TWI418630B - A novel anti-EB virus-induced tumor polypeptide, a gene encoding it and a plastid containing the gene, and its application and its preparation method - Google Patents
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Description
本發明是有關於抗腫瘤藥物領域,特別是有關於一種新型抗EB病毒所致腫瘤多肽、編碼其之基因及包含該基因之質體、其應用與製備方法。
在抗生素研究領域,人們一直在致力於開發模仿同種異株細菌之間互相殺傷的工作方式來開發新型抗生素,自然界中有不少細菌毒素直接在細菌胞膜上形成離子通道來殺死細菌,其模式標本就是大腸桿菌分泌的一種細菌毒素-大腸菌素。其中大腸菌素Ia自1952年被Jacob發現之後,經過數代人的努力,1996年Qiu et al(Major transmemebrane movement soociated with colicin Ia channel gating.J.Gen.Physiology,107:313-328(1996))終於揭示了大腸菌素Ia在人工脂質雙分子膜上所形成離子通道開放和關閉時的跨膜立體結構,為在分子水準上設計和製備新型的抗菌素奠定了理論基礎。並相繼有大腸菌素多肽與白色連珠球菌資訊素、葡萄球菌資訊素等信號肽分子連接而成的多肽分子能夠藉由資訊素識別靶細菌細胞,將大腸菌素引導到靶細菌細胞膜上形成跨膜離子通道導致胞容物外泄致死細胞。
惡性腫瘤是對人類健康的巨大威脅。全世界每年死於惡性腫瘤的患者約有七百萬人,其中中國就佔有六分
之一,惡性腫瘤已是我國第二位的死亡原因。由於其病因、發病機制、臨床表現尚未闡明,故防治效果不理想。現有抗腫瘤藥物在腫瘤治療中占重要地位,雖然對一些腫瘤已取得一定的療效,但仍存在著對腫瘤細胞的選擇性差,免疫抑制及不良反應多而嚴重,產生抗藥性等缺陷。
EB病毒所致的非洲兒童惡性淋巴肉瘤,Hodgkin’s淋巴肉瘤和鼻咽癌細胞表面均帶有特異的EB病毒表面抗原,因此,EB病毒表面抗原可以認為是該類腫瘤細胞的一種特異性標誌物。在EB病毒所致的腫瘤藥物上,專利號為ZL200410081446.8的發明,公開了大腸菌素與識別EB病毒表面抗原的模擬抗體結合形成的抗腫瘤多肽,能夠特異性殺死機體中的EB病毒所致癌細胞,而對正常細胞沒有傷害,殺傷力是其他抗癌藥物的若干倍,克服了近年來使用的抗腫瘤藥物中存在的藥物選擇性差、產生抗藥性、殺死癌細胞的同時正常組織也受到嚴重損傷等問題,Xiao-Qing Qiu等,2007的文章中對比了一系列結構的模擬抗體與大腸菌素構成的抗腫瘤多肽的殺腫瘤的能力,發現VHCDR1-VHFR2-VLCDR3及VLCDR1-VHFR2-VHCDR3兩種結構的模擬抗體與大腸菌素構成的抗腫瘤多肽具有較好的殺傷能力(Xiao-Qing Qiu et al.,2007,Small antibody mimetics comprising two complementarity-determining regions and a framework region for tumor targeting,Nature Biotechnology 25,921-929,1 August 2007),這為進一步製備抗EB病毒所
致腫瘤多肽提供了更多的候選模擬抗體。
但是在上述抗腫瘤多肽中,由於大腸菌素多肽的熟睡端存在較易引起超敏反應的胺基酸殘基,有可能導致含有大腸桿菌多肽的藥物較易引起機體異常的免疫反應;
有研究報導,很多癌症患者由於其代謝機制受到癌細胞干擾而不正常,對多肽類藥物容易產生過敏反應,而導致不能用藥,因此有必要對大腸菌素多肽進行改進,以獲得更安全適合更多患者的抗癌藥物。
本發明根據上述領域存在的不足,提供一種新型抗EB病毒所致腫瘤多肽及其應用與製備方法。為治療EB病毒所致腫瘤提供高殺傷力、高特異性,且致敏可能性較低的藥物。
一種新型抗EB病毒所致腫瘤多肽,由可形成離子通道的大腸菌素突變多肽與抗EB病毒抗體多肽或者抗EB病毒抗體的模擬抗體多肽可操作地連接構成,所述可形成離子通道的大腸菌素突變多肽由野生型大腸菌素E1、Ia、Ib、A、B、N或其水性孔道結構域的肽鏈突變了胺基酸殘基G11A、H22G、A26G、V31L和H40D而獲得,抗EB病毒抗體多肽的胺基酸序列與ATCC HB-168雜交瘤分泌的抗體多肽相同。
所述模擬抗體多肽指抗EB病毒抗體的重鏈CDR1
區、重鏈CDR1-CDR2連接肽段和輕鏈CDR3的連接肽。
可形成離子通道的大腸菌素突變多肽由野生型大腸菌素Ia突變而來。
新型抗EB病毒所致腫瘤多肽,具有如SEQ ID NO.29所示的胺基酸序列。
編碼所述新型抗EB病毒所致腫瘤多肽的基因。
所述基因,具有如SEQ ID NO.30所示的核苷酸序列。
含有上述基因的重組質體。
上述新型抗EB病毒所致腫瘤多肽的製備方法,步驟如下:將上述重組質體轉形到表達系統中進行表達,分離純化表達的多肽。
上述新型抗EB病毒所致腫瘤多肽在製備治療和預防EB病毒所致腫瘤的藥物中的應用。
一種大腸菌素Ia的突變多肽,其胺基酸序列如SEQ ID NO.24所示。
編碼大腸菌素Ia的突變多肽的基因。
所述基因在製備多肽藥物中的應用,指將所述基因與誘導多肽的基因可操作地連接並克隆到表達載體中,然後將表達載體轉形到表達系統中,分離純化表達的多肽。
本發明提供的新型抗EB病毒所致腫瘤多肽,由可
形成離子通道的大腸菌素突變多肽與抗EB病毒的抗體多肽或者抗EB病毒的抗體的模擬抗體多肽構成。由於野生大腸菌素多肽分子中存在容易引起超敏反應的胺基酸殘基,本發明在可形成離子通道結構的大腸菌素的多肽分子中,選擇性地突變了疏水區段部分容易引起機體超敏反應的胺基酸殘基,如本發明的一個較佳實施例中,大腸菌素Ia的多肽突變位置為:G11A、H22G、A26G、V31L和H40D,實驗資料表明,採用大腸菌素Ia多肽和變構的Ia多肽分別注射免疫小鼠,注射變構的Ia的小鼠產生的血清效價要比前者低1~2個數量級,即免疫反應水準較低,證明變構的多肽降低了引起機體過敏的可能性;同時突變多肽仍然保留了在細胞膜上形成跨膜離子通道的功能,實驗證明,本發明的重組多肽對腫瘤細胞的殺傷能力未受影響,說明突變的胺基酸殘基沒有影響大腸菌素形成離子通道的功能。本發明提供的新型抗EB病毒所致腫瘤多肽中,抗EB病毒的抗體多肽或者抗EB病毒的抗體的模擬多肽藉由與EB病毒所致的腫瘤細胞的表面特異性抗原識別,大腸菌素突變多肽引導至靶細胞膜上,大腸菌素突變多肽的跨膜離子通道結構域疏水區段插入腫瘤細胞膜中,進而形成離子通道,靶腫瘤細胞因內容物洩漏而被致死;抗EB病毒的抗體多肽的胺基酸序列完全參照ATCC HB-168雜交瘤細胞分泌單克隆抗體的多肽的胺基酸序列。
本發明的實施例中較佳採用上述抗EB病毒抗體的模擬抗體多肽可操作地連接在大腸菌素突變多肽的羧基
端而獲得分子量較小的本發明的抗腫瘤多肽,即這些小分子模擬多肽僅包括該抗EB病毒的抗體多肽的VHCDR1區、VLCDR3區,VHCDR1-VHCDR2連接肽段和輕鏈VLCDR3區連接的肽鏈VHCDR1-VHFR2-VLCDR3得到胺基酸序列如SEQ ID NO.25所示的新型抗腫瘤多肽1的模擬抗體,模擬抗體僅包含不到30個胺基酸,在分子量上遠遠小於天然抗體150個胺基酸,既達到了對抗原識別能力的要求又大幅度消減了抗腫瘤多肽的分子量,有利於提高本發明抗腫瘤多肽在組織中的穿透能力。
本發明的另一目的是提供編碼本發明抗腫瘤多肽的基因序列。本發明抗腫瘤多肽的基因由編碼大腸菌素突變多肽的基因與編碼抗EB病毒的抗體多肽的基因或者其模擬抗體多肽的基因可操作地連接構成,其中大腸菌素多肽和抗EB病毒抗體的基因序列是已知的,大腸菌素突變多肽的基因是在大腸菌素多肽基因的相應密碼子上進行如下點突變而得:G11A、H22G、A26G、V31L和H40D。
由於密碼子的兼併性,本領域技術人員可在不改變胺基酸序列的前提下對編碼本發明的抗腫瘤多肽的核苷酸序列進行調整。
本發明的重組質體,是指將裝載了野生大腸菌素基因的原始載體進行雙鏈核苷酸點突變,在目標突變位置上插入突變密碼子,獲得含有大腸菌素突變多肽的基因的突變載體,相同的點突變技術將編碼抗EB病毒的抗
體的模擬抗體基因經插入到大腸菌素突變多肽基因的羧基端,得到本發明的重組質體。原始載體pSELECTTM-1購於Promega公司,其中裝載了大腸菌素Ia和Immunity蛋白基因,點突變操作按照Strategene公司試劑盒說明書;本發明針對點突變製備大腸菌素突變多肽,其中突變了5個密碼子,因此設計了5對引物序列(Seq ID No.1~10);本發明實施例中針對模擬抗體基因設計了6對引物序列(Seq ID No.11~22)。
本發明更提供了製備本發明抗腫瘤多肽的方法,是將上述獲得的重組質體轉染入大腸桿菌BL21(DE3)工程菌中,篩選出陽性克隆,分離純化陽性克隆表達的蛋白即能得到為本發明新型抗EB病毒所致腫瘤多肽。
本發明提供的新型抗EB病毒所致腫瘤多肽,可在製備治療或預防EB病毒所致腫瘤的藥物中應用。可以藉由將本發明中獲得的新型抗生素的多肽添加到藥學上可接受的載體或者賦形劑或可選的其他成分而製成臨床上適用的藥物組合物。
本發明更提供了大腸菌素Ia突變多肽的胺基酸序列和基因序列,該突變多肽不僅可用於本發明中,更可以與其他引導多肽構成抗體多肽,本發明實施例3的實驗資料一方面證明了含有該突變多肽的多肽藥物具有較低的抗原性,也證明該突變多肽與其他引導多肽構成抗體
多肽具有殺菌能力,而製備方法是本領域的常規實驗操作。
本發明提供的新型抗腫瘤多肽,具有專利號ZL200410081446.8的發明所公開的抗腫瘤多肽的優點,即高特異性的靶向性和對正常細胞的安全性,不易產生抗藥性等優點,同時本發明的抗腫瘤多肽藉由對大腸菌素多肽中易引起超敏反應的胺基酸殘基進行了突變,降低了含該突變多肽的抗腫瘤多肽的免疫原性,即降低了引起過敏反應的可能性,改進了現有該類多肽的藥物使用安全性和殺腫瘤效果,還為其他含大腸菌素多肽的藥物提供了改進的參考。
結合附圖,藉由對本發明較佳實施例的描述具體說明本發明。
本發明所用的原始質體:pSELECTTM-1購於Promega公司。
工程菌:E.coli BL-21(DE3)工程菌,購於Novagen公司。
實施例1.構建含編碼突變大腸菌素Ia的基因的重組質體
原始質體為原始質體為裝載了大腸菌素多肽Ia和immunity蛋白基因的pSELECTTM-1質體(8.3kb)(購於
Promega公司),經雙鏈寡聚核苷酸點突變技術(QuickChangeTM Kit,Strategene公司)分別將編碼突變胺基酸的基因如:SEQ ID NO.1~10所示的寡聚核苷酸引物序列與野生型大腸菌素Ia的基因可操作地連接,獲得如SEQ ID NO.23所示編碼大腸菌素Ia突變多肽的基因,同時得到突變質體;再將編碼模擬抗體的基因SEQ ID NO.26或SEQ ID NO.28插入到突變質體中大腸菌素Ia突變多肽的基因的I626位元密碼子之後,製備出到新型抗EB病毒所致腫瘤多肽的兩種重組質體pCHCEB11(如第1圖所示),pCHCEB22(如第2圖所示),為製備重組質體中編碼抗EB病毒抗體的模擬抗體基因所設計的6條寡聚核苷酸引物序列如SEQ ID NO.11~22所示。重組質體轉染入E.coli BL21(DE3)工程菌(購於Novagen公司)裏製備多肽,獲得序列表中SEQ ID NO.25(在後面的實施例中稱為「新型抗腫瘤多肽1」)和SEQ ID NO.27(在後面的實施例中稱為「新型抗腫瘤多肽2」)所示。
雙鏈寡聚核苷酸點突變程式按Strategene QuickChang Site-Directed Mutagenesis Kit(catalog#200518)試劑盒進行。
1. 準備點突變反應物:5ul 10X buffer
2ul(10ng)裝載了野生型大腸菌素突變多肽和immunity蛋白基因的原始質體pSELECTTM-1。
1.25ul(125ng)設計的5’-3’寡聚核苷酸引物
1.25ul(125ng)設計的3’-5’寡聚核苷酸引物
1ul dNTP
雙蒸水50ul
1ul pfu
(除質體、引物和雙蒸水外,均為試劑盒所備試劑)
2. 進行PCR擴增,擴增條件:變性95℃,35秒,退火53℃,70秒,延伸68℃,17分,共20個循環;
3. 加入Dpn 1內切酶1ul消化母體DNA鏈(37℃,1小時),取1ul反應物與XL1-Blue感受態細胞50ul冰敷30分鐘,熱衝擊42℃,45秒,再置入冰中2分鐘;
4. 加入NZY培基0.5ml,220rpm,37℃搖菌1小時,取50-100ul反應物鋪板(LB培基加1%瓊脂加50ug/ml氨苄青黴素,37℃過夜);
5. 18小時後挑菌,提取質體後測序確定突變成功;
6. 將完成多個位點突變的最終獲得的重組質體50ng與製備的E.coli BL-21(DE3)工程菌感受態細胞40ul冰敷5分鐘,42℃熱衝擊30秒,再置入冰中2分鐘,加入Novagen公司SOC培養液160ul後220rpm,37℃搖菌1小時後鋪板(LB培基加1%瓊脂,加50ug/ml氨苄青黴素)37℃過夜。
7. 挑取單克隆菌落大量增菌,8-16升FB培基,250
rpm,30℃,4-5小時,熱衝擊250rpm,42℃,30分鐘,250rpm,37℃,2小時;離心沉澱菌體,4℃,6000g,20分鐘,取4℃,50mM硼酸緩衝液(2mM EDTA+2mM DTT)50-80ml懸浮菌體,加入0.2M PMSF 250毫升後,使用超聲破碎(4℃,400W,2分鐘),高速離心沉澱破碎的菌體(4℃,75,000g,90分鐘),取上清加入硫酸鏈黴素500萬單位沉澱DNA,15000g,4℃,10分鐘離心沉澱後,取上清裝入分子量15,000透析袋於4℃,50mM硼酸緩衝液4升透析過夜後,再次15000g,4℃,10分鐘離心沉澱,取上清上樣於CM離子交換柱,經0.1-0.3M NaCl+50mM硼酸緩衝液梯度洗脫即可得到重組抗腫瘤多肽。
點突變設計的引物序列如下:Seq ID NO.1突變大腸菌素基因中G11A所設計的寡聚引物5’-3’
cgt att aca aat ccc GCA gca gaa tcg ctg ggg
Seq ID NO.2突變大腸菌素基因中G11A所設計的寡聚引物3’-5’
ccc cag cga ttc tgc TGC ggg att tgt aat acg
Seq ID NO.3突變大腸菌素基因中H22G所設計的寡聚引物5’-3’
gat tca gat ggc GGT aaa tta tgg gtg
Seq ID NO.4突變大腸菌素基因中H22G所設計的
寡聚引物3’-5’
cac cca taa ttt ACC gcc atc tga atc
Seq ID NO.5突變大腸菌素基因中A26G所設計的寡聚引物5’-3’
gaaa ttatgGGTgt tgatatttat
Seq ID NO.6突變大腸菌素基因中A26G所設計的寡聚引物3,-5’
ataaatatacaacACCcataatttc
Seq ID NO.7突變大腸菌素基因中V31L所設計的寡聚引物5’-3’
gt tgatatttat CTC aaccctc cacgtgtc
Seq ID NO.8突變大腸菌素基因中V31L所設計的寡聚引物3’-5’
gacacgtggagggttGAGataaatatcaac
Seq ID NO.9突變大腸菌素基因中H40D所設計的寡聚引物5’-3’
cgtgtcga tgtctttGATggtaccccgc ctgcat
Seq ID NO.10突變大腸菌素基因中H40D所設計的寡聚引物3,-5’
atgcaggcggggtaccATCaaagacatcgacacg
Seq ID NO.11重組質體pCHCEB11中VHCDR1基因引物5’-3’
gcg aat aag ttc tgg ggt att TCC TTC GGT ATG CAT TGG GTG CGTCAGtaa ata aaa tat aag aca ggc
Seq ID NO.12重組質體pCHCEB11中VHCDR1基因引物3’-5’
gcc tgt ctt ata ttt tat tta CTG ACG CAC CCA ATG CAT ACC GAA GGA aat acc cca gaa ctt att cgc
Seq ID NO.13重組質體pCHCEB11中VHFR2基因引物5’-3’
ggt atg cat tgg gtg cgt cag GCC CCC GAG AAA GGT CTG GAG TGG GTG GCC taa ata aaa tat aag aca ggc
Seq ID NO.14重組質體pCHCEB11中VHFR2基因引物3’-5’
gcc tgt ctt ata ttt tat tta GGC CAC CCA CTC CAG ACCT TTT CTC GGG GGC ctg acg cac cca atg cat acc
Seq ID NO.15重組質體pCHCEB11中(Rev)V1CDR3基因引物5’-3’
aaa ggt ctg gag tgg gtg gcc ACC TAC CCC TAC TCC TAC GGT CAG GGT taa ata aaa tat aag aca ggc
Seq ID NO.16重組質體pCHCEB11中(Rev)VLCDR3基因引物3’-5’
gcc tgt ctt ata ttt tat tta ACC CTG ACC GTA GGA GTA GGG GGT ggc cac cca ctc cag acc ttt
Seq ID NO.17重組質體pCHCEB22中VHCDR1基
因引物5’-3’
gcg aat aag ttc tgg ggt att TCC TTC GGT ATG CAT TGG GTG CGT CAG taa ata aaa tat aag aca ggc
Seq ID NO.18重組質體pCHCEB22中VHCDR1基因引物3’-5’
gcc tgt ctt ata ttt tat tta CTG ACG CAC CCA ATG CAT ACC GAA GGA aat acc cca gaa ctt att cgc
Seq ID NO.19重組質體pCHCEB22中VHFR2基因引物5’-3’
ggt atg cat tgg gtg cgt cag GCC CCC GAG AAA GGT CTG GAG TGG GTG GCC taa ataaaa tat aag aca ggc
Seq ID NO.20重組質體pCHCEB22中VHFR2基因引物3’-5’
gcc tgt ctt ata ttt tat tta GGC CAC CCA CTC CAG ACCT TTT CTC GGG GGC ctg acg cac cca atg cat acc
Seq ID NO.21重組質體pCHCEB22中VLCDR3基因引物5’-3’
aaa ggt ctg gag tgg gtg gcc GGT CAG GGT TAC TCC TAC CCC TAC ACC taa ata aaa tat aag aca ggc
Seq ID NO.22重組質體pCHCEB22中VLCDR3基因引物3’-5’
gcc tgt ctt ata ttt tat tta GGT GTA GGG GTA GGA GTA ACC CTG ACC ggc cac cca ctc cag acc ttt
實施例2.重組質體pCHCEB11、pCHCEB22製備的新型抗腫瘤多肽的免疫效果觀察
取實施例1製備獲得重組質體pCHCEB11、pCHCEB22製備得到的新型抗腫瘤多肽1,新型抗腫瘤多肽2,發明人的前期專利中的抗腫瘤多肽1、抗腫瘤多肽2(ZL200410081446.8)各一份免疫小鼠:上述各蛋白與佐劑混合後,基礎量和追加量為腹腔注射每隻50μg(0.5ml)1次。間隔兩週,免疫5針。ELISA間接法檢測小鼠血清效價,本發明製得的新型抗腫瘤多肽1和2所免疫小鼠血清效價為10-3至10-4而抗腫瘤多肽1、抗腫瘤多肽2所免疫小鼠的血清效價為10-4至10-5。
可見本發明新型抗腫瘤多肽造成宿主致敏反應的可能性要比含野生型大腸菌素Ia的抗腫瘤多肽造成宿主致敏反應的可能性低一至兩個數量級。
實施例3.構成新型抗腫瘤多肽的大腸菌素Ia突變多肽的低致敏效果實驗
取實施例1中大腸菌素Ia突變多肽(其水性孔道結構域的肽鏈中突變了胺基酸殘基G11A、H22G、A26G、V31L和H40D)的突變質體,在其氨基端或羧基端可操作地連接金黃色葡萄球菌資訊素AgrD1(YSTCDFIM),製備出兩種抗菌多肽。AgrD1連接在變構的大腸菌素Ia羧基端製備而得的多肽命名為抗金葡多肽1,AgrD1連接在變構的大腸菌素Ia氨基端製備而得的多肽命名為抗綠膿桿菌多肽1。取野生型大腸菌素Ia的質體,在其氨
基端連接金黃色葡萄球菌資訊素AgrD1製備出抗綠膿桿菌多肽2。
實驗1:
取昆明小鼠一批,腹腔注射致死劑量耐甲氧西林金葡菌(ATCC BAA42),隨機分組為(1)對照組,(2)氨苄青黴素組,(3)抗金葡菌多肽組,(4)抗金葡菌多肽1組。每組小鼠均為10隻。
處理方法:腹腔注射致死劑量耐甲氧西林金葡菌(ATCC BAA42)一小時後,對照組:尾靜脈注射0.5毫升0.3M NaCl+50mM硼酸緩衝液一次;氨苄青黴素組:尾靜脈注射氨苄青黴素2.5mg/kg一次;抗金葡菌多肽組:尾靜脈注射發明人發明的抗金葡菌多肽(ZL 01128836.1)6mg/kg一次;抗金葡菌多肽1組:尾靜脈注射抗金葡菌多肽1 6mg/kg一次。
結果:對照組及氨苄青黴素組鼠在兩天內全部死亡。抗金
葡菌多肽組及抗金葡菌多肽1組有85%的鼠存活。
實驗2:
實驗1的第14天後,再取昆明小鼠一批作為對照和氨苄青黴素組,抗金葡菌多肽組及抗金葡菌多肽1組存活鼠作為抗金葡菌多肽組及抗金葡菌多肽1組重複上述試驗。對照組及氨苄青黴素組鼠在兩天內全部死亡。抗金葡菌多肽組有75%的鼠存活,抗金葡菌多肽1組有90%的鼠存活。
實驗3:
實驗1的41天後,再取昆明小鼠一批作為對照組、左氧氟沙星組和頭孢曲松鈉組,抗金葡菌多肽組及抗金葡菌多肽1組存活鼠作為抗綠膿桿菌多肽2組及抗綠膿桿菌多肽1組。
小鼠腹腔注射致死劑量多重抗藥綠膿桿菌(四川大學華西醫院試驗醫學系臨床分離株13578)一小時後,對照組尾靜脈注射0.5毫升0.3M NaCl+50mM硼酸緩衝液一次,左氧氟沙星組尾靜脈注射左氧氟沙星5mg/kg一次,頭孢曲松鈉組尾靜脈注射頭孢曲松鈉30mg/kg一次,抗綠膿桿菌多肽2組尾靜脈注射綠膿桿菌多肽2 8mg/kg一次,抗綠膿桿菌多肽1組尾靜脈注射抗綠膿桿菌多肽1
8mg/kg一次。對照組和左氧氟沙星組鼠在一天內全部死亡。頭孢曲松鈉組有25%的鼠存活。抗綠膿桿菌多肽2組有60%的鼠存活。抗綠膿桿菌多肽1組鼠全部存活,說明宿主抗體對突變多肽殺傷效用的干擾比對野生型多肽的干擾要低。
請參閱第3圖。
在試驗第一週、第二週和第7週分別採取上述抗金葡菌多肽/抗綠膿桿菌多肽2組和抗金葡菌多肽1/抗綠膿桿菌多肽1組存活鼠的血清進行ELISA間接法檢測其血中的抗體,酶標板的孔中分別包被野生型大腸菌素Ia和大腸菌素Ia突變多肽,100ng/well,一抗分別為抗金葡菌多肽/抗綠膿桿菌多肽2組和抗金葡菌多肽1/抗綠膿桿菌多肽1組存活鼠血清,2抗為山羊抗小滑鼠記抗體,陰性對照以5%牛奶-PBS為一抗,1:50,000滴度的所得結果如下(參閱第4圖)
可見本發明所製備的大腸菌素Ia突變多肽造成宿
主致敏反應的可能性要比野生型大腸菌素Ia造成宿主致敏反應的可能性低;
實施例4新型抗腫瘤多肽對EBV所致人惡性淋巴肉瘤(Burkitt’s lymphoma)體外殺傷效果
EB病毒陽性及陰性細胞株:為美國ATCC標準細胞株。
細胞培養:取出0.1ml復蘇培養的Raji細胞懸浮液,緩緩加入含3ml 1640液體培養基(加10%血清)的培養皿中(稀釋比例為1:30),混合均勻,放入37℃ CO2培養箱中培養。
實驗使用一株EB病毒陽性細胞株:ATCC CCL-86(即全世界細胞培養室使用的標準人Burkitt’s惡性淋巴肉瘤細胞,Raji細胞,1963年分離自12歲非洲男性患兒)。
受試細胞共分3組,第一組為空白組,即加入抗腫瘤多肽空白保存液(10Mmpb+0.2M NaCI磷酸鹽緩衝液(pH7.4))。
第二組為加入200μg/ml的新型抗腫瘤多肽1(質體為pCHCEB11,保存液為10mMPB+0.2M NaCI磷酸緩衝液pH7.4)。
第三組為加入200μg/ml的新型抗腫瘤多肽2(質體為pCHCEB22,保存液為10mMPB+0.2M NaCI磷酸緩衝液pH7.4)。
細胞在培養24小時後,分別加入上述各組處理物於培養皿中,在加入處理物後的第72小時加入100uMol碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)20ul,10分鐘後在螢光顯微鏡下觀察。結果顯示空白組細胞生長良好,唯新型抗腫瘤多肽1組中絕大部分細胞被PI染成了紅色,提示這些細胞膜已被抗腫瘤多肽破壞,造成腫瘤細胞死亡。從細胞死亡數量來比較,兩種新型抗腫瘤多肽中新型抗腫瘤多肽2效果較差,參閱第5圖。
實施例5.新型抗腫瘤多肽對EB病毒所致Burkitt’s人惡性淋巴肉瘤細胞和其他腫瘤細胞的體外殺傷作用之多重螢光染色觀察。
細胞培養條件同實施例2。實驗共使用三株細胞,EB病毒陽性細胞株:ATCC CCL-86(Raji細胞,Burkitt’s惡性淋巴肉瘤細胞);ATCC CRL-2230,46歲男性愛滋病人(AIDS)惡性淋巴肉瘤細胞株,EB病毒和Kaposi肉瘤病毒(HHV8)均陽性;EB病毒陰性細胞株:ATCC CRL-1648(CA-46,細胞分離自美國型Burkitt’s惡性淋巴肉瘤病人的腹水)。
每株細胞分為二個實驗組,第一組為加入新型抗腫瘤多肽空白保存液(10mMPB+0.2M NaCI磷酸鹽緩衝液(pH7.4))。第二組為加入200μg/ml的新型抗腫瘤多
肽1(質體為pCHCEB11),保存液為10mMPB+0.2M NaCI磷酸緩衝液pH7.4。
細胞在培養24小時後,分別加入上述各組處理物於培養皿中,在加入處理物後的第72小時分別加入50uMol FITC 20ul及50uMol Rodamin-123 20ul兩種螢光染料。10分鐘後在Olympus IX-71螢光顯微鏡下觀察。
結果顯示:EB病毒陰性的腫瘤細胞株被新型抗腫瘤多肽1處理後仍生長良好。而EB病毒陽性的各腫瘤細胞株被新型抗腫瘤多肽1處理後,絕大多數細胞出現粒線體及胞核結構消失,明顯腫脹和壞死,細胞幾乎全部死亡。顯然多重螢光染色的結果比實施例4碘化丙啶染色的結果更為精確的展示了新型抗腫瘤多肽1對EB病毒陽性腫瘤細胞的強大殺傷作用,參閱第6圖。
EB病毒陰性的腫瘤細胞生長良好,表明新型抗腫瘤多肽並不攻擊細胞膜上不帶有EB病毒表面抗原的細胞。這提示本發明新型抗腫瘤多肽具有理想的靶向特異性和安全性。
實施例6.新型抗腫瘤多肽對EB病毒所致Burkitt’s人惡性淋巴肉瘤細胞種植到裸鼠體內生長出的實體腫瘤的殺傷作用
SCID免疫缺陷小鼠購自中國科學院上海實驗動物中心,鼠餵養按標準飼養要求,水、墊草和飼料均經高溫或紫外線滅菌。在相對無菌條件下飼養一週,無異常
後進行接種實驗。
收集指數生長期的Raji(ATCC CCL-86)和1648(ATCC CRL-1648)細胞懸液於50毫升離心管中,4℃離心,棄上清後,用1640液體培養基(加小牛血清)重懸細胞,使之達到1.0×107/ml個細胞。在鼠左腋處皮下注射Raji細胞懸液0.1ml,在鼠右腋處皮下注射1648細胞懸液0.1ml。
注射細胞後3-4日腫瘤即長到約2 x 2mm,將荷瘤裸鼠隨機分為:(A組)抗腫瘤多肽空白保存液(10mM PBS+0.2M NaCI磷酸鹽緩衝液(pH7.4))為對照組;(B組)新型抗腫瘤多肽1(質體為pCHCEB11)治療組,300μg/鼠(以25克重計算)/日,連續20日;每組10隻荷瘤鼠,給藥方式為腹腔注射,每天注射2次,每次0.5ml,連續給藥20天。每天觀察鼠活動情況,並作記錄,隔天精確測量腫瘤大小並照相。
結果顯示:(參閱第7圖)B組新型抗腫瘤多肽組的鼠腫瘤生長明顯受到抑制,其中7隻鼠的瘤塊消失,其餘3隻的瘤塊明顯小於對照組。新型抗腫瘤多肽在鼠體內可以有效地抑制EBV病毒陽性淋巴肉瘤細胞所致的實體瘤塊生長。但對同體鼠內接種的EBV病毒陰性淋巴肉瘤細胞所致的實體瘤塊卻無抑制作用。
實施例7.體內實體腫瘤消除實驗的病理觀察
瘤體病理組織學觀察:實施例6實驗到期後處死小鼠,取出瘤體於10%福馬林中固定,石蠟切片,HE染色常規光鏡觀察。
鏡下觀察對照組鼠的實體腫瘤增殖旺盛;新型抗腫瘤多肽組鼠的EBV病毒陽性實體腫瘤細胞顯著減小,標本中縮小的腫瘤細胞團中幾乎均為壞死的腫瘤細胞,周邊可見大量淋巴細胞浸潤。病理組織學結果提示在20日處理期限中,新型抗腫瘤多肽幾乎殺滅了實體腫瘤中的所有腫瘤細胞(參閱第8圖中之第D圖)。
1、2‧‧‧新型抗腫瘤多肽
第1圖 含有模擬抗體多肽VHCDR1-VHFR2-VLCDR3的基因和大腸菌素Ia突變多肽基因的重組質體pCHCEB11的結構示意圖;
第2圖 含有模擬抗體多肽VHCDR1-VHFR2-(Rev)VLCDR3的基因和大腸菌素Ia突變多肽基因的重組質體pCHCEB22的結構示意圖;
第3圖 大腸菌素Ia突變多肽的致敏效果實驗1
(A)昆明小鼠腹腔注射致死劑量的耐甲氧西林金葡菌(ATCC BAA42),隨機分組為(1)對照組,(2)氨苄青黴素組,(3)抗金葡菌多肽(ZL 01128836.1)組,(4)抗金葡菌多肽1組。
(B)14天後,再取昆明小鼠一批作為對照和氨苄青黴素組,抗金葡菌多肽組及抗金葡菌多肽1組存活鼠作為抗金葡菌多肽組及抗金葡菌多肽1組重複上述試驗。
(C)41天後,再取昆明小鼠一批作為(1)對照組、(2)左氧氟沙星組和(3)頭孢曲松鈉組,(4)抗金葡菌多肽組及(5)抗金葡菌多肽1組存活鼠作為抗綠膿桿菌多肽2組及抗綠膿桿菌多肽1組。
第4圖 大腸菌素Ia突變多肽的低致敏效果實驗2
(A)抗金葡菌多肽/抗綠膿桿菌多肽2組血清,1:50,000滴度;
(B)抗金葡菌多肽1/抗綠膿桿菌多肽1組血清,1:50,000滴度。
(1)第一週,(2)第二週,(3)第7週血清,(4)陰性對照。
第5圖 新型抗腫瘤多肽對EB病毒所致人惡性淋巴肉瘤(Burkitt’s lymphoma)體外殺傷效果比較
(A)對照組,(B)新型抗腫瘤多肽1處理組,(C)新型抗腫瘤多肽2處理組。
第6圖 新型抗腫瘤多肽對EB病毒所致Burkitt’s人惡性淋巴肉瘤細胞和其他腫瘤細胞的體外殺傷作用
(A)EBV病毒陽性的Burkitt’s人惡性淋巴肉瘤細胞,
(B)EBV病毒陰性的Burkitt’s人惡性淋巴肉瘤細胞,
(C)EBV病毒陽性的愛滋病人(AIDS)惡性淋巴肉瘤細胞。
(1)對照組,(2)新型抗腫瘤多肽1處理組。
第7圖 新型抗腫瘤多肽對EB病毒所致Burkitt’s人惡性淋巴肉瘤細胞種植到裸鼠體內生長出的實體腫瘤的殺傷作用
(A)對照組。
(B)新型抗腫瘤多肽1處理組的SCID免疫缺陷鼠,
鼠雙腋下均接種Burkitt’s人惡性淋巴肉瘤細胞。左邊箭頭,EBV病毒陰性的淋巴肉瘤,右邊箭頭,EBV病毒陽性的淋巴肉瘤。
第8圖 新型抗腫瘤多肽對EB病毒所致Burkitt’s人惡性淋巴肉瘤細胞種植到裸鼠體內生長出的實體腫瘤的殺傷作用
(A)對照鼠EBV病毒陰性的淋巴肉瘤切片,(B)對照鼠EBV病毒陽性的淋巴肉瘤切片,(C)新型抗腫瘤多肽1處理鼠EBV病毒陰性的淋巴肉瘤切片,(D)新型抗腫瘤多肽1處理鼠EBV病毒陽性的淋巴肉瘤切片。
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<120> 新型抗EB病毒所致腫瘤多肽及其應用與製備方法
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<160> 32
<170> PatentIn version 3.3
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<220>
<223> 突變大腸菌素基因中V31L所設計的寡聚引物3'-5'
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<212> DNA
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<223> 突變大腸菌素基因中H40D所設計的寡聚引物5'-3'
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<223> 突變大腸菌素基因中H40D所設計的寡聚引物3'-5'
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<212> DNA
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<223> 大腸菌素Ia突變多肽基因序列
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<212> PRT
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<223> 大腸菌素Ia突變多肽胺基酸序列
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<223> 模擬抗體物VHCDR1-VHFR2-VLCDR3胺基酸序列
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<223> 編碼模擬抗體物VHCDR1-VHFR2-(Rev)VLCDR3的核苷酸序列
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<212> PRT
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<220>
<223> 抗EB病毒所致腫瘤多肽的胺基酸序列1
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<223> 編碼抗EB病毒所致腫瘤多肽的胺基酸序列1的核苷酸序列
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<223> 新型抗EB病毒所致腫瘤多肽2的胺基酸序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼抗EB病毒所致腫瘤多肽的胺基酸序列2的核苷酸序列
<400> 32
Claims (12)
- 一種新型抗EB病毒所致腫瘤多肽,由一可形成離子通道的大腸菌素突變多肽與一抗EB病毒抗體多肽或者一抗EB病毒抗體的一模擬抗體多肽可操作地連接構成,該可形成離子通道的大腸菌素突變多肽由野生型大腸菌素Ia或其水性孔道結構域的肽鏈突變了胺基酸殘基G11A、H22G、A26G、V31L和H40D而獲得,該抗EB病毒抗體的胺基酸序列與ATCC HB-168雜交瘤分泌的單克隆抗體相同。
- 如申請專利範圍第1項所述之新型抗EB病毒所致腫瘤多肽,其中該模擬抗體多肽指該抗EB病毒抗體的重鏈CDR1區、重鏈CDR1-CDR2連接肽段和輕鏈CDR3的連接肽。
- 如申請專利範圍第2項所述之新型抗EB病毒所致腫瘤多肽,其中該可形成離子通道的大腸菌素突變多肽由野生型大腸菌素Ia突變而來。
- 如申請專利範圍第3項所述之新型抗EB病毒所致腫瘤多肽,其中該新型抗EB病毒所致腫瘤的多肽,具有如SEQ ID NO.29所示的胺基酸序列。
- 一種編碼申請專利範圍第1~4項之任一項所述之新型抗EB病毒所致腫瘤多肽的基因。
- 如申請專利範圍第5項所述之基因,具有如SEQ ID NO.30所示的核苷酸序列。
- 一種含有如申請專利範圍第5項所述之基因的重 組質體。
- 一種申請專利範圍第1~4項之任一項所述之新型抗EB病毒所致腫瘤多肽的製備方法,步驟如下:將申請專利範圍第7項所述之重組質體轉形到表達系統中進行表達,分離純化表達的多肽。
- 一種申請專利範圍第1~4項之任一項所述之新型抗EB病毒所致腫瘤多肽在製備治療和預防EB病毒所致腫瘤的藥物中的應用。
- 一種大腸菌素Ia的突變多肽,其胺基酸序列如SEQ ID NO.24所示。
- 一種編碼申請專利範圍第10項所述之大腸菌素Ia突變多肽的基因。
- 一種申請專利範圍第11項所述之基因在製備多肽藥物中的應用,指將該基因與誘導多肽的基因可操作地連接並克隆到表達載體中,然後將表達載體轉形到表達系統中,分離純化表達的多肽。
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