JP2017529868A - バクテリオファージの改変 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)標的ファージの宿主域決定因子とは異なる、マーカーファージの宿主域決定因子を含むファージ標的化領域を含有するベクターであって、ファージ標的化領域が、標的ファージゲノムの第一および第二の標的配列と相同な第一および第二の隣接配列に隣接する、ベクターを提供するステップと;
(b)標的ファージの宿主である第一の宿主細胞にベクターを導入するステップと;
(c)第一の宿主細胞に標的ファージを感染させるステップと;
(d)ファージを複製および組み換えさせて、それによって標的ファージのゲノムを改変するステップと;
(e)得られたファージを、マーカーファージの宿主であるが標的ファージの宿主ではない第二の宿主細胞において増殖させるステップと
(f)得られたファージを回収するステップと
を含む方法を提供する。
本発明において、同種の宿主域決定因子を有する複数のファージを同定することができることが見出されている。そのようなファージは単離することができる。例として、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)株上でプラークを形成することができる環境起源由来のファージに関してスクリーニングすることによって、緑膿菌に感染するファージを単離することができる(Gill and Hyman、2010)。単離されたファージの全ゲノムをシークエンシングして、アノテーションを行ってもよい。あるいは、DNA配列データベースを宿主域決定因子に関して検索することができる。2014年9月現在、National Centre for Biotechnology Information(NCBI)データベースに寄託されたファージゲノム配列は約1400個であった。
クローニング目的でDNAを生成するためのPCR反応は、プライマーの融解温度(Tm)に応じて、Herculase II Fusion DNAポリメラーゼ(Agilent Technologies)を使用して、製造元の説明書に従って実施することができる。スクリーニング目的のPCR反応は、プライマーの融解温度(Tm)に応じて、Taq DNAポリメラーゼ(NEB)を使用して、製造元の説明書に従って実施することができる。特に明記していない限り、制限酵素消化、アガロースゲル電気泳動、T4 DNAリガーゼ依存的ライゲーション、コンピテント細胞の調製および形質転換などの一般的な分子生物学技術は、Sambrookら、(1989)に記述される方法に基づくことができる。酵素は、New England BiolabsまたはThermo Scientificから購入することができる。DNAは、酵素反応から精製して、Qiagen DNA精製キットを使用して細胞から調製することができる。プラスミドは、接合ヘルパー株である大腸菌HB101(pRK2013)によって媒介される接合によって大腸菌株から緑膿菌株に伝達することができる。β−ガラクトシダーゼの色素生成基質であるS−galはSigma(S9811)から購入することができ、これはβ−ガラクトシダーゼによる消化によって、鉄イオンとキレートを形成すると黒色の沈殿物を形成する。
1.緑膿菌PAO1 phoA相同体の3’末端に隣接するDNAを有するpSM1104を含むプラスミドpSMX301(図1)は、以下のように構築することができる。
1.プラスミドpSMX302(図1)を、接合によって、新しい宿主域決定因子を有するバクテリオファージの宿主であるが、元のバクテリオファージの宿主ではない適切な緑膿菌株に伝達して、テトラサイクリン(50μg/ml)に対する耐性の獲得によって一次組み換え体に関して選択することができる。
1.プラスミドpSMX303(図1)を、接合によって、新しい宿主域決定因子を有するバクテリオファージの宿主であるが、元のバクテリオファージの宿主ではない適切な緑膿菌株に伝達して、テトラサイクリン(50μg/ml)に対する耐性の獲得によって一次組み換え体に関して選択することができる。
1.関連するバクテリオファージPTP92の尾繊維宿主域決定因子の配列に隣接するPhi33配列を有するpSM1080を含むプラスミドpSMX304(図2)は、以下のように構築することができる。
1.プラスミドpSMX306(図2)を、接合によって、元のファージと宿主域決定因子ドナーファージの両方の宿主である緑膿菌株に導入して、テトラサイクリン耐性(50μg/ml)に基づいて接合伝達体を選択し、株PTA31を得ることができる。
1.プラスミドpUC19由来のlacZαレポーターを有するpSMX306を含むプラスミドpSMX307(図2)は、以下のように構築することができる。
1.プラスミドpSMX307(図2;図3)を、接合によって、元のファージと宿主域決定因子ドナーファージの両方の宿主である緑膿菌株に導入して、テトラサイクリン耐性(50μg/ml)に基づいて接合伝達体を選択し、株PTA32を得ることができる。
1.関連するバクテリオファージPTP92の尾繊維宿主域決定因子の配列に隣接するPhi33配列を有するが、エンドライシン遺伝子の欠失を含むpSM1080を含むプラスミドpSMX308(図4)は、以下のように構築することができる。
1.プラスミドpSMX310(図4)を、接合によって、元のファージと宿主域決定因子ドナーファージの両方の宿主である緑膿菌株に導入して、テトラサイクリン耐性(50μg/ml)に基づいて接合伝達体を選択し、株PTA33を得ることができる。
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Claims (35)
- 第一の標的配列と第二の標的配列とを含む溶菌性の標的ファージのゲノムを改変する方法であって:
(a)標的ファージの宿主域決定因子とは異なる、マーカーファージの宿主域決定因子を含むファージ標的化領域を含有するベクターであって、ファージ標的化領域が、標的ファージゲノムの第一および第二の標的配列と相同な第一および第二の隣接配列に隣接する、ベクターを提供するステップと;
(b)標的ファージの宿主である第一の宿主細胞にベクターを導入するステップと;
(c)第一の宿主細胞に標的ファージを感染させるステップと;
(d)ファージを複製および組み換えさせて、それによって標的ファージのゲノムを改変するステップと;
(e)得られたファージを、マーカーファージの宿主であるが標的ファージの宿主ではない第二の宿主細胞において増殖させるステップと
(f)得られたファージを回収するステップと
を含む方法。 - 標的ファージゲノムの第一および第二の標的配列が連続していない、請求項1に記載の方法。
- 標的ファージゲノムの第一および第二の標的配列が、組み換え後の遺伝子の不活化のためにファージ遺伝子またはその一部に隣接する、請求項2に記載の方法。
- ファージ遺伝子が溶菌遺伝子である、請求項3に記載の方法。
- ベクターのファージ標的化領域が、標的ファージのゲノムに組み込むための外因性のDNA配列をさらに含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 外因性のDNAが抗菌タンパク質をコードする、請求項5に記載の方法。
- 外因性のDNAがα/β型低分子酸可溶性芽胞タンパク質(SASP)をコードする遺伝子を含む、請求項6に記載の方法。
- SASPがSASP−Cである、請求項7に記載の方法。
- 遺伝子が構成的プロモーターの制御下にある、請求項7または請求項8に記載の方法。
- 構成的プロモーターがpdhA、rpsB、pgi、fda、lasB、およびそれらと90%超の配列同一性を有するプロモーターから選択される、請求項9に記載の方法。
- 第一および第二の隣接配列の少なくとも1つが、標的ファージゲノムの第一および第二の標的配列と比較して変異を含有する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 変異が点突然変異である、請求項11に記載の方法。
- マーカーファージの宿主域決定因子が、尾繊維タンパク質またはその領域をコードする、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 尾繊維タンパク質が、第二の宿主細胞に結合するための受容体結合領域と、受容体結合領域をファージのボディに結合させる領域とを含む、請求項13に記載の方法。
- 受容体結合領域が、C末端受容体結合領域であり、C末端受容体結合領域をファージのボディに結合させる領域がN末端領域である、請求項14に記載の方法。
- 第二の宿主細胞がシュードモナス(Pseudomonas)宿主細胞である、請求項14または請求項15に記載の方法。
- シュードモナスが緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)である、請求項16に記載の方法。
- N末端領域が、バクテリオファージPhi33のアミノ酸配列に基づいて、尾繊維タンパク質のアミノ酸1〜628位を含み、C末端領域が尾繊維タンパク質のアミノ酸629〜964位を含む、請求項15〜17のいずれか1項に記載の方法。
- C末端領域が、バクテリオファージPhi33のC末端領域と96%以下のアミノ酸配列同一性を有する、請求項15〜18のいずれか1項に記載の方法。
- C末端領域が、バクテリオファージPhi33、LBL3、SPM−1、F8、PB1、KPP12、LMA2、SN、14−1、JG024、NH−4、PTP47、C36、PTP93、およびPTP92のいずれか1つに由来する、請求項19に記載の方法。
- C末端領域アミノ酸配列同一性が80%未満である、請求項19または請求項20に記載の方法。
- C末端領域アミノ酸配列同一性が70%未満である、請求項21に記載の方法。
- C末端領域アミノ酸配列同一性が60%未満である、請求項22に記載の方法。
- N末端領域がバクテリオファージPhi33のN末端領域と少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有する、請求項15〜23のいずれか1項に記載の方法。
- N末端領域が、バクテリオファージPhi33、LBL3、SPM−1、F8、PB1、KPP12、LMA2、SN、14−1、JG024、NH−4、PTP47、C36、PTP92、およびPTP93のいずれか1つに由来する、請求項24に記載の方法。
- 尾繊維タンパク質がバクテリオファージPhi33の尾繊維アミノ酸配列と80%超のアミノ酸配列同一性を有する、請求項15〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 各尾繊維タンパク質が、Phi33、LBL3、SPM−1、F8、PB1、KPP12、LMA2、SN、14−1、JG024、NH−4、PTP47、C36、PTP92、およびPTP93から選択されるバクテリオファージに由来する、請求項26に記載の方法。
- アミノ酸配列同一性が85%超である、請求項26または請求項27に記載の方法。
- アミノ酸配列同一性が90%超である、請求項28に記載の方法。
- アミノ酸配列同一性が95%超である、請求項29に記載の方法。
- バクテリオファージが標的細菌に対して毒性であるSASPを含み、非溶菌性である、複数の異なる標的細菌に感染することができる改変バクテリオファージを産生するための、請求項7〜30のいずれか1項に記載の方法の使用。
- バクテリオファージが複数の異なる宿主域決定因子を発現し、それぞれの宿主域決定因子が異なる細菌宿主特異性を有する、請求項31に記載の使用。
- バクテリオファージが複数の異なるバクテリオファージ由来のアミノ酸配列を含む宿主域決定因子タンパク質を発現する、請求項31に記載の使用。
- 前記またはそれぞれの宿主域決定因子が尾繊維タンパク質である、請求項32または請求項33に記載の使用。
- 宿主域決定因子の細菌宿主特異性が、同じ細菌種内である、請求項32〜34のいずれか1項に記載の使用。
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