ES2272444T3 - Proteina de parkin, como ubiquitina-ligasa. - Google Patents

Abstract

El uso de proteína de Parkin (Parkin), como una ubiquitina-ligasa (E3).

Description

Proteína de Parkin, como ubiquitina-ligasa.

Antecedentes y transfondo de la invención

La presente invención, se refiere a un nuevo uso de proteínas de Parkin (a las cuales se les hará referencia, a en la parte que sigue de este documento, como "Parkin"). De una forma particular, la presente invención, se refiere al uso de Parkin como Ubiquitina-ligasa (E3). La presente invención, se refiere, también, a un procedimiento de diagnosis del Parkinsonismo juvenil, en base a la función ubiquitina-ligasa de Parkin (E3). De una forma particular, la presente invención, se refiere, también, a un procedimiento de Parkinsonismo juvenil, mediante la detección de una mutación de un gen de Parkin (al cual se le hará referencia, en la parte que sigue de este documento, como "Parkin"). La presente invención, se refiere adicionalmente a un procedimiento para investigar medicinas, para tratar y/o prevenir el Parkinsonismo juvenil.

Se conoce el hecho de que, la trayectoria de la ubiquitina, juega un rol interpretativo importante en la descomposición de la proteína celular, la cual se refiere al control de la cantidad de proteína en las células [Hershko, A. et al., Annul. Rev. Biochem, 67, 425 - 479 (1998); y Hochstrasser, M., Annu. Rev. Genet. 30, 405 - 439 (1966). La ubiquitina, se enlaza con una proteína diana, a través de un enlace isopeptídico de Gly C-terminal de ubiquitina y un grupo \varepsilon-NH_{2} en el residuo Lys de la proteína diana. Una proteína, se convierte en ubiquitina, en presencia de catalizadores enzimáticos en cascada, es decir E1 (ubiquitina-ligasa), E2 (enzima de enlace de la ubiquitina) y E3 (ubiquitina-ligasa). Se forma una cadena de poliubiquitina, mediante la serie de las funciones de reacción, como una señal de descomposición para el ataque proteolítico mediante proteasoma 26S, el cual es un complejo de proteasa, de eucariotas, ATP-dependiente [Coux O. et al., Annu. Rev. Biochem. 65, 801 - 847 (1996); y Baumeister W., et al. Cell 92, 367 - 380 (1998); Debido a la variedad de E2 (enzima de enlace ubiquitina) y E3 (ubiquitina-ligasa), se obtienen una o más trayectorias de la proteólisis, en las células [Hershko A. et al., Annu. Rev. Biochem. 67, 425 - 479 (1998), y Hochstrasser M., Annu. Rev. Genet. 30, 405 - 439 (1996)]. Los detalles de la base molecular de E3, la cual se refiere, de la forma más cercana, al reconocimiento del substrato, no se ha aclarado todavía. Se sugiere, en el momento presente, el hecho de que, varias proteínas RING-finger (de dedos anulares), se refieren, como E3, a la ubiquitinación de proteínas [Harper, J. W. et al., Nature Cell Biol. 1, E5-E7 (1999); Zachariae W. et al, Genes & Dev, 13, 2039 - 2058 (199); Xi Y. et al., EMBO J. 18, 6832 - 6844 (1999); Joazeiro C.A.P et al., Science 286, 309 - 312 (1999); Lorick K. L. et al. Proc. Natl. Acad. Scie. USA 96 11364 - 11369 (1999); Moynihan T.P. et al., J. Biol. Chem. 274, 30963 - 30968 (1999), y Martinez-Noel G. et al., FEBS Letters 454, 257 - 261 (1999)].

Se facilitará, ahora, una breve descripción de las E1, E2 y E3.

La E1 (enzima de activación de la ubiquitina), es una enzima, la cual, en primer lugar, forma moléculas de ubiquitina y un enlace tioéster de alta energía. En la formación del enlace de tioéster de alta energía, con la molécula de ubiquitina, se consume ATP. La E1, transfiere la ubiquitina activada a la siguiente E2 (enzima de enlace de la ubiquitina).

La E2, recibe la ubiquitina activada, de la E1, para formar un nuevo intermediario tioéster. Se había ya encontrado el hecho de que, muchas de las E2, interactúan selectivamente con la E3 (ubiquitina-ligasa) y, algunas de las E2, ubiquitinan directamente proteínas de substrato. La E2, forma una familia de genes. Se identificaron 13 genes, en levadura brotada. Se está ahora aclarando, el hecho de que, en los animales superiores, tales como los seres humanos, se encuentra presente un mayor número de genes.

La E3 (ubiquitina-ligasa), interactúa, de una forma directa o indirecta, con una proteína de substrato (proteína diana), para catalizar una reacción de transferencia de ubiquitina, al substrato o una cadena de ubiquitina, ya formada en el substrato. La E3, es la molécula funcional más importante, para la determinación de la especificidad del substrato, del sistema de ubiquitina. El número de enzimas E3 reportadas hasta ahora, es únicamente reducido y, las funciones de éstas, apenas se han aclarado. En el momento presente, las enzimas E3, se clasifican en dos grupos, del tipo HECT y del tipo de RING finger. Se ha sugerido la relación entre la anormalidad de enzimas E3 y enfermedades.

(1) Tipo HECT: una familia de enzimas E3, que tienen un dominio HECT (homólogo a E6 en el término C), homólogo a E6-AP (proteína asociada a E6) en el término C.

(2) Tipo RING-finger: los siguientes 6 tipos de RING-finger, se conocen ya:

(2-1) E-3\alpha (un homólogo de UBR1 de levadura) y E3\beta, que reconoce el terminal N del substrato (diana).

(2-2) Componente APC11 de APC (complejo promotor de anafasa) que tiene un peso molecular de aproximadamente 1.500 KDa, efectivo, principalmente en un período de división celular,

(2-3) ROC1, el cual es un factor de enlace del complejo SCF [SkpI/Cullin 1 (Cdc53)/proteína F-box], efectivo principalmente en el período G1,

(2-4) MDM2, el cual se refiere a la ubiquitinación de p53.

(2-5) Proteína adaptante c-Cb1 del receptor tirosina-quinasa, y

(2-6) producto del gen causante del cáncer de mama BRCA1.

Recientemente, se han identificado algunos genes causantes de enfermedades hereditarias degenerativas de los nervios y, la dinámica de proteínas anormales producida por los genes causantes, se está ahora elucidando. Por consiguiente, se encontró que, muchas proteínas anormales, se agregan y se depositan en el cerebro y en los nervios, los cuales se dañan por las enfermedades. Así, por lo tanto, se asume un mecanismo molecular provocado por la deposición de las proteínas anormales en la degeneración de los nervios. Se intenta, ahora, el desarrollar un nuevo procedimiento de tratamiento, mediante la aclaración de los mecanismos.

La enfermedad de Parkinson, es una enfermedad típica de degeneración de los nervios, caracterizada principalmente por síntomas extrapiramidales. Las características patológicas de la enfermedad de Parkinson, consisten en que, las neuronas dopaminérgicas de la substancia negra y otras neuronas germinales del cerebro, se degeneran y se rompen, y en que, aparecen cuerpos de Lewy en los cueros de las células de las neuronas restantes. Se ha encontrado, recientemente, el hecho de que, la proteína \alpha-sinucleína y la ubiquitina, se acumulan en los cueros de Lewy y en las neuronas de los pacientes. Se encontró, también, la variación de sentido fallido de los genes de \alpha-sinucleína, y se sugirió el hecho de que, esta variación, es una causa de la acumulación intracelular anormal.

Recientemente, se han identificado los genes causantes de la enfermedad juvenil de Parkinson autosómica recesiva (AR-JP) de seres humanos jóvenes, la cual es de herencia recesiva, después de un análisis de enlace y éstos se denominaron "parkin" [Kitada T. et al., Nature 392, 605 - 608 (1998)]. "parkin", es un nuevo gen derivado del cromosoma humano nº 6, q 25.2 - 27. La proteína (Parkin) codificada con parkin, tiene un dominio (dominio Ubl semejante a la ubiquitina), en el término N. Suponiendo que Parkin concierne a la proteólisis como la ubiquitina, la pérdida de la función de ésta, causa la acumulación de algunas proteínas (proteólisis anormal) y daña a las neuronas. Parkin, tiene un RING-box, que comprende dos dominios de RING-finger y un IBR (RING entremedio), entre éstos, en el terminal C. No obstante, no se ha reportado, hasta ahora, ninguna evidencia que muestre que, Parkin, concierna a la trayectoria de la ubiquitina. La función de Parkin, en las células, no se ha elucidado todavía.

Revelación de la invención

El objeto de la presente invención, es el de encontrar una nueva función de Parkin, procediendo a examinar sin Parkin concierne a la trayectoria de la ubiquitina, o no, y después proporcionar un nuevo procedimiento de diagnóstico del Parkinsonismo juvenil, en base a los descubrimientos. Otro aspecto de la presente invención, es la de proporcionar un procedimiento para investigar medicinas para prevenir y/o tratar la enfermedad de Parkinson juvenil, utilizando Parkin que tenga una función cambiada en la trayectoria de la ubiquitina.

Después de intensas investigaciones, realizadas con el propósito de resolver los problemas anteriormente descritos, arriba, los inventores han tenido éxito en probar el hecho de que, Parkin, concierne a la reacción de transferencia ubiquitina, en la proteína diana, en la trayectoria de la ubiquitina. La presente invención, se ha completado en base a este descubrimiento.

La presente invención, proporciona el uso de proteína de Parkin (Parkin), como una ubiquitina-ligasa (E3). En una forma de presentación de la presente invención, la ubiquitina-ligasa, es una enzima que tiene una actividad de enlace con una enzima de enlace de ubiquitina (E2), para enlazar ubiquitina con una proteína diana.

En todavía otro aspecto, la presente invención, proporciona un procedimiento de diagnóstico del Parkinsonismo juvenil, el cual comprende el determinar una actividad de una actividad de enlace de ubiquitina con la proteína diana, en neuronas, en proteína de Parkin)(Parkin) del paciente, y también, un procedimiento de diagnóstico del Parkinsonismo juvenil, el cual comprende el determinar la interacción entre la proteína de Parkin (Parkin) del paciente, con la enzima de ubiquitina-ligasa (E2).

La enzima de ubiquitina-ligasa (E2) es, de una forma preferente, UbcH7 ó UbcH8.

En aún todavía otro aspecto, la presente invención, proporciona un procedimiento para la investigación de medicinas, para tratar y/o prevenir el Parkinsonismo juvenil, el cual comprende:

(1) una etapa consistente en proporcionar células que tengan un vector de expresión que contenga el gen de Parkin (Parkin), procedente de un paciente afectado de Parkinsonismo juvenil.

(2) una etapa consistente en poner las células en contacto con un compuesto candidato y,

(3) una etapa consistente en determinar la actividad de proteína de Parkin (Parkin), con objeto de enlazar ubiquitina con una proteína diana y/o la interacción de proteína de Parkin (Parkin) y una enzima de enlace de ubiquitina
(E2).

Las células son, de una forma preferible, aquéllas derivadas de los nervios.

En aún todavía otro aspecto, la presente invención, proporciona una medicina para tratar y/o prevenir el Parkinsonismo juvenil, identificada mediante el procedimiento de investigación de la presente invención.

Descripción resumida de los dibujos

La figura 1, es una fotografía, la cual muestra los resultados de inmunoblotting (inmunotransferencia de Western), la cual muestra la asociación de Parkin y UbcH7 en células 293 del riñón humano fetal.

La figura 2a, es una vista esquemática, la cual muestra la estructura de Parkin y la estructura de una variante artificial o natural de Parkin, utilizada en el ejemplo 2. La figura 2b, es una fotografía que muestra los resultados de inmunoblotting (inmunotransferencia de Western), los cuales muestran la asociación de UbcH7 con Parkin variadas.

La figura 3, es una fotografía que muestra los resultados de inmunoblotting, que muestra la asociación de la proteína de célula ubiquitinada y Parkin, después del tratamiento con MG132 en la célula del neuroblastoma, de dopamina, SH-SY5Y.

La figura 4, es una fotografía que muestra los resultados de inmunoblotting, que muestra los resultados del análisis del dominio de Parkin, el cual es necesario para el enlace con la proteína ubiquitinada.

La figura 5, es una vista esquemática, la cual muestra un modelo de trayectoria de ubiquitinación, a la cual se refiere Parkin. En la figura 5, Ub, indica ubiquitina, E1, indica una enzima de activación de ubiquitina, E2, representa una enzima de enlace de ubiquitina, Ub1, representa un dominio semejante a la ubiquitina y, "X", representa una proteína diana, la cual se asume como siendo reconocida por del dominio semejante a la ubiquitina, de Parkin, para la ubiquitinación.

Descripción de la formas preferidas de presentación

La presente invención, se refiere al uso de proteína de Parkin (Parkin), como ubiquitina-ligasa (E3). La forma de presentación o personificación del término "uso" de Parkin, como ubiquitina-ligasa (E3), no se encuentra particularmente limitada. Ésta indica el uso de Parkin para la diagnosis de la enfermedad de Parkinson, de una forma particular, el Parkinsonismo juvenil, o el uso de ésta, para investigar medicinas para la diagnosis, prevención y/o tratamiento de la enfermedad de Parkinson, particularmente, el Parkinsonismo juvenil.

La ubiquitina-ligasa (E3), es una enzima que interactúa directamente o indirectamente con una proteína diana, para transferir ubiquitina a una proteína diana. En algunos casos, se ha formado ya una cadena de ubiquitina, en la proteína diana. En tal caso, la ubiquitina-ligasa (E3), cataliza la reacción de transferencia de ubiquitina al interior de la cadena de ubiquitina ya formada. Una expresión "la ubiquitina se enlaza con (o se transfiere al interior de) una proteína diana", indica aquí el hecho de que, la ubiquitina, se transfiere a la cadena de ubiquitina de proteína diana ya ubiquitinada.

En algunos casos, es necesario el que, la ubiquitina-ligasa (E3), se enlace con la enzima de enlace de la ubiquitina (E2), para exhibir su efecto de ubiquitina de enlace, a la proteína diana.

La presente invención, se refiere también aun procedimiento de diagnóstico del Parkinsonismo juvenil. En el procedimiento de diagnosis, el procedimiento de la presente invención, se examina una variación la cual ejerce una influencia en la actividad de Parkin, para enlazar ubiquitina con la proteína diana, en neuronas y/o una variación que ejerce una influencia en la interacción de Parkin y la enzima de enlace de ubiquitina (E2).

Parkin, se reporta en Kitada T. et al. Nature 392, 605 - 608 (1998). "parkin", está compuesta de 12 exones y ésta codifica a 465 aminoácidos. "parkin", tiene un dominio semejante a la ubiquitina (aminoácidos Nos. 1 a 76) en el terminal N, y dominio RING1 (aminoácidos Nos. 238 a 293), dominios IBR (aminoácidos Nos. 314 a 377) y dominio RING2 (aminoácidos Nos. 418 a 449) en el terminal C. Se procedió a analizar las variaciones del gen de Parkin, de pacientes japoneses y turcos. Se está ahora aclarando el hecho de que, en los pacientes con Parkinsonismo juvenil, la frecuencia de supresión de un exón específico, es alta. El término "RING-box", aquí, indica una secuencia de aminoácidos números 239 a 449, y "alrededor de ella", indica de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 residuos aminoácidos, alrededor de la RING-box.

Se detecta, en la transferencia de Northern, el hecho de que, la mRNa de Parkin, generalmente, se expresa y, la expresión, en el cerebro, es particularmente alta. Tal y como se mostrará en los ejemplos que se facilitan abajo, a continuación, Parkin, tiene una actividad de ubiquitinación de una proteína diana, en células SH-SY5Y, dopaminérgicas, del neuroblastoma humano. La actividad de Parkin, para catalizar la reacción de enlace de la ubiquitina, se considera como siendo mantenida, por parte de ciertas células, incluyendo a las neuronas. Así, por lo tanto, se prefiere el uso de neuronas, tales como las células SH-SY5Y, dopaminérgicas, del neuroblastoma humano.

La variación que ejerce una influencia en la actividad de enlace de la ubiquitina, con una proteína diana, involucra una variación de, bien ya sea el decrecimiento, o bien ya sea el incremento de la actividad de enlace de ubiquitina con la proteína diana. Se considera, generalmente, el hecho de que, cuando el enlace de ubiquitina con la proteína diana, es reducido, la eficacia de la descomposición de la proteína diana, se reduce y, como resultado de ello, se provoca la acumulación de la proteína, si bien, la presente invención, no se encuentra limitada por esta teoría. Es posible, por lo tanto, el que, el Parkinsonismo juvenil, pueda diagnosticarse mediante la determinación de la reducción de la actividad de enlace de ubiquitina.

La variación de Parkin, la cual ejerce una influencia en la actividad de enlace de ubiquitina, con la proteína diana, viene causada mediante la variación o ausencia de una base, en uno o más dominios semejantes a la ubiquitina, dominio RING1, dominio IBR y dominio RING2 de Parkin. Tal tipo de variación, puede detectarse procediendo a detectar directamente la secuencia de bases de DNA, tomada de un paciente, o éstas puede detectarse fácilmente, mediante PCR, cuando debe encontrarse la presencia o la ausencia de una variación ya conocida.

El término "enzima de enlace de ubiquitina (E2)", aquí, indica una enzima, la cual recibe ubiquitina activada, procedente de E1, para formar un nuevo intermediario tioéster. La enzima es, de una forma preferente, UbcH7 ó UbcH8. Es particularmente preferible la UbcH7.

La UbcH7, es una proteína compuesta de 154 aminoácidos, y que tiene un peso molecular de 17861 DA (Ulrike Nubert et al., J. Biol. Chem, 271, 2795 - 2800, 1966). La UbctH8, es una proteína compuesta de 153 aminoácidos y que tiene un peso molecular de 17668 Da (Sushant Kumar et al., J. Biol. Chem. 272, 13548 - 13554, 1997).

En la ubiquitinación de P53 dependiente de E6, derivado de los virus del papiloma, del tipo 16 y del tipo 18, la E6-AP (100 kDa) que tiene hectodominio, funciona como una ligasa. Se ha reportado el hecho de que, las enzimas de enlace de ubiquitina (E2), en este caso, son las UbcH5, UbcH7 y UbcH8 (Sushant Kumar et al., J. Biol. Chem. 272, 13458 - 13554, 1997).

La homología de la UbctH7 y la UbctH8, es de aproximadamente un 46%.

En el procedimiento de diagnosis de la presente invención, se determina la actividad de Parkin para enlazar ubiquitina con una proteína diana, en neuronas y/o la interacción de Parkin y enzima de enlace de ubiquitina (E2).

El procedimiento para determinar la actividad de Parkin, para enlazar ubiquitina con la proteína diana, en neuronas, no se encuentra limitado. Así, por ejemplo, un vector de expresión que contenga parkin marcado con Myc, o por el estilo, y un vector de expresión de ubiquitina marcado con FLAG, o por el estilo, se transfieren simultáneamente al interior de neuronas, tales como células del tipo SH-SY5Y. Las células, se dividen en dos grupos. Las células, en un grupo, se tratan con un inhibidor de proteasoma, tal como el MG132. Un cierto período de tiempo después de la transfección, las células, se recuperan. Una proteína de enlace de ubiquitina, se detecta mediante la aplicación del procedimiento de inmunoblotting (inmuno-transferencia), en donde, se utiliza un anticuerpo (tal como un anticuerpo anti FLAG) a la substancia, usado para la ubiquitina de marcación, a un inmunoprecipitado preparado mediante la utilización de un anticuerpo (tal como un anticuerpo antiMyc), a una substancia usada para el Parkin de marcación. Cuando se detecta una proteína ubiquitinada de alto peso molecular, mediante este procedimiento, se sugiere el hecho de que, la proteína ubiquitinada de alto peso molecular, se ha descompuesto con proteasoma. Así, de este modo, puede examinarse la relación de Parkin con la proteólisis.

En el procedimiento de diagnosis de la presente invención, se examina la interacción entre Parkin y la enzima de enlace de ubiquitina (E2). La interacción, puede determinarse mediante cualquier procedimiento. Así, por ejemplo, puede transferirse un vector que contenga parkin marcado con Myc o por el estilo, al interior de una propia célula, conjuntamente con la que contiene un gen que codifica una enzima enlazada con ubiquitina, con FLAG, His, HA, o por el estilo. Un cierto período de tiempo después de la transfección, se prepara un extracto de células, y se realiza una inmunoprecipitación con un anticuerpo (tal como un anticuerpo antiMyc), contra el marcador utilizado para marcar Parkin. La interacción entre Parkin y enzima de enlace de ubiquitina (E2), puede detectarse mediante el inmunoblotting, con el inmunoprecipitado, y un anticuerpo, contra el marcador utilizado par marcar la enzima de enlace de ubiquitina.

La presente invención, proporciona, también, un procedimiento para investigar una medicina par el tratamiento y/o la prevención del Parkinsonismo juvenil. El procedimiento de investigación de la presente invención, comprende las siguientes etapas:

(1) una etapa consistente en proporcionar células que retengan un vector de expresión que contenga parkin procedente de un paciente con Parkinsonismo juvenil,

(2) una etapa consistente en poner las células en contacto con un compuesto candidato, y

(3) una etapa consistente en determinar la actividad de Parkin, con objeto de enlazar ubiquitina con una proteína diana y/o la interacción de Parkin y una enzima de enlace de ubiquitina (E2).

Los vectores de expresión utilizados en la presente invención, son vectores capaces de expresar genes de inserción, preferiblemente, con células de animales, de una forma particularmente preferible, con neuronas de humanos. Los vectores de expresión son, de una forma preferible, aquéllos que son capaces de una replicación de autónomos, en células huésped, o que son capaces de integrarse en cromosomas y que contienen un promotor en una posición, en la cual, el gen insertado, puede transcribirse. Los tipos de vectores de expresión, no se encuentran particularmente limitados y, por ejemplo, son utilizables el vector pcDNA3.1(+)(Invitrogen), el vector p-Tet-On (Clontech), el Vector de Expresión, de mamíferos, pSI (Promega), y el vector de expresión pSVK3 (Amersham Pharmacia Biotech).

Los tipos de células utilizables en la presente invención, no se encuentran particularmente limitados, siempre y cuando que, Parkin, pueda exhibir su función, como una ubiquitina-ligasa, en la trayectoria de la ubiquitina. Las células, no obstante, son de una forma preferible células de animales, particularmente, neuronas y, de una forma más particular, neuronas tales como las del neuroblastoma dopaminérgico humano.

Cuando un compuesto candidato mejora la actividad de Parkin, para enlazar ubiquitina con una proteína diana, o éste mejora la interacción entre Parkin y la enzima de enlace de ubiquitina (E2), el compuesto candidato, puede seleccionarse como un candidato para una medicina para tratar y/o prevenir el Parkinsonismo juvenil. La medicina de esta forma seleccionada, puede someterse a tests de ensayo subsiguientes, para confirmar el efecto medicinal de ésta.

Los tipos de compuestos candidatos, no se encuentran particularmente limitados y, éstos, incluyen, por ejemplo, a las citocinas, las medicinas de bajo peso molecular, las hormonas, los anticuerpos específicos, imitaciones peptídicas, oligonucleótidos antisentido, y otras medicinas capaces de alterar las funciones de células o la expresión de proteínas.

Los ejemplos que se facilitan a continuación, ilustrarán adicionalmente la presente invención, los cuales, en modo alguno, limitan la invención.

Ejemplo Operación del experimento (1) Plásmido de transfección

Para preparar vectores de PcDNA3-1(+)Myc y pcDNA3.1(+)FLAG, se procedió a ligar epítopes de DNA que codifican N-terminal Myc y FLAG, al dominio KpnI/BamHI de pcDNA3-1(+) (Invitrogen). Después de la amplificación parkin de tipo salvaje o variante N-terminal-deficiente, Ubc2(HHR6B), UbcH8 y cDNA de ubiquitina, con un cebador apropiado, éstos se enlazaron en dominio BamHI del vector. La variante C-terminal-deficiente, y variante de sentido fallido de parkin, se prepararon mediante la introducción de una variación en pcDNA3.1(+)Myc-Parkin, procediendo a utilizar un equipo a modo de "kit" (Stratagene) de inducción de variación específica de dominio Quik Change, en concordancia con un manual. La CAGGS-Ubc3, ha sido ya reportada [Iwai K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 12436 - 12441 (1999)].

Se procedió a preparar pCGN-Ubc4 y otros pcDNA3.1(+)FLAG-Ubc, procedentes de una biblioteca de cDNA de hígado humano, mediante un procedimiento ordinario. La Ubc utilizada, se obtuvo de seres humanos, en todos los casos. Se procedió a cultivar células 293 (HEK293) de riñones fetales humanos, y células SH-SY5Y del neuroblastoma dopaminérgico humano, en DMEM, que contenía un 10% de suero bovino fetal, 10 \mug/ml de estreptomicina y 100 U/ml de penicilina.

La transfección, se llevó a cabo utilizando reactivo de transfección FuGENE6, en concordancia con el manual del productor (Boehringer-Mannheim). Las células, se trataron con MG132 (Cbz-Leu-Leu-Leu-aldehyde) (Peptide Institute, Inc., Osaka, Japón) que tenía una concentración final de 50 \muM.

(1) Análisis inmunológico

La inmunoprecipitación, se realizó con anticuerpos policlonales antiMyc del conejo (A-14)(Santa Cruz Biotechnology), tal y como se ha reportado previamente (Suzuki H. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 256, 127 - 132 (1999). El inmunoblotting (inmunotransferencia), se realizó con anticuerpo monoclonal del ratón, anti-FLAG(M2) enlazado con biotina (SIGMA), anticuerpo monoclonal del ratón, antiMyc, (9E10) (Santa Cruz Biotechnology), anticuerpo monoclonal del ratón, antiHA, (HA.11) (Bekerley Antibody Company), o anticuerpo monoclonal del ratón, antiHis, (RGS.His)(QIAGEN). Se procedió a utilizar un complejo de estreptoavidina/peroxidasa del rábano picante (Amersham Pharmacia Biotech), para detectar anticuerpo antiFLAG(M2) enlazado con biotina.

Ejemplo 1 Interacción entre Parkin y enzima E2

Se procedió a realizar el siguiente test de ensayo con objeto de averiguar si Parkin concierne, o no, a la trayectoria de la ubiquitina. Con objeto de averiguar si acontece, o no, la interacción entre Parkin y cada una de las varias enzimas E2, se procedió a expresar parkin marcada con Myc, conjuntamente con varias enzimas E2 marcadas con FLAG, HA ó His, en diferentes dominios, en células HEK293, y se detectó la interacción entre éstas, mediante inmunoprecipitación. Los resultados, se muestran en la figura 1.

Concretamente, se procedió a transferir pcDNA3.1(+)Myc-Parkin (10 \mug) en células HEK293, simultáneamente con varios vectores de expresión que codificaban FLAG-, His-, ó HA-Ubc, en una cantidad mostrada entre paréntesis, en la figura 1. 48 horas después de la transfección, se prepararon los extractos de células, y se realizó la inmunoprecipitacion (IP), con anticuerpo antiMyc. Los extractos de células (panel superior en la figura 1) y los inmunoprecipitados (paneles medio e inferior, en la figura 1), se analizaron mediante el inmunoblotting (inmunotransferencia), con varios anticuerpos, tal y como se muestra en la figura 1. Si bien la asociación de Parkin y UbcH8 no se detectó, bajo las condiciones ordinarias, ésta se detectó cuando se expresó una mayor cantidad de UbcH8 y, las películas de inmunoblotting, se expusieron, durante un prolongado período de tiempo, para la reacción ECL (referencia a la línea #). El símbolo (*), indica una banda no específica, incluyendo la cadena ligera IgG.

Tal y como se muestra en la figura 1, las UbcH7 y UbcH8, inmunoprecipitaron conjuntamente con Parkin (la inumunoprecipitación de UbcH8, era débil). No obstante, no se encontró ningún enlace detectable en otras enzimas E2 sometidas a test de ensayo (tales como Ubc2, Ubc3, Ubc4, UbcH5A-C y UbcH6).

Ejemplo 2

Se procedió a analizar la estructura del dominio de Parkin, el cual pueda interactuar con UbcH7. Parkin, tiene 3 dominios, a saber, el dominio semejante a la ubiquitina en N-terminal, el dominio RING-box en C-terminal y el dominio enlazante, el cual enlaza estos dos segmentos. Se conoce el hecho de que, el dominio RING-box en C-terminal, está compuesto de RING1, RING2 e IBR (RING entremedio - IBR, del inglés, in-between-RING -))[Morett E. et al., Trends Biochem. Sci. 24, 229 - 231 (1999)], tal y como se muestra en la figura 2a. La figura 2a, es una vista esquemática, la cual muestra las estructuras de variantes artificiales y naturales de Parkin, utilizadas en el ejemplo 2. El aminoácido, se representa mediante una notación consistente en letras, en la figura 2a. El isómero sin sentido y el isómero de sentido fallido de Parkin, encontrado en pacientes con Parkinsonismo juvenil (AR-JP), se muestran como Parkin^{Q311stop} y Parkin^{T240R}/Parkin^{R42P}. Parkin^{Q311stop}, es una variante formada mediante el reemplazo de glutamina Nº 211 con codón de paro (stop), y Parkin^{T240R}/Parkin^{R42P}, es una variante formada mediante el reemplazo de la treonina Nº 240, con arginina, y la arginina Nº 42 con prolina.

Se procedió a analizar la interacción entre la variante de Parkin y UbcH7, mediante la utilización de variante de Parkin, de la misma forma que en el ejemplo 1, excepto en cuanto a lo referente al hecho de que, la cantidad (\mug), de cada variante de Parkin, era según se muestra, entre paréntesis, en la figura 2b, y que se utilizó pcDNA3.1(+)FLAG-UbcH7 (7 \mug). En el inmunoblotting (inmunotransferencia), en donde se utilizó anticuerpo antiFLAG, se utilizó el extracto crudo (panel superior en la figura 2b). En el inmunoblotting, en donde se utilizó anticuerpo antiMyc (panel medio, en la figura 2b), o anticuerpo antiFLAG (panel inferior en la figura 2b), se utilizó el inmunoprecipitado obtenido con anticuerpo antiMyc. El símbolo (*), muestra la cadena pesada y la cadena ligera de IgG.

Se sobreentiende, a raíz de los resultados mostrados en la figura 2b, el hecho de que, la supresión de domino semejante a la ubiquitina, y el dominio del enlazante, no ejercía ninguna influencia en el enlace con UbcH7 y que fue suficiente únicamente la mitad de C-terminal que tuviera RING-box, para el complemento con UbcH7. Por el contrario, la variante de RING-box que carecía de dominio RING1 ó RING2, no pudo enlazarse con UbcH7. En los tests de ensayo de dos variantes de sentido fallido de pacientes con Parkinsonismo juvenil (AR-JP), Parkin^{R42P}, la cual era un dominio semejante a la ubiquitina, pudo enlazarse con UbcH7, mientras que, Parkin^{T240R}, en la cual, Thr, se cambió por Arg [Hattori N. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 249, 754 - 758 (1998)], no interactuó con UbcH7, en el dominio RING1. A raíz de estos resultados, se encontró que era necesario el dominio de RING-box (no otros dominios tales como el dominio del enlazante o el dominio semejante a la ubiquitina), para la asociación con UbcH7, la cual es una enzima de enlace de ubiquitina.

Ejemplo 3

Se procedió a realizar tests de ensayo, con objeto de averiguar si Parkin podía capturar una proteína diana, para ubiquitinarla, tal y como se ha reportado para E3 u otras clases, de tal forma que puedan elucidarse los roles interpretativos de Parkin en la trayectoria de la ubiquitina [ZacHAriae W. et al., Genes & Dev. 13, 2039 - 2058 (1999); Xie Y, et al., EMBO J. 18, 6832 - 6844 (1999); Joazeiro, C.A.P. et al., Science 286, 309 - 312 (1999); y Lorick, K. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 11364 - 11369 (1999)].

En primer lugar, se procedió a transferir, de una forma simultánea, 10 \mug de pcDNA3.1(+)Myc-parkin y 10 \mug de vector de ubiquitina pcDNA3.1(+)FLAG, al interior de células SH-SY5Y. 48 horas después de la transfección, se procedió a recuperar todas las células. En uno de los experimentos, las células, se trataron con MG132 (50 \muM), 3, 8 ó 24 horas antes de la recuperación de las células. Se utilizó un inmunoprecipitado preparado con anticuerpo antiMyc, para el inmunoblotting con anticuerpo con anticuerpo antiFLAG (panel superior, en la figura 3), y anticuerpo antiMyc (panel inferior, en la figura 3). En la figura 3, un símbolo (*), representa la posición de Parkin. Una proteína ubiquitinada de alto peso molecular, se muestra como (Ub)n, en el lado derecho.

Tal y como se entenderá, a raíz de los resultados mostrados en la figura 3, cuando se procedió a expresar simultáneamente Myc-parkin y FLAG-ubiquitina, con células SH-SY5Y dopaminérgicas del neroblastoma humano, se detectaron bandas ubiquitinadas que incluían proteínas ubiquitinadas de alto peso molecular, con inmunoprecipitados de antiMyc, procedentes de un extracto de células que se había tratado con inhibidor de proteasoma MG132 (Cbz-Leu-Leu-Leu-aldehído)[Rock K. L. et al., Cell 78, 761 - 771 (1994)]. Por otro lado, cuando el tratamiento no se realizó con un inhibidor, no se encontró ninguna banda ubiquitinada. La asociación de proteína ubiquitinada marcada con Parkin, procedió en dependencia del tiempo después del tratamiento de MG132. Algunas de las proteínas ubiquitinadas, eran más pequeñas que Parkin. Estos resultados, indican el hecho de que, Parkin, puede capturar las proteínas celulares para la ubiquitinación y que, ésta, puede funcionar como proteína ligasa de ubiquitina.

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En algunos de los análisis, tal y como se describen arriba, pero en donde se utilizó extracto de células de riñones fetales HEK293, no se observó ninguna banda ubiquitinada enlazada con Parkin (no se muestran datos). Estos resultados, sugieren el hecho de que, la proteína de Parkin, carecía de células HEK293, o que otro factor indispensable el cual ejerciera una influencia en el enlace de Parkin con la proteína diana ó en la actividad de E3 de Parkin, carece de células HEK293, y que, la proteína de inhibición de ubiquitinación, está contenida en las células
HEK293.

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Ejemplo 4

Se trató de elucidar la relación funcional entre el enlace de Parkin y E2, en neuronas SH-SY5Y, y la actividad de ubiquitinación.

Las condiciones experimentales, eran las mismas que las del ejemplo 3. Se procedió a utilizar los vectores de expresión, de varias variantes Myc-Parkin, en una cantidad (\mug), proporcionada entre paréntesis, en la figura 4. Antes de recuperar las células, éstas se trataron con MG132 (50 \mum), durante un transcurso de tiempo de 24 horas. 48 horas después de la transfección, se procedió a utilizar el inmunoprecipitado preparado con anticuerpo antiMyc, para el inmunoblotting con anticuerpo antiFLAG (panel superior, en la figura 4), y anticuerpo antiMyc (panel inferior, en la figura 4). Los detalles de la variante de Parkin, se muestran en la figura 2a. En la figura 4, un símbolo (*), representa las bandas de cadena pesada y de cadena ligera, de IgG, como en la figura 2b. La banda de cadena pesada de IgG, se solapa con las posiciones de Parkin salvaje y de Parkin variada de sentido fallido.

Tal y como se muestra en la figura 4, cuando acontece una variación consistente en una ausencia o en un sentido fallido, en RING-box, la cual convierte en imposible la toma o absorción de UbcH7, no se detectó una banda de la proteína ubiquitinada asociada con Parkin, bajo las mismas condiciones de tratamiento con MG132. Estos resultados, indican el hecho de que, la toma o absorción de UbcH7, es indispensable para la función de Parkin. Las variantes de Parkin que carecen de dominio semejante a la ubiquitina y Parkin^{R42P} variada, tomadas de un paciente, perdieron substancialmente, de una forma completa, la asociación con la proteína ubiquitinada (figura 4). No obstante, debido al hecho de que, estas Parkin variadas, pudieron enlazarse con UbcH7 (figura 2b), se sugirió el hecho, el dominio de ubiquitina-ligasa, es indispensable para el reconocimiento de la diana. Estos resultados, sugieren el hecho de que, la pérdida de la actividad de ubiquitinación de Parkin, es una causa del AR-JP.

Discusión de los ejemplos

Se sugirió el hecho de que, Parkin, concierne al síndrome de Parkinson juvenil, el cual causa la degeneración nerviosa de la substancia negra [Kitada T. et al., Nature 392, 605 - 608 (1998); y Mizuno Y. et al., J. Neurochem. 71, 893 - 902 (1998). Los resultados de los ejemplos 1 a 4, sugieren que, Parkin, funciona como una ligasa (enzima E3), para enlazar ubiquitina, con una proteína diana, con UbcH7 (enzima E2), y que ésta cataliza la ubiquitinación de la proteína diana. La figura 5, es una vista esquemática que muestra el mecanismo. Parkin, se compone de dos dominios funcionalmente diferentes, a saber, (1) RING-box C-terminal, para capturar UbcH7, la cual es una enzima E2 específica y, (2) dominio semejante a la ubiquitina N-terminal, necesario para el reconocimiento de la proteína diana, para la ubiquitinación. Muchos pacientes aquejados de AR-JP, tienen una deficiencia de variación de Parkin y, algunos de los pacientes, tienen variación de sentido fallido en el dominio RING-box ó en el dominio semejante a la ubiquitina [Hattori N. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 249, 754 - 758 (1998); y Hattori N. et al. Ann. Neurol. 44, 939 - 941, (1998)]. En nuestros tests de ensayo, todas las construcciones de Parkin que tienen una variación en este dominio, o que carecen de este dominio, carecían de actividad E3. Este hecho, indica que, la trayectoria de la ubiquitina, mediatizada por Parkin, juega un rol interpretativo importante, en mantener la homeóstasis de neuronas, en la substancia negra, procediendo a controlar la cantidad de
proteína.

No obstante, el mecanismo consistente en el hecho de que la disfunción de Parkin induce una alta mortalidad selectiva de las neuronas, es todavía desconocido. Se encontró, en experimentos en concordancia con la presente invención, que la proteína ubiquitinada, no se inmunoprecipita en células HEK293 de los riñones fetales, mientras que, ésta, se inmunoprecipita conjuntamente con Parkin, en células SH-SY5Y. Este descubrimiento, sugiere el hecho de que, Parkin, participa selectivamente en la proteólisis, en neuronas. Cuando Parkin se considera como siendo ubiquitina-ligasa, puede encontrarse presente un factor indispensable para el reconocimiento del substrato, con una proteína diana (mostrada como "X", en la figura 5) y/o Perkin, en únicamente neuronas dopaminérgicas. Posiblemente, una acumulación anormal de "X", en las células de substancia negra, de pacientes con AR-JP, induce una muerte específica de las neuronas. Este fenómeno, puede explicarse, probablemente, mediante el descubrimiento de que, Parkin, concierne a la ubiquitinación y, ésta, puede actuar como proteína-ligasa.

Las evidencias que prueban el hecho de que, la acumulación de proteína ubiquitinada, se observa a menudo, en varias enfermedades degenerativas nerviosas, se incrementan cada vez más y más [Lowe J. et al, Brain Pathol. 3, 55 - 65 (1993); y Mayer R. et al. (1998)], En "Ubiquitin and the Biology of the Cell", - Ubiquitina y la biología de la célula -, páginas 429 - 462, Plenum Press, New York. Estos descubrimientos, indican el hecho de que, el control en la cantidad de proteína, intermediado mediante la trayectoria de ubiquitina/proteasoma, juega un importante rol interpretativo, en muchas neuronas no divisorias.

Antes de la presente invención, se desconocía el hecho de que, la variación de parkin, en pacientes con AR-JP, está relaciona con la anormalidad de la ubiquitinación.

La función de parkin, se ha elucidado parcialmente, y se ha proporcionado un nuevo procedimiento de diagnosis para el Parkinsonismo juvenil, mediante la presente invención. También, el desarrollo de un sistema de investigación para nuevas medicinas, susceptibles de poder ser utilizadas para la prevención y/o tratamiento de enfermedades de Parkinson, ha sido posible, mediante la presente invención.

Claims (7)

1. El uso de proteína de Parkin (Parkin), como una ubiquitina-ligasa (E3).

2. El uso, según la reivindicación 1, en donde, la ubiquitina-ligasa, es una enzima que tiene una actividad de enlace con una enzima de enlace de ubiquitina (E2), para enlazar ubiquitina con una proteína diana.

3. Un procedimiento in vitro, de diagnosis de Parkinsonismo Juvenil, el cual comprende el determinar la actividad de enlazar ubiquitina con una proteína diana, en neuronas, en proteína de Parkin (Parkin) del paciente.

4. Un procedimiento in vitro, de diagnosis de Parkinsonismo Juvenil, el cual comprende el determinar la interacción entre proteína de Parkin (Parkin) del paciente, con enzima de enlace de ubiquitina (E2).

5. El procedimiento in vitro, según la reivindicación 4, en donde, la enzima de enlace de ubiquitina (E2), es UbcH7 ó UbcH8.

6. Un procedimiento para la investigación de medicinas, para tratar y/o prevenir el Parkinsonismo juvenil, el cual comprende:

(1) una etapa consistente en proporcionar células que tengan un vector de expresión que contiene el gen de Parkin (Parkin), procedente de un paciente afectado de Parkinsonismo juvenil.

(2) una etapa consistente en poner las células en contacto con un compuesto candidato y,

(3) una etapa consistente en determinar la actividad de proteína de Parkin (Parkin), con objeto de enlazar ubiquitina con una proteína diana y/o la interacción de proteína de Parkin (Parkin) y una enzima de enlace de ubiquitina (E2).

7. El procedimiento de investigación, según la reivindicación 6, en donde, las células, son aquéllas derivadas de nervios.