DE60125232T2 - Kleines säurelösliches sporenprotein und seine verwendungen - Google Patents

Kleines säurelösliches sporenprotein und seine verwendungen Download PDF

Info

Publication number
DE60125232T2
DE60125232T2 DE60125232T DE60125232T DE60125232T2 DE 60125232 T2 DE60125232 T2 DE 60125232T2 DE 60125232 T DE60125232 T DE 60125232T DE 60125232 T DE60125232 T DE 60125232T DE 60125232 T2 DE60125232 T2 DE 60125232T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
bacteriophage
sspc
lambda
dna
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE60125232T
Other languages
English (en)
Other versions
DE60125232D1 (de
Inventor
Marie Heather Histon FAIRHEAD
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Phico Therapeutics Ltd
Original Assignee
Phico Therapeutics Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Phico Therapeutics Ltd filed Critical Phico Therapeutics Ltd
Application granted granted Critical
Publication of DE60125232D1 publication Critical patent/DE60125232D1/de
Publication of DE60125232T2 publication Critical patent/DE60125232T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft Polypeptide, Polynukleotide und Zusammensetzungen davon zur Verwendung als Arzneimittel, insbesondere um Zellvermehrung, wie die Vermehrung von Bakterienzellen, zu hemmen oder zu verhindern.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Sporenbildende Bakterien bilden eine relativ kleine Klasse von Bakterien, die in der Lage sind, Endosporen zu bilden. Endosporen sind ruhende nicht-reproduktive Überlebensformen der Bakterien, die gegen unwirtliche Umgebungen, wie hohe Temperaturen, schädliche chemische Mittel und Schädigung aufgrund von UV-Licht resistent sind. Diese sporenbildenden Bakterien umfassen Bacillus-, Clostridia- und Sporosarcina-Spezies wie auch einen Stamm von Thermoactinomyces und andere weniger häufige Spezies von Sporolactobacillus und Oscillospira. Während eines Sporulationsprozesses wird eine Klasse von Proteinen, die als kleine säurelösliche Sporenproteine („small acid-soluble spore proteins"; SASP) bekannt sind, produziert. SASP sind säurelöslich und haben niedrige Molekulargewichte zwischen 5 und 11 kDa. Es wird berichtet, dass SASP zwei hauptsächliche Rollen innerhalb von bakteriellen Sporen zukommen: als erstes sind sie wirksam, um die Sporen-DNA vor Schädigungen aufgrund von UV, Wärme, Depurinierung und vielen potentiell schädlichen chemischen Mitteln zu schützen, und zweitens stellen SASP nach der Sporenkeimung eine Quelle von freien Aminosäuren bereit, ohne die die neuerlich vegetativen Zellen nicht auswachsen können.
  • In Bacillus-Spezies gibt es drei Arten von SASP, die als α-, β- und γ-Typ-SASP bekannt sind. Die Aminosäuresequenzen von α/β-Typ-SASP sind sowohl innerhalb von als auch zwischen Spezies hochgradig konserviert (~70% Identität und ~80% Ähnlichkeit, ohne Lücken für Bacillus-Spezies). Diese Proteine zeigen jedoch keine Sequenzähnlichkeit zu einer jeglichen anderen Proteinfamilie und enthalten keinerlei Motive, die für andere DNA-bindende Proteine charakteristisch sind (Setlow, 1988). Die α/β-Typ-SASP sind bezogen auf die Immunogenität eng verwandt, haben Molekulargewichte von ungefähr 6,2–7,6 kDa und weisen einen signifikanten Prozentsatz von hydrophoben Aminosäuren (bis zu 30%) auf (Setlow, 1988). Die γ-Typ-SASP haben ein Molekulargewicht von 8–11 kDa, haben einen extrem geringen Gehalt an großen hydrophoben Aminosäuren (< 11%) und weisen höhere isoelektrische Punkte als die α/β-Typ-SASP aus der gleichen Spezies auf (Setlow, 1988). In einem jeglichen gegebenen Organismus gibt es zwei hauptsächliche SASP des α/β-Typs wie auch viele in geringerer Menge vorkommende α/β-Typ-SASP, die jeweils durch ein einmalig vorkommendes Gen kodiert werden (Setlow, 1988). Im Gegensatz dazu haben alle Organismen, die untersucht worden sind, nur ein γ-Typ-SASP und dessen Funktion unterscheidet sich recht deutlich von den α/β-Typ- SASP, die primär verwendet werden, um Aminosäuren für die Keimung bereitzustellen (Hackett und Setlow, 1987). Eine Liste von allen α/β-Typ-SASP, die bislang sequenziert worden sind, ist in Anhang 1 zusammen mit den jeweils zugehörigen Proteinsequenzen angegeben. Das Ausmaß an konservierten Aminosäureresten zwischen diesen Proteinsequenzen ist in Anhang 2 gezeigt.
  • Verschiedene Untersuchungen an SASP haben sich auf die Charakterisierung der Art und Weise, auf welche die α/β-Typ-SASP DNA vor einer UV-Schädigung schützen, konzentriert. In einer Untersuchung (Setlow et al., 1991) wurde ein Gen (sspC), welches ein α/β-Typ-SASP kodiert, in ein Plasmid unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors inseriert, um zu zeigen, dass SASP bewirken, dass DNA einer vegetativen Zelle sporenartige Merkmale annimmt. Es wurde beobachtet, dass das Binden von α/β-Typ-SASP an E. coli-DNA eine Zunahme an negativer superhelikaler Dichte bei dem Plasmid bewirkte, was eine begleitende Veränderung in der DNA-Struktur nahe legt. Es wird postuliert, dass eine Veränderung der DNA-Konformation von B-artig zu A-artig die DNA gegen UV-Licht schützt.
  • Auf dem Gebiet der Medizin ist die Regulation der Zellvermehrung von fundamentaler Bedeutung. Innerhalb des Körpers unterliegt die Zellvermehrung einer strengen Kontrolle; dies umfasst sowohl die Zellen, die die Gewebe und Organe des Körpers umfassen, wie auch kommensale Bakterienzellen, wie die Haut- und Darmflora. Unkontrollierte Vermehrung von Mikroorganismen, wie Bakterien oder Pilzen, kann für einen Patienten problematisch oder lebensbedrohend sein. Eine übliche Behandlung für insbesondere bakterielle Infektionen umfasst die Verwendung von herkömmlichen Antibiotika, die ein breites Aktivitätsspektrum haben können (wie Penicilin), die üblicherweise wirken, indem bakterielle Zellwände das Ziel der Aktivität darstellen. Andere Klassen von Antibiotika wirken, indem die Proteinsynthese in der Bakterienzelle gehemmt wird, obwohl viele von diesen auch verschiedene Niveaus von Toxizität für menschliche und andere tierische Zellen zeigen. Bakterien können leicht gegen herkömmliche Antibiotika resistent werden und es treten jetzt „superresistente" Stämme auf. Es gibt dementsprechend einen eindeutigen Bedarf an Alternativen für gegenwärtig verfügbare Antibiotika.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Unter einem ersten Aspekt stellt die Erfindung ein Polypeptid mit α/β-Typ-SASP-Aktivität für eine Verwendung als Arzneimittel bereit.
  • Es ist überraschenderweise festgestellt worden, dass das Polypeptid der Erfindung als ein Arzneimittel verwendet werden kann, insbesondere um unerwünschte Zellvermehrung, wie Zellvermehrung, die für ein Individuum pathogen ist, zu hemmen oder zu verhindern. Eine solche Zellvermehrung umfasst Vermehrung durch Bakterienzellen und einige eukaryotische Zellen, wie Pilzzellen.
  • Ein erfindungsgemäßes Polypeptid kann ein jegliches Peptid, Oligopeptid, Protein umfassen und kann in monomerer oder multimerer Form mit oder ohne kovalente Modifizierung, wie posttranslationale Modifizierung, einschließlich Glycosylierung, existieren. Typische erfindungsgemäße Polypeptide umfassen die Aminosäuresequenz:
    mannnssnsnellvpgaeqaidqmkyeiasefgvnlgadttarangsvggeitkrlvqlaeqqlgggtk (SEQ ID NO: 1).
    Das Polypeptid umfasst vorzugsweise eine beliebige der in Anhang 1 gezeigten Aminosäuresequenzen, wie jene, die durch das sspC-Gen aus Bacillus subtilis, wie in Anhang 3 gezeigt, kodiert wird. Jegliche von diesen Polypeptiden können Mutationen und/oder Deletionen, wie jene, die durch zufällige Mutagenese oder durch ortsgerichtete Mutagenese erzeugt werden, enthalten, die die α/β-Typ-SASP-Aktivität davon nicht wesentlich reduzieren. Trotz des hohen Ausmaßes an Sequenzkonservierung zwischen natürlichen SASP-Proteinen existieren signifikante Unterschiede bei den DNA-Affinitäten (Setlow et al., 1992). Es besteht das Potential, SASP-Proteinsequenzen maßzuschneidern, um die Affinität des Proteins für Ziel-DNA zu erhöhen. Auf dieser Grundlage könnte es möglich sein, die natürliche Variation bei SASP auszunutzen oder SASP gentechnologisch zu modifizieren, um das zielgerichtete Ansteuern von verschiedenen Bakterienspezies und/oder gewünschten Genen innerhalb eines jeglichen gegebenen Organismus zu optimieren.
  • Allgemein kann α/β-Typ-SASP-Aktivität gemessen werden, indem die Wirkung des Polypeptids auf die DNA-Konformation ausgewertet wird. α/β-Typ-SASP-Aktivität kann dementsprechend definiert werden als die Fähigkeit, DNA von einer B-artigen Konformation zu einer A-artigen Konformation umzuwandeln. Dies kann durch eine jegliche der folgenden Techniken gemessen werden.
    • (a) Eine Referenz für das Beschreiben der Konformationsveränderung von B- zu A-artig ist Mohr et al., 1991. Veränderung in Zirkulardichroismus-Spektren sind seit langem als empfindliche Kriterien für DNA-Konformationen angesehen worden und Unterschiede zwischen den Sekundärstruktur-Hauptfamilien sind unzweideutig (Mohr et al., 1991). Eine Wechselwirkung von sowohl eukaryotischer (Kalbsthymus) DNA als auch prokaryotischen DNAs mit α/β-Typ-SASP (insbesondere Experimente unter Verwendung von SspC aus B. subtilis) induziert spektroskopische Merkmale, die für A-DNA charakteristisch sind. Fourier-Transform-Infrarot (FTIR)-Spektroskopie bietet ein unabhängiges Mittel für die Auswertung des Konformationszustands von mit α/β-Typ-SASP komplexierter DNA. Die FTIR-Spektren von konzentrierten Lösungen von Kalbsthymus-DNA zeigen eine hauptsächliche Absorptionsbande bei 1225 cm–1, die aus der antisymmetrischen O-P-O-Phosphat-Streckschwingung resultiert (Mohr et al., 1991). Diese Bande verschiebt sich bei SspC-Kalbsthymus zu 1246 cm–1. Ein solches Verhalten ist charakteristisch für einen B- zu A-Übergang, obwohl angemerkt werden sollte, dass Hydratisierungseffekte allein die Position dieser O-P-O-Streckungs-Bande ebenfalls beeinflussen können. Dementsprechend kann ein zusätzlicher Hinweis auf einen B- zu A-Übergang verwendet werden, welcher das Auftreten einer Absorptionsbande bei 1185 cm–1 in dem FTIR-Spektrum des SASP-DNA-Komplexes (in einem 1:1-Verhältnis) umfasst. Diese ist ein spezifischer Marker für die A-Konformation von DNA, da weder die B- noch die C-Form von DNA eine Infrarot-Bande bei 1185 cm–1 produziert (Phole und Fritzsche, 1980). Hydratisierungseffekte beeinflussen oder beeinträchtigen die Analyse der 1185 cm–1-Bande nicht. FTIR-Ergebnisse zeigen, dass, obwohl eine Dehydratisierung bewirken kann, dass DNA ihre Konformation von B- zu A-artig ändert, SASP diese Konformationsänderung fördern, so dass sie bei signifikant geringerer Verringerung der Feuchtigkeit, als sie für den Prozess mit DNA allein erforderlich ist, vollständig abläuft (Mohr et al., 1991).
    • (b) Auch werden an DNA gebundene SASP DNA vor einem Abbau durch DNase schützen (Setlow et al., 1992). Es sind zwei Assays möglich, um zu zeigen, dass ein an DNA gebundenes SASP in vitro eine Nukleinsäure vor einem Nukleaseverdau schützt. Der erste, ein elektrophoretischer Assay, ist der geradlinigste. Kurz zusammengefasst, wird Nukleinsäure (welche pUC19 und pUB110 umfasst) mit verschiedenen Mengen von SASP 1 h bei 37°C inkubiert. An dieser Stelle wird DNase I (oder S. aureus-Nuklease) zugegeben und die Inkubation weitere 15 min ausgeführt, bevor SDS/EDTA, gefolgt von NaCl und Ethanol, zugegeben werden, um die DNA auszufällen. Die ausgefällte DNA wird durch Agarose- (2%) (für Polynukleotide) oder Acrylamid (Oligonukleotide)-Gelelektrophorese analysiert. Ein Schutz von sowohl pUC19 als auch pUB110 ist bei einem SASP:DNA-Verhältnis von 1:1 augenscheinlich und ist bei einem Verhältnis von 4:1 maximal. Eine Analyse des DNase-Schutzes für vier andere α/β-Typ-SASP zeigt an, dass diese Proteine diesem Plasmid ebenfalls DNase-Resistenz verleihen. SASP-I aus Bacillus cereus und SASP-A zeigen ähnliche Muster von geschützten Banden, wohingegen SASP-α und -β aus Clostridia bifermentans unterschiedliche Muster ergeben (Setlow et al., 1992). Der zweite Assay ist ein Säurepräzipitationsassay.
    • (c) An DNA gebundenes SASP schützt die DNA gegen eine Spaltung durch Restriktionsenzyme, insbesondere jene mit einer Spezifität für GC-reiche Sequenzen (Setlow et al., 1992). Restriktionsenzymverdaue von pUC19-DNA, an welche SspC gebunden ist (8:1-Verhältnis von SspC zu DNA) wurden ausgeführt und Verdaue durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Für an AT-Sequenzen reiche Enzyme, d.h. DarI (TTTAAA), betrug die Hemmung < 10%. Zunehmende Ausmaße an GC-Gehalt in der Restriktionsenzymerkennungsstelle führten zu einem erhöhten Schutz durch SASP bei jenen Enzymen, die GC-reiche Sequenzen erkennen (d.h. KpnI GGTACC), welche zu > 75% gehemmt werden.
    • (d) Auch erhöhen SASP die negative superhelikale Dichte von Plasmiden in Gegenwart von Topoisomerase I. Das Verfahren zum Bestimmen dieser Wirkung wird in Nicholson et al., 1990b, angegeben. Zusammengefasst, werden 1 μg-Proben von Plasmid (pUC19 oder pUB110) über Nacht in einer ein Volumen von 20 μl umfassenden Reaktionsmischung bei 4°C mit unterschiedlichen Mengen von SspC inkubiert, gefolgt von der Zugabe von Topoisomerase I und weiterer Inkubation für 2 h bei 37°C. Nach Deproteinisierung (Protein-Entfernung) werden Proben durch Elektrophorese auf Agarosegelen, welche Chloroquin (2 μg pro ml) enthalten, analysiert. Der Durchschnittswert von negativen Supertwists kann bestimmt werden, indem die Lage der Banden auf dem Agarosegel verglichen wird mit einem Satz von Standards, welche durch Inkubieren von Plasmid-DNA mit Topoisomerase in Gegenwart von unterschiedlichen Mengen Ethidiumbromid hergestellt wurden (Nicholas und Setlow, 1990). Maximale SspC-Bindung führt zur Einführung einer großen Anzahl von negativen Supertwists in beide Plasmide. Bei 12 μg SspC, die zu der Plasmid-DNA zugesetzt werden, werden ungefähr 18 bzw. 38 Supercoils in pUC19 bzw. pUB110 eingeführt. Da pUC19 ungefähr 60% der Größe von pUB110 aufweist, ist die superhelikale Dichte, die in beiden Plasmiden durch SspC-Bindung induziert worden ist, ähnlich. Es ist anzumerken, dass die Bindung des Proteins HU an DNA, welche in DNA keine B-zu-A-Konformationsänderung induziert, nur ~40% der Anzahl von negativen Supertwists pro DNA-Einheit, wie sie SspC induziert, induziert (Nicholson et al., 1990).
    • (e) Auch schützt an DNA gebundenes SASP gegen die Bildung von Thymin-Dimeren vom Cyclobutan-Typ bei UV-Bestrahlung, fördert aber die Bildung von Sporen-Photoprodukt, einem Addukt zwischen benachbarten Thyminresten (Nicholson et al., 1991). Ausbeuten an Pyrimidin-Dimeren und Sporen-Photoprodukt (SP) betrugen < 0,2% bzw. 8% des gesamten Thymins, wenn mit SASP gesättigte DNA bei 254 nm mit 30 kJ/m2 bestrahlt wurde. In Abwesenheit von SASP waren die Ausbeuten umgekehrt, –4,5% bzw. 0,3% (Nicholson et al., 1991). Ausbeuten von SP in vivo, d.h. in Sporen, und Thymin-Dimeren sind in vegetativen Zellen ähnlich und extrem hoch (> 25% des gesamten Thymins) (Donnellan und Setlow, 1965). Eine UV-Bestrahlung von DNA in vitro produziert auch gewöhnlich fluoreszierende Bipyrimidin-Addukte, Cytosin-Dimere vom Cyclobutan-Typ und auch Cyclobutan-Dimere zwischen Cytosin und Thymin wie auch ein 6-4-Bipyrimidin-Addukt. Die Ausbeuten an allen Arten von Photoprodukten sind bei Bestrahlung, in vitro, von DNA, an welche α/β-Typ-SASP gebunden sind, stark verringert (Fairhead und Setlow, 1991).
    • (f) Es ist auch gezeigt worden, dass α/β-Typ-SASP die Depurinisierungsrate von DNA in vitro um wenigstens das 20-fache verringern. In Fairhead et al., 1993, werden drei unterschiedliche Vorgehensweisen zum Messen von DNA-Depurinisierung in vitro angegeben.
  • Unter einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Polynukleotid, welches ein Polypeptid, wie oben definiert, kodiert, für eine Verwendung als Arzneimittel bereit.
  • Unter diesem Aspekt der Erfindung kann, obwohl angenommen wird, dass das Polypeptid die aktive Spezies ist, eine Abgabe des Polynukleotids an Zielzellen für eine Expression darin zu einem exprimierten Polypeptid, welches die Vermehrung der Zelle hemmt oder verhindert, führen.
  • Das Polynukleotid kann abhängig von dem verwendeten Abgabesystem DNA oder RNA sein. Obwohl aus Gründen von Stabilität und leichter Handhabung bevorzugt ist, dass das Po lynukleotid DNA ist, wird, wenn RNA verwendet wird, die Möglichkeit eliminiert, dass SASP seine eigene Produktion hemmt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die DNA das sspC-Gen aus B. subtilis. Die Degeneration des genetischen Codes erlaubt Mutationen, die die Aminosäuresequenz der Expressionsproduktion der DNA nicht verändern.
  • Das Polynukleotid kann für die Herstellung eines Arzneimittels für das Hemmen oder Verhindern von Zellvermehrung auf verschiedene Weisen verwendet werden. In einer Ausführungsform umfasst das Arzneimittel das Polynukleotid, das typischerweise für eine Verabreichung an ein Individuum formuliert ist. In einer anderen Ausführungsform wird das Polynukleotid verwendet, um ein Arzneimittel, welches das Polypeptid umfasst, herzustellen. In einer weiteren Ausführungsform kann das Arzneimittel innerhalb der Zielzelle als das Polypeptid hergestellt werden.
  • Ohne auf eine Theorie festgelegt werden zu wollen, wird postuliert, dass das Polypeptid, wenn es in der Zielzelle vorhanden ist, an die DNA der Zelle bindet und die Replikation von jener DNA verhindert. Das Polypeptid kann auch die Transkription der DNA, mit der es assoziiert ist, vollständig oder teilweise hemmen oder verhindern. Auf diese Weise wird weitere Zellvermehrung gehemmt oder verhindert. Insbesondere im Falle einer Infektion durch mikrobielle Zellen gibt die Verhinderung oder Hemmung von Vermehrung dem Immunsystem des Individuums die Gelegenheit, sich mit den infizierten Zellen zu befassen. Ein anderer Aspekt ist, dass ein Binden von SASP an DNA verhindern könnte, dass Zellen Gene, die an der Evasion (Entkommen) von Wirtsimmunsystemen beteiligt sind, exprimieren.
  • Unter einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Zusammensetzung zum Hemmen oder Verhindern von Zellvermehrung bereit, welche ein Polypeptid, wie oben definiert, und ein Abgabesystem dafür umfasst. Unter einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Zusammensetzung zum Hemmen oder Verhindern von Zellvermehrung bereit, welche ein Polynukleotid, wie oben definiert, und ein Abgabesystem dafür, das in der Lage ist, eine Zelle zielgerichtet anzusteuern, umfasst.
  • Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können sowohl für medizinische als auch nicht-medizinische Zwecke verwendet werden. Wenn sie für medizinische Zwecke, wie hier diskutiert, verwendet werden, gibt es eine Notwendigkeit, sicherzustellen, dass das verwendete Abgabesystem geeignet ist, um den relevanten medizinischen Zustand zu behandeln. Es ist bevorzugt, die Polynukleotid-enthaltende Zusammensetzung zu verwenden, da diese an Zielzellen abgegeben werden kann durch Abgabesysteme, die auf Polynukleotiden, wie Viren, basieren. Wenn das Abgabesystem ein Virus umfasst, kann das Polynukleotid in das Genom des Virus eingebaut werden und kann dementsprechend die Viruszell-Targeting-Mechanismen verwenden, um in die Zelle einzudringen, so dass das Polypeptid in der Zelle exprimiert werden kann, um Wirkung zu entfalten. Wenn die Zielzelle eine eukaryotische Zelle ist, kann ein euka ryotisches Virus, wie Adenovirus, HSV, HIV, modifiziert und verwendet werden oder ein jegliches anderes Virus, welches einen spezifischen Tropismus für die Zielzelle hat.
  • In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung umfasst das Virus einen Bakteriophagen (d.h. ein bakterielles Virus). Bakteriophagen sind allgemein in der Lage, zielgerichtet Bakterien anzusteuern, und sind üblicherweise sehr spezifisch, indem eine jegliche Bakterienspezies ihr eigenes einzigartiges Spektrum von Bakteriophagen aufweist. Darüber hinaus kann jeder Bakterienstamm ebenso wenigstens einen Bakteriophagen haben, der für jenen Stamm einzigartig ist. Dementsprechend stellt die Verwendung eines Bakteriophagen als Abgabesystem sicher, dass keine anderen Bakterien als jene, die zielgerichtet angesteuert werden sollen, infiziert werden. Eine Liste von üblichen Pathogenen und einigen von deren Bakteriophagen ist in Anhang 4 angegeben.
  • Es gibt verschiedene Arten von Bakteriophagen, einschließlich lysogener Phagen, wie lambda, filamentöser Phagen oder lytischer Phagen, die nicht lysogen sind. Bakteriophagen können einzelsträngige DNA oder RNA, an die SASP nicht binden kann, wie auch die häufigere doppelsträngige DNA, wie lambda, umfassen. Es ist bevorzugt, einen Bakteriophagen, der keine Lysogenie etablieren kann, oder einen lysogenen Phagen, der behandelt worden ist, so dass ein Gen, welches an der Etablierung von Lysogenie beteiligt ist, inaktiviert worden ist, zu verwenden. In jedem Falle ist bevorzugt, wenigstens eines der Gene, die Produkte kodieren, die an dem lytischen Prozess beteiligt sind, zu inaktivieren. Dies ist vorteilhaft, da eine Verhinderung von Zielzelllyse verhindert, dass der toxische Inhalt der Zelle freigesetzt wird und den Wirt nachteilig beeinflusst. Ein Nachteil von herkömmlichen Antibiotika ist, dass, sind die Antibiotika einmal an ein Individuum verabreicht, ein Aufbrechen der bakteriellen Zellwand für den Wirt aufgrund einer massiven Immunantwort auf Zellwand-Komponenten tödlich sein kann. Dieses Problem wird vermieden, indem eine Bakterienzelllyse gemäß der Erfindung verhindert wird.
  • Eine Inaktivierung eines Lysegens wird bequem erzielt, indem in das Gen das erfindungsgemäße Polynukleotid inseriert wird. Dies kann einen weiteren Vorteil haben, indem die Expression von Lysegenen ausreichend spät im Lebenszyklus des Phagen auftritt, so dass viele Phagenpartikel in einer Wirtszelle produziert werden können, bevor das Polypeptid durch das Polynukleotid exprimiert wird.
  • Typische Lysegene umfassen das S-Gen des Bakteriophagen lambda. Dieses Gen kodiert ein Holin, das ein Protein ist, das Poren in der Wirtszelle bildet, was es dann anderen lytischen Enzymen, die durch den Bakteriophagen produziert werden, erlaubt, eine Lyse zu verursachen. Ein Polynukleotid der Erfindung kann in das S-Gen inseriert werden oder dieses in großem Umfang ersetzen und kommt vorzugsweise unter die Kontrolle des S-Gen-Promotors PR'. Analog kann das Polynukleotid in eines der anderen Gene, die an dem lytischen Zyklus beteiligt sind, inseriert werden, wie das R-Gen. Das R-Gen-Produkt ist eine lytische Transglycosylase. In diesem Falle kann das S-Gen zusätzlich unterbrochen werden oder nicht. Äquivalen te Gene in anderen Arten von Bakteriophagen können in einer analogen Weise verwendet werden als Positionen für das Polynukleotid, wenn andere Bakterien als E. coli zielgerichtet angesteuert werden sollen.
  • In einer weiteren Ausführungsform kann das Polynukleotid anderswo auf dem Bakteriophagen-Chromosom lokalisiert und unter die Kontrolle eines Bakteriophagen- oder bakteriellen Promotors gestellt sein. Gegebenenfalls könnte die Produktion von einem oder mehreren Proteinen, die an der Lyse beteiligt sind, nach wie vor gehemmt werden. Alternativ könnte man den lytischen Zyklus weiter ablaufen lassen. Es ist beispielsweise möglich, bakterielle Promotoren zu verwenden, die auf Signale, die in einem Wirt unter Infektionsbedingungen gefunden werden, reagieren, wie temperaturempfindliche Promotoren, der P3-Promotor des Staphylococcus aureus-agr-Genorts oder andere Promotoren, die an Zwei-Komponenten-Sensor-Regulator-Stoffwechselwegen beteiligt sind. Weitere Beispiele umfassen Promotoren, die unter mikroaerophilen Bedingungen, unter Bedingungen von niedrigen Eisenkonzentrationen aktiv sind, oder jene, die durch wirtsspezifische Faktoren, wie Nikotinsäure oder Magnesiumionen, stimuliert werden.
  • Unter einem weiteren Aspekt kann das Virus modifiziert werden, um seine Wirtsspezifität zu erhöhen oder zu verändern. In dem Falle von Bakteriophagen können diese gentechnologisch modifiziert werden, so dass sie andere Zellarten als Bakterien infizieren, indem der Schwanz modifiziert wird, so dass unterschiedliche Affinitäten und/oder Fähigkeit, Zellen zu infizieren, erzeugt werden. Es ist beispielsweise gezeigt worden, dass filamentösen Bakteriophagen Säugetierzell-Tropismus verliehen werden kann, indem ein Ligand, der an ein Säugetierzell-Oberflächenmolekül bindet, auf dem Hüllprotein des Bakteriophagen präsentiert wird (Larocca et al., 1998). Es ist beispielsweise gezeigt worden, dass, wenn ein Phage (M13) gentechnologisch modifiziert wird, so dass er genetisch den Wachstumsfaktor-Liganden FGF2 (als eine Fusion mit dessen kleinerem Hüllprotein pIII) aufweist, dieser die Fähigkeit erwirbt, ein Gen an Säugetierzellen durch den FGF-Rezeptor abzugeben, was zu transduzierten Zellen führt (Larocca et al., 1999). Andere Forscher haben auch über ähnliche Feststellungen bei Verwendung von Phagen, die einen einzelkettigen Antikörper (scFvc), der gegen ErbB2, ein Mitglied der EGF (epidermaler Wachstumsfaktor)-Rezeptorfamilie, gerichtet ist, aufweisen, berichtet (Poul und Marks, 1999). Die Auswahl von Phagen, die gentechnologisch für einen Rezeptor-vermittelten Gentransfer zu Säugetierzellen modifiziert worden sind, kann verstärkt werden durch Screenen von Phagen-Bibliotheken auf funktionale Liganden, die in der Lage sind, DNA an Zellen abzugeben (Kassner et al., 1999).
  • Eine Barriere für Caudovirales (einen Schwanz aufweisende Bakteriophagen), die andere Zellen als ihren natürlichen Wirt infizieren, stellt das Fehlen eines geeigneten Rezeptors, der auf der Oberfläche des Zielbakteriums vorhanden ist, an den der Phage adsorbieren kann, dar. Indem man sich darum kümmert, ist es möglich, Phagen zu erzeugen, die die gleiche modifi zierte DNA (d.h. enthaltend SASP) enthalten, die aber zielgerichtet breite Wirtsspektren ansteuern können. Ein Phage kann beispielsweise modifiziert werden, so dass ermöglicht wird, dass er zielgerichtet einen Rezeptor ansteuert, der in mehreren Bakterienspezies gleichermaßen vorkommt. Alternativ kann die modifizierte Phagen-DNA in identische Phagenköpfe, die mit verschiedenen Schwänzen ausgestattet worden sind, die jeweils eine Affinität für Rezeptoren, die durch verschiedene Bakterien exprimiert werden, verleihen, verpackt werden. Bakteriophagen können auch Antikörperfragmente als Fusionsproteine exprimieren. Beispielsweise ist der filamentöse Phage M13 gentechnologisch modifiziert worden, so dass er ein g3p-Fusionsprotein, umfassend ein Helicobacter pylori-Antigen-bindendes einzelkettiges variables Fragment (ScFv), exprimiert (Cao et al., 2000). Dieser ScFv-Phage verringerte die cfu von allen getesteten Stämmen von H. pylori. Es könnte auch möglich sein, zu bewirken, dass ein Zielbakterium einen gewählten Rezeptor exprimiert. Es ist beispielsweise bereits gezeigt worden, dass Pseudomonas-Spezies modifiziert werden können, so dass sie LamB-Rezeptoren, die der Rezeptor für den Bakteriophagen lambda sind, exprimieren (de Vries et al., 1984). Das Gen lamB, welches diese Proteinrezeptoren kodiert, wird in Pseudomonas mittels eines Plasmids eingeführt und inseriert sich in das Pseudomonas-Chromosom durch homologe Rekombination. Obwohl es nicht immer praktikabel ist, Zellen mit Plasmiden zu transformieren, ist es möglich, das lamB-Gen an ein jegliches gramnegatives Bakterium mittels eines modifizierten lysogenen Bakteriophagen, der für die Zielzellen spezifisch ist, abzugeben. Das lamB-Gen sollte unter der Kontrolle eines starken bakteriellen Promotors stehen und der Phage sollte derart verändert sein, dass stets Lysogenie etabliert wird. Eine Verabreichung dieser Art von Phagen wird dann Pseudomonas-Spezies geneigt für eine Infektion durch nachfolgend verabreichtes SASP/lambda machen. Für jede Zielspezies können andere derartige modifizierte Phagen hergestellt werden und werden Wirkung entfalten, um das Wirtsspektrum eines jeglichen gegebenen, SASP enthaltenden Bakteriophagen zu verbreitern.
  • Auf diese Weisen ist es möglich, das Spektrum von Bakterien, die ein SASP enthaltender Phage zielgerichtet ansteuern kann, zumindest innerhalb der breiten Kategorien von grampositiven oder gramnegativen Bakterien zu erweitern.
  • Es sind modifizierte Bakteriophagen kommerziell erhältlich, die speziell gestaltet worden sind vor dem Hintergrund einer Klonierung oder Genexpression, und diese können multiple Klonierungsstellen und induzierbare Promotoren, die in nicht-essentiellen Regionen inseriert sind, umfassen.
  • Es gibt zwei Klassen von Lambda-Klonierungsvektoren: Insertionsvektoren nehmen 0–12 kb DNA auf und umfassen Lambda ZAPII, Uni-ZAP XR und Lambda ZAP-Express (Stratagene); Ersetzungsvektoren nehmen 9–23 kb auf und umfassen Lambda FIXII und Lambda DASHII (Stratagene). Bakterielle Proteinexpressionskits, welche die Expression von toxischen Genen erlauben, stehen ebenfalls zur Verfügung, einschließlich des Lambda CE6-Bakteriophagen, welcher das T7-RNA-Polymerasegen für eine Abgabe an Zellen des E. coli-Stamms BL21 trägt (Stratagene). Bakteriophagen mit natürlichen Mutationen innerhalb des S-Gens werden kommerziell verwendet, um große Mengen herzustellen.
  • Bei einer Verwendung als Arzneimittel kann das Polypeptid oder Polynukleotid der Erfindung für eine Therapie beim Menschen verwendet werden und kann verschiedene Zustände oder Leiden, insbesondere mikrobielle Infektionen, behandeln. Unter jenen mikrobiellen Infektionen, die gemäß der Erfindung behandelbar sind, befinden sich lokale Infektionen, Zahnkaries, Atemwegsinfektionen, Augeninfektionen und lokalisierte Organinfektionen. Die Erfindung ist auf eine Therapie sowohl von Menschen als auch Tieren anwendbar und kann beispielsweise verwendet werden, um systemische oder lokale Infektionen bei Fischen zu behandeln. Arzneimittel oder pharmazeutische Zusammensetzungen können dementsprechend gemäß der Erfindung abhängig von der Verwendung, der das Polypeptid oder Polynukleotid zugeführt wird, formuliert werden. Typischerweise kann ein Arzneimittel formuliert werden, welches den Wirkstoff gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel, Verdünnungsmittel oder Träger umfasst. Die genaue Natur und Mengen der Bestandteile von solchen pharmazeutischen Zusammensetzungen können empirisch bestimmt werden und werden teilweise von der Verabreichungsroute der Zusammensetzung abhängen. Verabreichungsrouten an Empfänger umfassen oral, bukkal, sublingual, durch Inhalation, topisch (einschließlich ophthalmisch), rektal, vaginal, nasal und parenteral (einschließlich intravenös, intraarteriell, intramuskulär, subkutan und intraartikulär). Für eine bequeme Verwendung werden Dosierungen gemäß der Erfindung von dem Ort und der Art der Infektion, die behandelt oder verhütet werden soll, abhängen. Beispielsweise würde eine Behandlung von Atemwegsinfektionen infiziert (bewirkt) werden durch eine SASP/Phagen-Suspension, die durch Inhalation verabreicht wird. Eine Behandlung von Augeninfektionen würde bewirkt werden durch eine Verwendung einer SASP/Phagen-Suspension, die durch Augentropfen verabreicht wird, u.s.w. Eine Mundspülung oder Zahnpasta kann bei der Behandlung von Zahnkaries verwendet werden, die eine SASP/Phagen-Formulierung enthält, um Bakterien, die mit der Bildung von Dentalplaque verbunden sind, zu beseitigen. Dementsprechend werden auch Mundhygieneprodukte, die ein oder mehrere Polypeptid(e) oder Polynukleotid(e) gemäß der Erfindung enthalten, bereitgestellt.
  • Das Polypeptid, Polynukleotid und Zusammensetzungen davon gemäß der Erfindung können ebenso in nicht-medizinischen Anwendungen verwendet werden. Unter einem weiteren Aspekt wird eine Verwendung eines Polypeptids oder Polynukleotids, wie hier definiert, als ein mikrobielles Dekontaminationsmittel, insbesondere ein bakterielles Dekontaminationsmittel, das verwendet werden kann, um eine mikrobielle Kontamination von Oberflächen zu behandeln, bei der Bodensanierung oder bei der Wasserbehandlung verwendet werden kann, bereitgestellt. Das Polynukleotid oder Polypeptid kann beispielsweise bei der Behandlung von medizinischem Personal als Dekontaminierungsmittel, beispielsweise als Händewaschmittel, verwendet wer den. Die Behandlung von Arbeitsoberflächen und Ausrüstungsgegenständen wird ebenfalls bereitgestellt, insbesondere von jenen, die bei Prozeduren im Krankenhaus oder bei der Nahrungsmittelzubereitung verwendet werden. Hier besteht ein Vorteil gegenüber herkömmlichen antibakteriellen Chemikalien, die empfindliche Instrumente beschädigen können und in Bereichen, die der Nahrungsmittelzubereitung dienen, unerwünscht sein können. Als ein weiteres Beispiel für eine mikrobielle Dekontaminierung von Oberflächen kann die Erfindung bei der topischen Behandlung von Leichen oder Kadavern verwendet werden. Bei der Behandlung von Wasser kann die Erfindung wirksam sein gegen durch Wasser übertragene Pathogene, insbesondere Vibrio cholerae, Legionella pneumophila, Salmonella typhi und Shigella dysenteriae. Eine mikrobielle Verunreinigung von Boden kann gleichfalls gemäß der Erfindung bekämpft werden.
  • Unter einem weiteren Aspekt wird eine Verwendung des Polypeptids oder Polynukleotids als ein antimikrobielles Mittel, insbesondere ein antibakterielles oder antifungales Mittel, bei der Behandlung von Pflanzenmaterial, wie Pflanzen, beispielsweise Feldfrüchten, oder bei der Behandlung von Saatgut oder Getreidekörnern, die daraus hergestellt werden, bereitgestellt. Früchte können mit Phagen gegen Bakterien, die Weichfäule („soft rots") verursachen, besprüht werden. Auf diese Weise können Mikroorganismen, wie Erwinia-Spezies, behandelt werden. Zierpflanzen, wie Geranien-Arten, sind empfindlich gegenüber bakterieller Trockenfäule, die beispielsweise durch Xanthomonas campestris verursacht wird; dieser Organismus befällt auch Tomaten. In ähnlicher Weise können auch Pseudomonas-Spezies, die Bohnen und Pilze infizieren, gemäß der Erfindung behandelt werden.
  • Unter einem weiteren Aspekt kann das Polynukleotid oder Polypeptid verwendet werden, um tierische Ektoparasiten, wie Ratten, zu behandeln, um spezielle Bakterien daraus zu entfernen. Eine übliche Behandlung, um Ratten zu beseitigen, besteht in der Verabreichung von Futter, welches gerinnungshemmende Substanzen, wie Warfarin, enthält. Das Gegengift für solche Substanzen ist üblicherweise Vitamin K. Vitamin K wird im Säugetierdarm durch Bakterien produziert. Resistenz gegen gerinnungshemmende Mittel durch Ratten wird aufgrund einer Besiedelung des Darms durch Bakterien, die erhöhte Mengen an Vitamin K produzieren, erworben. Dementsprechend erlaubt die Behandlung von tierischen Ektoparasiten gemäß der Erfindung eine herkömmliche Verabreichung von gerinnungshemmenden Mitteln, um bei der Kontrolle von tierischen Ektoparasiten erfolgreich zu sein.
  • Die Erfindung wird jetzt detaillierter, nur beispielhaft, durch Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen und die folgenden Beispiele und Anhänge beschrieben.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt eine diagrammartige Darstellung eines Teils des lambda-Genoms, welcher das S-Gen überspannt;
  • 2 zeigt eine Karte von pB/LF1;
  • 3 zeigt eine diagrammartige Darstellung eines Teils des Bacillus subtilis-Genoms, welcher das sspC-Gen überspannt;
  • 4 zeigt eine Karte von (A) pB/SAPB und (B) pB/SAPO;
  • 5 zeigt eine Karte von pB/SAPOC;
  • 6 zeigt eine Karte von SSPC-lambda, welche das Ersetzen des lambda-S-Gens durch das sspC-Gen aus B. subtilis und die Insertion eines Chloramphenicolresistenz-Markergens (Cmr) zeigt;
  • 7 zeigt eine Karte eines Bereichs der genomischen SSPC-lambda-DNA mit Primerpositionen;
  • 8 zeigt eine diagrammartige Darstellung eines Teils des Bacillus subtilis-Genoms, welcher das sspC-Gen überspannt;
  • 9 zeigt eine Karte von pB/PIPC;
  • 10 zeigt eine diagrammartige Darstellung eines Fragments, welches das RPPC-lambda-Konstrukt umfasst, welche die Position der Sequenzierungsprimer SEQL1F und SEQL2R zeigt;
  • 11 zeigt eine diagrammartige Darstellung von Tandem-sspC-Genen und der Primer, die verwendet wurden, um die Gene vor der Ligation in lambda mittels PCR zu amplifizieren;
  • 12 zeigt die Abnahme von Lebensfähigkeit von E. coli nach einer Infektion mit SSPC-lambda; und
  • 13 zeigt ein Gel, welches die Bandenmuster von Plasmid-DNA, hergestellt aus Stämmen, die +/–Produktion von SspC kultiviert worden sind, demonstriert.
  • EXPERIMENTELLE VORGEHENSWEISEN
  • Alle experimentellen Vorgehensweisen sind Standard, wie in Sambrook et al. (1991) beschrieben, sofern nicht anders angegeben.
  • Restriktionsverdaue wurden in einem Gesamtvolumen von 50 μl unter Verwendung von 2 μl von jedem Enzym ausgeführt und bei 37°C 4 h inkubiert, sofern nicht anders angegeben.
  • Eine Dephosphorylierung von Matrizen-DNA wurde ausgeführt in einem Gesamtvolumen von 50 μl unter Verwendung von 10× Puffer (5 μl) und alkalischer Phosphatase (2,5 E) (5 μl) mit einer Inkubation bei 37°C für 1 h.
  • Ligationen wurden ausgeführt in einem Gesamtvolumen von 10 μl unter Verwendung von 3 Weiss-Einheiten (1 μl) von T4-DNA-Ligase und wurden routinemäßig bei 16°C über Nacht ausgeführt.
  • PCR-Mischungen wurden routinemäßig hergestellt, wie folgt (Gesamtvolumen von 100 μl):
    Matrizen-DNA 0,1 μg Plasmid oder gereinigte lambda-DNA/1 μg chromosomale DNA/1 Kolonie
    10× Puffer (mit 1,5 mM MgCl2) 10 μl
    dNTP-Mischung (10 mM Stammlösung) 2 μl
    Taq-Polymerase (2,5 E) 1 μl
    Primer (Vorwärts und Rückwärts) 100 pmol von jedem
    Einstellen auf ein Endvolumen von 100 μl mit dH2O.
  • PCR-Reaktionen wurden ausgeführt, wie folgt: (sofern nicht anders angegeben)
  • Figure 00130001
  • Primer wurden von Gibco BRL oder Sigma Genosys erhalten. Wenn Primer Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme enthalten, wurde die bevorzugte strangaufwärts gelegene Sequenz von jedem Enzym (PCR Essential Data, 1995) aufgenommen.
  • A In vitrolin vivo-Produktion I
    • 1. Ein Fragment des lambda-Genoms, welches das S-Gen überspannte, wurde durch PCR unter Verwendung von Primern mit geeigneten Restriktionsenzymstellen am 5'-Ende amplifiziert, um eine gerichtete Ligation in einen allgemeinen E. coli-Klonierungsvektor, wie pUC18 oder pBluescript (Stratagene), zu ermöglichen. Dementsprechend umfasst der Primer B1 die Restriktionsenzymerkennungssequenz von PstI, gefolgt von der lambda-Sequenz von Base 44660 bis Base 44677 (1). Der Primer B2 umfasst die Restriktionsenzymerkennungssequenz von XbaI, gefolgt von der Umkehr- und komplementären Sequenz der lambda-Sequenz von Base 45972 bis Base 45956 (1), beispielsweise:
      Figure 00130002
      In 1 ist die Position der an der Lyse beteiligten späten Gene zusammen mit dem PR'-Promotor bezogen aufeinander gezeigt. Die Position der Primer B1 und B2 zusammen mit der EcoRI-Restriktionsenzymstelle ist ebenfalls gezeigt.
    • 2. Das resultierende 1328 bp-PCR-Produkt wurde mit PstI/XbaI verdaut und mit ähnlich verdautem, dephosphoryliertem pBluescript ligiert, wodurch pB/LF1 erhalten wurde (2). 2 zeigt eine lineare Karte von pB/LF1, welche das Plasmid-Gerüst von pBluescript SK (+) (Stratagene) und die Lage des lambda-Fragment-Inserts, begrenzt von PstI/XbaI-Restriktions stellen, zeigt (siehe 1). Die Sequenz, die den Start des S-ORFs überspannt, ist zusammen mit der Position der Ribosomenbindungsstelle (rbs) und der ersten und zweiten Startcodons angegeben. Die relativen Positionen und Sequenzen der inversen PCR-Primer sind gezeigt. Primer B3 produziert ein PCR-Produkt, das am 5'-Ende ein stumpfes Ende aufweist. Primer B4 produziert ein PCR-Produkt, das nach Verdau mit NcoI ein überhängendes 5'-Ende aufweist.
    • 3. Das Plasmid pB/LF1 wurde in E. coli durch Elektroporation eingeführt und mutmaßliche Rekombinanten wurden als weiße Kolonien auf LB-Agarplatten in Gegenwart von X-gal (80 μl, 20 mg/ml) und Ampicillin (50 μg/ml) gewonnen. Eine korrekte Transformante wurde nach Restriktionsverdau der Plasmide mit EcoRI, welcher zu zwei Fragmenten von ungefähr 300 bp und 3950 bp führte, identifiziert.
    • 4. Das S-Gen von lambda ist ein Dual-Start-Gen (Gen mit zwei Startsequenzen) mit einer Transkription ausgehend von dem zweiten fMet-Startcodon, welche zu einer zweifach höheren Proteinkonzentration führt. Dementsprechend wurde das gewählte SASP-Gen, in diesem Falle sspC aus B. subtilis, im Leseraster mit diesem zweiten Startcodon inseriert. Es wurde eine inverse PCR des Plasmids pB/LF1 ausgeführt (mit einer Verlängerungszeit von 4 min 30 s bei 68°C) unter Verwendung von umgekehrten („reverse") Primern, um ein Fragment mit einem überhängenden 5'-Ende herzustellen. Das Restriktionsenzym NcoI weist eine Erkennungssequenz (CCATGG), welche die Nukleotide ATG umfasst, auf. Durch Hinzufügen der NcoI-Erkennungssequenz vor der Matrize (pB/LF1) und Inserieren von (sspC) DNA-Primern ermöglicht dies eine nachfolgende Ligation von diesen PCR-Produkten, so dass das sspC-Gen sich im Leseraster mit dem Startcodon des lambda-S-Gens befindet. Der umgekehrte („reverse") Primer (B4) ist die komplementäre Sequenz zu der lambda-Sequenz, beginnend an dem dritten Nukleotid 5' von dem zweiten ATG-Startcodon des S-Gens (2). Der Primer enthält die Erkennungssequenz des Restriktionsenzyms NcoI, beispielsweise:
      Figure 00140001
      Es ist möglich, das S-Gen durch ein SASP-Gen durch Blunt-End-Ligation zu ersetzen, und in diesem Falle kann ein umgekehrter Primer, der bei der komplementären Sequenz des zweiten ATG-Startcodons des S-Gens beginnt (2), verwendet werden, beispielsweise:
      Figure 00140002
      Der Vorwärts-Primer basierte auf der Sequenz am Beginn des lambda-R-Gens von Base 45499 bis Base 45515 (siehe 2). Die Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym SpeI wurde vor der lambda-Sequenz verwendet, um eine gerichtete Ligation mit dem sspC-Gen zu ermöglichen, beispielsweise:
      Figure 00150001
    • 5. Das sspC-Gen wurde PCR-amplifiziert (unter Verwendung von 20 s Verlängerungszeit) in einer solchen Weise, dass eine Ligation mit den inversen PCR-Produkten, die entweder ausgehend von den Primern B3 und B5 oder B4 und B5 erhalten worden sind, ermöglicht wurde; beispielsweise:
    • (i) sollte für eine Ligation an das inverse PCR-Produkt von pB/LF1, das unter Verwendung der Primer B3 und B5 hergestellt worden ist (wodurch das Plasmid pB/SAPB erhalten wurde), ein Vorwärts-Primer verwendet werden, der mit dem Nukleotid unmittelbar 3' von dem ATG-Startcodon des sspC-Gens beginnt (3), beispielsweise:
      Figure 00150002
    • (ii) wurde für eine Ligation an das inverse PCR-Produkt von pB/LF1, das unter Verwendung der Primer B4 und B5 hergestellt worden ist (wodurch das Plasmid pB/SAPO erhalten wurde), ein Vorwärts-Primer verwendet, der die Sequenz von sspC beginnend an dem 5. Nukleotid des sspC-ORFs umfasst (3). Dieser Primer weist eine NcoI-Restriktionsenzymsequenz unmittelbar vor der sspC-Sequenz auf, die tatsächlich die ersten vier Nukleotide des sspC-Gens selbst mit umfasst, beispielsweise:
      Figure 00150003
      Der umgekehrte („reverse") Primer ist die komplementäre Sequenz zu der Sequenz am Ende des sspC-ORFs, d.h. um ein PCR-Produkt herzustellen, das das Stop-Codon des sspC-Gens umfasst (3). Der Primer umfasst eine SpeI-Sequenz, um eine gerichtete Ligation mit jedem der beiden inversen PCR-Produkte von pB/LF1 zu ermöglichen, beispielsweise:
      Figure 00150004
      In 3 ist das sspC-Gen zusammen mit den relativen Positionen der PCR-Primer B6, B7 und B8 gezeigt. Primer B6 wird ein PCR-Produkt erzeugen, das am 5'-Ende ein stumpfes Ende aufweist. Der Primer B7 erzeugt ein PCR-Produkt, das nach einem Verdau mit NcoI ein überhängendes 5'-Ende haben wird.
    • 6. Das PCR-amplifizierte sspC-Gen (ausgehend von den Primern B7 und B8) und das durch inverse PCR amplifiziierte pB/LF1 (ausgehend von den Primern B4 und B5) wurden mit den Restriktionsenzymen NcoI und SpeI verdaut. Das verdaute lineare inverse PCR-Produkt von pB/LF1 wurde vor der Ligation dephosphoryliert.
    • 7. Nach dem Reinigen von verdauter DNA wurden Ligationen ausgeführt, um das Plasmid pB/SAPO zu erhalten, in welchem das sspC-Gen im Wesentlichen das S-Gen von lambda ersetzt (4). Für das Plasmid pB/SAPB werden PCR-Produkte einfach zusammen ligiert (4). Die 4 zeigt eine lineare Karte von (A) pB/SAPB oder (b) pB/SAPO. Diese Plasmide werden nach Insertion des sspC-Gens in das durch inverse PCR amplifizierte Plasmid pB/LF1 (amplifiziert unter Verwendung der Primer B3 und B5 oder B4 und B5 (siehe Abschnitt A 4)) konstruiert.
    • (A) Lineare Karte von pB/SAPB, welche durch inverse PCR amplifiziertes pB/LF1 (ausgehend von den Primern B3 und B5), enthaltend das sspC-Gen, zeigt. Die angegebene Sequenz überspannt die Ribosomenbindungsstelle des S-Gens und den Start des sspC-ORFs, verknüpft durch Blunt-End-Ligation. Lineare Karte von pB/SAPO, welche durch inverse PCR amplifiziertes pB/LF1 (ausgehend von den Primern B4 und B5), enthaltend das sspC-Gen, zeigt. Die angegebene Sequenz überspannt die Ribosomenbindungsstelle des S-Gens und den Start des sspC-ORF, verknüpft durch Ligation nach Verdau mit NcoI.
    • 8. Es ist möglich, einen lambda herzustellen, der ein SASP-Gen, mit oder ohne dass ein Antibiotikaresistenzgen vorhanden ist, trägt. Eine Verwendung eines Antibiotikaresistenzgens stellt einen selektierbaren Marker bereit, um das Vorhandensein eines SASP-Gens verfolgen zu können, und dies ist ausgeführt worden unter Verwendung eines Chloramphenicolresistenz (Cmr)-Gens. Ein Cmr-Gen (mit seinem eigenen Promotor) ist in der entgegengesetzten Orientierung am 3'-Ende des sspC-Gens nach Verdau von pB/SAPO mit SpeI inseriert worden. Dies führte zu dem Plasmid pB/SAPOC (5). 5 zeigt eine lineare Karte von pB/SAPOC, welche ein pBluescript-Gerüst und die Position der sspC- und Cmr-Gene innerhalb des lambda-Fragments, begrenzt durch PstI/XbaI-Restriktionsstellen, zeigt.
    • 9. Ein Verfahren zur Herstellung von SASP/lambda besteht darin, einen Stamm von E. coli, welcher pB/SAPOC trägt, mit dem Phagen lambda zu infizieren. Wenn sich die Phagen reproduzieren, wird das lambda/sspC/Cmr-Fragment innerhalb von pB/SAPOC in einige lambda-Genome eingebaut werden. Dieses Verfahren ist erfolgreich eingesetzt worden unter Verwendung eines temperaturempfindlichen (ts) lambda. Dieser lambda-Typ kann als ein Prophage stabil innerhalb eines E. coli-Chromosoms bei 30°C aufrechterhalten werden, nicht aber bei 42°C. Der pB/SAPOC enthaltende Stamm wurde in LB (enthaltend 10 mM MgSO4 + 0,2% Maltose (Gew./Vol.)) kultiviert, bis die OD600 0,3 erreichte. Ein Aliquot (100 μl) wurde entfernt und mit 100 μl lambda-Phagen-Präparat gemischt. Die Mischung wurde ohne Schütteln bei RT 20 min inkubiert, es wurden 3,5 ml geschmolzener, bei 45°C gehaltener Top-Agar (LB, 0,6% Agar, enthaltend 10 mM MgSO4 + 0,2% Maltose (Gew./Vol.)) zugegeben und auf vorgewärmte LB-Agar-Platten gegossen. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert, bevor LB (3 ml) auf die Oberfläche des Top-Agars zugegeben wurde. Der die Plaques enthaltende Top-Agar wurde in 50 ml-Zentrifugenröhrchen transferiert und bei 4°C über Nacht aufbewahrt. Es wurde Chloroform (250 μl) zugesetzt und das Röhrchen wurde vorsichtig mehrere Male umgewendet, um jegliche ganzen Bakterienzellen vor einer Zentrifugation (4000 Upm, 10 min, RT) zu lysieren. Der resultierende Phagenlysat-Überstand wurde in ein steriles Röhrchen transferiert und verwendet, um einen E. coli-Stamm, der lysogenisiert werden konnte, d.h. NM522 oder Y1089r–, zu infizieren, indem 100 μl Lysat mit 100 μl E. coli-Kultur, die bis zu einer OD600 von 0,3 kultiviert worden war, gemischt wurden. Nach der Inkubation bei RT für 30 min wurden 800 μl LB zugesetzt und die Mischung wurde in 100 μl-Aliquots auf mit Chloramphenicol (10 μg/ml) ergänzte LB-Agar-Platten ausplattiert. Nach einer Inkubation bei 30°C über Nacht wurden Cmr-Kolonien isoliert und auf das Vorhandensein von sspC-tragenden lambda-Prophagen untersucht.
    • 10. Cm-resistente Kolonien wurden auf zwei LB-Platten, enthaltend Chloramphenicol (10 μg/ml), subkultiviert und die Platten wurden bei entweder 30°C oder 42°C über Nacht inkubiert. Es wurde angenommen, dass Kolonien, die sich am folgenden Tag bei 30°C, nicht aber bei 42°C vermehrt hatten, lysogen hinsichtlich rekombinantem lambda, welcher die sspC- und Cmr-Gene enthält, sind. Kolonien wurden auch auf LB-Platten, die Ampicillin enthielten, subkultiviert, um sicherzustellen, dass das gesamte pB/SAPOC-Plasmid sich nicht in das lambda-Genom integriert hatte. Ein Stamm von E. coli, der lysogen, Cm-resistent und Ampicillin-empfindlich war, wurde identifiziert und der Prophage als SSPC-lambda bezeichnet (6). 6 zeigt eine lineare Karte von SSPC-lambda, welche die Substitution des lambda-S-Gens durch das sspC-Gen aus B. subtilis und die Insertion eines Chloramphenicolresistenz-Markergens (Cmr) zeigt.
    • 11. Sequenzierungsreaktionen wurden ausgeführt, um das Vorhandensein, die Übereinstimmung und die Orientierung der sspC- und Cmr-Gene innerhalb des SSPC-lambda-Genoms, das in dem E. coli-Wirtschromosom vorhanden ist, zu bestätigen. Aus dem E. coli-Stamm, der SSPC-lambda enthält, wurde chromosomale DNA hergestellt und mit dem Restriktionsenzym ClaI verdaut. Dieses Enzym schneidet an 15 Stellen innerhalb des lambda-Genoms und einer unbestimmten Anzahl von Stellen innerhalb des E. coli-Genoms. Speziell schneidet dieses Enzym an den Basen 43825 und 46439 des lambda-Genoms, was zu einem Fragment führt, das die S- und R-Lysegen-Bereiche von lambda, begrenzt durch die Primer B1 und B2, überspannt (7). 7 zeigt einen Bereich von genomischer SSPC-lambda-DNA mit Primer-Positionen:
    • – Position der Primer B1 und B2, die verwendet wurden, um anfänglich das lambda-Fragment zu amplifizieren, um pB/LF1 herzustellen (Abschnitt A 1);
    • – Position der ClaI-Stellen, was das Ausmaß von Ligationsprodukt für eine PCR-Amplifizierung und Sequenzverifizierung zeigt (Abschnitt A 11);
    • – Primer B31 und B32, die verwendet wurden, um die Region von lambda, welche das B1-B2-Fragment überspannt, durch PCR für eine Sequenzierung zu amplifizieren (Abschnitt A 11);
    • – Primer 13f1, B30, B55 und B54, die für die Sequenzierung des SSPC-lambda-Konstrukts verwendet wurden (Abschnitt A 11). Gesamte verdaute DNA wurde dann über Nacht ligiert und ein Aliquot der Ligationsmischung (2,5 μl) wurde als Matrizen-DNA für eine PCR-Reaktion unter Verwendung des folgenden Programms verwendet:
      Figure 00180001
      Die folgenden Primer (B31 von Base 43976 bis 44000; B32 von Base 46225 bis 46203 von lambda) wurden verwendet, um ein Fragment von lambda-DNA, welches die lambda/sspC/Cmr-Gen-DNA, die aus pB/SAPOC als ein PstI/XbaI-Insert stammte, überspannte (7), herzustellen.
      Figure 00180002
      Das resultierende PCR-Produkt wurde dann in mehreren Sequenzierungsreaktionen unter Verwendung der folgenden Primer verwendet (siehe 7):
      Figure 00190001
    • 12. Es ist auch möglich, ein ähnliches Konstrukt unter Verwendung einer unterschiedlichen Ribosomenbindungsstelle (rbs) strangaufwärts von dem SASP-Gen als eine Alternative zu der nativen rbs des S-Gens herzustellen. Beispielsweise kann eine T7-Phage-Gen 10-Leader-RNA die Expression von einigen fremden Genen in E. coli dramatisch verstärken (Olins et al., 1988). Alternativ könnte die Ribosomenbindungsstellensequenz des lambda V-Gens verwendet werden, da V ein Schwanz-Protein kodiert, das während des normalen lytischen Lebenszyklus des Bakteriophagen lambda reichlicher vorkommt als das S-Genprodukt. In diesem Falle ist ein Konstrukt hergestellt worden unter Verwendung der nativen sspC-rbs unter Einsatz der gleichen Methode wie oben mit der Ausnahme, dass das sspC-Gen PCR-amplifiziert wurde unter Verwendung eines Vorwärts-Primers, der zu der Sequenz ungefähr 40 Basen strangaufwärts des sspC-Startcodons homolog war. Eine BamHI-Restriktionsenzymstelle wurde vor der sspC-Sequenz mit aufgenommen. Beispielsweise:
      Figure 00190002
      Es wurde der umgekehrte („reverse") Primer B8 verwendet. Das resultierende PCR-Produkt wurde mit einem durch inverse PCR amplifizierten pB/LF1, der unter Verwendung des Vorwärts-Primers B5, wie zuvor, und eines umgekehrten Primers B21 mit einer BamHI-Restriktionsstelle vor der pB/LF1-Sequenz amplifiziert worden war, ligiert.
      Figure 00190003
      Produktion und Identifizierung eines Stammes, der diese als SPPC-lambda bezeichnete Form von lambda als ein Prophage trägt, wurden ausgeführt wie für SSPC-lambda. SPPC-lambda wurde ebenfalls sequenziert, wie in Abschnitt A 11 oben beschrieben.
    • 13. Sowohl SSPC- als auch SPPC-lambda-Konstrukte werden als Prophagen aufrechterhalten, d.h. sie verbleiben stabil innerhalb ihres E. coli-Wirtschromosoms. Nur reife Phagenpartikel der ersten Generation sind bislang für eine Infektion verwendet worden. Dies trägt dazu bei, Vergleichbarkeit zwischen jeder Charge von produzierten reifen Phagen sicherzustellen. Da es jedoch nicht notwendigerweise ideal ist, einen temperenten oder lysogenisierenden Phagen für therapeutische Zwecke zu verwenden, ist es möglich, die an der Etablierung von Lysogenie beteiligten Gene zu verändern, so dass sie in einer Infektionssituation inaktiv sind. Bei dem hier beschriebenen System bedeutet die Verwendung eines temperaturempfindlichen (ts) Phagen, dass eine Lysogenisierung bei 37°C oder darüber relativ selten ist. Selbstverständlich können Phagenstammlösungen ihrerseits ebenfalls anstelle von lysogenen E. coli aufrechterhalten werden.
    • 14. Präparate von sowohl SSPC-lambda als auch SPPC-lambda wurden erhalten, indem die rekombinante Prophagen enthaltenden Stämme induziert wurden, so dass sie reife Phagenpartikel produzierten. Jeder Stamm wurde bei 30°C kultiviert, bis die OD600 0,6 erreichte, und dann wurde die Temperatur 15 min auf 42°C verändert. Die Kultur wurden dann unter Schütteln bei 350 Upm, um eine gute Belüftung sicherzustellen, bei 37°C weitere 3 h inkubiert, bevor sie durch Zentrifugation geerntet wurde (4000 Upm, 10 min, RT). Der Überstand wurde entfernt und das Pellet in 1/5tel Volumen Phagenpuffer resuspendiert. Chloroform (1/100stel Volumen) wurde zu den resuspendierten Zellen zugesetzt und die Suspension wurde sanft gemischt. Das resultierende Lysat wurde zentrifugiert (4000 Upm, 10 min, RT) und der Überstand in ein steriles Röhrchen transferiert und dann bei 4°C aufbewahrt. Die Lysate wurden titriert, wie in Abschnitt A 15 unten beschrieben.
    • 15. Um nach Induktion produzierte SSPC-lambda-Phagenpartikel zu titrieren, wurde Phagenlysat verwendet, um einen nicht-lysogenisierenden Stamm von E. coli zu infizieren, der ein (als pB/LF2 bezeichnetes) Plasmid, welches ein Fragment von lambda-DNA, welches die S- und R-Lysegene und den PR'-Promotor überspannte, trug, enthielt. Dieses Promotor-enthaltende Fragment von lambda wurde durch PCR amplifiziert unter Verwendung des Primers B51 (5'-AACTGCAGCGCTGTGACGATGCTAATCC-3' SEQ ID NO: 18) von Base 44371 bis Base 44390 und des Primers B2 (zuvor beschrieben) (siehe 7). Das Vorhandensein von reproduzierenden lambda-Phagen innerhalb des pB/LF2-tragenden Stamms erlaubt eine Expression der Lysegen-Kassette strangabwärts von dem auf dem Plasmid basierenden PR-Promotor. Die ausgehend von dem Plasmid exprimierten Produkte der Lysegene vereinfachen die Lyse der Bakterien und die Bildung von Plaques. Der Phagentiter wird bestimmt durch Plaque-Zählung bei der Verdünnung, wo Plaques diskret und leicht beobachtbar sind. Eine Infektion wurde ausgeführt, indem der pB/LF2 enthaltende Stamm bis zu einer OD600 von 0,3 in LB, enthaltend 0,2% Maltose, 10 mM MgSO4 und 50 μg/ml Ampicillin, kultiviert wurde. Ein Aliquot (100 μl) der Zellkultur wurde mit 100 μl-Verdünnungen von SSPC-Phagenlysat 20 min bei RT inkubiert und dann mit Top-Agar gemischt und ausplattiert, wie in Abschnitt A 9 beschrieben. Es gibt eine Verringerung des Titers von SSPC-lambda-Partikeln bis zu 5log verglichen mit dem Ausgangs-lambda, von welchem diese abgeleitet worden sind. Indem dem beschriebenen Protokoll gefolgt wird, kann der Ausgangs-lambda ungefähr 1015 pfu pro ml produzieren.
  • B In vitrolin vivo-Produktion II
  • Es gibt alternative Verfahren, um ein SASP-Gen anstelle des lambda-S-Gens enthaltenden lambda zu erhalten, basierend auf einem Transformieren eines lambda-Lysogens mittels pB/SAPO oder pB/SAPB (siehe Abschnitt A oben). In diesem Falle sollten kompetente Zellen eines Restriktions–/Modifikations+-Stamms von E. coli, der ein lambda-Lysogen ist, beispielsweise MOB145, hergestellt werden.
    • 1. Elektro-kompetente lysogene E. coli-Zellen sollten mit entweder pB/SAPO oder pB/SAPB oder einem Suizid-Vektor, welcher das äquivalente lambda/sspC-Fragment von DNA enthält, transformiert werden. Man lässt die transformierten Zellen sich 1 h in SOC bei 37°C erholen, dann werden sie zentrifugiert (4000 Upm, 10 min, RT). Die pelletierten Zellen sollten in LB (1 ml) resuspendiert werden und 50 μl entfernt und mit sterilem LB auf 1 ml aufgefüllt werden. Zellen sollten auf LB-Agar in 200 μl-Aliquots ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert werden. Die verbleibenden 950 μl sollten in 50 μl-Aliquots schockgefroren und bei –20°C aufbewahrt werden.
    • 2. Es gibt mehrere Weisen, auf welche eine Selektion auf ein Doppel-Crossing-over-Ereignis zwischen dem lambda-Fragment, welches sich in den pB/SAPB- oder pB/SAPO-Plasmiden befindet, und einer homologen Sequenz innerhalb des lambda Genoms ausgeführt werden kann. Die Verwendung eines Suizid-Vektors kann ein Doppel-Crossing-over-Ereignis begünstigen, da der Vektor innerhalb des E. coli-Lysogens nicht aufrechterhalten werden kann. Kolonien von Stämmen, die potentiell rekombinante lambda-Prophagen tragen, erhalten aus einer Übernachtkultur auf LB-Agar-Platten (siehe Abschnitt A 9 oben), können durch PCR gescreent werden unter Verwendung von Primern, die auf dem sspC-Gen und lambda basieren, d.h. B1 und B8 oder B2 und B7 (siehe Abschnitt A). Das unter Verwendung eines der beiden Primerpaare resultierende PCR-Produkt sollte ungefähr 1,3 kb groß sein. Alternativ kann ein auf einer Induktion des lambda-Prophagen basierendes Verfahren eingesetzt werden, da ein SASP enthaltender Phage nicht länger ein funktionsfähiges S-Gen aufweisen wird und nicht in der Lage sein wird, deren Wirtszellen zu lysieren. Ein Screening kann ausgeführt werden durch entweder:
    • i) UV-Bestrahlung von transformierten Zellen gemäß Hendrix et al. (1983). Resuspendieren eines Aliquots von Zellen (20 μl) von oben (Schritt 9) bis zu einer maximalen Zellsuspension von 2 × 108 cfu in 10 ml eines geeigneten, nicht UV absorbierenden Suspensionsmediums (z.B. M9a oder PBS) in einer Standard-Petrischale (9 cm). Bestrahlen von Zellen unter Verwendung einer UV-Lichtquelle (maximale Leistungsabgabe 260 nm). Nach Bestrahlung werden induzierte Kulturen in M9a-Medium bei 37°C mit Belüftung inkubiert (wenn PBS als Suspensionsmedium verwendet wird, wird frisches steriles Vermehrungsmedium (1/10tel Volumen von 10× M9a) zugesetzt. Eine Photoreaktivierung wird verhindert, indem die bestrahlten Bakterien vor sichtbarem Licht geschützt werden.
    • ii) Induktion von thy–-lambda-Lysogenen durch Thymidin-Mangel gemäß Hendrix et al. (1983). Isolieren von thy-Mutanten (Miller, 1972): Der lysogene Stamm sollte in M9a-Medium, ergänzt mit 10 μg/ml Thymidin, bis zu 2 × 108 cfu/ml kultiviert werden. Zellen sollten gewaschen und in Thymidin-freiem M9a-Medium resuspendiert und dann bei 37°C 2 h inkubiert werden. Thymidin (10–25 μg/ml) sollte dann zu der Kultur zugesetzt werden und eine weitere Inkubation für 90–120 min bei 37°C ausgeführt werden.
    • iii) Temperaturverschiebungs-Induktion (wenn das lambda-clts-Lysogen verwendet wird), wie in Abschnitt A beschrieben.
    • 3. Man sollte Zellen ~2 h sich vermehren lassen (in Gegenwart von 0,2% Glucose, um Anzahlen von jeglichen Bindungsereignissen von freien (und dementsprechend potentiell SASP-freien) Phagen an nicht-lysierte Bakterienzellen zu verringern). Jegliche freie Phagen müssen von Zellen, die potentiell den SASP/Bakteriophagen enthalten, durch Zentrifugation (4000 Upm, 10 min, RT) abgetrennt werden. Pelletierte Zellen sollten in LB, enthaltend 0,2% Glucose, resuspendiert und die Inkubation ungefähr 1 h fortgesetzt werden. Zellen sollten zentrifugiert werden (4000 Upm, 10 min, RT), in LB (2 ml) resuspendiert und dann mit Chloroform (0,02 ml) lysiert werden. Aus Zellen nach einer Chloroform-induzierten Lyse freigesetzte reife Phagen sollten von Zellrückständen durch Zentrifugation (4000 Upm, 15 min, RT) abgetrennt werden.
    • 4. SASP enthaltender Bakteriophage sollte durch ein geeignetes Verfahren angereichert und gereinigt werden. Ein solches Verfahren besteht darin, eine sich vermehrende Kultur von empfänglichen E. coli-Zellen mit SASP-lambda zu infizieren und den obigen Schritt B 3 zu wiederholen.
    • 5. Das Vorhandensein von rekombinantem lambda sollte verifiziert werden, indem DNA aus mutmaßlichen SASP-lambda-Konstrukten isoliert und ein PCR-Screening ausgeführt wird, um das Vorhandensein des SASP-Gens unter Verwendung von geeigneten Primerpaaren zu bestätigen, wie in Abschnitt B 2 diskutiert. Mutmaßliche Konstrukte werden auch sequenziert und titriert, wie in Abschnitt A beschrieben.
  • C In vitro-Produktion (I)
  • Es ist möglich, einen lambda-Phagen, der ein SASP-Gen trägt, allein durch in vitro-Methoden herzustellen. Dies ist bewerkstelligt worden durch Insertion der sspC- und Cm-Resistenzgene in das R-Lysegen von lambda.
    • 1. Das lambda-Genom wurde mit KasI, dessen Erkennungssequenz eine einmalig vorkommende Restriktionsstelle in lambda, welche bei Base 45679 innerhalb des Peptidoglycanhydrolase kodierenden Gens, R, vorkommt, umfasst, verdaut. Dann wurde verdaute lambda-DNA dephosphoryliert.
    • 2. Das sspC-Gen wurde durch PCR amplifiziert mit einer Verlängerungszeit von 20 s unter Verwendung:
    • (i) eines Vorwärts-Primers, B13, umfassend eine PstI-Restriktionsenzymsequenz (mit bevorzugten strangaufwärts gelegenen Basen) und eine Sequenz strangaufwärts von der sspC-Ribosomenbindungsstelle (8). Die verwendete Ribosomenbindungsstelle ist jene von sspC selbst, könnte aber eine alternative Sequenz beinhalten mit dem Ziel, die Translation potentiell zu erhöhen (siehe Abschnitt A 12).
      Figure 00230001
    • ii) eines umgekehrten („reverse") Primers B8.
    • 3. Das sspC-PCR-Produkt wurde mit PstI und SpeI verdaut und an auf gleiche Weise verdauten, dephosphorylierten pBluescript SK (+) ligiert, wodurch pB/PIP erhalten wurde. Ein Cmr-Gen (siehe Abschnitt A 8) wurde in der entgegengesetzten Orientierung an der SpeI-Stelle am 3'-Ende des sspC-Gens inseriert, wodurch pB/PIPC erhalten wurde (9). 9 zeigt eine lineare Karte von pB/PIPC. Die Position der Primer B26 und B27 ist ebenfalls gezeigt.
    • 4. Das sspC/Cm-Fragment, das in pB/PIPC vorhanden ist, wurde durch PCR amplifiziert unter Verwendung:
    • i) eines Vorwärts-Primers, welcher eine KasI-Restriktionsenzymstelle vor der sspC-Ribosomenbindungsstellensequenz umfasst (siehe 9):
      Figure 00230002
    • ii) eines umgekehrten Primers, welcher ein KasI-Restriktionsenzym am Ende des Cmr-Gens umfasst (siehe 9):
      Figure 00230003
    • 5. Das resultierende PCR-Produkt wurde mit KasI verdaut und in ein auf gleiche Weise verdautes, dephosphoryliertes lambda-Genom ligiert (siehe Abschnitt C 1), wodurch SPPC-lambda erhalten wird (10).
    • 6. Die rekombinante lambda-DNA wurde in vitro gemäß der Methode von (Hohn und Murray, 1977) oder unter Verwendung eines Kits, wie Packagene (Promega), verpackt.
    • 7. Es wurden Reihenverdünnungen von verpacktem lambda (bis hinab zu 10–5) in Phagen-Puffer hergestellt. Ein Aliquot (100 μl) von jeder Verpackungsextrakt-Verdünnung wurde zu einer Ampulle, enthaltend 0,1 ml des E. coli-Stammes NM522, frisch kultiviert bis zu einer OD600 von 0,3 in LB, enthaltend 10 mM MgSO4 und 0,2% Maltose (Gew./Vol.), zugegeben.
    • 8. Die Voradsorptionsmischung wurde bei RT 20 min inkubiert, bevor die Mischung in 100 μl-Aliquots auf die getrocknete Oberfläche einer Chloramphenicol (10 μg/ml) enthaltenden LB-Agarplatte pipettiert wurde. Die Platten wurden umgewendet und über Nacht bei 30°C inkubiert.
    • 9. Kolonien, die nach Inkubation über Nacht vorhanden waren, waren mutmaßliche Lysogene, bei welchen das R-Lysegen von lambda durch Insertion durch das sspC-Gen inaktiviert worden war. Ungefähr 50 Kolonien wurden auf zwei LB-Platten, enthaltend Chloramphenicol (10 μg/ml), transferiert, und die Platten wurden über Nacht bei entweder 30°C oder 42°C inkubiert. Von Kolonien, die sich in Gegenwart von Chloramphenicol bei 30, nicht aber bei 42°C vermehrten, wurde angenommen, dass sie lambda-Lysogene, welche die sspC- und Cmr-Gene enthalten, darstellen. Ein RPPC-lambda-Konstrukt wurde isoliert und sequenziert, wie in Abschnitt A beschrieben, um die Integrität des sspC-Gens und Cm-Resistenzgens zu bestätigen und zu bestätigen, dass sie sich korrekt in das lambda-Genom integriert hatten. Es wurden Sequenzierungsprimer SEQL1F von Base 45613 bis Base 45629 (5'-CTATTTACTGATTACTC-3' (SEQ ID NO: 22)) und SEQL2R von Base 45792 bis Base 45776 (5'-CTTAATCTGCTGCAATG-3' (SEQ ID NO: 23)) verwendet (siehe 10).
  • D. In vitrolin vivo-Produktion unter Verwendung von Tandem-sspC-Genen
  • Es ist bereits festgestellt worden, dass zwischen α/β-Typ-SASP Protein-Protein-Kontakte gebildet werden, während diese an DNA gebunden sind (Hayes und Setlow, 1998). Es ist möglich, dass die Bildung von potentiellen Protein-Protein-Bindungsoberflächen, die durch DNA induziert wird, die weitere Addition von α/β-Typ-SASP-Molekülen an die Enden von an DNA gebundenen Protein-Clustern dirigieren und dementsprechend die Proteinbindung regulieren könnte (Hayes et al., 2000). Die anfängliche Bindungsrate von einigen (obwohl nicht allen) α/β-Typ-SASP ist zweiter Ordnung in Bezug auf die anfängliche Konzentration von ungebundenem Protein, was nahe legt, dass zwei SASP-Monomere für jedes produktive Bindungsereignis, das auftreten könnte, erforderlich sein könnten (Hayes et al., 2000). Angesichts dessen kann es bevorzugt sein, die Konzentration von SspC innerhalb der Zelle zu erhöhen. Abgesehen von einer Regulierung der Konzentration mittels eines starken Promotors oder, wie in Abschnitt A 12 diskutiert, einer Translationsenhancersequenz und einer Consensus-Ribosomenbindungsstelle mit einer optimierten Spacer-Region, um die Translation von SASP zu verstärken, können zwei SASP-Gene in Tandem-Anordnung in das lambda-Genom inseriert werden. Es ist möglich, dies unter Verwendung von, z.T., Primern und Methoden, die in früheren Abschnitten angegeben worden sind, zu erzielen.
  • Um beispielsweise Tandem-sspC-Gene anstelle des S-Gens von lambda zu erzeugen, sollte das sspC-Gen durch PCR unter Verwendung von Primern (B6) oder (B7) mit einem umgekehrten Primer (B15) amplifiziert werden (11);
  • Figure 00250001
  • In 11 sind die Tandem-sspC-Gene zusammen mit den Primern, die verwendet wurden, um die Gene vor einer Ligation in das inverse PCR-Produkt von pB/LF1 durch PCR zu amplifizieren, gezeigt. Die Produkte der Primer B6 oder B7 und B15 werden in das inverse PCR-Produkt von pB/LF1, welches unter Verwendung der Primer B3 und B5 oder B4 und B5 amplifziert worden ist (siehe 2), ligiert. Die resultierenden Plasmide, pB/SAPB2 bzw. pBSAPO2, werden dann mit MluI und SpeI verdaut und das auf gleiche Weise verdaute PCR-Produkt der Primer B16 und B8 wird inseriert, um entweder pB/SABP2T bzw. pB/SAPO2T zu erhalten.
  • Der Primer B15 ist ähnlich zu B8 mit der Ausnahme, dass er eine einmalig vorkommende Restriktionssequenz, d.h. für MluI, zwischen der sspC-Sequenz und der SpeI-Erkennungssequenz umfasst. Für das zweite sspC-Gen sollte der Primer B8 verwendet werden mit einem Vorwärts-Primer (B16), der die gleiche sspC-Sequenz wie die Primer B13 und B23 umfasst, aber eine Restriktionsstelle beinhaltet, die mit dem sspC-PCR-Produkt, das ausgehend von dem Primer B15 produziert wird, verträglich ist (d.h. MluI) (11):
  • Figure 00250002
  • Obwohl die angegebene rbs-Sequenz jene von sspC selbst ist, könnte eine alternative Leader-Sequenz ersatzweise verwendet werden, um die Expression dieses zweiten sspC-Gens zu beeinflussen (siehe Abschnitt A 12).
  • Das aus einer Amplifizierung von sspC unter Verwendung der Primer B6 oder B7 und B15 resultierende PCR-Produkt sollte mit dem inverse PCR-Produkt des Plasmids pB/LF1, amplifiziert, wie in Abschnitt A beschrieben, ligiert werden. Das resultierende Plasmid pB/SAPB2 bzw. pB/SAPO2 sollte dann mit MluI und SpeI verdaut und dephosphoryliert werden. Das aus einer Amplifizierung von sspC unter Verwendung der Primer B16 und B8 resultierende PCR-Produkt sollte mit MluI und SpeI verdaut und mit einem der obigen verdauten Plasmide ligiert werden, um entweder das Plasmid pB/SAPB2T oder pB/SAPO2T zu erhalten. Wieder kann ein Cmr-Gen an der SpeI-Stelle am Ende des zweiten sspC-Gens inseriert werden. Eine Integration dieses Konstrukts in lambda kann bewerkstelligt werden, wie zuvor in Abschnitt A beschrieben.
  • Alternativ könnte ein unterschiedliches SASP-Gen, wie SASPβ aus Clostridium bifermentans, nach dem sspC-Gen oder für sich allein inseriert werden, da SASPβ eine größere DNA-Bindungsaffinität als sspC aufweist, obwohl es weniger gut charakterisiert ist (Hayes et al., 2000).
  • E BEISPIELE DER WIRKUNG VON SASP
    • 1. Eine beispielhafte Vorgehensweise zum Testen der in vitro-Wirksamkeit von durch einen Bakteriophagen, der ein sspC-Gen trägt, abgegebenem SASP, um eine Reduktion der Lebensfähigkeit von E. coli-Zellen zu bewirken, ist, wie folgt:
    • i. Der zu infizierende E. coli-Stamm wird über Nacht ausgehend von einer eingefrorenen Stammlösung oder einer frischen Agarplatte in λLB (LB, enthaltend 0,2% Maltose und 10 mM MgSO4) kultiviert.
    • ii. Diese Übernachtkultur wird verwendet, um 3 ml λLB (bis zu einer OD600 von 0,02) zu inokulieren, die dann bei 37°C unter Schütteln bei 350 Upm kultiviert werden, bis die OD600 ungefähr 0,3 erreicht. Ein Aliquot von dieser Kultur (1 ml) wird dann direkt verwendet oder es werden 100 μl verwendet, um Reihenverdünnungen in 0,9 ml λLB herzustellen, wie geeignet, so dass das Verhältnis von Phagenzahlen zu Zellzahlen, wie erforderlich, variiert werden kann.
    • iii. Aliquots (1 ml) von dieser Zellkultur werden dann in ein steriles Universal-Röhrchen transferiert und es wird Phagenlysat oder eine Verdünnung von Phagenlysat (hergestellt, wie zuvor beschrieben) (1 ml) zugesetzt. Die Zell/Phagen-Mischung wird bei 37°C ohne Schütteln 30 min inkubiert und dann werden 2 ml frisches λLB zugesetzt.
    • iv. Die OD600 von jeder Testprobe wird bestimmt und ein Aliquot (100 μl) wird entfernt, in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt und 100 μl von geeigneten Verdünnungen werden auf LB-Platten ausgebreitet. Eine Inkubation der Proben und von Kontrollen wird bei 37°C unter Schütteln bei 250 Upm fortgesetzt und zu geeigneten Zeitpunkten, beispielsweise stündlich, wird dieser Schritt wiederholt.
    • v. Platten werden über Nacht bei 37°C inkubiert und am folgenden Tag wird die Anzahl von Kolonie-bildenden Einheiten (cfu) auf jeder Platte bestimmt.
    • 2. Typische Ergebnisse (aus 4 Experimenten) einer Infektion von Zellen durch diese Vorgehensweise mit beispielsweise SSPC-lambda sind in der folgenden Tabelle angegeben. TABELLE 1: Lebensfähigkeit von E. coli-Zellen nach einer Infektion mit SSPC-lambda
      Figure 00270001
      E. coli-Zellen wurden bis zu einer OD600 von 0,35 kultiviert, was ungefähr 1,4 × 108 Zellen/ml entsprach. Ein Aliquot (1 ml) Zellkultur wurde mit ungefähr 1 × 1010 SSPC-lambda-Phagen (1 ml Lysat, enthaltend ungefähr 1010 Phagen/ml), wie zuvor beschrieben, vor der Zugabe von 2 ml frischem LB infiziert. Anhand von vier Infektionsexperimenten ist beobachtet worden, dass es 30 min nach der Infektion von E. coli mit SSPC-lambda einen ≥ 60%-igen Abfall der Zelllebensfähigkeit verglichen mit Zellzahlen vor der Infektion gibt; dieser Abfall der Zelllebensfähigkeit nimmt routinemäßig bis auf ≥ 95% zum Zeitpunkt 3 h nach der Infektion zu. Die Abnahme der Zelllebensfähigkeit, entnommen aus dem in Tabelle 1 detailliert aufgeführten Experiment, ist in 12 gezeigt.
    • 3. Die vorangegangenen Daten können mit jenen verglichen werden, die routinemäßig nach einer Produktion von SspC in einem Stamm, welcher ein das sspC-Gen enthaltendes Expressionsplasmid trägt, beobachtet werden. Es ist ein solches Plasmid, (pET/PIP), konstruiert worden, in welchem das sspC-Gen in den Expressionsvektor pET24d (Novagen) inseriert ist. In diesem Plasmid steht sspC unter der Kontrolle des T7-RNA-Polymerasegen-Promotors und die Produktion von SspC wird durch das Vorhandensein von 0,2% Glucose in dem Vermehrungsmedium in großem Umfang reprimiert und durch die Zugabe von IPTG (in einer Konzentration von 1 mM) induziert. Sequenzdaten, die unter Verwendung der Standardprimer T7 und B8 erhalten worden sind, die die Insertion von sspC und dessen Integrität bestätigen, sind in Anhang 7 angegeben. Tabelle 2 führt detailliert typische Ergebnisse (aus 3 Experimenten) auf, die erhalten wurden, wenn der Stamm PTL14 (E. coli-Stamm BL21 λDE3, welcher pET/PIP enthält), wie folgt, kultiviert wird:
    • i) Der Stamm PTL14 wurde in 25 ml Kanamycin (30 μg/ml) enthaltendem LB in einem 100 ml-Kolben bei 37°C unter Schütteln bei 250 Upm bis zu einer OD600 von 0,25 vermehrt. Die Kultur wurde dann aufgeteilt, wobei 12,5 ml in einen frischen 100 ml-Kolben transferiert wurden.
    • ii) Die Kultur in einem der Kolben wurde durch die Zugabe von IPTG (in einer Konzentration von 1 mM) induziert und beide Kolben wurden bei 37°C unter Schütteln bei 350 Upm inkubiert. Aliquots (0,5 ml) wurden aus den Kontroll- und Probenkulturen unmittelbar vor der Induktion und in 30–60 min-Intervallen danach 3 h lang und nach 24 h entnommen.
    • iii) Diese Aliquots wurden verwendet, um OD600-Ablesungen zu erhalten, und auch verwendet, um Reihenverdünnungen, wie geeignet, in LB herzustellen, und in 100 μl-Aliquots auf Kanamycin (30 μg/ml) enthaltenden LB-Agar-Platten verteilt. Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert und Kolonie-bildende Einheiten (cfu) auf jeder Platte wurden gezählt und verwendet, um die cfu pro ml zu bestimmen. Diese Experimente bestätigten, dass eine Abgabe des sspC-Gens an Zellen über ein Plasmid und nach einer Expression von SspC zu einer massiven Verringerung der Zelllebensfähigkeit führt. 24 h nach der Induktion nimmt die Lebensfähigkeit von Zellen, die den pET/PIP-Vektor tragen, geringfügig zu als Ergebnis von Wirt- und/oder Plasmid-Mutationen, die die SspC-Expression beeinträchtigen. TABELLE 2: Vermehrung des Stammes PTL14, welcher das sspC-Gen innerhalb von pET24d (Novagen) enthält, in Abwesenheit (uninduziert) oder Anwesenheit (induziert) von IPTG (1 mM)
      Figure 00280001
      Die beobachtete Verringerung der Zelllebensfähigkeit in Zellen, die sspC exprimieren, wird unterstützt durch Daten, die nach einer Isolierung von Plasmid-DNA aus dem Stamm PTL14, der wie oben detailliert angegeben kultiviert und induziert oder reprimiert worden war, erhalten wurden. Als eine Negativkontrolle wurde der E. coli-Stamm NM522 ebenfalls mit dem Plasmid pET/PIP transformiert (wodurch der Stamm PTL38 erhalten wurde), da NM522 den T7-RNA-Polymerase-Promotor nicht enthält und folglich keine Expression von sspC auftreten kann. Plasmid-DNA aus dem Stamm PTL14 (induziert und uninduziert) und dem Stamm PTL38, die parallel kultiviert wurden, wurde gemäß dem Protokoll von Kieser (1984) isoliert. Um Plasmid-Supercoil-Bildung zu entspannen, wurde Plasmid-DNA aus jeder Probe (0,5–1 μg) mit Topoiso merase I (2 Einheiten) 2 h bei 37°C inkubiert. Die DNA wurde dann durch TAE-Agarose-Gelelektrophorese (5 h bei 4,5 V/cm) in Gegenwart von 0,06 μg/ml Ethidiumbromid (Keller, 1975) aufgetrennt. Nach Sichtbarmachung durch UV-Durchleuchtung wurde das Gel photographiert, wie in 13 gezeigt, die Bandenmuster von Plasmid-DNA, hergestellt aus Stämmen, die ±Produktion von SspC kultiviert worden waren, zeigt. Die Bahnen sind, wie folgt: Bahn 1 1 kb-DNA-Leiter (0,25 μg Gesamt-DNA) Bahn 2 Uninduziertes pET/PIP in dem E. coli-Stamm BL21 λDE3 (PTL14) Bahn 3 Induziertes pET/PIP in dem E. coli-Stamm BL21 λDE3 (PTL14) Bahn 4 Induziertes pET/PIP in dem E. coli-Stamm BL21 λDE3 (PTL14), Doppel-Präparation Bahn 5 Uninduziertes pET/PIP in dem E. coli-Stamm NM522 (PTL38). Anhand eines Vergleichs mit pET/PIP-DNA, die aus dem Stamm PTL38 präpariert worden ist, gibt es eine klare Veränderung bei den Plasmid-DNA-Formen in Gegenwart von SspC, die unter Induktionsbedingungen (Bahnen 3 und 4) stärker ausgeprägt ist. Eine viel geringer ausgeprägte Veränderung im Profil ist auch unter Bedingungen einer leckenden T7-RNA-Polymerase-Expression in der uninduzierten Probe (Bahn 2) vorhanden. Die hauptsächlichen Profilveränderungen, die mit dem hohen Ausmaß an SspC-Expression verbunden sind, sind:
    • i) Verzögerung der monomeren supergeknäuelten (Supercoil) Form (1 m S/C) (Bahnen 3 und 4) bezogen auf den uninduzierten Stamm BL21 (Bahn 2) und den Stamm PTL38 (Bahn 5).
    • ii) Erzeugung von diffusen Banden, die hinter der monomeren linearen/offenen zirkulären Form laufen (Bahnen 3 und 4). Die Verzögerung der monomeren supergeknäulten Plasmid-pET/PIP-Form, wenn eine T7-RNA-Polymerase-Expression induziert wird (Bahnen 3 und 4), und insbesondere die diffusen Banden in den Bahnen 3 und 4 sind charakteristisch für DNA-Protein-Komplexe. Das Fehlen von diesen Banden in Plasmid-DNA aus uninduzierten Zellen (Bahn 5) ist konsistent mit der Verzögerung und damit, dass diffuse Banden durch Komplexe zwischen pET/PIP-DNA und SspC-Protein gebildet werden. Diese Daten zeigen, dass ausgehend von einer Plasmid-Form exprimiertes SspC ebenfalls so angesehen werden kann, dass es eine potentielle Anwendung in Pestizid- oder GM-Pflanzen-Anwendungen finden kann.
    • 4. Um die Bedeutung des Expressionsniveaus von sspC zu zeigen, ist ein lambda-Phage konstruiert worden, in welchem das sspC-Gen in das S-Gen inseriert ist, aber unter Verwendung der T7-RNA-Polymerase-Ribosomenbindungsstelle. Dieser Stamm (ST7PC) wurde auf eine identische Weise wie SSPC-Lambda konstruiert mit Ausnahme dessen, dass die T7-rbs ersatzweise anstelle der nativen sspC-rbs vorhanden ist. Indem dem für eine SSPC-lambda-Infektion verwendeten Protokol gefolgt wird, führt ein Infizieren von Zellen mit ST7PC-lambda zu einem temporär beschleunigten Verlust an Lebensfähigkeit. Beispielsweise wird in einem typischen Experiment eine ≥ 95%-ige Verringerung der Zelllebensfähigkeit 1 h nach der Infektion festgestellt mit einer ≥ 99%-igen Verringerung innerhalb von 3 h (siehe Tabelle 3). Diese Ergebnisse zeigen an, dass das Verwenden einer alternativen rbs ein Mittel, um Expressionsniveaus von SspC zu modulieren, bereitstellt.
  • TABELLE 3: Lebensfähigkeit von Zellen nach einer Infektion mit ST7PC-lambda
    Figure 00300001
  • Figure 00310001
  • Figure 00320001
  • Figure 00330001
  • Figure 00340001
  • ANHANG 3 DNA-Sequenz von sspC, welches SASP C kodiert, aus Bacillus subtilis Stamm 168 (erhalten von Subtilist beim Institut Pasteur)
    Figure 00350001
  • Anmerkung:
    • Dass sspC-Gen erstreckt sich von 1–219 (einschließlich).
    • Die Terminator-Sequenz erstreckt sich von 225–243 (einschließlich).
  • ANHANG 4
  • Eine Liste von üblichen Pathogenen und einigen von deren Phagen. (Diese Liste ist repräsentativ, aber nicht erschöpfend).
  • Coliphagen:
    • Bakteriophage lambda
    • Bakteriophage 933W (Escherichia coli O157:H7)
    • Bakteriophage VT2-Sa (E. coli O157:H7)
    • Coliphage 186
    • Coliphage P1
    • Coliphage P2
    • Coliphage N15
    • Bakteriophage T3
    • Bakteriophage T4
    • Bakteriophage T7
    • Bakteriophage KU1
  • Bakteriophagen von Salmonella spp.
    • Bakteriophage Felix
    • Bakteriophage P22
    • Bakteriophage L
    • Bakteriophage 102
    • Bakteriophage 31
    • Bakteriophage F0
    • Bakteriophage 14
    • Bakteriophage 163
    • Bakteriophage 175
    • Bakteriophage Vir
    • Bakteriophage ViVl
    • Bakteriophage 8
    • Bakteriophage 23
    • Bakteriophage 25
    • Bakteriophage 46
    • Bakteriophage E15
    • Bakteriophage E34
    • Bakteriophage 9B
  • Bakteriophagen von Shigella dysenteriae
    • Bakteriophage ϕ80
    • Bakteriophage P2
    • Bakteriophage 2
    • Bakteriophage 37
  • Bakteriophagen von Vibrio cholerae
    • Bakteriophage fs-2
    • Bakteriophage 138
    • Bakteriophage 145
    • Bakteriophage 149
    • Bakteriophage 163
  • Bakteriophagen von Mycoplasma arthrititdis
    • Bakteriophage MAV1
  • Bakteriophagen von Streptococci
    • Bakteriophage CP-1
    • Bakteriophage ϕXz40
    • Bakteriophage 1A
    • Bakteriophage 1B
    • Bakteriophage 12/12
    • Bakteriophage 113
    • Bakteriophage 120
    • Bakteriophage 124
  • Bakteriophagen von Pseudomonas aeruginosa
    • Bakteriophage D3
    • Bakteriophage ϕCTX
    • Bakteriophage PP7
  • Bakteriophagen von Haemophilus influenzae
    • Bakteriophage S2
    • Bakteriophage HP1
    • Bakteriophage flu
    • Bakteriophage Mu
  • Bakteriophagen von Staphylococcus aureus
    • Bakteriophage Twort
    • Bakteriophage tIII-29S
    • Bakteriophage ϕPVL
    • Bakteriophage ϕPV83
    • Bakteriophage ϕ11
    • Bakteriophage ϕ12
    • Bakteriophage ϕ13
    • Bakteriophage ϕ42
    • Bakteriophage ϕ812
    • Bakteriophage K
    • Bakteriophage P3
    • Bakteriophage P14
    • Bakteriophage UC18
    • Bakteriophage 15
    • Bakteriophage 17
    • Bakteriophage 29
    • Bakteriophage 42d
    • Bakteriophage 47
    • Bakteriophage 52
    • Bakteriophage 53
    • Bakteriophage 79
    • Bakteriophage 80
    • Bakteriophage 81
    • Bakteriophage 83
    • Bakteriophage 85
    • Bakteriophage 93
    • Bakteriophage 95
    • Bakteriophage 187
  • Bakteriophagen von Chlamydien
    • Bakteriophage ϕCPAR39
  • Mycobakteriophagen
    • Bakteriophage L5
    • Bakteriophage LG
    • Bakteriophage D29
    • Bakteriophage Rv1
    • Bakteriophage Rv2
    • Bakteriophage DSGA
  • Bakteriophagen von Listeria monocytogenes
    • Bakteriophage A118
    • Bakteriophage 243
    • Bakteriophage A500
    • Bakteriophage A511
    • Bakteriophage 10
    • Bakteriophage 2685
    • Bakteriophage 12029
    • Bakteriophage 52
    • Bakteriophage 3274
  • Bakteriophagen von Klebsiella pneumoniae
    • Bakteriophage 60
    • Bakteriophage 92
  • Bakteriophagen von Yersinia pestis
    • Bakteriophage R
    • Bakteriophage Y
    • Bakteriophage P1
  • ANHANG 5
  • Eine Liste von Bakteriophagen-Rezeptoren und -Liganden aus Bakterien und anderen Zellen. (Diese Liste ist repräsentativ, aber nicht erschöpfend).
    Rezeptor/Ligand Phage
    Porine (OmpA, OmpC und LamB u.s.w.) (z.B. Proteine, die beteiligt sind an dem Transport von spezifischen Substraten: Phosphaten, Nukleosiden, Eisen, Vitamin B12, Maltose und Maltodextrinen) Lambda und andere Coliphagen, wie „T-Even"-Coliphage O×2, Wirtsspektrum-Mutante des O×2-Coliphagen
    Peptidoglycan Phage A25 (Gruppe A-Streptokokken) Listeria monocytogenes-Phage Coliphage T5
    N-Acetylglucosamin und Rhamnose-Substituenten von Teichonsäuren Listeria monocytogenes-Phage
    L-Rhamnose Phage PL-1 (Lactobacillus casei)
    Exopolysaccharide und Lipopolysaccharide Siphovirus-Phage NM8 (Rhizobium meliloti) Wirtsspektrum-Mutante des O×2-Coliphagens
    Teichonsäure Phagen SP 50 und ϕ25 (Bacillus subtilis)
    Modifizierte Rezeptor/Ligand-Affinitäten
    Fibroblastenwachstumsfaktor-Rezeptor Phage M13, der FGF auf Hüllen aufweist
    Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor Phage M13, der EGF auf Hüllen aufweist
  • ANHANG 6 Sequenzdaten aus SSPC-LAMBDA (nur positiver Strang), erhalten unter Verwendung der Primer:
    Figure 00410001
  • Figure 00420001
  • ANHANG 7 Sequenzdaten aus pET/PIP (nur positiver Strang), erhalten unter Verwendung der Primer:
    Figure 00430001
  • REFERENZEN
    • Cao, J., Y. Sun, T. Berlindh, B. Mellgard, Z. Li, B. Mardh und S. Mardh. 2000. Biochim. Biophys. Acta. 1474: 107–113.
    • Donnellan, J. E. jnr. und R. B. Setlow, 1965. Science. 149: 308–310.
    • Fairhead, H. und P. Setlow. 1991. J. Bacteriol. 174: 2874–2880.
    • Fairhead, H., B. Setlow und P. Setlow. 1993. J. Bacteriol. 175: 1367–1374.
    • Hawes Hackett, R. und P. Setlow. 1987. J. Bacteriol. 169: 1985–1992.
    • Hayes, C. S., Z-Y. Peng und P. Setlow. 2000. J. Biol. Chem. im Druck.
    • Kassner, P. D., A. A. Burg, A. Baird und D. Larocca. 1999. Biochem. Biophys. Res. Commun. 264: 921–928.
    • Keller, W. 1975. Determination of the number of superhelical turns in simian virus 40 DNA by gel electrophoresis. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 72: 4876–4880.
    • Kieser, T. 1984. Factors affecting the isolation of CCC-DNA from Streptomyces lividans and E. coli. Plasmid 22: 19–36.
    • Larocca, D., A. Witte, W. Johnson, C. G. Pierce und A. Baird. 1998. Hum. Gene Ther. 9: 2393–2399.
    • Larocca, D., P. Kassner, A. Witte, R. Ladner, G. F. Pierce und A. Baird. 1999. FASEB J. 13: 727–734.
    • Mohr, S. C., N. V. H. A. Sokolov, C. He und Peter Setlow. 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 77–81.
    • Nicholson, W. L., und P. Setlow, 1990. J. Bacteriol. 172: 7–14.
    • Nicholson, W. L., B. Setlow und P. Setlow. 1990a. J. Bacteriol. 172: 6900–6906.
    • Nicholson, W. L., B. Setlow und P. Setlow. 1990b. J. Bacteriol. 173: 1642–1653.
    • Nicholson, W. L., B. Setlow und P. Setlow. 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8288–8292.
    • Pohle, W. und H. Fritzche. 1980. Nucleic Acids Res. 8: 2527–2535.
    • Poul, M. und J. D. Marks. 1999. J. Mol. Biol. 288: 203–211.
    • Sambrook, J., E. F. Fritsch, T. Maniatis, 1989. In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSHL Press.
    • Setlow, B., A. R. Hand und P. Setlow. 1991. J. Bacteriol. 173: 1642–1653.
    • Setlow, B., D. Sun und P. Setlow. 1992. J. Bacteriol. 174: 2312–2322.
    • Setlow, P. 1988. Ann. Rev. Mcrobiol. 42: 319–338.
    • de Vries, G. E., C. K. Raymond und R. A. Ludwig. 1984 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6080–6084.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00460001
  • Figure 00470001
  • Figure 00480001
  • Figure 00490001
  • Figure 00500001
  • Figure 00510001
  • Figure 00520001
  • Figure 00530001
  • Figure 00540001
  • Figure 00550001
  • Figure 00560001
  • Figure 00570001
  • Figure 00580001
  • Figure 00590001
  • Figure 00600001
  • Figure 00610001
  • Figure 00620001
  • Figure 00630001
  • Figure 00640001
  • Figure 00650001
  • Figure 00660001
  • Figure 00670001
  • Figure 00680001
  • Figure 00690001
  • Figure 00700001
  • Figure 00710001
  • Figure 00720001
  • Figure 00730001
  • Figure 00740001

Claims (31)

  1. Polypeptid mit α/β-Typ-SASP-Aktivität zur Verwendung als Arzneimittel.
  2. Polypeptid nach Anspruch 1, welches die Aminosäuresequenz: mannnssnsnellvpgaeqaidqmkyeiasefgvnlgadttarangsvggeitkrlvqlaeqqlgggtk (SEQ ID NR: 1) umfasst, zur Verwendung als Arzneimittel.
  3. Polypeptid nach Anspruch 1, welches eine beliebige der Aminosäuresequenzen von SEQ ID NR: 26–52 umfasst, zur Verwendung als Arzneimittel.
  4. Polypeptid nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, welches Mutationen und/oder Deletionen umfasst, die die α/β-Typ-SASP-Aktivität davon nicht verringern, zur Verwendung als Arzneimittel.
  5. Verwendung eines Polypeptids, wie in einem der vorangegangenen Ansprüche definiert, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung oder Verhütung der Vermehrung von Zellen von Mikroorganismen.
  6. Verwendung nach Anspruch 5, wobei die Vermehrung von Zellen eine bakterielle Zellvermehrung umfasst.
  7. Verwendung nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, welche zur Herstellung eines Arzneimittels für eine Therapie beim Menschen dient.
  8. Verwendung nach Anspruch 7, welche zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von lokalen Infektionen, Zahnkaries, Atemwegsinfektionen, Augeninfektionen oder lokalisierten Organinfektionen dient.
  9. Verwendung eines Polypeptids, wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert, als ein mikrobielles Dekontaminationsmittel.
  10. Verwendung nach Anspruch 9, welche das Behandeln einer oberflächlichen mikrobiellen Kontamination, eine Bodensanierung oder eine Wasserbehandlung umfasst.
  11. Verwendung eines Polypeptids, wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert, als ein antimikrobielles Mittel bei der Behandlung von Pflanzenmaterial.
  12. Verwendung eines Polypeptids, wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert, bei der nicht-therapeutischen Behandlung von tierischen Ektoparasiten, um Darmbakterien daraus zu entfernen.
  13. Polynukleotid, welches ein Polypeptid, wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert, kodiert, zur Verwendung als Arzneimittel.
  14. Polynukleotid nach Anspruch 13, welches DNA umfasst, zur Verwendung als Arzneimittel.
  15. Polynukleotid nach Anspruch 14, welches das sspC-Gen aus B. subtilis umfasst, zur Verwendung als Arzneimittel.
  16. Verwendung eines Polynukleotids nach einem der Ansprüche 14 bis 16 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung oder Verhütung der Vermehrung von Zellen von Mikroorganismen.
  17. Verwendung nach Anspruch 16, wobei das Arzneimittel das Polynukleotid umfasst.
  18. Verwendung nach Anspruch 16 oder Anspruch 17, wobei die Vermehrung von Zellen eine bakterielle Zellvermehrung umfasst.
  19. Verwendung nach einem der Ansprüche 16 bis 18, welche zur Herstellung eines Arzneimittels für eine Therapie beim Menschen dient.
  20. Verwendung nach einem der Ansprüche 16 bis 19, welche zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von lokalen Infektionen, Zahnkaries, Atemwegsinfektionen, Augeninfektionen oder lokalisierten Organinfektionen dient.
  21. Zusammensetzung zur Hemmung oder Verhütung von Zellvermehrung, umfassend ein Polynukleotid, wie in einem der Ansprüche 13 bis 15 definiert, und ein Abgabesystem dafür, welches in der Lage ist, eine Zelle zielgerichtet anzusteuern.
  22. Zusammensetzung nach Anspruch 21, wobei das Abgabesystem ein Virus umfasst und das Polynukleotid in das Genom des Virus eingefügt ist.
  23. Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei das Virus einen Bakteriophagen, der in der Lage ist, ein Bakterium zielgerichtet anzusteuern, umfasst.
  24. Zusammensetzung nach Anspruch 23, wobei der Bakteriophage ein nicht-lysogener Bakteriophage ist.
  25. Zusammensetzung nach Anspruch 24, wobei der nicht-lysogene Bakteriophage einen lysogenen Bakteriophagen mit wenigstens einem inaktivierten Lyse-Gen umfasst.
  26. Zusammensetzung nach Anspruch 25, wobei das wenigstens eine Lyse-Gen durch Insertion des Polynukleotid inaktiviert ist.
  27. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 22 bis 26, wobei das Virus modifiziert worden ist, um dessen Wirtsspezifität zu erhöhen oder zu verändern.
  28. Verwendung eines Polynukleotids, wie in einem der Ansprüche 14 bis 16 definiert, als ein mikrobielles Dekontaminationsmittel.
  29. Verwendung nach Anspruch 28, welche das Behandeln einer oberflächlichen mikrobiellen Kontamination, eine Bodensanierung oder eine Wasserbehandlung umfasst.
  30. Verwendung eines Polynukleotids, wie in einem der Ansprüche 13 bis 15 definiert, als ein antimikrobielles Mittel bei der Behandlung von Pflanzenmaterial.
  31. Verwendung eines Polynukleotids, wie in einem der Ansprüche 13 bis 15 definiert, bei der nicht-therapeutischen Behandlung von tierischen Ektoparasiten, um Darmbakterien daraus zu entfernen.
DE60125232T 2000-11-17 2001-11-16 Kleines säurelösliches sporenprotein und seine verwendungen Expired - Lifetime DE60125232T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0028130.3A GB0028130D0 (en) 2000-11-17 2000-11-17 Polypeptide and uses thereof
GB0028130 2000-11-17
PCT/GB2001/005061 WO2002040678A1 (en) 2000-11-17 2001-11-16 Small acid-soluble spore protein and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE60125232D1 DE60125232D1 (de) 2007-01-25
DE60125232T2 true DE60125232T2 (de) 2007-05-31

Family

ID=9903398

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE60125232T Expired - Lifetime DE60125232T2 (de) 2000-11-17 2001-11-16 Kleines säurelösliches sporenprotein und seine verwendungen

Country Status (12)

Country Link
US (2) US7632512B2 (de)
EP (1) EP1343896B1 (de)
JP (1) JP4225780B2 (de)
AT (1) ATE348167T1 (de)
AU (2) AU2002223814B2 (de)
CA (1) CA2428662C (de)
DE (1) DE60125232T2 (de)
DK (1) DK1343896T3 (de)
ES (1) ES2276856T3 (de)
GB (1) GB0028130D0 (de)
PT (1) PT1343896E (de)
WO (1) WO2002040678A1 (de)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0314469D0 (en) * 2003-06-20 2003-07-23 Phico Therapeutics Ltd Antimicrobial compositions and uses thereof
US7674621B2 (en) 2004-05-21 2010-03-09 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Plasmids and phages for homologous recombination and methods of use
FR2910492B1 (fr) * 2006-12-20 2013-02-15 Bio Modeling Systems Ou Bmsystems Procede de preparation de bacteriophages modifies par insertion de sequences aleatoires dans les proteines de ciblage desdits bacteriophages
GB0715416D0 (en) * 2007-08-07 2007-09-19 Phico Therapeutics Ltd Modified bacteriophage
GB201417810D0 (en) 2014-10-08 2014-11-19 Phico Therapeutics Ltd Modifying bacteriophage
GB201417808D0 (en) * 2014-10-08 2014-11-19 Phico Therapeutics Ltd Modified bacteriophage
GB201417811D0 (en) * 2014-10-08 2014-11-19 Phico Therapeutics Ltd Modifying bacteriophage
GB201417805D0 (en) 2014-10-08 2014-11-19 Phico Therapeutics Ltd Modifield bacteriophage
JP7166244B2 (ja) 2016-04-08 2022-11-07 フィコ セラピューティクス リミテッド 改変バクテリオファージ
LT3440200T (lt) 2016-04-08 2021-05-25 Phico Therapeutics Ltd Modifikuotas bakteriofagas

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995027043A1 (en) 1994-04-05 1995-10-12 Exponential Biotherapies, Inc. Antibacterial therapy with genotypically modified bacteriophage
CA2329908A1 (en) 1998-04-24 1999-11-04 The Regents Of The University Of California Targeted gene delivery to cells by filamentous bacteriophage
WO2000003018A2 (en) * 1998-07-10 2000-01-20 Loyola University Of Chicago Antibiotic protein and method of production
CA2430501A1 (en) 2000-01-11 2001-07-19 Intralytix, Inc. Method for produce sanitation using bacteriophages

Also Published As

Publication number Publication date
ES2276856T3 (es) 2007-07-01
CA2428662C (en) 2010-10-05
JP2004513647A (ja) 2004-05-13
PT1343896E (pt) 2007-02-28
ATE348167T1 (de) 2007-01-15
US20100209393A1 (en) 2010-08-19
EP1343896A1 (de) 2003-09-17
US7632512B2 (en) 2009-12-15
CA2428662A1 (en) 2002-05-23
GB0028130D0 (en) 2001-01-03
WO2002040678A1 (en) 2002-05-23
US20040097705A1 (en) 2004-05-20
US8133498B2 (en) 2012-03-13
AU2381402A (en) 2002-05-27
DE60125232D1 (de) 2007-01-25
JP4225780B2 (ja) 2009-02-18
DK1343896T3 (da) 2007-04-10
EP1343896B1 (de) 2006-12-13
AU2002223814B2 (en) 2007-08-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8133498B2 (en) Use of polynucleotides encoding small acid-soluble spore protein for inhibiting bacterial cell growth and/or treating bacterial infections
EP2694535B1 (de) Mittel zur behandlung von mikrobiellen erkrankungen bei kulturpflanzen
JP2010207227A (ja) 新規な抗菌性ポリペプチド及び使用方法
Donmez Ozkan et al. Nematode-associated bacteria: Production of antimicrobial agent as a presumptive nominee for curing endodontic infections caused by Enterococcus faecalis
JP2010535482A (ja) 改変バクテリオファージ
DE60034879T2 (de) Lantibiotikum
KR20070118072A (ko) 식료품 처리 방법
WO2009087356A1 (en) Host range change phage
AU2002223814A1 (en) Small acid-soluble spore protein and uses thereof
Das et al. Anticandidal potential of endophytic bacteria isolated from Dryopteris uniformis (Makino)
KR102071706B1 (ko) 박테리오파지 pp2 및 카로신 d를 포함하는 채소 무름병 방제용 조성물 및 이의 용도
EP1023453B1 (de) Tgc-verfahren zur induktion einer zielgerichteten, somatischen transgenität
DE19642729C2 (de) Polynukleotide und die durch diese kodierten Proteine, geeignet zur Bekämpfung von Blatthornkäfern
KR970006163B1 (ko) 도열병의 방제 활성을 갖는 신균주 및 그로부터 분리한 유전자 단편
RU2777518C2 (ru) Композиции и соответствующие способы контроля заболеваний, передаваемых переносчиками
US20230309565A1 (en) Pseudomonas strains and their metabolites to control citrus huanglongbing and related diseases
DE19914817A1 (de) Wirkstoffe zur Bekämpfung von bakteriellen Infektionserkrankungen
RU2804136C2 (ru) Композиции и соответствующие способы контроля заболеваний, передаваемых переносчиками
JPH0380074A (ja) バシラス・チューリンジエンシス変種ドネガニ、鞘翅目類に対して殺虫作用を有するそれから得られる製剤または毒素
KR20190132331A (ko) 신규한 녹농균 특이 박테리오파지 pa4 및 이를 포함하는 항균 조성물
KR20010072765A (ko) 병원성 진균에 대한 항진균 활성을 가지는 미생물, 이를함유하는 항진균성 미생물 농약제 및 그의 제조방법
Moya-Elizondo et al. Assessment of 3 Tac-I/Beta, an antimicrobial peptide source, in the control of Pseudomonas plant pathogens
CN115427429A (zh) 对芽孢杆菌属具有裂解活性的抗菌蛋白及其制备方法
EA Assessment of 3 Tac-I/Beta, an Antimicrobial Peptide Source, in the Control of Pseudomonas Plant Pathogens
KR20010072767A (ko) 병원성 진균에 대한 항진균 활성을 가지는 미생물, 이를함유하는 항진균성 미생물 농약제 및 그의 제조방법

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition