ES2276856T3 - Proteina de espora soluble en acido pequeña y utilizaciones de la misma. - Google Patents

Abstract

Polipéptido con actividad SASP de tipo a/a, destinado a su utilización como un medicamento.

Description

Proteína de espora soluble en ácido pequeña y utilizaciones de la misma.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a polipéptidos, polinucleótidos y composiciones de los mismos para su utilización como medicamentos, destinados en particular a inhibir el crecimiento celular, tal como el crecimiento celular bacteriano.

Antecedentes de la invención

Las bacterias que esporulan constituyen una clase relativamente pequeña de bacterias que generan endoesporas. Las endoesporas son formas adormecidas de supervivencia no productiva de la bacteria, resistentes a los ambientes inhóspitos tales como las temperaturas elevadas, los agentes químicos dañinos y la luz UV. Dichas bacterias esporulantes comprenden especies de Bacillus, Clostridia y Sporosarcina así como también cepas de Thermoactinomyces y otras especies menos comunes de Sporolactobacillus y Oscilospira. Durante el proceso de esporulación se produce una clase de proteínas conocida como las pequeñas proteínas de espora (SASP). Las SASP son solubles en ácido y tienen un peso molecular bajo comprendido entre 5 y 11 kDa. Se ha publicado que las SASP tiene dos funciones principales en la espora bacteriana: en primer lugar, actúan con el fin de proteger el ADN de la espora contra el daño producido por la luz UV, el calor, la despurinificación y de muchos agentes químicos potencialmente dañinos; y en segundo lugar, las SASP proporcionan una fuente de aminoácidos libres cuando germina la espora, sin los que las nuevas células vegetativas no podrían crecer.

En la especie Bacillus existen tres tipos de SASP conocidas como SASP tipos \alpha, \beta y \gamma. La secuencia de aminoácidos de las SASP tipo \alpha/\beta está muy conservada tanto entre especies (entre aprox. un 70% de identidad y un 80% de similitud, sin espacios en la especie Bacilo). Sin embargo, dichas proteínas no muestran semejanza con cualquier otra familia de proteínas y no contienen ningún motivo característico de otras proteínas de unión al ADN (Setlow, 1988). Los tipos de SASP \alpha/\beta se encuentran inmunogénicamente muy relacionados, tienen un peso molecular comprendido entre aproximadamente 6,2 y 7,6 kDa y tienen un porcentaje significativo de aminoácidos hidrófobos (de hasta el 30%) (Setlow, 1988). La SASP de tipo \gamma tienen un peso molecular comprendido entre 8 y 11 kDa, tienen un contenido extremadamente bajo en aminoácidos hidrófobos grandes (<11%) y tiene un punto isoeléctrico superior al de las SASP tipo \alpha/\beta de la misma especie (Setlow, 1988). En un organismo determinado existen dos SASP principales de tipo \alpha/\beta, así como también múltiples SASP menores de tipo \alpha/\beta, cada una de las mismas codificada por un único gen (Setlow, 1988). Por el contrario, todos los organismos que se han estudiado disponen de solamente un tipo de SASP \gamma y su función es muy diferente a la de las SASP de tipo \alpha/\beta, y es utilizada principalmente para proporcionar aminoácidos para el crecimiento (Hackett y Setlow, 1987). En el Apéndice 1, se da una lista de todas las secuencias de SASP tipo \alpha/\beta que se han secuenciado hasta la fecha, junto con las secuencias de proteína relacionadas. El grado de conservación de los residuos de aminoácidos entre tales secuencias de proteínas se muestra en el Apéndice 2.

Diversos estudios sobre las SASP se han centrado en la caracterización del modo en que las SASP de tipos \alpha/\beta protegen el ADN del daño por luz UV. En uno de tales estudios (Setlow et al., 1991) se insertó un gen (SspC) que codifica una SASP de tipo \alpha/\beta en un plásmido bajo el control de un promotor inducible para demostrar que la SASP inducía que el ADN de una célula vegetativa adoptase las características del de una espora. Se observó que la unión de la SASP tipo \alpha/\beta al ADN de E. coli inducía un incremento en la densidad de superhélice negativa, lo que sugiere un cambio concomitante en la estructura del ADN. Se ha postulado que un cambio en la conformación del ADN de "semejante a B" a "semejante a A" protege al ADN de la luz UV.

En el campo de la medicina, la regulación del crecimiento celular es una preocupación fundamental. El crecimiento celular en el organismo está sujeto a un control estricto; que incluye tanto las células que comprenden los tejidos y los órganos del organismo como las células de las bacterias comensales de la flora de la piel y el intestino. El crecimiento incontrolado de los microorganismos tales como las bacterias o los hongos puede constituir un problema o riesgo mortal para un paciente. El tratamiento habitual de las infecciones bacterianas en particular, implica la utilización de los antibióticos convencionales que pueden tener un amplio espectro de actividad (tal como la penicilina) que generalmente actúan sobre la pared celular bacteriana. Otros tipos de antibióticos actúan mediante la inhibición de la síntesis de proteínas en las células bacterianas, aunque muchos de éstos muestran diversos niveles de toxicidad para las células humanas y de otros animales. Las bacterias pueden fácilmente desarrollar resistencia a los antibióticos convencionales y en la actualidad están apareciendo cepas "super resistentes". Por consiguiente resulta evidente que se necesitan alternativas a los antibióticos actualmente disponibles.

Sumario de la invención

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido con actividad SASP de tipo \alpha/\beta, de utilización como medicamento.

Sorprendentemente se ha descubierto que el polipéptido de la presente invención se puede utilizar como un medicamento, en particular con el fin de inhibir o evitar el crecimiento celular indeseable tal como el crecimiento que es patogénico en un sujeto. Dicho crecimiento celular incluye el crecimiento de las células bacterianas y de algunas células eucarióticas tales como las de los hongos.

Un polipéptido según la presente invención puede comprender un péptido cualquiera, oligopéptido, proteína y puede existir en forma monomérica o multimérica con o sin modificaciones covalentes tales como las modificaciones postranslacionales que incluyen la glicosilación. Los polipéptidos típicos según la presente invención comprenden la secuencia de aminoácidos:

100

Preferentemente, el polipéptido comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos mostradas en el Apéndice 1 tal como la codificada por el gen SspC de Bacillus subtilis, tal como se indica en el apéndice 3. Uno cualquiera de tales polipéptidos puede contener mutaciones y/o deleciones tales como las producidas mediante mutagénesis aleatoria o mediante mutagénesis dirigida, que no reduce sustancialmente la actividad SASP de tipo \alpha/\beta de la misma. A pesar del elevado grado de conservación de la secuencia entre la proteína SASP natural, existen diferencias significativas en las afinidades por el ADN (Setlow et al., 1992). Existe el potencial de diseñar secuencias de proteínas para incrementar la afinidad de la proteína para dirigirla al ADN. Basándose en lo anterior se podrían utilizar las variaciones naturales en SASP o modificar SASP para optimizar la dirección a las diferentes especies de bacterias y/o a los genes deseados en un organismo determinado.

En general, la actividad SASP de tipo \alpha/\beta se puede medir mediante la evaluación de los efectos del polipéptido sobre la conformación del ADN. La actividad SASP tipo \alpha/\beta se puede definir como la capacidad para convertir el ADN de la conformación B a la conformación A. Ello se puede medir mediante uno cualquiera de los siguientes procedimientos.

(a)

Una referencia para describir el cambio en conformación de B a A es Mohr et al., 1991. Desde hace tiempo, los cambios en el espectro de dicroísmo circular han sido considerados como un criterio sensible de la conformación del ADN y las distinciones entre las familias principales de estructuras secundarias no son ambiguas (Mohr et al., 1991). La interacción tanto del ADN eucariótico (timo de vaca) y del ADN procariótico con SASP tipo \alpha/\beta (en particular en los experimentos que utilizan SspC de B. subtilis) induce rasgos espectroscópicos característicos del ADN-A. La espectroscopia infrarroja de transformada de Fourier (FITR) proporciona un medio independiente de evaluar los estados conformacionales de los complejos de ADN con SASP tipo \alpha/\beta. El espectro FTIR de las disoluciones concentradas de ADN de timo vacuno muestra una banda de absorción principal a 1.225 cm^{-1} que se origina de la vibración de estiramiento antisimétrico del fosfato O-P-O (Mohr et al., 1991). Esta banda se desplaza a 1.246 cm^{-1} con SspC de timo de vaca. Tal comportamiento es característico de una transición de B a A, aunque se debe subrayar que los efectos de hidratación por sí solos pueden también influir en la posición de dicha banda de estiramiento O-P-O. Por consiguiente se puede utilizar una indicación adicional de la transición B a A, que comprende la aparición en el espectro FTIR del complejo SASP-ADN (en una proporción 1:1) de una banda de absorción a 1.185 cm^{-1}. Esto es un marcador específico de la conformación A del ADN ya que ni la forma B ni la forma C del ADN producen bandas infrarrojas a 1.185 cm^{-1} (Phole y Fritzsche, 1980). Los efectos de hidratación no influencian o afectan el análisis de la banda de 1.185 cm^{-1}. Los resultados de FTIR muestran que, aunque la hidratación puede provocar el cambio de la conformación del ADN de B a A, SASP promociona este cambio de conformación de manera que éste se completa con una reducción mucho menor en la humedad que necesita el proceso con ADN solamente (Mohr et al., 1991).

(b)

Además, el SASP unido al ADN lo protege de la degradación por las ADNasa (Setlow et al., 1992). Es posible demostrar mediante dos ensayos que el SASP unido al ADN in vitro protege a un ácido nucleico de la digestión por nucleasas. El primero, un ensayo electroforético, es el más directo. En breve, se incuba el ácido nucleico (incluyendo pUC19 y pUB110) con múltiples cantidades de SASP durante 1 hora a 37ºC. En este punto se añade ADNasa I (o nucleasa de S. aureus) y se continúa la incubación durante 15 minutos adicionales antes de añadir SDS/EDTA seguido de NaCl y etanol con el fin de precipitar el ADN. El ADN precipitado se analiza mediante electroforesis en geles de agarosa (2%) (de polinucleótidos) o de acrilamida (de oligonucleótidos). La protección tanto de pUC19 como de pUB110 es evidente a una proporción 1:1 de SASP a ADN y es máxima a una proporción de 4:1. El análisis de la protección contra ADNasa para otras cuatro SASP tipo \alpha/\beta indica que tales proteínas también confieren a dicho plásmido resistencia a la DNsa. SASP-I de Bacillus cereus y SASP-A muestra patrones similares de bandas protegidas mientras que SASP-\alpha y -\beta de Clostridia bifermentans genera patrones diferentes (Setlow et al., 1992). El segundo ensayo es un ensayo de precipitación con ácido.

(c)

La SASP unida al ADN protege al ADN contra el corte con enzimas de restricción, en particular las que presentan especificidad por las secuencias ricas en GC (Setlow et al., 1992). Se realizaron digestiones de ADN de pUC19 unido a SspC (proporción 8:1 de SspC a ADN) y las digestas se analizaron mediante electroforesis en geles de agarosa. Para los enzimas ricos en secuencias AT es decir DarI (TTTAAA) la inhibición fue <10%. El incremento en el contenido de GC en el lugar de reconocimiento del enzima de restricción condujo a un incremento en la protección mediante SASP contra los enzimas que reconocen secuencias ricas en GC (es decir, KpnI: GGTACC) que es inhibida> 75%.

(d)

SASP también incrementa la densidad de superhelicidad negativa de los plásmidos en presencia de la topoisomerasa I. El procedimiento para ensayar este efecto se da en Nicholson et al., 1990b. En breve, se incuban durante la noche muestras de 1 \mug de plásmido (pUC19 o pUB110) en un volumen de 20 \mul de mezcla de reacción a 4ºC con múltiples cantidades de SspC, seguido de la adición de topoisomerasa I e incubación adicional durante 2 horas a 37ºC. Después de desproteinizar, se analizan las muestras mediante electroforesis en geles de agarosa que contienen cloroquina (2 \mug/ml). El valor medio de las supertorsiones negativas se puede determinar mediante la comparación de la posición de las bandas en los geles de agarosa con un conjunto de estándares preparado mediante la incubación de ADN de plásmido con topoisomerasa en presencia de múltiples cantidades de bromuro de etidio (Nicholas y Setlow, 1990). La máxima unión de SspC produce la introducción de gran número de supertorsiones negativas en los dos plásmidos. Con la adición de 12 \mug de SspC al ADN del plásmido se introducen aproximadamente entre 18 y 38 superespirales en el ADN de pUC19 y pUB110, respectivamente. Ya que el tamaño de pUC19 es aproximadamente el 60% del de pUB110, la densidad de superhelicidad inducida por la unión de SspC a los dos plásmidos es similar. Adviértase que la unión al ADN de la proteína HU, que no induce un cambio de la conformación B a la A del ADN, solamente induce aproximadamente un 40% del número de supertorsiones negativas por unidad de ADN que induce SspC (Nicholson et al., 1990).

(e)

Además, SASP unido al ADN protege contra la formación por la irradiación UV de dímeros de timidina semejantes a ciclobutano, pero promociona la formación del fotoproducto de espora, un producto de adición entre residuos de timina adyacentes (Nicholson et al., 1991) el rendimiento en dímeros de pirimidina y fotoproducto de espora (SP) fue <0,2% y 8% de la timidina total, respectivamente cuando se irradió ADN saturado de SASP a 254 nm con 30 kJ/m^{2}. En ausencia de SASP los rendimientos se invirtieron a 4,5% y 0,3%, respectivamente (Nicholson et al., 1991). Los rendimientos en SP in vivo, es decir, en esporas, y de dímeros de timina en las células vegetativas fueron similares y muy elevados (> 25% de la timina total) (Donnellan y Setlow, 1965). La irradiación UV del ADN in vitro normalmente también produce productos de adición de bipirimidina fluorescentes, dímeros de citosina de tipo ciclobutano y dímeros de ciclobutano entre citosina y timina, así como también un producto de adición de 6-4 bipirimidina. El rendimiento de todos los tipos de fotoproductos se reduce considerablemente mediante la irradiación, in vitro, de ADN unido a SASP tipo \alpha/\beta (Fairhead y Setlow, 1991).

(f)

También se ha demostrado que SASP de tipo \alpha/\beta reduce la velocidad de despurinización del ADN in vitro en por lo menos 20 veces. En Fairhead et al., 1993 se dan tres procedimientos diferentes destinados a la medición de la despurinización del ADN in vitro.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un polinucelótido que codifica un polipéptido tal como se definió anteriormente, para su utilización como un medicamento.

En este aspecto de la presente invención, aunque se piensa que el polipéptido comprende la especie activa, la administración del polinucleótido a las células diana para su expresión en las mismas puede resultar en que el polipéptido expresado inhiba o evite el crecimiento de la célula.

El polinucleótido puede ser ADN o ARN, dependiendo del sistema de administración utilizado. Aunque se prefiere por razones de estabilidad y facilidad de manipulación que el polinucleótido sea ADN, si se utiliza ARN se elimina la posibilidad de que la unión a SASP inhiba su propia producción. En una forma de realización particularmente preferida, el ADN comprende el gen SspC de B. subtilis. La degeneración del código genético permite mutaciones que no alteran la secuencia de amino ácidos del producto expresado del ADN.

El polinucleótido se puede utilizar con el fin de preparar un medicamento destinado a inhibir o evitar el crecimiento celular en múltiples formas. En una forma de realización, el medicamento comprende el polinucleótido, típicamente formulado para la administración a un sujeto. En otra forma de realización, el polinucleótido se utiliza con el fin de producir un medicamento que comprende el polipéptido. En todavía otra forma de realización, el medicamento se puede producir como un polipéptido dentro de la célula diana.

Sin pretender quedar limitado por la teoría, se postula que el polipéptido, cuando se encuentra presente en la célula diana se une al ADN de la célula y evita la replicación de dicho ADN. El polipéptido podría también inhibir completa o parcialmente la transcripción del ADN con el que se encuentra asociado. De tal modo, se inhibe o evita el crecimiento celular. En particular, en el caso de las infecciones microbianas, la inhibición o prevención del crecimiento permite que el sistema inmune del sujeto tenga la oportunidad de hacer frente a las células infectadas. Otro aspecto es que la unión de SASP al ADN podría evitar que las células expresen genes implicados en la invasión del sistema inmune del huésped.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición destinada a la inhibición o prevención del crecimiento celular que comprende un polipéptido tal como se definió anteriormente y un sistema de administración del mismo. Todavía en otro aspecto, la presente invención proporciona una composición destinada a inhibir o prevenir el crecimiento celular que comprende un polinucleótido tal como se definió anteriormente y un sistema de administración del mismo que es capaz de dirigirlo a las células.

Las composiciones según la presente invención se pueden utilizar con fines medicinales y no medicinales. Cuando se utilizan con fines medicinales tales como los expuestos en la presente memoria, existe la necesidad de asegurar que el sistema de administración utilizado sea adecuado al tratamiento de la afección médica relevante. Se prefiere utilizar una composición que contiene el polinucleótido debido a que éste se puede administrar a las células diana mediante un sistema de administración que se base en polinucleótidos tales como virus. Cuando el sistema de administración comprende un virus, el polinucleótido puede estar incorporado en el genoma del virus y por consiguiente puede utilizar el mecanismo vírico dirigido a la célula para penetrar en ésta de manera que el polipéptido se exprese en la célula y haga efecto. Cuando la célula diana es una célula eucariótica, se puede modificar y utilizar un virus eucariótico tal como un adenovirus, HSV, HIV u otro virus cualquiera que tenga un tropismo específico por la célula
diana.

En una forma de realización de la presente invención particularmente ventajosa, el virus comprende un bacteriófago (es decir, un virus bacteriano). Los bacteriófagos son generalmente capaces de dirigirse a las bacterias y son generalmente muy específicos ya que toda especie de bacteria tiene su propio rango de bacteriófagos. Además, cada cepa bacteriana puede fácilmente tener por lo menos un bacteriófago que es específico para dicha cepa. Por consiguiente, la utilización de un bacteriófago como sistema de administración asegura que ninguna otra bacteria, aparte de las diana, sea infectada. En el Apéndice 4 se proporciona una lista de patógenos comunes y algunos de sus
bacteriófagos.

Existen múltiples tipos de bacteriófagos que incluyen fagos lisogénicos tales como lambda, fagos filamentosos o líticos, que no son lisogénicos. Los bacteriófagos pueden comprender una sola cadena de ADN o ARN, a la que SASP no se puede unir, así como los más comunes de doble cadena de ADN tales como lambda. Es preferible utilizar un bacteriófago que no puede establecer lisogenicidad, o un fago lisogénico que ha sido tratado con el fin de inactivar un gen implicado en el establecimiento de la lisogenicidad. En cualquiera de los casos es preferible inactivar por lo menos uno de los genes que codifican productos implicados en el proceso lítico. Ello es ventajoso debido a que al evitar la lisis de la célula diana evita que se libere el contenido tóxico de la célula y afecte negativamente al huésped. Un inconveniente de los antibióticos convencionales es que una vez que se administran antibióticos a un sujeto, la destrucción de la pared bacteriana puede ser fatal para el huésped debido a una respuesta inmune masiva a los componentes de la pared celular. Este problema se evita impidiendo la lisis de la célula bacteriana según la presente invención.

La inactivación de un gen lítico se logra convenientemente mediante la inserción en el gen del polinucleótido según la presente invención. Esto tiene la ventaja adicional de que la expresión de los genes líticos tiene lugar suficientemente tarde en el ciclo de vida del fago produciéndose muchas partículas de fago en la célula huésped antes de que el polinucleótido exprese el polipéptido.

Los genes de lisis típicos incluyen el gen S del bacteriófago lambda. Este gen codifica una holina, que es una proteína que forma poros en las células huésped lo que a su vez permiten que otros enzimas líticos producidos por el bacteriófago produzcan la lisis. Se puede insertar un polinucleótido de la presente invención en el gen S, o en lugar de la mayor parte del mismo y está preferentemente regulado por el promotor P_{R}' del gen S. Igualmente, se puede insertar el polinucleótido en uno de los demás genes implicados en el ciclo lítico tales como el gen R. El producto del gen R es una transglicosilasa lítica. En este caso, el gen S puede o no estar interrumpido. De modo semejante, se pueden utilizar genes equivalentes en otros tipos de bacteriófagos como lugares para el polinucleótido cuando se dirige a bacterias distintas de E. coli.

En otra forma de realización, el polinucleótido se puede colocar en cualquier lugar del cromosoma del bacteriófago y puede estar bajo el control de un promotor de bacteriófago o bacteriano. Opcionalmente, se puede inhibir la producción de una o más proteínas implicadas en las lisis. Por el contrario, se puede dejar que el ciclo lítico siga su curso. Por ejemplo, es posible utilizar promotores bacterianos que reaccionen a indicaciones que se encuentran en el huésped bajo las condiciones de infección, tales como los promotores sensibles a la temperatura, el promotor P3 del locus agr del Staphylococcus aureus; o los promotores implicados en las sendas reguladoras mediante sensores de dos componentes. Otros ejemplos incluyen los promotores activos bajo condiciones microaerófilas, por condiciones bajas en hierro o los estimulados por factores específicos del huésped, tales como el ácido nicotínico o los iones de magnesio.

Todavía en otro aspecto, los virus pueden estar modificados para incrementar o alterar su especificidad de huésped. En el caso de los bacteriófagos, éstos se pueden modificar con el fin de que infecten otros tipos celulares diferentes a las bacterias mediante la modificación de la cola con el fin de generar afinidades diferentes y/o la capacidad de infectar células. Por ejemplo, se ha demostrado que se puede conferir a los bacteriófagos filamentosos tropismo hacia las células de mamífero mediante la presentación en la proteína de la cubierta del bacteriófago de un ligando que se une a una molécula de la superficie de la célula de mamífero (Larocca et al., 1998). Por ejemplo, se ha demostrado que cuando se modifica un fago M13 para que exponga genéticamente el ligando del factor de crecimiento FGF2 (como una proteína de fusión con la proteína menor pIII de la cubierta), adquiere la capacidad de administrar un gen a las células de mamífero mediante su receptor FGF, produciendo una célula transfectada (Larocca et al., 1999). Otros investigadores ha publicado descubrimientos semejantes utilizando fagos para exponer anticuerpos de una sola cadena (scFvc) dirigidos contra ErbB2, un miembro de la familia de receptores EGF (factor de crecimiento epidermal) (Poul y Marks, 1999). La selección de fagos modificados con el fin de transferir genes a las células de mamífero mediante transferencia génica mediada por receptores, se puede incrementar mediante el cribado de librerías de fagos en busca de ligandos funcionales capaces administrar ADN a las células (Kassner et al., 1999).

Una barrera a la infección de las células distintas a las de su huésped natural por los Caudovirus (bacteriófagos con cola) es la falta de un receptor adecuado en la superficie de las bacterias diana al que se pueda absorber el fago. Dirigiéndose a esto es posible crear fagos que contengan el mismo ADN modificado (es decir, que contengan SASP) pero que puedan dirigirse amplios rangos de huéspedes. Por ejemplo, se puede modificar un fago para permitir que se dirija a un receptor común en múltiples especies de bacteria. Por el contrario, el ADN modificado del fago se puede empaquetar en cabezas de fagos idénticas a las que se les ha proporcionado una multiplicidad de colas expresando cada una de ellas una afinidad por los receptores expresado por diferentes bacterias. Los bacteriófagos también pueden expresar fragmentos de anticuerpos como proteínas de fusión. Por ejemplo, el fago filamentoso M13 ha sido modificado para que exprese una proteína de fusión con g3p que comprende un fragmento variable de cadena única que se une al antígeno de Helicobacter pylori (ScFv). (Cao et al., 2000). Dicho fago-ScFv disminuyó el cfu de todas las cepas ensayadas de H. pylori. También sería posible hacer que una bacteria diana expresase un receptor seleccionado. Por ejemplo, ya se ha demostrado que las especies de Pseudomonas se pueden modificar para que expresen receptores de Lam, que son los receptores del bacteriófago lambda (de Vries et al., 1984). El gen, lamB, que codifica estos receptores de proteína se introduce en Pseudomonas mediante un plásmido y se inserta en el cromosoma de Pseudomonas mediante recombinación homóloga. Aunque no siempre es práctico transformar células con plásmidos, es posible administrar el gen lamB a cualquier bacteria Gram negativa mediante un bacteriófago modificado específico de la diana. El gen lamB debe estar bajo el control de un promotor bacteriano fuerte y el fago debe ser modificado de modo que siempre se establece lisogénesis. La administración de dicho tipo de fago, hará que las especies de pseudomonas sean a continuación infectables mediante la siguiente administración de SASP/lambda. Se pueden producir otros fagos modificados de este modo para cada especie diana y también actuarán para ampliar el rango de huéspedes de cualquier bacteriófago que contenga SASP.

De tal modo, es posible extender el ámbito de bacterias a las que se puede dirigir un fago que contenga SASP, por lo menos dentro de la amplia categoría de las bacterias Gram positivas y Gram negativas.

Existe bacteriófagos modificados comercialmente disponibles que han sido diseñados específicamente para la clonación o la expresión génica y pueden comprender múltiples lugares de clonación y promotores inducibles insertados en regiones no esenciales.

Existen dos clases de vectores de clonación en lambda: Los vectores de inserción aceptan entre 0 y 12 kb de ADN e incluyen Lambda ZAPII, Unl-ZAP XR y Lambda ZAP-Express (Stratagene); los vectores de reemplazo aceptan entre 9 y 23 kb e incluyen Lambda FIXII y Lambda DASHII (Stratagene). También se encuentran disponibles equipos de expresión de proteínas en bacterias que permiten la expresión de genes tóxicos que incluyen el bacteriófago Lambda CE6 portador del gen de la ARN polimerasa T7 para ser administrado a células de la cepa BL21 de E. coli (Stratagene). Los bacteriófagos con mutaciones naturales en el gen S se utilizan comercialmente para la preparación de grandes cantidades.

Cuando se utiliza como medicamento, el polipépido o polinucleótido de la presente invención se puede utilizar en terapia humana y se pueden tratar múltiples enfermedades, especialmente infecciones microbianas. Entre las infecciones microbianas tratables según la presente invención se encuentran las infecciones tópicas, caries dentales infecciones respiratorias, infecciones oculares e infecciones en órganos localizadas. La presente invención se puede aplicar tanto a la terapia de seres humanos como a la de animales y se puede utilizar, por ejemplo, con el fin de tratar infecciones sistémicas o tópicas en peces. Por consiguiente, se pueden formular medicamentos o composiciones farmacéuticas según la presente invención dependiendo de la utilización que se realice del polipéptido o polinucleótido. Típicamente, se puede formular un medicamento que comprende el ingrediente activo opcionalmente junto a excipientes farmacéuticamente aceptables, diluyentes o vehículos. La naturaleza exacta y las cantidades de los componentes de dichas composiciones farmacéuticas se pueden determinar empíricamente y dependerán en parte de la vía de administración de la composición. Las vías de administración incluyen la oral, bucal, sublingual, mediante inhalación, tópica (incluyendo oftálmica), rectal, vaginal, nasal y parenteral (incluyendo intravenosa, intraarterial, intramuscular, subcutánea e intraarticular). Para la conveniencia de utilización, las dosis según la presente invención dependerán del lugar y del tipo de infección que se debe tratar o prevenir. Por ejemplo, el tratamiento de infecciones respiratorias se realizaría mediante administración por inhalación de una suspensión de SASP/fago. El tratamiento de infecciones oftálmicas se haría mediante la utilización de una suspensión de SASP/fago administrada mediante gotas oftálmicas etc. Se podría utilizar un gargarismo o una pasta dental que contiene una formulación de SASP/fago en el tratamiento de las caries dentales con el fin de eliminar las bacterias asociadas a la formación de placa dental. En consecuencia, también se proporcionan los productos de higiene oral que contienen los polipéptidos o polinucleótidos según la presente invención.

Los polipéptidos, polinucleótidos y composiciones de los mismos según la presente invención se pueden utilizar también en aplicaciones no médicas. En otro aspecto se proporciona la utilización de un polipéptido o polinucleótido tal como se define en la presente memoria como descontaminante bacteriano, más particularmente un descontaminante bacteriano que se puede utilizar con el fin de tratar la contaminación microbiana de las superficies, en la recuperación del suelo o en el tratamiento del agua. Por ejemplo, el polinucleótido o el polipéptido se puede utilizar en el tratamiento del personal médico como agente descontaminante, por ejemplo como un lavado de manos. También se proporciona el tratamiento de las superficies de trabajo y los equipos, especialmente el utilizado en procedimientos hospitalarios o en la preparación de alimentos. Esto tiene ventajas sobre los productos químicos antibacterianos convencionales que pueden dañar los instrumentos delicados y pueden ser indeseables en las zonas de preparación de alimentos. Como ejemplos adicionales de descontaminación microbiana de las superficies, la presente invención se puede utilizar en el tratamiento tópico de los cadáveres. En el tratamiento del agua, la presente invención puede ser efectiva contra los patógenos transmitidos por el agua, especialmente Vibrio cholerae, Legionella pneumophila, Salmonella typhi y Shigella dysenteriae. La contaminación microbiana del suelo se puede combatir también según la presente
invención.

Todavía en otro aspecto, se proporciona la utilización de un polipéptido o polinucleótido como agente antimicrobiano, particularmente un agente antibacteriano o antifúngico, para el tratamiento de material vegetal tal como las plantas, por ejemplo los cultivos o en el tratamiento de las semillas o granos producidas por los mismos. Las frutas se pueden rociar con fagos contra las bacterias que producen putrefacción. Se pueden tratar de este modo los microorganismos tales como los de la especie Erwinia. Las plantas ornamentales tales como los geranios son susceptibles a las plagas bacterianas producidas por, por ejemplo, Xanthomonas campestris; este organismo también afecta los tomates. Según la presente invención se pueden tratar de modo semejante las especies de Pseudomonas que infectan las habas y los guisantes.

En otro aspecto, el polinucleótido o polipéptido se puede utilizar con el fin de tratar plagas tales como las ratas con fin de eliminar bacterias específicas de éstas. Un tratamiento común destinado a la eliminación de ratas es la administración de cebo que contiene sustancias anticoagulantes tales como la warfarina. El antídoto a dicha sustancia es la vitamina K. La vitamina K la producen las bacterias en el intestino de los mamíferos. La resistencia de las ratas a los anticoagulantes la adquieren debido a la colonización del intestino por bacterias que producen niveles elevados de vitamina K. Por consiguiente, el tratamiento de las plagas según la presente invención permite que el tratamiento mediante anticoagulantes tenga éxito en el control de las plagas.

A continuación se describe la presente invención con mayor detalle, únicamente a título de ejemplo, haciendo referencia a los dibujos adjuntos y los ejemplos y apéndices siguientes.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra una representación diagramática de una parte del genoma de lambda, que comprende el gen S;

La Figura 2 muestra un mapa de pB/LF1;

La Figura 3 muestra una representación diagramático de parte del genoma de Bacillus subtilis que comprende el gen SspC;

La Figura 4 muestra un mapa de (A) pB/SAPB y (B) pB/SAPO;

La Figura 5 muestra un mapa de pB/SAPOC;

La Figura 6 muestra un mapa de SSP-lambda mostrando la substitución de gen S de lambda por el gen SspC de B. subtilis y la inserción de un gen marcador de resistencia a cloranfenicol (Cm^{r});

La Figura 7 muestra un mapa de una zona del ADN genómico de SSPC-lambda incluyendo las posiciones de los cebadores;

La Figura 8 muestra una representación diagramático de parte del genoma de Bacillus subtilis que comprende el gen SspC;

La Figura 9 muestra un mapa de pB/PIPC;

La Figura 10 muestra una representación diagramática de un fragmento que comprende la construcción RPPC-lambda, mostrando la posición de los cebadores de secuenciación SEQL1F y SEQL2R;

La Figura 11 muestra una representación diagramática de un tándem de genes SspC y de los cebadores utilizados para la amplificación mediante PCR los genes antes de la ligación en lambda;

La Figura 12 muestra la disminución en viabilidad de E. coli después de la infección con SSPC-lambda; y

La Figura 13 muestra un gel que demuestra el patrón de bandas de ADN de plásmido de las cepas crecidas +/- la producción de SspC.

Procedimientos experimentales

Todos los procedimientos experimentales son estándar tal como se describe en Sambrook et al., (1991) a menos que se indique de otro modo.

Las digestiones de restricción se realizaron en un volumen total de 50 \mul, utilizando 2 \mul de cada uno de los enzimas e incubando a 37ºC durante 4 horas, a menos que de otro modo se indique.

La defosforilación del ADN patrón se realizó en un volumen total de 50 \mul utilizando tampón 10X (5 \mul) y fosfatasa alcalina (2,5 U) (5 \mul) con incubación a 37ºC durante 1 hora.

Las ligaciones se realizaron en un volumen total de 10 \mul utilizando 3 Unidades Weiss (1 \mul) de ligasa T4 y ADN y se realizaron rutinariamente a 16ºC durante la noche.

Las mezclas de PCR se realizaron rutinariamente tal como sigue (volumen total de 100 \mul):

	ADN patrón	0,1 \mug plásmido o ADN de lambda
		purificado/1\mug ADN cromosómico/1colonia
	Tampón 10X (con 1,5 mM MgCl_{2})	10 \mul
	Mezcla de dNTP (10 mM stock)	2 \mul
	Polimerasa Taq (2,5 U)	1 \mul
	Cebadores (directos y reversos)	100 pmoles de cada uno
	Ajustar a un volumen final de	100 \mul con dH_{2}O

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Las reacciones de PCR se realizaron tal como sigue (a menos que se indique de otro modo):

	95ºC durante 3 minutos (desnaturalizar)
	94ºC durante 30 segundos (desnaturalizar)	)
	58ºC durante 30 segundos (hibridar)	) durante 25 ciclos
	72ºC durante 30 segundos por kb de ADN (extender)	)
	72ºC durante 10 minutos

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Los cebadores se obtuvieron de Gibco BRL o de Sigma Genosys Cuando los cebadores incluyen secuencias de reconocimiento para enzimas de restricción, se incluyó corriente arriba la secuencia preferida de cada enzima (PCR Essential Data, 1995).

A Producción in vitro/in vivo I

1. Un fragmento del genoma de lambda, que comprende el gen S, se amplificó mediante PCR utilizando cebadores con lugares de restricción adecuados en el extremo 5' y para permitir la ligación dirigida en un vector de clonación general en E. coli tal como pUC18 o pBluescript (Stratagene). En consecuencia, el cebador B1 comprende la secuencia de reconocimiento para el enzima de restricción PstI seguido de la secuencia de lambda comprendida entre la base 44660 y la base 44677 (Figura 1); El cebador B2 incluye la secuencia de reconocimiento del enzima de restricción XbaI seguida del complemento reverso y complemento de la secuencia de lambda comprendida entre la base 45792 y la base 45956 (Figura 1), por ejemplo:

Cebador B1:	5'-AACTGCAGGGTCACTTCGACGTATCG-3'	(SEC. ID nº:2)
Cebador B2:	5'-GCTCTAGAGCTCATACATCAATCTC-3'	(SEC. ID nº:3)

En la Figura 1, las posiciones de los genes tardíos implicados en la lisis, junto con el promotor P_{R}' se muestran relativos el uno al otro. También se muestra la posición de los cebadores B1 y B2, junto con el lugar del enzima de restricción EcoRI.

2. El producto de PCR de 1328 bp se digirió con PstI/XbaI y se ligó con Bluescript digerido de modo semejante y defosforilado, para obtener pB/ZF1 (Figura 2). La Figura 2 muestra un mapa lineal de pB/LF1 que muestra el esqueleto del plásmido pBluescript SK(+) (Stratagene) y la posición del fragmento de lambda insertado flanqueado de los lugares de restricción PstI/XbaI (ver la Figura 1). La secuencia que comprende el inicio del ORF de S, se da junto con la posición del lugar de unión de los ribosomas (rbs) y el primer y segundo codon de inicio. Se muestra la posición relativa y la secuencia de los cebadores de PCR inversos. El cebador B3 produce un producto de PCR romo en el extremo 5'. El cebador B4 produce un producto de PCR que, después de la digestión con NcoI, tiene un 5' sobresaliente.

3. El plásmido pB/LF1 se introdujo en E. coli mediante electroporación y los recombinantes putativos se recuperaron como colonias blancas en placas de agar LB en presencia de X-gal (80 \mul, 20 mg/ml) y ampicilina (50 \mug/ml). Se identificó un transformante correcto después de una digestión de restricción del plásmido con EcoRI, que resulta en dos fragmentos de aproximadamente 300 bp y 3950 bp.

4. El gen S de lambda es un gen de doble inicio, que produce la transcripción desde el segundo codon de inicio fMet con un nivel de proteína 2 veces superior. Por consiguiente, el gen SASP elegido, en este caso el SspC de B. subtilis, se insertó en marco con dicho segundo codon de inicio. La PCR inversa del plásmido pB/LF1 se realizó (con una extensión de tiempo de 4 minutos 30 segundos a 68ºC) utilizando los cebadores reversos con el fin de producir un fragmento con un 5' sobresaliente. El enzima de restricción NcoI tiene la secuencia de reconocimiento (CCATGG) que incorpora los nucleótidos ATG. Mediante la adición de la secuencia de reconocimiento de NcoI al frente los cebadores del ADN patrón (pB/LF1) y del inserto (SspC) se permite la subsiguiente ligación de los productos de PCR de modo que el gen SspC se encuentra en el marco con el codon de inicio del gen S de lambda.

El cebador reverso (B4) es el complemento de la secuencia de lambda que comienza en el tercer nucleótido 5' del segundo codon de inicio ATG del gen S (Figura 2). El cebador contiene la secuencia de reconocimiento del enzima de restricción NcoI, por ejemplo:

Cebador B4:

5'-CATGCCATGGTCATGTCTTACC-3'

(SEC. ID nº: 4)

Es posible reemplazar el gen S con un gen SASP mediante ligación de extremos romos y en este caso se puede utilizar un cebador reverso que comienza en el complemento del segundo codon de inicio ATG del gen S (Figura 2), por ejemplo:

Cebador B3:

5'-CATCTTCATGTCTTACC-3'

(SEC. ID nº: 5)

El cebador directo se basó en la secuencia al comienzo del gen R de lambda desde la base 45499 hasta la base 45515 (ver la Figura 2). La secuencia de reconocimiento para el enzima de restricción SpeI se utilizó al frente de la secuencia de lambda para permitir la ligación direccional con el gen SspC, por ejemplo:

Cebador B5:

5'-GGACTAGTGAAATCAATAATCAACG-3'

(SEC. ID nº: 6)

5. Se amplificó el gen SspC mediante PCR (utilizando una extensión de tiempo de 20 segundos) de modo que permitió la ligación al producto inverso de PCR obtenido o de los cebadores B3 y B5 o de los cebadores B4 y B5, por ejemplo:

(i) con el fin de ligar el producto de PCR inversa de pB/LF1 utilizando los cebadores B3 y B5 (con el fin de obtener el plásmido pB/SAPB), se debe utilizar un cebador directo que comience con el nucleótido inmediato al 3' del codon de inicio ATG del gen SspC (Figura 3), por ejemplo:

Cebador B6:

5'-GCTCAACAAAGTAGATCAAG-3'

(SEC. ID nº: 7)

(ii) con el fin de ligar al producto de PCR inversa de pB/LF1 generado utilizando los cebadores B4 y B5 (con el fin de obtener el plásmido pB/SAPO), se utilizó un cebador directo que comprende la secuencia de SspC que comienza en el 5º nucleótido del ORF de SspC (Figura 3). Dicho cebador comprende la secuencia del enzima de restricción NcoI inmediatamente antes de la secuencia de SspC, que de hecho incorpora los cuatro primeros nucleótidos del gen SspC propiamente, por ejemplo:

Cebador B7:

5'-CATGCCATGGCTCAACAAAGTAGATCAAG-3'

(SEC. ID nº: 8)

El cebador inverso es el complemento de la secuencia en el final del ORF de SspC, es decir, con el fin de generar un producto de PCR que incluye el codon de parada del gen SspC (Figura 3). El cebador incluye la secuencia de SpeI con el fin de permitir la ligación direccional con uno cualquiera de los productos de PCR inversa de pB/LF1, por ejemplo:

Cebador B8:

5'-GGACTAGTTTAATGAAATTGACCG-3'

(SEC. ID nº: 9)

En la Figura 3, el gen SspC se muestra junto con las posiciones relativas de los cebadores de PCR B6, B7 y B8. El cebador B6 producirá un producto de PCR con el extremo 5' romo. El cebador B7 produce un producto de PCR que, después de la digestión con NcoI, tendrá un 5' sobresaliente.

6. El gen SspC amplificado mediante PCR (a partir de los cebadores B7 y B8) y el pB/LF1 amplificado por PCR inversa (a partir de los cebadores B4 y B5) se digirieron con los enzimas de restricción NcoI y SpeI. El producto lineal de PCR inversa de pB/LF1 se defosforiló antes de la ligación.

7. Después de limpiar el ADN digerido, se realizó la ligación con el fin de producir el plásmido pB/SAPO en el que el gen SspC reemplaza la mayor parte del gen S de lambda (Figura 4). Para el plásmido pB/SAPB los productos de PCR simplemente se ligan (Figura 4). La Figura 4 muestra un mapa lineal de (A) pB/SAPB o (B) pB/SAPO. Estos plásmidos están construidos después de la inserción del gen SspC en el plásmido pB/LF1 amplificado mediante PCR inversa (amplificado utilizando los cebadores B3 y B5 o B4 y B5 (ver la sección A4)).

(A) Mapa lineal de pB/SAPB que muestra pB/LF1 amplificado por PCR inversa (a partir de los cebadores B3 y B5) que contiene el gen SspC. La secuencia proporcionada comprende el lugar de unión de los ribosomas del gen S y el inicio de ORF de SspC, unidos mediante ligación de extremos romos. Mapa lineal de pB/SAPO mostrando pB/LF1 amplificado mediante PCR inversa (a partir de los cebadores B4 y B5) que contiene el gen SspC. La secuencia proporcionada comprende el lugar de unión a los ribosomas del gen S y el inicio del ORF de SspC, unido mediante ligación después de la digestión con NcoI.

8. Es posible generar lambda portador de un gen SASP con, o sin un gen de resistencia a antibióticos. La utilización de un gen de resistencia a antibióticos proporciona un marcador seleccionable para seguir la presencia del gen SASP y ello se ha realizado utilizando el gen de resistencia a cloranfenicol (Cm^{r}). Un gen Cm^{r} (con su propio promotor) se ha insertado, en orientación opuesta, en el extremo 3' del gen SspC después de la digestión de pB/SAPO con SpeI. Esto generó el plásmido pB/SAPOC (Figura 5). La Figura 5 muestra un mapa lineal de pB/SAPOC que muestra el esqueleto de pBluescript y la posición de los genes SspC y Cm^{r} en el fragmento de lambda flanqueado por los lugares de restricción PstI/XbaI.

9. Un procedimiento para producir SASP/lambda es infectar una cepa de E. coli portadora de pB/SAPOC con un fago lambda. Cuando se reproduce el fago, el fragmento lambda/SspC/Cm^{r} en pB/SAPOC se incorpora en algunos de los genomas de lambda. Este procedimiento se ha utilizado con éxito con un lambda sensible a la temperatura (ts). Este tipo de lambda se puede mantener establemente, como profago, en el cromosoma de E. coli a 30ºC pero no a 42ºC. La cepa portadora de pB/SAPOC se creció en LB (que contiene 10 mM MgSO_{4} + 0,2% maltosa (peso/vol)) hasta que la OD_{600} alcanzó 0,3. Se extrajo una alícuota (100 \mul) y se mezcló con 100 \mul de preparación de fago lambda. La mezcla se incubó sin agitación a RT durante 20 minutos, 3,5 ml de agar superior fundido (LB 0,6% agar con 10 mM MgSO_{4} + 0,2% maltosa (peso/vol.) mantenido a 45ºC, se añadió y se vertió sobre placas de agar LB precalentadas. Las placas se incubaron durante la noche a 37ºC antes de añadir LB (3 ml) sobre la superficie del agar superior. El agar superior, que contiene las placas, se transfirió a tubos de centrífuga de 50 ml y se guardó a 4ºC durante la noche. Se añadió cloroformo (250 \mul) y se invirtió el tubo suavemente varias veces con el fin de romper todas las células bacterianas enteras, antes de centrifugar (4.000 rpm, 10 minutos, RT). El sobrenadante resultante del homogeneizado de fago se transfirió a un tubo estéril y se utilizó con el fin de infectar una cepa de E. coli que se pudiese lisogenizar, es decir, NM522 o Y1089r, mediante el mezclado de 100 \mul de homogeneizado con 100 \mul de cultivo de E. coli crecido a una OD_{600} de 0,3. Después de una incubación a RT durante 30 minutos, se añadieron 800 \mul de LB y se sembró la mezcla en alícuotas de 100 \mul sobre placas de agar LB suplido con cloranfenicol (10 \mug/ml). Después de la incubación a 30ºC durante la noche se aislaron colonias Cm^{r} y se examinaron con el fin de determinar la presencia de profagos lambda portadores de SspC.

10. Las colonias resistentes a Cm se subcultivaron en dos placas de LB con cloranfenicol (10 \mug/ml) y se incubaron las placas a 30ºC o 42ºC durante la noche. Se asumió que las colonias que habían crecido al día siguiente a 30ºC pero no a 42ºC eran lisogénicas para el lambda recombinante que contiene los genes de SspC y Cm^{r}. Las colonias se sub-cultivaron también en placas LB con ampicilina para asegurar que no se había integrado el plásmido pB/SAPOC completo en el genoma del lambda. Se identificó una cepa de E. coli lisogénica, resistente a Cm y sensible a ampicilina y se designó al profago SSPC-lambda (Figura 6). La Figura 6 muestra un mapa lineal de SSPC-lambda que muestra la sustitución del gen S de lambda por el gen SspC de B. subtilis y la inserción de un gen marcador de resistencia a cloranfenicol (Cm^{r}).

11. Se realizaron reacciones de secuenciación con el fin de confirmar la presencia, fidelidad y orientación de los genes de SspC y Cm^{r} en el genoma de SSPC-lambda presente en el cromosoma del huésped E. coli. Se preparó ADN cromosómico a partir de la cepa de E. coli que contiene SSPC-lambda y se digirió con el enzima de restricción ClaI. Este enzima corta en 15 lugares en el genoma de lambda y en un número indeterminado de lugares en el genoma de E. coli. Específicamente, este enzima corta en las bases 43825 y 46439 del genoma de lambda, generando un fragmento que comprenden las zonas de los genes de lisis S y R de lambda flanqueado por los cebadores B1 y B2 (Figura 7). La Figura 7 muestra una zona del ADN genómico con las posiciones de cebador:

-

posición de los cebadores B1 y B2 utilizados con el fin de amplificar inicialmente el fragmento de lambda para generar pB/LF1 (sección A1)

-

posición de los lugares ClaI mostrando la extensión del producto de ligación para la amplificación mediante PCR y la verificación de la secuencia (sección A11)

-

cebadores B31 y B32 utilizados con el fin de amplificar mediante PCR la región de lambda que comprende entre los fragmentos B1-B2, con el fin de secuenciar (sección A11)

-

cebadores 13f1, B30, B55 y B54 utilizados con el fin de secuenciar la construcción de SSPC-lambda (sección A11)

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El ADN totalmente digerido se ligó a continuación durante la noche y una alícuota de la mezcla de ligación (2,5 \mul) se utilizó como patrón de ADN en la reacción de PCR utilizando el siguiente programa:

	95ºC durante 3 minutos (desnaturalizar)
	94ºC durante 20 segundos (desnaturalizar)	)
	62ºC durante 30 segundos (hibridar)	) durante 10 ciclos
	68ºC durante 3 minutos 50 segundos (extender)	)
	94ºC durante 20 segundos (desnaturalizar)	)
	62ºC durante 30 segundos (hibridar)	) durante 25 ciclos
	68ºC durante 3 minutos 50 segundos +	)
	10 segundos de extensión (extender)
	72ºC durante 10 minutos

Los siguientes cebadores (B31 desde la base 43976 a la base 44000; B32 desde la base 46225 a la base 46203 de lambda) se utilizaron con el fin de generar un fragmento de ADN de lambda que comprende el ADN del gen lambda/SspC/Cm^{r} que se originó a partir de pB/SAPOC como un inserto PstI/XbaI (Figura 7).

Cebador B31:	5'-GGTACTGATGTGATGGCTGCTATGG-3'	(SEC. ID nº: 10)
Cebador B32:	5'-GCAACATCATCACGCAGAGCATC-3'	(SEC. ID nº: 11)

El producto de PCR resultante se utilizó a continuación in múltiples reacciones de secuenciación utilizando los siguientes cebadores (ver la Figura 7):

Cebador B30	5'-CAACAGTACTGCGATGAGTGG-3'	(SEC ID nº: 12)
Cebador 13f1	5'-GTAGTGAGATGAAAAGAG-3'	(SEC ID nº: 13)
Cebador B54	5'-GTAGGTAATGGCGTTATCACG-3'	(SEC ID nº: 14)
Cebador B55	5'-GGTGGTGCGTAACGGCAAAAGC-3'	(SEC ID nº: 15)

12. También es posible producir una construcción similar utilizando un diferente lugar de unión a los ribosomas (rbs) corriente arriba del gen SASP como alternativa al rbs del gen S nativo. Por ejemplo, el ARN guía del gen 10 del fago T7 puede amplificar dramáticamente la expresión de algunos genes exógenos en E. coli (Olins et al., 1988). Por el contrario, la secuencia del lugar de unión de los ribosomas del gen V de lambda se puede utilizar ya que V codifica la proteína de la cola que es más abundante que el producto del gen S durante el ciclo lítico de vida del bacteriófago lambda. En este caso, se ha generado una construcción utilizando el rbs nativo del SspC utilizando los procedimientos anteriores, excepto que el gen SspC se amplificó mediante PCR utilizando un cebador directo homólogo a la secuencia aproximadamente 40 bases corriente arriba del codon de inicio de SspC. Se incluyó un lugar de enzima de restricción BamHI delante de la secuencia SspC. Por ejemplo:

Cebador B23:

5'-CGGGATCCGATTCAAACAAGCTTG-3'

(SEC. ID nº: 16)

Se utilizó el cebador reverso B8. Los productos de PCR resultantes se ligaron a un pB/LF1 amplificado mediante PCR inversa, amplificado utilizando un cebador directo B5, como anteriormente, y un cebador reverso, B21 con un lugar de restricción BamHI delante de la secuencia de pB/LF1:

Cebador B21:

5'-CGGGATCCCATCTTCATGTCTTTAC-3'

(SEC. ID nº: 17)

La producción e identificación de las cepas portadoras de esta forma de lambda, designada SPPC-lambda, como profago, se realizó tal como para SSPC-lambda. SPPC-lambda también se secuenció tal como se describe en la sección A11 anterior.

13. Tanto la construcción SSPC-lambda como la SPPC-lambda se mantuvieron como profagos, es decir, permanecieron establemente en el cromosoma el huésped E. coli. Solamente la primera generación de partículas infecciosas de fago se ha utilizado para las infecciones. Esto ayuda a mantener la capacidad de comparación entre los lotes de fagos producidos. Sin embargo, ya que no es necesariamente ideal utilizar un fago temperado o lisogenizante con fines terapéuticos, es posible alterar los genes implicados en establecer la lisogénesis de modo que sean inactivos en una situación de infección. En el sistema que se describe, la utilización de un fago sensible a la temperatura (TS), significa que la lisogenización es relativamente rara a 37ºC o superior. Desde luego, se puede mantener stocks de fagos en lugar de E. coli lisogénico.

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14. Se obtuvieron preparaciones de SPPC-lambda y SPPC-lambda mediante la inducción de recombinación entre cepas portadoras de profagos con el fin de generar partículas de fago maduras. Cada cepa se creció a 30ºC hasta que la OD_{600} alcanzó 0,6 y a continuación se cambió la temperatura a 42ºC durante 15 minutos. A continuación se incubó el cultivo a 37ºC, con agitación a 350 rpm para proporcionar buena aireación, durante 3 horas antes de cosechar mediante centrifugación (4.000 rpm, 10 min, RT). Se retiró el sobrenadante y se resuspendió el precipitado en 1/5 del volumen de tampón de fago. Se añadió cloroformo (1/100 volumen) con el fin de resuspender las células y se mezcló la suspensión suavemente. El homogeneizado resultante se centrifugó (4.000 rpm, 10 min, RT) y el sobrenadante se transfirió a un tubo estéril y se almacenó a 4ºC. El homogeneizado se tituló tal como se describe en la sección A15, a continuación.

15. Con el fin de titular las partículas del fago SSPC-lambda producidas después de la inducción, el homogeneizado de fago se utilizó con el fin de infectar una cepa no lisogénica de E. coli que contiene un plásmido (designado pB/LF2) portador de un fragmento de ADN de lambda que comprende los genes de lisis S y R y el promotor P_{R}'. Este fragmento de lambda que contiene el promotor se amplificó mediante PCR utilizando el cebador B51 (5'-AACTG
CAGCGCTGTGACGATGCTAATCC-3' SEC. ID nº: 18) desde la base 44371 hasta la base 44390 y el cebador B2 (descrito anteriormente) (ver la Figura 7). La presencia de fagos lambda que se reproducen en la cepa portadora de pB/LF2 permite la expresión del casete del gen de lisis corriente abajo del promotor P_{R}' basado en el plásmido. Los productos de los genes de lisis expresados a partir del plásmido facilitan la lisis de las bacterias y la formación de las placas. El título del fago se determina mediante la cuenta de placas a una dilución a la que las placas son discretas y fáciles de observar. La infección se realizó cultivando la cepa que contiene pB/LF2 a una OD_{600} de 0,3 en LB con 0,2% maltosa, 10 mM MgSO_{4} y 50 \mug/ml ampicilina. Se incubó una alícuota (100 \mul) del cultivo celular con 100 \mul de una dilución de homogeneizado de fago SSPC durante 20 minutos a RT y a continuación se mezcló con agar superior y se sembró tal como se describió en la sección A9. Existe una reducción de hasta 5-log en el título de partículas de SSPC-lambda, en comparación con el lambda paterno del que se deriva. Siguiendo el protocolo descrito el lambda paterno puede producir aproximadamente 10^{15} pfu por ml.

B Producción in vivo/in vitro II

Existen procedimientos alternativos destinados a obtener lambda que contiene el gen SASP en lugar del gen S de lambda, basados en la transformación de un lisógeno de lambda con pB/SAPO o pB/SAPB (ver la sección A anterior). En tal caso, se deben preparar células competentes de una cepa de E. coli que es restricción^{-}/modificación^{+} y lisogénica para lambda, por ejemplo MOB145.

1. Las células de E. coli lisogénicas electro-competentes se deben transformar con pB/SAPO o con pB/SAPB, o con un vector suicida que contiene el fragmento de ADN equivalente a lambda/SspC. Se permite que se recuperen las células transformadas durante 1 h en SOC a 37ºC y a continuación se centrifugan (4.000 rpm, 10 min. RT). El precipitado de células se debe resuspender en LB (1 ml) y se extraen 50 \mul que se completan hasta 1 ml con LB estéril. Las células se deben sembrar en agar LB en alícuotas de 200 \mul y se incuban durante la noche a 37ºC. el resto de los 950 \mul se debe congelar instantáneamente en alícuotas de 50 \mul y almacenar a -20ºC.

2. Existen múltiples maneras de seleccionar un evento de doble recombinación entre fragmentos de lambda comprendidos en el plásmido pB/SAPB o el pB/SAPO y secuencias homólogas del genoma de lambda. La utilización de un vector suicida puede estimular el evento de doble recombinación ya que el vector no se puede mantener en el lisógeno de E. coli. Las colonias de cepas portadoras de profagos de lambda potencialmente recombinantes obtenidos a partir de crecimientos en placas de agar LB durante la noche (ver la sección A9 anterior) se pueden cribar mediante PCR utilizando cebadores basados en el gen SspC y lambda, es decir, B1 y B8 o B2 y B7 (ver la sección A). Los productos de PCR resultantes de usar uno cualquiera de los pares de cebadores debe ser de aproximadamente 1,3 kb. Por el contrario, se puede utilizar un procedimiento basado en la inducción del profago de lambda ya que los fagos que contienen SASP no tendrán un gen S funcional y no serán capaces de inducir la lisis de las células del huésped. El cribado se puede realizar mediante:

i) Irradiación UV de las células transformadas de acuerdo con Hendrix et al., 1983). Resuspender una alícuota de células (20 \mul) de la etapa anterior (etapa 9) a una suspensión máxima de células de 2 x 10^{8} cfu en 10 ml de un medio de suspensión adecuado no absorbente de UV (p. ej., M9a o PBS) en una placa de Petri estándar (9 cm). Irradiar las células utilizando una fuente de luz UV (potencia máxima a 260 nm). Después de la irradiación, los cultivos inducidos se incuban en medio M9a a 37ºC con aireación (si se utiliza PBS como medio de suspensión, se añade medio de cultivo estéril fresco (se añade 1/10 volumen de M9a 10x). La fotorreactivación se evita mediante la protección de las bacterias irradiadas de la luz visible.

ii) Inducción de los lisógenos de lambda mediante la privación de timidina, según Hendrix et al., (1983). Aislar mutantes thy (Miller, 1972): La cepa lisogénica se debe crecer en medio M9a suplementado con 10 \mug/ml de timidina hasta 2 x 10^{8} células/ml. Las células se deben lavar y resuspender en medio M9a libre de timidina y a continuación se deben incubar a 37ºC durante 2 horas. A continuación se debe añadir timidina (10 a 25 \mug/ml) al cultivo y se debe incubar durante entre 90 y 120 minutos a 37ºC.

iii) Inducción mediante cambio de temperatura (si se utiliza lisógeno de lambda cITs) tal como se describe en la sección A

3. Se debe permitir que las células crezcan durante aproximadamente 2 horas (en presencia de 0,2% glucosa con el fin de eliminar cualquier fago libre (y por consiguiente potencialmente libre de SASP) que se una a células bacterianas no rotas. Cualquier fago libre debe ser separado de las células que potencialmente contienen el SASP/bacteriófago, mediante centrifugación (4.000 rpm, 10 min, RT). Las células precipitadas se deben resuspender en LB con 0,2% glucosa y continuar la incubación durante aproximadamente 1 hora. Las células se deben centrifugar (4.000 rpm, 10 min. RT), resuspender en LB (2 ml) y a continuación romper con cloroformo (0,02 ml). El fago maduro liberado de las células después de la lisis inducida mediante el cloroformo se debe separar de los restos celulares mediante centrifugación (4.000 rpm, 15 min. RT).

4. El bacteriófago que contiene SASP se debe enriquecer y purificar mediante el procedimiento adecuado. Uno de tales procedimientos es infectar con SASP-lambda un cultivo en crecimiento de células de E. coli susceptibles y repetir la etapa B3 anterior.

5. La presencia de lambda recombinante se debe verificar mediante el aislamiento de ADN de las construcciones del putativo SASP-lambda y realizando un cribado por PCR con el fin de confirmar la presencia del gen SASP utilizando los cebadores apropiados, tal como se discute en la sección B2. Las construcciones putativas también se secuencias y titulan tal como se describe en la sección A.

C Producción in vitro (I)

Es posible producir fagos lambda portadores del gen SASP mediante solamente procedimientos in vitro. Esto se ha logrado mediante la inserción de los genes SspC y de resistencia a Cm en el gen R de lisis de lambda.

1. Se digirió el genoma de lambda con KasI, cuya secuencia de reconocimiento comprende un lugar de restricción único en lambda, que se encuentra en la base 45679, en el gen R, que codifica la petidoglicano hidroxilasa. A continuación se defosforila el ADN de lambda digerido.

2. El gen SspC se amplifica mediante PCR con un tiempo de extensión de 20 segundos, utilizando:

i) un cebador directo, B13, que comprende una secuencia del enzima de restricción para PstI (con las bases preferidas corriente arriba) y una secuencia corriente arriba del lugar de unión de ribosomas de SspC (Figura 8). El lugar de unión de ribosomas utilizado es el de SspC propiamente pero podría incorporar secuencias alternativas con el fin de incrementar potencialmente la traducción (ver la sección A12).

Cebador B13:

5'-AACTGCAGGATTCAAACAAGCTTG-3'

(SEC. ID nº: 19)

ii) Cebador reverso B8.

3. Se digirió el producto de PCR de SspC con PstI y SpeI y se ligó a una digesta semejante de pBluescript SK(+) defosforilado para obtener pB/PIP. Un gen de Cm^{r} (ver la sección A8) se insertó, en la orientación opuesta en el lugar SpeI en el extremo 3' del gen SspC para producir pB/PIPC (Figura 9). La Figura 9 muestra un mapa lineal de pB/PIPC. También se muestra la posición de los cebadores B26 y B27.

4. El fragmento SspC/Cm presente en pB/PIPC se amplificó mediante PCR utilizando:

i) un cebador directo que incorpora un lugar para el enzima de restricción KasI frente a la secuencia del lugar de unión a ribosomas de SspC (ver la Figura 9)

Cebador B26:

5'-AACAGGCGCCGATTCAAACAAGCTTG-3'

(SEC. ID nº: 20)

ii) un cebador reverso que incorpora un lugar para el enzima de restricción KasI en el extremo del gen Cm^{r} (ver la figura 9):

Cebador B27:

5'-AACAGGCGCCAGTATACACTCC-3'

(SEC. ID nº: 21)

5. Los productos de PCR resultantes se digirieron con KasI y se ligaron al genoma de lambda defosforilado y digerido de modo semejante (ver la sección C1) para generar SPPC-lambda (Figura 10).

6. El ADN de lambda recombinante se empaquetó in vitro según el procedimiento de (Hohn y Murray, 1977) o utilizando un equipo tal como Packagene (Promega).

7. Se realizaron diluciones seriadas (hasta 10^{-5}) de lambda empaquetado, en tampón de fago. Una alícuota (100 \mul) de cada una de las diluciones de extracto empaquetador se añadió a un vial con 0,1 ml de E. coli cepa NM522, recientemente crecida hasta una densidad OD_{600} de 0,3 en LB con 10 mM MgSO_{4} y 0,2% maltosa (peso/vol.).

8. La mezcla de preadsorción se incubó a RT durante 20 minutos antes de pipetear la mezcla en alícuotas de 100 \mul sobre la superficie seca de una placa de agar con cloranfenicol (10 \mug/ml). Las placas se invirtieron y se incubaron durante la noche a 30ºC.

9. Las colonias presentes después de la incubación durante la noche fueron lisógenos putativos que comprenden el gen de lisis R de lambda inactivado por inserción mediante el gen SspC. Aproximadamente 50 colonias se transfirieron a dos placas de LB con cloranfenicol (10 \mug/ml) y se incubaron las placas durante la noche a 30ºC o a 42ºC. Las colonias que crecieron a 30ºC pero no a 42ºC en presencia de cloranfenicol se asumió que eran lisógenos de lambda que comprenden los genes de SspC y Cm^{r}. Se aisló una construcción de RPPC-lambda y se secuenció tal como se describe en la sección A con el fin de confirmar la integridad de los genes sspc y de resistencia a Cm que se habían integrado correctamente en el genoma de lambda. Se utilizaron los cebadores de secuenciación, SEQL1F desde la base 45613 hasta la base 45629 (5'-CTATTTACTGATTACTC-3' (SEC. ID nº: 22) y SEQL2R desde la base 45792 hasta la base 45776 (5'-CTTAATCTGCTGCAATG-3' (SEC. ID nº: 23) (ver la Figura 10).

D. Producción in vitro/in vivo utilizando genes SspC en tándem

Se ha afirmado que se forman contactos proteína proteína entre SASP de tipo \alpha/\beta mientras se encuentran unidas al ADN (Hayes y Setlow, 1998). Es posible que la formación de superficies potenciales de unión proteína-proteína inducidas por el ADN pueda dirigir la unión de otras moléculas SASP de tipo \alpha/\beta a los extremos de los racimos de proteínas unidas al ADN y por consiguiente regular la unión de proteínas (Hayes et al, 2000). La velocidad de unión original de algunas (aunque no todas) las SASP de tipo \alpha/\beta es de segundo orden con respecto a la concentración inicial de proteína no unida, lo que sugiere que pueden ser necesarios dos monómeros de SASP para cada evento de enlace productivo (Hayes et al., 2000). En vista de esto puede preferirse incrementar el nivel de SspC en la célula. Además de regular el nivel mediante un promotor fuerte o, tal como se discutió en la sección A12, mediante la secuencia de un amplificador de traslación y un lugar de unión de ribosomas consensuado con una región separadora optimizada con el fin de incrementar la traducción de SASP, se pueden insertar dos genes de SASP, en secuencia, en el genoma de lambda. Es posible lograr esto utilizando, en parte, cebadores y procedimientos descritos en las secciones
anteriores.

Por ejemplo para crear genes SspC en tándem en lugar del gen S de lambda, el gen SspC se debe amplificar mediante PCR utilizando cebadores (B6) o (B7) con un cebador reverso (B15) (Figura 12):

Cebador B15:

5'-GGACTAGTCGACGCGTTTAATGAAATTGACCG-3'

(SEC. ID nº: 24)

En la Figura 11, el tándem de genes SspC se muestra junto con los cebadores utilizados con el fin de amplificar los genes mediante PCR antes de la ligación al producto de la PCR inversa de pB/LF1. El producto de los cebadores B6 o B7 y B15 se liga en el producto de PCR inversa de pB/LF1 amplificado utilizando los cebadores B3 y B5 o B4 y B5 (ver la Figura 2). Los plásmidos resultantes, pB/SAPB2 o pBSAPO2 se digieren respectivamente con MluI y SpeI y el producto de PCR de los cebadores B16 y B8 digerido del mismo modo, se insertaron para generar pB/SABP2T o pB/SAPO2T, respectivamente.

El cebador B15 es semejante a B8 a excepción de que incorpora una secuencia de restricción única, es decir, para MluI, entre la secuencia de SspC y la secuencia de restricción de SpeI. Para el segundo gen SspC, el cebador B8 se debe utilizar con un cebador directo (B16) que comprende la misma secuencia SspC que los cebadores B13 y B23, pero que incorpora un lugar de restricción que es compatible con el producto de PCR de SspC generado a partir del cebador B15 (es decir, MluI) (Figura 11):

Cebador B16:

5'-CGACGCGTGATTCAAACAAGCTTG-3'

(SEC. ID nº: 25)

Aunque la secuencia rbs dada es la de SspC propiamente, se pueden sustituir secuencias guía alternativas con el fin de influenciar la expresión de este segundo gen SspC (ver la sección A12).

El producto de PCR resultante de la amplificación de SspC utilizando los cebadores B6 o B7 y B15 se debe ligar con el producto de PCR inversa de pB/LF1, amplificado tal como se describió en la sección A. El plásmido resultante, pB/SAPB2 o pB/SAPO2, respectivamente se deben digerir a continuación con MluI y SpeI y defosforilar. El producto de PCR resultante de la amplificación de SspC utilizando los cebadores B16 y B8 se debe digerir con MluI y SpeI y ligar a uno de los dos plásmidos digeridos anteriormente con el fin de generar el plásmido pB/SAPB2T o el plásmido pB/SAPO2T, respectivamente. De nuevo, se puede insertar un gen Cm^{r} en el lugar SpeI en el extremo del segundo gen SspC. La integración de esta construcción en lambda se puede lograr tal como se describió anteriormente en la
sección A.

Por el contrario, se podría insertar un gen de SASP diferente, tal como SASP\beta de Clostridium bifermentans, después del gen SspC o por sí solo ya que SASPB tiene mayor afinidad de unión por el ADN que el sspc, aunque no está también caracterizado (Hayes et al., 2000).

E Ejemplos del efecto de SASP

1. Un ejemplo de procedimiento destinado al ensayo de la eficacia in vitro de SASP, administrado mediante un bacteriófago portador de un gen SspC, con el fin de producir la reducción de la viabilidad de las células de E. coli es como sigue:

\newpage

i. La cepa de E. coli que se debe infectar se hace crecer durante la noche a partir de una reserva congelada o una placa de agar reciente en \lambdaLB (LB que contiene 0,2% maltosa y 10 mM MgSO_{4}).

ii. Este cultivo de durante la noche se utiliza con el fin de inocular 3 ml de \lambdaLB (hasta una OD_{600} de 0,02) que a continuación se hace crecer a 37ºC, con agitación a 350 rpm hasta que la OD_{600} alcanza aproximadamente 0,3. Una alícuota de este cultivo (1 ml) se utiliza a continuación directamente, o 100 \mul se utilizan con el fin de producir diluciones seriadas en 0,9 ml de \lambdaLB, de tal modo que la proporción de número de fagos a número de células se pueda modificar según sea necesario.

iii. Alícuotas (1 ml) de este cultivo de células se transfieren entonces a un tubo Universal estéril y se rompen los fagos, o se añade una dilución de homogeneizado de fago (generado como se describió anteriormente) (1 ml). La mezcla de células/fagos se incuba a 37ºC, sin agitación, durante 30 minutos y a continuación se añaden 2 ml de \lambdaLB reciente.

iv. Se toma la OD_{600} de cada muestra de ensayo y se extrae una alícuota (100 \mul), se diluye en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) y 100 \mul de las diluciones adecuadas se esparcen en placas de LB. Se continúa la incubación a 37ºC de las muestras y el control, con agitación a 250 rpm y a los tiempos adecuados, por ejemplo, a cada hora, se repite esta etapa.

v. Se incuban las placas durante la noche a 37ºC y al día siguiente, se determina el número de unidades formadoras de colonias (cfu) en cada placa.

2. En la tabla siguiente se dan resultados típicos (de 4 experimentos) de células infectadas mediante este procedimiento con, por ejemplo, SSPC-lambda.

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TABLA 1 Viabilidad de las células de E. coli después de la infección con SSPC-lambda

1

Se crecieron células de E. coli hasta una OD_{600} de 0,35 lo que corresponde a aproximadamente 1,4 x 10^{8} células/ml. Se infectó una alícuota (1 ml) de cultivo celular con aproximadamente 1 x 10^{10} fagos SSPC-lambda (1 ml de homogeneizado comprende aproximadamente 10^{10} fagos/ml), tal como se describió anteriormente, antes de la adición de 2 ml de LB reciente.

A partir de cuatro experimentos de infección se ha observado que a los 30 minutos post-infección de E. coli con SSPC-lambda se produce una caída \geq 60% en la viabilidad celular en comparación con el número de células preinfección; dicha caída en viabilidad celular aumente generalmente a \geq 95% a las 3 horas postinfección. La disminución en la viabilidad celular observada en los experimentos detallados en la Tabla 1 se muestra en la Figura 12.

3. Los datos anteriores se pueden comparar con la observación de rutina después de la producción de SspC en una cepa portadora de un plásmido de expresión que contiene el gen SspC. Dicho plásmido se ha construido, (pET/PIP) con el gen SspC insertado en el vector de expresión, pET24d (Novagen). En dicho plásmido, SspC se encuentra bajo el control del promotor del gen de la ARN polimerasa T7 y la producción de SspC se reprime considerablemente mediante la presencia de 0,2% glucosa en el medio de cultivo y se induce mediante la adición de IPTG (a 1 mM). Los datos de secuencia, obtenidos utilizando cebadores estándar T7 y B8, que confirman la inserción de SspC en su totalidad se dan en el Apéndice 7. La Tabla 2 detalla resultados típicos (de 3 experimentos) obtenidos cuando la cepa PTL14 (cepa BL21 \lambdaDE3 de E. coli que contiene pET/PIP) se hace crecer como sigue:

i) La cepa PTL14 se hizo crecer en 25 ml de LB con Kanamicina (30 \mug/ml) en un frasco de 100 ml a 37ºC con agitación a 250 rpm hasta una OD_{600} de 0,25. A continuación se dividió el cultivo, transfiriendo 12,5 ml a un frasco limpio de 100 ml.

\newpage

ii) El cultivo de uno de los frascos se indujo mediante la adición de IPTG (hasta 1 mM) y se incubaron los dos frascos a 37ºC con agitación a 350 rpm. Inmediatamente antes de la inducción, durante 3 horas después de la inducción a intervalos de 30-60 minutos y a las 24 horas, se tomaron alícuotas (0,5 ml) de los cultivos ensayo y control.

iii) Dichas alícuotas se utilizaron con el fin de leer la OD_{600} y generar las diluciones seriadas adecuadas en LB y se esparcieron en alícuotas de 100 \mul sobre placas de agar LB con Kanamicina (30 \mug/ml). Las placas se incubaron durante la noche a 37ºC y se contó el número de unidades formadoras de colonias (cfu) en cada placa y se utilizaron con el fin de determinar el número de cfu por ml.

Estos experimentos confirmaron que la administración del gen SspC a las células mediante un plásmido seguida a continuación de la expresión de SspC, resultó en una reducción masiva en la viabilidad celular. A las 24 horas postinducción, la viabilidad de las células portadoras del vector pET/PIP se incrementó ligeramente como resultado de mutaciones en el plásmido y/o en el huésped que inhabilitan la expresión de SspC.

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TABLA 2 Crecimiento de la cepa PTL14 que contiene el gen SspC en pET24d (Novagen) en ausencia (no inducido) o presencia (inducido) de IPTG (1 mM)

2

La reducción de la viabilidad observada en las células que expresan SspC está apoyada por datos obtenidos después del aislamiento de ADN de la cepa de plásmido PTL14 crecida e inducida o expresada tal como se describió anteriormente. Como control negativo se transformó también la cepa de E. coli NM522 con el plásmido pET/PIP (con el fin de generar la cepa PTL38) ya que NM522 no contiene el promotor de la ARN polimerasa T7 y por consiguiente no tiene lugar expresión de SspC. El ADN del plásmido de la cepa PTL14 (inducida y no inducida) y de la cepa PTL38, crecida en paralelo, se aisló de acuerdo con el protocolo de Kieser (1984). Con el fin de relajar la superhelicidad del plásmido, se incubó el ADN de plásmido de cada muestra (0,5-1 \mug) con Topoisomerasa I (2 Unidades) durante 2 horas a 37ºC. El ADN se separó a continuación mediante electroforesis en geles de TAE agarosa (5 h a 4,5 v/cm) en presencia de 0,06 \mug/ml bromuro de etidio (Keller, 1975). Después de la visualización mediante transiluminación con UV el gel se fotografió tal como se describe en la Figura 13, lo que muestra un patrón de bandas de ADN de plásmido preparado a partir de las cepas crecidas con \pm la producción de SspC.

Los carriles son como sigue:

Carril 1

escalera de ADN de 1 kb (0,25 \mug ADN total)

Carril 2

pET/PIP no inducido en cepa de E. coli BL21 \lambdaDE3 (PTL14)

Carril 3

pET/PIP inducido en cepa de E. coli BL21 \lambdaDE3 (PTL14)

Carril 4

pET/PIP inducido en cepa de E. coli BL21 \lambdaDE3 (PTL14) preparación duplicada

Carril 5

pET/PIP no inducido en cepa de E. coli NM522 (PTL38)

En comparación con ADN de pET/PIP preparado a partir de la cepa PTL38, existe un claro cambio en las formas del ADN del plásmido en presencia de SspC que es considerablemente más pronunciado bajo las condiciones de inducción (carriles 3 y 4). Bajo condiciones de expresión permeable de la ARN polimerasa T7 en la muestra no inducida existe una alteración mucho menos marcada en el perfil (carril 2). Los principales cambios de perfil asociados con el nivel elevado de expresión SspC son:

i) retraso de la forma monomérica superenrollada (1 m S/C) (carriles 3 y 4) relativo a la cepa no inducida HL21 (carril 2) y cepa BTL38 (carril 5).

ii) generación de bandas difusas que corren detrás de la formas de monómero lineal/círculo abierto (carriles 3 y 4).

El retraso de la forma de plásmido superenrollado monomérico pET/PIP cuando se induce la expresión de la ARN polimerasa T7 (carriles 3 y 4) y, en particular, las bandas difusas en los carriles 3 y 4 son características de los complejos ADN proteína. La ausencia de dichas bandas en el ADN del plásmido de las células no inducidas (carril 5) concuerta con el hecho de que el retraso y las bandas difusas son consecuencia de la formación de complejos entre el ADN de pET/PIP y la proteína SspC.

Estos datos indican que el SspC expresado a partir de una forma de plásmido también se puede considerar de aplicación potencial en aplicaciones como pesticida o a plantas GM.

4. Con el fin de demostrar la importancia de los niveles de expresión de SspC, se construyó un fago lambda con el gen SspC insertado en el gen S pero utilizando el rbs de la ARN polimerasa T7. Esta cepa (ST7PC) se construyó de modo idéntico a la SPPC-lambda a excepción de que el rbs de T7 se sustituye por el rbs nativo de SspC. A continuación del procedimiento utilizado con el fin de infectar SSPC-lambda, la infección de las células con ST7PC-lambda produjo una aceleración temporal de la pérdida de viabilidad. Por ejemplo, en un experimento típico, se observa una reducción de la viabilidad \geq 95% después de 1 hora post-infección, con una reducción \geq 99% en 3 horas (ver la Tabla 3). Tales resultados indican que la utilización de un rbs diferente proporciona un medio de modular el nivel de expresión de SspC.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 3 Viabilidad de las células después de la infección con ST7PC-lambda

3

101

102

103

104

105

\newpage

Apéndice 3

Secuencia de ADN de SspC que codifica SASP C de Bacillus subtilis cepa 168 (obtenida de Subtilist en el Instituto Pasteur)

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,4cm (SEC ID nº: 53)

4

Nota:

El gen SspC se extiende desde 1-219 (inclusive)

La secuencia terminadora se extiende desde 225-243 (inclusive)

\vskip1.000000\baselineskip

Apéndice 4

Lista de los patógenos comunes y algunos de sus fagos (esta lista es representativa pero no exclusiva).

Colifagos

Bacteriófago lambda

Bacteriófago 933W (Escherichia coli 0157:H7)

Bacteriófago VT2-Sa (E. coli O157:H7)

Colifago 186

Colifago P1

Colifago P2

Colifago N15

Bacteriófago T3

Bacteriófago T4

Bacteriófago T7

Bacteriófago KU1

\vskip1.000000\baselineskip

Bacteriófagos de Salmonella spp

Bacteriófago Felix

Bacteriófago P22

Bacteriófago L

Bacteriófago 102

Bacteriófago 31

Bacteriófago F0

Bacteriófago 14

Bacteriófago 163

Bacteriófago 175

Bacteriófago Vir

Bacteriófago ViVI

Bacteriófago 8

Bacteriófago 23

Bacteriófago 25

Bacteriófago 46

Bacteriófago E15

Bacteriófago E34

Bacteriófago 9B

\vskip1.000000\baselineskip

Bacteriófagos de Shigella dysenteriae

Bacteriófago \theta80

Bacteriófago P2

Bacteriófago 2

Bacteriófago 37

\vskip1.000000\baselineskip

Bacteriófagos de Vibrio cholerae

Bacteriófago fs-2

Bacteriófago 138

Bacteriófago 145

Bacteriófago 149

Bacteriófago 163

\vskip1.000000\baselineskip

Bacteriófagos de Mycoplasma arthritidis

Bacteriófago MAV1

\vskip1.000000\baselineskip

Bacteriófagos de Streptococci

Bacteriófago CP-1

Bacteriófago \thetaXz40

Bacteriófago 1A

Bacteriófago 1B

Bacteriófago 12/12

Bacteriófago 113

Bacteriófago 120

Bacteriófago 124

\vskip1.000000\baselineskip

Bacteriófago de Pseudomonas aeruginosa

Bacteriófago D3

Bacteriófago \thetaCTX

Bacteriófago PP7

\vskip1.000000\baselineskip

Bacteriófagos de Haemophilus lnfluenzae

Bacteriófago S2

Bacteriófago HP1

Bacteriófago flu

Bacteriófago Mu

\vskip1.000000\baselineskip

Bacteriófagos de Staphylococcus aureus

Bacteriófago Twort

Bacteriófago tlll-29S

Bacteriófago \thetaPVL

Bacteriófago \thetaPV83

Bacteriófago \theta11

Bacteriófago \theta12

Bacteriófago \theta13

Bacteriófago \theta42

Bacteriófago \theta812

Bacteriófago K

Bacteriófago P3

Bacteriófago P14

Bacteriófago UC18

Bacteriófago 15

Bacteriófago 17

Bacteriófago 29

Bacteriófago 42d

Bacteriófago 47

Bacteriófago 52

Bacteriófago 53

Bacteriófago 79

Bacteriófago 80

Bacteriófago 81

Bacteriófago 83

Bacteriófago 85

Bacteriófago 93

Bacteriófago 95

Bacteriófago 187

\vskip1.000000\baselineskip

Bacteriófagos de Chlamydia

Bacteriófago \thetaCPAR39

\vskip1.000000\baselineskip

Micobacteriófago

Bacteriófago L5

Bacteriófago LG

Bacteriófago D29

Bacteriófago Rv1

Bacteriófago Rv2

Bacteriófago DSGA

\vskip1.000000\baselineskip

Bacteriófagos de Listeria monocytogenes

Bacteriófago A118

Bacteriófago 243

Bacteriófago A500

Bacteriófago A511

Bacteriófago 10

Bacteriófago 2685

Bacteriófago 12029

Bacteriófago 52

Bacteriófago 3274

\vskip1.000000\baselineskip

Bacteriófagos de Klebsiella pneumoniae

Bacteriófago 60

Bacteriófago 92

\newpage

Bacteriófago de Yersinia pestis

Bacteriófago R

Bacteriófago Y

Bacteriófago P1

\vskip1.000000\baselineskip

Apéndice 5

Lista de receptores y ligandos de bacteriófagos de bacterias y otras células (La presente lista es representativa pero no exclusiva).

106

107

\newpage

Apéndice 6

Datos de la secuencia de SSPC-LAMBDA (solamente la cadena positiva), obtenida utilizando los cebadores:

\hskip0,4cm 13FI y B30 /ver la Figura 7, Sección A11):

\hskip0,4cm (SEC. ID nº: 54)

5

\newpage

\hskip0,4cm B54 y B55:

\hskip0,4cm (SEC ID nº: 55)

6

Apéndice 7

Datos de la secuencia pET/PIP (solamente la cadena positiva), obtenida utilizando los cebadores:

\hskip0,2cm T3 y B8

\hskip0,2cm (SEC ID nº: 56)

7

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Proteína de espora soluble en ácido pequeña y utilizaciones de la misma

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 206308/JND/RD/sv

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn versión 3.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> polipéptido típico con actividad SASP tipo \alpha/\beta

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

8

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

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<211> 26

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia del cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aactgcaggg tcacttcgac gtatcg

\hfill

26

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

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<211> 25

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Secuencia de cebador

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<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctctagagc tcatacatca atctc

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catgccatgg tcatgtctta cc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catgcttcatg tcttacc

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggactagtga aatcaataat caacg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctcaacaaa gtagatcaag

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catgccatgg ctcaacaaag tagatcaag

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggactagttt aatgaaattg accg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400>10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtactgatg tgatggctgc tatgg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcaacatcat cacgcagagc atc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caacagtact gcgatgagtg g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtagtgagat gaaaagag

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtaggtaatg gcgttatcac g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtggtgcgt aacggcaaaa gc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgggatccga ttcaaacaag cttg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210>17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgggatccca tcttcatgtc tttac

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aactgcagcg ctgtgacgat gctaatcc

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aactgcagga ttcaaacaag cttg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacaggcgcc gattcaaaca agcttg

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacaggcgcc agtatacact cc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctatttactg attactc

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cttaatctgc tgcaatg

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggactagtcg acgcgtttaa tgaaattgac cg

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgacgcgtga ttcaaacaag cttg

\hfill

24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus subtilis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

9

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus subtilis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

10

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus subtills

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

11

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus subtilis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

12

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus megaterium

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus megaterium

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus megaterium

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus megaterium

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus megaterium

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus megaterium

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus megaterium

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus megaterium

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

20

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus megaterium

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus cereus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus cereus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

23

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus cereus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus stearothermophilus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thermus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

26

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Clostridium bifermentans

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Clostridium bifermentans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Clostridium perfringens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Clostridium perfringens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Clostridium perfringens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sporosarcina halophila

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sporosarcina ureae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

34

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Sporosarcina ureae

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

36

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Thermoactinomyces thalpophilus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 272

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus subtilis

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 823

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Datos de la secuencia de SSPC-LAMBDA obtenidos utilizando los cebadores 13FI y B30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

39

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 566

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Datos de la secuencia de SSPC-LAMBDA obtenidos utilizando los cebadores B54 y B55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

41

42

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 402

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Datos de la secuencia de SSPC-LAMBDA obtenidos utilizando los cebadores T3 y B8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de pB/LF1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtaagacat gaagatgcca gaa

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus subtilis

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atggctcaac aaagtagatc aagatcaaac

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de pB/SAPB

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtaagacat gaagatggct caacaaagta gatcaag

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Secuencia de pB/SAPO

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtaagacat gaccatggct caacaaagta gatcaag

\hfill

37

Claims (31)

1. Polipéptido con actividad SASP de tipo \alpha/\beta, destinado a su utilización como un medicamento.

2. Polipéptido según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos:

mannnssnsnellvpgaeqaidqmkyeiasefgvnlgadttarangsvgge itkrlvqlaeqqlgggtk (SEC ID nº: 1), destinado a ser utilizado como un medicamento.

3. Polipéptido según la reivindicación 1, que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de SEC. ID nº: 26 a nº 52 destinado a su utilización como un medicamento.

4. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, que comprende mutaciones y/o deleciones que no reducen la actividad SASP de tipo \alpha/\beta del mismo, destinado a su utilización como un medicamento.

5. Utilización de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para la preparación de un medicamento destinado a inhibir o prevenir el crecimiento celular de los microorganismos.

6. Utilización según la reivindicación 5, en la que el crecimiento celular comprende el crecimiento celular bacteriano.

7. Utilización según las reivindicaciones 5 ó 6, destinada a la preparación de un medicamento para la terapia humana.

8. Utilización según la reivindicación 7, destinada a la preparación de un medicamento para el tratamiento de infecciones tópicas, caries dentales, infecciones respiratorias, infecciones oculares o infecciones localizadas en órganos.

9. Utilización de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, como descontaminante microbiano.

10. Utilización según la reivindicación 9, que comprende tratar las contaminación microbiana superficial, la recuperación de suelos o el tratamiento del agua.

11. Utilización de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, como agente antimicrobiano en el tratamiento de material vegetal.

12. Utilización de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el tratamiento no terapéutico de las plagas con el fin de eliminar las bacterias intestinales de las mismas.

13. Polinucleótido que codifica un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, destinado a su utilización como medicamento.

14. Polinucleótido según la reivindicación 13, que comprende ADN, destinado a la utilización como medicamento.

15. Polinucleótido según la reivindicación 14, que comprende el gen de SspC de B. subtilis, destinado a la utilización como medicamento.

16. Utilización de un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, destinado a la preparación de un medicamento para inhibir o prevenir el crecimiento celular de los microorganismos.

17. Utilización según la reivindicación 16, en la que el medicamento comprende el polinucleótido.

18. Utilización según las reivindicaciones 16 ó 17, en la que el crecimiento celular comprende el crecimiento celular bacteriano.

19. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, destinado a la preparación de un medicamento para la terapia humana.

20. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, destinada a la preparación de un medicamento para el tratamiento de infecciones tópicas, caries dentales, infecciones respiratorias, infecciones oculares o infecciones localizadas en órganos.

21. Composición destinada a inhibir o prevenir el crecimiento celular que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15 y un sistema de administración para la misma que se puede dirigir a una célula.

22. Composición según la reivindicación 21, en la que el sistema de administración comprende un virus y el polinucleótido se encuentra incorporado al genoma del virus.

23. Composición según la reivindicación 22, en la que el virus comprende un bacteriófago que se puede dirigir a una bacteria.

24. Composición según la reivindicación 23, en la que el bacteriófago es un bacteriófago no lisogénico.

25. Composición según la reivindicación 24, en la que el bacteriófago no lisogénico comprende un bacteriófago lisogénico con por lo menos un gen de lisis inactivado.

26. Composición según la reivindicación 25, en la que por lo menos un gen de lisis se encuentra inactivado mediante la inserción del polinucleótido.

27. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, en la que el virus se ha modificado con el fin de incrementar o alterar su especificidad de huésped.

28. Utilización de un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 como descontaminante microbiano.

29. Utilización según la reivindicación 28, que comprende tratar la contaminación bacteriana superficial, la recuperación de los suelos o el tratamiento del agua.

30. Utilización de un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, como agente antimicrobiano en el tratamiento de material vegetal.

31. Utilización de un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el tratamiento no terapéutico de las plagas con el fin de eliminar las bacterias intestinales de las mismas.