ES2436356T3 - Enzimas de ARN polimerasa propensas a la formación de caperuza y sus aplicaciones - Google Patents

Enzimas de ARN polimerasa propensas a la formación de caperuza y sus aplicaciones Download PDF

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Abstract

Enzima híbrida que comprende: - por lo menos un dominio catalítico procedente de una ARN trifosfatasa, - por lo menos un dominio catalítico procedente de una guanililtransferasa, - por lo menos un dominio catalítico procedente de una N7 guanina-metiltransferasa, y - por lo menos un dominio catalítico procedente de una ARN polimerasa dependiente de ADN.

Description

Enzimas de ARN polimerasa propensas a la formación de caperuza y sus aplicaciones.
La presente invención se refiere al campo de la transgenia, especialmente en las células eucariotas.
En especial, la invención se refiere a una enzima híbrida útil para la producción de moléculas de ARN con estructuras con caperuza (en inglés "cap") m7GpppN en el terminal 5'.
La expresión eucariótica se utiliza ampliamente en las ciencias biológicas, la biotecnología y la medicina. Por lo tanto, se han desarrollado muchos métodos para la transgenia eficiente en las células eucariotas. Fuentes de ADN comunes y mecanismos para administración son los virus (por ejemplo, baculovirus, retrovirus, o adenovirus) o vectores no víricos, incluyendo plásmidos y cromosomas artificiales.
Debido a su sencillez, los plásmidos no víricos se utilizan generalmente como vectores de expresión para la transferencia génica en células eucariotas, tanto en aplicaciones in vitro como in vivo. Sin embargo, los niveles de expresión transgénica conseguida por procedimientos no víricos suelen ser modestos y disminuyen rápidamente. Una explicación frecuente de esta modesta eficacia es el hecho de que las moléculas de ADN, que son de más de aproximadamente 40.000 daltons, son demasiado grandes para atravesar los poros nucleares y entrar en el núcleo, donde son transcritos por la ARN polimerasa II nuclear (Lang, Scholz et al. 1986; Zabner, Fasbender et al. 1995). De hecho, sólo una cantidad muy pequeña (<0,1-0,001%) de grandes moléculas de ADN se transfiere activamente desde el citoplasma al núcleo de las células eucariotas. Los mecanismos por los cuales la expresión disminuye rápidamente son también posiblemente nucleares específicos y relacionados con el silenciamiento de la expresión transgénica por diversos mecanismos epigenéticos (Loser, Jennings et al. 1998;. Gill, Smyth et al. 2001;. Miao, Thompson et al. 2001; Nicol, Wong et al. 2002;. Miao, Ye et al. 2003).
Otros inconvenientes de los métodos de transgenia que utilizan el sistema de transcripción de ARN endógeno de las células eucariotas también restringen su uso. En primer lugar, la poca capacidad de procesamiento de las ARN polimerasas eucariotas nucleares (por ejemplo, 10-20 nucleótidos/segundo para la ARN polimerasa II) (Fire, Samuels et al., 1984;. Ucker y Yamamoto, 1984; Bengal, Flores et al. 1991;. Izban y Luse 1992) . En segundo lugar, la competencia entre la transcripción de genes endógenos y la transcripción de transgenes. En tercer lugar, la extrema complejidad de las ARN polimerasas eucariotas, que están formadas por varias subunidades (por ejemplo, 12 subunidades de ARN polimerasa II y reguladas por múltiples factores de transcripción (Lodish, Berk et al. 2008).
En vista de estos inconvenientes, se han desarrollado algunos métodos de transgenia basados en ARN polimerasas dependientes de ADN bacteriofágico. Estos métodos tienen en especial la ventaja de no utilizar el sistema de transcripción de ARN endógeno de las células eucariotas, excepto algunas ARN polimerasas dependientes de ADN bacteriofágico, que tienen una capacidad de procesamiento mayor que las ARN polimerasas eucariotas.
El sistema de expresión de pET es un método popular para la expresión génica en procariotas (Studier, Rosenberg et al. 1990). Se basa en la expresión de la ARN polimerasa dependiente de la única subunidad T7 ADN de bacteriófago (T7 ARN polimerasa, T7ARNP), el producto del gen 1 de T7, para transcribir los genes de interés modificados genéticamente para ser expresados bajo el control de un activador T7. El sistema de expresión pET se ha adaptado a las células eucariotas y por lo general se denomina ARN polimerasa híbrida. Sin embargo, en un medio eucariótico, la alta actividad enzimática de la ARN polimerasa dependiente de T7 ADN contrasta notablemente con rendimientos muy débiles de traducción de los transcritos de T7 (Fuerst, Niles et al. 1986). La ausencia de maduración de los transcritos en células eucariotas, que no son ni modificados por la adición de estructuras con caperuza en su extremo 5' (Benton, Eng et al. 1990; Dower y Rosbash 2002), ni muy poliadenilados en su extremo 3' (Mifflin y Kellems 1991; Dower y Rosbash 2002), proporciona una explicación de esta discrepancia.
Se han desarrollado por lo tanto procedimientos para mejorar la capacidad de traducción de transcritos sin caperuza producidos por el sistema híbrido, como el sistema de expresión híbrido virus vacunal/ARNP de bacteriófago. Este sistema de expresión eucariota se basa en un virus vacunal recombinante que sintetiza la ARN polimerasa dependiente de T7 ADN bacteriofágico en el citoplasma de células de mamíferos infectadas (Fuerst, Niles et al. 1986;. Fuerst, Earl et al. 1987;. Elroy-Stein, Fuerst et al. 1989; Fuerst, Fernández et al. 1989;. Fuerst y Moss 1989; Elroy-Stein y Moss 1990). El gen diana para la ARN polimerasa bacteriofágica, flanqueado por el activador T7 y secuencias de terminación, se introduce en las células infectadas, ya sea por transfección de un plásmido recombinante o por infección con un segundo virus vacunal recombinante (Fuerst, Niles et al. 1986;. Elroy-Stein, Fuerst et al. 1989; Elroy-Stein y Moss 1990). Era de esperar que las enzimas citoplásmicas codificadas por el virus vacunal para la caperuza (en inglés "capping") del ARNm actuarían en los transcritos de T7 para mejorar su capacidad de traducción. Sin embargo, la caperuza de transcritos de T7 permanece por debajo de la óptima (Fuerst y Moss 1989). Por ejemplo, utilizando este sistema de expresión, se descubrió que los transcritos de T7 pueden comprender hasta el 30% de todo el ARN citoplásmico tras un período de 24 horas, pero sólo el 5% -10% de las estructuras con caperuza en el terminal 5' contenidas en transcritos de T7 (Fuerst y Moss 1989). Aunque bastante eficaz, los inconvenientes técnicos del sistema de expresión híbrido virus vacunal/ARNP bacteriofágico restringen claramente su generalización y utilización a gran escala. En primer lugar, este sistema se basa en los virus de las
vacunas recombinantes, que son infecciosos para los seres humanos. Por lo tanto, la manipulación de estos virus recombinantes requiere instalaciones y prácticas de laboratorio específicas. Una cepa aviar atenuada anfitriona de espectro restringido, es decir, la Ankara de la vacuna modificada (MVA), que interrumpe su ciclo de replicación en una etapa de envasado en fase tardía en las células humanas, se puede utilizar para controlar mejor este riesgo (Wyatt, Moss et al. 1995; Engleka, Lewis et al. 1998). En segundo lugar, la vacuna recombinante o los virus MVA son citotóxicos. Por lo tanto, el sistema de expresión híbrido virus de la vacuna/ARNP de bacteriófago sólo se puede utilizar para la transgenia transitoria (Elroy-Stein, Fuerst et al. 1989; Elroy-Stein y Moss 1990). En tercer lugar, el sistema de expresión híbrido virus de la vacuna/ARNP de bacteriófago puede utilizarse fácilmente en algunos modelos celulares que son permisivos a la infección por la vacuna (por ejemplo, BSC-1), mientras que algunos no lo son (por ejemplo, CHO). La inserción del gen CP77 del virus de la viruela en el genoma del virus vacunal recombinante puede superar la restricción del espectro del anfitrión del sistema de expresión híbrido virus de la vacuna/ARNP bacteriofágico de las células de ovario de hámster chino (CHO) al permitir que el virus de la vacuna infecte de manera productiva estas células (Spehner, Gillard et al. 1988;. Ramsey-Ewing y Moss 1996). En cuarto lugar, debido a la complejidad del sistema, cabe esperar una variabilidad significativa en su eficacia, incluso en el mismo modelo celular. En quinto lugar, el sistema de expresión híbrido virus de la vacunal/ARNP bacteriofágico es una tecnología costosa y laboriosa que por lo tanto es poco apropiada para ensayos a gran escala y producción de proteínas.
En un intento de acoplar la caperuza a la transcripción y por lo tanto para mejorar la capacidad de traducción de transcritos sin caperuza producidos por la T7 ARN polimerasa, esta enzima se ha fusionado con el dominio del terminal carboxilo (DTC) de la subunidad mayor de la ARN polimerasa II (POLR2A), (Natalizio, Robson-Dixon et al. 2009). El DTC comprende 25 a 52 repeticiones de heptapéptido de la secuencia consenso 1YSPTSPS7, que está muy conservada en toda la evolución y está sometida a la fosforilación reversible durante el ciclo de la transcripción (Palancade y Bensaude 2003). Cuando está fosforilada, se cree que el DTC actúa como mediador en el acoplamiento de la transcripción y caperuza de las transcripciones nacientes, por unión a una o más subunidades de las enzimas de caperuza del ARNm en levaduras (Cho, Takagi et al. 1997; McCracken, Fong et al. 1997) y mamíferos (McCracken, Fong et al. 1997; Yue, Maldonado et al. 1997). Perceptiblemente, la ARN polimerasa II con repeticiones de DTC con Ser5-fosforilada se somete a descanso del activador proximal que es coincidente con la caperuza conjunta de la transcripción de los transcritos nacientes (Komarnitsky, Cho et al. 2000;. Schroeder, Schwer et al. 2000). Sin embargo, a diferencia de lo que se podría esperar intuitivamente, la fusión del DTC a la T7 ARN polimerasa unitaria no es suficiente para mejorar la caperuza de sustratos cortados y empalmados tanto constitutiva como alternativamente, in vivo (Natalizio, Robson-Dixon et al. 2009).
La caperuza es una estructura especializada encontrada en el extremo 5' de casi todos los ARN mensajeros eucariotas. La estructura de caperuza más sencilla, cap0, proviene de la adición de un nucleósido de guanina metilado en N7 que está unido por 5'-5' trifosfato unido al extremo del ARN primario (es decir, m7 GpppN, donde N es cualquier base, p indica un fosfato y m un grupo metilo). La formación del cap0 conlleva una serie de tres reacciones enzimáticas: ARN trifosfatasa (RTPasa) elimina el resto y fosfato del extremo 5' trifosfato de pre-ARNm naciente a difosfato, la ARN guanililtransferasa (GTasa) transfiere GMP desde GTP al terminal de ARN naciente del difosfato, y la ARN N7-guanina-metiltransferasa (N7-MTasa) añade un resto metilo en el nitrógeno 7 de la guanina en la caperuza de GpppN (Furuichi y Shatkin 2000). En los eucariotas superiores y algunos virus, el grupo 2'-hidroxilo de la ribosa del primer (es decir, estructuras cap1; m7GpppNm2'-OpN) y segundo (es decir, estructuras cap2; m7GpppNm2'-OpNm2'-O) nucleótidos transcritos pueden ser metilados por dos ribosa-2'-O Mtasas independientes, denominadas respectivamente MTasas específicas para cap1 y cap2 (Langberg y Moss 1981). Sin embargo, a diferencia de la actividad celular de N7-MTasa que es exclusivamente nuclear, se ha detectado la actividad de cap-1 ribosa-2'-O MTasa tanto en el citoplasma como en el núcleo de las células HeLa, mientras que la actividad de cap2 MTasa se encuentra exclusivamente en su citoplasma (Langberg y Moss 1981).
La formación de la caperuza m7GpppN en el terminal 5' es el primer paso del tratamiento de pre-ARNm. La caperuza m7GpppN desempeña funciones importantes en la estabilidad del ARNm y su transporte desde el núcleo al citoplasma (Huang y Steitz 2005; Kohler y Hurt 2007). Además, la caperuza m7GpppN en el terminal 5' es importante para la traducción de ARNm a la proteína mediante el anclaje del complejo 4F (eIF4F) del factor de iniciación de la traducción eucariótica, que actúa como mediador en la recuperación del fragmento 16S de la pequeña subunidad ribosómica al ARNm (Furuichi, Lafiandra et al. 1977; Gingras, Raught et al. 1999;. Rhoads 1999). La caperuza m7GpppN en el terminal 5' por lo tanto mejora drásticamente la traducción de ARNm tanto in vitro (Lo, Huang et al. 1998), como in vivo (Malone, Felgner et al. 1989; Gallie 1991; Lo, Huang et al. 1998; Kozak 2005). Por el contrario, los efectos de la 2'-O-metilación sobre la traducción del ARNm parecen depender del tipo de células y de las condiciones de la experimentación (página web Epicentre Biotechnologies; Drummond, Armstrong et al. 1985; Kuge, Brownlee et al. 1998).
Por tanto, continúa habiendo una necesidad significativa en la técnica para sistemas nuevos y mejorados para la transgenia eficiente en las células eucarióticas, que son apropiadas para la terapia génica y la producción de proteínas a gran escala sin citotoxicidad o citotoxicidad inducida. El presente inventor ha dado un paso importante hacia adelante con la invención dada a conocer en el presente documento.
El propósito de la invención es satisfacer esta necesidad al proporcionar nuevas enzimas híbridas, que hacen que
sea posible resolver en su totalidad o en parte los problemas mencionados anteriormente.
Inesperadamente, el inventor ha demostrado que las enzimas híbridas que comprenden un dominio catalítico de una ARN trifosfatasa, un dominio catalítico de una guanililtransferasa, un dominio catalítico de una N7-guaninametiltransferasa, y un dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN pueden sintetizar moléculas de ARN con caperuzas m7GpppN en el terminal 5', que son muy traducibles por el equipo informático de traducción eucariótico, sin citotoxicidad y mientras que no provoque apoptosis.
Estos resultados son sorprendentes ya que la caperuza de los transcritos T7 continúa por debajo del óptimo con el sistema de expresión híbrido virus vacunal/ARNP de bacteriófago, y no pueden conseguirse por la enzima de fusión DTC-T7 ARN polimerasa.
Por lo tanto, en un aspecto, la invención se refiere a una enzima híbrida que comprende:
-
por lo menos un dominio catalítico de una ARN trifosfatasa,
-
por lo menos un dominio catalítico de una guanililtransferasa,
-
por lo menos un dominio catalítico de una N7-guanina-metiltransferasa, y,
-
por lo menos un dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN.
En especial, la enzima híbrida según la invención puede sintetizar moléculas de ARN con caperuzas m7GpppN en el terminal 5'.
La enzima híbrida según la invención tiene en especial las siguientes ventajas:
-
No hay competencia entre la transcripción de genes endógenos y la transcripción de transgenes;
-
No es costosa, es rápida y fácil de realizar y por lo tanto adecuada para ensayos a gran escala y la producción de proteínas;
-
A diferencia del sistema de expresión del híbrido virus vacunal/ARNP bacteriofágico, no tiene citotoxicidad obvia o actividades pro-apoptósicas;
-
Permite la producción de transcritos de ARN en cualquiera de las especies eucariotas (por ejemplo, levaduras, plantas, roedores, rumiantes lecheros, primates y seres humanos).
A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos empleados en la presente memoria tienen el mismo significado que el normalmente entendido por un experto en la técnica en cuestión.
Para mayor comodidad, se proporciona el significado de algunos términos y expresiones empleados en la memoria, ejemplos y reivindicaciones.
Tal como se emplea en la presente memoria, la expresión "enzima híbrida" comprende a la enzima que no es una enzima natural que se encuentra en la naturaleza. Por consiguiente, una enzima híbrida puede comprender dominios catalíticos que provienen de diferentes fuentes (por ejemplo, de diferentes enzimas) o dominios catalíticos provenientes de la misma fuente (por ejemplo, de la misma enzima), pero dispuestos de diferente manera que la encontrada en la naturaleza.
La expresión "enzima híbrida" comprende enzimas monoméricas (es decir, de una sola unidad), pero también enzimas oligoméricas (es decir, de varias unidades), en especial enzimas hetero-oligoméricas.
Como se emplea en la presente memoria, la expresión "enzima monomérica" se refiere a una enzima de una sola unidad que consta de una sola cadena de polipéptido.
Tal como se emplea en la presente memoria, la expresión "enzima oligomérica" se refiere a una enzima de varias unidades que consta de por lo menos dos cadenas de polipéptidos, unidos entre sí por enlace covalente o no covalente. La expresión "enzima oligomérica" comprende una enzima de varias unidades, en el que por lo menos dos unidades de dicha enzima están unidos entre sí por enlace covalente o no covalente. La expresión "enzima oligomérica" comprende enzima homo-oligomérica que es una enzima de varias unidades que consta solo de un tipo de monómeros (subunidad) y enzima hetero-oligomérica que consta de diferentes tipos de monómeros (subunidades).
En especial, dichos dominios catalíticos de ARN trifosfatasa, de una guanililtransferasa, de una N7-guaninametiltransferasa y de una ARN polimerasa dependiente de ADN están unidas entre sí por enlace covalente y/o no covalente.
En especial, dichos dominios catalíticos de ARN trifosfatasa, de una guanililtransferasa, de una N7-guanina
metiltransferasa y de una ARN polimerasa dependiente de ADN están funcionalmente unidos entre sí para sintetizar moléculas de ARN con caperuzas m7GpppN en el terminal 5'.
En especial, la enzima híbrida según la invención que comprende:
5 − por lo menos un dominio catalítico de una ARN trifosfatasa, − por lo menos un dominio catalítico de una guanililtransferasa, − por lo menos un dominio catalítico de una N7 guanina-metiltransferasa, y − por lo menos un dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN;
10 en el que por lo menos dos de dichos dominios catalíticos están unidos entre sí, preferentemente en su extremo (extremo terminal C o N), por enlace covalente o no covalente, más especialmente en el que por lo menos uno de los dominios catalíticos se selecciona en el grupo constituido por:
15 − por lo menos dicho dominio catalítico de una ARN trifosfatasa,
− por lo menos dicho dominio catalítico de una guanililtransferasa, y
− por lo menos dicho dominio catalítico de una N7-guanina-metiltransferasa está unido, preferentemente en su 20 extremo (extremo terminal N o C), por enlace covalente o no covalente con
− por lo menos dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN, preferentemente en su extremo (extremo terminal N o C).
25 En especial, la invención se refiere a la enzima híbrida según la invención que comprende:
− por lo menos un dominio catalítico de una ARN trifosfatasa, − por lo menos un dominio catalítico de una guanililtransferasa, − por lo menos un dominio catalítico de una N7-guanina-metiltransferasa, y
30 − por lo menos un dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN;
con la excepción de la enzima híbrida que comprende:
− un dominio catalítico de una ARN trifosfatasa, 35 − un dominio catalítico de una guanililtransferasa,
− un dominio catalítico de una N7-guanina-metiltransferasa, y
40 − sólo dominios catalíticos de ARN polimerasa I, II y/o III dependiente de ADN eucariótico nuclear, y más específicamente, sólo dominio(s) catalítico(s) de la ARN polimerasa II dependiente de ADN.
En especial, la invención se refiere a la enzima híbrida según la invención que comprende:
45 − por lo menos un dominio catalítico de una ARN trifosfatasa, − por lo menos un dominio catalítico de una guanililtransferasa, − por lo menos un dominio catalítico de una N7-guanina-metiltransferasa, y − por lo menos un dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN;
50 con la excepción de la enzima híbrida que comprende:
− un dominio catalítico de una ARN trifosfatasa,
− un dominio catalítico de una guanililtransferasa, 55 − un dominio catalítico de una N7-guanina-metiltransferasa, y
− dominios catalíticos de ARN polimerasa I, II y/o III dependientes de ADN eucariótico nuclear, más específicamente, por lo menos un dominio catalítico de la ARN polimerasa II dependiente de ADN.
60 En especial, tras la expresión en una célula anfitriona eucariota, dicha enzima híbrida según la invención puede sintetizar moléculas de ARN con caperuzas m7GpppN en el terminal 5', que son preferentemente traducibles por el equipo informático de traducción eucariótica.
En especial, tras la expresión en una célula anfitriona eucariota dichos dominios catalíticos de una ARN trifosfatasa, de una guanililtransferasa y de una N7-guanina metiltransferasa pueden añadir una caperuza m7GpppN en el extremo del terminal 5' de las moléculas de ARN sintetizadas por dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN y preferentemente dichas moléculas de ARN con caperuza m7GpppN en el terminal 5' son traducibles por el equipo informático de traducción eucariótica.
En especial, tras la expresión en una célula anfitriona eucariota, cuando dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN es un dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN de bacteriófago, dichos dominios catalíticos de una ARN trifosfatasa, de una guanililtransferasa y de una N7-guaninametiltransferasa pueden añadir una caperuza m7GpppN en el extremo terminal 5' de moléculas de ARN que tienen un ribonucleótido de guanosina en su extremo terminal 5'.
En especial, tras la expresión en una célula anfitriona eucariota, cuando dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN es un dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN bacteriano, dichos dominios catalíticos de una ARN trifosfatasa, de una guanililtransferasa y de una N7-guanina-metiltransferasa pueden añadir una caperuza m7GpppN en el extremo terminal 5' de moléculas de ARN que tienen un de guanosina
o adenosina en su extremo terminal 5'.
En especial, tras la expresión en una célula anfitriona eucariota, cuando dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN es un dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN mitocondrial humano o de ratón, dichos dominios catalíticos de una ARN trifosfatasa, de una guanililtransferasa y de una N7guanina-metiltransferasa pueden añadir una caperuza m7GpppN en el extremo terminal 5' de moléculas de ARN que tienen un ribonucleótido de adenosina o timidina en sus extremo terminal 5'.
Como se emplea en la presente memoria la expresión "dominio catalítico" de una enzima se refiere al dominio, que es necesario y suficiente, en especial en su estructura tridimensional, para asegurar la función enzimática. Por ejemplo, un dominio catalítico de una ARN trifosfatasa es el dominio, que es necesario y suficiente para asegurar la función de ARN trifosfatasa. El término "dominio catalítico" abarca el dominio catalítico de la enzima natural o mutante.
La enzima híbrida según la invención comprende por lo menos dichos dominios catalíticos, pero puede comprender, además, la totalidad o parte de las enzimas que contienen dichos dominios catalíticos. De hecho, según una forma de realización de la enzima híbrida según la invención, dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN puede estar incluido en la totalidad o parte de una ARN polimerasa dependiente de ADN, preferentemente de una ARN polimerasa dependiente de ADN monomérico. Dicho dominio catalítico de una ARN trifosfatasa, dicho dominio catalítico de una guanililtransferasa y dicho dominio catalítico de una N7-guanina-metiltransferasa también pueden estar incluidos en la totalidad o parte de una enzima de formación de caperuza, preferentemente de una enzima monomérica de formación de caperuza.
La enzima híbrida según la invención puede ser una enzima nuclear, una enzima con compartimento subcelular o una enzima citoplásmica. Por lo tanto, la enzima híbrida según la invención puede comprender un péptido señal o una señal de marcador bien conocida por un experto en la técnica, que dirige el transporte de la enzima en las células. Por ejemplo, la enzima híbrida según la invención puede comprender una señal de localización nuclear (SLN), que dirige la enzima al núcleo. Dicha SLN es a menudo una unidad que consta de cinco aminoácidos básicos, más cargadas. La SLN se pueden localizar en cualquier parte de la cadena peptídica.
Preferentemente, la enzima híbrida según la invención es una enzima híbrida citoplásmica. En especial, no comprende el péptido señal o señal del marcador que dirige el transporte de la enzima, excepto al citoplasma.
La localización citoplásmica de la enzima híbrida según la invención tiene la ventaja de que optimiza los niveles de expresión del transgén, evitando la transferencia activa de grandes moléculas de ADN (es decir, transgenes) desde el citoplasma al núcleo de las células eucariotas y la exportación de moléculas de ARN desde el núcleo al citoplasma.
Estas enzimas híbridas citoplásmicas según la invención pueden por lo tanto ser útiles para generar un sistema de expresión génica eucariótica independiente del anfitrión, gen que puede actuar en el citoplasma en el que se encuentran por lo general cantidades significativamente mayores de ADN transfectado en comparación con el núcleo.
Estas enzimas citoplásmicas híbridas según la invención pueden sintetizar moléculas de ARN con caperuzas m7GpppN en el terminal 5', que son muy traducibles por el equipo informático de traducción citoplásmica eucariótica, sin citotoxicidad y mientras que no se produzca apoptosis.
No hay tampoco competencia entre la transcripción de genes endógenos y la transcripción de transgenes, ya que la transcripción de genes endógenos se produce en el núcleo de las células eucariotas, a diferencia de la transcripción de transgenes, que se produce en el citoplasma.
La enzima híbrida citoplásmica según la invención es por lo tanto notablemente apropiada para los ensayos a gran escala y la producción de proteínas.
En una forma de realización de la enzima híbrida según la invención, dicho dominio catalítico de una ARN trifosfatasa, dicho dominio catalítico de una guanililtransferasa, dicho dominio catalítico de una N7-guaninametiltransferasa, están incluidos en un monómero, es decir, en un polipéptido. Por ejemplo, dicho monómero puede ser una enzima monomérica de formación de caperuza o una enzima híbrida monomérica según la invención.
En especial, dicho dominio catalítico de una ARN trifosfatasa, dicho dominio catalítico de una guanililtransferasa, y dicho dominio catalítico de una N7-guanina-metiltransferasa están incluidos en una enzima monomérica de formación de caperuza. En este caso, las enzima híbridas según la invención comprenden una enzima monomérica de formación de caperuza, que incluye dicho dominio catalítico de una ARN trifosfatasa, dicho dominio catalítico de una guanililtransferasa, y dicho dominio catalítico de una N7-guanina-metiltransferasa. Dicha enzima monomérica de formación de caperuza puede ser una enzima monomérica de que forma caperuza para virus, en especial, seleccionada en el grupo constituido por la enzima natural que forma caperuza para el virus de la fiebre catarral ovina, la enzima natural que forma caperuza para el virus del mosaico del bambú, la enzima natural que forma caperuza para el virus de la peste porcina africana, la enzima natural que forma caperuza para el mimivirus Acanthamoeba polyphaga y mutantes y derivados de las mismas que pueden añadir una caperuza m7GpppN en el extremo del terminal 5' de las moléculas de ARN y, más especialmente de la enzima natural que forma caperuza para el virus de la peste porcina africana y mutantes y derivados de la misma que pueden añadir una caperuza m7GpppN en el extremo del terminal 5' de las moléculas de ARN, y aún más especialmente de la enzima natural que forma caperuza para el virus de la peste porcina africana.
En especial, dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN también puede estar incluido en un monómero, es decir, en un polipéptido. Por ejemplo, dicho monómero puede ser una ARN polimerasa dependiente de ADN monomérico o una enzima híbrida monomérica según la invención.
En especial, dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN está incluido en una ARN polimerasa dependiente de ADN monomérico. En este caso, la enzima híbrida según la invención comprende una ARN polimerasa dependiente de ADN monomérico, que incluye dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN. Dicha ARN polimerasa dependiente de ADN monomérico puede ser una ARN polimerasa dependiente de ADN monomérico bacteriofágico, en especial seleccionado del grupo constituido por T7 ARN polimerasa, T3 ARN polimerasa y SP6 ARN polimerasa y mutantes o derivados de las mismas, que pueden sintetizar ARN complementario monocatenario en la secuencia al ADN con plantilla bicatenaria en la dirección 5' 3', sobre todo de la T7 ARN polimerasa y mutantes o derivadas de los mismas, que pueden sintetizar ARN complementario monocatenario en la secuencia a la plantilla de ADN bicatenario en la dirección 5' - 3'.
Dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN y por lo menos uno, preferentemente por lo menos dos y más preferentemente todo el dominio catalítico se selecciona en el grupo constituido por:
-
dicho dominio catalítico de una ARN trifosfatasa;
-
dicho dominio catalítico de una guanililtransferasa; y
-
dicho dominio catalítico de una N7-guanina-metiltransferasa;
pueden estar incluidos en un monómero.
La enzima híbrida según la invención puede ser monomérica u oligomérica. De hecho, dichos dominios catalíticos de una ARN trifosfatasa, de una guanililtransferasa, de una N7-guanina-metiltransferasa y de una ARN polimerasa dependiente de ADN puede estar incluidos en uno o varios polipéptidos.
Preferentemente, la enzima híbrida según la invención es monomérica.
De hecho, el inventor ha demostrado que una enzima híbrida monomérica que comprende un dominio catalítico de una ARN trifosfatasa, un dominio catalítico de una guanililtransferasa, un dominio catalítico de una N7-guaninametiltransferasa y un dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN pueden sintetizar moléculas de ARN con caperuzas m7GpppN en el terminal 5', que son muy traducibles por el equipo informático de traducción eucariótica, sin citotoxicidad y mientras que no provocan apoptosis.
No era obvio que la caperuza de los transcritos sucediera bien con una enzima monomérica, debido al impedimento estérico y a los componentes y la enzima, que tienen que permanecer en su configuración natural. De hecho, la enzima de fusión DTC-T7 ARN polimerasa no puede conseguir la caperuza de los transcritos T7, aunque se suponía que desencadenaría caperuza con m7GpppN en el extremo terminal 5' de las moléculas de ARN naciente.
La enzima híbrida monomérica según la invención tiene, en especial, las ventajas de que no es costosa, es rápida y fácil de elaborar y por lo tanto apropiada en especial para los ensayos a gran escala y la producción de proteínas.
De hecho, la producción de una enzima monomérica es más fácil que la de una enzima oligomérica. También hay ningún problema de montaje de la unidad, ya que sólo hay una sola unidad. La enzima monomérica también es más fácil de manipular que la enzima polimérica.
Como se emplea en la presente memoria, la expresión "ARN polimerasa dependiente de ADN" (ARNP) se refiere a nucleotidil transferasas que sintetizan ARN complementario monocatenario en la secuencia a la plantilla de ADN bicatenario en la dirección 5' - 3'.
Preferentemente, dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN es un dominio catalítico de una enzima, que tiene una estructura relativamente sencilla y más preferentemente, que tiene elementos genómicos caracterizados de regulación enzimática (es decir, activador, señal de terminación de la transcripción y unión al concatémero). Por lo tanto, en especial, dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN puede ser un dominio catalítico de un ARN polimerasa dependiente de ADN de bacteriófago, de una ARN polimerasa dependiente de ADN bacteriano o de una ARN polimerasa dependiente de ADN de diversos orgánulos eucariotas (por ejemplo, mitocondrias, cloroplastos y proplástidos).
En una forma de realización , dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN es un dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN de bacteriófago.
Las ARN polimerasas dependientes de ADN bacteriofágico tienen sobre todo la ventaja de que optimizan los niveles de expresión del transgénica, en especial porque tienen una capacidad mayor de procesamiento que las ARN polimerasas eucariotas. Las ARN polimerasas dependientes de ADN bacteriofágico tienen también una estructura mucho más sencilla que la mayoría de las polimerasas eucariotas nucleares, que tienen estructura compleja con muchas subunidades (por ejemplo, ARN polimerasa II) (Chen y Schneider 2005). La mayoría de las ARN polimerasas dependientes de ADN bacteriofágico caracterizadas hasta ahora son enzimas de una sola subunidad, que no requieren proteínas accesorias para la iniciación, prolongación o terminación de la transcripción (Chen y Schneider 2005). Varias de estas enzimas, que se nombran por los bacteriófagos a partir de los que han sido clonadas, también tienen elementos genómicos de regulación bien caracterizados (es decir, activador, señales de terminación, secuencias que interrumpen la transcripción), que son importantes para la transgenia.
Tampoco hay competencia entre la transcripción de genes endógenos y la transcripción de l transgenes. Las enzimas híbridas según la invención, que comprenden restos de ARN-polimerasa dependiente de ADN de bacteriófago permiten la producción de transcritos de ARN en cualquiera de las especies eucariotas (por ejemplo, levadura, roedores y seres humanos). Estos no son costosos, son rápidos y fáciles de elaborar y por lo tanto apropiados para ensayos a gran escala y producciones de proteínas; ello permite la producción de transcritos de ARN en cualquier sistema biológico (por ejemplo, la mezcla de reacción acelular, las células cultivadas y organismos vivos), ya que a diferencia de la ARN polimerasa eucariota tal como la ARN polimerasa II, la mayoría de las ARN polimerasas dependientes de ADN bacteriofágico no requieren factores asociados para la iniciación, prolongación o terminación de la transcripción.
Dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN bacteriofágico puede ser un dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN bacteriofágico, en especial, seleccionada en el grupo constituido por la T7 ARN polimerasa natural, la T3 ARN polimerasa natural (secuencia genómica NCBI no ID. NC_003298; Gen no ID. 927437; UniProtKB/Swiss-Prot no ID. Q778M8), K11 ARN polimerasa natural (NCBI secuencia genómica de K11 ARNP no ID. NC_004665; Gen no ID. 1258850; UniProtKB/Swiss-Prot no ID. Q859H5), la <A1122 ARN polimerasa natural (secuencia genómica NCBI no ID. NC_004777; Gen no ID. 1733944; UniProtKB/Swiss-Prot no ID. proteína Q858N4), la <Yeo3-12 ARN polimerasa (genómica secuencia NCBI no ID. NC_001271; Gen no ID. 1262422; UniProtKB/Swiss-Prot no ID. Q9T145) y la gh-1 ARN polimerasa natural (secuencia genómica NCBI no ID. NC_004665; Gen no ID. 1258850; UniProtKB/Swiss-Prot proteína no ID. Q859H5), la Kl-5 ARNP ARN polimerasa natural (secuencia genómica NCBI no ID. NC_008152; Gen no ID. 5075932; proteína UniProtKB/Swiss-Prot no ID. Q8SCG8) y la SP6 ARN polimerasa natural (secuencia genómica NCBI ID no NC_004831; Gen no ID. 1481778; proteína UniProtKB/Swiss-Prot no ID. Q7Y5R1) y mutantes o derivados de las mismas, que pueden sintetizar ARN complementario monocatenario en secuencia a la plantilla de ADN bicatenario en la dirección 5' - 3', sobre todo de la T7 ARN polimerasa natural.
Como se emplea en la presente memoria, la expresión "T7 ARN polimerasa" se refiere a la T7 ARN dependiente de ADN polimerasa bacteriofágica. Preferentemente, la T7 ARN polimerasa tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. no 1 (secuencia genómica NCBI no ID. NC_001604; Gen no ID. 1261050; UniProtKB/Swiss-Prot no ID. P00573) y es una proteína del aminoácido 883 con un peso molecular de 98,8 kDa (Davanloo, Rosenberg et al. 1984; Moffatt, Dunn et al. 1984).
La T7 ARN polimerasa tiene, en especial, la ventaja de que, in vitro, la enzima es sumamente procesiva y alarga 240-250 nucleótidos a 37°C en la dirección 5' - 3' (Golomb y Chamberlin 1974; Lyakhov, He et al. 1997, Zhang y Studier 1997, Finn, MacLachlan et al. 2005). Por otra parte, cuando se expresa en células eucariotas, la T7 ARN polimerasa, sigue estando en gran medida en el citoplasma (Elroy-Stein y Moss 1990; Gao y Huang 1993; Brisson, He et al. 1999) y por lo tanto optimiza los niveles de expresión transgénica, evitando la transferencia activa de
grandes moléculas de ADN (es decir transgenes) desde el citoplasma hasta el núcleo de las células eucariotas y la exportación de moléculas de ARN desde el núcleo hasta el citoplasma.
El dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN puede ser el de la T7 ARN polimerasa natural, pero también el de los mutantes de la T7 ARN polimerasa, que pueden sintetizar ARN complementario monocatenario en secuencia a la plantilla de ADN bicatenario en la dirección 5' - 3', incluso con reducida capacidad de procesamiento. Por ejemplo, dichos mutantes pueden seleccionarse en el grupo que comprende R551S, F644A, Q649S, G645A, R627S, I810S, y D812E (Makarova, Makarov et al. 1995.), y K631M (Osumi-Davis, de Aguilera et al. 1992.; Osumi-Davis, Sreerama et al. 1994).
En una forma de realización de la enzima híbrida según la invención, dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN se encuentra extremo en el terminal C con respecto a dicho dominio catalítico de una ARN trifosfatasa, dicho dominio catalítico de una guanililtransferasa, y dicho dominio catalítico de una N7guanina-metiltransferasa.
De hecho, cuando el dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN es un dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN bacteriofágico, en especial, de una ARN polimerasa dependiente de ADN bacteriofágico seleccionada en el grupo constituido por T7, T3 y SP6-ARN polimerasas, dicho dominio catalítico conserva preferentemente su extremo carboxilo-terminal natural. En especial, el extremo del terminal C de dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN, en especial de una ARN polimerasa dependiente de ADN bacteriofágico corresponde al extremo del terminal C de dicha enzima híbrida. En especial, cuando la enzima híbrida comprende una ARN polimerasa completa dependiente de ADN de bacteriófago, en especial, de una ARN polimerasa dependiente de ADN bacteriofágico seleccionada del grupo constituido por T7, T3 y SP6- ARN polimerasas, dicha polimerasa conserva preferentemente su extremo terminal carboxilo natural. En especial, el extremo terminal C de dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN, en especial de una ARN polimerasa dependiente de ADN bacteriofágico corresponde al extremo terminal C de dicha enzima híbrida. En especial, dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN, en especial, de una ARN polimerasa dependiente de ADN bacteriofágico seleccionada en el grupo que consiste en T7, T3 y SP6-polimerasas de ARN, está incluida en la totalidad o parte de una ARN polimerasa dependiente de ADN bacteriofágico y en el que el extremo del terminal C de dicha ARN polimerasa dependiente de ADN de bacteriófago se corresponde con el extremo del terminal C de dicha enzima híbrida.
En una forma de realización de la enzima híbrida según la invención, dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN, especialmente dicho dominio catalítico de un ARN polimerasa dependiente de ADN bacteriofágico, en concreto, de una ARN polimerasa dependiente de ADN bacteriofágico seleccionada del grupo constituido por T7, T3 y SP6-ARN polimerasas, se encuentra en el terminal C con respecto a dicho dominio catalítico de una ARN trifosfatasa, dicho dominio catalítico de una guanililtransferasa y dicho dominio catalítico de una N7-guanina-metiltransferasa.
En otra forma de realización, dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN es un dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN bacteriano.
Preferentemente dicha ARN polimerasa dependiente de ADN bacteriano tiene una complejidad moderada de la estructura.
Por ejemplo, dicha ARN polimerasa dependiente de ADN bacteriano puede ser la ARN polimerasa dependiente de ADN de E. coli (secuencia genómica NCBI de la subcepa DH10B de K-12 no ID. NC_010473), que consta de cuatro subunidades diferentes (subunidad a: rpoA Gen no ID. 6060938, UniProtKB/Swiss-Prot no ID. B1X6E7; subunidad W:
rpoB Gen no ID. 6058462, UniProtKB/Swiss-Prot no ID. B1XBY9; subunidad W': rpoC Gen no ID. 6058956,
UniProtKB/Swiss-Prot no ID. B1XBZ0; subunidad o: rpoE Gen no ID. 6060683, UniProtKB/Swiss-Prot no ID. B1XBQ0), que están ensambladas en un complejo de cinco subunidades aaWW'o (Lodish, Berk et al. 2008). Los elementos genómicos que participan en la regulación de la actividad enzimática están bien caracterizados, incluyendo activadores de la ARN polimerasa de E. coli (Lisser y Margalit, 1993), señales de terminación incluyendo terminadores dependientes e independientes de rho (Platt 1986; Uptain y Chamberlin, 1997), secuencias que detienen la transcripción (Lee, Phung et al. 1990).
En otra forma de realización, dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN es un dominio catalítico de una ADN-polimerasa dependiente de ARN de un orgánulo eucariótico, como las mitocondrias, cloroplastos y proplástidos. De hecho, estas polimerasas también pueden tener una estructura relativamente sencilla.
En especial, dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN es un dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN mitocondrial.
En especial, dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN puede ser el dominio catalítico de la ARN polimerasa mitocondrial de ratón, que es una proteína unitaria de 120 kDa (no ID. del gen 216151,
UniProtKB/Swiss-Prot no ID. Q8B F1), que comparte homología con las ARN polimerasas bacteriofágicas (Tiranti, Savoia et al. 1997). Se necesitan varios factores de transcripción para la iniciación, prolongación o terminación de la transcripción: TFB1M (factor B1 de transcripción mitocondrial, no ID. 224481 del gen del ratón, UniProtKB/Swiss-Prot no ID. Q8JZM0) o TFB2M (factor B2 de transcripción mitocondrial, no ID. 15278 del gen del ratón, UniProtKB/Swiss-Prot no ID. Q3TL26), TFAM (factor A de transcripción mitocondrial; no ID. 21780 del gen del ratón, UniProtKB/Swiss-Prot no ID. P40630) y mTERF (factor de terminación de la transcripción mitocondrial, no ID. 545725 del gen ratón, UniProtKB/Swiss-Prot no ID. Q8CHZ9) para la terminación de la transcripción (Fisher y Clayton 1985; Fisher, Topper et al. 1987;. Fisher y Clayton 1988; Topper y Clayton 1989; Fernández-Silva, Martínez-Azorín et al., 1997;. Prieto-Martin, Montoya et al. 2001; McCulloch, Seidel-Rogol et al. 2002). Los elementos genómicos involucrados en la regulación de la actividad enzimática de la ARN polimerasa mitocondrial están bien caracterizados, incluyendo dos activadores en las cadenas ligera y pesada del genoma mitocondrial (Ojala, Montoya et al., 1981;. Clayton 1991), así como señales de terminación de transcripción (Kruse, Narasimhan et al. 1989).
Como se emplea en la presente memoria, la expresión "ARN trifosfatasa" (RTPasa) se refiere a la enzima, que elimina el resto de fosfato y del extremo 5' del trifosfato del pre-ARNm naciente a difosfato (Furuichi y Shatkin 2000).
Como se emplea en la presente memoria, la expresión "ARN guanililtransferasa" (GTasa) se refiere a la enzima, que transfiere GMP desde GTP al terminal de ARN naciente del difosfato (Furuichi y Shatkin 2000).
Como se emplea en la presente memoria, la expresión "N7-guanina-metiltransferasa" (N7-MTasa) se refiere a la enzima, que añade un resto de metilo en el nitrógeno 7 de guanina a la caperuza GpppN (Furuichi y Shatkin 2000).
Dichos dominios catalíticos de una ARN trifosfatasa, de una guanililtransferasa, de una N7-guanina-metiltransferasa, puede ser de la misma o de diferentes enzimas que forman caperuza. Si dichos dominios catalíticos son de la misma enzima, dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN es de una enzima diferente.
Preferentemente, dichos dominios catalíticos de ARN trifosfatasa, de una guanililtransferasa, de una N7-guaninametiltransferasa son de una o varias enzimas citoplásmicas, que tienen una estructura relativamente sencilla y ventajosamente actividades enzimáticas bien caracterizados. Por lo tanto, en especial, dichos dominios catalíticos de una ARN trifosfatasa, de una guanililtransferasa, de una N7-guanina-metiltransferasa puede ser dominios catalíticos de una o varias enzimas que forma caperuza para virus, o de enzimas que forman caperuza de episomas citoplásmicos.
En una forma de realización, dichos dominios catalíticos de una ARN trifosfatasa, de una guanililtransferasa, de una N7-guanina-metiltransferasa son de una o varias enzimas que forman caperuza para virus, en especial, seleccionadas en el grupo constituido por la enzima natural que forma caperuza para el virus de la fiebre catarral ovina, la enzima natural que forma caperuza para el virus del mosaico del bambú, la enzima natural que forma caperuza para el virus de la peste porcina africana, la enzima natural que forma caperuza para el mimivirus Acanthamoeba polyphaga y los mutantes o derivados de los mismos que pueden, respectivamente, sacar el resto de fosfato y del extremo 5' trifosfato del pre-ARNm naciente a difosfato o transferir GMP desde GTP al terminal difosfato de ARN naciente o añadir un resto metilo en el nitrógeno 7 de la guanina a la caperuza GpppN, sobre todo de la enzima natural que forma caperuza para el virus de la peste porcina africana.
Tal como se emplea en la presente memoria, la expresión "enzima que forma caperuza para el virus de la fiebre catarral bovina" se refiere a la enzima que forma caperuza VP4 unitaria del virus de la fiebre catarral bovina (BTV), que es una proteína de 76 kDa (644 aminoácidos; para la secuencia, véase, por ejemplo secuencia genómica no ID. Y00421 serotipo 10 NCBI BTV; no ID. del gen 2943157; UniProtKB/Swiss-Prot no ID. P07132, D0UZ45, Q5J7C0, Q65751, Q8BA65, P33428, P33429, P33427, C3TUP7, Q8BAD5, C5IWW0, B4E551, Q3KVQ2, Q3KVQ1, Q65732, Q3KVP8, Q3KVP9, Q3KVQ0). Esta enzima que forma caperuza es probable que pueda homodimerizarse mediante la cremallera de leucina se encuentra cerca de su terminal carboxilo (Ramadevi, Rodríguez et al. 1998). VP4 catalizan las tres etapas enzimáticas necesarias para síntesis de ARNm de restricción m7GpppN: RTPasa (Martínez-Costas, Sutton et al. 1998.), GTasa (Martínez-Costas, Sutton et al. 1998; Ramadevi, Burroughs et al. 1998.). y N7-MTasa (Ramadevi, Burroughs et al. 1998).
Como se emplea en la presente memoria, la expresión "enzima que forma caperuza para el virus del mosaico del bambú" se refiere a ORF1, enzima que protege el ARNm del virus del mosaico del bambú (VMB), que es una proteína de una sola unidad de155 kDa (1365 aminoácidos; no ID. NC 001642 de la secuencia genómica cepa BaMV-0 del VMB en NCBI; no ID. 1497253 del gen; no ID. Q65005 de UniProtKB/Swiss-Prot). La proteína ORF1 tiene todas las actividades enzimáticas necesarias para generar ARNm con la caperuza m7GpppN, es decir RTPasa (Li, Shih et al. 2001;. Han, Tsai et al. 2007), GTasa y N7-MTasa (Li, Chen et al. 2001.; Li, Shih et al. 2001). Además, ORF1 tiene actividad de ARN-polimerasa dependiente de ARN, que no es obligatorio para las actividades enzimáticas híbridas según la invención y pueden suprimirse por eliminación de los restos Asp1229 Asp1210 de la enzima que protege al ARNm (Li, Cheng et al. 1998). Como se emplea en la presente memoria, la expresión "enzima que forma caperuza para el virus de la peste porcina africana" se refiere a la enzima que forma caperuza NP868R (G4R), (ASFV), que es una proteína de una sola unidad de 100 kDa (868 aminoácidos; cepa BA71V con secuencia genómica del ASFV en NCBI no ID. NC_001659; no ID. del gen 1488865; no ID. P32094 de
UniProtKB/Swiss-Prot).
Tal como se emplea en la presente memoria, la expresión "enzima que forma caperuza para el mimivirus Acanthamoeba polyphaga" se refiere a R382, (APMV), que es otra proteína de una sola unidad de 136,5 kDa (1170 aminoácidos; secuencia genómica del APMV en NCBI no ID. NC_006450; no ID. del gen 3162607; no ID. Q5UQX1 de UniProtKB/Swiss-Prot.).
En una forma de realización, dichos dominios catalíticos de una ARN trifosfatasa, de una guanililtransferasa, de una N7-guanina-metiltransferasa son de una o varias enzimas que forman caperuza para episomas citoplásmicos, como pGKL2. En concreto, dichos dominios catalíticos de una ARN trifosfatasa, de una guanililtransferasa, de una N7guanina-metiltransferasa se incluyen en la totalidad o parte de la enzima que forma caperuza para el episoma pGKL2 extracromosómico de la levadura lineal.
Los episomas lineales citoplásmicos son estructuras de ADN bicatenario, que se replican de forma estable en el citoplasma de las varias cepas de levadura (Cong, Yarrow et al. 1994). Un prototipo de episoma extracromosómico de levadura lineal, pGKL2 (13457 pb; también denominado pGK12), se ha secuenciado completamente a partir de varias cepas de levadura, incluyendo CB 2359 de Kluyveromyces lactis y F102-2 de Saccharomyces cerevisiae (Tommasino, Ricci et al. 1988.). La enzima que forma caperuza codificada por el gen ORF3 de pGKL2 de Kluyveromyces lactis (secuencia genómica pGKL2 de CB 2359 de Kluyveromyces lactis no ID. NC_010187 en NCBI; la UniProtKB/Swiss-Prot no ID. P05469) es una proteína de 594 aminoácidos (proteína de 70,6 kDa).
En una forma de realización de la enzima híbrida según la invención, por lo menos dos, en especial por lo menos tres y más especialmente un péptido de enlace puede montar, fusionar o unir directa o indirectamente todos los dominios catalíticos.
En especial, por lo menos dos, especialmente por lo menos tres y más especialmente todos los dominios catalíticos se seleccionan en el grupo constituido por:
-
un dominio catalítico de una ARN trifosfatasa,
-
un dominio catalítico de una guanililtransferasa,
-
un dominio catalítico de una N7-guanina-metiltransferasa, y
-
un dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN,
están unidos directamente o por un péptido de enlace.
El péptido de enlace tiene la ventaja de generar proteínas de fusión en la que el impedimento estérico está minimizado y se proporciona suficiente espacio para que los componentes de la proteína de fusión permanezcan en su configuración natural.
Preferentemente, por lo menos dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN está unido por un péptido de unión a por lo menos uno del dominio catalítico seleccionadodo en el grupo que consiste en:
-
dicho dominio catalítico de una ARN trifosfatasa;
-
dicho dominio catalítico de una guanililtransferasa y
-
dicho dominio catalítico de una N7-guanina-metiltransferasa.
Especialmente, el péptido de unión puede estar situado el terminal N con respecto a dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN, en especial, de una ARN polimerasa dependiente de ADN bacteriofágico seleccionada del en el grupo constituido por T7, T3 y SP6-polimerasas de ARN, y en el terminal C con respecto a dicho dominio catalítico de una ARN trifosfatasa, dicho dominio catalítico de una guanililtransferasa y dicho dominio catalítico de una N7-guanina-metiltransferasa.
En especial, el extremo del terminal N de dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN, en especial, de una ARN polimerasa dependiente de ADN bacteriofágico seleccionada del grupo constituido por T7, T3 y SP6-polimerasas de ARN, está unido por enlace covalente, en especial, por un péptido de unión, al extremo del terminal C de uno de los dominios catalíticos seleccionados del grupo que consiste en:
-
dicho dominio catalítico de una ARN trifosfatasa,
-
dicho dominio catalítico de una guanililtransferasa y
-
dicho dominio catalítico de una N7-guanina-metiltransferasa.
Dicho péptido de unión puede seleccionarse de entre el grupo constituido por:
-
péptidos de fórmula (GlymSerp)n, en la que:
o m representa un número entero de 0 a 12, en especial de 1 a 8, y más especialmente de 3 a 6 y aún más
especialmente 4;
o p representa un número entero de 0 a 6, en especial, de 0 a 5, más especialmente de 0 a 3 y más especialmente 1; y
o n representa un número entero de 0 a 30, en especial de 0 a 12, más especialmente de 0 a 8 y aún más especialmente entre 1 y 6 inclusive;
-
péptidos que constan de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC. ID. no 2, SEC. ID. no 3, SEC. ID. no 4, SEC. ID. no 5, SEC. ID. no 6, SEC. ID. no 7, SEC. ID. no 8, SEC. ID. no 9, SEC. ID. no 10, SEC. ID. no 11, SEC. ID. no 12, SEC. ID. no 13, SEC. ID. no 14, SEC. ID. no 15, SEC. ID. n° 16, SEC. ID. no 17, SEQ ID n°18.
Los péptidos enlazadores flexibles de fórmula (GlymSerp)n tienen las ventajas de que los restos de glicina confieren flexibilidad peptídica, mientras que la serina proporciona cierta solubilidad (Huston, Levinson et al. 1988). Por otra parte, la ausencia de sitios sensibles para quimotripsina I, el factor Xa, papaína, plasmina, trombina y tripsina en las secuencias enlazadoras de (GlymSerp)n se supone que aumentan la estabilidad general de las proteínas de fusión resultantes (Crasto y Feng 2000) .
Para diseñar anticuerpos de fragmentos Fv monocatenarios (sFv) se utilizan frecuentemente enlazadores (GlymSerp)n de longitudes variables (Huston, Levinson et al. 1988). Además, se han utilizado enlazadores (GlymSerp)n para generar diversas proteínas de fusión, que conservan con frecuencia las actividades biológicas de cada uno de sus componentes (Newton, Xue et al. 1996; Lieschke, Rao et al. 1997; Shao, Zhang et al. 2000; Hu, Li et al. 2004).
También se pueden considerar otros tipos de enlazadores de péptidos para generar enzimas híbridas según la invención, tales como GGGGIAPSMVGGGGS (SEC. ID. no 2) (Turner, Ritter et al. 1997), SPNGASNSGSAPDTSSAPGSQ (SEC. ID. no 3) (Hennecke, Krebber et al. 1998), EGKSSGSGSESKSTE (SEC. ID. no 4) (Bird, Hardman et al. 1988), EGKSSGSGSESKEF (SEC. ID. n° 5) (Newton, Xue et al. 1996), GGGSGGGSGGGTGGGSGGG (SEC. ID. no 6) (Robinson y Sauer, 1998), GSTSGSGKSSEGKG (SEC. ID. no 7) (Bedzyk, Weidner et al. 1990), YPRSIYIRRRHPSPSLTT (SEC. ID. no 8) (Tang, Jiang et al. 1996), GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEC. ID. no 9 ) (Whitlow, Bell et al. 1993), GSTSGSGKPGSGEGS (SEC. ID. no 10) (Ting, Kain et al. 2001), SSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDA (SEC. ID. no 11) (Pantoliano, Bird et al. 1991), GSADDAXXDAAXKDDAKKDDAKKDGS SEC. ID. no 12) (Gregoire, Lin et al. 1996), LSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDL (SEC. ID. no 13) (Pavlinkova, Beresford et al. 1999), AEAAAKEAAAKEAAAKA (SEC. ID. no 14) (Wickham, Carrion et al. 1995 ), GSHSGSGKP (SEC. ID. no 15) (Ting, Kain et al. 2001), GSTSGSGKPGSGEGSTGAGGAGSTSGSGKPSGEG (SEC. ID. no 16) (Ting 2003), LSLEVAEEIARLEAEV (SEC. ID. no 17) (Liu, Jian-Bo et al. 2005) y GTPTPTPTPTGEF (SEC. ID. no 18) (Gustavsson, Lehtio et al. 2001).
Otros tipos de enlace covalente incluyen, pero no se limitan a enlaces disulfuro (Mantile, Fuchs et al. 2000), transglutaminación (Paguirigan y Beebe 2007), así como trans-enlaces de proteínas por agentes físicos y/o químicos, por ejemplo , la reticulación por dicloruro de tris(bipiridina)rutenio (II) e iluminación con luz y ultravioleta (Fancy y Kodadek 1999).
Dichos dominios catalíticos de una ARN trifosfatasa, de una guanililtransferasa, de una N7-guanina-metiltransferasa, y de una ARN polimerasa dependiente de ADN también pueden ser ensamblados por elementos específicos de proteínas, como cremalleras de leucina, como el dominio de biotinilación a uno de los dominios catalíticos (por ejemplo, Avi-tag II (Cronan 1990) o PFB-tag (Wu, Yeung et al. 2002)) y un dominio de unión de biotina a uno de los demás dominios catalíticos (por ejemplo, Strep-tag II (Schmidt y Skerra 1993) o Nano -tag (Lamia y Erdmann 2004)) en la enzima híbrida según la invención.
En una forma de realización de la enzima híbrida según la invención, por lo menos dos de dichos dominios catalíticos se pueden ensamblar, mediante enlace no covalente, en especial mediante cremalleras de leucina.
Preferentemente, por lo menos dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN se ensambla mediante un enlace no covalente, en especial mediante cremalleras de leucina, a por lo menos uno de los dominios catalíticos seleccionado del grupo constituido por:
-
dicho dominio catalítico de una ARN trifosfatasa;
-
dicho dominio catalítico de una guanililtransferasa y
-
dicho dominio catalítico de una N7-guanina-metiltransferasa.
Las cremalleras de leucina, que son estructuras proteicas diméricas superenrolladas compuestas de dos hélices a anfipáticas que interactúan entre sí, se utilizan comúnmente para homo-o hetero-dimerizar proteínas (O'Shea, Klemm et al. 1991). Cada una de las hélices constan de repeticiones de siete aminoácidos, en las que el primer aminoácidos (resto a) amino-ácido es hidrófobo, el cuarto (resto d) es por lo general un Leucina, mientras que los demás restos son polares. Las cremalleras de leucina VELCRO ACID-p1 y BASE-p1, que forman estructuras
superenrolladas bicatenarias heterodímeras en paralelo, son muy propensas a formar heterodímeros de proteínas en paralelo (O'Shea, Lumb et al. 1993). Ellos se han utilizado para las heterodimerizar proteínas de membrana (Chang, Bao et al. 1994; Pashine, Busch et al. 2003), así como varias proteínas solubles (Busch, Reich et al. 1998;. Busch, Pashine et al. 2002).
5 También se pueden considerar otros tipos de dominios de oligomerización de péptidos para generar enzimas híbridas según la invención, para montar por lo menos dos de dichos dominios catalíticos de la enzima híbrida según la invención, especialmente cremalleras de leucina que forman estructuras heteroméricas antiparalelas, tales como las cremalleras de leucina ÁCIDO -a1/BASE-a1 (Oakley y Kim 1998), ÁCIDO-Kg/BASE-Eg (McClain, Woods et al.
10 2001), NZ/CZ (Ghosh, Hamilton et al. 2000), ÁCIDO-pLL/BASE-pLL (Lumb y Kim 1995) y EE1234L y RR1234L (Moll, Ruvinov et al. 2001). También se pueden utilizar versiones unidas por enlaces disulfuro de cremalleras de leucina para generar enzimas híbridas heterodiméricas superenrrolladas unidas por enlaces disulfuro según la invención (O'Shea, Lumb et al. 1993), así como puentes disulfuro intercatenarios entre los restos de cisteína en condiciones oxidantes ( Wells y Powers 1986).
15 Por lo menos dos de dichos dominios catalíticos de una ARN trifosfatasa, de una guanililtransferasa, de una N7guanina-metiltransferasa y de una ARN polimerasa dependiente de ADN pueden montarse por lo tanto por cremalleras de leucina, en especial, cremalleras de leucina que forman estructuras heteroméricas antiparalelas, tales como las cremalleras de leucina ÁCIDO-a1/BASE-a1 (Oakley y Kim 1998), ÁCIDO-Kg/BASE-Eg (McClain,
20 Woods et al. 2001), NZ/CZ (Ghosh, Hamilton et al. 2000), y ÁCIDO-pLL/BASE-PLL, superenrrolladas con disulfuro (O'Shea, Lumb et al. 1993), así como puentes disulfuro entre restos de cisteína (Wells y Powers 1986).
En una forma de realización, la enzima híbrida según la invención comprende:
25 − la enzima que forma caperuza para el ARNm del virus de la peste porcina africana o un mutante o un derivado del mismo, que puede añadir una caperuza m7GpppN al extremo del terminal 5' de las moléculas de ARN, en especial la enzima natural que forma caperuza para el virus de la peste porcina africana, fusionado a
− el extremo del terminal amino de la T7 ARN polimerasa natural o mutante o derivado de la misma que puede 30 sintetizar ARN complementario monocatenario en la secuencia para la plantilla de ADN bicatenario en la dirección 5' -3', en especial, la T7 ARN polimerasa natural,
en especial, mediante un enlazador, y más especialmente mediante un enlazador (Gly3Ser)4.
35 En otra forma de realización, la enzima híbrida según la invención comprende:
la enzima natural que forma caperuza para el ARNm del virus de la peste porcina africana o un mutante o un derivado del mismo, que puede añadir una caperuza m7GpppN en el extremo del terminal 5' de las moléculas de ARN, en especial la enzima natural que forma caperuza para el virus de la peste porcina africana, fusionada a
40 el extremo del terminal amino de la T3 ARN polimerasa natural o mutante o derivado de la misma que puede sintetizar ARN complementario monocatenario en secuencia a la plantilla de ADN bicatenario en el 5' - 3' dirección, en especial la T3 ARN polimerasa natural,
45 en especial, mediante un enlazador, y más especialmente mediante un enlazador (Gly3Ser)4.
En otra forma de realización, la enzima híbrida según la invención comprende:
-
la enzima natural que forma caperuza para el ARNm del virus de la peste porcina africana o un mutante o un
50 derivado del mismo, que puede añadir una caperuza m7GpppN en el extremo del terminal 5' de las moléculas de ARN, en especial de la enzima natural que forma caperuza para el virus de la peste porcina africana fusionado a
-
el extremo del terminal amino de la SP6 ARN polimerasa natural o un mutante o un derivado del mismo que
55 puede sintetizar ARN complementario monocatenario en secuencia a la plantilla de ADN bicatenario en la dirección 5' -3', en especial la SP6 ARN polimerasa natural,
en especial, mediante un enlazador, y más especialmente mediante un enlazador(Gly3Ser)4.
60 En otra forma de realización, la enzima híbrida según la invención comprende
− la enzima natural que forma caperuza para el el ARNm del virus de la peste porcina africana o un mutante o un derivado del mismo, que puede añadir una caperuza m7GpppN en el extremo del terminal 5' de las moléculas de ARN, en especial la enzima natural que forma caperuza para el virus de la peste porcina
65 africana, y
− el extremo del terminal amino de la T7 ARN polimerasa natural o mutante o derivado de la misma que puede sintetizar ARN complementario monocatenario en la secuencia para la plantilla de ADN bicatenario en la dirección 5' -3', en especial la ARN polimerasa T7 natural,
montados por cremalleras de leucina.
La enzima híbrida según la invención también puede comprender además un dominio, que aumenta la actividad de por lo menos un dominio catalítico de la enzima híbrida de la invención, en especial, de por lo menos un dominio catalítico seleccionado del grupo constituido por un dominio catalítico de una ARN trifosfatasa, un dominio catalítico de una guanililtransferasa, un dominio catalítico de una N7-guanina-metiltransferasa y un dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN.
Por ejemplo dicho dominio, que aumenta la actividad de por lo menos un dominio catalítico de la enzima híbrida de la invención, puede ser una subunidad de 31 kDa codificada por el gen D12L del virus de la vacuna (secuencia genómica no ID. NC_006998.1; gen no ID. 3707515; UniProtKB/Swiss-Prot no ID. YP_232999.1), que no tiene actividad enzimática intrínseca, pero aumenta drásticamente la actividad de la ARN N7-guanina-metiltransferasa de la subunidad D1R de la enzima que forma caperuza para el ARNm de la vacuna (Higman, Bourgeois, et al. 1992;. Higman, Christen et al. 1994; Mao y Shuman 1994).
En una forma de realización, la enzima híbrida de la invención comprende:
-
por lo menos un dominio catalítico de la enzima que forma caperuza para el ARNm de la vacuna, en especial, la subunidad de 95 kDa codificada por el gen D1R del virus de la vacuna (secuencia genómica no ID. NC 006/998.1; gen n o ID. 3707562; UniProtKB/Swiss-Prot no ID. YP_232988.1), que tiene actividades enzimáticas de ARN-trifosfatasa, ARN guanililtransferasa y ARN N7-guanina-metiltransferasa (Cong y Shuman 1993, Niles y Christen 1993, Higman y Niles 1994, Mao y Shuman 1994; Gong y Shuman 2003);
-
por lo menos un dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN, en especial, seleccionada del grupo constituido por T7, T3 y SP6- ARN polimerasas y más especialmente la T7 ARN polimerasa; y
-
una subunidad de 31 kDa codificada por el gen D12L del virus vacunal,
en especial, montado en su totalidad o en parte por un enlazador, y más especialmente por un enlazador (Gly3Ser)4 y/o por cremalleras de leucina.
La invención también se refiere a una molécula de ácido nucleico aislado o un grupo de moléculas de ácido nucleico aisladas, codificando dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico (s) una enzima híbrida según la invención.
Dicho grupo de moléculas nucleico aislado que codifica una enzima híbrida según la invención comprende o consta de todas las moléculas de ácido nucleico que son necesarias y suficientes para obtener una enzima híbrida según la invención por su expresión.
En una forma de realización, dicho grupo de moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican una enzima híbrida según la invención comprende o consiste en:
-
una molécula de ácido nucleico que codifica por lo menos un dominio catalítico de una ARN trifosfatasa, por lo menos un dominio catalítico de una guanililtransferasa y por lo menos un dominio catalítico de una N7guanina-metiltransferasa; y
-
una molécula de ácido nucleico que codifica por lo menos un dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN.
En otra forma de realización, dicho grupo de moléculas de ácido nucleico aislado que codifica una enzima híbrida según la invención comprende o consta de:
-
una molécula de ácido nucleico que codifica por lo menos un dominio catalítico de una ARN trifosfatasa,
-
una molécula de ácido nucleico que codifica por lo menos un dominio catalítico de una guanililtransferasa,
-
una molécula de ácido nucleico que codifica por lo menos un dominio catalítico de una N7-guaninametiltransferasa; y
-
una molécula de ácido nucleico que codifica por lo menos un dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN.
En especial, la molécula de ácido nucleico según la invención puede unirse funcionalmente a por lo menos uno,
preferentemente todos los activadores) seleccionado(s) de entre el grupo constituido por:
-
un activador para una ARN polimerasa dependiente de ADN eucariota, preferentemente para la ARN polimerasa II; y
-
un activador para dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN.
El enlace del ácido nucleico a un activador para una ARN dependiente de ADN polimerasa eucariota, preferentemente para la ARN polimerasa II presenta sobre todo la ventaja de que cuando la enzima híbrida de la invención se expresa en una célula anfitriona eucariota, la expresión de las enzimas híbridas es conducida por la ARN polimerasa eucariota, preferentemente la ARN polimerasa II. Estas enzimas híbridas, a su vez, puede iniciar la transcripción del transgén. Si se utilizan activadores de ARN polimerasa II específicos de tejido, la enzima híbrida de la invención se puede expresar de forma selectiva en los tejidos/células diana.
Dicho activador puede ser un activador constitutivo o un activador inducible bien conocido por un experto en la técnica. El activador puede ser regulado por el desarrollo, inducible o específico de tejido.
La invención también se refiere a un vector que comprende una molécula de ácido nucleico según la invención. Dicho vector puede ser apropiado para la expresión semiestable o estable.
La invención también se refiere a un grupo de vectores que comprenden dicho grupo de moléculas de ácido nucleico aisladas según la invención.
En especial, dicho vector según la invención es un un vector de clonación o de expresión. Los vectores pueden ser vectores víricos como bacteriófagos, o no víricos, tales como vectores plasmídicos.
En una forma de realización, dicho vector según la invención es un vector bicistrónico, que comprende en especial una molécula de ácido nucleico según la invención y un activador para dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN y/o por lo menos una secuencia de ADN de interés, en el que dicha secuencia de ADN está funcionalmente unida a un activador para dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN.
Dicho vector según la invención también puede comprender un activador para dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN.
La invención también se refiere a una célula anfitriona que comprende una molécula de ácido nucleico aislada según la invención o un grupo de moléculas de ácido nucleico aisladas según la invención o un vector según la invención o un grupo de vectores según la invención.
La célula anfitriona según la invención puede ser útil para la producción de proteínas a gran escala.
Preferentemente, dichos dominios catalíticos de la enzima híbrida ADN-polimerasa ARN polimerasa según la invención son de diferentes enzimas que las de la célula anfitriona para evitar la competencia entre la transcripción del gen endógeno y la transcripción del transgén.
La invención también se refiere a un organismo eucariota no humano transgénico, que expresa una enzima híbrida según la invención. Dicho organismo eucariota no humano puede ser de cualquier animal no humano o plantas.
La invención también se refiere a la utilización, en especial in vitro o ex vivo, de una enzima híbrida según la invención o de una molécula de ácido nucleico aislada según la invención o de un grupo de moléculas de ácido nucleico aisladas según la invención, para la producción de moléculas de ARN con caperuza m7GpppN en el terminal 5'.
La invención también se refiere a la utilización in vitro o ex vivo de una enzima híbrida según la invención o de una molécula de ácido nucleico aislada según la invención o un grupo de moléculas de ácido nucleico aisladas según la invención para la producción de proteínas, en especial proteínas de interés terapéutico como anticuerpos, especialmente en sistemas eucariotas, tales como ensayo de proteínas sintetizadas in vitro o en células cultivadas.
La invención también se refiere a un procedimiento, en especial in vitro o ex vivo, para la producción de una molécula de ARN con caperuza m7GpppN en el terminal 5' codificada por una secuencia de ADN, en una célula anfitriona, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de expresar en la célula anfitriona una molécula de ácido nucleico o un grupo de moléculas de ácido nucleico según la invención, en el que dicha secuencia de ADN está funcionalmente unida a un activador para dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN, en especial siendo dicho activador eficaz en dicha célula anfitriona.
Preferentemente, dicho dominio catalítico de la ARN dependiente de ADN-polimerasa de la enzima híbrida según la
invención es de diferentes enzimas que las de la célula anfitriona para evitar la competencia entre la transcripción del gen endógeno y dicha transcripción de la secuencia del ADN.
En especial, dicho procedimiento según la invención puede comprender además la etapa de introducir en la célula anfitriona dicha secuencia de ADN y/o el ácido nucleico según la invención, utilizando procedimientos bien conocidos por un experto en la técnica como por transfección utilizando el fosfato de calcio, por electroporación o mezclando un lípido catiónico con ADN para producir liposomas.
En una forma de realización, dicho procedimiento según la invención comprende además la etapa de inhibir, en especial silenciar (preferentemente por ARNsi) los mecanismos de transcripción y transcripción celulares de dicha célula anfitriona.
En una forma de realización, dicho método según la invención comprende además la etapa de inhibir la expresión de por lo menos una de las subunidades de la ARN polimerasa dependiente de ADN endógeno y/o de la enzima endógena que forma caperuza en dicha célula anfitriona.
Dichos etapas adicionales (es decir, la inhibición, en especial, el silenciamiento (preferentemente por ARNsi o ARNsh) de los mecanismos de la transcripción celular y tras la transcripción de dicha célula anfitriona y/o la inhibición de la expresión de una o varias subunidades de la ARN polimerasa dependiente de ADN endógeno y/o de la enzima endógena en dicha célula anfitriona) permiten la optimización de moléculas de ARN con síntesis de caperuzas m 7GpppN en el terminal 5'.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "ARN polimerasa dependiente de ADN endógeno" se refiere a la ARN polimerasa dependiente de ADN endógeno de dicha célula anfitriona. Cuando la célula anfitriona es una célula eucariota, dicha ARN polimerasa dependiente de ADN endógeno es la ARN polimerasa II.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "enzima que forma caperuza" se refiere a la enzima que forma caperuza de dicha célula anfitriona.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "inhibición de la expresión de una proteína" se refiere a una disminución de por lo menos 20%, especialmente por lo menos 35%, por lo menos 50% y más especialmente por lo menos 65%, por lo menos el 80%, por lo menos 90 % de expresión de dicha proteína. La inhibición de la expresión de la proteína puede determinarse por técnicas bien conocidas para un experto en la técnica, incluyendo pero sin limitarse a la transferencia Northern, la transferencia Western, RT-RCP.
La etapa de inhibición de la expresión de la ARN polimerasa dependiente de ADN endógeno y/o la enzima que forma caperuza en dicha célula anfitriona puede realizarse por cualquiera de las técnicas bien conocidas para un experto en la técnica, incluyendo pero sin limitarse a técnicas con ARNsi (ARN pequeño de interferencia) que se dirigen a dicha ARN polimerasa dependiente de ADN endógeno y/o la enzima que forma caperuza, técnicas con ARNsh (ARN de horquilla corta) que se dirigen dicho ARN polimerasa dependiente de ADN endógeno y/o la enzima que forma caperuza.
Además del ARNsi (o ARNsh; ARN de horquilla corta), podrían considerarse también otras secuencias inhibidoras para el mismo propósito, incluyendo ADN o ARN complementario (Liu y Carmichael, 1994; Dias y Stein 2002), ribozima cabeza de martillo (Salehi-Ashtiani y Szostak 2001), ribozima de horquilla (Lian, De Young et al. 1999) o secuencia dirigida al híbrido ARNsn complementario-Ul (Fortes, Cuevas et al. 2003). Además, pueden considerarse otros genes diana celulares para la inhibición, incluyendo otros genes implicados en la transcripción celular (por ejemplo, otras subunidades de la ARN polimerasa II o factores de transcripción), el tratamiento tras la transcripción (por ejemplo, otra subunidad de la enzima que forma caperuza, así como factores poliadenilación o espliceosomas) y vía de exportación nuclear del ARNm.
En una forma de realización del procedimiento según la invención, dicha molécula de ARN puede codificar un polipéptido de interés terapéutico.
En otra forma de realización, dicha molécula de ARN puede ser una molécula de ARN no codificado seleccionada del grupo que comprende ARNsi, ribozima, ARNsh y ARN complementario. En especial, dicha secuencia de ADN puede codificar una molécula de ARN seleccionada del grupo constituido por ARNm, ARN no codificado, especialmente ARNsi, ribozima, ARNsh y ARN complementario.
La invención también se refiere a la utilización de una enzima híbrida según la invención, tal como una enzima de de restricción y ARN polimerasa dependiente de ADN.
La invención también se refiere a un kit para la producción de una molécula de ARN de restricción m7GpppN en el terminal 5', que comprende por lo menos una enzima híbrida según la invención, y/o una molécula de ácido nucleico aislada y/o un grupo de moléculas de ácido nucleico según la invención y/o un vector según la invención y/o un grupo de vectores según la invención.
En una forma de realización, el kit de la invención comprende un vector según la invención y/o un grupo de vectores según la invención, en el que dicho(s) vector(es) que comprende(n):
− un activador para dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN, y/o
− por lo menos una secuencia de ADN de interés, en donde dicha secuencia de ADN está funcionalmente unida a un activador para dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN.
El kit según la invención puede comprender además:
− un vector que comprende un activador para dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN; y/o
− por lo menos una secuencia de ADN de interés, en el que dicha secuencia de ADN está funcionalmente unida a un activador para dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN.
La invención también se refiere a una enzima híbrida según la invención, a una molécula de ácido nucleico aislada según la invención, a un grupo de moléculas de ácido nucleico según la invención o un vector según la invención, para su utilización como medicamento, en especial para la prevención y/o tratamiento de enfermedades humanas o animales, preferentemente por medio de terapia génica.
La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende una enzima híbrida según la invención, y/o a una molécula de ácido nucleico aislada según la invención y/o a un grupo de moléculas de ácido nucleico según la invención, y/o a un vector según la invención. Preferentemente, dicha composición farmacéutica según la invención se formula en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos por un experto en la técnica.
La composición farmacéutica según la invención puede comprender además:
-
por lo menos una secuencia de ADN de interés, en el que dicha secuencia de ADN está unida funcionalmente a un activador para dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN.
Dichos componentes (en especial, seleccionados del grupo constituido por una enzima híbrida según la invención, de una molécula de ácido nucleico aislada según la invención, de un grupo de moléculas de ácido nucleico aisladas según la invención, de un vector según la invención, de un grupo del vector(es) según la invención y por lo menos una secuencia de ADN de interés) puede estar presente en la composición farmacéutica o medicamento según la invención en una cantidad terapéuticamente (activa y en cantidad no tóxica).
Dicha cantidad terapéuticamente puede ser determinada por un experto en la técnica mediante análisis de rutina, incluyendo la evaluación del efecto de la administración de dichos componentes en las enfermedades y/o trastornos que se buscan para ser prevenidas y/o tratadas mediante la administración de dicha composición farmacéutica o medicamento según la invención.
Por ejemplo, dichas pruebas pueden ser realizarse analizando tanto el efecto cuantitativo como cualitativo de la administración de diferentes cantidades de dichos componentes anteriormente mencionados (en especial, seleccionados del grupo constituido por una enzima híbrida según la invención, una molécula de ácido nucleico aislada según la invención, un grupo de moléculas aisladas según la invención, un vector según la invención, un grupo de vectores según la invención y por lo menos una secuencia de ADN de interés) en un conjunto de marcadores (biológicos y/o clínicos) característicos de los dichas enfermedades y/o de dichos trastornos, en especial, a partir de una muestra biológica de un paciente.
La invención también se refiere a un método terapéutico que comprende la administración de una enzima híbrida según la invención, y/o una molécula de ácido nucleico aislada según la invención, y/o un grupo de moléculas de ácido nucleico según la invención y/o un vector según la invención y/o un grupo de vectores según la invención en una cantidad terapéuticamente a un paciente en necesidad del mismo. El método terapéutico según la invención puede comprender además la administración de por lo menos una secuencia de ADN de interés, en el que dicha secuencia de ADN está unida funcionalmente a un activador por dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN, en una cantidad terapéuticamente a un paciente en necesidad de la misma.
Dicha enzima híbrida, molécula de ácido nucleico y/o dicho vector según la invención puede administrarse simultáneamente, por separado o sucesivamente de dicha secuencia de ADN de interés, en especial, antes de dicha secuencia de ADN de interés.
La invención se refiere también a una composición farmacéutica según la invención para su utilización para la
prevención y/o tratamiento de enfermedades humanas o animales, en especial por medio de la terapia génica.
Dichas enfermedades se pueden seleccionar del grupo constituido por enfermedades, que puede mejorada por la administración de por lo menos dicha secuencia de ADN de interés.
La invención también se refiere a la utilización de una enzima híbrida según la invención, y/o de una molécula de ácido nucleico aislada según la invención, y/o de un grupo de moléculas de ácido nucleico según la invención y/o de un vector según la invención, y/o de un grupo de vectores según la invención para la preparación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de enfermedades humanas o animales, en especial por medio de la terapia génica.
La invención también se refiere a un producto de combinación, que comprende:
− por lo menos una enzima según la invención y/o por lo menos una molécula de ácido nucleico según la invención y/o un grupo de moléculas de ácido nucleico según la invención y/o por lo menos un vector que comprende y/o expresa una molécula de ácido nucleico según la invención y/o un grupo de moléculas de ácido nucleico según la invención; y
− por lo menos una secuencia de ADN de interés, en el que dicha secuencia de ADN está funcionalmente unida a un activador por dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN;
para la administración simultánea, por separado o sucesiva.
Dicha secuencia de ADN de interés puede ser un anti-oncogén (un gen supresor de tumores).
Dicha secuencia de ADN de interés puede codificar un polipéptido de interés terapéutico o un ARN no codificado seleccionados en el grupo que comprende ARNsi, ribozima, ARNsh y ARN complementario.
Dicho polipéptido de interés terapéutico se puede seleccionar de entre, una citocina, una célula o receptor nuclear, un ligando, un factor de coagulación, la proteína CFTR, la insulina, la distrofina, una hormona de crecimiento, una enzima, un inhibidor enzimático, un polipéptido que tiene un efecto antineoplásico, un polipéptido que puede inhibir una infección bacteriana, parasitaria o vírica, en especial el VIH, una infección, un anticuerpo, una toxina, una inmunotoxina, una subunidad de ARN polimerasa II (en especial, la subunidad Rpb1 de ARN polimerasa II, que puede ser inhibida por la toxina a-amanitina) y un marcador.
Preferentemente, el producto de combinación según la invención puede formularse en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En una forma de realización del producto de combinación según la invención, dicho vector se administra antes de dicha secuencia de ADN de interés.
La invención también se refiere a un producto de combinación según la invención, para su utilización para la prevención y/o tratamiento de enfermedades humanas o animales, en especial mediante la terapia génica.
Dichas enfermedades se pueden seleccionar del grupo constituido por enfermedades, que pueden mejorarse mediante la administración de por lo menos una secuencia de ADN de interés, como se describió anteriormente.
Por ejemplo, dichas enfermedades, así como sus subtipos clínicos, biológicos o genéticos, se puede seleccionar del grupo que comprende tipos de cáncer y su predisposición (especialmente cánceres de mama y colorrectal, melanoma), hemopatías malignas (en especial leucemias, linfomas de Hodgkin y no hodgkinianos, linfomas, mieloma), trastornos de la coagulación y hemostasia primaria, hemoglobinopatías (anemia depranocítica y especialmente talasemias), trastornos autoinmunitarios (incluyendo el lupus eritematoso diseminado y la esclerodermia), las enfermedades cardiovasculares (en especial, trastornos del ritmo cardíaco y de la conducción, y la miocardiopatía hipertrófica), trastornos metabólicos (especialmente diabetes mellitus de tipo I y tipo II y sus complicaciones, dislipidemia, aterosclerosis y sus complicaciones, mucopolisacaridosis, enfermedades de almacenamiento de glucógeno, fenilcetonuria), trastornos infecciosos (incluyendo el SIDA, hepatitis vírica B, hepatitis vírica C, la gripe y otras enfermedades víricas; botulismo, tétanos y otros trastornos bacterianos; el paludismo y otras enfermedades parasitarias), trastornos musculares (incluyendo la distrofia muscular de Duchenne y la distrofia muscular miotónica de Steinert), enfermedades respiratorias (especialmente la fibrosis quística y la carencia de antitripsina a-1), enfermedades renales (especialmente la enfermedad renal poliquística), las enfermedades hepáticas (incluyendo la cirrosis, la enfermedad de Wilson, la hepatotoxicidad debida a la a-amanitina, hepatotoxicidad relacionada con los fármacos), trastornos colorrectales (incluyendo la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa), trastornos oculares especialmente enfermedades retinianas (especialmente la amaurosis de Leber, la retinitis pigmentosa, la degeneración macular por la edad), trastornos del sistema nervioso central (especialmente la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, la esclerosis múltiple, la enfermedad de Huntington, la neurofibromatosis, la adrenoleucodistrofia, la enfermedad bipolar, la esquizofrenia y el autismo), y trastornos de la
piel y del tejido conjuntivo (especialmente el síndrome de Marfan y la psoriasis).
En una forma de realización, el producto de combinación de la invención comprende:
− por lo menos un vector que comprende y expresa una molécula de ácido nucleico según la invención y/o un grupo de moléculas de ácido nucleico según la invención, en el que dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN es un dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN bacteriofágico, en especial de una de ARN polimerasa dependiente de ADN de bacteriófagoT7; y
− por lo menos una secuencia de ADN de interés, en el que dicha secuencia de ADN está funcionalmente unida a un activador por dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN bacteriofágico, en especial de una ARN polimerasa dependiente de ADN de bacteriófago T7, en la que dicha secuencia de ADN de interés codifica la subunidad Rpb de ARN polimerasa II, que puede ser inhibida por la toxina a-amanitina.
La invención también se refiere a este producto de combinación para su utilización para la prevención y/o tratamiento de la hepatotoxicidad humana o animal debida a la a-amanitina, por medio de terapia génica.
La invención también se refiere a un procedimiento para producir la enzima híbrida según la invención que comprende la etapa de expresar en por lo menos una célula anfitriona dicha molécula de ácido nucleico o dicho grupo de moléculas de ácido nucleico que codifican la enzima híbrida de la invención en condiciones que permiten la expresión de dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico en dicha célula anfitriona.
La invención también se refiere a un procedimiento para producir la enzima híbrida según la invención comprende las etapas siguientes:
-
expresión de una parte de dicho grupo de moléculas de ácido nucleico que codifica una enzima híbrida de la invención en una primera célula anfitriona en condiciones que permiten la expresión de dichas moléculas de ácido nucleico en dicha célula anfitriona, para obtener una primera parte de la enzima híbrida de la invención;
-
expresión de la otra parte de dicho grupo de moléculas de ácido nucleico que codifica la enzima híbrida de la invención en una segunda célula anfitriona en condiciones que permiten la expresión de dichas moléculas de ácido nucleico en dicha célula anfitriona para obtener una segunda parte de la enzima híbrida de la invención; y
-
montaje de dicha primera parte y dicha segunda parte para obtener la enzima híbrida de la invención.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 representa un ensayo de expresión del gen indicador de luciferasa de luciérnaga, que se utilizó para controlar los rendimientos de traducción desencadenados por una enzima híbrida según la invención, la NP868R-T7ARNP. Los plásmidos pNP868R-T7ARNP o pT7ARNP se co-transfectaron con el plásmido de luciferasa pT7p en las células humanas HEK-293 cultivadas. La expresión de las enzimas NP868R-T7ARNP y T7ARNP es conducida por el activador del CMV dependiente de ARN polimerasa II de los plásmidos correspondientes. Las enzimas NP868R-T7ARNP y T7ARNP, a su vez, cabe esperar que inicien la transcripción en el activador T7 del plásmido pT7p-gen indicador de luciferasa. Si las actividades enzimáticas tanto de la caperuza del ARNm como de ARNP dependiente del ADN de las enzimas NP868R-T7ARNP se conservan, deben sintetizarse ARNm de luciferasa con estructuras de caperuza m7GpppGm, que se pueden traducir en la proteína luciferasa de luciérnaga y detectarse por análisis de luminiscencia celular. Por el contrario, cabe esperar que la enzima T7ARNP sintetice moléculas de ARN sin caperuza m7GpppN en el terminal 5', que por consiguiente están mal traducidas.
La figura 2 (A-B) representa las cartografías físicas de los plásmidos pNP868R-T7ARNP y pT7ARNP. Las cartografías físicas de (A) plásmido pT7ARNP, que codifica la T7 ARN polimerasa dependiente de ADN bacteriofágico natural, (B) plásmidos pNP868R-T7ARNP, que codifican una fusión entre las enzimas NP868R que forman caperuza para contra el ARNm (virus de la peste porcina africana) y la T7 ARN polimerasa dependiente de ADN bacteriofágico natural (bacteriófago T7), mediante un enlazador flexible (Gly3Ser)4. Estos dos plásmidos tienen el mismo diseño: activador de CMV, secuencia Kozak seguida de los marcos abiertos de lectura (ORF) de NP868R-T7ARNP o T7ARNP, señal de poli[A], terminador Te de la transcripción de la ARN polimerasa del bacteriófago, y la señal de poliadenilación de SV40.
La figura 3 (A-C) representa las cartografías físicas de los plásmidos deL gen indicador de luciferasa de luciérnaga.
(A) pT7p-Luciferasa: se diseñó para ensayar la actividad de las enzimas NP868R-T7ARNP y la T7ARNP. Consta de una serie de activadores de ARN polimerasa (activadores ARNP de los bacteriófagos T7, T3 y SP6, seguido del activador ribosómico rrnDl de E. coli), una secuencia de operador Lac, todo el ORF de la luciferasa de luciérnaga, señal de poli[A], una secuencia que codifica la ribozima de la hepatitis D para la autoescisión del ARN y el terminador Te en el eje central de pET-22b(+), (B) pT7p-Luciferasa digerido con BamHI: en el que se interrumpe la conexión física entre el ORF de la luciferasa y la serie de activadores por la digestión con enzimas que forman
caperuza. Este plásmido se utilizó como referencia negativa. Las flechas indican los puntos de digestión. (C) pCMV-Luciferasa: en la que todo el ORF de la luciferasa de luciérnaga está bajo el control del activador de CMV. Este plásmido se utiliza como un comparador positivo.
La figura 4 (A-C) muestra la expresión del gen indicador de luciferasa de luciérnaga después de transfección del plásmido en las células HEK-293. Las células HEK-293 se cultivaron y transfectaron como se describió anteriormente. Las células se transfectaron ya sea con el pNP868R-T7ARNP o los plásmidos pT7ARNP (0,4 Ig de ADN/pocillo y 1Il/pocillo de Lipofectamina 2000), y/o el pT7p-luciferasa, pT7p-luciferasa digerido con BamHI, o pCMV-T7ARNP (0,4 Ig de ADN/pocillo y 1 Il/pocillo de Lipofectamina 2000) o ninguno. La luminiscencia de la luciferasa de luciérnaga se ensayó en los tiempos puntuales seleccionados utilizando el Luciferase Assay System (Promega, Madison WI, EE.UU.). Para normalizar la eficiencia de transfección, las células se transfectaron también con el plásmido pORF-eSEAP, que codifica la fosfatasa alcalina placentaria segregada (SEAP) que se ensayó en medio de cultivo celular utilizando el kit de ensayo enzimático colorimétrico Quanti-azul (InvivoGen, San Diego, CA). La expresión del gen indicador se expresó como la luminiscencia de luciferasa en las células estudiadas restada de la luminiscencia en las células tratadas sólo con el reactivo de transfección (URL; unidades relativas de luz), a continuación, dividida por la relación de absorbancia de SEAP (DO, densidad óptica). Se realizaron dos repeticiones independientes de este experimento. Las barras de desviaciones representan la desviación estándar de la media (SEM). Se realizaron análisis estadísticos utilizando la preba de la t de Student de dos colas. (A) Expresión del gen indicador de luciferasa de luciérnaga en pNP868R-T7ARNP/pT7p-Luciferasa, las células transfectadas con pT7ARNP/pT7p-Luciferasa y pCMV-luciferasa. Células transfectadas con el pNP868R-T7ARNP/pT7p-Luciferasa y los plásmidos pCMV-Luciferasa presentan señales 23 y 33 veces mayores que las células transfectadas junto con pT7ARNP/pT7p-Luciferasa, respectivamente (*p<0,05). (B) Expresión del gen indicador de luciferasa de luciérnaga para las células transfectadas con pT7ARNP/pT7p-Luciferasa, pT7p-luciferasa digerido con pT7ARNP/BamHI (*p<0,05) y otras condiciones de referencia (pT7ARNP solo, pT7p-luciferasa digerido o no solo, o sólo reactivo de transfección). (C) Expresión del gen indicador de luciferasa de luciérnaga para el pNP868R-T7ARNP/pT7p-Luciferasa, pNP868R-T7ARNP/pT7p-luciferasa digeridos con BamHI (*p<0,05) y otras condiciones de referencia (pNP868R-T7ARNP solo, pT7p-luciferasa digerido o no solo, o sólo reactivo de transfección).
La figura 5 (A-C) representa la expresión del gen indicador de luciferasa de luciérnaga de células HEK-293 transfectadas tratadas con a-amanitina. (A) Diagrama esquemático del ensayo. Para el plásmido pCMV-luciferasa (la expresión de la luciferasa es conducida por el activador de CMV dependiente de ARN polimerasa II), se añadió aamanitina al medio celular (a 0 o 20Ig/ml) al mismo tiempo a la transfección celular. Para los plásmidos pNP868RT7ARNP/pT7p-Luciferasa, una primera transfección con el plásmido pNP868R-T7ARNP (la expresión de NP868R-T7ARNP es conducida por el activador de CMV dependiente de ARN polimerasa II) se llevó a cabo 24 horas antes de la adición de a-amanitina al medio celular (en concentraciones que oscilan entre 0 y 20Ig/ml) y una segunda transfección con el plásmido pT7p-luciferasa. Se realizaron dos repeticiones de estos experimentos. Las barras de desviaciones representan la desviación estándar de la media (SEM). El análisis estadístico se realizó como se describió anteriormente. (B) a-amanitina suprimió casi completamente la expresión del gen indicador de luciferasa de las células transfectadas con el plásmido pCMV-luciferasa; *p<0,05) (C) a-amanitina activó sólo una leve disminución de la señal de la expresión de luciferasa en las células transfectadas con los plásmidos pNP868RT7ARNP/pT7p-luciferasa (*p<0,05), lo que por consiguiente, sugieren que la transcripción por la enzima NP868R-T7ARNP es dependiente de su resto T7 ARN polimerasa dependiente de ADN bacteriofágico.
La figura 6 (A-C) representa ensayos de viabilidad celular, citotoxicidad y apoptosis de las células HEK-293 transfectadas. Las células se cultivaron y transfectaron como anteriormente con los plásmidos pNP868R-pT7ARNP
o T7ARNP. La viabilidad celular, citotoxicidad y apoptosis se evaluaron en los tiempos puntuales seleccionados utilizando el ensayo ApoTox-Glo Triplex. Se realizaron dos repeticiones de este experimento. Las barras de desviaciones representan la desviación estándar de la media (SEM). Los niveles de viabilidad celular, citotoxicidad y apoptosis se expresaron como la señal de luminiscencia/fluorescencia en las células estudiadas restada de luminiscencia/fluorescencia en las células no tratadas. El análisis estadístico se realizó como anteriormente. El reactivo de transfección (es decir, Lipofectamina 2000), con o sin ADN plásmido, perjudica la viabilidad celular, la citotoxicidad y la apoptosis. Sin embargo, no se observó ninguna diferencia estadísticamente significativa entre las células transfectadas con el plásmido pNP868R-y el plásmido T7ARNP para (A) los niveles de viabilidad celular, en todos los tiempos puntuales, excepto en el día 1 (prueba de la t de Student de dos colas, *p<0,05 ), (B) niveles de citotoxicidad en todos los tiempos puntuales, o (C) niveles de apoptosis en todos los tiempos puntuales.
La figura 7 (A-D) representa las cartografías físicas de los plásmidos utilizados para las enzimas monoméricas NP868R-T3ARNP e híbridas NP868R-SP6ARNP. Cartografías físicas de: (A) plásmido pT3ARNP, que codifica el T3 ARN polimerasa dependiente de ADN bacteriofágico, (B) plásmido pSP6 ARNP, que codifica la SP6 ARN polimerasa dependiente de ADN bacteriofágico, (C) plásmido pNP868R-T3ARNP, que codifica una fusión entre la enzima que forma caperuza para el ARNm del virus de la fiebre porcina africana NP868R y la T3 ARN polimerasa dependiente del ADN bacteriofágico, mediante enlazador (Gly3Ser)4 flexible, (D) plásmido pNP868R-SP6ARNP, que codifica una fusión entre la enzima que forma caperuza para el ARNm del virus de la peste porcina africana NP868R y la SP6 ARN polimerasa dependiente del ADN bacteriofágico, mediante el enlazador (Gly3Ser)4 flexible. Estos dos plásmidos tienen el mismo diseño: activador de CMV, secuencia de Kozak seguida por los ORF, señal de poli[A], terminador Te para la transcripción de ARN polimerasa bacteriofágica y señal de poliadenilación de SV40.
La figura 8 representa la expresión del gen indicador de la luciferasa por las enzimas monomérica NP868R-T3ARNP e híbrida NP868R-SP6ARNP. La transfección y el ensayo de luciferasa se realizaron como se describió anteriormente. La expresión del gen indicador se expresó como la luminiscencia de la luciferasa en las células estudiadas restada de la luminiscencia en las células tratadas sólo con el reactivo de transfección (ULR, unidades relativas de luz), dividida a continuación por la relación de absorbancia de SEAP (DO, densidad óptica). Se realizaron cuatro repeticiones de este experimento. Las barras de desviaciones representan la desviación estándar de la media (SEM).
La figura 9 (A-C) representa la estructura esquemática de enzimas híbridas heterodimérica y heterotrimérica. (A) Enzima heterodimérica RR1234L-NP868R/EE1234L-T7ARNP. Se añadieron las cremalleras de leucina EE1234L (ácida) y RR1234L (básica) a los extremos de los terminales amino de NP868R y T7 ARN polimerasa, respectivamente, que interactúan para formar un heterodímero; (B) Enzima heterodimérica D12L/D1R-T7ARNP CCPP. La subunidad D1R de la enzima que forma caperuza para el ARNm del virus vacunal se fusiona con el extremo del terminal amino de la T7 ARN polimerasa de una sola unidad. Cuando se expresó junto con la subunidad D12L de la enzima que forma caperuza para el ARNm, D1R-T7ARNP forma un heterodímero denominado D12L/D1R-T7ARNP. Para simplificar, no se muestra el otro montaje, es decir, la enzima híbrida D1R/D12L-T7ARNP; (C) enzima híbrida heterotrimérica D12L/RR1234L-D1R/EE1234L-T7ARNP. Las cremalleras de leucina EE1234L (ácida) y RR1234L (básica) se añadieron a los extremos de los terminales amino de D1R y T7 ARN polimerasa, respectivamente. La coexpresión de RR1234L-D1R junto con EE1234L-T7ARNP y la subunidad D12L de la enzima que forma caperuza para el ARNm del virus vacunal forman un heterotrímero. Para simplificar, no se muestra el otro montaje, es decir, la enzima híbrida D1R/RR1234L-D12L/EE1234L-T7ARNP. Las flechas abiertas indican la unión de la cremallera de leucina en orientación antiparalela. Las flechas negras indican otros tipos de interacción de proteínas.
La figura 10 (A-H) representa cartografías físicas de los plásmidos utilizados para enzimas híbridas heterodiméricas y heterotriméricas. Cartografías físicas de (A) plásmido pD1R, que codifica D1R, la subunidad grande de la enzima que forma caperuza para el ARNm de la vacuna, (B) plásmido pD12L, que codifica el D12L, la pequeña subunidad de la enzima que forma caperuza para el ARNm de la vacuna, (C) plásmido pRR1234L -NP868R, que codifica la la cremallera de leucina RR1234L fusionada al extremo del terminal amino de NP868R, la enzima que forma caperuza para el ARNm del virus de la peste porcina africana, (D) plásmido pRR1234L-DLR, que codifica la cremallera de leucina RR1234L fusionado con la extremo del terminal amino de D1R, la subunidad grande de la enzima que forma caperuza para ARNm de la vacuna, (E) plásmido pRR1234L-D12L, que codifica la de cremallera de leucina RR1234L fusionado al extremo del terminal amino de D12L, la subunidad pequeña de la enzima que forma caperuza para el ARNm de la vacuna, (F) plásmido pEE1234L-T7ARN, que codifica la cremallera de leucina pEE1234L fusionado a la T7 ARN polimerasa dependiente del ADN bacteriofágico, (G) plásmido pD1R-T7ARNP, que codifica una fusión entre la subunidad grande de la enzima que forma caperuza para el ARNm de la vacuna y la T7 ARN polimerasa dependiente del ADN bacteriofágico, mediante el enlazador (Gly3Ser)4 flexible, (H) plásmido pD12L-T7ARNP, que codifica una fusión entre la subunidad pequeña de la enzima que forma caperuza para el ARNm de la vacuna y T7 ARN polimerasa dependiente de ADN bacteriofágico, mediante el enlazador (Gly3Ser)4 flexible. Todos estos plásmidos tienen el mismo diseño: activador de CMV, secuencia de Kozak seguida de los ORFs, señal de poli[A], terminador Te para la transcripción de ARN polimerasa bacteriofágica, y señal de poliadenilación de SV40.
La figura 11 representa la expresión del gen indicador de luciferasa para las enzimas híbridas heterodiméricas RR1234L-NP868R/EE1234L-T7ARNP. Las células HEK-293 se cultivaron y transfectaron como se describió anteriormente. Las células se transfectaron ya sea con los plásmidos correspondientes (0,4 Ig de ADN/pocillo y 1 Il/pocillo de lipofectamina 2000) y pT7p-luciferasa, o pCMV-T7ARNP 0,4 Ig de ADN/pocillo y 1 Il/pocillo de lipofectamina 2000).La expresión del gen indicador se expresa como la luminiscencia de luciferasa en las células estudiadas restada de la luminiscencia en las células tratadas sólo con el reactivo de transfección (ULR, unidades relativas de luz), dividida a continuación por la relación de absorbancia de SEAP (DO, densidad óptica). Se realizaron cuatro repeticiones de este experimento. Las barras de desviaciones representan la desviación estándar de la media (SEM).
La figura 12 representa la expresión del gen indicador de luciferasa por las enzimas heterodimérica D1R/D12L-T7ARNP e híbrida D12L/D1R-T7ARNP. La transfección y ensayo con luciferasa se realizaron como se describió anteriormente. La expresión del gen indicador se expresa como la luminiscencia de la luciferasa en las células estudiadas restada de la luminiscencia en las células tratadas sólo con el reactivo de transfección (ULR, unidades relativas de luz), dividida a continuación,por la relación de absorbancia de SEAP (DO, densidad óptica). Se realizaron dos repeticiones de este experimento. Las barras de desviaciones representan la desviación estándar de la media (SEM).
La figura 13 representa la expresión del gen indicador de la luciferasa por las enzimas heterotrimérica D1R/RR1234L-D12L/EE1234L-T7ARNP e híbrida D12L/RR1234L-DlR/EE1234-T7ARNP. La transfección y el ensayo con luciferasa se realizaron como se describió anteriormente. La expresión del gen indicador se expresó como la luminiscencia de la luciferasa en las células estudiadas restada de la luminiscencia en las células tratadas sólo con el reactivo de transfección (ULR, unidades relativas de luz), dividida a continuación por la relación de absorbancia de SEAP (DO, densidad óptica). Se realizaron dos repeticiones de este experimento. Las barras de desviaciones representan la
desviación estándar de la media (SEM).
La figura 14 representa la expresión del gen indicador de la luciferasa por las enzimas híbridas monoméricas NP868R-SP6ARNP en presencia de los ARNsi conducidos a la subunidad grande de la ARN polimerasa II (POL2AR) o la enzima que forma caperuza humana (RNGTT). La transfección y el ensayo con luciferasa se realizaron como se describió anteriormente, excepto que los ARNsi a una concentración final 25 nM se añadieron al reactivo de transfección. Los ARNsi SI04364381, SI04369344, SI04250162 y SI04354420 se dirigieron al gen POLR2A, mientras que los ARNsi SI00055986, SI03021508, SI00055972 y SI00055979 se dirigieron a RNGTT. La expresión del gen indicador se expresó como la luminiscencia de la luciferasa en las células estudiadas restada de la luminiscencia en las células tratadas sólo con el reactivo de transfección (ULR, unidades relativas de luz), a continuación, dividida por la relación de absorbancia de SEAP (DO, densidad óptica). Se realizaron dos repeticiones de este experimento. Las barras de desviaciones representan la desviación estándar de la media (SEM).
La figura 15 representa la actividad del efecto de la dosis de los ARNsi conducidos a la subunidad grande de la ARN polimerasa II (POL2AR) y la enzima que forma caperuza humana (RNGTT). La transfección y ensayo de luciferasa se realizaron como se describió anteriormente, excepto que los ARNsi se añadieron a una concentración que oscila entre 0 y 100 nM para el reactivo de transfección. Los ARNsi SI04369344 y SI00055972 se dirigieron a los genes POLR2A y RNGTT, respectivamente. La expresión del gen indicador se expresa como la luminiscencia de la luciferasa en las células estudiadas restada de la luminiscencia en las células tratadas sólo con el reactivo de transfección (ULR, unidades relativas de luz), a continuación, dividida por la relación de absorbancia de SEAP (DO, densidad óptica). Se realizaron tres repeticiones de este experimento. Las barras de desviaciones representan la desviación estándar de la media (SEM).
La presente invención se explicará con detalle con ejemplos a continuación, pero el alcance técnico de la presente invención no se limita a estos ejemplos.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Ejemplo de enzima híbrida monomérica activa NP868R-T7ARNP
I. Plásmidos
Se ha sintetizado un plásmido, que codifica las fusiones entre NP868R, la enzima que forma caperuza para el ARNm del virus de la peste porcina africana, y la ARN polimerasa dependiente del ADN bacteriofágico natural del bacteriófago T7. La enzima que forma caperuza se fusionó al extremo del terminal amino de la T7 ARN polimerasa mediante un enlazador (Gly3Ser)4. El plásmido pNP868R-T7ARNP se utilizó para evaluar la actividad de la enzima codificada por un ensayo de expresión del gen indicador de luciferasa de luciérnaga (figura 1). En resumen, los plásmidos pNP868R-T7ARNP y pT7p-luciferasa se co-transfectaron en las células HEK-293 humanas cultivadas. La expresión de la enzima NP868R-T7ARNP es conducida por el activador de CMV dependiente de la ARN polimerasa II del plásmido correspondiente. La enzima NP868R-T7ARNP, a su vez, cabe esperar que inicie la transcripción del plásmido pT7p-luciferasa en su activador T7. Si se conservan ambas actividades enzimáticas de la enzima NP868R-T7ARNP que forma caperuza para el ARNm y ARNP dependiente del ADN, el ARNm de luciferasa que tiene estructuras con caperuza m7GpppGm deben sintetizarse, que a su vez puede traducirse en la proteína luciferasa de luciérnaga y detectarse por el ensayo de luminiscencia celular. Además, el plásmido pNP868R-T7ARNP se utilizó para investigar la distribución celular de la enzima, así como la viabilidad celular, la citotoxicidad y la apoptosis relacionada con la expresión de la enzima en las células HEK-293.
El plásmido que codifica las enzimas NP868R-T7ARNP y T7ARNP (T7 ARN polimerasa) se sintetizó en cuatro etapas por AG GeneArt (Regensburg, Alemania). La secuencia de la proteína codificada por plásmido pT7ARN corresponde a la SEC. ID. no 19. La secuencia de la proteína codificada por el plásmido pNP868R-T7ARNP corresponde a la SEC. ID. no 20. En primer lugar, un fragmento de ADN que contiene el activador de la T7 ARN polimerasa y el sitio de clonación múltiple (MCS) se retiró del plásmido pCMV-Script (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.). En segundo lugar, se introdujo un casete en el plásmido entre su activador de CMV y la señal de poliadenilación de SV40 pCMV-Script. Este casete constaba de la estructura en horquilla del operador Lac (Gilbert y Maxam 1973), un MCS, un poly[A]-tract, y una señal de terminador en horquilla Te de clase I (Lyakhov, He et al. 1997). En tercer lugar, la secuencia de consenso de Kozak para el inicio de la traducción (Kozak, 1987), seguido por el marco de lectura abierto (ORF) completo de las enzimas NP868R-T7ARNP o T7ARNP se montaron en oligonucleótidos sintéticos utilizando un procedimiento basado en la RCP, se clonaron y se verificó toda la secuencia. El ORF de la NP868R-T7ARNP (SEC. ID. no 21) y de la ORF de la T7ARNP (SEC. ID. no 22) se optimizaron alterando la utilización de codones preferidos, eliminando los elementos que actúan en cis tales como sitios de corte y empalme crípticos y señales de poli(A), así como mejorando la estabilidad del ARNm por eliminación de repeticiones directas y elementos con estructura secundaria. En cuarto lugar, la totalidad de los ORFs de cada NP868R-T7ARNP o T7ARNP se subclonaron en el MCS del casete, dando como resultado el plásmido pNP868R-T7ARNP y el plásmido pT7ARNP. Como consecuencia de la estrategia de construcción, se añadieron dos aminoácidos adicionales (Glu, Phe) inmediatamente corriente abajo al ATG de la secuencia de Kozak, se añadieron otros dos inmediatamente corriente arriba del enlazador (Gly3Ser)4 (Gly, Pro), y dos inmediatamente corriente abajo
de este enlazador (Leu, Glu) de la enzima NP868R-T7ARNP. Por último, los plásmidos pNP868R-T7ARNP y pT7ARNP tenían el siguiente diseño (figuras 2A y 2B): activador de CMV, secuencia de Kozak seguido por los ORF de NP868R-T7ARNP o T7ARNP, señal de poli[A], terminador Te para la transcripción de ARN polimerasa bacteriofágica y la señal de poliadenilación de SV40.
En Eurofins/MWT/Operon (Ebersberg, Alemania) se sintetizarondos plásmidos que codifican el gen indicador de luciferasa de luciérnaga. El plásmido pET-22b(+)ARNPp-luciferasa (denominado pT7p-luciferasa en lo sucesivo) se diseñó para ensayar la actividad de la enzima híbrida según la invención. Una secuencia de prueba se introdujo en el eje central del pET-22b(+) (Novagen, San Diego, CA, EE.UU.), que consistía en una serie de activadores de ARN polimerasa (activadores de ARNP de los bacteriófagos T7, T3 y SP6, seguido por el activador ribosómico rrnDl de E. coli), una secuencia con estructura en horquilla del operador Lac, toda la ORF de la luciferasa de luciérnaga, un señal de poli[A], una secuencia que codifica la ribozima de la hepatitis D para autoescisión del ARN (Conzelmann y Schnell 1994; Garcin, Pelet et al., 1995; Bridgen y Elliott 1996; Schurer, Lang et al. 2002;. Walker, Avis et al. 2003) y el terminador Te para la transcripción de la ARN polimerasa del bacteriófago (figura 3A). Una versión del plásmido pT7p-Luciferasa digerida con BamHI, que interrumpe la conexión física entre la ORF de luciferasa y el activador de T7, se utilizó también como referencia negativa (figura 3B). Por otra parte, el plásmido pCMV-luciferasa, que se utilizó como comparador activo, contenía luciferasa de luciérnaga corriente abajo al activador de CMV dependiente de ARN polimerasa II del plásmido pCMV-Script (figura 3C).
II. Cultivo celular y transfección
Células 293 de riñón embrionario humano (HEK-293, ATCC CRL 1573) se cultivaron a 37°C con 5% de CO2. Las células se mantuvieron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) enriquecido con L-alanil-L-glutamina 3,97 mM (sustituida en base equivalente molar de L-glutamina), 10% de suero bovino fetal (FBS), 1% de aminoácidos no esenciales, 1% de penicilina y estreptomicina y 0,2% de fungizona.
El día antes de la transfección, se sembraron células HEK-293 en placas de 24 pocillos a densidades de aproximadamente 8 x 104 células por pocillo. Una hora antes de la transfección, el medio se cambió a medio completo fresco sin antibióticos. Se realizaron transfecciones con Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) según las recomendaciones del fabricante. En resumen, ADN plásmido, diluido en medio de suero reducido con Opti-MEM I (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y mezclado con Lipofectamina 2000, se añadió al medio celular. Después de la transfección, las células se incubaron hasta 120 horas antes de la prueba para la expresión del gen indicador de la luciferasa y SEAP.
Las células se transfectaron junto con el pT7ARNP o pNP868R-T7ARNP (0,4 Ig de ADN/pocillo y 1Il/pocillo de Lipofectamina 2000), junto con el plásmido indicador pT7p-luciferasa (0,4 Ig de ADN/pocillo y Il/pocillo d Lipofectamina 2000). Se utilizó una serie de otras condiciones de transfección como referencias negativos e incluía:
(a) la misma co-transfección que antes, excepto que el pT7p-luciferasa fue digerido por la enzima que forma caperuza BamHI, lo que interrumpe la conexión física entre el ORF de la luciferasa y la activador de T7, (b) los plásmidos pNP868R-T7ARNP o pT7ARNP solos, (c) el plásmido indicador pT7p-luciferasa digerido o no solo, (d) el reactivo de transfección solo (es decir, Lipofectamina 2000). Las células también se transfectaron con el plásmido pORF-eSEAP (InvivoGen, San Diego, CA; utilizado para normalizar la eficacia de la transfección), así como con el plásmido pCMV-T7ARNP (utilizado como comparador activo).
III. Luminiscencia de la luciferasa de luciérnaga y ensayos colorimétricos con SEAP
La luminiscencia de la luciferasa de luciérnaga se ensayó con el Luciferase Assay System según las recomendaciones del fabricante (Promega, Madison WI, EE.UU.). En resumen, se lisaron células HEK-293 en tampón de lisis Cell Culture Lysis Reagent (CCLR), y después se centrifugaron a 12.000 x g durante 2 minutos a 4°C. Luciferase Assay Reagent (Promega; 100 Il/pocillo) se añadió al sobrenadante (20 Il/pocillo). La lectura de luminiscencia se tomó en un lector luminómetro (Fluostar; BMG Labtech, Offenburg, Alemania) según las instrucciones del fabricante.
Se utilizó la expresión del plásmido pORF-eSEAP para normalizar la eficiencia de la transfección. Este plásmido codifica la fosfatasa alcalina placentaria segregada (SEAP), cuya actividad enzimática se ensayó en el medio de cultivo celular utilizando el kit de ensayo enzimático colorimétrico Quanti-Blue (InvivoGen, San Diego, CA) en los tiempos puntuales seleccionados. La expresión del gen indicador se expresó como la luminiscencia de la luciferasa en las células estudiadas restada de la luminiscencia en las células tratadas sólo con reactivo de transfección (URL; unidades relativas de luz), a continuación, dividida por la relación de absorbancia de SEAP para normalizar la eficacia de transfección (DO, densidad óptica).
IV. Análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando la prueba de la t de Student de dos colas ajustada por corrección de Holm-Bonferroni para pruebas múltiples, si procede. Un valor p inferior a 0,05 se consideró como significativo.
V. Ensayo de expresión del gen indicador
Se utilizó un ensayo de luminiscencia indicador de luciferasa de luciérnaga para evaluar la traducibilidad del ARNm generado por la enzima híbrida según la invención o la enzima T7ARNP. La cotransfección de los plásmidos pT7ARNP y pT7p-luciferasa activó la señal de expresión de la luciferasa baja pero detectable en comparación con las células cotransfectadas con la versión digerida con pT7ARNP/BamHI del plásmido pT7p-luciferasa (que por lo tanto, demuestran que la expresión de gen indicador de luciferasa es conducida por el activador del bacteriófago T7; figuras 4A y 4B). Esto está de acuerdo con los informes publicados previamente, que han demostrado que la T7ARNP expresada en células eucariotas puede sintetizar moléculas de ARN que están mal traducidas debido a su ausencia de caperuza en 5' (Fuerst, S. et al. 1986;. Chen, Li et al. 1994). También se observó una reducción drástica de la señal de la expresión del gen de luciferasa de luciérnaga cuando la transfección se llevó a cabo sin el plásmido pT7ARNP (lo que confirma que la expresión de luciferasa requiere la presencia de T7ARNP) o el plásmido pT7pluciferasa (lo que confirma la especificidad de la señal de luminiscencia ), o ambas.
El plásmido pNP868R-T7ARNP se transfectó junto con el plásmido de luciferasa-pT7p y se probó en las mismas condiciones que anteriormente. En el máximo, se observó la señal de expresión de luciferasa aproximadamente 23 veces mayor con pNP868R-T7ARNP/pT7p-Luciferasa que con los plásmidospT7ARNP/pT7p-Luciferasa (figura 4A). La especificidad de los resultados anteriores se confirmó por la co-transfección de la versión digerida con BamHI del plásmido pT7p-luciferasa, así como la transfección por los plásmidos pNP868R-T7ARNP o pT7p-Luciferasa digerido
o no solo, lo que dio la señal de expresión luciferasa drásticamente reducida (figura 4C). En el máximo, la cotransfección de los plásmidos pNP868R-T7ARNP/pT7p-Luciferasa dio el 72% de la señal de expresión de luciferasa de la del plásmido pCMV-T7ARNP (figura 4A).
En resumen, se ha demostrado la actividad de la enzima híbrida NP868R-T7ARNP según la invención codificada por el plásmido pNP868R-T7ARNP utilizando un ensayo de luminiscencia indicador de luciferasa de luciérnaga. La especificidad de los presentes descubrimientos se apoya en una serie de controles, lo que sugiere que tanto la caperuza del ARNm como las actividades enzimáticas de ARN polimerasa dependiente del ADN de la enzima NP868R-T7ARNP se conservan cuando se expresan en células HEK-293.
VI. Ensayo de la expresión del gen indicador en células tratadas con a-amanitina
Para demostrar aún más que la transcripción por pNP868R-T7ARNP depende de su resto T7 ARN polimerasa dependiente de ADN bacteriofágico, también se llevaron a cabo ensayos de transfección génica en células tratadas con a-amanitina. a-amanitina es un inhibidor específico de la ARN nuclear polimerasa II (Jacob, Sajdel et al. 1970; Kedinger, Gniazdowski et al. 1970; Lindell, Weinberg et al. 1970), que une su subunidad Rpb1 (Bushnell, Cramer et al. 2002). Por el contrario, a-amanitina no tiene ningún efecto sobre la transcripción por la ARN polimerasa del bacteriófagoT7 que se utilizó para diseñar la enzima híbrida NP868R-T7ARNP según la invención (Kupper, McAllister et al. 1973; Engleka, Lewis et al. 1998).
Para iniciar la expresión de la enzima NP868R-T7ARNP, que es conducida por el activador de CMV dependiente de ARN polimerasa II, se transfectaron células con el pNP868R-T7ARNP 24 horas antes de la adición de a-amanitina al medio celular (en concentraciones que van de 0 a 20 Ig/ml) y una segunda transfección con el plásmido pT7pluciferasa (figura 5A). Para el plásmido pCMV-luciferasa, las células se transfectaron simultáneamente y se trataron con a-amanitina (a 0 o 20 Ig/ml; figura 5A). La expresión del gen indicador se expresó como la luminiscencia de la luciferasa en las células estudiadas restada de la luminiscencia en las células tratadas sólo con el reactivo de transfección (URL; unidades relativas de luz), dividida a continuación por la relación de absorbancia de SEAP para normalizar la eficacia de transfección (DO, densidad óptica).
Como era de esperar, a-amanitina suprimió casi completamente la expresión del gen indicador de luciferasa de luciérnaga de las células transfectadas con pCMV-luciferasa (figura 5B). Por el contrario, sólo una disminución leve de la expresión de la luciferasa fue desencadenada por la a-amanitina a todas las concentraciones en las células transfectadas con pNP868R-T7ARNP/pT7p-Luciferasa (figura 5C).
Los presentes descubrimientos, confirman por lo tanto que la transcripción por la enzima NP868R-T7ARNP depende de la actividad enzimática de su resto de ARN polimerasa dependiente del ADN del bacteriófago T7.
VII. Inmunofluorescencia
Se investigó la distribución subcelular de la enzima NP868R-T7ARNP por inmunofluorescencia indirecta. Las células HEK-293 se sembraron en placas de 24 pocillos a razón de 8 x 104 células/pocillo, sobre cubreobjetos recubiertos con poli-L-lisina (BD BioCoat; Bioscience, Mississauga, ON EE.UU.), a continuación se transfectaron como se describió anteriormente. Seis y 24 horas después de la transfección, las células se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS), y después se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 15 minutos. Después de la fijación, las células se lavaron con PBS, y a continuación se permeabilizaron durante 30 minutos en PBS que contiene suero de cabra al 5% (Invitrogen), Triton X-100 al 0,1% y azida de sodio al 0,02%. Las células se incubaron
durante la noche a 4°C con el anticuerpo monoclonal de ratón producido contra la T7 ARN polimerasa (1:200, Novagen). Después de un lavado extensivo con PBS, las células se incubaron durante 3 horas a temperatura ambiente conanti-IgG de ratón en cabra (Sigma-Aldrich) conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC). Los núcleos celulares se tiñeron con 4'-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 5 minutos. Las células se lavaron a continuación y se montaron en el medio anti-desteñido Mowiol 4-88 (Calbiochem, Gibbstown, Nueva Jersey EE.UU.). Las células se analizaron utilizando un microscopio de epifluorescencia con filtros adecuados.
Como era de esperar, se observó una señal débil pero detectable con FITC a las 6 y 24 horas en el citoplasma de las células transfectadas con el plásmido pNP868R-T7ARNP, mientras que sus núcleos se tiñeron con DAPI.
VIII. Ensayos de viabilidad celular, citotoxicidad y apoptosis
El ensayo ApoTox-Glo Triplex (Promega, Madison WI) se utilizó para investigar si la expresión de la enzima NP868R-T7ARNP perjudica la viabilidad, o provoca toxicidad o apoptosis de las células transfectadas. Se analizaron por fluorescencia dos actividades de la proteasa: una es un marcador de viabilidad celular (es decir, el sustrato del péptido GF-AFC), y el otro es un marcador de citotoxicidad (es decir, el sustrato del péptido bis-AAF-R110). La apoptosis se ensayó mediante el sustrato luminógeno caspasa-3/7, que contiene la secuencia DEVD de tetrapéptido, en un reactivo optimizado para la actividad de la caspasa.
El cultivo de células y transfecciones se realizaron como anteriormente, excepto que las células HEK-293 se sembraron en placas de 96 pocillos a densidades que van de 1,2 x 104 células por pocillo. Las células se transfectaron con el plásmido pNP868R-T7ARNP, el plásmido pT7ARNP, o sólo reactivo de transfección. El ensayo ApoTox-Glo Triplex se realizó según las recomendaciones del fabricante. En resumen, en tiempos puntuales seleccionados, se añadió a los pocillos el reactivo de viabilidad/citotoxicidad que contiene tanto sustrato GF-AFC como sustratos bis-AAF-R110 y se incubó durante 30 minutos a 37°C, antes de la evaluación de la viabilidad y la citotoxicidad de la fluorescencia a dos series de longitudes de onda diferentes. El reactivo de la caspasa, se añadió a continuación a todos los pocillos, y se midió la luminiscencia después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente. El análisis estadístico se realizó como anteriormente. Los niveles de viabilidad celular, citotoxicidad y apoptosis se expresaron como señal de luminiscencia/fluorescencia en las células estudiadas restada de luminiscencia/fluorescencia en las células no tratadas.
Como se informó anteriormente (Patil, Rhodes et al. 2004), la viabilidad celular, la citotoxicidad y la apoptosis fueron afectadas de manera significativa en las células tratadas con el reactivo de transfección (es decir, Lipofectamina 2000), en comparación con las células no tratadas (figuras 6A, 6B y 6C). Como también cabía esperar, la viabilidad celular, la citotoxicidad y la apoptosis fueron en general más afectadas cuando se añadió ADN plasmídico a la mezcla de transfección (figuras 6A, 6B y 6C). Sin embargo, en todos los tiempos puntuales estudiados, los marcadores de viabilidad celular, citotoxicidad o apoptosis de las células transfectadas con el plásmido pNP868R-T7ARNP no eran estadísticamente diferentes a los del plásmido pT7ARNP, excepto 24 horas después de la transfección para la viabilidad celular sólo, lo que es debido posiblemente al riesgo solamente (figuras 6A, 6B y 6C, prueba de la t de Student de dos colas para tiempos puntuales individuales, valor p <0,05).
En conclusión, ninguna diferencia obvia en la citotoxicidad, la viabilidad celular y la apoptosis y de la enzima NP868R-T7ARNP se puede demostrar en comparación con T7ARNP, que no tiene actividad enzimática que forma caperuza reconocida.
Ejemplo 2 - Ejemplos de enzimas híbridas monoméricas activas NP868R-T3ARNP y NP868R-SP6ARNP
Se han generado otros dos tipos de enzimas híbridas monoméricas según la invención, que consisten en NP868R, la enzima que forma caperuza para ARNm monomérico del virus de la fiebre porcina africana, fusionado al extremo del terminal amino de las ARN polimerasas dependientes de ADN de bacteriófago monomérico T3 o SP6 natural, mediante el enlazador flexible (Gly3Ser)4.
I. Procedimientos
Las secuencias utilizadas para generar dichas enzimas híbridas monoméricas se ensamblaron en oligonucleótidos sintéticos utilizando un procedimiento basado en la RCP, se clonaron y se verificó la secuencia completamente. Estas secuencias se subclonaron en el plásmido pCMV-Script que contiene el casete de subclonación descrito anteriormente. Por último, todos los plásmidos utilizados para la expresión tenían el diseño similar: activador/activador potenciador IE1 de CMV, secuencia de Kozak seguida de los ORF, señal de poli[A], terminador Te de la transcripción de ARN polimerasa bacteriofágica y señal de poliadenilación de SV40 y (Fiure 7 (A-D)).
Como consecuencia de la estrategia de subclonación, se añadieron aminoácidos inmediatamente corriente abajo del ATG de la secuencia Kozak codificada por los plásmidos (Glu-Phe-Leu-Glu para pT3ARNP y pSP6ARNP; Glu-Phe para pNP868R-T3ARNP y pNP868R-SP6ARNP). Además, se añadieron dos aminoácidos inmediatamente corriente arriba (Gly-Pro para pNP868R-T3ARNP y pNP868R-SP6ARNP) o corriente abajo del enlazador (Gly3Ser)4 (Leu-Glu para pNP868R-T3ARNP y pNP868R-SP6ARNP).
Se cultivaron células HEK-293 como se describió anteriormente en placas de 24 pocillos y se transfectaron utilizando el reactivo Lipofectamina 2000, y los plásmidos apropiados (0,4 Ig de ADN/pocillo, más 1 Il/pocillo de lipofectamina 2000, por plásmido transfectado). La luminiscencia de la luciferasa de luciérnaga se ensayó como se describió anteriormente utilizando el pT7p-luciferasa (que contiene también ambos activadores T3 y SP6) y el Luciferase Assay System. Se utilizó la expresión del plásmido pORF-eSEAP para normalizar la eficacia de la transfección como se describió anteriormente. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando la prueba de la t de Student de dos colas ajustada por la corrección de Holm-Bonferroni para múltiples pruebas, si procede. Un valor de p inferior a 0,05 se consideró como estadísticamente significativo.
II. Resultados
Como se muestra en la figura 8, cuando se transfectaron junto con el plásmido indicador de luciferasa-pT7p, tanto pNP868R-T3ARNP como NP868R-SP6ARNP muestran una fuerte señal del gen indicador de luciferasa, que era 14 y 56 veces superior que pT3ARNP o pSP6RAP, respectivamente (p<0,001 para cada comparación, la prueba t de Student). La enzima NP868R-T3ARNP tiene 36% de actividad de la del plásmido pCMV-T7ARNP (p <0,001, prueba de la t de Student), mientras que o la enzima heterodimérica NP868R-SP6ARNP presenta 1,1 veces la expresión del gen indicador de luciferasa de la del plásmido pCMV-T7ARNP (diferencia no estadísticamente significativa, prueba de la t de Student).
Estos resultados demuestran la actividad de diferentes tipos de enzimas híbridas monoméricas según la invención.
Ejemplo 3 - Ejemplos de enzimas híbridas diméricas y triméricas activas
Se han generado diferentes tipos de enzimas híbridas oligoméricas activas según la invención como se muestra en la figura 9:
-
Una enzima híbrida heterodimérica, que proviene del enlace no covalente entre la enzima que forma caperuza NP868R monomérica contra el ARNm del virus de la peste porcina africana y la T7 ARN polimerasa monomérica, mediante las cremalleras de leucina EE1234L y RR1234L, que forman la enzima híbrida RR1234LpNP868R/EE1234L-T7ARNP heterodimérica,
-
dos enzimas híbridas heterodiméricas, obtenidas por fusión entre cada una de las dos subunidades de la enzima que forma caperuza para el ARNm del virus vacunal (es decir, D1R o D12L) con la T7 ARN polimerasa monomérica, mediante el enlazador flexible (Gly3Ser)4. Cada una de las proteínas de fusión se expresan junto con la otra subunidad de la enzima que forma caperuza para el ARNm del virus de la vacuna, con el fin de formar las enzimas híbridas D12L/D1R-T7ARNP y D1R/ D12L-T7ARNP heterodiméricas,
-
Dos enzimas híbridas heterotriméricas, que se generan por fusión de las cremalleras de leucina EE1234L y RR1234L a los extremos de los terminales amino a una de las subunidades de la enzima que forma caperuza para el ARNm del virus vacunal y la T7 ARN polimerasa, respectivamente. La expresión de RR1234L-D1R o pRR1234L-D12L, junto con la otra subunidad de la enzima que forma caperuza para el ARNm del virus vacunal, más EE1234L-T7ARNP, forman las enzimas híbridas D1R/RR1234L- D12L/EE1234L-T7ARNP y D12L/RR1234L-D1R/EE1234L-T7ARNP heterotriméricas.
I. Procedimientos
Las secuencias utilizadas para generar las enzimas híbridas se montaron en oligonucleótidos sintéticos utilizando un procedimiento basado en la RCP, se clonaron y se verificó toda la secuencia. Estas secuencias se subclonaron en el plásmido pCMV-Script con el casete de subclonación descrito anteriormente. Por último, todos los plásmidos utilizados para la expresión tenían el diseño similar: activador/activador potenciador IE1 de CMV, secuencia de Kozak seguida de los marcos de lectura abiertos (ORF), señal de poli[A], terminador Te de la transcripción de la ARN polimerasa de bacteriófago y señal de poliadenilación de SV40 (figura 10 (A-H)).
Como consecuencia de la estrategia de subclonación, se añadieron inmediatamente corriente abajo dos aminoácidos al ATG de la secuencia de Kozak de algunos plásmidos (Leu-Glu para pT7ARNP; Glu-Phe para pNP868R, pD1R, pD12L, pd1R-T7ARNP y pD12L -T7ARNP), inmediatamente corriente abajo de las secuencias de cremallera de leucina (Leu-Glu para pEE1234L-T7ARNP; Glu-Phe para pRR1234L-NP868R, pRR1234L-D1R y pRR1234L-D12L), y en el extremo del terminal carboxilo de algunas proteínas codificadas (Gly-Pro para pNP868R, pRR1234L-NP868R, PD1R, pD12L, pRR1234L-D1R y pRR1234L-D12L). Además, se añadieron inmediatamente dos aminoácidos corriente arriba (Gly-Pro para pD1R-T7ARNP y pD12L-T7ARNP) o corriente abajo al enlazador (Gly3Ser)4 (Leu-Glu para pD1R-T7ARNP y pD12L-T7ARNP).
Como se describió anteriormente, las células 293 de riñón embrionario humano (HEK-293) se cultivaron en placas de 24 pocillos. Las células HEK-293 se transfectaron utilizando el reactivo lipofectamina 2000, y los plásmidos apropiados (0,4 Ig de ADN/pocillo, más 1 Il/pocillo de lipofectamina 2000, por plásmido transfectado) como se
describió anteriormente. La luminiscencia de la luciferasa luciérnaga se ensayó como se describió anteriormente utilizando el plásmido indicador pET-22b(+)T7ARNPp-luciferasa (denominado pT7p-luciferasa en lo sucesivo) y el Luciferase Assay System. La expresión del plásmido pORF-eSEAP se utilizó para normalizar la eficacia de la transfección como se describió anteriormente.
La expresión del gen indicador se expresa como la luminiscencia de la luciferasa en las condiciones estudiadas restadada de la luminiscencia en las células tratadas sólo con el reactivo de transfección (ULR, unidades relativas de luz), dividida a continuación por la relación de absorbancia de SEAP (DO, densidad óptica). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando la prueba de la t de Student de dos colas ajustada por la corrección de Holm-Bonferroni para múltiples pruebas, si procede. Un valor de p inferior a 0,05 se consideraba estadísticamente significativo.
II. Resultados
II.1 Enzima híbrida RR1234L-NP868R/EE1234L-T7ARNP heterodimérica
Se ha demostrado la actividad de la enzima híbrida RR1234L-NP868R/EE1234L-T7ARN heterodimérica (codificada por los plásmidos pRR1234L-pNP868R y pEE1234L-T7ARNP, respectivamente). Esta enzima heterodimérica se genera mediante un enlace no covalente entre el pNP868R de la enzima que forma caperuza monomérica contra el ARNm del virus de la peste porcina africana y la T7 ARN polimerasa monomérica, mediante las cremalleras de leucina EE1234L y RR1234L (figura 9). La EE1234L (cremallera de leucina ácida; LEIEAAFLEQENTALETEVAELEQEVQRLENIVSQYETRYGPLGGGK, código de aminoácidos de una letra) y la cremallera de leucina RR1234L (cremallera de leucina básica con una ligera modificación de la orientación de GGGK, que no está implicada en la dimerización de la cremallera de leucina (Moll, Ruvinov et al. 2001); LEIRAAFLRRRNTALRTRVAELRQRVQRLRNIVSQYETRYGPLGGGK, código de aminoácidos de una letra), que se añadieron respectivamente al extremo del terminal amino de NP868R y T7ARNP, respectivamente. Las cremalleras de leucina RR1234L y EE1234L son estructuras superenrolladas de péptidos diméricos que consisten en dos hélices a anfipáticas que se funden preferentemente en forma de heterodímero en orientación antiparalela (Moll, Ruvinov et al. 2001).
Como era de esperar, la transfección del plásmido que codifica la enzima que forma caperuza sola contra el ARNm del virus de la peste porcina africana con o sin secuencias de la cremallera de leucina (es decir, pRR1234L-NP868R y pNP868R, respectivamente) no producen ninguna expresión del gen indicador de luciferasa detectable (figura 11). Como también era de esperar, las células transfectadas con el plásmido que codifica la T7 ARN polimerasa con la cremallera de leucina EE1234L (codificada por pEE1234L-T7ARN) muestran una actividad muy similar a la T7 ARN polimerasa sin cremallera de leucina (codificada por pT7ARN), que proporcionan más pruebas de que el extremo del terminal amino natural de la T7 ARN polimerasa puede modificarse sin deterioro importante de su procesividad enzimática.
Las células HEK293 transfectadas junto con los plásmidos pRR1234L-NP868R y pEE1234L-T7ARN (que codifican a NP868R y T7ARNP con cremalleras de leucina), junto con el plásmido indicador pT7p-luciferasa, muestran una fuerte señal de la expresión del gen indicador de luciferasa, que es 87% con respecto a la del plásmido pCMV-T7ARNP (diferencia estadísticamente no significativa, prueba de la t de Student; (figura 11). Además, las células transfectadas en presencia del plásmido indicador pT7p-luciferasa junto con los plásmidos pRR1234L-NP868R y pEE1234L-T7ARN, presentan 3,7 veces mayor expresión del gen indicador luciferasa que las células transfectadas junto con pNP868R y pT7ARNP (que codifican a NP868R y T7ARNP sin cremalleras de leucina, p <0,05, prueba de la t de Student).
Estos resultados demuestran la actividad de enzimas híbridas heterodiméricas según la invención y que el enlace no covalente entre NP868R y T7ARNP por cremalleras de leucina aumenta significativamente la expresión del gen indicador conducida por dichas enzimas híbridas.
II.2 Enzimas híbridas D1R/D12L-T7ARNP y D12L/D1R-T7ARNP heterodiméricas
Se ha demostrado también la actividad de otros tipos de enzima híbrida heterodimérica, utilizando la enzima que forma caperuza para el ARNm de la vacuna.
Por sí misma, la enzima que forma caperuza para el ARNm de la vacuna es un heterodímero que consta de: (i) una subunidad de 95 kDa codificada por el gen D1R del virus de la vacuna (secuencia genómica no ID. NC_006998,1; gen no ID. 3707562; UniProtKB/Swiss-Prot no ID. YP_232988.1), denominado en adelante D1R, que tiene actividades enzimáticas de ARN-trifosfatasa, ARN guanililtransferasa y ARN N7-guanina-metiltransferasa (Cong y Shuman 1993, Niles y Christen 1993, Higman y Niles 1994, Mao y Shuman 1994; Gong y Shuman 2003), (ii) y una subunidad de 31 kDa codificada por el gen D12L del virus vacunal (secuencia genómica no ID. NC_006998,1; gen no ID. 3707515; UniProtKB/Swiss-Prot no ID. YP_232999.1), denominado en lo sucesivo D12L, que no tiene actividad enzimática intrínseca, pero aumenta drásticamente la actividad de ARN N7- guanina-metiltransferasa de la subunidad D1R (Higman, Bourgeois, et al., 1992; Higman, Christen et al. 1994;. Mao y Shuman 1994).
D1R o D12L se fusionaron al extremo del terminal amino de la T7 ARN polimerasa, mediante el enlazador (Gly3Ser)4 (codificada por D1R-T7ARNP o D12L-T7ARNP, respectivamente). Cuando se coexpresaron, cada una de las proteínas de fusión, junto la otra subunidad enzima que forma caperuza para el ARNm de la vacuna (codificada por pD12L o D1R, respectivamente), generan dos enzimas híbridas heterodiméricas diferentes denominadas D12L/D1R-T7ARNP y D1R/D12L-T7ARNP, respectivamente (figura 9). En presencia del plásmido indicador pT7p-luciferasa, las enzimas híbridas heterodiméricas generan una señal fuerte de un gen indicador de luciferasa en células HEK293 (figura 12). La enzima híbrida D12L/D1R-T7ARNP heterodimérica tiene una 32% de actividad con respecto a la del plásmido pCMV-T7ARNP (p<0,01, prueba de la t de Student), mientras que la enzima D1R/D12L-T7ARNP heterodimérica tiene 1,5 veces mayor expresión del gen indicador luciferasa que el plásmido pCMV-T7ARNP (diferencia no estadísticamente significativa, prueba de la t de Student). Además, la expresión conjunta de las dos subunidades de la enzima que forma caperuza para el ARNm de la vacuna no unidas a la T7 ARN polimerasa (codificada por pD1R, pD12L y pT7ARNP) presenta 9 y 42 veces menor señal de expresión del gen indicador de luciferasa que las enzimas híbridas D12L/D1R-T7ARNP y D1R/D12L-T7ARNP heterodiméricas, respectivamente (P<0,05 para ambas comparaciones estadísticas, prueba de la t de Student).
Estos resultados demuestran la actividad de diferentes tipos de enzimas híbridas heterodiméricas según la invención y que el enlace covalente entre las subunidades de la enzima que forma caperuza para ARNm de la vacuna y T7ARNP estimula significativamente la expresión del gen indicador. Como también era de esperar, en presencia del plásmido indicador pT7p-luciferasa, la expresión de D1R y/o D12L sin T7 ARN polimerasa no produce prácticamente ninguna expresión de la luciferasa detectable.
II.3 Enzimas híbridas D12L/RR1234L-D1R/EE1234L-T7ARNP y D1R/RR1234L- D12L/EE1234L-T7ARNP heterotriméricas
También se ha demostrado la actividad de la enzima híbrida heterotrimérica.
La cremallera de leucina básica RR1234L se fusionó a los extremos de los terminales amino de cualquiera de las subunidades D1R o D12L de la enzima que forma caperuza para ARNm del virus vacunal (codificado por pRR1234L-DLR y RR1234L-D12L, respectivamente), mientras que la cremallera de leucina EE1234L ácida complementaria se añadió al extremo del terminal amino de la T7 ARN polimerasa (codificada por el plásmido pEE1234L-T7ARN). La expresión de pEE1234L-T7ARNP, junto con cualquiera de pRR1234L-D1R o pRR1234L-D12L, más la otra subunidad de la enzima que forma caperuza para el ARNm de la vacuna (plásmidos pD12L y pD1R, respectivamente), por lo tanto generan dos enzimas CCPP heterotriméricas diferentes, denominadas D12L/RR1234L-D1R/EE1234L-T7ARNP y D1R/RR1234L-D12L/EE1234L-T7ARNP, respectivamente (figura 9).
La T7 ARN polimerasa presentó 7 veces mayor señal del gen indicador de luciferasa cuando se expresó junto con las subunidades D1R/D12L de la enzima que forma caperuza para el ARNm del virus de la vacuna que en su ausencia. Estos resultados están por lo tanto, en línea con los obtenidos por el sistema de expresión híbrido virus vacunal/ARNP bacteriofágico, en el que la traducibilidad de los transcritos T7 sin restricción aumenta por la expresión de la enzima que forma caperuza para ARNm de la vacuna proporcionada por un virus recombinante (Fuerst, Niles et al. 1986; Fuerst, Earl et al. 1987; Elroy-Stein, Fuerst et al. 1989; Fuerst, Fernández et al. 1989; Fuerst y Moss 1989; Elroy-Stein y Moss 1990).
Una señal fuerte del gen indicador de luciferasa se muestra en las células HEK-293 que expresan las enzimas CCPP D1R/RR1234L-D12L/EE1234L-T7ARNP o la D12L/RR1234L-D1R/EE1234L-T7ARNP, en presencia del plásmido pT7p-luciferasa indicador (figura 13). Las enzimas híbridas D12L/RR1234L-D1R/EE1234L-T7ARNP y D1R/RR1234L-D12L/EE1234L-T7ARNP heterodiméricas tienen respectivamente 57% y 33% de actividad con respecto a la del plásmido pCMV-T7ARNP (diferencia estadísticamente no significativa, prueba de la t de Student). Las enzimas híbridas D12L/RR1234L-D1R/EE1234L-T7ARNP y D1R/RR1234L-D12L/EE1234L-T7ARNP heterodiméricas muestran, respectivamente, 11 y 6,7 veces más fuerte la señal de expresión del gen indicador de la luciferasa que las células que expresan D1, D12L y T7ARNP sin cremalleras de leucina(p = 0,05 y diferencia estadísticamente no significativa, respectivamente; prueba de la t de Student).
Estos resultados demuestran la actividad de las enzimas híbridas heterotriméricas según la invención y que el enlace no covalente entre cualquiera de las subunidades de la enzima que forma caperuza para ARNm de la vacuna y la T7 ARN polimerasa aumenta significativamente la expresión del gen indicador.
III. Conclusión
Estos resultados muestran la actividad de diferentes tipos de enzimas híbridas heterodiméricas y heterotriméricas según la invención, generadas por enlace covalente o no covalente.
Los presentes resultados también proporcionan pruebas de que el enlace covalente o no covalente entre el dominio catalítico diferente de la enzima híbrida y, en especial, entre las enzimas que forman caperuza y ARN polimerasas permite la optimización de la expresión del gen indicador por las enzimas híbridas.
Ejemplo 4 - Estimulación de la expresión del gen indicador de luciferasa por silenciamiento de secuencias contra la ARN polimerasa II celular y la enzima que forma caperuza
I. Procedimientos
Se cultivaron células HEK-293 como se describió previamente en placas de 24 pocillos y se transfectaron utilizando el reactivo Lipofectamina 2000, y la concentración apropiada de ARNsi (Qiagen, Hilden, Alemania) y plásmidos (0,4 Ig de ADN/pocillo, más 1 Il/pocillo de lipofectamina 2000, por plásmido transfectado). La enzima híbrida NP868R-SP6, que tiene una fuerte actividad demostrada, se utilizó en el presente experimento. La luminiscencia de la luciferasa de luciérnaga se ensayó como se describió anteriormente utilizando el pT7p-luciferasa (que también contiene ambos activadores T3 y SP6) y el Luciferase Assay System. Se utilizó la expresión del plásmido pORFeSEAP para normalizar la eficacia de la transfección como se describió anteriormente.
Se utilizaron cuatro ARNsi que se dirigen a la POLR2A humana (gen NCBI no ID. 5430; secuencias de ARNm no ID. NM 000937,4; secuencia de proteína NCBI no ID .NP_000928.1): SI04364381 (secuencia de ARNm 1255-1275: CAGCGGTTGAAGGGCAAGGAA), SI04369344 (secuencia de ARNm 830-850: ATGCGGAATGGAAGCACGTTA), SI04250162 (secuencia de ARNm 2539-2559: ATGGTCGTGTCCGGAGCTAAA) y SI04354420 (secuencia de ARNm 4896-4916: CAGCGGCTTCAGCCCAGGTTA).
Además, se utilizaron cuatro ARNsi que se dirigen a la RNGTT humana (gen no ID. 8732; secuencia de ARNm no ID. NM_003800.3; secuencia de proteína NCBI no ID. NP_003791.3): SI00055986 (secuencia de ARNm 3187-3207: ATGGATTTAAAGGGCGGCTAA), SI03021508 (secuencia de ARNm 430-450: TTCAAGGTTCTATGACCGAAA), SI00055972 (secuencia de ARNm 2530-2550: CAGGGTTGTTAAGTTGTACTA) y SI00055979 (secuencia de ARNm 4132-4152: TACCATCTGCAGTATTATAAA).
II. Resultados
En una primera serie de experimentos, los efectos de cuatro ARNsi de POLR2A y cuatro ARNsi de RNGTT se ensayaron a una concentración final de 25 nM (figura 14). Los ARNsi se transfectaron junto con el plásmido de la enzima híbrida pNP868R-SP6ARNP y el plásmido pT7p-luciferasa indicador. En conjunto, la tendencia de ARNsi de POLR2A a aumentar la expresión del gen indicador de luciferasa en un 127%, de promedio, en comparación con la misma condición, sin ARNsi. Del mismo modo, la adición del ARNsi de RNGTT aumentó en conjunto la expresión del gen indicador de la luciferasa en un 147% de promedio en comparación con la misma condición sin ARNsi.
Los ARNsi SI04369344 de POLR2A y SI00055972 de RNGTT, que han mostrado la tasa de estimulación más alta, se seleccionaron para una segunda serie de experimentos. Se ensayó la expresión del gen indicador de luciferasa conducido por NP868R-SP6ARNP en presencia de ARNsi a concentraciones que van de 0 a 100 nM (figura 15). Se observó la respuesta a la dosis con ambos ARNsi. La estimulación de la expresión más fuerte de 3,8 veces se observó a 100 nM con el ARNsi SI04369344 de POLR2A, y de 5,1 veces con el SI00055972 de RNGTT a 100 nM.
III. Conclusión
Los presentes resultados demuestran que el silenciamiento de la transcripción celular y de los mecanismos tras la transcripción por ARNsi estimulan la expresión del gen indicador conducido por la enzima híbrida NP868R-SP6ARNP.
Referencias
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<210> 1 55 <211> 883
<212> PRT
<213> Enterobacteria fago T7
<400> 1 60
<210> 2
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Enlazador de péptidos 10
<400> 2
15 <210> 3
<211> 21
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> Enlazador de péptidos
<400> 3
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
10 <220>
<223> Enlazador de péptidos
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<220>
<223> Enlazador de péptidos
25 <400> 5
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<213> Secuencia artificial
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45
<220>
<223> Enlazador de péptidos
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Enlazador de péptidos
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
15 <220>
<223> Enlazador de péptidos
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<220>
<223> Enlazador de péptidos
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<213> Secuencia artificial
50
<220>
<223> Enlazador de péptidos
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(8)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido que aparece de manera natural
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido que aparece de manera natural
<400> 12
15 <210> 13
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Enlazador de péptidos
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Enlazador de péptidos
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 45 <223> Enlazador de péptidos
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Enlazador de péptidos
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
15 <220>
<223> Enlazador de péptidos
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<211> 13
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<220>
<223> Enlazador de péptidos
30 <400> 18
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<220>
<223> Secuencia de proteína codificada por plásmido pNP868R-pT7ARNP 10
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5 <210> 21
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<212> ADN
<213> Secuencia artificial
10 <220>
<223> ORF del NP868R-T7ARNP
<400> 21
<210> 22
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<213> Secuencia artificial
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<223> ORF del T7ARNP 10
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<213> Artificial
<220>
<223> Marco abierto de lectura del plásmido pT3ARNP 10
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<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de proteína codificada por plásmido pT3ARNP 10
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<213> Artificial
<220>
<223> Marco de lectura abierto del plásmido pSP6ARNP 10
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<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de proteína codificada por plásmido pSP6ARNP
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<213> Artificial
<220>
<223>
Marco abierto de lectura del plásmido pD1R 10
<400> 27
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de proteína codificada por plásmido pD1R
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<213> Artificial
<220>
<223>
Marco abierto de lectura del plásmido pD12L 10
<400> 29
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<213> Artificial
<220>
<223>
Secuencia de proteína codificada por plásmido pD12L 10
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<213> Artificial
<220>
<223> Marco abierto de lectura del plásmido pRR1234L-NP868R 10
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5
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10
<220>
78
<223> Secuencia de proteína codificada por plásmido pRR1234L-NP868R
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<210> 33
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<213> Artificial
<220>
<223>
Marco abierto de lectura del plásmido pRR1234L-DIR 10
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<213> Artificial
<220>
<223>
Secuencia de proteína codificada por plásmido pRR1234L-DIR 10
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<213> Artificial
<220>
<223>
Marco abierto de lectura del plásmido pRR1234L-D12L 10
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<213> Artificial
<220>
<223>
Secuencia de proteína codificada por plásmido pRR1234L-D12L 10
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Marco abierto de lectura del plásmido pEE1234L-T7ARN
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<213> Artificial
<220>
<223>
Secuencia de proteína codificada por plásmido pEE1234L-T7ARN 10
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<213> Artificial
<220>
<223> Marco abierto de lectura del plásmido pD1R-T7ARNP 10
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<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de proteína codificada por plásmido pD1R-T7ARNP 10
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<213> Artificial
<220>
<223> Marco abierto de lectura del plásmido pD12L-T7ARNP 10
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<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia de proteína codificada por plásmido pD12L-T7ARNP 10
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<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> SI04364381
<400> 43
cagcggttga agggcaagga a
21
<210> 44
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> SI04369344
<400> 44
atgcggaatg gaagcacgtt a
21
<210> 45
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> SI04250162
<400> 45
atggtcgtgt ccggagctaa a
21
<210> 46
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> SI04354420
<400> 46
cagcggcttc agcccaggtt a
21
<210> 47
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> SI00055986
<400> 47
atggatttaa agggcggcta a
21
<210> 48
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> SI03021508
<400> 48
ttcaaggttc tatgaccgaa a
21
<210> 49
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> SI00055972
<400> 49
cagggttgtt aagttgtact a
21
<210> 50
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> SI00055979
<400> 50
taccatctgc agtattataa a
21

Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Enzima híbrida que comprende:
    -
    por lo menos un dominio catalítico procedente de una ARN trifosfatasa,
    -
    por lo menos un dominio catalítico procedente de una guanililtransferasa,
    -
    por lo menos un dominio catalítico procedente de una N7 guanina-metiltransferasa, y
    -
    por lo menos un dominio catalítico procedente de una ARN polimerasa dependiente de ADN.
  2. 2.
    Enzima híbrida según la reivindicación 1, caracterizada porque es una enzima híbrida citoplásmica.
  3. 3.
    Enzima híbrida según la reivindicación 1 o 2, en la que dicho dominio catalítico de una ARN polimerasa dependiente de ADN es un dominio catalítico procedente de una ARN polimerasa dependiente del ADN de bacteriófago.
  4. 4.
    Enzima híbrida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que por lo menos uno de dichos dominios catalíticos seleccionado de entre el grupo constituido por:
    -
    dicho dominio catalítico de una ARN trifosfatasa;
    -
    dicho dominio catalítico de una guanililtransferasa y
    -
    dicho dominio catalítico de una N7-guanina-metiltransferasa;
    es un dominio catalítico procedente de una enzima que forma caperuza para virus.
  5. 5.
    Molécula aislada de ácido nucleico o un grupo de moléculas aisladas de ácido nucleico, codificando dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico una enzima híbrida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  6. 6.
    Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 5, que está unida funcionalmente por lo menos a un activador seleccionado de entre el grupo constituido por:
    -
    el activador para la ARN polimerasa II; y
    -
    el activador para dicha ARN polimerasa dependiente de ADN.
  7. 7.
    Vector, que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 5 o 6.
  8. 8.
    Célula anfitriona que comprende una molécula de ácido nucleico o un grupo de moléculas de ácido nucleico aisladas según la reivindicación 5 o 6 o un vector según la reivindicación 7.
  9. 9.
    Organismo eucariota no humano genéticamente modificado, que expresa una enzima híbrida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  10. 10.
    Utilización in vitro o ex vivo de una enzima híbrida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para la producción de la molécula de ARN con una caperuza m7GpppN en el terminal 5'.
  11. 11.
    Procedimiento in vitro o ex vivo para la producción de una molécula de ARN con una caperuza m7GpppN en el terminal 5' codificada por una secuencia de ADN, en una célula anfitriona, comprendiendo dicho procedimiento la etapa de expresar en la célula anfitriona una molécula de ácido nucleico o un grupo de moléculas de ácido nucleico aisladas según la reivindicación 5 o 6, en el que dicha secuencia de ADN está funcionalmente unida al activador para dicha ARN polimerasa dependiente de ADN.
  12. 12.
    Procedimiento según la reivindicación 11, en el que dicho procedimiento comprende además la etapa de inhibir la expresión de por lo menos una de las subunidades de la ARN polimerasa dependiente de ADN endógeno y/o de la enzima endógena que forma caperuza en dicha célula anfitriona.
  13. 13.
    Kit para la producción de una molécula de ARN con caperuza m7GpppN en el terminal 5', que comprende por lo menos una enzima híbrida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y/o una molécula de ácido nucleico aislado y/o un grupo de moléculas aisladas de ácido nucleico según la reivindicación 5 o 6, y/o un vector según la reivindicación
  14. 7.
  15. 14. Composición farmacéutica que comprende una enzima híbrida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y/o una molécula aislada de ácido nucleico y/o un grupo de moléculas aisladas de ácido nucleico según la reivindicación 5
    o 6 y/o un vector según la reivindicación 7.
  16. 15. Composición farmacéutica según la reivindicación 14, que comprende además:
    -
    por lo menos una secuencia de ADN de interés, en el que dicha secuencia de ADN está funcionalmente unida al activador para dicha ARN polimerasa dependiente de ADN.
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