PT1343896E - Proteínas pequenas de esporo solúveis em ácido e suas utilizações - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO C Αΐ?4 ΪΓ«20Α13Α CAT ΤΥΧΗ? T €2 ΐΓ C7T&,€2 ίτ jrCx^ X jí>i wL j^í*x,53 -Br y oW-Πιυ1 ^sL· JSit w ju y V ο χ AwXwv j£L< ί2·«ν*χ,53 rrrfi ττ Tiyii A ΑΪ39 C1 e> UX J.LÍ. iwiXLUfií & A presente invenção refere-se a polipéptidos, polinucleótidos e suas composições para utilização coiro medicamentos, pa.rt icuiarmente para inibir ou prevenir o crescimento celular, tal como o crescimento celular bacteriano.

Antecedentes da Invenção

As bactérias que formam esporos formam uma classe relativamente pequena de bactérias que são capazes de produzir endosporos. Os endosporos são formas de sobrevivência não reprodutiva de dormência das bactérias que são resistentes a ambientes inóspitos, tais como temperaturas elevadas, agentes químicos perigosos e lesão provocada por luz UV. Estas bactérias que formam esporos compreendem espécies de Bacillus, Clostridi a e Sporosarcina, assim como uma estirpe de Thermoactinomyces e outras espécies menos comuns de Sporolactobacillus e Oscillospíra. Durante um processo de esporulação são produzidas uma. ciasse de proteínas conhecidas como as proteínas pequenas de esporo solúveis em ácido (SASP) . As SASP são solúveis em ácido e possuem baixos pesos moleculares entre 5 e II kDa. As SASP são descritas como possuindo dois papéis principais nos esporos bacteríanos: primeiramente, actuara para proteger o ADN do esporo 1

das lesões por UV, calor, despurinação e muitos agentes químicos potencialmente perigosos; e em segundo lugar, as SASP proporcionam uma fonte de aminoácidos livres durante a germinação do esporo, sem a qual as novas células vegerativas não podem crescer.

Em espécies de Bacillus existem três tipos de SASP, conhecidas como SASP de tipo α, β e yc As sequências de aminoácidos de SASP de tipo α/β são altamente conservadas quer dentro da mesma espécie como entre espécies (~7G% de identidade e -80% de semelhança, sem intervalos para espécies de Bacillus), Todavia., essas proteínas não apresentam semelhança de sequência com qualquer outra família de proteínas e não contêm quaisquer motivos característicos de outras proteínas de ligação a ADN (Setlow, 1988) . As SASP de tipo α/β estão infimamente relacionadas ímunogenícamente, possuem pesos moleculares de aproximadamente 6,2-7,6 kDa. e possuem uma percentagem significativa, de aminoácidos hidrof óbicos (até 30%) (Setlow, 1988) . As SASP de y possuem um peso molecular de 8-11 kDa, são extremamente baixas em aminoácidos hidrofóbicos grandes (<11%) e possuem pontos isoeléctricos mais elevados do que as SASP de tipo α/β da mesma espécie (Setlow, 1388), Num dado organismo qualquer, existem duas SASP principais do tipo α/β, assim como muitas SASP menores de tipo α/β, cada uma codificada por um único gene (Setlow, 1988). Contrariamente, todos os organismos que foram examinados têm apenas uma SA.SP de tipo γ e a sua função é bem diferente da das SASP de tipo α/β, sendo utilizadas principalmente para fornecer aminoácidos para o crescimento (Hackett e Setlow, 1987), E apresentada uma lista de todas as SASP de tipo α/β que foram sequenciadas até à data no Apêndice 1, juntamente com as sequências da sua proteína relacionada. Ά 2 extensão dos resíduos de aminoácido conservados entre estas sequências de proteínas é apresentada no Apêndice 2. Vár los e s t;. udos sobre SASP foca rami-se na cara cter ção do moc io mel o qual as SA.SP de tipo α/β protegem c i ADN i. Θ 5 r>ão p r-> }·' UV. Num estude (Setlow et aí 1991) foi inseri .do u rp íj0 ne (ssp C) coc lif í ca: ndo um a SASP de tipo α/β num plasmídeo sob o cc >ntroio de um promo tor ir id utível para demonstre ;r que a S 7^ Q '[) 1". ci Z í com , que A.Df ‘i cle uma c 0 lula vegetativa assu ma. característ icas d e t. i po esp )02ΓΟ . Observ O' U36 CJlIG ci. J-lCfSlÇáO ΟΛ c SASP de tipo α/β ci ADN 0 '* & , coli prov o cou rim aumento na densidade de super- -hélí C 0 negativa do plasmídeo, sugerindo una alteração concomitante na estrutura, do ADN. Postulou-se que uma alteração na conformação do ADN de tipo B para tipo A protege o ADN contra a luz UV.

No campo da medicina, a regulação do crescimento celular é uma preocupação fundamental. 0 crescimento celular no corpo está sujeito a um controlo restrito; este inclui tanto as células que cc :>mp reenc em C'1 ^ bc ict O J_‘ S_ p\ -p; as comc C.l -·' px c] cirnen U 0 de sc tecidos e órgãos do corpo bem como as células :aís, tais como a pele e a flora gástrica. 0 crescimento descontrolado de microrganismos, tais como bactérias ou fungos pode ser problemático ou colocar em risco a vida de um doente. 0 tratamento comum para iníecções bacterianas, em particular, envolve a utilização de antibióticos convencionais que podem possuir um espectro de actividade alargado (tal corno a penicilina) que normalmente funcionam du.reccionando-se para as paredes celulares bacterianas. Outras ciasses de antibióticos actuam através da inibição da síntese proteica na célula bacteríana, embora muitas destas também apresentem níveis variáveis de toxicidade contra, células de humanos e outros animais. As bactérias podem tornar-se rapidamente resistentes a antibióticos convencionais e as estripes "super resistentes" s estão agora a emergir. Por isso, existe uma necessidade ciara de alternativas aos antibióticos presentemente disponíveis.

Sumário da Invex^çao

Num primeiro aspecto, a presente invenção proporciona um polipéptido possuindo actividade de SASP de tipo cx/í$, para utilização como um medicamento. c é r u r a s bacterianas, e a1guma s células eucariotas, tais como células de fungos. Um polipéptido. de acordo com a presente invenção. pode compreender qualquer péptido, oiigopéptido, proteína e pode existi r: na forma monomérica ou mu l.t imbrica, com ou sem modificação covalente, tal como modificação pós-tradução, incluindo glicosilação. Polipéptidos típicos, de acordo com a presente invenção, compreendem a sequência de aminoácidos:

Foi descoberto surpreendentemente que o polipéptido da presente invenção pode ser utilizado como um medicamento, particul.arm.ente para inibir ou prevenir crescimento celular não desejado, tal como crescimento celular que é patogénico para um indivíduo. Esse crescimento celular inclui o crescimento por ma©

De um modo preferido, o polipéptido compreende qualquer uma das sequências de aminoácidos apresentadas no apêndice 1, tal como a codificada pelo gene sspC de Bacillus subtilis, como apresentado no apêndice 3. Qualquer um destes polipéptidos pode 4 conter mutações e/ou deteções, tal corno as produzidas por mutagénese aleatória ou por mutagénese dirigida, que não reduzem substancialmente a sua actividade de SASP de tipo α/β. Apesar do grau elevado de conservação de sequências entre proteínas SASP naturais, existem diferenças significativas nas afinidades de (Setiow et aí., 1932). Existe o potencial para conceber sequência S 0- 0 prot eína s SA .SP para aumentar a afinidci.de da prot ei na para o A DM a. ]. v o. Ne sta base pó de ser dg: ssivel utrl ,:j r 3. v 3.1' _i. ó. C c i q jq ; íturai nas SASP ou const: rui .r SASP pa ra optimiz, ar o dire c c i o n amen to de dife rente s espécie s de bactér ias e/ou g enes dese num Ci ado o rgan ismo. Gera l.men te / a a. c t. i V idade de SASP ( de tipo a/S oode ser me ci i d a. aval iando 0 Θ s t' e d. t. o cio pol i pép t .r. ci o ; oa conformação do A.DK N A acti vidad .e das SASP de tipo OÇ podi e, por isso , ser defí nida como a c a ρ ói c n .d£ ide para conve. V' 0 r ADN de uma confc irmação do tipo B p; η r a η ;ma. conform ação do tipo A. Es ta pode ; oer medida. por qu a 1 συ e r um.a d. a s seg uint Θ S Γ. Θ cni c a s * (a) Uma re f erên c i a para QP 0 crever a alteração na conform a a 3. o '30 Γ. i p Q •p. ρ a Γ- a :. A é Mo! 1 Ά e c a i. * f 1391. As alterações nos espe ctros 0.Θ d. ic.ro -j O. j"p 0 cir cular sã. o conside radas há m ui to temp o c om o cr rtér 1 0 ^ sen síveis í- :ara conf ormações e cl a ç q ;· «.Λ. -j_ o «... inço es de A .DN s rntre as principa is famili; os de estrutura 3 0 0 0 nd.ár i a SãO ineq uívoc as (Mohr et aí v, 1391 ). A intera cção quer d.e ADN eucariota ( \ timo i de vitela) como de A.DNs pro cariotas com SASP de tipo of/ 3 (em particular experiências utí rizando SspC CÍ0 B. subti lis) induz particularidades esp ectroscõpica s caro d ϋ a 0 .T .1 S t" À. c a .s de A-ADN. A espectroscopia d.e infra-verme lhos transfoi ;mada. de Fourier í FTIR) pro porcrona um mer: t indepenc iente de avaliar o estado coniormacionai de ADN complexado com SASP de tipo α/β o espectros de FTIR de soluções concentradas de ABN de timo de vitela apresentam uma banda de absorção principal a 122 5 crrf" que surge da vibração de estiramento do fosfato O-P-O anti-simétrico {Mohr et al 1991}* Esta banda desvia para 124 6 cirmL com SspC de timo de vitela, Esse comportamento é característico de uma transição de B para A, embora deva ser referido que os efeitos de hidratação, ísoladamente, também podem influenciar a posição desta banda de estiramento O-P-O. Por isso, pode ser utilizada uma ma: adicional de transição de B para A, compreendendo o aparecimento no espe ctro de FTIR do complexo SASl '“ADJSi ( prooorcão de 1:1) ίΐθ ma banda de absorção a. 1185 cm"1 , I é um marcador esu ps ,·'* Ί f ico para a conformação A de ADN, vez que nem a fori 71 cL tu ΓΊΘΠ7 3. C do ADN produzem uma banda infra-vermelhos a 118 5 cm"1 í Phole e Fritzsche, 1980). efeitos de hidratação não influenciam ou afectam a análise da banda de 1185 cm"1. Os resultados de FTIR demonstram que, embora a desidratação possa provocar uma aiteraçã.o na. conformação do ADN de tipo B para A, as SASP promovem esta alteração de conformação de modo a que alcance a conclusão com signif icat i vamente menos redução na humrda.de do que é necessário para o processo com. ADN isoladamente {Mohr et al, 1991). <b) Também, as SASP ligadas a ADN irão proteger o ADN da degradação por ADNase (Setlow et ai,, 1992), São possíveis >, c; para demonstrar que ãS SA .SP 0 um á .eido nucleico gí : dige stã ura ens; uo elecurororél tico, Θ . t Θ f 0 3. eido nucleico {:. ncluir ! d.o mais dírecto. Cl9 e pUBl10) é incubado com várras quantidades de SASP durante 1 hora a 37 °C. Neste momento, é adicionada ADNase I (ou nuciease de b S, aureus) e a incubação é realizada durante 15 min antes de adicionar SDS/EDTA seçurdo por NaCl e etanol para precipitar o ADN, 0 ADN precipitado é analisado por electroforese era gel de agarose (2%) (para polinucleótídos) ou acrilarnida (oligonucleótidos). A protecção tanto de pUC19 como de pUBilG é óbvia a uma proporção de SASP para ADN de 1:1 e é máxima a uma proporção de 4:1. A análise de protecção de ADNase para quatro outras SASP de tipo α/β indica que estas proteínas também conferem resistência a ADNase para este plasmídeo. As SA5P-I de Bacillus cereus e SASP-A apresentam padrões semelhantes de bandas protegidas, enquanto que as SASP-oí e β de Clostrídia bi fermentaria produzem padrões diferentes ÇSetlow et ai., 1992) . 0 segundo ensaio é um ensaio de precipitação ácida. stões com e nzimas de SspC (propor Ç-Siv c3.0 Β β 1 f orar anal) i. S ci d cl. S O O -TC ra as enzimas ricas em Dâ2T~L ( TTT AA A) foi <10%. ; em GC no sítio de gáo co Π O UZ cX P .0 O t". 0 C Ç 0 O izimas que reconhecem GGTAO C) send .o inrbidas sidade G ct. S1J p ΘΠ Θ1 .1. c 0 de tc jpoisomt uase r. 0 - forne eido eir 1 Nicholson (c) SASP ligada a ADN protege o ADN contra clivagem por enzimas de restrição, particularmente aquelas com especificidade para sequências ricas em GC (Setlow et al., 1992) . Foram realizadas as dige restrição de ADN de pUC19 ligado poj de SspC para ADN) e as digestoe: electroforese em gel de agarose. Pí sequências AT, i. e., a inibição de 0 aumento dos níveis do conteúd reconhecimento da. enzima de restri iumentad.a 5 Θ Q”U Θ11C13.3 negativa dos plasmídeos na presença método para quantificar este efeito í / são incubadas durante a noite et ai,, 1 990b, Em resumo, amostras de 1 pg de plasmideo (pUC19 ou pUBUO) num volume de 20 pL de mistura de reacção a 4 °C com várias quantidades de SspC, seguido por adição de topoísomerase I e posterior incubação durante 2 h a 37 °C. Após desproternização, as amostras são analisadas por electroforese em géis de agarose contendo cloroquina (2 pç por mL) . O valor médio de super-enrolamentos negativos pode ser determinado comparando a poszção das bandas no gel de agarose com um conjunto de padrões preparados incubando o ADN de plasmideo com topoisomerase na presença de quantidades diferentes de brometo de etídio (Nícholas e Setlow, 1990). A ligação máxima de SspC resulta na introdução de um grande número de super-enrolamentos negativos em ambos os plasmídeos. Com 12 pg de SspC adicionados ao ADN plasmídico são introduzidos aproximadamente 18 e 38 super-enrolamentos em pUC19 e pUBllO, respectivarnente. Uma vez que o pUC19 tem aproximadamente 60% do tamanho de pUBll.0, a densidade de super-hélice induzida em ambos os plasmídeos por ligação ao SspC é semelhante. Note-se que a ligação de proteína HIJ ao ADN que não induz a alteração de conformação B em A no ADN apenas induz -40% do número de super-enrolamentos negativos por unidade de ADN como o faz SspC (Nicholson et ai., 1990). <e) Também, a SASP ligada a ADN protege contra a formação de dlmeros de timrna de tipo crclobutano após irradiação com UV, mas promove a formação de fotoproduto de esporo, uma adução entre resíduos de timina adjacentes {Nicholson et al.,f 1991). Os rendimentos de dímeros de pirimidina e fotoproduto de esporo (SP) foram <0,2% e 8% da timina total, respect ivamente, quando o ADN saturado com SASP foi irradiado a 254 nm com 30 kJ/nb. Na ausência de SASP os « rendimentos foram revertidos -4,5% e 0,3%, respectivamente (Nicholson et ai., 1991) . Os rendimentos de SP in vivo, i. e., nos esporos e dimeros de timina em células vegetativas sâo semelhantes e extremarnente elevados {>25% da timina total) (Donnellan e Setlow, 1965), A irradiação do ADN com UV in vitro também proc luz normalmente at iuções de brprrrmrdrna fluoresc :entes, dirm ;ros de citosina do tipo ci.clobu.tano e também, c 11 meros de c i c 1 o butano entre c itosina e timina, berr :. como uma adução d.0 6-4 bipirimi' dina. Os rendimentos de todos : os tipos de fot< oproduto são f ortemente reduzidos aj: )ós irradie ;LÇãO, r n Vil ;ro, de ADN ligado por SASP de tipo α:/β Fairhead e Setlow, 1931) 3ASP de tipo oí/3 reduz a itro em, pelo menos, 2 0 sos diferentes para medir airhead et al,, 1993. (f) Também for demonstrado que a taxa de despurinação de ADN in vezes. São apresentados três proc· a despurinação de ADK in vzii.ro em presente invenção proporciona um :omo definido acima,

Noutro aspecto, a inucleótido codificando um polipéptidc a utilização como um medicamento.

Neste aspecto da invenção, embora se pense que o polipéptido a a espécie activa, a distribuição do polinueleótido a ulas alvo para a expressão nestas pode resultar no ipéptido expresso inibir ou prevenir o crescimento da célula, 0 p olinu creo fido pode ser ADN ou ARN, c leç ;ende di str •ibu iç :ao l '.! t iil zado. Embora sei a pref θ Γ ido, abil i dade e f a c 111 .dade de mani pui. 3. Ç â O / qu ( 3 0 a ADN ! Q for utii izado ARN, isso eiimir ícl a po 5ASP : Lnibij cl sua própria produção . Numa f orma ado do sistema por razões de polinueleótido ssibilidade de de realização y partic· ularmente preferid O. / o ADN compreen .de o gene sspC de B, subtil is. A degeneração do código genétícc :> permite mutaçô es que não al teram a sequência de arai no ácidos da producblo de exp cessão do ADN - 0 ie ser utilizado p ara a prep 13. Σ cl Ç <3.0 de um medicamento para inibir ou prevenir o crescimento celular de vários modos. Numa forma de realização, o medicamento compreende

o po. 1 inucd l.eót ido, t. ípicamen cu\ formulado para administração a um indi\ ríduo. Noutra forma de realização, o polinucieótido utíli _ Z eido para o fabrico de um medicament o compreendendo O poiipéptido. Noutra forma de realização, o medicamento pode ser produzido dentro da célula alvo como o poiipéptido.

Sem desejar estar limitado pela teoria, foi postulado que o poiipéptido, quando presente na célula alvo, liga-se ao ADN da cé 1 u 1. a p rj ·[·" p, γ "[ rp, a repiicação desse ADN. 0 ρ olipéptido pode tambérr i inibir ou prevenir completar nente ou parcialmente a transe :rição do ADN com ci o quaj. e... t u associada. Deste modo, o crescimento celular adicional é inibido ou prevenido. Particul.arm.ente no caso de infecção celular microbiana, a prevenção ou inibição do crescimento permite ao sistema imunitário de um indivíduo a oportunidade de lidar com as células infectadas. Outro aspecto é que a ligação de SASP a ADN pode prevenir que as células expressem genes envolvidos na evasã.o de sistemas imunitários dos hospedeiros.

Noutro aspecto, a presente invenção proporciona uma compo si çã.o cara inibir O Li prevenir crescimento celular compr θ θ η ο θ n. c l.o um pol.ipéptíd r-\ ^ ( como defin u.do acima, e um seu sis te ma de distribuição. 11- outr O cl 8 Ρ Θ C t O ? a presente invenção propo rciona uma composição ρ ara inibir ou prevenir o crescimento ru celular compreendendo um polinucleótido corno definido acima e um seu sistema de distribuição que é capaz de se direccionar para urna célula.

As composições de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas tanto para objectivos medicinais como não medicinais. Quando são utilizados para objectivos medicinais, tal corno aqui discutido, existe uma necessidade para assegurar que o sistema de distribuição utilizado é adequado para tratar o estado médico relevante. É preferido utilrzar a composição contendo polinucleótido porque esta pode ser distribuída as células alvo através de sistemas de distribuição que são baseados em polinucleótidos, tais corno vírus. Quando o sistema de distribuiçã.o compreende um vírus, o polinucleótido pode ser incorporado no genoma do vírus e pode por isso utilizar os mecanismos virais de direccíonamento para a célula para entrar na célula de modo a. que o polípéptido possa ser expresso na célula para ter efeito. Quando a célula alvo é uma célula eucariota, pode ser modificado e utilizado um vírus eucariota, tal como adenovirus, HSV, HIV, ou qualquer outro vírus possuindo um tropismo especifico pa.ra a. célula alvo.

Numa forma de realização particularmente vantajosa da presente invenção, o vírus compreende um bacteriófaço (i, e., um vírus bacteriano). Os bacteriófagos são geralmente capazes de se direccionarem a bactérias e são normalmente muito específicos no sentido em que as espécies de bactérias terão a sua gama de bacteriófagos única. Para além disso, cada estirpe bacteriana pode muito bem ter, pelo menos, urn bacteriófago que é único para. essa estirpe, Assim, utilizando um bacteriófago como um sistema de distribuição, assegura que nenhuma bactéria, para além daquelas consideradas alvo, será infectada. Uma lista de n patogénios comuns e alguns dos seus bacteriófagos é apresentad no apêndice 4. r i ó faao, inclui nd.o f a.gos 3 t i lamentosos ou f 3. Cf 0 S 0; s bacteriófa Cf O uj Çj odem ple s, aos quais a SAÍ >P é ADN de cadeia < iupi a ma 1 s d. 1 i zar um bacter i6faço que lisogénicos tais como lambda, fagos iíticos, que não são lisogénicos compreender ADN ou ARN de cadeia si incapaz de se ligar, assim como o comum, tal como lambda. É preferido i não pode estabelecer lisogenia, ou um fago lisogénico que foi tratado de modo a que um gene envolvido no estabelecimento da lisogenia seja inactivado. Em qualquer dos casos, é preferido inactivar, pelo menos, um dos genes codificando produtos envolvido processn 1 í.tico. vantajoso porque prevenção da lise da célula alvo evita que os conteúdos tóxicoí da célula sejam libertados e afectem adversamente o hospedeiro. ma. desvantagem dos antibióticos convencionai . s é que urna vez que s antibióticos sejam admini strados a um indivíduo, o ebentamento da par ede da célula Ό 3. C t Θ 2Γ Í cl Π 3. pode ser fatai para o hospedeiro devido a uma resposta imunitária massiva ao componentes c la. parede da. célula. E ste problema j. é evi uad< prevenindo a J. .1S 6 d 3. C Θ J. ala bacter.lana. de acordo cc sm a presente invenção. A inactivação de um gene de lise é alcançada convenientemente inserindo no gene o polinucleótrdo de acordo com a presente invenção. Isto pode possuir uma outra vantagem no sentido em que a expressão dos genes de lise ocorrem sufie.ientem.ente tarde no ciclo de vida do fago que muitas partículas fágicas podem ser produzidas numa célula hospedeira antes de o polipéptido ser expresse peio polinncieótido. iz

Os genes de li se típicos incluem o gene S do bacteriófago lambda. Este gene codifica uma holina, que é uma proteína que forma poros na célula hospedeira que depois permite que outras enzimas liticas produzidas pelo bacteriófago provoquem 1ise. Pode ser ai inserido um polinucleótido da presente invenção, ou o gene S ser largamente substituído e, de um modo preferido, fica sob o controlo do promotor PR do gene S. Analogamente, o polinucleótido pode ser inserido num dos outros genes envolvidos no cicio lírico, tal como o gene R, 0 produto do gene R é uma transgiicosiiase litica. Neste caso, o gene S pode ser adicionalmente desactivado ou nâo. Podem ser utilizados genes equivalentes noutros tipos de bacteriófago de um modo análogo como iocaiizações para o polinucleótido, quando se dirige a outras bactérias sem serem E. coli.

Noutra forma de realização, o polinucleótido pode estar localizado noutro locai no cromossoma do bacteriófago e colocado sob o controlo de um promotor de bacteriófago ou bacterrano. Opcionalmente, a produção de uma ou mais proteinas envolvidas na lise pode ainda ser inibida. Alternativamente, o ciclo litico pode ser deixado a percorrer o seu curso. Por exemplo, é possivel utilizar promotores bacterianos que reagem a induções encontradas num hospedeiro em condições de infecção, tais como promotores sensíveis à temperatura, o promotor P3 do iocus agr de StspkylGcoccus aureus, ou outros promotores envolvidos em duas vias de regulador de sensor de componente. Outros exemplos incluem promotores activos em condições microaerofílicas, em condições de baixo ferro ou aqueles estimulados por factores específicos do hospedeiro, tais como ácido nicotínico ou iões de magnésio. 13

Noutro aspecto, o vírus pode ser modificado para aumentar ou caso de infectar a cauda infectar alterar a sua especificidade para o hospedeiro. No bacteriófagos, estes podem ser projectados de modo a tipos de células diferentes de bactérias modificando para criar afinidades diferentes e/ou capacidade para células. Por exemplo, foi demonstrado que o tropismo de células de mamífero pode ser conferido ao bacteriófago filamentoso apresentando um ligando que se liga a urna molécula de superfície de célula de mamífero na proteína da capa do bacteriófago (Larocca et al. 1998). Por exemplo, foi demonstrado que quando um fago M13 é construído de modo a apresentar geneticamente o ligando do factor de crescimento, FGF2 (como uma fusão da sua proteína da capa menor pIII), adquire a capacidade para distribuir um gene às células de mamífero através do receptor FGF resultando em células transduzidas (Larocca et al., 1999) .

Outros investigadores também relataram descobertas semelhantes utilizando um fago que apresenta um anticorpo de cadeia única (scFvc) dirigido contra Er'bB2, um membro da família de receptores EGF (factor de crescimento da epiderme) (Poul e

Marks, 1999). A selecçâo de fagos construídos para transferir genes mediados pelo receptor para células de mamífero pode ser aumentada peio rastreio de bibliotecas de fagos para ligandos funcionais capazes de distribuir ADN a células (Kassner et al.,

Uma barreara para Caudovirales (bacteriófagos com cauda) infectarem células diferentes do seu hospedeiro natural é a falta de um receptor apropriado presente na superfície da bactéria alvo, à. qual o fago pode absorver. Através da abordagem deste assunto é possível criar fagos que contêm o mesmo ADN modificado (i. e., contendo SASP), mas que pode dirigir-se a intervalos largos de hospedeiros. Por exemplo, um fago pode ser 14

Aiternatívamer ite, c ) fago de em cabeças de fago idêntico, iade de caudas, expressando es expressos por di fere modificado para permitir que se dirija a um receptor que é comum em várias espécies de bactéri; modificado pode ser empacotad qual foram fornecidas uma var uma afinidade para receptores bactérias. Os bacteriófagos também podem expressar fragmentos de anticorpo como proteínas de fusão. Por exemplo, o fago fusão .mentoso Ml 3 foi construído para expressar uma prot velr ia de o g3p c empreender ido um fraamento V 3. -T.’ _i. 8.1/ Θ .1. G 0 C 3 dela ' ú n i ca de .çãe ae antigénio de Helicobacter pylori (ScFv) (Cao et c? 1 2000), Este fago dc ϊ ScFv dimir luíu as efu de todas as estirpes de H. pylori Le & l, tidt ís . '.Vambérn pode ser possível induzír uma bactéria adm f('· 8. exi rressar um i . 0 C Θ ρ L O .L Θ s colhido. Por exemplo, j á foi demons trado que espéc ies de Pseudomonas podem ser modificadas P 8ΙΓ cl expressar receptores de LamB, que são 0 receptor pa: ra o ba .cteriófago lambda (de Yries et a. 1. , 1984) . 0 gene, lamB, que codifica introduzido em Pseudomonas inse rço es no cromessc )ma G0 homó log a. Embora nem S 0 í npre com plc ismídeos, é po s s í v θ .1. bact 0 01 as Gram negati \7 3 d ; po estes receptores de proteína. é por meio de um plasmídeo e as Pseudomonas através de recombinação seja praticável transformar células distribuir o gene lamB a quaisquer meio de um bacteriófago lisogénico de Pseudomon ‘ãS susc ::eptív· eis a infecção administrado subse; quente mente. Podem destes fagos modí fií 8 ci d O S para cada espéc para alargar a gama d.0 h C spedeiros de qu modificado especifico para o alvo ± ãíí ieve b o controlo de um pre imotor bc xeteriano fort 0 0 O iago aeve ser alterado de modo a que a i :i .soaenia sei a sempre estabelecida. Ά administr ‘608.0 deste tipo de fago, então, irá tor ί í 8. .1. 8. uà espécies através de SASP/lambda ier \ irdos outros e de a 1 v o e irá actuar 1 quer 0.3. G G bacteriófago

Nestes casos, é possível estender a gama de bactérias que a;n fago contendo SASP pode ter como alvo, pelo menos, dentro das vastas categorias de bactérias Gram positivas ou Gram negativas.

Estão disponíveis comercialmente bacteriófagos modificados que foram concebidos especificamente com a clonagem ou a expressão de genes em mente e podem compreender sítios de clonagem múltiplos e promotores indutiveis Inseridos nas regiões não essenciais.

Existem duas classes de vectores de clonagem em lambda: veetores de inserção que aceitam ADN de 0-12 kb e incluem Lambda Z.APII, Uní-ZAP XR, e Lambda. Z.AP-Express (Stratagene) ; vectores de substiturção que aceitam. 9-23 kb e incluem Lambda FIXII e Lambda DASHII (Stratagene). Estão também disponíveis kits de expressão de proteína bacterlana permitindo a expressão de genes tóxicos, incluindo o bacteriófago Lambda CE6 comportando o gene da polimerase de Ά.ΕΝ de T7 para distribuição a células da estirpe BL21 de E. coli (Stratagene). Bacteriófagos com mutações naturais no gene S são utilizados comercialmente para produzir grandes quantidades.

Quando utilizado como um medicamento, o polipéptido ou polinucleótido da presente invenção pode ser utilizado para terapêutica, humana e pode tratar vários estados, especia.lm.ente infecções microbianas, Entre estas iníecções microbianas que são tratáveis de acordo com a presente invenção estão infecções tópicas, cáries dentárias, infecções respiratórias, infecções do olho e infecções dos órgãos localizadas. A invenção é aplicável tanto a terapêutica de seres humanos como de animais e pode, por exemplo, ser utilizada para tratar infecções sistémicas ou tópicas em peixes. Os medicamentos ou composições farmacêuticas 1 b podem, por isso ser formulados de acordo com a invenção dependendo da utilização para a qual o polipéptido ou polinucleótido é colocado. Tipicamente, pode ser formulado um medicamento que compreenda, o ingrediente activo, opcionalmenre juntamente com um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável. A natureza e as quantidades exactas dos componentes dessas composições farmacêuticas podem ser determinadas empiricamente e dependerão, em parte, da via de administração da. composição, Vias de administração para recipientes incluem orai, bucal, sublingual, por inalação, tópica (incluindo oftálmica), rectal, vaginal, nasal e parentéríca. (incluindo intravenosa, intra-arter ial, .intra-m.uscul.ar, subcutânea e intra.-articu.lar} , Para conveniência de utilização, dosagens de acordo com. a presente invenção irão depender do sítio e do tipo de infecção a ser tratada ou prevenida. Por exemplo, o tratamento de infecções respiratórias seria realizado através de uma suspensão de SASP/fago administrada por inalação. 0 tratamento de infecções do olho seria realizado através da utilização de uma suspensão de SASP/fago administrada através de gotas para os olhos e assim por diante. Pode ser utilizado um elixir de lavagem bucal ou pasta de dentes, no tratamento de cáries dentárias que contêm uma formulação de SASP/fago para elrminar as bactérias associadas com a formação de placa dentária. Consequentemente, também são proporcionados produtos de higiene oral. contendo polipéptido ou polinucleótido de acorde com a presente invenção, 0 polipéptido, polinucleótido e suas composições de acordo com a presente invenção podem ser utilizados também em aplicações não médicas. Noutro aspecto, é proporcionada a utilização de um polipéptido ou polinucleótido, como aqui definido, como um descontaminante microbiano, mais particularmente um descontaminante bacteria.no que pode ser utilizado para tratar a contaminação microbiana de superfície, pode ser utilizado em remediaçao de terrenos ou no tratamento de água. Por exemplo, o polinucleótido ou polipéptído pod.e ser utilizado no tratamento do pessoal médico como um agente de descontaminação, por exemplo como uma lavagem de mãos. 0 tratamento de superfícies de trabalho e equipamento é também proporcionado, especialmente aquele utilizado em processos hospitalares ou na prepara.ção de alimentos. Isto tem uma vantagem em relação a agentes químicos antibacterianos convencionais que podem danificar instrumentos delicados e podem ser indesejáveis em áreas de preparação de alimentos. Como um outro exemplo de descontaminação microbiana de superfície, a invenção pode ser utilizada no tratamento tópico de carcaças. No tratamento de água, a presente invenção pode ser eficaz contra patogénios da água, especialmente Vibrio cholerae, Legionella pneu mophila, Salmonel A. Õi typhl 0 Sh.i ge 1.1 a dysen L. 0-t’. A. , .a cont aminação microbia na de te η γθ nos pode igual mente ser comb atida de acordo corr 1 cl presente in vençâo.

Noutro aspecto, é proporcionaria a utilização do polipéptído ou polinucleótido como um agente antimierobíano, particularmente um agente antibacteriano cu antifúngico, no tratamento de material vegetal, tal como plantas, por exemplo, colheitas, ou no tratamento de sementes ou grão produzidos a partir destas. Os frutos podem ser aspergidos com fagos contra bactérias que zganismos, tais com' srwinaa, poaem ser srataaos deste modo. Plantai u s c e ρ 1 -L v e -i. a podi ΐ'α gí. o o a c 1 e o r a i .í a r Xanthomonas campestris; este orcranismo também afecta tomates. De um modo semelhante, am raízes moles. Mic .P f podem ser tratado conic t Q(Ci Y' aios, são a da f por exemplo, afecta timo espécies de tas ornamentais,

De um modo as 18 ;m fel “1 fS -p C| e cogumel os ta; mbém ;resen j” CZ'. in V Θ Π Ç cl O o i d. o o u. po I ipéptrc Ίο pode s e r ais c :orr IO ratos, de mo d O ^ :e. Ur n tra tamento c: omum P a ir a Le raç ã O cc dutendo Sl ibstân c i a s ..na v o an tídoto p; ira essas K* A v. rta mina K 0 p.rod.u z, i d. a elas 1 3cl( r:t.é: rias. A rc d S O G O 0 ncia d.es de P, [ ser trat Nout r.O Cl; z ciclo par nar bact·: nar rato; oagu lante ánci 3. S Θ :acto digc ιonas que infectain

Substi mamlieros a anticoaguiantes pelos ratos é adquirida devido à colonização do tracto digestivo pelas bactérias que produzem níveis elevados de vitamina K. Por isso, o tratamento de animais de acordo com a presente invenção permite que a administração de anticoa.gula.nte convencional seja bem sucedida no controlo de pragas. A invenção será agora descrita em maior detalhe, apenas a titulo de exemplo, com referência aos desenhos acompanhantes e os seguintes exemplos e apêndices. A FIGURA 1 apresenta uma representação em dragrama de parte do genoma de lambda, cobrindo o gene S; A FIGURA 2 apresenta um mapa de pB/LFI; A FIGURA 3 apresenta uma represent.a.ção em dragrama de parte do genoma de Bacillus subtilis cobrindo o gene ssp; (B) pB/SAPO; A FIGURA 4 apresenta um mapa de (A) pB/SAPB e i y A FiGURA 5 apresenta um mapa de pB/SAPOC; FIGURA 6 apresenta um mapa de SSPC-lambda mostrando a

C QTG. f'-', C substituição do qene de lambda pelo gene subtilis e inserção de um gene marcador de resistênci cloranfenicol (Cm1); A FIGURA 7 apresenta um mapa de uma área do SSPC-lambda com as posições dos iniciadores; ·' Cl -L x Pt A FIGURA 8 apresenta um representação em diagrama de do genoma de Bacillus subtilis cobrindo o gene sspC; A FiGURA 9 apresenta um mapa de pB/PIPC; A FIGURA 10 apresenta uma representação em diagrama de um fragmento compreendendo a construção RPPC-lambda, apresentado a posição dos iniciadores de sequenciação SEQL1F e SEQL2R; A FIGURA II apresenta uma representação em diagrama de genes sspC em tandem e os iniciadores utilizados para amplificar por PCR os genes antes da ligação em lambda; A FIGURA 12 apresenta a diminuição na viabilidade de E. coli a seguir à infecção com SSPC-lambda; e JRA 1 apresenta um gel demonst rando os perfis de do ADR r-* 0 O| cjp·; Ideo prep arado a parti r d.as estirpes d. CÍcI S , / ” produção de SspC. zu

Todos os processos experimentais são convencionais conforme descrito em Sambrook et al. (1991) a menos que seja. indicado o contrário.

As dicestoes de foram efectuadas num volume total de oO p.L, utilizando 2 p.L de cada enzima, e incubadas a ouranre menos que seja indicado o contrário. num volume e r. o s 1 a t a s e A desfosforilação do ADN molde foi realizad total de 50 p.L utilizando tampão a 10X (5 pL) alcalina (2,5 U) (5 p.L) com incubação a 37 °C durante

As ligações foram efectuadas num volume total de 10 pL utilizando 3 Unidades Werss (1 pL) de ligase de ADN de T4 e foram realizadas de rotina a 16 °C durante a noite.

As misturas de PCR foram realizadas de rotina como se segue (volume total de 100 pL): ADN molde 0,1 p.ç ADN de plasmldeo ou lambda puríficado/1 pg de ADN cromossómico/1 colónia iyi ... . mpão a 1 OX ( C OITI MgC 1 2 a 1,5 mM) 1.0 p.L Mi st ura de dN TP ( "stoc k" a 10 mM) 2 pL Po iimer ase T·^ q (2 / 5 ϋ) 1 uL in rcrad' O '£. í:- s (Dire cto e Reverso) 100 pmoles A j ustar pa ra um. v o lume f i n a 1. de 100 P.L com O; Τ' ίΤϊ cl C Ç ,'V CZ'. C‘ -J V-, de PC !R foram efe ctuadas com GU e set a i ndi cado o co ntrárío): zi ta menoi 95 °c durante 3 : min (desnaturar) 94 °C durante 3 0 seg (desnaturar) ) 58 °c durante 3 0 seg (emparelhar) ) durante 25 72 O V. durante 30 seg por kb de ADN (extensão)) 72 ec durante 10 min

Os iniciadores foram obtidos da Gibco BRL oa Sigma Genosys. Quando os iniciadores incluem sequências de reconhecimento para enzimas de restrição, a sequência a montante preferida de cada enzima (PCR Essential Data, 1995) foi incluída. A Produção ln vltrofIn vivo I 1. Um fragmento do genoma de lambda que abarca o gene S, foi amplificado por PCR utilizando iniciadores com sítios de enzima de restrição adequados na extremidade 5' para permitir a ligação direccional num vector de clonagem geral de E. colif tal como pUCIS ou pBluescript (Stratagene). Assim, o Iniciador BI compreende a sequência de reconhecimento da enzima de restrição de Psfcl seguido pera sequência de lambda desd.e a base 44660 até à base 44 677 (Figura 1) . O Iniciador B2 inclui a sequência de reconhecimento da enzrma de restrição de Xbal seguido pera sequência reversa e complementar de lambda desde a base 45972 até à. base 45956 (Figura 1), por exemplo:

Iniciador BI: 5'-AACTGCAGGGTCACTTCGACGTATCG-3'(SEQ ID N°: 2) Iniciador B2: 5'-GCTCTAGAGCTCATACATCAATCTC-3' (SEQ ID K°: 3} 22

Na Figura 1, a posição dos genes tardios envolvidos na l i se, juntamente com o promotor Pp/ é apresentada em relação um ao outro. A posição dos iniciadores BI e B2, juntamente com o sitio da enzima de restrição EcoRI, são também, apresentados. 2. 0 produto de PCR de 1328 pb resultante foi digerido com

PstI/Xbal e ligado a pBluescript digerido de modo semelhante, desfosforilado para. originar pB/LFl (Figura. 2). A Figura 2 apresenta um mapa linear de pB/LFl apresentando a estrutura plasmídica de pBluescript SK (+) (Stratagene) e a posição ca inserção do fragmento de lambda é ladeada por sitios de restrição PstI/Xbal (ver Figura 1). A sequência que abarca, o inicio da. GRF de S é fornecida, juntamente com a posição do sitio de ligação ao ribossoma (rbs), e o primeiro e segundo codões de iniciação. As posições relativas e as sequências dos iniciadores de PCR inversos são apresentadas. 0 iniciador B3 produz um produto de PCR que tem extremidades rombas na extremidade : ' . 0 iniciador B4 produz um produto de PCR que, após digestão com NcoI, possur uma extremidade saliente a 5'. 3. 0 plasmldeo pB/LFl rol. introduzido em E. coli por electroporaçâo e os recombínantes putativos ioram recuperados como colónias brancas em placas de LB agar na presença, de X-gal (80 pL, 20 mg/mL) e amp.icil.ina (50 pg/mL) . Foi identificado um transiormante correcto após digestão de restrição dos plasmideos com FcoRI, resultando em dois fragmentos de, aproximadamente, 300 pb e 3950 pb, 4. O gene S de lambda é u.m gene duplo de iniciação, com a transcrição do segundo codão de iniciação fMet resultando num nivel de proteína 2 vezes maior. Por isso, o gene de zo SA.SP escolhido, neste caso sspC de B. subtilis, foi inserido em grelha com este segundo codão de iniciação. A PCR inversa do plasmídeo ρΒ/LFl foi realizada (com um tempo de extensão de 4 mín 30 seg· a 68 °C) utilizando iniciadores reversos para produzir um fragmento com urna extremidade 5' saliente. A enzima de restrição Ncol possui uma sequência de reconhecimento (CCA1GG) que incorpora os nucleótidos ATG. Adicionando a sequência de reconhec imento de Ncol para a frente do molde (ρΒ/LFl) e os iniciadores do ADN da inserção (sspC) permite a ligação subsequente destes produtos de PCR de modo a que o gene sspC está em grelha com o codão de iniciação do gene S de lambda. O iniciador reverso (B4) é o complemento da sequência de lambda começando no terceiro nucleótido a 5' do segundo codão de iniciação ATG do gene S (Figura 2). O iniciador contém a sequência de reconhecimento da enzima de restrição Ncolr por exemplo:

Iniciador B4: 5'-CATGCCATGGTCATGTCTTACC-3' (SEQ ID N4) É possível substituir o gene S com um gene de SA3P através de ligação de extremidade romba e neste caso pode ser utilizado um iniciador reverso que começa no complemento do segundo codão de iniciação ATG do gene S (Figura 2), por exemplo:

Iniciador B3: 5!-CATCTTCATGTCTTACC-3’ (SEQ ID N°: 5) O inreiador directo for baseado na sequência no inicio do gene R de lambda desde a. base 45493 até à. base 45515 (ver Figura 2). A sequência de reconhecimento para a enzima de restrição 24

Spel foi utilizada em frente da sequência de lambda para permitir a ligação direccional com o gene sspC, por exemplo:

Iniciador B5: 5'-GGACTAGTGAAATCAATAATCAACG-3' {SEQ ID N°: 6} 5. 0 gene sspC for amplificado por PCR (utilizando um tempo de extensão de 2 0 seg) de modo a permitir a ligação a qualquer dos produtos de PCR inversa obtidos a partir dos iniciadores B3 e R5, ou B4 e R5, por exemplo: (i) para ligar ao produto de PCR inversa pB/LFl produzido utilizando os inzciad.ores B3 e B5 (para originar o piasmídeo pB/SAPB), deve ser utilizado um iniciador directo que começa com o nucleótido imediatamente a 3' do codão de iniciação ATG do gene sspC (Figura 3), por exemplo:

Iniciador B6: 5'-GCTCAACAAAGTAGATCAAG-3' (SEQ ID N°: 7) (ir) para ligar ao produto de PCR inversa pB/LFl produzido utilizando os iniciadores B4 e B5 (para originar o plasrnideo pB/SAPO) , foi utilizado um iniciador directo compreendendo a sequência de sspC começando no 5o nucleótido da ORF de sspC (Figura 3) . Este iniciador possui uma sequência da enzima de restrição Ncol rmed.ratam.ente antes da sequência de sspC, que de facto incorpora os primeiros quatro nucleótidos do próprio gene sspC, por exemplo:

Iniciador B7 ; 5' -CATGCCATGGCTCAACAAAGTAGATCAAG-3' (SEQ ID Nd 8) zo u fermento d 3. sequencia Π ci arai premi jzir um produto 0iTi do gene sspC (Figura 3). . 0 ο reverso iniciador reverso é o co extremidade da QRF de sspC, i. e., PCR que inclui o codão de terminação iniciador inclui a sequência de Spel parai permitir ligação direccionai com qualquer produto da PCR inversa de pB/LFl, por exemplo: “ fo v;, TTAATGAAATTGACCG-3' (SEQ ID N°: 9) Ο0Π0 sspC é aprese nta· do j' unt. amente com as dos iniciadores de PC Ρ ϊ *6, B7 e B8. d u z i r um produto de PCR QU0 ;· ps r n extremida de s ie 57 „ 0 iniciador B / prodi iZ um produto de rnrcraoor bb rra rombas na extremidade 5' . PCR que, após digestão com NcoI, terá uma saliência, em 5' , O to- O-iLL;- amo 1 r r r carro .) ρ o IR idos iniciadores B7 e B8) e pi 3/LF1 amj 3.1Í í :icadc ' por PCR inversa idos ir Ί n 1 Π Π ' res Bi e B5) foram di .ger idos ! som as enzimas de r; 0 3 3 r; q 3.0 NcgI e Spel . 0 x uoduto de PCR inversa pB/LFl linear diger ido foi ce s í do antes da ligação. plasmíde -i-s / 0 p n / nte c d qene d de B/SARj 3 os produ ·'. Após a limpeza, do A.DN digerido, as ligações foram ifectuadas para originar o plasmídeo pB/SAPO no qual o gene

Para o plasmídeo

:CR 8 Ί mp .1. esm j£ç>r-j te, 1 igac los em conjunto (Figure 3. 4). , A F i gu: ra 4 ap re lio ent a um mapa linear de (A) pB/SAPB ou (to) pB / £ IAPO, Es te Q pi .as miíde os sã Ο ΟΟΓ· 3' t rui dos ar 3 o s i a s e rção do gene sspC no •Q 1 asm li d .eo p B/LF'1 amplií :icado por PCR inversa (amplifi cado ut 1 I i zan .do id o. rni cr adores B C β B 0 ou b4 e b5 íver seco ) . 26 (A.) Mapa linear de pB/SA.PB apresentando pB/ZFl amplificado por PCR inversa (dos iniciadores B3 e B5) contendo o gene sspC. A sequência apresentada abarca o sítio de ligação ao rrbossoma do gene Se o início da ORF de sspC, ligado por ligação de extremidades rombas. Mapa linear de pB/SAPO apresentando pB/LFl amplificado por PCR inversa (dos iniciadores B4 e B5) contendo o gene sspC. A sequência apresentada abarca o sítio de ligação ao ribossoma do gene S e o início da ORF de sspC, unido por ligação após digestão com NcoI , 8. É possível produzir um lambda comportando um gene de SASP com, ou sem um gene de resistência a antibiótico presente. A utilização de um gene de resistência. a antibiótico proporciona um marcador seleccionável para monitorizar a presença de um gene de SASP e isto foi realizado utilizando um. gene de resistência a cloranfenicol (Cm1} , Um. gene Cm.1 (com. o seu próprio promotor) foi inserido, na orientação oposta, na extremidade 3' do gene sspC após digestão de pB/SAPO com Spel. Isto resultou no plasmídeo pB/SAPOC (Figura 5) . A Figura 5 apresenta um mapa linear de pB/SAPOC apresentando a. estrutura de pBIuescri.pt e a posição dos genes sspC e Cm1 no fragmento de lambda ladeado pelos sítios de restrição PstI/Xbal. 9. Um método de produzir SASP/lambda é infectar uma estirpe de E. coli comportando pB/SAPOC com fago lambda. À medida que os fagos se reproduzem, o fragmento lambda/nspC/Crrr no pB/SAPOC ficará, incorporado em alguns genomas de lambda. Este método foi empregue com sucesso utilizando um lambda sensível à temperatura (ts) . Este tipo de lambda pode ser mantido de forma estável, como um prófago, num cromossoma de z / 1-, ; ' -p O ά. cali a Ju C, m, as não a 42 °C. A estirpe coir iportanri pB/SAPOC foi c- ultiv ada em LB (contendo MgS04 a 10 mM maltose a 0,2% (p/v) ) até a DO60 o atingir 0,3. Foi removid· uma fracçâo (10Í 3 uL} e misturada com 100 |uL de prepe ira cão d< fago lambda. A mi st oura for incubada sem agitação 3. 0 3. durante 20 min, foi adicionado 3,5 mL de top agar f undí d< (LB com agar a 0 f 6% contendo MçS O4 a 10 mM + martos e a 0,2: (d/v)) mantido a 4 5 °C, e verto ido para placas de LB aga.. pré-aquecido. A S plc iças foram i ncubadas durante a noite . 37 °C antes de ser adicionado LB (3 mL) à superficie do top agar. As placas contendo top agar foram transferidas paira tubos de a sntrifuga de 50 mL e armazena d. as a 4 °C durante a noi te Foi adicionado clorofórmio (250 pL) e 0 tubo foi .1 V V 0 .0 tido suavemente várias vezes par a lisar quaisquer célul as b acterianas inteiras, antes da centrifugação (400 0 rpm, 10 min, t.a .) . 0 sobrenadante do lrsado de fagos

resultante foi t ran f r i Π n xó η τ :a um tubo e sterzl e utiriz ;ado para infec tar υ.ΓΠο estirpe de .Eb col. i que podia s θ r Irsogenizad '3- r -L 0 e. NM522 ou Y1089r-f mis sturando 100 pL de lrsado com I 0 0 1 aL ; de cultura de E, colí cultivada até uma DOsoo de 0, 3. At rds incubação a t.a. dui :ante 3 0 min, r oi adicionado 800 pL de i..B e a mistura foi plaqueada em fracções de 100 pL em placas de LB agar : suplementado com croranfenrc ol íi 0 ρ g/mL) . Apó; a incubação a ou C aurant e a noite as c ol ón 1 as Cm1 foram isoladas e examinadas par. 3. cX presença de prófagos de lambda contendo sspC, ol (1( 3 pg/mL) e a. s placa. /1 ·;: durante a. noite. A.. nham c srescido a 3 0 “C ma. 10. Colónias resistentes a Cm foram sub-cuitivadas em duas placas de LB contendo cloranfer foram incubadas quer a 30 °C o colónias que, no dia seguinte, não a 42 °C foram assumidas como sendo lisogénicas para

Ztí lambda recombinante contendo os genes sspC e Cm1, .As colónias também foram sub-cuitivadas em placas de LB contendo ampicilina para assegurar que o piasmídeo pB/SAPOC completo não se tinha integrado no genoma de lambda. A estirpe de E, coli que era lisogénica, resistente a. Cm e sensível à ampicilina foi identificada e o prófago designado SSPC-lambda (Figura 6) . A Figura 6 apresenta um mapa linear de SSPC-lambda apresentando a substituição do gene S de lambda pelo gene sspC de B. subtilis e inserção de um gene marcador de resrstência a cioranfenicol (Cm1). 11. A.s reacções de sequencíação foram efectuadas para confirmar a presença, frdelrda.de e orientação dos genes sspC e Cm.1 no genoma de SSPC-genoma de lambda presente no cromossoma do hospedeiro de E. coli. 0 ADN cromossómico foi preparado a partir da estirpe de E, coli contendo SSPC-lambda e digerido com a enzima de restrição Ciai, Esta enzima corta em 15 sítios no genoma de lambda, e num número de sitios indeterminado no genoma de E, coli. Especificamente, esta enzima corta nas bases 43825 e 46439 do genoma de lambda, resultand.o num fra.gm.ent o que abarca a área do gene de 1 ise S e R de Iambda ladeada pelos iniciadores Bi e B2 (Figura 7) , A Figura '7 apresenta uma área de SSPC-AND genómico de lambda com as posições de iniciadores: posição dos iniciadores Bi e B2 utilizados para amplificar inicialmente o fragmento de lambda para preparar pB/LFl (secção A 1) posição de sítios Ciai apresentando a extensão do produto de ligação para a amplificação por PCR e verificação da sequência (secção A 11) z y iniciadores B31 e B32 utilizados para amplificar por

p CR a regia o de 1 ambda 30 cl ΙΓ C cl Π Ο- Ο Ο X . rag: nento ( Bi- 'Orl f p 3. Ji cl sequenc iaçao ( secçac ) A li) i n i c iadores 1 3 f 1 / B30f B 5 5 e B 5 4 a ϋ. 1 .1 Z 3 cio S ;ara s equ enciar a. constr ução c ie SSPC-lambda ( 3 3 C ção A : !.l) • .·'*) Ά Τ'iM vj 1 .ai digei :ido foi . entã o ligado durante 3 3 norte O foi Z 3 d cl. i .ima fracção da mi; atura de 1rgaçao (2, 5 ]. ;L) corr ·; Ο ADN molde para uma reacção de PCR utilizando o seguinte programa: 95 °C durante 3 min (desnaturar) 94 o dui ; a ri t.'. Θ 0 0 seg (desna "Γ p irar) ) b y dlj 3 :an O "< 0 seg (empar Θ .1 .har) ) por 10 ciclos 68 o p GUI :an te d min 50 seg (extensão) ) 94 O ,.-1 dui :an L O .-y 0 seg ídesna 3 u irar) ) 62 O GU 3 :an ps ' < 0 seg (empar Ί .har t ) por 25 cicios o 8 L- dui ;an Γ.6 min 50 seg + 10 seg de -j“ CZ'. mpo de CZ'. xt. ensão (extens ãc ) ) ) 72 °C durante 10 min

Foram u ti. 112 :ado s o S S0Cf U í V. ί t (z 3 ínicí adores (B31 gí 2Sde cl base λ — i r\ ·—* 3 Z 3 / 6 até à 44 0 0 32 c iesde a base 4 622 5 até à L 462 :03 de i . a rnbda) para oroduzi V um Ç- -r ag;m mito de ADN de la imbda a ba.rc. and o o 3.: DN de gene 1ambda/ O Cò pC / Cmr qu 0 t0V0 or: ig em a partir d.0 PB/ ! j Ά x U Q como uma inserção 7Çi r-, 4-2 2' L. A ! / Xb ai (Figura 7) . 1 n i c iador B3 \ t 5' -GG rn ?\ ; J. TGATGTGA. TGGC r|i iyi v\ r rGG-3' (SEQ 1D N° : 1 1/ 5 .n:

iijZ

-GCI 1ATCACGCAGAGCATC-. SEÍ !D Ν'

CU 0 produto de PCR resultante for então utilizado em vária: eacções de sequenciação utilizando os seguintes iniciadora: ver Figura 7) :

Iniciador B30 -CAA.CAGTACTGCGATGAGTGG“3' (SEQ ID N° : 12) C! / „ r'' rn y AG ΐ GAGATGAAAAGAG - (SEQ ID R°: 13)

Iniciador B54 5’ ~GTAGGTAATGGCGTTATCACG~3' (SEQ ID Nc : 14)

Iniciador B5d 5'-GGTGGTGCGTAACGGCAAAAGC-3' (SEQ ID N° 12, É também possivel produzir uma construção semelhante utilizando um sítio de ligação ao ribossoma (rbs) diferente a montante do gene SASP como uma alternativa ao rbs do gene S nativo. Por exemplo, o ARN lider do gene 10 do fago T7 pode aumentar dramaticamente a. expressão de alguns genes co C; tranhos em. E, coli (Oii ns et ai. , 1988) , Aiter nat. a sequênc la do sitio de ligação ao ril aossoma do la mbda V7 pode ser utilí zado com· o, na medida em co difica , a prot eína da ca 1. L! O cd. O LJ Θ t é rna i s d. í.j \j. Π d c. i a f e produto do gene S, durante nnente, de vida lítico normal do bacteriófago lambda. Neste momento, foi produzida uma construção utilizando o rbs de sspC nativo, empregando t mesmo método que acima, excepto que :e foi

amplificado por PCR utilizando um iniciador directo homói o g o à sequência, aproximadamente, 40 bases a montante do s spc codão de iniciação. Foi inclu ido um sítio de restrição '.o, CL ern frente da sequência i ae roí

Por exemolo: r·' - r-\

'CGGGATCCGATTCAAACAAGCTTG-3 f (SEO ID N li

Foi utilizado o iniciador reverso B8. 0 produto de PCR resultante foi ligado a um pB/LFl amplificado por PCR inversa, amplificado utilizando o iniciador directo B5, corno previamente, e um iniciador reverso, B2I com um sitio de restrição BamHI em frente à sequência de pB/LFl: mi a. GGGATCCCAT C T T CAT GT CT T TAC-3' (SEQ ID Nc ) A produção e identificaça.o de uma estirpe comportando esta forma de lambda, designada SPPC-lambda, como um prófago foi zada comc '·> P :notado con. 10 d· 13. Tanto 3. S como prófago; cromossoma l do de fago rr :.adu. agora, p rara iníecçao, Isto >ara SSPC-iambda. 0 SPPC-lambda também foi esor j. O1 u.a secoco a j. J. cíCiiticí . iPPC si i.o rnanti d. as estaví ilmente ΤΊ Q ipenas particr tlas ut i I i z ado s, até sseoura.r eu hospedeiro ae E. coii de fago maduro de primeira geração foram utilizados, ar comparabiiidade entre cada lote de fagos maduros produzidos. Todavia, uma vez que não é necessariamente ideal utilizar um fago temperado, ou iisogénico, para efeitos terapêuticos é possível ar uerar os genes e; 3 V 01 lisogenra. de modo a que 3 ci. infecciosa. do sis d ama aqui fago sensi .vel à temperam .ura dos no estabelecimento da inactivos numa situação descrito, a utilização de um (ts), significa que a iisogenrzação é, reiatrvamente, rara a 37 cC ou acima. Certamente, os próprios stocks de fagos também podem ser mantidos em vez de E. colí lisoaénica. 14, Foram obtidas preparaçc ;es tanto de SSPC-] .ambd.a como de SPPC-lambda por indução d e estirpes compor tando prófago recombinante para produzir partículas gí s fago madura s. Cada que a estirpe foi cultivada a 30 c‘C que a DCçgo tivesse atingido 0,6 e depois a temperatura foi alterada para 42 °C durante 15 minutos. A cultura foi depois incubada a 37 eC, com agitação a 350 rpm para proporcionar bom arejamento, durante mais 3 h antes de recolha, por centrifugação (4000 rpm, 10 min, t. a.) . O sobrenadante foi removido e o sedimento foi ressuspenso em 1/5 do volume do tampão de fagos. Foi adicionado clorofórmio (1/100 do volume) às células ressuspensas e a suspensão foi misturada suavemente. O lisado resultante foi centrifugado (4000 rpm, 10 min, t.a.) e o sobrenadante foi transferido para um tubo estéril e depois armazenado a 4 °C. Os lisados foram titulados como descritos na secção Ά 15, abaixo. 15. Para titular as partículas de fago SS PO lambda produzidas após indução, o lisado de fago foi utilizado para 1 n f ect ar uma e s 11 ; de hj ^ coli não- 1isogeni .sante cont en do um pla smídeo (des: ip a do pB/ LF2) compo rtando u mi fragment o.e ADN de lambda aba: eca ndo OS genes de 1 ise b e R e o prom .ot or Pr- . E is te fr agmento de i ambda cont ;endo o promotor f oí amp 1 íf .1 ca do por PCE f. 1 ]. ; eand.o o 1 n .1. c .i a d o r B 51 Í5'-AAC?GCAGCGC?GTGACGA?GCTAATCC-3' SEQ ID N°: 18) desde a base 44371 até à base 44390 e o iniciador B2 (previamente descrito) (ver Figura 7) . A presença de fagos lambda em reprodução na estirpe contendo pB/LF2 permite a expressão da

f'' sset e de ge p. Cl· d de 1 ise 3l ju o. g r-, j- Cl· ( lo p ro: motor P;·) f CÍ D 0 S 0 de pi asmi deo. I1' 'í C' p )dut.o s dos rjQ nes d 0 lis e expre C‘ cs r O ·_ )s a p 1 d 2- L ir cio pla smí d eo f a m J .lita m a li C; ;Γ> das b acté ri as e a j formaç ao 'mie pp acas , G t i t j.I 0 ri n ri .1". cl Cj G S Θ dete ri ai na· do por em. uneraç ã.o do pi cl C 3. S à 0 .1. u ição em qu. Θ cl S P A. 3. C 3 3 são G 1 Lscret 3. S Θ ente Ob 3 Cl· r\ rávei s . I 1 i nf eecâo for re ;aliza da culti V ci Π Ól O a estirpe contendo pB/LF2 até uma DOsoo de 0,3 em LB contendo çç mal. tose a 0,2%, Mg >, n 4 a 10 mM e ampicilina a 50 pq/mL. Foi incubada uma fracc 5 (100 pL) da cultura de células com 10 0 pL d e diluições le lisado de fago SSPC durante 20 min à T.A. e devo s ίΠ-ΐ- í 5ti; irado com top aqar e plaqueados como descrito Ώ 3. S Θ C Ç 3 O A 9, Existe uma redução até um log de 5 no títuJ cuias de SSPC-lambda, comparado com o lambda parental do qual derivaram. Ap 6s o protocolo descri to , o lambda P arental pode produzir, aproximadame nte, 1015 pfu por mL.

Existem métodos alternativos para obter lambda contendo um gene de SASP no loco ai do ç· ene S de lamJo da, com base na tran, s formação de um li sogénio ( uG lcmm)cIo com P B/SAPG or i pB/S APB (ver secção A acima), Neste ca so, as células competent .0 8 G6 vem ser preparadas de uma estirpe de restriçãoVr lodif icaçã O d Θ p coli que é um lisogénio de lambda, por exemplo ] MOB145.

pB/SAPC ) ( JU PB/. SAPB, ou Π 0 0 Ολ0 AI :>n equ ivalente Ο.ΠΠ8 ί Ό cd. 3 s; d. O ο β 1 x a d a s 7 °C , d .ep oi o. f- az nitrir uga· . -L 3.3 sed ím en fada s devem "1", r- ρ mov íd C· c e c :onstitui as d eve m 3Θ r p 1. aqueadas ncub 0 P; s G u. rant. e a noit< ser con cri 1—1 dos rapidame i 3. “ -20 O 1. As células electro-competentes lisogénicas de Ξ, coli devem ser transformadas quer com pB/SAPO ou pB/SAPB, ou um vector suicida contendo o fraç lambda/sspC. A.s células tra:

recuperar durante 1 h em SOC a (4000 rpm, 10 min, t.a.). As cu ressuspensas em LB (I mL) e 5G até 1 mL com LB estéril. As células devem ser pia.quead.as em LB agar em fracções de 200 uL e 37 °C. Os restantes 950 pL devem em fracções de 50 pL e armazenado 04 2. Existem vários modos para seieocionar eventos de duplo cruzamento entre o fragmenro de lambda transportado nos plasmídeos ρΒ/SAPB ou ρΒ/SAPO e a sequência, homologa no genoma de lambda. A utilização de um vector surcida pode encorajam eventos de cruzamento duplo, uma vez que o vector não pode ser mantido no lisogénio de E, coli. As colónias das estirpes comportando prófagos de lambda potencialmente recombínantes obtidos a partir de culturas durante a noite em placais de LB agar (ver secção acima) oodem ;er .T.' 'ò. reada s por PCR ut .11. no Q β η θ s spC e ] Lambda, .1 A) • Q Ό Λ. :oduto de PC R pa re s de rnrcr adores 0 te rnat i vamente, um mé 1 la mb da po de s e r empregue nã "O O S -o11 iirá um Qfc ΠΘ S 3.3 C; uas c jélulas hospe de: PO r : 1} 1 rra.d.iaç :ão com ] tb com Hendri: a 0 τ a. I» q.1- na indução do prófago o rapo contendo SASP já ião será capaz de lisar s transformadas de acordo ísuspender uma fraccão de ulas (20 μΐ d acima (paSS·. o 9) até uma . suspensão c| p. ulas máxr mia de 2 x 10y c: tu em 10 mL de um meio de pens ão de n ão absort cão de UV adequado (e. g. M9a. ou

( Q

S Li O p PBS) numa placa de petrr convencionai as célula s utii .ízando um ia fonte de máxima de 260 i im.) . Após irradiação, induzidas são incubadas jripi -j r-·, VI UV (produção ci ,g t L com arejamento (se é utilizado PB5 como o meio de suspensão, é adicionado meio de cultura estéril fresco (1/10 do volume de 10X M9a). A. fotorreactivação € prevenida protegendo as bactérias irradiadas da lu; visível. ir) Ind.uça.o c ios lisogéni os de lambd; thy" por supressão de timidina, de acordo com Hendr rx et 7 /7 OQ O \ Ol ~L· * \ d- O --J } » Isolar muta ntes thy (Miller, 1972) : A estirpe lisogénica deve ser cult ivada em. me io M9a 8 U p .1. Θ ITl 611 L cX d O com trmidrna a 10 pç/mL até 2 x 10a cf u/m L. As células devem ser i 8 V ciClci S Θ X essuspensas em a rieio M9a sem trmidrna e depois incubadas a durante; 2 timidina (10-25 pg/mL) deve ser então adicionada à cultura e realizada outra incubação durante 30-120 min a 37 °C. i ri) Indução de Qp c; y p Q, de t empera tura (se f O H utiiiz 3do r-', 1 r sogénio de lambda c l ts) corno de s c r i t o n. a secção Λ .ci » S A Q cél· alas devem S Θ Γ deix adas a cul t i va r du. ra e -2 hc mas 1 r·, \ * * a pr ese nca de glucose a C b 2% para γ· pr p Ί ·; :·- 1 r O 0 números de a d. er fago livre (e por η o w ,·Ά Ό ΓΊ Ά -i. O ·_/ ··/ bú r. enci alme: nt 0 isento de ς q "D UilU i- ) se iigar a cél -Ul.3. s bac -> -|” o, jc são iisac acl s) . Qualc [uer ia go 1 rvr e de ve se r sep arado da: s célir "Í pO; Cg que ] pO te nciaime :nte cont êm o SASP/bacter d. óf; ugo, por centm í.fuo; ação ( 40 00 rpm, 10 mi n, t - · 3 · ) . As céiu i a s sediment ieve: Π S Θ ç re ; & S Li S p θ Γ : S d. S em LB contendo glu COSt d cL 0,21 : e a inc rubaç ãc prosseç pj.ru cl1 ra nt '-íl ? aproximada .merr L 0 f 1 P. As C 5; aluía devem S Θ Γ ce nt Ύ- ", fug adas (4000 rpm , Ϊ0 mi n f 1l * a * 5 , ' ressu ispe; asas em. LB (2 n iL) 0 depois lis ;ada; s cor r·. 0 | orofór m.io (0,0 2 ml :,) . 0 f : 8 Q O ma O. "Li ro S ibertado c Xci S Cél' u 1 a s ap o s li se i nd uzida por 36 clorofórmio deve ser separado dos resíduos celulares por centrifugação (4000 rpm, 15 min, t.a.). /1 Γ', io 3 cteriofaçfo contendo SASP deve ser enriquecido e purif -t O cL '·_ 1 O cl Z Z cl V Θ S de um método ad iequado. Un i tai método é inf ec tar uma cuitu ra de crescimento o de célul .as de E. coli susceptíveis com SASP-lambda e repetir o passo B 3 acima * 5. A presença de lambda recombinante deve ser verificada isolando o ADN de construções de SASP-lambda putativas e reaiiz; ando rastreio por PCR p ara contr rmar a presença d gene d .e SASP utilizando pares de ínicí in ri rã rp s apropriados como d ί seu t .tcl o na secção B 2 . As constr -ações putativas sa também sequenciadas e tit‘ aladas como de st arito na secção A. C Produção In wltro (I) É possível produzir um fago lambda comportando um gene de apenas através de métodos in vitro. Isto foi conseguido vés de inserção dos genes sspC e de resistência a Cm no gene ise R de lambda. 1. O genoma de lambda foi digerido com Kasl, cuja sequência de rec ' Ο ΤΊ h.ecimen li 0 compreende um sitio un ico de : f Θ S ‘ Lrição em lambda ; ocorrer ido na base 4561 i α m, --1 ; - - Cf( O. -r\ pi r-r-, -w r r. ·_ '•d er CC >dí f ica cl hidroi así cle pe ptr dogiicano, A. k) ALN de lambda ; dig· erido í :oi então de; a f o s .L. cr r ria d n v 2. 0 ge: ae ssp( z oi ampiíficad o por PC :R com ί jm tempo 0iTi extens âo de 2G seq , utilizando: s / (i) um iniciador directo, B13, compreendendo uma sequência de enzima de restrição PstI (com bases prefer d dm s a. montante) e a sequência í i montante do sitio de lioação ao ribossom; 3 d.0 SSpC (Figura. 8) * Vd sitro cle ligação ao ribossoma utilizado έ õ o do prcq ?rio Q Qp i’> ^ Ir'^ f mas pode incorporar a se quência alta C XI1 Cl t" X V Cl C C ;m o objectivo de aumentar potencialmente a tradução (vei s 0 c ç â o A. J. 2} *

Iniciador BI! 19 '>

3GATTCAAACAAGCTTG-3' (SEO ID N i i ) i. n i c d.ador i .'Θ V 0 0 s o B 8 * ) prc .duto ppp? CÍ0 sspC for digerido com Bati e Sp ei 0 do a L pB.l uescrip t o iv Λ : ( + ) dig 0.1 .i.GO C10 forma semelha .nt vt f osro ,C J. 3 O O P 3.X 3 o r 1 ginar pB / XIP. Foi inserido um qe Π0 (ver secç ão A 8) na orre ntaç ão oposta , no sitio Spe d i i d extremidade 3' do gene sspC para originar pB/PIPC (Figura 9} , A Figura 9 apresenta um mapa linear de pB/PIPC. h posição dos iniciadores B26 e B27 é também apresentada. 4. 0 fragmento sspC/Cm presente em pB/PIPC foi amplificado por PCR utilizando: i) um iniciador directo incorporando um sitio de restrição da enzima Kasl à frente da sequência sitio de Izgaçâo ao ribossoma. de sspC (ver Figura 9):

Iniciador B26: 5' -AACA.GGCGCCGA.TTCAAACAAGCTTG-3f (SEQ IB Nc 2 0 ) 0« i i) um i n i t Z td 3 1 0\ * idor reverso l na extremi ncorporand·: ie do gene uma enzima de Cm1 (ver Figura

Iniciador B2 -AACAGGCGCCAGTATACACTí SEQ ID Nc 5. 0 produto de PCR ligado a genorna de desfosforilado (ver s (Figura 10) . resultante for digerido ambda digerido de forma (Ί r'- v,. para originar com KasI e semelhante, SPPC-lambda 6. O ADN de lambda recombinante foi empacotado in vitro de acordo com o método de (Hohn e Murray, 1977) ou utilizando um kit tal como Packagene (Promega). 'I Foz am Z 0 Cl 1 JG aadas dilui .coes emp aco tado em 1 tampão '30 tago. d.11 uiç â.0 d.0 ΘΧ tracto de empa f ra SCO O ϋ ntendc . /o g y \J t d. rnL di n. JÃ CÍ0 t r- ρ S GO até uma DOf mo de 0,3 mal "L O S e a 0,2 % (p/v) . em série (até 10“°) de 1 ambda Uma f ra.cç ão (100 ui ,} de cada :ot.ame í n t o : toi adieio na. d. a a um coli e s t i r :pe NM522, cult í vai d o em LB cont endo MgSOá a 10 mM e 8 . A mi st .urra de pré :~adsori são foi incubada à t . ·a. durar ite 2 m i n utos a ntes : da mi stura : ser pipeta.d.a em f rac çoes de 1 . 0 0 μ Π 3 super f 1 c .1 e seco 3. G 0 uma placa de LB 3. Cf 3.1. C Ο Γ itend cio ranfen icol (10 pg/mL) c S P F cl C 3. S £ í oram invertic _i cl li inc ubadas cl1z ante aL noite 0 r. ° ^ jy olónias p resentes após incubação c íurante a noi te eram ios puta tivos com. o gene de li se .1 oe lambda ado por inserção do gene sspC. Foram tra.ns b θ -T.’ u. G 3. S adamente 50 colónias p • d. J_ cí ciu d jp acas d< a LB c entendo cloranfenicol (10 pg/mL) e as placas foram incubadas durante a noite quer a 30 °C οι Λ ^ O j. a a z o . As coic 3 0 ma s não a. 42 ° C na prese: r'' pi de assumida s como sendo i isoaéníos de iamb as que cresceram a .oranfenicol foram s de lambda contendo os genes sspC e Cmr. Foi isolada e sequencíada ama construção RPPC-lambda como descrito na secção A para confirmar a integridade dos genes sspC e de resistência, a Cm e que estes se tinham integrado correctamente no genoma de lambda. Foram utilizados os iniciadores de sequenciaçâo, SEQL1F desde a N° : 22} e SEQL2R desde a base 45792 até à base 45776 (5'-CTTAATCTGCTGCAATG-3' (SEQ ID N°: 23) (ver Figura 10). D. Produção In vitro/in vivo utilizando gene sspC em tandem Já foi refe rido que os con formados entre SA .lã 1 d0 L, m p O Ot / G j Setlow, 1998) . É possível que a i ígação proteina- -proteina potenci; dirigir cl 3. d G Ç3 O posterior de moié ;teína ;ac contactos proten que a xormaçao ae superricies ae > induzida por ADN possa le SASP de tipo α/β as lesse extremidades dos agregados de proteina ligada ao ADN, ç. modo regula r a. ligação da proteína (Hayes et 3.1., 2QC 10 ) . A taxa inicial de ligação de algumas (embora não de to d. as} as SAS: P de tipo α/β é de segunda ordem, em relação â co ncentração ini ciai de proteina não ligada. sugerindo que podem se r necessários dois

4U monómeros de SASP para que ocorra cada evento de ligaçao produtiva (Hayes et al., 2000). À luz disto, pode ser preferível aumentar o nivel de SspC na célula. Para além de regular o nivel por meio de um promotor forte ou, como discutido na secção A 12, uma sequência de intensifiçador de tradução e um sitio de ligação ao ribossoma de consenso com uma região espaçadora optimízada para aumentar a tradução de SASP, podem ser inseridos dois genes de SASP, em tandem, no genoma de lambda. É possível alcançar isto utilizando, em parte, iniciadores e métodos fornecidos em secções anteriores.

Por exemplo para criar um tandem de genes sspC em vez do gene S de lambda, o gene sspC deve ser amplificado por PCR utilizando os iniciadores (B6) ou (B7) com um iniciador reverso (BIS) (Figura 12): iniciador BI 5 S GACGCGT!ΪΑΑΤGAAATTGACCG·

SEQ ID IM° : 24)

Na Figura 11, os genes sspC em tandem são apresentados juntamente com os iniciadores utilizados para amplificar por PCR os genes antes da ligação no produto de pB/LFl por PCR inversa. Os produtos dos iniciadores B6 ou B7 e B15 são ligados no produto de ρΒ/LFl amplificado por PCR inversa utilizando os iniciadores 33 e B5 ou B4 e B5 (ver Figura 2) . Os plasmldeos resultantes, pB/SAPB2 ou pBSAP02 respectivamente, são então digeridos com MluI e Spel e o produto de PCR dos iniciadores Bi6 e B8 inserido é digerido de forma semelhante, para produzir quer pB/SABP2T ou pB/SAP021, respectivamente. O iniciador B15 é semelhante a B8 excepto que incorpora uma sequência de restrição única, i. e. para MluI, entre a sequência 41 de sspC e a sequência de reconhecimento de Spel, Para o segundo gene sspC, o iniciador E8 deve ser utilrzado com um iniciador directo (Bi6) que compreende a mesma sequência de sspC que os iniciadores B13 e B23, mas incorporando um sírio de restrição que é compatível com o produto de PCR de sspC produzido a partir oo iniciador B15 (i. e. MluI) (Figura 11):

Iniciador B16: 5'-CGACGCGTGATTCAAACAAGCTTG-3' (SEQ ID N° : 25)

Embora a sequência de rbs fornecida seja a do próprio sspC, a sequência líder alternativa pode ser substituída para influenciar a expressão deste segundo gene sspC (ver secção A. 0 produto de PCR resultante da amplificação de sspC utilizando os iniciadores 36 ou B7 e BI 5 deve ser ligado ao produto de I ^CR inversa. d. o p1asmídeo pB/LFl, amplificado como descrito na secção A. 0 piasmídeo resultante, pB/SAPB2 ou pB/SAP02f respectivamente deve ser então digerido com Mlu1 e Spel e desfosforiiado. 0 produto de PCR resultante da amplificação de sspC utilizando os iniciadores B16 e B8 deve ser digerido com Mlu 1 e Spel e ligado a qualquer um dos plasmídeos digeridos acima para originar qualquer um dos plasmídeos pB/SAPB2T ou pB/SAPQ2T, respectivamente. Novamente, pode ser inserido um. gene Cm1 no sitio Spel na extremidade do segundo gene sspC. A integração desta construção em lambda pode ser realizada como descrito anteriormente na secção A,

Alternativamente, um gene de 3ASP diferente, tal como, SASPp de Clostridium bifermentans, pode ser inserido após o gene sspC ou por si só, uma vez que o SASPp possui uma afinidade de ligação ao ADN maior do que o sspC, embora esteja menos bem caracterizado (Hayes et ai., 2000).

JmíAim1vÍ£ JLtvw y v JUíJJ u«L 1U JUJ^ tJjraDJÍ eficiência ia Ϊ/ 7 taro :omporranoo um g ene de de células < de E„ 1. Um exemplo de processo para testar a de 3ASP, distribuído por um bacteriófago sspC, para. provocar uma redução na vi abri rd; e como se segue: i. A estirpe de E. colí a ser infectada é cultivada durante a norte a partir de "stock" congelado ou de placas de agar fresco em XLB (LB contendo maltose a 0,2% e MgSO« a 10 mJM) . ii. Esta cultura durante a noite é utilizada para inocular 3 mL de XLB (até uma DCXoo de 0,02) que é depois cultivada a 37 °C, agitação a 350 rpm até que a DCLoo atinja aproximadamente 0,3. Uma f racção desta cultura. (1 mL) é então utilizada directamente, ou 100 pL são utilizados para fazer diluições de modo a que érre em 0,9 i UL de XLB, oporçao dos núr reros d arn ariar consoante numeros ae ceiuras como apropriado fagos para os necessidade. íii. Fracções (1 mL) desta cultura de células são então transferidas para um tubo Universal estéril, e é adicionado o iisado do fago, ou uma d.iiur ção do Iisado do fago (preparada como descrito anter dormente) (1 mL). A mistu ra cé iuia/fago é xncubaoa a o ·. c, sem agite içao, durante 30 min e depois é adicionado 2 mL de XLB fresco. iv. A DQsoo de cada amostra de teste é retirada e é removida uma fracçâo (100 pL), diluida em soro fisiológico tamponado 40 com fosfato (FBS) e são espalhados nas placas de LB : 100 ui cie arluições ade ouadas, A íncubacão das amostras 0 do controlo é continuada a 37 °C com agitação a 250 rpm e a pontos de tempo adequados, por exemplo de hora a hora, este passo é repetido, v. As placas são incubadas durante a noite a 37 °C e no dia seguinte é determinado o número de unidades formadoras de colónias (cfu) em cada placa. 2 . Re s ϊ iltados típicos (das 4 experiên; as por este processo com, por exemplo, é^r'! ϊ :.a.d.os na tabela segui r·, ps s) de infectar SPC-lambda, são TABELA 1: Viabilidade de células de E. coli após infecção com SSPC-larnbda

Tempo (h) DOsoo cfu/mL Pré-infecção 0,35 1,4 x 10b Pós-infecção 0, 15 1,2 x 10 ; 1 h pós-infecçã.o U , .3 5,4 x I0fc 2 h pós-infecção 0,23 1,3 x 10b 3 n pós-infecção 0,3 3 7,0 x 10b 4 n pós-infecção 0,52 5,2 x 10" 5 h pós-infecção n r-- q 3,2 x 10"

As células de E, coli foram cuitiv ci cl C S cl t Θ uma DOfjoo de 0,35 que correspondeu ; a aproximadamr ;nte 1, 4 x 10G células/mL, Uma fracção (1 inL) , de cultura de cél ulas foi infectada com aproximadamente 1 x 10"1' fagos ; SSPC” lambda ( 1 m.L de iisado 44 contendo descritof antes aproximadamente

10! adição de 2 mL i a Cf o s / ill .:.:j > ie LB frescc ncc previamente A partir de quatro experiências de infecção foi observado que através de 30 minutos pós-infecçao de E. coli com SSPC-lambda há uma quebra 360% na viabilidade celular comparada com os números de células pre-infecção; esta quebra na viabilidade celular aumenta de rotina para >95% através de 3 horas pós-infecçã.o. A diminuição na. viabilidade celular retirada da experiência detalhada na Tabela 1 é apresentada na Figura 12. 3. Os dedos anteriores podem ser comparados com a seguinte produção de SspC observada de rotina numa estirpe comportando arn plasmídeo de expressão contendo o gene sspC. Um tal plasmideo foi construído, (pET/PIP) com o gene sspC inserido no vector de expressão, pET24d (Novagen). Neste plasmídeo, o sspC está sob o controi o do prom ;Otor do aene da polímera se de ARN' de TV e a produção d Θ ò S jO ( Θ fortemente reprimida por uma presença de glucose a 0,2% nc mei o de crescimento e induzida pel L cl cl Cl 1. Ç cl C i de IPTG (a 1 mM) . Os dados de sequência, obtidos utilizi mído iniciadores convencionais T7 e B8, confirmando a inserção de sspC e a sua integridade é apresentada no Apêndice 7. A Tabela 2 detalha os resultados típicos (a partir das 3 experiências) obtidos quando a estirpe PTL14 (estirpe de E. coli BL21 ÀDE3 contendo pET/PIP) é cultivada como se segue:

i) A estirpe PTL14 foi cultivada em 25 mL de LB contendo Canamicina (30 gg/mL) num frasco de 100 mL a 37 °C com aqitaçã o a 2 5 0 rpm até uma. TV) oo de 0,2 5 cultura foi então dividi .da, sendo 12, i ) ml, transferi para um frasco de 100 mL frescos. 4 0 ii) A cultura num dos frascos foi induzida pela adição de IPTG (a 1 mM) e ambos os frascos foram incubados a 37 °C com agitação a 350 rpm. Foram retiradas fracções / í : f-v p-i 1 \ da.s cud .taras de controlo e amostra, imediatament e pré-in· dução e a i n t e r v a r o s de 30-60 min depois disso durante 3 horas e a 24 horas. iri) Estas fracções foram utilizadas para obter leituras de DCA η o Çr também util izadas para preparar diluições em série co mo apropriad o em LEf e e 'spalhadas em fracções de 100 μ .L em placas de LB agar contendo Canamicina (30 ug/m L). As pia .C8S Γ. ϋ.ϊ.'αίΓ! Incubadas durante a noite a 37 3 Θ cl. S LJ í a Ida des form. clCíO -C. e ip de colónia (cfu) em C 3. dei placa, foram. contadas e u ti 1 izadas para determinar cfu por mu,

Estas experi ênelas conf irmaram ç [ue a du .s tribu ição ( do ge Γ1Θ spC às células 31.3 3. V Θ C ; de um piasm ideo, e após expi ;0 ; ssã.o de spC-i ς e s ii 1l3 n li ma redi JÇcíO 133.3 S 1. V cl na víab ilidade ce :ll alar. 7^ iabi 1idade de a élulas compi arcando o vector pET/P IP, 2· 4 hor 3. S (\ q — ·; ndução, aur senta .1 i o e iramente como u:m r esul tu ido do ospe delro e/ou m utações de plasmíd.eo que red‘ uzern a exp: ΓΘ ssão de spC. 46 contendo o gene sspC no induzido) ou presença TABELA 2: Crescimento cia estirpe PTL pET24d (Novagen) na ausência (na (induzido) de IPTG (1 mM) .

Tempo (h) (pós-indução) DOeoo cfu/mL Células nào induz ida.8 Células induzidas Células não Induzidas Células Induzidas 0 0,25 0,25 7,0 x 10 ; 7,0 x 10 ; 0,5 0, 65 0,58 3,0 x 10" 5,8 x 104 1, 0 1,38 0,79 5, U x 10 7,0 x 104 2,0 Z / ! 0,83 6,0 x I011 6,0 x 10" 3,0 p ιζ ρ p U 1,20 9,8 x 1011 3,0 x 10" 24 4,23 1,52 8,0 x 1011 6,6 x 10 ' A redução observada da viabilidade celular em células que expressam sspC é suportada pelos resultados obtidos após o isolamento do ADK do plasmideo da estirpe PTLii cultivada e induzida ou reprimida como detalhado acima. Como um controlo negativo, a estirpe de E. coli NM522 também foi transformada, com o plasmideo pET/PIP (para originar a estirpe PTL38) uma vez que NM522 não contém o promotor da polimerase de ARN de T7 e assim, n S o pode < SCO rrer exprei í S ti O ri e e s t i rpe PT LI 4 (i n c luzida 0 jfj. § π i cui t ivadas em para.l .elo, í - χ·- “j . s o 1 a. d.! Kies er (U ; O A \ ! v "i; D« 2 mo d; s a y O ] ; p 1 a s mídeo, 0 ADN c io pia smí d .0 0 cie ineu bado cc sm 7 bpois tine ras θ I (2 Un ADN for err cão reso 1 v d. do por elect TAE (5 h 3. 4,5 V/cm) ro p; prese aapC, 0 ADN do plasmideo da induzida) e a estirpe PTL38, ie acordo com o protocolo de axar o super-enrolamento do ada amostrai (0,5-1 pg) foi presença de brometo de etidio a 0,06 pg./mL (Keller, 1975). Após visualização por transrlurnrnação de UV o gel foi fotografado como apresentado na Figura 13, que apresenta padrões de band de ADN de plasmideo preparado a 47 partir das estirpes cultivadas ± produção de SspC. como se seque.

3. S S σ O

Pista 1 Pista 2 Pista 3 Pista 4 Pista 5

Escada cie rud de i loo -..-, r.S jjq cie A.oiS( c.o ai) pET/PIP não induzido na estirpe de E, coli BL21 DDE3 (PTLi 4) pET/PIP induzida na estirpe de E, coli BL21 DDE3 (PTLI4) pET/PIP induzida na estirpe de E. coli BL21 ODE3 (PTLI4) preparação em duplicado pET/PIP não induzido na estirpe de E. coli NM522 ÍPTL38)

Por comparação com ADN de pET/PIP preparado a partir da estirpe PTL38, existe uma alteração clara nas formas do ADN do SspC que é plasmídeo na presença de marcaaamente mars pronunciada, em condições de indução (pistas 3 e 4)

Uma alteracao muito menos marcao? perfil também está presente em vertente na principais associadas ao elevado nível de expressão de SspC são: condições de expressão de poiimerase de ARN de amostra não induzida (pista 2) . alterações lo monómero (1 m S/C) i) Atraso da forma suoer-enro (pistas 3 e 4) em relação à estirpe BL21 não induzida (pista 2) e estirpe PTL38 (pista 5}, ir) Criaç cL 0 Ο-Θ Oclfl-aaS Gil U S d S que c orre at rás da forma ilar J -íne / acerta cio ιτιο11óiric·. yr o (ρ 1 s' t a s 3 e 4) . 0 3. C r a s o da t o riria mo n orné rica super-e: c r o J. a cí a. do plasmídeo pET/PIP qi rando a ·: sxpressão da polime rase de ARN de T7 é induzida (pistas 3 e i) e, emi particular, as bandas difusas nas pistas 3 4« e 4 são carac ausência desta; induzidas (pist difusas í lo risa d a proteína SspC. Este s dadc forma de η Ί ^ r potencial api icr ndas no AND é consistente roplexos de proteína e ADN. A do plasmídeo de células não com o atraso e sendo as bandas í i o r e o ADN de pET/Pl P ADN e a SspC e xpres S "'· a part i r de uma ser encar cl d c i como possuindo ou apl ica.ço Θ S 06 p.i. 3.Π ta s GM, 4. Para demonstrar a importância do nível de expressão de sspC, foi construído um fago lambda com o gene sspC inserido no gene S r nas polimerase de de um modo idi é substitu .r. d o T| 3 -j i -j “ γ·| n. np ί Π Ϊ G C ti. cl dei S i- ailizando o sítio de ligação ao ribossorna da N de T7. Esta estirpe (ST7PC) foi construída de ara raodo idêntico ao SPPC-Lambda, excepto que o rbs de T7 elo rbs do sspC nativo. Após o protocolo infecção com SSPC-lambda, as células com ST7PC-lambda resultam numa perda temporariamente acelerada de viabilidade. Por exemplo, numa experiêr r c i a tipica, uma red.ucç ão de d9o% na viabilidade celular e ob servada dentro de 1 hora após i nfecçã.o, com um. redução Q 9 dentro de 3 h (ver Tabela 3) . Estes resultado indicam que a utíii zaçao de um rbs alterna tivo proporcion· um meio para modular os niveis o Le expressão ps S SOí"" 49

TABELA ο j

Viabilidade de células após infecção com ST7PC-lambda

Tempo (h) DOgoo cfu/mL Pré-infeeç;ão 0,39 3,2 x 10b Pós-infecção 0,15 3,5 x 10' 1 h pós-infecção 0 , 18 3,7 x 10e 2 h pós-infecção 0,37 3,0 x 10b 3 h pós-ínfecção 0,34 7,2 x 10" 4 n pós-infecção 0, Í5 6,8 x i 0b 5 h pós-infecção 0,47 6,2 x 10" APENDICE 1 tipo α/β que foram as suas sequências de

Uma lista de todos os SA.SP do sequenciados até à data em conjunto com proteína relacionadas ε.Άΰϊ' A lua.c jc ais qítnçi η 11 vp q a sc; a idqmikl e L a s 1 ! s-.it; Auivs.tú qqnitggçíQi: ( di?Q LO dOí2:ed A MJ 1. lLqpj-;udqãã;> qlikldi ·: d d í; Pupd.qádxé t tã d Pl-PPqqjtí a •::'kid.váfi>qq Q ID ÍÁ):27} βΑχ'Ρ ¢.1 .« % n n n.r; dl 1 ip q a asa iv.vxaklt· ixassítpxqlvj adkbcrcvn jo· v"q;ps .uL-Kr j. v ic j.i^c.Ttsudtfcrõ; fíifS32Q Γί:· HO s 2::&$ p ti ϊ* r ] τρ r.j v« íjh 1 dq r k 1 vacjí? jí qvr.·. Iqsdfvaran '.-•qq-cníf ler Ivqqõ.qsqln. rçt.t.s: (.¾¾ 3: sie-gr® SASF A ib. ·ζ\ π c 11 k 1 v ii p çs^cãaidQicik lqp‘xav.ar<rri qsvdi?>d.Lt;ka d-yqciissqppiq qk (nEQ ID mi ãcíj ã: Arc i·1 C .¾ »l" Nc H ' ' >J" · <4 O '< Ί kl -) Ist ''d "> Ί i ^ JL 1 "O L 1 ' Ί ] [· >501 dIJ 3as:í! >:::l ΪΒ *iL a " ^ i ) ] 1* j A-l > U » "j > "dv1 ^ ' j 1 f N Ti .dc:ql-;íqo;r:i: < 1 li .:?►?.) GAGF 02. Alt ' \ 1 L j 1 ΐϊ'. •ϊ1»·* ixín:;\ppld‘;.>r.l'c i x ]s tn \ ^ wv.Kk:í:· < >-. λ . > :r< PO:33: SFiSF C3 aui 1 -+) ** j- > ^ fk- K ^ í>** sl1· t" ' - ^1 SASl u-4 ÍUJf «* •írk '.Pvw -All'· ^ y']\ki -OV' Λ :dn ílísS" Cd Tft ΐ s ^ N “ } vC ^ ^ i op1 ^ ·*- í 1 % <' Ht qir.kfl vtyr.a *· VN ' Sh gj.íòOkq) ir> NO:dti; C-l β ' V > — >>5^ f1 Ç"_^d_T Ji. târangs-vgg eisferlvqla Vn 'q vr.dtd ÍG NO;3?: i' q> 2 ϊΰο ,vVv 5 v ' ' At 11 ό · S K i- Vr’ÃT;^r;t;í?rvyq q.í VMrJ.vq. Ib. v H %l . ti.íSKQ ;i'> AG : 3« ; Skíl? 1 mcj k.rs. n ç.· tf n pn ;,dqEÁ;yA.Ídq tay-ST^isvgg q i p. k x çsqcí.çççxfíp.í' • (SSQ IP Wí>?5?) A Kôxrsbsiitisv pçiseçfiidqc; kyvdctqc-fgv «luadtatara ngsvqíjídifK rlv.isl-atíqql. ÍSEO li· HO:4ÚO SÃS.? OEi jxí.lTin.i.tnçye sdUsUisa t:t:at:ád.':co:ky qpdk.í;hhlq:i! açnkqqp.pdk.p l.vx^xçk-ldi : ccyaiA ΪΕ' jSO;4l s £¢32¾ fcíi^-raacçitxi. j.u.9 SAÍÍ? 1 dipdqsç:vrN’ss :iqilrpuaaq yi-dquètixaia vnlq-.id. dusx'aíiç:svq qe Àtkdí.Ço í: aOTçgg·^ ; {S £G 1CD 1000 42.) JâflKiíiliaí? £2.1TlCliJ? SÃS!? A diAdTduéofiq]. qsikyc-ia.sfif r^nçrxVvTq^.i t.krl^jrnaôq r^iGgyíUCSS IS 5íO:4j; 50 C.i >:,.a t s.'±dl aa: AíííAziíít:·;: t-m;? S.ASP a fcíísjumtkav :psií-kíií:.lkard kl«ian«.l.g.l sriydí.fjdkgíf aOo.yqíjgyvç gyjstKKly&sa âe.qqsisgqíjr (BEQ Π> íKiriOt SSSP 3 skskavpea.t aalnqaiklei aiislqisiiys Sv-ikgrsita;; qrjgyvggyssí; kfclv>^vaerq ujsijkÍi.íXJ XCí iSO;45i

CiilrSÈI-idilEJ! píU:££À3iq>r!US SAHP i Hsksivpask; .iiçisáíkiiAy «raXqv^Ssâ yr^^sssqo· ssTrgçsavkác avasy&sqiS; ÍSES 13 SíQiSS; SASl? t.:i Eisqhiivpeak jiçls kífcsev aafasgypfsc; yngaUsskqcj esvggemvkr javsqyskgi (SEQ PD ^0:42 SASP c:2 ®ÉqÍÍS.vpeal: lur.tskfkíws.' atiaísu^pEsd yrididj.ssrqí. eevgeetrTkx R^ysys-q?:!]};;@;;q 13 $0;48) 33¾ :odd^‘ d x>j i a .d iialcpAila

SftSí- 1 *Mirm»s!i*.l -trvpgiipnaja qaiiiy«3,say:í gvqlqsdsts rssgsvqg*! t.xr2.T<|Siíieg gfggqqygçq qxiSECi £» MOsíSi iícío.rôesríí.ijua uneae ÃACP 3. !stn;«insfssri qll'.ísxivqqa inqsRkeaian efgvakq-pda UsraiNSvgg eitÁiiv^qw «sqiíiusfytA (SSQ ΪΒ NO;30) S&fíí? £ JKprausssfiçj. ivp^vqqslt; <^)k««laee£ <p?qiqp4iasa laíigs-í-çyei. tfcxivxííxq» qiBísgytS·:{SSÇ> ID S0;5i) 3S i . jr; c; ;í ,:X: i n ,:,n: y. :>y _? fc&sípijpfci luss S&Sp 3 isiaqqgsEtss τ;3ί1ί.vaçaaq aidqssfcísia qyio;vtiq&ò ttsrsadqavg ggipsrlvs':, aqqqÀgggts £{SSQ X& 80:52} APENDICE 2

Um alinhamento de sequências cie proteínas SASP do tipo oí/3 conhecidas até à data. SAÉ? A tivá tiTj na qr± anr <. Λ-w . ·. ^ ^ p L q ^ > íívifs vot>i t k-l·· ·\Τ ^ i \^r 1 SASP .3 as T\ir ] 1 i , k v' ^ p J 0 f, l”S' xuV. 13 < vi,.·!1 1 L1 í' SASP ú; os jSííC ? > «a*' inn ioll_ ' ^ " o - ? - í vil-, po > 1 1 i ; yi l íp ' A ] ' !\P SASP iv‘ OS n%ëjvn.c.L”Vi ^ t' 1 ti J_ \ V ^ n TSr " <Λ l''',' 'j ίΐ'Ρ' 1 ^11 " i . s, _ \0 SASP à m l y v \ o, J sV δ S* 7 Ί ' ' ϊ "Τ' , n :- _ ' Lvt: Ki23 P ' >·, Oi d00 SASP 0 U) 3' 3 \ \ oq e' ;i_, *, θ'- à λ "d qjv ^ , ’ - Í1 u '1 J! Ϊ . ''í L’ 3 - v SASP 01 í 2 í "> v a * > V ^ a * - i ϊ v X ^ ’ . >1 ,1 !l >’! -.o; I. vt*} S SASP C2 (Si ''«•vi ' < in t v Λ " w ctc--’ Mf' s vh i ^ ,1 . -^1 A'_-J C ' O ^ ib t SASP C3 i ··· :· jiiKftr.iõo.htp·'' ^ S irp^l^"' C^-Ls 1 à 11 ^ *VjS\ NÍV.P 1 V. \ '•m 1 ! 1' ' : S f p P SASP C$ <23 1 Ί / ^ fc. J. L *> V t. > " i ^ i c t ^-u,c ή ^ Λ^νί5 «. ώ' ' \* '"·= Ϊ )i'j' 31, t ' 'i ' > "Άο ' OS (2) U K ^vP J ^ l 'í t iv. cv ! ' c i ttiA-δίΛνί 'ívynl v xJ. ' f llq ] ’Ί S ^ p IU ^\J -ei ν': ' -1 (23 ΙΛ ίϊλ i - U jlY5k l d·- dO 1 4. t v \ '· 1: t & i: ar.tc: avcj 9 .ώ-iu k x 3' 3 ,7' 1 ‘ ,sr,' 15' L’ 2-¾ -a i v -2 U; K*SV"V t * ΝΛ.Ι \s. 1 C i 1 U \ v. Λ L__^.a^Ci ^ \ '' -j' . ,'_3 J.7 '< '3 A, Γ ííf v 4 i· χ -l '* 1 S < < C-\ t _{ <-L 1 V>.v ' x4T .-ar-.a^qni 7','' " 0·'. ’ w \t-f 5· ! SASP d m ° o.^ l \ ...Jv < ·- c’ ^_tu... ,P... w <* L v . 7 ."·'. ' *11' .''S í A! .U:!'--íld ^ ΐ Νΐ ^ '' £-tv ·> ” νν-'Ί <"·ΐν>^ v<-3‘ t ^-¾ }·'* » sSfr _ v v . C- 3 < S Ν' ' . ?'3v I' ms 42 s sasp í 5 ! Ná.«^0^iL 5 5\q 1 L K v h "ijc -ΑΓΙΤΟ “'P. 1' 00 r 41) ' ' !S.) ??v f t t &ivvr ; \ , i srari^*" - u s. !]i . 0,5, T ( ’'. 7T. -lS k ’ U '0 49. .o m ító t iOs ' »-í gllvíp^ 54^ r **>>1 siafi.sít/vr· 1 ttSKlpíl f V , 1 [. 1' £ ,a í, 1 Sã 1 IP ΡΠ x 2' SSSP Π) íspnruiaenqllvpg-ifqqalníjísteeiíissígvcl^pdassranç'' ί. „< "· 11' { a 17 ' 1" 3 0LP dl 5 SfiSP ÍU *.«-^ií§i;!ve*aíi.qllv&qa8iqíd.vJíí(»kí«is^e£qvtlí!adttsraR« 'ί ,ι i -i A' -y * k ' -y-kl-ir *i * ,K v y A > χ r- '' V104 Ji|"r , \ , j ' Ί, £ w .3 d ave 0.: Ui Sãcidiws .ílíanis \2} &&GÍ11.ÍI3 jssçsssrGZ-im ííí SpcjroaaroiAa íjaàqpijila ! 3; Sãoi.l.las >d<é retue : Ί 1 Pphd.Odarairrs s? Í43 steex-ozh&sxtqpnilm (¾) 1¾ ··; t}. u ·4·Λρυ>'<:ίί thalpopij Li u $ * Re ε í du c '3 contervadoo eui SASP rfe Bacil.ius e SporosarcÍ.aa, assim c 0 ih 0 e ir: S A S R de

Thermoa ct ínonwces. 51 SSSP « í 9i srsp fí m SSSP 1 UOí SASP ci [1Í!J ss.sp c;i <xcj ttesnnt&íspeakaííiJfgBjafciswsIç.isrsytStaíikgiwstairq^gyTggyMSíSki.yajsseqi-jiafí^çr (SSQ SC 530j 44) sÍ'kk;ivpíiak:iain-qskielaríSÁ5iSP:y«sv'àá::j‘aitiix(jft9wijgyíP;aS'K.S.'ípy.iStó«'r;íjresíík ÍBSQ. ΐ.ϋ S30! 4ã} 5*sksX’jp«.»kíi^lskfknevarelgvpÈsdy«gd“~.j-5'is:ri;yjçja'V9g*EivkrisnrsKj.'sj5í£.i,k Í.HEQ IJ> Kí>; 4 S-) ®3rthlvpfsakayisJifkjjevaaeaitj^íadys^d—iss&gygsvyije-Kyirisvaqyeicgi (SSQ .!'£) MQ: 4 7} wcíwhã v£)S«kTiylsk£iíttevansff.<pTp£s!SyT*gtí~~is;í£gcsS'ígijere-s'}f..rjKveky«qí5Ksk ÍSílQ 3£I3 iií): 4.8} ¢¢¢¢¢0 ΰ * < * * * 0 * *** Ç * * -5 «

Chave ífij CãíMficídíííasi MíCeríseriíAiis iãOJ Cãoscridicus perfriagesae a Aesidcioa eonservacioe eia SASP de Bacillus, Sporoaarsciaa e Clustradaaf asaiin oorao eia CACh cie TBeraioac iiaoaiyces.

Resíduos conservados em SASE: cie C.loscridia 52 APÊNDICE 3

Sequência cie ADN cie sspC ous codiiiCd oAaa C o'a esuxrpe d-Bacíllus subtílis 168 (obtxdo a par tir de Subtixis ^ nu Instituto Pasteur. atttactaat 50 atagcttctg 100 a&acggttca ISO aacaaaacat 200 ctctettttt 250 272 {SBQ ID NO:53) atggctcaac aaagtagatc aagstcaaac aacaataatg tcctcaagca gcttcaqeta ttgaacaaat gaaaettgaa sgtttggtgt tcaattaggc gccgagacta catetegtge gttggtggag aaatcactaa acgttt&gtt «gc^tagctc gggcggtcaa t-ttcattaat ft-âtgagggg gacaatitece taagtcttct ctaaatccat ac

Mota: O gene de sspC estende-se cie í-ti.9 (.inclusive) A sequência terminadora estende-se de 22o-24J (inclusive). APÊNDICE 4

Uma lista de patogénicos comuns e alguns dos seus fagos. (Esta lista é representativa mas não exaustiva).

Colifagos:

Bacteriófago lambda

Bacteriófago 933W (Escherichia coli 0157:H7) Bacteriófago VT2-Sa (E. coli 0157:H7) Colifago 186 53

Colifago PI Colifago P2 Colifago N15 Bacteriófago Bacteriófago Bacteriófago Bacteriófago

Bacteriófagos

Bacteriófago Bacteriófago Bacteriófago Bacteriófago Bacteriófago Bacteriófago Bacteriófago Bacteriófago Bacteriófago Bacteriófago Bacteriófago Bacteriófago Bacteriófago Bacteriófago Bacteriófago Bacteriófago Bacteriófago Bacteriófago

Salmonella spp x 54

Bacteriófagos de Shigella dysenteriae

Bacteriófago Φ80 Bacteriófago P2 Bacteriófago 2 Bacteriófago 37

Bacteriófagos de Vibrio cholerae

Bacteriófago fs-2 Bacteriófago 138 Bacteriófago 145 Bacteriófago 149 Bacteriófago 163

Bacteriófagos de Mycoplasma arthritidis

Bacteriófago MAV1

Bacteriófagos de Streptococci

Bacteriófago CP-1 Bacteriófago ΦΧζ40 Bacteriófago IA Bacteriófago 1B Bacteriófago 12/12 Bacteriófago 113 Bacteriófago 120 Bacteriófago 124

Bacteriófagos de Pseudomonas aeruginosa

Bacteriófago D3 Bacteriófago ΦΟΤΧ Bacteriófago PP7

Bacteriófagos de Haemophilus influenzae

Bacteriófago S2 Bacteriófago HP1 Bacteriófago flu Bacteriófago Mu

Bacteriófagos de Staphylococcus aureus

Twort tlll-2 9S OPVL 0PV8 3 Φ11 Φ12 Φ13 Φ42 Φ812 K P3 P14 UC18 15 17

Bacteriófago

Bacteriófago

Bacteriófago

Bacteriófago

Bacteriófago

Bacteriófago

Bacteriófago

Bacteriófago

Bacteriófago

Bacteriófago

Bacteriófago

Bacteriófago

Bacteriófago

Bacteriófago

Bacteriófago 56

Bacteriófago 29 Bacteriófago 42d Bacteriófago 47 Bacteriófago 52 Bacteriófago 53 Bacteriófago 79 Bacteriófago 80 Bacteriófago 81 Bacteriófago 83 Bacteriófago 85 Bacteriófago 93 Bacteriófago 95 Bacteriófago 187

Bacteriófagos de Chlamydia

Bacteriófago <í>CPAR39

Micobacteriófago

Bacteriófago L5 Bacteriófago LG Bacteriófago D29 Bacteriófago Rvl Bacteriófago Rv2 Bacteriófago DSGA 57

Bacteriófagos de Listeria monocytogenes

Bacteriófago AI 18 Bacteriófago 243 Bacteriófago A500 Bacteriófago A511 Bacteriófago 10 Bacteriófago 2685 Bacteriófago 12029 Bacteriófago 52 Bacteriófago 3274 Bacteriófagos de Klebsiella pneumoniae Bacteriófago 60 Bacteriófago 92 Bacteriófagos de Yersinia pestis Bacteriófago R Bacteriófago Y Bacteriófago PI 58 APENDICE 5

Uma lista de receptores de bacteriófago e ligandos de bactérias e de outras células, não exaustiva). (Esta lista é representativa mas Receptor/ligando Fago Porinas (OmpA, OmpC e LamB etc.) (e. g. proteínas envolvidas no transporte de substratos específicos: fosfatos, nucleósidos, ferro, vitamina B 12, maltose e maltodextrinas) Lambda e outros colifagos tais como colifago T-Par 0x2, Gama de Hospedeiros de Mutantes de colifago 0x2 Peptidoglicano Fago A25 (Estreptococus Grupo A) fago de Listeria monocytogenes Colifago T5 N-acetilglucosamina e ramnose substituintes de ácidos teicóicos Fago de Listeria monocytogenes L-Ramnose Fago PL-1 (Lactobacillus casei) Exopolissacáridos e Lipopolissacáridos Fago Siphovirus NM8 (Rhízobium meliloti) Gama de Hospedeiros de Mutantes de colifago 0x2 Ácido teicóico Fagos SP 50 e Φ25 (Bacillus subtilis) Afinidades receptor/ligando modificadas Receptor de factor de crescimento de fibroblastos Fago M13 apresentando FGF2 nos revestimentos

Receptor de factor de Fago Ml3 apresentando EGF2 nos crescimento epidérmico revestimentos 59 APÊNDICE 6

Dados da Sequência de SSPC-L&MBDA (apenas cadeia positiva), obtida utilizando o& iniciadores: 13FI e B30 (ver Figura 7, Secção A 11) (BIQ ΙΏ wmU) jExtremidade inicial f:c ^agmentc òo >- originado de p3/IPSAP0C (base 44660) —__——►

CTAGTX-feOTCACtDTCSACSrATCSTCTSGMCTCCiyVCCATCGCAGGCAGAGAGGTCTG

CAAAAíGCAA^CCGAAACAS^^^SCMGTAAfAOT&SAíSCCTGCATMCGgTTTCGG

GA?TTTrTA!PAfCTSCàCAACASSTMGASCAffSÃS?CGATAATCGTSAASASTC<3QC

SAGCCf CSGf TAGCCAGIGC TCTI T CCGTIGf GC1 GAâlT AAGCGMf ACCGGAAGCAGA ACCGGATCAC CAMTGC GTAGAGGC GTCATCGCCGCC CAGCAAOAGC&C&ACCCAA&CT GãS CC GTAGCCACf GTCTGf CCfeAATTCATTAGTAATAG TT&CGC ΐ CSCGGCCT T1T&C

ACATGACCtriÇGTGAAAGCGGGfGSCAGGàGGfCGCGCTA&CAACCTCCTGCCGTfGTG CC CGTGCAíTATCGGTCACSAACâ&ATCTGAT TACTAAftCACASTAGC CTGGAfffSff C

Ϊ.ΤπΙοο o cio gene sspC

CAfGACC^^GgCTCA^CAAAGfAGA^CgyiGÃTCAAACARCAAfAATGArTTACTAA^C ATaol

Cf CAAGCÃGCf TCAGGTM’ TGMCAJ^TGMACfT SMAT&GGTTCfGAGf TfGGfGfT

CAAffAG8CGCTGA6ACfACATCrCGfQCAAACí5GTTCAGf^SSTGGAGAMfGACf.aA

Finai do aene napC

Final do ACGTTfAGffCGCTTAGCfCAACAAAACAf GGGCGGTCAAfS5 T CATf ÃÂâCfAg ;?"r.agn;.ento do aene C:rd <

Spsí

CAATAACIGCC TTAAAAAAATTACGCC CCGC C CIGCCACTC&^CGC&Q fACfGTTG 60 Β54 e B55: ÍSSO ID UOt&S) TGfTCAGCT^

í. bsss 4S43S

Inicio do Frag:^ní;o do gene Cif

SCGGAGfGMÃCfG^ÇT^èÃÃATCAÍuTM^CMCGTMGGCSTTCCTCGMMGC

TGGCGTSGTCOGAQGfíMCTí3AmMKaÃC0TCMÃBJmCÇm5mÂBTCÃ.TGGTTÃTQAC

GfCATTGmGâCGgAGÃSCTATTTACTaATmCTCCGATCACCGTCGCAMCTTGTCAC

GCfAAACCCAASÂCTCMATCAACASGCGCCGGÁCGCmcCAGCTTCTTTCCCGTTGGT OSGM;SCCT ACCGCAAGCAGC1:!TGGCCT GAAAG.ACTTCTC TCCGAÃÃAGTC AGGAC GCT GT6GCAÍ TGCÀGCAQ&TI&âGG&GC STSGC GCTf tac ctatgat t g&í c gtgg? gaga? CCGTCAGGCA.àTCGAOCGTTSCASCMaTCTGGGCfTCÁCTGCCGSGCGCTGGtrmTG .SíGÃGrTCfíAÒCATÁASGCT:SÃCAGCCGGATTGCÃAAATTCAAAGAA<5CGQGCGGAàCG :;.x;r£:AÍ'dade áe '--n iraoiuento de λ originado de pB/IPSAPOC (bane 45S72)

£7 çâGASâGãTf GA:f'(ÍmGs3 AEâGTC ACCGGG 61 APÊNDICE 7

Dados da Sequência de pET/PIP (apenas cadeia positiva), obtida utilizando os iniciadores: T3 e T8 P r: o"i o't c. r: de T 7

rbs de T7 lei.ci.o do gene sspL ççcyGyh<zMMM%rT¥G%TTP^^Tm<m&msMM&Gm^&cTGP&c&&Í^'z

ClAÃC^GTfCACTfGGÍTGSASMATCACTlyyiCGfffAetfCeCffAGCfS»

Extremidade da ORE de sspC CIMAftC^^íSSGCDSftmM1? TCMTMbTm^SliCGGSeMmTTCCDCTCf CTiel X *

Extremidade cia. sego·?.cola de terminacto de espC

XhtiZ

Mardh

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Phico Therapeutics Limited <120> Polipéptidos e suas utilizações <130> 206308/JND/RD/sv <16 0 > 60 <170> Patentln versão 3.1

<210> 1 <211> 69 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Polipéptido tipico possuindo actividade de SASP alfa/beta <4 0 0> 1 65 &©t Ala Asn Mn Mn Ser Ser Asn Ser Rmi e.le Leu Leu ¥®1 Prcs Gly 1 5 10 15 M,ss. Glu wls Ala XI e &sp Gin Μ: 1: Lya Tyr Giu 11¾ Ala Ser Cl.u Phé 20 25 30

Gly Vai Asn. isu Gly Ala Asp lar Thr Alm Arg Ala Asn Sly Ser vai a 5 4 0 4 is

Gly Giy Glu íle Thr Lya Arg Lsu ¥al Gin leu Ala Glu Gin Gin Leu 5 0 55 6 0 G1 y 31y Giy Thr Lys Sõ

<210> 2 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sequência do iniciador <400> 2

aaqtqçâ.qgà tcacf tcqao qtetcg 2S

<210> 3 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sequência do iniciador <400> 3 66 25

<210> 4 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sequência do iniciador <4 0 0> 4 oátfcs&tgg tcatgtatta se ‘"í. <210> 5 <211> 17 <212> ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> sequência de iniciador <4 0 0> 5 oatctfccatg tcttacc <210> 6 <211> 25 <212> ADN <213> sequência artificial <223> sequência do iniciador <400> 6 67 ggaGtsgtgs ..sa·: caat aat caacg 2$ <210> 7 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> sequência de iniciado <4 0 0> gçitcsscaàâ aitagatcasg 20 <210> 8 <211> 29 <212> ADN <213> SEQUÊNCIA ARTIFICIAL <22 0> <223> sequência do iniciador <4 0 0> 8 datgçcátgg ctoaadas&g tagatcaag 20 <210> 9 <211> 24

<212> ADN

<213> SEQUÊNCIA ARTIFICIAL 68 <22 0> <223> sequência do iniciador <400> 9 gg&efca-gttt siUdgaasttg 24

<210> 10 <211> 25 <212> ADN <213> SEQUÊNCIA ARTIFICIAL <22 0> <223> sequência do iniciador <4 0 0> 10 gqtantqatq tgstggctgc tstgg 25 <210> 11 <211> 23 <212> ADN <213> SEQUÊNCIA ARTIFICIAL <22 0> <223> sequência do iniciado <4 0 0> 11 gcsaeatoât a&cgcaga-gc· &tc 23

<210> 12 <211> 21 <212> ADN

<213> SEQUÊNCIA ARTIFICIAL 69 <22 0> <223> sequência do iniciador <4 0 0> 12 caagâqfcact: qeg&í;g&gt.g g 21 <210> 13 <211> 18 <212> ADN <213> SEQUÊNCIA ARTIFICIAL <22 0> <223> sequência do iniciador <4 0 0> 13 ia <210> 14 <211> 21 <212> ADN <213> SEQUÊNCIA ARTIFICIAL <22 0> <223> sequência do iniciador <4 0 0> 14 gt&ggt&aig gcgttsteaG q Ò -Ί

Cv t·.'.

<210> 15 <211> 22 <212> ADN

<213> SEQUÊNCIA ARTIFICIAL 70 <22 0> <223> sequência do iniciador <4 0 0> 15 ggtggtgc

<210> 16 <211> 24 <212> ADN <213> SEQUÊNCIA ARTIFICIAL <22 0> <223> sequência do iniciador <4 0 0> 16

<210> 17 <211> 25 <212> ADN <213> SEQUÊNCIA ARTIFICIAL <22 0> <223> sequência do iniciador <4 0 0> 17 v uj: sj <·ν Sv w s-i. ai

<210> 18 <211> 28 <212> ADN

<213> SEQUÊNCIA ARTIFICIAL <22 0>

<223> sequência do iniciador <4 0 0> 18 â&utqe&goq etgtg&egât get&afccc 28 <210> 19 <211 > 24 <212> ADN <213> SEQUÊNCIA ARTIFICIAL <22 0> <223> sequência de iniciador <4 0 0> 19 s-âctgcsGga ttoaaaos&g cttq 21 <210> 20 <211> 26 <212> ADN <213> SEQUÊNCIA ARTIFICIAL <22 0> <223> sequência do iniciador <4 0 0> 20 asc&ggcgcc gattcaasca agcttg 2:6 <210> 21 <211> 22 <212> ADN <213> SEQUÊNCIA ARTIFICIAL 72 <22 0> <223> sequência do iniciador <400> 21 do

<210> 22 <211> 17 <212> ADN <213> SEQUÊNCIA ARTIFICIAL <22 0> <223> sequência do iniciador <400> 22

<210> 23 <211> 17 <212> ADN <213> SEQUÊNCIA ARTIFICIAL <22 0> <223> sequência do iniciador <400> 23 ctt&atctqc tqcmatg

<210> 24 <211> 32 <212> ADN

<213> SEQUÊNCIA ARTIFICIAL 73 <22 0> <223> sequência do iniciador <4 0 0> 24 ggsçisgieg acgogxtto;® iga 32 <210> 25 <211> 24 <212> ADN <213> SEQUÊNCIA ARTIFICIAL <22 0> <223> sequência do iniciador <4 0 0> 25 cgâogogtga ttcsasosai Λ A <210> 26 <211> 69 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <4 0 0> 26 74

Met Ai a Asn Asn A*» Ser 51 y Asn Ser Arn Asn Leu Leu Vai PV:o Gly 1 5 10 15

Ala Ala Gin Ala lie A»p Gin !yu In» Slu lia Ala Ser Glu Phe 20 25 30 01 y Vai Asíí La» Gly Ala. Aãp Thr Thr Ser Ary Ala Aen Gly Ser Vai 35 " " 40 45

Gly Gly Glu lis fhr Lye Arg La» ¥sl Ser Phã Ala Gin Gin Asn Stet 56 55 60

Glv Gly Gly Gin Fhe 65

<210> 27 <211> 67 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 27

Met Ala Mn Qln hmn Ser Sax As» Mj* Lá» Leu Vâl Pr® Gly Ala Ala 1 5 10 15

Gin. Ai δ lis Asp Gin Met :ly.s Leu GI» 11® Ala Ser 01» Ph® Gly ¥&1 20' 25 . 30 A,sr Leu Gly Ala Asp Tbr TAr Ser Arg Ala A®n Gly Ser Vai Gly Gly 35 . 40 45

Glu 11« m» lys Arg La» ?®X Ser Fh® Ala Gin Gin Gin M®t Oiy Gly 50 55 00

Ara Vai 3 ir. OS 75

<210> 28 <211> 72 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <4Ο0> 28

Met Α1 δ Gin GIí» Arg $*r Mg Ser A.m Am Mn Mn Asp Leis. Leu. 1 S 10 IS

Ilé PrO Gin Ala AIr Ser Ale I le GIu L1 n Met Ay 3 Le:.; SI& 11¾ ?>.la 20 25 ' 30

Ser 61 u. Pha £»ly Tal Slr Ler. Qly Ais Gla Thr Thr Ser Arg Ala Asn

35 40 IS

Gly Ser Vai Sly Giv SI·,; Ile Thr Lys Arg Seu Tal Arg Leu Ala Gin 50 55 60

Gin Aãn Met Gly 61 y Gin Phé Sis 6S 10

<210> 29 <211> 64 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 29 76

Mst Ala Ssr &rg Asm Lys Ma Vai. Vai Fxo §iy Vai §iu Gin Ais Lee. 1 S 10 is

Ssp Gin. Phe Lys Leu G.i u Vai Ais Gin Giu PA© Gly Vai. Asm. Leu Gly 20 23 30

Sar Asp Thr Vai Al® Arg Ala Agp Gly Ser Vai Gly Gly Sln Aet; Thr 35 ’ 40 , 45

Lys Arg Lê®. Vsl Gin Gin Ala Gin Sér Gin Lê® Asn Gly Thr Thx Lvs SD 55 SD

<210> 30 <211> 62 <212> PRT <213> Bacillus megaterium <400> 30

Met AI® Asm Thr Ãsn Lys Leu Vai Ala Bro Gly Ser Ala. Ala Ala 1.1® 1 5 ' 2 0 " 15

Asp Gin líst Aye Tyr Glu Iln Ala Ser Glu PA® Gly Vai Asm. Leu Gly 20 2S 30

Pro Glu Ala. Thr Al.â Ar® Ala &®n Gly Ser Vai Gly Gly Gla Ile Thr 35 ' 40 45 ays .Axg n®® Vs.l Glr® Gfer. Ara G-lu G.m G.m ggu G gy GLi.y Lys $0’ 55 6(f <210> 31

<211> 72 <212> PRT <213> Bacillus megaterium 11 <4Ο0> 31

Met Ms Asn Vyr Gin &&n Ala. Ser Aan Irg Aba S&r Sar Asm Ays Leu 1 " 5 10" xs V&l Ala Fr o Giy Ala SI o. Ala Ais 11« Aep (11 n Set Lya Ph- Glu Ila 20 35 ' 30

Ala Ser G1u Phã Giy Vai &sn Leu Giy Prc Asp Ala Thr Ala Arg Ala 35, 40 ' ” 45

Asi; Giy Sar Vai Giy Giy Glu lie Thr Lys Ara Lee ¥.sl Gin Isn Ale. 50 " ' 55 60

Gin Ase Leu Giy Giy !ye fyr r " ?o"

<210> 32 <211> 69 <212> PRT <213> Bacillus megaterium <400> 32

Met Ala Aisr Asa Ase Sar Ser Asa Ass Asa Gie Lee Lsu Vai fyr Giy 1 S 10 15

Ala Gle Gin Ala Ils Aap Gin Stet Lye Tyr Vi u lis Ala Ser Glu Fsa 30 " 15 “ 30

Giy Vai Asn Leu Giy Ala Atp fhr Thr Ala Ara Ala Asn Giy Ser Vai 35 40 45

Giy fílw Via lis Thr Lys Arq Lee vsl Gin Lee Ala Qiu Gin Gin Lãé 5 0 ' 55' 00

Glv Giy Giy Arg Fhs 65" 78

<210> 33 <211> 73 <212> PRT <213> Bacillus megaterium <4Ο0> 33

Mefe Ala As» A®η Ly® Ser Ser Assl Ά&η Gin. Leu Léu ¥®1 Tyr Sly 1 s" 10 là

Ais Glu Gin Ai.® lie Aep Gin Hei: Lvs 7y?: Giu II e Ala Ser Giu Phe 20 2S 30

Gly Sal Asn Ler Gly Ala Asp Thr Thx Ala. Sxg Ala Asn Gly Ser ¥al

35 40 * 4S

Gly Sly Slss II® fhr Lys Arg L®u Vai Sl:« Ase. Ala Gla Gin Gin Leu 30' SS 00

Glf Siy Gly Arg Ser ly.s Thr Thr Lm; 65' 70

<210> 34 <211> 65 <212> PRT <213> Bacillus megaterium 79 <4Ο0> 34 Mêfe Μ®. Arg TM j-sn Ay® Leu Leu Thr Fru Qly Vâ.l Gin Gin Pb® leu í 5 LO ' 15

Asm Gin fyr Ay® Tyr Sl® Iln Al® Gin Gin Fh*s G.I y ¥®1 Thr Lê® Giy SÓ 35 30

Se® Asy ífhr Ma Ala Arg Ser Aan Gly Ssr Vai Gly Gly Glu II e Thr 3.5 40 45

Ly® Ara La® vai Gin Gl® Ala Gin Ala Mn L®® S%r Glj Ser Thr Gin So’ 35 50

LiVS 35

<210> 35 <211> 69 <212> PRT <213> Bacillus megaterium <400> 35

Met Ala Assa &$u Lys Ssr Ser Aso Asn Ά&η GIu lau L«s Vai Ty® Glv 1 5 10 15

Ala Slu Gin Ala Ila A.ap Gin Mat Lys Tyr Glu lie Ala Sar Glu i?he 20 25 30

Gly Vai Asn Léu Gly Ala Aap Thr TAx Ala Arq Ala Asn Gly Ser Vai 3 S " ' 40 ’ 45

Gly Gly Gin Ile Thr Lys Arg Mã Vai Gin l*u Ala Glu Gin Gls Leu 5θ“ 53 00

Gly Gly Gly Arg P.he SS 80 <210> 36

<211> 73 <212> PRT <213> Bacillus megaterium <4Ο0> 36

Met Ma Asn S«r &rq Aan Ly« Ssr Ãsn fôlu Is®a Ala Vai His: Gly 1 S 10 15

Ala. Glr Gin Ais 1.1¾ Asp Gin tfet Ly® Vyr Giu lie AI.® Sar 91 υ Fbe 20 Ξ5 * 30

Gly Vai Thr Lea Gly Fm Asp Thr Thr Ala Arq Ala As» 91 y Ser Vai 35 40 45

Gly Gly Glu II» Thr Lys Arg Vai Gin Hat Ala 9.U< Gin Gin. Isu. SÕ 55 SQ

Gly Gly Gly Arg Ser lys Ser Leu Ser SS~ " ' 70

<210> 37 <211> 68 <212> PRT <213> Bacillus megaterium 81 <4Ο0> 37

Ast Ala Αχ η Asn. Asn 3er 3®r Asa Asa Asn Glu Leu Lsu Vai Tyr Gl 7 1 5 10 15

Ala GX:i Gin Ala Ila Aap 0,1- Set Lyã Ty.r Glu ílè Ala Ssx Gly Pha 20 25 30

Gly ¥ai Asn Len Gly Ala Asp fhr Thr Ala Axg Ala Asa Gly Ser lei 35 40 ’ 45

Gly Gly Glu Ile Thr Lys Arq leu Vai Gin Lau hl® Gly Gin Leu Gly 50 55 60

Gly Gly Ary Fhs 65"

<210> 38 <211> 72 <212> PRT <213> Bacillus megaterium <400> 38

Mat Ala Asn Aan Lye Ser Ser Asa As π Aán Gin leu Leu Va i Tyr Gly 1 5' 10 15

Ala Glxi Gin Ala Jls Asp Glú Áya Tyr Glu xl® Ala Ssr Glu Fh® 20 25 30

Gly va.i Asa Leu Gly Ala Aap Thr fhr Ala Arqr Ala Asn Gly Ssr Vai 35 ~ “40 ' 45

Gly Gly Glu Ixa Thr rys Axq Leu Vsl Gin Lsy Al® G1 a Gin Leu Gly S0 .55 60

Gly Gly Arg Ser Lye Thr thr Lar •65 7Q 82 <210> 39

<211> 70 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 39

Met (71 y Lyn Asn Asm. Ser 41 y Ser tag Asa Glu Sal !®a Vai Àrq Gly I 5 10 15“ M& Glu G1& Ma Leu Asp Gin Met 11¾¾ Tyr Gin lie Ma Gin Gin Phs 20 25 30

Glf ¥&1 Gin 1¾¾ Gly Ma Aap Thr Tfer Ma Arg Sar ãia Gly Sn¥al 35 40 45

Gly Giy Gin lis Thr Lys Arg Lee ¥sl Ala Met Ma Gin Gin Gln leu 50 55 60

Sly Gly Arg Ala Mn Mg 65 70

<210> 40 <211> 65 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 40 83

Msfc S?r Ary Ser Thr &sk Lys Leu Me Vai Fxo Sly Ala SI a Ser Ais I 5 10 15

Leu Aãp Gin M®t Lys Tyr Glu II® Ale Gin Glu Fha Gly Vál Gin Leu 20 " " 25 30:

Gly Ala Asp Ala Thr Alá Arg Ala Asn Gly Ser Vai GJ y Sly Glu Ile 3Ξ " 40 " 45''

Thr Lys Arg Leu Vai Ser Leu Ala Glo Gin Gin leu GIv Gly Tyx Gin 50 ' 55 60

Lys §5

<210> 41 <211> 76 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 41

Mst Leu Lhe lie Aen 11a Gin Arg Tyr Gin Ser Aap Thr Asn Glu Ile

1 5 10 XS

Lua Ile Ser Ala Thr Thr Ser Thr lie Gla Gin Met Lys Tyr Glu Ile 00 2 5 .. * 30 1.1a Lhe Glu. Leu GX y Vai Thr Leu Sly Fro Asp fhr Ser Eia Hís Leu 35 ~ 40 ‘ 45

Gin Met Vai Arg lie Gly Sly Gin Ile Thr Lys Arg Leu ¥al Arg Hat 50 SS S0

Ala SIa Lys Gin Leu Thr Giy Gin Tyr Arg Leu H i s 65 " 70 75 84

<210> 42 <211> 70 <212> PRT <213> Bacillus stearothermophilus <400> 42

Pro IhBXi Oia Ser Gly Ser Aar Ser Ser Asn Gin. Leu Leu Vai Pro 1 5 10 15

Gly Ala Ale Gin Vai 11* Asp Gla Ifet Lyr F.he Glu II® Ala Ssr Slu 20 25 30

Phv Gly ?sl Am Leu Gly Ala Gin ihr Iht Ser Srg Ala Asm GLy Ser 35 4 0 45

Vai 01 y Gly Gin lis Thr Lys Are Leu Vai Sãr Bhe Alá Gin Gin Gin 5β“ 5S 00

Mst Gly Gly Slj Vai Gin €5 7 0

<210> 43 <211> 67 <212> PRT <213> Bacillus thermus <400> 43 85

Hat Ala &sn Ami Asn Sss Ser Asn. 61:¾ Leu Vai Vai Pr» Gly Vai Gin 1 5 10 IS

Gin ala Leu Aap Glu Lys Tyr Glu 11® Ala Gla Phe Gly Vai ao' " " 25 30

Gin leu Gly Pro Aup Ala Tl:a: Ma Arg Ala Asn Gly Ser Vai Gly Gly 3S 40 ' ' 45

Giu ílâ Thr Lys Arg Len Vai Gin Mete Ala Glu Gin Gin Mete Gly Gly ao 55 50

Tyr Glã Lya 65

<210> 44 <211> 70 <212> PRT <213> Clostridium bifermentans <400> 44

Thr tb.r Asn Asn Asn Asn Thr lya Ala Vai Pr o 01 a Ala Ays Ala Alá 1 5 " 15 15

Luu lys Gin Mst lys Leu Glu Ila Ala Mn Qlu lau Gly lis Ser Asn 20 25 30

Tyr Aep TAr Ala Assp Lyá Gly Asn Msst Th£ Ala Arq Gin Asa Gly Tyr 35 40 ' 43

Vai Gly Gly Tyx Mat Thr Lys Lyg Leu Vai Glv He~ Ala Glu Gin. Gin 50 55 60

Het Ssr Gly· SIa Gin Ax-y 55 ' 70 86 <210> 45

<211> 64 <212> PRT <213> Clostridium bifermentans <4Ο0> 45

Ser Fbx Lyu Ly® Ala. Vai Frõ Slu Ma 'Lys Alâ Âlâ Lãs A.sn Glrs. Msfc 1 5 IG 15

Lys Leu Qlu lie Alá. Âen Glu Leu. Gly Leu Ser fyx SLu Ser vai 20 25" ' 30

Asp Lys GXy IXsn Leu Ihr Ala Arg Gin Aar. Siy Fyr Vai Gly Gly Syr 35' 40" " ' 45 fefet Thr Lys Ly.s Leu Vai GIu Fiet Ala Gle Arg Gin Met Ser GXy Ly:s 50 55 00

<210> 46 <211> 60 <212> PRT <213> Clostridium perfringens <400> 46

Met Ser lye Ser Leu Vai Pro Giu Ala Lys Aau Gly Leu Ser Lys fh.e 1 S 10 15

Lys Asn Glu Vai, AI n Arg Οΐυ Leu Gly Ysl Pro Pise Sa:r Asp Tyr Ana 20 .25 30'

Giy Asp Leu. Ser Ser &rq Gin. Cys Gly Ser Vai Glv Gly Glr Hat Vai 35 40 43

Lys Ãrg Met. Vai Glu Ala Τ'/r Glu Sur Gin 11$ Lys 50" 53 60 87 <210> 47

<211> 59 <212> PRT <213> Clostridium perfringens <4Ο0> 47

Ser Lys Phe 15 ,!fci Ser Riu Eis Leu Vâl Fra 1 5 CSlu JUa Lys Asn Gly Leu 10

Lys Asn Slu Vai Ala Ala Glis 20

Met 01 y Yal Pro PLa Sex: 25

Mp iyr Aim 30 21 y Aep Leu Ser Ser Lys Gia 35

Cys Gly Ser Ya.l Úly Óly 4 0 4 S

Giu Hat Vai

Lyx Arg Vai 00

Slu Gin 7yr Glu Lys G1y Ile 55

<210> 48 <211> 60 <212> PRT <213> Clostridium perfringens <400> 48

Mgt Sex €ln Hie leà Vai Fro Gl\i Ma ly® Aen Glv Leu Ser Lvs Phe 1 5 10 " 15

Ay® Aen Glu Vai Ala Asn Glu Hat Gly Vai Pro Eh® 5ar Asp- Tyr Axn 20 25 30

Gly Asp I?au Ser Ser Arq Gin. Cys Gly Sqr VAI Gly Gly Slu. Met Vai 35 4Ò ' 4S~

aya Axg Met VAI Gin Lys Tyy Glu Gin S®r Sfet Lys 10 ' 55 SQ <210> 49 <211> 72 <212> PRT <213> Sporosarcina halophila <4 0 0> 49

Het Ala Asn. Asn Aa:n Ser Sar Asa Glu Leu Vai Vai Frçs Gly Vai SI» 1 5 10 * 15

Gin Ala Ií®n Aap Gin Hat Lya Tyr Glu lia Ala G.Xn Glu Fn* Gly Vai 20 “ 25 30

Gin. Leu Gly Alá Àap Ssr Thr Ser Arg Ala Mn Gly Sur Vai Gly Gly 33 ' 40 ' 4S

Glu llê T.hr Lys Arg Asa Vai Gin Hat Ala Glu Gin Gin Fhã Gly Gly 50 55 50

Gla Gin. Tyr Gly Gin Gin Gin Ly® 05 ..... 7 0 89 <210> 50

<211> 69 <212> PRT <213> Sporosarcina ureae <400> 50 mt Thr Mn â.sn Asn 5©r hsn. Ser Asa Gin Ii8’a Mm Vai £ro Gly 1 5 10 15 V&1 Sln Gin Ais XI ® A.ísn '5.1 n I4%t Lyis Glu Slu lie Ala Mn Glu Phs 20 25 30 Giy Vai &31X Leu. 01y tro &sp Ssr Thr Ser Mg Ma Mm Gly S«r Vai 35 40 45 Gl.y Giy GlU 11« Thx Arg La» Vai Arg Gin ."V-x íS Gin Sèr Gin Msst 50 '55 60 Μη Gly Tyr T'hx Ly® 55 <210> 51 <211> 67 <212> PRT <213> Sporosarcina ureae <4 0 0> 51 90

Mat Pra Asa A:s» As:n Ser Ser «sn Gin Lsr Lnu Vai Pro Gly Vai Gin 1 5 10 15

Giϋ Âla Laa Usa Gin Ktet lya Glu Gl ;.· Ila Ala Ser Glo Phg Gly Vai S0 25 30

Gin Leu Gly Pro Arp Ma. Ser Ser Arg Ala Aan Gly Ser Vai Gly Giy 35 40 ’ 45 S!\s lie Tb:r iys Arg Lm Vai Ãrq GI n Ãlâ Gin Sãr Gin Met Aen Gly 50 ' " 55 “ 60 ly.>: Th::' Lys 65

<210> 52 <211> 71 <212> PRT <213> Thermoactinomyces thalpophilus <400> 52 OOst Ala Glia Gin Gly Arg Ara, Arg Ser Ser Mn Gin :L®u Len Vai AI a X 5 10 15

Gly Ala Ala «In Ala lia Asp Gin. Hat Lys FM Glu Ile Ala SXn Glu ao as ao PM Gly Vai Xhr leu Gly Ala Ά&ρ thr Tgr M.r Mg Ala Ara Gly Ser 35 ' 40* 45

Vai Gly Giy Qlw IIe Ibr Lye Arg Leu Vai Sér i*ea Ala Gin Sln Gin 50 55 60

Be® Gly Gly Gly TM Ser FM 65 ' “ 70 91 <210> 53 subtilis <211> 272 <212> ADN <213> Bacillus <4Ο0> 53 atggctcis&c aagafco&S&e? 70 ' sas''a.;stài5tg çcttcaacfcs ttgaasaa&t aaaactqz:xaao gctgagiàcta caxctcgtqo âSac-gqttca 180' ogcttsgatç asoqaq&ast gggoggfcc&a 240 qfcçiutttit t&agtettci ots.satcciic átsgcrtctg gttggtggsg tttcattaat ãtttàctsat tqstíia&gca sgittggfcgt fcqaatsaggc: saatcaetaâ scgtttagtt ttatgsgggg gsfesâticce sc

<210> 54 <211> 823 <212> ADN <213> SEQUÊNCIA ARTIFICIAL <22 0> <223> dados da sequência de SSPC-LAMBDA obtidos utilizando os iniciadores 13FI e B30 <400> 54 92 íítisgttggto S8 «fcteg&ogt atcgtctgg® .'Π w ώ \.· Ç> â 5;.· wCj L· <3- «r Lj çL Lj agaggttttgc asaatgcáat. 120 ceagaaacag ttQgcaggta atagitagag ••::ci:gaa taac ggfcttogggs. ttttttatat ISO Qtgaaa&âcs ggtaagagoa q ugaotcqar. aatcgtgasg agtcggegag eotggtfcaqc;. 240 osgtgatctt tccgttgtgc tí|aatt asgq gaatsçcggs agcagaaeeg qstçaqçass 3ÕS fcgogt&qagg qgtpatqgqq gsocagcasq sgcacaaccc aaaatgsgcs gtagocactç 3S0 tetgtectga attcattagfc. satagttaag ctgcggcctt ttaaaeatgã ccttagtsaa 420 sgagggtggc aggaggtcgc gctaaeaaca tcctgcegtt CtgcGcgtgc statcqqtçs 480 qgsacmsate tgsttíâqtaa &eaesgtsgó ctggatttgt tctal:c&gta stcgSccita 540' CtcotaâÊLã àãtà.gsgcaa atcccctiat tgggggiaag acàtgàgqàu gqctcsscaa 600 aqtagatcas gatea.âãcjaa castaâtgst ttástaattq atoaagcaça tioaqcfc&tt 66D gaaaaaâtga áacttgaaat sgcttçfcgag tttggtgttc &«tt&ggcgq tgagsíc:taa® 720" tcL “gt-jc.aa scggÇtasgfc tggtggagsis stc:®ct»a&c gtt-tagttcg ctit&gcfcqsa 780 caaa&cstgg geggteaatt tcattaaact sgtgçsacas taactgcctt aa&Kiaasttts 823 cgcoac-gccc tgçcaçtoat cgçagtactg ttg

<210> 55 <211> 566 <212> ADN

<213> SEQUÊNCIA ARTIFICIAL 93 <22 0> <223> dados da sequência de SSPC-LAMBDA obtidos utilizando os iniciadores B54 e B55 <400> 55

fegtfccagcfcã. cigaaggggfc ggtgcgtsac ggçaasagos çcgcaggaea tcagcgctsg 60 cggagfcgtafc ãctggactag tg&satoast aatcsacgta aggcgttòct sge-tàtgctq 120 gcqtggtcgcr aujggaacfega tãacqcscqt cagssaacca gaaatsatgç? ttstqaeato ISO atfcgtaggcq qsqaqctatt taçtq-aitac tccgatcacc ctcqcaasot tgtcacgets 240 saccçaaaas tçaaaicaac aggogsoGiqs cqctscc&qe ttefcttaswar itgutcqgs b 300 gccu.aocgca aycagctigq cctgs«agac rtatctoogs aaagtcagça Qáctgtggaa 360 ttgoaqçags ifcsaqqsqcg tgceçcttta' ectsiqâtiq atcqtqqtqs tSUCCCteaq 420 gsaqtegaes grtgcagoaa tsictçggct tcactqacçg çeqctqgtt« tqqtcqgttc 4 8;) çaqcataagg ctgãcagcct gattgcaaaa ttcaàagaag cgqqçgq&.qç ggtcagagag 540 atigatgtat g&gçagaglçc SCOgcg SS6

<210> 56 <211> 402 <212> ADN

<213> SEQUÊNCIA ARTIFICIAL 94 <22 0> <223> dados da sequência de SSPC-LAMBDA obtidos utilizando os iniciadores T3 e B8 <400> 56 cfegsfcceag w&Si&tiaai aaqactcsct ataagggs&i tgtaaq-cacra ta&ca&ttcc 6C5 cototagááffi taattttgtt taactttaag aaagaaatat accat-gactc a&caasgt&q 120 sto&aqaiaa atsãttt&ci qatioctcaa geascttosq cfcattemsca

ISO aatgaaaett gasãtaqatt stgagtttgq tgttcsafcta qgqqqtg&ga eiacatctqci 240 tgcãaáãggt tcagitgqtg gaqss.atcs.c taaaegttta giieqcttag cfcaaaeaaaa 300 cstgggeggfc ca&tttcatt astttstqaq gaqsat&sdi ο·::·::·::ΐo:t:ou:: ttttaagfcet 360 tctctáâatc gatacctag& qcacaaãcai:: ça®:;s.ocaet qa 402 <210> 57 <211> 23 <212> ADN <213> SEQUÊNCIA ARTIFICIAL <22 0> <223> sequência de pB/LFl <4 0 0> 57 qqtsaqr&c&t q&sg&tqecsi gas 23 95 <2 Λ o \—1 58 <2 11> 30 <2 12> ADN <2 13> Bacillus subtilis <4 A o o 58 &s&gfc&g&tç. aagatcâaae 30 <210> 59 <211> 37 <212> ADN <213> SEQUÊNCIA ARTIFICIAL <22 0> <223> sequência de pB/SAPB <4 0 0> 59 ggtaagsçat gaag&tqgat câaaâaagta gafccsag 37 <210> 60 <211> 37 <212> ADN <213> SEQUÊNCIA ARTIFICIAL <22 0> <223> sequência de pB/SAPB <4 0 0> 60 ggtaaaadãt qaocatqoci caac&aaqtâ as.tca.aer 31 96

Claims (5)

1. REIVINDICAÇÕES Pol u t i Pol man i t k me d. Pol qua Nce; Pol rei red par Uti das ined. mi o Uti ipéptido possuindo actividade SA.SP do tipo α/β, paro lização como medicamento. ipéptido de acordo com a reivindicação 1, que compreende equência de aminoácidos: nnssnsnellvpgaeqaidqmkyeiasefgvnlgadttarangsvgge rlvqiaeqqlgggtk (SSQ ID K° : 1), para utilização comc isarnento. péptido de acordo com a reiv indicação 1, que compreende quer uma das sequências c ie aminoácidc s de SSQ ID >6-52 para utilização como um medicamento. ipéptido de acordo coin a reivindic ação ou V i ΙΊ d IC3. Ç cl O 3; que contém muta· ções e/ou deleções que não uzem substancialmente a i rua ac Cavidade SASP do t ipo c */β, cl. U T.". ,'J. .1. X. Z cl. Ç cl O C orno um medi camen to. lização de um ÇX 0 ο. 1 ÇX 3 jp t '.1 o com; o definido em qual< quer uma reiviudicaçõ es anterio L 3 lo F para a prepe iracãc de um isarnento para inibir ou evita.. r o cresciment :.o ce' iulai rorganismo. lização de acordo saimento celular terlano. com reivmazcacao em que compreende o crescimento celular Ut. i 1 iz.ação de i acordo com a. i •eivindicação 5 ou reivindicação ç- ^ / que é pa r a a preparação de um medicamento para ter a pêuticí • hun .lana, Util i zação de acordo com a reivindicação 7, que é para a prep aração de um medi camento para o tratamento de infecções '!” Q 'Q ± casf cár: l a s o .entária s, rnfecçoes respiratórias. .nfecções do olho ou infecção localizada em órgãos. Utilização de um poiipéotido como definido em aualsuer uma como um descontaminante das reivindicações mic rob ia η o♦ Utiiiza ç a. o cí e acordo com a reivindicação 9, qu e c o mpr e e nde tratar uma contaminação microbiana de superfícies, remedia ção de terrenos ou tr atamento de águas Util ização de um pol ipéptido como das reivinc iícações 1 a 4 como um trat amento de materiê •r vecietau , definido em qualquer uma agente antimícrobrano no Utilização de um p ol ipépt. ido como defin ido e m qualquer das reivindicações 1 a 4 no tratamento não terapêutic vermes para elimina .r as bacté rias do tra; s t o d: Lgestívo. u ma de Polinucleótido que codifica um poiipéptid.o como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, para utilização como um medicamento. Polinucleótido de acordo 1Π Tf. compreende ADN, para utilização a. reivindicaçã.o omo um medicament que y« Polinucleótido de acordo οοιη a reivindicação 14, que compreende o gene sspC de B. subtilis, para utilização como um me d i c ame nfco. • Utit iízação de um polini: i.C.Í.GOt .ido G0 0C Ou.'( do com qualquer uma das reivindicações 14 3. 1 b pâlâ 0 preparação de um medicamento para inibir ou evitar o crescimento celular de microrganismos. Utilização de acordo o o a reivindicação 16, em que medicamento o o mp r e e n d e o p; olinucleótido.
2. 18. Utilização de acordo com a rei vinda, cação 16 ou reivindicação 1.7, em que o crescimento celular compreende o crescimento celular bacteriano. Utilização de acordo com qual que.! a 18, que é para preparação terapêutica humana. ma :ervzndicacoes ib de um medicamento para
3. 20. Utilização de acordo com qualquer uma. das reivindrcações 16 a 13, para a preparação de um medicamento para o tratamento de infecções tópicas, cáries dentárias, infecções respiratórias, infecções do olho ou infecção localizada em órqãos.
4. 21. Composição para inibir ou evitar < compreendendo um polinucleótido como crescimento celular oeirniao em quaíque um. das reivindic; 1 0 .b e um sistema de dístríbuzcã; respectivo que é capaz de atingir uma célula. 99 2 . Composição de acordo com a reivindicação 21 , em que o sistema de distribuição c< smpreende um virus e o polinucleótido é incorporado no genoma do vir' 0 0 * 23 . Composição de ; acordo com a. reivindicaçã.o 22, em que o virus compreende um bacteriófago qi 0Θ Θ C0p0Z O- e atingir uma bactéria. 2 4 . Composição de acordo com a reivindicação 2.3 / θπι QU Θ O bacteriófago é um bacteriófago não lisogénico 25. C o mp o s i ç a o d e acordo com a reivindicação 2 4, em que o o íi c "b θ .c í. o i_ 0 g o ; são lisogénico compreende ur o bacter .L. vi i 0G vi lisogénico cora, pelo menos, um gene de iise inactivado. Composição de aco r do com a reivindicação 2 5, em que, p< elo menos, um gene de Irse e rnactivaao por inserção do polinucleót i do, Composição de aco: -do com qualquer uma das reiv indicações 22 a 2 6, em que o v i rus ios moaiiicaoo para aumentar ou alterar a sua especificidade para o hospedeiro.
5. 28. Utilização de um polinucleótido como definido em qualquer uma das reivindicações 14 to 16 como um descontaminante microbiano. 7 g e Utilização de acordo com a reivindicação 28, que compreend· tratar contam inação mzcrobrana de simermcu remediaçã de terrenos ou tratamento de água. 100 Ut i 1 i z.ação de um poli nuci 0 Ó t i do c orno de finado 0TP qu .aaquer uma das reivir 1 Cl H C S ç :ões i 3 a 15 t como um agente an tira icrobí ano no trati ameno t; o ( ie mat :eria vegetar • Ut il i zação de um pol a nucl .eót .a d o c ap*! o de finido em qu alquer uma aas j ceivinc iicaçc 5 CZ'. C‘ 13 cl 15, V~\ o trat .ame nt: o não terap êutico de v ermes pa ra elimi: nar as bactéi • ·; C; io seu tract o dicre silvo- Lisboa, 23 de Janeiro de 2007 101