ES2768773T3 - Modificación de bacteriófagos - Google Patents

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Abstract

Un método para la incorporación en el genoma de un fago lítico diana de una secuencia de ADN exógeno, donde el genoma del fago lítico diana incluye una primera secuencia diana y una segunda secuencia diana, cuyo método comprende: (a) proporcionar un vector que contenga una región de direccionamiento del fago que comprenda (i) un determinante de intervalo de huéspedes de un fago marcador, diferente del determinante de intervalo de huéspedes del fago lítico diana, y (ii) una secuencia de ADN exógeno: donde la región de direccionamiento del fago está flanqueada por la primera y segunda secuencias flanqueantes homólogas a la primera y segunda secuencias del genoma del fago lítico diana; (b) introducir el vector en una primera célula huésped, cuya célula huésped es un huésped para el fago lítico diana; (c) infectar la primera célula huésped con el fago lítico diana; (d) permitir que tenga lugar la replicación y recombinación del fago de manera que el genoma del fago lítico diana se modifique; (e) propagar el fago resultante en una segunda célula huésped, cuya célula huésped es un huésped para el fago marcador y no para el fago lítico diana; y (f) recolectar el fago resultante, de manera que el genoma del fago lítico diana está modificado por la incorporación en el mismo de una secuencia de ADN exógeno.

Description

DESCRIPCIÓN
Modificación de bacteriófagos
La presente invención se refiere a un método para la modificación del genoma de un fago lítico diana, y los usos del método.
Antecedentes de la invención
Los bacteriófagos son los organismos más abundantes en el mundo y se estima que en cualquier momento hay presentes 103<r Según nos consta, los bacteriófagos pueden habitar cualquier entorno imaginable (Brabban et al., 2005), proporcionando de esta manera un enorme reservorio de diversidad biológica para su uso en biotecnología. Los fagos se han utilizado en una variedad de aplicaciones, tales como fagos de presentación para caracterizar interacciones proteína-proteína (Smith y Petrenko, 1997), ensayos diagnósticos para la rápida identificación de agentes patógenos bacterianos (Dobozi-King et al., 2005), y en el tratamiento de infecciones bacterianas mediante "terapia con fagos" (Harper et al., 2011). Otro uso de los fagos es como base de modificación para producir vehículos de suministro genético a medida, que se puede utilizar para el suministro de genes que codifiquen proteínas tóxicas que se dirijan a bacterias patógenas. Dicha estrategia se describe en el sistema SASPject (documento WO 2009/019293), en el que se modifican los bacteriófagos para que sean no líticos, por tanto, no viables en último término, y que llevan un casete de expresión del gen SASP, que se suministra en las bacterias diana, lo que da lugar a la rápida expresión de SASP. SASP quiere decir pequeñas proteínas de espora solubles en ácido, que protegen el ADN de endosporas de bacterias grampositivas durante la latencia. Sin embargo, al expresarse la SASP en las células vegetativas, se produce una rápida unión de la SASP al ADN de la célula de una manera no específica de secuencia (Nicholson et al., 1990) dando lugar a una muerte celular rápida.
Los fagos se pueden dividir ampliamente en fagos moderados y fagos no moderados (Abedon, 2008). Los fagos moderados son capaces de existir con dos tipos de vida distintos. En un tipo de vida, los fagos moderados se replican "líticamente" - infectan la célula huésped, se replican y producen una nueva progenie de fagos, un proceso que termina con la lisis de la célula y la liberación de partículas maduras de fago. En el otro tipo de vida, los fagos moderados infectan la célula y se integran en el genoma de la célula huésped, normalmente en sitios de unión específicos, convirtiéndose en "profagos". De esta manera, se convierten en una parte transitoria del genoma de la célula huésped y se replican junto con el ADN de la célula huésped. El profago integrado es inocuo para su célula huésped mientras está en este estado integrado, y a menudo puede proporcionar una ventaja selectiva a la célula, proporcionando genes adicionales a la célula, por ejemplo el profago CTX proporciona genes de toxina CTX al Vibrio cholera, aumentando la virulencia de dichas cepas en comparación con las cepas que no llevan el gen de toxina (Waldor y Mekalanos, 1996). Por el contrario, los fagos no moderados, conocidos de otra manera como fagos "líticos", solo son capaces de replicarse con un tipo de vida lítico como se ha descrito anteriormente - no pueden integrarse en el ADN de la célula huésped y por lo tanto nunca llegan a formar parte del genoma de la célula huésped: Por lo tanto, dichos fagos se describirán como "líticos obligados" para distinguirlos de los fagos moderados que son capaces de la replicación lítica y por profagos.
Cuando se escoge un fago para la modificación genética, por ejemplo, cuando dicho fago actúa como vector de suministro de un gen que codifique una proteína antibacteriana, tal como una SASP, la viabilidad del fago para la modificación genética es un factor importante. En términos generales, los bacteriófagos moderados se modifican genéticamente de manera fácil, posibilitando que las especies bacterianas huéspedes se puedan modificar mediante técnicas de genética molecular convencionales que impliquen la recombinación y selección por marcadores de resistencia, o un sistema de recombinodificación (Thomason et al., 2014).
Los fagos moderados, en forma de lisógenos que llevan el ADN del fago integrado como un profago, se pueden modificar para que lleve un ADN exógeno unido a cualquiera de una amplia matriz de marcadores genéticos, tales como marcadores de resistencia a antibióticos o metales pesados. Dichos marcadores se pueden unir a un ADN exógeno y se flanquean por regiones de ADN del profago y se clonan en vectores adecuados que no son replicantes (vectores suicidas) en el huésped bacteriano (lisógeno). Con la introducción de dichos plásmidos en la bacteria lisogénica, mediante métodos comunes tales como la conjugación o la transformación química o eléctrica, se pueden seleccionar los recombinantes que se hayan integrado mediante secuencias homólogas presentes en el plásmido, mediante el marcador de resistencia unido al ADN exógeno. También se pueden utilizar marcadores contra genéticos en la modificación de fagos moderados. El fago recombinante que retenga el marcador de resistencia se puede explorar mediante métodos comunes tales como PCR. De manera alternativa, se puede modificar un marcador contra genético, tal como sacB, en el armazón del plásmido utilizado para la modificación de dicho fago, y se puede aislar el profago recombinante que solo tiene el ADN exógeno seleccionando el marcador de resistencia unido al ADN exógeno, pero contra el marcador contra genético. El genotipo se puede confirmar mediante PCR. Dichos vectores están disponibles de manera común. Dicho fago modificado puede inducirse a partir de la cepa lisogenizada, por ejemplo, mediante la adición de Mitomicina C (Williamson et al., 2002) en cuyo punto el fago se escinde del cromosoma del huésped y entra en su fase lítica, de manera que el marcador retenido no puede seleccionarse más, pero el marcador y el ADN exógeno permanece en el genoma del fago.
El aislamiento del fago lítico modificado genéticamente, sin embargo, no se puede conseguir utilizando los mismos métodos descritos anteriormente. Por ejemplo, es imposible utilizar una selección positiva convencional para aislar los fagos líticos obligados modificados, ya que no se pueden seleccionar tal como por marcadores de resistencia a antibióticos o metales pesados, que transmiten resistencia a la bacteria, debido al tipo de vida obligatoriamente lítica del fago. El ADN del fago nunca se convierte en parte del genoma de la célula huésped y por lo tanto los marcadores genéticos de resistencia que transmiten resistencia al huésped no se pueden seleccionar cuando se localizan en los fagos líticos obligados.
Se han desarrollado algunas técnicas para la modificación de fagos líticos. Uno de dichos ejemplos es la técnica BRED (recombinación de bacteriófago de ADN electroporado) (Marinelli et al., 2008), que utiliza una estrategia de "recombinodificación", y que se ha descrito para la modificación de fagos de Mycobacterium. Los métodos de recombinodificación para la modificación de los genomas bacterianos se describió por primera vez en el sistema A Red (Yu et al., 2000). En esta técnica, las proteínas de recombinación Exo y Beta catalizan la recombinación eficaz de la secuencia de ADN lineal introducida en la célula huésped mediante transformación. La estrategia BRED utiliza de manera similar las proteínas promotoras de la recombinación - las proteínas gp60 y gp61 tipo RecE/RecT de un bacteriófago de Mycobacterium - para promover altos niveles de recombinación cuando los genomas del fago se co­ transforman con fragmentos de ADN lineal "direccionado" en células de M. smegmatis. Entonces se explora el fago recombinante y se identifica con relativa facilidad debido a la alta eficacia de recombinación. Sin embargo, dicha estrategia se basa en el desarrollo de un sistema de recombinodificación eficaz en la especie bacteriana escogida. Además, los genomas de los fagos son grandes (Hendrix, 2009) y la transformación de grandes moléculas de ADN es ineficaz incluso en bacterias fácilmente transformables tales como E. coli (Sheng et al, 1995), y las técnicas de transformación eficaz no se han desarrollado en muchas especies bacterianas.
Se han desarrollado algunas técnicas para la modificación de ciertos bacteriófagos. Por ejemplo, se ha desarrollado una técnica conocida como RlPh (inhibición de la replicación de fagos mediada por Rho*) para el fago T4 (Pouillot et al., 2010). Los genes tempranos esenciales para la replicación del fago se transcriben como ARN concatenados de ejecución continua que necesitan el factor terminador Rho del huésped para la producción de proteínas tempranas. Se descubrió que modificando E. coli para que contuviera una copia de Rho mutada sobre expresada controlada por un inductor, llamada Rho*, se inhibía la producción de proteínas tempranas del T4 y por lo tanto se inhibía reversiblemente la replicación del fago T4, con un mínimo efecto sobre la viabilidad de la célula huésped. En este estado, el genoma de T4 no se replica y no hay continuación del ciclo de vida del fago hacia la síntesis de fagos maduros y la lisis, pero no se pierde de la célula y es un sustrato para la recombinación. En la técnica RlPh, se utiliza en sistema A Red para dirigir la recombinación en el genoma del T4 mientas está en este estado suspendido estable. La retirada del inductor permite que el fago continúe con su ciclo de vida y se forma el fago modificado maduro.
Otros ejemplos de sistemas de modificación de fagos líticos obligados se encuentran en el fago T7. Los genes de E. coli trxA y cmk son necesarios para la propagación del fago T7 pero no son necesarios para el crecimiento de la célula huésped (Qimron et al, 2006; Mark, 1976). Por lo tanto, se podría modificar el T7 para que lleve cualquiera de estos genes "marcadores", seleccionando el fago recombinante en células huésped modificadas que carezcan de los genes marcadores. Sin embargo, en ambos ejemplos de T4 y T7, se necesita un conocimiento bastante específico y detallado de la maquinaria de replicación del fago, sobre los genes de la célula huésped que son necesarios específicamente para la replicación del fago.
Yoichi et al., en J. Biotech., 115(1), 101-107 (2005) describen el cambio de especificidad en la infección del fago T2 mediante la alteración de la proteína gp38 de las fibras de la cola. Tao et al., en PNAS, 110(15), 5846-5851 (2013) describen el suministro in vitro e in vivo de genes y proteínas utilizando cabezas vacías de bacteriófago T4 como un vehículo de suministro progenético. DePorter y McNaughton en Bioconjugate Chemistry 25(9), 1620-1625 (2014) describen nanovehículos de bacteriófago M13 para el suministro intracelular de proteínas exógenas a las células cancerosas de próstata humanas.
Sería deseable tener una técnica para modificar el genoma de los fagos líticos que no se base en un conocimiento detallado de los genes implicados en la ruta de replicación del fago o los genes de la célula huésped necesarios para la propagación del fago en la célula. Sería deseable adicionalmente que dicha técnica sea aplicable ampliamente a los fagos de cualquier especie bacteriana.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona: un método para la incorporación en el genoma de un fago lítico diana de una secuencia de ADN exógeno, donde el genoma del fago lítico diana incluya una primera secuencia diana y una segunda secuencia diana, cuyo método comprende:
(a) proporcionar un vector que contenga una región de direccionamiento del fago que comprenda
(i) un determinante de intervalo de huéspedes de un fago marcador, diferente del determinante de intervalo de huéspedes del fago lítico diana, y
(ii) una secuencia de ADN exógeno:
donde la región de direccionamiento del fago está flanqueada por la primera y segunda secuencias flanqueantes homólogas a la primera y segunda secuencias del genoma del fago lítico diana;
(b) introducir el vector en una primera célula huésped, cuya célula huésped es un huésped para el fago lítico diana;
(c) infectar la primera célula huésped con el fago lítico diana;
(d) permitir que tenga lugar la replicación y recombinación del fago de manera que el genoma del fago lítico diana se modifique;
(e) propagar el fago resultante en una segunda célula huésped, cuya célula huésped es un huésped del fago marcador y no del fago lítico diana; y
(f) recolectar el fago resultante, de manera que el genoma del fago lítico diana está modificado por la incorporación en el de una secuencia de ADN exógeno.
Se ha descubierto sorprendentemente que se puede utilizar un determinante del intervalo de huéspedes de un fago como marcador genético para modificar el genoma de un fago relacionado. Los inventores han llamado a esta técnica Selección de determinante del intervalo de huéspedes (HORDS). La presente invención es particularmente útil para la modificación genética de fagos líticos obligados que no pueden formar lisógenos, ya que proporciona un medio de selección genética que no se basa en características de selección de la célula huésped, sino que en vez de eso selecciona una característica hereditaria del fago en su estado lítico.
Esta técnica no se basa en el conocimiento detallado específico de los genes implicados en la ruta de replicación del fago y/o en los genes de la célula huésped necesarios para la propagación del fago en la célula, no necesitando de esta manera una experimentación excesiva sobre el fago antes de la modificación. Además, esta técnica se puede aplicar ampliamente a fagos de cualquier especie bacteriana. Esta técnica necesita la identificación de factores del fago que dictan su intervalo de huéspedes, junto con factores del fago relacionado. Esto se puede llevar a cabo fácilmente por un experto en la técnica, según las directrices de esta solicitud.
El genoma del fago lítico diana se modifica por la incorporación en éste de una secuencia de ADN exógeno. El genoma del fago lítico diana puede modificarse adicionalmente mediante la incorporación de una mutación tal como una mutación puntual o creando una eliminación. También se pueden hacer combinaciones de estas modificaciones. Debido a que la primera y segunda secuencias flanqueantes de la región de direccionamiento del fago son homólogas a la primer y segunda secuencias diana del genoma del fago lítico diana, una vez que la primera célula huésped contenga tanto el vector como el fago lítico diana, el fago puede replicarse y tendrá lugar la recombinación entre los pares de secuencias homólogas. A continuación de la recombinación, solo los fagos resultantes que lleven el determinante de intervalo de huéspedes del fago marcador se pueden propagar en la segunda célula huésped. Esto hace posible la selección del fago resultante deseado que contenga el determinante de intervalo de huéspedes del fago marcador.
La primera y segunda secuencias diana del genoma del fago lítico diana pueden ser contiguas o no contiguas. En una disposición, la primera y segunda secuencias del genoma del fago lítico diana no son contiguas. De acuerdo con esta disposición, cuando se produce un evento de recombinación entre la primera y la segunda secuencias flanqueantes y la primera y segunda secuencias diana, se escinde la región de ADN entre la primera y segunda secuencias diana del genoma del fago lítico diana lo que da como resultado una eliminación. De manera ventajosa, cuando la primera y segunda secuencias diana del genoma del fago lítico diana flanquean un gen del fago o parte del mismo, dicha eliminación da como resultado la inactivación del gen después de la recombinación. En una disposición el gen del fago es un gen de lisis tal como de una endolisina. De esta manera el fago lítico diana se puede convertir en no lítico.
La modificación del genoma del fago lítico diana implica la incorporación de una secuencia de ADN exógeno y de esta manera la región de direccionamiento del fago vector comprende adicionalmente una secuencia de ADN exógeno para su incorporación en el genoma del fago diana. Debido a que la secuencia de ADN exógeno y el determinante de intervalo de huéspedes del fago marcador se encuentran dentro de la primera y segunda secuencias flanqueantes de la región de direccionamiento del fago, la recombinación del fago para seleccionar el determinante de intervalo de huéspedes dará como resultado la incorporación de la secuencia de ADN exógeno en el fago resultante. La primera y segunda secuencias diana del genoma del fago lítico diana pueden ser contiguas o no contiguas. Cuando no son contiguas, la incorporación de la secuencia de ADN exógeno dará como resultado la eliminación simultánea de una región del genoma. Cuando la primera y la segunda secuencias diana se posicionan en un gen del fago o cuando flanquean un gen del fago o parte del mismo, la incorporación de la secuencia de ADN exógeno dará como resultado la inactivación simultánea del gen después de la recombinación.
Cuando es necesario que se incorpore una mutación, tal como una mutación puntual en el fago lítico diana, al menos una de la primera y segunda secuencias flanqueantes de la región de direccionamiento del fago contendrán la mutación en comparación con la primera y segunda secuencias diana del genoma del fago lítico diana. Con la replicación y recombinación del fago, el genoma del fago lítico diana se modificará de manera que incorpore la mutación. De esta manera, se aislará el fago que lleve el determinante de intervalo de huéspedes del fago marcador y se podría explorar la presencia de la mutación.
Como se ha descrito anteriormente, la introducción de dichas mutaciones podría combinarse opcionalmente con la incorporación de una secuencia de ADN exógeno junto con una eliminación en el fago lítico diana.
Normalmente el vector que contiene la región de direccionamiento del fago es un plásmido. Dichos vectores son capaces de la replicación en la primera célula huésped.
De acuerdo con la presente invención, el determinante de intervalo de huéspedes del fago marcador codifica normalmente una proteína de la placa base, o una proteína de las fibras de la cola, o región de las mismas. En general, en el caso de las proteínas de las fibras de la cola, cada una comprende una región de unión al receptor en el extremo C para unirse a la bacteria diana y una región de extremo N que une la región de unión al receptor del extremo C con el cuerpo del bacteriófago. En una disposición, tomando el Phi33 y el fago relacionado como ejemplo, la región del extremo N comprende los aminoácidos 1 a 628 de la proteína de las fibras de la cola y la región del extremo C comprende los aminoácidos 629 a 964 de la proteína de las fibras de la cola.
La región del extremo C puede tener no más de un 96 % de identidad de secuencia con la región del extremo C del bacteriófago Phi33 y puede ser de uno cualquiera de los bacteriófagos, Phi33, LBL3, SPM-1, F8, PB1, KPP12, LMA2, SN, 14-1, JG024, NH-4, PTP47, c 36, PTP92 y PTP93. Se prefieren identidades de secuencia de aminoácidos menores de la región del extremo C. Ventajosamente, la identidad de secuencia es menor del 90 %, más ventajosamente menor del 80 %, preferentemente menos del 70 %, más preferentemente menos del 60 %, más preferentemente aún menos del 50 %, particularmente preferentemente menos del 40 %, más particularmente preferentemente menos del 30 %. La región del extremo N puede tener al menos un 90 % y ventajosamente al menos un 95 % de identidad de secuencia con la región del extremo N del bacteriófago Phi33 y puede ser de uno cualquiera de los bacteriófagos, Phi33, LBL3, SPM-1, F8, PB1, KPP12, LMA2, SN, 14-1, JG024, NH-4, PTP47, C36, PTP92 y PTP93. Normalmente, cada proteína de las fibras de la cola tiene más de un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de las fibras de la cola del bacteriófago Phi33, ventajosamente más del 85 %, preferentemente más del 90 % y más preferentemente más del 95 % de identidad de secuencia entre ellas. La región del extremo N y la región del extremo C pueden ser del mismo bacteriófago para proporcionar una proteína de las fibras de la cola homóloga. La región del extremo N y la región del extremo C pueden ser del mismo bacteriófago para proporcionar una proteína de las fibras de la cola homóloga. En una disposición donde la proteína de las fibras de la cola del fago es homóloga, cada proteína de las fibras de la cola es de un bacteriófago seleccionado de entre Phi33, LBL3, SPM-1, F8, PB1, KPP12, LMA2, SN, 14-1, JG024, NH-4, PTP47, C36, PTP92 y PTP93.
En una disposición, la presente invención se puede utilizar para modificar un bacteriófago lítico obligado. En otra disposición. La invención se puede utilizar para modificar un fago moderado, durante el crecimiento lítico.
En una disposición adicional, la presente invención es particularmente útil para la modificación de un bacteriófago lítico obligado para su uso como vehículo de suministro genético. En una disposición preferida, la presente invención se podría utilizar para modificar un fago lítico para que lleve un gen de una proteína antibacteriana.
Como alternativa a los antibióticos convencionales, una familia de proteínas que ha demostrado una actividad antibacteriana de amplio espectro dentro de las bacterias comprende las proteínas pequeñas de esporas solubles en ácido de tipo a/p (conocidas de aquí en adelante como SASP). Dentro de las bacterias, las SASP se unen al ADN bacteriano: la visualización de este proceso, utilizando microscopía crioelectrónica, ha demostrado que el SspC, la SASP más estudiada, reviste el ADN y forma dominios que protruyen y modifica la estructura del ADN (Francesconi et al., 1988; Frenkiel-Krispin et al., 2004) desde el ADN tipo B (a una distancia de 3,4 nm) hacia el tipo A (3,18 nm; el ADN tipo A tiene una distancia de 2,8 nm). Los motivos de la SspC que protruyen interactúan con filamentos de SspC del ADN adyacente empaquetando los filamentos en un ensamblaje estrecho de hélices nucleoproteicas. En 2008, Lee et al., publicó la estructura cristalina con una resolución de 2.1 A de una SASP tipo a/p unido a un dúplex de ADN de 10 pb. En el complejo, la SASP tipo a/p adopta un motivo de hélice de vuelta helicoidal, interactúa con el ADN mediante contactos de agrupamientos menores, se une a aproximadamente 6 pb del ADN como un dímero y el ADN está en una conformación tipo A-B. De esta manera se detiene la replicación del ADN y, cuando se une, la SASP evita la transcripción de ADN. La SASP se une al ADN de una manera no específica de la secuencia (Nicholson et al., 1990) de manera que las mutaciones del ADN bacteriano no afecten la unión de las SASP. Las secuencias de SASP tipo a/p se pueden encontrar en el apéndice 1 del documento WO 02/40678, incluyendo la SASP-C de Bacillus megaterium que es la SASP de tipo a/p preferida. El documento WO 02/40678 describe el uso de un agente antimicrobiano de bacteriófago modificado para incorporar un gen de SASP.
Los vectores de bacteriófago modificados para que contengan un gen de SASP se han llamado en general vectores SASPject. Una vez que se ha suministrado el gen SASP de una bacterina diana, se produce el SASP en el interior de las bacterias donde se une al ADN bacteriano y cambia la conformación del ADN desde el tipo B hacia el tipo A. La producción de suficiente SASP dentro de las células bacterianas diana produce una vaída de la viabilidad de células afectadas.
En realizaciones particularmente preferidas, el método de la presente invención puede utilizarse para modificar un casete de expresión de SASP en un fago para crear un vector SASPject, esta técnica se podría utilizar también para modificar un casete de expresión de SASP en un fago y simultáneamente eliminar un gen lítico para crear un vector SASPject.
En consecuencia, en una disposición de acuerdo con la invención, el ADN exógeno comprende un gen que codifica una proteína pequeña de esporas soluble en ácido a/p (SASP). De esta manera, el método de la invención puede utilizarse para producir un bacteriófago modificado capaz de infectar una pluralidad de diferentes bacterias diana. El bacteriófago modificado incluye una SASP que es tóxica para la bacteria diana, donde el bacteriófago normalmente es no lítico.
En un aspecto, el término 'SASP' como se utiliza en la presente memoria descriptiva se refiere a una proteína con una actividad de SASP tipo a/p, es decir, la capacidad de unirse al ADN y modificar su estructura desde su forma tipo B hacia su forma tipo A, y no solo cubre las proteínas enumeradas en el apéndice 1 del documento WO 02/40678 sino también cualquier homóloga de las mismas así como cualquier otra proteína que tenga actividad de SASP tipo a/p. En un aspecto alternativo, el término 'SASP' como se utiliza en la memoria descriptiva se refiere a cualquier proteína enumerada en el apéndice 1 del documento WO 02/40678, o cualquier homóloga que tenga al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con una cualquiera de las proteínas listadas en el apéndice 1 del documento WO 02/40678. En otro aspecto alternativo, el término 'SASP' como se utiliza en la memoria descriptiva se refiere a cualquier proteína enumerada en el apéndice 1 del documento WO 02/40678.
El gen de SASP puede escogerse de entre uno cualquiera de los genes que codifican la SASP desvelados en el Apéndice 1 del documento WO 02/40678. En una disposición preferida, la SASP es una SASP-C. La SASP-C puede ser del Bacillus megaterium.
Se prefiere que el gen de la SASP está bajo el control de un promotor constitutivo que es de manera ventajosa lo suficientemente fuerte para dirigir la producción de niveles tóxicos de SASP cuando el bacteriófago está presente en múltiples copias en la bacteria diana. Los promotores constitutivos útiles incluyen el pdhA de las subunidades alfa del componente E1 de la piruvato deshidrogenasa, rpsB para la proteína S2 ribosómica 30S, pgi para la glucosasfosfato isomerasa y el promotor genético fda de la fructosa bisfosfato aldolasa. Los promotores regulados preferidos, activos durante la infección, son lasB para la elastasa. Estos promotores son normalmente de P. aeruginosa. Los promotores que tienen una secuencia que presente al menos un 90 % de identidad de secuencia con estas secuencias promotores también se pueden utilizar.
Cuando el método de la invención se utiliza para proporcionar un bacteriófago modificado, este puede expresar una pluralidad de determinantes de intervalo de huéspedes, donde cada determinante de intervalo de huéspedes tiene una especificidad diferente para la bacteria huésped. De manera alternativa, el bacteriófago modificado, puede expresar una proteína determinante de intervalo de huéspedes híbrida que comprende una secuencia de aminoácidos de una pluralidad de diferentes bacteriófagos. Cada determinante de intervalo de huéspedes puede ser una proteína de las fibras de la cola. La especificidad del huésped bacteriano de los determinantes de intervalo de huéspedes está ventajosamente dentro de la misma especie bacteriana.
En un aspecto adicional, se proporciona una composición para la inhibición o prevención del crecimiento de las células bacterianas, que comprende un bacteriófago modificado o mezcla de los mismos como se define en el presente documento y un vehículo. Dicha composición puede tener un amplio intervalo de usos y por lo tanto se va a formular de acuerdo con el uso que se pretende. La composición se puede formular como un medicamento especialmente para el tratamiento del ser humano y se pueden tratar distintas afecciones, incluyendo las infecciones bacterianas. Entre estas infecciones que se pueden tratar de acuerdo con la presente invención son infecciones localizadas en tejidos u órganos, incluyendo las infecciones de la corriente sanguínea, infecciones tópicas, vehículos dentales, infecciones respiratorias, e infecciones oculares. El vehículo puede ser un receptor o diluyente farmacéuticamente aceptable. La naturaleza exacta y las cantidades de los componentes de dichas composiciones se pueden determinar empíricamente y dependerán en parte de las vías de administración de la composición.
Las vías de administración a los receptores incluyen la intravenosa, intraarterial, oral, bucal, sublingual, intranasal por inhalación, tópica (incluyendo la oftálmica), intramuscular, subcutánea e intraarticular. Por comodidad de uso, las dosificaciones de acuerdo con la invención dependerán del sitio y tipo de la infección que se va a tratar o prevenir. Las infecciones respiratorias se pueden tratar mediante administración por inhalación y las infecciones oculares se pueden tratar utilizando gotas oftálmicas. También se proporcionan productos de higiene oral que contienen el bacteriófago modificado; se puede utilizar un enjuague bucal o pasta de dientes que contenga el bacteriófago modificado de acuerdo con la invención formulado para eliminar las bacterias asociadas con la formación de la placa dental.
Un bacteriófago modificado producido de acuerdo con la invención se puede utilizar como un descontaminante bacteriano, por ejemplo, en el tratamiento de la contaminación bacteriana de superficie así como remedios del suelo o tratamiento del agua. El bacteriófago se puede utilizar en el tratamiento de personal médico y/o pacientes como un agente descontaminante, por ejemplo, como un lavado de manos. El tratamiento de las superficies de trabajo y el equipamiento también se proporciona, especialmente el que se utiliza en procedimientos hospitalarios o en la preparación de alimentos. Una realización particular comprende una composición formulada para su uso tópico en la prevención, eliminación o reducción de carga bacteriana y contaminación de un individuo a otro. Es importante limitar la transmisión de infecciones microbianas, particularmente en un entorno hospitalario donde son prevalentes bacterias resistentes a los antibióticos convencionales. Para dicho uso, el bacteriófago modificado puede contenerse en una solución salina de tampón Tris o solución salina de tampón de fosfato o se puede formular dentro de un gel o crema. Para un uso múltiple, se le puede añadir un conservante. De manera alternativa, el producto se puede liofilizar y se pueden añadir excipientes, por ejemplo, un azúcar tal como la sacarosa.
Descripción detallada de la técnica
En la presente invención se ha descubierto que se pueden identificar múltiples fagos que lleven determinantes de intervalo de huéspedes homólogos. Dichos fagos pueden aislarse. Por ejemplo, se puede aislar el fago que infecte Pseudomonas aeruginosa explorando fagos de fuentes ambientales que sean capaces de formar placas en las cepas de Pseudomonas aeruginosa (Gill y Hyman, 2010). El fago aislado puede tener secuenciado y anotado todo su genoma. De manera alternativa, se podrían explorar en las bases de datos de secuencias de ADN los determinantes de intervalo de huéspedes. En septiembre de 2014 había -1400 secuencias genómicas de fagos depositadas en la base de datos del Centro Nacional de Información biotecnológica (NCBI).
Los HRD pueden ser proteínas de las fibras de la cola, que se ha descubierto que son comúnmente proteínas responsables del reconocimiento/unión inicial a la bacteria huésped, por ejemplo, en el fago T4, T5 y T7 (Rakhuba et al., 2010). De manera alternativa, otros HRD pueden ser proteínas de la placa base. Los genomas de los fagos se pueden explorar en cuanto a secuencias potenciales de HRD evaluando la homología de todas las proteínas del genoma del fago con secuencias conocidas utilizando búsquedas BLAST. En ventajosos identificar las proteínas de las fibras de la cola que sean homólogas. Por ejemplo, se han identificado varios fagos Phi33, PTP47, PTP92 y C36 - con un amplio intervalo de huéspedes para las cepas de P. aeruginosa, y se han secuenciado sus genomas. El análisis de las secuencias del genoma de Phi33, PTP47, PTP92 y C36 revela que contienen genes que codifican supuestas proteínas de las fibras de la cola con un alto nivel de identidad de secuencias (identidad de aminoácidos entre paréntesis): C36 (96 %), PTP47 (86 %), PTP92 (83 %). Las búsquedas con BLAST han demostrado que estos 4 fagos están relacionados con otras 10 secuencias genómicas de fagos depositadas que, en conjunto, forman la familia de los fagos tipo PB1: PB1, SPM1, F8, LBL3, KPP12, LMA2, SN, JG024, NH-4, 14-1 (Ceyssens et al., 2009). Se evaluó la homología de estas supuestas proteínas de fibras de la cola. Después de un alineamiento BLAST de 2 secuencias, en comparación con la proteína de las fibras de la cola de Phi33 (identidad de aminoácidos entre paréntesis): LBL3 (96 %), SPM-1 (95 %), F8 (95 %), PB1 (95 %), KPP12 (94 %), LMA2 (94 %), SN (87 %), 14-1 (86 %), JG024 (83 %), NH-4 (83 %). Un alineamiento de los 14 fagos mencionados anteriormente se muestra en la Figura 6.
El análisis de las secuencias de proteínas de las fibras de la cola anotadas de estos 14 fagos reveló que la región del extremo N de las proteínas - equivalentes a los aminoácidos de las fibras de la cola de Phi33 1-628 - presentan un nivel incluso más alto de identidad de secuencia a nivel de aminoácidos que la identidad de secuencias de estas proteínas sobre su longitud completa, en el intervalo del 96-100% para las 14 proteínas. Después de un alineamiento BLAST de 2 secuencias, en comparación con los aminoácidos 1-628 del extremo N de la proteína de las fibras de la cola de Phi33 (identidad de aminoácidos entre paréntesis): LBL3 (96 %), SPM-1 (96 %), F8 (96 %), PB1 (96 %), KPP12 (98 %), LMA2 (99 %), SN (99 %), 14-1 (97 %), JG024 (97 %), NH-4 (97 %), PTP47 (98 %), C36 (96 %), PTP92 (97 %). Sin embargo, la región del extremo C de la proteína - equivalente a los aminoácidos 629-964 de las fibras de la cola de Phi33 - no está tan conservada como la región del extremo N en algunas de las proteínas, siendo el intervalo de identidad de secuencia normalmente del 57-96 %. Después de un alineamiento BLAST de 2 secuencias, en comparación con los aminoácidos 629-964 del extremo C de la proteína de las fibras de la cola de Phi33 (identidad de aminoácidos entre paréntesis): LBL3 (94 %), SPM-1 (93 %), F8 (93 %), PB1 (94 %), KPP12 (87%), LMA2 (85%), SN (65%), 14-1 (65%), JG024 (57 %), NH-4 (57%), PTP47 (64%), C36 (96%), PTP92 (57 %). El análisis de las fibras de la cola del fago de otros fagos bien caracterizados ha demostrado que poseen una región de unión a la placa base de la cola en el extremo N y una región de unión al receptor en el extremo C (Veesler y Cambillau, 2011). En un análisis experimental de su intervalo de cepas huéspedes, utilizando un ensayo de placas o ensayos de inhibición del crecimiento, los fagos Phi33, PTP47, PTP92 y C36 tenían un intervalo de huéspedes solapado pero no idéntico (Tabla 1). En conjunto con la evidencia establecida del papel de la región del extremo C de las fibras de la cola del fago que está implicada en la unión con el receptor del huésped bacteriano, y la variación de secuencia en la región del extremo C de estos 4 fagos, y su intervalo de huéspedes similar pero no idéntico, se postula que la variación del extremo C está asociada con el intervalo de huéspedes en el fago evaluado.
Se proporciona adicionalmente, de acuerdo con la presente invención, que los genes para las proteínas de las fibras de la cola homólogas se tomen de un fago y se añadan a otro, basándose en su alto nivel de identidad de secuencia de la región del extremo N. Se cree que la región del extremo N está implicada en la unión de las fibras de la cola a la cola del fago (Veesler y Cambillau, 2011), permitiendo la formación de un fago viable con el intervalo de huéspedes asociado con las fibras de la cola del fago donante. De manera alternativa se pueden producir genes híbridos de las fibras de la cola, que lleven la región de unión a la cola del extremo N conservada de las fibras de la cola de un fago receptor, junto con la región variable de unión al receptor del extremo C de una proteína de las fibras de la cola de un fago donante heterólogo, utilizando los genes de las fibras de la cola tales como los que se describen en el presente documento. Dichos genes híbridos de las fibras de la cola se podrían utilizar para remplazar algunas de las fibras de la cola del fago. Esto proporciona una región del extremo N de las fibras de la cola híbridas (del fago receptor) y permite la formación de fagos viables con el intervalo de huéspedes asociado con la región de unión al receptor del extremo C de las fibras de la cola del fago donante. El trasplante de los genes híbridos de las fibras de la cola modificados en un fago receptor se ha demostrado en la presente invención. Utilizando técnicas de genética molecular convencionales, se ha modificado el Phi33 para que lleve híbridos de las fibras de la cola heterólogos de los siguientes fagos: PTP92, PTP47, LBL3, SPM-1, F8, PB1, KPP12, LMA2, SN, 14­ 1, NH-4. Todos los fagos modificados demostraron ser viables y capaces de formar placas en P. aeruginosa. (La nomenclatura de los híbridos de las fibras de la cola es la siguiente: A modo de ejemplo, un gen híbrido de manera que la región de unión a la cola del extremo N de Phi33 se hibrida con la región de unión al receptor del extremo C de PTP47 es Phi33(N)PTP47(C)).
El fago Phi33 y PTP92. Tienen un intervalo de huéspedes similar pero no idéntico. Por lo tanto se postula que el intervalo de huéspedes de PTP92 podría heredarse por Phi33, mediante el remplazo del gen de las fibras de la cola en Phi33 (denominada ORF32) por un gen híbridos de las fibras de la cola Phi33(N)PTP92(C). El gen híbrido se hace utilizando la secuencia de ADN que codifica la región del extremo N de Phi33 (equivalente a los aminoácidos 1­ 628) y la región del extremo C de PTP92 (equivalente a los aminoácidos 629-962), creando así un gen híbrido de las fibras de la cola. El razonamiento para utilizar estas regiones para crear este gen híbrido es evidente a partir de los análisis anteriores de estas proteínas. Las regiones del extremo N de ambas proteínas de las fibras de la cola, que se cree que están implicadas en la unión del fago, son idénticas al 97 %; las regiones del extremo C de ambas proteínas de las fibras de la cola, que se cree que están implicadas en la unión al receptor de la célula huésped, son idénticas en el 57 %. El gen híbrido de las fibras de la cola estaba flanqueado por el a Dn de Phi33, utilizando -1000 pb de la secuencia a cada lado de la ORF32 de Phi33 (el gen nativo de las fibras de la cola de Phi33), y se clonaron en un plásmido. El plásmido se introdujo en una cepa de P. aeruginosa susceptible a la infección por Phi33 y la cepa resultante se infectó con Phi33 para producir un lisado con fagos. Dentro de este lisado, existirían fagos recombinantes, que llevarían las fibras de la cola híbridas más que las fibras de la cola nativas de Phi33. El lisado con fagos se utilizó para infectar una cepa que era capaz de producir placas de PTP92 pero no de Phi33. Por lo tanto, el fago Phi33 no recombinante no se propagaría en este huésped y se seleccionaría contra las placas de Phi33 que llevan un gen híbrido de las fibras de la cola Phi33-PTP92 sería capaz de propagarse y se seleccionaría. Se aislaron las placas y se exploraron por PCR para evaluar su genotipo. Se descubrió que todas las placas ensayadas llevaban la región del extremo N de Phi33 y la región del extremo C de PTP92 y por lo tanto el intervalo de huéspedes de PTP92 se transfirió al Phi33.
El Phi33 se ha modificado de manera similar para que lleve híbridos de las fibras de la cola (lleva la región del extremo N de Phi33) de los siguientes fagos: PTP92, PTP47, LBL3, SPM-1, F8, PB1, KPP12, LMA2, SN, 14-1, NH-4. Todos los fagos modificados demostraron ser viables y capaces de formar placas en P. aeruginosa.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se describirá ahora con mayor detalle por medio solo de ejemplos, y con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
La Figura 1 es un diagrama esquemático que muestra la construcción de los plásmidos que contienen /acZAM15 y un gen de endo/isina;
La Figura 2 es un diagrama esquemático que muestra la construcción de los plásmidos con las secciones de fibras de cola remplazadas, para la modificación genética del fago al añadir SASP-C, o SASP-C además de un marcador /acZa;
La Figura 3 es un diagrama esquemático que muestra la producción de un fago en el que se han añadido SASP-C o SASP-C además de un marcador /acZa, al fago, mediante recombinación utilizando e1HORDS como medio de selección para el fago recombinante;
La Figura 4 es un diagrama esquemático que muestra la construcción de los plásmidos con las secciones de fibras de cola remplazadas, para la modificación genética del fago al remplazar el gen de endo/isina por SASP-C, o por SASP-C y un marcador /acZa;
La Figura 5 es un diagrama esquemático que muestra la producción de un fago en el que el gen de la endo/isina se ha eliminado y remplazado por SASP-C o por SASP-C y un marcador lacZa , mediante recombinación utilizando HORDS como medio de selección del fago recombinante; y
La Figura 6 muestra el alineamiento de múltiples secuencias de los genes de las fibras de la cola de los fagos relacionados.
Se dan los siguientes ejemplos para demostrar la utilidad de la técnica HORDS en la adición de un ADN exógeno a un fago lítico obligado.
Como ejemplo, se puede clonar una región de ADN que comprende el gen de las fibras de la cola, o una sección del gen de las fibras de la cola, de un fago alternativo, y el gen de SASP-C del Bacillus megaterium controlado por un promotor fda de Pseudomonas aeruginosa, entre dos regiones del ADN de Phi33 que flanquean la región de fibras, o la sección de la misma, en un vector con un amplio intervalo de huéspedes E. coli/P. aeruginosa. Este plásmido se puede introducir en P. aeruginosa, y la cepa resultante se infectó con Phi33. A continuación de la recolección de la progenie del fago, se puede aislar un bacteriófago recombinante doble en el que las fibras de la cola del Phi33, o una sección de las fibras de la cola, se han remplazado por las nuevas fibras de la cola o sección de las fibras de la cola, y al que la región fda-SASP-C del ADN se ha introducido, mediante formación de placas en una cepa de P. aeruginosa adecuada que es un huésped para el nuevo bacteriófago recombinante, pero no es un huésped para Phi33.
En otro ejemplo, para la construcción de un derivado de Phi33 en el que se han introducido en el genoma dos secciones no relacionadas de ADN ajeno, se muestra en el presente documento solo a modo de ejemplo, cómo las fibras de la cola existentes , o una sección de las mismas, se pueden remplazar por fibras de la cola alternativas o sección de fibras de la cola de un bacteriófago diferente, mientras se añade simultáneamente un gen de SASP-C de Bacillus megaterium bajo el control de un promotor fda de Pseudomonas aeruginosa, junto con un marcador lacZa de Escherichia coli mediante recombinación homóloga. Se puede clonar una región de ADN que comprende el gen de las fibras de la cola, o una sección del gen de las fibras de la cola, de un fago alternativo, el gen de SASP-C del Bacillus megaterium controlado por un promotor fda de Pseudomonas aeruginosa, y el gen indicador lacZa de Escherichia coli, entre dos regiones del ADN de Phi33 que flanquean la región de fibras de la cola nativa, o sección de la misma, en un vector con un amplio intervalo de huéspedes E. coli/P. aeruginosa. Este plásmido se puede introducir en P. aeruginosa, y la cepa resultante se infectó con Phi33. A continuación de la recolección de la progenie del fago, se puede aislar un bacteriófago recombinante doble en el que las fibras de la cola del Phi33, o una sección de las fibras de la cola, se han remplazado por las nuevas fibras de la cola o sección de las fibras de la cola, y en el que se han introducido las regiones fda-SASP-C y lacZa, se pueden aislar mediante formación de placas en una cepa de P. aeruginosa adecuada que es un huésped para el nuevo bacteriófago recombinante, pero no es un huésped para Phi33. Si es necesaria la visualización del marcador lacZa, la cepa huésped de Pseudomonas aeruginosa que se utilice debería llevar el alelo lacZAM15 de Escherichia coli en una localización adecuada del genoma de la cepa huésped.
En otro ejemplo, para la construcción de un derivado de Phi33 en el que se elimina una región del genoma del bacteriófago, mientras se introduce simultáneamente una sección de a Dn ajeno en el genoma, se muestra en el presente documento solo a modo de ejemplo, cómo las fibras de la cola existentes, o una sección de las mismas se pueden remplazar por fibras de la cola alternativas o sección de fibras de la cola de un bacteriófago diferente, mientras que se elimina simultáneamente el gen de endolisina nativo para hacer que fago sea no lítico, y también la introducción simultánea de un gen de SASP-C de Bacillus megaterium controlado por un promotor fda de Pseudomonas aeruginosa, mediante recombinación homóloga. Los recombinantes satisfactorios se pueden identificar mediante la selección bacteriófagos que forman placas en la cepa de P. aeruginosa que es un huésped del fago recombinante que lleva el nuevo determinante de intervalo de huéspedes, pero que no es un huésped para el fago nativo original, y que también se ha modificado de manera que el gen de la endolisina de Phi33 está presente en el genoma de la P. aeruginosa.
Una región de ADN que comprende el gen de las fibras de la cola, o una sección del gen de las fibras de la cola, de un fago alternativo, y el gen de SASP-C del Bacillus megaterium controlado por un promotor fda de Pseudomonas aeruginosa, entre dos regiones del ADN de Phi33 que flanquean la región de fibras de la cola nativa y la región de endolisina, o una sección de la misma, en un vector con un amplio intervalo de huéspedes E. coli/P. aeruginosa. Este plásmido se puede introducir en P. aeruginosa, y la cepa resultante se infectó con Phi33. A continuación de la recolección de la progenie del fago, se puede aislar un bacteriófago recombinante doble en el que las fibras de la cola del Phi33, o una sección de las fibras de la cola, se han remplazado por las nuevas fibras de la cola o sección de las fibras de la cola, y al que la región fda-SASP-C del ADN se ha introducido, y en el que se ha eliminado el gen de endolisina nativo, mediante formación de placas en una cepa de P. aeruginosa (endolisina ) adecuada que es un huésped para el nuevo bacteriófago recombinante, pero no es un huésped para Phi33.
Con el fin de generar una versión no lítica de un bacteriófago lítico mediante este método, se necesita una cepa huésped de Pseudomonas aeruginosa que sea huésped para el bacteriófago recombinante que lleva el nuevo determinante de intervalo de huéspedes, pero que no es un huésped para el bacteriófago nativo, pero que además, lleva el gen de endolisina de bacteriófago en una localización adecuada en el genoma de la Pseudomonas aeruginosa. De manera similar, si se necesita la visualización de un bacteriófago que transmite el indicador lacZa se necesita una cepa huésped de Pseudomonas aeruginosa que sea huésped para el bacteriófago recombinante que lleva el nuevo determinante de intervalo de huéspedes, pero que no sea un huésped para el bacteriófago nativo, pero que además, lleve el alelo lacZAM15 de Escherichia coli en una localización adecuada. La localización genómica para la inserción de transgenes tales como estas deberían escogerse de manera que estén afectados los genes no esenciales y no se generen fenotipos no deseados como resultado de los efectos polares de la expresión de genes adyacentes. A modo de ejemplo, una de dichas localizaciones podría incluir la inmediatamente corriente abajo del gen phoA de Pseudomonas aeruginosa.
A modo de ejemplo, el gen de endolisina del Phi33 se puede clonar en un vector de E. coli que sea incapaz de replicarse en P. aeruginosa, entre dos regiones del ADN genómico de la cepa PAO1 de P. aeruginosa que flanquean el extremo 3' del phoA. Este plásmido se puede introducir en P. aeruginosa y se aísla para someterse a una única recombinación homóloga para integrar el plásmido completo en el genoma seleccionado de acuerdo con la adquisición de resistencia a la tetraciclina (50 pg/ml). Los aislados (endolisina*, lacZAM15+ ) que se han sometido a un evento de segunda recombinación homóloga se pueden aislar entonces en un medio que contiene un 10 % de sacarosa (que utiliza el marcador contra seleccionable sacB presente en el armazón del plásmido).
A modo de ejemplo, el alelo lacZAM15 de Escherichia coli se puede clonar en un vector de E. coli que sea incapaz de replicarse en P. aeruginosa, entre dos regiones del ADN genómico de la cepa PAO1 de P. aeruginosa que flanquean el extremo 3' del phoA. Este plásmido se puede introducir en P. aeruginosa y se aísla para someterse a una única recombinación homóloga para integrar el plásmido completo en el genoma seleccionado de acuerdo con la adquisición de resistencia a la tetraciclina (50 pg/ml). Los aislados (endolisina*, lacZAM15+ ) que se han sometido a un evento de segunda recombinación homóloga se pueden aislar entonces en un medio que contiene un 10 % de sacarosa (que utiliza el marcador contra seleccionable sacB presente en el armazón del plásmido).
Procedimientos experimentales
Las reacciones de PCR para generar el ADN con fines de clonación se pueden llevar a cabo utilizando una ADN polimerasa Herculase Fusion II (Agilent Technologies), dependiendo de las temperaturas de fusión (Tm) de los cebadores, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones de PCR con fines de exploración se pueden llevar a cabo utilizando una ADN polimerasa Taq (NEB), dependiendo de las Tm de los cebadores, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A menos de que se establezca otra cosa, las técnicas de biología molecular generales, tales como la digestión por enzimas de restricción, electroforesis en gel de agarosa, ligaduras dependientes de la T4 ADN ligasa, preparación y transformación de células competentes se pueden basar en métodos descritos en Sambrook et al., (1989). Las enzimas se pueden adquirir en New England Biolabs o Thermo Scientific. El ADN se puede purificar a partir de reacciones enzimáticas y preparase a partir de las células utilizando kits de purificación de ADN de Qiagen. Los plásmidos se pueden transferir desde las cepas de E. coli a las cepas de P. aeruginosa por conjugación mediada por la cepa auxiliar de conjugación HB101 (pRK2013) de E. coli. Se puede adquirir un sustrato cromogénico para la p-galactosidasa, S-gal, que al digerirse con la p-galactosidasa forma un precipitado negro cuando se quela con hierro férrico, en Sigma (S9811).
Los cebadores se pueden obtener en Sigma Life Science. Cuando los cebadores incluyen secuencias de reconocimiento para las enzimas de restricción, se pueden añadir de 2-6 nucleótidos adicionales en el extremo 5' para asegurar la digestión del ADN amplificado por PCR.
Todas las clonaciones, a menos de que se establezca otra cosa, se pueden conseguir ligando los ADN durante una noche con la T4 ADN ligasa y luego se transforman en cepas de clonación de E. coli, tal como DH5a o TOP10, con aislamiento en medio selectivo, como se describe en otros sitios (Sambrook et al., 1989).
Se puede utilizar un vector de amplio intervalo de huéspedes E. coli /P. aeruginosa, para transferir los genes entre E. coli y P. aeruginosa. Se produjo previamente un pSM1080 combinando un origen de replicación de amplio intervalo de huéspedes para permitir la replicación en P. aeruginosa, oriT de pRK2, el marcador genético tetAR para su uso tanto en E. coli como P. aeruginosa del plásmido pRK415, y el origen de replicación, oriV, de alto número de copias en E. coli, del plásmido pUC19.
Se puede utilizar un vector para E. coli que sea incapaz de replicarse en P. aeruginosa, pSM1104, para generar mutantes de P. aeruginosa por intercambio alélico. El pSM1104 se produjo previamente combinando el oriT de pRK2, el marcador genético tetAR para su uso tanto en E. coli como en P. aeruginosa, a partir del plásmido pRK415, el origen de replicación, oriV, de alto número de copias en E. coli, del plásmido pUC19, y el gen sacB de la cepa 168 de Bacillus subtilis, bajo el control de un promotor fuerte, para su uso como un marcador contra seleccionable.
Construcción de plásmidos para generar cepas de Pseudomonas aeruginosa que lleva el gen de endolisina de Phi33, o el gen lacZAM15. de Escherichia coli, inmediatamente corriente abajo del locus de phoA del genoma bacteriano
1. Se puede construir el plásmido pSMX301 (Figura 1), que comprende el pSM1104 que lleva un ADN flanqueando el extremo 3' del PAO1 homólogo de phoA de P. aeruginosa, de la siguiente manera.
Se puede amplificar una región que comprende aproximadamente 1 kb del extremo del gen phoA de P. aeruginosa mediante PCR utilizando los cebadores B4300 y B4301 (Figura 1). El producto de PCR se puede limpiar entonces y digerirse con SpeI y BglII. Se puede amplificar una segunda región que comprende aproximadamente 1 kb corriente abajo del gen phoA de P. aeruginosa mediante PCR utilizando los cebadores B4302 y B4303 (Figura 1). Este segundo producto de PCR se puede lavar entonces y digerirse con BglII y XhoI. Las dos digestiones se pueden limpiar y ligar a pSM1104 que se ha diferido con SpeI y XhoI, en una ligadura de 3 vías, para dar lugar al plásmido pSMX301 (Figura 1).
El cebador B4300 consiste en un sitio de restricción de SpeI en 5' (subrayado), seguido por la secuencia localizada aproximadamente 1 kb corriente arriba del codón de parada de phoA de la cepa PAO1 de P. aeruginosa (Figura 1). El cebador B4301 consiste en los sitios de restricción para BglII y AflII en 5' (subrayados), seguidos por la secuencia complementaria hasta el final del gen phoA de la cepa PAO1 de P. aeruginosa (el codón de parada está en la casilla inferior; Figura 1). El cebador B4302 consiste en los sitios de restricción para BglII y AflII en 5' (subrayados), seguidos por la secuencia inmediatamente corriente abajo del codón de parada del gen phoA de la cepa PAO1 de P. aeruginosa (Figura 1). El cebador B4303 consiste en un sitio de restricción de XhoI en 5' (subrayado), seguido por una secuencia que es complementaria de la secuencia aproximadamente 1 kb corriente abajo del gen phoA de la cepa PAO1 de P. aeruginosa. (Figura 1).
Cebador B43005'-GATAACTAGTCCTGGTCCACCGGGGTCAAG-3' (SEQ ID NO: 1)
Cebador B4301 5'-GCTCAGATCTTCCTTAAGtcaGTCGCGCAGGTTCAG-3' (SEQ ID NO: 2)
Cebador B43025'-AGGAAGATCTGAGCTAGCTCGGACCAGAACGAAAAAG-3' (SEQ ID NO: 3)
Cebador B43035'-GATACTCGAGGCGGATGAACATTGAGGTG-3' (SEQ ID NO: 4)
2. El plásmido pSMX302 (Figura 1), que comprende el pSMX301 que lleva el gen de endolisina de Phi33 bajo el control de un promotor genético de endolisina, se puede construir de la siguiente manera.
El promotor del gen de endolisina puede amplificarse por PCR a partir del Phi33 utilizando los cebadores B4304, y B4305. (Figura 1). El propio gen de endolisina puede amplificarse por PCR a partir del Phi33 utilizando los cebadores B4306, y B4307 (Figura 1). Los dos productos de la PCR se pueden unir en conjunto mediante PCR de Extensión Solapada por Corte y Empalme (SOEing) utilizando los dos cebadores externos B4304 y B4307. El producto de la PCR resultante se puede digerir entonces con AflII y BglII y se liga en el pSMX301 que también se ha digerido con AflII y BgIII, para dar lugar al plásmido pSMX302 (Figura 1).
El cebador B4304 consiste en un sitio de restricción AfIII (subrayado) en 5', seguido por un terminador transcripcional bidireccional (terminador soxR, de 60-96 bases con el número de registro de Genbank DQ058714), y la secuencia del principio de la región del promotor de la endolisina (subrayado en negrita) (Figura 1). El cebador B4305 consiste en una región en 5' de la secuencia que es complementaria con la región que se solapa con el codón de inicio del gen de endolisina de Phi33, seguido por una secuencia que es complementaria del final de la región del promotor de endolisina (subrayado en negrita; Figura 1). El cebador B4306 es el complemento inverso del cebador B4305 (véase también la Figura 1). El cebador B4307 consiste en un sitio de restricción BgIII en 5' (subrayado), seguido por una secuencia complementaria del extremo del gen de endolisina de Phi33 (Figura 1). Cebador B4304
S’-GATACTTAAGAAAACAAACTAAAGCGCCCTTGTGGCGCTTTAGTTTTA TACTACTGAGAAAAATCTGGATTC-3* (SEQ ID NO: 5)
Cebador B4305
5'-GATTTTCATCAATACTCCTGGATCCCGTTAATTCGAAGAGTCG-3' (SEQ ID NO: 6)
Cebador B4306
5'-CGACTCTTCGAATTAACGGGATCCAGGAGTATTGATG AAAATC-3' (SEQ ID NO: 7)
Cebador B4307
5'-GATAAGATCTTCAGGAGCCTTGATTGATC-3' (SEQ ID NO: 8)
3. El plásmido pSMX303 , que comprende el pSMX301 que lleva el gen de lacZAM15 bajo el control de un promotor lac, se puede construir de la siguiente manera.
El gen lacZAM15 bajo el control de un promotor lac se puede amplificar por PCR a partir de la cepa DH10B de Escherichia coli utilizando los cebadores B4308 y B4309 (Figura 1). El producto de la PCR resultante se puede digerir entonces con BglII y NheI y se liga en el pSMX301 que también se ha digerido con BgIII y NheI, para dar lugar al plásmido pSMX303 (Figura 1).
El cebador B4308 consiste en un sitio de restricción BgIII en 5' (subrayado), seguido por una secuencia del promotor lac (Figura 1). El cebador B4309 consiste en un sitio de restricción de NheI en 5' (subrayado), seguido por un terminador transcripcional bidireccional y la secuencia complementaria al extremo 3' del lacZAM15 (subrayado en negrita; Figura 1).
Cebador B4308
5'-GATAAGATCTGAGCGCAACGCAATTAATGTG-3' (SEQ ID NO: 9)
Cebador B4309
5 ’-GAT AGCTAGC AGTCAAAAGCCTCCGGTCGGAGGCTTTTGACTTTATT TTTGACACCAGACCAAC-3’ (SEQ ID NO: 10)
Modificación genética de Pseudomonas aeruginosa para introducir el gen de endolisina del Phi33 inmediatamente corriente abajo del locus phoA del genoma bacteriano
1. El plásmido pSMX302 (Figura 1) se puede transferir a una cepa adecuada de P. aeruginosa que sea un huésped del bacteriófago que lleva el nuevo determinante de intervalo de huéspedes, pero que no sea un huésped para el bacteriófago original, mediante conjugación, selección de los recombinantes primarios por adquisición de resistencia a la tetraciclina (50 pg/ml).
2. Entonces se pueden seleccionar los recombinantes dobles mediante contra selección mediada por sacB, poniéndolos en medio que contenga un 10 % de sacarosa.
3. Los aislados que crecen sobre un 10% de sacarosa se pueden explorar entonces mediante PCR para confirmar que se ha introducido el gen de endolisina del Phi33 corriente abajo del gen phoA de P. aeruginosa. 4. A continuación de la verificación de un aislado (PAX31), esta cepa se puede utilizar entonces como huésped para una modificación posterior del bacteriófago donde es necesario el complemento de una mutación de endolisina.
Modificación genética de Pseudomonas aeruginosa para introducir el alelo lacZAM15 de Escherichia coli inmediatamente corriente abajo del locus phoA del genoma bacteriano
1. El plásmido pSMX303 (Figura 1) se puede transferir a una cepa adecuada de P. aeruginosa que sea un huésped del bacteriófago que lleva el nuevo determinante de intervalo de huéspedes, pero que no sea un huésped para el bacteriófago original, mediante conjugación, selección de los recombinantes primarios por adquisición de resistencia a la tetraciclina (50 pg/ml).
2. Entonces se pueden seleccionar los recombinantes dobles mediante contra selección mediada por sacB, poniéndolos en medio que contenga un 10 % de sacarosa.
3. Los aislados que crecen sobre un 10% de sacarosa se pueden explorar entonces mediante PCR para confirmar que se había introducido el alelo lacZAM15 de Escherichia coli corriente abajo del gen phoA de P. aeruginosa.
4. A continuación de la verificación de un aislado (PAX32), esta cepa se puede utilizar entonces como huésped para un bacteriófago donde es necesario el complemento de un indicador lacZa.
Construcción de un plásmido para introducir una nueva sección de ADN (fda-SASP-C) en el genoma del bacteriófago Phi33, que utiliza un determinante de intervalo de huéspedes alternativo como marcador genético.
1. El plásmido pSMX304 (Figura 2), que comprende el pSM1080 que lleva secuencias de Phi33 que flanquean las secuencias del determinante de intervalo de huéspedes de las fibras de la cola del bacteriófago PTP92, se puede construir de la siguiente manera.
La región inmediatamente corriente abajo de las fibras de la cola de Phi33 se puede amplificar mediante PCR utilizando los cebadores B4333 y B4334 (Figura 2). La región que codifica la región de unión al receptor en el extremo C de las fibras de la cola del bacteriófago PTP92 se puede amplificar por PCR utilizando los cebadores B4335 y B4336 (Figura 2). Estos dos productos de la PCR se pueden unir en conjunto mediante PCR SOEing utilizando los cebadores externos B4333 y B4336. La región que codifica la región del extremo N de las fibras de la cola, y la región inmediatamente corriente arriba de las fibras de la cola de Phi33, se pueden amplificar mediante PCR utilizando los cebadores B4337 y B4338 (Figura 2). Esta región de las fibras de la cola de Phi33 se puede unir entonces al producto de PCR que comprende la región corriente abajo de las fibras de la cola del Phi33 y el determinante de intervalo de huéspedes de PTP92, mediante PCR SOEing utilizando los cebadores externos B4333 y B4338. El producto de la PCR resultante se puede entonces limpiar, digerir con NheI, volver a limpiar y luego ligarse en el pSM1080 que se había digerido con NheI, tratado con fosfatasa alcalina y limpiado antes de la ligadura. Esta construcción daba lugar al plásmido pSMX304 (Figura 2).
El cebador B4333 consiste en los sitios de restricción de NheI-AflII-PacI en 5' (subrayados) seguido por una secuencia complementaria de la región de aproximadamente 1 kb corriente abajo de las fibras de la cola de Phi33 (Figura 2). El cebador B4334 consiste en la secuencia en 5' del extremo de la región que codifica el extremo C, la región de unión al receptor de las fibras de la cola de PTP92, seguido por la secuencia inmediatamente corriente abajo de las fibras de la cola del Phi33 (subrayado; Figura 2). El cebador B4335 es el complemento inverso del cebador B4334. El cebador B4336 consiste en la secuencia complementaria en 5' respecto a la región que codifica parte del extremo C, la región de unión al receptor de las fibras de la cola de PTP92, seguido por la secuencia complementaria de las fibras de la cola del Phi33 (subrayado; Figura 2). El cebador B4337 es el complemento inverso del cebador B4336 (Figura 2). El cebador B4338 consiste en un sitio de restricción NheI en 5' (subrayado), seguido por una secuencia de una región corriente arriba de las fibras de la cola de Phi33 (Figura 2).
Cebador B4333
5'-GATAGCTAGCGACTTAAGGATTAATTAATCAGGAGCCTTGATTGATC-3' (SEQ ID NO: 11)
Cebador B4334
5'-CTATTCCAGCGGGTAACGTAAAATGAAATGGACGCGGATCAG-3' (SEQ ID NO: 12)
Cebador B4335
5'-CTGATCCGCGTCCATTTCATTTTACGTTACCCGCTGGAATAG-3' (SEQ ID NO: 13)
Cebador B4336
5'-CTCAAGCGGGCCGGCTGGTCTCTCGGCAATAACTCCTATGTGATCACC-3' (SEQ ID NO: 14) Cebador B4337
5'-GGTGATCACATAGGAGTTATTGCCGAGAGACCAGCCGGCCCGCTTGAG-3' (SEQ ID NO: 15) Cebador B4338
5'-GATAGCTAGCGGAGTACCGCTTACGTCTC-3' (SEQ ID NO: 16)
2. El plásmido pSMX305 (Figura 2), que comprende el PSMX304 que lleva una región de ADN del Phi33 inmediatamente corriente abajo del gen de la endolisina, la localización que se escoge aquí para la inserción del ADN ajeno del fda-SASP-C, se puede construir de la siguiente manera.
Una región de aproximadamente 1 kb de ADN de Phi33 localizada inmediatamente corriente abajo del gen de la endolisina, la localización se escogió para la inserción del ADN ajeno fda-SASP-C, se puede amplificar mediante PCR utilizando los cebadores B4339 y B4340 (Figura 2). El producto de la PCR resultante se puede digerir entonces con AflII y PacI y se liga en el pSMX304 que también se ha digerido con AflII y PacI, antes de la ligadura, dando lugar al plásmido pSMX305 (Figura 2).
El cebador B4339 consiste en un sitio de restricción de AflII en 5' (subrayado), seguido por la secuencia de Phi33 de aproximadamente 1 kb corriente abajo de la localización escogida aquí para la inserción del ADN de fda-SASP-C (Figura 2). El cebador B4340 consiste en los sitios de restricción de PacI - KpnI - SacI en 5' (subrayados), seguidos por la secuencia complementaria de la secuencia de Phi33 localizada inmediatamente corriente abajo de la localización escogida aquí para la inserción del ADN de fda-SASP-C (Figura 2).
Cebador B4339
5'-GATACTTAAGTCGCTCCAGCCATGCGGAAAAC-3' (SEQ ID NO: 17)
Cebador B4340
5'-GATATTAATTAATCGGTACCTCGAGCTCTATTCGCCCAAAAGAAAAG-3' (SEQ ID NO: 18)
3. El plásmido pSMX306 (Figura 2), que comprende el pMSX305 que lleva el fda-SASP-C, se puede construir de la siguiente manera.
El gen SASP-C de la cepa KM de Bacillus megaterium (ATCC 13632) se puede amplificar mediante PCR utilizando los cebadores B4341 y B4342 (Figura 2). El producto de la PCR resultante se puede entonces limpiar, digerirse con KpnI y Ncol, y limpiarse de nuevo. El promotor fda de Pseudomonas aeruginosa puede amplificarse por PCR utilizando los cebadores B4343 y B4344 (Figura 2). El producto de la PCR resultante se puede entonces limpiar, digerirse con Ncol y PcaI, y limpiarse de nuevo. Los dos productos de PCR se pueden entonces ligar, en una ligadura de 3 vías al pSMX305 que se había digerido con KpnI y PacI y se limpió antes de la ligadura, para dar lugar al plásmido pSMX306 (Figura 2).
El cebador B4341 consiste en un sitio de restricción de KpnI en 5' (subrayado), seguido por un terminador transcripcional bidireccional (terminador tonB), seguido por la secuencia complementaria del extremo de SASP-C de la cepa KM de Bacillus megaterium (ATCC 13632) (subrayado, en negrita; Figura 2). El cebador B4342 (Figura 2) consiste en un sitio de restricción NcoI en 5' (subrayado), seguido por la secuencia del principio del gen SASP-C de la cepa KM del Bacillus megaterium (ATCC 13632). El cebador B4343 consiste en un sitio de restricción NcoI en 5' (subrayado), seguido por una secuencia del promotor fda (Figura 2). El cebador B4344 consiste en un sitio de restricción PacI en 5' (subrayado), seguido por una secuencia complementaria del promotor fda (Figura 2).
B4341
5’-GATAGGTACCAGTCAAAAGCCTCCGACCGGAGGCTTTTGACTTTAGTACTT GCCGCCTAG-3’ (SEQ ID NO: 19)
B4342
5'-GATACCATGGCAAATTATCAAAACGCATC-3' (SEQ ID NO: 20)
B4343
5’-GATACCATGGTTCTCGTATCTCCCAATC-3’ (SEQ ID NO: 21)
B4344
5’-GATATTAATTAACGACGAAGGCCTGGTG-3’ (SEQ ID NO: 22)
Modificación genética de Phi33 para añadir el fda-SASP-C al genoma del bacteriófago, utilizando el determinante de intervalo de huéspedes de PTP92 como medio de selección
1. El plásmido PSM306 (Figura 2) se puede introducir en una cepa de P. aeruginosa que sea huésped tanto del fago original como del fago donante del determinante de intervalo de huéspedes , mediante conjugación, selección de transconjugantes basándose en la resistencia a la tetraciclina (50 pg/ml), dando lugar a la cepa PTA31.
2. La cepa PTA31 se puede infectar con el fago Phi33 y se recolecta la progenie del fago.
3. El fago recombinante, en el que el determinante de intervalo de huéspedes de PTP92 se ha transferido al Phi33, se puede identificar por formación de placas del lisado de la etapa (2) sobre la cepa 2726 de P. aeruginosa, que es huésped del fago recombinante que tiene el determinante de intervalo de huéspedes de PTP92, pero que no es huésped del bacteriófago parental Phi33.
4. Se puede llevar a cabo adicionalmente una exploración por PCR para identificar aislados que han adquirido simultáneamente el fda-SASP-C, además del determinante de intervalos de huéspedes de PTP92.
5. A continuación de la identificación de un aislado verificado (PTPX31; Figura 2; Figura 3), este aislado se puede purificar en placa dos veces más antes de su uso posterior.
Construcción de un plásmido para introducir dos nuevas secciones de ADN (fda-SASP-C y lacZa) en el genoma del bacteriófago Phi33, utilizando un determinante de intervalo de huéspedes alternativo como marcador genético.
1. El plásmido pSMX307 (Figura 2), que comprende el pSMX306 que lleva el indicador lacZa del plásmido pUC19, se puede construir de la siguiente manera.
El indicador lacZa puede amplificarse por PCR a partir del pUC19 utilizando los cebadores B4345, y B4346. (Figura 2). El producto de la PCR resultante puede entonces limpiarse, digerirse con SacI y KpnI, se limpió de nuevo, y se ligó en el pSMX306 que se había digerido con SacI y KpnI y limpiado antes de la ligadura, para dar lugar al plásmido pSMX307 (Figura 2).
El cebador B4345 consiste en un sitio de restricción SacI en 5' (subrayado), seguido por una secuencia complementaria del extremo 3' de lacZa (Figura 2). El cebador B4346 consiste en un sitio de restricción KpnI en 5' (subrayado), seguido por una secuencia del promotor lac (Figura 2).
Cebador B4345
5’-GATAGAGCTCTTAGCGCCATTCGCCATTC-3’ (SEQ ID NO: 23)
Cebador B4346
5'-GATAGGTACCGCGCAACGCAATTAATGTG-3' (SEQ ID NO: 24)
Modificación genética de Phi33 para añadir el fda-SASP-C y lacZa al genoma del bacteriófago, utilizando el determinante de intervalo de huéspedes de PTP92 como medio de selección
1. El plásmido PSM307 (Figura 2; Figura 3) se puede introducir en una cepa de P. aeruginosa que sea huésped tanto del fago original como del fago donante del determinante de intervalo de huéspedes , mediante conjugación, selección de transconjugantes basándose en la resistencia a la tetraciclina (50 |jg/ml), dando lugar a la cepa PTA32.
2. La cepa PTA32 se puede infectar con el fago Phi33 y se recolecta la progenie del fago.
3. El fago recombinante, en el que el determinante de intervalo de huéspedes de PTP92 se ha transferido al Phi33, se puede identificar por formación de placas del lisado de la etapa (2) sobre la cepa 2726 de P. aeruginosa, que es huésped del fago recombinante que tiene el determinante de intervalo de huéspedes de PTP92, pero que no es huésped del bacteriófago parental Phi33.
4. Se puede llevar a cabo adicionalmente una exploración por PCR para identificar aislados que han adquirido simultáneamente el fda-SASP-C y lacZa, además del determinante de intervalo de huéspedes de PTP92.
5. Los aislados que han adquirido el lacZa se pueden confirmar adicionalmente por formación de placas sobre la cepa PAX32 de Pseudomonas aeruginosa (Figura 1), utilizando un medio de cultivo que contiene el sustrato cromogénico para la p-galactosidasa, S-Gal (Sigma). El bacteriófago que lleva el indicador lacZa genera placas negras en su huésped utilizando este medio de cultivo, mientras que las placas del bacteriófago que carece del indicador lacZa se mantienen claros.
6. A continuación de la identificación de un aislado verificado (PTPX32; Figura 3), este aislado se puede purificar en placa dos veces más antes de su uso posterior.
Construcción de un plásmido para eliminar simultáneamente una sección del bacteriófago Phi33 (el gen de endolisina) e introducir una nueva sección de ADN (fda-SASP-C) en el genoma del bacteriófago Phi33, utilizando un determinante de intervalo de huéspedes alternativo como marcador genético.
1. El plásmido pSMX308 (Figura 4), que comprende el pSM1080 que lleva secuencias de Phi33 que flanquean secuencias del determinante de intervalo de huéspedes de las fibras de la cola del bacteriófago relacionado PTP92, pero que incluye una eliminación del gen de endolisina, se puede construir de la siguiente manera.
La región inmediatamente corriente abajo de las fibras de la cola de Phi33 se puede amplificar mediante PCR utilizando los cebadores B4347 y B4334 (Figura 4). La región que codifica el extremo C, la región de unión al receptor del bacteriófago PTP92 se puede amplificar mediante PCR utilizando los cebadores B4335 y B4336 (Figura 4). Estos dos productos de la PCR se pueden unir en conjunto mediante PCR SOEing utilizando los cebadores externos B4347 y B4336. La secuencia del Phi33 que codifica la región del extremo N de las fibras de la cola del Phi33, y la secuencia de fibras de la cola corriente arriba se pueden amplificar a partir del Phi33 mediante PCR utilizando los cebadores B4337 y B4338. Esta región de las fibras de la cola de Phi33 se puede unir entonces al producto de PCR que comprende la región corriente abajo de las fibras de la cola del Phi33 y el determinante de intervalo de huéspedes de PTP92, mediante PCR SOEing utilizando los cebadores externos B4347 y B4338. El producto de la pCr resultante se puede entonces limpiar, digerir con Nhel, volver a limpiar y luego ligarse en el pSM1080 que se había digerido con Nhel, tratado con fosfatasa alcalina y limpiado antes de la ligadura. Esta construcción daba lugar al plásmido pSMX308 (Figura 4).
El cebador B4347 consiste en los sitios de restricción de Nhel-Aflll-Pacl en 5' (subrayados) seguido por una secuencia complementaria de la región de aproximadamente 1 kb corriente abajo de las fibras de la cola de Phi33 (Figura 4). El cebador B4334 consiste en la secuencia en 5' del determinante de intervalo de huéspedes de PTP92, seguido por secuencias inmediatamente corriente abajo de las fibras de la cola del Phi33 (subrayado; Figura 4). El cebador B4335 es el complemento inverso del cebador B4334 (Figura 4). El cebador B4336 consiste en la secuencia en 5' complementaria del determinante de intervalo de huéspedes de PTP92, seguido por la secuencia complementaria de la cola del Phi33 (subrayado; Figura 4). El cebador B4337 es el complemento inverso del cebador B4336 (Figura 4). El cebador B4338 consiste en un sitio de restricción Nhel en 5' (subrayado), seguido por una secuencia de una región corriente arriba de las fibras de la cola de Phi33 (Figura 4).
Cebador B4347
5'-GATAGCTAGCGACTTAAGGATTAATTAATCAATACTCCTGATTTTTG-3' (SEQ ID NO: 25)
Cebador B4334
5'-CTATTCCAGCGGGTAACGTAAAATGAAATGGACGCGGATCAG-3' (SEQ ID NO: 12)
Cebador B4335
5'-CTGATCCGCGTCCATTTCATTTTACGTTACCCGCTGGAATAG-3' (SEQ ID NO: 13)
Cebador B4336
5'-CTCAAGCGGGCCGGCTGGTCTCTCGGCAATAACTCCTATGTGATCACC-3' (SEQ ID NO: 14) Cebador B4337
5'-GGTGATCACATAGGAGTTATTGCCGAGAGACCAGCCGGCCCGCTTGAG-3' (SEQ ID NO: 15) Cebador B4338
5'-GATAGCTAGCGGAGTACCGCTTACGTCTC-3' (SEQ ID NO: 16)
2. El plásmido pSMX309 (Figura 4), que comprende el pSMX304 que lleva una región de ADN del Phi33 inmediatamente corriente abajo del gen de la endolisina, que es la localización escogida aquí para la inserción del ADN ajeno del fda-SASP-C, se puede construir de la siguiente manera.
Una región de aproximadamente 1 kb de ADN de Phi33 localizada inmediatamente corriente abajo del gen de la endolisina, la localización escogida aquí para la inserción del ADN ajeno fda-SASP-C, se puede amplificar mediante PCR utilizando los cebadores B4339 y B4340 (Figura 4). El producto de la PCR resultante se puede digerir entonces con AflII y PacI y se liga en el pSMX308 que también se ha digerido con AflII y PacI, antes de la ligadura, dando lugar al plásmido pSMX309 (Figura 4).
El cebador B4339 consiste en un sitio de restricción de AflII en 5' (subrayado), seguido por la secuencia de Phi33 de aproximadamente 1 kb corriente abajo del gen de la endolisina, la localización escogida aquí para la inserción del ADN de fda-SASP-C (Figura 4). El cebador B4340 consiste en los sitios de restricción de PacI - KpnI - SacI en 5' (subrayados), seguidos por la secuencia complementaria de la secuencia de Phi33 localizada inmediatamente corriente abajo del gen de la endolisina, la localización escogida aquí para la inserción del ADN de fda-SASP-C (Figura 4).
Cebador B4339
5'-GATACTTAAGTCGCTCCAGCCATGCGGAAAAC-3' (SEQ ID NO: 17)
Cebador B4340
5'-GATATTAATTAATCGGTACCTCGAGCTCTATTCGCCCAAAAGAAAAG-3' (SEQ ID NO: 18)
3. El plásmido pSMX310 (Figura 4), que comprende el pMSX309 que lleva el fda-SASP-C, se puede construir de la siguiente manera.
El gen SASP-C de la cepa KM de Bacillus megaterium (ATCC 13632) se puede amplificar mediante PCR utilizando los cebadores B4341 y B4342 (Figura 4). El producto de la PCR resultante se puede entonces limpiar, digerirse con KpnI y Ncol, y limpiarse de nuevo. El promotor fda de Pseudomonas aeruginosa puede amplificarse por PCR utilizando los cebadores B4343 y B4344 (Figura 4). El producto de la PCR resultante se puede entonces limpiar, digerirse con Ncol y PcaI, y limpiarse de nuevo. Los dos productos de PCR se pueden entonces ligar, en una ligadura de 3 vías al pSMX309 que se había digerido con KpnI y PacI y se limpió antes de la ligadura, para dar lugar al plásmido pSMX310 (Figura 4).
El cebador B4341 consiste en un sitio de restricción de KpnI en 5' (subrayado), seguido por un terminador transcripcional bidireccional (terminador tonB), seguido por la secuencia complementaria del extremo de SASP-C de la cepa KM de Bacillus megaterium (ATCC 13632) (subrayado, en negrita; Figura 4). El cebador B4342 (Figura 4) consiste en un sitio de restricción NcoI en 5' (subrayado), seguido por la secuencia del principio del gen SASP-C de la cepa KM del Bacillus megaterium (ATCC 13632). El cebador B4343 consiste en un sitio de restricción NcoI en 5' (subrayado), seguido por una secuencia del promotor fda (Figura 4). El cebador B4344 consiste en un sitio de restricción PacI en 5' (subrayado), seguido por una secuencia complementaria del promotor fda (Figura 4).
B4341
5 ’-G A T AG G TAC C A G T C A A A A G C C T C C G A C C G G A G G C T T T T G A C T T T A G T A C T T
G C C G C C T A G -3 ’ (SEQ ID N O : 19)
B4342
5'-GATACCATGGCAAATTATCAAAACGCATC-3' (SEQ ID NO: 20)
B4343
5'-GATACCATGGTTCTCGTATCTCCCAATC-3' (SEQ ID NO: 21)
B4344
5'-GATATTAATTAACGACGAAGGCCTGGTG-3' (SEQ ID NO: 22)
Modificación genética de Phi33 para eliminar simultáneamente el gen de endolisina de Phi33 y añadir el fda-SASP-C al genoma del bacteriófago, utilizando el determinante de intervalo de huéspedes de PTP92 como medio de selección
1. El plásmido PSM310 (Figura 4) se puede introducir en una cepa de P. aeruginosa que sea huésped tanto del fago original como del fago donante del determinante de intervalo de huéspedes , mediante conjugación, selección de transconjugantes basándose en la resistencia a la tetraciclina (50 |jg/ml), dando lugar a la cepa PTA33.
2. La cepa PTA33 se puede infectar con el fago Phi33 y se recolecta la progenie del fago.
3. El fago recombinante, en el que el determinante de intervalo de huéspedes de PTP92 se ha transferido al Phi33, se puede identificar por formación de placas del lisado de la etapa (2) sobre la cepa PAX31 (endolisina*; Figura 1), es decir, una cepa derivada de la 2726 de P. aeruginosa, que es huésped del fago recombinante que lleva el determinante de intervalo de huéspedes de PTP92, pero que no es huésped del bacteriófago parental Phi33, y que lleva el gen de endolisina de Phi33 en trans.
Se puede llevar a cabo adicionalmente una exploración por PCR para identificar aislados que han adquirido simultáneamente el fda-SASP-C, además del determinante de intervalos de huéspedes de PTP92.
4. Los aislados se pueden ensayar adicionalmente en cuanto a la eliminación de endolisina mediante formación de placas sobre la cepa 2726 de P. aeruginosa no modificada (endolisina ), ya que los aislados de fago en los que se ha retirado satisfactoriamente la endolisina no formarán placas en esta cepa.
5. A continuación de la identificación de un aislado verificado (PTPX33; Figura 5), este aislado se puede purificar en placa dos veces más sobre una cepa de P. aeruginosa endolisina+ antes de su uso posterior.
Tabla 1. Intervalo de huéspedes de Phi33, PTP92, C36 y PTP47 contra 44 aislados clínicos europeos de Pseudomonas aeru inosa.
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continuación
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Referencias
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LISTADO DE SECUENCIAS

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método para la incorporación en el genoma de un fago lítico diana de una secuencia de ADN exógeno, donde el genoma del fago lítico diana incluye una primera secuencia diana y una segunda secuencia diana, cuyo método comprende:
(a) proporcionar un vector que contenga una región de direccionamiento del fago que comprenda
(i) un determinante de intervalo de huéspedes de un fago marcador, diferente del determinante de intervalo de huéspedes del fago lítico diana, y
(ii) una secuencia de ADN exógeno:
donde la región de direccionamiento del fago está flanqueada por la primera y segunda secuencias flanqueantes homólogas a la primera y segunda secuencias del genoma del fago lítico diana;
(b) introducir el vector en una primera célula huésped, cuya célula huésped es un huésped para el fago lítico diana;
(c) infectar la primera célula huésped con el fago lítico diana;
(d) permitir que tenga lugar la replicación y recombinación del fago de manera que el genoma del fago lítico diana se modifique;
(e) propagar el fago resultante en una segunda célula huésped, cuya célula huésped es un huésped para el fago marcador y no para el fago lítico diana; y
(f) recolectar el fago resultante, de manera que el genoma del fago lítico diana está modificado por la incorporación en el mismo de una secuencia de ADN exógeno.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde la primera y segunda secuencias diana del genoma del fago lítico diana; no son contiguas y/o flanquean un gen del fago o parte del mismo para la inactivación del gen después de la recombinación, donde el gen del fago es opcionalmente un gen de lisis.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde el ADN exógeno comprende un gen.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3, donde el ADN exógeno codifica una proteína antibacteriana, donde opcionalmente el ADN exógeno comprende un gen que codifica una proteína pequeña de espora soluble en ácido a/p (SASP), tal como SASP-C.
5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, donde el gen que codifica la SASP está bajo el control de un promotor constitutivo el cual se selecciona opcionalmente de entre pdhA, rpsB, pgi, fda, lasB y promotores que tienen más de un 90 % de identidad de secuencias con estos.
6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde al menos una de la primera y segunda secuencias flanqueantes contienen una mutación en comparación con la primera y segunda secuencias diana del genoma del fago lítico diana, donde la mutación es opcionalmente una mutación puntual.
7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el determinante de intervalo de huéspedes del fago marcador codifica una proteína de las fibras de la cola o una región de la misma, opcionalmente donde la proteína de las fibras de la cola comprende una región de unión al receptor para la unión a la segunda célula huésped y una región que une la región de unión al receptor con el cuerpo del fago.
8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, donde la región de unión al receptor es una región de unión al receptor en el extremo C y la región que une la región de unión al receptor del extremo C con el cuerpo del fago es una región del extremo N, opcionalmente donde la región del extremo N comprende los aminoácidos 1 a 628 de la proteína de las fibras de la cola y la región del extremo C comprende los aminoácidos 629 a 964 de la proteína de las fibras de la cola, basándose en la secuencia de aminoácidos del bacteriófago Phi33.
9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8, donde la región del extremo C no tiene más de un 96 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la región del extremo C del bacteriófago Phi33, opcionalmente donde la región del extremo C es de uno cualquiera de los bacteriófagos Phi33, LBL3, SPM-1, F8, p B1, KPP12, LMA2, SN, 14-1, JG024, NH-4, PTP47, C36, PTP93 y PTP92.
10. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, donde la identidad de secuencia de aminoácidos de la región del extremo C es menor de un 80 %, o menor de un 70 %, o menor de un 60 %.
11. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, donde la región del extremo N tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la región del extremo N del bacteriófago Phi33, opcionalmente donde la región del extremo N es de uno cualquiera de los bacteriófagos Phi33, LBL3, SPM-1, F8, PB1, KPP12, LMA2, SN, 14-1, JG024, NH-4, PTP47, C36, PTP92 y PTP93.
12. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, donde la proteína de las fibras de la cola tiene más de un 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de las fibras de la cola del bacteriófago Phi33, opcionalmente donde cada proteína de las fibras de la cola es de un bacteriófago seleccionado de entre Phi33, LBL3, SPM-1, F8, PB1, KPP12, LMA2, SN, 14-1, JG024, NH-4, PTP47, C36, PTP92 y PTP93, opcionalmente donde la identidad de la secuencia de aminoácidos es mayor del 85 % o mayor del 90 %, mayor del 95 %.
13. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, donde la segunda célula huésped es una célula huésped de Pseudomonas, opcionalmente donde la Pseudomona es Pseudomonas aeruginosa.
14. El uso de un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 13, para la producción de un bacteriófago modificado capaz de infectar una pluralidad de diferentes bacterias diana, cuyo bacteriófago incluye una SASP que sea tóxica para la bacteria diana, y/o donde el bacteriófago es no lítico como resultado de la modificación llevada a cabo en la reivindicación 1.
15. El uso de acuerdo con la reivindicación 14, donde el bacteriófago expresa una pluralidad de diferentes determinantes de intervalo de huéspedes y donde cada uno de los determinantes de intervalo de huéspedes tiene una especificidad diferente por el huésped bacteriano, o donde el bacteriófago expresa una proteína determinante de intervalo de huéspedes que comprende una secuencia de aminoácidos de una pluralidad de bacteriófagos diferentes, opcionalmente donde el o cada determinante de intervalo de huéspedes es una proteína de las fibras de la cola, opcionalmente donde la especificidad por el huésped bacteriano del determinante de intervalo de huéspedes está dentro de la misma especie bacteriana.
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