PROTEINA PARKIN COMO UBIQUITINA LIGASA
.Antecedentes de la Invención La presente invención se refiere a un nuevo uso de la, X proteína Parkm (de aquí en adelante denominada "Parkin") . En particular, la presente invención se refiere al uso de la proteína Parkin como ubiquitma-ligasa (E3) . La presente invención se refiere también a un método de diagnóstico del parkinsonismo juvenil basado en la función de ubiquitina-ligasa de la proteína Parkin (E3) . En particular, la presente invención se refiere también a un método de diagnóstico del parkinsonismo juvenil por medio de detectar una mutación del gen Parkin (de aquí en adelante denominado "parkin") . La presente invención se refiere además a un método de cribado de medicamentos para tratar y/o prevenir el parkinsonismo juvenil. Es sabido que la ruta de la ubiquitina desempeña un importante papel en la descomposición de las proteínas intracelulares que se relaciona con el control de la cantidad de proteínas en las células [Hershko, A et al . , Annu. Rev. Biochem. 67, 425-479 (1998); y Hochstrasser, M, Annu. Rev. Genet . 30, 405-439 (1996)]. La ubiquitina se une con una proteína objetivo por medio de una unión isopeptídica del Gly del C-terminal de la ubiquitina y de un grupo e-NH2 del resí- REF. : 140823
dúo Lys "w' la proteína objetivo. Una proteína se convierte e? ubiquitina en presencia de tres catalizadores de la cascada enzimática, esto es, El (enzima activadora de la ubiquitiná) , E2 (enzima conjugadora de la ubiquitina) y E3 (ubiquitina--;. 'iigasa) . Una cadena de poliubiquitina formada por la serie de, s reacciones funciona como una señal de descomposición para el '. X ataque proteolítico por el proteosoma 26S que es un complejo de proteasas dependientes del ATP de las eucariotas [Coux O. et al . , Annu. Rev. Biochem. 65. 801-847 (1996); y Baumeister "W., et al . Cell 92, 367-380 (1998)]. Debido a la variedad de E2 (enzima conjugadora de la ubiquitina) y E3 (ubiquitina- ; ligasa) , se obtienen dos o más rutas de la proteolisis en las células [Hershko A. et al . , Annu. Rev. Biochem. 67, 425-479 , (1998); y Hochstrasser M., Annu. Rev. Genet. 30, 405-439 (1996)]. Los detalles de la base molecular de la E3 que es la ¡que se relaciona más estrechamente con el reconocimiento del sustrato no han sido aclarados todavía. Actualmente se considera que diferentes proteínas RING-finger están relacionadas, como E3, con la ubiquitinación de las proteínas [Harper Jt W, et al . , Nature Cell Biol. 1, E5-E7 (1999); Zachariae W. et al., Genes & Dev. 13, 2039-2058 (1999): Xie Y. et al . , EMBO J. 18, 6832-6844 (1999); Joazeiro C. A. P. et al . , Science 286, 309-312 (1999); Loríck K. L. et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96, 11364-11369 (1999); Moynihan T. P. et al., J.
Biol. Chista. 274, 30963-30968 (1999); y Martinez-Noel G. eü al . , FEBS Leters 454, 257-261 (1999)]. Se hará una breve descripción de El, E2 y E3. El (enzima activadora de la ubiquitina) es una enzima que en primer lugar forma moléculas de ubiquitina y un enlace tioéster de alta energía. El ATP se consume en la formación,* del enlace tioéster de alta energía con la molécula de ubi- quitina. El transfiere la ubiquitma activada a la siguiente E2 (enzima conjugadora de la ubiquitina) . La enzima E2 recibe la ubiquitina activada de El para formar un nuevo intermedio tioéster. Se había encontrado anteriormente que muchas de las E2 interactúan selectivamente con E3 (ubiquitína-ligasa) , algunas E2 realizan directamente la ubiquitinación de las proteínas sustrato. La E2 forma una familia de genes. Se identificaron 13 genes en gérmenes de levaduras. Se está aclarando ahora que en los animales superiores tales como los seres humanos, está presente un gran número de genes . La E3 (ubiquitina-ligasa) interactúa directa o indirec- tamente con una proteína sustrato (proteína objetivo) para catalizar una reacción de transferencia de la ubiquitina al sustrato o a una cadena de ubiquitina previamente formada en el sustrato. La E3 es la más importante molécula funcional para la determinación de la especificidad del sustrato del
sistemá km* la ubiquitina. El número de enzimas E3 descrito- hasta ahora es todavía pequeño, y las funciones de las misalas- apenas han sido aclaradas. En la actualidad, las enzimas B3 se clasifican en dos grupos de tipo HECT y de tipo RING fín- 5 ger. Se ha dado sugerido la relación entre anormalidad de las enzimas E3 y enfermedades. (1) Tipo HECT: una familia de enzimas E3 que tienen un dominio HECT (homólogo con E6-AP en el C-terminal) homólogo con E6-AP (proteína asociada a E6) en el C-terminal; y 10 (2) Tipo RING finger: los 6 tipos RING finger siguientes ya eran conocidos: (2-1) E-3a (un homólogo de UBR1 de levadura) y E3ß que reconoce el N-terminal del sustrato (objetivo) (2-2) Componente APC11 de APC (complejo favorecedor de 15 la anafase) que tiene un peso molecular de aproximadamente 1.500 Kda, efectivo principalmente en un periodo de división celular, (2-3) R0C1 que es un factor de unión de SCF [Skpl/Cullin 1 (Cdc53) /F-caja proteína] complejo efectivo principalmente 20 en un periodo Gl, (2-4) MDM2 que está relacionado con la ubiquitinación de p53, (2-5) Proteína adaptadora c-Cbl del receptor de tirosi- na-quinasa, y
(2-6) El produc€b géniso BRCAl que causa el cáncer de mama. Recientemente, se han identificado algunos genes causantes de enfermedades nerviosas degenerativas hereditarias, y está siendo aclarada ahora la dinámica de las proteínas anormales producidas por los genes causantes. Consecuentemente, se ha encontrado que muchas proteínas anormales se agregan y depositan en los cerebros y nervios que están dañados por las enfermedades. Por tanto, se admiten en la degeneración ner-viosa mecanismos moleculares comunes causados por la deposición de las proteínas anormales. Se intenta desarrollar ahora un nuevo método de tratamiento por medio de aclarar los mecanismos. La enfermedad de Parkinson es una enfermedad nerviosa degenerativa típica caracterizada principalmente por síntomas extrapiramidales. Las características patológicas de la enfermedad de Parkmson son que las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra y otras neuronas madre cerebrales han degenerado y desaparecido y que los cuerpos de Lewy aparecen en los cuerpos celulares de las restantes neuronas. Se ha encontrado recientemente que la proteína a-sinucleina y la ubiquitina se acumulan en los cuerpos de Lewy de las neuronas de los pacientes. Se ha encontrado también la variación sin sentido invertida de los genes de a-sinucleína, y se ha inter-
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pretado que esta variación es una causa de la acumulación intracelular anormal. Recientemente, los genes que causan la enfermedad de Parkinson juvenil recesiva autosómica (AR-JP) de seres huma- nos jóvenes, que es de herencia recesiva, han sido identificados después del análisis de unión, y han sido denominados wparkin" [Kitada T. et al . , Nature 392, 605-608 (1998)]. El gen "parkm" era un nuevo gen derivado del cromosoma humano No. 6 q 25.2-27. La proteína (Parkin) codificada por el gen parkm tiene un dominio [dominio similar a ubiquitina (Ubi)] homólogo a la ubiquitina en el N-terminal. Dando por hecho que la proteína Parkin está relacionada con la proteolisis como la ubiquitina, la pérdida de su función causa la acumulación de algunas proteínas (proteolisis anormal) y daña las neuronas. La proteína Parkin tiene un RING-box, que comprende dos dominios RING finger y un IBR (en-entre-RING) entre ellos, en el C-terminal. Sin embargo, no se ha descrito hasta ahora ninguna prueba que demuestre que la proteína Parkin está relacionada con la ruta de la ubiquitina. La función de la proteína Par ín en las células, todavía no ha sido aclarada del todo. Descripción de la Invención El objetivo de la presente invención es encontrar una nueva función de la proteína Parkin examinando si la proteína
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e?ítá relacionada o no con la ruta de la ubiquitina y proporcionar después un nuevo método de diagnóstico del parkinsonismo juvenil basado en el hallazgo. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método para el cribado 5 de medicamentos para prevenir y/o tratar la enfermedad de Parkinson juvenil usando la proteína Parkin que tiene una función modificada, en la ruta de la ubíquitina. Después de investigaciones intensivas realizadas con el propósito de resolver los problemas descritos antes, se han
tenido resultados satisfactorios en esta invención para demostrar el hecho de que la proteína Parkin está relacionada con la reacción de transferencia de la ubiquitina a la proteína objetivo en la ruta de la ubiquitina. La presente invención se ha completado basándose en este hallazgo. 15 La presente invención proporciona el uso de la proteína Parkin (Parkin) como ubiquitina-ligasa (E3) . En una realización de la presente invención, la ubiquitina-ligasa es una enzima que tiene actividad para unirse con una enzima conjugadora de la ubiquitina (E2) para unir la ubiquitina con una
proteína objetivo. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de diagnóstico para detectar una variación en el gen Parkin (parkin) , esto es un método de diagnóstico del parkinsonismo juvenil por medio de detectar una variación por la
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que Parkín ejerce una influencia sobre la actividad para unir la ubiquitina con una proteína objetivo en las neuronas y/o una variación que ejerce una influencia sobre la interacción de la proteína Parkin (Parkin) y la enzima conjugadora de la 5 ubiquitina (E2) . Preferiblemente, la variación que ejerce una influencia sobre la actividad para unir la ubiquitina con una proteína objetivo en las neuronas es la variación o deleción en el dominio similar a ubiquitina (Ubi) del gen parkin (parkin) y/o
en el RING-box o el próximo al mismo. Preferiblemente, la variación que ejerce una influencia sobre la interacción entre la proteína Parkin y la enzima conjugadora de la ubiquitina (E2) es la variación o deleción en el RING-box del gen Parkin (parkín) o el próximo al mismo.
La enzima conjugadora de la ubiquitina (E2) es preferiblemente UbcH7 o UbcH8. En otro aspecto más, la presente invención proporciona un método de diagnóstico del parkinsonismo juvenil que comprende determinar en la proteína Parkin (Parkin) del paciente
una actividad para unir la ubiquitina con la proteína objetivo en las neuronas, y también un método de diagnóstico del parkinsonismo juvenil que comprende determinar la interacción entre la proteína Parkin (Parkin) del paciente con la enzima conjugadora de la ubiquitina (E2) .
La enzima conjugadora de la ubiquitina (E2) es preferiblemente UbcH7 o UbcH8. En otro aspecto más, la presente invención proporciona un método de cribado de medicamentos para tratar y/o prevenir el parkinsonismo juvenil, que comprende: (1) una etapa de proporcionar células que tienen un vector de expresión que contiene el gen Parkin (parkin) procedentes de un paciente con parkinsonismo juvenil, (2) una etapa de poner las células en contacto con un compuesto candidato, y (3) una etapa de determinar la actividad de la proteína Parkín (Parkin) para unir la ubiquitina con una proteína objetivo y/o la interacción de la proteína Parkin (Parkin) y una enzima conjugadora de la ubiquitina (E2) . Las células son preferiblemente las derivadas de los nervios . En otro aspecto más, la presente invención proporciona un medicamento para tratar y/o prevenir el parkinsonismo juvenil identificado por el método de cribado de la presente invención. En otro aspecto más, la presente invención proporciona células que llevan un vector de expresión que tiene el gen (parkin) obtenidas de pacientes con parkinsonismo juvenil, las cuales se van a usar para el método de cribado de la pre-
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. Breve Descripción de los Dibujos La Fig. 1 es una fotografía que presenta los resultados e la inmunotransferencia, que muestra la asociación de la 5 proteína Parkin y UbcH7 en células 293 de riñon fetal humano. La Fig. 2a es una vista esquemática que muestra la estructura de la proteína Parkin y la estructura de la variante artificial o natural de la proteína Parkin usada en el Ejemplo 2. La Fig. 2b es una fotografía que presenta los resulta- *10 dos de la inmunotransferencia que muestra la asociación de UbcH7 con la variante de la proteína Parkin. La Fig. 3 es una imagen que presenta los resultados de la inmunotransferencia, que muestra la asociación de la proteína celular ubiquitinada y la proteína Parkin después del 15 tratamiento con MG132 en la célula SH-SY5Y del neuroblastoma humano con dopamina. La Fig. 4 es una imagen que presenta los resultados de la inmunotransferencia, que muestra los resultados del análisis de los dominios de la proteína Parkin necesarios para la 20 unión con la proteína ubiquitinada. La Fig. 5 es una vista esquemática que muestra un modelo de ruta de ubiquitinación con la que se relaciona a la proteína Parkin. En la Fig. 5, Ub indica ubiquitina, El indica una enzima actívadora de la ubiquitina, E2 representa una en-
zima conjfigadora de la ubiquitina, Ubi representa un dominio similar a ubiquitina, y "X" representa una proteína objetivo que se supone que será reconocida por el dominio similar a ubiquitina de la proteína Parkin para la ubiquitinación. Descripción de las realizaciones preferidas: La presente invención se refiere al uso de la proteína „ Parkin (Parkin) como ubiquitina-ligasa (E3) . La realización " del término "uso" de la proteína Parkin como ubiquitina- ligasa (E3) no está particularmente limitada. Dicha realízación indica el uso de Parkin para el diagnóstico de la enfermedad de Parkinson, particularmente del parkinsonismo juvenil, o el uso de la misma para el cribado de medicamentos para el diagnóstico, prevención y/o tratamiento de la enfermedad de Parkinson, particularmente del parkinsonismo juvenil. La ubiquitina-ligasa (E3) es una enzima que interactúa directa o indirectamente con una proteína objetivo para transferir la ubiquitina a una proteína objetivo. En algunos casos, se ha formado previamente una cadena de ubiquitina en la proteína objetivo. En tales casos, la ubiquitina-ligasa (E3) cataliza la reacción de transferir la ubiquitina a la cadena de ubiquitina ya formada. La expresión "la ubiquitina se une con (o se transfiere a) una proteína objetivo" indica aquí que la ubiquitina es transferida a la proteína objetivo o ubiquitinada per se o es transferida a una cadena de ubi-
quitina áé la proteína objetivo ya ubíquitinada. En algunos casos, es necesario que la ubiquitina-ligasa (E3) se una con la enzima conjugadora de la ubiquitina (E2) para presentar su efecto de unir la ubiquitina a la proteína objetivo. La presente invención se refiere también a un método de diagnóstico del parkinsonismo juvenil. En el método de diagnóstico de la presente invención, hay una variación que ejerce una influencia sobre la actividad de la proteína Parkin para unir la ubiquitina con la proteína objetivo en las neuronas y/o una variación que ejerce una influencia sobre la interacción de la proteína Parkin y la enzima conjugadora de la ubiquitina (E2) . La proteína Parkin está descrita en Kitada T. et al . , Nature 392, 605-608 (1998) . El gen "parkin" está compuesto de 12 exones y codifica 465 aminoácidos. El gen "parkin" tiene un dominio similar a ubiquitina (aminoácidos No. 1 a 76) en el N-terminal, y el dominio RING1 (aminoácidos No. 238 a 293), dominios IBR (aminoácidos No. 314 a 377) y el dominio RING2 (aminoácidos No. 418 a 449) en el C-terminal. Se analizan las variaciones del gen parkin de pacientes japoneses y turcos. Está siendo aclarado ahora por qué en los pacientes con parkinsonismo juvenil, la frecuencia de deleción de un «o especificado es alta. El término "RING-box" indica aquí
í una secuéricia de aminoácidos de los aminoácidos números 238 a 449, y "alrededor de él" indica aproximadamente 10 a 20 residuos de aminoácidos alrededor de RING-box. Se ha detectado con la transferencia Northern que el 5 mRNA de la proteína Parkin generalmente está expresado, y la expresión en el cerebro es particularmente alta. Como se muestra en los ejemplos dados más adelante, la proteína Parkin tiene una actividad para ubiquitinar una proteína objetivo en las células SH-SY5Y dopaminérgicas del neuroblastoma
humano. La actividad de la proteína Parkin para catalizar la reacción de unión de la ubiquitina se considera que es mantenida por ciertas células incluyendo las neuronas. Por tanto, se prefiere usar neuronas tales como las células SH-SY5Y dopaminérgicas del neuroblastoma humano. 15 La variación que ejerce una influencia sobre la actividad para unir la ubiquitina con una proteína objetivo implica una variación o bien para disminuir o bien para aumentar la actividad para unir la ubiquitina con la proteína objetivo. Generalmente se considera que cuando se reduce la unión de la
ubiquitina con la proteína objetivo, se reduce la eficacia de la descomposición de la proteína objetivo y, como resultado, ?e produce acumulación de la proteína, aunque la presente invención no está limitada por esta teoría. Es posible, por tanto, que se pueda diagnosticar el parkinsonismo juvenil de-
termina jd la reducción de la actividad para unir la ubiquitina. La variación de la proteína Parkin que ejerce una influencia sobre la actividad para unir la ubiquitina con la proteína objetivo es causada por la variación o falta de una base en uno o más dominios similares a ubiquitina, dominio RING1, dominio IBR y dominio RING2 del gen parkin. Se puede detectar tal variación determinando directamente la secuencia de bases del DNA tomado de un paciente o se puede detectar fácilmente por PCR cuando hay que encontrar la presencia o ausencia de una variación ya conocida. El término "enzima conjugadora de la ubiquitina (E2)" indica aquí una enzima que recibe ubiquitina activada de El para formar un nuevo intermedio tioéster. Esta enzima es pre-feriblemente UbcH7 o UbcH8. En particular, es preferiblemente
UbcH7. UbcH7 es una proteína compuesta de 154 aminoácidos y que tiene un peso molecular de 17861 Da (Ulrike Nubert et al . , J. Biol. Chem., 271, 2795-2800, 1996). UbcHd es una proteína compuesta de 153 aminoácidos y que tiene un peso molecular de 17768 Da (Sushant Kumar et al . , J. Biol. Chem., 272, 13548-13554, 1997) . En la ubiquitinación de P53, dependiente de E6, derivado ¡Sea papillomavirus de tipo 16 y tipo 18, la E6-AP (100 kDa)
que tiefte un hectodominio funciona como una ligasa. Se ha descrito que las enzimas conjugadoras de la ubiquitina (E2) son en este caso UbcH5, UbcH7 y UbcH8 (Sushant Kumar et al . , J. Biol. Chem., 272, 13548-13554, 1997). La homología de UbcH7 y UbcH8 es aproximadamente 46 %. En el método de diagnóstico de la presente invención, ee determina la actividad de la proteína Parkin para unir la ubiquitina con una proteína objetivo en las neuronas y/o la interacción de la proteína Parkin y la enzima conjugadora de la ubiquitina (E2) . El método para determinar la actividad de la proteína Parkin para unir la ubiquitina con la proteína objetivo en las neuronas no es limitado. Por ejemplo, un vector de expresión que contiene el gen parkin marcado con Myc o simila-res y un vector de expresión de ubiquitina marcado con FLAG o similares se transfieren simultáneamente a neuronas tales como las células SH-SY5Y. Las células se dividen en 2 grupos. Las células de un grupo se tratan con un inhibidor del proteosoma tal como MG132. Un cierto tiempo después de la trans-fección, se recogen las células. Se detecta una proteína unida a la ubiquitina aplicando el método de la inmunotransfe-rencia en el que se usa un anticuerpo (tal como anticuerpo anti-FLAG) frente a la sustancia usada para el marcado de la ubiquitina, a un mmunoprecipitado preparado usando un anti-
*5& cuerpd (tal como anticuerpo antiMyc) frente a una substancia usada para el marcado de la proteína Parkin. Cuando se detecta por este método una proteína ubiquitinada de alto peso* molecular, se considera que la ubíquitina está alineada con la proteína objetivo. Cuando no se detecta una banda correspondiente a la proteína ubiquitinada de alto peso molecular en las células que no fueron tratadas con el inhibidor del proteosoma, se considera que la proteína ubiquitinada de alto peso molecular ha sido descompuesta con el proteosoma. Por
tanto se puede examinar la relación de la proteína Parkin con la proteolisis. En el método de diagnóstico de la presente invención, se examina la interacción entre la proteína Parkin y la enzima conjugadora de la ubiquitína (E2) . La interacción se puede
determinar por cualquier método. Por ejemplo, un vector de expresión que contiene el gen parkin marcado con Myc o similares se puede transfectar a una célula apropiada junto con otro que contiene un gen que codifica una enzima conjugada a ubiquitina marcada con FLAG, His, HA o similares. Un cierto
tiempo después de la transfección, se prepara un extracto celular y se lleva a cabo la inmunoprecipitación con un anticuerpo (tal como anticuerpo antiMyc) frente al marcador usado para marcar la proteína Parkin. La interacción entre la proteína Parkin y la enzima conjugadora de la ubiquitina (E2) se
**> - (& S -17- puede detfg?tar por la inmunotransferencia con el inmunopreci- pitado y un anticuerpo frente al marcador usado para marcar la enzima conjugadora de la ubiquitina. La presente invención proporciona también un método de cribado de medicamentos para tratar y/o prevenir el parkinsonismo juvenil. El método de cribado de la presente invención comprende las siguientes etapas: (1) una etapa de proporcionar células que mantienen un vector de expresión que contiene el gen parkin procedentes de un paciente con parkinsonismo juvenil, (2) una etapa de poner las células en contacto con un compuesto candidato, y (3) una etapa de determinar la actividad de la proteína Parkin para unir la ubiquitina con una proteína objetivo y/o la interacción entre la proteína Parkin y la enzima conjugadora de la ubiquitina (E2) . Los vectores de expresión usados en la presente intención son vectores capaces de expresar genes de inserción preferiblemente con células animales, en particular pre- feriblemente con neuronas humanas. Los vectores de expresión son preferiblemente aquellos capaces de replicación autónoma en células hospedantes o capaces de integración en los cromosomas y que contienen un promotor en una posición en la que el gen insertado puede ser transcrito. Las clases de los vec-
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tores de* exprésion no están particularmente limitadas y se pueden usar, por ejemplo, vector pcDNA3.1(+) (Invitrogen), vector p-Tet-On (Clontech) , vector de expresión de mamíferos pSI (Promega) y vector de expresión pSVK3 (Amersham Pharmacia Biotech) . Las clases de las células utilizables en la presente invención no están particularmente limitadas siempre que la proteína Parkin pueda presentar su función como una ubiquitina-ligasa en la ruta de la ubiquitina. Las células son, sin embargo, preferiblemente células animales, particularmente neuronas y más particularmente neuronas humanas tales como neuroblastoma dopaminérgico humano. Cuando un compuesto candidato mejora la actividad de la proteína Parkin para unir la ubiquitina con una proteína ob-jetivo o mejora la interacción entre la proteína Parkin y la enzima conjugadora de la ubiquitina (E2), el compuesto candidato se puede seleccionar como un candidato para un medicamento para tratar y/o prevenir el parkinsonismo juvenil. El medicamento seleccionado de este modo puede ser sometido a los ensayos subsiguientes para confirmar su efecto medicinal. Las clases de los compuestos candidatos no están particularmente limitadas, y ellas incluyen, por ejemplo, cítoquí-nas, medicamentos de bajo peso molecular, hormonas, anticuerpos de especificidad, imitaciones de péptidos, oligonucleóti-
dos antisentido y otros medicamentos capaces de alterar las funciones celulares o la expresión de las proteínas. Los siguientes ejemplos ilustrarán adicionalmente la presente invención, pero no limitan de ningún modo la inven- ción. Ejemplo Operación experimental (1) Plásmido de expresión y transfección Para preparar los vectores pcDNA3.1 (+)Myc pcDNA3.1 (+) FLAG, el oligo-DNA que codifica los epítopes Myc y FLAG en el N-terminal se ligó al dominio Kpnl/BamHl de pcDNA3.1(+) (Invitrogen). Después de la amplificación del gen parkin de tipo natural o de una variante deficiente en el N- terminal, se ligaron al dominio BamHl del vector las Ubc2 (HHR6B) , UbcHd y el cDNA de ubiquitina con un cebador adecuado. La variante deficiente en el C-terminal y la variante sin sentido invertida del gen parkin se prepararon introduciendo una variación en pcDNA3.1 (+)Myc-Parkin usando un kit Quik Change inductor de la variación específica en el do- minio (Stratagene) de acuerdo con un manual. El pCAGGS-Ubc3 había sido descrito previamente [Iwai K. et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96, 12436-12441 (1999)]. Se prepararon pCGN-Ubc4 y otro pcDNA3.1 (+) FLAG-Ubc a partir de una genoteca de cDNA de hígado humano por un método
Í ordinario. El übc usado se obtuvo de seres humanos en todos los casos. Se cultivaron células 293 (HEK293) de riñon fetal humano y células SH-SY5Y de neuroblastoma dopa inérgico humano en DMEM que contenía 10 % de suero fetal bovino, 10 µg/ml de estreptomicina y 100 U/ml de penicilina. Se realizó la transfección usando el reactivo de transfección FuGENEd de acuerdo con el manual del fabricante (Boehringer-Mannheim) . Se trataron las células con MG132 (Cbz-Leu-Leu-Leu-aldehído) (Peptide Institute, Inc., Osaka, Japan) teniendo una concentración final de 50 µM. (1) Análisis inmunológico Se realizó la inmunoprecipitación con anticuerpos policlonales antiMyc de conejo (A-14) (Santa Cruz Biotechnology) como se ha descrito previamente [Suzuki H. et al . , Biochem. Biophys. Res. Commun. 256, 127-132 (1999)]. La inmunotransferencia se llevó a cabo con anticuerpo monoclonal antiFLAG(M2) de ratón unido a biotina (SIGMA) , anticuerpo monoclonal antiMyc de ratón (9E10) (Santa Cruz Biotechnology), anticuerpo monoclonal antiHA de ratón (HA.11) (Berkeley Anticuerpo Co - pany) o anticuerpo monoclonal antiHis de ratón (RGS.His) (QIAGEN) . Se usó el complejo de estreptoavidina / peroxidasa de rábano (Amersham Pharmacia Biotech) para detectar el anticuerpo antiFLAG(M2) unido a biotina.
f*!§2 Ejemplo 1: Interacción entre la proteína Parkin y la enzima E2. Se realizó el siguiente ensayo para averiguar si la proteína Parkin está relacionada o no con la ruta de la ubi- quitina. Para averiguar si la interacción entre la proteína Parkin y cada una de las diferentes enzimas E2 tiene lugar o no, se expresó el gen parkin marcado con Myc junto con diferentes enzimas E2 marcadas con FLAG, HA o His en diferentes dominios de las células HEK293, y se detectó la interacción entre ellos por la inmunoprecipitación. Los resultados se muestran en la Fig. 1. Concretamente, se transfectó pcDNA3.1 (+)Myc-Parkin (10 lµg) en células HEK293 simultáneamente con diferentes vectores de expresión que codifican FLAG-Ubc, His-Ubc o HA-Ubc en cantidades que se muestran entre paréntesis en la Fig. 1. 48 horas después de la transfección, se prepararon extractos celulares, y se realizó la inmunoprecipitación (IP) con anticuerpo antiMyc. Los extractos celulares (panel superior de la Fig. 1) y los inmunoprecipitados (paneles medio e inferior de la Fig. 1) se analizaron por inmunotransferencia con diferentes anticuerpos como se muestra en la Fig. 1. Aunque en condiciones ordinarias no se detectó la asociación de la proteína Parkin y UbcH8, se detectó la misma cuando se expresó una gran cantidad de UbcHd y las películas de la inmunotransfe-
' ;* &£ I 22- rencia se expusieron durante un largo periodo de tiempo a la reacción ECL (véase la pista #) . El símbolo (*) indica u a*: banda no específica que incluye la cadena ligera de IgG. Como se muestra en la Fig. 1, UbcH7 y UbcH8 inmunopreci- 5 pitaron junto con la proteína Parkin (la inmunoprecipitación de UbcHd fue débil) . Sin embargo, no se encontró una unión detectable en otras enzimas E2 ensayadas (tales como Ubc2, Ubc3, Ubc4, UbcH5A-C y UbcH6) . Ejemplo 2 10 Se analizó la estructura del dominio de la proteína Parkin que puede interactuar con UbcH7. La proteína Parkin tiene 3 dominios, esto es, el dominio similar a ubiquitina en el N- terminal, el dominio RING~box en el C-terminal y el dominio enlace que une estos dos segmentos. Es sabido que el dominio
RING-box en el C terminal está compuesto de RING1, RING2 e IBR (en-entre-RING) [Morett E. et al . , Trends Biochem. Sci. 24, 229-231 (1999)] como se muestra en la Fig. 2a. La Fig. 2a es una vista esquemática que muestra las estructuras de las variantes artificiales y naturales de la proteína Parkin usa- 20 das en Ejemplo 2. El aminoácido se representa por notación de una letra en la Fig. 2a. El isómero sin sentido y el isómero sin sentido invertido de la proteína Parkin encontrados en los pacientes con parkinsonismo juvenil (AR-JP) se muestran como ParkinQ311s op y ParkinT240R / ParkinR42P. La proteína Par-
íes una varj_ánte formada reemplazando la glutamina No. 211 con el codón final (stop), y la proteína Parkin?20R / ParkmR42P es una variante formada reemplazando la treonina Mo. 240 con arginina y la arginina No. 42 con prolina. La interacción entre la variante Parkin y UbcH7 se analizó usando la variante Parkín de la misma manera que en el Ejemplo 1 excepto que la cantidad (µg) de cada variante Parkin fue como se muestra entre paréntesis en la Fig. 2b, y se Usó pcDNA3.1 (+) FLAG-UbcH7 (7 µg) . En la inmunotransferencia en la que se usó el anticuerpo antiFLAG, se usó el extracto crudo (panel superior de la Fig. 2b) . En la inmunotransferencia en la que se usó el anticuerpo antiMyc (panel medio de la Fig. 2b) o el anticuerpo antiFLAG (panel inferior de la Fig. 2b) , se usó el mmunoprecipitado obtenido con el anticuerpo antiMyc. El símbolo (*) muestra la cadena pesada y la cadena ligera de IgG. De los resultados mostrados en la Fig. 2b se deduce que la deleción del dominio similar a ubiquitina y del dominio enlace no ejerció ninguna influencia sobre la unión con UbcH7 y que solamente la mitad de RING-box que tiene el C-terminal fue suficiente para el complemento de UbcH7. Por el contrario, la variante de RING-box que carece del dominio RING1 o RING2 no puede ser unida con UbcH7. En los ensayos de dos va-
*< , -24-
^iantes s|n sentido invertidas de pacientes con parkinsonis?tio juvenil (AR-JP) , la proteína ParkinR42p que era una variante con dominio similar a ubiquitina se pudo unir con UbcK7, mientras que la proteína Parkint2 0R en la cual Thr había sido 5 cambiada a Arg [Hattori N. et al . , Biochem. Biophys. Res. Commun. 249, 754-758 (1998)] no interactuó con UbcH7 en el dominio RING1. A partir de estos resultados, se encontró que el dominio RING-box (no otros dominios tales como el dominio enlace o el dominio similar a ubiquitina) era necesario para
la asociación con UbcH7 que es una enzima conjugadora de la ubiquitina. Ejemplo 3 Se realizaron ensayos para saber si la proteína Parkin puede captar una proteína objetivo para ubiquitinarla como se
ha descrito para las E3 de otras clases y de esta forma aclarar los papeles de la proteína Parkin en la ruta de la ubi- quitina [ZacHAriae W. et al . , Genes & Dev. 13, 2039-2058 (1999); Xie Y. et al . , EMBO J. 18, 6832-6844 (1999); Joazeí- ro, C. A. P. et al . Science 286, 309-312 (1999); y Lorick K.
L. et al . Proc. Nati. Acad. Sci. USA 96, 11364-11369 (1999)]. En primer lugar, se transfectaron simultáneamente a células SH-SY5Y 10 µg de pcDNA3.1 (+)Myc-parkin y 10 µg del vector pcDNA3.1 (+) FLAG-ubiquitina. 48 horas después de la transfección, se recogieron todas las células. En uno de los expe-
rimentos, se trataron las células con MG132 (50 µM) 3, 8 o 24 horas antes de la recogida de las células. Se usó un inmuno- precipitado preparado con anticuerpo antiMyc para la inmuno- transferencia con anticuerpo antiFLAG (panel superior de la Fig. 3) y anticuerpo antiMyc (panel inferior de la Fig. 3) . En la Fig. 3, un símbolo (*) representa la posición de la proteína Parkin. Una proteína ubiquitinada de un alto peso molecular se muestra como (Ub)n en el lado derecho. Como se puede entender de los resultados mostrados en la Fig. 3, cuando Myc-parkin y FLAG-ubiquitina se expresaron simultáneamente con células SH-SY5Y de neuroblastoma dopaminér- gico humano, se detectaron las bandas ubiquitinadas que incluyen proteínas ubiquitinadas de alto peso molecular, con los mmunoprecipitados antiMyc procedentes de un extracto crudo de células que habían sido tratadas con un inhibidor del proteosoma MG132 (Cbz-Leu-Leu-Leu-aldehído) [Rock K. L, et al . , Cell 78, 761-771 (1994)]. Por otro lado, cuando no se realizó el tratamiento con un inhibidor, no se encontró ninguna banda ubiquitinada. Se realizó la asociación de la pro- teína marcada ubiquitmada con la proteína Parkin, dependiendo del tiempo, después del tratamiento con MG132. Algunas de las proteínas ubiquitmadas eran más pequeñas que la proteína Parkín. Estos resultados indicaron que la proteína Parkin puede captar las proteínas celulares para la ubiquitmacíón y
1 i que pue<fí#ífuncionar como ubiquitina-proteína-ligasa. En el mismo análisis que anteriormente pero en el que se usó extracto celular HEK293 de riñon fetal, no se observó ninguna banda ubiquitinada unida con la proteína Parkin (no se muestran datos) . Estos resultados indicaron que la proteína objetivo de la proteína Parkin faltaba en las células HEK293 o que otro factor indispensable que ejerce una influencia sobre la unión de la proteína Parkin con la proteína objetivo o sobre la actividad E3 de la proteína Parkin fáltaba en las células HEK293 y que la proteína inhibidora de la ubiquitinación estaba contenida en las células HEK293. Ejemplo 4 Se intentó aclarar la relación funcional entre la unión de Parkin y E2 en las neuronas SH-SY5Y y la actividad de ubi-quitinación. Las condiciones experimentales fueron las mismas que las del Ejemplo 3. Los vectores de expresión de diferentes variantes Myc-Parkin se usaron en una cantidad (µg) que se da entre paréntesis en la Fig. 4. Antes de recoger las células, se trataron éstas con MG132 (50 µM) durante 24 horas. 48 horas después de la transfección, el inmunoprecipitado preparado con anticuerpo antiMyc se usó para la inmunotransferencia con anticuerpo antiFLAG (panel superior de la Fig. 4) y anti-
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cuerpo aiitiMyc (panel inferior de la Fig. 4) . Los detalles de la varia te de Parkin se muestran en la Fig. 2a. En la Fig. 4, un símbolo (*) representa las bandas de cadena pesada y de cadena ligera de IgG como en la Fig. 2b. La banda de la cade- na pesada de IgG se solapa con las posiciones de la Parkin natural y de la variante de Parkin sin sentido invertida. Como se muestra en la Fig. 4, cuando apareció una falta o una variación sin sentido invertida en RING-box, que hizo imposible la absorción de UbcH7, no se detectó una banda de la proteína ubiquitinada asociada con Parkin en las mismas condiciones de tratamiento con MG132. Estos resultados indican que la absorción de UbcH7 es indispensable para la función de la proteína Parkin. Las variantes de Parkin que carecen del dominio similar a ubiquitina y la variante ParkinR42P tomada de un paciente perdieron casi completamente la asociación con la proteína ubiquitinada (Fig. 4) . Sin embargo, ya que estas variantes de Parkin podían ser unidas con UbcH7 (Fig. 2b), esto dio a entender que el dominio similar a ubi- quitina es indispensable para el reconocimiento del objetivo. Estos resultados indicaron que la pérdida de la actividad de ubiquitinación de la proteína Parkin es una causa de AR-JP. Discusión de los ejemplos: Se ha considerado que la proteína Parkin está relacionada con el síndrome de Parkinson juvenil que causa la degene-
rací? f ? jviosa de la sustancia negra (Kitada T. et al . , Nature 392, 605-608 (1998); y Mizuno Y. et al . , J. Neurochem. 71, 893-902 (1998) ] . Los resultados de los ejemplos 1 a 4 indican que la proteína Parkin funciona como una ligasa (enzima E3) para unir la ubiquitina con una proteína objetivo con UbcH7 (enzima E2) y que cataliza la ubiquitinación de la proteína objetivo. La Fig. 5 es una vista esquemática que muestra el mecanismo. La proteína Parkin está compuesta de dos dominios funcionalmente diferentes, esto es, (1) RING-box en el C-terminal para captar UbcH7 que es una enzima E2 específica y (2) dominio similar a ubiquitina en el N-terminal necesario para el reconocimiento de la proteína objetivo para la ubiquitinación. Muchos pacientes de AR-JP tienen una variación de Parkin por deficiencia y algunos de los pacientes tienen una variación sin sentido invertida en el dominio RING-box o en el dominio similar a ubiquitina [Hattori N. et al . , Biochem. Biophys. Res. Commun. 249, 754-758 (1998); y Hattori N. et al . , Ann. Neurol. 44. 935-941 (1998)]. En los presentes ensayos, todas las construcciones de Parkin que te- nían una variación en este dominio o carecían de este dominio carecían de la actividad E3. Este hecho indica que la ruta de ubiquitinación mediada por Parkin desempeña un importante papel en el mantenimiento de la homeostasis de las neuronas de la sustancia negra por medio de controlar la cantidad de pro-
teína. í i Sin embargo, el mecanismo del hecho por el que la disfunción de la proteína Parkin induce una muerte de neuronas altamente selectiva todavía es desconocido. Se encontró en experimentos según la presente invención que la proteína ubiquitinada no se inmunoprecipita en las células HEK293 de riñones fetales, mientras que se inmunoprecipita junto con la proteína Parkin en las células SH-SY5Y de los nervios. Este hallazgo indica que la proteína Parkin participa selectiva-mente en la proteolisis de las neuronas. Cuando se considera que la proteína Parkin es una ubiquitina-ligasa, un factor indispensable para el reconocimiento del sustrato con una proteína objetivo (mostrada como "X" en la Fig. 5) y/o Parkin podría estar presente solamente en las neuronas dopaminérgi-cas. Posiblemente, una acumulación anormal de "X" en las células de la sustancia negra de pacientes con AR-JP induce una muerte específica de las neuronas. Este fenómeno se puede explicar probablemente por el hallazgo de que la proteína Parkin está relacionada con la ubiquitinación y puede actuar co-mo ubiquitma-proteína-ligasa. Cada vez van en aumento las pruebas que demuestran el hecho de que la acumulación anormal de proteína ubiquitinada se observa a menudo en diferentes enfermedades nerviosas degenerativas [Lowe J. et al . , Brain Pathol. 3, 55-65 (1993); y
M ^e R. kt al . (1998), en "Ubíquitin and the Biology of the Cell" pp. 429-462, plenum Press, New York] . Estos hallazgos indican que el control de la cantidad de proteína intermediada por la ruta ubiquitina/proteosoma desempeña un importante- 5 papel en muchas neuronas que no se dividen. .Antes de la presente invención, no se sabía que la variación del gen parkin en los pacientes con AR-JP estaba relacionada con la anormalidad de la ubiquitinación. Por la presente invención ha sido parcialmente aclarada 10 la función del gen parkin y se proporciona un nuevo método de diagnóstico del parkinsonismo juvenil. También el desarrollo de un sistema de cribado para medicamentos utilizables para la prevención y/o tratamiento de la enfermedad de Parkinson se ha hecho posible por la presente invención. 15 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. 20