DE69929417T2

DE69929417T2 - Dns oder gene, die an der parkinsonschen krankheit beteiligt sind

Info

Publication number: DE69929417T2
Application number: DE69929417T
Authority: DE
Inventors: Nobuyoshi Shimizu; Yoshikuni Mizuno
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 1998-02-09
Filing date: 1999-02-09
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2019-02-10
Also published as: ES2257029T3; DK1063294T3; JP4430815B2; DE69929417D1; US6716621B1; US20050003385A1; ATE315645T1; EP1063294B1; EP1063294A4; CA2320220A1; DE1063294T1; AU2299999A; CA2320220C; WO1999040191A1; EP1063294A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Gen, das für das Einsetzen der Parkinson-Krankheit verantwortlich ist. Da festgestellt wurde, dass Patienten mit Parkinson-Krankheit eine teilweise Deletion dieses Gens aufweisen, ist das erfindungsgemäße Gen von erheblichem Wert als Gen für die Diagnose der Parkinson-Krankheit. Ein Protein und ein pharmazeutisch aktives Mittel und dergl., die aus dem erfindungsgemäßen Gen erhältlich sind, finden Anwendung bei der Prophylaxe und Therapie der Parkinson-Krankheit.
Technischer Hintergrund
Im allgemeinen wird häufig in Betracht gezogen, dass ein oder mehr Gene für verschiedene chronische progressive Krankheiten verantwortlich sind. Eine Isolierung des oder der Gene, die für diese Krankheiten verantwortlich sind, ermöglicht nicht nur eine Erleichterung der pränatalen oder postnatalen Diagnose, sondern auch die Durchführung einer Gentherapie dieser Krankheit auf der Grundlage der beträchtlichen Fortschritte und Entwicklungen, die zur Zeit auf dem Gebiet der Gentherapie erkennbar sind.
Die Parkinson-Krankheit ist eine chronische Krankheit. α-Synuclein, über das im Jahre 1997 berichtet wurde, ist bisher das einzige Gen, von dem festgestellt wurde, dass es für die Parkinson-Krankheit verantwortlich ist. Es wurde berichtet, dass einige Personen mit italienischen Vorfahren an autosomaler, dominanter Parkinson-Krankheit aufgrund einer Mutation dieses Gens leiden. Jedoch ist auch bei Verwendung dieses Gens die Diagnose der Parkinson-Krankheit begrenzt. Daher wird derzeit als einzige Diagnose für die Parkinson-Krankheit eine klinische Herangehensweise eingeschlagen, die auf neurodegenerativen Symptomen, wie Ruhetremor, Rigor, Akinese und Störung des Nackenreflexes, beruhen. Eine auf Levodopa reagierende oder dopaminerge Verbindung (Agonist) wurde als symptomatische Behandlung verabreicht. Bisher wurde keine durchgreifende Therapie zur Behandlung der Parkinson-Krankheit realisiert.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wurde in Anbetracht des vorstehenden Sachverhalts gemacht. Eine Aufgabe der Erfindung ist es, eine isolierte DNA oder ein Gen oder ein Genfragment bereitzustellen, die für die Parkinson-Krankheit verantwortlich sind und die sich zur Diagnose und Behandlung der Krankheit und dergl. eignen. Ferner sollen ein rekombinanter Vektor, ein Protein oder Polypeptid; ein monoklonaler Antikörper oder ein polyklonaler Antikörper; ein Primer oder eine Sonde oder eine immobilisierte Nucleinsäure oder ein DNA-Chip; oder ein Oligonucleotid oder dergl. bereitgestellt werden.
Diese Aufgabe wurde erfindungsgemäß gemäß den Angaben in den beigefügten Ansprüchen gelöst. Speziell handelt es sich bei der hier beschriebenen isolierten DNA oder dem Gen um folgendes:

➀ Isolierte DNA oder Gen: umfassend die Basensequenz von voller Länge gemäß Sequenz ID. No. 1 oder 2 [die Sequenz ID. No. 2 umfasst nicht den Basenteil 636 bis 719 (entsprechend einem Exon 5, das später beschrieben wird) der Sequenz ID. No. 1, nämlich eine Variante davon gemäß einem alternativen Spleißvorgang] oder einer partiellen Sequenz davon oder einer Basensequenz, die damit hybridisierbar ist oder mit einem komplementären Strang davon hybridisierbar ist und mit Parkinson-Krankheit in Verbindung steht. Ferner können die DNA oder das Gen eine DNA oder ein Gen oder Genfragment mit den folgenden Merkmalen ➁ bis ➇ neben ➀ umfassen.
➁ Eine isolierte DNA oder Gen: umfassend die Basensequenz von ➀ oder die Basensequenz von voller Länge davon oder eine partielle Basensequenz davon und die isolierte DNA oder das Gen, dessen Gendefekt für Parkinson-Krankheit verantwortlich ist, oder das eine Basensequenz umfasst, die damit hybridisierbar oder mit einem komplementären Strang davon hybridisierbar ist.
➂ Isolierte DNA oder Gen: umfassend die Basensequenz von ➀ oder ➁, wobei es sich bei der isolierten DNA oder dem Gen um eine Variante davon aufgrund von alternativer Spleißung handelt, wobei eine Verbindung mit der Parkinson-Krankheit vorliegt, oder isolierte DNA oder Gen, umfassend eine Basensequenz, die damit hybridisierbar oder mit einem komplementären Strang davon hybridisierbar ist.
➃ Gen, umfassend die Basensequenz nach einem der Abschnitte ➀ bis ➂, dessen Genprodukt für ein Protein kodiert, das eine im wesentlichen gleichwertige Funktion mit einem Protein, das die Aminosäuresequenz 1 bis 465 in der Sequenz ID. No. 1 umfasst, oder mit einem Protein, das die Aminosäuresequenz 1 bis 437 in Sequenz ID. No. 2 umfasst, aufweist.
➄ Isolierte DNA oder Gen, die ein Gen umfassen, das eine Exon-Deletion, eine Nonsense-Basensubstitution, eine Missense-Basensubstitution, eine Basendeletion, eine Basenaddition, eine Baseninsertion, eine Spleißabnormalität und/oder eine Rasterverschiebung in Bezug auf die Basensequenz gemäß einem der Abschnitte ➀ bis ➃ aufweist; oder eine Basensequenz aufweist, die damit hybridisierbar ist oder mit einem komplementären Strang davon hybridisierbar ist, wobei die isolierte DNA oder das Gen mit Parkinson-Krankheit in Verbindung steht.
➅ Isolierte DNA oder Gen oder Genfragment, die eine partielle Basensequenz der DNA oder des Gens gemäß einem der Ansprüche ➀ bis ➄ umfassen, oder isolierte DNA oder Gen oder Genfragment, umfassend eine Basensequenz, die damit hybridisierbar ist oder mit einem komplementären Strang davon hybridisierbar ist.
➆ Gen, kodierend für ein Protein (a) oder (b), umfassend (a) das Protein, umfassend die Aminosäuresequenz 1 bis 465 in der Sequenz ID. No. 1; (b) das Protein, bei dem eine oder mehrere Aminosäuren der Aminosäuresequenz deletiert, substituiert oder addiert sind und das Protein mit Parkinson-Krankheit in Verbindung steht. ➇ Gen, kodierend für ein Protein (c) oder (d): (c) das Protein, umfassend die Aminosäuresequenz 1 bis 437 in der Sequenz ID. No. 2; (d) das Protein, bei dem eine oder mehrere Aminosäuren der Aminosäuresequenz deletiert, substituiert oder addiert sind, wobei das Protein mit der Parkinson-Krankheit in Verbindung steht.

Die Basensequenz von voller Länge in er Sequenz ID No. 1 ist so beschaffen, dass 11 Introns zwischen 12 Exons am Genom liegen; und ein Protein mit der Aminosäuresequenz 1 bis 465 in einem Teil (102 bis 1496) der Basensequenz kodiert wird. Die Basensequenz des Introns in einem Grenzbereich zwischen dem Exon und dem Intron weist die folgende Anordnung auf:
das Intron, das zwischen Exon 1 und 2 liegt, weist eine in Sequenz ID. No. 3 neben dem 3'-Ende des Exons 1 dargestellte Basensequenz auf und weist eine in Sequenz ID. No. 4 neben dem 5'-Ende des Exons 2 dargestellte Basensequenz auf;
das Intron, das zwischen Exon 2 und Exon 3 liegt, weist eine in Sequenz ID.
No. 5 neben dem 3'-Ende des Exons 2 dargestellte Basensequenz auf und weist eine in Sequenz ID. No. 6 neben dem 5'-Ende des Exons 3 dargestellte Basensequenz auf;
das Intron, das zwischen Exon 3 und Exon 4 liegt, weist eine in Sequenz ID.
No. 7 neben dem 3'-Ende des Exons 3 dargestellte Basensequenz auf und weist eine in Sequenz ID. No. 8 neben dem 5'-Ende des Exons 4 dargestellte Basensequenz auf;
das Intron, das zwischen Exon 4 und Exon 5 liegt, weist eine in Sequenz ID.
No. 9 neben dem 3'-Ende des Exons 4 dargestellte Basensequenz auf und weist eine in Sequenz ID. No. 10 neben dem 5'-Ende des Exons 5 dargestellte Basensequenz auf;
das Intron, das zwischen Exon 5 und Exon 6 liegt, weist eine in Sequenz ID. No. 11 neben dem 3'-Ende des Exons 5 dargestellte Basensequenz auf und weist eine in Sequenz ID. No. 12 neben dem 5'-Ende des Exons 6 dargestellte Basensequenz auf;
das Intron, das zwischen Exon 6 und Exon 7 liegt, weist eine in Sequenz ID. No. 13 neben dem 3'-Ende des Exons 6 dargestellte Basensequenz auf und weist eine in Sequenz ID. No. 14 neben dem 5'-Ende des Exons 7 dargestellte Basensequenz auf;
das Intron, das zwischen Exon 7 und Exon 8 liegt, weist eine in Sequenz ID. No. 15 neben dem 3'-Ende des Exons 7 dargestellte Basensequenz auf und weist eine in Sequenz ID. No. 16 neben dem 5'-Ende des Exons 8 dargestellte Basensequenz auf;
das Intron, das zwischen Exon 8 und Exon 9 liegt, weist eine in Sequenz ID. No. 17 neben dem 3'-Ende des Exons 8 dargestellte Basensequenz auf und weist eine in Sequenz ID. No. 18 neben dem 5'-Ende des Exons 9 dargestellte Basensequenz auf;
das Intron, das zwischen Exon 9 und Exon 10 liegt, weist eine in Sequenz ID. No. 19 neben dem 3'-Ende des Exons 9 dargestellte Basensequenz auf und weist eine in Sequenz ID. No. 20 neben dem 5'-Ende des Exons 10 dargestellte Basensequenz auf;
das Intron, das zwischen Exon 10 und Exon 11 liegt, weist eine in Sequenz ID. No. 21 neben dem 3'-Ende des Exons 10 dargestellte Basensequenz auf und weist eine in Sequenz ID. No. 22 neben dem 5'-Ende des Exons 11 dargestellte Basensequenz auf; und
das Intron, das zwischen Exon 11 und Exon 12 liegt, weist eine in Sequenz ID. No. 23 neben dem 3'-Ende des Exons 11 dargestellte Basensequenz auf und weist eine in Sequenz ID. No. 24 neben dem 5'-Ende des Exons 12 dargestellte Basensequenz auf.
Ferner kann ein rekombinanter Vektor, der das DNA-Fragment oder das Gen nach einem der Abschnitte ➀ bis ➇ umfasst, unter den Schutzumfang der Erfindung fallen, sofern dieser von den beigefügten Ansprüchen umfasst wird.
Beim hier beschriebenen Protein handelt es sich um (i) ein Protein, das die Aminosäuresequenz 1 bis 465 in Sequenz ID. No. 1 umfasst; oder (ii) ein Protein, das die Aminosäuresequenz 1 bis 437 in Sequenz ID. No. 2 umfasst, wobei das Protein mit Parkinson-Krankheit in Verbindung steht; oder ein Protein, das eine im wesentlichen gleichwertige Funktion hierzu aufweist.
Insbesondere können das Protein oder Polypeptid die folgenden Aspekte (ii) bis viii umfassen.

(ii) Ein Protein, das durch das Gen gemäß einem der Abschnitte ➀ bis exprimiert wird, wobei das Protein mit Parkinson-Krankheit assoziiert ist oder eine identische Funktion hierzu oder eine im wesentlichen gleichwertige Funktion hierzu aufweist.
(iii) Ein Protein, das eine durch das Gen gemäß Abschnitt ➄ translatierte Aminosäuresequenz umfasst, wobei das Protein mit Parkinson-Krankheit assoziiert ist oder eine identische Funktion damit oder eine im wesentlichen gleichwertige Funktion damit aufweist.
(iv) Ein Protein, das die Aminosäuresequenz von (iii) umfasst, wobei eine Aminosäure an mindestens einer Position substituiert, deletiert oder addiert ist und das Protein mit Parkinson-Krankheit in Verbindung steht.
(v) Ein Protein, umfassend die Aminosäuresequenz nach einem der Abschnitte (ii) bis (iv), umfassend: eine Ubiquitin-artige Aminosäuresequenz 1 bis 72, die partiell in Sequenz ID. No. 1 enthalten ist; und die Zink-Fingerprotein-artige Aminosäuresequenz 418 bis 449, die partiell in der Sequenz ID. No. 1 enthalten ist.
(vi) Ein Protein (a) oder (b): (a) das Protein, umfassend die Aminosäuresequenz 1 bis 465 in der Sequenz ID. No. 1; (b) das Protein, bei dem eine oder mehrere Aminosäuren der Aminosäuresequenz deletiert, substituiert oder addiert sind, wobei das Protein mit Parkinson-Krankheit in Verbindung steht.
(vii) Ein Protein (c) oder (d): (c) das Protein, umfassend die Aminosäuresequenz 1 bis 437 in der Sequenz ID. No. 2; (d) das Protein, bei dem eine oder mehrere Aminosäuren der Aminosäuresequenz deletiert, substituiert oder addiert sind, wobei das Protein mit Parkinson-Krankheit in Verbindung steht.
(viii) Ein Polypeptid oder ein Protein, bestehend aus einem partiellen Fragment der Aminosäuresequenz nach einem der Abschnitte (i) bis (vii) oder umfassend das partielle Fragment davon oder die Aminosäuresequenz von voller Länge davon.

Ferner können unter den Umfang der Erfindung ein monoklonaler Antikörper oder ein polyklonaler Antikörper gegen das Protein nach einem der Abschnitte (i) bis (viii) fallen, sofern sie von den Ansprüchen umfasst werden.
Ferner können erfindungsgemäß ein Primer oder eine Sonde oder eine immoqbilisierte Nucleinsäure oder ein DNA-Chip gemäß der Erfindung vorzugsweise für die folgenden Zwecke (I) bis (IV) verwendet werden:

(I) Zur Verwendung beim Nachweis einer Basensequenz, einer genetischen Mutation, einer Deletion und/oder einer Expressionsmenge der DNA oder des Gens gemäß einem der Abschnitte ➀ bis ➇ oder zur Verwendung bei deren Einengung;
(II) zur Verwendung beim Nachweis einer Basensequenz, einer genetischen Mutation, einer Deletion und/oder einer Expressionsmenge einer RNA, die einer Transkription unterworfen wird und einer Prozessierung aus der DNA oder dem Gen gemäß einem der Abschnitte ➀ bis ➇ unterworfen wird, oder zur Verwendung bei deren Einengung;
(III) zur Verwendung beim Nachweis einer Basensequenz, einer genetischen Mutation und/oder Deletion des Exons in der Sequenz ID. No. 1 oder No. 2 oder zur Verwendung bei der Haplotypisierung eines Locus davon; oder
(IV) zur Verwendung beim Nachweis einer Basensequenz, einer genetischen Mutation und/oder einer Deletion des vorerwähnten Introns oder zur Verwendung bei der Haplotypisiereung eines Locus davon.

Speziell kann mindestens einer von 14 Sätzen von Primern oder Sonden, die in den nachstehenden Abschnitten (1) bis (14) dargestellt sind, verwendet werden.

(1) Ein Primer oder eine Sonde zur Verwendung beim Nachweis einer Basensequenz des Introns neben dem Exon 1 des Gens, das mit Parkinson-Krankheit im Zusammenhang steht, nach Abschnitt ➀ oder eines Locus davon, wobei der Primer oder die Sonde die folgende Basensequenz umfasst: eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 25 in der 5'-3'-Richtung der Sequenz ID. No. 1 am Genom und eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 26 in der 5'-3'-Richtung an einem komplementären Strang der Sequenz ID. No. 1 am Genom.
(2) Ein Primer oder eine Sonde zur Verwendung beim Nachweis einer Basensequenz des Introns neben dem Exon 2 des Gens, das mit Parkinson-Krankheit im Zusammenhang steht, nach Abschnitt ➀ oder eines Locus davon, wobei der Primer oder die Sonde die folgende Basensequenz umfasst: eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 27 in der 5'-3'-Richtung der Sequenz ID. No. 1 am Genom und eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 28 in der 5'-3'-Richtung an einem komplementären Strang der Sequenz ID. No. 1 am Genom.
(3) Ein Primer oder eine Sonde zur Verwendung beim Nachweis einer Basensequenz des Introns neben dem Exon 3 des Gens, das mit Parkinson- Krankheit im Zusammenhang steht, nach Abschnitt ➀ oder eines Locus davon, wobei der Primer oder die Sonde die folgende Basensequenz umfasst: eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 29 in der 5'-3'-Richtung der Sequenz ID. No. 1 am Genom und eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 30 in der 5'-3'-Richtung an einem komplementären Strang der Sequenz ID. No. 1 am Genom.
(4) Ein Primer oder eine Sonde zur Verwendung beim Nachweis einer Basensequenz des Introns neben dem Exon 4 des Gens, das mit Parkinson-Krankheit im Zusammenhang steht, nach Abschnitt ➀ oder eines Locus davon, wobei der Primer oder die Sonde die folgende Basensequenz umfasst: eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 31 in der 5'-3'-Richtung der Sequenz ID. No. 1 am Genom und eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 32 in der 5'-3'-Richtung an einem komplementären Strang der Sequenz ID. No. 1 am Genom.
(5) Ein Primer oder eine Sonde zur Verwendung beim Nachweis einer Basensequenz des Introns neben dem Exon 4 des Gens, das mit Parkinson-Krankheit im Zusammenhang steht, nach Abschnitt ➀ oder eines Locus davon, wobei der Primer oder die Sonde die folgende Basensequenz umfasst: eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 33 in der 5'-3'-Richtung der Sequenz ID. No. 1 am Genom und eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 34 in der 5'-3'-Richtung an einem komplementären Strang der Sequenz ID. No. 1 am Genom.
(6) Ein Primer oder eine Sonde zur Verwendung beim Nachweis einer Basensequenz des Introns neben dem Exon 5 des Gens, das mit Parkinson-Krankheit im Zusammenhang steht, nach Abschnitt ➀ oder eines Locus davon, wobei der Primer oder die Sonde die folgende Basensequenz umfasst: eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 35 in der 5'-3'-Richtung der Sequenz ID. No. 1 am Genom und eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 36 in der 5'-3'-Richtung an einem komplementären Strang der Sequenz ID. No. 1 am Genom.
(7) Ein Primer oder eine Sonde zur Verwendung beim Nachweis einer Basensequenz des Introns neben dem Exon 6 des Gens, das mit Parkinson-Krankheit im Zusammenhang steht, nach Abschnitt ➀ oder eines Locus davon, wobei der Primer oder die Sonde die folgende Basensequenz umfasst: eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 37 in der 5'-3'-Richtung der Sequenz ID. No. 1 am Genom und eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 38 in der 5'-3'-Richtung an einem komplementären Strang der Sequenz ID. No. 1 am Genom.
(8) Ein Primer oder eine Sonde zur Verwendung beim Nachweis einer Basensequenz des Introns neben dem Exon 7 des Gens, das mit Parkinson-Krankheit im Zusammenhang steht, nach Abschnitt ➀ oder eines Locus davon, wobei der Primer oder die Sonde die folgende Basensequenz umfasst: eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 39 in der 5'-3'-Richtung der Sequenz ID. No. 1 am Genom und eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 40 in der 5'-3'-Richtung an einem komplementären Strang der Sequenz ID. No. 1 am Genom.
(9) Ein Primer oder eine Sonde zur Verwendung beim Nachweis einer Basensequenz des Introns neben dem Exon 7 des Gens, das mit Parkinson-Krankheit im Zusammenhang steht, nach Abschnitt ➀ oder eines Locus davon, wobei der Primer oder die Sonde die folgende Basensequenz umfasst: eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 41 in der 5'-3'-Richtung der Sequenz ID. No. 1 am Genom und eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 42 in der 5'-3'-Richtung an einem komplementären Strang der Sequenz ID. No. 1 am Genom.
(10) Ein Primer oder eine Sonde zur Verwendung beim Nachweis einer Basensequenz des Introns neben dem Exon 8 des Gens, das mit Parkinson-Krankheit im Zusammenhang steht, nach Abschnitt ➀ oder eines Locus davon, wobei der Primer oder die Sonde die folgende Basensequenz umfasst: eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 43 in der 5'-3'-Richtung der Sequenz ID. No. 1 am Genom und eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 44 in der 5'-3'-Richtung an einem komplementären Strang der Sequenz ID. No. 1 am Genom.
(11) Ein Primer oder eine Sonde zur Verwendung beim Nachweis einer Basensequenz des Introns neben dem Exon 9 des Gens, das mit Parkinson-Krankheit im Zusammenhang steht, nach Abschnitt ➀ oder eines Locus davon, wobei der Primer oder die Sonde die folgende Basensequenz umfasst: eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 45 in der 5'-3'-Richtung der Sequenz ID. No. 1 am Genom und eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 46 in der 5'-3'-Richtung an einem komplementären Strang der Sequenz ID. No. 1 am Genom.
(12) Ein Primer oder eine Sonde zur Verwendung beim Nachweis einer Basensequenz des Introns neben dem Exon 10 des Gens, das mit Parkinson-Krankheit im Zusammenhang steht, nach Abschnitt ➀ oder eines Locus davon, wobei der Primer oder die Sonde die folgende Basensequenz umfasst: eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 47 in der 5'-3'-Richtung der Sequenz ID. No. 1 am Genom und eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 48 in der 5'-3'-Richtung an einem komplementären Strang der Sequenz ID. No. 1 am Genom.
(13) Ein Primer oder eine Sonde zur Verwendung beim Nachweis einer Basensequenz des Introns neben dem Exon 11 des Gens, das mit Parkinson-Krankheit im Zusammenhang steht, nach Abschnitt ➀ oder eines Locus davon, wobei der Primer oder die Sonde die folgende Basensequenz umfasst: eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 49 in der 5'-3'-Richtung der Sequenz ID. No. 1 am Genom und eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 50 in der 5'-3'-Richtung an einem komplementären Strang der Sequenz ID. No. 1 am Genom.
(14) Ein Primer oder eine Sonde zur Verwendung beim Nachweis einer Basensequenz des Introns neben dem Exon 12 des Gens, das mit Parkinson-Krankheit im Zusammenhang steht, nach Abschnitt ➀ oder eines Locus davon, wobei der Primer oder die Sonde die folgende Basensequenz umfasst: eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 51 in der 5'-3'-Richtung der Sequenz ID. No. 1 am Genom und eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 52 in der 5'-3'-Richtung an einem komplementären Strang der Sequenz ID. No. 1 am Genom. Ferner kann die vorliegende Erfindung das folgende Oligonucleotid oder ein Oligonucleotid-Analoges oder ein modifiziertes Produkt davon gemäß den Angaben in (a) bis (c) umfassen, sofern sie unter die beigefügten Ansprüche fallen: (a) ein Produkt, das eine partielle Sequenz der Basensequenz nach einem der Abschnitte ➀ bis ➇ umfasst oder mit der Basensequenz nach einem der Abschnitte ➀ bis ➇ hybridisierbar ist; (b) ein Produkt zur Verwendung bei der Amplifikation der Basensequenz von voller Länge oder der partiellen Basensequenz nach einem der Abschnitte ➀ bis ➇ oder das Oligonucleotid zur Verwendung bei der partiellen Amplifikation der Basensequenz von voller Länge oder der partiellen Basensequenz nach einem der Abschnitte ➀ bis ➇ gemäß dem PCR-Verfahren unter Verwendung einer humanen RNA als Matrize, dem PCR-Verfahren oder dem RT-PCR-Verfahren unter Verwendung einer humanen cDNA als Matrize; (c) das Oligonucleotid zur Verwendung bei der Amplifikation der Basensequenz, die das Exon in der Sequenz ID. No. 1 oder No. 2 und das vorerwähnte Intron, das sich neben dem Exon befindet, umfasst, gemäß dem PCR-Verfahren oder das Oligonucleotid zur Verwendung bei der Amplifikation eines Teils der Basensequenz nach dem PCR-Verfahren.

Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 ist ein Diagramm zur Darstellung des Stammbaums von Familienmitgliedern unter Einschluss des Parkinson-Patienten von Beispiel 1.
2 ist ein Diagramm zur Darstellung der Ergebnisse der Haplotypisierung gemäß der PCR-Analyse in Bezug auf die Familienmitglieder, einschließlich des Parkinson-Patienten von 1.
3 ist ein Diagramm zur Darstellung der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Gendeletion bei den Familienmitgliedern, einschließlich des Parkinson-Patienten von 1.
4 ist ein Diagramm zur Darstellung einer Ausrichtung von 6 cDNA-Fragmenten und eines Gens von voller Länge gemäß Isolation in Beispiel 3.
5 ist ein Diagramm zur Darstellung der Aminosäure-Sequenzhomologie zwischen dem N-Terminus des erfindungsgemäßen Gens und Ubiquitin.
6 ist ein Diagramm zur Darstellung des Ergebnisses der Gelelektrophorese eines EcoRI-Verdauungsprodukts von genomischen DNA-Fragmenten in Bezug auf die Familienmitglieder unter Einschluss des Parkinson-Patienten von 1.
7 ist ein Diagramm zur Darstellung des Stammbaums von Familienmitgliedern unter Einschluss des Parkinson-Patienten von Beispiel 7.
8 ist ein Diagramm zur Darstellung der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Gendeletion in Bezug auf die Familienmitglieder unter Einschluss des Parkinson-Patienten von 7.
9 ist ein Diagramm zur Darstellung eines cDNA-Fragments des Parkinson-Patienten von 7, erhalten gemäß Beispiel 7.
10 ist ein Diagramm zur Darstellung von mRNAs des erfindungsgemäßen Gens, das in verschiedenen humanen Geweben exprimiert wird.
11 zeigt Diagramme von mRNAS des erfindungsgemäßen Gens, das in verschiedenen humanen Geweben exprimiert wird.
12 ist ein Diagramm zur Darstellung des Stammbaums von Familienmitgliedern unter Einschluss des Parkinson-Patienten von Beispiel 9.
13 ist ein Diagramm zur Darstellung der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Gendeletion bei den Familienmitgliedern unter Einschluss des Parkinson-Patienten von 12.
14 ist ein Diagramm zur Darstellung des Ergebnisses der Gelelektrophorese eines EcoRI-Verdauungsprodukts von genomischen DNA-Fragmenten in Bezug auf die Familienmitglieder unter Einschluss des Parkinson-Patienten von 12.
15 ist ein Diagramm zur Darstellung des Stammbaums von Familienmitgliedern unter Einschluss des Parkinson-Patienten von Beispiel 10.
16 ist ein Diagramm zur Darstellung der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Gendeletion in Bezug auf die Familienmitglieder unter Einschluss des Parkinson-Patienten von 15.
17 ist ein Diagramm zur Darstellung des Stammbaums von Familienmitgliedern unter Einschluss des Parkinson-Patienten von Beispiel 11.
18 ist ein Diagramm zur Darstellung der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Gendeletion in Bezug auf die Familienmitglieder von 17.
19 ist ein Diagramm zur Darstellung des Stammbaums von Familienmitgliedern unter Einschluss des Parkinson-Patienten von Beispiel 12.
20 ist ein Diagramm zur Darstellung der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Gendeletion in Bezug auf die Familienmitglieder unter Einschluss des Parkinson-Patienten von 19.
21 ist ein Diagramm zur Darstellung des Stammbaums von Familienmitgliedern unter Einschluss des Parkinson-Patienten von Beispiel 13.
22 ist ein Diagramm zur Darstellung der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Gendeletion in Bezug auf die Familienmitglieder unter Einschluss des Parkinson-Patienten von 21.
23 ist ein Diagramm zur Darstellung des Stammbaums von Familienmitgliedern unter Einschluss des Parkinson-Patienten von Beispiel 14.
24 ist ein Chromatogramm zur Darstellung des Ergebnisses der direkten Sequenzierung von PCR-Produkten von Exon 5 einer Wildallele und einer mutanten Allele.
25 ist ein Diagramm zur Darstellung der DNA- und Aminosäuresequenzen eines Wildtyp (W)-Parkin-Gens und der vorhergesagten Sequenz eines mutanten (M) Parkin-Moleküls mit einer Einbasendeletion.
26 ist ein Diagramm zur Darstellung des Ergebnisses einer NIaIV-Restriktionsstellenanalyse von PCR-Produkten in Beispiel 14.
27 zeigt photomikrographische Aufnahmen zur Darstellung des Ergebnisses einer immunohistochemischen Färbung des erfindungsgemäßen Gens, das in Gehirnschnitten exprimiert ist.
28 zeigt photomikrographische Aufnahmen zur Darstellung des Ergebnisses einer Immunofärbung des erfindungsgemäßen Gens, das in Gehirnschnitten exprimiert wird, von Polyubiquitin und α-Synuclein.
29 ist ein Diagramm zur Darstellung des Ergebnisses des Immunoblottings der vollständigen Homogenisate des Stirnlappens von Kontrollsubjekten, Parkinson-Patienten und AR-JP-Patienten.
30 ist ein Diagramm zur Darstellung des Ergebnisses des Immunoblottings der subzellulären Fraktionen des Stirnlappengewebes eines Kontrollsubjekts.
31 ist ein Diagramm zur Darstellung des Ergebnisses des Immunoblottings der vollständigen Homogenisate von SN, Putamen und Stirnlappen von Kontrollsubjekten, Parkinson-Patienten und AR-JP-Patienten.
32 ist ein Diagramm zur Darstellung der Gelelektrophorese von PCR-Produkten von Exon 4 und Exon 10.
33 ist ein Diagramm, das durch Auftragen des hydropathischen Index der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz erhalten worden ist.
34 ist ein Diagramm, das zeigt, dass ein Ersatz von –366 Arg durch Trp den α-Helixbereich in eine β-Blattstruktur abändert.
Beste Ausführungsform zur Durchführung der Erfindung
Es wird angenommen, dass die Parkinson-Krankheit oder der Parkinsonismus durch eine genetische Prädisposition und durch Umweltfaktoren eingeleitet wird. Die Aufklärung von individuellen Faktoren stellt eine dringende Aufgabe in Bezug auf das fundamentale Verständnis und die Behandlung der Parkinson-Krankheit und des Parkinsonismus im Stadium des Einsetzens der Krankheit dar. Die Erfinder haben Untersuchungen angestellt, um ein Gen aufzufinden, das für das Einsetzen der Parkinson-Krankheit verantwortlich ist. Als Ergebnis ihrer Untersuchungen haben sie festgestellt, dass die Region des Chromosoms 6q25.2-q27, spezieller eine 17-cM-Region zwischen den zwei Chromosomenmarkern DS437 und D6S264, eine starke Verbindung mit juvenilem Parkinsonismus, einer der Parkinson-Krankheiten, aufweist (Matsumine et al., Am. J. Hum. Genet., Bd. 60 (1997), S. 588-596). Die Erfinder konnten mit Erfolg das für die Parkinson-Krankheit verantwortliche Gen isolieren, indem sie die nachstehend erwähnten Beispiele bei Patienten mit der juvenilen Parkinson-Krankheit durchführten. Dadurch sind sie zu der vorliegenden Erfindung gelangt.
Nachstehend wird die vorliegende Erfindung ausführlich unter Bezugnahme auf die Experimente, die zum Auffinden des erfindungsgemäßen Gens beigetragen haben, beschrieben. Es ist darauf hinzuweisen, dass die folgenden Beispiele nur der Erläuterung dienen und keine Beschränkung darstellen. Sämtliche Abänderungen, die innerhalb der Grenzen und des Umfangs der Ansprüche liegen oder Äquivalente derartiger Grenzen und Bereiche sollen somit unter die Ansprüche fallen.
Beispiel 1
Chromosomaler Deletionsbereich bei einem Patienten mit juveniler Parkinson-Krankheit
1 zeigt den Stammbaum von Familienmitgliedern unter Einschluss des Parkinson-Patienten von Beispiel 1. In 1 bezeichnet ein leeres Quadrat eine nicht betroffene männliche Person, ein leerer Kreis eine nicht betroffene weibliche Person und ein ausgefüllter Kreis die betroffene weibliche Person. Kreise oder Quadrate mit Schrägstrichen bezeichnen verstorbene Familienmitglieder. Obgleich die Eltern und Brüder der Patientin nicht betroffen sind, wies die Patientin ab dem zweiten Lebensjahrzehnt Parkinson-artige Symptome auf. Bei ihr wurde die Diagnose der Parkinson-Krankheit gestellt. Die Symptome nahmen allmählich zu.
Eine Haplotypisierung gemäß dem PCR-Verfahren wurde unter Verwendung von D6S305, einem der Marker des Chromosoms 6, an der genomischen DNA von Subjekten, die in 1 mit einem Stern gekennzeichnet sind (Patientin und zwei nicht betroffene Familienmitglieder) durchgeführt. Die Ergebnisse sind in 2 aufgeführt.
Wie aus 2 ersichtlich ist, wurde D6S305 aus einer DNA-Matrize der Eltern und Brüder des Patienten amplifiziert, jedoch wurde D6S305 aus der DNA-Matrize der Patienten nicht amplifiziert. Demzufolge wurde bestätigt, dass die Patientin eine Deletion von D6S305, bei dem es sich um einen der chromosomalen Marker handelt, aufweist.
Beispiel 2
Screening eines genomischen Fragments unter Einschluss von D6S305 und Exon-Trapping
Da in Beispiel 1 bestätigt wurde, dass die Patientin eine Deletion der genomischen DNA entsprechend dem Marker D6S305 aufweist, besteht die Möglichkeit, dass ein Gen, das für die Parkinson-Krankheit verantwortlich ist, an der genomischen DNA vorliegt. Um diese Möglichkeit zu bestätigen, wurde ein PCR-Screening durchgeführt, um eine normale, humane, genomische Bibliothek, die aus 96 000 genomischen Fragmenten (die humane Keio-BAC-Bibliothek) bestand, unter Verwendung eines Satzes von Amplimeren mit einer Sequenz eines Teils des Markers D6S305 durchgeführt. Als Ergebnis des Screenings wurden zwei Klone, die genomischen Fragmente KB761D4 und KB430C4, die jeweils eine Insertgröße von etwa 110 kb aufweisen, isoliert.
Anschließend wurde ein Exon-Trapping durchgeführt, um ein Exon-Fragment des Gens, das an den genomischen Fragmenten vorliegt, zu isolieren, wobei ein Exon-Trappingsystem (von GIBCO/BRL) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wurde. Es ergab sich, dass es sich beim isolierten Exon nur um J-17 handelte, trotz der Tatsache, dass die beiden genomischen Fragmente jeweils eine relativ umfangreiche Größe von etwa 110 kb aufwiesen.
Anschließend wurde die Basensequenz des Introns neben dem Exon J-17 auf der Grundlage der Basensequenz des Exons J-17 unter Verwendung eines PCR-Primers zur Amplifikation des Exons J-17 selbst (J-17 innen) und von BAC KB761D4 als Matrize bestimmt. Sodann wurden zwei Sätze von PCR-Primern (J-17 außen) hergestellt, um das Fragment unter Einschluss von J-17 auf der Grundlage der auf diese Weise bestimmten Sequenz des Introns zu amplifizieren. Auf diese Weise wurde eine PCR-Amplifikationsanalyse auf die genomische DNA der in Beispiel 1 aufgeführten Subjekte durchgeführt (Patientin und die nicht betroffenen Eltern und Brüder). Das Ergebnis der Analyse ist in 3 dargestellt. Es ist darauf hinzuweisen, dass 3 das Ergebnis von Beispiel 6 sowie auch das Ergebnis von Beispiel 2 zeigt.
Wie in 3 dargestellt, wurde aus der genomischen DNA der Patientin kein PCR-Produkt nachgewiesen (Bahn 3), während ein PCR-Produkt aus der normalen genomischen DNA des Vaters (Bahn 1), der Mutter (Bahn 2) und des Bruders (Bahn 4) nachgewiesen wurde. Dies lässt darauf schließen, dass die Patientin mindestens eine chromosomale Deletion entsprechend dem Exon J-17 des erfindungsgemäßen Gens aufweist.
Beispiel 3
Screening des erfindungsgemäßen Gens aus einer normalen humanen cDNA-Bibliothek
Anschließend wurde ein Screening des erfindungsgemäßen Gens unter Verwendung einer humanen cDNA-Bibliothek durchgeführt, um cDNAs zu isolieren, die das Gen von voller Länge unter Einschluss von J-17 zusammen mit dessen Translationssequenz von voller Länge abdecken. Speziell wurden cDNA-Bibliotheken von normalem, humanem, fötalem Hirn und Skelettmuskel von der Fa. Clontech bezogen. Das J-17-Fragment, das Bestandteil des Exons des erfindungsgemäßen Gens ist und in Beispiel 2 isoliert worden ist, wurde als anfängliche Sonde verwendet und Insertions-DNA-Fragmente von positiven Klonen, die durch anfängliches Screening unter Verwendung der anfänglichen Sonde isoliert worden waren, wurden als Sonden für das sekundäre Screening verwendet. Als Ergebnis wurden sieben cDNA-Klone [HFB1, HFB3, HFB4, HFB5, SKM1, SKM3 und SKM8], die in 4 dargestellt sind, isoliert. Die Insertions-DNA-Fragmente von positiven Klonen wurden mit zwei Sätzen von vektorspezifischen Primern amplifiziert
(F10 innen: 5'-AGCCTGGTTAAGTCCAAGCTG-3' und R10 innen: 5'-GAAGGTCCCATTTTTCGTTTTC-3').
Das auf diese Weise amplifizierte positive DNA-Fragment wurde direkt gemäß dem Primer-Walking-Verfahren sequenziert. Eine Zyklus-Sequenzierung wurde unter Verwendung der vorerwähnten Primer und eines handelsüblichen Kits [ABI PRISM-Markierungskits (Produkt der Fa. Perkin-Elmer)] und des ABI-Sequenziergeräts Modell 377DNA (Produkt der Fa. Applied Biosystems) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
Dabei wurde festgestellt, dass sieben cDNAs eine Stapelbeziehung aufweisen, wie in 4 dargestellt ist. Die längste Basensequenz SKM8 weist 2960 bp auf, die eine volle Länge der Translationssequenz umfasst, die für ein Protein mit 1395 bp (nt102 bis nt1496 oder bis nt1499 unter Einschluss des Stoppcodons) und 465 Aminosäuren umfasst.
Ferner wurde festgestellt, dass vier cDNA-Klone (HFB3, HFB4, SKM1 und SKM3) von sieben cDNAs 84 bp von nt636 bis nt719 verloren hatten. Dies impliziert, dass es mindestens zwei Wege zum Spleißen gibt, wenn reife mRNA aus diesem erfindungsgemäßen Gen am Genom durch Spleißen wächst.
Ferner wurde bestätigt, dass der N-terminale Bereich (von Methionin-1 bis Arginin-72) des Proteins, das aus der Aminosäuresequenz 1 bis 465, die durch das erfindungsgemäße Gen kodiert wird, besteht, eine mäßige Homologie (Gehalt an gleichen Aminosäuren: 33 %) mit Ubiquitin aufweist, wie in 5 gezeigt ist.
Ubiquitin ist bekanntlich eine wichtige Substanz, die ein Protein, das in einer Zelle nicht mehr benötigt wird, entfernt. Seine Beteiligung bei verschiedenen neurodegenerativen Krankheiten wurde ebenfalls betont. Ferner ist es bekannt, dass gepaarte helikale Filamente (PHFs) bei der Alzheimer-Krankheit und Lewy-Körper bei der Parkinson-Krankheit durch einen anti-Polyubiquitin-Antikörper gefärbt werden. Folgender Wirkungsmechanismus wird angenommen: Ubiquitin wird mit verschiedenen Proteinen konjugiert und bildet durch wiederholte Konjugationen eine Multiubiquitinkette und induziert eine Hemmung des Proteasom-Wegs und wird schließlich metabolisiert.
Vom Lysinrest 48 ist bekannt, dass er ein wesentliches Element für das Ubiquitin-Konjugat darstellt. Da Lysin im vorgenannten Protein in Position 48 vorliegt und die Aminosäuresequenz in der Nähe der Zielregion (beispielsweise die Positionen 44 bis 48 und die Position 51) mit der von Ubiquitin übereinstimmt, entsteht die Vermutung, dass das vorstehende Protein eine Ubiquitin-artige Funktion ausübt. Ferner wurden in neueren Untersuchungen einige konjugierte Proteine gefunden, die einen Ubiquitin-artigen Bereich an ihrem N-terminalen Bereich aufweisen. Der letztgenannte Befund lässt darauf schließen, dass der Ubiquitin-artige Bereich als molekularer Begleiter wirkt.
Obgleich eine Homologie mit Ubiquitin am N-terminalen Bereich des vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Proteins beobachtet wird, wird eine Homologie mit Ubiquitin in Bezug auf die Aminosäuresequenz in Position 73 und im Anschluss daran selten festgestellt. Als weiteres Merkmal weist das erfindungsgemäße Protein eine Aminosäuresequenz in der Nähe des C-terminalen Bereiches (Positionen 418 bis 449) auf, die eine große Anzahl an Cysteinresten enthält: Cys-X₂-Cys-Xg-Cys-X₁-His-X₂-Cys-X₄-Cys-X₄-Cys-X₂-Cys. Diese Sequenz weist eine äußerst große Ähnlichkeit zu der Sequenz eines Ringfingermotivs (Cys-X₂-Cys-X(_9-399)-Cys-X(_1-3)-His-X(_2-3)-Cys-X₂-Cys-X(_4-48)-Cys-X₂-Cys), einer Art einer Sequenz eines Zink-Bindungsmotivs in einem Zink-Fingerprotein (ein mit Zink konjugiertes Protein, das stark am Wachstum, der Differenzierung und Erzeugung einer Zelle beteiligt ist) auf. Demzufolge wird angenommen, dass es sich beim erfindungsgemäßen Protein um ein neues Mitglied der Zink-Finger-Proteine handelt.
Beispiel 4
Screening des erfindungsgemäßen genomischen Gens aus der Genombibliothek
Wie vorstehend erwähnt, wurde nur das Exon (J-17) in zwei positiven genomischen Klonen (KB761D4 und KB430C4), die in Beispiel 2 erhalten worden waren, gefunden. In diesem Beispiel wurden zu dem Zweck, ein genomisches Fragment mit einem Gehalt an anderen Exons zu erhalten, ein BAC-Klon-Screening durch Hybridisierung von DNA aus einer Genombibliothek, die aus 95 232 Klonen (humane Keio-BAC-Bibliothek) unter Verwendung des SKM8-Klons, der unter den positiven Klonen, die aus der vorerwähnten cDNA-Bibliothek erhalten wurden, am größten ist, als Sonde durchgeführt. Als Ergebnis wurden 24 neue positive Klone erhalten.
Ferner wurde ein PCR-Primer zur Amplifikation von Exon 1, das dem N-terminalen Bereich der cNDA-Basensequenz entspricht, hergestellt, ein Screening der BAC-Bibliothek gemäß PCR-Amplifikation wurde durchgeführt und ein weiterer neuer positiver Klon wurde erhalten.
Die Identifikation jedes Exons und die Sequenzierung des Introns neben jedem Exon wurde gemäß dem Primer-Walking-Verfahren (BEE-Verfahren) unter Verwendung der vorstehend erhaltenen 25 Klone durchgeführt. Als Analysenergebnis wurden die Exons 1 bis 3, 5, 6 und 8-12 mit jedem der 25 BAC-Klone kartiert. Ferner wurde bestätigt, dass J-17 dem Exon 7 entspricht. BAC-Klone mit einer genomischen Sequenz unter Einschluss von Exon 4 wurden jedoch in den 25 BAC-Klonen nicht gefunden.
Ein weiterer PCR-Primer zur Amplifikation von Exon 4 wurde hergestellt und zwei neue positive Klone wurden durch PCR-Screening unter Verwendung einer von der Fa. Genome Systems Inc. bereitgestellten Genombibliothek erhalten. Eine Sequenzierung der einzelnen Exons und der Introns neben jedem Exon wurde gemäß dem vorerwähnten Primer-Walking-Verfahren unter Verwendung von 27 BAC-DNA-Klonen als Matrize durchgeführt. Die beim Primer-Walking-Verfahren verwendeten Primer wurden in geeigneter Weise auf der Grundlage der cDNA-Sequenz hergestellt. BAC-Klone, die den jeweiligen Primern entsprachen, wurden gemäß der Oligonucleotid-Koloniehybridisierung unter Verwendung des Primers selbst als Sonde abgetrennt. Ein DNA-Sequenziergerät wurde für ihre Sequenzierung verwendet.
Als Ergebnis wurde die Ausrichtung des Exons und Introns dieses erfindungsgemäßen Gens geklärt. Es wurde bestätigt, dass das erfindungsgemäße Gen eine sehr große Spanne über 500 kb aufweist und aus 12 Exons besteht, bei denen 11 sehr große Introns dazwischen angeordnet sind. Die Intronsequenz in der Grenzregion zwischen Exon und Intron entsprach den vorstehenden Ausführungen. Tabelle 1 zeigt die vollständigen Basensequenzen in Exon-Intron-Grenzbereichen.
Beispiel 5
Bestimmung der Basensequenz des Exon-Teils an genomischer DNA
Anschließend wurde die Basensequenz des in Beispiel 4 erhaltenen Exons-Teils amplifiziert, um festzustellen, ob die Basensequenz des Teils mit dem entsprechenden Teil der cDNA übereinstimmt. Speziell wurden 14 Sätze von Primern auf der Grundlage der flankierenden Intronsequenz am 5'-Ende und 3'-Ende der einzelnen Exons hergestellt (der Teil der Primer wurde auf der Grundlage der partiellen Exon-Sequenz hergestellt) und eine PCR-Amplifikation wurde unter Verwendung von DNAs, die nach dem üblichen Verfahren unter Verwendung von normalen, humanen, peripheren Blutleukozyten als Matrize hergestellt worden waren, durchgeführt. Zum Vergleich zeigt Tabelle 2 die Basensequenzen der 14 Primersätze, die in diesem Beispiel verwendet wurden.
Die vorstehende PCR-Amplifikation wurde auf folgende Weise durchgeführt. In diesem Beispiel wurden 10 ml-Reaktionsgemische hergestellt, die jeweils 100 ng DNA, 1 × PCR-Puffer [50 mM Tris-HCl (pH-Wert 9,2 bei 25 °C), 14 mM (NH₄)₂SO₄, 1,75 mM MgCl₂], 350 μM der einzelnen dNTPs, 0,5 μM der einzelnen Primer und 0,35 U Expand Long Taq-Polymerase (Boerhinger Mannheim) enthielten. Die PCR-Bedingungen wurden eingestellt auf 94 °C für 30 sec, 50-53 °C für 30 sec, 68 °C für 30 sec bis 1 min; Wiederholung von 35 Zyklen.
Die Basensequenz der einzelnen DNA-Fragmente, die durch das vorstehende PCR-Verfahren amplifiziert worden waren, wurden unter Verwendung geeigneter PCR-Primer und eines handelsüblichen Kits bestimmt. Das Sequenzierungsergebnis ist in Tabelle 2 aufgeführt.
Wie aus Tabelle 2 ersichtlich ist, wurde bestätigt, dass die gemäß dem PCR-Verfahren unter Verwendung der vorerwähnten Primer amplifizierte Basensequenz mit der Sequenz des entsprechenden Teils der cDNA übereinstimmt.
Beispiel 6
Partielle Deletion des erfindungsgemäßen Gens bei einem juvenilen Parkinson-Patienten (Fall 1)
In diesem Beispiel wurde die Abnormalität des erfindungsgemäßen Gens unter Heranziehung der juvenilen Parkinson-Patientin und der Familienmitglieder von Beispiel 1 geprüft.
Speziell wurden genomische DNAs aus den Leukozyten der Subjekte hergestellt und eine PCR-Amplifikation wurde unter Verwendung der genomischen DNAs als Matrizen und Primer-Sets, die aus den Vorwärtsprimern (5'-3') und Rückwärtsprimern (5'-3') von Exon 2, Exon 3, J-17 Innen, J-17 außen und Exon 8 unter den in Tabelle 2 aufgeführten Primer-Sätzen bestanden, durchgeführt. Das Analysenergebnis ist in 3 dargestellt.
Wie aus 3 ersichtlich ist, wurde bei Benutzung der genomischen DNAs des Vaters (Bahn 1), der Mutter (Bahn 2) und des Bruders (Bahn 4) der Parkinson-Patientin als Matrize die jedem Exon entsprechende Sequenz amplifiziert. Dieses Ergebnis bestätigt, dass die genomischen DNAs dieser Familienmitglieder keine Deletion oder signifikante Mutation aufweisen. Andererseits wurde bei Verwendung der genomischen DNA der Parkinson-Patientin (Bahn 3) als Matrize keine Amplifikation der Basensequenz der genomischen DNA entsprechend den Exons 3, 4, 5, 6 und 7 festgestellt. Dieses Ergebnis bestätigte, dass das genomische Gen der Patientin eine Deletion einer langen Basensequenz entsprechend den Exons 3 bis 7 aufwies.
Ferner wurden die genomischen DNAs der Personen mt EcoRI verdaut, einer Elektrophorese unterzogen und durch Southern-Blot-Analyse auf eine Nylon-Membran geblottet. Eine P-Markierung der SKM8-cDNA-Sonde wurde durch Southern-Blot-Hybridisierung durchgeführt. Als Ergebnis wurde, wie in 6 dargestellt, festgestellt, dass zwar mindestens 8 EcoRI-Fragmente bei den Eltern und dem Bruder der Patientin gefunden wurden, während nur 4 Fragmente bei der Patientin gefunden wurden (In 6 bezeichnet der Stern die 4 EcoRI-Fragmente, die bei der Patientin nicht festgestellt wurden.) Dieses Ergebnis bestätigt auch, dass das genomische Gen der Patientin eine Deletion oder Mutation in einem bestimmten Teil davon aufweist.
Beispiel 7
Partielle Deletion des erfindungsgemäßen Gens bei juvenilen Parkinson-Patienten (Fall 2)
Wie dem Beispiel 6 entnommen werden kann, ist es offensichtlich, dass juvenile Parkinson-Patienten eine Deletion oder dergl. im erfindungsgemäßen Gen aufweisen. Das vorstehende Beispiel lässt stark darauf schließen, dass die Deletion oder dergl. des erfindungsgemäßen Gens für die juvenile Parkinson-Krankheit verantwortlich ist. Um dies zusätzlich zu bestätigen, wurden ähnliche Experimente bei anderen Familienmitgliedern, die mit denen von Beispiel 6 nicht verwandt waren, durchgeführt.
Speziell wurde eine Genomanalyse an den Familienmitgliedern unter Einschluss der Patienten mit juvenilem Parkinson gemäß dem Stammbaum in 7 durchgeführt. Während 2 von 6 Geschwistern nicht betroffen waren, litten die übrigen 4 Geschwister alle an juveniler Parkinson-Krankheit. Eine PCR-Analyse wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 5 unter Verwendung von Primern, die den jeweiligen Exons entsprachen, durchgeführt, wobei die genomischen DNAs der mit einem Stern markierten Mirglieder (nämlich die nicht betroffene Mutter, 2 nicht betroffene Brüder und 2 betroffene Schwestern) als Matrize verwendet wurden. Das Analysenergebnis ist in 8 dargestellt.
Wie aus 8 ersichtlich ist, zeigen zwar die beiden genomischen DNAs der beiden Patienten (Bahnen 2 und 3) in diesem Beispiel eine Deletion des Exons 4, aber keine der genomischen DNAs der übrigen Personen (nicht betroffene Mutter (Bahn 1) und 2 nicht betroffene Schwestern (Bahnen 5 und 6)) weist eine Deletion auf.
Ferner wurde mRNA aus dem Hirngewebe von einem der Patienten gemäß dem üblichen AGPC-Verfahren extrahiert. Insgesamt 1 mg mRNA wurde 30 Minuten bei 50 °C einem Priming unterworfen, wobei ein Titan^R-Einröhrchen-RT-PCR-System-Kit (Boehringer Mannheim) verwendet wurde. Das Reaktionsgemisch wurde direkt für die PCR mit einem Vorwärtsprimer (nt 351 bis nt 371 von Sequenz ID No. 1) 5'-GGAGGCGACGACCCCAGAAAC-3' und einem Rückwärtsprimer (nt 963 bis nt 983 von Sequenz ID. No. 1) 5'-GGGACAGCCAGCCACACAAGG-3' verwendet. Die PCR wurde 30 sec bei 94 °C, 30 sec bei 56 °C und 1 min bei 68 °C durchgeführt und in 45 Zyklen wiederholt. Die cDNA-Sequenz der gemäß dem vorstehenden Verfahren erhaltenen PCR-Produkte wurde analysiert. Die Ergebnisse der Analyse sind in 9 aufgeführt.
Wie aus 9 ersichtlich ist, zeigt die Patienten-mRNA eine vollständige Deletion von Exon 4, wobei das Exon 3 unter Überspringen des Exons 4 direkt an das Exon 5 angrenzt. Somit wurde bestätigt, dass die juvenilen Parkinson-Patienten von zwei nicht miteinander verwandten Familienmitgliedern eine Deletion des Exons im erfindungsgemäßen Gen aufweisen und die Deletion des erfindungsgemäßen Gens für die juvenile Parkinson-Krankheit verantwortlich ist.
Beispiel 8
Expression der erfindungsgemäßen Gen-mRNA in verschiedenen Geweben
In diesem Beispiel wurde eine Northern-Blot-Analyse unter Verwendung des genomischen Fragments J-17 durchgeführt, um zu prüfen, wie weitgehend mRNA [Poly(A)⁺] des erfindungsgemäßen Gens in verschiedenen humanen Geweben exprimiert wird.
Speziell wurden Northern-Blots von verschiedenen humanen Geweben von der Fa. Clontech bezogen und ein Northern-Blotting wurde gemäß dem bereitgestellten Handbuch mit Anweisungen unter Verwendung von J-17 entsprechend dem Exon 4 des erfindungsgemäßen Gens als Sonde durchgeführt. Die Analysenergebnisse sind in den 10 und 11 dargestellt. Es ist darauf hinzuweisen, dass es sich bei den Geweben in 10A von links nach rechts um folgendes handelt: Milz, Thymus, Prostata, Testis, Ovarium, Dünndarm, Kolon und periphere Blutleukozyten; in 10B von links nach rechts um: Herz, Hirn, Plazenta, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere und Pankreas; in 10C von links nach rechts um: Magen, Schilddrüse, Rückenmark, Lymphknoten, Luftröhre, Nebenniere und Knochenmark; in 11A von links nach rechts um: Kleinhirn, Hirnrinde, Medulla, Rückenmark, okzipitaler Pol, Hirnlappen, Schläfenlappen und Putamen; und in 11B von links nach rechts um: Mandel, Nucleus caudatus, Corpus callosum, Hippocampus, Gesamthirn, Substantia nigra, Nucleus subthalamus und Thalamus.
Die Ergebnisse der 10 und 11 zeigen, dass mRNA besonders stark im Gewebe von Hirn, Herz, Testis und Skelettmuskel exprimiert wurde, obgleich mRNA mit 4,5 kb unter Einschluss von Poly-A-Schwanz in sämtlichen Geweben, die in diesem Beispiel geprüft wurden, nachgewiesen wurde. Es wurde ferner bestätigt, dass die Expression in der Hirnrinde und im Hirnlappen besonders ausgeprägt war, obgleich die Expression in sämtlichen Abschnitten des Gehirns nachgewiesen wurde.
Beispiel 9
Partielle Deletion des erfindungsgemäßen Gens bei juvenilen Parkinson-Patienten (Fall 3)
12 zeigt den Stammbaum von Familienmitgliedern unter Einschluss der Parkinson-Patienten von Beispiel 9. In diesem Beispiel wurden genomische DNAs aus Leukozyten der Personen, die in 12 mit den Ziffern 1 bis 7 bezeichnet sind (nämlich nicht betroffene Eltern, 3 nicht betroffene Schwestern und 2 betroffene Brüder) hergestellt und als Matrize verwendet. Eine PCR-Amplifikation wurde unter Verwendung der in Tabelle 3 aufgeführten Oligonucleotid-Primerpaare durchgeführt.
Sämtliche Reaktionen wurden gemäß dem nachstehend angegebenen Verfahren durchgeführt. 25 μl Reaktionsgemisch mit einem Gehalt an 50 mM KCl, 10 mM Tris (pH-Wert 8,3), 1,5 mM MgCl₂, 0,02 % Gelatine mit Primern, 10 nmol der einzelnen dNTPs und 2,5 Einheiten AmpliTaq Gold DNA-Polymerase (Perkin-Elmer Applied Biosystems Division) hergestellt. Einer anfänglichen, 10-minütigen Denaturierung bei 94 °C schlossen sich 40 Zyklen von 30 sec bei 94 °C, 30 sec bei 55 °C und 45 sec bei 72 °C an. Die letzte Extension wurde 10 min bei 72 °C durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden an mit Ethidiumbromid gefärbten 2 %-Agarosegelen sichtbar gemacht. Die Anwesenheit oder Abwesenheit des oder der Zielexons wurde festgestellt. Die Ergebnisse sind in 13 dargestellt.
Wie aus 13 ersichtlich ist, wurde bei Verwendung der DNA der beiden Parkinson-Patienten (Bahnen 6, 7) als Matrize keine Amplifikation der dem Exon 5 entsprechenden Regionen nachgewiesen.
Ein weiteres Experiment wurde durchgeführt. Die genomische DNA des Parkinson-Patienten (in 12 mit der Ziffer 6 bezeichnet) und von dessen Vater wurde mit EcoRI verdaut, der Elektrophorese unterzogen und sodann durch Southern-Blotting auf eine Nylon-Membran geblottet. Anschließend wurde die P-Markierung der SKM8-DNA-Sonde der Southern-Blot-Hybridisierung unterworfen. Das Analysenergebnis ist in 14 dargestellt. Aus 14 ist ersichtlich, dass zwar mindestens 8 EcoRI-Fragmente beim Vater nachgewiesen wurden, dass aber beim Patienten nur 7 EcoRI-Fragmente nachgewiesen wurden (in 14 bezeichnet der Stern das nicht nachgewiesene EcoRI-Fragment). Diese Analyse bestätigt, dass das genomische Gen des Parkinson-Patienten eine Deletion oder Mutation in einem speziellen Bereich des erfindungsgemäßen Gens aufweist.
Beispiel 10
Partielle Deletion des erfindungsgemäßen Gens bei einem juvenilen Parkinson-Patienten (Fall 4)
Ein weiteres Experiment wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 9 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass weitere Familienmitglieder, die mit denen von Beispiel 9 nicht verwandt waren, untersucht wurden. Speziell wurde eine Genomanalyse für die Familienmitglieder unter Einschluss der juvenilen Parkinson-Patienten des in 15 dargestellten Stammbaums durchgeführt. 4 von 7 Schwestern waren nicht betroffen, während die übrigen 3 Schwestern an juveniler Parkinson-Krankheit litten. Eine PCR-Analyse wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 9 durchgeführt, wobei Primer, die den entsprechenden Exons entsprachen und die genomischen DNAs der in 15 mit den Ziffern 1 bis 6 bezeichneten Personen als Matrizen verwendet wurden. Die Analysenergebnisse sind in 16 dargestellt.
Wie aus 16 ersichtlich ist, wurde bei Verwendung der DNAs der Parkinson-Patienten (Bahnen 3 und 6) als Matrize keine Amplifikation der Basensequenz der dem Exon 3 entsprechenden Regionen festgestellt.
Beispiel 11
Partielle Deletion des erfindungsgemäßen Gens bei juvenilen Parkinson-Patienten (Fall 5)
Ein weiteres Experiment wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 9 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass Familienmitglieder, die mit denen der vorstehenden Beispiele nicht verwandt waren, untersucht wurden. In diesem Beispiel wurde eine genomische Analyse für die Familienmitglieder unter Einschluss von juvenilen Parkinson-Patienten des in 17 dargestellten Stammbaums durchgeführt. 3 Geschwister von 5 waren nicht betroffen, während die beiden übrigen Geschwister an juveniler Parkinson-Krankheit litten. Eine PCR-Analyse wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 9 unter Verwendung von Primern entsprechend den jeweiligen Exons und unter Verwendung der genomischen DNAs der in 17 mit den Ziffern 1 bis 3 bezeichneten Personen als Matrizen durchgeführt. Die Analysenergebnisse sind in 18 dargestellt.
Wie aus 18 ersichtlich ist, wurde bei Verwendung der DNA des Parkinson-Patienten (Bahn 1) als Matrize keine Amplifikation der Basensequenz der Regionen, die dem Exon 4 entsprechen, festgestellt.
Beispiel 12
Partielle Deletion des erfindungsgemäßen Gens bei juvenilen Parkinson-Patienten (Fall 6)
Ein weiteres Experiment wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 9 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass Familienmitglieder, die mit denen der vorstehenden Beispiele nicht verwandt waren, untersucht wurden. Speziell wurde eine Genomanalyse für die Familienmitglieder unter Einschluss von juvenilen Parkinson-Patienten des in 19 gezeigten Stammbaums durchgeführt. Die Eltern und 6 von 8 Geschwistern waren nicht betroffen, während die übrigen beiden Geschwister an juveniler Parkinson-Krankheit litten. Eine PCR-Analyse wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 9 unter Verwendung von Primern, die den jeweiligen Exons entsprachen, und unter Verwendung von genomischen DNAs der in 19 mit den Ziffern 1 bis 8 bezeichneten Personen als Matrizen durchgeführt. Die Analysenergebnisse sind in 20 dargestellt.
Wie aus 20 ersichtlich ist, wurde bei Verwendung der DNA der Parkinson-Patienten (Bahnen 4 und 8) als Matrize keine Amplifikation der Basensequenz der DNAs, die den Exons 3 und 4 entsprachen, beobachtet.
Beispiel 13
Partielle Deletion des erfindungsgemäßen Gens bei juvenilen Parkinson-Patienten (Fall 7)
Ein weiteres Experiment wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 9 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass Familienmitglieder, die mit denen der vorstehenden Beispiele nicht verwandt waren, untersucht wurden. Speziell wurde die genomische Analyse für die Familienmitglieder unter Einschluss von juvenilen Parkinson-Patienten des in 21 gezeigten Stammbaums durchgeführt. Die Eltern und ein Bruder der 5 Geschwister waren nicht betroffen, während die übrigen 4 Geschwister an juveniler Parkinson-Krankheit litten. Die PCR-Analyse wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 9 unter Verwendung von Primern entsprechend den jeweiligen Exons und unter Verwendung der genomischen DNAs der in 21 mit den Ziffern 1 bis 6 bezeichneten Personen als Matrizen durchgeführt. Die Analysenergebnisse sind in 22 dargestellt.
Wie aus 22 ersichtlich, wurde bei Verwendung der DNA der Parkinson-Patienten (Bahnen 2 bis 6) als Matrize keine Amplifikation der Basensequenz der Bereiche, die dem Exon 5 entsprachen, beobachtet.
Beispiel 14
Identifikation einer homozygoten Einbasendeletion im Exon 5
Zur Bestimmung einer Deletion, Insertion oder Punktmutation wurde ein Screening gemäß einer direkten Sequenzierungs-PCR für jeweils einen Patienten der Familienmitglieder des in 23 und dergl. dargestellten Stammbaums durchgeführt. Die PCR wurde mit chimären Primern durchgeführt, die spezifisch für Oligonucleotid-Primersequenzen waren und die Sequenzen der üblichen Sequenzierungsprimer (M13 universelle und reverse Primer) an ihren 5'-Enden aufwiesen. Überschüssige Primer und dNTPs wurden von den PCR-Produkten mit einem Ultrafree-MC-Zentrifugenfilter (Millipore) entfernt. Die gereinigten PCR-Produkte wurden durch das Desoxy-Kettenterminationsverfahren mit einem Applied Biosystems 373A-DNA-Sequenziergerät sequenziert.
Als Ergebnis des Screenings wurde eine Einbasendeletion im Exon 5 unter den Patienten identifiziert (vergl. 24). In 24 stellt der obere Abschnitt (N) das Ergebnis der direkten Sequenzierung der PCR-Produkte aus dem Exon 5 einer Wildallele dar und der untere Abschnitt (M) das Ergebnis der direkten Sequenzierung der PCR-Produkte aus dem Exon 5 einer mutanten Allele.
Speziell entfernte die Einbasendeletion ein Guanosin aus der Sequenz -GGT- (Codon 179), was eine Rasterverschiebung bewirkt, die ein Zwischenstoppcodon an der Aminosäureposition 187 ergab. Die Nucleotidsequenzen und die vorhergesagten Aminosäuresequenzen sind in
25 dargestellt. In 25 zeigt der "normale" Abschnitt DNA- und Aminosäuresequenzen einer Wildtyp-Allele und der "mutante" Abschnitt DNA- und Aminosäuresequenzen einer mutanten Allele mit einer Einbasendeletion. Diese Einbasendeletion wurde bei normalen Personen nicht nachgewiesen.
Um sodann die Einbasendeletion im Patienten (mit der Ziffer 3 bezeichnet) des in 23 dargestellten Stammbaums zu bestätigen und die Genotypen ihrer Eltern (mit den Ziffern 1 und 2 bezeichnet) und ihrer nicht betroffenen Schwester (mit der Ziffer 4 bezeichnet) zu identifizieren, wurde eine NIaIV-Restriktionsstellenanalyse durchgeführt. Bei dieser Analyse wurde das Exon 5 der Personen durch Primerpaare gemäß dem vorerwähnten Verfahren amplifiziert und ihre PCR-Produkte wurden mit NIaIV (New England Biolabs Inc., Massachusetts) verdaut. Die PCR-Produkte wurden an einem 3%igen Gel (2 % Agarose/1 NuSieve Agarose) der Elektrophorese unterzogen und mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Die Ergebnisse sind in 26 dargestellt. In 26 zeigt die Bahn 1 die Sequenz des Vaters, die Bahn 2 die Sequenz der Mutter, die Bahn 3 die Sequenz der Patientin und die Bahn 4 die Sequenz ihrer nicht betroffenen Schwester.
Die Wildtypallele kann als eine NIaIV-Stelle im Exon 5 nachgewiesen werden. Ein Verdau mit NIaIV erzeugte zwei Fragmente (159 bp und 68 bp). Andererseits ergab die mutante Allele mit einer Einbasendeletion ein einziges Fragment mit 227 bp. Diese Restriktionsstellenanalyse bestätigte, dass die Patientin aufgrund einer Einbasendeletion im Exon 5 mutant homozygot ist, während ihre Eltern Wildtyp-heterozygot sind und ihre nicht betroffene Schwester Wildtyp-homozygot ist. Diese Ergebnisse sind mit der Art der autosomalen, rezessiven Vererbung konsistent.
Beispiel 15
Immunohistochemische und Immunofluoreszenz-Analyse des erfindungsgemäßen Gens bei juvenilen Parkinson-Patienten
Um den molekularen Mechanismus der durch die Mutation des erfindungsgemäßen Gens (nachstehend gelegentlich als "Parkin" bezeichnet) hervorgerufenen Substantia nigra (SN) aufzuklären, wurde die Lokalisation des erfindungsgemäßen Proteins im Gehirn von Patienten mit autosomalem, rezessivem, juvenilem Parkinsonismus (AR-JP) von Patienten mit Parkinson-Krankheit (PD) und normalen Kontrollpersonen unter Verwendung von Antikörpern gegen das erfindungsgemäße Protein geprüft.
Speziell wurden Fälle von 15 PD-Patienten, 3 AR-JP-Patienten und 8 Kontrollpersonen untersucht. Unter den AR-JP-Patienten handelte es sich bei Fall 1 und Fall 2 um Schwestern. Sie wiesen eine Deletion im Exon 4 des erfindungsgemäßen Gens auf, was zu einem verkürzten Protein mit 143 Aminosäuren führt, und zwar aufgrund eines durch die Rasterverschiebung erzeugten Stoppcodons 6 Aminosäuren nach dem Codon 138. Beim Fall 3 handelte es sich um eine AR-JP-Patientin im Alter von 52 Jahren. Sie wies eine Deletion des Exons 3 auf, die eine vorzeitige Termination bei der Aminosäure 96 aufgrund von Rasterverschiebung nach Aminosäure 58 verursacht.
Zwei Arten von polyklonalen Kaninchen-Antikörpern (M-73 und M-74), polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen α-Synuclein und monoklonaler Mäuse-Antikörper gegen Polyubiquitin wurden in diesem Beispiel verwendet.
Zunächst wurde eine immunohistochemische Färbung gemäß dem folgenden Verfahren vorgenommen. Mit Formalin fixierte, in Paraffin eingebettete Schnitte des Mittelhirns, der Nirnlappenrinde und des Putamens der Personen wurden mit anti-Parkin M-74-, anti-α-Synuclein- oder anti-Polyubiquitin-Antikörpern nach entsprechender Verdünnung durch ein übliches Avidin-Biotin-Komplex-Verfahren unter Verwendung von 3',3'-Diaminobenzidin für die Sichtbarmachung behandelt. Eine doppelte Immunofluoreszenz wurde mit Kaninchen-anti-Parkin-Antikörper M74 und monoklonalem Mäuse-anti-Polyubiquitin-Antikörper und anschließende Inkubation mit FITC-konjugiertem Ziegen-anti-Kaninchen-IgG (Dako, Carpinteria, CA), biotinyliertem Ziegen-anti-Mäuse-IgG (Sigma, St. Louis, Mo) und Avidin-Rhodamin (Sigma) durchgeführt. Das Signal wurde unter einem fluoreszierenden konfokalen Mikroskop MRC-1024 (Bio-Rad, Richmond, CA) betrachtet. Die Ergebnisse der Betrachtung sind in den 27 und 28 dargestellt.
27 zeigt photomikrographische Aufnahmen einer immunohistochemischen Färbung mit anti-Parkin-Antikörper M-74 in Hirnschnitten, während 27A bis 27C das Ergebnis eines PD-Patienten (Fall 2) zeigt, 27D bis 27F das Ergebnis einer Kontrollperson (Fall 1) zeigt und 27G bis 27I das Ergebnis eines AR-JP-Patienten (Fall 1) zeigt. Insbesondere zeigen die photomikrographischen Aufnahmen 27A, 27D und 27G die melaninhaltigen Neuronen in der SN; 27B, 27E und 27H zeigen das Putamen; und 27C, 27F und 27I zeigen die Stirnlappenrinde. In den photomikrographischen Aufnahmen bezeichnet die Pfeilspitze das Neuron, dessen Ursprungsstelle bezeichnet Neuromelanin und die Einheitslänge des Pfeilstabes beträgt 50 μm.
Wie aus 27 ersichtlich ist, wurden melaninhaltige Neuronen in der SN (einschließlich Locus coeruleus) beim PD-Patienten und bei der Kontrollperson am intensivsten gefärbt, jedoch nicht beim AR-JP-Patienten (27A, 27D und 27G). Ferner wurden bei diesen melaninhaltigen Neuronen die SN, das Zytoplasma und die granuläre Struktur sowie die neuronalen Prozesse homogen gefärbt. Im Gegensatz dazu war in den Kernen keine Färbung ersichtlich. Eine gewisse schwache Färbung wurde in glialen Zellen beobachtet (27A bis 27F). Neuronen im Putamen und in der Stirnlappenrinde des PD-Patienten und der Kontrollperson waren im Zytoplasma und in perinukleären Strukturen schwach gefärbt (27B, 27C, 27E und 27F).
28 zeigt photomikrographische Aufnahmen einer immunohistochemischen Färbung mit dem erfindungsgemäßen Gen, Polyubiquitin und α-Synuclein in Hirnschnitten, wobei 28A bis 28C das melaninhaltige Neuron in der SN eines PD-Patienten (Fall 1) bei Doppelfärbung mit anti-Parkin-Antikörper M74 (grün: A) und monoklonalem anti-Polyubiquitin-Antikörper (rot: B) zeigen, 28D bis 28F Mittelhirnschnitte des PD-Patienten (Fall 1) bei Färbung mit anti-alpha-Synuclein-Antikörper zeigen und 28G bis 28I Mittelhirnschnitte des PD-Patienten (Fall 1) bei Färbung mit anti-Parkin-Antikörper M-74 zeigen. In den photomikrographischen Aufnahmen von 28 bezeichnet die Pfeilausgangsstelle den Lewy-Körper. Die Längeneinheit des Pfeilstabes beträgt 50 μm.
Bei Doppelimmunofluoreszenz wurden die anti-Parkin- und anti-Polyubiquitin-Antikörper im Lewy-Körper der melaninhaltigen Neuronen der SN gefärbt (28A bis 28C). Bei der Immunofärbung von Mittelhirnschnitten wurde eine Kolokalisierung des erfindungsgemäßen Gens und von α-Synuclein in einigen Lewy-Körpern des PD-Patienten beobachtet (28D, 28E, 28G und 28H). Keine derartige Färbung wurde in Hirngeweben der AR-JP-Patienten beobachtet (Daten nicht dargestellt).
Die vorstehenden Beobachtungsergebnisse bestätigen, dass das erfindungsgemäße Protein zwar im Gehirn der sporadischen PD-Patienten und der Kontrollpersonen beobachtet wurde, dieses Protein jedoch nicht im Gehirn der AR-JP-Patienten festgestellt wurde. Ferner wurde das erfindungsgemäße Protein in Lewy-Körpern der PD-Patienten gefunden.
Beispiel 16
Immunoblotting des erfindungsgemäßen Gens bei juvenilen Parkinson-Patienten
In diesem Beispiel wurde gemäß Beispiel 15 ein Immunoblotting des erfindungsgemäßen Gens, das im Gehirn von AR-JP-Patienten, PD-Patienten und Kontrollpatienten vorliegt, unter Verwendung von Antikörpern gegen das erfindungsgemäße Protein durchgeführt.
Speziell wurden Gewebeblöcke der Stirnlappenrinde, der Substantia nigra und des Putamens der Personen mit einem Potter-Elvehjem-Homogenisator in isotonischer Saccharoselösung (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4, 0,32 M Saccharose, 1 mM Zn-acetat, 15 μg/ml Leupeptin, 5 μg/ml p-Amidinophenylmethansulfonylfluorid-hydrochlorid (APMSF) und 50 ng/ml Pepstatin) homogenisiert. Das Homogenisat wurde einer 4-stufigen differenziellen Zentrifugation unterworfen, wodurch man die folgenden Fraktionen erhielt: Kernfraktion (Pellets nach 10 min mit 600 × g), Mitochondrienfraktion (Pellets nach 10 min mit 7 000 × g), Mikrosomenfraktion (Pellets nach 1 Stunde mit 100 000 × g) und Zytosolfraktion (Überstand nach 1 Stunde mit 900 000 × g). Das 900 000 × g-Pellet wurde in TES-Puffer mit einem Gehalt an 0,25 M Saccharose resuspendiert und auf einen Saccharose-Stufengradienten (0,25 M, 0,86 M und 1,3 M) geschichtet und 1 Stunde bei 4 °C in einem SW28-Rotor mit 28 000 U/min zentrifugiert. Nach Absaugen des Lipids an der oberen Schicht wurde die Grenzfläche zwischen den 0,5 M- und 0,86 M-Saccharoseschichten als Golgi-Fraktion gewonnen.
Proteine in diesen verschiedenen Fraktionen wurden an einem 10 Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel der Elektrophorese unterzogen und auf PVDF-Membranblots (Bio-Rad) übertragen. Die Blots wurden in mit Tris gepufferter Kochsalzlösung mit einem Gehalt an 0,05 % Tween 20 und 5 Rinderserumalbumin (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,6 und 150 mM NaCl) 1 Stunde bei 52 °C eingeweicht, einer Sondenbehandlung mit verschiedenen Antikörpern, wie anti-Parkin-Antikörper M-74 über Nacht bei 4 °C in der Blockierlösung unterworfen und anschließend mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit einem Gehalt an 0,05 % Tween 20 gewaschen. Anti-β-Tubulin-Antikörper (Amersham Life Science, Arlington, IL) wurde als interne Kontrolle und anti-γ-Adaptin-Antikörper (Sigma) als Golgi-Marker verwendet. Schließlich wurden die Blots mit Peroxidase-konjugiertem Ziegen-anti-Kaninchen-IgG (Dako) und anti-Mäuse-IgG (Dako) 1 Stunde bei Raumtemperatur behandelt. Sodann wurden die Reaktionsprodukte unter Verwendung eines Chemilumineszenzreagenz (Amersham, Buckinghamshire, UK) sichtbar gemacht.
Die Immunoblotting-Ergebnisse sind in den 29 bis 31 dargestellt. Die 29 bis 31 sind mikrophotographische Aufnahmen zur Darstellung der Immunoblotting-Ergebnisse des erfindungsgemäßen Proteins in verschiedenen Homogenisaten. 29 zeigt das Ergebnis von vollständigen Homogenisaten des Stirnlappens der 3 Kontrollpersonen (Fälle 1 bis 3), von 3 PD-Patienten (Fälle 1 bis 3) und von 2 AR-JP-Patienten (Fälle 1 und 2), wobei die Gele auf der linken Seite Größenmarkierungen sind und β-Tubulin einen internen Marker darstellt. 30 zeigt das Ergebnis von subzellulären Fraktionen des Stirnlappengewebes der Kontrollperson (Fall 1), wobei von links nach rechts Kerne, Mitochondrien, Mikrosamen, Zytosol und Golgi-Apparate dargestellt sind. γ-Adaptin ist ein Golgi-Marker. 31 zeigt das Ergebnis von vollständigen Homogenisaten der SN, des Putamens und des Stirnlappens der 2 Kontrollpersonen (Fälle 1 und 2) und der beiden PD-Patienten (Fälle 2 und 3).
Als Ergebnis wurde das erfindungsgemäße Protein (in den Figuren als "Parkin") mit 52 kDa in vollständigen Homogenisaten der Stirnlappenrinde der PD-Patienten und der Kontrollpersonen, jedoch nicht in denen der AR-JP-Patienten nachgewiesen (vergl. 29). Eine zweite Proteinbande mit 41 kDa, möglicherweise eine prozessierte Form des Parkin-Proteins, wurde bei den PD-Patienten gefunden. Ähnliche Ergebnisse wurden unter Verwendung des weiteren Antikörpers M-73 erzielt (Daten nicht dargestellt).
Nach subzellulärer Fraktionierung der Stirnlappenrinden-Homogenisate der Kontrollperson wurde der Großteil des erfindungsgemäßen Proteins im Zytosol und den Golgi-Fraktionen gefunden. Eine winzige Menge des erfindungsgemäßen Proteins wurde in der mikrosomalen Fraktion gefunden (vergl. 30).
Ferner ergab eine Immunoblotting-Analyse der Homogenisate der SN, des Putamens und der Stirnlappenrinde der Kontrollpersonen und der PD-Patienten, dass das erfindungsgemäße Protein reichlicher in der SN vorkommt, verglichen mit den übrigen Teilen des Gehirns (31). Das erfindungsgemäße Protein in der SN der Parkinson-Patienten war offensichtlich in Übereinstimmung mit dem Verlust von nigralen Neuronen bei den PD-Patienten verringert.
Die vorstehenden Ergebnisse bestätigen, dass das erfindungsgemäße Protein in keinem Gehirnschnitt der AR-JP-Patienten nachgewiesen wurde und dass dieses Protein in melaninhaltigen Neuronen in der SN vorliegt.
Beispiel 17
Polymorphismus des Parkin-Gens bei Patienten mit sporadischer
Parkinson-Krankheit (PD) und Kontrollpersonen
In diesem Beispiel wurde die Polymorphismus-Frequenz bei PD untersucht. Speziell wurde erblicher Polymorphismus gemäß dem nachstehend angegebenen Verfahren an einer Personengruppe, die aus 160 PD-Patienten und 160 Kontrollpersonen ohne neurodegenerative Störung bestand, analysiert. In diesem Beispiel wurden Patienten, bei denen die Krankheit in einem Alter unter 40 Jahren eingesetzt hatte, ausgeschlossen. Das Durchschnittsalter des Krankheitseintritts betrug 55,4 ± 10,7 Jahre. Keiner der PD-Patienten wies eine PD-Familienanamnese auf, noch lagen tägliche Fluktuationen von Symptomen vor. Das Alter der Kontrollpersonen lag im Bereich von 40 bis 98 Jahren.
Humane genomische DNA wurde aus den peripheren Leukozyten der Personen extrahiert. Proben wurden entweder sofort verwendet oder bis zur Analyse bei –20 °C aufbewahrt. Die Exons 4 und 10 des Parkin-Gens wurden durch PCR unter Verwendung von zwei Primerpaaren amplifiziert (Exon 4: Vorwärtsprimer, 5'-acaagcttttaaagagtttcttgt-3', Rückwärtsprimer, 5'-aggcaatgtgttagtacaca-3', Exon 10: Vorwärtsprimer, 5'-attgccaaatgcaacctaatgtc-3', Rückwärtsprimer, 5'-ttggaggaatgagtagggcatt-3').
Ein Polymorphismus, bei dem Ser in der Aminosäureposition 167 durch Asn ersetzt ist (S167N) (Ersatz von G durch A) wurde in Exon 4 festgestellt. Polymorphismen, bei denen Arg in der Aminosäureposition 366 durch Trp (R366W) ersetzt ist (Ersatz von C durch T) und Val in der Aminosäureposition 380 gegen Leu (V380L) ersetzt ist (Ersatz von G durch C) wurden im Exon 10 festgestellt. Allelen der Polymorphismen S167N, R366W und V380L wurden durch Verdau mit AIwNI, NciI bzw. Bsp 1286I identifiziert. Während sowohl die S167N- als auch R366W-Wildallelen Restriktionsstellen für AIwNI bzw. NciI schufen, erzeugte die mutante V380L-Allele eine Restriktionsstelle für Bsp 12861, wodurch die Wildallele und die mutante Allele identifiziert wurden.
Speziell wurden die PCR-Produkte einer Elektrophorese an 3%igem Agarosegel unterworfen und sodann mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Als Ergebnis wurde gemäß der Darstellung in 32 eine Bande mit der Spannweite 50 bp/131 bp durch Verdau mit AIwNI [vergl. 32 A)], eine Bande mit der Spannweite 68 bp/97 bp durch Verdau mit NciI [vergl. 32 B)] und eine Bande mit der Spannweite von 57 bp/108 bp durch Verdau mit Bsp 1286I [vergl. 32 C)] gefunden.
Speziell wurden folgende PCR-Bedingungen für das Exon 4 eingehalten. Die anfängliche Denaturierung wurde 10 min bei 94 °C durchgeführt, wonach sich 40 Zyklen einer Denaturierung bei 94 °C für 30 sec, einer Annealing-Behandlung für 1 min bei 53 °C und einer Extension bei 72 °C für 1 min anschlossen, wobei die letzte Extension 10 min bei 72 °C durchgeführt wurde. Für das Exon 10 wurden folgende PCR-Bedingungen eingehalten. Die anfängliche Denaturierung wurde 10 min bei 94 °C durchgeführt, wonach sich 40 Zyklen einer Denaturierung für 30 sec bei 94 °C, einer Annealing-Behandlung bei 55 °C für 30 sec und einer Extension für 45 sec bei 72 °C anschlossen, wobei die letzte Extension 10 min bei 72 °C durchgeführt wurde.
Anschließend wurden die Frequenzen von Wildtyp-Homozygoten (w/w), Wildtyp/Mutante-Heterozygoten (w/m) und mutanten Homozygoten (m/m) geprüft. Die Tabellen 4 und 5 zeigen die Wildallelen und Genotyp-Frequenzen des Polymorphismus S167N. Die erwarteten Werte in Tabelle 5 wurden gemäß dem Hardy-Weinberg-Gleichgewicht berechnet. Tabelle 4
Anmerkungen

a: Kein signifikanter Unterschied in den Allelen-Frequenzen zwischen den PD-Patienten und den Kontrollpersonen.

Die erwarteten Werte wurden gemäß dem Hardy-Weinberg-Gleichgewicht berechnet.
Tabelle 5
Anmerkungen:

b: Die erwarteten Frequenzen gegen die beobachteten Frequenzen des Genotyps bei der Kontrolle.
c: Die erwarteten Frequenzen gegen die beobachteten Frequenzen des Genotyps bei den PD-Patienten.
d: Kein signifikanter Unterschied in der Genotyp-Verteilung zwischen den PD-Patienten und den Kontrollpersonen.

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, dass kein signifikanter Unterschied zwischen den PD-Patienten und den Kontrollpersonen bezüglich der Allelen- und Genotyp-Frequenz bestehen. Ferner unterschieden sich die Frequenzen sowohl der –167Ser-Homozygoten als auch der –167Ser/Asn-Heterozygoten zwischen den beiden Gruppen nicht signifikant.
Ferner zeigt Tabelle 5, dass die beobachteten Frequenzen der drei Genotypen keine signifikanten Unterschiede zwischen den erwarteten Frequenzen der Kontrollpersonen und denen der Patienten zeigten. Eine Computeranalyse bestätigte, dass dieser Ersatz keine Veränderungen in der sekundären Struktur der Genprodukte hervorrief.
Tabelle 6 zeigt die Allelen- und Genotyp-Frequenzen des Polymorphismus V380L.
Tabelle 6
Anmerkung

a: Kein signifikanter Unterschied in den Allelen-Frequenzen zwischen den PD-Patienten und den Kontrollen.

Wie aus Tabelle 6 ersichtlich ist, ergab sich kein signifikanter Unterschied der Allelen-Frequenzen des Polymorphismus V380L zwischen den PD-Patienten und den Kontrollpersonen. Ferner wurde bestätigt, dass die beobachteten Frequenzen des Polymorphismus V380L mit den erwarteten Frequenzen übereinstimmten und dass die sekundäre Struktur des Genprodukts sich nicht aufgrund dieser polymorphen Mutation veränderte.
Nachstehend sind in Tabelle 7 die Allelen- und Genotyp-Frequenzen des Polymorphismus R366W aufgeführt.
Tabelle 7
Anmerkung

a: Signifikanter Unterschied der Allelen-Frequenzen zwischen den PD-Patienten und den Kontrollpersonen.
(Fisher-Wahrscheinlichkeitstest, p = 0,014<0,02, Odds-Ratio = 3,60, 95 % Cl: 0,45-6,50)

Bezüglich des Polymorphismus R366W waren die erwarteten Frequenzen der drei Genotypen unter den PD-Patienten und den Kontrollpersonen genau gleich. Jedoch unterschied sich die Allelen-Frequenz von R366W signifikant zwischen den PD-Patienten und den Kontrollpersonen. Speziell betrug die Allelenfrequenz bei den PD-Patienten 1,2 %, während sie bei den Kontrollpersonen 4,4 % betrug. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Allelenfrequenz bei den PD-Patienten im Vergleich zum Wert bei den Kontrollpersonen signifikant verringert war. Das Odd-Ratio (Verhältnis des Vorliegens der Allele bei Kontrollpersonen zu PD-Patienten betrug 3,60).
33 ist ein Diagramm zur Darstellung des Hydropathie-Index der Aminosäuresequenz im Polymorphismus R366W. (+)- und (–)-Regionen in 33 stellen die hydrophoben bzw. hydrophilen Regionen dar. Der mit dem Pfeil in 33 bezeichnete Punkt gibt die Veränderung von Hydrophilizität zu Hydrophobizität wieder, die durch den Ersatz von –366 Arg durch Trp hervorgerufen wird.
34 ist eine Darstellung der Veränderung der Sekundärstruktur beim Polymorphismus R366W. Die Darstellung zeigt, dass der Ersatz von –366 Arg durch Trp die α-Helix (in Position 361 bis 376) zur β-Blattstruktur (in Position 360-360) verändert.
Dieses Beispiel zeigt, dass von den drei Polymorphismen S167N und V380L zwar das Genprodukt der PD-Patienten nicht entscheidend beeinflussen, dass aber die Allelen-Frequenz des Polymorphismus R366W bei den PD-Patienten äußerst nieder war und der Odd-Ratio-Wert zu 3,60 berechnet wurde. Dieses Ergebnis lässt darauf schließen, dass die Allele einen Schutzfaktor gegen PD darstellt, der das Einsetzen von PD hemmt.
Gewerbliche Verwertbarkeit
Die vorliegende Erfindung betrifft die vorstehend zusammengestellten Punkte, die in verschiedenen Aspekten beschrieben sind. Die vorerwähnten verschiedenen Beispiele und Beschreibungen identifizieren nicht nur das Gen, das für die Parkinson-Krankheit verantwortlich ist, sondern klären auch, dass eine partielle Deletion oder Mutation und dergl. des erfindungsgemäßen Gens die Parkinson-Krankheit induziert. Demzufolge lässt sich das Einsetzen von Parkinson-Krankheit leicht durch Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Abnormalität des erfindungsgemäßen Gens beurteilen, was bei der Diagnose der Parkinson-Krankheit in einem Anfangsstadium oder frühen Stadium sehr wertvoll ist.
Auch eine sogenannte "Gentherapie" zur Behandlung von Parkinson-Patienten ist unter Verwendung des erfindungsgemäßen Gens möglich. Ferner eignet sich ein rekombinantes Protein, das aus dem erfindungsgemäßen Gen erhältlich ist, als Arzneistoff zur Prophylaxe und/oder Therapie der Parkinson-Krankheit. Antikörper (monoklonale Antikörper und polyklonale Antikörper) gegen ein derartiges rekombinantes Protein können für die Diagnose und dergl. der Parkinson-Krankheit herangezogen werden. Die Verwendung eines derartigen rekombinanten Proteins ermöglicht die Synthese eines pharmazeutischen Wirkstoffes, der sich in erheblichem Maße bei der Prophylaxe, Therapie und Diagnose der Parkinson-Krankheit und dergl. eignet. Somit besitzt die vorliegende Erfindung erhebliche gewerbliche Verwertungsmöglichkeiten, da sie zur Entwicklung verschiedener Gentherapien und pharmazeutischer Zusammensetzungen beiträgt, die bei verschiedenen Krankheiten unter Fokussierung auf die Parkinson-Krankheit und damit verwandte Krankheiten wirksam sind.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierte DNA oder Gen, umfassend (a) die Basensequenz von voller Länge gemäß Sequenz ID. No. 1 oder 2 oder (b) eine Basensequenz, die damit hybridisierbar ist oder mit einem komplementären Strang davon hybridisierbar ist, wobei die Basensequenz mit Parkinson-Krankheit in Verbindung steht und (i) für ein Protein kodiert, das die Aminosäuresequenz 1 bis 465 in der Sequenz ID. No. 1 oder die Aminosäuresequenz 1 bis 437 in der Sequenz ID. No. 2 umfasst; oder (ii) eine Variante der Sequenz ID. No. 1 oder 2 aufgrund von alternativer Spleißung ist; oder (iii) ein Gen umfasst, das in Bezug auf die Sequenz ID. No. 1 oder 2 eine Exon-Deletion, eine Nonsense-Basensubstitution, eine Missense-Basensubstitution, eine Basendeletion, eine Basenaddition, eine Baseninsertion, eine Spleißabnormalität und/oder eine Rasterverschiebung aufweist.
Isolierte DNA oder Gen nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Exondeletion um die Deletion von - Exon 4; oder - Exon 3 und Exon 4 handelt.
Isolierte DNA oder Gen nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Nonsense-Basendeletion um eine Einbasendeletion unter Entfernung von einem Guanosin aus der Sequenz -GGT- aus dem Codon 179 handelt.
Isolierte DNA oder Gen nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Missense-Basensubstitution um einen Polymorphismus handelt, der – Ser in der Aminosäureposition 167 durch Asn; oder – Arg in der Aminosäureposition 366 durch Trp; oder – Val in der Aminosäureposition 380 durch Leu ersetzt.
Rekombinanter Vektor, umfassend das DNA-Fragment oder das Gen von einem der Ansprüche 1 bis 4.
Gen nach Anspruch 1, umfassend die Basensequenz von voller Länge in der Sequenz ID. No. 1, so dass 11 Introns zwischen 12 Exons am Genom liegen; und kodierend für ein Protein mit der Aminosäuresequenz 1 bis 465 in einem Teil (102 bis 1496) der Basensequenz.
Gen nach Anspruch 6, umfassend die folgende Basensequenz des Introns in einem Grenzbereich zwischen dem Exon und dem Intron: das Intron, das zwischen Exon 1 und Exon 2 liegt, weist eine in Sequenz ID. No. 3 neben dem 3'-Ende des Exons 1 dargestellte Basensequenz auf und weist eine in Sequenz ID. No. 4 neben dem 5'-Ende des Exons 2 dargestellte Basensequenz auf; das Intron, das zwischen Exon 2 und Exon 3 liegt, weist eine in Sequenz ID. No. 5 neben dem 3'-Ende des Exons 2 dargestellte Basensequenz auf und weist eine in Sequenz ID. No. 6 neben dem 5'-Ende des Exons 3 dargestellte Basensequenz auf; das Intron, das zwischen Exon 3 und Exon 4 liegt, weist eine in Sequenz ID. No. 7 neben dem 3'-Ende des Exons 3 dargestellte Basensequenz auf und weist eine in Sequenz ID. No. 8 neben dem 5'-Ende des Exons 4 dargestellte Basensequenz auf; das Intron, das zwischen Exon 4 und Exon 5 liegt, weist eine in Sequenz ID. No. 9 neben dem 3'-Ende des Exons 4 dargestellte Basensequenz auf und weist eine in Sequenz ID. No. 10 neben dem 5'-Ende des Exons 5 dargestellte Basensequenz auf; das Intron, das zwischen Exon 5 und Exon 6 liegt, weist eine in Sequenz ID. No. 11 neben dem 3'-Ende des Exons 5 dargestellte Basensequenz auf und weist eine in Sequenz ID. No. 12 neben dem 5'-Ende des Exons 6 dargestellte Basensequenz auf; das Intron, das zwischen Exon 6 und Exon 7 liegt, weist eine in Sequenz ID. No. 13 neben dem 3'-Ende des Exons 6 dargestellte Basensequenz auf und weist eine in Sequenz ID. No. 14 neben dem 5'-Ende des Exons 7 dargestellte Basensequenz auf; das Intron, das zwischen Exon 7 und Exon 8 liegt, weist eine in Sequenz ID. No. 15 neben dem 3'-Ende des Exons 7 dargestellte Basensequenz auf und weist eine in Sequenz ID. No. 16 neben dem 5'-Ende des Exons 8 dargestellte Basensequenz auf; das Intron, das zwischen Exon 8 und Exon 9 liegt, weist eine in Sequenz ID. No. 17 neben dem 3'-Ende des Exons 8 dargestellte Basensequenz auf und weist eine in Sequenz ID. No. 18 neben dem 5'-Ende des Exons 9 dargestellte Basensequenz auf; das Intron, das zwischen Exon 9 und Exon 10 liegt, weist eine in Sequenz ID. No. 19 neben dem 3'-Ende des Exons 9 dargestellte Basensequenz auf und weist eine in Sequenz ID. No. 20 neben dem 5'-Ende des Exons 10 dargestellte Basensequenz auf; das Intron, das zwischen Exon 10 und Exon 11 liegt, weist eine in Sequenz ID. No. 21 neben dem 3'-Ende des Exons 10 dargestellte Basensequenz auf und weist eine in Sequenz ID. No. 22 neben dem 5'-Ende des Exons 11 dargestellte Basensequenz auf; und das Intron, das zwischen Exon 11 und Exon 12 liegt, weist eine in Sequenz ID. No. 23 neben dem 3'-Ende des Exons 11 dargestellte Basensequenz auf und weist eine in Sequenz ID. No. 24 neben dem 5'-Ende des Exons 12 dargestellte Basensequenz auf.
Protein, kodiert durch die DNA oder das Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
Protein nach Anspruch 8, umfassend die Aminosäuresequenz 1 bis 465 in der Sequenz ID. No. 1 oder die Aminosäuresequenz 1 bis 437 in der Sequenz ID. No. 2.
Protein nach Anspruch 8, umfassend: die Ubiquitin-artige Aminosäuresequenz 1 bis 72, die in Sequenz ID. No. 1 enthalten ist; und die Zink-Fingerprotein-artige Aminosäuresequenz 418 bis 449, die in Sequenz ID. No. 1 enthalten ist.
Monoklonaler Antikörper oder polyklonaler Antikörper gegen das Protein von einem der Ansprüche 8 bis 10.
Primer oder Sonde oder immobilisierte Nucleinsäure oder DNA-Chip zur Verwendung beim Nachweis einer Basensequenz, einer genetischen Mutation, einer Deletion und/oder einer Expressionsmenge der DNA oder des Gens nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Verwendung bei der Konzentration davon.
Primer oder Sonde oder immobilisierte Nucleinsäure oder DNA-Chip nach Anspruch 12 zur Verwendung beim Nachweis einer Basensequenz, einer genetischen Mutation und/oder einer Deletion des Exons in der Sequenz ID. No. 1 oder No. 2 oder zur Verwendung bei der Haplotypisierung eines Locus davon.
Primer oder Sonde oder immobilisierte Nucleinsäure oder DNA-Chip nach Anspruch 12 zur Verwendung beim Nachweis einer Basensequenz, einer genetischen Mutation und/oder einer Deletion des Introns von Anspruch 7 oder zur Verwendung bei der Haplotypisierung eines Locus davon.
Primer oder Sonde nach Anspruch 12 zur Verwendung beim Nachweis einer Basensequenz des Introns neben dem Exon 1 des Gens, das mit Parkinson-Krankheit in Zusammenhang steht, nach Anspruch 1 oder eines Locus davon, wobei der Primer oder die Sonde die folgende Basensequenz umfasst: eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 25 in der 5'-3'-Richtung der Sequenz ID. No. 1 am Genom und eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 26 in der 5'-3'-Richtung an einem komplementären Strang der Sequenz ID. No. 1 am Genom.
Primer oder Sonde nach Anspruch 12 zur Verwendung beim Nachweis einer Basensequenz eines Introns neben dem Exon 2 des Gens, das mit der Parkinson-Krankheit in Zusammenhang steht, nach Anspruch 1 oder eines Locus davon, wobei der Primer oder die Sonde die folgende Basensequenz umfasst: eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 27 in der 5'-3'-Richtung der Sequenz ID. No. 1 am Genom und eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 28 in der 5'-3'-Richtung an einem komplementären Strang der Sequenz ID. No. 1 am Genom.
Primer oder Sonde nach Anspruch 12 zur Verwendung beim Nachweis einer Basensequenz eines Introns neben dem Exon 3 des Gens, das mit der Parkinson-Krankheit in Zusammenhang steht, nach Anspruch 1 oder eines Locus davon, wobei der Primer oder die Sonde die folgende Basensequenz umfasst: eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 29 in der 5'-3'-Richtung der Sequenz ID. No. 1 am Genom und eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 30 in der 5'-3'-Richtung an einem komplementären Strang der Sequenz ID. No. 1 am Genom.
Primer oder Sonde nach Anspruch 12 zur Verwendung beim Nachweis einer Basensequenz eines Introns neben dem Exon 4 des Gens, das mit der Parkinson-Krankheit in Zusammenhang steht, nach Anspruch 1 oder eines Locus davon, wobei der Primer oder die Sonde die folgende Basensequenz umfasst: eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 31 in der 5'-3'-Richtung der Sequenz ID. No. 1 am Genom und eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 32 in der 5'-3'-Richtung an einem komplementären Strang der Sequenz ID. No. 1 am Genom.
Primer oder Sonde nach Anspruch 12 zur Verwendung beim Nachweis einer Basensequenz eines Introns neben dem Exon 4 des Gens, das mit der Parkinson-Krankheit in Zusammenhang steht, nach Anspruch 1 oder eines Locus davon, wobei der Primer oder die Sonde die folgende Basensequenz umfasst: eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 33 in der 5'-3'-Richtung der Sequenz ID. No. 1 am Genom und eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 34 in der 5'-3'-Richtung an einem komplementären Strang der Sequenz ID. No. 1 am Genom.
Primer oder Sonde nach Anspruch 12 zur Verwendung beim Nachweis einer Basensequenz eines Introns neben dem Exon 5 des Gens, das mit der Parkinson-Krankheit in Zusammenhang steht, nach Anspruch 1 oder eines Locus davon, wobei der Primer oder die Sonde die folgende Basensequenz umfasst: eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 35 in der 5'-3'-Richtung der Sequenz ID. No. 1 am Genom und eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 36 in der 5'-3'-Richtung an einem komplementären Strang der Sequenz ID. No. 1 am Genom.
Primer oder Sonde nach Anspruch 12 zur Verwendung beim Nachweis einer Basensequenz eines Introns neben dem Exon 6 des Gens, das mit der Parkinson-Krankheit in Zusammenhang steht, nach Anspruch 1 oder eines Locus davon, wobei der Primer oder die Sonde die folgende Basensequenz umfasst: eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 37 in der 5'-3'-Richtung der Sequenz ID. No. 1 am Genom und eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 38 in der 5'-3'-Richtung an einem komplementären Strang der Sequenz ID. No. 1 am Genom.
Primer oder Sonde nach Anspruch 12 zur Verwendung beim Nachweis einer Basensequenz eines Introns neben dem Exon 7 des Gens, das mit der Parkinson-Krankheit in Zusammenhang steht, nach Anspruch 1 oder eines Locus davon, wobei der Primer oder die Sonde die folgende Basensequenz umfasst: eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 39 in der 5'-3'-Richtung der Sequenz ID. No. 1 am Genom und eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 40 in der 5'-3'-Richtung an einem komplementären Strang der Sequenz ID. No. 1 am Genom.
Primer oder Sonde nach Anspruch 12 zur Verwendung beim Nachweis einer Basensequenz eines Introns neben dem Exon 7 des Gens, das mit der Parkinson-Krankheit in Zusammenhang steht, nach Anspruch 1 oder eines Locus davon, wobei der Primer oder die Sonde die folgende Basensequenz umfasst: eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 41 in der 5'-3'-Richtung der Sequenz ID. No. 1 am Genom und eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 42 in der 5'-3'-Richtung an einem komplementären Strang der Sequenz ID. No. 1 am Genom.
Primer oder Sonde nach Anspruch 12 zur Verwendung beim Nachweis einer Basensequenz eines Introns neben dem Exon 8 des Gens, das mit der Parkinson-Krankheit in Zusammenhang steht, nach Anspruch 1 oder eines Locus davon, wobei der Primer oder die Sonde die folgende Basensequenz umfasst: eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 43 in der 5'-3'-Richtung der Sequenz ID. No. 1 am Genom und eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 44 in der 5'-3'-Richtung an einem komplementären Strang der Sequenz ID. No. 1 am Genom.
Primer oder Sonde nach Anspruch 12 zur Verwendung beim Nachweis einer Basensequenz eines Introns neben dem Exon 9 des Gens, das mit der Parkinson-Krankheit in Zusammenhang steht, nach Anspruch 1 oder eines Locus davon, wobei der Primer oder die Sonde die folgende Basensequenz umfasst: eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 45 in der 5'-3'-Richtung der Sequenz ID. No. 1 am Genom und eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 46 in der 5'-3'-Richtung an einem komplementären Strang der Sequenz ID. No. 1 am Genom.
Primer oder Sonde nach Anspruch 12 zur Verwendung beim Nachweis einer Basensequenz eines Introns neben dem Exon 10 des Gens, das mit der Parkinson-Krankheit in Zusammenhang steht, nach Anspruch 1 oder eines Locus davon, wobei der Primer oder die Sonde die folgende Basensequenz umfasst: eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 47 in der 5'-3'-Richtung der Sequenz ID. No. 1 am Genom und eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 48 in der 5'-3'-Richtung an einem komplementären Strang der Sequenz ID. No. 1 am Genom.
Primer oder Sonde nach Anspruch 12 zur Verwendung beim Nachweis einer Basensequenz eines Introns neben dem Exon 11 des Gens, das mit der Parkinson-Krankheit in Zusammenhang steht, nach Anspruch 1 oder eines Locus davon, wobei der Primer oder die Sonde die folgende Basensequenz umfasst: eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 49 in der 5'-3'-Richtung der Sequenz ID. No. 1 am Genom und eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 50 in der 5'-3'-Richtung an einem komplementären Strang der Sequenz ID. No. 1 am Genom.
Primer oder Sonde nach Anspruch 12 zur Verwendung beim Nachweis einer Basensequenz eines Introns neben dem Exon 12 des Gens, das mit der Parkinson-Krankheit in Zusammenhang steht, nach Anspruch 1 oder eines Locus davon, wobei der Primer oder die Sonde die folgende Basensequenz umfasst: eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 51 in der 5'-3'-Richtung der Sequenz ID. No. 1 am Genom und eine Basensequenz der Sequenz ID. No. 52 in der 5'-3'-Richtung an einem komplementären Strang der Sequenz ID. No. 1 am Genom.
Verwendung des Primers oder der Sonde nach einem der Ansprüche 12 bis 28 zum Nachweis einer Basensequenz des Introns neben dem Exon des Gens, das mit der Parkinson-Krankheit assoziiert ist, oder eines Locus davon.