JP7141756B2 - 異なる尾繊維を有する複数宿主域のバクテリオファージ - Google Patents

Description

本発明は、改変バクテリオファージ、その使用、および改変バクテリオファージを含有する組成物に関する。

世界保健機構（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ）の２０１４年の抗菌剤耐性に関する地球規模調査報告書は、抗生物質耐性が、地域および病院において一般的な感染症を治療する能力を危険に曝している地球規模の問題であることを明らかにしている。緊急の対策をとらなければ、世界は、何十年もの間治療可能であった一般的な感染症および軽微な損傷のために再び死に至りうるポスト抗生物質の時代に向かいつつある（ＷＨＯ、２０１４）。抗生物質耐性は、たとえ簡単な手術であっても患者の回復を複雑にし、治療の失敗をますます引き起こしつつある。実際に、利用可能な全ての抗生物質に対して耐性であるいくつかの属の細菌株が地球規模で広まっている。そのような株は、一般的にいわゆるＥＳＫＡＰＥ病原体、すなわちエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アシネトバクター・バウマニイ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、およびエンテロバクター種の範囲の株である（Ｂｏｕｃｈｅｒら、２００９）。用語ＥＳＫＡＰＥ病原体は、Ｂｏｕｃｈｅｒらによって、これらの細菌が現在、米国およびヨーロッパにおいて院内感染症の大半を引き起こし、全てではないが利用可能な大半の抗生物質から有効に「逃避する」ことができ、全抗生物質耐性の感染症が起こりつつあることを強調するために作出された。病院で治療される一般的な細菌によって引き起こされる重篤な感染症を有する患者の死亡率は、同じであるが非耐性の細菌によって引き起こされる感染症を有する患者の死亡率のおよそ２倍であり、例えばメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を有する人は、非耐性型感染症を有する人より死亡する可能性が６４％高いと推定されている（ＷＨＯ、２０１４）。グラム陽性細菌の中で、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌は、米国およびヨーロッパにおいて病院での有病率および死亡率の主な原因であり続けている。しかし、より近年では、アシネトバクター種、多剤耐性（ＭＤＲ）緑膿菌、ならびにカルバペネム耐性クレブシエラ種および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を含むいくつかの高度耐性グラム陰性病原体が、重篤で時に治療不能の感染症を引き起こす主要な病原体として出現している。医学が進歩するということは、ますます複雑な技法が行われることを意味し、これらの進歩によって、手術、移植、および化学療法を受ける高齢患者および患者の数がますます増加して、それらの全ての技法によって、これらの感染症のリスクを有する免疫無防備状態の人の数はさらに増加する（Ｗａｌｋｅｒら、２００９）。この現象により、有効な抗生物質に対する依存および必要性が高まっている。

緑膿菌は、その外膜の透過性が低いために薬物が細胞内に入るのを制限し、首尾よく細胞内に入ったいかなる薬物も複数の排出ポンプで押し出されるために内因性の耐性を有する、しばしば多剤耐性（ＭＤＲ）である１つの細菌である。緑膿菌はまた、グラム陰性菌に対する「最後の手段の抗生物質」であるカルバペネムに対するさらなる耐性機構も獲得しつつある。耐性菌を含む緑膿菌は、院内感染症全体のおよそ１０％を引き起こし、院内感染処方全体の５０％を占める院内感染肺炎の原因の第二位である。病院における緑膿菌感染症は、一般的に、患者を少なくとも２種類の抗生物質で治療することを指示する、現行の緑膿菌感染症の標準治療による静脈内（ＩＶ）治療を必要とする。残念なことに、耐性はしばしば、治療中の患者に起こる。過去３０～４０年以内に開発されて販売が承認された新規クラスの抗生物質は非常に少ないことから、新規の安全かつ有効な抗菌剤が緊急に必要である。

従来の抗生物質に対する代替として、細菌内部で広いスペクトルの抗菌活性を証明する１つのタンパク質ファミリーは、α／β型の低分子酸可溶性芽胞タンパク質（今後ＳＡＳＰとして知られる）を含む。細菌内部で、ＳＡＳＰは、細菌ＤＮＡに結合し、クライオ電子顕微鏡を使用するこのプロセスの可視化により、最も研究されているＳＡＳＰであるＳｓｐＣが、ＤＮＡを被覆して、突出ドメインを形成し、ＤＮＡ構造（Ｆｒａｎｃｅｓｃｏｎｉら、１９８８；Ｆｒｅｎｋｉｅｌ－Ｋｒｉｓｐｉｎら、２００４）をＢ様（ピッチ３．４ｎｍ）からＡ様（３．１８ｎｍ；Ａ様ＤＮＡは２．８ｎｍのピッチを有する）に改変することが示されている。突出するＳｓｐＣモチーフは、隣接するＤＮＡ－ＳｓｐＣフィラメントと相互作用して、フィラメントを核タンパク質ヘリックスの堅固なアセンブリに詰め込む。２００８年に、Ｌｅｅらは、１０ｂｐ ＤＮＡ二本鎖に結合したα／β型ＳＡＳＰの結晶構造を２．１Åの解像度で報告した。複合体において、α／β型ＳＡＳＰは、ヘリックス－ターン－ヘリックスモチーフを採用し、副溝の接触を通してＤＮＡと相互作用し、二量体としてＤＮＡのおよそ６ｂｐに結合し、ＤＮＡはＡ－Ｂ型コンフォメーションで存在する。このようにして、ＤＮＡの複製は停止し、ＳＡＳＰが結合している場合、ＳＡＳＰは、ＤＮＡの転写を防止する。ＳＡＳＰは、非配列特異的にＤＮＡに結合し（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、１９９０）、そのため細菌ＤＮＡに変異があっても、ＳＡＳＰの結合に影響を及ぼさない。α／β型ＳＡＳＰの配列は、好ましいα／β型ＳＡＳＰであるバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）のＳＡＳＰ－Ｃを含む、国際公開第０２／４０６７８号パンフレットの付録１に見出されうる。

国際公開第０２／４０６７８号パンフレットは、ＳＡＳＰ遺伝子を取り込むように改変されたバクテリオファージの抗菌剤としての使用を記述する。細菌宿主における改変バクテリオファージの効果的な産生を提供するために、国際公開第０２／４０６７８号パンフレットは、産生宿主の増殖の際にＳＡＳＰ遺伝子の発現を回避することを目的としている。この目的のために、ＳＡＳＰ遺伝子を誘導型プロモーターの制御下に置いた。１つの構成において、ＳＡＳＰ遺伝子を、テンペレートバクテリオファージの溶菌遺伝子に挿入することによって、バクテリオファージ生活環の終了時に限って活性となる溶菌遺伝子プロモーターの制御下に置いた。この場合、ファージは、プロファージとして生存したままである。別の構成において、ＳＡＳＰ遺伝子は、バクテリオファージ染色体上のいずれに存在してもよく、バクテリオファージプロモーターまたは細菌プロモーターの制御下に置かれ、それによって溶菌サイクルは自然の経過をたどることができる。この構成において、細菌プロモーターは、非構成的であり、環境の合図によってアップレギュレートされうる。細菌産生宿主の増殖は、特にＳＡＳＰ遺伝子が構成的プロモーターの制御下に置かれた場合には、ＳＡＳＰ遺伝子産物の存在により防止されると考えられた。

国際公開第２００９０１９２９３号パンフレットは、バクテリオファージとは独立して制御されて、外因性またはトランスでの調節が必要でないかまたは提供されなくとも構成的であるプロモーターの制御下で、ＳＡＳＰをコードする遺伝子を有するように改変されているバクテリオファージを効果的に産生することができることを記述している。例は、バチルス・メガテリウム由来のＳＡＳＰ－Ｃ遺伝子の発現を促進するために使用される黄色ブドウ球菌のｆｂａＡプロモーターであり、このプロモーターは、複数のコピーで存在する場合、例えば標的細胞の感染後に毒性レベルのＳＡＳＰ発現を促進する。

ＳＡＳＰ遺伝子を含有するように改変されたバクテリオファージベクターは、一般的にＳＡＳＰｊｅｃｔベクターと呼ばれている。ＳＡＳＰ遺伝子が標的細菌に送達されると、ＳＡＳＰがそれらの細菌内で産生され、細菌ＤＮＡに結合して、ＤＮＡのコンフォメーションをＢ様からＡ様に変化させる。標的細菌細胞内で十分量のＳＡＳＰが産生されると、感染細胞の生存率の低下を引き起こす。

バクテリオファージは、１９２０年代または３０年代以降に細菌感染症の治療のための薬剤として使用されている。一般的に、バクテリオファージは、その細菌宿主に対して特異的である。いくつかのバクテリオファージは、テンペレートであるが、他はテンペレートではない。テンペレートファージは、宿主細胞に感染して、宿主細胞ゲノムに組み込まれてプロファージとなることができるが、一般的にプロファージの状態では宿主に対して無害である。非テンペレートまたは「溶菌性」ファージは、新たなバクテリオファージ子孫を作製して、宿主細胞の溶解および成熟ファージ粒子の放出で終わるという溶菌性の生活環で複製することができる。有用な薬剤として難しい点は、多様な異なる細菌の感染症を有効に治療するために使用することができるバクテリオファージ組成物を提供することである。一般的には、これは、利用可能な最も強力なバクテリオファージ組成物、すなわち偏性溶菌性で、複製を通して生存率を保持し、治療時に放出され、広い宿主域を有するバクテリオファージを、バクテリオファージのおそらく混合物または「カクテル」として使用することにより達成されると考えられる（Ｃａｒｌｔｏｎ、１９９９；Ｋｕｔａｔｅｌａｄｚｅ ａｎｄ Ａｄａｍｉａ、２０１０）。野生型ファージのカクテルは、細菌の臨床株に対して十分な活性スペクトルを確保するために使用されている（Ｂｕｒｒｏｗｅｓ ａｎｄ Ｈａｒｐｅｒ、２０１２）。そのようなカクテルは、最大２０種の異なる無関係なファージで構成することができる（Ａｂｅｄｏｎ、２００８）。カクテルアプローチの代替として、大腸菌バクテリオファージＫ１－５が単離されている。これは、大腸菌のＫ１およびＫ５株の両方において感染および複製することができる１つより多くの宿主域決定因子を有する天然に存在する偏性溶菌性ファージである（Ｓｃｈｏｌｌら、２００１）。これらのファージは、極めて強力であると考えられる。

医療において細菌感染症の治療に、ならびに医学的および非医学的状況で細菌細胞増殖の阻害または予防に使用するために改善されたバクテリオファージを提供することがなおも必要である。

国際公開第０２／４０６７８号パンフレット 国際公開第２００９０１９２９３号パンフレット

世界保健機構（ＷＨＯ）の２０１４年の抗菌剤耐性に関する地球規模調査報告書（ＷＨＯ（２０１４）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：ｇｌｏｂａｌ ｒｅｐｏｒｔ ｏｎ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ２０１４）． Ｂｏｕｃｈｅｒ，Ｈ．Ｗ．，Ｔａｌｂｏｔ，Ｇ．Ｈ．，Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｊ．Ｓ．，Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｊ．Ｅ．，Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｄ．，Ｒｉｃｅ，Ｌ．Ｂ．，＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｊ．（２００９）．Ｂａｄｂｕｇｓ，ｎｏｄｒｕｇｓ：ｎｏＥＳＫＡＰＥ！Ａｎ ｕｐｄａｔｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，４８：１－１２． Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．，Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｓ．，Ｐｏｌａｓｋｙ，Ｓ．，Ｇａｌａｚ，Ｖ．，Ｆｏｌｋｅ，Ｃ．，Ｅｎｇｓｔｒｏｍ，Ｇ．，＆ｄｅ Ｚｅｅｕｗ，Ａ．（２００９）．Ｌｏｏｍｉｎｇ ｇｌｏｂａｌ－ｓｃａｌｅ ｆａｉｌｕｒｅｓ ａｎｄ ｍｉｓｓｉｎｇ ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２５：１３４５－１３４６． Ｆｒａｎｃｅｓｃｏｎｉ，Ｓ．Ｃ．，ＭａｃＡｌｉｓｔｅｒ，Ｔ．Ｊ．，Ｓｅｔｌｏｗ，Ｂ．，＆Ｓｅｔｌｏｗ，Ｐ．（１９８８）．Ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｍａｌｌ， ａｃｉｄ－ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｐｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｓｐｏｒｕｌａｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７０：５９６３－５９６７． Ｆｒｅｎｋｉｅｌ－Ｋｒｉｓｐｉｎ，Ｄ．，Ｓａｃｋ，Ｒ．，Ｅｎｇｌａｎｄｅｒ，Ｊ．，Ｓｈｉｍｏｎｉ，Ｅ．，Ｅｉｓｅｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．，Ｂｕｌｌｉｔｔ，Ｅ．＆Ｗｏｌｆ，Ｓ．Ｇ．（２００４）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＤＮＡ－ＳｓｐＣ ｃｏｍｐｌｅｘ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｐａｃｋａｇｉｎｇ， ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， ａｎｄ ｒｅｐａｉｒ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｐｏｒｅｓ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：３５２５－３５３０． Ｌｅｅ，Ｋ．Ｓ．，Ｂｕｍｂａｃａ，Ｄ．，Ｋｏｓｍａｎ，Ｊ．，Ｓｅｔｌｏｗ，Ｐ．，＆Ｊｅｄｒｚｅｊａｓ，Ｍ．Ｊ．（２００８）．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ－ＤＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ＤＮＡ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｓｐｏｒｅｓ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０５：２８０６－２８１１． Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ＷＬ，Ｓｅｔｌｏｗ Ｂ，Ｓｅｔｌｏｗ Ｐ．（１９９０）．Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ａ ｓｍａｌｌ， ａｃｉｄ－ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｐｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｉｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｎ ＤＮＡ ｔｏｐｏｌｏｇｙ．ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：６９００－６９０６． Ｃａｒｌｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９９）．Ｐｈａｇｅ ｔｈｅｒａｐｙ： ｐａｓｔ ｈｉｓｔｏｒｙ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．Ａｒｃｈｉｖｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａｅ ｅｔ Ｔｈｅｒａｐｉａｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ－Ｅｎｇｌｉｓｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ ４７：２６７－２７４． Ｋｕｔａｔｅｌａｄｚｅ，Ｍ．，＆Ａｄａｍｉａ，Ｒ．（２０１０）．Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｔｏ ｒｅｐｌａｃｅ ｏｒ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８：５９１－５９５． Ｂｕｒｒｏｗｅｓ，Ｂ．，＆ Ｈａｒｐｅｒ，Ｄ．Ｒ．（２０１２）．Ｐｈａｇｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｎｏｎ－ｗｏｕｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ， Ｃｈａｐｔｅｒ １４：２０３－２１６． Ａｂｅｄｏｎ ＳＴ．（２００８）．Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｅｃｏｌｏｇｙ：Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ，Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ， ａｎ Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．Ｃｈａｐｔｅｒ １． Ｓｃｈｏｌｌ，Ｄ．，Ｒｏｇｅｒｓ，Ｓ．，Ａｄｈｙａ，Ｓ．，＆Ｍｅｒｒｉｌ，Ｃ．Ｒ．（２００１）．Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｋ１－５ ｅｎｃｏｄｅｓ ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔａｉｌ ｆｉｂｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａｌｌｏｗｉｎｇ ｉｔ ｔｏ ｉｎｆｅｃｔ ａｎｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｅ ｏｎ ｂｏｔｈ Ｋ１ ａｎｄ Ｋ５ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：２５０９－２５１５． Ｇｉｌｌ ＪＪ，Ｈｙｍａｎ Ｐ．（２０１０）．Ｐｈａｇｅ Ｃｈｏｉｃｅ， Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｐｈａｇｅ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１１：２－１４． Ｒａｋｈｕｂａ ＤＶ，Ｋｏｌｏｍｉｅｔｓ ＥＩ，Ｓｚｗａｊｃｅｒ Ｄｅｙ Ｅ，Ｎｏｖｉｋ ＥＩ．（２０１０）．Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｐｈａｇｅ Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ．Ｐｏｌｉｓｈ Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５９：１４５－１５５． Ｃｅｙｓｓｅｎｓ Ｐ，Ｍｉｒｏｓｈｎｉｋｏｖ Ｋ，Ｍａｔｔｈｅｕｓ Ｗ，Ｋｒｙｌｏｖ Ｖ，Ｒｏｂｂｅｎ Ｊ，Ｎｏｂｅｎ Ｊ，Ｖａｎｄｅｒｓｃｈｒａｅｇｈｅ Ｓ，Ｓｙｋｉｌｉｎｄａ Ｎ，Ｋｒｏｐｉｎｓｋｉ ＡＭ，Ｖｏｌｃｋａｅｒｔ Ｇ，Ｍｅｓｙａｎｚｈｉｎｏｖ Ｖ， Ｌａｖｉｇｎｅ Ｒ．（２００９）．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ａｎｄ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ＰＢ１－ｌｉｋｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ． Ｅｎｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．．１１：２８７４－２８８３． Ｖｅｅｓｌｅｒ Ｄ，Ｃａｍｂｉｌｌａｕ Ｃ．（２０１１）．Ａ Ｃｏｍｍｏｎ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｏｒｉｇｉｎ ｆｏｒ Ｔａｉｌｅｄ－Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｕｌｅｓ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｍａｃｈｉｎｅｒｉｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ．７５：４２３－４３３． Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｖｏｌ．２，ｐｐ．１４－９）．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．

第一の態様において、本発明は、標的細菌に対して毒性であるＳＡＳＰをコードするα／β型の低分子酸可溶性芽胞タンパク質（ＳＡＳＰ）遺伝子を含む、複数の異なる標的細菌に感染することができる改変バクテリオファージであって、非溶菌性であり、および複数の異なるバクテリオファージ由来のアミノ酸配列を含むハイブリッド宿主域決定因子（ＨＲＤ）を発現する、改変バクテリオファージを提供する。ＨＲＤの細菌宿主特異性は、同じ細菌種内であることが都合がよい。

意外にも、多様な異なる標的細菌に感染することができ、たとえバクテリオファージが非溶菌性であっても医療において使用するために有効である改変バクテリオファージを産生することができることが見出されている。バクテリオファージは、ハイブリッドＨＲＤタンパク質を発現することから、増強された宿主域を有する。ハイブリッドＨＲＤは複数の異なるバクテリオファージ由来のアミノ酸配列を含む。本発明によるバクテリオファージは、例えば近縁のファージ由来のＨＲＤを選択することによって、遺伝子工学によって産生されうる。そのような極めて強力なファージの作製後、それを非溶菌性にすることができ、したがって非生存にして、それでもなおＳＡＳＰｊｅｃｔベクターとして適したファージにすることができる。

改変バクテリオファージは、不活化された溶菌遺伝子を含むことから、非溶菌性でありうる。溶菌遺伝子への配列の挿入または溶菌遺伝子の除去によって、この遺伝子は不活化される。溶菌遺伝子は、簡便には、ＳＡＳＰ遺伝子の挿入によって不活化されうる。

１つの態様において、本明細書において使用される用語「ＳＡＳＰ」は、α／β型のＳＡＳＰ活性、すなわちＤＮＡに結合してその構造をそのＢ様型からＡ様型に改変する能力を有するタンパク質を指し、国際公開第０２／４０６７８号パンフレットの付録１に記載のタンパク質を含むのみならず、その任意の相同体、ならびに同様にα／β型のＳＡＳＰ活性を有する任意の他のタンパク質も含む。代わりの態様において、本明細書において使用される用語「ＳＡＳＰ」は、国際公開第０２／４０６７８号パンフレットの付録１に記載の任意のタンパク質、または国際公開第０２／４０６７８号パンフレットの付録１に記載のタンパク質の任意の１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９８％、もしくは９９％配列同一性を有する任意の相同体を指す。別の代替の態様において、本明細書において使用される用語「ＳＡＳＰ」は、国際公開第０２／４０６７８号パンフレットの付録１に記載の任意のタンパク質を指す。

ＳＡＳＰ遺伝子は、国際公開第０２／４０６７８号パンフレットの付録１に開示のＳＡＳＰをコードする遺伝子の任意の１つから選択されうる。好ましい構成において、ＳＡＳＰは、ＳＡＳＰ－Ｃである。ＳＡＳＰ－Ｃは、バチルス・メガテリウムに由来しうる。

ＳＡＳＰ遺伝子は、改変バクテリオファージが標的細菌に複数のコピーで存在する場合に、毒性レベルのＳＡＳＰの産生を促進するために十分に強力であることが都合がよい構成的プロモーターの制御下に存在することが好ましい。有用な構成的プロモーターには、ピルビン酸デヒドロゲナーゼＥ１成分αサブユニットのｐｄｈＡ、３０Ｓリボソームタンパク質Ｓ２のｒｐｓＢ、グルコース－６－リン酸イソメラーゼのｐｇｉ、およびフルクトースビスリン酸アルドラーゼ遺伝子プロモーターｆｄａが挙げられる。感染の際に活性な好ましい調節型プロモーターは、エラスターゼのｌａｓＢである。これらのプロモーターは、典型的には緑膿菌に由来する。これらのプロモーター配列と少なくとも９０％の配列同一性を示す配列を有するプロモーターも同様に使用することができる。

本発明は、一般的に多様な異なる標的細菌に感染するバクテリオファージに応用可能である。１つの構成において、標的細菌の少なくとも１つは、緑膿菌である。細菌の複数の異なる標的は、複数の異なるシュードモナス細菌であることが都合がよい。重要な標的は、緑膿菌である。

ＳＡＳＰｊｅｃｔベクターの必要条件は、それが最適な治療的使用のために特に溶菌性ではなく、ＳＡＳＰ発現に関してより長い時間枠を与えて、インビボでの治療時の急速な溶解の予防を可能にし、このように危険な炎症応答を引き起こしうる抗生物質耐性遺伝子および毒性細胞壁成分の起こりうる放出を制限する点であることから、偏性溶菌性ファージの使用が、ＳＡＳＰｊｅｃｔベクターとして適していないことはこれまで明白であると考えられていた。

本明細書に記述するアプローチは、これまで記述されたカクテルアプローチと比較して都合がよい。ＳＡＳＰｊｅｃｔベクターなどの改変バクテリオファージの混合物は、異なるＨＲＤまたはハイブリッドＨＲＤを有すること以外は、構造およびゲノム配列が同一である。１つの利点は、ＳＡＳＰｊｅｃｔの混合物の製造プロセスの制御が容易であることであり、これは薬剤調製の重要な態様である。プロセスは、ファージが同一またはほぼ同一の生物物理学的特性を共有することから、異種ＨＲＤを有するように改変されたファージに関して実質的に同じである。別の利点は、それぞれのベクターが構造的に同じまたは類似であることから、ＳＡＳＰｊｅｃｔベクターのインビボ特徴、たとえば薬物動態／薬物動力学が類似である可能性がある点である。

本発明において、ハイブリッドＨＲＤを有する極めて強力な偏性溶菌性バクテリオファージであるファージを作製できることが見出されている。意外にも、そのようなファージを使用して、これらのファージを非溶菌性および非生存にすることによって、ＳＡＳＰ遺伝子を挿入するかまたは溶菌遺伝子をＳＡＳＰ遺伝子に置換することによって、増強されたＳＡＳＰｊｅｃｔベクターを作製することができる。そのような改変にとって適したファージは、選択された細菌種に感染することができるファージに関してスクリーニングすることによって単離することができる。例として、代表的な緑膿菌株においてプラークを形成することができる環境起源由来のファージに関してスクリーニングすることによって、緑膿菌に感染するファージを単離することができる（Ｇｉｌｌ ａｎｄ Ｈｙｍａｎ、２０１０）。単離されたファージの全ゲノムをシークエンシングして、アノテーションを行ってもよい。ＨＲＤは、例としてファージＴ４、Ｔ５、およびＴ７において宿主細菌に対する最初の認識／結合を担うタンパク質であることが一般的に見出されている尾繊維タンパク質でありうる（Ｒａｋｈｕｂａら、２０１０）。あるいは、他のＨＲＤは基盤タンパク質でありうる。ＢＬＡＳＴ検索を使用して、公知の配列に対するファージゲノム中の全てのタンパク質の相同性を評価することによって、ファージゲノムを、可能性があるＨＲＤ配列に関して検索することができる。

本発明に従って、それぞれのＨＲＤは広い宿主域を有することが好ましい。これは、多様なコレクションまたは臨床単離体の５０％超、全体で少なくとも３５、好ましくは少なくとも４０、より好ましくは少なくとも４４、および最も好ましくは５０個超に感染する能力として定義されうる。そのような単離体は、ヨーロッパ、アメリカ、およびアジアを含む広範囲の地理的場所に由来しなければならず、多剤耐性（ＭＤＲ）株を含む広範囲の抗生物質耐性表現型を有しなければならず、ならびに血液、肺、および皮膚感染症から培養した株などの広範囲の感染部位に由来しなければならない。そのような単離体は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）およびＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＮＣＴＣ）などの公共の株コレクションから得ることができる。一般的に、それぞれの尾繊維タンパク質は、標的細菌に結合するためのＣ末端受容体結合領域と、Ｃ末端受容体結合領域をバクテリオファージの体部に結合させるＮ末端領域とを含む。Ｃ末端領域とＮ末端領域のそれぞれは異なるバクテリオファージに由来しうる。１つの構成において、Ｎ末端領域は、尾繊維タンパク質のアミノ酸１～６２８位を含み、Ｃ末端領域は尾繊維タンパク質のアミノ酸６２９～９６４位を含む。

Ｃ末端領域は、バクテリオファージＰｈｉ３３のＣ末端領域と９６％以下のアミノ酸配列同一性を有してもよく、バクテリオファージＰｈｉ３３、ＬＢＬ３、ＳＰＭ－１、Ｆ８、ＰＢ１、ＫＰＰ１２、ＬＭＡ２、ＳＮ、１４－１、ＪＧ０２４、ＮＨ－４、ＰＴＰ４７、Ｃ３６、ＰＴＰ９２、およびＰＴＰ９３のいずれか１つに由来しうる。Ｃ末端領域のアミノ酸配列同一性がより低いことが好ましい。配列同一性は、９０％未満であることが都合がよく、８０％未満であることがより都合がよく、好ましくは７０％未満、より好ましくは６０％未満、さらにより好ましくは５０％未満、特に好ましくは４０％未満、より特に好ましくは３０％未満である。Ｎ末端領域はバクテリオファージＰｈｉ３３のＮ末端領域と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有し、少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することが都合がよく、バクテリオファージＰｈｉ３３、ＬＢＬ３、ＳＰＭ－１、Ｆ８、ＰＢ１、ＫＰＰ１２、ＬＭＡ２、ＳＮ、１４－１、ＪＧ０２４、ＮＨ－４、ＰＴＰ４７、Ｃ３６、ＰＴＰ９２、およびＰＴＰ９３のいずれか１つに由来しうる。Ｎ末端領域とＣ末端領域は異なるバクテリオファージ尾繊維タンパク質に由来して、異種尾繊維タンパク質を提供してもよい。

Ｎ末端領域において９０％超の配列同一性を共有するファージ尾部タンパク質を同定することが都合がよい。例えば、緑膿菌株に対して広い宿主域を有するいくつかのファージ、Ｐｈｉ３３、ＰＴＰ４７、ＰＴＰ９２、およびＣ３６（これらのファージの全てが２６０株に対して分析した場合に６０％超に感染する）が、単離／同定されており、そのゲノムがシークエンシングされている。Ｐｈｉ３３、ＰＴＰ４７、ＰＴＰ９２、およびＣ３６のゲノム配列の分析により、それらが、２配列ＢＬＡＳＴアライメント後にＰｈｉ３３尾繊維アミノ酸１～６２８位（カッコ内はアミノ酸同一性）と比較すると、Ｎ末端領域において高レベルの配列同一性（＞９５％アミノ酸配列同一性）を有する推定の尾繊維タンパク質をコードする遺伝子を含有することが判明している：Ｃ３６（９６％）、ＰＴＰ４７（９８％）、ＰＴＰ９２（９７％）。ＢＬＡＳＴ検索により、これらの４つのファージは、共にＰＢ１様ファージのファミリーを形成する他の寄託された１０個のファージゲノム配列：ＰＢ１、ＳＰＭ１、Ｆ８、ＬＢＬ３、ＫＰＰ１２、ＬＭＡ２、ＳＮ、ＪＧ０２４、ＮＨ－４、１４－１に関連することが示されている（Ｃｅｙｓｓｅｎｓら、２００９）。これらの推定の尾繊維タンパク質の相同性を評価した。２配列ＢＬＡＳＴアライメント後にＰｈｉ３３尾繊維タンパク質と比較した（カッコ内はアミノ酸同一性）：ＬＢＬ３（９６％）、ＳＰＭ－１（９５％）、Ｆ８（９５％）、ＰＢ１（９５％）、ＫＰＰ１２（９４％）、ＬＭＡ２（９４％）、ＳＮ（８７％）、１４－１（８６％）、ＪＧ０２４（８３％）、ＮＨ－４（８３％）、Ｃ３６（９６％）、ＰＴＰ４７（８６％）、ＰＴＰ９２（８３％）。上記のファージの１４個全てのアライメントを図１３に示す。

これら１４個のファージ由来のアノテーションを行った尾繊維タンパク質の分析により、Ｐｈｉ３３尾繊維アミノ酸１～６２８位と同等のタンパク質のＮ末端領域が、１４個全てのタンパク質に関して９６～１００％の範囲で、その全長に対するこれらのタンパク質の配列同一性よりアミノ酸レベルでさらにより高いレベルの配列同一性を示すことが判明している。２配列ＢＬＡＳＴアライメント後に、Ｐｈｉ３３尾繊維タンパク質のＮ末端アミノ酸１～６２８位（カッコ内はアミノ酸同一性）と比較した：ＬＢＬ３（９６％）、ＳＰＭ－１（９６％）、Ｆ８（９６％）、ＰＢ１（９６％）、ＫＰＰ１２（９８％）、ＬＭＡ２（９９％）、ＳＮ（９９％）、１４－１（９７％）、ＪＧ０２４（９７％）、ＮＨ－４（９７％）、ＰＴＰ４７（９８％）、Ｃ３６（９６％）、ＰＴＰ９２（９７％）。しかし、Ｐｈｉ３３尾繊維アミノ酸６２９～９６４位と同等のタンパク質のＣ末端領域は、いくつかのタンパク質ではＮ末端領域ほど保存されず、配列同一性の範囲は、典型的に５７～９６％である。２配列ＢＬＡＳＴアライメント後、Ｐｈｉ３３尾繊維タンパク質のＣ末端アミノ酸６２９～９６４位（カッコ内はアミノ酸同一性）と比較した：ＬＢＬ３（９４％）、ＳＰＭ－１（９３％）、Ｆ８（９３％）、ＰＢ１（９４％）、ＫＰＰ１２（８７％）、ＬＭＡ２（８５％）、ＳＮ（６５％）、１４－１（６５％）、ＪＧ０２４（５７％）、ＮＨ－４（５７％）、ＰＴＰ４７（６４％）、Ｃ３６（９６％）、ＰＴＰ９２（５７％）。他の十分に特徴づけされたファージのファージ尾繊維の分析により、それらがＮ末端尾部基盤結合領域とＣ末端受容体結合領域とを有することが示されている（Ｖｅｅｓｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｍｂｉｌｌａｕ，２０１１）。プラークアッセイまたは増殖阻害試験を使用するそれらの細菌株宿主域の実験的分析において、ファージＰｈｉ３３、ＰＴＰ４７、ＰＴＰ９２、およびＣ３６は、重なり合うが同一ではない宿主域を有する（表１）。ファージ尾繊維のＣ末端領域の役割が細菌宿主受容体結合に関係しているという確立された証拠と、これらの４つのファージのＣ末端領域の配列多様性およびその類似であるが同一でない宿主域と共に考慮すると、Ｃ末端の多様性は、評価されるファージの宿主域に関連すると推定される。

本発明に従って、同種の尾繊維タンパク質の遺伝子を、Ｎ末端領域におけるその高レベルの配列同一性に基づいて、１つのファージから採取して別のファージに付加できること、元の尾繊維と置換できることがさらに提供される。Ｎ末端領域は、尾繊維のファージ尾部への結合に関係すると考えられており（Ｖｅｅｓｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｍｂｉｌｌａｕ，２０１１）、宿主域がドナーファージの尾繊維に関連する生存ファージを形成することができる。本明細書に記述される遺伝子などの尾繊維遺伝子を使用して、同種ドナーファージ尾繊維タンパク質由来の多様なＣ末端受容体結合領域と共に、レシピエントファージ由来の尾繊維の保存されたＮ末端尾部結合領域を有するハイブリッド尾繊維遺伝子を作製してもよい。そのような尾繊維ハイブリッド遺伝子を使用して、ファージの尾繊維を置換することができる。これは、（レシピエントファージ由来の）ハイブリッド尾繊維のＮ末端領域を提供して、宿主域がドナーファージ尾繊維のＣ末端受容体結合領域に関連する生存ファージを形成することができる。改変された尾繊維ハイブリッド遺伝子のレシピエントファージへの移植は、本発明において証明されている。標準的な分子遺伝学技術を使用して、Ｐｈｉ３３は、以下のファージ：ＰＴＰ９２、ＰＴＰ４７、ＬＢＬ３、ＳＰＭ－１、Ｆ８、ＰＢ１、ＫＰＰ１２、ＬＭＡ２、ＳＮ、１４－１、ＮＨ－４由来の異種尾繊維ハイブリッドを有するように改変されている。全ての改変ファージは、緑膿菌上で生存しており、プラークを形成できることが示されている（尾繊維ハイブリッドの命名は以下のとおりである：一例として、Ｐｈｉ３３のＮ末端尾部結合領域がＰＴＰ４７のＣ末端受容体結合領域とハイブリダイズしているハイブリッド遺伝子は、Ｐｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）である）。

１つのそのような改変ファージにおいて、その尾繊維遺伝子が、ＰＴＰ９２のＣ末端受容体結合領域を有するようにＰｈｉ３３を改変して、ＰＴＰ９３（Ｐｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ９２（Ｃ））を作製した。これを、３５個の多様な緑膿菌臨床単離体に対して宿主域を試験することによって、より詳細に評価した。前駆体ファージ（Ｐｈｉ３３）、尾繊維ドナー（ＰＴＰ９２）、およびハイブリッドファージ（ＰＴＰ９３）の宿主域を比較すると、ＰＴＰ９３ハイブリッドファージの宿主域は、Ｐｈｉ３３よりむしろ尾繊維ドナーファージ（ＰＴＰ９２）の宿主域と同等であるが、意外にもいくつかの例において、ＰＴＰ９３は、ＰＴＰ９２が感染することができない株に対してもＰｈｉ３３の宿主域を有し、このようにＰＴＰ９３が両方のファージの宿主域を受け継いでいることが見出された（表２）。ＰＴＰ９３は、Ｐｈｉ３３（７４％）またはＰＴＰ９２（６６％）より広い宿主域（９２％）を有する（表２）。ＰＴＰ９３は、それがその非改変状態で示される特徴をはるかに超える特徴を保有することから「極めて強力」であると考えることができる偏性溶菌性バクテリオファージの例である。そのような極めて強力なファージは、ＳＡＳＰｊｅｃｔベクターを作製するさらなる改変のために適している。

当業者による配列相同性の評価を通して、Ｐｈｉ３３は、ＰＢ１様ファージの群に入れることができ（Ｃｅｙｓｓｅｎｓら、２００９）、上記で与えられた定義によって広い宿主域のファージであると考えることができる。そのようなファージは、上記の方法によって単離することができる。Ｐｈｉ３３は、プロモーターの制御下でＳＡＳＰ遺伝子を導入する遺伝子改変にとって適している。そのような改変ファージは、単独でまたは他の改変バクテリオファージと併用して、感受性のある緑膿菌によって引き起こされる感染症の治療に使用するために適しているであろう。

本発明による好ましいアプローチは、それぞれが構成的プロモーターから発現されたＳＡＳＰ遺伝子を有するように改変され、それぞれのファージが自身の尾繊維遺伝子または尾繊維ハイブリッド遺伝子を有すること以外は遺伝的に同一であり、それによって溶菌遺伝子が不活化されている、１つまたは複数の偏性溶菌性ファージを使用することである。そのようなファージは、欠失された溶菌遺伝子をトランスに有する株において増殖させることができる。尾繊維遺伝子または尾繊維ハイブリッド遺伝子を作製するための尾繊維遺伝子の改変および提供にとって好ましい偏性溶菌性ファージは、他の単離または同定されたファージの尾繊維のＮ末端領域と比較してそのＮ末端領域に≧９０％のアミノ酸配列同一性を保有する予想タンパク質をコードする尾繊維遺伝子を有するファージである。この基準を満たす好ましい偏性溶菌性ファージは、Ｐｈｉ３３、ＰＴＰ９２、ＰＴＰ４７、ＬＢＬ３、ＳＰＭ－１、Ｆ８、ＰＢ１、ＫＰＰ１２、ＬＭＡ２、ＳＮ、１４－１、ＮＨ－４、ＰＴＰ９３、ＪＧ０２４、ＰＴＰ４７およびＣ３６である。そのようなファージは、単純なＰＣＲアッセイによって、単離されたファージのプラークを、尾部遺伝子のＮ末端領域の高度保存領域に対して特異的なプライマーによるＰＣＲに供することによって、同定することができる。そのようにして、全ゲノムシークエンシングを行うことなく、適したファージを同定することができる。ファージＰＢ１は、公共の株コレクションから得ることができる。そのような配列は、標準的な方法によってそのような配列を合成およびクローニングするために必要なまたはハイブリッド尾繊維配列を作製するために必要な情報を提供することができるＤＮＡ配列データベースまたは他のＤＮＡ配列ソースにおいて同定されうることから、尾繊維配列を生成するためにファージを単離または提供する必要はない。

改変にとって特に好ましいファージは、ＰＴＰ９３、Ｐｈｉ３３、ＰＴＰ９２、ＰＴＰ４７およびＣ３６である。特に好ましい極めて強力な偏性溶菌性ファージは、存在する尾繊維の代わりに尾繊維ハイブリッドＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ９２（Ｃ）を有するように改変されたＰｈｉ３３；存在する尾繊維の代わりに尾繊維ハイブリッドＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）を有するように改変されたＰｈｉ３３である。本発明の１つの態様において、Ｐｈｉ３３の好ましい極めて強力な非溶菌性ＳＡＳＰｊｅｃｔ誘導体には、存在する尾繊維の代わりに尾繊維ハイブリッドＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ９２（Ｃ）を有するように改変され、エンドライシン遺伝子の代わりに緑膿菌リボソームサブユニットタンパク質Ｓ２（ｒｐｓＢ）遺伝子プロモーターの制御下でバチルス・メガテリウム由来のＳＡＳＰ－Ｃを有する、Ｐｈｉ３３；存在する尾繊維の代わりに尾繊維ハイブリッドＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）を有するように改変され、エンドライシン遺伝子の代わりに緑膿菌リボソームサブユニットタンパク質Ｓ２（ｒｐｓＢ）遺伝子プロモーターの制御下でバチルス・メガテリウム由来のＳＡＳＰ－Ｃを有する、Ｐｈｉ３３；エンドライシン遺伝子の代わりに緑膿菌リボソームサブユニットタンパク質Ｓ２（ｒｐｓＢ）遺伝子プロモーターの制御下でバチルス・メガテリウム由来のＳＡＳＰ－Ｃを有するように改変されたＰｈｉ３３が挙げられる。１つの好ましい態様において、本発明は、共に調合された上記の３つのＳＡＳＰｊｅｃｔを含むまたはからなるＳＡＳＰｊｅｃｔの好ましい混合物を提供する。

本発明の特に好ましい態様において、Ｐｈｉ３３の極めて強力な非溶菌性ＳＡＳＰｊｅｃｔ誘導体には、存在する尾繊維の代わりに尾繊維ハイブリッドＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ９２（Ｃ）を有するように改変され、エンドライシン遺伝子の代わりに緑膿菌フルクトースビスリン酸アルドラーゼ（ｆｄａ）遺伝子プロモーターの制御下で緑膿菌での発現に関してコドン最適化されたバチルス・メガテリウム由来のＳＡＳＰ－Ｃを有する、Ｐｈｉ３３；存在する尾繊維の代わりに尾繊維ハイブリッドＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）を有するように改変され、エンドライシン遺伝子の代わりに、緑膿菌フルクトースビスリン酸アルドラーゼ（ｆｄａ）遺伝子プロモーターの制御下で、緑膿菌での発現に関してコドン最適化されたバチルス・メガテリウム由来のＳＡＳＰ－Ｃを有する、Ｐｈｉ３３；エンドライシン遺伝子の代わりに緑膿菌フルクトースビスリン酸アルドラーゼ（ｆｄａ）遺伝子プロモーターの制御下で緑膿菌での発現に関してコドン最適化されたバチルス・メガテリウム由来のＳＡＳＰ－Ｃを有するように改変されたＰｈｉ３３が挙げられる。特に好ましい態様において、本発明は、共に調合された上記の３つのＳＡＳＰｊｅｃｔを含むまたはからなるＳＡＳＰｊｅｃｔの混合物を提供する。

２つの非改変バクテリオファージと比較して、ｒｐｓＢ－ＳＡＳＰ－Ｃカセットを有するように改変されたＰｈｉ３３（ＰＴＰ１１４）と共にｒｐｓＢ－ＳＡＳＰ－Ｃカセットを有するように改変された３３（Ｎ）９２（Ｃ）尾繊維を有するＰｈｉ３３（ＰＴＰ１１０）の混合物としての有効性を、図１４に示す。ＰＴＰ１１０とＰＴＰ１１４の混合物は、３時間以内に生存細胞の＞３対数の低減をもたらし、Ｐｈｉ３３（約１．５対数の低減）およびＰＴＰ９２（低減なし）より有効である。

ＰＴ３．８と称する３つの改変バクテリオファージの混合物を構築して、その緑膿菌の殺菌能力を試験した。混合物は、エンドライシン溶菌遺伝子の代わりにｆｄａ－ＳＡＳＰ－Ｃ（緑膿菌コドン最適化配列）を有するように改変された、Ｐｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ９２（Ｃ）尾繊維を有するＰｈｉ３３（ＰＴＰ３８４）；エンドライシン溶菌遺伝子の代わりにｆｄａ－ＳＡＳＰ－Ｃ（緑膿菌コドン最適化配列）を有するように改変された、Ｐｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）尾繊維を有するＰｈｉ３３（ＰＴＰ３８５）；エンドライシン溶菌遺伝子の代わりにｆｄａ－ＳＡＳＰ－Ｃ（緑膿菌コドン最適化配列）を有するように改変された、Ｐｈｉ３３（Ｎ）Ｐｈｉ３３（Ｃ）尾繊維を有するＰｈｉ３３（ＰＴＰ２８４）からなる。

ＰＴ３．８の有効性を、緑膿菌株３５０３および基準株ＡＴＣＣ２７８５３の多剤耐性（ＭＤＲ）臨床単離体（気管単離部位、セフタジジム、ピペラシリン－タゾバクタム、およびイミペネムに対する抗生物質耐性）に対する２４時間の時間殺菌曲線実験において試験した。簡単に説明すると、５ｍＭ塩化カルシウム、５ｍＭ硫酸マグネシウム、および０．１％グルコースを補充したルリア・ベルタニ（ＬＢ）ブロス（ＬＣブロス）中で培養を設定して、３７℃で増殖させた。緑膿菌５×１０^５コロニー形成単位／ｍｌ（ｃｆｕ／ｍｌ）を、ＰＴ３．８の３×１０^９プラーク形成単位（ｐｆｕ／ｍｌ）または対照としての追加のＬＣブロス（無処置培養）と共にインキュベートした。試料を連続希釈するために０、１、２、４、６、および２４時間で採取して、ＬＣ寒天プレート上に播種した後、３２℃で一晩インキュベートした。いずれの株に関しても、生存細胞数は、処置後１時間以内に５×１０^５ｃｆｕ／ｍｌから検出限界（１０^２ｃｆｕ／ｍｌ）未満へと低減し、２４時間後では生存細胞は検出されなかった（図１５）。これに対し、無処置対照培養は、両方の株に関して５×１０^８～１×１０^９ｃｆｕ／ｍｌへと増殖した。このことは、ＰＴ３．８の緑膿菌の臨床単離体の殺菌能力を証明している。

上記のとおりであるが１時間以上行った別の時間殺菌曲線実験において、株３５０３の５×１０^５ｃｆｕ／ｍｌを、ＰＴ３．８の３×１０^９ｐｆｕ／ｍｌまたは対照としての追加のＬＣブロス（無処置培養）と共にインキュベートした。２分以降、生存細胞は検出できなかったが（検出限界＝１×１０^２ｃｆｕ／ｍｌ）、無処置対照培養は、１時間で１×１０^６ｃｆｕ／ｍｌであり、このように、市販の抗生物質と比較してＰＴ３．８の活性が迅速であることを証明した（図１６）。

ＰＴ３．８をマウス肺感染モデルにおいて試験した。簡単に説明すると、動物を麻酔した後、緑膿菌株ＡＴＣＣ２７８５３の７．５ｌｏｇ_１０ ｃｆｕの接種物を鼻腔内吸入によって投与した。感染の２時間後、マウスをＰＴ３．８（３×１０^１０ｐｆｕ）またはビヒクル（緩衝液）対照のいずれかの静脈内注射によって処置した。処置の２および２２時間後、マウスを二酸化炭素仮死によって安楽死させて、胸腔を開いて、肺を摘出し、重量を測定した。肺組織をトリプトンソーヤブロス（ＴＳＢ）中でホモジナイズして、肺組織中の生存細胞数を、連続希釈してセトリミド寒天プレート上での播種によって計数した。対照（無処置）群のマウスを感染の２時間後に安楽死させて、肺組織中の生存細胞を計数して、処置時間での肺組織中の生存細胞数を評価した。ＰＴ３．８処置マウスの肺組織１グラムあたりのｃｆｕ（ｃｆｕ／ｇ）は急速に低減し、マウスを処置した時間での生存細胞レベルと比較して処置後２時間で５対数値低減した（図１７）。処置後２２時間までに、ＰＴ３．８処置マウスの肺組織の生存細胞は、処置時間の計数より約４対数値低いままであり、同じ時間に採取したビヒクル処置マウスの肺組織より４～５対数値低いままであった。このことは、ＰＴ３．８のインビボでの有効性を証明している。

別の実施形態において、構成的プロモーターの制御下で溶菌遺伝子をＳＡＳＰに置換するかまたは不活化することによって、ＳＡＳＰｊｅｃｔを作製するように偏性溶菌性ファージを改変することができ、尾繊維遺伝子を完全に欠失させることができる。そのようなファージは、尾繊維遺伝子または尾繊維ハイブリッド遺伝子をトランスに発現し、溶菌遺伝子をトランスに発現する株で増殖させなければならない。そのような例において、そのような株のＳＡＳＰｊｅｃｔ子孫は、増殖株に由来する１つの尾繊維を有するが、なおもそのゲノムにいかなる尾繊維または尾繊維ハイブリッド遺伝子も欠如するであろう。いくつかのそのような増殖株を構築して、それぞれにおいて同じ尾繊維欠失ＳＡＳＰｊｅｃｔを発現させることができる。このようにして、それぞれが、異なる尾繊維または尾繊維ハイブリッドタンパク質を有する、いくつかの異なるＳＡＳＰｊｅｃｔ誘導体を作製することができる。これらのＳＡＳＰｊｅｃｔを使用して、混合物を調合することができる。

別の実施形態において、溶菌遺伝子の代わりに構成的プロモーターから発現されたＳＡＳＰ遺伝子を有する、または溶菌遺伝子を不活化するように改変された偏性溶菌性ファージを、適したプロモーターの制御下でハイブリッド尾繊維タンパク質の遺伝子をトランスに有し、適したプロモーターからトランスに発現された溶菌遺伝子を有する宿主株において増殖させてもよい。尾繊維ハイブリッド遺伝子にとって適したプロモーターは、ファージプロモーター、特に改変された偏性溶菌性ファージにおいて尾繊維遺伝子の発現を促進するプロモーターでありうる。他の適したプロモーターは、その同族の調節タンパク質と共に、ｌａｃおよびｔｒｐなどの誘導型プロモーターである。溶菌遺伝子にとって適したプロモーターは、ファージプロモーター、特に改変された偏性溶菌性ファージにおいて溶菌遺伝子の発現を通常促進するプロモーターである。他の適したプロモーターはその同族の調節タンパク質と共にｌａｃおよびｔｒｐなどの誘導型プロモーターである。そのような株から得られたＳＡＳＰｊｅｃｔ子孫は、極めて強力で非溶菌性であり、その株からトランスに発現された尾繊維ハイブリッド、ならびに自身の尾繊維を有する。あるいは、尾繊維遺伝子または尾繊維ハイブリッド遺伝子がトランスに発現され、溶菌遺伝子がトランスに発現される株を増殖のために使用して、誘導体ＳＡＳＰｊｅｃｔを形成することができる限り、偏性溶菌性ファージから尾繊維遺伝子を完全に欠失させてもよい。そのような例において、そのような株からのＳＡＳＰｊｅｃｔの子孫は、複数の尾繊維を有するが、それらのゲノムにいかなる尾繊維または尾繊維ハイブリッド遺伝子も欠如する。

さらなる態様において、本発明は、本明細書において定義される改変バクテリオファージまたはその混合物とその担体とを含む、細菌細胞増殖を阻害または予防するための組成物を提供する。改変バクテリオファージは、標的細菌に対して毒性であるＳＡＳＰをコードするＳＡＳＰ遺伝子を含み、非溶菌性である、標的細菌に感染することができる少なくとも１つの他の改変バクテリオファージとの混合物として提供されうる。少なくとも１つの他の改変バクテリオファージは、複数の異なるＨＲＤを発現してもよく、または発現しなくてもよい。そのような組成物は、広範囲の用途を有し、したがって意図される用途に従って調合される。組成物は、薬剤、特にヒト治療のための薬剤として調合されてもよく、細菌感染症を含む様々な状態を治療しうる。本発明に従って治療可能な感染症は、血流中の感染症、局所感染症、虫歯を含む口腔内感染症、呼吸器感染症、および眼の感染症を含む、局所組織および臓器の感染症、または多臓器感染症である。担体は、薬学的に許容されるレシピエントまたは希釈剤でありうる。そのような組成物の成分の正確な性質および量は、経験的に決定され、組成物の投与経路に一部依存するであろう。

レシピエントに対する投与経路には、静脈内、動脈内、経口、口腔内、舌下、鼻腔内、吸入、局所（眼科を含む）、筋肉内、皮下、および関節内が挙げられる。使用の便宜上、本発明による投薬量は、治療または予防される感染症の部位およびタイプに依存する、呼吸器感染症は吸入投与によって治療され、眼の感染症は点眼液を使用して治療されうる。改変バクテリオファージを含有する口腔内衛生製品も同様に提供される。歯垢の形成に関連する細菌を消失させるように調合された、本発明による改変バクテリオファージを含有するマウスウォッシュまたは練り歯磨きを使用してもよい。

本発明による改変バクテリオファージまたはその混合物は、例えば表面細菌汚染の処理ならびに土壌の改良または水の処理における除菌剤として使用されうる。バクテリオファージは、医療従事者および／または患者の処置において、例えばハンドウォッシュ中の除菌剤として使用されうる。特に病院での技法または食品調製で使用される作業表面および機器の処置も同様に提供される。１つの特定の実施形態は、１人の個体から他の個体への細菌の伝達および汚染を予防、消失、または低減するために、局所使用のために調合された組成物を含む。これは、特に従来の抗生物質に対する耐性菌が流行している病院の環境において微生物感染症の伝播を制限するために重要である。そのような使用に関して、改変バクテリオファージを、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水に含めてもよく、またはゲルもしくはクリームに調合してもよい。何回も使用する場合、保存剤を添加してもよい。あるいは、製品を凍結乾燥して、賦形剤、例えばスクロースなどの糖を添加してもよい。

本発明を、単なる例として、および添付の図面を参照してより詳細に記述する。

ｌａｃＺ△Ｍ１５およびＰｈｉ３３エンドライシンを含有するプラスミドの構築を示す概略図（その１）である。 ｌａｃＺ△Ｍ１５およびＰｈｉ３３エンドライシンを含有するプラスミドの構築を示す概略図（その２）である。 ｌａｃＺ△Ｍ１５およびＰｈｉ３３エンドライシンを含有するプラスミドの構築を示す概略図（その３）である。 置換された尾繊維部分を有するプラスミドの構築を示す概略図（その１）である。 置換された尾繊維部分を有するプラスミドの構築を示す概略図（その２）である。 置換された尾繊維部分を有するプラスミドの構築を示す概略図（その３）である。 置換された尾繊維部分を有するプラスミドの構築を示す概略図（その４）である。 ハイブリッド尾繊維遺伝子を有するファージの構築を示す概略図（その１）であり、これは、後に本発明に従ってエンドライシンをＳＡＳＰ－Ｃに置換するように改変されうる。 ハイブリッド尾繊維遺伝子を有するファージの構築を示す概略図（その２）であり、これは、後に本発明に従ってエンドライシンをＳＡＳＰ－Ｃに置換するように改変されうる。 ハイブリッド尾繊維遺伝子を有するファージの構築を示す概略図（その３）であり、これは、後に本発明に従ってエンドライシンをＳＡＳＰ－Ｃに置換するように改変されうる。 ハイブリッド尾繊維遺伝子を有するファージの構築を示す概略図（その４）であり、これは、後に本発明に従ってエンドライシンをＳＡＳＰ－Ｃに置換するように改変されうる。 さらなるハイブリッド尾繊維遺伝子を有するファージの構築を示す概略図（その１）であり、これは、後に本発明に従ってエンドライシンをＳＡＳＰ－Ｃに置換するように改変されうる。 さらなるハイブリッド尾繊維遺伝子を有するファージの構築を示す概略図（その２）であり、これは、後に本発明に従ってエンドライシンをＳＡＳＰ－Ｃに置換するように改変されうる。 さらなるハイブリッド尾繊維遺伝子を有するファージの構築を示す概略図（その３）であり、これは、後に本発明に従ってエンドライシンをＳＡＳＰ－Ｃに置換するように改変されうる。 さらなるハイブリッド尾繊維遺伝子を有するファージの構築を示す概略図（その４）であり、これは、後に本発明に従ってエンドライシンをＳＡＳＰ－Ｃに置換するように改変されうる。 ｌａｃＺαマーカーが除去されている、ハイブリッド尾繊維遺伝子を有するバクテリオファージの構築を示す概略図（その１）である。 ｌａｃＺαマーカーが除去されている、ハイブリッド尾繊維遺伝子を有するバクテリオファージの構築を示す概略図（その２）である。 エンドライシン遺伝子がＳＡＳＰ－Ｃに置換されているプラスミドの構築を示す概略図（その１）である。 エンドライシン遺伝子がＳＡＳＰ－Ｃに置換されているプラスミドの構築を示す概略図（その２）である。 エンドライシン遺伝子がＳＡＳＰ－Ｃに置換されているプラスミドの構築を示す概略図（その３）である。 エンドライシン遺伝子がＳＡＳＰ－Ｃに置換されているプラスミドの構築を示す概略図（その４）である。 本発明によるさらなるバクテリオファージの産生を示す概略図（その１）である。 本発明によるさらなるバクテリオファージの産生を示す概略図（その２）である。 エンドライシン遺伝子が、緑膿菌での発現に関してコドン最適化されたＳＡＳＰ－Ｃに置換されているプラスミドの構築を示す概略図（その１）である。 エンドライシン遺伝子が、緑膿菌での発現に関してコドン最適化されたＳＡＳＰ－Ｃに置換されているプラスミドの構築を示す概略図（その２）である。 エンドライシン遺伝子が、緑膿菌での発現に関してコドン最適化されたＳＡＳＰ－Ｃに置換されているプラスミドの構築を示す概略図（その３）である。 エンドライシン遺伝子が、緑膿菌での発現に関してコドン最適化されたＳＡＳＰ－Ｃに置換されているプラスミドの構築を示す概略図（その４）である。 緑膿菌での発現に関してコドン最適化されているバチルス・メガテリウム株ＫＭ（ＡＴＣＣ １３６３２）由来のＳＡＳＰ－Ｃ遺伝子の配列を示す図である。 エンドライシン遺伝子が、緑膿菌での発現に関してコドン最適化されているＳＡＳＰ－Ｃに置換されているバクテリオファージの構築を示す概略図（その１）である。 エンドライシン遺伝子が、緑膿菌での発現に関してコドン最適化されているＳＡＳＰ－Ｃに置換されているバクテリオファージの構築を示す概略図（その２）である。 エンドライシン遺伝子が、緑膿菌での発現に関してコドン最適化されているＳＡＳＰ－Ｃに置換されているバクテリオファージの構築を示す概略図（その３）である。 エンドライシン遺伝子が、緑膿菌での発現に関してコドン最適化されているＳＡＳＰ－Ｃに置換されているバクテリオファージの構築を示す概略図（その４）である。 本発明によるさらなるバクテリオファージの産生を示す概略図（その１）である。 本発明によるさらなるバクテリオファージの産生を示す概略図（その２）である。 本発明によるさらなるバクテリオファージの産生を示す概略図（その３）である。 本発明によるさらなるバクテリオファージの産生を示す概略図（その４）である。 本発明によるさらなるバクテリオファージの産生を示す概略図（その１）である。 本発明によるさらなるバクテリオファージの産生を示す概略図（その２）である。 ファージＳＰＭ－１、Ｆ８、ＰＢ１、Ｃ３６、ＬＢＬ３、Ｐｈｉ３３、ＬＭＡ２、ＫＰＰ１２、ＪＧ０２４、ＰＴＰ９２、ＮＨ－４、１４－１、ＰＴＰ４７、ＳＮ由来の尾繊維遺伝子のＣＬＵＳＴＡＬ２．１マルチプル配列アライメント（その１）である。 ファージＳＰＭ－１、Ｆ８、ＰＢ１、Ｃ３６、ＬＢＬ３、Ｐｈｉ３３、ＬＭＡ２、ＫＰＰ１２、ＪＧ０２４、ＰＴＰ９２、ＮＨ－４、１４－１、ＰＴＰ４７、ＳＮ由来の尾繊維遺伝子のＣＬＵＳＴＡＬ２．１マルチプル配列アライメント（その２）である。 ファージＳＰＭ－１、Ｆ８、ＰＢ１、Ｃ３６、ＬＢＬ３、Ｐｈｉ３３、ＬＭＡ２、ＫＰＰ１２、ＪＧ０２４、ＰＴＰ９２、ＮＨ－４、１４－１、ＰＴＰ４７、ＳＮ由来の尾繊維遺伝子のＣＬＵＳＴＡＬ２．１マルチプル配列アライメント（その３）である。 ファージＳＰＭ－１、Ｆ８、ＰＢ１、Ｃ３６、ＬＢＬ３、Ｐｈｉ３３、ＬＭＡ２、ＫＰＰ１２、ＪＧ０２４、ＰＴＰ９２、ＮＨ－４、１４－１、ＰＴＰ４７、ＳＮ由来の尾繊維遺伝子のＣＬＵＳＴＡＬ２．１マルチプル配列アライメント（その４）である。 ファージＳＰＭ－１、Ｆ８、ＰＢ１、Ｃ３６、ＬＢＬ３、Ｐｈｉ３３、ＬＭＡ２、ＫＰＰ１２、ＪＧ０２４、ＰＴＰ９２、ＮＨ－４、１４－１、ＰＴＰ４７、ＳＮ由来の尾繊維遺伝子のＣＬＵＳＴＡＬ２．１マルチプル配列アライメント（その５）である。 Ｐｈｉ３３、ＰＴＰ９２、およびＰＴＰ１１０とＰＴＰ１１４の混合物による緑膿菌の殺菌の棒グラフを示す。 緑膿菌株３５０３（Ａ）およびＡＴＣＣ ２７８５３（Ｂ）に対するＰＴ３．８のインビボ有効性を示す２４時間の時間殺菌曲線を示す。 緑膿菌株３５０３に対するＰＴ３．８のインビトロ有効性を示す６０分間の時間殺菌曲線を示す。 マウス肺感染症モデルにおけるＰＴ３．８のインビボ有効性を示す。

図１３はファージＳＰＭ－１、Ｆ８、ＰＢ１、Ｃ３６、ＬＢＬ３、Ｐｈｉ３３、ＬＭＡ２、ＫＰＰ１２、ＪＧ０２４、ＰＴＰ９２、ＮＨ－４、１４－１、ＰＴＰ４７、ＳＮ由来の尾繊維遺伝子のＣＬＵＳＴＡＬ２．１マルチプル配列アライメントである。

図１４はＰｈｉ３３、ＰＴＰ９２、およびＰＴＰ１１０とＰＴＰ１１４の混合物による緑膿菌の殺菌の棒グラフを示す。

図１５は緑膿菌株３５０３（Ａ）およびＡＴＣＣ ２７８５３（Ｂ）に対するＰＴ３．８のインビボ有効性を示す２４時間の時間殺菌曲線。培養物を、５ｍＭ塩化カルシウム、５ｍＭ硫酸マグネシウム、および０．１％グルコースを補充したルリア・ベルタニ（ＬＢ）ブロスにおいて３７℃で増殖させた。

図１６は緑膿菌株３５０３に対するＰＴ３．８のインビトロ有効性を示す６０分間の時間殺菌曲線。培養物を、５ｍＭ塩化カルシウム、５ｍＭ硫酸マグネシウム、および０．１％グルコースを補充したルリア・ベルタニ（ＬＢ）ブロスにおいて３７℃で増殖させた。

図１７はマウス肺感染症モデルにおけるＰＴ３．８のインビボ有効性。「０時間」と標識される線は、ビヒクル（１ｍＭ硫酸マグネシウム、１０ｍＭ塩化カルシウム、および１０体積％グリセロールを含有するトリス緩衝生理食塩水）、またはＰＴ３．８（緑膿菌の感染後２時間）のいずれかによる処置時間での肺組織における生存細胞数を示す。処置後２および２２時間での生存細胞数を、各群の各動物に関して示す（群のサイズ＝６）、それぞれのデータセットの幾何平均を水平線で表す。２２時間のビヒクル群に関して、正確な値を確認できたのは動物６匹中３匹に過ぎず、他の３匹の動物の生存細胞数は、＞１０^１１ｃｆｕ／ｍｌであった。

（個々のファージまたはそれぞれのタイプのファージが１つの異なる尾繊維を有するファージの混合物内の１つの尾繊維を含む一般的な産物）
溶菌性バクテリオファージを非溶菌性にするための、および溶菌性バクテリオファージが、３０Ｓリボソームサブユニットタンパク質Ｓ２遺伝子（ｒｐｓＢ）の発現を通常制御するプロモーターの制御下でＳＡＳＰ－Ｃに加えて、多数の可能性がある尾繊維変種を有するようにする遺伝子改変の概要。

相同組み換えを使用して、ファージゲノムから遺伝子を除去および付加することができる。外来遺伝子およびプロモーターを有するファージを構築することができるいくつかの方法があり、以下はそのような方法の例である。

Ｐｈｉ３３誘導体の構築に関して、単なる例として、大腸菌／緑膿菌の広い宿主域のベクターを使用して、バクテリオファージゲノムに存在する尾繊維または尾繊維の一部を、相同組み換えによって異なるバクテリオファージ由来の代替の尾繊維または尾繊維部分に置換する方法が示される。同様に、単なる例として、得られたファージを非溶菌性にする方法、および緑膿菌ｒｐｓＢプロモーターの制御下でＢ・メガテリウム由来のＳＡＳＰ－Ｃ遺伝子、または緑膿菌ｆｄａプロモーターの制御下で緑膿菌での発現に関してコドン最適化されたＢ・バクテリウム由来のＳＡＳＰ－Ｃ遺伝子などのさらなるＤＮＡ配列を、相同組み換えによりバクテリオファージゲノムに付加しうる方法も示される。

代替ファージ由来の尾繊維遺伝子または尾繊維遺伝子の一部を、広い宿主範囲の大腸菌／緑膿菌ベクターにおいてｌａｃＺα遺伝子マーカーと共にネイティブ尾繊維またはその一部に隣接するＰｈｉ３３ ＤＮＡの２つの領域の間にクローニングすることができる。このプラスミドを緑膿菌に導入して、得られた株にＰｈｉ３３を感染させてもよい。子孫ファージの回収後、ネイティブＰｈｉ３３尾繊維または尾繊維の一部が、新しい尾繊維または尾繊維の一部およびｌａｃＺαに置換されている二重組み換え体を、β－ガラクトシダーゼの作用を検出する色素生成基質を含有する培地を使用して、適した緑膿菌（ｌａｃＺ△Ｍ１５^＋）宿主株でのプラーク形成によって単離することができる。

次のステップにおいて、既に記述された尾繊維領域組み換えプラスミドのｌａｃＺαマーカーを含まないバージョンを作製すること、新しいプラスミドを適した緑膿菌宿主株に導入すること、およびｌａｃＺαマーカーと共に、対応する代替尾繊維遺伝子またはその一部を有するＰｈｉ３３の既に改変されたバクテリオファージ誘導体を感染させることによって、バクテリオファージゲノムからｌａｃＺαマーカーを除去することができる。新しい尾繊維または尾繊維の一部を保持するが、ｌａｃＺαが除去されている組み換え体を、β－ガラクトシダーゼの作用を検出する色素生成基質を含有する培地を使用して、適した緑膿菌（ｌａｃＺ△Ｍ１５^＋）宿主株でのプラーク形成によって単離することができる。

次のステップにおいて、類似の相同組み換えを使用して、Ｐｈｉ３３もしくは既に記述されたＰｈｉ３３誘導体のいずれか、または類似のバクテリオファージもしくは類似の誘導体のエンドライシン遺伝子を、組み換え型ファージの同定のための大腸菌ｌａｃＺαレポーター遺伝子を同時に付加しながら、緑膿菌ｒｐｓＢプロモーターの制御下でＳＡＳＰ－Ｃ遺伝子に置換することができる。ｒｐｓＢプロモーターによって制御されるＳＡＳＰ－Ｃと、大腸菌ｌａｃＺα対立遺伝子とからなる領域を、広い宿主域の大腸菌／緑膿菌ベクターにおいてエンドライシン遺伝子に隣接するＰｈｉ３３の２つの領域の間にクローニングしてもよい。このプラスミドを適した緑膿菌（エンドライシン^＋ｌａｃＺ△Ｍ１５^＋）株に伝達して、得られた株にＰｈｉ３３または既に構築されたＰｈｉ３３誘導体（そこから最初のｌａｃＺαマーカーが除去される）を感染させることができる。子孫ファージを回収して、緑膿菌（エンドライシン^＋ｌａｃＺ△Ｍ１５^＋）でのプラーク形成によって二重組み換え体を同定し、β－ガラクトシダーゼの作用を検出する色素生成基質を含有する培地上で新しいｌａｃＺαレポーターの獲得を調べることができる。

代替の次のステップにおいて、類似の相同組み換えを使用して、Ｐｈｉ３３または既に記述されたＰｈｉ３３誘導体、または類似のバクテリオファージもしくは類似の誘導体のいずれかのエンドライシン遺伝子を、組み換え型ファージの同定のための大腸菌ｌａｃＺαレポーター遺伝子を同時に付加しながら、緑膿菌ｆｄａプロモーターの制御下で、緑膿菌での発現に関してコドン最適化されているＳＡＳＰ－Ｃ遺伝子に置換することができる。ｆｄａプロモーターによって制御されるコドン最適化されたＳＡＳＰ－Ｃと、大腸菌ｌａｃＺα対立遺伝子とからなる領域を、広い宿主域の大腸菌／緑膿菌ベクターにおいてエンドライシン遺伝子に隣接するＰｈｉ３３の２つの領域の間にクローニングすることができる。このプラスミドを適した緑膿菌（エンドライシン^＋ｌａｃＺ△Ｍ１５^＋）株に伝達して、得られた株にＰｈｉ３３または既に構築されたＰｈｉ３３誘導体（そこから最初のｌａｃＺαマーカーが除去される）を感染させることができる。子孫ファージを回収して、緑膿菌（エンドライシン^＋ｌａｃＺ△Ｍ１５^＋）でのプラーク形成によって二重組み換え体を同定し、β－ガラクトシダーゼの作用を検出する色素生成基質を含有する培地において新しいｌａｃＺαレポーターの獲得を調べることができる。

改変されるこれらのバクテリオファージは、溶菌性（テンペレートではなくて）であることから、バクテリオファージ構築に関して記述されるこれらのステップには、所望の組み換え型バクテリオファージのｌａｃＺα、または△エンドライシン、ｌａｃＺα表現型を相補するために、細菌ゲノムにおける適した位置で大腸菌ｌａｃＺ△Ｍ１５遺伝子、または細菌ゲノムにおける適した位置でＰｈｉ３３エンドライシン遺伝子と大腸菌ｌａｃＺ△Ｍ１５の両方のいずれかを有する適した宿主緑膿菌株を構築することが他にも必要である。一例として、これらの緑膿菌株の構築は、緑膿菌において複製することができない大腸菌ベクターを使用して相同組み換えによって達成されうる。エンドライシンおよびｌａｃＺ△Ｍ１５トランスジーンを挿入するためのゲノム位置は、必須の遺伝子が影響を受けないように、および隣接する遺伝子の発現に対する極性効果を通して望ましくない表現型が生成されないように選択しなければならない。一例として、１つのそのような位置は、緑膿菌株ＰＡＯ１ ｐｈｏＡ相同体のすぐ下流でありうる。

大腸菌ｌａｃＺ△Ｍ１５対立遺伝子を、緑膿菌において複製できない大腸菌ベクターにおいて、ｐｈｏＡの３’末端に隣接する緑膿菌株ＰＡＯ１ゲノムＤＮＡの２つの領域の間にクローニングすることができる。このプラスミドを緑膿菌に導入して、ゲノムに全プラスミドを組み込むために１回の相同組み換えを受けている単離体をテトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）の獲得に従って選択することができる。次に２回目の相同組み換え事象を受けた単離体（ｌａｃＺ△Ｍ１５^＋）を、１０％スクロース（プラスミド骨格に存在するｓａｃＢカウンターセレクタブルマーカーを利用して）を含有する培地で単離することができる。

Ｐｈｉ３３エンドライシン遺伝子および大腸菌ｌａｃＺ△Ｍ１５対立遺伝子を、緑膿菌において複製できない大腸菌ベクターにおいて、ｐｈｏＡの３’末端に隣接する緑膿菌株ＰＡＯ１ゲノムＤＮＡの２つの領域の間にクローニングすることができる。このプラスミドを緑膿菌に導入して、ゲノムに全プラスミドを組み込むために１回の相同組み換えを受けている単離体をテトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）の獲得に従って選択することができる。次に２回目の相同組み換え事象を受けた単離体（エンドライシン^＋ｌａｃＺ△Ｍ１５^＋）を、１０％スクロース（プラスミド骨格に存在するｓａｃＢカウンターセレクタブルマーカーを利用して）を含有する培地で単離することができる。

次のステップにおいて、類似の相同組み換えを使用して、緑膿菌ｒｐｓＢプロモーターの制御下でエンドライシン遺伝子をＳＡＳＰ－Ｃ遺伝子に置換するように改変されている既に記述された（ｌａｃＺα^＋）Ｐｈｉ３３誘導体からｌａｃＺαマーカーを除去することができる。ｒｐｓＢプロモーターによって制御されるＳＡＳＰ－Ｃからなる領域を、広い宿主域の大腸菌／緑膿菌ベクターにおいて、エンドライシン遺伝子に隣接するＰｈｉ３３の２つの領域の間にクローニングすることができる。このプラスミドを、既に構築された緑膿菌（エンドライシン^＋ｌａｃＺ△Ｍ１５^＋）株に伝達してもよく、得られた株に、緑膿菌ｒｐｓＢプロモーターの制御下でエンドライシン遺伝子をＳＡＳＰ－Ｃ遺伝子に置換するように改変されている既に記述された（ｌａｃＺα^＋）Ｐｈｉ３３誘導体を感染させることができる。子孫ファージを回収して、緑膿菌（エンドライシン^＋ｌａｃＺ△Ｍ１５^＋）上でのプラーク形成によって二重組み換え体を同定し、β－ガラクトシダーゼの作用を検出する色素生成基質を含有する培地上でｌａｃＺαレポーターの喪失を調べることができる。

代替の次のステップにおいて、類似の相同組み換えを使用して、エンドライシン遺伝子を、緑膿菌ｆｄａプロモーターの制御下で、緑膿菌での発現に関してコドン最適化されたＳＡＳＰ－Ｃ遺伝子に置換するように改変されている既に記述された（ｌａｃＺα^＋）Ｐｈｉ３３誘導体から、ｌａｃＺαマーカーを除去することができる。ｆｄａプロモーターによって制御される緑膿菌での発現に関してコドン最適化されたＳＡＳＰ－Ｃからなる領域を、広い宿主域の大腸菌／緑膿菌ベクターにおいて、エンドライシン遺伝子に隣接するＰｈｉ３３の２つの領域の間にクローニングすることができる。このプラスミドを、適した緑膿菌（エンドライシン^＋ｌａｃＺ△Ｍ１５^＋）株に伝達して、得られた株に、エンドライシン遺伝子を、緑膿菌ｆｄａプロモーターの制御下で緑膿菌での発現に関してコドン最適化されたＳＡＳＰ－Ｃ遺伝子に置換するように改変されている既に記述された（ｌａｃＺα^＋）Ｐｈｉ３３誘導体を感染させることができる。子孫ファージを回収して、緑膿菌（エンドライシン^＋ｌａｃＺ△Ｍ１５^＋）上でのプラーク形成によって二重組み換え体を同定し、β－ガラクトシダーゼの作用を検出する色素生成基質を含有する培地上でｌａｃＺαレポーターの喪失を調べることができる。

（実験技法）
クローニング目的でＤＮＡを生成するためのＰＣＲ反応は、プライマーの融解温度（Ｔ_ｍ）に応じて、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ Ｆｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、製造元の説明書に従って実施することができる。スクリーニング目的のＰＣＲ反応は、プライマーの融解温度（Ｔ_ｍ）に応じて、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用して、製造元の説明書に従って実施することができる。特に明記していない限り、制限酵素消化、アガロースゲル電気泳動、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ依存的ライゲーション、コンピテント細胞の調製および形質転換などの一般的な分子生物学技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）に記述される方法に基づくことができる。酵素は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓまたはＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入することができる。ＤＮＡは、酵素反応から精製して、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＡ精製キットを使用して細胞から調製することができる。プラスミドは、接合ヘルパー株である大腸菌ＨＢ１０１（ｐＲＫ２０１３）によって媒介される接合によって大腸菌株から緑膿菌株に伝達することができる。β－ガラクトシダーゼの色素生成基質であるＳ－ｇａｌはＳｉｇｍａ（Ｓ９８１１）から購入することができ、これはβ－ガラクトシダーゼによる消化によって、鉄イオンとキレートを形成すると黒色の沈殿物を形成する。

プライマーは、Ｓｉｇｍａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅから得ることができる。プライマーが制限酵素の認識配列を含む場合、ＰＣＲ増幅ＤＮＡの消化を確実にするために、さらなる２～６ヌクレオチドを５’末端に付加することができる。

クローニングは全て、特に明記していない限り、他所で記述されるように（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによってＤＮＡを一晩ライゲートした後、ＤＨ５αまたはＴＯＰ１０などの大腸菌クローニング株にそれらを形質転換して、選択培地で単離することによって行うことができる。

ｐＳＭ１０８０などの広い宿主域の大腸菌／緑膿菌ベクターを使用して、大腸菌と緑膿菌の間で遺伝子を伝達することができる。ｐＳＭ１０８０は、ｐＲＫ２由来の、緑膿菌プラスミドからの広い宿主域の複製開始点ｏｒｉＴ、プラスミドｐＲＫ４１５由来の、大腸菌および緑膿菌の両方で使用するためのｔｅｔＡＲ選択可能マーカー、ならびにプラスミドｐＵＣ１９由来の、高コピー数の大腸菌複製開始点ｏｒｉＶを結合させることによって既に産生された。

緑膿菌において複製することができない大腸菌ベクターｐＳＭ１１０４を使用して、対立遺伝子交換によって緑膿菌変異体を生成することができる。ｐＳＭ１１０４は、ｐＲＫ２由来のｏｒｉＴ、プラスミドｐＲＫ４１５由来の、大腸菌および緑膿菌の両方で使用するためのｔｅｔＡＲ選択可能マーカー、プラスミドｐＵＣ１９由来の高コピー数の大腸菌複製開始点ｏｒｉＶ、ならびに枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株１６８由来のｓａｃＢ遺伝子を、カウンターセレクタブルマーカーとして使用するために、強力なプロモーターの制御下で結合させることによって既に産生された。

（Ｐｈｉ３３様ファージ（ＰＢ１様ファージファミリー）保存Ｎ末端尾繊維領域のＰＣＲによる検出）
１．実験的ファージ試料中のＰｈｉ３３様ファージ様尾繊維遺伝子を検出するためのプライマーは、以下のように設計することができる。

シークエンシングされた全てのＰｈｉ３３様ファージ（Ｐｈｉ３３、ＰＢ１、ＮＨ－４、１４－１、ＬＭＡ２、ＫＰＰ１２、ＪＧ０２４、Ｆ８、ＳＰＭ－１、ＬＢＬ３、ＰＴＰ４７、Ｃ３６、ＰＴＰ９２、およびＳＮを含む）からの尾繊維遺伝子のＤＮＡ配列を、ＥＢＩのウェブサイトで入手可能なＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを使用して整列させることができ、このようにして遺伝子の５’配列にマップされる長さがおよそ２ｋｂの高度保存領域を同定することができる（ＰＢ１ゲノム配列における位置３１６８０～３３５５７位、受託番号ＥＵ７１６４１４）。１１個の尾繊維遺伝子配列における１００％同一性の部分は、肉眼での検分によって同定することができる。選択された絶対的保存領域を標的として、１ｋｂ以下のＰＣＲ産物を増幅するＰＣＲプライマーの３つのペアは、以下のように選択することができる：長さ１９４ｂｐの領域を定義するペアＢ４５００とＢ４５０１；長さ７７４ｂｐの領域を定義するペアＢ４５０２とＢ４５０３；および長さ３６５ｂｐの領域を定義するペアＢ４５０４とＢ４５０５。

プライマーＢ４５００は、ＰＢ１ファージゲノム（受託番号ＥＵ７１６４１４）の３１６８０～３１６９７位の範囲の配列からなる。プライマーＢ４５０１は、ＰＢ１ファージゲノム（受託番号ＥＵ７１６４１４）の３１８５１位～３１８７２位の範囲の配列からなる。Ｂ４５０２は、ＰＢ１ファージゲノム（受託番号ＥＵ７１６４１４）の３１７８５～３１８０４位の範囲の配列からなる。プライマーＢ４５０３は、ＰＢ１ファージゲノム（受託番号ＥＵ７１６４１４）の３２５４１～３２５５８位の範囲の配列からなる。プライマーＢ４５０４は、ＰＢ１ファージゲノム（受託番号ＥＵ７１６４１４）の３２８６８～３２８８８位の範囲の配列からなる。プライマーＢ４５０５は、ＰＢ１ファージゲノム（受託番号ＥＵ７１６４１４）の３３２１３～３３２３２位の範囲の配列からなる。

２．Ｐｈｉ３３様尾繊維遺伝子は、以下のように実験的ファージ試料中で検出することができる。

環境起源の単離ファージのプラークを、寒天プレートから採取して、水に添加し、３０分間インキュベートして、プラークを吸い取ることができる。吸い取ったプラークを希釈して、上記のプライマーペアの１つまたは全てを含有する部分をＰＣＲ反応に添加して、標準的なプロトコールに従ってＰＣＲを実施することができる。ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル上でエチジウムブロマイド染色によって可視化して、その大きさを評価することができる。使用したプライマーペアに関して正しい大きさのＰＣＲ産物をゲル抽出して、シークエンシングのために外部施設に提供することができる。ＰＣＲ産物の同一性を確認するために、シークエンシングの結果を利用可能な尾繊維遺伝子配列と比較することができる。

（細菌ゲノムのｐｈｏＡ座のすぐ下流に、大腸菌ｌａｃＺ△Ｍ１５遺伝子、またはＰｈｉ３３エンドライシン遺伝子と大腸菌ｌａｃＺ△Ｍ１５遺伝子の両方のいずれかを有する緑膿菌株を生成する、プラスミドの構築）
１．緑膿菌ＰＡＯ１ ｐｈｏＡ相同体の３’末端に隣接するＤＮＡを有するｐＳＭ１１０４を有するプラスミドｐＳＭＸ２００（図１）は以下のように構築することができる。

緑膿菌のｐｈｏＡ遺伝子の末端のおよそ１ｋｂを含む領域は、プライマーＢ４２００およびＢ４２０１を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図１）。次にＰＣＲ産物を精製して、ＳｐｅＩおよびＢｇｌＩＩによって消化することができる。ＰＡ３２９７オープンリーディングフレームの３’末端を含む緑膿菌由来のｐｈｏＡ遺伝子の下流のおよそ１ｋｂを含む第二の領域は、プライマーＢ４２０２およびＢ４２０３を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図１）。次に、この第二のＰＣＲ産物を精製して、ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩによって消化することができる。２つの消化物を再度精製して、ＳｐｅＩおよびＸｈｏＩによって消化されているｐＳＭ１１０４に３方式のライゲーションでライゲートして、プラスミドｐＳＭＸ２００を得ることができる（図１）。

プライマーＢ４２００は、５’ＳｐｅＩ制限部位（下線）と、その後に続く緑膿菌株ＰＡＯ１由来のｐｈｏＡの終止コドンのおよそ１ｋｂ上流に位置する配列とからなる（図１）。プライマーＢ４２０１は、５’ＢｇｌＩＩおよびＡｆｌＩＩ制限部位（下線）と、その後に続く緑膿菌株ＰＡＯ１由来のｐｈｏＡ遺伝子の末端と相補的な配列とからなる（終止コドンを小文字で示す；図１）。プライマーＢ４２０２は、５’ＢｇｌＩＩおよびＮｈｅＩ制限部位（下線）と、その後に続く緑膿菌株ＰＡＯ１由来のｐｈｏＡ遺伝子の終止コドンのすぐ下流の配列とからなる（図１）。プライマーＢ４２０３は、５’ＸｈｏＩ制限部位（下線）と、その後に続く緑膿菌株ＰＡＯ１由来のｐｈｏＡ遺伝子のおよそ１ｋｂ下流のＰＡ３２９７オープンリーディングフレーム内の配列とからなる（図１）。

２．エンドライシンプロモーターの制御下でＰｈｉ３３エンドライシン遺伝子を有するｐＳＭＸ２００を含むプラスミドｐＳＭＸ２０１（図１）は以下のように構築することができる。

エンドライシンプロモーターは、プライマーＢ４２０４およびＢ４２０５を使用してＰｈｉ３３からＰＣＲによって増幅することができる（図１）。エンドライシン遺伝子そのものは、プライマーＢ４２０６およびＢ４２０７を使用してＰｈｉ３３からＰＣＲによって増幅することができる。次に２つのＰＣＲ産物を、２つの外側のプライマーＢ４２０４およびＢ４２０７を使用して、Ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ Ｏｖｅｒｌａｐ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（ＳＯＥｉｎｇ）ＰＣＲによって結合させることができる。得られたＰＣＲ産物をＡｆｌＩＩおよびＢｇｌＩＩによって消化して、ＡｆｌＩＩおよびＢｇｌＩＩによって同様に消化されているｐＳＭＸ２００にライゲートして、プラスミドｐＳＭＸ２０１を得ることができる（図１）。

プライマーＢ４２０４は、５’ＡｆｌＩＩ制限部位（下線）と、その後に続く二方向の転写ターミネーター（ｓｏｘＲターミネーター、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＤＱ０５８７１４の６０～９６塩基）と、Ｐｈｉ３３エンドライシンプロモーター領域の開始部の配列（下線、太字）とからなる（図１）。プライマーＢ４２０５は、Ｐｈｉ３３由来のエンドライシン遺伝子の開始コドンと重なり合う領域と相補的な配列の５’領域と、その後に続くエンドライシンプロモーター領域の末端と相補的な配列（下線、太字；図１）とからなる。プライマーＢ４２０６は、プライマーＢ４２０５の逆相補体である（同様に図１を参照されたい）。プライマーＢ４２０７は、５’ＢｇｌＩＩ制限部位（下線）と、その後に続くＰｈｉ３３エンドライシン遺伝子の末端と相補的な配列とからなる（図１）。

３．ｌａｃプロモーターの制御下でｌａｃＺ△Ｍ１５を有するｐＳＭＸ２０１を含むプラスミドｐＳＭＸ２０２（図１）は、以下のように構築することができる。

ｌａｃプロモーターの制御下のｌａｃＺ△Ｍ１５遺伝子は、プライマーＢ４２０８およびＢ４２０９を使用して大腸菌株ＤＨ１０ＢからＰＣＲによって増幅することができる（図１）。次に、得られたＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩおよびＮｈｅＩによって消化して、ＢｇｌＩＩおよびＮｈｅＩによって同様に消化されているｐＳＭＸ２０１にライゲートして、プラスミドｐＳＭＸ２０２を得ることができる（図１）。

プライマーＢ４２０８は、５’ＢｇｌＩＩ制限部位（下線）と、その後に続くｌａｃプロモーターの配列とからなる（図１）。プライマーＢ４２０９は、５’ＮｈｅＩ制限部位（下線）と、その後に続く二方向の転写ターミネーターおよびｌａｃＺ△Ｍ１５の３’末端と相補的な配列とからなる（下線、太字、図１）。

４．ｌａｃプロモーターの制御下でｌａｃＺ△Ｍ１５を有するｐＳＭＸ２００を含むプラスミドｐＳＭＸ２０３（図１）は、以下のように構築することができる。

ｌａｃプロモーターの制御下のｌａｃＺ△Ｍ１５遺伝子は、プライマーＢ４２０８およびＢ４２０９を使用して大腸菌株ＤＨ１０ＢからＰＣＲによって増幅することができる（図１）。次に、得られたＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩおよびＮｈｅＩによって消化して、ＢｇｌＩＩおよびＮｈｅＩによって同様に消化されているｐＳＭＸ２００にライゲートして、プラスミドｐＳＭＸ２０３を得ることができる（図１）。

プライマーＢ４２０８は、５’ＢｇｌＩＩ制限部位（下線）と、その後に続くｌａｃプロモーターの配列とからなる（図１）。プライマーＢ４２０９は、５’ＮｈｅＩ制限部位（下線）と、その後に続く二方向の転写ターミネーターと、ｌａｃＺ△Ｍ１５の３’末端と相補的な配列とからなる（下線、太字、図１）。

（細菌ゲノムのｐｈｏＡ座のすぐ下流に、Ｐｈｉ３３エンドライシン遺伝子および大腸菌ｌａｃＺ△Ｍ１５を導入する、緑膿菌の遺伝子改変）
１．プラスミドｐＳＭＸ２０２（図１）を接合によって緑膿菌に伝達して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）の獲得に従って一次組み換え体に関して選択することができる。

２．次に、二重組み換え体を、１０％スクロースを含有する培地に播種することによってｓａｃＢ媒介カウンターセレクションによって選択することができる。

３．次に、１０％スクロースで増殖させた単離体をＰＣＲによってスクリーニングして、エンドライシン遺伝子およびｌａｃＺ△Ｍ１５が緑膿菌ｐｈｏＡ遺伝子の下流に導入されていることを確認することができる。

４．単離体（ＰＡＸ２０）の確認後、この株をエンドライシン変異とｌａｃＺαレポーターの両方の相補が必要であるＰｈｉ３３関連バクテリオファージのさらなる改変のための宿主として使用することができる。

（細菌ゲノムのｐｈｏＡ座のすぐ下流に大腸菌ｌａｃＺ△Ｍ１５遺伝子を導入する、緑膿菌の遺伝子改変）
１．プラスミドｐＳＭＸ２０３（図１）を接合によって緑膿菌に伝達して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）の獲得に従って一次組み換え体に関して選択することができる。

２．次に、二重組み換え体を、１０％スクロースを含有する培地に播種することによってｓａｃＢ媒介カウンターセレクションによって選択することができる。

３．次に、１０％スクロースで増殖させた単離体をＰＣＲによってスクリーニングして、ｌａｃＺ△Ｍ１５が緑膿菌ｐｈｏＡ遺伝子の下流に導入されていることを確認することができる。

４．単離体（ＰＡＸ２１）の確認後、この株をｌａｃＺαレポーターの相補が必要であるバクテリオファージのさらなる改変のための宿主として使用することができる。

（ｌａｃＺαスクリーニングプロセスを利用して、Ｐｈｉ３３尾繊維の３’部分をＰＴＰ９２の３’部分に置換する、プラスミドの構築）
１．Ｐｈｉ３３尾繊維遺伝子のすぐ下流の領域を有するｐＳＭ１０８０を含むｐＳＭＸ２０４（図２）は、以下のように構築することができる。

Ｐｈｉ３３尾繊維の末端２０塩基を含むＰｈｉ３３配列の１ｋｂ領域および隣接する下流の領域を、プライマーＢ４２２２およびＢ４２４９を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図２）。得られたＰＣＲ産物を精製して、ＮｈｅＩで消化して、同様にＮｈｅＩによって消化されていて、ライゲーション前にアルカリホスファターゼによって処理されているｐＳＭ１０８０にライゲートして、プラスミドｐＳＭＸ２０４（図２）を得ることができる。

プライマーＢ４２２２は、５’ＮｈｅＩ制限部位（下線）と、その後に続くＰｈｉ３３尾繊維遺伝子の末端のおよそ１ｋｂ下流のＰｈｉ３３由来の配列とからなる（図２）。Ｂ４２４９は、５’ＮｈｅＩ－ＫｐｎＩ－ＡｖｒＩＩ制限部位（下線）と、その後に続くＰｈｉ３３尾繊維の３’末端と相補的な配列と、尾繊維オープンリーディングフレームのすぐ下流の配列とからなる（図２）。

２．ｌａｃＺα、ＰＴＰ９２尾繊維遺伝子配列の３’部分、および尾繊維遺伝子の５’末端を含むＰｈｉ３３配列の領域、およびＰｈｉ３３尾繊維遺伝子のすぐ上流に位置する配列を有するｐＳＭＸ２０４を含むｐＳＭＸ２０５（図２）は、以下のように構築することができる。

ｌａｃＺαオープンリーディングフレームは、プライマーＢ４２５０およびＢ４２５２を使用してｐＵＣ１９からＰＣＲによって増幅することができる（図２）。ＰＴＰ９２尾繊維の３’部分は、プライマーＢ４２５１およびＢ４２５４を使用してＰＴＰ９２からＰＣＲによって増幅することができる（図２）。次に、ｌａｃＺαオープンリーディングフレームを、外側のプライマーＢ４２５０およびＢ４２５４を使用してＳＯＥｉｎｇＰＣＲによって、ＰＴＰ９２尾繊維遺伝子の３’部分に結合することができる。Ｐｈｉ３３尾繊維遺伝子の５’末端の配列と、Ｐｈｉ３３尾繊維遺伝子のすぐ上流に位置する配列とを含む領域は、プライマーＢ４２５３およびＢ４２２９を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図２）。このＰＣＲ産物を次に、外側のプライマーＢ４２５０およびＢ４２２９を使用して、ＳＯＥｉｎｇＰＣＲによってｌａｃＺαおよびＰＴＰ９２尾繊維遺伝子３’部分を含むＰＣＲ産物に結合させることができる。次に、得られたＰＣＲ産物を精製して、ＡｖｒＩＩおよびＫｐｎＩによって消化し、同様にＡｖｒＩＩおよびＫｐｎＩによって消化されているｐＳＭＸ２０４にライゲートして、プラスミドｐＳＭＸ２０５を得ることができる（図２）。

プライマーＢ４２５０は５’ＡｖｒＩＩ制限部位と、その後に続くｌａｃＺαオープンリーディングフレームの３’末端と相補的な配列とからなる（図２）。プライマーＢ４２５２は、ＰＴＰ９２尾繊維遺伝子の３’末端と重なり合う配列の５’部分（下線）と、その後に続くｌａｃＺαオープンリーディングフレームの５’末端の配列とからなる。プライマーＢ４２５１はプライマーＢ４２５２の逆相補体である（図２）。プライマーＢ４２５４は、Ｐｈｉ３３尾繊維遺伝子内の５’配列（下線）と、その後に続くＰＴＰ９２尾繊維遺伝子の３’末端内の配列とからなる（図２）。プライマーＢ４２５３は、プライマーＢ４２５４の逆相補体である。プライマーＢ４２２９は、５’ＫｐｎＩ制限部位（下線）と、その後に続くＰｈｉ３３における尾繊維遺伝子のおよそ１ｋｂ上流の領域と相補的な配列とからなる（図２）。

（尾繊維遺伝子の３’部分をＰＴＰ９２の３’部分に置換する、Ｐｈｉ３３の遺伝子改変）
１．プラスミドｐＳＭＸ２０５（図２、図３）を接合によって緑膿菌株ＰＡＸ２１に導入して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいて接合伝達体を選択し、株ＰＴＡ２０を得ることができる。

２．株ＰＴＡ２０にファージＰｈｉ３３を感染させて、子孫ファージを回収することができる。

３．Ｐｈｉ３３尾繊維遺伝子の３’末端がＰＴＰ９２の３’末端に置換されていて、ｌａｃＺαが付加されている組み換え型ファージは、Ｓ－ｇａｌを含有する培地において緑膿菌株ＰＡＸ２１上でステップ（２）の溶解物をプラーク形成させて、β－ガラクトシダーゼ活性の指標である黒色のプラークを調べることによって、同定することができる。

４．ＰＣＲを行って、尾繊維遺伝子が置換されていることおよびｌａｃＺαが存在することをチェックすることができる。

５．確認された単離体（ＰＴＰＸ２１、図３）の同定後、この単離体を、さらに使用する前に緑膿菌株ＰＡＸ２１においてさらに２回プラーク精製することができる。

（ｌａｃＺαスクリーニングプロセスを利用して、Ｐｈｉ３３尾繊維の３’部分をＰＴＰ４７の３’部分に置換する、プラスミドの構築）
１．ｌａｃＺα、ＰＴＰ４７尾繊維遺伝子配列の３’部分、および尾繊維遺伝子の５’末端を含むＰｈｉ３３配列の領域、およびＰｈｉ３３尾繊維遺伝子のすぐ上流に位置する配列を有するｐＳＭＸ２０４を含むｐＳＭＸ２０６（図２）は、以下のように構築することができる。

ｌａｃＺαオープンリーディングフレームは、プライマーＢ４２５０およびＢ４２５８を使用してｐＵＣ１９からＰＣＲによって増幅することができる（図２）。ＰＴＰ４７尾繊維の３’部分は、プライマーＢ４２５９およびＢ４２６０を使用してＰＴＰ４７からＰＣＲによって増幅することができる（図２）。次に、ｌａｃＺαオープンリーディングフレームを、外側のプライマーＢ４２５０およびＢ４２６０を使用してＳＯＥｉｎｇＰＣＲによって、ＰＴＰ４７尾繊維遺伝子の３’部分に結合することができる。Ｐｈｉ３３尾繊維遺伝子の５’末端の配列と、Ｐｈｉ３３尾繊維遺伝子のすぐ上流に位置する配列とを含む領域は、プライマーＢ４２６１およびＢ４２２９を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図２）。このＰＣＲ産物を次に、外側のプライマーＢ４２５０およびＢ４２２９を使用して、ＳＯＥｉｎｇＰＣＲによってｌａｃＺαおよびＰＴＰ４７尾繊維遺伝子の３’部分を含むＰＣＲ産物に結合させることができる。次に、得られたＰＣＲ産物を精製して、ＡｖｒＩＩおよびＫｐｎＩによって消化し、同様にＡｖｒＩＩおよびＫｐｎＩによって消化されているｐＳＭＸ２０４にライゲートして、プラスミドｐＳＭＸ２０６を得ることができる（図２）。

プライマーＢ４２５０は５’ＡｖｒＩＩ制限部位と、その後に続くｌａｃＺαオープンリーディングフレームの３’末端と相補的な配列とからなる（図２）。プライマーＢ４２５８は、ＰＴＰ４７尾繊維遺伝子の３’末端と重なり合う配列の５’部分（下線）と、その後に続くｌａｃＺαオープンリーディングフレームの５’末端の配列とからなる。プライマーＢ４２５９はプライマーＢ４２５８の逆相補体である（図２）。プライマーＢ４２６０は、Ｐｈｉ３３尾繊維遺伝子内の５’配列（下線）と、その後に続くＰＴＰ４７尾繊維遺伝子の３’末端内の配列とからなる（図２）。プライマーＢ４２６１は、プライマーＢ４２６０の逆相補体である。プライマーＢ４２２９は、５’ＫｐｎＩ制限部位（下線）と、その後に続くＰｈｉ３３における尾繊維遺伝子のおよそ１ｋｂ上流の領域と相補的である配列とからなる（図２）。

（尾繊維遺伝子の３’部分をＰＴＰ４７の３’部分に置換する、Ｐｈｉ３３の遺伝子改変）
１．プラスミドｐＳＭＸ２０６（図２、図４）を接合によって緑膿菌株ＰＡＸ２１に導入して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいて接合伝達体を選択し、株ＰＴＡ２１を得ることができる。

２．株ＰＴＡ２１にファージＰｈｉ３３を感染させて、子孫ファージを回収することができる。

３．Ｐｈｉ３３尾繊維遺伝子の３’末端がＰＴＰ４７の３’末端に置換されていて、ｌａｃＺαが付加されている組み換え型ファージは、Ｓ－ｇａｌを含有する培地において緑膿菌株ＰＡＸ２１上でステップ（２）の溶解物をプラーク形成させて、β－ガラクトシダーゼ活性の指標である黒色のプラークを調べることによって、同定することができる。

４．ＰＣＲを行って、尾繊維遺伝子が置換されていることおよびｌａｃＺαが存在することをチェックすることができる。

５．確認された単離体（ＰＴＰＸ２２、図４）の同定後、この単離体を、さらに使用する前に緑膿菌株ＰＡＸ２１においてさらに２回プラーク精製することができる。

（ＰＴＰＸ２１からｌａｃＺαマーカーを除去する、プラスミドの構築）
１．ＰＴＰ９２尾繊維遺伝子の３’部分と、Ｐｈｉ３３尾繊維遺伝子のすぐ下流に位置するＰｈｉ３３配列の領域とを有するｐＳＭ１０８０を含むｐＳＭＸ２０７（図５）は、以下のように構築することができる。

Ｐｈｉ３３尾繊維のすぐ下流に位置するＰｈｉ３３配列の領域は、プライマーＢ４２２２およびＢ４２５５を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図５）。ＰＴＰ９２尾繊維遺伝子の３’末端は、プライマーＢ４２５６およびＢ４２５７を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図５）。これらの２つのＰＣＲ産物を次に、２つの外側のプライマーＢ４２２２およびＢ４２５７を使用してＳＯＥｉｎｇＰＣＲによって結合することができる。得られたＰＣＲ産物を次に精製して、ＮｈｅＩによって消化し、再度精製して、ＮｈｅＩによって同様に消化されていて、ライゲーション前にアルカリホスファターゼによって処理されているｐＳＭ１０８０にライゲートして、プラスミドｐＳＭＸ２０７を得ることができる（図５）。

プライマーＢ４２５５は、ＰＴＰ９２尾繊維遺伝子の末端の５’部分（下線）と、その後に続くＰｈｉ３３尾繊維遺伝子のすぐ下流の配列とからなる（図５）。プライマーＢ４２５６は、プライマーＢ４２５５の逆相補体である（図５）。プライマーＢ４２５７は、５’ＮｈｅＩ制限部位（下線）と、その後に続くＰＴＰ９２尾繊維遺伝子の末端の１ｋｂの配列とからなる（図５）。

（ｌａｃＺαマーカーを除去する、ＰＴＰＸ２１の遺伝子改変）
１．プラスミドｐＳＭＸ２０７（図５、図３）を接合によって緑膿菌株ＰＡＸ２１に導入して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいて接合伝達体を選択し、株ＰＴＡ２２を得ることができる。

２．株ＰＴＡ２２にファージＰＴＰＸ２１を感染させて、子孫ファージを回収することができる。

３．ｌａｃＺαマーカーが除去されている組み換え型ファージは、Ｓ－ｇａｌを含有する培地において緑膿菌株ＰＡＸ２１上でステップ（２）の溶解物をプラーク形成させて、β－ガラクトシダーゼ活性喪失の指標である白色のプラークを調べることによって、同定することができる。

４．ＰＣＲを行って、尾繊維遺伝子が保持されていることおよびｌａｃＺαが除去されていることをチェックすることができる。

５．確認された単離体（ＰＴＰＸ２３、図３）の同定後、この単離体を、さらに使用する前に緑膿菌株ＰＡＸ２１においてさらに２回プラーク精製することができる。

（ＰＴＰＸ２２からｌａｃＺαマーカーを除去する、プラスミドの構築）
１．ＰＴＰ４７尾繊維遺伝子の３’部分と、Ｐｈｉ３３尾繊維遺伝子のすぐ下流に位置するＰｈｉ３３配列の領域とを有するｐＳＭ１０８０を含むｐＳＭＸ２０８（図５）は、以下のように構築することができる。

Ｐｈｉ３３尾繊維のすぐ下流に位置するＰｈｉ３３配列の領域は、プライマーＢ４２２２およびＢ４２６２を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図５）。ＰＴＰ４７尾繊維遺伝子の３’末端は、プライマーＢ４２６３およびＢ４２６４を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図５）。これらの２つのＰＣＲ産物を次に、２つの外側のプライマーＢ４２２２およびＢ４２６４を使用してＳＯＥｉｎｇＰＣＲによって結合することができる。得られたＰＣＲ産物を次に精製して、ＮｈｅＩによって消化し、再度精製して、ＮｈｅＩによって同様に消化されていて、ライゲーション前にアルカリホスファターゼによって処理されているｐＳＭ１０８０にライゲートして、プラスミドｐＳＭＸ２０８を得ることができる（図５）。

プライマーＢ４２６２は、ＰＴＰ４７尾繊維遺伝子の末端の５’部分（下線）と、その後に続くＰｈｉ３３尾繊維遺伝子のすぐ下流の配列とからなる（図５）。プライマーＢ４２６３は、プライマーＢ４２６２の逆相補体である（図５）。プライマーＢ４２６４は、５’ＮｈｅＩ制限部位（下線）と、その後に続くＰＴＰ４７尾繊維遺伝子の末端の１ｋｂの配列とからなる（図５）。

（ｌａｃＺαマーカーを除去する、ＰＴＰＸ２２の遺伝子改変）
１．プラスミドｐＳＭＸ２０８（図５、図４）を接合によって緑膿菌株ＰＡＸ２１に導入して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいて接合伝達体を選択し、株ＰＴＡ２３を得ることができる。

２．株ＰＴＡ２３にファージＰＴＰＸ２２を感染させて、子孫ファージを回収することができる。

３．ｌａｃＺαマーカーが除去されている組み換え型ファージは、Ｓ－ｇａｌを含有する培地において緑膿菌株ＰＡＸ２１上でステップ（２）の溶解物をプラーク形成させて、β－ガラクトシダーゼ活性喪失の指標である白色のプラークを調べることによって、同定することができる。

４．ＰＣＲを行って、尾繊維遺伝子が保持されていることおよびｌａｃＺαが除去されていることをチェックすることができる。

５．確認された単離体（ＰＴＰＸ２４、図４）の同定後、この単離体を、さらに使用する前に緑膿菌株ＰＡＸ２１においてさらに２回プラーク精製することができる。

（Ｐｈｉ３３、ＰＴＰＸ２３、ＰＴＰＸ２４、および類似のファージのエンドライシン遺伝子をｒｐｓＢ－ＳＡＳＰ－ＣおよびｌａｃＺαに置換する、プラスミドの構築）
１．エンドライシン遺伝子に隣接するＰｈｉ３３の領域を含有するｐＳＭ１０８０を含むプラスミドｐＳＭＸ２０９（図６）は、以下のように構築することができる。

エンドライシン遺伝子のすぐ下流に位置するＰｈｉ３３配列の領域は、プライマーＢ４２６５よびＢ４２６６を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図６）。次に、このＰＣＲ産物を精製して、ＮｄｅＩおよびＮｈｅＩによって消化することができる。エンドライシン遺伝子のすぐ上流のＰｈｉ３３配列の領域は、プライマーＢ４２６７およびＢ４２６８を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図６）。この第二のＰＣＲ産物を次に、精製して、ＮｄｅＩおよびＮｈｅＩによって消化することができる。２つのＰＣＲ産物消化物を、再度精製して、ＮｈｅＩによって消化されていて、ライゲーション前にアルカリホスファターゼによって処理されているｐＳＭ１０８０にライゲートすることができる。２つのＰＣＲ産物のそれぞれの１つのインサートを有するクローンを、プライマーＢ４２６５およびＢ４２６８を使用してＰＣＲによって同定することができ、精製された推定のクローンのＮｄｅＩ制限酵素消化物分析によって、プラスミドｐＳＭＸ２０９を同定することができる（図６）。

プライマーＢ４２６５は、５’ＮｈｅＩ制限部位（下線）と、その後に続くＰｈｉ３３エンドライシン遺伝子のおよそ３４０ｂｐ下流に位置するＰｈｉ３３配列とからなる（図６）。プライマーＢ４２６６は、５’ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩ制限部位（下線）と、その後に続くエンドライシン遺伝子のすぐ下流に位置するＰｈｉ３３の配列とからなる（図６）。プライマーＢ４２６７は、５’ＮｄｅＩ制限部位（下線）と、その後に続くＰｈｉ３３エンドライシン遺伝子のすぐ上流に位置する配列と相補的な配列とからなる（図６）。プライマーＢ４２６８は、５’ＮｈｅＩ制限部位（下線）と、その後に続くエンドライシン遺伝子のおよそ３４０ｂｐ上流に位置するＰｈｉ３３配列とからなる（図６）。

２．ｒｐｓＢプロモーターの制御下でＳＡＳＰ－Ｃを含有するｐＳＭＸ２０９を含むプラスミドｐＳＭＸ２１０（図６）は、以下のように構築することができる。

バチルス・メガテリウム株ＫＭ（ＡＴＣＣ １３６３２）由来のＳＡＳＰ－Ｃ遺伝子を、プライマーＢ４２６９およびＢ４２７０を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図６）。次に、得られたＰＣＲ産物をＫｐｎＩおよびＮｃｏＩによって消化することができる。ｒｐｓＢプロモーターを、プライマーＢ４２７１およびＢ４２７２を使用して緑膿菌からＰＣＲによって増幅することができる（図６）。次に、得られたＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＮｄｅＩによって消化することができる。２つの消化されたＰＣＲ産物を精製して、ＫｐｎＩおおよびＮｄｅＩによって消化されているｐＳＭＸ２０９にライゲートして、プラスミドｐＳＭＸ２１０を得ることができる（図６）。

プライマーＢ４２６９は、５’ＫｐｎＩ制限部位と、続く５塩基と、その後の二方向の転写ターミネーターと、Ｂ．メガテリウム株ＫＭ（ＡＴＣＣ １３６３２）由来のＳＡＳＰ－Ｃ遺伝子の３’末端と相補的な配列（下線、太字；図６）とを含む。プライマーＢ４２７０は、５’ＮｃｏＩ制限部位（下線）と、その後に続くＢ．メガテリウム株ＫＭ（ＡＴＣＣ １３６３２）由来のＳＡＳＰ－Ｃ遺伝子の５’末端の配列（図６）とを含む。プライマーＢ４２７１は、５’ＮｃｏＩ制限部位（下線）と、その後に続く緑膿菌ＰＡＯ１由来のｒｐｓＢプロモーターの末端と相補的な配列（図６）とを含む。プライマーＢ４２７２は、５’ＮｄｅＩ制限部位（下線）と、その後に続く緑膿菌ＰＡＯ１由来のｒｐｓＢプロモーターの開始部の配列（図６）とを含む。

３．ｌａｃＺαを含有するｐＳＭＸ２１０を含むプラスミドｐＳＭＸ２１１（図６）は、以下のように構築することができる。

ｌａｃＺαは、プライマーＢ４２７３およびＢ４２７４を使用してＰＣＲ増幅することができる（図１１）。得られたＰＣＲ産物をＫｐｎＩで消化して、同様にＫｐｎＩで消化されていて、ライゲーション前にアルカリホスファターゼによって処理されているｐＳＭＸ２１０にライゲートして、ｐＳＭＸ２１１を得ることができる（図６）。

プライマーＢ４２７３は、５’ＫｐｎＩ制限部位（下線）と、その後に続くｌａｃＺαの３’末端と相補的な配列とからなる（図６）。プライマーＢ４２７４は、５’ＫｐｎＩ制限部位と、その後に続くｌａｃＺαの発現を促進するｌａｃプロモーターの配列（図６）とからなる。

（エンドライシン遺伝子をｒｐｓＢ－ＳＡＳＰ－ＣおよびｌａｃＺαに置換する、Ｐｈｉ３３、ＰＴＰＸ２３、ＰＴＰＸ２４、および類似のファージの遺伝子改変）
１．プラスミドｐＳＭＸ２１１（図６、図３、図４、図７）を接合によって緑膿菌株ＰＡＸ２０に導入して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいて接合伝達体を選択し、株ＰＴＡ２４を得ることができる。

２．個々の実験において、株ＰＴＡ２４にファージＰｈｉ３３、ＰＴＰＸ２３、またはＰＴＰＸ２４、または他の類似のファージを感染させて、子孫ファージを回収することができる。

３．エンドライシン遺伝子がｒｐｓＢ－ＳＡＳＰ－ＣおよびｌａｃＺαに置換されている組み換え型ファージを、Ｓ－ｇａｌを含有する培地を使用して緑膿菌株ＰＡＸ２０上でステップ（２）からの溶解物のプラークを形成させて、β－ガラクトシダーゼ活性の指標である黒色のプラークを調べることによって同定することができる。

４．ＰＣＲを行って、エンドライシン遺伝子が置換されていること、ならびにｒｐｓＢ－ＳＡＳＰ－ＣおよびｌａｃＺαが存在することをチェックすることができる。

５．確認された単離体（例えば、ＰＴＰＸ２５（図７）、ＰＴＰＸ２６（図３）、ＰＴＰＸ２７（図４））の同定後、単離体をさらに使用する前に緑膿菌株ＰＡＸ２０においてさらに２回プラーク精製することができる。

（ＰＴＰＸ２５、ＰＴＰＸ２６、ＰＴＰＸ２７、およびＰｈｉ３３の類似の誘導体からｌａｃＺαマーカーを除去する、遺伝子改変）
１．プラスミドｐＳＭＸ２１０（図６、図３、図４、図７）を接合によって緑膿菌株ＰＡＸ２０に導入して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいて接合伝達体を選択し、株ＰＴＡ２５を得ることができる。

２．個々の実験において株ＰＴＡ２５にファージＰＴＰＸ２５、またはＰＴＰＸ２６、またはＰＴＰＸ２７、または他の類似のファージを感染させて、子孫ファージを回収することができる。

３．ｌａｃＺαマーカーが除去されている組み換え型ファージは、Ｓ－ｇａｌを含有する培地において緑膿菌株ＰＡＸ２０上でステップ（２）の溶解物をプラーク形成させて、β－ガラクトシダーゼ活性喪失の指標である白色のプラークを調べることによって、同定することができる。

４．ＰＣＲを行って、ｒｐｓＢ－ＳＡＳＰ－Ｃがなおも存在することを確保しながらｌａｃＺαマーカーの除去を確認することができる。

５．確認された単離体（例えば、ＰＴＰ１１４（図７）、ＰＴＰ１１０（図３）、ＰＴＰＸ２８（図４））の同定後、単離体を、さらに使用する前に緑膿菌株ＰＡＸ２０においてさらに２回プラーク精製することができる。

（Ｐｈｉ３３、ＰＴＰＸ２３、ＰＴＰＸ２４、および類似のファージのエンドライシン遺伝子をｆｄａ－ＳＡＳＰ－Ｃ（コドン最適化）およびｌａｃＺαに置換する、プラスミドの構築）
１．エンドライシン遺伝子に隣接するＰｈｉ３３の領域を含有するｐＳＭ１０８０を含むプラスミドｐＳＭＸ２１２（図８）は、以下のように構築することができる。

エンドライシン遺伝子のすぐ下流に位置するＰｈｉ３３配列の領域は、プライマーＢ４２６５よびＢ４３１０を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図８）。次に、このＰＣＲ産物を精製して、ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩによって消化することができる。エンドライシン遺伝子のすぐ上流のＰｈｉ３３配列の領域は、プライマーＢ４３１１およびＢ４２６８を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図８）。この第二のＰＣＲ産物を次に、精製して、ＸｈｏＩおよびＮｈｅＩによって消化することができる。２つのＰＣＲ産物消化物を、再度精製して、ＮｈｅＩによって消化されていて、ライゲーション前にアルカリホスファターゼによって処理されているｐＳＭ１０８０にライゲートすることができる。２つのＰＣＲ産物のそれぞれの１つのインサートを有するクローンを、プライマーＢ４２６５およびＢ４２６８を使用してＰＣＲによって同定することができ、精製された推定のクローンのＸｈｏＩ制限酵素消化物分析によって、プラスミドｐＳＭＸ２１２を同定することができる（図８）。

プライマーＢ４２６５は、５’ＮｈｅＩ制限部位（下線）と、その後に続くＰｈｉ３３エンドライシン遺伝子のおよそ３４０ｂｐ下流に位置するＰｈｉ３３配列とからなる（図８）。プライマーＢ４３１０は、５’ＡｖｒＩＩおよびＸｈｏＩ制限部位（下線）と、その後に続くエンドライシン遺伝子のすぐ下流に位置するＰｈｉ３３の配列とからなる（図８）。プライマーＢ４３１１は、５’ＸｈｏＩおよびＡｖｒＩＩ制限部位（下線）と、その後に続くＰｈｉ３３エンドライシン遺伝子のすぐ上流に位置する配列と相補的な配列とからなる（図８）。プライマーＢ４２６８は、５’ＮｈｅＩ制限部位（下線）と、その後に続くエンドライシン遺伝子のおよそ３４０ｂｐ上流に位置するＰｈｉ３３配列とからなる（図８）。

２．ｆｄａプロモーターの制御下で緑膿菌における発現に関してコドン最適化されたＳＡＳＰ－Ｃを含有するｐＳＭＸ２１２を含むプラスミドｐＳＭＸ２１３（図８）は、以下のように構築することができる。

バチルス・メガテリウム株ＫＭ（ＡＴＣＣ １３６３２）由来のＳＡＳＰ－Ｃ遺伝子を、緑膿菌での発現に関してコドン最適化して（図９）、インビトロで合成することができる。コドン最適化されたＳＡＳＰ－Ｃ遺伝子を、プライマーＢ４３１２およびＢ４３１３を使用してＰＣＲによって増幅することができる（図８）。ｆｄａプロモーターは、プライマーＢ４３１４およびＢ４３１５を使用して緑膿菌からＰＣＲによって増幅することができる（図８）。得られた２つのＰＣＲ産物を、外側のプライマーＢ４３１２およびＢ４３１４を使用してｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（ＳＯＥｉｎｇ）ＰＣＲによって結合することができる（図８）。次に、得られたｆｄａ－コドン最適化ＳＡＳＰ－ＣターミネーターＰＣＲ産物をＸｈｏＩおよびＡｖｒＩＩによって消化して、精製し、ＸｈｏＩおよびＡｖｒＩＩによって消化されているｐＳＭＸ２１２にライゲートして、プラスミドｐＳＭＸ２１３を得た（図８）。

プライマーＢ４３１２は、５’ＸｈｏＩ制限部位と、その後に続く二方向の転写ターミネーターと、緑膿菌での発現に関してコドン最適化されているＢ．メガテリウム株ＫＭ（ＡＴＣＣ １３６３２）由来のＳＡＳＰ－Ｃ遺伝子の３’末端と相補的な配列（下線、太字；図８）とを含む。プライマーＢ４３１３は、緑膿菌ＰＡＯ１由来のｆｄａプロモーターの３’末端の配列（太字）と、その後に続くコドン最適化されたＳＡＳＰ－Ｃ遺伝子の５’末端の配列とを含む。プライマーＢ４３１４は、コドン最適化されたＳＡＳＰ－Ｃ遺伝子の５’末端と相補的な配列と、その後に続く緑膿菌ＰＡＯ１由来のｆｄａプロモーターの３’末端と相補的な配列（図８）とを含む。プライマーＢ４３１５は、５’ＡｖｒＩＩ制限部位（下線）と、その後に続く緑膿菌ＰＡＯ１由来のｆｄａプロモーターの開始部の配列（図８）とを含む。

３．ｌａｃＺαを含有するｐＳＭＸ２１３を含むｐＳＭＸ２１４（図８）は、以下のように構築することができる。

ｌａｃＺαは、プライマーＢ４３１６およびＢ４３１７を使用してＰＣＲ増幅することができる（図８）。得られたＰＣＲ産物を、ＸｈｏＩによって消化して、同様にＸｈｏＩによって消化されていて、ライゲーション前にアルカリホスファターゼによって処理されているｐＳＭＸ２１３にライゲートして、ｐＳＭＸ２１４を得ることができる（図８）。

プライマーＢ４３１６は、５’ＸｈｏＩ制限部位（下線）と、その後に続くｌａｃＺαの３’末端と相補的な配列とからなる（図８）。プライマーＢ４３１７は、５’ＸｈｏＩ制限部位（下線）と、その後に続くｌａｃＺαの発現を促進するｌａｃプロモーターの配列とからなる（図８）。

（エンドライシン遺伝子をｆｄａ－コドン最適化ＳＡＳＰ－ＣおよびｌａｃＺαに置換する、Ｐｈｉ３３、ＰＴＰＸ２３、ＰＴＰＸ２４、および類似のファージの遺伝子改変）
１．プラスミドｐＳＭＸ２１４（図８、図１０、図１１、図１２）を接合によって緑膿菌株ＰＡＸ２０に導入して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいて接合伝達体を選択し、株ＰＴＡ２６を得ることができる。

２．個々の実験において株ＰＴＡ２６にファージＰｈｉ３３、またはＰＴＰＸ２３、またはＰＴＰＸ２４、または他の類似のファージを感染させて、子孫ファージを回収することができる。

３．エンドライシン遺伝子がｆｄａコドン最適化ＳＡＳＰ－ＣおよびｌａｃＺαに置換されている組み換え型ファージは、Ｓ－ｇａｌを含有する培地において緑膿菌株ＰＡＸ２０上でステップ（２）の溶解物をプラーク形成させて、β－ガラクトシダーゼ活性の指標である黒色のプラークを調べることによって、同定することができる。

４．ＰＣＲを行って、エンドライシン遺伝子が置換されていること、ならびにｆｄａ－コドン最適化ＳＡＳＰ－ＣおよびｌａｃＺαが存在することをチェックすることができる。

５．確認された単離体（例えば、ＰＴＰＸ２９（図１２）、ＰＴＰＸ３０（図１０）、ＰＴＰＸ３４（図１１））の同定後、単離体を、さらに使用する前に緑膿菌株ＰＡＸ２０においてさらに２回プラーク精製することができる。

（ＰＴＰＸ２９、ＰＴＰＸ３０、ＰＴＰＸ３４、およびＰｈｉ３３の類似の誘導体からｌａｃＺαマーカーを除去する、遺伝子改変）
１．プラスミドｐＳＭＸ２１３（図８、図１０、図１１、図１２）を接合によって緑膿菌株ＰＡＸ２０に導入して、テトラサイクリン耐性（５０μｇ／ｍｌ）に基づいて接合伝達体を選択し、株ＰＴＡ２７を得ることができる。

２．個々の実験において株ＰＴＡ２７にファージＰＴＰＸ２９、またはＰＴＰＸ３０、またはＰＴＰＸ３４、または他の類似のファージを感染させて、子孫ファージを回収することができる。

３．ｌａｃＺαマーカーが除去されている組み換え型ファージは、Ｓ－ｇａｌを含有する培地において緑膿菌株ＰＡＸ２０上でステップ（２）の溶解物をプラーク形成させて、β－ガラクトシダーゼ活性喪失の指標である白色のプラークを調べることによって、同定することができる。

４．ＰＣＲを行って、ｌａｃＺαマーカーが除去されていることを確認し、ｆｄａ－コドン最適化ＳＡＳＰ－Ｃがなおも存在することを確保することができる。

５．確認された単離体（例えば、ＰＴＰ２８４（図１２）、ＰＴＰ３８４（図１０）、ＰＴＰ３８５（図１１））の同定後、単離体を、さらに使用する前に緑膿菌株ＰＡＸ２０においてさらに２回プラーク精製することができる。

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表１．緑膿菌の４４個のヨーロッパ臨床単離体に対するＰｈｉ３３、ＰＴＰ９２、Ｃ３６、およびＰＴＰ４７の宿主域

粗ファージ溶解物１０μｌを、細菌を接種した軟寒天重層プレート上に滴下することによって、株を各ファージに対する感受性に関して試験した。プレートを３２℃で一晩増殖させて、接種点でのクリアゾーンを評価することによって、株を各ファージに対する感受性に関して採点した。ファージが、菌叢の消失として認められる増殖を阻害する場合、株を感受性（＋）と記し、増殖の阻害が認められない場合、株を非感受性（－）と記した。

表２．緑膿菌の３５個のヨーロッパ臨床単離体に対するＰｈｉ３３、ＰＴＰ９２、およびＰＴＰ９３の宿主域。

粗ファージ溶解物１０μｌを、細菌を接種した軟寒天重層プレート上に滴下することによって、株を各ファージに対する感受性に関して試験した。プレートを３２℃で一晩増殖させて、接種点でのクリアゾーンを評価することによって、株を各ファージに対する感受性に関して採点した。ファージが菌叢の消失として認められる増殖を阻害する場合、株を感受性（＋）と記し、増殖の阻害が認められない場合、株を非感受性（－）と記した。

Claims (28)

1. 標的細菌に対して毒性であるＳＡＳＰをコードするα／β型低分子酸可溶性芽胞タンパク質（ＳＡＳＰ）遺伝子を含む、複数の異なる標的細菌に感染することができる改変バクテリオファージであって、
   該バクテリオファージはバクテリオファージＰｈｉ３３を含み、
   前記改変バクテリオファージは非溶菌性である、改変バクテリオファージ。
2. 不活化された溶菌遺伝子を含む、請求項１に記載の改変バクテリオファージ。
3. 溶菌遺伝子がＳＡＳＰ遺伝子の挿入によって不活化される、請求項２に記載の改変バクテリオファージ。
4. ＳＡＳＰがＳＡＳＰ－Ｃである、請求項１～３のいずれか１項に記載の改変バクテリオファージ。
5. ＳＡＳＰ－Ｃがバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来である、請求項４に記載の改変バクテリオファージ。
6. ＳＡＳＰ遺伝子が構成的プロモーターの制御下にある、請求項１～５のいずれか１項に記載の改変バクテリオファージ。
7. 改変バクテリオファージが標的細菌において複数のコピーで存在する場合、プロモーターが、毒性レベルのＳＡＳＰの産生を促進するために十分に強い、請求項６に記載の改変バクテリオファージ。
8. 構成的プロモーターが、ｐｄｈＡ、ｒｐｓＢ、ｐｇｉ、ｆｄａ、ｌａｓＢ、およびそれらに対して９０％超の配列同一性を有するプロモーターから選択される、請求項６または７に記載の改変バクテリオファージ。
9. 標的細菌の少なくとも１つがシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）である、請求項１～８のいずれか１項に記載の改変バクテリオファージ。
10. シュードモナス細菌が緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を含む、請求項９に記載の改変バクテリオファージ。
11. 尾繊維タンパク質が、標的細菌に結合するための受容体結合領域と、受容体結合領域をバクテリオファージの体部に結合させる領域とを含む、請求項１～１０に記載の改変バクテリオファージ。
12. 受容体結合領域が、Ｃ末端受容体結合領域であり、Ｃ末端受容体結合領域をバクテリオファージの体部に結合させる領域がＮ末端領域であり、
    Ｎ末端領域が、バクテリオファージＰｈｉ３３のアミノ酸配列に基づいて、尾繊維タンパク質のアミノ酸１～６２８位を含み、Ｃ末端領域が、尾繊維タンパク質のアミノ酸６２９～９６４位を含む、請求項１１に記載の改変バクテリオファージ。
13. Ｎ末端領域が、バクテリオファージＰｈｉ３３のＮ末端領域と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１２に記載の改変バクテリオファージ。
14. エンドライシン遺伝子の代わりに緑膿菌フルクトースビスリン酸アルドラーゼ（ｆｄａ）遺伝子プロモーターの制御下で緑膿菌での発現に関してコドン最適化されたバチルス・メガテリウム由来のＳＡＳＰ－Ｃを運ぶように改変されたＰｈｉ３３を含む、請求項９に記載の改変バクテリオファージ。
15. バクテリオファージＰＴＰ２８４を含む、請求項１４に記載の改変バクテリオファージ。
16. （ｉ）請求項１４に記載の改変バクテリオファージ；（ｉｉ）存在する尾繊維の代わりに尾繊維ハイブリッドＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ９２（Ｃ）を運ぶように改変され、エンドライシン遺伝子の代わりに、緑膿菌フルクトースビスリン酸アルドラーゼ（ｆｄａ）遺伝子プロモーターの制御下で、緑膿菌での発現に関してコドン最適化されたバチルス・メガテリウム由来のＳＡＳＰ－Ｃを運ぶ、Ｐｈｉ３３；および、（ｉｉｉ）存在する尾繊維の代わりに尾繊維ハイブリッドＰｈｉ３３（Ｎ）ＰＴＰ４７（Ｃ）を運ぶように改変され、エンドライシン遺伝子の代わりに、緑膿菌フルクトースビスリン酸アルドラーゼ（ｆｄａ）遺伝子プロモーターの制御下で、緑膿菌での発現に関してコドン最適化されたバチルス・メガテリウム由来のＳＡＳＰ－Ｃを有する、Ｐｈｉ３３；エンドライシン遺伝子の代わりに緑膿菌フルクトースビスリン酸アルドラーゼ（ｆｄａ）遺伝子プロモーターの制御下で緑膿菌での発現に関してコドン最適化されたバチルス・メガテリウム由来のＳＡＳＰ－Ｃを運ぶＰｈｉ３３、を含む、改変バクテリオファージの混合物。
17. （ｉ）バクテリオファージＰＴＰ２８４；（ｉｉ）バクテリオファージＰＴＰ３８４；および、（ｉｉｉ）バクテリオファージＰＴＰ３８５を含む、請求項１６に記載の混合物。
18. 薬剤として使用するための、請求項１～１７のいずれか１項に記載の改変バクテリオファージまたは混合物。
19. 細菌感染症の治療に使用するための、請求項１～１７のいずれか１項に記載の改変バクテリオファージまたは混合物。
20. 細菌感染症が、局所臓器感染症または多臓器感染症を含む、請求項１９に記載の改変バクテリオファージまたは混合物。
21. 感染症が、局所感染症、経口感染症、呼吸器感染症、眼の感染症、または血流中の感染症を含む、請求項２０に記載の改変バクテリオファージまたは混合物。
22. ヒトの治療のためである、請求項１８～２１のいずれか１項に記載の改変バクテリオファージまたは混合物。
23. 細菌細胞増殖の治療的阻害または予防に使用するための、請求項１～１７のいずれか１項に記載の改変バクテリオファージまたは混合物。
24. 請求項１～１７のいずれか１項に記載の改変バクテリオファージまたは混合物とその担体とを含む、細菌細胞増殖を阻害または防止するための組成物。
25. 薬学的使用のために調合される、請求項２４に記載の組成物。
26. 局所使用のために調合される、請求項２４または請求項２５に記載の組成物。
27. 請求項１～１７のいずれか１項に記載の改変バクテリオファージまたは混合物を含む、除菌剤。
28. 表面細菌汚染の処理、土壌改良、または水の処理における、請求項２７に記載の除菌剤。

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