte der cDNA enthalten, die nur für spezifische Domänen des Proteins oder umgelagerte Domänen des Proteins codieren. Alle Konstrukte können so konstruiert werden, dass sie die Gesamtheit, Teile der 5'- und/oder 3'-untranslatierten Region einer MC-R1B-cDNA oder nichts davon enthalten. Die Expressionsniveaus und Aktivität von MC-R1B können nach der Einführung, sowohl einzeln als auch in Kombination, dieser Konstrukte in geeignete Wirtszellen bestimmt werden. Nach der Bestimmung der MC-R1B-cDNA-Kassette, welche optimale Expression in transienten Assays ergibt, wird dieses MC-R1B-cDNA-Konstrukt in eine Vielfalt von Expressionsvektoren (einschließlich rekombinanter Viren), einschließlich derjenigen, jedoch nicht beschränkt auf diejenigen, für Säugerzellen, Pflanzenzellen, Insektenzellen, Oozyten, Bakterien und Hefezellen, überführt.
Deshalb umfasst ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung Wirtszellen, welche so manipuliert wurden, dass sie DNA-Sequenzen, codierend für das MC-R1B, enthalten und/oder exprimieren. Solche rekombinanten Wirtszellen können unter geeigneten Bedingungen kultiviert werden, um MC-R1B oder eine biologisch äquivalente Form herzustellen. Rekombinante Wirtszellen können prokaryotisch oder eukaryotisch sein, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Bakterien wie E. coli, Pilzzellen wie Hefe, Säugerzellen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Zelllinien, die von Menschen, Rindern, Schweinen, Affen und Nagern stammen, und Insektenzellen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, von Drosophila und Seidenraupe abgeleitete Zelllinien. Deshalb kann ein Expressionsvektor, der für ein MC-R1B-ähnliches Protein codierende DNA enthält, zur Expression von MC-R1B in einer rekombinanten Wirtszelle verwendet werden. Rekombinante Wirtszellen können prokaryotisch oder eukaryotisch sein, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Bakterien wie E. coli, Pilzzellen wie z.B. Hefe, Säugerzellen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Zelllinien die von Menschen, Rindern, Schweinen, Affen und Nagern stammen, und Insektenzellen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, von Drosophila und der Seidenraupe abgeleitete Zelllinien. Beispielsweise verwendet ein Insektenexpressionssystem Spodoptera frugiperda (Sf21)-Insektenzellen (Invitrogen) zusammen mit einem Baculovirus-Expressionsvektor (pAcG2T, Pharmingen). Säugerspezies, welche geeignet sein mögen und im Handel erhältlich sind, schließen auch ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, L-M(TK-)-L-Zellen (ATCC CCL 1.3), L-M-L-Zellen (ATCC CCL 1.2), Saos-2 (ATCC HTB-85), 293 (ATCC CRL 1573), Raji (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26), MRC-5 (ATCC CCL 171) und CPAE (ATCC CCL 209). Der Expressionsvektor kann mit irgendeinem einer Vielfalt von Verfahren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Transformation, Transfektion, Protoplastenfusion und Elektroporation, in Wirtszellen eingeführt werden. Die Expressionsvektor enthaltenden Zellen werden individuell analysiert, um festzustellen, ob sie MC-R1B-Protein produzieren. Die Identifizierung von MC-R1B-exprimierenden Zellen kann auf verschiedene Weise erfolgen, einschließlich der, jedoch nicht beschränkt auf die, immunologische(n) Reaktivität mit Anti-MC-R1B-Antikörpern, Bindung eines markierten Liganden und Anwesenheit von wirtszell-assoziierter MC-R1B-Aktivität.
Die hier beschriebenen Assays sowie Proteinreinigungsschemata können mit Zellen durchgeführt werden, die mit einem Expressionsvektor, welcher die Expression von MC-R1B steuert, transient oder stabil transfiziert oder transformiert wurden. Der Expressionsvektor kann mittels irgendeinem einer Vielfalt von Verfahren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Transformation, Transfektion, Protoplastenfusion und Elektroporation, in Wirtszellen eingeführt werden. Transformation soll eine genetische Veränderung der Zielzelle umfassen, welche das Ergebnis einer Inkorporation von DNA ist. Transfektion soll jedes Verfahren einschließen, das im Stand der Technik zur Einführung von MC-R1B in die Testzellen bekannt ist. Beispielsweise umfasst Transfektion durch Calciumphosphat oder Calciumchlorid vermittelte Transfektion, Lipofektion, Infektion mit einem retroviralen Konstrukt, das MC-R1B enthält, und Elektroporation. Die Expressionsvektor enthaltenden Zellen werden individuell analysiert, um festzustellen, ob sie humanes MC-R1B-Protein produzieren. Die Identifizierung von Human-MC-R1B-exprimierenden Zellen kann auf verschiedene Weise erfolgen, einschließlich der, jedoch nicht beschränkt auf die, immunologische(n) Reaktivität mit Anti-Human-MC-R1B-Antikörpern, Bindung eines markierten Liganden und Anwesenheit von wirtszell-assoziierter Human-MC-R1B-Aktivität.
Die Spezifität der Bindung von Verbindungen, welche Affinität für MC-R1B zeigen, wird demonstriert durch Messung der Affinität der Verbindungen für rekombinante Zellen, welche den klonierten Rezeptor exprimieren, oder für Membranen aus diesen Zellen. Die Expression des klonierten Rezeptors und das Screenen hinsichtlich Verbindungen, welche an MC-R1B binden oder die Bindung eines bekannten radioaktiv markierten Liganden von MC-R1B an diese Zellen oder aus diesen Zellen hergestellte Membranen inhibieren, stellt ein effektives Verfahren für die schnelle Selektion von Verbindungen mit hoher Affinität für MC-R1B dar. Solche Liganden müssen nicht notwendigerweise radioaktiv markiert sein, können jedoch auch nicht-isotope Verbindungen sein, welche zur Verdrängung von gebundenen radioaktiv markierten Verbindungen verwendet werden können oder als Aktivatoren in funktionellen Assays verwendet werden können. Verbindungen, welche mit dem obigen Verfahren identifiziert wurden, sind wahrscheinlich Agonisten oder Antagonisten von MC-R1B und können Peptide, Proteine oder nicht-proteinhaltige organische Moleküle sein.
Melanocortin-Rezeptoren gehören zu der Odopsin-Subfamilie von GPCRs. Jedoch werden mehrere Merkmale in den MC-R1B von allen anderen Rezeptoren geteilt und fehlen in den meisten anderen GPCRs, einschließlich des EN-Motivs in TM1, des Fehlens von Cys in der Schleife zwischen TM2 und TM3 oder zwischen TM4 und TM5, des MxxxxxxxY-Motivs in TM5 und des DPxxY-Motivs in TM7. Nachdem allen Melanocortin-Rezeptoren Cys-Reste in den extrazellulären Schleifen fehlen, die bei anderen Mitgliedern der Odopsin-Subfamilie vorhanden sind, kann eine interhelikale Disulfid-Bindung (z.B. zwischen den Cys-Resten in der Nähe des oberen Endes von TM3 und TM5) die gleiche Funktion haben wie die Interschleifen-Disulfid-Bindung in den meisten anderen GPCR. Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zum Screenen hinsichtlich von Verbindungen, welche die Expression von DNA oder RNA, codierend für ein MC-R1B-Protein, modulieren, sowie hinsichtlich Verbindungen, welche die Funktion des MC-R1B-Proteins beeinflussen. Verfahren zur Identifizierung von Agonisten und Antagonisten anderer Rezeptoren sind im Stand der Technik wohlbekannt und können zur Identifizierung von Agonisten und Antagonisten von MC-R1B adaptiert werden. Beispielsweise beschreiben Cascieri et al. (1992, Molec. Pharmacol. 41: 1096–1099) ein Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, welche die Agonistenbindung an Ratten-Neurokinin-Rezeptoren inhibieren und somit potentielle Agonisten oder Antagonisten von Neurokinin-Rezeptoren sind. Das Verfahren beinhaltet die Transfektion von COS-Zellen mit Expressionsvektoren, welche Ratten-Neurokinin-Rezeptoren enthalten, Wachsen lassen der transfizierten Zellen für eine ausreichende Zeit, um den Neurokinin-Rezeptoren die Expression zu ermöglichen, Ernten der transfizierten Zellen und Resuspendieren der Zellen in Assaypuffer, der einen bekannten radioaktiv markierten Agonisten der Neurokinin-Rezeptoren enthält, entweder in Anwesenheit oder Abwesenheit der Substanz, und anschließendes Messen der Bindung des radioaktiv markierten bekannten Agonisten des Neurokinin-Rezeptors an den Neurokinin-Rezeptor. Falls das Ausmaß der Bindung des bekannten Agonisten in Anwesenheit der Substanz geringer ist als in Abwesenheit der Substanz, dann ist die Substanz ein potentieller Agonist oder Antagonist des Neurokinin-Rezeptors. Wenn die Bindung der Substanz, wie z.B. eines Agonisten oder Antagonisten, an MC-R1B gemessen wird, kann eine solche Bindung durch Einsatz einer markierten Substanz oder eines markierten Agonisten gemessen werden. Die Substanz oder der Agonist können in irgendeiner im Stand der Technik bekannten günstigen Weise markiert sein, z.B. radioaktiv, fluoreszent, enzymatisch.
Deshalb wird die Spezifität der Bindung von Verbindungen, welche Affinität für MC-R1B aufweisen, durch Messen der Affinität der Verbindungen für rekombinante Zellen, welche den klonierten Rezeptor exprimieren, oder für Membranen von diesen Zellen gezeigt. Die Expression des klonierten Rezeptors und das Screenen hinsichtlich Verbindungen, welche an MC-R1B binden oder die Bindung eines bekannten radioaktiv markierten Liganden von MC-R1B an diese Zellen oder aus diesen Zellen hergestellte Membranen inhibieren, bietet ein effektives Verfahren zur schnellen Selektion von Verbindungen mit hoher Affinität für MC-R1B. Solche Liganden müssen nicht notwendigerweise radioaktiv markiert sein, sondern können auch nicht-isotope Verbindungen sein, welche zur Verdrängung von gebundenen radioaktiv markierten Verbindungen eingesetzt werden können oder als Aktivatoren in funktionellen Assays eingesetzt werden können. Verbindungen, welche mit dem obigen Verfahren identifiziert wurden, sind wahrscheinlich Agonisten oder Antagonisten von MC-R1B und können Peptide, Proteine oder nicht-proteinhaltige organische Moleküle sein. Verbindungen können durch Erhöhung oder Abschwächung der Expression von DNA oder RNA, die für MC-R1B codiert, oder durch die Funktion als Agonist oder Antagonist des MC-R1B-Rezeptorproteins modulieren. Diese Verbindungen, welche die Expression von für MC-R1B codierender DNA oder RNA oder dessen biologische Funktion modulieren, können mit einer Vielfalt von Assays nachgewiesen werden. Der Assay kann ein einfacher "Ja/Nein"-Assay sein, um festzustellen, ob es eine Änderung der Expression oder Funktion gibt. Der Assay kann durch Vergleichen der Expression oder Funktion einer Testprobe mit den Niveaus an Expression oder Funktion in einer Standardprobe quantitativ gemacht werden. Kits, enthaltend MC-R1B, Antikörper gegen MC-R1B oder modifiziertes MC-R1B, können nach bekannten Verfahren für solche Anwendungen hergestellt werden.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Expression von MC-R1B in rekombinanten Systemen und zur Identifizierung von Agonisten und Antagonisten von MC-R1B. Wenn Verbindungen gescreent werden, um potentielle Pharmazeutika zu identifizieren, welche speziell mit einem Ziel-Rezeptor wechselwirken, ist es erforderlich sicherzustellen, dass die identifizierten Verbindungen so spezifisch wie möglich für den Zielrezeptor sind. Um dies zu erreichen, ist es erforderlich, die Verbindungen gegen eine so umfangreiche Anordnung von Rezeptoren, welche dem Zielrezeptor ähnlich sind, wie möglich zu screenen. Somit ist es zum Auffinden von Verbindungen, welche potentielle Pharmazeutika sind, die mit dem Rezeptor A wechselwirken, erforderlich, nicht nur sicherzustellen, dass die Verbindungen mit Rezeptor A (dem "Plus-Target") wechselwirken und die gewünschte pharmakologische Wirkung durch den Rezeptor A hervorrufen, es ist auch erforderlich festzustellen, dass die Verbindungen nicht mit den Rezeptoren B, C, D etc. (den "Minus-Targets") wechselwirken.
Im Allgemeinen ist es als Teil eines Screeningprogramms wichtig, so viele Minus-Targets wie möglich zu haben (siehe Hodgson, 1992, Bio/Technology 10: 973–980, @ 980). MC-R1B-Proteine und die DNA-Moleküle, welche für dieses Rezeptorprotein codieren, haben die zusätzliche Anwendungsmöglichkeit, dass sie als "Minus-Targets" in Screenings verwendet werden können, welche dazu gestaltet sind, Verbindungen zu identifizieren, die speziell mit anderen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren wechselwirken. Aufgrund der Homologie mit GPCRs wird angenommen, dass der MC-R1B dieser Erfindung ähnlich wie GPCRs funktioniert und eine ähnliche biologische Aktivität aufweist. Sie sind von Nutzen beim Verständnis der biologischen und physiologischen Wirkungen und zur Untersuchung von melanocortin-aktiven Verbindungen in Primaten, gefolgt von klinischen Versuchen an Menschen. Insbesondere werden MC-R1B-Agonisten identifiziert und hinsichtlich ihrer Wirkungen auf die Nahrungsaufnahme, Gewichtszunahme und Stoffwechselrate beurteilt werden, um neue Mittel gegen Obesität zu identifizieren, welche bei Primaten wirksam sind. Sie können auch zum Scannen hinsichtlich Affen-Melanocortin-Agonisten und -Antagonisten verwendet werden, insbesondere zum Testen der Spezifität von identifizierten Liganden.
Diesbezüglich betrifft die vorliegende Erfindung teilweise Verfahren zur Identifizierung einer Substanz, welche MC-R1B-Rezeptoraktivität moduliert, umfassend:

(a) Kombinieren einer Testsubstanz in Anwesenheit und Abwesenheit eines MC-R1B-Rezeptorproteins, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, die MC-R1B-Proteine, welche die in SEQ-ID-Nr. 2, SEQ-ID-Nr. 4, SEQ-ID-Nr. 6, SEQ-ID-Nr. 8, SEQ-ID-Nr. 10, SEQ-ID-Nr. 12, SEQ-ID-Nr. 14, SEQ-ID-Nr. 17, SEQ-ID-Nr. 20, SEQ-ID-Nr. 23 und SEQ-ID-Nr. 26 angegebene Aminosäuresequenz umfassen; und
(b) Messen und Vergleichen der Wirkung der Testsubstanz in Anwesenheit und Abwesenheit des MC-R1B-Rezeptorproteins.

Darüber hinaus sind hier mehrere spezifische Ausführungsformen offenbart, um die verschiedenen Typen von Screening- oder Selektions-Assays zu zeigen, die der geschulte Fachmann zusammen mit einem Expressionsvektor, welcher die Expression des MC-R1B-Rezeptorproteins steuert, einsetzen kann. Verfahren zur Identifizierung von Agonisten und Antagonisten anderer Rezeptoren sind im Stand der Technik wohlbekannt und können zur Identifizierung von Agonisten und Antagonisten von MC-R1B adaptiert werden. Deshalb werden diese Ausführungsformen als Beispiele präsentiert und nicht als Beschränkungen. Diesbezüglich umfasst die vorliegende Erfindung Assays, mit denen MC-R1B-Modulatoren (wie z.B. Agonisten und Antagonisten) identifiziert werden können. Dementsprechend umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Feststellung, ob eine Substanz ein potentieller Agonist oder Antagonist von MC-R1B ist, welches umfasst:

(a) Transfizieren oder Transformieren von Zellen mit einem Expressionsvektor, der die Expression von MC-R1B in den Zellen steuert, welches Testzellen ergibt;
(b) Wachsen lassen der Testzellen für einen ausreichenden Zeitraum, um die Expression von MC-R1B zu erlauben;
(c) Aussetzen der Zellen einem markierten Liganden von MC-R1B in Anwesenheit und Abwesenheit der Substanz;
(d) Messen der Bindung des markierten Liganden an MC-R1B; wobei die Substanz einer potentieller Agonist oder Antagonist von MC-R1B ist, wenn das Ausmaß der Bindung des markierten Liganden in Anwesenheit der Substanz geringer ist als in Abwesenheit der Substanz.

Die Bedingungen unter denen Schritt (c) des Verfahrens durchgeführt wird, sind Bedingungen, welche typischerweise auf dem Gebiet zur Untersuchung von Protein-Ligand-Wechselwirkungen verwendet werden: z.B. physiologischer pH-Wert, Salzbedingungen wie diejenigen, welche von solchen allgemein eingesetzten Puffern wie PBS repräsentiert werden, oder in Gewebekulturmedien; eine Temperatur von etwa 4°C bis etwa 55°C. Die Testzellen können geerntet und in Gegenwart der Substanz und des markierten Liganden resuspendiert werden. Bei einer Modifizierung des oben beschrieben Verfahrens wird Schritt (c) insofern modifiziert, als die Zellen nicht geerntet und resuspendiert werden, sondern vielmehr der radioaktiv markierte bekannte Agonist und die Substanz mit den Zellen kontaktiert werden, während die Zellen an einem Substrat, z.B. Gewebekulturplatten, haften.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Feststellung, ob eine Substanz zur Bindung an MC-R1B in der Lage ist, d.h., ob die Substanz ein potentieller Agonist oder Antagonist von MC-R1B ist, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Transfizieren oder Transformieren von Zellen mit einem Expressionsvektor, welcher die Expression von MC-R1B in den Zellen steuert, welches Testzellen ergibt;
(b) Aussetzen der Testzellen der Substanz;
(c) Messen des Ausmaßes der Bindung der Substanz an MC-R1B;
(d) Vergleichen des Ausmaßes der Bindung der Substanz an MC-R1B in den Testzellen mit dem Ausmaß der Bindung der Substanz an Kontrollzellen, die nicht mit MC-R1B transfiziert wurden;

Die Feststellung, ob die Substanz tatsächlich ein Agonist oder Antagonist ist, kann dann mit Hilfe funktioneller Assays erfolgen, wie z.B. dem unten beschriebenen Assay, der die Verwendung von promiskuitiven G-Proteinen, beinhaltet.
Die Bedingungen, unter denen Schritt (b) des Verfahrens durchgeführt wird, sind Bedingungen, die typischerweise auf dem Gebiet zur Untersuchung von Protein-Ligand-Wechselwirkungen eingesetzt werden: z.B. physiologischer pH-Wert; Salzbedingungen, wie z.B. diejenigen, welche von solchen allgemein eingesetzten Puffern wie PBS repräsentiert werden, oder in Gewebekulturmedien; eine Temperatur von etwa 4°C bis etwa 55°C. Die Testzellen werden geerntet und in Anwesenheit der Substanz resuspendiert.
Chen et al. (1995, Analytical Biochemistry 226: 349–354) beschreiben einen kolorimetrischen Assay, bei dem eine rekombinante Zelle verwendet wird, die mit einem Expressionsvektor, der für einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor codiert, und mit einem zweiten Expressionsvektor, enthaltend einen Promotor mit einem auf cAMP ansprechenden Element in Fusion mit dem LacZ-Gen, transfiziert wurde. Die Aktivität des überexprimierten G-Protein-gekoppelten Rezeptors wird als Expression und OD-Messung von β-Gal gemessen. Deshalb umfasst ein weiterer Aspekt dieses Teils der Erfindung ein nicht-radioaktives Verfahren zur Feststellung, ob eine Substanz ein potentieller Agonist oder Antagonist von MC-R1B ist, welches umfasst:

(a) Transfizieren oder Transformieren von Zellen mit einem Expressionsvektor, der für MC-R1B codiert, welches Testzellen ergibt;
(b) Transfizieren oder Transformieren der Testzellen von Schritt (a) mit einem Expressionsvektor, welcher einen cAMP-induzierbaren Promotor in Fusion mit einem kolorimetrischen Gen wie LacZ umfasst;
(c) Wachsen lassen der transfizierten Zellen für einen ausreichenden Zeitraum, um die Expression von MC-R1B zu erlauben;
(d) Ernten der transfizierten Zellen und Resuspendieren der Zellen in Anwesenheit eines bekannten Agonisten von MC-R1B und/oder in sowohl der Anwesenheit als auch der Abwesenheit der Testverbindung;
(e) Messen der Bindung des bekannten Agonisten und der Testverbindung an überexprimiertes MC-R1B mittels eines kolorimetrischen Assays, welcher die Expression von dem cAMP-induzierbaren Promotor misst, und Vergleichen der Expressionsniveaus in Anwesenheit des bekannten Agonisten sowie in Anwesenheit und Abwesenheit der unbekannten Substanz, um so festzustellen, ob die unbekannte Substanz entweder als potentieller Agonist oder Antagonist von MC-R1B fungiert.

Weitere Verfahren zur Identifizierung von Agonisten oder Antagonisten umfassen, sind jedoch keineswegs beschränkt auf, die folgenden:

I. (a) Transfizieren oder Transformieren von Zellen mit einem ersten Expressionsvektor, der die Expression von MC-R1B steuert, und einem zweiten Expressionsvektor, der die Expression eines promiskuitiven G-Proteins steuert, welches Testzellen ergibt; (b) Aussetzen der Testzellen einer Substanz, die ein mutmaßlicher Agonist von MC-R1B ist; (c) Messen des Niveaus von Inositphosphaten in den Zellen; wobei eine Erhöhung des Niveaus von Inositphosphaten in den Zellen im Vergleich zu dem Niveau von Inositphosphaten in den Zellen in Abwesenheit des mutmaßlichen Agonisten anzeigt, dass die Substanz ein Agonist von MC-R1B ist.
II. (a) Transfizieren oder Transformieren von Zellen mit einem ersten Expressionsvektor, der die Expression von MC-R1B steuert, und einem zweiten Expressionsvektor, der die Expression eines promiskuitiven G-Proteins steuert, welches Testzellen ergibt; (b) Aussetzen der Testzellen einer Substanz, die ein Agonist von MC-R1B ist; (c) nach oder gleichzeitig mit Schritt (b) Aussetzen der Testzellen einer Substanz, die ein mutmaßlicher Antagonist von MC-R1B ist; (d) Messen des Niveaus von Inositphosphaten in den Zellen; wobei eine Abnahme des Niveaus von Inositphosphaten in den Zellen in Anwesenheit des mutmaßlichen Antagonisten im Vergleich zu dem Niveau von Inositphosphaten in den Zellen in Abwesenheit des mutmaßlichen Antagonisten anzeigt, dass die Substanz ein Antagonist von MC-R1B ist.
III. Das Verfahren von II, wobei die ersten und zweiten Expressionsvektoren von Schritt (a) durch einen einzigen Expressionsvektor ersetzt sind, welcher ein chimäres MC-R1B-Protein exprimiert, das an seinem C-Terminus mit einem promiskuitiven G-Protein fusioniert ist.

Die oben beschriebenen Verfahren können insofern modifiziert werden, als anstatt des Aussetzens der Testzellen der Substanz Membranen aus den Testzellen hergestellt werden können und diese Membranen der Substanz ausgesetzt werden können. Eine solche Modifizierung unter Verwendung von Membranen statt Zellen ist im Stand der Technik wohlbekannt und beispielsweise beschrieben in Hess et al., 1992, Biochem. Biophys. Res. Comm. 184: 260–268. Dementsprechend umfasst eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Feststellung, ob eine Substanz an MC-R1B bindet und/oder ein potentieller Agonist oder Antagonist von MC-R1B ist, bei dem Membran präparationen aus den Testzellen anstelle der Testzellen verwendet werden. Solche Verfahren umfassen das folgende und können unter Einsatz der physiologischen Bedingungen wie oben angegeben durchgeführt werden:

(a) Transfizieren oder Transformieren von Zellen mit einem Expressionsvektor, der die Expression von MC-R1B in den Zellen steuert, welches Testzellen ergibt;
(b) Herstellen von Membranen, die MC-R1B enthalten, aus den Testzellen und Aussetzen der Membranen einem Liganden von MC-R1B unter solchen Bedingungen, dass der Ligand an das MC-R1B in den Membranen bindet;
(c) nach oder gleichzeitig mit Schritt (b) Aussetzen der Membranen aus den Testzellen einer Substanz;
(d) Messen des Ausmaßes der Bindung des Liganden an das MC-R1B in den Membranen in Anwesenheit und Abwesenheit der Substanz;
(e) Vergleichen des Ausmaßes der Bindung des Liganden an MC-R1B in den Membranen in Anwesenheit und Abwesenheit der Substanz, wobei eine Abnahme des Ausmaßes der Bindung des Liganden an MC-R1B in den Membranen in Anwesenheit der Substanz anzeigt, dass die Substanz zur Bindung an MC-R1B in der Lage ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Feststellung, ob eine Substanz zur Bindung an MC-R1B in der Lage ist, umfassend:

(a) Transfizieren oder Transformieren von Zellen mit einem Expressionsvektor, der die Expression von MC-R1B in den Zellen steuert, welches Testzellen ergibt;
(b) Herstellen von Membranen, die MC-R1B enthalten, aus den Testzellen und Aussetzen der Membranen aus den Testzellen der Substanz;
(c) Messen des Ausmaßes der Bindung der Substanz an das MC-R1B in den Membranen aus den Testzellen;
(d) Vergleichen des Ausmaßes der Bindung der Substanz an MC-R1B in den Membranen aus den Testzellen mit dem Ausmaß der Bindung der Substanz an Membranen aus Kontrollzellen, die nicht mit MC-R1B transfiziert wurden, wobei die Substanz zur Bindung an MC-R1B in der Lage ist, wenn das Ausmaß der Bindung der Substanz an MC-R1B in den Membranen aus den Testzellen größer als das Ausmaß der Bindung der Substanz an die Membranen aus den Kontrollzellen ist.

Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Bestimmung verschiedener Ligandenbindungsaffinitäten unter Verwendung von ¹²⁵I-markiertem NDP-α-MSH als markierter Ligand in Anwesenheit variierender Konzentrationen an unmarkierten Liganden. Die Aktivierung des zweiten Messenger-Signalwegs kann festgestellt werden durch Messen des intrazellulären cAMP, welches durch einen Agonisten bei verschiedenen Konzentrationen hervorgerufen wurde.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch polyklonale und monoklonale Antikörper, die als Reaktion auf entweder die Form von MC-R1B oder ein biologisch aktives Fragment davon induziert wurden. Polyklonale oder monoklonale Antikörper können gegen MC-R1B oder ein synthetisches Peptid (gewöhnlich von etwa 9 bis etwa 25 Aminosäuren Länge) von einem Abschnitt von MC-R1B, beispielsweise wie offenbart in SEQ-ID-Nr. 2, SEQ-ID-Nr. 4, SEQ-ID-Nr. 6, SEQ-ID-Nr. 8, SEQ-ID-Nr. 10, SEQ-ID-Nr. 12, SEQ-ID-Nr. 14, SEQ-ID-Nr. 17, SEQ-ID-Nr. 20, SEQ-ID-Nr. 23 und SEQ-ID-Nr. 26, induziert werden. Monospezifische Antikörper gegen MC-R1B werden aus Säuger-Antiseren gereinigt, welche Antikörper mit Reaktivität gegen MC-R1B enthalten, oder als monoklonale Antikörper mit Reaktivität gegen MC-R1B unter Anwendung der Technik von Kohler und Milstein (1975, Nature 256: 495–497) hergestellt. Ein monospezifischer Antikörper, wie hier verwendet, ist definiert als eine einzige Antikörperspezies oder multiple Antikörperspezies mit homogenen Bindungseigenschaften für MC-R1B. Homogene Bindung, wie hier verwendet, bezieht sich auf das Vermögen der Antikörperspezies, an ein spezifisches Antigen oder Epitop, wie z.B. die mit MC-R1B assoziierten wie oben beschrieben, zu binden. MC-R1B-spezifische Antikörper werden induziert durch Immunisierung von Tieren, wie z.B. Mäusen, Ratten, Meerschweinchen, Kaninchen, Ziegen, Pferden und dgl., mit einer geeigneten Konzentration an MC-R1B-Protein oder einem synthetischen Peptid, das von einem Abschnitt von MC-R1B erzeugt wurde, mit einem oder ohne ein Immunadjuvans.
Vorimmunserum wird vor der ersten Immunisierung gewonnen. Jedes Tier erhält zwischen etwa 0,1 mg und etwa 1000 mg MC-R1B-Protein, assoziiert mit einem annehmbaren Immunadjuvans. Solche annehmbaren Adjuvanzien umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, vollständiges Freund-Adjuvans, unvollständiges Freund-Adjuvans, Alaun-Präzipitat, Wasser-in-Öl-Emulsion, die Corynebacterium parvum und tRNA enthält. Die erste Immunisierung besteht aus dem MC-R1B-Protein oder Peptidfragment davon in, vorzugsweise, vollständigem Freund-Adjuvans an mehreren Stellen, entweder subkutan (SC), intraperitoneal (IP) oder beides. Jedem Tier wird in regelmäßigen Abständen, vorzugsweise wöchentlich, Blut entnommen, um Antikörpertiter zu bestimmen. Die Tiere können nach der ersten Immunisierung Booster-Injektionen erhalten oder nicht. Diejenigen Tiere, welche Booster-Injektionen erhalten, bekommen gewöhnlich eine gleiche Menge an MC-R1B in unvollständigem Freund-Adjuvans auf dem gleichen Weg. Booster-Injektionen werden in etwa dreiwöchigen Intervallen gegeben, bis maximale Titer erhalten werden. Nach etwa 7 Tagen nach jeder Booster-Immunisierung oder etwa wöchentlich nach einer Einzelimmunisierung wird den Tieren Blut entnommen, das Serum gewonnen und Aliquots werden bei etwa –20°C gelagert.
Monoklonale Antikörper (mAb), die mit MC-R1B reagieren können, werden durch Immunisierung von Inzucht-Mäusen, vorzugsweise Balb/c, mit MC-R1B-Protein hergestellt. Die Mäuse werden auf dem IP- oder SC-Weg mit etwa 1 mg bis etwa 100 mg, vorzugsweise etwa 10 mg, MC-R1B-Protein in etwa 0,5 ml Puffer oder Salzlösung, inkorporiert in einem gleichen Volumen eines annehmbaren Adjuvans wie oben erörtert, immunisiert. Vollständiges Freund-Adjuvans ist bevorzugt. Die Mäuse erhalten eine erste Immunisierung am Tag 0 und etwa 3 bis etwa 30 Wochen Ruhe. Die immunisierten Mäuse erhalten eine oder mehrere Booster-Immunisierung(en) von etwa 1 bis etwa 100 mg MC-R1B in einer Pufferlösung wie phosphatgepufferter Salzlösung auf dem intravenösen (IV) Weg.
Lymphozyten aus antikörper-positiven Mäusen, vorzugsweise Milz-Lymphozyten, werden durch Entfernung der Milz aus immunisierten Mäusen nach auf diesem Gebiet bekannten Standardverfahren erhalten. Hybridomzellen werden erzeugt durch Mischen der Milz-Lymphozyten mit einem geeigneten Fusionspartner, vorzugsweise Myelomzellen, unter Bedingungen, welche die Bildung stabiler Hybridome erlauben. Fusionspartner können umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf: Maus-Myelome P3/NS1/Ag 4-1; MPC-11; S-194 und Sp 2/0, wobei Sp 2/0 bevorzugt sind. Die antikörper-produzierenden Zellen und Myelomzellen werden in Polyethylenglycol mit einem Molekulargewicht von etwa 1000 bei Konzentrationen von etwa 30 % bis etwa 50 % fusioniert. Die fusionierten Hybridomzellen werden durch Wachstum in mit Hypoxanthin, Thymidin und Aminopterin ergänztem Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) nach im Stand der Technik bekannten Verfahren selektioniert. Überstandsflüssigkeiten werden aus Vertiefungen mit positivem Wachstum etwa an den Tagen 14, 18 und 21 gewonnen und durch einen Immunoassay, wie z.B. Festphasen-Immunoradioassay (SPIRA), unter Verwendung von MC-R1B als Antigen auf Antikörperproduktion gescreent. Die Kulturflüssigkeiten werden auch in dem Ouchterlony-Präzipitationsassay getestet, um den Isotyp der mAb zu bestimmen. Hybridomzellen aus antikörper-positiven Vertiefungen werden nach einer Technik wie der Soft-Agar-Technik von MacPherson, Soft Agar Techniques, in Tissue Culture Methods and Applications, Kruse und Paterson, Hrsg., Academic Press, 1973, kloniert.
Monoklonale Antikörper werden in vivo produziert, indem pristin-geprimten Balb/c-Mäusen, etwa 0,5 ml pro Maus, etwa 2 × 10⁶ bis etwa 6 × 10⁶ Hybridomzellen etwa 4 Tage nach dem Primen injiziert werden. Ascites-Flüssigkeit wird etwa 8–12 Tage nach dem Zelltransfer gewonnen und die monoklonalen Antikörper werden durch im Stand der Technik bekannte Verfahren gereinigt.
Die in vitro-Produktion von Anti-MC-R1B-mAb erfolgt durch Züchtung der Hybridome in DMEM mit etwa 2 % fetalem Kalbsserum, um ausreichende Mengen der spezifischen mAb zu erhalten. Die mAb werden nach im Stand der Technik bekannten Verfahren gereinigt.
Die Antikörpertiter von Ascites- oder Hybridomkultur-Flüssigkeiten werden durch verschiedene serologische oder immunologische Assays bestimmt, welche umfassen, jedoch nicht beschränkt sind auf, Präzipitation, passive Agglutination, enzym-gekoppelte Immunosorbens-Antikörper (ELISA)-Technik und Radioimmunoassay (RIA)-Techniken. Ähnliche Assays werden eingesetzt, um die Anwesenheit von MC-R1B in Körperflüssigkeiten oder Gewebe und Zellextrakten nachzuweisen.
Für Fachleute auf dem Gebiet ist ohne weiteres ersichtlich, dass die oben beschriebenen Verfahren zur Herstellung monospezifischer Antikörper eingesetzt werden können, um Antikörper herzustellen, die für MC-R1B-Peptidfragmente oder Volllängen-MC-R1B spezifisch sind.
MC-R1B-Antikörper-Affinitätssäulen werden beispielsweise hergestellt durch Zugabe der Antikörper zu Affigel-10 (Biorad), einem Gelträger, der mit N-Hydroxysuccinimidestern voraktiviert ist, so dass die Antikörper kovalente Verknüpfungen mit dem Agarosegelperlen-Träger bilden. Die Antikörper werden dann an das Gel über Amidbindungen mit dem Spacer-Arm gekoppelt. Die verbleibenden aktivierten Ester werden dann mit 1 M Ethanolamin-HCl (pH 8) gequencht. Die Säule wird mit Wasser, gefolgt von 0,23 M Glycin-HCl (pH 2,6), gewaschen, um jeglichen nicht-konjugierten Antikörper oder Fremdprotein zu entfernen. Die Säule wird dann in phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7,3) äquilibriert und die Zellkulturüberstände oder Zellextrakte, die Volllängen-MC-R1B oder MC-R1B-Proteinfragmente enthalten, werden langsam durch die Säule geleitet. Die Säule wird dann mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen, bis die optische Dichte (A₂₈₀) bis zum Hintergrund abnimmt, dann das Protein mit 0,23 M Glycin-HCl (pH 2,6) eluiert. Das gereinigte MC-R1B-Protein wird dann gegen phosphatgepufferte Salzlösung dialysiert.
Die DNA-Moleküle, RNA-Moleküle, rekombinanten Proteine und Antikörper der vorliegenden Erfindung können zum Screenen und Messen der Niveaus von MC-R1B eingesetzt werden.
Die rekombinanten Proteine, DNA-Moleküle, RNA-Moleküle und Antikörper eignen sich zur Formulierung von Kits, welche für den Nachweis und die Typenbestimmung von MC-R1B geeignet sind. Ein solcher Kit würde einen in Abteile aufgeteilten Träger umfassen, welcher dazu geeignet ist, in festem Einschluß mindestens einen Behälter zu halten. Der Träger würde ferner Reagenzien wie rekombinantes MC-R1B-Protein oder Anti-MC-R1B-Antikörper, geeignet zum Nachweis von MC-R1B, umfassen. Der Träger kann auch ein Nachweismittel, wie z.B. ein markiertes Antigen oder Enzymsubstrate oder dgl., enthalten.
Pharmazeutisch geeignete Zusammensetzungen, die Modulatoren von MC-R1B umfassen, können nach im Stand der Technik bekannten Verfahren wie z.B. der Zumischung eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers formuliert werden. Beispiele solcher Träger und Formulierungsverfahren sind in Remington's Pharmaceutical Sciences zu finden. Zur Herstellung einer pharmazeutisch annehmbaren Zusammensetzung, die sich für eine wirksame Verabreichung eignet, werden solche Zusammensetzungen eine wirksame Menge des Proteins, der DNA, RNA, von modifiziertem MC-R1B oder entweder MC-R1B-Agonisten oder -Antagonisten, einschließlich Tyrosinkinase-Aktivatoren oder -Inhibitoren, enthalten.
Therapeutische oder diagnostische Zusammensetzungen der Erfindung werden einem Individuum in ausreichenden Mengen verabreicht, um Krankheitszustände zu behandeln oder zu diagnostizieren. Die wirksame Menge kann entsprechend einer Vielfalt von Faktoren, wie z.B. dem Zustand, Gewicht, Geschlecht und Alter des Individuums, variieren. Andere Faktoren beinhalten die Verabreichungsweise.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können dem Individuum auf einer Vielfalt von Wegen, wie z.B. subkutan, topisch, oral und intramuskulär, verabreicht werden.
Der Begriff "chemisches Derivat" beschreibt ein Molekül, welches zusätzliche chemische Gruppierungen enthält, die normalerweise nicht Teil des Grundmoleküls sind. Solche Gruppierungen können die Löslichkeit, Halbwertszeit, Absorption etc. des Grundmoleküls verbessern. Alternativ können die Gruppierungen unerwünschte Nebenwirkungen des Grundmoleküls abschwächen oder die Toxizität des Grundmoleküls verringern. Beispiele solcher Gruppierungen sind in einer Vielfalt von Texten, wie z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences, beschrieben.
Verbindungen, die mit den hier offenbarten Verfahren identifiziert wurden, können alleine in geeigneten Dosierungen eingesetzt werden. Alternativ kann eine gemeinsame Verabreichung oder sequentielle Verabreichung anderer Mittel wünschenswert sein.
Die vorliegende Erfindung hat auch die Aufgabe der Bereitstellung geeigneter topischer, oraler, systemischer und parenteraler pharmazeutischer Formulierungen zur Verwendung in den neuen Behandlungsverfahren der vorliegenden Erfindung. Die Zusammensetzungen, welche gemäß dieser Erfindung identifizierte Verbindungen als aktiven Bestandteil enthalten, können in einer breiten Vielfalt therapeutischer Dosierungsformen in herkömmlichen Vehikeln zur Verabreichung verabreicht werden. Beispielsweise können die Verbindungen in solchen oralen Dosierungsformen wie Tabletten, Kapseln (jeweils einschließlich Formulierungen zur zeitlich festgelegten und verzögerten Freisetzung), Dragees, Pulver, Granula, Elixiere, Tinkturen, Lösungen, Suspensionen, Sirupe und Emulsionen oder mittels Injektion verabreicht werden. Gleichermaßen können sie auch intravenös (sowohl Bolus als auch Infusion), intraperitoneal, subkutan, topisch mit oder ohne Okklusion, oder in intramuskulärer Form verabreicht werden, wobei alle verwendeten Formen Durchschnittsfachleuten auf dem Gebiet der Pharmazie wohlbekannt sind.
Vorteilhafterweise können Verbindungen der vorliegenden Erfindung in einer einzigen Tagesdosis verabreicht werden oder die tägliche Gesamtdosis kann in aufgeteilten Dosen von zwei, drei oder viermal täglich verabreicht werden. Ferner können Verbindungen für die vorliegende Erfindung in intranasaler Form unter topischer Verwendung geeigneter intranasaler Vehikel oder über transdermale Routen verabreicht werden, wobei diejenigen Formen transdermaler Hautpflaster verwendet werden, die Durchschnittsfachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt sind. Zur Verabreichung in Form eines transdermalen Abgabesystems wird die Dosierungsverabreichung natürlich eher kontinuierlich als diskontinuierlich während des Behandlungsplans erfolgen.
Zur Kombinationsbehandlung mit mehr als einem aktiven Mittel, wobei die aktiven Agenzien in separaten Dosierungsformulierungen vorliegen, können die aktiven Agenzien gleichzeitig verabreicht werden oder sie können jeweils zu separaten versetzten Zeiten verabreicht werden.
Der Dosierungsplan unter Verwendung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung wird gemäß einer Vielfalt von Faktoren gewählt, einschließlich Typ, Spezies, Alter, Gewicht, Geschlecht und medizinischer Zustand des Patienten, der Schwere des zu behandelnden Zustands, des Verabreichungswegs, der Nieren-, Leber- und kardiovaskulären Funktion des Patienten und der speziell davon eingesetzten Verbindung. Ein Arzt oder Veterinärmediziner von durchschnittlichen Fähigkeiten kann unschwer die wirksame Menge des Arzneiwirkstoffs bestimmen und verschreiben, welcher zur Verhinderung, Entgegenwirkung oder zum Stillstandbringen des Krankheitsfortschritts erforderlich ist. Eine optimale Präzision bei der Erzielung von Arzneiwirkstoffkonzentrationen innerhalb des Bereichs, welcher eine Wirksamkeit ohne Toxizität ergibt, erfordert einen Plan auf der Basis der Kinetik der Verfügbarkeit des Arzneiwirkstoffs an Zielstellen. Dies beinhaltet eine Berücksichtigung der Verteilung, des Gleichgewichts und der Eliminierung eines Arzneiwirkstoffs.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung, ohne diese jedoch darauf zu beschränken.
BEISPIEL 1
Isolierung und Charakterisierung von Human-MC-1R-Spleissvarianten
Identifizierung eines Expresssionssequenz-Tags ("Expressed Sequence Tag"; EST) – Genbank-Datenbanken wurden unter Verwendung des Tblastn-Suchprogramms (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403–410) mit der Aminosäuresequenz von humanen Melanocortin-Rezeptorproteinen überprüft. Ein humanes EST (GenBank Hinterlegungs-Nr. AI123000; dbEST Id-Nr. 1881544; GenBank gi: 3538766; Clone Id: Image: 1509887 (3'), hinterlegt am 18. August 1997), erhalten von fünf normalisierten und gepoolten cDNA-Banken, wurde mit einem signifikanten Homologiewert identifiziert. EST AI123000 wies eine Sequenzidentität (> 90 % auf der DNA-Ebene) mit dem 3'-Ende des Gens für das humane MC-1R auf. Die Nukleotidsequenz von EST AA123000 ist wie folgt:
Ein zusätzliches EST mit ähnlicher Sequenzidentität mit dem 3'-Ende des humanen MC-R1-Gens wurde anschließend am 13. Oktober 1998 hinterlegt. Die GenBank-Hinterlegungs-Nr. dieses EST ist AI187892 (dbEST Id-Nr. 826102; GenBank gi: 1774101; Clone Id: Image: 625984 (3')). Die Nukleotidsequenz von EST AA187892 ist wie folgt:
Eine zusätzliche Durchsuchung des dbEST-Subsets von Genbank identifizierte zwei andere Human-EST mit Sequenzidentität mit dem Human-MC-R1R: Das erste ist verfügbar unter der GenBank-Hinterlegungs-Nr. AA431397 und wurde aus Human-Hoden-mRNA isoliert und am 22. Mai 1997 eingetragen (dbEST Id-Nr. 1075968; GenBank gi: 2115105; Clone Id: Image: 782133 (5')). Die Nukleotidsequenz von EST AA431397 ist wie folgt:
Ein weiteres EST ist unter der GenBank-Hinterlegungs-Nr. AA778295 erhältlich und wurde aus Human-Fötusherz-mRNA isoliert und am 5. Februar 1998 in die Datenbank eingetragen (dbEST Id-Nr. 1075968; GenBank gi: 2115105; Clone Id: Image: 782133 (5')). Die Nukleotidsequenz von EST AA431397 ist wie folgt:
Eine DNA-Sequenzierung beider Stränge unter Verwendung von Farbstoffterminator-Zyklus-Sequencing-Ready-Reaktionen (Perkin Elmer-ABI), analysiert mit einem 377-ABI-Prisma-Zyklus-Sequenzierer, legte nahe, dass dieses EST einen Teil einer alternativ gespleissten Form des Human-MC-R1-Gens, die in dieser Beschreibung als ein MC-R1B-Protein mit 382 Aminosäuren offenbart ist, repräsentieren könnte. Das früher beschriebene MC-R1-Protein mit 317 Aminosäuren wird als MC-R1A bezeichnet (Mountjoy et al., 1992, Science 257: 1248–1251 [siehe auch US-Patent-Nr. 5,532,347); Chhajlani und Wikberg, 1992, FEBS Letters 309: 417–420). 1 zeigt die Zuordnung dieser EST in Bezug zu den MC-R1-A- und MC-R1B-Genen.
Klonierung der MC-R-Spleissvariante MC-R1B aus humaner genomischer DNA – "Touchdown"-PCR wurde mit gescherter humaner genomischer DNA (0,5 mg; Clontech, Palo Alto, CA) in einem GeneAmp 9700 PCR-System (Perkin Elmer, Foster City, CA) durchgeführt. Zwei Sense-Primer, MC1R-5'for1 (5'TCTCACACTCATCGTCCTCTGCCC3'; SEQ-ID-Nr. 32) und MC1R-5'for2 (5'CATCGCCTACTACGACCACGTGGC3'; SEQ-ID-Nr. 33), wurden auf Basis der veröffentlichten Sequenz von Human-MC-1RA (oben) konstruiert. Die Antisense-Primer MC1R-3'rev1 (5'CGCTGCAAGGCTGTTGGATGAAGC3'; SEQ-ID-Nr. 34) und MC1R-3'rev2 (5'GTGGGAGTAGCTCTTGGCACACAC, SEQ-ID-Nr. 35) wurden von EST AI123000 abgeleitet. Ein Advantage-cDNA-PCR-Kit (Clontech, Palo Alto, CA) wurde in den PCR-Reaktionen im wesentlichen nach den Instruktionen des Herstellers verwendet. Zwei Ausnahmen waren die Zugabe von 5 % DMSO zu den PCR-Reaktionen und eine zyklische PCR-Führung wie im folgenden beschrieben: 1) 94°C für eine Minute, 2) 5 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 72°C für 3 Minuten, 3) 5 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 70°C für 3 Minuten, 4) 20 Zyklen von 94°C für 30 Sekunden, 68°C für 3 Minuten. Eine anschließende Sequenzierung der PCR-Produkte unter Verwendung von BIG DYE-Terminator-Zyklus-Ready-Sequencing-Reaktionen (Perkin Elmer, Foster City, CA) und Analyse mit einem 377-ABI-Prisma-Zyklus-Sequenzierer (Perkin Elmer, Foster City, CA) offenbarte die Anwesenheit eines kryptischen 381-bp-Introns unmittelbar stromaufwärts (am C-terminalen Trp-317-Rest) des TGA-Stoppcodons des humanen MC-R1-Gens. Die Nukleotidgrenzen, welche dieses Intron beschreiben, unter Verwendung von Konsensus-Spleissverbindungssequenzen als Anleitung (Senapathy et al., 1990, Meth. Enzymol. 183: 252–278), sind wie folgt. Eine konservierte Konsensus-Spleissdonorstelle (A/C)AG/gt (Nukleotide 950-952) wurde gefunden, welche die ersten beiden Basen des Trp-Triplett-Codons bildet.
2 zeigt die alternative Spleissung der beiden humanen Formen von MC-R1, wobei die COOH-terminalen Regionen von exprimiertem Protein ebenso gezeigt sind wie die Spleissverbindungsstellen, die in den verschiedenen genomischen Klonen, codierend für Human-MC-R1B, identifiziert wurden.
3 zeigt einen repräsentativen genomischen Klon für Human-MC-R1B, die DNA-Sequenz des genomischen Klons mc1-8 (SEQ-ID-Nr. 21). Große Buchstaben repräsentieren Exonbereiche, während kleinbuchstabige Nukleotide das einzige Intron des MC-R1-Gens repräsentieren. Eine konservierte Konsensus-Spleissakzeptorstelle cag/R wurde bei den Nukleotiden 1330-1332 identifiziert. Die Bildung dieser Spleissverbindungsstelle ist das Ergebnis der vom Donor bereitgestellten TG und des vom Akzeptor bereitgestellten C zur Bildung des Triplett-Codons für Cys (anstelle der C-terminalen Aminosäure Trp des MC-R1A). Die neue codierende Sequenz, die zusätzliche 65 Aminosäuren (ohne das Trp-317 zur Cys-Substitution) ergibt, tritt als Ergebnis dieses Spleissereignisses auf.
4A–4B zeigen die Nukleotid- und Aminosäuresequenz des aminoterminalen Abschnitts der MC-R1A- und MC-R1B-Formen von mc1-8, die 5'- und 3'-Spleissverbindungssequenzen sowie die jeweiligen Aminosäuresequenzen der carboxyterminalen Abschnitte von MC-R1A und MC-R1B.
Dann wurde eine überlappende PCR durchgeführt, um einen zusammenhängenden offenen Leserahmen ohne das Intron (382 Aminosäuren) zu erzeugen, welcher diesen neuen Carboxyterminus enthält. PCR-Produkte für die Exons I und II wurden hergestellt, die jeweils einen kleinen Abschnitt des anderen Exons enthielten. Die Primer für Exon I waren wie folgt: 1. mc1-like-1f
und 2. mc1-like-1r
und enthielten eine EcoRI-Stelle und eine Kozak-Sequenz (GCC GCC) für optimale Translation. Die Primer für Exon II waren wie folgt: 1. mc1-like-2f
und
2. mc1-like-2r (5'agtttagcggccgcCTAGGGGGGCTCCTGCAAACCTGG3'; SEQ-ID-Nr. 39), welcher eine NotI-Stelle enthält. Der MC1-artige offene Leserahmen wurde dann aus Exon I- und -II-Matrizen und den Primern mc1-like-1f und mc1-like-2r erzeugt. Das MC1-artige ORF-Fragment wurde mit EcoRI und NotI verdaut, gelgereinigt, in den Vektor pcDNA3 ligiert und in E. coli SCS1 (Stratagene, La Jolla, CA) transformiert. Jeder der vier beispielhaft aufgeführten genomischen Klone (mc1-3, mc1-6, mc1-8 und mc1-9) wurde unter Verwendung der oben offenbarten Methodik isoliert.
Klonierung der MC-R-Spleissvariante (MC-R18) aus Human-Hoden-mRNA – Volllängen-cDNA, codierend für MC-R1B, wurde aus Human-Hoden-Poly-(A)⁺-mRNA (Pool von 25 männlichen Kaukasiern) isoliert. RT-PCR unter Verwendung von 1 mg Hoden-mRNA wurde unter Verwendung des Kits „Advantage RT for PCR" mit reverser MMLV-Transkriptase (Clontech, Palo Alto, CA) im wesentlichen nach den Instruktionen des Herstellers durchgeführt. Die PCR wurde dann mit dem Advantage-cDNA-PCR-Kit (Clontech, Palo Alto, CA) im wesentlichen nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt (Zyklusbedingungen: 94°C für 1 Minute, 60°C für 2 Minuten, 72°C für 2 Minuten, 72°C für 10 Minuten). Der verwendete Vorwärts-Sense-Primer (der eine EcoR1-Restriktionsstelle und eine optimierte Initiationssequenz auf der Basis von Kozak-Regeln hinzufügte) war
(5'GATCGAATTCGCCGCCATGGCTGTGCAGGGATCCCAGAGAAG3'; SEQ-ID-Nr. 40), während die reversen Antisense-Primer
(5'GATCGAATTCCTAGGGGGGCTCCTGCAAACCTG3'; SEQ-ID-Nr. 41) oder
(5'GATCGAATTCGTGCCCAGTCTGAGCCTTAGAACCG3'; SEQ-ID-Nr. 42) waren.
Amplifizierte Produkte wurden mit Agarose gelgereinigt, mit EcoR1 verdaut und in den Säuger-Expressionsvektor pcDNA-3.1 (–) (Invitrogen) ligiert. Diese Methodik wurde dazu verwendet, MC-R1ESTc11 sowie die anderen cDNA-Klone zu identifizieren.
BEISPIEL 2
Transiente Expression von Human-MC-R1B
Vier 800-ml-Dreifachkolben (Nalge Nunc), enthaltend 125 ml Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM), (Gibco-BRL), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (Sigma), L-Glutamin (Gibco/BRL) und Pen/Strep (Gibco/BRL), wurden mit COS-7-Zellen angeimpft und vier Tage lang inkubiert. Die Zellen in jedem Kolben wurden durch Abgießen des Mediums, Zugabe von 30 ml Trypsin/EDTA (0,05 %, Gibco/BRL) zu jedem Kolben und Inkubieren lassen der Kolben bei Raumtemperatur für zwei Minuten gewonnen. Dann wurde die Trypsinlösung entfernt und die Kolben wurden 10 Minuten lang bei 37°C inkubiert, 30 ml DMEM wurden zugegeben und die Zellen gewonnen. Die Zellen wurden 8 Minuten lang bei 1000 UpM pelletiert, zweimal mit Dulbecco's PBS ohne Mg⁺⁺ und Ca⁺⁺ (Gibco/BRL) gewaschen. Die Zellen wurden gezählt und auf eine Dichte von 1,2 × 10⁷/ml PBS ohne Mg⁺⁺ und Ca⁺⁺ resuspendiert. DNA wurde in die Zellen durch Elektroporation eingeführt; 0,85 ml der Zellen wurden mit 20 μg MC-R1-Expressionsplasmid in einer eiskalten 0,4-cm-Küvette (BioRad) gemischt. Die Lösung wurde mit einem BioRad Gene Pulsar Electroporator, der auf 0,26 kV, 960 μFD, eingestellt war, elektroporiert. Die Zellen von 30 Elektroporationen wurden in einem Liter DMEM vereinigt und mit 125 ml pro Dreifachkolben verteilt und bei 37°C inkubiert. Drei Tage später wurde das Medium aus jedem Kolben abgegossen, die Zellen wurden mit 100 ml Dulbecco's PBS ohne Mg⁺⁺ und Ca⁺⁺ gewaschen und 30 ml enzymfreier Dissoziationspuffer (Gibco/BRL) zugegeben. Nach Inkubation bei Raumtemperatur für 10 Minuten wurden die Zellen gewonnen, 10 Minuten lang mit 1000 UpM bei 4°C zentrifugiert und in 15 ml Membranpuffer (10 mM Tris, pH 7,4, mit Proteinase-Inhibitoren) resuspendiert. Eine 500 × Proteinase-Inhibitor-Lösung enthält Leupeptin (Sigma) 2 μg/ml, Phosphoramidon (Sigma) 5 μM, Bacitracin (Sigma) 20 μg/ml, Aprotinin (Sigma) 2,5 μg/ml und 0,05 M AEBSF (Pefabloc). Die Zellen werden mit 10 Impulsen eines motorgetriebenen Dounce-Homogenisators aufgebrochen, das Homogenat wird auf 50-ml-Falcon-Röhrchen überführt und 10 Minuten lang mit 2200 UpM bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde in 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und 20 Minuten lang in einer Sorvall RC5B-Zentrifuge mit 18 K zentrifugiert. Die Membranen wurden in 0,6 ml Membranpuffer resuspendiert, zweimal durch eine 18-Gauge-Nadel und fünfmal durch eine 25-Gauge-Nadel passiert, in Aliquots aufgeteilt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur Verwendung bei –80°C gelagert.
BEISPIEL 3
Pharmakologische Eigenschaften von Human-MC-R1B
Melanocortin-Radioliganden-Bindungsassay-Bindungsreaktionen (Gesamtvolumen = 250 μl) enthielten MBB (50 mM Tris, pH 7,2, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂), 0,1 % BSA, rohe Membranen, hergestellt aus Zellen, die Human-MC-R1B-Rezeptor exprimieren, 200 pM [¹²⁵I]-NDP-αMSH (Amersham Corp.), und zunehmende Konzentrationen an unmarkierten Testverbindungen, gelöst in DMSO (DMSO-Endkonzentration = 2 %). Die Reaktionen wurden eine Stunde lang ohne Schütteln inkubiert und dann durch 96-Mulden-Filterplatten (Packard Corp.) filtriert. Die Filter wurden dreimal mit TNE-Puffer (50 mM Tris, pH 7,4, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl) gewaschen, getrocknet und unter Verwendung von Microscint-20 in einem Topcount-Szintillationszähler (Packard) gezählt. Die 50%ige inhibitorische Konzentration (IC₅₀, angegeben in nM) ist definiert als die Konzentration unmarkierter Melanocortin-Peptide, welche 50 % der Bindung an die MC-1R-exprimierenden Zellmembranen verdrängt. Unspezifische Bindung wurde in Anwesenheit von 2 μM unmarkiertem NDP-αMSH (Peninsula Laboratories) bestimmt. COS-7-Zellen, die transient MC-R1B exprimierten, banden [¹²⁵I]-NDP-αMSH mit hoher Affinität und Spezifität (die spezifische Bindung, definiert als Unterschied der beobachteten Bindung in Abwesenheit und Anwesenheit von 1 μM unmarkiertem NDP-αMSH, war > 90 % Gesamtbindung). Wenig oder keine spezifische Bindung wurde in sham-transfizierten COS-7-Zellen beobachtet. Wie unten in Tabelle 1 gezeigt, verdrängten mehrere melanocortin-abgeleiteten Peptide (Aminosäuresequenz unten im einbuchstabigen IUPAC-Code definiert) die Bindung von [¹²⁵I]-NDP-αMSH wirksam, was die Anwesenheit einer hoch affinen Bindungsstelle, die durch die MC-R1B-Expression verliehen wurde, anzeigt. Tabelle 1
Funktioneller cAMP-Rezeptor-Assay-Rezeptor-vermittelte Stimulation der Bildung von cyclischem AMP (cAMP) wurde in COS-7-Zellen, die mit MC-1 RB-Expressionsplasmiden transfiziert worden waren, untersucht. Zellen, die MC-1 RB exprimierten, wurden von Gewebekulturkolben durch Spülen mit Ca- und Mg-freier phosphatgepufferter Salzlösung (Life Technologies, Gaithersburg, MD) dissoziiert und nach 5 Minuten Inkubation mit enzymfreiem Dissoziationspuffer (Specialty Media, Lavellette, NJ) abgelöst. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen und in Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) (Life Technologies, Gaithersburg, MD) unter Zugabe von 10 mM HEPES, pH 7,5, 5 mM MgCl₂, 1 mM Glutamin und 1 mg/ml Rinderserumalbum gewonnen. Die Zellen werden gezählt und auf 2 bis 4 × 10⁶/ml verdünnt. Der Phosphodiesterase-Inhibitor 3-Isobutyl-1-methylxanthin wurde in einer Konzentration von 0,6 mM zugegeben. Testpeptide wurden in EBSS mit den obigen Additionen und 10 % DMSO verdünnt, wobei 0,1 Volumina Verbindungen zu 0,9 Volumina Zellen hinzugegeben wurden. Nach Inkubation für 40 Minuten bei Raumtemperatur werden die Zellen durch Inkubation bei 100°C für 5 Minuten lysiert, um akkumuliertes cAMP frei zu setzen. cAMP wird in einem Aliquot des Zelllysats mit dem Amersham (Arlington Heights, IL)-cAMP-Nachweisassay (RPA556) gemessen. Das Ausmaß der cAMP-Bildung, welche das Ergebnis einer unbekannten Verbindung ist, wird mit der Menge an cAMP verglichen, die als Reaktion auf αMSH, welches als 100%iger Agonist definiert ist, gebildet wird.
Frühere Studien (Mountjoy et al., 1992, Science 257: 1248–1251 [siehe auch US-Patent Nr. 5,532,347]; Chhajlani und Wikberg, 1992, FEBS Letters 309: 417–420) dokumentierten, dass die Aktivierung der MC-1 RA-Isoform durch Melanocortin-Agonisten zu einer Erhöhung der intrazellulären cAMP-Bildung durch die Kopplung von G-Proteinen an die Aktivierung von membrangebundener Adenylatcyclase führt. Die transiente Expression von MC-R1B-Protein in COS-7 führt ebenfalls zu einer Erhöhung (um ungefähr das Dreifache bei maximaler Agonisten-Konzentration im Vergleich zur Hintergrundreaktion, die in sham-transfizierten COS-7-Zellen gemessen wurde) der intrazellulären cAMP-Bildung, die spezifisch von mehreren Melaonocortin-Agonisten oder gemischten Agonisten/Antagonisten, einschließlich αMSH, MT-II, SHU-9119, γMSH, NDP-αMSH und βMSH, hervorgerufen wurde. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass MC-R1B-cDNA für einen funktionellen Rezeptor für Melanocortine codiert. Die ungefähre Reihenfolge der Wirksamkeit der obigen Peptide bei der Hervorrufung der cAMP-Reaktion war NT-II > NDP-MSH > SHU-9119 > αMSH > βMSH > γMSH.
Der Umfang der vorliegenden Erfindung soll durch die hier beschriebenen speziellen Ausführungsformen nicht beschränkt sein. Tatsächlich werden für Fachleute auf dem Gebiet verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu den hier beschriebenen anhand der vorstehenden Beschreibung offensichtlich sein. Solche Modifikationen sollen vom Umfang der beigefügten Ansprüche umfasst sein. SEQUENZVERZEICHNIS

Claims

Gereinigtes Nukleinsäuremolekül, codierend für ein humanes Melanocortin 1-Rezeptorprotein, wobei das humane Melanocortin 1-Rezeptorprotein eine carboxyterminale Region mit der in SEQ-ID-Nr. 27 angegebenen Aminosäuresequenz umfasst.
Gereinigtes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei das Nukleinsäuremolekül aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ-ID-Nr. 1, SEQ-ID-Nr. 3, SEQ-ID-Nr. 5, SEQ-ID-Nr. 7, SEQ-ID-Nr. 9, SEQ-ID-Nr. 11, SEQ-ID-Nr. 13, SEQ-ID-Nr. 15, SEQ-ID-Nr. 16, SEQ-ID-Nr. 18, SEQ-ID-Nr. 19, SEQ-ID-Nr. 21, SEQ-ID-Nr. 22, SEQ-ID-Nr. 24 und SEQ-ID-Nr. 25 besteht.
Gereinigtes Nukleinsäuremolekül, codierend für ein humanes MC-R1B-Protein, wobei das Nukleinsäuremolekül für ein Protein codiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ-ID-Nr. 2, SEQ-ID-Nr. 4, SEQ-ID-Nr. 6, SEQ-ID-Nr. 8, SEQ-ID-Nr. 10, SEQ-ID-Nr. 12, SEQ-ID-Nr. 14, SEQ-ID-Nr. 17, SEQ-ID-Nr. 20, SEQ-ID-Nr. 23 und SEQ-ID-Nr. 26 besteht.
Expressionsvektor zur Expression eines humanen MC-R1B-Proteins in einer rekombinanten Wirtszelle, wobei der Expressionsvektor ein DNA-Molekül umfasst, welches für die Aminosäuresequenz von Anspruch 1 codiert.
Expressionsvektor nach Anspruch 4, welcher ein eukaryotischer Expressionsvektor ist.
Expressionsvektor nach Anspruch 4, welcher ein prokaryotischer Expressionsvektor ist.
Wirtszelle, welche ein rekombinantes humanes MC-R1B-Protein exprimiert, wobei die Wirtszelle den Expressionsvektor nach Anspruch 4 enthält.
Wirtszelle, welche ein rekombinantes humanes MC-R1B-Protein exprimiert, wobei die Wirtszelle den Expressionsvektor nach Anspruch 5 enthält.
Wirtszelle, welche ein rekombinantes humanes MC-R1B-Protein exprimiert, wobei die Wirtszelle den Expressionsvektor nach Anspruch 6 enthält.
Wirtszelle nach Anspruch 7, wobei das humane MC-R1B-Protein von dem Expressionsvektor überexprimiert wird.
Wirtszelle nach Anspruch 8, wobei das humane MC-R1B-Protein von dem Expressionsvektor überexprimiert wird.
Wirtszelle nach Anspruch 9, wobei das humane MC-R1B-Protein von dem Expressionsvektor überexprimiert wird.
Subzelluläre Membranfraktion, erhalten aus der Wirtszelle nach Anspruch 10, wobei die Fraktion rekombinantes humanes MC-R1B-Protein enthält.
Subzelluläre Membranfraktion, erhalten aus der Wirtszelle nach Anspruch 11, wobei die Fraktion rekombinantes humanes MC-R1B-Protein enthält.
Subzelluläre Membranfraktion, erhalten aus der Wirtszelle nach Anspruch 12, wobei die Fraktion rekombinantes humanes MC-R1B-Protein enthält.
Gereinigtes Nukleinsäuremolekül, codierend für ein humanes MC-R1B-Protein, wobei das Nukleinsäuremolekül für ein Protein codiert, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ-ID-Nr. 2, SEQ-ID-Nr. 4, SEQ-ID-Nr. 6, SEQ-ID-Nr. 8, SEQ-ID-Nr. 10, SEQ-ID-Nr. 12, SEQ-ID-Nr. 14, SEQ-ID-Nr. 17, SEQ-ID-Nr. 20, SEQ-ID-Nr. 23 und SEQ-ID-Nr. 26 besteht.
Gereinigtes humanes Melanocortin 1-Rezeptorprotein, das eine carboxyterminale Aminosäuredomäne wie in SEQ-ID-Nr. 27 angegeben umfasst.
Gereinigtes humanes Melanocortin 1-Rezeptorprotein nach Anspruch 17, das die Aminosäuresequenz umfasst, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ- ID-Nr. 2, SEQ-ID-Nr. 4, SEQ-ID-Nr. 6, SEQ-ID-Nr. 8, SEQ-ID-Nr. 10, SEQ-ID-Nr. 12, SEQ-ID-Nr. 14, SEQ-ID-Nr. 17, SEQ-ID-Nr. 20, SEQ-ID-Nr. 23 und SEQ-ID-Nr. 26 besteht.
Verfahren zur Feststellung, ob eine Substanz zur Bindung an humanes MC-R1B in der Lage ist, umfassend: (a) Bereitstellen von Testzellen durch Transfektion von Zellen mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 4; (b) Aussetzen der Testzellen der Substanz; (c) Messen des Ausmaßes der Bindung der Substanz an MC-R1B; (d) Vergleichen des Ausmaßes der Bindung der Substanz an MC-R1B in den Testzellen mit dem Ausmaß der Bindung der Substanz an Kontrollzellen, die nicht mit MC-R1B transfiziert wurden.
Verfahren zur Feststellung, ob eine Substanz zur Aktivierung von MC-R1B in der Lage ist, umfassend: (a) Bereitstellen von Testzellen durch Transfektion von Zellen mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 4; (b) Aussetzen der Testzellen der Substanz; (c) Messen des Menge von akkumuliertem intrazellulären cAMP; (d) Vergleichen der Menge von cAMP in den Testzellen als Reaktion auf die Substanz mit der Menge von cAMP in Testzellen, die nicht der Substanz ausgesetzt wurden.
Verfahren zur Identifizierung einer Substanz, welche MC-R1B-Rezeptoraktivität moduliert, umfassend: (a) Kombinieren einer Testsubstanz in Anwesenheit und Abwesenheit eines MC-R1B-Rezeptorproteins, wobei das MC-R1B-Rezeptorprotein die Aminosäuresequenz umfasst, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ-ID-Nr. 2, SEQ-ID-Nr. 4, SEQ-ID-Nr. 6, SEQ-ID-Nr. 8, SEQ-ID-Nr. 10, SEQ-ID-Nr. 12, SEQ-ID-Nr. 14, SEQ-ID-Nr. 17, SEQ-ID-Nr. 20, SEQ-ID-Nr. 23 und SEQ-ID-Nr. 26 besteht; und (b) Messen und Vergleichen der Wirkung der Testsubstanz in Anwesenheit und Abwesenheit des MC-R1B-Rezeptorproteins.
Verfahren zur Feststellung, ob eine Substanz ein potentieller Agonist oder Antagonist von MC-R1B ist, umfassend: (a) Transfizieren oder Transformieren von Zellen mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 4, der die Expression von MC-R1B in den Zellen steuert, welches Testzellen ergibt; (b) Wachsen lassen der Testzellen für einen ausreichenden Zeitraum, um die Expression von MC-R1B zu erlauben; (c) Aussetzen der Zellen einem markierten Liganden von MC-R1B in Anwesenheit und in Abwesenheit der Substanz; (d) Messen der Bindung des markierten Liganden an MC-R1B; wobei die Substanz ein potentieller Agonist oder Antagonist von MC-R1B ist, wenn das Ausmaß der Bindung des markierten Liganden in Anwesenheit der Substanz geringer ist als in Abwesenheit der Substanz.
Verfahren zur Feststellung, ob eine Substanz zur Bindung an MC-R1B in der Lage ist, umfassend: (a) Transfizieren oder Transformieren von Zellen mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 4, der die Expression von MC-R1B in den Zellen steuert, welches Testzellen ergibt; (b) Aussetzen der Testzellen der Substanz; (c) Messen des Ausmaßes der Bindung der Substanz an MC-R1B; (d) Vergleichen des Ausmaßes der Bindung der Substanz an MC-R1B in den Testzellen mit dem Ausmaß der Bindung der Substanz an Kontrollzellen, die nicht mit MC-R1B transfiziert wurden; wobei die Substanz zur Bindung an MC-R1B in der Lage ist, wenn das Ausmaß der Bindung der Substanz in den Testzellen größer als in den Kontrollzellen ist.
Verfahren zur Feststellung, ob eine Substanz zur Bindung an MC-R1B in der Lage ist, umfassend: (a) Transfizieren oder Transformieren von Zellen mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 4, der die Expression von MC-R1B in den Zellen steuert, welches Testzellen ergibt; (b) Herstellen von Membranen, die MC-R1B enthalten, aus den Testzellen und Aussetzen der Membranen einem Liganden von MC-R1B unter solchen Bedingungen, dass der Ligand an das MC-R1B in den Membranen bindet; (c) nach oder gleichzeitig mit Schritt (b) Aussetzen der Membranen aus den Testzellen einer Substanz; (d) Messen des Ausmaßes der Bindung des Liganden an das MC-R1B in den Membranen in Anwesenheit und Abwesenheit der Substanz; (e) Vergleichen des Ausmaßes der Bindung des Liganden an MC-R1B in den Membranen in Anwesenheit und Abwesenheit der Substanz, wobei eine Abnahme des Ausmaßes der Bindung des Liganden an MC-R1B in den Membranen in Anwesenheit der Substanz anzeigt, dass die Substanz zur Bindung an MC-R1B in der Lage ist.
Verfahren zur Feststellung, ob eine Substanz zur Bindung an MC-R1B in der Lage ist, umfassend: (a) Transfizieren oder Transformieren von Zellen mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 4, der die Expression von MC-R1B in den Zellen steuert, welches Testzellen ergibt; (b) Herstellen von Membranen, die MC-R1B enthalten, aus den Testzellen und Aussetzen der Membranen aus den Testzellen der Substanz; (c) Messen des Ausmaßes der Bindung der Substanz an das MC-R1B in den Membranen aus den Testzellen; (d) Vergleichen des Ausmaßes der Bindung der Substanz an MC-R1B in den Membranen aus den Testzellen mit dem Ausmaß der Bindung der Substanz an Membranen aus Kontrollzellen, die nicht mit MC-R1B transfiziert wurden, wobei die Substanz zur Bindung an MC-R1B in der Lage ist, wenn das Ausmaß der Bindung der Substanz an MC-R1B in den Membranen aus den Testzellen größer als das Ausmaß der Bindung der Substanz an die Membranen aus den Kontrollzellen ist.
Verfahren zur Identifizierung von Agonisten von MC-R1B, umfassend: (a) Transfizieren oder Transformieren von Zellen mit einem ersten Expressionsvektor nach Anspruch 4, der die Expression von MC-R1B steuert, und einem zweiten Expressionsvektor, der die Expression eines promiskuitiven G-Proteins steuert, welches Testzellen ergibt; (b) Aussetzen der Testzellen einer Substanz, die ein mutmaßlicher Agonist von MG-R1B ist; (c) Messen des Niveaus von Inositphosphaten in den Zellen; wobei eine Erhöhung des Niveaus von Inositphosphaten in den Zellen im Vergleich zu dem Niveau von Inositphosphaten in den Zellen in Abwesenheit des mutmaßlichen Agonisten anzeigt, dass die Substanz ein Agonist von MC-R1B ist.
Verfahren zur Identifizierung von Antagonisten von MC-R1B, umfassend: (a) Transfizieren oder Transformieren von Zellen mit einem ersten Expressionsvektor nach Anspruch 4, der die Expression von MC-R1B steuert, und einem zweiten Expressionsvektor, der die Expression eines promiskuitiven G-Proteins steuert, welches Testzellen ergibt; (b) Aussetzen der Testzellen einer Substanz, die ein Agonist von MC-R1B ist; (c) nach oder gleichzeitig mit Schritt (b) Aussetzen der Testzellen einer Substanz, die ein mutmaßlicher Antagonist von MC-R1B ist; (d) Messen des Niveaus von Inositphosphaten in den Zellen; wobei eine Abnahme des Niveaus von Inositphosphaten in den Zellen in Anwesenheit des mutmaßlichen Antagonisten im Vergleich zu dem Niveau von Inositphosphaten in den Zellen in Abwesenheit des mutmaßlichen Antagonisten anzeigt, dass die Substanz ein Antagonist von MC-R1B ist.
Verfahren zur Identifizierung von Antagonisten von MC-R1B nach Anspruch 27, wobei die ersten und zweiten Expressionsvektoren von Schritt (a) durch einen einzigen Expressionsvektor ersetzt sind, welcher ein chimäres MC-R1B-Protein exprimiert, das an seinem C-Terminus mit einem promiskuitiven G-Protein fusioniert ist.
Antikörper, der spezifisch an ein MC-R1B-Protein bindet, wobei das MC-R1B-Rezeptorprotein die Aminosäuresequenz umfasst, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ-ID-Nr. 2, SEQ-ID-Nr. 4, SEQ-ID-Nr. 6, SEQ-ID-Nr. 8, SEQ-ID-Nr. 10, SEQ-ID-Nr. 12, SEQ-ID-Nr. 14, SEQ-ID-Nr. 17, SEQ-ID-Nr. 20, SEQ-ID-Nr. 23 und SEQ-ID-Nr. 26 besteht.