JP2022058377A - 異なる尾繊維を有する複数宿主域のバクテリオファージ - Google Patents
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Abstract
【課題】医療において細菌感染症の治療に、ならびに医学的および非医学的状況で細菌細胞増殖の阻害または予防に使用するために改善されたバクテリオファージを提供する。【解決手段】改変バクテリオファージは、標的細菌に対して毒性である低分子酸可溶性芽胞タンパク質（ＳＡＳＰ）をコードするα／β型ＳＡＳＰ遺伝子を含む、複数の異なる標的細菌に感染することができ、非溶菌性であり、複数の異なる宿主域決定因子を発現し、各宿主域決定因子が異なる細菌宿主特異性を有し、各宿主域決定因子は、標的細菌に結合するための受容体結合領域と、受容体結合領域をバクテリオファージのボディに結合させる領域とを含む尾繊維タンパク質を含み、かつ、受容体結合領域が、Ｃ末端受容体結合領域であり、Ｃ末端受容体結合領域をバクテリオファージのボディに結合させる領域がＮ末端領域である。【選択図】なし
Description
本発明は、改変バクテリオファージ、その使用、および改変バクテリオファージを含有する組成物に関する。
世界保健機構（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ）の２０１４年の抗菌剤耐性に関する地球規模調査報告書は、抗生物質耐性が、地域および病院において一般的な感染症を治療する能力を危険に曝している地球規模の問題であることを明らかにしている。緊急の対策をとらなければ、世界は、何十年もの間治療可能であった一般的な感染症および軽微な損傷のために再び死に至りうるポスト抗生物質の時代に向かいつつある（ＷＨＯ、２０１４）。抗生物質耐性は、たとえ簡単な手術であっても患者の回復を複雑にし、治療の失敗をますます引き起こしつつある。実際に、利用可能な全ての抗生物質に対して耐性であるいくつかの属の細菌株が地球規模で広まっている。そのような株は、一般的にいわゆるＥＳＫＡＰＥ病原体、すなわちエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アシネトバクター・バウマニイ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、およびエンテロバクター種の範囲の株である（Ｂｏｕｃｈｅｒら、２００９）。用語ＥＳＫＡＰＥ病原体は、Ｂｏｕｃｈｅｒらによって、これらの細菌が現在、米国およびヨーロッパにおいて院内感染症の大半を引き起こし、全てではないが利用可能な大半の抗生物質から有効に「逃避する」ことができ、全抗生物質耐性の感染症が起こりつつあることを強調するために作出された。病院で治療される一般的な細菌によって引き起こされる重篤な感染症を有する患者の死亡率は、同じであるが非耐性の細菌によって引き起こされる感染症を有する患者の死亡率のおよそ２倍であり、例えばメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を有する人は、非耐性型感染症を有する人より死亡する可能性が６４％高いと推定されている（ＷＨＯ、２０１４）。グラム陽性細菌の中で、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌は、米国およびヨーロッパにおいて病院での有病率および死亡率の主な原因であり続けている。しかし、より近年では、アシネトバクター種、多剤耐性（ＭＤＲ）緑膿菌、ならびにカルバペネム耐性クレブシエラ種および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を含むいくつかの高度耐性グラム陰性病原体が、重篤で時に治療不能の感染症を引き起こす主要な病原体として出現している。医学が進歩するということは、ますます複雑な技法が行われることを意味し、これらの進歩によって、手術、移植、および化学療法を受ける高齢患者および患者の数がますます増加して、それらの全ての技法によって、これらの感染症のリスクを有する免疫無防備状態の人の数はさらに増加する（Ｗａｌｋｅｒら、２００９）。この現象により、有効な抗生物質に対する依存および必要性が高まっている。
緑膿菌は、その外膜の透過性が低いために薬物が細胞内に入るのを制限し、首尾よく細胞内に入ったいかなる薬物も複数の排出ポンプで押し出されるために内因性の耐性を有する、しばしば多剤耐性（ＭＤＲ）である１つの細菌である。緑膿菌はまた、グラム陰性菌に対する「最後の手段の抗生物質」であるカルバペネムに対する耐性を含む、さらなる耐性機構も獲得しつつある。緑膿菌は、院内感染症全体のおよそ１０％を引き起こし、院内感染処方全体の５０％を占める院内感染肺炎の原因の第二位である。病院における緑膿菌感染症は、一般的に、患者を少なくとも２種類の抗生物質で治療することを指示する、現行の緑膿菌感染症の標準治療による静脈内（ＩＶ）治療を必要とする。残念なことに、耐性はしばしば、治療中の患者に起こる。過去３０～４０年以内に開発されて販売が承認された新規クラスの抗生物質は非常に少ないことから、新規の安全かつ有効な抗菌剤が緊急に必要である。
従来の抗生物質に対する代替として、細菌内部で広いスペクトルの抗菌活性を証明する１つのタンパク質ファミリーは、α／β型の低分子酸可溶性芽胞タンパク質（今後ＳＡＳＰとして知られる）を含む。細菌内部で、ＳＡＳＰは、細菌ＤＮＡに結合し、クライオ電子顕微鏡を使用するこのプロセスの可視化により、最も研究されているＳＡＳＰであるＳｓｐＣが、ＤＮＡを被覆して、突出ドメインを形成し、ＤＮＡ構造（Ｆｒａｎｃｅｓｃｏｎｉら、１９８８；Ｆｒｅｎｋｉｅｌ－Ｋｒｉｓｐｉｎら、２００４）をＢ様（ピッチ３．４ｎｍ）からＡ様（３．１８ｎｍ；Ａ様ＤＮＡは２．８ｎｍのピッチを有する）に改変することが示されている。突出するＳｓｐＣモチーフは、隣接するＤＮＡ－ＳｓｐＣフィラメントと相互作用して、フィラメントを核タンパク質ヘリックスの堅固なアセンブリに詰め込む。２００８年に、Ｌｅｅらは、１０ｂｐ ＤＮＡ二本鎖に結合したα／β型ＳＡＳＰの結晶構造を２．１Åの解像度で報告した。複合体において、α／β型ＳＡＳＰは、ヘリックス－ターン－ヘリックスモチーフを採用し、副溝の接触を通してＤＮＡと相互作用し、二量体としてＤＮＡのおよそ６ｂｐに結合し、ＤＮＡはＡ－Ｂ型コンフォメーションで存在する。このようにして、ＤＮＡの複製は停止し、ＳＡＳＰが結合している場合、ＳＡＳＰは、ＤＮＡの転写を防止する。ＳＡＳＰは、非配列特異的にＤＮＡに結合し（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、１９９０）、そのため細菌ＤＮＡに変異があっても、ＳＡＳＰの結合に影響を及ぼさない。α／β型ＳＡＳＰの配列は、好ましいα／β型ＳＡＳＰであるバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）のＳＡＳＰ－Ｃを含む、国際公開第０２／４０６７８号パンフレットの付録１に見出されうる。
国際公開第０２／４０６７８号パンフレットは、ＳＡＳＰ遺伝子を取り込むように改変されたバクテリオファージの抗菌剤としての使用を記述する。細菌宿主における改変バクテリオファージの効果的な産生を提供するために、国際公開第０２／４０６７８号パンフレットは、産生宿主の増殖の際にＳＡＳＰ遺伝子の発現を回避することを目的としている。この目的のために、ＳＡＳＰ遺伝子を誘導型プロモーターの制御下に置いた。１つの構成において、ＳＡＳＰ遺伝子を、テンペレートバクテリオファージの溶菌遺伝子に挿入することによって、バクテリオファージ生活環の終了時に限って活性となる溶菌遺伝子プロモーターの制御下に置いた。この場合、ファージは、プロファージとして生存したままである。別の構成において、ＳＡＳＰ遺伝子は、バクテリオファージ染色体上のいずれに存在してもよく、バクテリオファージプロモーターまたは細菌プロモーターの制御下に置かれ、それによって溶菌サイクルは自然の経過をたどることができる。この構成において、細菌プロモーターは、非構成的であり、環境の合図によってアップレギュレートされうる。細菌産生宿主の増殖は、特にＳＡＳＰ遺伝子が構成的プロモーターの制御下に置かれた場合には、ＳＡＳＰ遺伝子産物の存在により防止されると考えられた。
国際公開第２００９０１９２９３号パンフレットは、バクテリオファージとは独立して制御されて、外因性またはトランスでの調節が必要でないかまたは提供されなくとも構成的であるプロモーターの制御下で、ＳＡＳＰをコードする遺伝子を有するように改変されているバクテリオファージを効果的に産生することができることを記述している。例は、バチルス・メガテリウム由来のＳＡＳＰ－Ｃ遺伝子の発現を促進するために使用される黄色ブドウ球菌のｆｂａＡプロモーターであり、このプロモーターは、複数のコピーで存在する場合、例えば標的細胞の感染後に毒性レベルのＳＡＳＰ発現を促進する。
ＳＡＳＰ遺伝子を含有するように改変されたバクテリオファージベクターは、一般的にＳＡＳＰｊｅｃｔベクターと呼ばれている。ＳＡＳＰ遺伝子が標的細菌に送達されると、ＳＡＳＰがそれらの細菌内で産生され、細菌ＤＮＡに結合して、ＤＮＡのコンフォメーションをＢ様からＡ様に変化させる。標的細菌細胞内で十分量のＳＡＳＰが産生されると、感染細胞の生存率の低下を引き起こす。
バクテリオファージは、１９２０年代または３０年代以降に細菌感染症の治療のための薬剤として使用されている。一般的に、バクテリオファージは、その細菌宿主に対して特異的である。いくつかのバクテリオファージは、テンペレートであるが、他はテンペレートではない。テンペレートファージは、宿主細胞に感染して、宿主細胞ゲノムに組み込まれてプロファージとなることができるが、一般的にプロファージの状態では宿主に対して無害である。非テンペレートまたは「溶菌性」ファージは、新たなバクテリオファージ子孫を作製して、宿主細胞の溶解および成熟ファージ粒子の放出で終わるという溶菌性の生活環で複製することができる。有用な薬剤として難しい点は、多様な異なる細菌の感染症を有効に治療するために使用することができるバクテリオファージ組成物を提供することである。一般的には、これは、利用可能な最も強力なバクテリオファージ組成物、すなわち偏性溶菌性で、複製を通して生存率を保持し、治療時に放出され、広い宿主域を有するバクテリオファージを、バクテリオファージのおそらく混合物または「カクテル」として使用することにより達成されると考えられる（Ｃａｒｌｔｏｎ、１９９９；Ｋｕｔａｔｅｌａｄｚｅ ａｎｄ Ａｄａｍｉａ、２０１０）。野生型ファージのカクテルは、細菌の臨床株に対して十分な活性スペクトルを確保するために使用されている（Ｂｕｒｒｏｗｅｓ ａｎｄ Ｈａｒｐｅｒ、２０１２）。そのようなカクテルは、最大２０種の異なる無関係なファージで構成することができる（Ａｂｅｄｏｎ、２００８）。カクテルアプローチの代替として、大腸菌バクテリオファージＫ１－５が単離されている。これは、大腸菌のＫ１およびＫ５株の両方において感染および複製することができる１つより多くの宿主域決定因子を有する天然に存在する偏性溶菌性ファージである（Ｓｃｈｏｌｌら、２００１）。これらのファージは、極めて強力であると考えられる。
医療において細菌感染症の治療に、ならびに医学的および非医学的状況で細菌細胞増殖の阻害または予防に使用するために改善されたバクテリオファージを提供することがなおも必要である。
世界保健機構（ＷＨＯ）の２０１４年の抗菌剤耐性に関する地球規模調査報告書（ＷＨＯ（２０１４）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：ｇｌｏｂａｌ ｒｅｐｏｒｔ ｏｎ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ２０１４）．
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第一の態様において、本発明は、標的細菌に対して毒性であるＳＡＳＰをコードするα／β型の低分子酸可溶性芽胞タンパク質（ＳＡＳＰ）遺伝子を含む、複数の異なる標的細菌に感染することができる改変バクテリオファージであって、非溶菌性であり、複数の異なる宿主域決定因子（ＨＲＤ）を有し、それぞれのＨＲＤが異なる細菌宿主特異性を有する改変バクテリオファージを提供する。ＨＲＤの細菌宿主特異性は、同じ細菌種内であることが都合がよい。
意外にも、多様な異なる標的細菌に感染することができ、たとえバクテリオファージが非溶菌性であっても医療において使用するために有効である、改変バクテリオファージを産生することができることが見出されている。バクテリオファージは、それぞれのＨＲＤが異なる細菌宿主特異性を有する複数の異なるＨＲＤを発現することから、増強された宿主域を有する。そのようなファージは、例えば同じ細菌種に感染するファージからのＨＲＤを選択することによって、遺伝子工学によって産生されうる。そのような極めて強力なファージの作製後、それを非溶菌性にすることができ、したがって非生存にして、それでもなおＳＡＳＰｊｅｃｔベクターとして適したファージにすることができる。
１つの態様において、本明細書において使用される用語「ＳＡＳＰ」は、α／β型ＳＡＳＰ活性、すなわちＤＮＡに結合してその構造をそのＢ型からＡ型に改変する能力を有するタンパク質を指し、国際公開第０２／４０６７８号パンフレットの付録１に記載のタンパク質を含むのみならず、その任意の相同体、ならびに同様にα／β型ＳＡＳＰ活性を有する任意の他のタンパク質も含む。代わりの態様において、本明細書において使用される用語「ＳＡＳＰ」は、国際公開第０２／４０６７８号パンフレットの付録１に記載の任意のタンパク質、または国際公開第０２／４０６７８号パンフレットの付録１に記載のタンパク質の任意の１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９８％、もしくは９９％配列同一性を有する任意の相同体を指す。別の代替の態様において、本明細書において使用される用語「ＳＡＳＰ」は、国際公開第０２／４０６７８号パンフレットの付録１に記載の任意のタンパク質を指す。
改変バクテリオファージは、不活化された溶菌遺伝子を含むことから、非溶菌性でありうる。溶菌遺伝子への配列の挿入または溶菌遺伝子の除去によって、この遺伝子は不活化される。溶菌遺伝子は、簡便には、ＳＡＳＰ遺伝子の挿入によって不活化されうる。ＳＡＳＰ遺伝子は、国際公開第０２／４０６７８号パンフレットの付録１に開示のＳＡＳＰをコードする遺伝子の任意の１つから選択されうる。好ましい構成において、ＳＡＳＰは、ＳＡＳＰ－Ｃである。ＳＡＳＰ－Ｃは、バチルス・メガテリウムに由来しうる。
ＳＡＳＰ遺伝子は、改変バクテリオファージが標的細菌に複数のコピーで存在する場合に、毒性レベルのＳＡＳＰの産生を促進するために十分に強力であることが都合がよい構成的プロモーターの制御下に存在することが好ましい。有用な構成的プロモーターには、ピルビン酸デヒドロゲナーゼＥ１成分αサブユニットのｐｄｈＡ、３０Ｓリボソームタンパク質Ｓ２のｒｐｓＢ、グルコース－６－リン酸イソメラーゼのｐｇｉ、およびフルクトース二リン酸アルドラーゼ遺伝子プロモーターｆｄａが挙げられる。感染の際に活性な好ましい調節型プロモーターは、エラスターゼのｌａｓＢである。これらのプロモーターは、典型的には緑膿菌に由来する。これらのプロモーター配列と少なくとも９０％の配列同一性を示す配列を有するプロモーターも同様に使用することができる。
本発明は、一般的に多様な異なる標的細菌に感染するバクテリオファージに応用可能である。１つの構成において、標的細菌の少なくとも１つは、緑膿菌である。細菌の複数の異なる標的は、複数の異なるシュードモナス細菌であることが都合がよい。重要な標的は、緑膿菌である。
ＳＡＳＰｊｅｃｔベクターの必要条件は、それが最適な治療的使用のために特に溶菌性ではなく、ＳＡＳＰ発現に関してより長い時間枠を与えて、インビボでの治療時の急速な溶解の予防を可能にし、このように危険な炎症応答を引き起こしうる抗生物質耐性遺伝子および毒性細胞壁成分の起こりうる放出を制限する点であることから、偏性溶菌性ファージの使用が、ＳＡＳＰｊｅｃｔベクターとして適していないことはこれまで明白であると考えられていた。
本明細書に記述するアプローチは、これまで記述されたカクテルアプローチと比較して都合がよい。ＳＡＳＰｊｅｃｔベクターなどの改変バクテリオファージの混合物は、１つまたは複数の追加のＨＲＤを有すること以外は、構造およびゲノム配列が同一である。１つの利点は、ＳＡＳＰｊｅｃｔの混合物の製造プロセスの制御が容易であることであり、これは薬剤調製の重要な態様である。プロセスは、ファージが同一またはほぼ同一の生物物理学的特性を共有することから、１つまたは複数の異種ＨＲＤを有するように改変されたファージに関して実質的に同じである。別の利点は、それぞれのベクターが構造的に同じまたは類似であることから、ＳＡＳＰｊｅｃｔベクターのインビボ特徴、たとえば薬物動態／薬物動力学が類似である可能性がある点である。
本発明において、１つまたは複数の追加のＨＲＤを有する極めて強力な偏性溶菌性バクテリオファージであるファージを作製できることが見出されている。意外にも、そのようなファージを使用して、これらのファージを非溶菌性および非生存にすることによって、ＳＡＳＰ遺伝子を挿入するかまたは溶菌遺伝子をＳＡＳＰ遺伝子に置換することによって、増強されたＳＡＳＰｊｅｃｔベクターを作製することができる。そのような改変にとって適したファージは、選択された細菌種に感染することができるファージに関してスクリーニングすることによって単離することができる。例として、代表的な緑膿菌株においてプラークを形成することができる環境起源由来のファージに関してスクリーニングすることによって、緑膿菌に感染するファージを単離することができる（Ｇｉｌｌ ａｎｄ Ｈｙｍａｎ、２０１０）。単離されたファージの全ゲノムをシークエンシングして、アノテーションを行ってもよい。ＨＲＤは、例としてファージＴ４、Ｔ５、およびＴ７において宿主細菌に対する最初の認識／結合を担うタンパク質であることが一般的に見出されている尾繊維タンパク質でありうる（Ｒａｋｈｕｂａら、２０１０）。あるいは、他のＨＲＤは基盤タンパク質でありうる。ＢＬＡＳＴ検索を使用して、公知の配列に対するファージゲノム中の全てのタンパク質の相同性を評価することによって、ファージゲノムを、可能性があるＨＲＤ配列に関して検索することができる。
本発明に従って、それぞれのＨＲＤは広い宿主域を有することが好ましい。これは、多様なコレクションまたは臨床単離体の５０％超、全体で少なくとも３５、好ましくは少なくとも４０、より好ましくは少なくとも４４、および最も好ましくは５０個超に感染する能力として定義されうる。そのような単離体は、ヨーロッパ、アメリカ、およびアジアを含む広範囲の地理的場所に由来しなければならず、多剤耐性（ＭＤＲ）株を含む広範囲の抗生物質耐性表現型を有しなければならず、ならびに血液、肺、および皮膚感染症から培養した株などの広範囲の感染部位に由来しなければならない。そのような単離体は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）およびＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＮＣＴＣ）などの公共の株コレクションから得ることができる。ＨＲＤタンパク質は、ファージへの構造の取り込みに関係する少なくとも１つの領域と、宿主認識に関係する少なくとも１つの領域とを有する。一般的に、尾繊維タンパク質の場合、それぞれは、標的細菌に結合するためのＣ末端受容体結合領域と、Ｃ末端受容体結合領域をバクテリオファージのボディに結合させるＮ末端領域とを含む。１つの構成において、Ｐｈｉ３３および関連ファージを例とすると、Ｎ末端領域は、尾繊維タンパク質のアミノ酸１～６２８位を含み、Ｃ末端領域は尾繊維タンパク質のアミノ酸６２９～９６４位を含む。
Ｃ末端領域は、バクテリオファージＰｈｉ３３のＣ末端領域と９６％以下のアミノ酸配列同一性を有してもよく、バクテリオファージＰｈｉ３３、ＬＢＬ３、ＳＰＭ－１、Ｆ８、ＰＢ１、ＫＰＰ１２、ＬＭＡ２、ＳＮ、１４－１、ＪＧ０２４、ＮＨ－４、ＰＴＰ４７、Ｃ３６、ＰＴＰ９２、およびＰＴＰ９３のいずれか１つに由来しうる。Ｃ末端領域のアミノ酸配列同一性がより低いことが好ましい。配列同一性は、９０％未満であることが都合がよく、８０％未満であることがより都合がよく、好ましくは７０％未満、より好ましくは６０％未満、さらにより好ましくは５０％未満、特に好ましくは４０％未満、より特に好ましくは３０％未満である。Ｎ末端領域はバクテリオファージＰｈｉ３３のＮ末端領域と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有し、少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することが都合がよく、バクテリオファージＰｈｉ３３、ＬＢＬ３、ＳＰＭ－１、Ｆ８、ＰＢ１、ＫＰＰ１２、ＬＭＡ２、ＳＮ、１４－１、ＪＧ０２４、ＮＨ－４、ＰＴＰ４７、Ｃ３６、ＰＴＰ９２、およびＰＴＰ９３のいずれか１つに由来しうる。Ｎ末端領域とＣ末端領域が同じバクテリオファージに由来して、同種の尾繊維タンパク質を提供してもよい。あるいは、Ｎ末端領域とＣ末端領域が異なるバクテリオファージに由来して、異種尾繊維タンパク質を提供してもよい。ファージ尾繊維タンパク質が同種である１つの構成において、それぞれの尾繊維タンパク質は、Ｐｈｉ３３、ＬＢＬ３、ＳＰＭ－１、Ｆ８、ＰＢ１、ＫＰＰ１２、ＬＭＡ２、ＳＮ、１４－１、ＪＧ０２４、ＮＨ－４、ＰＴＰ４７、Ｃ３６、ＰＴＰ９２、およびＰＴＰ９３から選択されるバクテリオファージに由来する。
Ｎ末端領域において９０％超の配列同一性を共有するファージ尾部タンパク質を同定することが都合がよい。例えば、緑膿菌株に対して広い宿主域を有するいくつかのファージ、Ｐｈｉ３３、ＰＴＰ４７、ＰＴＰ９２、およびＣ３６（これらのファージの全てが２６０株に対して分析した場合に６０％超に感染する）が、単離／同定されており、そのゲノムがシークエンシングされている。Ｐｈｉ３３、ＰＴＰ４７、ＰＴＰ９２、およびＣ３６のゲノム配列の分析により、それらが、２配列ＢＬＡＳＴアライメント後にＰｈｉ３３尾繊維アミノ酸１～６２８位（カッコ内はアミノ酸同一性）と比較すると、Ｎ末端領域において高レベルの配列同一性（＞９５％アミノ酸配列同一性）を有する推定の尾繊維タンパク質をコードする遺伝子を含有することが判明している：Ｃ３６（９６％）、ＰＴＰ４７（９８％）、ＰＴＰ９２（９７％）。ＢＬＡＳＴ検索により、これらの４つのファージは、共にＰＢ１様ファージのファミリーを形成する他の寄託された１０個のファージゲノム配列：ＰＢ１、ＳＰＭ１、Ｆ８、ＬＢＬ３、ＫＰＰ１２、ＬＭＡ２、ＳＮ、ＪＧ０２４、ＮＨ－４、１４－１に関連することが示されている（Ｃｅｙｓｓｅｎｓら、２００９）。これらの推定の尾繊維タンパク質の相同性を評価した。２配列ＢＬＡＳＴアライメント後にＰｈｉ３３尾繊維タンパク質と比較した（カッコ内はアミノ酸同一性）：ＬＢＬ３（９６％）、ＳＰＭ－１（９５％）、Ｆ８（９５％）、ＰＢ１（９５％）、ＫＰＰ１２（９４％）、ＬＭＡ２（９４％）、ＳＮ（８７％）、１４－１（８６％）、ＪＧ０２４（８３％）、ＮＨ－４（８３％）、Ｃ３６（９６％）、ＰＴＰ４７（８６％）、ＰＴＰ９２（８３％）。上記のファージの１４個全てのアライメントを図１４に示す。
これら１４個のファージ由来のアノテーションを行った尾繊維タンパク質の分析により、Ｐｈｉ３３尾繊維アミノ酸１～６２８位と同等のタンパク質のＮ末端領域が、１４個全てのタンパク質に関して９６～１００％の範囲で、その全長に対するこれらのタンパク質の配列同一性よりアミノ酸レベルでさらにより高いレベルの配列同一性を示すことが判明している。２配列ＢＬＡＳＴアライメント後に、Ｐｈｉ３３尾繊維タンパク質のＮ末端アミノ酸１～６２８位（カッコ内はアミノ酸同一性）と比較した：ＬＢＬ３（９６％）、ＳＰＭ－１（９６％）、Ｆ８（９６％）、ＰＢ１（９６％）、ＫＰＰ１２（９８％）、ＬＭＡ２（９９％）、ＳＮ（９９％）、１４－１（９７％）、ＪＧ０２４（９７％）、ＮＨ－４（９７％）、ＰＴＰ４７（９８％）、Ｃ３６（９６％）、ＰＴＰ９２（９７％）。しかし、Ｐｈｉ３３尾繊維アミノ酸６２９～９６４位と同等のタンパク質のＣ末端領域は、いくつかのタンパク質ではＮ末端領域ほど保存されず、配列同一性の範囲は、典型的に５７～９６％である。２配列ＢＬＡＳＴアライメント後、Ｐｈｉ３３尾繊維タンパク質のＣ末端アミノ酸６２９～９６４位（カッコ内はアミノ酸同一性）と比較した：ＬＢＬ３（９４％）、ＳＰＭ－１（９３％）、Ｆ８（９３％）、ＰＢ１（９４％）、ＫＰＰ１２（８７％）、ＬＭＡ２（８５％）、ＳＮ（６５％）、１４－１（６５％）、ＪＧ０２４（５７％）、ＮＨ－４（５７％）、ＰＴＰ４７（６４％）、Ｃ３６（９６％）、ＰＴＰ９２（５７％）。他の十分に特徴づけされたファージのファージ尾繊維の分析により、それらがＮ末端尾部基盤結合領域とＣ末端受容体結合領域とを有することが示されている（Ｖｅｅｓｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｍｂｉｌｌａｕ，２０１１）。プラークアッセイまたは増殖阻害試験を使用するそれらの細菌株宿主域の実験的分析において、ファージＰｈｉ３３、ＰＴＰ４７、ＰＴＰ９２、およびＣ３６は、重なり合うが同一ではない宿主域を有する（表１）。ファージ尾繊維のＣ末端領域の役割が細菌宿主受容体結合に関係しているという確立された証拠と、これらの４つのファージのＣ末端領域の配列多様性およびその類似であるが同一でない宿主域と共に考慮すると、Ｃ末端の多様性は、評価されるファージの宿主域に関連すると推定される。
本発明に従って、同種の尾繊維タンパク質の遺伝子を、Ｎ末端領域におけるその高レベルの配列同一性に基づいて、１つのファージから採取して別のファージに付加できることがさらに提供される。Ｎ末端領域は、尾繊維のファージ尾部への結合に関係すると考えられており（Ｖｅｅｓｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｍｂｉｌｌａｕ，２０１１）、宿主域がドナーファージの尾繊維に関連する生存ファージを形成することができる。あるいは、本明細書に記述される遺伝子などの尾繊維遺伝子を使用して、異種ドナーファージ尾繊維タンパク質由来の多様なＣ末端受容体結合領域と共に、レシピエントファージ由来の尾繊維の保存されたＮ末端尾部結合領域を有するハイブリッド尾繊維遺伝子を作製してもよい。そのような尾繊維ハイブリッド遺伝子を使用して、ファージの尾繊維のいくつかを置換することができる。これは、（レシピエントファージ由来の）ハイブリッド尾繊維のＮ末端領域を提供して、宿主域がドナーファージ尾繊維のＣ末端受容体結合領域に関連する生存ファージを形成することができる。標準的な分子遺伝学技術を使用して、Ｐｈｉ３３は、以下のファージＰＴＰ９２、ＰＴＰ４７、ＬＢＬ３、ＳＰＭ－１、Ｆ８、ＰＢ１、ＫＰＰ１２、ＬＭＡ２、ＳＮ、１４－１、ＮＨ－４由来の異種尾繊維ハイブリッドを有するように改変されている。全ての改変ファージは、生存しており、緑膿菌上でプラークを形成できることが示されている（尾繊維ハイブリッドの命名は以下のとおりである：一例として、Ｐｈｉ３３のＮ末端尾部結合領域がＰＴＰ４７のＣ末端受容体結合領域とハイブリダイズしているハイブリッド遺伝子は、Ｐｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）である）。
１つのそのような改変ファージにおいて、その尾繊維遺伝子が、ＰＴＰ９２のＣ末端受容体結合領域を有するようにＰｈｉ３３を改変して、ＰＴＰ９３（Ｐｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ９２（Ｃ））を作製した。これを、３５個の多様な緑膿菌臨床単離体に対して宿主域を試験することによって、より詳細に評価した。前駆体ファージ（Ｐｈｉ３３）、尾繊維ドナー（ＰＴＰ９２）、およびハイブリッドファージ（ＰＴＰ９３）の宿主域を比較すると、ＰＴＰ９３ハイブリッドファージの宿主域は、Ｐｈｉ３３よりむしろ尾繊維ドナーファージ（ＰＴＰ９２）の宿主域と同等であるが、意外にもいくつかの例において、ＰＴＰ９３は、ＰＴＰ９２が感染することができない株に対してもＰｈｉ３３の宿主域を有し、このように両方のファージの宿主域を受け継いでいることが見出された（表２）。実際に、ＰＴＰ９３は、Ｐｈｉ３３（７４％）またはＰＴＰ９２（６６％）より広い宿主域（９２％）を有する（表２）。ＰＴＰ９３は、それがその非改変状態で示される特徴に加えてある特徴を保有することから「極めて強力」であると考えることができる偏性溶菌性バクテリオファージの例である。そのような極めて強力なファージは、ＳＡＳＰｊｅｃｔベクターを作製するさらなる改変のために適している。
本発明による好ましいアプローチは、それぞれが構成的プロモーターから発現されたＳＡＳＰ遺伝子を有するように改変され、それぞれのファージが異なる尾繊維遺伝子または尾繊維ハイブリッド遺伝子を有すること以外は遺伝的に同一であり、それによって溶菌遺伝子が不活化されている、２つ以上の宿主域決定因子を発現するように改変された１つまたは複数の偏性溶菌性ファージ（極めて強力な偏性溶菌性ファージ）を使用することである。そのようなファージは、欠失された溶菌遺伝子をトランスに有する株において増殖させることができる。複数の尾繊維遺伝子または尾繊維ハイブリッド遺伝子を有するファージを作製するための尾繊維遺伝子の改変および提供にとって好ましい偏性溶菌性ファージは、他の単離または同定されたファージの尾繊維のＮ末端領域と比較してそのＮ末端領域において≧９０％のアミノ酸配列同一性を保有する予想タンパク質をコードする尾繊維遺伝子を有するファージである。この基準を満たす好ましい偏性溶菌性ファージは、Ｐｈｉ３３、ＰＴＰ９２、ＰＴＰ４７、ＬＢＬ３、ＳＰＭ－１、Ｆ８、ＰＢ１、ＫＰＰ１２、ＬＭＡ２、ＳＮ、１４－１、ＮＨ－４、ＰＴＰ９３、ＪＧ０２４、ＰＴＰ４７およびＣ３６である。そのようなファージは、単純なＰＣＲアッセイによって、単離されたファージのプラークを、尾部遺伝子のＮ末端領域の高度保存領域に対して特異的なプライマーによるＰＣＲに供することによって、同定することができる。そのようにして、全ゲノムシークエンシングを行うことなく、適したファージを同定することができる。ファージＰＢ１は、公共の株コレクションから得ることができる。そのような配列は、標準的な方法によってそのような配列を合成およびクローニングするために必要なまたはハイブリッド尾繊維配列を作製するために必要な情報を提供することができるＤＮＡ配列データベースまたは他のＤＮＡ配列ソースにおいて同定されうることから、尾繊維配列を生成するためにファージを単離または提供する必要はない。
改変にとって特に好ましいファージは、ＰＴＰ９２、ＰＴＰ９３、Ｐｈｉ３３、ＰＴＰ４７およびＣ３６である。特に好ましい極めて強力な偏性溶菌性ファージは、Ｐｈｉ３３由来の尾繊維および／または尾繊維ハイブリッドＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）を有するように改変されたＰＴＰ９３、ならびにハイブリッド尾繊維Ｐｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）を有するように改変されたＰｈｉ３３である。ＰＴＰ９３の特に好ましい極めて強力な非溶菌性ＳＡＳＰｊｅｃｔ誘導体は、Ｐｈｉ３３尾繊維遺伝子とＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維ハイブリッド遺伝子とを有し、エンドライシン遺伝子の代わりに緑膿菌リボソームサブユニットタンパク質Ｓ２（ｒｐｓＢ）遺伝子プロモーターの制御下でバチルス・メガテリウム由来のＳＡＳＰ－Ｃを有するＰＴＰ９３である。
上記の異なる改変バクテリオファージの混合物もまた、提供されうる。改変された極めて強力な非溶菌性の偏性溶菌性ＳＡＳＰｊｅｃｔベクターの混合物を使用してもよい。そのようなＳＡＳＰｊｅｃｔの特に好ましい混合物は、Ｐｈｉ３３尾繊維遺伝子を有し、エンドライシン遺伝子の代わりに緑膿菌リボソームサブユニットタンパク質Ｓ２（ｒｐｓＢ）遺伝子プロモーターの制御下でバチルス・メガテリウム由来のＳＡＳＰ－Ｃを有するＰＴＰ９３、と共に、Ｐｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維遺伝子を有し、エンドライシン遺伝子の代わりに緑膿菌リボソームサブユニットタンパク質Ｓ２（ｒｐｓＢ）遺伝子プロモーターの制御下でバチルス・メガテリウム由来のＳＡＳＰ－Ｃを有するＰＴＰ９３、と共にエンドライシン遺伝子の代わりに緑膿菌リボソームサブユニットタンパク質Ｓ２（ｒｐｓＢ）遺伝子プロモーターの制御下でバチルス・メガテリウム由来のＳＡＳＰ－Ｃを有するハイブリッド尾繊維Ｐｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）を有するように改変されたＰｈｉ３３である。
１つのそのような改変ファージ（ＰＴＰ２１３）の宿主域を表３に示す。Ｐｈｉ３３尾繊維遺伝子を有し、エンドライシン遺伝子の代わりに緑膿菌リボソームサブユニットタンパク質Ｓ２（ｒｐｓＢ）遺伝子プロモーターの制御下でバチルス・メガテリウム由来のＳＡＳＰ－Ｃを有するＰＴＰ９３（ＰＴＰ２１３）は、Ｐｈｉ３３またはＰＴＰ９２より広い宿主域の株に対して活性を示す。
別の実施形態において、溶菌遺伝子の代わりに構成的プロモーターから発現されたＳＡＳＰ遺伝子を有する、または溶菌遺伝子を不活化するように改変された偏性溶菌性ファージを、適したプロモーターの制御下で異種尾繊維タンパク質またはハイブリッド尾繊維タンパク質の遺伝子をトランスに有し、適したプロモーターからトランスに発現された溶菌遺伝子を有する宿主株において増殖させてもよい。尾繊維または尾繊維ハイブリッド遺伝子にとって適したプロモーターは、ファージプロモーター、特に改変された偏性溶菌性ファージにおいて尾繊維遺伝子の発現を促進するプロモーターでありうる。他の適したプロモーターは、その同族の調節タンパク質と共に、ｌａｃおよびｔｒｐなどの誘導型プロモーターである。溶菌遺伝子にとって適したプロモーターは、ファージプロモーター、特に改変された偏性溶菌性ファージにおいて溶菌遺伝子の発現を通常促進するプロモーターである。他の適したプロモーターはその同族の調節タンパク質と共にｌａｃおよびｔｒｐなどの誘導型プロモーターである。そのような株から得られたＳＡＳＰｊｅｃｔ子孫は、極めて強力で非溶菌性であり、その株からトランスに発現された尾繊維または尾繊維ハイブリッド、ならびに自身の尾繊維または尾繊維ハイブリッドを有する。あるいは、尾繊維遺伝子または尾繊維ハイブリッド遺伝子がトランスに発現され、溶菌遺伝子がトランスに発現される株を増殖のために使用して、誘導体ＳＡＳＰｊｅｃｔを形成することができる限り、偏性溶菌性ファージの尾繊維遺伝子を完全に欠失させてもよい。そのような例において、そのような株からのＳＡＳＰｊｅｃｔの子孫は、複数の尾繊維を有するが、それらのゲノムでは、いかなる尾繊維または尾繊維ハイブリッド遺伝子も欠如する。
さらなる態様において、本発明は、本明細書において定義される改変バクテリオファージまたはその混合物とその担体とを含む、細菌細胞増殖を阻害または予防するための組成物を提供する。改変バクテリオファージは、標的細菌に対して毒性であるＳＡＳＰをコードするＳＡＳＰ遺伝子を含み、非溶菌性である、標的細菌に感染することができる少なくとも１つの他の改変バクテリオファージとの混合物として提供されうる。少なくとも１つの他の改変バクテリオファージは、複数の異なるＨＲＤを発現してもよく、または発現しなくてもよい。そのような組成物は、広範囲の用途を有し、したがって意図される用途に従って調製される。組成物は、薬剤、特にヒト治療のための薬剤として調製されてもよく、細菌感染症を含む様々な状態を治療しうる。本発明に従って治療可能な感染症は、血流中の感染症、局所感染症、虫歯を含む口腔内感染症、呼吸器感染症、および眼の感染症を含む、局所組織および臓器の感染症、または多臓器感染症である。担体は、薬学的に許容されるレシピエントまたは希釈剤でありうる。そのような組成物の成分の正確な性質および量は、経験的に決定され、組成物の投与経路に一部依存するであろう。
レシピエントに対する投与経路には、静脈内、動脈内、経口、口腔内、舌下、鼻腔内、吸入、局所（眼科を含む）、筋肉内、皮下、および関節内が挙げられる。使用の便宜上、本発明による投薬量は、治療または予防される感染症の部位およびタイプに依存する、呼吸器感染症は吸入投与によって治療され、眼の感染症は点眼液を使用して治療されうる。改変バクテリオファージを含有する口腔内衛生製品も同様に提供される。歯垢の形成に関連する細菌を消失させるように調製された、本発明による改変バクテリオファージを含有するマウスウォッシュまたは練り歯磨きを使用してもよい。
本発明による改変バクテリオファージは、例えば表面細菌汚染の処理ならびに土壌の改良または水の処理における除菌剤として使用されうる。バクテリオファージは、医療従事者および／または患者の処置において、例えばハンドウォッシュ中の除菌剤として使用されうる。特に病院での手順または食品調製に使用する作業表面および機器の処置も同様に提供される。１つの特定の実施形態は、１人の個体から他の個体への細菌の伝達および汚染を予防、消失、または低減するために、局所使用のために調製された組成物を含む。これは、特に従来の抗生物質に対して耐性の細菌が流行している病院の環境において微生物感染症の伝播を制限するために重要である。そのような使用に関して、改変バクテリオファージを、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水に含めて、これをゲルまたはクリームに調製してもよい。何回も使用する場合、保存剤を添加してもよい。あるいは、製品を凍結乾燥して、賦形剤、例えばスクロースなどの糖を添加してもよい。
本発明を、添付の図面および以下の実施例を参照して、単なる例としてさらに詳細に記述する。
図１４は、関連するファージの尾繊維遺伝子の複数の配列アライメントである。
（それぞれが複数の尾繊維を含有する個々のファージまたはファージ混合物における複数の尾繊維を含む遺伝子構築物）
溶菌性バクテリオファージを非溶菌性にして、および３０Ｓリボソームサブユニットタンパク質Ｓ２遺伝子（ｒｐｓＢ）の発現を通常制御するプロモーターの制御下でＳＡＳＰ－Ｃに加えて、１つより多くの尾繊維遺伝子を有するようにする溶菌性バクテリオファージの遺伝子改変の概要。
（それぞれが複数の尾繊維を含有する個々のファージまたはファージ混合物における複数の尾繊維を含む遺伝子構築物）
溶菌性バクテリオファージを非溶菌性にして、および３０Ｓリボソームサブユニットタンパク質Ｓ２遺伝子（ｒｐｓＢ）の発現を通常制御するプロモーターの制御下でＳＡＳＰ－Ｃに加えて、１つより多くの尾繊維遺伝子を有するようにする溶菌性バクテリオファージの遺伝子改変の概要。
相同組み換えを使用して、ファージゲノムから遺伝子を除去および付加することができる。外来遺伝子およびプロモーターを有するファージを構築することができるいくつかの方法があり、以下はそのような方法の例である。
Ｐｈｉ３３誘導体の構築に関して、単なる例として大腸菌／緑膿菌の広い宿主域のベクターを使用して、代替の尾繊維遺伝子を有するＰｈｉ３３骨格のバクテリオファージを相同組み換えによって作製することができる方法を示す。同様に、単なる例として大腸菌／緑膿菌の広い宿主域のベクターを使用して、得られたバクテリオファージが２つの尾繊維遺伝子を有するように、さらなる尾繊維遺伝子が相同組み換えによってバクテリオファージゲノムに付加される、Ｐｈｉ３３誘導体を構築する方法も示される。次のステップにおいて、単なる例として大腸菌／緑膿菌の広い宿主域のベクターを使用して、得られたバクテリオファージが３つの尾繊維遺伝子を有するように、相同組み換えによって、第３の尾繊維遺伝子がバクテリオファージゲノムに付加されうる方法が示される。
一例として、組み換え型溶菌性バクテリオファージを構築するために、大腸菌ｌａｃＺαマーカーを、組み換え型バクテリオファージを同定する手段として含めてもよい。このマーカーを使用するためには、所望の組み換え型バクテリオファージのｌａｃＺ表現型を相補するために、バクテリオファージ宿主株を最初に、細菌ゲノムにおける適した位置で大腸菌ｌａｃＺ△Ｍ１５を有するように改変しなければならない。一例として、この緑膿菌株の構築は、緑膿菌において複製することができない大腸菌ベクターを使用して、相同組み換えによって達成されうる。ｌａｃＺ△Ｍ１５トランスジーンを挿入するためのゲノム位置は、必須の遺伝子が影響を受けないように、および隣接する遺伝子の発現に対する極性効果を通して望ましくない表現型が生成されないように、選択すべきである。一例として、１つのそのような位置は、緑膿菌株ＰＡＯ１ ｐｈｏＡ相同体のすぐ下流でありうる。
大腸菌ｌａｃＺ△Ｍ１５対立遺伝子を、緑膿菌において複製できない大腸菌ベクターにおいて、ｐｈｏＡに隣接する緑膿菌株ＰＡＯ１ゲノムＤＮＡの２つの領域の間にクローニングすることができる。このプラスミドを緑膿菌に導入して、ゲノムに全プラスミドを組み込むために１回の相同組み換えを受けている単離体を、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）の獲得に従って選択することができる。次に、２回目の相同組み換え事象を受けた単離体を次に、１０％スクロースを含有する培地において単離することができる（プラスミド骨格に存在するｓａｃＢカウンターセレクタブルマーカーを利用する）。
代替尾繊維遺伝子を保有するＰｈｉ３３誘導体が作製されうる例として、Ｐｈｉ３３尾繊維のＮ末端領域をコードする領域と、その後に続くファージＰＴＰ９２由来の尾繊維のＣ末端受容体結合領域をコードする領域とを含む尾繊維遺伝子（Ｐｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ９２（Ｃ））を構築して、次に、ｌａｃＺαマーカーの隣の、Ｐｈｉ３３のネイティブ尾繊維遺伝子に隣接する２つの相同性領域の間にクローニングすることができる。このプラスミドを緑膿菌に導入して、得られた株にＰｈｉ３３を感染させることができる。子孫ファージの回収後、β－ガラクトシダーゼ活性の色素生成指標としてＳ－ｇａｌを含有する培地を使用して、適した緑膿菌（ｌａｃＺ△Ｍ１５＋）宿主でのプラーク形成によって二重組み換え体を単離することができる。得られたファージは、ネイティブＰｈｉ３３尾繊維がＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ９２（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子に置換され、それに加えてｌａｃＺαマーカーを有しているであろう。
次のステップにおいて、ｌａｃＺαマーカーを、別の相同組み換えステップを介してＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ９２（Ｃ）尾繊維ファージから除去することができる。ネイティブＰｈｉ３３尾繊維の下流の相同性領域を、ＰＴＰ９２のＣ末端受容体結合領域をコードする遺伝子の隣にクローニングすることができる。このプラスミドを、適した緑膿菌株に導入して、得られた株に、Ｐｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ９２（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子に加えてｌａｃＺαを有するＰｈｉ３３誘導体を感染させることができる。子孫ファージの回収後、β－ガラクトシダーゼ活性の色素生成指標としてＳ－ｇａｌを含有する培地を使用して、適した緑膿菌（ｌａｃＺ△Ｍ１５＋）宿主でのプラーク形成によって二重組み換え体を単離することができる。得られたＰｈｉ３３誘導体（ＰＴＰ９３）は、ネイティブのＰｈｉ３３尾繊維がＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ９２（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子に置換され、ｌａｃＺαマーカーをもはや有していないであろう。
尾繊維遺伝子がバクテリオファージゲノムに付加されうる一例として、広い宿主域の大腸菌／緑膿菌ベクターにおいて、バクテリオファージＰｈｉ３３由来の尾繊維遺伝子を、大腸菌ｌａｃＺαマーカーの隣の、ｏｒｆ５７の５’末端に隣接するＰｈｉ３３ＤＮＡの２つの領域の間（異所１位、これはネイティブ尾繊維遺伝子を含有する予想オペロンの開始位置である）にクローニングすることができる。このプラスミドを緑膿菌に導入して、得られた株にＰＴＰ９３を感染させることができる。子孫ファージの回収後、β－ガラクトシダーゼ活性の色素生成指標としてＳ－ｇａｌを含有する培地を使用して、適した緑膿菌（ｌａｃＺ△Ｍ１５＋）宿主でのプラーク形成によって二重組み換え体を単離することができる。得られたファージは、２つの尾繊維遺伝子、すなわちネイティブ位置でＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ９２（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子と、異所位置（異所位置１）でネイティブＰｈｉ３３尾繊維をコードする遺伝子（に加えてｌａｃＺαマーカー）とを含有するであろう。
代替例において、Ｐｈｉ３３尾繊維のＮ末端領域と、バクテリオファージＰＴＰ４７由来の尾繊維のＣ末端受容体結合領域とを含む尾繊維をコードする遺伝子（Ｐｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ））を構築して、広い宿主域の大腸菌／緑膿菌ベクターにおいて、大腸菌ｌａｃＺαマーカーの隣の、ｏｒｆ５７の５’末端に隣接するＰｈｉ３３ＤＮＡの２つの領域の間（異所１位、これはネイティブ尾繊維遺伝子を含有する予想オペロンの開始位置である）にクローニングすることができる。このプラスミドを緑膿菌に導入して、得られた株にＰＴＰ９３を感染させることができる。子孫ファージの回収後、β－ガラクトシダーゼ活性の色素生成指標としてＳ－ｇａｌを含有する培地を使用して、適した緑膿菌（ｌａｃＺ△Ｍ１５＋）宿主でのプラーク形成によって二重組み換え体を単離することができる。得られたファージは、２つの尾繊維遺伝子、すなわちネイティブ位置でＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ９２（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子と、異所位置（異所位置１）でＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子（に加えてｌａｃＺαマーカー）とを含有するであろう。
代替例において、Ｐｈｉ３３尾繊維のＮ末端領域と、バクテリオファージＰＴＰ４７由来の尾繊維のＣ末端受容体結合領域とを含む尾繊維をコードする遺伝子（Ｐｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ））を構築して、広い宿主域の大腸菌／緑膿菌ベクターにおいて、大腸菌ｌａｃＺαマーカーの隣の、ｏｒｆ５７に隣接するＰｈｉ３３ＤＮＡの２つの領域の間（異所１位、これはネイティブ尾繊維遺伝子を含有する予想オペロンの開始位置である）にクローニングすることができる。このプラスミドを緑膿菌に導入して、得られた株にＰｈｉ３３を感染させることができる。子孫ファージの回収後、β－ガラクトシダーゼ活性の色素生成指標としてＳ－ｇａｌを含有する培地を使用して、適した緑膿菌（ｌａｃＺ△Ｍ１５＋）宿主でのプラーク形成によって二重組み換え体を単離することができる。得られたファージは、２つの尾繊維遺伝子、すなわちネイティブ位置でＰｈｉ３３ネイティブ尾繊維をコードする遺伝子と、異所位置（異所位置１）でＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子（に加えてｌａｃＺαマーカー）とを含有するであろう。
次のステップにおいて、ｌａｃＺαマーカーを別の相同組み換えステップによってこれらのＰｈｉ３３誘導体から除去することができる。ｌａｃＺαマーカーを、Ｐｈｉ３３ネイティブ尾繊維またはＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子を異所位置１に導入するために使用した既に記述した組み換えプラスミドから欠失させることができる。これらの△ｌａｃＺαプラスミドを、適した緑膿菌株に導入して、得られた株に必要に応じて、野生型Ｐｈｉ３３尾繊維遺伝子に加えてｌａｃＺαマーカー、または異所位置１でＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子に加えてｌａｃＺαマーカーのいずれかを有するＰｈｉ３３誘導体を感染させることができる。子孫ファージの回収後、β－ガラクトシダーゼ活性の色素生成指標としてＳ－ｇａｌを含有する培地を使用して、適した緑膿菌（ｌａｃＺ△Ｍ１５＋）宿主でのプラーク形成によって二重組み換え体を単離することができる。得られたＰｈｉ３３誘導体は、２つの尾繊維遺伝子（ネイティブ位置でＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ９２（Ｃ）と異所位置（異所位置１）でＰｈｉ３３ネイティブ尾繊維、またはネイティブ位置でＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ９２（Ｃ）と異所位置でＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維、またはネイティブ位置でＰｈｉ３３ネイティブ尾繊維と異所位置１でＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ））を含有し、もはやｌａｃＺαマーカーを有しないであろう。
次のステップにおいて、別の相同組み換えを使用して、第３の尾繊維遺伝子をバクテリオファージゲノムに付加することができる。一例として、ネイティブ尾繊維プロモーター（ｏｒｆ５７プロモーター）の制御下で、Ｐｈｉ３３尾繊維のＮ末端領域と、バクテリオファージＰＴＰ４７由来の尾繊維のＣ末端受容体結合領域とを含む尾繊維をコードする遺伝子を構築して、広い宿主域の大腸菌／緑膿菌ベクターにおいて、ｌａｃＺαマーカーの隣の、ｏｒｆ２８とｏｒｆ２９の間の遺伝子間領域に隣接するＰｈｉ３３ＤＮＡの２つの領域の間（異所位置２）にクローニングすることができる。このプラスミドを緑膿菌に導入して、得られた株に、ネイティブ位置でＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ９２（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子と異所位置１でネイティブＰｈｉ３３尾繊維をコードする遺伝子（△ｌａｃＺα）とを有するＰｈｉ３３を感染させることができる。子孫ファージの回収後、β－ガラクトシダーゼ活性の色素生成指標としてＳ－ｇａｌを含有する培地を使用して、適した緑膿菌（ｌａｃＺ△Ｍ１５＋）宿主でのプラーク形成によって二重組み換え体を単離することができる。得られたファージは、３つの尾繊維遺伝子：ネイティブ位置でＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ９２（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子と、異所位置１でネイティブＰｈｉ３３尾繊維をコードする遺伝子と、異所位置２でＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子（に加えてｌａｃＺαマーカー）とを含有するであろう。
次のステップにおいて、３つの尾繊維遺伝子（ネイティブ座でＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ９２（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子と、異所位置１でネイティブＰｈｉ３３尾繊維をコードする遺伝子と、異所位置２でＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子に加えてｌａｃＺαマーカー）を有するこのＰｈｉ３３誘導体から、別の相同組み換えステップによってｌａｃＺαマーカーを除去することができる。ｌａｃＺαマーカーを、異所位置２でＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子を導入するために使用した既に記述した組み換えプラスミドから欠失させることができる。この△ｌａｃＺαプラスミドを適した緑膿菌株に導入して、得られた株に、ネイティブ座でＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ９２（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子、異所位置１でネイティブＰｈｉ３３尾繊維遺伝子、および異所位置２でＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子に加えてｌａｃＺαマーカーを有するＰｈｉ３３誘導体を感染させることができる。子孫ファージの回収後、β－ガラクトシダーゼ活性の色素生成指標としてＳ－ｇａｌを含有する培地を使用して、適した緑膿菌（ｌａｃＺ△Ｍ１５＋）宿主でのプラーク形成によって二重組み換え体を単離することができる。得られたファージは、３つの尾繊維遺伝子：ネイティブ位置でＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ９２（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子と、異所位置１でネイティブＰｈｉ３３尾繊維遺伝子と、異所位置２でＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子とを含有し、ｌａｃＺαマーカーをもはや有しないであろう。
次のステップにおいて、類似の相同組み換えを使用して、組み換え型ファージを同定するために大腸菌ｌａｃＺαマーカーを同時に付加しながら、Ｐｈｉ３３誘導体または類似のバクテリオファージのいずれかのエンドライシン遺伝子を、緑膿菌ｒｐｓＢプロモーターの制御下でＳＡＳＰ－Ｃ遺伝子に置換することができる。改変されるバクテリオファージは、溶菌性（テンペレートではなくて）であることから、バクテリオファージ構築のこの後のステップでは、所望の組み換え型バクテリオファージの△エンドライシンおよびｌａｃＺα表現型を相補するために、細菌ゲノムの適した位置で、Ｐｈｉ３３エンドライシン遺伝子と大腸菌ｌａｃＺ△Ｍ１５対立遺伝子とを有する緑膿菌宿主株の誘導体の構築が別に必要である。一例として、この緑膿菌株の構築は、緑膿菌において複製することができない大腸菌ベクターを使用して相同組み換えを介して行うことができる。エンドライシンおよびｌａｃＺ△Ｍ１５トランスジーンを挿入するためのゲノム位置は、必須遺伝子が影響を受けないように、および隣接する遺伝子の発現に対する極性効果を通して望ましくない表現型が生成されないように選択しなければならない。一例として、そのような１つの位置は、緑膿菌株ＰＡＯ１ ｐｈｏＡ相同体のすぐ下流でありうる。
Ｐｈｉ３３エンドライシン遺伝子および大腸菌ｌａｃＺ△Ｍ１５対立遺伝子を、緑膿菌において複製することができない大腸菌ベクターにおいて、ｐｈｏＡに隣接する緑膿菌株ＰＡＯ１ゲノムＤＮＡの２つの領域の間にクローニングすることができる。このプラスミドを緑膿菌に導入して、ゲノムに全プラスミドを組み込むために１回の相同組み換えを受けている単離体をテトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）の獲得に従って選択することができる。次に２回目の相同組み換え事象を受けている単離体を、１０％スクロース（プラスミド骨格に存在するｓａｃＢカウンターセレクタブルマーカーを利用して）を含有する培地で単離することができる。
ｒｐｓＢプロモーターによって制御されるＳＡＳＰ－Ｃおよび大腸菌ｌａｃＺα対立遺伝子からなる領域を、広い宿主域の大腸菌／緑膿菌ベクターにおいて、エンドライシン遺伝子に隣接するＰｈｉ３３の２つの領域の間にクローニングすることができる。このプラスミドを、既に構築された緑膿菌（エンドライシン＋ｌａｃＺ△Ｍ１５＋）株に伝達してもよく、得られた株に、前回のステップにおいて上記で例示したように、１つより多くの尾繊維遺伝子を有するように既に遺伝子改変されているＰｈｉ３３誘導体のいずれかを感染させることができる。子孫ファージを回収して、緑膿菌（エンドライシン＋ｌａｃＺ△Ｍ１５＋）上でのプラーク形成によって二重組み換え体を同定し、β－ガラクトシダーゼの作用を検出する色素生成基質を含有する培地上でｌａｃＺαレポーターの獲得に関して調べることができる。
次のステップにおいてｌａｃＺαマーカーを、相同組み換えによって、エンドライシン遺伝子の代わりにｒｐｓＢ－ＳＡＳＰ－ＣおよびｌａｃＺαを有する既に構築されたファージから除去することができる。ｒｐｓＢ－ＳＡＳＰ－Ｃからなる領域を、広い宿主域の大腸菌／緑膿菌ベクターにおいて、Ｐｈｉ３３エンドライシン遺伝子に隣接する２つの相同性領域の間にクローニングすることができる。このプラスミドを、既に構築された緑膿菌（エンドライシン＋ｌａｃＺ△Ｍ１５＋）株に伝達して、得られた株に、前回のステップにおいて上記で例示したように、エンドライシン遺伝子の代わりにｒｐｓＢ－ＳＡＳＰ－Ｃを有するように既に遺伝子改変されているＰｈｉ３３誘導体のいずれかを感染させることができる。子孫ファージを回収して、緑膿菌（エンドライシン＋ｌａｃＺ△Ｍ１５＋）上でのプラーク形成によって二重組み換え体を同定し、β－ガラクトシダーゼの作用を検出する色素生成基質を含有する培地上でｌａｃＺαレポーターの喪失に関して調べることができる。得られたファージは複数の尾繊維または尾繊維ハイブリッド遺伝子を有し、本発明に従ってエンドライシンの代わりにｒｐｓＢ－ＳＡＳＰ－Ｃを有する。
（実験技法）
クローニング目的でＤＮＡを生成するためのＰＣＲ反応は、プライマーの融解温度（Ｔｍ）に応じて、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ Ｆｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、製造元の説明書に従って実施することができる。スクリーニング目的のＰＣＲ反応は、プライマーの融解温度（Ｔｍ）に応じて、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用して、製造元の説明書に従って実施することができる。特に明記していない限り、制限酵素消化、アガロースゲル電気泳動、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ依存的ライゲーション、コンピテント細胞の調製および形質転換などの一般的な分子生物学技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）に記述される方法に基づくことができる。酵素は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓまたはＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入することができる。ＤＮＡは、酵素反応から精製して、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＡ精製キットを使用して細胞から調製することができる。プラスミドは、接合ヘルパー株である大腸菌ＨＢ１０１（ｐＲＫ２０１３）によって媒介される接合によって大腸菌株から緑膿菌株に伝達することができる。β－ガラクトシダーゼの色素生成基質であるＳ－ｇａｌはＳｉｇｍａ（Ｓ９８１１）から購入することができ、これはβ－ガラクトシダーゼによる消化によって、鉄イオンとキレートを形成すると黒色の沈殿物を形成する。
クローニング目的でＤＮＡを生成するためのＰＣＲ反応は、プライマーの融解温度（Ｔｍ）に応じて、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ Ｆｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、製造元の説明書に従って実施することができる。スクリーニング目的のＰＣＲ反応は、プライマーの融解温度（Ｔｍ）に応じて、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用して、製造元の説明書に従って実施することができる。特に明記していない限り、制限酵素消化、アガロースゲル電気泳動、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ依存的ライゲーション、コンピテント細胞の調製および形質転換などの一般的な分子生物学技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）に記述される方法に基づくことができる。酵素は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓまたはＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入することができる。ＤＮＡは、酵素反応から精製して、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＡ精製キットを使用して細胞から調製することができる。プラスミドは、接合ヘルパー株である大腸菌ＨＢ１０１（ｐＲＫ２０１３）によって媒介される接合によって大腸菌株から緑膿菌株に伝達することができる。β－ガラクトシダーゼの色素生成基質であるＳ－ｇａｌはＳｉｇｍａ（Ｓ９８１１）から購入することができ、これはβ－ガラクトシダーゼによる消化によって、鉄イオンとキレートを形成すると黒色の沈殿物を形成する。
プライマーは、Ｓｉｇｍａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅから得ることができる。プライマーが制限酵素の認識配列を含む場合、ＰＣＲ増幅ＤＮＡの消化を確実にするために、さらなる２～６ヌクレオチドを５’末端に付加することができる。
クローニングは全て、特に明記していない限り、他所で記述されるように（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによってＤＮＡを一晩ライゲートした後、ＤＨ５αまたはＴＯＰ１０などの大腸菌クローニング株にそれらを形質転換して、選択培地で単離することによって行うことができる。
ｐＳＭ１０８０などの広い宿主域の大腸菌／緑膿菌ベクターを使用して大腸菌と緑膿菌の間で遺伝子を伝達させることができる。ｐＳＭ１０８０は、ｐＲＫ２由来の、緑膿菌における複製を可能にする広い宿主域の複製開始点ｏｒｉＴ、プラスミドｐＲＫ４１５由来の、大腸菌および緑膿菌の両方で使用するためのｔｅｔＡＲ選択可能マーカー、ならびにプラスミドｐＵＣ１９由来の、高コピー数の大腸菌複製開始点ｏｒｉＶを結合させることによって既に産生された。
緑膿菌において複製することができない大腸菌ベクターｐＳＭ１１０４を使用して、対立遺伝子交換によって緑膿菌変異体を生成することができる。ｐＳＭ１１０４は、ｐＲＫ２由来のｏｒｉＴ、プラスミドｐＲＫ４１５由来の、大腸菌および緑膿菌の両方で使用するためのｔｅｔＡＲ選択可能マーカー、プラスミドｐＵＣ１９由来の高コピー数の大腸菌複製開始点ｏｒｉＶ、ならびに枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株１６８由来のｓａｃＢ遺伝子を、カウンターセレクタブルマーカーとして使用するために、強力なプロモーターの制御下で結合させることによって既に産生された。
（Ｐｈｉ３３様ファージ（ＰＢ１様ファージファミリー）保存Ｎ末端尾繊維領域のＰＣＲによる検出）
１．実験的ファージ試料中のＰｈｉ３３様ファージ様尾繊維遺伝子を検出するためのプライマーは、以下のように設計することができる。
１．実験的ファージ試料中のＰｈｉ３３様ファージ様尾繊維遺伝子を検出するためのプライマーは、以下のように設計することができる。
シークエンシングされた全てのＰｈｉ３３様ファージ（Ｐｈｉ３３、ＰＢ１、ＮＨ－４、１４－１、ＬＭＡ２、ＫＰＰ１２、ＪＧ０２４、Ｆ８、ＳＰＭ－１、ＬＢＬ３、ＰＴＰ４７、Ｃ３６、ＰＴＰ９２、およびＳＮを含む）からの尾繊維遺伝子のＤＮＡ配列を、ＥＢＩのウェブサイトで入手可能なＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを使用して整列させることができ、このようにして遺伝子の５’配列にマップされる長さがおよそ２ｋｂの高度保存領域を同定することができる（ＰＢ１ゲノム配列における位置３１６８０～３３５５７位、受託番号ＥＵ７１６４１４）。１１個の尾繊維遺伝子配列における１００％同一性の部分は、肉眼での検分によって同定することができる。選択された絶対的保存領域を標的として、１ｋｂ以下のＰＣＲ産物を増幅するＰＣＲプライマーの３つのペアは、以下のように選択することができる：長さ１９４ｂｐの領域を定義するペアＢ４５００とＢ４５０１；長さ７７４ｂｐの領域を定義するペアＢ４５０２とＢ４５０３；および長さ３６５ｂｐの領域を定義するペアＢ４５０４とＢ４５０５。
プライマーＢ４５００は、ＰＢ１ファージゲノム（受託番号ＥＵ７１６４１４）の３１６８０～３１６９７位の範囲の配列からなる。プライマーＢ４５０１は、ＰＢ１ファージゲノム（受託番号ＥＵ７１６４１４）の３１８５１位～３１８７２位の範囲の配列からなる。Ｂ４５０２は、ＰＢ１ファージゲノム（受託番号ＥＵ７１６４１４）の３１７８５～３１８０４位の範囲の配列からなる。プライマーＢ４５０３は、ＰＢ１ファージゲノム（受託番号ＥＵ７１６４１４）の３２５４１～３２５５８位の範囲の配列からなる。プライマーＢ４５０４は、ＰＢ１ファージゲノム（受託番号ＥＵ７１６４１４）の３２８６８～３２８８８位の範囲の配列からなる。プライマーＢ４５０５は、ＰＢ１ファージゲノム（受託番号ＥＵ７１６４１４）の３３２１３～３３２３２位の範囲の配列からなる。
２．Ｐｈｉ３３様尾繊維遺伝子は、以下のように実験的ファージ試料中で検出することができる。
環境起源の単離ファージのプラークを、寒天プレートから採取して、水に添加し、３０分間インキュベートして、プラークを吸い取ることができる。吸い取ったプラークを希釈して、上記のプライマーペアの１つまたは全てを含有する部分をＰＣＲ反応に添加して、標準的なプロトコールに従ってＰＣＲを実施することができる。ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル上でエチジウムブロマイド染色によって可視化して、その大きさを評価することができる。使用したプライマーペアに関して正しい大きさのＰＣＲ産物をゲル抽出して、シークエンシングのために外部施設に提供することができる。ＰＣＲ産物の同一性を確認するために、シークエンシングの結果を利用可能な尾繊維遺伝子配列と比較することができる。
（緑膿菌のゲノムのｐｈｏＡの下流に大腸菌ｌａｃＺ△Ｍ１５対立遺伝子を導入する、プラスミドの構築）
１．緑膿菌ＰＡＯ１ ｐｈｏＡ相同体の３’末端に隣接するＤＮＡを有するｐＳＭ１１０４を有するプラスミドｐＳＭＸ４００（図１）は以下のように構築することができる。
１．緑膿菌ＰＡＯ１ ｐｈｏＡ相同体の３’末端に隣接するＤＮＡを有するｐＳＭ１１０４を有するプラスミドｐＳＭＸ４００（図１）は以下のように構築することができる。
緑膿菌のｐｈｏＡ遺伝子の末端のおよそ１ｋｂを含む領域は、プライマーＢ４４００およびＢ４４０１を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図１）。次にＰＣＲ産物を精製して、ＳｐｅＩおよびＢｇｌＩＩによって消化することができる。ＰＡ３２９７オープンリーディングフレームの３’末端を含む緑膿菌由来のｐｈｏＡ遺伝子の下流のおよそ１ｋｂを含む第二の領域は、プライマーＢ４４０２およびＢ４４０３を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図１）。次に、この第二のＰＣＲ産物を精製して、ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩによって消化することができる。２つの消化物を再度精製して、ＳｐｅＩおよびＸｈｏＩによって消化されているｐＳＭ１１０４に３方式のライゲーションでライゲートして、プラスミドｐＳＭＸ４００を得ることができる（図１）。
プライマーＢ４４００は、５’ＳｐｅＩ制限部位（下線）と、その後に続く緑膿菌株ＰＡＯ１由来のｐｈｏＡの終止コドンのおよそ１ｋｂ上流に位置する配列とからなる（図１）。プライマーＢ４４０１は、５’ＢｇｌＩＩおよびＡｆｌＩＩ制限部位（下線）と、その後に続く緑膿菌株ＰＡＯ１由来のｐｈｏＡ遺伝子の末端と相補的な配列とからなる（終止コドンを小文字で示す；図１）。プライマーＢ４４０２は、５’ＢｇｌＩＩおよびＮｈｅＩ制限部位（下線）と、その後に続く緑膿菌株ＰＡＯ１由来のｐｈｏＡ遺伝子の終止コドンのすぐ下流の配列とからなる（図１）。プライマーＢ４４０３は、５’ＸｈｏＩ制限部位（下線）と、その後に続く緑膿菌株ＰＡＯ１由来のｐｈｏＡ遺伝子のおよそ１ｋｂ下流のＰＡ３２９７オープンリーディングフレーム内の配列とからなる（図１）。
２．ｌａｃプロモーターの制御下でｌａｃＺ△Ｍ１５を有するｐＳＭＸ４００を含むプラスミドｐＳＭＸ４０１（図１）は以下のように構築することができる。
ｌａｃプロモーターの制御下のｌａｃＺ△Ｍ１５遺伝子は、プライマーＢ４４０８およびＢ４４０９を使用して大腸菌株ＤＨ１０ＢからＰＣＲによって増幅することができる（図１）。得られたＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩおよびＮｈｅＩによって消化して、ＢｇｌＩＩおよびＮｈｅＩで同様に消化されているｐＳＭＸ４００にライゲートして、プラスミドｐＳＭＸ４０１を得ることができる（図１）。
プライマーＢ４４０８は、５’ＢｇｌＩＩ制限部位（下線）と、その後に続くｌａｃプロモーターの配列とからなる（図１）。プライマーＢ４４０９は、５’ＮｈｅＩ制限部位（下線）と、その後に続く二方向の転写ターミネーターおよびｌａｃＺ△Ｍ１５の３’末端と相補的な配列とからなる（下線、太字、図１）。
（細菌ゲノムのｐｈｏＡ座のすぐ下流に大腸菌ｌａｃＺ△Ｍ１５遺伝子を導入する、緑膿菌の遺伝子改変）
１．プラスミドｐＳＭＸ４０１（図１）を接合によって緑膿菌に伝達して、テトラサイクリン（５０μｇ／ｍｌ）に対する耐性の獲得によって一次組み換え体に関して選択することができる。
１．プラスミドｐＳＭＸ４０１（図１）を接合によって緑膿菌に伝達して、テトラサイクリン（５０μｇ／ｍｌ）に対する耐性の獲得によって一次組み換え体に関して選択することができる。
２．次に、二重組み換え体を、１０％スクロースを含有する培地に播種することによってｓａｃＢ媒介カウンターセレクションによって選択することができる。
３．次に、１０％スクロースで増殖させた単離体をＰＣＲによってスクリーニングして、ｌａｃＺ△Ｍ１５が緑膿菌ｐｈｏＡ遺伝子の下流に導入されていることを確認することができる。
４．単離体（ＰＡＸ４０）の確認後、この株をｌａｃＺαレポーターの相補が必要であるバクテリオファージのさらなる改変のための宿主として使用することができる。
（ｌａｃＺαスクリーニングプロセスを利用してＰＴＰ９３を生成する、Ｐｈｉ３３との組み換えのためのプラスミドの構築）
１．Ｐｈｉ３３尾繊維遺伝子のすぐ下流の領域を有するｐＳＭ１０８０を含むｐＳＭＸ４０２（図２）は、以下のように構築することができる。
１．Ｐｈｉ３３尾繊維遺伝子のすぐ下流の領域を有するｐＳＭ１０８０を含むｐＳＭＸ４０２（図２）は、以下のように構築することができる。
Ｐｈｉ３３尾繊維の末端２０塩基を含むＰｈｉ３３配列の１ｋｂ領域および隣接する下流の領域を、プライマーＢ４４２２およびＢ４４４９を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図２）。得られたＰＣＲ産物を精製して、ＮｈｅＩで消化して、同様にＮｈｅＩによって消化されていて、ライゲーション前にアルカリホスファターゼによって処理されているｐＳＭ１０８０にライゲートして、プラスミドｐＳＭＸ４０２（図２）を得ることができる。
プライマーＢ４４２２は、５’ＮｈｅＩ制限部位（下線）と、その後に続くＰｈｉ３３尾繊維遺伝子の末端のおよそ１ｋｂ下流のＰｈｉ３３由来の配列とからなる（図２）。Ｂ４４４９は、５’ＮｈｅＩ－ＫｐｎＩ－ＡｖｒＩＩ制限部位（下線）と、その後に続くＰｈｉ３３尾繊維の３’末端と相補的な配列と、尾繊維オープンリーディングフレームのすぐ下流の配列とからなる（図２）。
２．ｌａｃＺαを有するｐＳＭＸ４０２、尾繊維のＣ末端受容体結合領域をコードするＰＴＰ９２ ＤＮＡの３’部分およびＮ末端領域をコードするＰｈｉ３３尾繊維遺伝子配列の５’部分からなる尾繊維遺伝子、ならびにＰｈｉ３３尾繊維遺伝子のすぐ上流に位置する配列を含むｐＳＭＸ４０３（図２）は、以下のように構築することができる。
ｌａｃＺαオープンリーディングフレームは、プライマーＢ４４５０およびＢ４４５２を使用してｐＵＣ１９からＰＣＲによって増幅することができる（図２）。Ｃ末端受容体結合領域をコードするＰＴＰ９２尾繊維遺伝子の領域は、プライマーＢ４４５１およびＢ４４５４を使用してＰＴＰ９２からＰＣＲによって増幅することができる（図２）。次に、ｌａｃＺαオープンリーディングフレームを、外側のプライマーＢ４４５０およびＢ４４５４を使用してＳＯＥｉｎｇＰＣＲによって、尾繊維のＣ末端受容体結合領域をコードするＰＴＰ９２ ＤＮＡの部分に結合することができる。Ｎ末端領域をコードするＰｈｉ３３尾繊維遺伝子の配列と、Ｐｈｉ３３尾繊維遺伝子のすぐ上流に位置する配列とを含む領域は、プライマーＢ４４５３およびＢ４４２９を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図２）。このＰＣＲ産物を次に、外側のプライマーＢ４４５０およびＢ４４２９を使用して、ＳＯＥｉｎｇＰＣＲによってｌａｃＺαおよびＰＴＰ９２尾繊維遺伝子部分を含むＰＣＲ産物に結合させることができる。次に、得られたＰＣＲ産物を精製して、ＡｖｒＩＩおよびＫｐｎＩによって消化し、同様にＡｖｒＩＩおよびＫｐｎＩによって消化されているｐＳＭＸ４０２にライゲートして、プラスミドｐＳＭＸ４０３を得ることができる（図２）。
プライマーＢ４４５０は５’ＡｖｒＩＩ制限部位と、その後に続くｌａｃＺαオープンリーディングフレームの３’末端と相補的な配列とからなる（図２）。プライマーＢ４４５２は、Ｃ末端受容体結合領域をコードする３’末端ＰＴＰ９２尾繊維領域と重なり合う配列の５’部分と、その後に続くｌａｃＺαオープンリーディングフレームの５’末端の配列とからなる（図２）。プライマーＢ４４５１はプライマーＢ４４５２の逆相補体である（図２）。プライマーＢ４４５４は、Ｎ末端領域（下線）をコードするＰｈｉ３３尾繊維遺伝子の領域内の５’配列と、その後に続くＣ末端受容体結合領域をコードするＰＴＰ９２尾繊維遺伝子の領域内の配列とからなる（図２）。プライマーＢ４４５３は、プライマーＢ４４５４の逆相補体である。プライマーＢ４４２９は、５’ＫｐｎＩ制限部位（下線）と、その後に続くＰｈｉ３３における尾繊維遺伝子のおよそ１ｋｂ上流の領域と相補的である配列とからなる（図２）。
３．ＰＴＰ９２尾繊維のＣ末端受容体結合領域をコードする遺伝子の領域と、Ｐｈｉ３３尾繊維遺伝子のすぐ下流に位置するＰｈｉ３３配列の領域とを有するｐＳＭ１０８０を含むｐＳＭＸ４０４（図３）は、以下のように構築することができる。
Ｐｈｉ３３尾繊維のすぐ下流に位置するＰｈｉ３３配列の領域は、プライマーＢ４４２２およびＢ４４５５を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図３）。ＰＴＰ９２尾繊維のＣ末端受容体結合領域をコードする遺伝子の領域は、プライマーＢ４４５６およびＢ４４５７を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図３）。これらの２つのＰＣＲ産物を次に、２つの外側のプライマーＢ４４２２およびＢ４４５７を使用してＳＯＥｉｎｇＰＣＲによって結合することができる。得られたＰＣＲ産物を次に精製して、ＮｈｅＩによって消化し、再度精製して、ＮｈｅＩによって同様に消化されていて、ライゲーション前にアルカリホスファターゼによって処理されているｐＳＭ１０８０にライゲートして、プラスミドｐＳＭＸ４０４を得ることができる（図３）。
プライマーＢ４４５５は、ＰＴＰ９２尾繊維遺伝子のＣ末端受容体結合領域（下線）をコードする遺伝子の領域の５’部分と、その後に続くＰｈｉ３３尾繊維遺伝子のすぐ下流の配列とからなる（図３）。プライマーＢ４４５６は、プライマーＢ４４５５の逆相補体である（図３）。プライマーＢ４４５７は、５’ＮｈｅＩ制限部位（下線）と、その後に続くＣ末端受容体結合領域をコードするＰＴＰ９２の尾繊維遺伝子の部分内の領域の配列とからなる（図３）。
（Ｃ末端受容体結合領域をコードする尾繊維遺伝子の３’領域をＰＴＰ９２の３’領域と置換して、Ｐｈｉ３３ゲノム内のネイティブ位置でＰｈｉ３３（Ｃ）ＰＴＰ９２（Ｎ）尾繊維遺伝子を形成する、Ｐｈｉ３３の遺伝子改変）
１．プラスミドｐＳＭＸ４０３（図２、図４）を、接合によって緑膿菌株ＰＡＸ４０に導入して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいて接合伝達体を選択し、株ＰＴＡ４０を得ることができる。
１．プラスミドｐＳＭＸ４０３（図２、図４）を、接合によって緑膿菌株ＰＡＸ４０に導入して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいて接合伝達体を選択し、株ＰＴＡ４０を得ることができる。
２．株ＰＴＡ４０にファージＰｈｉ３３を感染させて、子孫ファージを回収することができる。
３．尾繊維のＣ末端受容体結合領域をコードするＰｈｉ３３遺伝子の領域がＰＴＰ９２の領域に置換されていて、ｌａｃＺαが付加されている組み換え型ファージは、Ｓ－ｇａｌを含有する培地において緑膿菌株ＰＡＸ４０上でステップ（２）の溶解物をプラーク形成させて、β－ガラクトシダーゼ活性の指標である黒色のプラークを調べることによって、同定することができる。
４．ＰＣＲを行って、尾繊維遺伝子が置換されていることおよびｌａｃＺαが存在することをチェックすることができる。
５．確認された単離体（ＰＴＰＸ４０、図４）の同定後、この単離体を、さらに使用する前に緑膿菌株ＰＡＸ４０においてさらに２回プラーク精製することができる。
（ｌａｃＺαマーカーを除去してＰＴＰ９３（Ｐｈｉ３３、Ｐｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ９２（Ｃ）尾繊維遺伝子を有する）を生成する、ＰＴＰＸ４０の遺伝子改変）
１．プラスミドｐＳＭＸ４０４（図３、図４）を、接合により緑膿菌株ＰＡＸ４０に導入して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいて接合伝達体を選択し、株ＰＴＡ４１を得ることができる。
１．プラスミドｐＳＭＸ４０４（図３、図４）を、接合により緑膿菌株ＰＡＸ４０に導入して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいて接合伝達体を選択し、株ＰＴＡ４１を得ることができる。
２．株ＰＴＡ４１にファージＰＴＰＸ４０を感染させて、子孫ファージを回収することができる。
３．ｌａｃＺαマーカーが除去されている組み換え型ファージは、Ｓ－ｇａｌを含有する培地において緑膿菌株ＰＡＸ４０上でステップ（２）の溶解物をプラーク形成させて、β－ガラクトシダーゼ活性喪失の指標である白色のプラークを調べることによって、同定することができる。
４．ＰＣＲを行って、尾繊維遺伝子が保持されていること、およびｌａｃＺαが除去されていることをチェックすることができる。
５．確認された単離体（ＰＴＰ９３、図４）の同定後、この単離体を、さらに使用する前に緑膿菌株ＰＡＸ４０においてさらに２回プラーク精製することができる。
（Ｐｈｉ３３尾繊維遺伝子または異所位置１でＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子のいずれかを導入する、ＰＴＰ９３の遺伝子改変のためのプラスミドの構築）
１．連続するｏｒｆ６０からｏｒｆ５７の配列（ｏｒｆ６０もｏｒｆ５７も完全ではなかった）に及ぶＰｈｉ３３の２．８ｋｂの断片を含有するｐＳＭ１０８０を含むプラスミドｐＳＭＸ４０５（図５）は、以下のように構築することができる。図５は、Ｐｈｉ３３ゲノム由来の領域を増幅するために以下に記述されるオリゴヌクレオチドのプライミング部位を示す。
１．連続するｏｒｆ６０からｏｒｆ５７の配列（ｏｒｆ６０もｏｒｆ５７も完全ではなかった）に及ぶＰｈｉ３３の２．８ｋｂの断片を含有するｐＳＭ１０８０を含むプラスミドｐＳＭＸ４０５（図５）は、以下のように構築することができる。図５は、Ｐｈｉ３３ゲノム由来の領域を増幅するために以下に記述されるオリゴヌクレオチドのプライミング部位を示す。
Ｐｈｉ３３ ＤＮＡのＰＣＲ増幅を、プライマーＢ４４１０およびＢ３３３２（図５）を使用して実施して、２．９ｋｂ断片を得て、これを精製してＰｃｉＩによって消化することができる。消化後、ＤＮＡを精製して、ＮｃｏＩによって消化されていて、アルカリホスファターゼによって処理されているｐＳＭ１０８０にライゲートして、ｐＳＭＸ４０５を得ることができる（図５）。
プライマーＢ４４１０は、５’ＰｃｉＩ部位（下線、図５）と、その後に続くセンス方向の、Ｐｈｉ３３ ｏｒｆ６０の開始コドンの下流のおよそ２４０ｂｐにアニールする配列とからなる。プライマーＢ３３３２は、Ｐｈｉ３３ ｏｒｆ５７と相補的な配列からなり、ｏｒｆ５７内で内因性のＰｃｉＩ部位の下流のおよそ１２０ｂｐにアニールする。
２．Ｐｈｉ３３由来の完全な尾繊維遺伝子と、プロモーターを持たないｌａｃＺαマーカーとを有するｐＳＭＸ４０５を含むプラスミドｐＳＭＸ４０６（図５）は、以下のように構築することができる。
Ｐｈｉ３３由来の完全な尾繊維遺伝子（図５）は、プライマーＢ３３２４およびＢ４４１１を使用してＰＣＲによって増幅することができる。プロモーターを持たないｌａｃＺαマーカーは、プライマーＢ４４１２およびＢ４４１３を使用してｐＵＣ１９からＰＣＲによって増幅することができる（図５）。２つのＰＣＲ産物を、２つの外側のプライマーＢ３３２４およびＢ４４１３を使用してＳＯＥｉｎｇＰＣＲによって共に結合することができる。次に、得られたＰＣＲ産物をＢｓｔＢＩによって消化して、同様にＢｓｔＢＩによって消化されていて、ライゲーション前にアルカリホスファターゼによって処理されているｐＳＭＸ４０５にライゲートすることができる。プラスミドｐＳＭＸ４０６をクローンのスクリーニング後に単離して、Ｐｈｉ３３尾繊維がｏｒｆ５７と同じ方向にクローニングされているクローンを同定することができる（図５）。
プライマーＢ３３２４は、５’ＢｓｔＢＩ部位（下線）と、その後に続くＰｈｉ３３尾繊維遺伝子のすぐ上流のリボソーム結合部位にアニールする配列とからなる（図５）。プライマーＢ４４１１は、ｐＵＣ１９由来のｌａｃＺαマーカーの開始部と相補的な５’配列と、その後に続くＰｈｉ３３由来の尾繊維遺伝子の末端と相補的な配列（下線、図５）とからなる。プライマーＢ４４１２は、プライマーＢ４４１１の逆相補体である（図５）。プライマーＢ４４１３は、５’ＢｓｔＢＩ部位（下線）と、その後に続くネイティブＰｈｉ３３ ＢｓｔＢＩ部位とｏｒｆ５７の間の領域と相補的な配列と、その後に続くｐＵＣ１９由来のｌａｃＺαマーカーの末端と相補的な配列とからなる（図５）。
３．プロモーターを持たないｌａｃＺαマーカーに加えて、Ｐｈｉ３３尾繊維のＮ末端領域をコードするＰｈｉ３３ ＤＮＡの５’部分と、ＰＴＰ４７尾繊維のＣ末端受容体結合領域をコードするＰＴＰ４７ ＤＮＡの３’部分とからなる尾繊維遺伝子を有するｐＳＭＸ４０５を含む、プラスミドｐＳＭＸ４０７（図５）は、以下のように構築することができる。
Ｐｈｉ３３尾繊維のＮ末端領域をコードするＤＮＡ領域を、プライマーＢ３３２４およびＢ４４１７を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図５）。ＰＴＰ４７尾繊維のＣ末端受容体結合領域をコードするＤＮＡ領域は、プライマーＢ４４１６およびＢ４４１４を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図５）。２つのＰＣＲ産物は、２つの外側のプライマーＢ３３２４およびＢ４４１４を使用してＳＯＥｉｎｇＰＣＲによって共に結合することができる。ｐＵＣ１９由来のｌａｃＺαマーカーは、プライマーＢ４４１５およびＢ４４１３を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図５）。ｌａｃＺαマーカーは、外側のプライマーＢ３３２４およびＢ４４１３を使用してＳＯＥｉｎｇＰＣＲによって構築された尾繊維ＰＣＲ産物に結合することができる。次に、得られたＰＣＲ産物をＢｓｔＢＩによって消化して、ＢｓｔＢＩによって消化されていて、ライゲーション前にアルカリホスファターゼによって処理されているｐＳＭＸ４０５にライゲートすることができる。プラスミドｐＳＭＸ４０７をクローンのスクリーニング後に単離して、Ｐｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維がｏｒｆ５７と同じ方向にクローニングされているクローンを同定することができる（図５）。
プライマーＢ４４１７は、ＰＴＰ４７尾繊維のＣ末端受容体結合領域（下線）をコードするＰＴＰ４７の一部と相補的な配列の５’部分と、その後に続くＰｈｉ３３尾繊維のＮ末端領域をコードするＰｈｉ３３の一部と相補的な配列とからなる（図５）。プライマーＢ４４１６は、Ｂ４４１７の逆相補体である（図５）。Ｂ４４１４は、ｐＵＣ１９由来のｌａｃＺαマーカーの開始部と相補的な５’配列と、その後に続くＰＴＰ４７由来の尾繊維遺伝子の末端と相補的な配列（下線、図５）とからなる。プライマーＢ４４１５は、プライマーＢ４４１４の逆相補体である（図５）。
（ｏｒｆ５７の上流にＰｈｉ３３尾繊維遺伝子とｌａｃＺαマーカーとを付加する、ＰＴＰ９３の遺伝子改変）
１．ｐＳＭＸ４０６（図５；図６）を緑膿菌株ＰＭＬ１４に接合によって導入して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいて接合伝達体を選択し、株ＰＴＡ４２を得ることができる。
１．ｐＳＭＸ４０６（図５；図６）を緑膿菌株ＰＭＬ１４に接合によって導入して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいて接合伝達体を選択し、株ＰＴＡ４２を得ることができる。
２．株ＰＴＡ４２にＰＴＰ９３を感染させて、子孫ファージを回収することができる。
３．ｏｒｆ５７の上流でＰｈｉ３３尾繊維およびｌａｃＺαマーカーを獲得している組み換え型ファージを、β－ガラクトシダーゼ活性を検出する色素生成基質であるＳ－ｇａｌを含有する培地を使用して緑膿菌株ＰＡＸ４０上でプラーク形成させて、黒色のプラークを調べることによって同定することができる。
４．ＰＣＲを行って、Ｐｈｉ３３尾繊維およびｌａｃＺαマーカーがＰＴＰ９３のｏｒｆ５７の上流に導入されていること、およびネイティブＰＴＰ９３尾繊維領域がなおもインタクトであることを確認することができる。
５．確認された単離体（ＰＴＰＸ４１；図６）の同定後、さらに使用する前に、新しい組み換え型ファージを、緑膿菌株ＰＡＸ４０上でさらに２回プラーク精製することができる。したがって、ＰＴＰＸ４１は、ネイティブ位置でＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ９２（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子と、異所位置１でｌａｃＺαマーカーと共にＰｈｉ３３野生型尾繊維遺伝子とを有するＰｈｉ３３誘導体である。
（ｏｒｆ５７の上流にＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維遺伝子とｌａｃＺαマーカーとを付加する、ＰＴＰ９３の遺伝子改変）
１．ｐＳＭＸ４０７（図５；図７）を緑膿菌株ＰＭＬ１４に接合によって導入して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいて接合伝達体を選択し、株ＰＴＡ４３を得ることができる。
１．ｐＳＭＸ４０７（図５；図７）を緑膿菌株ＰＭＬ１４に接合によって導入して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいて接合伝達体を選択し、株ＰＴＡ４３を得ることができる。
２．株ＰＴＡ４３にＰＴＰ９３を感染させて、子孫ファージを回収することができる。
３．ｏｒｆ５７の上流で、ｌａｃＺαマーカーに加えてＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子を獲得している組み換え型ファージを、β－ガラクトシダーゼ活性を検出する色素生成基質であるＳ－ｇａｌを含有する培地を使用して緑膿菌株ＰＡＸ４０上でプラーク形成させて、黒色のプラークを調べることによって同定することができる。
４．ＰＣＲを行って、ｌａｃＺαマーカーに加えてＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子がＰＴＰ９３のｏｒｆ５７の上流に導入されていること、およびネイティブＰＴＰ９３尾繊維領域がなおもインタクトであることを確認することができる。
５．確認された単離体（ＰＴＰＸ４２；図７）の同定後、さらに使用する前に、新しい組み換え型ファージを、緑膿菌株ＰＡＸ４０上でさらに２回プラーク精製することができる。したがって、ＰＴＰＸ４２は、ネイティブ位置でＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ９２（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子と、異所位置１でｌａｃＺαマーカーと共にＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子とを有するＰｈｉ３３誘導体である。
（ｏｒｆ５７の上流にＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維遺伝子とｌａｃＺαマーカーとを付加する、Ｐｈｉ３３の遺伝子改変）
１．ｐＳＭＸ４０７（図５；図８）を緑膿菌株ＰＭＬ１４に接合によって導入して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいて接合伝達体を選択し、株ＰＴＡ４３を得ることができる。
１．ｐＳＭＸ４０７（図５；図８）を緑膿菌株ＰＭＬ１４に接合によって導入して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいて接合伝達体を選択し、株ＰＴＡ４３を得ることができる。
２．株ＰＴＡ４３にＰｈｉ３３を感染させて、子孫ファージを回収することができる。
３．ｏｒｆ５７の上流で、ｌａｃＺαマーカーに加えてＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子を獲得している組み換え型ファージを、β－ガラクトシダーゼ活性を検出する色素生成基質であるＳ－ｇａｌを含有する培地を使用して緑膿菌株ＰＡＸ４０上でプラーク形成させて、黒色のプラークを調べることによって同定することができる。
４．ＰＣＲを行って、ｌａｃＺαマーカーに加えてＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子がＰｈｉ３３のｏｒｆ５７の上流に導入されていること、およびネイティブＰｈｉ３３尾繊維領域がなおもインタクトであることを確認することができる。
５．確認された単離体（ＰＴＰＸ４３；図８）の同定後、さらに使用する前に、新しい組み換え型ファージを、緑膿菌株ＰＡＸ４０上でさらに２回プラーク精製することができる。したがって、ＰＴＰＸ４３は、ネイティブ位置でネイティブＰｈｉ３３尾繊維遺伝子と、異所位置１でｌａｃＺαマーカーと共にＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子とを有するＰｈｉ３３誘導体である。
（二重尾繊維ファージＰＴＰＸ４１、ＰＴＰＸ４２、およびＰＴＰＸ４３からｌａｃＺαマーカーを除去する、プラスミドの構築）
１．Ｐｈｉ３３尾繊維遺伝子を有するｐＳＭＸ４０５からなるプラスミドｐＳＭＸ４０８（図５）は以下のように構築することができる。
１．Ｐｈｉ３３尾繊維遺伝子を有するｐＳＭＸ４０５からなるプラスミドｐＳＭＸ４０８（図５）は以下のように構築することができる。
Ｐｈｉ３３尾繊維遺伝子を、プライマーＢ３３２４およびＢ３３３３を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図５）。得られたＰＣＲ産物をＢｓｔＢＩで消化して、ＢｓｔＢＩで消化されていて、ライゲーション前にアルカリホスファターゼによって処理されているｐＳＭ４０５にライゲートして、プラスミドｐＳＭＸ４０８を得ることができる。
プライマーＢ３３３３は、５’ＢｓｔＢＩ部位（下線）と、その後に続くネイティブＰｈｉ３３ ＢｓｔＢＩ部位とｏｒｆ５７の間の領域と相補的な配列と、その後に続くＰｈｉ３３由来の尾繊維遺伝子の３’末端と相補的な配列とからなる（図５）。
２．Ｐｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子を有するｐＳＭＸ４０５からなるプラスミドｐＳＭＸ４０９（図５）は、以下のように構築することができる。
Ｐｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ７４（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子は、プライマーＢ３３２４およびＢ４４１８を使用してｐＳＭＸ４０７からＰＣＲによって増幅することができる（図５）。得られたＰＣＲ産物をＢｓｔＢＩによって消化して、ＢｓｔＢＩによって消化されていて、ライゲーション前にアルカリホスファターゼによって処理されているｐＳＭ４０５にライゲートして、プラスミドｐＳＭＸ４０９を得ることができる（図５）。
プライマーＢ４４１８は、５’ＢｓｔＢＩ部位（下線）と、その後に続くネイティブＰｈｉ３３ ＢｓｔＢＩ部位とｏｒｆ５７の間の領域と相補的な配列と、その後に続くＰＴＰ４７由来の尾繊維遺伝子の３’末端と相補的な配列とからなる。
（二重尾繊維ファージＰＴＰＸ４１からのｌａｃＺαマーカーの除去）
１．ｐＳＭＸ４０８（図５；図６）を緑膿菌株ＰＭＬ１４に接合によって導入して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいて接合伝達体を選択し、株ＰＴＡ４４を得ることができる。
１．ｐＳＭＸ４０８（図５；図６）を緑膿菌株ＰＭＬ１４に接合によって導入して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいて接合伝達体を選択し、株ＰＴＡ４４を得ることができる。
２．株ＰＴＡ４４にＰＴＰＸ４１を感染させて、子孫ファージを回収することができる。
３．ｌａｃＺαマーカーが除去されている組み換え型ファージを、β－ガラクトシダーゼ活性を検出する色素生成基質であるＳ－ｇａｌを含有する培地を使用して緑膿菌株ＰＡＸ４０上でプラーク形成させて、透明なプラークを調べることによって同定することができる。
４．ＰＣＲを行って、ｌａｃＺαマーカーが除去されていること、および２つの尾繊維遺伝子がなおもインタクトであることを確認することができる。
５．確認された単離体（ＰＴＰＸ４４；図６）の同定後、さらに使用する前に、新しい組み換え型ファージを、緑膿菌株ＰＡＸ４０上でさらに２回プラーク精製することができる。したがって、ＰＴＰＸ４４は、ネイティブ位置でＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ９２（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子と、異所位置１でＰｈｉ３３尾繊維遺伝子（△ｌａｃＺα）とを有するＰｈｉ３３誘導体である。
（二重尾繊維ファージＰＴＰＸ４２およびＰＴＰＸ４３からのｌａｃＺαマーカーの除去）
１．ｐＳＭＸ４０９（図５；図７；図８）を緑膿菌株ＰＭＬ１４に接合によって導入して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいて接合伝達体を選択し、株ＰＴＡ４５を得ることができる。
１．ｐＳＭＸ４０９（図５；図７；図８）を緑膿菌株ＰＭＬ１４に接合によって導入して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいて接合伝達体を選択し、株ＰＴＡ４５を得ることができる。
２．株ＰＴＡ４５に、ＰＴＰＸ４２（図７）またはＰＴＰＸ４３（図８）を必要に応じて感染させて、子孫ファージを回収することができる。
３．ｌａｃＺαマーカーが除去されている組み換え型ファージを、β－ガラクトシダーゼ活性を検出する色素生成基質であるＳ－ｇａｌを含有する培地を使用して緑膿菌株ＰＡＸ４０上でプラーク形成させて、透明なプラークを調べることによって同定することができる。
４．ＰＣＲを行って、ｌａｃＺαマーカーが除去されていること、および２つの尾繊維遺伝子がなおもインタクトであることを確認することができる。
５．確認された単離体の同定後、さらに使用する前に、新しい組み換え型ファージを、緑膿菌株ＰＡＸ４０上でさらに２回プラーク精製することができる。したがって、ＰＴＰＸ４５（図７）は、ネイティブ位置でＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ９２（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子と、異所位置１でＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子（△ｌａｃＺα）とを有するＰｈｉ３３誘導体である。したがって、ＰＴＰＸ４６（図８）は、ネイティブ位置でＰｈｉ３３尾繊維遺伝子と、異所位置１でＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子（△ｌａｃＺα）とを有するＰｈｉ３３誘導体である。
（ｏｒｆ２８とｏｒｆ２９の間の遺伝子間領域の異所位置２でＰＴＰＸ４４に第３の尾繊維遺伝子を付加する、プラスミドの構築）
１．ｏｒｆ２８～２９遺伝子間領域に隣接するＰｈｉ３３ ＤＮＡの配列を有するｐＳＭ１０８０を含むプラスミドｐＳＭＸ４１０（図９）は以下のように構築することができる。
１．ｏｒｆ２８～２９遺伝子間領域に隣接するＰｈｉ３３ ＤＮＡの配列を有するｐＳＭ１０８０を含むプラスミドｐＳＭＸ４１０（図９）は以下のように構築することができる。
ｏｒｆ２８の末端に隣接するＰｈｉ３３ ＤＮＡの領域を、プライマーＢ４４１９およびＢ４４２０を使用してＰＣＲによって増幅することができる。ｏｒｆ２９の開始部に隣接するＰｈｉ３３ ＤＮＡの領域を、プライマーＢ４４２１およびＢ４４２２を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図９）。次に、得られたＰＣＲ産物を、外側のプライマーＢ４４１９およびＢ４４２２を使用してＳＯＥｉｎｇＰＣＲによって結合することができる。結合したＰＣＲ産物を精製して、ＮｈｅＩによって消化して、ＮｈｅＩによって消化されていて、ライゲーション前にアルカリホスファターゼによって処理されているｐＳＭ１０８０にライゲートして、プラスミドｐＳＭＸ４１０を得ることができる（図９）。
プライマーＢ４４１９は、５’ＮｈｅＩ制限部位（下線）と、その後に続くｏｒｆ２８内のＰｈｉ３３配列とからなる（図９）。プライマーＢ４４２０は、Ｐｈｉ３３のｏｒｆ２８～ｏｒｆ２９遺伝子間領域の配列と相補的な５’配列、ＫｐｎＩおよびＡｆｌＩＩ制限部位（下線）、その後に続くＰｈｉ３３のｏｒｆ２８～ｏｒｆ２９遺伝子間領域のより多くと相補的な配列とからなる（図９）。プライマーＢ４４２１は、プライマーＢ４４２０の逆相補体である（図９）。プライマーＢ４４２２は、５’ＮｈｅＩ制限部位（下線）と、その後に続くｏｒｆ２９の下流の領域と相補的なＰｈｉ３３配列とからなる（図９）。
２．ネイティブ尾繊維プロモーター（Ｐｏｒｆ５７）の制御下で、ｌａｃＺαマーカーに加えて、Ｐｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維をコードするように構築された遺伝子を有するｐＳＭＸ４１０を含むプラスミドｐＳＭＸ４１１（図９）は、以下のように構築することができる。
［Ｐｏｒｆ５７－Ｐｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維遺伝子－ｌａｃＺα］を含むＤＮＡ領域を、プライマーＢ４４２３およびＢ４４２４（図９）を使用してＰＣＲによってプラスミドｐＳＭＸ４０７（図５）から増幅することができる。得られたＰＣＲ産物をＡｆｌＩＩおよびＫｐｎＩによって消化して、同様にＡｆｌＩＩおよびＫｐｎＩによって消化されているｐＳＭＸ４１０にライゲートして、プラスミドｐＳＭＸ４１１を得ることができる（図９）。
プライマーＢ４４２３は、５’ＡｆｌＩＩ制限部位（下線）と、その後に続くＰｈｉ３３ ｏｒｆ５７プロモーターの配列とからなる（図９）。プライマーＢ４４２４は、５’ＫｐｎＩ制限部位（下線）と、その後に続くｌａｃＺαマーカーの末端と相補的な配列とからなる（図９）。
（ｏｒｆ２８とｏｒｆ２９の間の遺伝子間領域（異所位置２）にＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維遺伝子とｌａｃＺαマーカーとを付加して、３つの尾繊維遺伝子を有するバクテリオファージを生成する、ＰＴＰＸ４４の遺伝子改変）
１．ｐＳＭＸ４１１（図９；図１０）を緑膿菌株ＰＭＬ１４に接合によって導入して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいて接合伝達体を選択し、株ＰＴＡ４６を生成することができる。
１．ｐＳＭＸ４１１（図９；図１０）を緑膿菌株ＰＭＬ１４に接合によって導入して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいて接合伝達体を選択し、株ＰＴＡ４６を生成することができる。
２．株ＰＴＡ４６にＰＴＰＸ４４を感染させて、子孫ファージを回収することができる。
３．ｏｒｆ２８～２９の遺伝子間領域において、ｌａｃＺαマーカーに加えて、Ｐｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子を獲得している組み換え型ファージを、β－ガラクトシダーゼ活性を検出する色素生成基質であるＳ－ｇａｌを含有する培地を使用して緑膿菌株ＰＡＸ４０上でプラーク形成させて、黒色のプラークを調べることによって同定することができる。
４．ＰＣＲを行って、ｌａｃＺαマーカーに加えて、Ｐｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子がｏｒｆ２８～２９の遺伝子間領域に導入されていること、ならびにネイティブ位置でのＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ９２（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子および異所位置１でのネイティブＰｈｉ３３尾繊維遺伝子の存在を確認することができる。
５．確認された単離体（ＰＴＰＸ４７；図１０）の同定後、さらに使用する前に、新しい組み換え型ファージを、緑膿菌株ＰＡＸ４０上でさらに２回プラーク精製することができる。したがって、ＰＴＰＸ４７は、ネイティブ位置でＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ９２（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子と、異所位置１でネイティブＰｈｉ３３尾繊維遺伝子と、および異所位置２でｌａｃＺαマーカーと共にＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子とを有するＰｈｉ３３誘導体である。
（三重尾繊維バクテリオファージＰＴＰＸ４７からｌａｃＺαマーカーを除去する、プラスミドの構築）
１．ネイティブプロモーター（Ｐｏｒｆ５７）の制御下で、Ｐｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子を有するｐＳＭＸ４１０を含むプラスミドｐＳＭＸ４１２（図９）は、以下のように構築することができる。
１．ネイティブプロモーター（Ｐｏｒｆ５７）の制御下で、Ｐｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子を有するｐＳＭＸ４１０を含むプラスミドｐＳＭＸ４１２（図９）は、以下のように構築することができる。
ｐＳＭＸ４０７（図５）由来の［Ｐｏｒｆ５７－Ｐｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維遺伝子］領域を、プライマーＢ４４２３およびＢ４４２５（図９）を使用してＰＣＲによって増幅することができる。得られたＰＣＲ産物をＡｆｌＩＩおよびＫｐｎＩによって消化して、同様にＡｆｌＩＩおよびＫｐｎＩによって消化されているｐＳＭＸ４１０にライゲートして、プラスミドｐＳＭＸ４１２を得ることができる（図９）。
プライマーＢ４４２５は、５’ＫｐｎＩ部位（下線）と、その後に続くＰＴＰ４７尾繊維遺伝子の末端と相補的な配列とからなる（図９）。
（ｌａｃＺαマーカーを除去する、三重尾繊維バクテリオファージＰＴＰＸ４７の遺伝子改変）
１．ｐＳＭＸ４１２（図９；図１０）を緑膿菌株ＰＭＬ１４に接合によって導入して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいて接合伝達体を選択し、株ＰＴＡ４７を得ることができる。
１．ｐＳＭＸ４１２（図９；図１０）を緑膿菌株ＰＭＬ１４に接合によって導入して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいて接合伝達体を選択し、株ＰＴＡ４７を得ることができる。
２．株ＰＴＡ４７にＰＴＰＸ４７を感染させて、子孫ファージを回収することができる。
３．ｌａｃＺαマーカーが除去されている組み換え型ファージを、β－ガラクトシダーゼ活性を検出する色素生成基質であるＳ－ｇａｌを含有する培地を使用して緑膿菌株ＰＡＸ４０上でプラーク形成させて、β－ガラクトシダーゼ活性喪失の指標である透明なプラークを調べることによって同定することができる。
４．ＰＣＲを行って、ｌａｃＺαマーカーが除去されていること、およびＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子がｏｒｆ２８～２９の遺伝子間領域（異所位置２）になおも存在することを確認することができ、ならびにネイティブ位置でのＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ９２（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子および異所位置１でのネイティブＰｈｉ３３尾繊維遺伝子の存在を確認することができる。
５．確認された単離体（ＰＴＰＸ４８；図１０）の同定後、さらに使用する前に、新しい組み換え型ファージを、緑膿菌株ＰＡＸ４０上でさらに２回プラーク精製することができる。したがって、ＰＴＰＸ４８は、ネイティブ位置でＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ９２（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子と、異所位置１でネイティブＰｈｉ３３尾繊維遺伝子と、異所位置２でＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維をコードする遺伝子（△ｌａｃＺα）とを有するＰｈｉ３３誘導体である。
（細菌ゲノムのｐｈｏＡ座のすぐ下流にＰｈｉ３３エンドライシン遺伝子および大腸菌ｌａｃＺ△Ｍ１５を有する緑膿菌株を生成する、プラスミドの構築）
１．ネイティブエンドライシンプロモーターの制御下で、Ｐｈｉ３３由来のエンドライシン遺伝子を有するｐＳＭＸ４００を含むプラスミドｐＳＭＸ４１３（図１）は以下のように構築することができる。
１．ネイティブエンドライシンプロモーターの制御下で、Ｐｈｉ３３由来のエンドライシン遺伝子を有するｐＳＭＸ４００を含むプラスミドｐＳＭＸ４１３（図１）は以下のように構築することができる。
エンドライシンプロモーターを、プライマーＢ４４０４およびＢ４４０５を使用してＰｈｉ３３からＰＣＲによって増幅することができる（図１）。エンドライシン遺伝子そのものは、プライマーＢ４４０６およびＢ４４０７を使用してＰｈｉ３３からＰＣＲによって増幅することができる（図１）。次に、２つのＰＣＲ産物を、２つの外側のプライマーＢ４４０４およびＢ４４０７を使用してＳｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ Ｏｖｅｒｌａｐ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（ＳＯＥｉｎｇ）ＰＣＲによって共に結合することができる。得られたＰＣＲ産物をＡｆｌＩＩおよびＢｇｌＩＩによって消化して、同様にＡｆｌＩＩおよびＢｇｌＩＩによって消化されているｐＳＭＸ４００にライゲートして、プラスミドｐＳＭＸ４１３を得ることができる（図１）。
プライマーＢ４４０４は、５’ＡｆｌＩＩ制限部位（下線）と、その後に続く二方向転写ターミネーター（ｓｏｘＲターミネーター、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＤＱ０５８７１４の６０～９６塩基）と、エンドライシンプロモーター領域の開始部の配列（下線、太字）とからなる（図１）。プライマーＢ４４０５は、Ｐｈｉ３３由来のエンドライシンの開始コドンと重なり合う領域と相補的な配列の５’領域と、その後に続くエンドライシンプロモーター領域の末端と相補的な配列（下線、太字；図１）とからなる。プライマーＢ４４０６は、プライマーＢ４４０５の逆相補体である（同様に図１を参照されたい）。プライマーＢ４４０７は、５’ＢｇｌＩＩ制限部位（下線）と、その後に続くＰｈｉ３３エンドライシン遺伝子の末端と相補的な配列とからなる（図１）。
２．ｌａｃプロモーターの制御下でｌａｃＺ△Ｍ１５を有するｐＳＭＸ４１３を含むプラスミドｐＳＭＸ４１４（図１）は、以下のように構築することができる。
ｌａｃプロモーターの制御下のｌａｃＺ△Ｍ１５遺伝子を、プライマーＢ４４０８およびＢ４４０９を使用して大腸菌株ＤＨ１０ＢからＰＣＲによって増幅することができる（図１）。次に、得られたＰＣＲ産物を、ＢｇｌＩＩおよびＮｈｅＩによって消化して、同様にＢｇｌＩＩおよびＮｈｅＩによって消化されているｐＳＭＸ４１３にライゲートして、プラスミドｐＳＭＸ４１４を得ることができる（図１）。
プライマーＢ４４０８は、５’ＢｇｌＩＩ制限部位（下線）と、その後に続くｌａｃプロモーターの配列とからなる（図１）。プライマーＢ４４０９は、５’ＮｈｅＩ制限部位（下線）と、その後に続く二方向転写ターミネーターおよびｌａｃＺ△Ｍ１５の３’末端と相補的な配列とからなる（下線、太字；図１）。
（細菌ゲノムのｐｈｏＡ座のすぐ下流にＰｈｉ３３エンドライシン遺伝子と大腸菌ｌａｃＺ△Ｍ１５対立遺伝子を導入する、緑膿菌の遺伝子改変）
１．プラスミドｐＳＭＸ４１４を接合によって緑膿菌に伝達し、テトラサイクリン（５０μｇ／ｍｌ）に対する耐性の獲得によって一次組み換え体に関して選択することができる。
１．プラスミドｐＳＭＸ４１４を接合によって緑膿菌に伝達し、テトラサイクリン（５０μｇ／ｍｌ）に対する耐性の獲得によって一次組み換え体に関して選択することができる。
２．二重組み換え体を、１０％スクロースを含有する培地に播種することによって、ｓａｃＢ媒介カウンターセレクションによって選択することができる。
３．次に、１０％スクロース上で増殖させた単離体を、ＰＣＲによってスクリーニングして、エンドライシンおよびｌａｃＺ△Ｍ１５が緑膿菌ｐｈｏＡ遺伝子の下流に導入されていることを確認することができる。
４．単離体（ＰＡＸ４１）の確認後、この株を、△エンドライシン、ｌａｃＺα＋遺伝子型の相補が必要であるバクテリオファージのさらなる改変のための宿主として使用することができる。
（二重尾繊維ファージ（ＰＴＰＸ４４、ＰＴＰＸ４５、ＰＴＰＸ４６）もしくは類似のバクテリオファージ、または三重尾繊維ファージ（ＰＴＰＸ４８）もしくは類似のバクテリオファージのエンドライシン遺伝子をｒｐｓＢ－ＳＡＳＰ－ＣおよびｌａｃＺαに置換する、プラスミドの構築）
１．エンドライシン遺伝子に隣接するＰｈｉ３３の領域を含有するｐＳＭ１０８０を含むプラスミドｐＳＭＸ４１５（図１１）は、以下のように構築することができる。
１．エンドライシン遺伝子に隣接するＰｈｉ３３の領域を含有するｐＳＭ１０８０を含むプラスミドｐＳＭＸ４１５（図１１）は、以下のように構築することができる。
エンドライシン遺伝子のすぐ下流のＰｈｉ３３配列の領域を、プライマーＢ４４６５およびＢ４４６６を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図１１）。次に、このＰＣＲ産物を精製して、ＮｄｅＩおよびＮｈｅＩによって消化することができる。エンドライシン遺伝子のすぐ上流のＰｈｉ３３配列の領域を、プライマーＢ４４６７およびＢ４４６８を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図１１）。この第二のＰＣＲ産物を精製して、ＮｄｅＩおよびＮｈｅＩによって消化することができる。次に、２つのＰＣＲ産物消化物を再度精製して、ＮｈｅＩによって消化されていて、ライゲーションの前にアルカリホスファターゼによって処理されているｐＳＭ１０８０にライゲートすることができる。２つのＰＣＲ産物のそれぞれの１つのインサートを有するクローンを、プライマーＢ４４６５およびＢ４４６８を使用してＰＣＲによって同定して、精製プラスミドＤＮＡのＮｄｅＩによる制限酵素消化物によってプラスミドｐＳＭＸ４１５を同定することができる（図１１）。
プライマーＢ４４６５は、５’ＮｈｅＩ制限部位（下線）と、その後に続くＰｈｉ３３エンドライシン遺伝子のおよそ３４０ｂｐ下流に位置するＰｈｉ３３配列とからなる（図１１）。プライマーＢ４４６６は、５’ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩ制限部位（下線）と、その後に続くエンドライシン遺伝子のすぐ下流に位置するＰｈｉ３３の配列とからなる（図１１）。プライマーＢ４４６７は、５’ＮｄｅＩ制限部位（下線）と、その後に続くＰｈｉ３３エンドライシン遺伝子のすぐ上流に位置する配列と相補的な配列とからなる（図１１）。プライマーＢ４４６８は、５’ＮｈｅＩ部位（下線）と、その後に続くエンドライシン遺伝子のおよそ３４０ｂｐ上流に位置するＰｈｉ３３配列とからなる（図１１）。
２．ｒｐｓＢプロモーターの制御下でＳＡＳＰ－Ｃを含有するｐＳＭＸ４１５を含むプラスミドｐＳＭＸ４１６（図１１）は、以下のように構築することができる。
バチルス・メガテリウム株ＫＭ（ＡＴＣＣ １３６３２）由来のＳＡＳＰ－Ｃ遺伝子を、プライマーＢ４４６９およびＢ４４７０を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図１１）。次に、得られたＰＣＲ産物をＫｐｎＩおよびＮｃｏＩによって消化することができる。ｒｐｓＢプロモーターを、プライマーＢ４４７１およびＢ４４７２を使用して緑膿菌からＰＣＲによって増幅することができる（図１１）。次に、得られたＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＮｄｅＩによって消化することができる。２つの消化されたＰＣＲ産物を精製して、ＫｐｎＩおおよびＮｄｅＩによって消化されているｐＳＭＸ４１５にライゲートして、プラスミドｐＳＭＸ４１６を得ることができる（図１１）。
プライマーＢ４４６９は、５’ＫｐｎＩ制限部位と、その後に続く二方向の転写ターミネーターと、Ｂ．メガテリウム株ＫＭ（ＡＴＣＣ １３６３２）由来のＳＡＳＰ－Ｃ遺伝子の３’末端と相補的な配列（下線、太字；図１１）とからなる。プライマーＢ４４７０は、５’ＮｃｏＩ制限部位（下線）と、その後に続くＢ．メガテリウム株ＫＭ（ＡＴＣＣ １３６３２）由来のＳＡＳＰ－Ｃ遺伝子の５’末端の配列（図１１）とからなる。プライマーＢ４４７１は、５’ＮｃｏＩ制限部位（下線）と、その後に続く緑膿菌ＰＡＯ１由来のｒｐｓＢプロモーターの末端と相補的な配列（図１１）とからなる。プライマーＢ４４７２は、５’ＮｄｅＩ制限部位（下線）と、その後に続く緑膿菌ＰＡＯ１由来のｒｐｓＢプロモーターの開始部の配列（図１１）とからなる。
３．ｌａｃＺαを含有するｐＳＭＸ４１６を含むプラスミドｐＳＭＸ４１７（図１１）は、以下のように構築することができる。
ｌａｃＺαは、プライマーＢ４４７３およびＢ４４７４を使用してＰＣＲ増幅することができる（図１１）。得られたＰＣＲ産物をＫｐｎＩで消化して、同様にＫｐｎＩで消化されていて、ライゲーション前にアルカリホスファターゼによって処理されているｐＳＭＸ４１６にライゲートして、ｐＳＭＸ４１７を得ることができる（図１１）。
プライマーＢ４４７３は、５’ＫｐｎＩ制限部位（下線）と、その後に続くｌａｃＺαの３’末端と相補的な配列とからなる（図１１）。プライマーＢ４４７４は、５’ＫｐｎＩ制限部位と、その後に続くｌａｃＺαの発現を促進するｌａｃプロモーターの配列（図１１）とからなる。
（エンドライシンをｒｐｓＢ－ＳＡＳＰ－ＣおよびｌａｃＺαに置換する、二重尾繊維ファージ（ＰＴＰＸ４４、ＰＴＰＸ４５、ＰＴＰＸ４６）もしくは類似のバクテリオファージ、または三重尾繊維ファージ（ＰＴＰＸ４８）もしくは類似のバクテリオファージの遺伝子構築）
１．プラスミドｐＳＭＸ４１７（図１１）を緑膿菌株ＰＡＸ４１に接合によって導入して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいて接合伝達体を選択し、株ＰＴＡ４８を得ることができる。
１．プラスミドｐＳＭＸ４１７（図１１）を緑膿菌株ＰＡＸ４１に接合によって導入して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいて接合伝達体を選択し、株ＰＴＡ４８を得ることができる。
２．株ＰＴＡ４８に、個々の実験において二重尾繊維ファージ（ＰＴＰＸ４４（図６）、ＰＴＰＸ４５（図７）、ＰＴＰＸ４６（図８））もしくは類似のバクテリオファージ、または三重尾繊維ファージ（ＰＴＰＸ４８；図１０）もしくは類似のバクテリオファージの１つを感染させて、子孫ファージを回収することができる。
３．エンドライシン遺伝子がｒｐｓＢ－ＳＡＳＰ－ＣおよびｌａｃＺαに置換されている組み換え型ファージを、Ｓ－ｇａｌを含有する培地を使用して緑膿菌株ＰＡＸ４１上でステップ（２）からの溶解物のプラークを形成させて、β－ガラクトシダーゼ活性の指標である黒色のプラークを調べることによって同定することができる。
４．ＰＣＲを行って、エンドライシン遺伝子が置換されていること、ならびにｒｐｓＢ－ＳＡＳＰ－ＣおよびｌａｃＺαが存在することをチェックすることができる。
５．確認された単離体（例えば、ＰＴＰＸ４９（図６）、ＰＴＰＸ５０（図７）、ＰＴＰＸ５１（図８）、ＰＴＰＸ５２（図１０））の同定後、単離体をさらに使用する前に緑膿菌株ＰＡＸ４１においてさらに２回プラーク精製することができる。
（ＰＴＰＸ４９、ＰＴＰＸ５０、ＰＴＰＸ５１、およびＰＴＰＸ５２ならびにエンドライシン遺伝子の代わりにｒｐｓＢ－ＳＡＳＰ－Ｃを有するＰｈｉ３３の類似の誘導体からｌａｃＺαマーカーを除去する、遺伝子改変）
１．プラスミドｐＳＭＸ４１６（図１１）を緑膿菌株ＰＡＸ４１に接合によって導入して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいて接合伝達体を選択し、株ＰＴＡ４９を得ることができる。
１．プラスミドｐＳＭＸ４１６（図１１）を緑膿菌株ＰＡＸ４１に接合によって導入して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいて接合伝達体を選択し、株ＰＴＡ４９を得ることができる。
２．株ＰＴＡ４９に、個々の実験においてファージＰＴＰＸ４９、もしくはＰＴＰＸ５０、もしくはＰＴＰＸ５１、もしくはＰＴＰＸ５２、または他の類似のファージを感染させて、子孫ファージを回収することができる。
３．ｌａｃＺαマーカーが除去されている組み換え型ファージを、Ｓ－ｇａｌを含有する培地において緑膿菌株ＰＡＸ４１上でステップ（２）からの溶解物をプラーク形成させて、β－ガラクトシダーゼ活性喪失の指標である透明なプラークを調べることによって同定することができる。
４．ＰＣＲを行って、ｒｐｓＢ－ＳＡＳＰ－Ｃがなおも存在することを確保しながらｌａｃＺαマーカーの除去を確認することができる。
５．確認された単離体（例えば、ＰＴＰ２１３（図１１；図１２）、ＰＴＰＸ５３（図１１；図１２）、ＰＴＰＸ５４（図１１；図１３）、ＰＴＰＸ５５（図１１；図１３））の同定後、単離体をさらに使用する前に緑膿菌株ＰＡＸ４１においてさらに２回プラーク精製することができる。
表１．緑膿菌の４４個のヨーロッパ臨床単離体に対するＰｈｉ３３、ＰＴＰ９２、Ｃ３６、およびＰＴＰ４７の宿主域
粗ファージ溶解物１０μｌを、細菌を接種した軟寒天重層プレート上に滴下することによって、株を各ファージに対する感受性に関して試験した。プレートを３２℃で一晩増殖させて、接種点でのクリアランスゾーンを評価することによって、株を各ファージに対する感受性に関して採点した。ファージが、菌叢のクリアランスによって認められるように増殖を阻害した場合、株を感受性（＋）と記し、増殖の阻害が認められない場合、株を非感受性（－）と記した。
粗ファージ溶解物１０μｌを、細菌を接種した軟寒天重層プレート上に滴下することによって、株を各ファージに対する感受性に関して試験した。プレートを３２℃で一晩増殖させて、接種点でのクリアランスゾーンを評価することによって、株を各ファージに対する感受性に関して採点した。ファージが、菌叢のクリアランスによって認められるように増殖を阻害した場合、株を感受性（＋）と記し、増殖の阻害が認められない場合、株を非感受性（－）と記した。
表２．緑膿菌の３５個のヨーロッパ臨床単離体に対するＰｈｉ３３、ＰＴＰ９２、およびＰＴＰ９３の宿主域。粗ファージ溶解物１０μｌを、細菌を接種した軟寒天重層プレート上に滴下することによって、株を各ファージに対する感受性に関して試験した。プレートを３２℃で一晩増殖させて、接種点でのクリアランスゾーンを評価することによって、株を各ファージに対する感受性に関して採点した。ファージが菌叢のクリアランスによって認められるように増殖を阻害した場合、株を感受性（＋）と記し、増殖の阻害が認められない場合、株を非感受性（－）と記した。
表３．緑膿菌の９個の臨床単離体に対するＰＴＰ２１３、Ｐｈｉ３３、およびＰＴＰ９２の宿主域。
粗ファージ溶解物１０μｌを、細菌を接種した軟寒天重層プレート上に滴下することによって、株を各ファージに対する感受性に関して試験した。プレートを３２℃で一晩増殖させて、接種点でのクリアランスゾーンを評価することによって、株を各ファージに対する感受性に関して採点した。ファージがクリアランスによって認められるように増殖を阻害した場合、株を感受性（＋）と記し、増殖の阻害が認められない場合、株を非感受性（－）と記した。
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Claims (18)
- 標的細菌に対して毒性である低分子酸可溶性芽胞タンパク質（ＳＡＳＰ）をコードするα／β型ＳＡＳＰ遺伝子を含む、複数の異なる標的細菌に感染することができる改変バクテリオファージであって、
非溶菌性であり、
複数の異なる宿主域決定因子を発現し、
各宿主域決定因子が異なる細菌宿主特異性を有し、
各宿主域決定因子は、標的細菌に結合するための受容体結合領域と、受容体結合領域をバクテリオファージのボディに結合させる領域とを含む尾繊維タンパク質を含み、かつ、
受容体結合領域が、Ｃ末端受容体結合領域であり、Ｃ末端受容体結合領域をバクテリオファージのボディに結合させる領域がＮ末端領域である、改変バクテリオファージ。 - 宿主域決定因子の細菌宿主特異性が同じ細菌種に存在する、請求項１に記載の改変バクテリオファージ。
- 不活化された溶菌遺伝子、または、ＳＡＳＰ遺伝子、ＳＡＳＰ－ＣであるＳＡＳＰ遺伝子、もしくはバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来であるＳＡＳＰ－Ｃの挿入によって不活化された溶菌遺伝子を含む、請求項１または請求項２に記載の改変バクテリオファージ。
- ＳＡＳＰ遺伝子が、
構成的プロモーター、改変バクテリオファージが標的細菌において複数のコピーで存在する場合、毒性レベルのＳＡＳＰの産生を促進するために十分に強いプロモーター、および、ｐｄｈＡ、ｒｐｓＢ、ｐｇｉ、ｆｄａ、ｌａｓＢ、およびそれらに対して９０％超の配列同一性を有するプロモーターから選択されるプロモーター
からなる群より選択される少なくとも１つのプロモーターの制御下にある、請求項１～３のいずれか１項に記載の改変バクテリオファージ。 - 標的細菌の少なくとも１つがシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）であるか、もしくは、
複数の異なる標的細菌が、複数の異なるシュードモナス細菌であり、および／または、
前記シュードモナス細菌が緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の改変バクテリオファージ。 - 各宿主域決定因子が、複数の異なる感染部位からの、およびある範囲の抗生物質耐性表現型を含む、少なくとも３５個超の臨床単離体のコレクションの５０％超によって定義される広い宿主域を有する、請求項１～５のいずれか１項に記載の改変バクテリオファージ。
- Ｎ末端領域が、バクテリオファージＰｈｉ３３のアミノ酸配列に基づいて、尾繊維タンパク質のアミノ酸１～６２８位を含み、Ｃ末端領域が、尾繊維タンパク質のアミノ酸６２９～９６４位を含み、および／または
Ｃ末端領域がバクテリオファージＰｈｉ３３のＣ末端領域と９６％以下のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１～６のいずれか１項に記載の改変バクテリオファージ。 - Ｃ末端領域がバクテリオファージＰｈｉ３３、ＬＢＬ３、ＳＰＭ－１、Ｆ８、ＰＢ１、ＫＰＰ１２、ＬＭＡ２、ＳＮ、１４－１、ＪＧ０２４、ＮＨ４、ＰＴＰ４７、ＰＴＰ９２、Ｃ３６、およびＰＴＰ９３のいずれか１つに由来する、請求項７に記載の改変バクテリオファージ。
- Ｃ末端領域アミノ酸配列同一性が８０％未満である、請求項８に記載の改変バクテリオファージ。
- Ｎ末端領域が、バクテリオファージＰｈｉ３３のＮ末端領域と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１～９のいずれか１項に記載の改変バクテリオファージ。
- Ｎ末端領域が、バクテリオファージＰｈｉ３３、ＬＢＬ３、ＳＰＭ－１、Ｆ８、ＰＢ１、ＫＰＰ１２、ＬＭＡ２、ＳＮ、１４－１、ＪＧ０２４、ＮＨ４、ＰＴＰ４７、ＰＴＰ９２、Ｃ３６、およびＰＴＰ９３のいずれか１つに由来する、請求項１０に記載の改変バクテリオファージ。
- 各尾繊維タンパク質が、Ｐｈｉ３３、ＬＢＬ３、ＳＰＭ－１、Ｆ８、ＰＢ１、ＫＰＰ１２、ＬＭＡ２、ＳＮ、１４－１、ＪＧ０２４、ＮＨ４、ＰＴＰ４７、ＰＴＰ９２、Ｃ３６、およびＰＴＰ９３から選択されるバクテリオファージに由来する、請求項１～１１のいずれか１項に記載の改変バクテリオファージ。
- 標的細菌に対して毒性であるＳＡＳＰをコードするＳＡＳＰ遺伝子を含み、非溶菌性である、標的細菌に感染することができる少なくとも１つの他の改変バクテリオファージの混合物中の請求項１～１２のいずれか１項に記載の改変バクテリオファージ。
- 薬剤として使用するための、請求項１～１３のいずれか１項に記載の改変バクテリオファージ。
- 細菌感染症、または、
局所臓器感染症もしくは多臓器感染症を含む細菌感染症、または
局所感染症、経口感染症、呼吸器感染症、眼の感染症、もしくは血流中の感染症を含む細菌感染症の治療、および／または
前記感染症のヒトのための治療に使用するための、請求項１～１４のいずれか１項に記載の改変バクテリオファージ。 - 細菌細胞増殖の治療的阻害または予防に使用するための、請求項１～１３のいずれか１項に記載の改変バクテリオファージ。
- 請求項１～１３のいずれか１項に記載の改変バクテリオファージとその担体とを含む、細菌細胞増殖を阻害または予防するための組成物；
薬学的使用のために調製される前記組成物；または、
局所使用のために調製される前記組成物。 - 請求項１～１３のいずれか１項に記載の改変バクテリオファージを含む、表面細菌汚染の処理、土壌改良、または水の処理における除菌剤。
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