ES2867029T3 - Bacteriófago modificado - Google Patents

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Abstract

Un bacteriófago modificado capaz de infectar una pluralidad de bacterias diana diferentes para utilizar como medicamento, incluyendo el bacteriófago un gen de toxina que codifica una proteína de toxina que es tóxica para las bacterias diana; donde el bacteriófago es lítico; y donde el bacteriófago expresa proteínas determinantes de la variedad del hospedador que tienen una pluralidad de especificidades del hospedador bacteriano.

Description

DESCRIPCIÓN
Bacteriófago modificado
La presente invención se refiere a un bacteriófago modificado, usos del mismo y composiciones que contienen el bacteriófago modificado.
Antecedentes de la invención
El informe de 2014 de la Organización Mundial de la Salud sobre la vigilancia mundial de la resistencia a los antimicrobianos revela que la resistencia a los antibióticos es un problema mundial que está poniendo en peligro la capacidad de tratar infecciones comunes en el ámbito extrahospitalario y en hospitales. Si no se toman medidas urgentes, el mundo se encamina hacia una era posterior a los antibióticos, en la que infecciones comunes y lesiones menores, que han sido tratables durante décadas, pueden volver a matar (OMS, 2014). La resistencia a los antibióticos complica la recuperación de los pacientes incluso de operaciones menores y está causando cada vez más fallos terapéuticos. De hecho, en la actualidad, existen cepas de algunos géneros de bacterias que circulan por todo el mundo y que son resistentes a todos los antibióticos disponibles. Dichas cepas comúnmente están dentro del alcance de los llamados patógenos ESKAPE: Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa y especies de Enterobacter (Boucher et al., 2009). La expresión patógenos ESKAPE fue acuñado por Boucher et al., para enfatizar que estas bacterias actualmente causan la mayoría de las infecciones hospitalarias en los EE. UU. y Europa y pueden "escapar" de manera eficaz de la mayoría de, si no de todos, los antibióticos disponibles con infecciones resistentes a panantibióticos que están ocurriendo ahora. La tasa de mortalidad de pacientes con infecciones graves causadas por bacterias frecuentes tratados en hospitales es aproximadamente el doble que la de pacientes con infecciones causadas por las mismas bacterias no resistentes, por ejemplo, se estima que las personas con infecciones por Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA, por sus siglas en inglés 'methicillin-resistant Staphylococcus aureus’) tienen el 64 % más de probabilidades de morir que las personas con una forma no resistente de la infección (OMS, 2014). De las bacterias grampositivas, el S. aureus resistente a meticilina sigue siendo una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en los hospitales de EE. UU. y Europa. Sin embargo, en años más recientes, varios patógenos gramnegativos altamente resistentes, incluyendo especies de Acinetobacter, P. aeruginosa mulrirresistente (MDR, por sus siglas en inglés 'multi-drug resistant') y Escherichia coli y especies de Klebsiella resistentes a carbapenémicos, han surgido como importantes patógenos que causan infecciones graves y a veces intratables. Los avances en la medicina hacen que se realicen procedimientos cada vez más complejos: y estos avances están llevando a un número creciente de pacientes de edad avanzada y de pacientes sometidos a cirugía, trasplante y quimioterapia, todo lo cual producirá un número aún mayor de individuos inmunodeprimidos en riesgo de estas infecciones (Walker et al., 2009). Este fenómeno ha llevado a una mayor dependencia y necesidad de antibióticos eficaces.
P. aeruginosa es una bacteria que frecuentemente es multirresistente (MDR) que tiene resistencia intrínseca debido a la baja permeabilidad de su membrana externa que limita la entrada de fármacos a la célula, y una multitud de bombas de expulsión para expulsar cualquier fármaco que consiga entrar con éxito en la célula. P. aeruginosa también está adquiriendo mecanismos de resistencia adicionales, incluyendo resistencia a los "antibióticos de último recurso" para los gramnegativos, los carbapenémicos. P. aeruginosa causa aproximadamente un 10 % de todas las infecciones adquiridas en hospitales y es la segunda causa principal de neumonía adquirida en hospitales, que representa el 50 % de todas las prescripciones de infecciones adquiridas en hospitales. Las infecciones por P. aeruginosa en los hospitales comúnmente requieren tratamiento intravenoso (i.v.) con el actual tratamiento de referencia para las infecciones por P. aeruginosa que dictan que los pacientes sean tratados con al menos dos antibióticos. Desafortunadamente, la resistencia se desarrolla con frecuencia en los pacientes durante la terapia. Con tan pocas nuevas clases de antibióticos desarrollados y aprobados para el mercado en los últimos 30 a 40 años, existe una necesidad esencial de agentes antibacterianos nuevos, seguros y eficaces.
Como alternativa a los antibióticos convencionales, una familia de proteínas que demuestra una actividad antibacteriana de amplio espectro dentro de las bacterias comprende las pequeñas proteínas de esporas solubles en ácido de tipo a/p (conocidas en lo sucesivo como SASP). Dentro de las bacterias, las SASP se unen al ADN bacteriano: la visualización de este proceso, utilizando microscopía crioelectrónica, ha demostrado que SspC, la SASP más estudiada, recubre el ADN y forma dominios que sobresalen y modifica la estructura del ADN (Francesconi et al., 1988; Frenkiel-Krispin et al., 2004) de tipo B (paso de 3,4 nm) hacia tipo A (3,18 nm; el ADN de tipo A tiene un paso de 2,8 nm). Los motivos de SspC que sobresalen interactúan con los filamentos de ADN-SspC adyacentes que empaquetan los filamentos en un ensamblaje estrecho de hélices de nucleoproteínas. En 2008, Lee et al. informaron de la estructura cristalina a una resolución de 2,1 A de una SASP de tipo a/p unida a una doble hélice de ADN de 10 pb. En el complejo, las SASP de tipo a/p adoptan un motivo de hélice-giro-hélice, interactúan con el ADN a través de contactos de surco menor, se unen a aproximadamente 6 pb de ADN como un dímero y el ADN tiene una conformación de tipo A-B. De esta manera, se detiene la replicación del ADN y, cuando se unen, las SASP evitan la transcripción del ADN. Las SASP se unen al ADN de una manera no específica de secuencia (Nicholson et al., 1990) para que las mutaciones en el ADN bacteriano no afecten la unión de SASP. Las secuencias de SASP de tipo a/p se pueden encontrar en el apéndice 1 del documento WO02/40678, incluyendo SASP-C de Bacillus megaterium que es la SASP de tipo a/p preferida.
El documento WO02/40678 describe el uso como un antibiótico del bacteriófago modificado para incorporar un gen de SASP. Para proporcionar una producción eficaz del bacteriófago modificado en un hospedador bacteriano, el documento WO02/40678 se dirige a evitar factores que puedan interrumpir la proliferación del hospedador de producción, tal como la expresión del gen de SASP durante la producción. Con este fin, el gen de SASP se puso bajo el control de un promotor inducible. En una disposición preferida, se inactivó al menos uno de los genes que codifican productos implicados en el proceso lítico.
El documento WO2009019293 describe que se puede lograr una producción eficaz del bacteriófago cuando el bacteriófago se ha modificado para eliminar un gen de lisis y para llevar un gen que codifica una SASP bajo el control de un promotor que está controlado de manera independiente del bacteriófago y que es constitutivo sin que sea necesaria o se proporcione una regulación exógena o en trans. Dicho bacteriófago modificado se mantiene como probacteriófago en una cepa hospedadora de fabricación y puede amplificarse mediante métodos de inducción adecuados para sintetizar nuevos bacteriófagos dentro de la cepa hospedadora de fabricación. En esta disposición, la cepa hospedadora de fabricación debe lisarse mediante la adición de sustancias exógenas, por ejemplo, enzimas líticas o productos químicos, para liberar bacteriófagos viables. Un ejemplo de un promotor adecuado es el promotor fbaA de S. aureus que se utiliza para impulsar la expresión del gen de SASP-C de Bacillus megaterium y que, cuando está presente en varias copias, por ejemplo, después de la infección de células diana, impulsa niveles tóxicos de expresión de SASP.
Los vectores bacteriófagos modificados para contener un gen de SASP se han denominado generalmente vectores SASPject. Una vez que el gen de SASP se ha administrado a una bacteria diana, la SASP se produce dentro de esas bacterias cuando se une al ADN bacteriano y cambia la conformación del ADN de tipo B a tipo A. La producción de suficiente SASP dentro de las células bacterianas diana provoca una disminución en la viabilidad de las células afectadas.
Los bacteriófagos se han utilizado como medicamentos para el tratamiento de infecciones bacterianas desde las décadas de 1920 o 1930. Generalmente, los bacteriófagos son específicos de su hospedador bacteriano. Algunos bacteriófagos son moderados y otros no moderados. Los bacteriófagos moderados son capaces de infectar la célula hospedadora e integrarse en el genoma de la célula hospedadora convirtiéndose en un probacteriófago que generalmente es inofensivo para la célula hospedadora en este estado. Los bacteriófagos no moderados o "líticos" solo son capaces de replicarse en un modo de vida lítico mediante la creación de una nueva progenie de bacteriófagos y terminando en la lisis de la célula hospedadora y la liberación de partículas de bacteriófagos maduros. Para medicamentos útiles, el desafío es proporcionar composiciones de bacteriófagos que se puedan utilizar para tratar infecciones de una variedad de bacterias diferentes de una manera eficaz. Con frecuencia se piensa que esto se logra utilizando las composiciones de bacteriófagos más potentes disponibles: aquellas con una variedad de hospedadores más amplio, posiblemente como una mezcla o "combinado" de bacteriófagos (Carlton, 1999; Kutateladze y Adamia, 2010). Se han utilizado combinados de bacteriófagos de tipo silvestre para asegurar un espectro de actividad suficiente contra cepas clínicas de bacterias (Burrowes y Harper, 2012). Dichos combinados pueden consistir en hasta 20 bacteriófagos diferentes y no relacionados (Abedon 2008). Como alternativa al enfoque de los combinados, se ha aislado el bacteriófago K1-5 de E. coli. Este es un bacteriófago obligatoriamente lítico de origen natural que lleva más de un determinante de la variedad de hospedadores (HRD, por sus siglas en inglés 'host range determinant'), lo que le permite infectar y replicar tanto en las cepas K1 como K5 de E. coli (Scholl et al, 2001). Estos bacteriófagos se consideran extrapotentes.
Sigue existiendo una necesidad de proporcionar bacteriófagos mejorados para utilizar en el tratamiento de infecciones bacterianas en medicina, así como para inhibir o evitar el crecimiento de células bacterianas en situaciones médicas y no médicas.
Sumario de la invención
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un bacteriófago modificado capaz de infectar una pluralidad de bacterias diana diferentes, incluyendo el bacteriófago un gen de toxina que codifica una proteína de toxina que es tóxica para las bacterias diana; donde el bacteriófago es lítico; y donde el bacteriófago expresa proteínas determinantes de la variedad del hospedador (HRD) que tienen una pluralidad de especificidades del hospedador bacteriano. La especificidad del hospedador bacteriano del HRD se encuentra ventajosamente dentro de la misma especie bacteriana.
Sorprendentemente, se ha descubierto que se puede producir un bacteriófago modificado que es capaz de infectar una variedad de bacterias diana diferentes y que es eficaz para utilizar en medicina cuando se genomanipula para llevar un gen de una proteína tóxica. El bacteriófago modificado es letal para las células bacterianas y, a pesar de ser lítico y, por lo tanto, requerir la finalización del ciclo vital del bacteriófago para ser liberado de las células, se puede fabricar en una célula hospedadora a través de varias rondas de infección y replicación.
En un aspecto, las proteínas HRD que tienen una pluralidad de especificidades del hospedador bacteriano son proteínas HRD híbridas que comprenden cada una de ellas una secuencia de aminoácidos de una pluralidad de bacteriófagos diferentes. Debido a que el bacteriófago modificado expresa una proteína HRD híbrida, esto confiere una variedad de hospedadores mejorada en el bacteriófago. Los bacteriófagos de acuerdo con la invención se pueden producir mediante ingeniería genética, por ejemplo, mediante la selección de HRD de bacteriófagos estrechamente relacionados. Una vez creado dicho bacteriófago lítico extrapotente, entonces, se puede genomanipular para crear un vector que incorpore el gen de la toxina, cuyo vector es capaz de fabricarse en una célula hospedadora y es eficaz como antibacteriano in vivo.
En otro aspecto, las proteínas HRD expresadas por el bacteriófago comprenden una pluralidad de HRD diferentes, donde cada HRD tiene una especificidad de hospedador bacteriano diferente. En este aspecto, los HRD pueden ser homólogos, heterólogos, (híbridos) o una mezcla de HRD homólogos e híbridos. La pluralidad de diferentes HRD confiere al bacteriófago una variedad de hospedadores mejorada. Dicho bacteriófago puede producirse mediante ingeniería genética, por ejemplo, mediante la selección de HRD de bacteriófagos que infectan la misma especie bacteriana. Una vez creado dicho bacteriófago lítico extrapotente, entonces, se puede genomanipular para crear un vector que incorpore el gen de la toxina, cuyo vector es capaz de fabricarse en una célula hospedadora y ser eficaz como antibacteriano in vivo.
En una disposición preferida, el gen de la toxina comprende un gen de la proteína pequeña de espora soluble en ácido (SASP) a/p que codifica una SASP. En un aspecto, el término "SASP", como se utiliza en la memoria descriptiva, se refiere a una proteína con actividad SASP de tipo a/p, es decir, la capacidad de unirse al ADN y modificar su estructura de la forma B hacia la forma A, y no solo cubre las proteínas enumeradas en el apéndice 1 del documento WO02/40678, sino también cualquier homólogo de la misma, así como cualquier otra proteína que también tenga actividad SASP de tipo a/p. En un aspecto alternativo, el término "SASP", como se utiliza en la memoria descriptiva, se refiere a cualquier proteína enumerada en el apéndice 1 del documento WO02/40678, o cualquier homólogo que tenga al menos un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 92 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con una cualquiera de las proteínas enumeradas en el apéndice 1 del documento WO02/40678. En otro aspecto alternativo, el término "SASP", como se utiliza en la memoria descriptiva, se refiere a cualquier proteína enumerada en el apéndice 1 del documento WO02/40678. El gen de SASP se puede elegir a partir de uno cualquiera de los genes que codifican la SASP divulgada en el apéndice 1 del documento WO02/40678. En una disposición preferida, la SASP es SASP-C. La SASP-C puede ser de Bacillus megaterium.
Se prefiere que el gen de SASP esté bajo el control de un promotor constitutivo que sea de manera ventajosa suficientemente fuerte para impulsar la producción de niveles tóxicos de SASP cuando el bacteriófago modificado está presente en múltiples copias en la bacteria diana. Los promotores constitutivos útiles incluyen pdhA para las subunidades a del componente E1 de la piruvato deshidrogenasa, rpsB para la proteína S2 ribosómica 30S, pgi para la glucosa-6-fosfato isomerasa y el promotor fda del gen de fructosa bisfosfato aldolasa. Los promotores regulados preferidos, activos durante la infección, son lasB para elastasa. Estos promotores normalmente son de P. aeruginosa. También se pueden utilizar promotores que tengan una secuencia que muestre al menos un 90 % de identidad de secuencia con estas secuencias promotoras.
La presente invención es generalmente aplicable a bacteriófagos que infectan una variedad de bacterias diana diferentes. En una disposición, al menos una de las bacterias diana es Pseudomonas. De manera ventajosa, la pluralidad de bacterias diana diferentes es una pluralidad de diferentes bacterias Pseudomonas. Una diana importante es Pseudomonas aeruginosa.
Anteriormente se consideró que un bacteriófago lítico obligado no sería adecuado para utilizar como vector SASPject, ya que un requisito de un vector SASPject es que no sea específicamente lítico para un uso terapéutico óptimo. Un vector no lítico permite un mayor tiempo para la expresión de SASP, aumentando así la eficacia del tratamiento. Además, la prevención de la lisis rápida tras el tratamiento in vivo, se consideró ventajoso porque limitaría la posible liberación de genes de resistencia a antibióticos y componentes tóxicos de la pared celular que pueden conducir a una respuesta inflamatoria peligrosa.
El enfoque descrito en la presente invención es ventajoso en comparación con el enfoque de combinaciones de bacteriófagos descrito anteriormente. Las mezclas de bacteriófagos modificados, tales como vectores SASPject, son idénticas en estructura y secuencia del genoma, aparte de llevar un HRD diferente o un HRD híbrido. Una ventaja es que el control del proceso de fabricación de la mezcla de SASPjects será sencillo, que es un aspecto importante de una preparación farmacéutica: el proceso será materialmente el mismo para los bacteriófagos modificados para llevar un HRD heterólogo, ya que comparten propiedades biofísicas idénticas o casi idénticas. Otra ventaja es que es probable que las características in vivo de los vectores SASPject sean similares, por ejemplo, la farmacocinética/farmacodinámica, ya que cada vector es estructuralmente igual o similar.
En un aspecto de la presente invención, se ha encontrado que se pueden crear bacteriófagos que son bacteriófagos obligatoriamente líticos extrapotentes que llevan HRD que tienen una pluralidad de especificidades del hospedador bacteriano. Sorprendentemente, dicho bacteriófago se puede utilizar para producir vectores SASPject mejorados que conservan un fenotipo lítico y siguen siendo eficaces in vivo y dicho bacteriófago se puede fabricar hasta un valor adecuado en un hospedador bacteriano. Los documentos WO02/40678 y WO2009019293 han enseñado la creación de vectores SASPject a partir de bacteriófagos que se han modificado para eliminar uno o más genes de lisis y que residen como probacteriófagos en una célula hospedadora. Dichos vectores SASPject se fabrican mediante inducción de probacteriófagos y las células se lisan mediante la adición exógena de agentes de lisis, por ejemplo, enzimas que degradan la pared celular o productos químicos tales como el cloroformo. Así, las células no necesitan permanecer viables hasta el final del ciclo vital del bacteriófago, ya que la etapa de lisis final no depende de la síntesis y acumulación en la célula hospedadora de las proteínas de lisis del propio bacteriófago modificado. Dada la naturaleza tóxica de la proteína SASP y la naturaleza extrapotente del bacteriófago modificado descrito en la presente invención, no se anticipó que dicho bacteriófago sería adecuado para su modificación con el fin de crear SASPjects que podrían fabricarse a través de un ciclo vital lítico obligado, requiriendo que el bacteriófago completara su ciclo vital lítico para crear vectores SASPject viables. Sin embargo, se ha encontrado que dichos vectores SASPject son capaces de replicarse en células hospedadoras hasta un valor adecuado. Esto permite la fabricación de vectores SASPject en una cantidad adecuada para su utilización eficaz in vivo. De manera ventajosa, los vectores SASPject basados en dichos bacteriófagos líticos obligados modificados son capaces de replicarse en el sitio de infección. Esto significa que la dosis requerida para un SASPject lítico puede ser menor que la requerida para un SASPject no lítico cuando se utiliza in vivo. Los vectores SASPject líticos de acuerdo con la invención pueden considerarse más potentes que sus homólogos no líticos.
El bacteriófago adecuado para dicha modificación puede aislarse mediante la selección de bacteriófagos capaces de infectar una especie bacteriana seleccionada. Por ejemplo, se pueden aislar bacteriófagos que infectan Pseudomonas aeruginosa, mediante la selección de fuentes ambientales en busca de bacteriófagos que sean capaces de formar placas en cepas representativas de P. aeruginosa (Gill y Hyman, 2010). Los bacteriófagos aislados pueden tener sus genomas completos secuenciados y anotados. Los HRD pueden ser proteínas de la fibra de la cola, que comúnmente son proteínas responsables del reconocimiento/unión inicial a la bacteria hospedadora, por ejemplo, en el bacteriófago T4, T5 y T7 (Rakhuba et al., 2010). Alternativamente, otros HRD pueden ser proteínas de la placa base. Se pueden buscar en los genomas de bacteriófagos posibles secuencias de HRD mediante la evaluación de la homología de todas las proteínas en el genoma del bacteriófago con secuencias conocidas, utilizando búsquedas BLAST.
De acuerdo con la presente invención, se prefiere que cada HRD tenga una amplia variedad de hospedadores. Esto puede definirse como la capacidad de infectar >50 % de una colección diversa o aislados clínicos, con un total de al menos 35, preferentemente al menos 40, más preferentemente al menos 44, y lo más preferentemente >50 en número. Dichos aislados deben ser de una variedad de ubicaciones geográficas, incluyendo Europa, las Américas y Asia, deben llevar una amplia variedad de fenotipos de resistencia a antibióticos, incluyendo las cepas multirresistentes (MDR), y deben provenir de una amplia variedad de sitios de infección, tales como cepas cultivadas a partir de Infecciones sanguíneas, pulmonares y cutáneas. Dichos aislados se pueden obtener de colecciones de cepas públicas tales como la American Type Culture Collection (ATCC) y la National Collection of Type Cultures (NCTC). Generalmente, cada proteína de la fibra de la cola comprende una región de unión al receptor carboxiterminal para unirse a las bacterias diana y una región aminoterminal que une la región de unión al receptor carboxiterminal al cuerpo del bacteriófago. Cada una de las regiones carboxiterminal y aminoterminal puede ser de diferentes bacteriófagos. En una disposición, la región aminoterminal comprende los aminoácidos 1 a 628 de la proteína de la fibra de la cola y la región carboxiterminal comprende los aminoácidos 629 a 964 de la proteína de la fibra de la cola.
La región carboxiterminal puede tener no más del 96 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la región carboxiterminal del bacteriófago 033 y puede ser de uno cualquiera de los bacteriófagos 033, LBL3, SPM-1, F8, PB1, KPP12, LMA2, SN, 14-1, JG024, NH-4, PTP47, C36, PTP92 y PTP93. Se prefieren las identidades de secuencia de aminoácidos inferiores en la región carboxiterminal. De manera ventajosa, la identidad de secuencia es inferior al 90 %, más ventajosamente inferior al 80 %, preferentemente inferior al 70 %, más preferentemente inferior al 60 %, aún más preferentemente inferior al 50 %, de manera particular preferentemente inferior al 40 %, de manera más particular preferentemente inferior al 30 %. La región aminoterminal puede tener al menos un 90 % y de manera ventajosa al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la región aminoterminal del bacteriófago 033 y puede ser de uno cualquiera de los bacteriófagos 033, LBL3, SPM-1, F8, PB1, KPP12, LMA2, SN, 14-1, JG024, NH-4, PTP47, C36, PTP92 y PTP93. La región aminoterminal y la región carboxiterminal pueden ser del mismo bacteriófago para proporcionar una proteína de la fibra de cola homóloga. Como alternativa, la región aminoterminal y la región carboxiterminal pueden ser de diferentes proteínas de las fibras de la cola del bacteriófago para proporcionar una proteína de la fibra de la cola heteróloga. En una disposición, cuando la proteína de la fibra de la cola del bacteriófago es homóloga, cada proteína de la fibra de la cola es de un bacteriófago seleccionado de 033, LBL3, SPM-1, F8, PB1, KPP12, LMA2, SN, 14-1, JG024, NH-4, PTP47, C36, PTP92 y PTP93.
Es ventajoso identificar las proteínas de las fibras de la cola del bacteriófago que comparten una identidad de secuencia superior al 90 % en la región aminoterminal. Por ejemplo, varios bacteriófagos - 033, PTP47, PTP92 y C36 - con una amplia variedad de hospedadores para las cepas de P. aeruginosa (todos estos bacteriófagos infectan >60 %, cuando se analizan frente a 260 cepas), se han aislado/identificado y se han secuenciado sus genomas. Los análisis de las secuencias del genoma de 033, PTP47, PTP92 y C36 revelan que contienen genes que codifican supuestas proteínas de las fibras de la cola con un elevado nivel de identidad de secuencia en la región aminoterminal (>95 % de identidad de secuencia de aminoácidos), después de una alineación BLAST de 2 secuencias, en comparación con los aminoácidos 1 a 628 de las fibras de la cola de 033 (identidad de aminoácidos entre paréntesis): C36 (96 %), PTP47 (98 %), PTP92 (97 %). Las búsquedas BLAST han demostrado que estos 4 bacteriófagos están relacionados con otras 10 secuencias del genoma del bacteriófago depositadas que, conjuntamente, forman la familia de bacteriófagos similares a PB1: PB1, SPM1, F8, LBL3, KPP12, LMA2, SN, JG024, NH-4, 14-1 (Ceyssens et al., 2009). Se evaluó la homología de estas supuestas proteínas de las fibras de la cola. Después de una alineación BLAST de 2 secuencias, se comparó con la proteína de la fibra de la cola 033 (identidad de aminoácidos entre paréntesis): LBL3 (96%), SPM-1 (95%), F8 (95%), PB1 (95%), KPP12 (94%), LMA2 (94 %), SN (87 %), 14-1 (86 %), JG024 (83 %), NH-4 (83 %), C36 (96 %), PTP47 (86 %), PTP92 (83 %). En la figura 13 se muestra una alineación de las 14 proteínas de las fibras de la cola del bacteriófago mencionadas anteriormente.
El análisis de las secuencias de proteínas de las fibras de la cola anotadas de estos 14 bacteriófagos revela que la región aminoterminal de las proteínas, equivalente a los aminoácidos 1 a 628 de la fibra de la cola 033, muestra un nivel aún mayor de identidad de secuencia a nivel de aminoácidos que la identidad de secuencia de estas proteínas en toda su longitud, en el intervalo del 96 al 100 % para las 14 proteínas. Después de una alineación BLAST de 2 secuencias, se comparó con los aminoácidos aminoterminales 1 a 628 de la proteína de la fibra de la cola 033 (identidad de aminoácidos entre paréntesis): LBL3 (96%), SPM-1 (96%), F8 (96%), PB1 (96%), KPP12 (98%), LMA2 (99 %), SN (99 %), 14-1 (97 %), JG024 (97 %), NH-4 (97 %), PTP47 (98 %), C36 (96 %), PTP92 (97 %). Sin embargo, la región carboxiterminal de la proteína, equivalente a los aminoácidos 629 a 964 de la fibra de la cola 033, no está tan conservada como la región aminoterminal en algunas de las proteínas, siendo el intervalo de identidad de secuencia normalmente del 57 al 96 %. Después de una alineación BLAST de 2 secuencias, se comparó con los aminoácidos 629 a 964 carboxiterminales de la proteína de la fibra de la cola 033 (identidad de aminoácidos entre paréntesis): LBL3 (94%), SPM-1 (93%), F8 (93%), PB1 (94%), KPP12 (87%), LMA2 (85%), SN (65 %), 14-1 (65 %), JG024 (57 %), NH-4 (57 %), PTP47 (64 %), C36 (96 %), PTP92 (57 %). El análisis de las fibras de la cola del bacteriófago de otros bacteriófagos bien caracterizados ha demostrado que poseen una región de unión a la placa base de la cola aminoterminal y una región de unión al receptor carboxiterminal (Veesler y Cambillau, 2011). En el análisis experimental de su variedad de hospedadores de cepas bacterianas, utilizando ensayo de placa o pruebas de inhibición del crecimiento, el bacteriófago 033, PTP47, PTP92 y C36 tienen una variedad de hospedadores superpuesta pero no idéntica (Tabla 1). Tomado junto con la evidencia establecida del papel de la región carboxiterminal de las fibras de la cola del bacteriófago que está implicada en la unión al receptor del hospedador bacteriano, y la variación de secuencia en la región carboxiterminal de estos 4 bacteriófagos, y su variedad de hospedadores similar pero no idéntica, se postula que la variación carboxiterminal está asociada con la variación de hospedadores en el bacteriófago evaluado.
Además se proporciona, de acuerdo con la presente invención, que los genes de una proteína de la fibra de la cola homóloga se pueden tomar de un bacteriófago y añadirse a otro, reemplazando la fibra de la cola residente, basándose en su elevado nivel de identidad de secuencia en la región aminoterminal. Se cree que la región aminoterminal está implicada en la unión de la fibra de la cola a la cola del bacteriófago (Veesler y Cambillau, 2011), lo que permite la formación de bacteriófagos viables con la variedad de hospedadores asociada con la fibra de la cola del bacteriófago donante. Se pueden fabricar genes de las fibras de cola híbridos, que llevan la región aminoterminal de unión de la cola conservada de la fibra de la cola de un bacteriófago receptor, junto con la región carboxiterminal de unión al receptor variable de una proteína de la fibra de cola del bacteriófago donante homóloga, utilizando genes de las fibras de la cola como los descritos en el presente documento. Dichos genes híbridos de las fibras de la cola podrían utilizarse para reemplazar las fibras de la cola del bacteriófago. Esto proporciona una región aminoterminal de la fibra de la cola híbrida (del bacteriófago receptor) y permite la formación de bacteriófagos viables con la variedad de hospedadores asociada con la región carboxiterminal de unión al receptor de la fibra de la cola del bacteriófago donante. En la presente invención se ha demostrado el trasplante de genes híbridos de la fibra de la cola genomanipulados en un bacteriófago receptor. Utilizando técnicas genéticas moleculares estándar, 033 se ha modificado para llevar híbridos de la fibra de la cola heterólogos de los siguientes bacteriófagos: PTP92, PTP47, LBL3, SPM-1, F8, PB1, KPP12, LMA2, SN, 14-1 y NH-4. Se ha demostrado que todos los bacteriófagos modificados son viables y capaces de formar placas en P. aeruginosa. (La nomenclatura de los híbridos de la fibra de la cola es la siguiente: Como ejemplo, un gen híbrido tal que la región aminoterminal de unión de la cola de 033 se hibrida con la región carboxiterminal de unión al receptor de PTP47 es 033(N)PTP47(C).)
En uno de dichos bacteriófagos modificados, 033 se genomanipuló de manera que el gen de la fibra de la cola lleve la región carboxiterminal de unión al receptor de PTP92, creando PTP93(033(N)PTP92(C)). Esto se evaluó con más detalle, probando la variedad de hospedadores contra 35 diversos aislados clínicos de P. aeruginosa. Comparando la variedad de hospedadores del bacteriófago progenitor (033), el donante de fibras de la cola (PTP92) y el bacteriófago híbrido (PTP93), la variedad de hospedadores del bacteriófago híbrido PTP93 es equivalente a la del bacteriófago donante de fibras de la cola (PTP92) en lugar de 033, pero se encontró sorprendentemente que en algunos casos PTP93 posee la variedad de hospedadores de 033 en cepas que PTP92 no puede infectar, por lo tanto, PTP93 hereda la variedad de hospedadores de ambos bacteriófagos (Tabla 2). PTP93 posee una variedad de hospedadores más amplia (92%) que 033 (74%) o PTP92 (66%) (Tabla 2). PTP93 es un ejemplo de un bacteriófago obligatoriamente lítico que puede considerarse como "extrapotente" ya que posee una característica por encima y más allá de las presentadas en su estado no modificado. Dichos bacteriófagos extrapotentes son adecuados para modificaciones adicionales para producir vectores SASPject.
033, a través de la evaluación de la homología de secuencia por un experto en la materia, puede colocarse en el grupo de bacteriófagos similares a PB1 (Ceyssens et al., 2009), y puede considerarse un bacteriófago de amplia variedad de hospedadores según la definición dada anteriormente. Dicho bacteriófago podría aislarse mediante los métodos descritos anteriormente. 033 es adecuado para la modificación genética para introducir un gen de SASP bajo el control de un promotor. Dicho bacteriófago modificado sería adecuado para utilizar en el tratamiento de infecciones causadas por bacterias P. aeruginosa susceptibles, ya sea solo o en combinación con otro bacteriófago modificado. En una disposición, la invención puede no extenderse a un bacteriófago aislado PTPX31 o PTPX32.
Un enfoque preferido de acuerdo con la presente invención es utilizar uno o más bacteriófagos obligatoriamente líticos, cada uno genomanipulado para llevar un gen de SASP expresado a partir de un promotor constitutivo, siendo cada bacteriófago genéticamente idéntico con excepción de su fibra de la cola o su gen híbrido de la fibra de la cola. Los bacteriófagos obligatoriamente líticos preferidos para la modificación y para la provisión de genes de la fibra de la cola con el fin de crear genes de la fibra de la cola o genes híbridos de la fibra de la cola son los bacteriófagos que llevan genes de la fibra de la cola que codifican proteínas previstas que poseen >90 % de identidad de secuencia de aminoácidos en sus regiones aminoterminales en comparación con regiones aminoterminales de la fibra de la cola de otro bacteriófago aislado o identificado.
Otro enfoque preferido de acuerdo con la presente invención es utilizar uno o más bacteriófagos obligatoriamente líticos genomanipulados para expresar 2 o más HRD (fagos líticos obligatoriamente extrapotentes), cada uno genomanipulado para llevar un gen de SASP expresado a partir de un promotor constitutivo, siendo cada bacteriófago genéticamente idéntico, además de llevar diferentes genes de la fibra de la cola, o genes híbridos de la fibra de la cola, Los bacteriófagos obligatoriamente líticos preferidos para la modificación y para la provisión de genes de la fibra de la cola con el fin de crear bacteriófagos que llevan múltiples genes de la fibra de la cola o genes híbridos de la fibra de la cola son los bacteriófagos que llevan genes de la fibra de la cola que codifican proteínas previstas que poseen >90 % de identidad de secuencia de aminoácidos en sus regiones aminoterminales en comparación con las regiones aminoterminales de la fibra de la cola de otro bacteriófago aislado o identificado.
Los bacteriófagos líticos obligados preferidos que cumplen estos criterios son 033, PTP92, PTP47, LBL3, SPM-1, F8, PB1, KPP12, LMA2, SN, 14-1, NH-4, PTP93, JG024, PTP47 y C36. Dicho bacteriófago se puede identificar mediante un simple ensayo de PCR, sometiendo placas de bacteriófagos aislados a PCR con cebadores específicos para regiones altamente conservadas en la región aminoterminal de los genes de la cola. De tal manera, el bacteriófago adecuado se puede identificar sin secuenciar el genoma completo. El bacteriófago PB1 se puede obtener de una colección pública de cepas. No es necesario aislar o proporcionar bacteriófagos para generar secuencias de fibras de la cola, ya que dichas secuencias pueden identificarse en bases de datos de secuencias de ADN u otras fuentes de secuencias de ADN, que pueden proporcionar la información necesaria para sintetizar y clonar, mediante métodos estándar, dichas secuencias, o para crear secuencias de fibras de la cola híbridas.
Los bacteriófagos particularmente preferidos para la modificación son PTP93, 033, PTP92, PTP47 y C36. Los bacteriófagos líticos obligados extrapotentes particularmente preferidos son: 033, modificado para llevar la fibra de la cola híbrida 033(N)PTP92(C) en lugar de la fibra de la cola residente; 033 modificado para llevar la fibra de la cola híbrida 033(N)PTP47(C) en lugar de la fibra de la cola residente. En un aspecto de la presente invención, los derivados de SASPject líticos extrapotentes preferidos de 033 incluyen: 033, modificado para llevar la fibra de la cola híbrida 033(N)PTP92(C) en lugar de la fibra de la cola residente y que lleva SASP-C de Bacillus megaterium, codones optimizados para la expresión en P. aeruginosa, bajo el control del promotor génico fructosa bisfosfato aldolasa (fda) de P. aeruginosa; 033 modificado para llevar la fibra de cola híbrida 033(N)PTP47(C) en lugar de la fibra de cola residente y que lleva SASP-C de Bacillus megaterium, codones optimizados para la expresión en P. aeruginosa, bajo el control del gen de la fructosa bisfosfato aldolasa (fda) de P. aeruginosa; 033 modificado para llevar SASP-C de Bacillus megaterium, codones optimizados para la expresión en P. aeruginosa, bajo el control del promotor génico fructosa bisfosfato aldolasa (fda) de P. aeruginosa. En un aspecto particularmente preferido, la presente invención proporciona una mezcla de SASPject que comprende o consiste en los 3 SASPjects mencionados anteriormente formulados juntos.
Se construyó una mezcla de tres bacteriófagos modificados, designada PT3.9, y se probó su eficacia para destruir P. aeruginosa. La mezcla consiste en: 033 que lleva la fibra de cola 033(N)PTP92(C), modificado para llevar el fda-SASP-C (secuencia con codones optimizados de P. aeruginosa) (PTP388); 033 que lleva la fibra de cola 033(N)PTP47(C), modificado para llevar el fda-SASP-C (secuencia con codones optimizados de P. aeruginosa) (PTP389); 033 que lleva la fibra de cola 033(N)033(C), modificado para llevar la fda-SASP-C (secuencia con codones optimizados de P. aeruginosa) (PTP387).
La eficacia de PT3.9 se probó en un experimento de curva de letalidad de 6 horas contra un aislado clínico multirresistente (MDR) (sitio de aislamiento de la tráquea, resistencia a antibióticos a ceftazidima, piperacilinatazobactam e imipenem) de P. aeruginosa, cepa 3503 y cepa de referencia ATCC 27853. En resumen, se prepararon cultivos en caldo Luria Bertani (LB) complementado con cloruro de calcio 5 mM, sulfato de magnesio 5 mM y glucosa al 0,1 % (caldo LC) y se cultivó a 37 °C. Se incubaron 5 * 105 unidades formadoras de colonias por mililitro (ufc/ml) de P. aeruginosa con 3 * 109 unidades formadoras de placas por ml (ufp/ml) de PT3.9, o caldo LC extra como control (cultivo sin tratar). Las muestras se retiraron a las 0, 1, 2, 4 y 6 horas para dilución en serie y sembrarlas en placas de agar LC y, a continuación, incubarlas durante la noche a 32 °C. Para ambas cepas, el recuento de células viables se redujo de 5 * 105 ufc/ml hasta situarse por debajo del límite de detección (102 ufc/ml) al cabo de 1 hora de tratamiento, y no se detectaron células viables después de 6 horas (Figura 14). Por el contrario, el cultivo de control sin tratar creció entre 5 * 108 ufc/ml y 1 * 109 ufc/ml para ambas cepas. Esto demuestra la capacidad de PT3.9 para destruir cepas clínicas de P. aeruginosa.
PTP387, un componente SASPject de PT3.9, se probó in vivo en comparación con PTP284, un SASPject que es equivalente a PTP387 excepto que carece de uno de los genes de lisis (endolisina). Se utilizó un modelo murino inmunocompetente de bacteriemia por P. aeruginosa para evaluar la potencia de los dos vectores SASPject. En resumen, se infectaron animales mediante inyección intravenosa con un inóculo de 7,5 log-io ufc de la cepa ATCC 27853 de P. aeruginosa. A las 2 horas después de la infección, los ratones se trataron con PTP284, PTP387, vehículo (tampón) o ceftazidima (50 mg/kg) mediante inyección intravenosa. PTP284 y PTP387 se administraron en las siguientes dosis: 3 * 1010, 1 * 1010, 3 * 109 y 1 * 109 ufp. A las 22 horas después del tratamiento, los ratones se sacrificaron mediante asfixia con dióxido de carbono y se extrajeron y pesaron los hígados. El tejido hepático se homogeneizó en caldo de triptona de soja (TSB, por sus siglas en inglés 'tryptone soya broth') y se contó el número de células viables en el tejido hepático mediante diluciones seriadas y cultivo en placas de agar cetrimida. Un grupo de control (no tratado) de ratones se sacrificó 2 horas después de la infección y se contaron las células viables en el tejido hepático, para evaluar el recuento de células viables en el tejido hepático en el momento del tratamiento. Se observó una respuesta a la dosis tanto para PTP284 como para PTP387, cuando se evaluó la media geométrica de los niveles de contaminación microbiana de P. aeruginosa en tejido hepático (Figura 15). La potencia de PTP387 fue mayor que la de PTP284 cuando se evaluó la reducción logarítmica de ufc/g de tejido hepático en comparación con el nivel evaluado en el momento del tratamiento: 22 horas después del tratamiento, PTP387 provocó una reducción logarítmica de 3 en la contaminación microbiana del tejido hepático con una dosis de 1 * 109 ufp, mientras que se observó un efecto equivalente de PTP284 a 1 * 1010 ufp. PTP387 causó un efecto máximo mayor en la reducción de la contaminación microbiana del tejido hepático en comparación con PTP284: a una dosis de 3 * 1010 ufp, PTP387 provocó una reducción logarítmica de 5,4 en la contaminación microbiana del tejido hepático 22 horas después del tratamiento, mientras que PTP284 provocó una reducción logarítmica de 2,4.
Esto demuestra el aumento de la potencia del SASPject lítico in vivo en comparación con SASPject no lítico equivalente.
Se probó la mezcla de bacteriófago SASPject modificado lítico que comprende PT3.9 in vivo en comparación con la mezcla de bacteriófago SASPject modificado no lítico que comprende PT3.8. Los bacteriófagos modificados en PT3.8 son idénticos a los de PT3.9 salvo que carecen del gen de lisis (endolisina) presente en PT3.9. Se utilizó un modelo murino neutropénico de neumonía por P. aeruginosa para evaluar la potencia de las dos mezclas de bacteriófagos SASPject. En resumen, los animales se volvieron neutropénicos mediante inmunosupresión con ciclofosfamida 200 mg/kg 4 días antes de la infección y 150 mg/kg 1 día antes de la infección mediante inyección intraperitoneal. Los animales se anestesiaron y se infectaron por vía intranasal con 4,5 * 103 ufc de la cepa ATCC 27853 de P. aeruginosa. Se administró cada tratamiento a grupos de 6 ratones. PT3.8 y PT3.9 se administraron a través de la tráquea 15 minutos después de la infección en forma de aerosol en las siguientes dosis: 1 * 109, 3 * 10 , 1 * 10 y 1,5 *10 ufp. Se administró tobramicina (200 |jg) en forma de aerosol a un grupo de control de ratones, y otro grupo se trató con tampón placebo. Los animales se sacrificaron 24 horas después del tratamiento y se extrajo tejido pulmonar y se homogeneizó en solución salina tamponada con fosfato (PBS). El homogeneizado de tejido se diluyó en serie y se sembró en placas de agar para contar las bacterias en el tejido pulmonar. Un grupo de control (no tratado) de ratones se sacrificó 15 minutos después de la infección y se contaron las células viables en el tejido pulmonar, para evaluar el recuento de células viables en el tejido en el momento del tratamiento. Se observó una respuesta a la dosis tanto para PT3.8 como para PT3.9, cuando se evaluó la media geométrica de los niveles de contaminación microbiana de P. aeruginosa en tejido pulmonar (Figura 16). La potencia de PT3.9 fue mayor que la de PT3.8. Cuando se evaluó la reducción logarítmica de ufc/g de tejido pulmonar en comparación con el nivel evaluado en el momento del tratamiento: 24 horas después del tratamiento, PT3.9 causó una reducción logarítmica de >2 en la contaminación microbiana del tejido pulmonar a una dosis de 1 * 109 ufp, mientras que se observó un efecto equivalente de PT3.8 a dosis entre 1 * 1010 y 1,5 * 1010 ufp. Por lo tanto, PT3.9 era más de 10 veces más potente que PT3.8.
Se evaluó la capacidad de PTP387 para propagarse en una célula hospedadora y producir lisados bacterianos adecuados para una purificación adicional en comparación con el bacteriófago no modificado (033). En resumen, se utilizaron cultivos nocturnos de la cepa 1868 de P. aeruginosa para inocular recipientes biorreactores de 2 * 1 l, conteniendo cada uno 0,5 l de medio rico en caldo, a una DO600 de 0,05. Los cultivos se hicieron crecer hasta una DO600 = 0,3 a 0,4 y, a continuación, se infectaron con el bacteriófago 033 o PTP387 hasta una concentración final de 1 * 107 ufp/ml, y se cultivaron adicionalmente a 37 °C. Después de 5 horas de crecimiento, los cultivos se trataron con benzonasa y se esterilizaron por filtración. La concentración de cada bacteriófago se determinó mediante ensayo de placa. Los valores de lisado obtenidos para PTP387 fueron comparables a los obtenidos para 033: 2 * 1011 ufp/ml (PTP387) y 5 * 1011 ufp/ml (033). El valor de PTP387 aumentó en 4 log durante 5 horas, demostrando la capacidad de este bacteriófago para completar varios ciclos de infección, multiplicación y lisis, a pesar de la presencia del gen de SASP tóxico.
Las fermentaciones se realizaron a una escala de 15,5 l a 16 l para los 3 bacteriófagos modificados que comprenden PT3.9. En resumen, se utilizaron cultivos nocturnos de Pseudomonas aeruginosa para inocular un biorreactor de 16 l que contenía de 15,5 l a 16 l de medio rico en caldo, a una DO600 de 0,05. Cada cultivo se cultivó hasta una Do 600 = 0,4 a 0,7 antes de ser infectado con PTP387, PTP388 o PTP389 (bacteriófago SASPject que comprende PT3.9) a una concentración final de 1 x 107 ufp/ml. Los cultivos se hicieron crecer durante otras 5 horas antes del tratamiento con benzonasa. Las muestras se extrajeron, se filtraron de forma estéril y se analizaron mediante ensayo de placa. Se realizaron dos fermentaciones para cada bacteriófago SASPject. Los 3 bacteriófagos SASPject modificados que comprenden PT3.9 fueron capaces de propagarse a 5 x 1011 ufp/ml hasta 1 x 1012 ufp/ml. Por lo tanto, los 3 bacteriófagos SASPject modificados son capaces de completar varios ciclos de infección, multiplicación y lisis, a pesar de la presencia del gen de SASP tóxico.
Las cantidades de PTP387 obtenidas mediante dichos procesos de fabricación a escala de 1 l son adecuadas para un uso in vivo eficaz, como lo demuestra la utilización de dichas preparaciones en modelos de infección murina (Figura 15). Los niveles de PT387, PTP388 y PTP389 obtenidos mediante dichos procesos de fabricación a una escala de 15,5 l a 16 l son adecuados para un uso in vivo eficaz, como lo demuestra la utilización de dichas preparaciones, cuando se combinan como una mezcla (PT3.9), en modelos de infección murina (Figura 16).
En otra realización, un bacteriófago obligatoriamente lítico puede modificarse para crear un SASPject mediante la inserción de un gen de SASP bajo el control de un promotor constitutivo, y el gen de la fibra de la cola podría eliminarse por completo. Dicho bacteriófago debe propagarse en una cepa en la que se exprese en trans un gen de la fibra de la cola o un gen híbrido de la fibra de la cola. En dicho caso, la progenie de SASPject de dicha cepa llevaría una sola fibra de cola, derivada de la cepa de propagación, sin embargo, carecería en sus genomas de cualquier de la fibra de la cola o gen híbrido de la fibra de la cola. Se podrían construir varias de dichas cepas de propagación y la misma fibra de la cola eliminada de SASPject expresarse en cada una. De esta manera se podrían hacer varios derivados SASPject diferentes, cada uno con una fibra de la cola diferente o una proteína híbrida de la fibra de la cola. Estos SASPjects se podrían utilizar para formular una mezcla.
En otra realización, un bacteriófago obligatoriamente lítico genomanipulado para llevar un gen de SASP expresado a partir de un promotor constitutivo puede propagarse en una cepa hospedadora que lleve el gen o los genes para la proteína o las proteínas de la fibra de la cola híbrida en trans bajo el control de un promotor adecuado. Los promotores adecuados para el (los) gen(es) híbridos de la fibra de la cola pueden ser un promotor de bacteriófagos, particularmente el promotor que impulsa la expresión del gen de la fibra de la cola en el bacteriófago genomanipulado y obligatoriamente lítico. Otros promotores adecuados son promotores inducibles, tales como lac y trp, junto con sus proteínas reguladoras afines. La progenie de SASPject obtenida de dichas cepas es extrapotente, que llevan el (los) híbrido(s) de fibra de la cola expresados a partir de la cepa en trans así como los propios. Como alternativa, el gen de la fibra de la cola del bacteriófago obligatoriamente lítico puede eliminarse por completo, siempre que se utilice una cepa para la propagación en la que se expresen genes de la fibra de la cola o genes híbridos de la fibra de la cola en trans, permitiendo la formación de SASPjects derivados. En dicho caso, la progenie de SASPject de dicha cepa llevaría múltiples fibras de la cola, sin embargo, carecería en sus genomas de cualquier de la fibra de la cola o gen híbrido de la fibra de la cola.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición para inhibir o evitar el crecimiento de células bacterianas, que comprende un bacteriófago modificado o mezclas de los mismos como se define en el presente documento y un vehículo para el mismo. El bacteriófago modificado puede proporcionarse mezclado con al menos otro bacteriófago modificado que sea capaz de infectar bacterias diana, que incluye un gen de toxina tal como un gen de SASP que codifica una SASP que es tóxica para las bacterias diana. Entonces, al menos otro bacteriófago modificado puede o no expresar una pluralidad de HRD diferentes. Dichas composiciones pueden tener una amplia gama de usos y, por lo tanto, deben formularse de acuerdo con el uso pretendido. La composición puede formularse como un medicamento, especialmente para el tratamiento humano y puede tratar diversas afecciones, incluyendo infecciones bacterianas. Entre las infecciones tratables de acuerdo con la presente invención se encuentran las infecciones localizadas de tejidos y órganos, o infecciones multiorgánicas, incluyendo infecciones del torrente sanguíneo, infecciones tópicas, infecciones orales, incluyendo caries dentales, infecciones respiratorias e infecciones oculares. El vehículo puede ser un excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. La naturaleza exacta y las cantidades de los componentes de dichas composiciones pueden determinarse empíricamente y dependerán en parte de las vías de administración de la composición.
Las vías de administración a los receptores incluyen intravenosa, intrarterial, oral, bucal, sublingual, intranasal, mediante inhalación, tópica (incluyendo oftálmica), intramuscular, subcutánea, intravaginal, intratecal e intrarticular. Para mayor comodidad de uso, las dosis de acuerdo con la invención dependerán del sitio y del tipo de infección a tratar o evitar. Las infecciones respiratorias se pueden tratar mediante la administración por inhalación y las infecciones oculares se pueden tratar con gotas para los ojos. También se proporcionan productos de higiene bucal que contienen el bacteriófago modificado; se puede utilizar un enjuague bucal o pasta de dientes que contenga el bacteriófago modificado de acuerdo con la invención formulada para eliminar las bacterias asociadas con la formación de placa dental.
Un bacteriófago modificado, o una mezcla del mismo, de acuerdo con la invención se puede utilizar como descontaminante bacteriano, por ejemplo, en el tratamiento de la contaminación bacteriana de la superficie, así como en el saneamiento de tierras o el tratamiento del agua. El bacteriófago se puede utilizar en el tratamiento de personal médico y/o pacientes como agente descontaminante, por ejemplo, en un lavado de manos. También se proporciona tratamiento de superficies de trabajo y equipos, especialmente el utilizado en procedimientos hospitalarios o en la preparación de alimentos. Una realización particular comprende una composición formulada para uso tópico para evitar, eliminar o reducir el transporte de bacterias y la contaminación de un individuo a otro. Esto es importante para limitar la transmisión de infecciones microbianas, particularmente en un entorno hospitalario donde prevalecen las bacterias resistentes a antibióticos convencionales. Para dicho uso, el bacteriófago modificado puede estar contenido en solución salina tamponada con Tris o solución salina tamponada con fosfato o puede formularse dentro de un gel o crema. Para usos múltiples, se puede añadir un conservante. De manera alternativa, el producto puede liofilizarse y se pueden añadir excipientes, por ejemplo, un azúcar tal como sacarosa.
Descripción detallada de la invención
Esta invención se describirá ahora con más detalle, solo a modo de ejemplo, y con referencia a los dibujos adjuntos, en donde:
La figura 1 es un diagrama esquemático que muestra la construcción de un plásmido que contiene /acZAM15 La figura 2 es un diagrama esquemático que muestra la construcción de plásmidos con secciones de fibras de la cola reemplazadas;
La figura 3 es un diagrama esquemático que muestra la construcción de un bacteriófago con genes de la fibra de la cola híbridos, que pueden modificarse posteriormente para introducir SASP-C de acuerdo con la invención; La figura 4 es un diagrama esquemático que muestra la construcción de un bacteriófago con más genes de la fibra de cola híbridos, que pueden modificarse posteriormente para introducir SASP-C de acuerdo con la invención;
La figura 5 es un diagrama esquemático que muestra la construcción de un bacteriófago con genes de la fibra de la cola híbridos, en el que se ha eliminado el marcador /acZa;
La figura 6 es un diagrama esquemático que muestra la construcción de plásmidos en los que se introduce SASP-C en un sitio de inserción 033 adecuado;
La figura 7 es un diagrama esquemático que muestra la producción de bacteriófagos adicionales de acuerdo con la invención;
La figura 8 es un diagrama esquemático que muestra la construcción de plásmidos en los que se introduce el codón de SASP-C optimizado para su expresión en P. aeruginosa en un sitio de inserción 033 adecuado;
La figura 9 muestra la secuencia del gen de SASP-C de la cepa KM de Baci//us megaterium (ATCC 13632), cuyo codón se ha optimizado para su expresión en P. aeruginosa;
La figura 10 es un diagrama esquemático que muestra la producción de un bacteriófago en el que se introduce SASP-C, cuyo codón se ha optimizado para su expresión en P. aeruginosa en un sitio de inserción 033 adecuado;
La figura 11 es un diagrama esquemático que muestra la producción de bacteriófagos adicionales de acuerdo con la invención;
La figura 12 es un diagrama esquemático que muestra la producción de bacteriófagos adicionales de acuerdo con la invención;
La figura 13 es una alineación de secuencia múltiple CLUSTAL 2.1 de las proteínas de la fibra de la cola del bacteriófago SPM-1, F8, PB1, C36, LBL3, 033, LMA2, KPP12, JG024, PTP92, NH-4, 14-1, PTP47 y SN; y Figura 14. Curva de letalidad de 24 horas que muestra la eficacia in vitro de PT3.9 contra las cepas 3503 (A) y ATCC 27853 (B) de P. aeruginosa. Los cultivos se cultivaron en caldo Luria Bertani (LB) complementado con cloruro de calcio 10 mM, sulfato de magnesio 1 mM y glucosa al 1 %, a 37 °C.
Figura 15. Eficacia in vivo de PT3.9 en un modelo de infección por bacteriemia murina. Los ratones se trataron por vía intravenosa con vehículo (solución salina tamponada con tris que contenía sulfato de magnesio 1 mM, cloruro de calcio 10 mM y glicerol al 10% v/v), PTP284 o PTP387 (2 horas después de la infección con P. aeruginosa). Los recuentos de células viables en el tejido hepático a las 22 horas después del tratamiento se muestran para cada animal en cada grupo (tamaño del grupo = 6), la media geométrica para cada conjunto de datos está representada por una línea horizontal.
Figura 16. Eficacia in vivo de PT3.9 en un modelo de infección de neumonía murina neutropénica. Los ratones se trataron por vía i.t (intratraqueal) con vehículo placebo (solución salina tamponada con tris que contenía sulfato de magnesio 1 mM, cloruro de calcio 10 mM y glicerol al 10% v/v), PT3.9, PT3.8 o tobramicina (15 minutos después de la infección con P. aeruginosa). Los recuentos de células viables en el tejido pulmonar a las 24 horas después del tratamiento se muestran para cada animal en cada grupo (tamaño del grupo = 6), la media geométrica para cada conjunto de datos está representada por una línea horizontal.
El producto de la invención proporciona en un aspecto una única fibra de cola dentro de un bacteriófago individual, o una mezcla de bacteriófagos donde cada tipo de bacteriófago tiene una fibra de la cola única y diferente.
Este es un sumario de la modificación genética de un bacteriófago lítico de modo que lleva una de las posibles variantes de la fibra de la cola, además de SASP-C bajo el control de un promotor que normalmente controla la expresión del gen S2 de la proteína de la subunidad ribosómica 30S de Pseudomonas aeruginosa (rpsB), o el codón de SASP-C optimizado para su expresión en P. aeruginosa, bajo el control de un promotor que normalmente controla la expresión del gen de la fructosa-1,6-bisfosfato aldolasa de P. aeruginosa (fda).
Los genes se pueden eliminar y añadir al genoma del bacteriófago mediante recombinación homóloga. Hay varias formas en las que se pueden construir bacteriófagos que llevan genes y promotores extraños y el siguiente es un ejemplo de dichos métodos.
Para la construcción de un derivado de 033 se muestra cómo, utilizando un vector de amplia variedad de hospedadores de E. coli/P. aeruginosa, solo como un ejemplo, la fibra de la cola existente, o una sección de la fibra de la cola, en el genoma del bacteriófago puede ser reemplazada por una fibra de la cola o una sección de fibra de la cola alternativa de un bacteriófago diferente, mediante recombinación homóloga. También se muestra solo como ejemplo, cómo secuencias de ADN adicionales, tales como el gen de SASP-C de B. megaterium bajo el control de un promotor rpsB de P. aeruginosa, o el gen de SASP-C de B. megaterium, con codones optimizados para su expresión en P. aeruginosa, bajo el control de un promotor de P. aeruginosa fda, pueden añadirse al genoma del bacteriófago mediante recombinación homóloga.
Un gen de la fibra de la cola, o sección de un gen de la fibra de la cola, de un bacteriófago alternativo puede clonarse entre dos regiones de ADN 033 que flanquean la fibra de la cola natural, o una sección de la misma, junto con un marcador genético lacZa, en un vector de una amplia variedad de hospedadores de E. coli/P. aeruginosa. Este plásmido puede introducirse en P. aeruginosa, y la cepa resultante se infecta con 033. Después de la recogida de la progenie del bacteriófago, recombinantes dobles en los que la fibra de la cola 033 o la sección de fibra de la cola natural, ha sido reemplazada por la nueva fibra de cola o sección de fibra de cola y lacZa, pueden aislarse mediante la colocación sobre una cepa hospedadora de P. aeruginosa (lacZAM15+) adecuada utilizando medio que contiene un sustrato cromogénico que detecta la acción de la p-galactosidasa.
En una etapa posterior, el marcador lacZa puede eliminarse de los genomas del bacteriófago haciendo versiones de los plásmidos de recombinación de la región de la fibra de la cola descritos anteriormente que no contienen el marcador lacZa, introduciendo los nuevos plásmidos en cepas hospedadoras de P. aeruginosa adecuadas e infectando con los derivados bacteriófagos de 033 previamente modificados que llevan el gen de la fibra de la cola alternativo correspondiente, o una sección del mismo, junto con el marcador lacZa. Recombinantes que conservan la nueva fibra de la cola o sección de fibra de la cola, pero de donde se ha eliminado lacZa, pueden aislarse mediante la colocación sobre una cepa hospedadora de P. aeruginosa (lacZAM15+) adecuada utilizando medio que contiene un sustrato cromogénico que detecta la acción de la p-galactosidasa.
En una etapa posterior, se puede utilizar una recombinación homóloga similar para introducir el gen de SASP-C, bajo el control de un promotor rpsB de P. aeruginosa, al mismo tiempo que se añade un gen informador lacZa de E. coli para la identificación de bacteriófagos recombinantes, en 033, o cualquiera de los derivados de 033 previamente descritos, o bacteriófagos similares o derivados similares. Una región que consiste en SASP-C controlada por el promotor rpsB, y el alelo lacZa de E. coli, puede clonarse entre dos regiones de 033 que flanquean un sitio de inserción adecuado, tal como la región intergénica ubicada inmediatamente cadena abajo del operón de la fibra de la cola 033, en un vector de una amplia variedad de hospedadores de E. coli/P. aeruginosa. Este plásmido se puede transferir a una cepa de P. aeruginosa (lacZAM15+), y la cepa resultante se infecta por 033 o el derivado de 033 previamente construido (a partir del cual se ha eliminado el marcador lacZa). Se pueden recoger los bacteriófagos de la progenie e identificar los recombinantes dobles mediante la colocación en placas en P. aeruginosa (lacZAM15+), buscando adquisición del nuevo informador lacZa en medio que contiene un sustrato cromogénico que detecta la acción de la p-galactosidasa.
En una etapa posterior alternativa, se puede utilizar una recombinación homóloga similar para introducir el gen de SASP-C que se ha optimizado en codones para su expresión en P. aeruginosa, bajo el control de un promotor fda de P. aeruginosa, al mismo tiempo que se añade un gen informador lacZa de E. coli para la identificación de bacteriófagos recombinantes, en 033, o cualquiera de los derivados de 033 previamente descritos, o bacteriófagos similares o derivados similares. Una región que consiste en codones de SASP-C optimizados controlada por el promotor fda, y el alelo lacZa de E. coli, puede clonarse entre dos regiones de 033 que flanquean un sitio de inserción adecuado, tal como la región intergénica ubicada inmediatamente cadena abajo del operón de la fibra de la cola 033, en un vector de una amplia variedad de hospedadores de E. coli/P. aeruginosa. Este plásmido se puede transferir a una cepa de P. aeruginosa (lacZAM15+), y la cepa resultante se infecta por 033 o el derivado de 033 previamente construido (a partir del cual se ha eliminado el marcador lacZa). Se pueden recoger los bacteriófagos de la progenie e identificar los recombinantes dobles mediante la colocación en placas en P. aeruginosa (lacZAMl5+), buscando adquisición del nuevo informador lacZa en medio que contiene un sustrato cromogénico que detecta la acción de la p-galactosidasa.
Dado que estos bacteriófagos que se van a modificar son líticos (en lugar de moderados), otro requisito para estas etapas descritas de construcción de bacteriófagos es la construcción de una cepa hospedadora adecuada de P. aeruginosa que lleva el gen lacZAM15 de E. coli en una ubicación adecuada en el genoma bacteriano, para complementar el fenotipo lacZa del bacteriófago recombinante deseado. Como ejemplo, la construcción de estas cepas de P. aeruginosa se puede lograr mediante recombinación homóloga utilizando un vector de E. coli que no es capaz de replicarse en P. aeruginosa. La ubicación genómica para la inserción del transgen lacZAM15 debe elegirse de manera que no afecte a ningún gen esencial y no se generen fenotipos no deseados a través de efectos contrarios sobre la expresión de genes adyacentes. Como ejemplo, uno de dichas ubicaciones puede estar inmediatamente cadena abajo del homólogo de phoA de la cepa PAO1 de P. aeruginosa.
El alelo lncZAM15 de E. coli puede clonarse en un vector de E. coli que no es capaz de replicarse en P. aeruginosa, entre dos regiones del ADN genómico de la cepa PAO1 de P. aeruginosa que flanquean el extremo 3' de phoA. Este plásmido puede introducirse en P. aeruginosa y los aislados que han sufrido una única recombinación homóloga para integrar el plásmido completo en el genoma se seleccionan de acuerdo con la adquisición de resistencia a tetraciclina (50 |jg/ml). Los aislados (lacZAM15+) que han sufrido un segundo evento de recombinación homóloga pueden, a continuación, aislarse en un medio que contenga sacarosa al 10% (utilizando el marcador contraseleccionable sacB presente en la cadena principal del plásmido).
En una etapa posterior, se puede utilizar una recombinación homóloga similar para eliminar el marcador lacZa de los derivados de 033 (lacZa+) previamente descritos que se han modificado para introducir el gen de SASP-C, bajo el control de un promotor rpsB de P. aeruginosa. Una región que consiste en SASP-C controlada por el promotor rpsB, puede clonarse entre dos regiones de 033 que flanquean el sitio de inserción elegido, en un vector de una amplia variedad de hospedadores de E. coli/P. aeruginosa. Este plásmido se puede transferir a una cepa de P. aeruginosa (lacZAM15+) adecuada, y la cepa resultante se puede infectar por los derivados de 033 (lacZa+) descritos anteriormente que se han modificado para introducir el gen de SASP-C, bajo el control de un promotor rpsB de P. aeruginosa. Se pueden recoger los bacteriófagos de la progenie e identificar los recombinantes dobles mediante la colocación en placas en P. aeruginosa (lacZAM15+), buscando la pérdida del informador lacZa en un medio que contiene un sustrato cromogénico que detecta la acción de la p-galactosidasa.
En una etapa posterior alternativa, se puede utilizar una recombinación homóloga similar para eliminar el marcador lacZa de los derivados de 033 (lacZa+) previamente descritos que se han modificado para introducir el gen de SASP-C, con codones optimizados para su expresión en P. aeruginosa, bajo el control de un promotor fda de P. aeruginosa. Una región que consiste en SASP-C, con codones optimizados para su expresión en P. aeruginosa, controlada por el promotor fda, puede clonarse entre dos regiones de 033 que flanquean el sitio de inserción elegido, en un vector de una amplia variedad de hospedadores de E. coli/P. aeruginosa. Este plásmido se puede transferir a una cepa de P. aeruginosa (lacZAM15+) adecuada, y la cepa resultante se puede infectar por los derivados de 033 (lacZa+) descritos anteriormente que se han modificado para introducir el gen de SASP-C, con codones optimizados para su expresión en P. aeruginosa, bajo el control de un promotor fda de P. aeruginosa. Se pueden recoger los bacteriófagos de la progenie e identificar los recombinantes dobles mediante la colocación en placas en P. aeruginosa (lacZAM15+), buscando la pérdida del informador lacZa en un medio que contiene un sustrato cromogénico que detecta la acción de la p-galactosidasa.
Procedimientos experimentales
Las reacciones de PCR para generar ADN con fines de clonación se pueden llevar a cabo utilizando la ADN polimerasa de fusión Herculasa II (Agilent Technologies), dependiendo de las temperaturas de fusión (Tm) de los cebadores, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones de PCR con fines de selección se pueden llevar a cabo utilizando la ADN polimerasa Taq (NEB), dependiendo de la Tm de los cebadores, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A menos que se indique de otro modo, las técnicas generales de biología molecular, tales como la digestión con enzimas de restricción, la electroforesis en gel de agarosa, las uniones dependientes de ADN ligasa T4 y la preparación y transformación celular competente pueden basarse en los métodos descritos en Sambrook et al., (1989). Las enzimas se pueden adquirir en New England Biolabs o Thermo Scientific. El ADN puede purificarse a partir de reacciones enzimáticas y prepararse a partir de células utilizando los kits de purificación de ADN de Qiagen. Los plásmidos se pueden transferir de cepas de E. coli a cepas de P. aeruginosa mediante conjugación, mediada por la cepa auxiliar de conjugación de E. coli HB101 (pRK2013). Un sustrato cromogénico para la p-galactosidasa, S-gal, que tras la digestión mediante p-galactosidasa forma un precipitado negro cuando se quela con hierro férrico, puede adquirirse en Sigma (S9811).
Los cebadores se pueden obtener de Sigma Life Science. Cuando los cebadores incluyen secuencias de reconocimiento para enzimas de restricción, pueden añadirse de 2 a 6 nucleótidos adicionales en el extremo 5' para asegurar la digestión del ADN amplificado por PCR.
Todas las clonaciones, a menos que se indique de otro modo, se pueden lograr mediante la unión de los ADN durante la noche con la ADN ligasa T4 y, a continuación, mediante su transformación en cepas de clonación de E. coli, tal como DH5a o TOP10, con aislamiento en medio selectivo, como se describe en otra parte (Sambrook et al., 1989).
Un vector de amplia variedad de hospedadores de E. coli/P. aeruginosa, tal como pSM 1080A, se puede utilizar para transferir genes entre E. coli y P. aeruginosa. El pSM1080A se produjo previamente mediante la combinación del origen de replicación de una amplia variedad de hospedadores de un plásmido de P. aeruginosa, oriT de pRK2, el marcador seleccionable tetAR para utilizar tanto en E. coli como en P. aeruginosa, del plásmido pRK415, y el origen de la replicación de E. coli de elevado número de copias, oriV, del plásmido pUC19.
Un vector de E. coli que no es capaz de replicarse en P. aeruginosa, pSM1104, se puede utilizar para generar mutantes de P. aeruginosa mediante intercambio alélico. pSM1104 se produjo previamente mediante la combinación de oriT de pRK2, el marcador seleccionable tetAR para utilizar tanto en E. coli como en P. aeruginosa, del plásmido pRK415, el origen de la replicación de E. coli de elevado número de copias, oriV, del plásmido pUC19, y el gen sacB de la cepa 168 de Bacillus subtilis, bajo el control de un promotor fuerte, para utilizar como marcador contraseleccionable.
Detección de bacteriófagos similares a 033 (familia de bacteriófagos similares a PB1) conservados en regiones amino terminales de la fibra de la cola mediante PCR
1. Los cebadores para la detección de genes de la fibra de la cola de bacteriófagos similares a 033 en muestras de bacteriófagos experimentales pueden genomanipularse de la siguiente manera:
Las secuencias de ADN de los genes de la fibra de la cola de todos los bacteriófagos similares a 033 secuenciados (incluyendo 033, PB1, NH-4, 14-1, LMA2, KPP12, JG024, F8, SPM-1, LBL3, PTP47, C36, PTP92 y SN) pueden alinearse usando Clustal Omega, que está disponible en el sitio web de EBI, y el mapeo de la región altamente conservada de aproximadamente 2 kb de largo para la secuencia en 5' del gen puede entonces identificarse (posiciones 31680 a 33557 en la secuencia del genoma PB1, Acc. EU716414). Las secciones del 100% de identidad entre las 11 secuencias de genes de la fibra de la cola pueden identificarse mediante inspección visual. Se pueden elegir tres pares de cebadores de PCR que se dirigen a regiones seleccionadas absolutamente conservadas y que amplifican productos de PCR de no más de 1 kb de la siguiente manera: par B4500 y B4501, que define una región de 193 pb de longitud; par B4502 y B4503, que define una región de 774 pb de longitud; y par B4504 y B4505, que define una región de 365 pb de longitud.
El cebador B4500 consiste en la secuencia del genoma del bacteriófago PB1 (Acc. EU716414) que va de la posición 31680 a la 31697.
El cebador B4501 consiste en la secuencia del genoma del bacteriófago PB1 (Acc. EU716414) que va de la posición 31851 a la 31872.
El cebador B4502 consiste en la secuencia del genoma del bacteriófago PB1 (Acc. EU716414) que va de la posición 31785 a la 31804.
El cebador B4503 consiste en la secuencia del genoma del bacteriófago PB1 (Acc. EU716414) que va de la posición 32541 a la 32558.
El cebador B4504 consiste en la secuencia del genoma del bacteriófago PB1 (Acc. EU716414) que va de la posición 32868 a la 32888.
El cebador B4505 consiste en la secuencia del genoma del bacteriófago PB1 (Acc. EU716414) que va de la posición 33213 a la 33232.
B4500 (SEQ ID NO: 1)
5'-GTGATCACACCCGAACTG-3'
B4501 (SEQ ID NO:2)
5'-CGATGAAGAAGAGTTGGTTTTG-3'
B4502 (SEQ ID NO: 3)
5'-ACGCCGGACTACGAAATCAG-3'
B4503 (SEQ ID NO: 4)
5'-TCCGGAGACGTTGATGGT-3'
B4504 (SEQ ID NO: 5)
5'-CCTTTCATCGATTTCCACTTC-3'
B4505 (SEQ ID NO: 6)
5'-TTCGTGGACGCCCAGTCCCA-3'
2. Los genes de la fibra de la cola similares a 033 se pueden detectar en muestras de bacteriófagos experimentales de la siguiente manera:
Las placas de bacteriófagos aislados de origen ambiental se pueden recoger de las placas de agar y se pueden añadir al agua e incubar durante 30 minutos, haciendo que la placa se empape. Los empapados de placa se pueden diluir y añadir una porción a las reacciones de pCr que contienen uno o todos los pares de cebadores anteriores, y la PCR se puede realizar de acuerdo con un protocolo estándar. Los productos de PCR se pueden visualizar en un gel de agarosa al 1,5 % con tinción con bromuro de etidio y se puede evaluar su tamaño. Los productos de PCR del tamaño correcto para el par de cebadores utilizados pueden extraerse en gel y enviarse a una instalación externa para su secuenciación. Los resultados de la secuenciación se pueden comparar con las secuencias de genes de la fibra de la cola disponibles para confirmar la identidad del producto de pCr .
Construcción de plásmidos para generar cepas de Pseudomonas aeruginosa que llevan el gen /acZAM15 de Escherichia co/i, inmediatamente cadena abajo del locus PhoA del genoma bacteriano
1. El plásmido pSMX200 (Figura 1), que comprende pSM1104 que lleva ADN que flanquea el extremo 3' del homólogo de PhoA de PAO1 de P. aeruginosa, puede construirse de la siguiente manera.
Una región que comprende el extremo de aproximadamente 1 kb del gen PhoA de P. aeruginosa puede amplificarse mediante PCR utilizando los cebadores B4200 y B4201 (Figura 1). A continuación, el producto de PCR se puede limpiar y digerir con Spel y BgllI. Una segunda región que comprende aproximadamente 1 kb cadena abajo del gen PhoA de P. aeruginosa, incluyendo el extremo 3' del marco de lectura abierto PA3297, puede amplificarse mediante PCR utilizando los cebadores B4202 y B4203 (Figura 1). A continuación, este segundo producto de PCR se puede limpiar y digerir con BgllI y Xhol. Los dos digeridos pueden limpiarse nuevamente y unirse a pSM1104 que se ha digerido con Spel y Xhol, en una unión de 3 vías, para producir el plásmido pSMx200 (Figura 1).
El cebador B4200 consiste en un sitio de restricción SpeI en 5', seguido de la secuencia ubicada aproximadamente 1 kb cadena arriba del codón de parada de PhoA de la cepa PAO1 de P. aeruginosa (Figura 1). El cebador B4201 consiste en sitios de restricción BgllI y Aflll en 5', seguido de una secuencia complementaria al final del gen PhoA de la cepa PAO1 de P. aeruginosa (el codón de parada está en minúsculas; Figura 1). El cebador B4202 consiste en sitios de restricción BgllI y Nhel en 5', seguido de una secuencia inmediatamente cadena abajo del codón de parada del gen PhoA de la cepa PAO1 de P. aeruginosa (Figura 1). El cebador B4203 consiste en un sitio de restricción Xhol en 5', seguido de una secuencia dentro del marco de lectura abierto PA3297, aproximadamente 1 kb cadena abajo del gen PhoA gen de la cepa PAO1 de P. aeruginosa (Figura 1).
Cebador B4200 (SEQ ID NO:7)
5'-gataACTAGTCCTGGTCCACCGGGGTCAAG-3'
Cebador B4201 (SEQ ID NO: 8)
5' -gctcagatcttccttaagtcaGTCGCGCAGGTTCAG-3'
Cebador B4202 (SEQ ID NO: 9)
5'-aggaagatctgagctagcTCGGACCAGAACGAAAAAG-3'
Cebador B4203 (SEQ ID NO: 10)
5' -gataCTCGAGGCGGATGAACATTGAGGTG-3'
2. El plásmido pSMX203 (Figura 1), que comprende pSMX200 que lleva /acZAM15 bajo el control de un promotor /ac, puede construirse de la siguiente manera.
El gen /acZAM15 bajo el control de un promotor /ac puede amplificarse mediante PCR a partir de la cepa DH10B de Escherichia co/i utilizando los cebadores B4208 y B4209 (Figura 1). El producto de PCR resultante puede digerirse a continuación con BgllI y Nhel, y ligarse a pSMX200 que también se ha digerido con BgllI y Nhel, para producir el plásmido pSMX203 (Figura 1).
El cebador B4208 consiste en un sitio de restricción BgllI en 5', seguido de la secuencia del promotor /ac (Figura 1). El cebador B4209 consiste en un sitio de restricción Nhel en 5', seguido de un finalizador transcripcional bidireccional y una secuencia complementaria al extremo 3' de /acZAM15 (Figura 1).
Cebador B4208 (SEQ ID NO: 11)
5'-gataagatctgagcgcaacgcaattaatgtg-3'
Cebador B4209 (SEQ ID NO: 12)
5'-gatagctagcAGTCAAAAGCCTCCGGTCGGAGGCTTTTGACTTTATT TTTGACACCAGACCAAC-3' Modificación genética de Pseudomonas aeruginosa para introducir el gen /acZAM15 de Escherichia coli inmediatamente cadena abajo del locus PhoA del genoma bacteriano
1. El plásmido pSMX203 (Figura 1) puede transferirse a P. aeruginosa mediante conjugación, seleccionando recombinantes primarios mediante la adquisición de resistencia a tetraciclina (50 pg/ml).
2. A continuación, se pueden seleccionar recombinantes dobles mediante contraselección mediada por sacB, mediante la colocación en placas sobre un medio que contiene sacarosa al 10 %.
3. Los aislados que crecen en sacarosa al 10% se pueden seleccionar a continuación mediante PCR para confirmar que /acZAM15 se ha introducido cadena abajo del gen phoA de P. aeruginosa.
4. Tras la verificación de un aislado (PAX21), esta cepa se puede utilizar a continuación como hospedador para una modificación adicional del bacteriófago, donde se requiere la complementación de un informador /acZa. Construcción de un plásmido para reemplazar la sección 3' de la fibra de la cola 033 con la de PTP92, utilizando un proceso de selección de /acZa
1. El pSMX284 (Figura 2), que comprende pSM1080A que lleva la región inmediatamente cadena abajo del gen de la fibra de la cola 033, puede construirse de la siguiente manera.
Una región de 1 kb de la secuencia 033 que cubre las 20 bases terminales de la fibra de la cola 033 y la región cadena abajo adyacente, puede amplificarse mediante PCR utilizando los cebadores B4222 y B4249 (Figura 2). El producto de PCR resultante puede, a continuación, limpiarse y digerirse con Nhel y ligarse a pSM1080A que también se ha digerido con Nhel y después tratarse con fosfatasa alcalina antes de la unión, produciendo el plásmido pSMX284 (Figura 2).
El cebador B4222 consiste en un sitio de restricción NheI en 5', seguido de la secuencia de 033, aproximadamente 1 kb cadena abajo del extremo del gen de la fibra de la cola 033 (Figura 2). B4249 consiste en sitios de restricción Nhel-Kpnl-Avrll en 5', seguido de la secuencia complementaria al extremo 3' de la fibra de la cola 033 y la secuencia inmediatamente cadena abajo del marco de lectura abierto de la fibra de la cola (Figura 2).
B4222 (SEQ ID NO: 13)
5'-gataGCTAGCATGGTTTTCACGACCATG-3'
B4249 (SEQ ID NO: 14)
5'-GATAGCTAGCGAGGTACCGACCTAGGTTTTCCAGCGAGTGACGTAA AATG-3'
2. El pSMX285 (Figura 2), que comprende pSMX284 que lleva /acZa, una sección en 3' de la secuencia del gen de la fibra de la cola PTP92, y una región de la secuencia de 033 que comprende el extremo 5' del gen de la fibra de la cola y la secuencia ubicada inmediatamente cadena arriba del gen de la fibra de la cola 033, puede construirse de la siguiente manera.
El marco de lectura abierto /acZa puede amplificarse mediante PCR a partir de pUC19 utilizando los cebadores B4250 y B4252 (Figura 2). La sección en 3' de la fibra de la cola PTP92 puede amplificarse mediante PCR a partir de PTP92 utilizando los cebadores B4251 y B4254 (Figura 2). El marco de lectura abierto /acZa se puede unir a continuación a la sección en 3' del gen de la fibra de la cola PTP92 mediante PCR SOEing utilizando los cebadores externos B4250 y B4254. Una región que comprende la secuencia del extremo 5' del gen de la fibra de la cola 033 y la secuencia ubicada inmediatamente cadena arriba del gen de la fibra de la cola 033, puede amplificarse mediante PCR utilizando los cebadores B4253 y B4229 (Figura 2). Este producto de PCR puede unirse después al producto de PCR que comprende /acZa y la sección en 3' del gen de la fibra de la cola PTP92, mediante PCR SOEing utilizando los cebadores externos B4250 y B4229. El producto de PCR resultante puede, a continuación, limpiarse y digerirse con Avrll y Kpnl y ligarse a pSMX284 que también se ha digerido con Avrll y Kpnl, produciendo el plásmido pSMX285 (Figura 2).
El cebador B4250 consiste en un sitio de restricción Avrll en 5', seguido de una secuencia complementaria al extremo 3' del marco de lectura abierto de /acZa (Figura 2). El cebador B4252 consiste en una sección en 5' de la secuencia que se superpone al extremo 3' del gen de la fibra de la cola PTP92, seguido de la secuencia del extremo 5' del marco de lectura abierto de /acZa. El cebador B4251 es el complemento inverso del cebador B4252 (Figura 2). El cebador B4254 consiste en una secuencia en 5' del interior del gen de la fibra de la cola 033, seguido de la secuencia dentro del extremo 3' del gen de la fibra de la cola PTP92 (Figura 2). El cebador B4253 es el complemento inverso del cebador B4254. El cebador B4229 consiste en un sitio de restricción KpnI en 5', seguido de una secuencia que es complementaria a una región aproximadamente 1 kb cadena arriba del gen de la fibra de la cola 033 (Figura 2).
Cebador B4250 (SEQ ID NO: 15)
5' -GataCCTAGGttagcgccattcgccattc-3'
Cebador B4252 (SEQ ID NO: 16)
5'-CTATTCCAGCGGGTAACGTAAAatgaccatgattacggattC-3'
Cebador B4251 (SEQ ID NO: 17)
5'-GaatccgtaatcatggtcatTTTACGTTACCCGCTGGAATAG-3'
Cebador B4254 (SEQ ID NO: 18)
5' -CAAGCGGGCCGGCTGGTCTCTCGGCAATAACTCCTATGTGATC-3'
Cebador B4253 (SEQ ID NO: 19)
5'-GATCACATAGGAGTTATTGCCGAGAGACCAGCCGGCCCGCTTG-3'
Cebador B4229 (SEQ ID NO: 20)
5' -gataGGTACCGCGACCGGTCTGTACTTC-3'
Modificación genética de 033 para reemplazar la sección 3' del gen de la fibra de la cola con la de PTP92
1. El plásmido pSMX285 (Figura 2; Figura 3) se puede introducir en la cepa PAX21 de P. aeruginosa mediante conjugación, seleccionando transconjugantes sobre la base de la resistencia a la tetraciclina (50 |jg/ml), produciendo la cepa PTA80.
2. La cepa PTA80 se puede infectar con el bacteriófago 033 y se puede recoger la progenie del bacteriófago. 3. El fago recombinante en el que el extremo 3' del gen de la fibra de la cola 033 se ha reemplazado por el de PTP92, y al que se ha añadido lacZa, puede identificarse mediante la colocación en placas del lisado de la etapa (2) en la cepa PAX21 de P. aeruginosa, en medio que contiene S-gal, buscando placas negras, que son indicativas de la actividad de la p-galactosidasa.
4. Puede llevarse a cabo una PCR para comprobar que el gen de la fibra de la cola se ha reemplazado y que lacZa está presente.
5. Tras la identificación de un aislado verificado (PTPX81; Figura 3), este aislado se puede purificar en placa dos veces más en la cepa PAX21 de P. aeruginosa, antes de su utilización posterior.
Construcción de un plásmido para reemplazar la sección 3' de la fibra de la cola 033 con la de PTP47, utilizando un proceso de selección de lacZa
1. El pSMX286 (Figura 2), que comprende pSMX284 que lleva lacZa, una sección en 3' de la secuencia del gen de la fibra de la cola PTP47, y una región de la secuencia de 033 que comprende el extremo 5' del gen de la fibra de la cola y la secuencia ubicada inmediatamente cadena arriba del gen de la fibra de la cola 033, puede construirse de la siguiente manera.
El marco de lectura abierto lacZa puede amplificarse mediante PCR a partir de pUC19 utilizando los cebadores B4250 y B4258 (Figura 2).
La sección en 3' de la fibra de la cola PTP47 puede amplificarse mediante PCR a partir de PTP47 utilizando los cebadores B4259 y B4260 (Figura 2).
El marco de lectura abierto lacZa se puede unir a continuación a la sección en 3' del gen de la fibra de la cola PTP47 mediante PCR SOEing utilizando los cebadores externos B4250 y B4260. Una región que comprende la secuencia del extremo 5' del gen de la fibra de la cola 033 y la secuencia ubicada inmediatamente cadena arriba del gen de la fibra de la cola 033, puede amplificarse mediante PCR utilizando los cebadores B4261 y B4229 (Figura 2). Este producto de PCR puede unirse después al producto de PCR que comprende lacZa y la sección en 3' del gen de la fibra de la cola PTP47, mediante PCR SOEing utilizando los cebadores externos B4250 y B4229. El producto de PCR resultante puede, a continuación, limpiarse y digerirse con AvrII y KpnI y ligarse a pSMX284 que también se ha digerido con AvrII y KpnI, produciendo el plásmido pSMX286 (Figura 2).
El cebador B4250 consiste en un sitio de restricción AvrII en 5', seguido de una secuencia complementaria al extremo 3' del marco de lectura abierto de lacZa (Figura 2). El cebador B4258 consiste en una sección en 5' de la secuencia que se superpone al extremo 3' del gen de la fibra de la cola PTP47, seguido de la secuencia del extremo 5' del marco de lectura abierto de lacZa. El cebador B4259 es el complemento inverso del cebador B4258 (Figura 2). El cebador B4260 consiste en una secuencia en 5' del interior del gen de la fibra de la cola 033, seguido de la secuencia dentro del extremo 3' del gen de la fibra de la cola PTP47 (Figura 2). El cebador B4261 es el complemento inverso del cebador B4260. El cebador B4229 consiste en un sitio de restricción KpnI en 5', seguido de una secuencia que es complementaria a una región aproximadamente 1 kb cadena arriba del gen de la fibra de la cola 033 (Figura 2).
Cebador B4250 (SEQ ID NO: 15)
5'-GataCCTAGGttagcgccattcgccattc-3'
Cebador B4258 (SEQ ID NO: 21)
5'-CTTTTCCAGCGAGTGACGTAAAatgaccatgattacggattC-3'
Cebador B4259 (SEQ ID NO: 22)
5'-gaatccgtaatcatggtcatTTTACGTCACTCGCTGGAAAAG-3'
Cebador B4260 (SEQ ID NO: 23)
5'-CAAGCGGGCCGGCTGGTCTCTCGGCAATAACTCCTATGTGATC-3'
Cebador B4261 (SEQ ID NO: 24)
5'-GATCACATAGGAGTTATTGCCGAGAGACCAGCCGGCCCGCTTG-3'
Cebador B4229 (SEQ ID NO: 20)
5' -gataGGTACCGCGACCGGTCTGTACTTC-3'
Modificación genética de 033 para reemplazar la sección 3' del gen de la fibra de la cola con la de PTP47
1. El plásmido pSMX286 (Figura 2; Figura 4) se puede introducir en la cepa PAX21 de P. aeruginosa mediante conjugación, seleccionando transconjugantes sobre la base de la resistencia a la tetraciclina (50 |jg/ml), produciendo la cepa PTA81.
2. La cepa PTA81 se puede infectar con el bacteriófago 033 y se puede recoger la progenie del bacteriófago. 3. El fago recombinante en el que el extremo 3' del gen de la fibra de la cola 033 se ha reemplazado por el de PTP47, y al que se ha añadido lacZa, puede identificarse mediante la colocación en placas del lisado de la etapa (2) en la cepa PAX21 de P. aeruginosa, en medio que contiene S-gal, buscando placas negras, que son indicativas de la actividad de la p-galactosidasa.
4. Puede llevarse a cabo una PCR para comprobar que el gen de la fibra de la cola se ha reemplazado y que lacZa está presente.
5. Tras la identificación de un aislado verificado (PTPX82; Figura 4), este aislado se puede purificar en placa dos veces más en la cepa PAX21 de P. aeruginosa, antes de su utilización posterior.
Construcción de un plásmido para eliminar el marcador lacZa de PTPX81
1. El pSMX287 (Figura 5), que comprende pSM1080A que lleva una sección en 3' del gen de la fibra de la cola PTP92 y una región de la secuencia 033 ubicada inmediatamente cadena abajo del gen de la fibra de la cola 033, puede construirse de la siguiente manera.
La región de la secuencia de 033 ubicada inmediatamente cadena abajo de la fibra de la cola 033 puede amplificarse mediante PCR utilizando los cebadores B4222 y B4255 (Figura 5). El extremo 3' del gen de la fibra de la cola PTP92 puede amplificarse mediante PCR utilizando los cebadores B4256 y B4257 (Figura 5). Estos dos productos de PCR se pueden unir a continuación mediante PCR SOEing, utilizando los dos cebadores externos B4222 y B4257. A continuación, se puede limpiar el producto de PCR resultante, diferir con NheI, limpiar nuevamente y unir a pSM1080A que también se ha digerido con NheI y, después, tratar con fosfatasa alcalina antes de la unión, para producir el plásmido pSMX287 (Figura 5).
El cebador B4255 consiste en una sección en 5' del extremo del gen de la fibra de la cola PTP92, seguido de la secuencia inmediatamente cadena abajo del gen de la fibra de la cola 033 (Figura 5). El cebador B4256 es el complemento inverso del cebador B4255 (Figura 5). El cebador B4257 consiste en un sitio de restricción NheI en 5', seguido de la secuencia de 1 kb terminal del gen de la fibra de la cola PTP92 (Figura 5).
Cebador B4255 (SEQ ID NO: 25) 5'-CTATTCCAGCGGGTAACGTAAAATGAAATGGACGCGGATCAG-3' Cebador B4256 (SEQ ID NO: 26) 5'-CTGATCCGCGTCCATTTCATTTTACGTTACCCGCTGGAATAG-3' Cebador B4257 (SEQ ID NO: 27) 5'-gataGCTAGCGGCAATAACTCCTATGTGATC-3'
Modificación genética de PTPX81 para eliminar el marcador lacZa
1. El plásmido pSMX287 (Figura 5; Figura 3) se puede introducir en la cepa PAX21 de P. aeruginosa mediante conjugación, seleccionando transconjugantes sobre la base de la resistencia a la tetraciclina (50 |jg/ml), produciendo la cepa PTA82.
2. La cepa PTA82 se puede infectar con el bacteriófago PTPX81 y se puede recoger el bacteriófago de la progenie.
3. El fago recombinante en el que se ha eliminado el marcador lacZa se puede identificar mediante la colocación en placas del lisado de la etapa (2) en la cepa PAX21 de P. aeruginosa, en medio que contiene S-gal, buscando placas blancas, que son indicativas de la pérdida de actividad de p-galactosidasa.
4. Puede llevarse a cabo una PCR para comprobar que se ha retenido el gen de la fibra de la cola y que ha sido eliminado lacZa.
5. Tras la identificación de un aislado verificado (PTPX83; Figura 3), este aislado se puede purificar en placa dos veces más en la cepa PAX21 de P. aeruginosa, antes de su utilización posterior.
Construcción de un plásmido para eliminar el marcador lacZa de PTPX82
1. El pSMX288 (Figura 5), que comprende pSM1080A que lleva una sección en 3' del gen de la fibra de la cola PTP47 y una región de la secuencia 033 ubicada inmediatamente cadena abajo del gen de la fibra de la cola 033, puede construirse de la siguiente manera.
La región de la secuencia de 033 ubicada inmediatamente cadena abajo de la fibra de la cola 033 puede amplificarse mediante PCR utilizando los cebadores B4222 y B4262 (Figura 5). El extremo 3' del gen de la fibra de la cola PTP47 puede amplificarse mediante PCR utilizando los cebadores B4263 y B4264 (Figura 5). Estos dos productos de PCR se pueden unir a continuación mediante PCR SOEing, utilizando los dos cebadores externos B4222 y B4264. A continuación, se puede limpiar el producto de PCR resultante, diferir con Nhel, limpiar nuevamente y unir a pSM1080A que también se ha digerido con Nhel y, después, tratar con fosfatasa alcalina antes de la unión, para producir el plásmido pSMX288 (Figura 5).
El cebador B4262 consiste en una sección en 5' del extremo del gen de la fibra de la cola PTP47, seguido de la secuencia inmediatamente cadena abajo del gen de la fibra de la cola 033 (Figura 5). El cebador B4263 es el complemento inverso del cebador B4262 (Figura 5). El cebador B4264 consiste en un sitio de restricción NheI en 5', seguido de la secuencia de 1 kb terminal del gen de la fibra de la cola PTP47 (Figura 5).
Cebador B4262 (SEQ ID NO: 28) 5'-CTTTTCCAGCGAGTGACGTAAAATGAAATGGACGCGGATCAG-3' Cebador B4263 (SEQ ID NO: 29) 5'-CTGATCCGCGTCCATTTCATTTTACGTCACTCGCTGGAAAAG -3' Cebador B4264 (SEQ ID NO: 30) 5'-gataGCTAGCGGCAATAACTCCTATGTGATC-3'
Modificación genética de PTPX82 para eliminar el marcador lacZa
1. El plásmido pSMX288 (Figura 5; Figura 4) se puede introducir en la cepa PAX21 de P. aeruginosa mediante conjugación, seleccionando transconjugantes sobre la base de la resistencia a la tetraciclina (50 jg/ml), produciendo la cepa PTA83.
2. La cepa PTA83 se puede infectar con el bacteriófago PTPX82 y se puede recoger el bacteriófago de la progenie.
3. El fago recombinante en el que se ha eliminado el marcador lacZa se puede identificar mediante la colocación en placas del lisado de la etapa (2) en la cepa PAX21 de P. aeruginosa, en medio que contiene S-gal, buscando placas blancas, que son indicativas de la pérdida de actividad de S-galactosidasa.
4. Puede llevarse a cabo una PCR para comprobar que se ha retenido el gen de la fibra de la cola y que ha sido eliminado lacZa.
5. Tras la identificación de un aislado verificado (PTPX84; Figura 4), este aislado se puede purificar en placa dos veces más en la cepa PAX21 de P. aeruginosa, antes de su utilización posterior.
Construcción de un plásmido para introducir rpsB-SASP-C y lacZa en el genoma del bacteriófago de 033, PTPX83, PTPX84 y bacteriófago similar
1. El plásmido pSMX251 (Figura 6), que comprende pSM1080A que contiene regiones de 033 que flanquean el sitio de inserción elegido para rpsB-SASP-C, tal como la región intergénica inmediatamente cadena abajo del operón de la fibra de la cola, puede construirse de la siguiente manera.
La región de la secuencia de 033 inmediatamente cadena abajo del sitio de inserción elegido puede amplificarse mediante PCR utilizando los cebadores B4900 y B4901 (Figura 6). A continuación, este producto de PCR se puede limpiar y digerir con Nhel y AvrlI. La región de la secuencia de 033 inmediatamente cadena arriba del sitio de inserción elegido puede amplificarse mediante PCR usando los cebadores B4902 y B4903 (Figura 6). A continuación, este segundo producto de PCR se puede limpiar y digerir con AvrII y NheI. Después, los dos productos de digestión de PCR pueden limpiarse de nuevo y ligarse a pSM1080A que se ha digerido con NheI y tratado con fosfatasa alcalina antes de la unión. Los clones que llevan un inserto de cada uno de los dos productos de PCR pueden identificarse mediante PCR utilizando los cebadores B4900 y B4903, y el análisis de digestión de restricción con NheI de los supuestos clones purificados, para identificar el plásmido pSMX251 (Figura 6).
El cebador B4900 consiste en un sitio de restricción NheI en 5', seguido de la secuencia 033 ubicada aproximadamente 500 pb cadena abajo del sitio de inserción 033 que está dentro de la región intergénica inmediatamente cadena abajo del operón de la fibra de la cola (Figura 6). El cebador B4901 consiste en sitios de restricción AvrII y Xhol en 5', seguido de la secuencia de 033 que es complementaria a la secuencia ubicada inmediatamente cadena abajo del sitio de inserción de 033 (Figura 6). El cebador B4902 consiste en un sitio de restricción AvrII en 5', seguido de la secuencia 033 ubicada inmediatamente cadena arriba del sitio de inserción (Figura 6). El cebador B4903 consiste en un sitio NheI en 5', seguido de la secuencia 033 que es complementaria a la secuencia ubicada aproximadamente 500 pb cadena arriba del sitio de inserción 033 (Figura 6).
Cebador B4900 (SEQ ID NO: 31)
5' gatagctagcTTTCTCGTTTTAATGTCG 3'
Cebador B4901 (SEQ ID NO: 32)
5' gataCCTAGGtgCTCGAGTATTCGCCCAAAAGAAAAG 3'
Cebador B4902 (SEQ ID NO: 33)
5' gataCCTAGGTCAGGAGCCTTGATTGATC 3'
Cebador B4903 (SEQ ID NO: 34)
5' gatagctagcGGACTGGTAAGTCTGGTG 3'
2. El plásmido pSMX252 (Figura 6), que comprende pSMX251 que contiene SASP-C bajo el control de un promotor rpsB, puede construirse de la siguiente manera.
El gen de SASP-C de la cepa KM de Bacillus megaterium (ATCC 13632) puede amplificarse mediante PCR utilizando los cebadores B4904 y B4270 (Figura 6). El producto de PCR resultante se puede digerir después con XhoI y NcoI. El promotor rpsB puede amplificarse mediante PCR a partir de P. aeruginosa utilizando los cebadores B4271 y B4905 (Figura 6). El producto de PCR resultante se puede digerir después con NcoI y AvrII. A continuación, los dos productos de PCR digeridos pueden limpiarse y ligarse a pSMX251 que se ha digerido con XhoI y AvrII, produciendo el plásmido pSMX252 (Figura 6).
El cebador B4904 comprende un sitio de restricción XhoI en 5', seguido de 5 bases, y después un finalizador transcripcional bidireccional, y después una secuencia complementaria al extremo 3' del gen de SASP-C de la cepa KM de B. megaterium (ATCC 13632) (Figura 6). El cebador B4270 comprende un sitio de restricción NcoI en 5', seguido de la secuencia del extremo 5' del gen de SASP-C de la cepa KM de B. megaterium (ATCC 13632) (Figura 6). El cebador B4271 comprende un sitio de restricción NcoI en 5', seguido de una secuencia complementaria al final del promotor rpsB de PAO1 de P. aeruginosa (Figura 6). El cebador B4905 comprende un sitio de restricción AvrII en 5', seguido de la secuencia del comienzo del promotor rpsB de PAO1 de P. aeruginosa (Figura 6).
Cebador B4904 (SEQ ID NO: 35)
5'-gataCTCGAGGATCTAGTCAAAAGCCTCCGACCGGAGGCTTTTGACT ttagtacttgccgcctag-3 '
Cebador B4270 (SEQ ID NO: 36)
5'-gataccATGGcaaattatcaaaacgcatc-3'
Cebador B4271 (SEQ ID NO: 37)
5'-gataCCATggTAGTTCCTCGATAAGTCG-3'
Cebador B4905 (SEQ ID NO: 38)
5'-gataCCTAGGCCTAGGgatctGACCGACCGATCTACTCC-3'
3. El pSMX253 (Figura 6), que comprende pSMX252 que contiene lacZa, puede construirse de la siguiente manera.
lacZa puede amplificarse mediante PCR utilizando los cebadores B4906 y B4907 (Figura 6). El producto de PCR resultante puede, a continuación, digerirse con Xhol y unirse a pSMX252 que también se ha digerido con Xhol y tratarse con fosfatasa alcalina antes de la unión, para producir pSMX253 (Figura 6).
El cebador B4906 consiste en un sitio de restricción Xhol en 5', seguido de una secuencia complementaria al extremo 3' de lacZa (Figura 6). El cebador B4907 consiste en un sitio de restricción Xhol en 5', seguido de la secuencia del promotor lac que impulsa la expresión de lacZa (Figura 6).
Cebador B4906 (SEQ ID NO: 39)
5'-gataCTCGAGttagcgccattcgccattc-3'
Cebador B4907 (SEQ ID NO: 40)
5' -gataCTCGAGgcgcaacgcaattaatgtg-3'
Modificación genética de 033, PTPX83, PTPX84 y bacteriófago similar, para introducir rpsB-SASP-C y lacZa 1. El plásmido pSMX253 (Figura 6; Figura 3; Figura 4; Figura 7) se puede introducir en la cepa PAX21 de P. aeruginosa mediante conjugación, seleccionando transconjugantes sobre la base de la resistencia a la tetraciclina (50 pg/ml), produciendo la cepa PTA51.
2. La cepa PTA51 se puede infectar en experimentos individuales con el bacteriófago 033, o PTPX83, o PTPX84, u otro bacteriófago similar, y se puede recoger el bacteriófago de la progenie.
3. El fago recombinante, en el que se ha introducido rpsB-SASP-C y lacZa en el sitio de inserción elegido, puede identificarse mediante la colocación en placas del lisado de la etapa (2) en la cepa PAX21 de P. aeruginosa, en medio que contiene S-gal, buscando placas negras, que son indicativas de la actividad de la p-galactosidasa. 4. Se puede realizar una PCR para comprobar que rpsB-SASP-C y lacZa están presentes.
5. Después de la identificación de aislados verificados (por ejemplo, PTPX85 (Figura 7), PTPX86 (Figura 3), PTPX87 (Figura 4)), los aislados se pueden purificar en placa dos veces más en la cepa PAX21 de P. aeruginosa, antes de su utilización posterior.
Modificación genética para eliminar el marcador lacZa de PTPX85, PTPX86, PTPX87 y derivados similares de 033 1. El plásmido pSMX252 (Figura 6; Figura 3; Figura 4; Figura 7) se puede introducir en la cepa PAX21 de P. aeruginosa mediante conjugación, seleccionando transconjugantes sobre la base de la resistencia a la tetraciclina (50 pg/ml), produciendo la cepa PTA85.
2. La cepa PTA85 se puede infectar en experimentos individuales con el bacteriófago PTPX85, o PTPX86, o PTPX87, u otro bacteriófago similar, y se puede recoger el bacteriófago de la progenie.
3. El fago recombinante, en el que se ha eliminado el marcador lacZa, puede identificarse mediante la colocación en placas del lisado de la etapa (2) en la cepa PAX21 de P. aeruginosa, en medio que contiene S-gal, buscando placas blancas, que son indicativas de la pérdida de actividad de S-galactosidasa.
4. Se puede realizar una PCR para confirmar la eliminación del marcador lacZa, mientras se asegura de que rpsB-SASP-C todavía está presente.
5. Después de la identificación de aislados verificados (por ejemplo, PTPX88 (Figura 7), PTPX89 (Figura 3), PTPX90 (Figura 4)), los aislados se pueden purificar en placa dos veces más en la cepa PAX21 de P. aeruginosa, antes de su utilización posterior.
Construcción de un plásmido para introducir fda-SASP-C (codón optimizado) y lacZa en un sitio de inserción elegido, ubicado en una región intergénica inmediatamente cadena abajo del operón de la fibra de la cola, dentro del genoma de 033, PTPX83, PTPX84 y bacteriófago similar
1. El plásmido pSMX254 (Figura 8), que comprende pSMX251 que contiene el codón de SASP-C optimizado para su expresión en P. aeruginosa, bajo el control de un promotor fda, puede construirse de la siguiente manera.
El gen de SASP-C de la cepa KM de Bacillus megaterium (ATCC 13632) puede tener codones optimizados para su expresión en P. aeruginosa (Figura 9) y sintetizarse in vitro. A continuación, el gen de SASP-C con codones optimizados puede amplificarse mediante PCR utilizando los cebadores B4312 y B4313 (Figura 8). El promotor fda puede amplificarse mediante PCR a partir de P. aeruginosa utilizando los cebadores B4314 y B4315 (Figura 8). Los dos productos de PCR resultantes se pueden unir después mediante PCR de empalme por extensión de solapamiento (SOEing, por sus siglas en inglés 'splicing by overlap extension'), utilizando los cebadores externos B4312 y B4315 (Figura 8).
El producto de PCR resultante del finalizador fda-SASP-C con codones optimizados puede digerirse después con Xhol y AvrlI, limpiarse y unirse a pSMX251 que se ha digerido con Xhol y AvrlI, produciendo el plásmido pSMX254 (Figura 8). El cebador B4312 comprende un sitio de restricción Xhol en 5', seguido de un finalizador transcripcional bidireccional y, a continuación, una secuencia complementaria al extremo 3' del gen de SASP-C de la cepa KM de B. megaterium (ATCC 13632) cuyos codones se han optimizado para su expresión en P. aeruginosa (Figura 8). El cebador B4313 comprende la secuencia del extremo 3' del promotor fda de PAO1 de P. aeruginosa seguido de la secuencia del extremo 5' del gen de SASP-C con codones optimizados. El cebador B4314 comprende una secuencia complementaria al extremo 5' del gen de SASP-C con codones optimizados seguida de una secuencia complementaria al extremo 3' del promotor fda de PAO1 de P. aeruginosa (Figura 8). El cebador B4315 comprende un sitio de restricción AvrII en 5', seguido de la secuencia del comienzo del promotor fda de PAO1 de P. aeruginosa (Figura 8).
Cebador B4312 (SEQ ID NO: 41)
5'-gataCTCGAGAGTCAAAAGCCTCCGACCGGAGGCTTTTGACTTCAGTACTTGCCGC CCAG-3 ' Cebador B4313 (SEQ ID NO: 42)
5'-GATTGGGAGATACGAGAACCATGGCCAACTACCAGAACGC -3'
Cebador B4314 (SEQ ID NO: 43)
5'-GCGTTCTGGTAGTTGGCCATGGTTCTCGTATCTCCCAATC-3'
Cebador B4315 (SEQ ID NO: 44)
5'-GATACCTAGGAACGACGAAGGCCTGGTG-3'
3. El pSMX255 (Figura 8), que comprende pSMX254 que contiene lacZa, puede construirse de la siguiente manera.
lacZa puede amplificarse mediante PCR utilizando los cebadores B4906 y B4907 (Figura 8). El producto de PCR resultante puede, a continuación, digerirse con Xhol y unirse a pSMX254 que también se ha digerido con Xhol y tratarse con fosfatasa alcalina antes de la unión, para producir pSMX255 (Figura 8).
El cebador B4906 consiste en un sitio de restricción Xhol en 5', seguido de una secuencia complementaria al extremo 3' de lacZa (Figura 8). El cebador B4907 consiste en un sitio de restricción Xhol en 5', seguido de la secuencia del promotor lac que impulsa la expresión de lacZa (Figura 8).
Cebador B4906 (SEQ ID NO: 39)
5'-gataCTCGAGttagcgccattcgccattc-3'
Cebador B4907 (SEQ ID NO: 40)
5'-gataCTCGAGgcgcaacgcaattaatgtg-3'
Modificación genética de 033, PTPX83, PTPX84 y bacteriófago similar, para introducir fda-codón de SASP-C optimizado y lacZa
1. El plásmido pSMX255 (Figura 8; Figura 10; Figura 11; Figura 12) se puede introducir en la cepa PAX21 de P. aeruginosa mediante conjugación, seleccionando transconjugantes sobre la base de la resistencia a la tetraciclina (50 pg/ml), produciendo la cepa PTA86.
2. La cepa PTA86 se puede infectar en experimentos individuales con el bacteriófago 033, o PTPX83, o PTPX84, u otro bacteriófago similar, y se puede recoger el bacteriófago de la progenie.
3. El fago recombinante, dentro del cual se ha introducido fda-codón de SASP-C optimizado y lacZa, puede identificarse mediante la colocación en placas del lisado de la etapa (2) en la cepa PAX21 de P. aeruginosa, en medio que contiene S-gal, buscando placas negras, que son indicativas de la actividad de la p-galactosidasa. 4. Se puede realizar una PCR para comprobar que fda-codón de SASP-C optimizado y lacZa están presentes.
5. Después de la identificación de aislados verificados (por ejemplo, PTPX91 (Figura 12), PTPX92 (Figura 10), PTPX93 (Figura 11)), los aislados se pueden purificar en placa dos veces más en la cepa PAX21 de P. aeruginosa, antes de su utilización posterior.
Modificación genética para eliminar el marcador lacZa de PTPX91, PTPX92, PTPX93 y derivados similares de 033 1. El plásmido pSMX254 (Figura 8; Figura 10; Figura 11; Figura 12) se puede introducir en la cepa PAX21 de P. aeruginosa mediante conjugación, seleccionando transconjugantes sobre la base de la resistencia a la tetraciclina (50 pg/ml), produciendo la cepa PTA87.
2. La cepa PTA87 se puede infectar en experimentos individuales con el bacteriófago PTPX91, o PTPX92, o PTPX93, u otro bacteriófago similar, y se puede recoger el bacteriófago de la progenie.
3. El fago recombinante, en el que se ha eliminado el marcador lacZa, puede identificarse mediante la colocación en placas del lisado de la etapa (2) en la cepa PAX21 de P. aeruginosa, en medio que contiene S-gal, buscando placas blancas, que son indicativas de la pérdida de actividad de S-galactosidasa.
4. Se puede realizar una PCR para confirmar la eliminación del marcador lacZa, mientras se asegura que fda-codón de SASP-C optimizado todavía está presente.
5. Después de la identificación de aislados verificados (por ejemplo, PTP387 (Figura 12), PTP388 (Figura 10), PTP389 (Figura 11)), los aislados se pueden purificar en placa dos veces más en la cepa PAX21 de P. aeruginosa, antes de su utilización posterior.
Bibliografía
Abedon S. T. (2008). Bacteriophage Ecology: Population Growth, Evolution, an Impact of Bacterial Viruses. Cambridge. Cambridge University Press. Capítulo 1.
Boucher, H. W., Talbot, G. H., Bradley, J. S., Edwards, J. E., Gilbert, D., Rice, L. B., y Bartlett, J. (2009). Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases, 48: 1-12.
Burrowes, B., y Harper, D. R. (2012). Phage Therapy of Non-wound Infections. Bacteriophages in Health and Disease: Bacteriophages in Health and Disease, Capítulo 14: 203-216.
Carlton, R. M. (1999). Phage therapy: past history and future prospects. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis-Edición en inglés 47:267-274.
Ceyssens P., Miroshnikov K., Mattheus W., Krylov V., Robben J., Noben J., Vanderschraeghe S., Sykilinda N., Kropinski A. M., Volckaert G., Mesyanzhinov V., Lavigne R. (2009). Comparative analysis of the widespread and conserved PB1-like viruses infecting Pseudomonas aeruginosa. Env. Microbiol. 11:2874-2883.
Francesconi, S. C., MacAlister, T. J., Setlow, B., y Setlow, P. (1988). Immunoelectron microscopic localization of small, acid-soluble spore proteins in sporulating cells of Bacillus subtilis. J Bacteriol., 170: 5963-5967.
Frenkiel-Krispin, D., Sack, R., Englander, J., Shimoni, E., Eisenstein, M., Bullitt, E. y Wolf, S. G. (2004). Structure of the DNA-SspC complex: implications for DNA packaging, protection, and repair in bacterial spores. J. Bacteriol.
186:3525-3530.
Gill J. J., Hyman P. (2010). Phage Choice, Isolation and Preparation for Phage therapy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 11:2-14.
Kutateladze, M., y Adamia, R. (2010). Bacteriophages as potential new therapeutics to replace or supplement antibiotics. Trends Biotechnol. 28:591-595.
Lee, K. S., Bumbaca, D., Kosman, J., Setlow, P., y Jedrzejas, M. J. (2008). Structure of a protein-DNA complex essential for DNA protection in spores of Bacillus species. Proc. Natl. Acad. Sci. 105:2806-2811.
Nicholson WL, Setlow B., Setlow P. (1990). Binding of DNA in vitro by a small, acid-soluble spore protein from Bacillus subtilis and the effect of this binding on DNA topology. J Bacteriol. 172: 6900-6906.
Rakhuba D. V., Kolomiets E. I., Szwajcer Dey E., Novik E. I. (2010). Bacteriophage Receptors, Mechanisms of Phage Adsorption and Penetration into Host Cell. Polish J.Microbiol. 59:145-155.
Sambrook, J., Fritsch, E. F., y Maniatis, T. (1989). Molecular cloning (Vol. 2, pág. 14-9). Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Scholl, D., Rogers, S., Adhya, S., y Merril, C. R. (2001). Bacteriophage K1-5 encodes two different tail fiber proteins, allowing it to infect and replicate on both K1 and K5 strains of Escherichia coli. J. Virol. 75:2509-2515.
Veesler D., Cambillau C. (2011). A Common Evolutionary Origin for Tailed-Bacteriophage Functional Modules and Bacterial Machineries. Microbiol Mol Biol Rev. 75:423-433.
Walker, B., Barrett, S., Polasky, S., Galaz, V., Folke, C., Engstrom, G., y de Zeeuw, A. (2009). Looming globalscale failures and missing institutions. Science, 325:1345-1346.
OMS (2014) Antimicrobial resistance: global report on surveillance 2014.
Tabla 1. Variedad de hospedadores de 033, PTP92, C36 y PTP47 contra 44 aislados clínicos europeos de Pseudomonas aeru inosa.
Figure imgf000023_0001
(continuación)
Figure imgf000024_0001
(continuación)
Figure imgf000025_0001
Tabla 2. Variedad de hospedadores de 033, PTP92 y PTP93 contra 35 aislados clínicos europeos de Pseudomonas aeruginosa. Se analizó la sensibilidad de las cepas a cada bacteriófago dejando caer 10 |jl de lisado de bacteriófago bruto en una placa de recubrimiento de agar blando inoculada con bacterias. Las placas se cultivaron durante la noche a 32 °C y se puntuó la sensibilidad de las cepas a cada bacteriófago mediante la evaluación de las zonas de aclaramiento en el punto de inoculación. Cuando los bacteriófagos inhibieron el crecimiento, como se ve por el aclaramiento del césped bacteriano, la cepa se marcó como sensible (+), y cuando no se observó inhibición del crecimiento la ce a se marcó como no sensible -
Figure imgf000025_0002

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un bacteriófago modificado capaz de infectar una pluralidad de bacterias diana diferentes para utilizar como medicamento, incluyendo el bacteriófago un gen de toxina que codifica una proteína de toxina que es tóxica para las bacterias diana; donde el bacteriófago es lítico; y donde el bacteriófago expresa proteínas determinantes de la variedad del hospedador que tienen una pluralidad de especificidades del hospedador bacteriano.
2. Un bacteriófago modificado para utilizar como medicamento de acuerdo con la reivindicación 1, donde el gen de la toxina comprende un gen de una proteína pequeña de espora soluble en ácido (SASP) a/p que codifica una SASP, opcionalmente donde la SASP es SASP-C, opcionalmente donde la SASP-C es de Bacillus megaterium.
3. Un bacteriófago modificado para utilizar como medicamento de acuerdo con la reivindicación 1, donde la especificidad del hospedador bacteriano del determinante de la variedad del hospedador está dentro de la misma especie bacteriana.
4. Un bacteriófago modificado para utilizar como medicamento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el gen de la toxina está bajo el control de un promotor constitutivo, opcionalmente donde el promotor constitutivo se selecciona de pdhA, rpsB, pgi, fda, lasB y promotores que tienen más del 90 % de identidad de secuencia con los mismos, opcionalmente donde el promotor constitutivo es fda.
5. Un bacteriófago modificado para utilizar como medicamento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde al menos una de las bacterias diana es Pseudomonas, o una pluralidad de diferentes bacterias Pseudomonas, opcionalmente donde las bacterias Pseudomonas comprenden Pseudomonas aeruginosa.
6. Un bacteriófago modificado para utilizar como medicamento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los determinantes de la variedad del hospedador comprenden proteínas de la fibra de la cola, opcionalmente, donde cada proteína de la fibra de la cola comprende una región de unión al receptor para unirse a las bacterias diana y una región que une la región de unión al receptor con el cuerpo del bacteriófago, opcionalmente, donde la región de unión al receptor es una región de unión al receptor carboxiterminal y la región que une la región de unión al receptor carboxiterminal con el cuerpo del bacteriófago es una región aminoterminal, opcionalmente, donde la región aminoterminal comprende los aminoácidos 1 a 628 de la proteína de la fibra de la cola y la región carboxiterminal comprende los aminoácidos 629 a 964 de la proteína de la fibra de la cola, basado en la secuencia de aminoácidos del bacteriófago 033 como se establece en la SEQ ID NO: 50, opcionalmente, donde la región carboxiterminal no tiene más del 96 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la región carboxiterminal del bacteriófago 033, opcionalmente, donde la región carboxiterminal es de uno cualquiera de los bacteriófagos 033, LBL3, SPM-1, F8, PB1, KPP12, LMA2, SN, 14-1, JG024, NH4, PTP47, PTP92, C36 y PTP93, opcionalmente, donde la identidad de secuencia de aminoácidos de la región carboxiterminal es menos del 80 %, o es menos del 70 %, o es menos del 60 %.
7. Un bacteriófago modificado para utilizar como medicamento de acuerdo con la reivindicación 6, donde la región aminoterminal tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la región aminoterminal del bacteriófago 033, opcionalmente, donde la región aminoterminal es de uno cualquiera de los bacteriófagos 033, LBL3, SPM-1, F8, PB1, KPP12, LMA2, SN, 14-1, JG024, NH4, PTP47, PTP92, C36 y PTP93, opcionalmente, donde el bacteriófago modificado es el bacteriófago PTP387 que comprende 033, modificado para llevar fda-SASP-C (secuencia con codones optimizados de P. aeruginosa).
8. Un bacteriófago modificado para utilizar como medicamento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde las proteínas determinantes de la variedad del hospedador son proteínas determinantes de la variedad del hospedador híbridas, comprendiendo cada una de las cuales una secuencia de aminoácidos de una pluralidad de bacteriófagos diferentes, opcionalmente, donde las proteínas determinantes de la variedad del hospedador híbridas comprenden proteínas de fibra de la cola híbridas que comprenden una región carboxiterminal de unión al receptor y una región aminoterminal que une la región carboxiterminal de unión al receptor con el cuerpo del bacteriófago, donde las regiones carboxiterminal y aminoterminal son cada una de un bacteriófago diferente, opcionalmente, donde cada proteína de la fibra de la cola híbrida comprende la región carboxiterminal de unión al receptor del bacteriófago PTP47 y la región aminoterminal del bacteriófago 033, opcionalmente, donde cada proteína de la fibra de la cola híbrida comprende la región carboxiterminal de unión al receptor del bacteriófago PTP92 y la región aminoterminal del bacteriófago 033.
9. Un bacteriófago modificado para utilizar como medicamento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el bacteriófago expresa una pluralidad de determinantes de la variedad del hospedador diferentes; y donde cada determinante de la variedad del hospedador tiene una especificidad de hospedador bacteriano diferente, opcionalmente, donde cada proteína determinante de la variedad del hospedador comprende una proteína de la fibra de la cola que proviene de un bacteriófago seleccionado de 033, LBL3, SPM-1, f8, PB1, KPP12, LMA2, SN, 14-1, JG024, NH4, PTP47, PTP92, C36 y PTP93.
10. Un bacteriófago modificado como se define en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores mezclado con al menos otro bacteriófago modificado que es capaz de infectar bacterias diana, que incluye un gen de SASP que codifica una SASP que es tóxica para las bacterias diana.
11. Un bacteriófago modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para utilizar en el tratamiento de infecciones bacterianas, opcionalmente, donde la infección bacteriana comprende una infección orgánica localizada o una infección multiorgánica, opcionalmente, donde la infección comprende una infección tópica, infección oral, infección respiratoria, infección ocular o infección del torrente sanguíneo, que, opcionalmente, es para terapia humana.
12. Un bacteriófago modificado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para utilizar en la inhibición o prevención terapéutica del crecimiento de células bacterianas.
13. Una composición para inhibir o prevenir el crecimiento de células bacterianas, que comprende un bacteriófago modificado como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, y un vehículo para el mismo, comprendiendo opcionalmente la composición una pluralidad de bacteriófagos modificados, al menos dos de los cuales tienen diferentes especificidades de hospedador.
14. Una composición de acuerdo con la reivindicación 13, que comprende el bacteriófago PTP387, el bacteriófago PTP388 y el bacteriófago PTP389 donde el bacteriófago PTp387 comprende 033, modificado para llevar fda-SASP-C (secuencia con codones optimizados de P. aeruginosa); el bacteriófago PTP388 comprende 033 modificado para llevar fda-SASP-C (secuencia con codones optimizados de P. aeruginosa) y lleva una fibra de la cola 033 en la que los aminoácidos 629-964 se reemplazan por los aminoácidos 629-962 de la fibra de la cola PTP92 (SEQ ID NO: 54); y el bacteriófago PTP389 comprende 033 modificado para llevar fda-SASP-C (secuencia con codones optimizados de P. aeruginosa) y lleva una fibra de la cola 033 en la que los aminoácidos 629-964 se reemplazan por los aminoácidos 629-962 de la fibra de la cola PTP47 (SEQ ID NO: 57).
15. Una composición de acuerdo con la reivindicación 13 o reivindicación 14, que está formulada para uso farmacéutico, que está formulada para uso tópico, o que está formulada para administrarse a las vías respiratorias.
16. Un uso no médico de un bacteriófago modificado como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, como descontaminante bacteriano, opcionalmente que comprende el tratamiento de la contaminación bacteriana de superficies, saneamiento de tierras o tratamiento de agua.
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Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998033901A2 (en) 1997-01-31 1998-08-06 Cosmix Molecular Biologicals Gmbh Generation of diversity in combinatorial libraries
US6310191B1 (en) 1998-02-02 2001-10-30 Cosmix Molecular Biologicals Gmbh Generation of diversity in combinatorial libraries
US6492161B1 (en) * 1999-06-02 2002-12-10 Prokaria Ltd. Bacteriophage RM 378 of a thermophilic host organism
ATE305793T1 (de) 2000-07-25 2005-10-15 Us Gov Health & Human Serv Bakteriophage mit breitem wirtspektrum
GB0028130D0 (en) * 2000-11-17 2001-01-03 Phico Therapeutics Ltd Polypeptide and uses thereof
EP1384779A1 (en) 2002-07-26 2004-01-28 Cosmix Molecular Biologicals GmbH Method for generating molecules with specific properties by recombination and selection
GB0314469D0 (en) * 2003-06-20 2003-07-23 Phico Therapeutics Ltd Antimicrobial compositions and uses thereof
AU2004258731B2 (en) * 2003-07-23 2010-02-25 Biocontrol Limited Bacteriophage-containing therapeutic agents
GB0715416D0 (en) 2007-08-07 2007-09-19 Phico Therapeutics Ltd Modified bacteriophage
DE102010013834A1 (de) 2008-03-30 2010-12-16 VLB Berlin e. V. Institut für Mikrobiologie Mittel zur Blockierung der Vermehrung und der Abtötung von Bakterien
WO2010141135A2 (en) 2009-03-05 2010-12-09 Trustees Of Boston University Bacteriophages expressing antimicrobial peptides and uses thereof
US9617522B2 (en) 2013-09-05 2017-04-11 Massachusetts Institute Of Technology Tuning bacteriophage host range
GB201417808D0 (en) 2014-10-08 2014-11-19 Phico Therapeutics Ltd Modified bacteriophage
GB201417810D0 (en) 2014-10-08 2014-11-19 Phico Therapeutics Ltd Modifying bacteriophage
GB201417805D0 (en) * 2014-10-08 2014-11-19 Phico Therapeutics Ltd Modifield bacteriophage
GB201417811D0 (en) * 2014-10-08 2014-11-19 Phico Therapeutics Ltd Modifying bacteriophage

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