KR101930091B1 - 캡핑-용이한 rna 폴리머라제 효소 및 이들의 용도 - Google Patents

캡핑-용이한 rna 폴리머라제 효소 및 이들의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 RNA 트리포스파타제의 적어도 하나의 촉매 도메인, 구아닐릴트랜스퍼라제의 적어도 하나의 촉매 도메인, N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 적어도 하나의 촉매 도메인 및 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 적어도 하나의 촉매 도메인을 포함하는 키메라 효소를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 키메라 효소를 포함하는 약제학적 조성물 및 상기 키메라 효소의 용도를 제공한다.

Description

캡핑-용이한 RNA 폴리머라제 효소 및 이들의 용도{Capping-prone RNA polymerase enzymes and their applications}
본 발명은 특히 진핵 세포에서 유전자도입 분야에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 5'-말단 m7 GpppN 캡 구조를 갖는 RNA 분자의 생산에 유용한 키메라 효소에 관한 것이다.
진핵세포 발현은 생명 과학, 생물기술 및 의학에서 광범위하게 사용되고 있다. 따라서, 진핵 세포에서 효율적인 유전자도입을 위한 다수의 방법이 개발되어 왔다. 통상의 DNA 공급원 및 전달 메카니즘은 바이러스(예: 배큘로바이러스(baculovirus), 레트로바이러스(retrovirus) 또는 아데노바이러스(adenovirus)) 또는 플라스미드 및 합성 염색체를 포함하는 비바이러스(non-viral) 벡터이다.
이들의 단순성 때문에, 비바이러스 플라스미드는 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo) 적용 둘 다에서 진핵 세포내로 유전자 전달을 위한 발현 벡터로서 통상 사용된다. 그러나, 비바이러스 방법에 의해 달성된 도입유전자(transgenes) 발현 수준은 통상 평범하며 신속하게 감소한다. 이러한 평범한 효능에 대한 통상의 설명은 대략 40,000 달톤에 달하는 DNA 분자가 핵공을 통과하여 핵 RNA 폴리머라제 II에 의해 전사되는 곳인 핵에 들어가기에는 너무 크다는 사실이다[참조: Lang, Scholz et al. 1986; Zabner, Fasbender et al. 1995]. 실제로, 매우 소량(<0.1-0.001%)의 거대 DNA 분자만이 진핵 세포의 세포질로부터 핵으로 활발히 전달된다. 발현이 신속히 감소하는 메카니즘은 또한 가능하게는 핵-특이적이고, 다수의 후성적 메카니즘에 의한 도입유전자 발현의 침묵과 관련된다[참조: Loser, Jennings et al. 1998; Gill, Smyth et al. 2001; Miao, Thompson et al. 2001; Nicol, Wong et al. 2002; Miao, Ye et al. 2003].
진핵 세포의 내인성 RNA 전사 시스템을 사용한 유전자도입 방법의 다른 결점은 또한 이들의 사용을 제한한다. 첫째, 핵 진핵세포 RNA 폴리머라제의 약한 처리능(예: RNA 폴리머라제 II의 경우 10 내지 20개 뉴클레오티드/초)[참조: Fire, Samuels et al. 1984; Ucker and Yamamoto 1984; Bengal, Flores et al. 1991; Izban and Luse 1992]. 둘째, 내인성 유전자 전사와 도입유전자 전사 사이의 경쟁. 셋째, 몇 개의 서브유닛(예를 들면, RNA 폴리머라제 II의 경우 12개 서브유닛)로 이루어져 있고 다중 전사 인자에 의해 조절되는 진핵세포 RNA 폴리머라제의 과도한 복잡성[참조: Lodish, Berk et al. 2008].
이들 단점에 비추어, 박테리오파지 의존성 RNA 폴리머라제에 기반한 일부 유전자도입 방법이 개발되었다. 이들 방법은 특히 진핵 세포의 내인성 RNA 전사 시스템을 사용하지 않지만, 진핵세포 RNA 폴리머라제보다 높은 처리능을 갖는 일부 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제를 이용하는 잇점을 갖는다.
pET 발현 시스템은 원핵생물에서 유전자 발현을 위한 일반적인 방법이다[참조: Studier, Rosenberg et al. 1990]. 이는, T7 프로모터의 조절하에 발현되도록 유전자 조작된 목적하는 유전자를 전사하기 위해, 박테리오파지 단일-서브유닛 T7 DNA-의존성 RNA 폴리머라제(T7 RNA 폴리머라제, T7RNAP), 즉 T7 유전자 1의 생성물의 발현에 의존한다. pET 발현 시스템은 진핵 세포에 적합하고, 통상적으로 하이브리드 RNA 폴리머라제로서 지정되어 있다. 그러나, 진핵세포 환경에서, T7 DNA 의존성 RNA 폴리머라제의 높은 효소 활성은 T7 전사체의 매우 약한 번역 수율과 현저하게 대비된다[참조: Fuerst, Niles et al. 1986]. 진핵 세포에서 전사체의 성숙 부재는 5'-말단에서 캡 구조의 부가에 의해 변형되지 않고[참조: Benton, Eng et al. 1990; Dower and Rosbash 2002], 이들의 3'-말단에서 강력하게 폴리아데닐화되지 않으며[참조: Mifflin and Kellems 1991; Dower and Rosbash 2002], 이는 이러한 불일치에 대한 설명을 제공한다.
따라서, 백시니아 바이러스/박테리오파지 RNAP 하이브리드 발현 시스템과 같은 하이브리드 시스템에 의해 생산된 비캡핑된 전사체의 번역능을 개선시키는 방법이 개발되어 왔다. 이러한 진핵세포 발현 시스템은 감염된 포유동물 세포의 세포질에서 박테리오파지 T7 DNA 의존성 RNA 폴리머라제를 합성하는 재조합체 백시니아에 기반하고 있다[참조: Fuerst, Niles et al. 1986; Fuerst, Earl et al. 1987; Elroy-Stein, Fuerst et al. 1989; Fuerst, Fernandez et al. 1989; Fuerst and Moss 1989; Elroy-Stein and Moss 1990]. T7 프로모터 및 종결 서열의 측면에 위치된, 박테리오파지 RNA 폴리머라제에 대한 표적 유전자는 재조합 플라스미드의 형질감염 또는 2차 재조합 백시니아 바이러스에 의한 감염에 의해 감염된 세포 내로 도입된다[참조: Fuerst, Niles et al. 1986; Elroy-Stein, Fuerst et al. 1989; Elroy-Stein and Moss 1990]. mRNA 캡핑을 위한 백시니아 인코딩된 세포질 효소는 T7 전사체에 작용하여 이들의 번역능을 개선시킬 수 있다. 그러나, T7 전사체의 캡핑은 최적 이하의 상태로 유지된다[참조: Fuerst and Moss 1989]. 예를 들면, 이러한 발현 시스템을 사용하여, T7 전사체는 24시간 후에 30% 이하의 총 세포질 RNA를 포함할 수 있지만, 5 내지 10%의 T7 전사체만이 5'-말단 캡 구조를 함유했다[참조: Fuerst and Moss 1989]. 보다 효율적이긴 하지만, 백시니아 바이러스/박테리오파지 RNAP 하이브리드 발현 시스템의 기술적 결점은 이의 범용화 및 대규모 사용을 명백하게 제한한다. 먼저, 이 시스템은 재조합 백시니아 바이러스에 기반하고, 이는 사람에 대해 감염성이다. 따라서, 이들 재조합체 바이러스의 취급은 특정한 실험실 시설 및 실습을 필요로 한다. 사람 세포에서 후기 팩키징 단계에서 이의 복제 사이클을 중지하는, 약화된 조류 숙주-범위-제한 균주, 즉 변형된 백시니아 안카라(Ankara)(MVA)는 이러한 위험을 보다 잘 제어하기 위해 사용될 수 있다[참조: Wyatt, Moss et al. 1995; Engleka, Lewis et al. 1998]. 둘째, 재조합체 백시니아 또는 MVA 바이러스는 세포독성이다. 따라서, 백시니아 바이러스/박테리오파지 RNAP 하이브리드 발현 시스템은 일시적인 유전자도입에 유일하게 사용될 수 있다[참조: Elroy-Stein, Fuerst et al. 1989; Elroy-Stein and Moss 1990]. 셋째, 백시니아 바이러스/박테리오파지 RNAP 하이브리드 발현 시스템은 백시니아 감염에 대해 허용되는 일부 세포 모델(예: BSC-1)에서 용이하게 사용될 수 있으나, 일부(예: CHO)에서는 허용되지 않는다. 재조합체 백시니아 바이러스의 게놈 내로 우두 바이러스의 CP77 유전자의 삽입은, 백시니아 바이러스가 이들 세포를 생산적으로 감염시킬 수 있게 함으로써 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포의 백시니아 바이러스/박테리오파지 RNAP 하이브리드 발현 시스템 숙주 범위 제한을 극복할 수 있다[참조: Spehner, Gillard et al. 1988; Ramsey-Ewing and Moss 1996]. 넷째, 당해 시스템의 복잡성에 기인하여, 이의 효능의 현저한 변이성이 동일한 세포 모델에서 예상될 수 있다. 다섯째, 백시니아 바이러스/박테리오파지 RNAP 하이브리드 발현 시스템은 비용 및 노동 소모적 기술이고, 따라서 이는 대규모 분석 및 단백질 생산에 적절하지 않다.
캡핑을 전사와 결합시켜 T7 RNA 폴리머라제에 의해 생산된 비캡핑된 전사체의 번역능을 개선시키기 위한 시도에서, 이러한 효소는 TNA 폴리머라제 II(POLA2A)의 최대 서브유닛의 카복실-말단 도메인(CTD)에 융합되었다[참조: Natlizio, Robson-Dixon et al. 2009]. CTD는 컨센서스 서열 1YSPTSPS7의 25개 내지 52개 헵타펩티드 반복체를 포함하고, 이는 진화 동안 고도로 보존되었고, 전사 사이클 동안 가역적 인산화된다[참조: Palanade and Bensaude 2003]. 인산화되는 경우, CTD는, 효모[참조: Cho, Takagi et al. 1997; McCracken, Fong et al. 1997] 및 포유동물[참조: McCracken, Fong et al. 1997; Yue, Maldonado et al. 1997]에서 mRNA 캡핑 효소의 하나 이상의 서브유닛를 결합시킴으로써 전사 커플링 및 발생 전사체의 캡핑을 매개하는 것으로 생각된다. 현저하게는, Ser5-인산화 CTD 반복체를 갖는 RNA 폴리머라제 II는 발생 전사체의 공-전사 캡핑과 동시에 일어나는 프로모터 인접 중단을 겪는다[참조: Komarnitsky, Cho et al. 2000; Schroeder, Schwer et al. 2000]. 그러나, 직관적으로 예상할 수 있는 것과는 대조적으로, 단일-단위 T7 RNA 폴리머라제에 대한 CTD의 융합은 생체내에서 구조적 및 대안적으로 스플라이싱된 기질의 캡핑을 증강시키는데 충분하지 않다[참조: Natalizio, Robson-Dixon et al. 2009].
캡핑은 거의 모든 진핵세포 메신저 RNA의 5'-말단에서 발견된 특수한 구조이다. 가장 단순한 캡 구조, cap0은 1차 RNA의 말단에 결합된 5'-5' 트리포스페이트 말단의 감마 포스페이트에 의해 결합되는 N7에서 메틸화된 구아닌 뉴클레오사이드 부가의 결과이다(즉, m7GpppN, 여기서 N은 임의의 염기이고, p는 포스페이트를 나타내며, m은 메틸 그룹이다). cap0의 형성은 일련의 3가지 효소 반응을 수반한다: RNA 트리포스파타제(RTPase)는 디포스페이트에 대한 발생 프리-mRNA의 5' 트리포스페이트 말단의 감마 포스페이트 잔기를 제거하고, RNA 구아닐릴트랜스퍼라제(GTase)는 GMP를 GTP로부터 디포스페이트 발생 RNA 말단으로 전달하며, RNA N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제(N7-MTase)는 GpppN 캡에 구아닌의 질소 7 상의 메틸 잔기를 부가한다[참조: Furuichi and Shatkin 2000]. 보다 고급 진핵세포 및 일부 바이러스에서, 1차(즉, cap1 구조체; m7GpppNm2'- opN) 및 2차(즉, cap2 구제초; m7GpppNm2'-opNm2'-o) 전사된 뉴클레오티드의 리보스의 2'-하이드록실 그룹은 각각 cap1- 및 cap2-특이적 MTase로서 명명된 2개의 별개의 리보스-2'-O MTase에 의해 메틸화될 수 있다[참조: Langberg and Moss 1981]. 그러나, 오로지 핵에 존재하는 세포 N7-MTase 활성과 대조적으로, cap1 리보스-2'-O MTase 활성은 헬라 세포의 세포질 및 핵 둘 다에서 검출된 반면, cap2 MTase 활성은 이들의 세포질에서 유일하게 발견되었다[참조: Langberg and Moss 1981].
5'-말단 m7GpppN 캡의 형성은 프리-mRNA 프로세싱의 제1 단계이다. m7GpppN cap는 mRNA 안정성 및 핵으로부터 세포질로의 이의 수송에 중요한 역할을 담당한다[참조: Huang and Steitz 2005; Kohler and Hurt 2007]. 또한, 5'-말단 m7GpppN 캡은 진핵세포 번역 개시 인자 4F(eIF4F) 복합체를 고정함으로써 단백질로의 mRNA의 번역에 중요하며, 상기 복합체는 작은 리보솜 서브유닛의 16S 부분의 mRNA로의 보충을 매개한다[참조: Furuichi, Lafiandra et al. 1977; Gingras, Raught et al. 1999; Rhoads 1999]. 따라서, 5'-말단 m7GpppN 캡은 시험관내[참조: Lo, Huang et al. 1998] 및 생체내[참조: Malone, Felgner et al. 1989; Gallie 1991; Lo, Huang et al. 1998; Kozak 2005] 둘 다에서 mRNA의 번역을 현저히 향상시킨다. 대조적으로, mRNA 번역에 미치는 2'-O-메틸화의 효과는 세포의 종류 및 실험 조건에 의존하는 것 같다[참조: Epicentre Biotechnologies website ; Drummond, Armstrong et al. 1985; Kuge, Brownlee et al. 1998].
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따라서, 당해 기술분야에서는, 세포독성 또는 유도된 세포독성 없이 유전자 치료 및 대규모 단백질 생산에 적절한, 진핵 세포에서 효율적인 유전자도입을 위한 신규하고 개선된 시스템이 현저히 요구되고 있다. 본 발명자들은 본원에 기재된 본원 발명으로 현저한 진보성을 달성하였다.
본 발명의 목적은, 상술한 문제 전부 또는 일부를 해결할 수 있는 신규한 키메라 효소를 제공함으로써 이러한 필요를 달성하는 것이다.
예상치 않게, 본 발명자들은 RNA 트리포스파타제(RNA triphosphatase)의 촉매 도메인, 구아닐릴트랜스퍼라제(guanylyltransferase)의 촉매 도메인, N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제(N7-guanine methyltransferase) 및 DNA-의존성 RNA 폴리머라제(DNA-dependant RNA polymerase)의 촉매 도메인을 포함하는 키메라 효소가, 세포독성 및 아폽토시스의 유도 없이, 진핵세포 번역 장치에 의해 고도로 해독가능한 5'-말단 m7GpppN 캡을 갖는 RNA 분자를 합성할 수 있음을 증명했다.
이들 결과는, T7 전사체의 캡핑이 백시니아 바이러스/박테리오파지 RNAP 하이브리드 발현 시스템으로 최적 이하 상태로 유지되고 융합 효소 CTD-T7 RNA 폴리머라제에 의해 달성될 수 없기 때문에 놀라운 것이다.
따라서, 한 가지 양태에서, 본 발명은:
적어도 하나의, 특히 RNA 트리포스파타제의 촉매 도메인,
적어도 하나의, 특히 구아닐릴트랜스퍼라제의 촉매 도메인,
적어도 하나의, 특히 N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 촉매 도메인, 및
적어도 하나의, 특히 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인을 포함하는 키메라 효소에 관한 것이다.
특히, 본 발명에 따르는 키메라 효소는 5'-말단 m7GpppN 캡을 갖는 RNA 분자를 합성할 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 관련 분야의 당업자에게 통상 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
편의상, 명세서, 실시예 및 특허청구범위에 사용된 특정 용어 및 문구의 의미가 제공된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "키메라 효소"는 자연에서 발견되는 천연 효소가 아닌 효소를 지칭한다. 따라서, 키메라 효소는, 자연에서 발견된 것과는 상이한 방식으로 배열된, 상이한 공급원(예: 상이한 효소)으로부터 유래된 촉매 도메인 또는 동일한 공급원(예: 동일한 효소)으로부터 유래된 촉매 도메인을 포함할 수 있다.
용어 "키메라 효소"는 단량체성(즉, 단일 단위) 효소 뿐만 아니라 올리고머성(즉, 복수 단위) 효소, 특히 헤테로-올리고머성 효소를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단량체성 효소"는 단지 하나의 폴리펩티드 쇄로 이루어진 단일-단위 효소와 관련된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "올리고머성 효소"는, 함께 공유 또는 비공유적으로 연결된, 적어도 2개의 폴리펩티드 쇄로 이루어진 복수-단위 효소를 지칭한다. 용어 "올리고머성 효소"는 복수 단위 효소를 포함하며, 여기서 상기 효소 중의 적어도 2개 단위는 함께 공유 또는 비공유적으로 연결되어 있다. 용어 "올리고머성 효소"는, 단지 한 종류의 단량체(서브유닛)로 이루어진 복수 단위 효소 및 상이한 종류의 단량체(서브유닛)로 이루어진 헤테로-올리고모성 효소인 호모-올리고머성 효소를 포함한다.
특히, RNA 트리포스파타제, 구아닐릴트랜스퍼라제, N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제 및 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인들은 함께 공유 및/또는 비공유적으로 연결되어 있다.
특히, RNA 트리포스파타제, 구아닐릴트랜스퍼라제, N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제 및 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 함께 작동적으로 연결되어, 5'-말단 m7GpppN 캡을 갖는 RNA 분자를 합성한다.
특히,
- 적어도 하나의, 특히 RNA 트리포스파타제의 촉매 도메인,
- 적어도 하나의, 특히 구아닐릴트랜스퍼라제의 촉매 도메인,
- 적어도 하나의, 특히 N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 촉매 도메인 및
- 적어도 하나의, 특히 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인(여기서, 상기 촉매 도메인 중의 적어도 2개는 바람직하게는 이들의 말단(N 또는 C 말단)에서 함께 공유 또는 비공유적으로 연결되고, 보다 특히는
- 상기 적어도 하나의, 특히 RNA 트리포스파타제의 촉매 도메인,
- 상기 적어도 하나의, 특히 구아닐릴트랜스퍼라제의 촉매 도메인,
- 상기 적어도 하나의, 특히 N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 촉매 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 촉매 도메인은 바람직하게는 이의 말단(N 또는 C 말단)에서 공유 또는 비공유적으로 연결된다)을 포함하는 본 발명에 따르는 키메라 효소는
- 상기 적어도 하나의, 특히 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인과 바람직하게는 이의 말단(N 또는 C 말단)에서 연결된다.
특히, 본 발명은
- 적어도 하나의, 특히 RNA 트리포스파타제의 촉매 도메인,
- 적어도 하나의, 특히 구아닐릴트랜스퍼라제의 촉매 도메인,
- 적어도 하나의, 특히 N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 촉매 도메인 및
- 적어도 하나의, 특히 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매적 도메인을 포함하는 본 발명의 키메라 효소에 관한 것이며, 단
- RNA 트리포스파타제의 촉매 도메인,
- 구아닐릴트랜스퍼라제의 촉매 도메인,
- N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 촉매 도메인 및
- 핵 진핵세포 DNA-의존성 RNA 폴리머라제 I, II 및/또는 III의 유일한 촉매 도메인; 및 보다 특히는, DNA-의존성 RNA 폴리머라제 II의 유일한 촉매 도메인(들)을 포함하는 키메라 효소는 제외된다.
특히, 본 발명은
- 적어도 하나의, 특히 RNA 트리포스파타제의 촉매 도메인,
- 적어도 하나의, 특히 구아닐릴트랜스퍼라제의 촉매 도메인,
- 적어도 하나의, 특히 N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 촉매 도메인 및
- 적어도 하나의, 특히 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매적 도메인을 포함하는 본 발명의 키메라 효소에 관한 것이며, 단
- RNA 트리포스파타제의 촉매 도메인,
- 구아닐릴트랜스퍼라제의 촉매 도메인,
- N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 촉매 도메인 및
- 핵 진핵세포 DNA-의존성 RNA 폴리머라제 I, II 및/또는 III의 촉매 도메인; 및 보다 특히는, DNA-의존성 RNA 폴리머라제 II의 적어도 하나의 촉매 도메인을 포함하는 키메라 효소는 제외된다.
특히, 진핵 숙주 세포에서 발현시키면, 본 발명에 따르는 상기 키메라 효소는, 바람직하게는 진핵세포 번역 장치에 의해 번역가능한, 5'-말단 m7GpppN 캡을 갖는 RNA 분자를 합성할 수 있다.
특히, 진핵 숙주 세포에서 발현시키면, RNA 트리포스파타제, 구아닐릴트랜스퍼라제 및 N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인은 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인에 의해 합성된 RNA 분자의 5'-말단에서 m7GpppN 캡을 부가할 수 있고, 바람직하게는 5'-말단 m7GpppN 캡을 갖는 상기 RNA 분자는 진핵세포 번역 장치에 의해 번역할 수 있다.
특히, 진핵 숙주 세포에서 발현시키면, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인이 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인인 경우, RNA 트리포스파타제, 구아닐릴트랜스퍼라제 및 N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인은, 이들의 5' 말단에서 구아노신 리보뉴클레오티드를 갖는 RNA 분자의 5'-말단에 m7GpppN 캡을 부가할 수 있다.
특히, 진핵 숙주 세포에서 발현시키면, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인이 박테리아 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인인 경우, RNA 트리포스파타제, 구아닐릴트랜스퍼라제 및 N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인은, 이들의 5' 말단에서 구아노신 또는 아데노신 리보뉴클레오티드를 갖는 RNA 분자의 5'-말단에서 m7GpppN 캡을 부가할 수 있다.
특히, 진핵 숙주 세포에서 발현시키면, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인이 사람 또는 마우스 미토콘드리아 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인인 경우, RNA 트리포스파타제, 구아닐릴트랜스퍼라제 및 N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인은, 이들의 5' 말단에서 아데노신 또는 티미딘 리보뉴클레오티드를 갖는 RNA 분자의 5'-말단에서 m7GpppN 캡을 부가할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 효소의 "촉매 도메인"은, 특히 이의 3차원 구조에서, 효소 기능을 보장하기에 필요하고 충분한 도메인에 관한 것이다. 예를 들면, RNA 트리포스파타제의 촉매 도메인은 RNA 트리포스파타제 기능을 보장하기에 필요하고 충분한 도메인이다. 용어 "촉매 도메인"은 야생형 또는 돌연변이체 효소의 촉매 도메인을 포함한다.
본 발명에 따르는 키메라 효소는 적어도 상기 촉매 도메인을 포함하지만, 상기 촉매 도메인을 함유하는 효소 전체 또는 일부분을 추가로 포함할 수 있다. 실제로, 본 발명에 따르는 키메라 효소의 한 가지 양태에 따라, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 DNA-의존성 RNA 폴리머라제, 바람직하게는 단량체성 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 전부 또는 일부에 포함될 수 있다. RNA 트리포스파타제의 상기 촉매 도메인, 구아닐릴트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인 및 N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인은 또한 캡핑 효소, 바람직하게는 단량체성 캡핑 효소의 전부 또는 일부에 포함될 수 있다.
본 발명에 따르는 키메라 효소는 핵 효소, 아세포 구획 효소(subcellular compartment enzyme) 또는 세포질 효소일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르는 키메라 효소는, 세포에서 효소의 전달을 유도하는, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 시그날 펩티드 또는 마커-시그날을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따르는 키메라 효소는 당해 효소를 핵으로 유도하는 핵 국지화 시그날(NLS)을 포함할 수 있다. 이러한 NLS는 종종 5개의 기본적 양전하 아미노산으로 이루어진 단위이다. NLS는 펩티드 쇄 상의 어느 곳에도 위치할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따르는 키메라 효소는 세포질 키메라 효소이다. 특히, 이는, 세포질을 제외하고는, 당해 효소의 전달을 유도하는 시그날 펩티드 또는 마커-시그날을 포함하지 않는다.
본 발명에 따르는 키메라 효소의 세포질 국지화는, 세포질로부터 진핵 세포의 핵으로의 거대 DNA 분자(즉, 도입유전자)의 활발한 이동 및 핵으로부터 세포질로의 RNA 분자의 이출을 피함으로써 도입유전자 발현 수준을 최적화시키는 잇점을 갖는다.
따라서, 본 발명에 따르는 이들 세포질 키메라 효소는, 현저히 높은 양의 형질감염된 DNA가 핵과 비교하여 통상 발견되는 세포질에서 작동할 수 있는, 숙주 독립적, 진핵세포 유전자 발현 시스템을 생성하는데 유용할 수 있다.
본 발명에 따르는 이들 세포질 키메라 효소는, 세포독성 및 아폽토시스 유도 없이, 진핵세포 세포질 번역 장치에 의해 고도로 번역가능한, 5'-말단 m7GpppN 캡을 갖는 RNA 분자를 합성할 수 있다.
내인성 유전자 전사가, 세포질에서 일어나는 도입유전자 전사와 대조적으로, 진핵 세포의 핵에서 일어나기 때문에, 내인성 유전자 잔사와 도입유전자 전사 사이에 경쟁이 없다.
따라서, 본 발명에 따르는 세포질 키메라 효소는 특히 대규모 분석 및 단백질 생산에 적절하다.
본 발명에 따르는 키메라 효소의 한 가지 양태에서, RNA 트리포스파타제의 상기 촉매 도메인, 구아닐릴트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인 및 N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인은 단량체, 즉 하나의 폴리펩티드에 포함된다. 예를 들면, 상기 단량체는 본 발명에 따르는 단량체성 캡핑 효소 또는 단량체성 키메라 효소일 수 있다.
특히, RNA 트리포스파타제의 상기 촉매 도메인, 구아닐릴트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인 및 N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인은 단량체성 캡핑 효소에 포함된다. 이 경우, 본 발명에 따르는 키메라 효소는 단량체성 캡핑 효소를 포함하고, 이 효소는 RNA 트리포스파타제의 상기 촉매 도메인, 구아닐릴트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인 및 N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인을 포함한다. 상기 단량체성 캡핑 효소는, RNA 분자의 5'-말단에서 m7GpppN 캡을 부가할 수 있는, 특히 야생형 청설병 바이러스 캡핑 효소, 야생형 대나무 모자이크 바이러스 캡핑 효소, 야생형 아프리카 돼지열 바이러스 캡핑 효소, 야생형 아칸트아메바 폴리파가 미미바이러스(acanthamoeba polyphaga mimivirus) 캡핑 효소 및 이의 돌연변이체 및 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단량체성 바이러스 캡핑 효소 및 보다 특히는 야생형 아프리카 돼지열 바이러스 캡핑 효소일 수 있다.
특히, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 또한 단량체, 즉 하나의 폴리펩티드에 포함될 수 있다. 예를 들면, 상기 단량체는 본 발명에 따르는 단량체성 DNA-의존성 RNA 폴리머라제 또는 단량체성 키메라 효소일 수 있다.
특히, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 단량체성 DNA-의존성 RNA 폴리머라제에 포함된다. 이 경우, 본 발명에 따르는 키메라 효소는, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인을 포함하는, 단량체성 DNA-의존성 RNA 폴리머라제를 포함한다. 상기 단량체성 DNA-의존성 RNA 폴리머라제는 단량체성 파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제일 수 있고, 특히 5' → 3' 방향에서 이본쇄 주형 DNA에 서열 상보성이 있는 일본쇄 RNA를 합성할 수 있는, T7 RNA 폴리머라제, T3 RNA 폴리머라제 및 SP6 RNA 폴리머라제 및 이의 돌연변이체 또는 유도체로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있고, 보다 특히는 5' → 3' 방향에서 이본쇄 주형 DNA에 서열 상보성이 있는 일본쇄 RNA를 합성할 수 있는 T7 RNA 폴리머라제 및 이의 돌연변이체 또는 유도체로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다.
DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인 및
- RNA 트리포스파타제의 상기 촉매 도메인,
- 구아닐릴트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인 및
- N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인으로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 2개 및 보다 바람직하게는 전체 촉매 도메인은 단량체에 포함될 수 있다.
본 발명에 따르는 키메라 효소는 단량체성 또는 올리고머성일 수 있다. 실제로, RNA 트리포스파타제, 구아닐릴트랜스퍼라제, N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제 및 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 하나 또는 수 개의 폴리펩티드에 포함될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따르는 키메라 효소는 단량체성일 수 있다.
실제로, 본 발명자는, RNA 트리포스파타제의 촉매 도메인, 구아닐릴트랜스퍼라제의 촉매 도메인, N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 촉매 도메인 및 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인을 포함하는 단량체성 키메라 효소가, 세포독성 및 아폽토시스 유도 없이, 진핵 번역 장치에 의해 고도로 번역가능한, 5'-말단 m7GpppN 캡을 갖는 RNA 분자를 합성할 수 있음을 증명했다.
이들의 천연 구조로 유지되어야 하는, 입체 장애 및 성분 및 효소에 기인하여, 전사체의 캡핑이 단량체성 효소로 발생다는 것은 자명하지 않다. 실제로, T7 전사체의 캡핑은, 발생 RNA 분자의 5'-말단에서 m7GpppN 캡을 유발하는 것으로 가정하더라도, 융합 효소 CTD-T7 RNA 폴리머라제에 의해 달성될 수 없다.
본 발명에 따르는 단량체성 키메라 효소는, 특히 저렴하고 신속하며 실시가 용이하여 대규모 분석 및 단백질 생산에 상당히 적절하다는 잇점을 갖는다. 실제로, 단량체성 효소의 생산은 올리고머성 효소보다 더욱 용이하다. 또한, 단일-단위만이 존재하기 때문에, 단위 조립 문제가 없다. 단량체성 효소는 또한 다량체성 효소보다 조작이 보다 용이하다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "DNA-의존성 RNA 폴리머라제"(RNAP)는 5'→3' 방향에서 이본쇄 주형 DNA에 서열 상보성이 있는 일본쇄 RNA를 합성하는 뉴클레오티딜 트랜스퍼라제에 관한 것이다.
바람직하게는, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 효소의 촉매 도메인이고, 이는 비교적 단순한 구조이고 보다 바람직하게는 게놈 효소 조절 요소(즉, 프로모터, 전사 종결 시그날 및 연쇄 접합)를 특성화한다. 따라서, 특히, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제, 박테리아 DNA-의존성 RNA 폴리머라제 또는 각종 진핵세포 세포기관(예: 미토콘드리아, 엽록체 및 전색소체)의 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인일 수 있다.
한 가지 양태에서, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인이다.
박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제는 특히 진핵세포 RNA 폴리머라제보다 높은 처리능을 가짐으로써 도입유전자 발현 수준을 최적화하는 잇점을 상당히 갖는다. 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제는 또한, 다중 서브유닛(예: RNA 폴리머라제 II)와 함께 복잡한 구조를 갖는 대부분 핵 진핵세포 폴리머라제보다 훨씬 단순한 구조를 갖는다[참조: Chen and Schneider 2005]. 지금까지 특성화된 대부분의 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제는 단일-서브유닛 효소이고, 이는 전사의 개시, 신장 또는 종결을 위해 보조 단백질을 필요로 하지 않는다[참조: Chen and Schneider 2005]. 클로닝된 박테리오파지에 대해 명명화된 이들 효소 중의 몇가지는 또한 잘 특성화된 조절 게놈 요소(즉, 프로모터, 종결 시그날, 전사 정지 서열)을 갖고, 이들은 유전자도입에 중요하다.
또한, 내인성 유전자 전사와 도입유전자 전사 사이에 경쟁이 없다. 박테리오파지 DNA 의존성 RNA-폴리머라제 잔기를 포함하는 본 발명에 따르는 키메라 효소는, 임의의 진핵세포 종(예: 효모, 설치류 및 사람)에서 RNA 전사체의 생산을 가능하게 한다. 이들은 저렴하고 신속하며 실시가 용이하여 대규모 분석 및 단백질 생산에 적절하고, RNA 폴리머라제 II 등의 진핵세포 RNA 폴리머라제와 대조적으로, 대부분의 박테리오파지 DNA 의존성 RNA 폴리머라제가 전사의 개시, 신장 또는 종결을 위해 관련 인자를 필요로 하지 않기 때문에, 임의의 생물학적 시스템(예: 세포 반응 혼합물, 배양된 세포 및 살아있는 생물체)에서 RNA 전사체의 생산을 가능하게 한다.
박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인, 특히 T7 RNA 폴리머라제의 야생형, T3 RNA 폴리머라제의 야생형(NCBI 게놈 서열 ID# NC_003298; GeneID# 927437; UniProtKB/Swiss-Prot ID# Q778M8), K11 RNA 폴리머라제의 야생형(NCBI 게놈 K11 RNAP 서열 ID# NC_004665; GeneID# 1258850; UniProtKB/Swiss-Prot ID# Q859H5), ψA1122 RNA 폴리머라제의 야생형(NCBI 게놈 서열 ID# NC_004777; GeneID# 1733944; UniProtKB/Swiss-Prot 단백질 ID# Q858N4), ψYeo3-12 RNA 폴리머라제의 야생형(NCBI 게놈 서열 ID# NC_001271; GeneID# 1262422; UniProtKB/Swiss-Prot ID# Q9T145) 및 gh-1 RNA 폴리머라제의 야생형(NCBI 게놈 서열 ID# NC 004665; GeneID# 1258850; UniProtKB/Swiss-Prot 단백질 ID# Q859H5), K1-5 RNAP RNA 폴리머라제의 야생형(NCBI 게놈 서열 ID# NC_008125; GeneID# 5075932 UniProtKB/Swiss-Prot 단백질 ID# Q8SCG8) 및 SP6 RNA 폴리머라제의 야생형(NCBI 게놈 서열 ID# NC_004831; GeneID# 1481778; UniProtKB/Swiss-Prot 단백질 ID# Q7Y5R1) 및 이의 돌연변이체 또는 유도체로 이루어진 그룹에서 선택된 촉매 도메인일 수 있고, 이들은 5'→3' 방향에서 이본쇄 주형 DNA에 서열 상보성이 있는 일본쇄 RNA를 합성할 수 있고, 보다 특히는 T7 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "T7 RNA 폴리머라제"는 박테리오파지 T7 DNA-의존성 RNA 폴리머라제에 관한 것이다. 바람직하게는, T7 RNA 폴리머라제는 서열번호 1의 아미노산 서열(NCBI 게놈 서열 ID# NC_001604; GeneID# 1261050; UniProtKB/Swiss-Prot ID# P00573)을 갖고, 98.8kDa의 분자량을 갖는 883개 아미노산 단백질이다[참조: Davanloo, Rosenberg et al. 1984; Moffatt, Dunn et al. 1984].
T7 RNA 폴리머라제는 특히, 시험관내에서 당해 효소가 매우 처리능이 있고, 5'→3' 방향에서 37℃에서 240 내지 250 개 뉴클레오티드/s를 신장시킨다[참조: Golomb and Chamberlin 1974; Lyakhov, He et al. 1997; Zhang and Studier 1997; Finn, MacLachlan et al. 2005]. 더욱이, 진핵 세포에서 발현되는 경우, T7 RNA 폴리머라제는 대부분 세포질에서 유지되며[참조: Elroy-Stein and Moss 1990; Gao and Huang 1993; Brisson, He et al. 1999], 따라서 세포질로부터 진핵 세포 핵으로 거대 DNA 분자(즉, 도입유전자)의 활발한 이동 및 핵으로부터 세포질로 RNA 분자의 이출을 피함으로써 도입유전자 발현 수준을 최적화한다.
DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인은 T7 RNA 폴리머라제의 야생형 뿐만 아니라 T7 RNA 폴리머라제의 돌연변이체 중의 하나일 수 있고, 이는 감소된 처리능에서도 5'→3' 방향에서 이본쇄 주형 DNA에 서열 상보성이 있는 일본쇄 RNA를 합성할 수 있다. 예를 들면, 상기 돌연변이체는 R551S, F644A, Q649S, G645A, R627S, I810S 및 D812E[참조: Makarova, Makarov et al. 1995] 및 K631M[참조: Osumi-Davis, de Aguilera et al. 1992; Osumi-Davis, Sreerama et al. 1994]로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다.
본 발명에 따르는 키메라 효소의 한 가지 양태에서, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 RNA 트리포스파타제의 상기 촉매 도메인, 구아닐릴트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인 및 N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인에 대해 C-말단에 위치된다.
실제로, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인이 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인, 특히 T7, T3 및 SP6-RNA 폴리머라제로 이루어진 그룹에서 선택된 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인인 경우, 상기 촉매 도메인은 바람직하게는 이의 천연 카복실 말단을 보존한다. 특히, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인, 특히 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인의 C-말단은 상기 키메라 효소의 C-말단에 상응한다. 특히, 키메라 효소가 전체 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제, 특히 T7, T3 및 SP6-RNA 폴리머라제로 이루어진 그룹에서 선택된 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제인 경우, 상기 폴리머라제는 바람직하게는 이의 천연 카복실-말단을 보존한다. 특히, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인, 특히 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인의 C-말단은 상기 키메라 효소의 C-말단에 상응한다. 특히, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인, 특히 T7, T3 및 SP6-RNA 폴리머라제로 이루어진 그룹에서 선택된 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 전체 또는 일부에 포함되고, 이때 상기 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 C-말단은 상기 키메라 효소의 C-말단에 상응한다.
본 발명에 따르는 키메라 효소의 한 가지 양태에서, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인, 특히 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인, 특히 T7, T3 및 SP6-RNA 폴리머라제로 이루어진 그룹에서 선택된 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 RNA 트리포스파타제의 상기 촉매 도메인, 구아닐릴트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인 및 N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인에 대하여 C-말단에 위치된다.
또 다른 양태에서, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 박테리아 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인이다.
바람직하게는, 상기 박테리아 DNA-의존성 RNA 폴리머라제는 적당한 구조 복잡성을 갖는다.
예를 들면, 상기 박테리아 DNA-의존성 RNA 폴리머라제는 이. 콜라이(E. coli) DNA-의존성 RNA 폴리머라제(K-12 기질 DH10B ID# NC_010473의 NCBI 게놈 서열)일 수 있고, 이는 4개의 상이한 서브유닛(α 서브유닛: rpoA GeneID# 6060938, UniProtKB/Swiss-Prot ID# B1X6E7; β 서브유닛: rpoB GeneID# 6058462, UniProtKB/Swiss-Prot ID# B1XBY9; β' 서브유닛: rpoC GeneID# 6058956, UniProtKB/Swiss-Prot ID# B1XBZ0; σ 서브유닛: rpoE GeneID# 6060683, UniProtKB/Swiss-Prot ID# B1XBQ0)으로 이루어져 있고, 5개의 ααββ'σ 서브유닛 복합체(Lodish, Berk et al. 2008)에서 조립된다. 이. 콜라이 RNA 폴리머라제 프로모터[참조: Lisser and Margalit 1993], rho-의존성 및 -독립성 터미네이터[참조: Platt 1986; Uptain and Chamberlin 1997] 및 전사 중지 서열[참조: Lee, Phung et al. 1990]을 포함하는, 효소 활성의 조절에 수반된 게놈 요소는 잘 특성화되어 있다.
또 다른 양태에서, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 미토콘드리아, 엽록체 및 전색소체와 같이 진핵세포 세포기의 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인이다. 실제로, 이들 폴리머라제는 또한 비교적 단순한 구조를 가질 수 있다.
DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 포유동물 마우스 미토콘드리아 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인일 수 있고, 이는 단일 단위 120 kDa 단백질(GeneID# 216151, UniProtKB/Swiss-Prot ID# Q8BKF1)이고 박테리오파지 RNA 폴리머라제와 상동성을 공유한다[참조: Tiranti, Savoia et al. 1997]. 몇몇 전사 인자는 전사 개시, 신장 또는 종결에 요구된다: 전사 종결을 위한 TFB1M (미토콘드리아 전사 인자 Bl; 마우스 GeneID# 224481, UniProtKB/Swiss-Prot ID# Q8JZM0) 또는 TFB2M (미토콘드리아 전사 인자 B2; 마우스 GeneID# 15278, UniProtKB/Swiss-Prot ID# Q3TL26), TFAM (미토콘드리아 전사 인자 A; 마우스 GeneID# 21780, UniProtKB/Swiss-Prot ID# P40630), 및 mTERF (미토콘드리아 전사 종결 인자; 마우스 GeneID# 545725, UniProtKB/Swiss-Prot ID# Q8CHZ9)[참조: Fisher and Clayton 1985; Fisher, Topper et al. 1987; Fisher and Clayton 1988; Topper and Clayton 1989; Fernandez-Silva, Martinez-Azorin et al. 1997; Prieto-Martin, Montoya et al. 2001; McCulloch, Seidel-Rogol et al. 2002]. 전사 종결 시그날[참조: Kruse, Narasimhan et al. 1989] 뿐만 아니라 미토콘드리아 게놈[참조: Ojala, Montoya et al. 1981; Clayton 1991]의 경쇄 및 중쇄에서 2개의 프로모터를 포함하는, 미토콘드리아 RNA 폴리머라제의 효소 활성의 조절에 수반된 게놈 요소는 잘 특성화되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "RNA 트리포스파타제"(RTPase)는, 발생 프리-mRNA의 5' 트리포스페이트 말단의 감마 포스페이트 잔기를 제거하여 디포스페이트로 되게 하는 효소이다[참조: Furuichi and Shatkin 2000].
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "RNA 구아닐릴트랜스퍼라제"(GTase)는, GMP를 GTP로부터 디포스페이트 발생 RNA 말단으로 전달하는 효소를 지칭한다[참조: Furuichi and Shatkin 2000].
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제"(N7-MTase)는, 구아닌의 질소 7상의 메틸 잔기를 GpppN 캡에 부가하는 효소에 관한 것이다[참조: Furuichi and Shatkin 2000].
RNA 트리포스파타제, 구아닐릴트랜스퍼라제, N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인은 동일하거나 상이한 캡핑 효소의 것일 수 있다. 상기 촉매 도메인이 동일한 효소의 것이면, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 상이한 효소의 것이다.
바람직하게는, RNA 트리포스파타제, 구아닐릴트랜스퍼라제, N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인은, 유리하게는 비교적 단순한 구조 및 잘 특성화된 효소 활성을 갖는 하나 또는 수개의 세포질 효소로부터 기원한다. 따라서, 특히, RNA 트리포스파타제, 구아닐릴트랜스퍼라제, N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인은 하나 또는 수개의 바이러스 캡핑 효소, 또는 세포질 에피좀의 캡핑 효소의 촉매 도메인일 수 있다.
한 가지 양태에서, RNA 트리포스파타제, 구아닐릴트랜스퍼라제, N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인은 하나 또는 수개의 바이러스 캡핑 효소, 특히 야생형 청설병 바이러스 캡핑 효소, 야생형 대나무 모자이크 바이러스 캡핑 효소, 야생형 아프리카 돼지열 바이러스 캡핑 효소, 야생형 아칸트아메바 폴리파가 미미바이러스 캡핑 효소 및 이의 돌연변이체 또는 유도체로 이루어진 그룹에서 선택된 효소의 것이고, 이들은 각각 발생 프리-mRNA의 5' 트리포스페이트 말단의 감마 포스페이트 잔기를 제거하여 디포스페이트로 되게 하거나, GMP를 GTP로부터 디포스페이트 발생 RNA 말단으로 전달하거나, 구아닌의 질소 7 상의 메틸 잔기를 GpppN 캡에 부가할 수 있고, 보다 특히는 야생형 아프리카 돼지열 바이러스 캡핑 효소의 것일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "청설병 바이러스 캡핑 효소"는 청설병 바이러스(BTV)의 단일-단위 VP4 캡핑 효소에 관한 것이고, 이는 74 kDa 단백질이다(644개 아미노산; 서열의 경우, 예를 들면, NCBI BTV 혈청형 10 게놈 서열 ID# Y00421; GeneID# 2943157; UniProtKB/Swiss-Prot ID# P07132, D0UZ45, Q5J7C0, Q65751, Q8BA65, P33428, P33429, P33427, C3TUP7, Q8BAD5, C5IWW0, B4E551, Q3KVQ2, Q3KVQ1, Q65732, Q3 VP8, Q3KVP9, Q3KVQ0). 이러한 캡핑 효소는 이의 카복실 말단에 인접하여 위치된 류신 지퍼를 통해 호모이량체화할 수 있다[참조: Ramadevi, Rodriguez et al. 1998]. VP4는 mRNA m7GpppN 캡핑 합성에 요구된 모두 3개의 효소 단계를 촉매한다: RTPase (Martinez-Costas, Sutton et al. 1998), GTase (Martinez-Costas, Sutton et al. 1998; Ramadevi, Burroughs et al. 1998) 및 N7-MTase (Ramadevi, Burroughs et al. 1998).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대나무 모자이크 바이러스 효소"는 ORF1, 대나무 모자이크 바이러스(BMV) mRNA 캡핑 효소에 관한 것이고, 이는 단일-단위 155-kDa 단백질이다(1365-아미노산; NCBI BMV 분리물 BaMV-0 게놈 서열 ID# NC 001642; GeneID# 1497253; UniProtKB/Swiss-Prot ID# Q65005). ORF1 단백질은 m7GpppN mRNA 캡핑, 즉 RTPase [참조: Li, Shih et al. 2001; Han, Tsai et al. 2007], GTase 및 N7-MTase [참조: Li, Chen et al. 2001; Li, Shih et al. 2001]을 생성하는데 필요한 모든 효소 활성을 갖는다. 또한, ORF1은 RNA-의존성 RNA-폴리머라제 활성을 갖고, 이는 본 발명에 따르는 키메라 효소 활성에 지배되지 않으며, mRNA 캡핑 효소의 Asp1229 Asp1230 잔사의 결실에 의해 파괴될 수 있다[참조: Li, Cheng et al. 1998]. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아프리카 돼지열 바이러스 캡핑 효소"는 NP868R 캡핑 효소(G4R), (ASFV)에 관한 것이며, 이는 단일-단위 100 kDa 단백질이다(868 아미노산; NCBI ASFV 게놈 서열 균주 BA71V ID# NC_001659; GeneID# 1488865; UniProtKB/Swiss-Prot ID# P32094).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아칸트아메바 폴리파가 미미바이러스 캡핑 효소"는 또다른 단일 단위 136.5 kDa 단백질인 R382(APMV)에 관한 것이다(1170 아미노산; NCBI APMV 게놈 서열 ID# NC_006450; GeneID# 3162607; UniProtKB/Swiss-Prot ID# Q5UQX1).
한 가지 양태에서, RNA 트리포스파타제, 구아닐릴트랜스퍼라제, N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인은 pGKL2와 같이 세포질 에피좀의 하나 또는 수개의 캡핑 효소의 것이다. 특히, RNA 트리포스파타제, 구아닐릴트랜스퍼라제, N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인은 효모 선형 염색체외 에피좀 pGKL2의 캡핑 효소의 전부 또는 일부에 포함된다.
세포질 선형 에피좀은 이본쇄 DNA 구조이고, 이는 다양한 효모 균주의 세포질에서 안정하게 복제한다[참조: Cong, Yarrow et al. 1994]. 효모 선형 염색체외 에피좀의 한 가지 프로토타입, pgKL2(13,457 bp; 또한 pGK12로 명명됨)은 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) CB 2359 및 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) F102-2를 포함하는 다양한 효모 균주로부터 완전히 서열분석되었다[참조: Tommasino, Ricci et al. 1988]. 클루이베로마이세스 락티스 pGKL2의 ORF3 유전자에 의해 인코딩된 캡핑 효소(NCBI 클루이베로마이세스 락티스 CB 2359 pGKL2 게놈 서열 ID# NC_010187; UniProtKB/Swiss-Prot ID# P05469)은 594 아미노산 단백질(70.6 kDa 단백질)이다.
본 발명에 따르는 키메라 효소의 한 가지 양태에서, 적어도 2개, 특히 적어도 3개 및 보다 특히는 전체 촉매 도메인은 연결 펩티드에 의해 조립, 융합 또는 직접 또는 간접적으로 결합될 수 있다.
특히, - RNA 트리포스파타제의 촉매 도메인,
- 구아닐릴트랜스퍼라제의 촉매 도메인,
- N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 촉매 도메인 및
- DNA-의존성 RNA 폴리머라제로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 2개, 특히 적어도 3개 및 보다 특히는 전체 촉매 도메인은 직접 또는 연결 펩티드에 의해 결합된다.
연결 펩티드는, 입체 장애를 최소화하고 충분한 공간이 융합 단백질의 성분에 제공되어 이들의 천연 배좌를 유지하는 융합 단백질을 생성하는 잇점을 갖는다.
바람직하게는, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 적어도 상기 촉매 도메인은
- RNA 트리포스파타제의 상기 촉매 도메인;
- 구아닐릴트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인; 및
- N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인으로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 촉매 도메인에 연결 펩티드에 의해 결합된다.
특히, 연결 펩티드는 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인, 특히 T7, T3 및 SP6-RNA 폴리머라제로 이루어진 그룹에서 선택된 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인에 대해 N-말단에 위치할 수 있고, RNA 트리포스파타제의 상기 촉매 도메인, 구아닐릴트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인 및 N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인에 대해 C-말단에 위치할 수 있다.
특히, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인, 특히 T7, T3 및 SP6-RNA 폴리머라제로 이루어진 그룹에서 선택된 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인의 N-말단은,
- RNA 트리포스파타제의 상기 촉매 도메인,
- 구아닐릴트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인 및
- N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나의 촉매 도메인의 C-말단에 공유 결합, 특히 연결 펩티드에 의해 연결된다.
상기 연결 펩티드는
- 화학식 (GlymSerp)n의 펩티드(여기서, m은 0 내지 12의 정수, 특히 1 내지 8의 정수 및 보다 특히는 3 내지 6 및 보다 특히는 4의 정수이고, p는 0 내지 6의 정수, 특히 0 내지 5의 정수, 보다 특히는 0 내지 3 및 특히 1의 정수이고, n은 0 내지 30의 정수, 특히 0 내지 12, 보다 특히는 0 내지 8 및 더욱 특히는 1 내지 6의 정수이다),
- 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 펩티드로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
화학식(GlymSerp)n의 가요성 링커 펩티드는, 글리신 잔기가 펩티드 가요성을 제공하고 세린이 일부 가용성을 제공하는 잇점을 갖는다[참조: Huston, Levinson et al. 1988]. 추가로, 화학식 (GlymSerp)n 링커 서열 중의 키로트립신 I, 인자 Xa, 파파인, 플라스민, 트롬빈 및 트립신에 대한 감수성 부위의 부재는 생성 융합 단백질의 전체 안정성을 증가시키는 것으로 생각된다[참조: Crasto and Feng 2000].
가변 길이의 화학식 (GlymSerp)n 링커는 일본쇄 Fv 단편(sFv) 항체를 작제하기 위해 통상 사용된다[참조: Huston, Levinson et al. 1988]. 또한, 화학식 (GlymSerp)n 링커는 각종 융합 단백질을 생성하기 위해 사용되었고, 이는 종종 이들의 성분 각각의 생물학적 활성을 보유한다[참조: Newton, Xue et al. 1996; Lieschke, Rao et al. 1997; Shao, Zhang et al. 2000; Hu, Li et al. 2004].
다른 형태의 펩티드 링커는 또한 본 발명에 따르는 키메라 효소, 예를 들면, GGGGIAPSMVGGGGS(서열번호 2)[참조: Turner, Ritter et al. 1997], SPNGASNSGSAPDTSSAPGSQ(서열번호 3)[참조: Hennecke, Krebber et al. 1998], EGKSSGSGSESKSTE(서열번호 4)[참조: Bird, Hardman et al. 1988], EGKSSGSGSESKEF(서열번호 5)[참조: Newton, Xue et al. 1996], GGGSGGGSGGGTGGGSGGG(서열번호 6)[참조: Robinson and Sauer 1998], GSTSGSGKSSEGKG(서열번호 7)[참조: Bedzyk, Weidner et al. 1990], YPRSIYIRRRHPSPSLTT(서열번호 8)[참조: Tang, Jiang et al. 1996], GSTSGSGKPGSGEGSTKG(서열번호 9)[참조: Whitlow, Bell et al. 1993], GSTSGSGKPGSGEGS(서열번호 10)[참조: Ting, Kain et al. 2001], SSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDA(서열번호 l1)[참조: Pantoliano, Bird et al. 1991], GSADDAXXDAAXKDDAKKDDAKKDGS(서열번호 12)[참조: Gregoire, Lin et al. 1996], LSADDAKKDAAKKDDAKKDDAKKDL(서열번호 13)[참조: Pavlinkova, Beresford et al. 1999], AEAAAKEAAAKEAAAKA(서열번호 14)[참조: Wickham, Carrion et al. 1995], GSHSGSGKP(서열번호 15)[참조: Ting, Kain et al. 2001], GSTSGSGKPGSGEGSTGAGGAGSTSGSGKPSGEG(서열번호 16)[참조: Ting 2003], LSLEVAEEIARLEAEV(서열번호 17)[참조: Liu, Jian-Bo et al. 2005], 및 GTPTPTPTPTGEF(서열번호 18)[참조: Gustavsson, Lehtio et al. 2001]을 생성하는 것으로 고려될 수 있다.
다른 종류의 공유 결합은, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 디설파이드 결합[참조: Mantile, Fuchs et al. 2000], 트랜스글루타민화[참조: Paguirigan and Beebe 2007] 및 화학적 및/또는 물리적 제제에 의한 단백질 트랜스-결합, 예를 들면, 트리스(비피리딘)루테늄(II)-디클로라이드 및 자외선광 조사를 포함한다[참조: Fancy and Kodadek 1999].
RNA 트리포스파타제, 구아닐릴트랜스퍼라제, N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제 및 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 또한 특정한 단백질 요소, 예를 들면, 류신 지퍼에 의해 조립될 수 있고, 예를 들면, 본 발명에 따르는 키메라 효소에서 비오티닐화 도메인을 촉매 도메인의 하나(예: Avi-tag II(Cronan 1990) 또는 PFB-tag(Wu, Yeung et al. 2002)) 및 비오틴 결합 도메인을 다른 촉매 도메인의 하나(예를 들면, 스트렙-tag II(Schmidt and Skerra 1993) 또는 nono-tag(Lamla and Erdmann 2004))로 조립될 수 있다.
본 발명에 따르는 키메라 효소의 한 가지 양태에서, 적어도 2개의 상기 촉매 도메인은 비공유 결합, 특히 류신 지퍼에 의해 조립될 수 있다.
바람직하게는, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 적어도 상기 촉매 도메인은 비공유 결합, 특히 류신 지퍼에 의해
- RNA 트리포스파타제의 상기 촉매 도메인,
- 구아닐릴트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인 및
- N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인으로 이루어진 그룹에서 선택된 촉매 도메인의 적어도 하나로 조립될 수 있다.
서로 상호작용하는 2개의 양쪽성 α-헬릭스로 이루어진 이량체성 나선형-코일 단백질 구조인 류신 지퍼는 통상 단백질을 호모- 또는 헤테로-이량체화하는데 사용된다[참조: O'Shea, Klemm et al. 1991]. 각각의 헬릭스는 7개의 아미노산의 반복체로 이루어져 있고, 여기서 제1 아미노산(잔기 a)는 소수성이며, 제4 아미노산(잔기 d)는 통상 류신이며, 다른 잔기는 극성이다. 평행한 헤테로이량체성 2본쇄 나선형 코일 구조를 형성하는 류신 지퍼 VELCRO ACID-p1 및 BASE-p1은 평행 단백질 헤테로-이량체를 형성하는 높은 경향을 갖는다[참조: O'Shea, Lumb et al. 1993]. 이들은 몇몇 가용성 단백질[참조: Busch, Reich et al. 1998; Busch, Pashine et al. 2002] 뿐만 아니라 구성원 단백질[참조: Chang, Bao et al. 1994; Pashine, Busch et al. 2003]을 헤테로이량체화하는데 사용되었다.
다른 종류의 올리고머화 펩티드 도메인은 또한 본 발명에 따르는 키메라 효소를 생성하고 본 발명에 따르는 키메라 효소의 적어도 2개의 상기 도메인, 특히 항평행 헤테로이량체성 구조를 형성하는 류신 지퍼, 예를 들면, ACID-al/BASE-al (Oakley and Kim 1998), ACID-Kg/BASE-Eg (McClain, Woods et al. 2001), NZ/CZ (Ghosh, Hamilton et al. 2000), ACID-pLL/ BASE-pLL (Lumb and Kim 1995) 및 EE1234L 및 RR1234L (Moll, Ruvinov et al. 2001) 류신 지퍼를 조립하는 것으로 생각된다. 류신 지퍼의 디설파이드-연결된 버젼은 또한 본 발명에 따르는 디설파이드 나선형 코일-결합된 헤테로이량체성 키메라 효소[참조: O'Shea, Lumb et al. 1993] 뿐만 아니라 환원 조건하에 시스테인 잔기 사이의 쇄간 디설파이드 브릿지[참조: Wells and Powers 1986]를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, RNA 트리포스파타제, 구아닐릴트랜스퍼라제, N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제 및 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 적어도 2개의 상기 촉매 도메인은 류신 지퍼, 특히 항평행 헤테로이량체성 구조를 형성하는 류신 지퍼, 예를 들면, ACID-al/BASE-al(Oakley and Kim 1998), ACID-Kg/BASE-Eg(McClain, Woods et al. 2001), NZ/CZ(Ghosh, Hamilton et al. 2000) 및 ACID-pLL/ BASE-pLL 류신 지퍼, 디설파이드 나선형 코일-결합된 지퍼(O'Shea, Lumb et al. 1993), 및 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 브릿지(Wells and Powers 1986)에 의해 조립될 수 있다.
한 가지 양태에서, 본 발명에 따르는 키메라 효소는, 특히 링커 및 보다 특히는 화학식 (Gly3Ser)4 링커를 통해 5'→3' 방향에서 이본쇄 주형 DNA에 서열 상보성이 있는 일본쇄 RNA를 합성할 수 있는 야생형 T7 RNA 폴리머라제 또는 이의 돌연변이체 또는 유도체의 아미노 말단, 특히 T7 RNA 폴리머라제의 야생형에 융합된, RNA 분자의 5'-말단에서 m7GpppN 캡을 부가할 수 있는, 아프리카 돼지열 바이러스의 야생형 mRNA 캡핑 효소 또는 이의 돌연변이체 또는 유도체, 특히 야생형 아프리카 돼지열 바이러스 캡핑 효소를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명에 따르는 키메라 효소는, 특히 링커 및 보다 특히는 화학식 (Gly3Ser)4 링커를 통해 5'→3' 방향에서 이본쇄 주형 DNA에 서열 상보성이 있는 일본쇄 RNA를 합성할 수 있는 야생형 T3 RNA 폴리머라제 또는 이의 돌연변이체 또는 유도체의 아미노 말단, 특히 T3 RNA 폴리머라제의 야생형에 융합된, RNA 분자의 5'-말단에서 m7GpppN 캡을 부가할 수 있는, 아프리카 돼지열 바이러스의 야생형 mRNA 캡핑 효소 또는 이의 돌연변이체 또는 유도체, 특히 야생형 아프리카 돼지열 바이러스 캡핑 효소를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명에 따르는 키메라 효소는, 특히 링커 및 보다 특히는 화학식 (Gly3Ser)4 링커를 통해 5'→3' 방향에서 이본쇄 주형 DNA에 서열 상보성이 있는 일본쇄 RNA를 합성할 수 있는 야생형 SP6 RNA 폴리머라제 또는 이의 돌연변이체 또는 유도체의 아미노 말단, 특히 SP6 RNA 폴리머라제의 야생형에 융합된, RNA 분자의 5'-말단에서 m7GpppN 캡을 부가할 수 있는, 아프리카 돼지열 바이러스의 야생형 mRNA 캡핑 효소 또는 이의 돌연변이체 또는 유도체, 특히 야생형 아프리카 돼지열 바이러스 캡핑 효소를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명에 따르는 키메라 효소는, 류신 지퍼에 의해 조립된, RNA 분자의 5'-말단에서 m7GpppN 캡을 부가할 수 있는, 아프리카 돼지열 바이러스의 야생형 mRNA 캡핑 효소 또는 이의 돌연변이체 또는 유도체, 특히 야생형 아프리카 돼지열 바이러스 캡핑 효소 및
5'→3' 방향에서 이본쇄 주형 DNA에 서열 상보성이 있는 일본쇄 RNA를 합성할 수 있는, 야생형 T7 RNA 폴리머라제 또는 이의 돌연변이체 또는 유도체의 아미노 말단, 특히 T7 RNA 폴리머라제의 야생형을 포함한다.
본 발명에 키메라 효소는, 본 발명의 키메라 효소의 적어도 하나의 촉매 도메인, 특히 RNA 트리포스파타제의 촉매 도메인, 구아닐릴트랜스퍼라제의 촉매 도메인, N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 촉매 도메인 및 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인으로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나의 촉매 도메인의 활성을 증강시키는 도메인을 추가로 포함한다.
예를 들면, 본 발명의 키메라 효소의 적어도 하나의 촉매 도메인의 활성을 증강시키는 상기 도메인은, 고유한 효소 활성은 없지만 백시니아 mRNA 캡핑 효소의 D1R 서브유닛의 RNA N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제 활성을 현저히 증강시키는, 백시니아 바이러스 D12L 유전자에 의해 인코딩된 31-kDa 서브유닛일 수 있다(게놈 서열 ID# NC_006998.1; GeneID#3707515; UniProtKB/Swiss-Prot ID#YP_232999.1)[참조: (Higman, Bourgeois et al. 1992; Higman, Christen et al. 1994; Mao and Shuman 1994].
한 가지 양태에서, 본 발명의 키메라 효소는, 특히 링커 및 보다 특히는 화학식 (Gly3Ser)4 링커 및/또는 류신 지퍼에 의해 전체 또는 부분으로 조립된,
- RNA-트리포스파타제, RNA 구아닐릴트랜스퍼라제 및 RNA-구아닌 메틸트랜스퍼라제 효소 활성을 갖는, 백시니아 mRNA 캡핑 효소의 적어도 하나의 촉매 도메인, 특히 백시니아 바이러스 D1R 유전자에 의해 인코딩된 95 kDa 서브유닛(genomic sequence ID# NC 006998.1; GeneID# 3707562; UniProtKB/Swiss-Prot ID# YP 232988.1)[참조: Cong and Shuman 1993; Niles and Christen 1993; Higman and Niles 1994; Mao and Shuman 1994; Gong and Shuman 2003];
- DNA-의존성 RNA 폴리머라제, 특히 T7, T3 및 SP6-RNA 폴리머라제로 이루어진 그룹에서 선택된 폴리머라제 및 보다 특히는 T7 RNA 폴리머라제의 적어도 하나의 촉매 도메인 및
백시니아 바이러스 D12L 유전자에 의해 인코딩된 31-kDa를 포함한다.
본 발명은 또한 분리된 핵산 분자 또는 분리된 핵산 분자의 그룹에 관한 것이며, 상기 핵산 분자(들)는 본 발명에 따르는 키메라 효소를 인코딩한다.
본 발명에 따르는 키메라 효소를 인코딩하는 분리된 핵산 분자의 상기 그룹은, 이들의 발현에 의해 본 발명에 따르는 키메라 효소를 수득하는데 필요하고 충분한 모든 핵산 분자를 포함하거나 이들로 이루어진다.
한 가지 양태에서, 본 발명에 따르는 키메라 효소를 인코딩하는 분리된 핵산 분자의 상기 그룹은
- RNA 트리포스파타제의 적어도 하나의 촉매 도메인, 구아닐릴트랜스퍼라제의 적어도 하나의 촉매 도메인 및 N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 적어도 하나의 촉매 도메인을 인코딩하는 핵산 분자 및
- DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 적어도 하나의 촉매 도메인을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하거나 이들로 이루어진다.
또 다른 양태에서, 본 발명에 따르는 키메라 효소를 인코딩하는 분리된 핵산 분자의 상기 그룹은
- RNA 트리포스파타제의 적어도 하나의 촉매 도메인을 인코딩하는 핵산 분자,
- 구아닐릴트랜스퍼라제의 적어도 하나의 촉매 도메인을 인코딩하는 핵산 분자,
N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 적어도 하나의 촉매 도메인을 인코딩하는 핵산 분자 및
- DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 적어도 하나의 촉매 도메인을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하거나 이들로 이루어진다.
특히, 본 발명에 따르는 핵산 분자는,
- 진핵세포 DNA 의존성 RNA 폴리머라제, 바람직하게는 RNA 폴리머라제 II를 위한 프로모터 및
- DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인을 위한 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나, 바람직하게는 전체 프로모터(들)에 작동적으로 연결될 수 있다.
진핵세포 DNA 의존성 RNA 폴리머라제, 바람직하게는 RNA 폴리머라제 II를 위한 프로모터에 대한 핵산의 연결은 현저하게는, 본 발명의 키메라 효소가 진핵 숙주 세포에서 발현되는 경우, 당해 키메라 효소의 발현은 진핵 RNA 폴리머라제, 바람직하게는 RNA 폴리머라제 II에 의해 유도된다는 잇점을 갖는다. 이들 키메라 효소는 또한 도입유전자의 전사를 개시할 수 있다. 조직 특이적 RNA 폴리머라제 II 프로모터가 사용되는 경우, 본 발명의 키메라 효소는 표적 조직/세포에서 선택적으로 발현될 수 있다.
상기 프로모터는 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 구조 프로모터 또는 유도 프로모터일 수 있다. 당해 프로모터는 발달상 조절될 수 있고, 유도성 또는 조직 특이성일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따르는 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 상기 벡터는 반-안정한 또는 안정한 발현에 적절할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따르는 분리된 핵산 분자의 상기 그룹을 포함하는 벡터 그룹에 관한 것이다.
특히, 본 발명에 따르는 상기 벡터는 클로닝 또는 발현 벡터이다.
당해 벡터는 박테리오파지 등의 바이러스 벡터 또는 플라스미드 벡터 등의 비바이러스성 벡터일 수 있다.
한 가지 양태에서, 본 발명에 따르는 상기 벡터는, 특히 본 발명에 따르는 핵산 분자, 및 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인 및/또는 목적하는 적어도 하나의 DNA 서열을 위한 프로모터를 포함하는 비시스트로닉 벡터(bicistronic vector)이고, 상기 DNA 서열은 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인을 위한 프로모터에 작동적으로 연결된다.
본 발명에 따르는 상기 벡터는 또한 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인을 위한 프로모터를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따르는 분리된 핵산 분자 또는 본 발명에 따르는 분리된 핵산 분자 그룹 또는 본 발명에 따르는 벡터 또는 본 발명에 따르는 벡터 그룹을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명에 따르는 숙주 세포는 대규모 단백질 생산에 유용할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따르는 DNA-폴리머라제 RNA 폴리머라제 키메라 효소의 상기 촉매 도메인은 내인성 유전자 전사와 도입유전자 전사 사이의 경쟁을 방지하기 위해 숙주 세포의 것과는 상이한 효소의 것이다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따르는 키메라 효소를 발현하는 유전자 조작된 비사람 진핵 생물에 관한 것이다. 상기 비사람 진핵 생물은 임의의 비사람 동물 및 식물일 수 있다.
본 발명은 또한, 5'-말단 m7GpppN 캡을 갖는 RNA 분자를 생산하기 위한, 본 발명에 따르는 키메라 효소 또는 본 발명에 따르는 분리된 핵산 분자 또는 본 발명에 따르는 분리된 핵산 분자 그룹의 특히 시험관내 또는 생체외에서의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 특히 진핵세포 시스템, 예를 들면, 시험관내 합성된 단백질 분석 또는 배양된 세포에서 단백질, 특히 항체와 같은 치료학적 목적의 단백질을 생산하기 위한, 본 발명에 따르는 키메라 효소, 본 발명에 따르는 분리된 핵산 분자 또는 본 발명에 따르는 분리된 핵산 분자 그룹의 시험관내 또는 생체외 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한, DNA 서열에 의해 인코딩된 5'-말단 m7GpppN 캡을 갖는 RNA 분자를 숙주 세포에서 생산하는 특히 시험관내 또는 생체외 방법으로서, 상기 방법은 숙주 세포에서 본 발명에 따르는 핵산 분자 또는 본 발명에 따르는 분리된 핵산 분자의 그룹을 발현시키는 단계를 포함하고, 상기 DNA 서열은 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인에 대한 프로모터에 작동적으로 연결되어 있고, 특히 상기 상기 프로모터는 상기 숙주 세포에서 효과적인, 시험관내 또는 생체외 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명에 따르는 키메라 효소의 DNA-의존성 RNA-폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 내인성 유전자 전사와 상기 DNA 서열 전사 사이의 경쟁을 방지하기 위해 숙주 세포의 것과는 상이한 효소의 것이다.
특히, 본 발명에 따르는 상기 방법은, 인산칼슘을 사용한 형질감염, 전기천공 또는 리포좀을 생산하기 위해 양이온성 지질과 DNA와의 혼합에 의해 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 공지던 방법을 사용하여, 본 발명에 따르는 상기 DNA 서열 및/또는 핵산을 숙주 세포에서 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
한 가지 양태에서, 본 발명에 따르는 상기 방법은, 상기 숙주 세포의 세포 전사 및 전사후 메카니즘을 억제, 특히 침묵(바람직하게는 siRNA에 의해)하는 단계를 추가로 포함한다.
한 가지 양태에서, 본 발명에 따르는 상기 방법은, 숙주 세포에서 내인성 DNA-의존성 RNA 폴리머라제 및/또는 내인성 캡핑 효소의 서브유닛 중의 적어도 하나의 발현을 억제하는 단계를 추가로 포함한다.
상기 추가의 단계(즉, 상기 숙주 세포의 세포 전사 및 전사후 메카니즘을 억제, 특히 침묵(바람직하게는 siRNA 또는 shRNA에 의해) 및/또는 상기 숙주 세포에서 내인성 DNA-의존성 RNA 폴리머라제 및/또는 내인성 캡핑 효소의 하나 또는 수개 서브유닛의 발현을 억제)는 5'-말단 m7GpppN 캡 합성을 갖는 RNA 분자의 최적화를 가능하게 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "내인성 DNA-의존성 RNA 분자"는 상기 숙주 세포에서 내인성 DNA-의존성 RNA 폴리머라제에 관한 것이다. 숙주 세포가 진핵 세포인 경우, 상기 내인성 RNA-의존성 RNA 폴리머라제는 RNA 폴리머라제 II이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "내인성 캡핑 효소"는 상기 숙주 세포의 내인성 캡핑 효소를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "단백질의 발현의 억제"는 상기 단백질 발현의 적어도 20%, 특히 적어도 35%, 적어도 50% 및 보다 특히는 적어도 65%, 적어도 80%, 적어도 90%의 감소에 관한 것이다. 단백질 발현의 억제는 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 기술에 의해 측정될 수 있고, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 노턴-블롯, 웨스턴-블롯, RT-PCR이 포함된다.
상기 숙주 세포에서 내인성 DNA-의존성 RNA 폴리머라제 및/또는 내인성 캡핑 효소의 발현을 억제하는 단계는 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 임의의 기술에 의해 수행할 수 있고, 이로써 한정되는 것은 아니지만, 상기 내인성 DNA-의존성 RNA 폴리머라제 및/또는 내인성 캡핑 효소를 표적화하는 siRNA(소형 간섭 RNA) 기술, 내인성 DNA-의존성 RNA 폴리머라제 및/또는 내인성 캡핑 효소를 표적화하는 안티센스 RNA 기술, 상기 내인성 DNA-의존성 RNA 폴리머라제 및/또는 내인성 캡핑 효소를 표적화하는 shRNA(짧은 헤어핀 RNA) 기술이 포함된다.
siRNA(또는 shRNA; 짧은 헤어핀 RNA) 이외에, 다른 억제 서열은 또한 DNA 또는 RNA 안티센스(Liu and Carmichael 1994; Dias and Stein 2002), 햄머헤드 리보자임(Salehi-Ashtiani and Szostak 2001), 헤어핀 리보자임(Lian, De Young et al. 1999) 또는 키메라 snRNA U1-안티센스 표적화 서열(Fortes, Cuevas et al. 2003)을 포함하는 동일한 목적을 위해 고려될 수 있다. 또한, 세포 전사(예를 들면, RNA 폴리머라제 II 또는 전사 인자의 다른 서브유닛), 전사후 처리(예: 폴리아데닐화 또는 스플라이오솜(spliceosome) 인자) 및 mRNA 핵 이출 경로에 수반된 다른 유전자를 포함하는 다른 세포 표적 유전자가 억제를 위해 고려될 수 있다.
본 발명에 따르는 방법의 한 가지 양태에서, 상기 RNA 분자는 치료학적 목적의 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다.
또 다른 양태에서, 상기 RNA 분자는 siRNA, 리보자임, shRNA 및 안티센스 RNA으로 이루어진 그룹에서 선택된 비-인코딩 RNA 분자일 수 있다. 특히, 상기 DNA 서열은 mRNA, 비-인코딩 RNA, 특히 siRNA, 리보자임, shRNA 및 안티센스 RNA로 이루어진 그룹에서 선택된 RNA 분자를 인코딩할 수 있다.
본 발명은 또한 캡핑 효소 및 DNA-의존성 RNA 폴리머라제로서 본 발명에 따르는 키메라 효소의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따르는 적어도 하나의 키메라 효소 및/또는 본 발명에 따르는 분리된 핵산 분자 및/또는 핵산 분자 그룹, 및/또는 본 발명에 따르는 벡터 및/또는 본 발명에 따르는 벡터 그룹을 포함하는, 5'-말단 m7GpppN 캡을 갖는 RNA 분자를 생산하기 위한 키트에 관한 것이다.
한 가지 양태에서, 본 발명의 키트는 본 발명에 따르는 벡터 및/또는 본 발명에 따르는 벡터 그룹을 포함하고, 상기 벡터(들)는
- DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인을 위한 프로모터 및/또는
- 목적하는 적어도 하나의 DNA 서열(여기서, 상기 DNA 서열은 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인을 위한 프로모터에 작동적으로 연결된다)를 포함한다.
본 발명에 따르는 키트는
- DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인을 위한 프로모터를 포함하는 벡터 및/또는
- 목적하는 적어도 하나의 DNA 서열(여기서, 상기 DNA 서열은 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인을 위한 프로모터에 작동적으로 연결된다)를 하추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 의약, 바람직하게는 유전자 치료에 의해 특히 사람 또는 동물 질병을 예방 및/또는 치료하기 위한 본 발명에 따르는 키메라 효소, 본 발명에 따르는 분리된 핵산 분자, 본 발명에 따르는 핵산 분자 그룹 또는 본 발명에 따르는 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따르는 키메라 효소 및/또는 본 발명에 따르는 분리된 핵산 분자 및/또는 본 발명에 따르는 핵산 분자 그룹 및/또는 본 발명에 따르는 벡터를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따르는 상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체에서 제형화된다.
본 발명에 따르는 약제학적으로 허용되는 담체는 당해 기술분야에 공지되어 있다.
본 발명에 따르는 약제학적 조성물은
- 목적하는 적어도 하나의 DNA 서열을 추가로 포함할 수 있고, 여기서 상기 DNA 서열은 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인을 위한 프로모터에 작동적으로 연결된다.
이러한 성분들(특히, 본 발명에 따르는 키메라 효소, 본 발명에 따르는 분리된 핵산 분자, 본 발명에 따르는 분리된 핵산 분자 그룹, 본 발명에 따르는 벡터, 본 발명에 따르는 벡터(들) 그룹 및 목적하는 적어도 하나의 DNA 서열로 이루어진 그룹에서 선택됨)은 본 발명에 따르는 약제학적 조성물 또는 의약에 치료학적 유효량(활성 및 무독성 양)으로 존재할 수 있다.
이러한 치료학적 양은 본 발명에 따르는 상기 약제학적 조성물 또는 의약의 투여에 의해 예방 및/또는 치료하고자 하는 질병 및/또는 질환에 대한 상기 성분의 투여 효과의 평가를 포함하는 통상의 시험에 의해 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 결정될 수 있다.
예를 들면, 이러한 시험은 특히 피검체의 생물학적 샘플로부터 상기 질병 및/또는 질환의 마커(생물학적 및/또는 임상적) 특성 세트에 대한 상이한 양의 상술한 성분들(특히 본 발명에 따르는 키메라 효소, 본 발명에 따르는 분리된 핵산 분자, 본 발명에 따르는 분리된 분자 그룹, 본 발명에 따르는 벡터, 본 발명에 따르는 벡터 그룹 및 목적하는 적어도 하나의 DNA 서열로 이루어진 그룹에서 선택됨)의 투여에 대한 정량적 및 정성적 효과 둘 다를 분석함으로써 수행할 수 있다.
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 피검체에게 치료학적 유효량으로 본 발명에 따르는 키메라 효소, 및/또는 본 발명에 따르는 분리된 핵산 분자, 및/또는 본 발명에 따르는 핵산 분자 그룹 및/또는 본 발명에 따르는 벡터 및/또는 본 발명에 따르는 벡터 그룹의 투여를 포함하는 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르는 치료 방법은 목적하는 적어도 하나의 DNA 서열의 투여를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 상기 DNA 서열은 이를 필요로 하는 피검체에게 치료학적 양으로 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인을 위한 프로모터에 작동적으로 연결된다.
본 발명에 따르는 상기 키메라 효소, 핵산 분자 및/또는 상기 벡터는 목적하는 상기 DNA 서열, 특히 목적하는 상기 DNA 서열과 동시에, 별개로 또는 순차로 투여될 수 있다.
본 발명은 또한, 특히 유전자 치료에 의해 사람 또는 동물 질병의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따르는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
상기 질병은 목적하는 상기 적어도 하나의 DNA 서열의 투여에 의해 개선될 수 있는 질병으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 또한, 특히 유전자 치료에 의해, 사람 또는 동물 질병의 예방 및/또는 치료용 의약을 제조하기 위한 본 발명에 따르는 키메라 효소, 및/또는 본 발명에 따르는 분리된 핵산 분자, 및/또는 본 발명에 따르는 핵산 분자 그룹 및/또는 본 발명에 따르는 벡터, 및/또는 본 발명에 따르는 벡터 그룹의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 동시, 개별 또는 순차 투여하기 위한,
- 본 발명에 따르는 적어도 하나의 효소 및/또는 본 발명에 따르는 적어도 하나의 핵산 분자 및/또는 본 발명에 따르는 핵산 분자 그룹 및/또는 본 발명에 따르는 핵산 분자 및/또는 본 발명에 따르는 핵산 분자 그룹을 포함하는 적어도 하나의 벡터; 및
- 목적하는 적어도 하나의 DNA 서열(여기서, 상기 DNA 서열은 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인을 위한 프로모터에 작동적으로 연결된다)를 포함하는 배합 생성물에 관한 것이다.
목적하는 상기 DNA 서열은 항-종양유전자(종양 억제 유전자)일 수 있다.
목적하는 상기 DNA 서열은 siRNA, 리보자임, shRNA 및 안티센스 RNA로 이루어진 그룹에서 선택된 치료 목적 또는 비-인코딩 RNA의 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다.
치료 목적의 상기 폴리펩티드는 사이토킨, 세포 또는 핵 수용체, 리간드, 응고 인자, CFTR 단백질, 인슐린, 디스트로핀, 성장 호르몬, 효소, 효소 억제제, 항신생물 효과를 갖는 폴리펩티드, 박테리아, 기생체 또는 바이러스, 특히 HIV 감염을 억제할 수 있는 폴리펩티드, 항체, 독소, 면역독소, RNA 폴리머라제 II의 서브유닛(특히, 알파-아마니틴 독소에 의해 억제될 수 있는 RNA 폴리머라제 II의 Rpb1 서브유닛) 및 마커로부터 선택될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따르는 배합 생성물은 약제학적으로 허용되는 담체에서 제형화될 수 있다.
본 발명에 따르는 배합 생성물의 한 가지 양태에서, 상기 벡터는 목적하는 상기 DNA 서열 전에 투여된다.
본 발명은 또한, 특히 유전자 치료에 의해 사람 또는 동물 질병의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따르는 배합 생성물에 관한 것이다.
상기 질병은, 상술한 바와 같이, 목적하는 적어도 하나의 DNA 서열의 투여에 의해 개선될 수 있는 질병들로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
예를 들면, 상기 질병들 뿐만 아니라 이들의 임상적, 생물학적 또는 유전자 아유형은 암 및 이들의 소질(특히 유방 및 결장암, 흑색종), 악성 혈액질환(특히, 백혈병, 호드킨 및 비호드킨 임파종, 골수종), 응고 및 1차 지혈 질환, 이상혈색소증(특히 겸상 적혈구 빈혈증 및 지중해빈혈), 자가면역 질환(전신 홍반성 낭창 및 경피증 포함), 심혈관 질병(특히 심장 조율 및 수축 질환, 및 비대형 심근증), 대사 질환(특히 I형 및 II형 당뇨병 및 이들의 합병증, 이상 지질혈증, 아테롬성 동맥경화증 및 이들의 합병증, 점액다당류증, 글리코겐 저장 질환, 페닐케톤뇨증), 감염성 질환(AIDS, 바이러스 간염 B, 바이러스 간염 C, 독감 및 기타 바이러스 질환; 보툴리누스 중독, 파상풍 및 기타 박테리아 질환; 말라리아 및 기타 기생충 질환 포함), 근육 질환(듀헨네 근영양실조 및 스테이너 근긴장성 근영양실조 포함), 호흡 질환(특히 낭포성 섬유증 및 알파-1 항트립신 결핍), 신장 질환(특히 다낭포성 신장 질환), 간 질환(간경변, 윌슨 질환, 알파-아마니틴에 기인한 간독, 약물 관련 간독성 포함), 결장 질환(크론병 및 궤양성 결장염 포함), 안과 질환, 특히 망막 질환(특히 레버 흑내장, 망막세포병변, 연령 관련 황반 변성), 중추신경계 질환(특히 알츠하이머병, 파킨슨씨병, 다발성 경화증, 헌팅톤병, 신경섬유종, 부신백질이영양증, 쌍극성 질환, 정신분열증 및 자폐증) 및 피부 및 결합 조직 질환(특히 마르판 증후군 및 건선)을 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다.
한 가지 양태에서, 본 발명의 배합 생성물은
- 본 발명에 따르는 핵산 분자 및/또는 본 발명에 따르는 핵산 분자 그룹을 포함하고 이를 발현시키는 적어도 하나의 벡터(여기서, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인은 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제, 특히 T7 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인이다) 및
- 목적하는 적어도 하나의 DNA 서열(여기서, 상기 DNA 서열은 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제, 특히 T7 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인을 위한 프로모터에 작동적으로 연결되고, 목적하는 상기 DNA 서열은 알파-아마니틴 독소에 의해 억제될 수 있는 RNA 폴리머라제 II의 Rpb1 서브유닛를 인코딩한다)을 포함한다.
본 발명은 또한, 유전자 치료에 의해, 알파-아마니틴에 기인하는 사람 또는 동물 간독성의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 이러한 배합 생성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 숙주 세포에서 상기 핵산 분자(들)의 발현을 가능하게 하는 조건하에 본 발명의 키메라 효소를 인코딩하는 상기 핵산 분자 또는 핵산 분자의 상기 그룹을 적어도 하나의 숙주 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는 본 발명에 따르는 키메라 효소를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한
- 숙주 세포에서 상기 핵산 분자의 발현을 가능하게 하는 조건하에 본 발명의 키메라 효소를 인코딩하는 상기 핵산 분자 그룹의 일부를 제1 숙주 세포에서 발현시켜 본 발명의 키메라 효소의 제1 부분을 수득하는 단계;
- 숙주 세포에서 상기 핵산 분자의 발현을 가능하게 하는 조건하에 본 발명의 키메라 효소를 인코딩하는 상기 핵산 분자 그룹의 다른 일부를 제2 숙주 세포에서 발현시켜 본 발명의 키메라 효소의 제2 부분을 수득하는 단계 및
상기 제1 부분 및 제2 부분을 조립하여 본 발명의 키메라 효소를 수득하는 단계를 포함하는 본 발명에 따르는 키메라 효소를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르는 키메라 유전자는 특히 하기 장점을 갖는다:
- 내인성 유전자 전사와 도입유전자 전사 사이에 경쟁이 없고;
- 저렴하고 신속하고 용이하게 수행하여 대규모 분석 및 단백질 생산에 적합하며;
백시니아 바이러스/박테리오파지 RNAP 하이브리드 발현 시스템과 대조적으로, 명백한 세포독성 또는 프로-아폽토시스 활성이 없고;
임의의 진핵세포 종(예: 효모, 식물, 설치류, 낙농 반추동물, 영장류 및 사람)에서 RNA 전사체를 생산한다.
도 1은 반딧불 루시퍼라제 유전자 리포터 발현 분석을 나타내고, 이는 본 발명에 따르는 키메라 효소, NP868R-T7RNAP에 의해 유발된 번역 수율을 모니터링하기 위해 사용된다. pNP868R-T7RNAP 또는 pT7RNAP 플라스미드를 사람 HE-293 배양 세포에서 pT7p-루시퍼라제 플라스미드로 공-형질감염시켰다. NP868R-T7RNAP 및 T7RNAP 효소의 발현은 상응하는 플라스미드의 RNA 폴리머라제 II-의존성 CMV 프로모터에 의해 유도했다. NP868R-T7RNAP 및 T7RNAP 효소는 또한 pT7p-루시퍼라제 유전자 리포터 플라스미드의 T7 프로모터에서 전사를 개시할 것으로 예상된다. NP868R-T7RNAP 효소의 mRNA 캡핑 및 DNA-의존성 RNAP 효소 활성이 유지되면, m7GpppGm 캡 구조를 갖는 루시퍼라제 mRNA가 합성될 것이고, 이는 반딧불 루시퍼라제 단백질로 번역되어 세포 형광 분석에 의해 검출될 것이다. 대조적으로, T7RNAP 효소는 5'-말단 m7GpppN 캡 없이 RNA 분자를 합성할 것으로 예상되며, 따라서 이는 불량하게 번역된다.
도 2(A 내지 B)는 pNP868R-T7RNAP 및 pT7RNAP 플라스미드의 물리적 맵을 나타낸다. (A) 야생형 파지 DNA-의존성 T7 RNA 폴리머라제를 인코딩하는 pT7RNAP 플라스미드, (B) 가요성 (Gly3Ser)4 링커에 의해, NP868R mRNA 캡핑 효소(African Swine Fever Virus) 및 야생형 파지 DNA-의존성 T7 RNA 폴리머라제(bacteriophage T7) 사이의 융합을 인코딩하는 pNP868R-T7RNAP 플라스미드의 물리적 맵. 이들 2개의 플라스미드는 동일한 설계를 갖는다: CMV 프로모터, Kozak 서열, 이어서 NP868R-T7RNAP 또는 T7RNAP 개방-판독 프레임(ORFs), 폴리[A]-트랙, 파지 RNA 폴리머라제 전사를 위한 ΤΦ 터미네이터 및 SV40 폴리아데닐화 시그날.
도 3(A-C)는 반딧불 루시퍼라제 유전자 리포터 플라스미드의 물리적 맵을 나타낸다. (A) pT7p-루시퍼라제는 NP868R-T7RNAP 및 T7RNAP 효소의 활성을 분석하기 위해 설계되었다. 이는 RNA 폴리머라제 프로모터(T7, T3 및 SP6 파지 RNAP 프로모터, 이어서 이.콜라이 리보솜 rrnDl 프로모터), Lac 오퍼레이터 서열, 반딧불 루시퍼라제의 전체 ORF, 폴리[A]-트랙, RNA 자가-절단을 위한 간염-D 리보자임 인코딩 서열 및 pET-22b(+) 골격 내의 ΤΦ 터미네이터의 배열로 이루어지고, (B) BamHI-소화된 pT7p-루시퍼라제: 루시퍼라제 ORF 및 프로모터 배열 사이의 물리적 결합은 제한 효소 소화에 의해 분열된다. 이 플라스미드는 음성 대조군으로 사용된다. 화살표는 소화 부위를 나타낸다. (C) pCMV-루시퍼라제: 반딧불 루시퍼라제의 전체 ORF는 CMV 프로모터의 조절하에 있다. 이 플라스미드는 양성 비교용으로 사용된다.
도 4(A-C)는 HEK-293 세포에서 플라스미드 형질감염후 반딧불 루시퍼라제 유전자 리포터 발현을 나타낸다. HEK-293 세포를 배양하고, 상기한 바와 같이 형질감염시켰다. 세포는 pNP868R-T7RNAP 또는 pT7RNAP 플라스미드(0.4㎍ DNA/웰 및 1 ㎕/웰 리포펙타민 2000), 및/또는 pT7p-루시퍼라제, BamHI-소화된 pT7p-루시퍼라제 또는 pCMV-T7RNAP(0.4㎍ DNA/웰 및 1㎕/웰 리포펙타민 2000)로 형질감염시키거나, 또는 어떤 것으로 형질감염시키지 않았다. 반딧불 루시퍼라제 형광은 루시퍼라제 분석 시스템(Promega, Madison WI USA)을 사용하여 선택된 시점에서 분석했다. 형질감염 효율을 표준화하기 위해, 세포는 또한 pORF-eSEAP 플라스미드로 형질감염시켰고, 이는, 퀀티-블루(Quanti-Blue) 비색 효소 분석 키트(InvivoGen, San Diego, CA)를 사용하여 세포 배양 배지에서 분석되는 분비된 태반 알칼리 포스파타제(SEAP)를 인코딩한다. 유전자 리포터 발현은, 시험 세포 중의 루시퍼라제 형광으로부터 형질감염 시약 단독(RLU; 상대 광 단위)으로 처리한 세포 중의 형광을 뺀 다음, SEAP 흡광도(OD, 광학 밀도) 비율로 나눈 값으로 나타낸다. 당해 실험의 2개의 독립적 반복이 수행되었다. 오차 막대는 평균 표준 편차(SEM)를 나타낸다. 통계학적 분석은 스튜던트 t 양측(two-tailed)검정 시험을 사용하여 수행했다. (A) pNP868R-T7R AP/pT7p-루시퍼라제, pT7RNAP/pT7p-루시퍼라제 및 pCMV-루시퍼라제 감염된 세포에서 반딧불 루시퍼라제 유전자 리포터 발현. pNP868R-T7RNAP/pT7p-루시퍼라제 및 pCMV-루시퍼라제 플라스미드로 형질감염된 세포는 각각 pT7RNAP/pT7p-루시퍼라제와 함께 공-형질감염된 세포보다 23배 및 33배 높은 시그날을 나타낸다(*p<0.05). (B) pT7RNAP/pT7p-루시퍼라제, pT7RNAP/BamHI-소화된 pT7p-루시퍼라제(*p<0.05) 및 다른 대조군 조건(pT7RNAP 단독, pT7p-루시퍼라제 소화된 또는 소화되지 않은 것 단독, 또는 형질감염 시약 단독)으로 공-형질감염된 세포에 대한 반딧불 루시퍼라제 유전자 리포터 발현. (C) pNP868R-T7R AP/pT7p-루시퍼라제, pNP868R-T7RNAP/BamHI-소화된 pT7p-루시퍼라제(*p<0.05) 및 다른 대조군 조건(pNP868R-T7RNAP 단독, pT7p-루시퍼라제 소화된 또는 소화되지 않은 것 단독, 또는 형질감염 시약 단독)에 대한 반딧불 루시퍼라제 유전자 리포터 발현.
도 5(A-C)는 α-아마니틴으로 처리된 HEK-293 형질감염된 세포의 반딧불 루시퍼라제 유전자 리포터 발현을 나타낸다. (A) 당해 분석의 도식적 다이아그램. pCMV-루시퍼라제 플라스미드(루시퍼라제의 발현은 RNA 폴리머라제 II-의존성 CMV 프로모터에 의해 유도된다)의 경우, α-아마니틴을 세포 형질감염과 동시에 세포 배지(0 또는 20㎍/ml)에 첨가했다. pNP868R-T7RNAP/pT7p-루시퍼라제 플라스미드의 경우, pNP868R-T7RNAP 플라스미드(NP868R-T7RNAP의 발현은 RNA 폴리머라제 II-의존성 CMV 프로모터에 의해 유도된다)의 1차 형질감염은 세포 배지에 대한 α-아마니틴의 첨가(0 내지 20㎍/ml 범위의 농도)전 24시간에 수행했고, 2차 감염은 pT7p-루시퍼라제 플라스미드로 수행했다. 이들 시험의 2회 반복을 수행했다. 오차 막대는 평균 표준 편차(SEM)를 나타낸다. 통계학적 분석은 상기한 바와 같이 수행했다. (B) α-아마니틴은 pCMV-루시퍼라제 플라스미드로 형질감염된 세포의 루시퍼라제 유전자 리포터 발현을 거의 완전히 파괴했다; *p<0.05) (C) α-아마니틴은 pNP868R-T7RNAP/pT7p-루시퍼라제 플라스미드로 형질감염된 세포에서 루시퍼라제 발현 시그날의 완만한 감소만을 유발했고(*p<0.05), 따라서 이는 NP868R-T7RNAP 효소에 의한 전사가 이의 파지 DNA-의존성 T7 RNA 폴리머라제 잔기에 의존적임을 시사한다.
도 6(A-C)은 HEK-293 형질감염된 세포의 세포 생존능, 세포독성 및 아폽토시스를 나타낸다. 세포는 상기한 바와 같이 배양하여 pNP868R-T7RNAP 또는 pT7RNAP 플라스미드로 형질감염시켰다. 세포 생존능, 세포독성 및 아폽토시스는 ApoTox-Glo 트리플렉스 분석을 사용하여 선택된 시점에서 평가했다. 이 시험의 2회 반복을 수행했다. 오차 막대는 평균 표준 편차(SEM)를 나타낸다. 세포 생존능, 세포독성 및 아폽토시스는 무처리 세포 중의 발광/형광을 뺀 시험 세포 중의 발광/형광 시그날로서 나타냈다. 통계학적 분석은 상기한 바와 같이 수행했다. 플라스미드 DNA의 존재 또는 부재하에 형질감염 시약(즉, Lipofectamine 2000)은 세포 생존능, 세포독성 및 아폽토시스를 손상시킨다. 그러나, (A) 세포 생존능 수준의 경우에 1일(양측검정 스튜던트 t 시험, *p<0.05)을 제외한 모든 시점에서, (B) 세포독성 수준의 경우에 모든 시점에서, 또는 (C) 아폽토시스의 경우에 모든 시점에서, 어떠한 통계학적 유의차도, pNP868R-T7RNAP 플라스미드 및 pT7RNAP 플라스미드로 형질감염된 세포 사이에서 관찰되지 않았다.
도 7(A-D)는 단량체성 NP868R-T3RNAP 및 NP868R-SP6RNAP 키메라 효소에 사용된 플라스미드의 물리적 맵을 나타낸다. 물리적 맵: (A) 파지 DNA-의존성 T3 RNA 폴리머라제를 인코딩하는 pT3RNAP 플라스미드, (B) 파지 DNA-의존성 SP6 RNA 폴리머라제를 인코딩하는 pSP6 RNAP 플라스미드, (C) 가요성 (Gly3Ser)4 링커에 의해 NP868R 아프리카 돼지열 바이러스 mRNA 캡핑 효소 및 파지 DNA-의존성 T3 RNA 폴리머라제 사이의 융합을 인코딩하는 pNP868R-T3RNAP 플라스미드, (D) 가요성 (Gly3Ser)4 링커에 의해 NP868R 아프리카 돼지열 바이러스 mRNA 캡핑 효소 및 파지 DNA-의존성 SP6 RNA 폴리머라제 사이의 융합을 인코딩하는 pNP868R-SP6RNAP 플라스미드. 이들 2개 플라스미드는 동일한 설계를 갖는다: CMV 프로모터, Kozak 서열, 이어서 ORF, 폴리[A]-트랙, 파지 RNA 폴리머라제 전사를 위한 ΤΦ 터미네이터, 및 SV40 폴리아데닐화 시그날.
도 8은 단량체성 NP868R-T3RNAP 및 NP868R-SP6RNAP 키메라 효소에 의한 루시퍼라제 리포터 유전자의 발현을 나타낸다. 형질감염 및 루시퍼라제 분석은 상기한 바와 같이 수행했다. 유전자 리포터 발현은, 시험 세포 중의 루시퍼라제 발광으로부터 형질감염 시약 단독(RLU, 상대 광 단위)으로 처리한 세포 중의 발광을 뺀 다음, SEAP 흡광도(OD, 광학 밀도) 비율로 나눈 값으로 나타낸다. 당해 실험의 4회 반복을 수행했다. 오차 막대는 평균 표준 편차(SEM)를 나타낸다.
도 9(A-C)는 헤테로이량체성 및 헤테로삼량체성 키메라 효소의 개략적 구조를 나타낸다. (A) 헤테로이량체성 RRi234L-NP868R/EE1234L-T7RNAP 효소. 류신 지퍼 EE1234L(산) 및 RR1234L(염기)를, 상호작용하여 헤테로이량체를 형성하는 NP868R 및 T7 RNA 폴리머라제의 아미노 말단에 각각 부가하고; (B) 헤테로이량체성 D12L/D1R-T7RNAP CCPP 효소. 백시니아 바이러스 mRNA 캡핑 효소의 D1R 서브유닛를 단일-단위 T7 RNA 폴리머라제의 아미노 말단과 융합시킨다. mRNA 캡핑 효소의 D12L 서브유닛와 함께 동시 발현시키면, D1R-T7RNAP은 D12L/D1R-T7RNAP로 지정된 헤테로이량체를 형성한다. 단순화를 위해, 다른 구성, 즉 D1R/D12L-T7RNAP 키메라 효소는 나타내지 않는다; (C) 헤테로삼량체성 D12L/RR1234L-D1R/EE1234L-T7RNAP 키메라 효소. 류신 지퍼 EE1234L(산) 및 RR1234L(염기성)을 D1R 및 T7 RNA 폴리머라제의 아미노 말단에 각각 부가했다. EE1234L-T7RNAP 및 백시니아 바이러스 mRNA 캡핑 효소의 D12L 서브유닛와 함께 RR1234L-DIR의 동시 발현은 헤테로삼량체를 형성한다. 단순화를 위해, 다른 구성, 즉 DlR/RRl234L-D12L/EEl234L-T7RNAP 키메라 효소는 나타내지 않는다. 개방(빈) 화살표는 반평행 배향의 류신-지퍼 결합을 나타낸다. 흑색 화살표는 다른 유형의 단백질 상호작용을 나타낸다.
도 10(A-H)는 헤테로이량체성 및 헤테로삼량체성 키메라 효소에 사용된 플라스미드의 물리적 맵을 나타낸다. 물리적 맵: (A) D1R을 인코딩하는 pDIR 플라스미드, 백시니아 mRNA 캡핑 효소의 거대 서브유닛, (B) D12L을 인코딩하는 pD12L 플라스미드, 백시니아 mRNA 캡핑 효소의 소형 서브유닛, (C) NP868R, 아프리카 돼지열 방러스 mRNA 캡핑 효소의 아미노 말단에 융합된 RR1234L 류신-지퍼를 인코딩하는 pRRl234L-NP868R 플라스미드, (D) D1R, 백시니아 mRNA 캡핑 효소의 거대 서브유닛의 아미노 말단에 융합된 RR1234L 류신-지퍼를 인코딩하는 pRRi234L-DlR 플라스미드, (E) D12L, 백시니아 mRNA 캡핑 효소의 소형 서브유닛에 융합된 RR1234L 류신-지퍼를 인코딩하는 pRRl234L-D12L 플라스미드, (F) 파지 DNA-의존성 T7 RNA 폴리머라제에 융합된 pEE1234L 류신-지퍼를 인코딩하는 pEEl234L-T7RNA 플라스미드, (G) 가요성 (Gly3Ser)4 링커에 의해 백시니아 mRNA 캡핑 효소와 파지 DNA-의존성 T7 RNA 폴리머라제의 거대 서브유닛 사이의 융합을 인코딩하는 pDlR-T7RNAP 플라스미드, (H) 가요성 (Gly3Ser)4 링커에 의해 백시니아 mRNA 캡핑 효소와 파지 DNA-의존성 T7 RNA 폴리머라제 사이의 소형 서브유닛 사이의 융합을 인코딩하는 pD12L-T7RNAP 플라스미드. 모든 이들 플라스미드는 동일한 설계를 갖는다: CMV 프로모터, Kozak 서열, 이어서 ORF, 폴리[A]-트랙, 파지 RNA 폴리머라제 전사를 위한 ΤΦ 터미네이터 및 SV40 폴리아데닐화 시그날.
도 11은 헤테로이량체성 RR1234L-NP868R/EE1234L-T7RNAP 키메라 효소에 의한 루시퍼라제 리포터 유전자의 발현을 나타낸다. HEK-293 세포를 배양하고, 상기한 바와 같이 혈질감염시켰다. 세포는 상응하는 플라스미드(0.4㎍ DNA/웰 및 1㎕/웰 리포펙타민 2000) 및 pT7p-루시퍼라제, 또는 pCMV-T7RNAP(0.4㎍ DNA/웰 및 1㎕/웰 리포펙타민 2000)으로 형질감염시켰다. 유전자 리포터 발현은 시험 세포 중의 루시퍼라제 발광으로부터 형질감염 시약 단독(RLU, 상대 광 단위)로 처리한 세포 중의 발광을 뺀 다음, SEAP 흡광도(OD, 광학 밀도) 비율로 나눈 값으로 나타냈다. 이 실험의 4회 반복을 수행했다. 오차 막대는 평균 표준 편차(SEM)을 나타낸다.
도 12는 헤테로이량체성 D1R/D12L-T7RNAP 및 D12L/D1R-T7RNAP 키메라 효소에 의한 루시퍼라제 리포터 유전자의 발현을 나타낸다. 형질감염 및 루시퍼라제 분석은 상기한 바와 같이 수행했다. 유전자 리포터 발현은, 시험 세포 중의 루시퍼라제 발광으로부터 형질감염 시약 단독(RLU, 상대 광 단위)로 처리한 세포 중의 발광을 뺀 다음, SEAP 흡광도(OD, 광학 밀도) 비율로 나눈 값으로 나타냈다. 이 실험의 2회 반복을 수행했다. 오차 막대는 평균 표준 편차(SEM)을 나타낸다.
도 13은 헤테로삼량체성 D1R/RR1234L-D12L/EE1234L-T7RNAP 및 D12L/RRl234L-DlR/EEl234L-T7RNAP 키메라 효소에 의한 루시퍼라제 리포터 유전자의 발현을 나타낸다. 형질감염 및 루시퍼라제 분석은 상기한 바와 같이 수행했다. 유전자 리포터 발현은, 시험 세포 중의 루시퍼라제 발광으로부터 형질감염 시약 단독(RLU, 상대 광 단위)로 처리한 세포 중의 발광을 뺀 다음, SEAP 흡광도(OD, 광학 밀도) 비율로 나눈 값으로 나타냈다. 이 실험의 2회 반복을 수행했다. 오차 막대는 평균 표준 편차(SEM)을 나타낸다.
도 14는 RNA 폴리머라제 II(POL2AR) 또는 사람 캡핑 효소(RNGTT)의 거대 서브유닛를 표적화하는 siRNA의 존재하에 단량체성 NP868R-SP6RNAP 키메라 효소에 의한 루시퍼라제 리포터 유전자의 발현을 나타낸다. 형질감염 및 루시퍼라제 분석은, 25nM 최종 농도의 siRNA를 형질감염 시약에 첨가한 것을 제외하고는, 상기한 바와 같이 수행했다. siRNA SI04364381, SI04369344, SI04250162 및 SI04354420은 POLR2A 유전자를 표적화하고, siRNA SI00055986, SI03021508, SI00055972 및 SI00055979는 RNGTT를 표적화한다. 유전자 리포터 발현은, 시험 세포 중의 루시퍼라제 발광으로부터 형질감염 시약 단독(RLU, 상대 광 단위)로 처리한 세포 중의 발광을 뺀 다음, SEAP 흡광도(OD, 광학 밀도) 비율로 나눈 값으로 나타냈다. 이 실험의 2회 반복을 수행했다. 오차 막대는 평균 표준 편차(SEM)을 나타낸다.
도 15는 RNA 폴리머라제 II(POL2AR) 또는 사람 캡핑 효소(RNGTT)의 거대 서브유닛를 표적화하는 siRNA의 용량 효과 활성을 나타낸다. 형질감염 및 루시퍼라제 분석은, siRNA를 0 내지 100 nM의 농도로 형질감염 시약에 첨가한 것을 제외하고는, 상기한 바와 같이 수행했다. siRNA SI04369344 및 SI00055972는 각각 POLR2A 및 RNGTT 유전자를 표적화한다. 유전자 리포터 발현은, 시험 세포 중의 루시퍼라제 발광으로부터 형질감염 시약 단독(RLU, 상대 광 단위)로 처리한 세포 중의 발광을 뺀 다음, SEAP 흡광도(OD, 광학 밀도) 비율로 나눈 값으로 나타냈다. 이 실험의 3회 반복을 수행했다. 오차 막대는 평균 표준 편차(SEM)을 나타낸다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 상세히 설명되지만, 본 발명의 기술적 범위는 이들 실시예로 제한되지 않는다.
실시예
실시예 1 - 활성 단량체성 키메라 효소 NP868R-T7RNAP의 실시예
I. 플라스미드
NP868R, 아프리카 돼지열 바이러스의 mRNA 캡핑 효소, 및 박테리오파지 T7의 야생형 파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제 사이의 융합을 인코딩하는 하나의 플라스미드를 합성했다. 당해 캡핑 효소는 (Gly3Ser)4 링커에 의해 T7 RNA 폴리머라제의 아미노 말단에 융합시켰다.
pNP868R-T7RNAP 플라스미드를 사용하여, 반딧불 루시퍼라제 유전자 리포터 발현 분석에 의해 인코딩된 효소의 활성을 평가했다(도 1). 요약하면, pNP868R-T7RNAP 및 pT7p-루시퍼라제 플라스미드를 사람 HEK-293 배양 세포에서 공-형질감염시켰다. NP868R-T7RNAP ㅎ소의 발현은 상응하는 플라스미드의 RNA 폴리머라제 II-의존성 CMV 프로모터에 의해 유도했다. NP868R-T7RNAP 효소는 또한 이의 T7 프로모터에서 pT7p-루시퍼라제 플라스미드의 전사를 개시할 것으로 예상된다. NP868R-T7RNAP 효소의 mRNA 캡핑 및 DNA-의존성 RNAP 효소 활성 둘 다가 보유되는 경우, m7GpppGm 캡 구조를 갖는 루시퍼라제 mRNA가 합성될 것이고, 이는 또한 반딧불 루시퍼라제 단백질로 번역되어 세포 발광 분석에 의해 검출될 수 있다. 또한, pNP868R-T7RNAP 플라스미드는 HEK-293 세포에서의 효소 발현과 관련된 세포 생존능, 세포독성 및 아폽토시스 뿐만 아니라 당해 효소의 세포 분포를 조사하기 위해 사용되었다.
NP868R-T7RNAP 및 T7RNAP(T7 RNA 폴리머라제) 효소를 인코딩하는 플라스미드는 GeneArt AG(Regensburg, Germany)에 의해 4단계로 합성되었다. pT7RNA 플라스미드에 의해 인코딩된 단백질 서열은 서열번호 19에 상응한다. pNP868R-T7RNAP 플라스미드에 의해 인코딩된 단백질 서열은 서열번호 20에 상응한다. 먼저, T7 RNA 폴리머라제 프로모터 및 다중 클로닝 부위(MCS)를 함유하는 DNA 단편을 pCMV-Script 플라스미드(Stratagene, La Jolla, CA USA)로부터 제거했다. 둘째, 카세트를, 이의 CMV 프로모터와 이의 SV40 폴리아데닐화 시그날 사이의 pCMV-Script 플라스미드에 도입했다. 이 카세트는 Lac 오퍼레이터 스템-루프(Gilbert and Maxam 1973), MCS, 폴리[A]-트랙 및 ΤΦ 부류-I 헤어핀 터미네이터 시그날(Lyakhov, He et al. 1997)로 이루어졌다. 셋째, 번역의 개시를 위한 Kozak 컨센서스 서열(Kozak 1987), 이어서 NP868R-T7RNAP 또는 T7RNAP 효소의 전체 개방-판독 프레임(ORF)는 PCR 기반 방법을 사용하여 합성 올리고뉴클레오티드로부터 조립하고, 클로닝하고, 완전히 서열 분석했다. NP868R-T7RNAP(서열번호 21)의 ORF 및 T7RNAP(서열번호 22)의 ORF는 바람직한 코돈 사용을 변경하고, 미소 스플라이상 부위 및 폴리(A) 시그날 등의 시스-작용 요소를 제거하고, 직접 반복체 및 제2 구조 요소의 제거에 의해 mRNA 안정성을 개선함으로써 최적화했다. 넷째, NP868R-T7RNAP 또는 T7RNAP의 전체 ORF를 당해 카세트의 MCS에 서브클로닝하여, pNP868R-T7RNAP 플라스미드 및 pT7RNAP 플라스미드를 생성했다. 작제 방법의 결과로서, 2개의 추가 아미노산(Glu, Phe)을 Kozak 서열의 ATG의 바로 하류에 부가했고, 2개의 다른 아미노산을 (Gly3Ser)4 링커(Gly, Pro)의 바로 상류에 부가했고, 2개의 아미노산을 NP868R-T7RNAP 효소의 이 링커(Leu, Glu)의 바로 상류에 부가했다. 마지막으로, pNP868R-T7RNAP 및 pT7RNAP 플라스미드는 하기 설계를 갖는다(도 2a 및 2b): CMV 프로모터, Kozak 서열, 이어서 NP868R-T7RNAP 또는 T7RNAP ORF, 폴리[A]-트랙, 파지 RNA 폴리머라제 전사를 위한 ΤΦ 터미네이터, 및 SV40 폴리아데닐화 시그날.
반딧불 루시퍼라제 리포터 유전자를 인코딩하는 2개의 플라스미드는 Eurofins/MWG/Operon(Ebersberg, Germany)에 의해 합성했다. pET-22b(+)RNAPp-루시퍼라제 플라스미드(이후 pT7p-루시퍼라제로 명명됨)은 본 발명에 따르는 키메라 효소의 활성을 분석하기 위해 설계했다. 시험 서열은 pET-22b(+) 골격(Novagen, San Diego, CA USA)에 도입했고, 이는 RNA 폴리머라제 프로모터(T7, T3 및 SP6 파지 RNAP 프로모터, 이어서 이. 콜라이 리보솜 rrnDl 프로모터), Lac 오퍼레이터 스템-루프 서열, 반딧불 루시퍼라제의 전체 ORF, 폴리[A]-트랙, RNA 자가-절단을 위한 간염-D 리보자임 인코딩 서열(Conzelmann and Schnell 1994; Garcin, Pelet et al. 1995; Bridgen and Elliott 1996; Schurer, Lang et al. 2002; Walker, Avis et al. 2003) 및 파지 RNA 폴리머라제를 위한 ΤΦ 터미네이터의 배열로 이루어졌다(도 3a). 루시퍼라제 ORF 및 T7 프로모터 사이의 물리적 결합을 파괴하는 pT7p-루시퍼라제 플라스미드의 BamHI-소화된 버젼은 음성 대조군으로 사용되었다(도 3b). 더욱이, 활성 비교용으로 사용된 pCMV-루시퍼라제 플라스미드는 pCMV-Script 플라스미드의 RNA 폴리머라제 II-의존성 CMV 프로모터의 하류에 반딧불 루시퍼라제를 함유했다(도 3c).
II. 세포 배양 및 형질감염
사람 배아 신장 293 세포(HEK-293, ATCC CRL 1573)는 5% CO2와 함께 37℃에서 성장시켰다. 세포는 3.97mM L-알라닐-L-글루타민(몰 등량 기준으로 L-글루타민을 대체함), 10% 태소 혈청(FBS), 1% 비필수 아미노산, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신 및 0.2% 펀지존이 보충된 둘베코 변형된 배지(DMEM)에서 유지했다.
형질감염 1일 전, HEK-293 세포를 웰당 대략 8 × 104 세포의 밀도로 24웰 플레이트에 플레이팅했다. 형질감염 1시간 전, 배지를 항체 부재하의 신선한 완전 배지로 변경했다. 형질감염은 리포펙타민(Lipofectamine) 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA USA)으로 제조업자의 권고에 따라 수행했다. 요약하면, Opti-MEM I 감소된 혈청 배지(Invitrogen, Carlsbad, CA USA)에서 희석하고 리포펙타민 2000과 혼합된 플라스미드 DNA를 세포 배지에 첨가했다. 형질감염 후, 세포를 120시간 이하로 항온처리하여, 루시퍼라제 및 SEAP 유전자 리포터 발현에 대해 시험했다.
세포는, pT7p-루시퍼라제 리포터 플라스미드(0.4㎍ DNA/웰 및 1㎕/웰 리포펙타민 2000)와 함께, pT7RNAP 또는 pNP868R-T7RNAP(0.4㎍ DNA/웰 및 0.1㎕/웰 리포펙타민 2000)로 공-형질감염시켰다. 일련의 다른 형질감염 조건을 음성 대조군으로 사용했고, 다음을 포함했다: (a) 루시퍼라제 ORF와 T7 프로모터 사이의 물리적 결합을 파괴하는 BamHI 제한 효소로 pT7p-루시퍼라제를 소화시킨 것을 제외하고는, 전과 동일한 공-형질감염, (b) pNP868R-T7RNAP 또는 pT7RNAP 플라스미드 단독, (c) pT7p-루시퍼라제 리포터 플라스미드 소화되거나 소화되지 않은 것 단독, (d) 형질감염 시약 단독(즉, 리포펙타민 2000). 세포는 또한 pORF-eSEAP 플라스미드(InvivoGen, San Diego, CA; 혈질감염 효능을 표준화하기 위해 사용됨) 뿐만 아니라 pCMV-T7RNAP 플라스미드(활성 비교용으로 사용됨)으로 형질감염시켰다.
III. 반딧불 루시퍼라제 발광 및 SEAP 비색계 분석
반딧불 루시퍼라제 발광은 제조업자의 권고에 따라 루시퍼라제 분석 시스템으로 분석했다(Promega, Madison WI USA). 요약하면, HEK-293 세포는 세포 배양 용해 시약(CCLR) 용해 완충제에서 용해시키고, 이어서 12,000 × g으로 2분 동안 4℃에서 원심분리했다. 루시퍼라제 분석 시약(Promega; 100㎕/웰)을 상청액(20㎕/웰)에 첨가했다. 발광 판독치는 발광계 판독기(Fluostar; BMG Labtech, Offenburg Germany) 상에서 제조업자의 지시에 따라 취했다.
pORF-eSEAP 플라스미드의 발현은 형질감염 효능을 표준화하기 위해 사용했다. 이 플라스미드는 분비된 태반 알칼리 포스파타제(SEAP)를 인코딩하고, 이는 퀀티-블루(Quanti-Blue) 비색계 효소 분석 키트(InvivoGen, San Diego, CA)를 선택된 시점에서 사용하여 세포 배양 배지 중의 효소 활성에 대해 분석했다. 유전자 리포터 발현은, 시험 세포 중의 루시퍼라제 발광으로부터 형질감염 시약 단독(RLU; 상대 광 단위)로 처리한 세포 중의 발광을 뺀 다음, 형질감염 효율(OD, 광학 밀도) 비율을 표준화하기 위해 SEAP 흡광도로 나눈 값으로 나타냈다.
IV. 통계학적 분석
모든 통계학적 분석은 다중 시험을 위한 홀름-본페로니(Holm-Bonferroni) 보정에 의해 조절된 스튜던트 t 양측검정 시험을 사용하여 수행했다. 적절한 경우, 0.05 미만의 p 값은 유의적인 것으로 간주했다.
V. 유전자 리포터 발현 분석
반딧불 루시퍼라제 리포터 발광 분석은, 본 발명에 따르는 키메라 효소 또는 T7RNAP 효소에 의해 생성된 mRNA의 번역능을 평가하기 위해 사용했다. pT7RNAP 및 pT7p-루시퍼라제 플라스미드의 공-형질감염은, pT7p-루시퍼라제 플라스미드의 pT7RNAP/BamHI-소화된 버젼으로 공-형질감염시킨 세포와 비교하여, 낮지만 검출가능한 루시퍼라제 발현 시그날을 유발했다(따라서, 이는 루시퍼라제 유전자 리포터 발현이 파지 T7 프로모터에 의해 유도됨을 증명한다; 도 4a 및 4b). 이는, 진핵 세포에서 발현된 T7RNAP가 이들의 5'-캡핑의 부재 때문에 불량하게 번역되는 RNA 분자를 합성할 수 있음을 나타낸, 이미 공개된 보고와 일치한다[참조: Fuerst, ies et al. 1986; Chen, Li et al. 1994]. 반딧불 루시퍼라제 유전자 발현 시그날의 현저 감소는 또한, 형질감염을 pT7RNAP 플라스미드(이는 루시퍼라제 발현이 T7RNAP의 존재를 필요로 함을 확증한다) 또는 pT7p-루시퍼라제 플라스미드(이는 발광 시그날의 특이성을 확증한다) 또는 둘 다의 부재하에 수행했을 때에 관찰되었다.
pNP868R-T7RNAP 플라스미드는 pT7p-루시퍼라제 플라스미드와 함께 공형질감염시키고, 상기와 동일한 조건하에 시험했다. 피크에서, pT7RNAP/pT7p-루시퍼라제 플라스미드와 비교하여, 대략 23배 높은 루시퍼라제 발현 시그날이 pNP868R-T7RNAP/pT7p-루시퍼라제로 관찰되었다. 상기 발견의 특이성은, pNP868R-T7RNAP 또는 pT7p-루시퍼라제 플라스미드 소화되거나 소화되지 않은 것 단독에 의한 형질감염 뿐만 아니라 pT7p-루시퍼라제 플라스미드의 BamHI-소화된 버젼의 공-형질감염에 의해 확증되었고, 이는 현저히 감소된 루시퍼라제 발현 시그날을 제공했다(도 4c). 피크에서, pNP868R-T7RNAP/pT7p-루시퍼라제 플라스미드의 공-형질감염은 pCMV-T7RNAP 플라스미드와 비교하여 72%의 루시퍼라제 발현 시그날을 제공했다(도 4a).
요약하면, pNP868R-T7RNAP 플라스미드에 의해 인코딩된 본 발명에 따르는 키메라 NP868R-T7RNAP 효소의 활성은 반딧불 루시퍼라제 리포터 발광 분석을 사용하여 증명되었다. 본 발명의 발견의 특이성은 일련의 대조군에 의해 뒷받침되고, 이는 NP868R-T7RNAP 효소의 mRNA 캡핑 및 DNA-의존성 RNA 폴리머라제 효소 활성 둘 다가 HEK-293 세포에서 발현되는 경우에 유지됨을 시사한다.
VI. 알파-아마니틴 처리된 세포에서 유전자 리포터 발현 분석
pNP868R-T7RNAP에 의한 전사가 이의 파지 DNA-의존성 T7 RNA 폴리머라제 잔기에 의존적임을 추가로 입증하기 위해, 유전자 형질감염 분석을 또한 α-아마니틴 처리된 세포에서 수행했다. α-아마니틴은 핵 RNA 폴리머라제 II의 특이적 억제제이고[참조: Jacob, Sajdel et al. 1970; edinger, Gniazdowski et al. 1970; Lindell, Weinberg et al. 1970], 이는 이의 Rpbl 서브유닛에 결합한다[참조: Bushnell, Cramer et al. 2002]. 대조적으로, α-아마니틴은, 본 발명에 따르는 NPNP868R-T7RNAP 키메라 효소의 유전자 조작에 사용된 파지 T7 RNA 폴리머라제에 의한 전사에 어떠한 효과도 갖지 않는다[참조: Kupper, McAllister et al. 1973; Engleka, Lewis et al. 1998].
RNA 폴리머라제 II-의존성 CMV 프로모터에 의해 유도되는 NP868R-T7RNAP 효소의 발현을 개시하기 위해, 세포 배지에 α-아마니틴의 첨가(0 내지 20㎍/ml 범위의 농도) 24시간 전 및 pT7p-루시퍼라제 플라스미드에 의한 2차 형질감염 전에 세포를 pNP868R-T7RNAP로 형질감염시켰다(도 5a). pCMV-루시퍼라제 플라스미드의 경우, 세포는 동시에 형질감염시키고 α-아마니틴으로 처리했다((0 또는 20㎍/ml; 도 5a). 유전자 리포터 발현은 시험 세포 중의 루시퍼라제 발광으로부터 형질감염 시약 단독(RLU; 상대 광 단위)로 처리한 세포 중의 발광을 뺀 다음, 형질감염 효능(OD, 광학 밀도) 비율에 대해 표준화하기 위해 SEAP 흡광도로 나눈 값으로 나타냈다.
예상한 바와 같이, α-아마니틴은 pCMV-루시퍼라제 형질감염된 세포의 루시퍼라제 유전자 리포터 발현을 거의 완전히 파괴했다(도 5b). 대조적으로, 루시퍼라제 발현의 완만한 감소만이 pNP868R-T7RNAP/pT7p-루시퍼라제 형질감염된 세포의 모든 농도에서 α-아마니틴에 의해 유발되었다(도 5c).
따라서, 본 발견은 NP868R-T7RNAP 효소에 의한 전사가 이의 파지 T7 DNA-의존성 RNA 폴리머라제 잔기의 효소 활성에 의존하고 있음을 확증한다.
VII. 면역형광
NP868R-T7RNAP 효소의 아세포 분포는 간접 면역형광에 의해 조사했다. HEK-293 세포를 폴리-L-리신 피복된 커버슬립 상에서 8 × 104 세포/웰로 24웰 플레이트에서 플레이팅하고(BD BioCoat; Bioscience, Mississauga, ON USA), 이어서 상기한 바와 같이 형질감염시켰다. 형질감염 6시간 및 24시간 후, 세포를 인산염 완충된 염수(PBS)로 세척하고, 이어서 15분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 고정 후, 세포를 PBS로 세척하고, 이어서 5% 염소 혈청(Invitrogen), 0.1% 트리톤 X-100 및 0.02% 나트륨 아지드를 함유하는 PBS에서 30분 동안 투과시켰다. 세포를 밤새 4℃에서, T7 RNA 폴리머라제(1:200, Novagen)에 대해 생성한 마우스 모노클로날 항체와 함께 배양했다. PBS로 광범위하게 세척한 후, 세포를 3시간 동안 실온에서 형광 이소티오시아네이트-접합된(FITC) 염소 항-마우스 IgG(Sigma-Aldrich)와 함께 배양했다. 세포를 5분 동안 4'-6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 염색했다. 이어서, 세포를 세척하고, 항-소멸 배지 모위올(Mowiol) 4-88(Calbiochem, Gibbstown, NJ USA)에 적재했다. 세포는 적절한 필터를 갖는 에피형광 현미경을 사용하여 분석했다.
예상한 바와 같이, 약하지만 검출가능한 FITC 시그날이 pNP868R-T7RNAP 플라스미드로 형질감염시킨 세포의 세포질에서 6시간 및 24시간 둘 다에서 관찰되었고, 이들의 핵은 DAPI에 의해 염색되었다.
VIII. 세포 생존능, 세포독성 및 아폽토시스
ApoTox-Glo 트리플렉스(Triplex) 분석(Promega, Madison WI)을 사용하여, NP868R-T7RNAP 효소의 발현이 생존능을 손상시키거나 형질감염된 세포의 세포독성 또는 아폽토시스를 유도하는지를 조사했다. 2개의 프로테아제 활성은 형광에 의해 분석했다: 하나는 세포 생존능의 마커(즉, 펩티드 기질 GF-AFC)이고, 다른 하나는 세포독성의 마커(즉, 펩티드 기질 bis-AAF-Rl10)이다. 아폽토시스는 캐스패스 활성에 대해 최적화된 시약에서, 테트라펩티드 서열 DEVD를 함유하는 발광원성 캐스패스-3/7 기질에 의해 분석했다.
세포 배양 및 형질감염은, HEK-293 세포를 웰당 1.2×104 세포의 밀도로 96-웰 플레이트에서 도말한 것을 제외하고는 상기한 바와 같이 수행했다. 세포는 pNP868R-T7RNAP 플라스미드, pT7RNAP 플라스미드 또는 형질감염 시약 단독으로 형질감염시켰다. ApoTox-Glo 트리플렉스(Triplex) 분석은 제조업자의 권고에 따라 수행했다. 요약하면, 선택된 시점에서, GF-AFC 기질 및 비스-AAF-Rl10 기질 둘 다를 함유하는 생존능/세포독성 시약을 웰에 첨가하고, 30분 동안 37℃에서 배양한 다음, 생존능 및 세포독성을 위해 2개의 상이한 파장 세트에서 형광 평가했다. 이어서, 캐스패스 시약을 모든 웰에 첨가하고, 실온에서 30분 배양후에 형광을 측정했다. 통계학적 분석은 상기한 바와 같이 수행했다. 세포 생존능, 세포독성 및 아폽토시스는 시험 세포 중의 발광/형광 시그날로부터 무처리 세포 중의 발광/형광을 뺀 값으로 나타냈다.
이미 보고된 바와 같이[참조: Patil, Rhodes et al. 2004], 세포 생존능, 세포독성 및 아폽토시스는, 무처리 세포와 비교하여, 형질감염 시약(즉, 리포펙타민 2000)으로 처리한 세포에서 현저히 손상되었다(도 6a, 6b 및 6c). 또한, 예상한 바와 같이, 세포 생존능, 세포독성 및 아폽토시스는, 플라스미드 DNA를 형질감염 혼합물에 첨가하는 경우에 일반적으로 더 많이 손상되었다(도 6a, 6b 및 6c). 그러나, 모든 시험된 시점에서, pNP868R-T7RNAP 플라스미드로 형질감염시킨 세포의 세포 생존능, 세포독성 또는 아폽토시스는, 세포 생조능 단독에 대한 형질감염 24시간 후를 제외하고는, pT7RNAP 플라스미드의 것과 통계학적으로 차이가 없었고, 이는 가능하게는 불확실성에 기인한다(도 6a, 6b 및 6c; 개개 시점에 대한 양측검정 스튜던트 t 시험, P-값<0.05).
결론적으로, NP868R-T7RNAP 효소에 대한 어떠한 세포독성, 세포 생존능 및 아폽토시스에서의 명백한 차이도 입증할 수 없고, 이는 어떠한 인식된 캡핑 효소 활성을 갖지 않는다.
실시예 2 - 활성 단량체성 키메라 효소 NP868R-T3RNAP 및 NP868R-SP6RNAP의 실시예
본 발명에 따르는 2개의 다른 유형의 단량체성 키메라 효소를 생성했고, 이는 가요성 링커(Gly3Ser)4에 의해 야생형 T3 또는 SP6 단량체성 박테이로파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 아미노 말단에 융합된 NP868R, 아프리카 돼지열 바이러스의 단량체성 mRNA 캡핑 효소로 이루어져 있다.
I. 방법
상기 단량체성 키메라 효소를 생성하는데 사용된 서열은 PCR 기반 방법을 사용하여 합성 올리고뉴클레오티드로부터 조립했고, 클로닝했고, 완전히 서열 분석했다. 이들 서열은 상기한 아클로닝 카세트를 함유하는 pCMV-Script 플라스미드에 아클로닝했다. 마지막으로, 발현에 사용된 모든 플라스미드는 유사한 설계를 가졌다: CMV IE1 프로모터/인핸서 프로모터, Kozak 서열, 이어서 ORF, 폴리[A]-트랙, 파지 RNA 폴리머라제 전사를 위한 ΤΦ 터미네이터 및 SV40 폴리아데닐화 시그날(도 7(A-D)).
아클로닝 방법의 결과로서, 아미노산을 플라스미드(pT3RNAP 및 pSP6RNAP의 경우에 Glu-Phe-Leu-Glu; pNP868R-T3RNAP 및 pNP868R-SP6RNAP의 경우에 Glu-Phe)에 의해 인코딩된 Kozac 서열의 ATG의 바로 하류에 부가했다. 또한, 2개의 아미노산을 (Gly3Ser)4 링커의 바로 상류(pNP868R-T3RNAP 및 pNP868R-SP6RNAP의 경우에 Gly-Pro) 또는 바로 하류(pNP868R-T3RNAP 및 pNP868R-SP6RNAP의 경우에 Leu-Glu)에 부가했다.
HEK-293 세포를 상기한 바와 같이24-웰 플레이트에서 성장시키고, 리포펙타민 2000 시약 및 적절한 플라스미드(0.4㎍ DNA/웰, + 1㎕/웰 리포펙타민 2000, 형질감염된 플라스미드당)를 사용하여 형질감염시켰다. 반딧불 루시퍼라제 발광은 pT7p-루시퍼라제(이는 또한 T3 및 SP6 프로모터 둘 다를 함유한다) 및 루시퍼라제 분석 시스템을 사용하여 상기한 바와 같이 분석했다. pORF-eSEAP 플라스미드의 발현은 상기한 바와 같이 형질감염 효능을 표준화하기 위해 사용했다. 통계학적 분석은, 적절한 경우, 다중 시험을 위해 홀름-본페로니 보정에 의해 조절된 스튜던트 t 양측검정 시험을 사용하여 수행했다. 0.05 미만의 p-값은 통계학적으로 유의적인 것으로 간주했다.
II. 결과
도 8에 제시된 바와 같이, 리포터 pT7p-루시퍼라제 플라스미드로 공-형질감염시키는 경우, , pNP868R-T3RNAP 및 NP868R-SP6RNAP 둘 다는 강력한 루시퍼라제 유전자 리포터 시그날을 나타내고, 이는 pT3RNAP 또는 pSP6RNAP보다 각각 14배 및 56배 높았다(각 비교를 위해 p<0.001, 스튜던트 t-시험). NP868R-T3RNAP 효소는 pCMV-T7RNAP 플라스미드에 대해 36% 활성을 갖고(p<0.001, 스튜던트 t-시험), NP868R-SP6RNAP 헤테로이량체성 효소는 pCMV-T7RNAP 플라스미드에 대해 1.1배 루시퍼라제 리포터 유전자 발현을 나타낸다(비통계학적 유의차, 스튜던트 t-시험).
이들 결과는 본 발명에 따르는 상이한 종류의 단량체성 키메라 효소의 활성을 입증한다.
실시예 3 - 활성 이량체성 및 삼량체성 키메라 효소의 실시예
본 발명에 따르는 상이한 종류의 활성 올리고머성 키메라 효소는 도 9에 제시된 바와 같이 생성되었다:
- 하나의 헤테로이량체성 키메라 효소(이는 EE1234L 및 RR1234L 류신-지퍼에 의해 단량체성 아프리카 돼지열 바이러스 mRNA 캡핑 효소 NP868R 및 단량체성 T7 RNA 폴리머라제 사이의 비공유 결합을 생성하여, 헤테로이량체성 RRl234L-pNP868R/EEl234L-T7RNAP 키메라 효소를 형성함),
- 가요성 (Gly3Ser)4 링커에 의해 단량체성 T7 RNA 폴리머라제와 2개의 백시니아 바이러스 mRNA 캡핑 효소(즉, D1R 또는 D12L) 각각 사이의 융합에 의해 수득된 2개의 헤테로이량체성 키메라 효소. 각각의 융합 단백질은 백시니아 바이러스 mRNA 캡핑 효소와 함께 공-발현되어, 헤테로이량체성 D12L/D1-T7RNAP 및 D1R/D12L-T7RNAP 키메라 효소를 형성함,
- 각각 백시니아 바이러스 mRNA 캡핑 효소와 T7 RNA 폴리머라제의 하나의 서브유닛의 아미노 말단에 EE1234L 및 RR1234L 류신-지퍼의 융합으로 생성되는 2개의 헤테로삼량체성 키메라 효소. 백시니아 바이러스 mRNA 캡핑 효소의 상이한 서브유닛를 갖는 RR1234L-DIR 또는 pRRl234L-D12L + EE1234L-T7RNAP의 동시 발현은 헤테로이량체성 DIR/RR1234L-D12L/EE1234L-T7RNAP 및 D12L/RRl234L-DlR/EEl234L-T7RNAP 키메라 효소를 형성한다.
I. 방법
키메라 효소를 생성하기 위해 사용된 서열은 PCR 기반 방법을 사용하여 합성 올리고뉴클레오티드로부터 조립하고, 클로닝하고, 완전히 서열 분석했다. 이들 서열은 상기한 아클로닝 카세트와 함께 pCMV-Script 플라스미드에 아클로닝시켰다. 마지막으로, 발현에 사용된 모든 플라스미드는 유사한 설계를 갖는다: CMV IE1 프로모터/인핸서 프로모터, Kozak 서열, 이어서 개방-판독 프레임(ORFs), 폴리[A]-트랙, 파지 RNA 폴리머라제 전사를 위한 ΤΦ 터미네이터, 및 SV40 폴리아데닐화 시그날(도 10(A-H)).
아클로닝 방법의 결과로서, 2개의 아미노산은 일부 플라스미드의 Kozak 서열(pT7RNAP의 경우에 Leu-Glu; pNP868R, pDIR, pD12L, pDlR-T7RNAP 및 pD12L-T7RNAP의 경우에 Glu-Phe)의 ATG의 바로 하류에, 류신-지퍼 서열(pEEl234L-T7RNAP의 경우에 Leu-Glu; pRRl234L-NP868R, pRRl234L-DlR 및 pRRl234L-D12L의 경우에 Glu-Phe)의 바로 하류에, 및 일부 인코딩된 단백질(pNP868R, pRRi234L-NP868R, pDIR, pD12L, pRRi234L-D1R 및 pRRl234L-D12L의 경우에 Gly-Pro)의 카복실-말단에 부가했다. 또한, 2개의 아미노산은 (Gly3Ser)4 링커에 대해 바류 상류(pDlR-T7RNAP 및 pD12L-T7RNAP의 경우에 Gly-Pro) 또는 바류 하류(pDlR-T7RNAP 및 pD12L-T7RNAP의 경우에 Leu-Glu)에 부가했다.
상기한 바와 같이, 사람 배아 신장 293 세포(HEK-293)를 24-웰 플레이트에서 성장시켰다. HEK-293 세포는 상기한 바와 같이 리포펙타민 2000 시약 및 적절한 플라스미드(0.4㎍ DNA/웰, + 1 ㎕/웰 리포펙타민 2000, 형질감염된 플라스미드당)을 사용하여 형질감염시켰다. 반딧불 루시퍼라제 발광은 pET-22b(+)T7RNAPp-루시퍼라제 리포터 플라스미드(이후 pT7p-루시퍼라제로서 지정함) 및 루시퍼라제 분석 시스템을 사용하여 상기한 바와 같이 분석했다. pORF-eSEAP 플라스미드의 발현은 상기한 바와 같이 형질감염 효능을 표준화하기 위해 사용했다.
유전자 리포터 발현은 시험된 조건하의 루시퍼하제 발광으로부터 형질감염 시약 단독(RLU, 상대 광 단위)으로 처리한 세포에서의 발광을 뺀 다음, SEAP 흡광도(OD, 광학 밀도) 비율로 나눈 값으로 나타냈다. 통계학적 분석은, 적절한 경우, 다중 시험을 위해 홀름-본페로니 보정에 의해 조정된 스튜던트 t 양측검정 시험을 사용하여 수행했다. 0.05 미만의 p-값은 통계학적으로 유의한 것으로 간주했다.
II. 결과
II.1 헤테로이량체성 RR1234L-NP868R/EE1234L-T7RNAP 키메라 효소
헤테로이량체성 효소 RRl234L-NP868R/EEl234L-T7RNA 키메라 효소(각각 pRRl234L-pNP868R 및 pEEl234L-T7RNAP 플라스미드에 의해 인코딩됨)의 활성이 증명되었다. 이러한 헤테로이량체성 효소는 EE1234L 및 RR1234L 류신-지퍼에 의해 단량체성 아프리카 돼지열 바이러스 mRNA 캡핑 효소 pNP868R 및 단량체성 T7 RNA 폴리머라제 사이의 비공유 연결에 의해 생성된다(도 9). EE1234L(산성 류신-지퍼; LEIEAAFLEQENTALETEVAELEQEVQRLENIVSQYETRYGPLGGG, 1문자 아미노산 코드) 및 RR1234L 류신-지퍼(류신-지퍼 이량체화에 관여하지 않는 GGGK 배향의 약간의 변형을 갖는 염기성 류신-지퍼[참조: Moll, Ruvinov et al. 2001]; LEIRAAFLRRRNTALRTRVAELRQRVQRLRNIVSQYETRYGPLGGG, 1문자 아미노산 코드)는 각각 P868R 및 T7RNAP의 아미노 말단에 각각 부가했다. RR1234L 및 EE1234L 류신 지퍼는 바람직하게는 반평행 배향으로 헤테로이량체로서 바람직하게는 용융하는 2개의 양쪽 α-헬릭스로 이루어진 이량체성 나선형 코일 펩티 구조이다[참조: Moll, Ruvinov et al. 2001].
예상된 바와 같이, 류신-지퍼 서열의 존재 또는 부재하에 아프리카 돼지열 바이러스 mRNA 캡핑 효소 단독을 인코딩하는 플라스미드(즉, 각각 pRRi234L-NP868R 및 pNP868R)의 형질감염은 어떠한 검출가능한 루시퍼라제 리포터 유전자 발현을 유도하지 않는다(도 11). 또한, 예상된 바와 같이, EE1234L 류신 지퍼(pEEl234L-T7RNA에 의해 인코딩됨)와 함께 T7 RNA 폴리머라제를 인코딩하는 플라스미드로 형질감염된 세포는 류신-지퍼(pT7RNA에 의해 인코딩됨)의 부재하에 T7 RNA 폴리머라제에 대한 매우 유사한 활성을 나타내고, 이는 T7 RNA 폴리머라제의 천연 아미노산 말단이 이의 효소 처리능의 주요 손상 없이 변형될 수 있다는 추가의 증거를 제공한다.
리포터 pT7p-루시퍼라제 플라스미드와 함께 pRRl234L-NP868R 및 pEEl234L-T7RNA 플라스미드(루시퍼라제-지퍼와 함께 NP868R 및 T7RNAP를 인코딩함)로 공-형질감염된 HEK293 세포는 강력한 루시퍼라제 리포터 유전자 발현 시그날을 나타내고, 이는 pCMV-T7RNAP 플라스미드에 대해 87%이다(비-통계학적 유의차, 스튜던트 t-시험; (도 11)). 추가로, pRRi234L-NP868R 및 pEEi234L-T7RNA 플라스미드와 함께 리포터 pT7p-루시퍼라제 플라스미드의 존재하에 공-형질감염된 세포는 pNP868R 및 pT7RNAP로 공형질감염된 세포보다 3.7배 더 높은 루시퍼라제 리포터 유전자 발현을 나타낸다(류신-지퍼의 부재하에 NP868R 및 T7RNAP를 인코딩함; p<0.05, 스튜던트 t-시험).
이들 결과는 본 발명에 따르는 헤테로이량체성 키메라 효소의 활성을 입증하고, 류신-지퍼에 의해 NP868R 및 T7RNAP 사이의 비공유 결합이 상기 키메라 효소에 의해 유도된 유전자 리포터의 발현을 현저히 증가시킴을 입증한다.
II.2 헤테로이량체성 D1R/D12L-T7RNAP 및 D12L/D1R-T7RNAP 키메라 효소
다른 종류의 헤테로이량체성 키메라 효소의 활성은 백시니아 mRNA 캡핑 효소를 사용하여 입증했다.
자체로서, 백시니아 mRNA 캡핑 효소는 (i) RNA-트리포스파타제, RNA 구아닐릴트랜스퍼라제 및 RNA N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제 효소 활성을 갖는, 이후 D1R로서 지정된, 백시니아 바이러스 D1R 유전자(게놈 서열번호 NC 006998.1; GeneID# 3707562; UniProtKB/Swiss-Prot ID# YP_232988.1)에 의해 인코딩된 서브유닛 95kDa[참조: Cong and Shuman 1993; Niles and Christen 1993; Higman and Niles 1994; Mao and Shuman 1994; Gong and Shuman 2003] 및 (ii) 고유 효소 활성을 갖지 않지만 역동적으로 D1R 서브유닛의 RNA N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제 활성을 향상시키는, 이후 D12L로서 지정된, 백시니아 바이러스 D12L 유전자(게놈 서열번호 NC 006998.1; GeneID#3707 15; UniProtKB/Swiss-Prot ID#YP_232999.1)에 의해 인코딩된 서브유닛 31-kDa[참조: Higman, Bourgeois et al. 1992; Higman, Christen et al. 1994; Mao and Shuman 1994]로 이루어진 헤테로이량체이다.
DIR 또는 D12L는 (Gly3Ser)4 링커(각각, D1R-T7RNAP 또는 D12L-T7RNAP로서 인코딩됨)를 통해 T7 RNA 폴리머라제의 아미노-말단에 융합시켰다. 공-발현될 경우, 기타 백시니아 mRNA 캡핑 효소 서브유닛(각각, pD12L 또는 D1R에 의해 인코딩됨)와 함께 각 융합 단백질은 각각 D12L/D1R-T7RNAP 및 D1R/D12L-T7RNAP로서 지정된 두 개의 상이한 헤테로이량체성 키메라 효소를 생성한다(도 9). 리포터 pT7p-루시퍼라제 플라스미드의 존재하에, 헤테로이량체성 키메라 효소는 HEK293 세포에서 강한 루시퍼라제 유전자 리포터 시그날을 생성한다(도 12). 헤테로이량체성 D12L/D1R-T7RNAP 키메라 효소는 pCMV-T7RNAP 플라스미드의 것에 대해 32% 활성을 갖는(p<0.01, 스튜던츠 t-시험) 반면, D1R/D12L-T7RNAP 헤테로이량체성 효소는 pCMV-T7RNAP 플라스미드(비통계학적 유의차, 스튜던츠 t-시험)보다 1.5배 높은 루시퍼라제 리포터 유전자 발현을 갖는다. 또한, T7 RNA 폴리머라제(pD1R, pD12L 및 pT7RNAP에 의해 인코딩됨)에 결합되지 않은 백시니아 mRNA 캡핑 효소의 두 서브유닛의 공발현은 각각 헤테로이량체성 D12L/D1R-T7RNAP 및 D1R/D12L-T7RNAP 키메라 효소보다 9배 및 42배 낮은 루시퍼라제 리포터 유전자 발현 시그날을 나타낸다(두 통계학적 비교에 대해 P<0.05, 스튜던츠 t-시험).
이러한 결과는 본 발명에 따르는 상이한 종류의 헤테로이량체성 키메라 효소의 활성, 및 백시니아 mRNA 캡핑 효소 및 T7RNAP의 서브유닛 사이의 공유 결합이 유전자 리포터 발현을 상당히 자극한다는 것을 입증한다. 또한 기대했던 바와 같이, 리포터 pT7p-루시퍼라제 플라스미드의 존재하에, T7 RNA 폴리머라제 없이 D1R 및/또는 D12L의 발현은 실질적으로 검출가능한 루시퍼라제 발현을 전혀 유도하지 않는다.
II.3 헤테로이량체성 D12L/RR1234L-D1R/EE1234L-T7RNAP 및 D1R/RR1234L-D 12L/EE1234L-T7RNAP 키메라 효소
헤테로삼량체성 키메라 효소의 활성이 또한 입증되었다.
염기성 RR1234L 류신 지퍼를 백시니아 바이러스 mRNA 캡핑 효소(각각, pRR1234L-DlR 및 RR1234L-D12L에 의해 인코딩됨)의 D1R 또는 D12L 서브유닛의 아미노 말단에 융합시킨 반면, 상보적 산성 EE1234L 류신-지퍼를 T7 RNA 폴리머라제(pEE1234L-T7RNA 플라스미드에 의해 인코딩됨)의 아미노 말단에 부가했다. pRR1234L-DIR 또는 pRR1234L-D12L과 함께, pEE1234L-T7RNAP + 기타 백시니아 mRNA 캡핑 효소 서브유닛(각각, pD12L 및 pD1R 플라스미드)의 공발현은 따라서 각각 D12L/RR1234L-D1R/EE1234L-T7RNAP 및 D1R/RR1234L-D12L/EE1234L-T7RNAP로서 지정된 두 개의 상이한 헤테로삼량체성 CCPP 효소를 생성한다(도 9).
T7 RNA 폴리머라제는 이들의 부재시보다 백시니아 바이러스 mRNA 캡핑 효소의 D1R/D12L 서브유닛와 함께 공발현될 때 7배 더 높은 루시퍼라제 유전자 리포터 시그날을 나타냈다. 따라서, 이들 결과는 백시니아 바이러스/박테리오파지 RNAP 하이브리드 발현 시스템에 의해 수득된 것들과 병행하고, 여기서 캡핑되지 않은 T7 기록의 번역능은 재조합 바이러스에 의해 제공된 백시니아 mRNA 캡핑 효소의 발현에 의해 증가한다[참조: Fuerst, Niles et al. 1986; Fuerst, Earl et al. 1987; Elroy-Stein, Fuerst et al. 1989; Fuerst, Fernandez et al. 1989; Fuerst and Moss 1989; Elroy-Stein and Moss 1990].
강한 루시퍼라제 유전자 리포터 시그날은 리포터 pT7p-루시퍼라제 플라스미드의 존재하에 D1R/RR1234L-D12L/EE1234L-T7RNAP 또는 D12L/RR1234L-D1R/EE1234L-T7RNAP CCPP 효소를 발현시키는 HE-293 세포에서 나타났다(도 13). 헤테로이량체성 D12L/RR1234L-D1R/EE1234L-T7RNAP 및 D1R/RR1234L-D12L/EE1234L-T7RNAP 키메라 효소는 pCMV-T7RNAP 플라스미드의 것에 대해 각각 57% 및 33%를 갖는다(비통계학적 유의차, 스튜던츠 t-시험). 헤테로이량체성 D12L/RR1234L-D1R/EE1234L-T7RNAP 및 DlR/RRl234L-D12L/EEl234L-T7RNAP 키메라 효소는 류신-지퍼 없이 Dl, D12L 및 T7RNAP를 발현시키는 세포보다 각각 11배 및 6.7배 더 강한 루시퍼라제 유전자 리포터 발현 시그날을 나타낸다(각각, p=0.05 및 비통계학적 유의차; 스튜던츠 t-시험).
이들 결과는 본 발명에 따르는 헤테로이량체성 키메라 효소의 활성, 및 백시니아 mRNA 캡핑 효소 및 T7 RNA 폴리머라제의 임의의 서브유닛 사이의 비공유 결합이 유전자 리포터 발현을 상당히 증가시킨다는 것을 증명한다.
III. 결론
이들 본 발명의 결과는 공유 또는 비공유 연결에 의해 생성된 본 발명에 따르는 상이한 종류의 헤테로이량체성 및 헤테로삼량체성 키메라 효소의 활성을 나타낸다.
본 발명은 또한 키메라 효소의 상이한 촉매 도메인 사이 및 특히 캡핑 효소와 RNA 폴리머라제 사이의 공유 또는 비공유 연결이 키메라 효소에 의한 유전자 리포터 발현의 최적화를 가능하게 한다는 증거를 제공한다.
실시예 4 - 루시퍼라제 리포터 유전자의 자극
세포 RNA 폴리머라제 II 및 캡핑 효소에 대한 침묵 서열에 의한 발현
I. 방법
HEK-293 세포는 24웰 플레이트에서 상기한 바와 같이 성장시키고, 리포펙틴 2000 시약, 및 적절한 농도의 siRNA(Qiagen; Hilden, Germany) 및 플라스미드(0.4㎍ DNA/웰, + 1㎕/웰 리포펙틴 2000, 형질감염된 플라스미드당)을 사용하여 형질감염시켰다. 증명된 강력한 활성을 갖는 NP868R-SP6 키메라 효소를 당해 실험에 사용했다. 반딧불 루시퍼라제 발광은 pT7p-루시퍼라제(이는 또한 T3 및 SP6 프로모터 둘 다를 함유한다) 및 루시퍼라제 분석 시스템을 사용하여 상기한 바와 같이 분석했다. pORF-eSEAP 플라스미드의 발현은 상기한 바와 같인 형질감염 효능을 표준화하기 위해 사용했다.
사람 POLR2A(NCBI 유전자 ID# 5430; mRNA 서열 ID# NM 000937.4; NCBI 단백질 서열 ID# NP_000928.1)을 표적화하는 4개의 siRNA가 사용되었다: SI04364381 (mRNA 서열 1255-1275: CAGCGGTTGAAGGGCAAGGAA), SI04369344 (mRNA 서열 830-850: ATGCGGAATGGAAGCACGTTA), SI04250162 (mRNA 서열 2539-2559: ATGGTCGTGTCCGGAGCTAAA), 및 SI04354420 (mRNA 서열 4896-4916: CAGCGGCTTCAGCCC AGGTTA).
또한, 사람 RNGTT(유전자 ID# 8732; mRNA 서열 ID# NM_003800.3; NCBI 단백질 서열 ID# NP_003791.3)을 표적화하는 4개의 siRNA가 사용되었다: SI00055986 (mRNA 서열 3187-3207: ATGGATTTAAAGGGCGGCTAA), SI03021508 (mRNA 서열 430-450: TTCAAGGTTCTATGACCGAAA), SI00055972 (mRNA 서열 2530-2550: CAGGGTTGTTAAGTTGTACTA) 및 SI00055979 (mRNA 서열 4132-4152: TACCATCTGCAGTATTATAAA).
II. 결과
1차 실험에서, 4개 POLR2A siRNA 및 4개 RNGTT siRNA의 효과를 25nM 최종 농도에서 시험했다(도 14). siRNA는 pNP868R-SP6RNAP 키메라 효소 플라스미드 및 리포터 pT7p-루시퍼라제 플라스미드와 함께 공-형질감염시켰다. 총괄하여, POLR2A siRNA는, siRNA 부재하의 동일한 조건과 비교하여, 루시퍼라제 유전자 리포터 발현을 평균 127% 증가시키는 경향이 있다. 유사하게는, RNGTT siRNA의 부가는, siRNA 부재하의 동일한 조건과 비교하여, 루시퍼라제 유전자 리포터 발현을 평균 147% 증가시켰다.
최고 자극 비율을 나타낸 POLR2A SI04369344 및 RNGTT SI00055972 siRNA는 2차 실험을 위해 선택했다. NP868R-SP6RNAP에 의해 유도된 루시퍼라제 리포터 유전자의 발현은 0 내지 100nM 범위의 농도에서 siRNA의 존재하에 분석했다(도 15). 용량 반응은 siRNA 둘 다로 관찰했다. 3.8배의 최고 발현 자극이 POLR2A SI04369344의 경우에 100 nM에서 관찰되었고, 5.1배의 자극이 RNGTT SI00055972 siRNA의 경우에 100 nM에서 관찰되었다.
III. 결론
본 발명의 발견은 siRNA에 의한 세포 전사 및 전사후 메카니즘의 침묵이 NP868R-SP6RNAP 키메라 효소에 의해 유도된 리포터 유전자 발현을 자극함을 증명한다.
<110> EUKARYS <120> Capping-prone RNA polymerase enzymes and their applications <130> IPA120900 <150> EP 10305400.3 <151> 2010-04-16 <160> 50 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 883 <212> PRT <213> Enterobacteria phage T7 <400> 1 Met Asn Thr Ile Asn Ile Ala Lys Asn Asp Phe Ser Asp Ile Glu Leu 1 5 10 15 Ala Ala Ile Pro Phe Asn Thr Leu Ala Asp His Tyr Gly Glu Arg Leu 20 25 30 Ala Arg Glu Gln Leu Ala Leu Glu His Glu Ser Tyr Glu Met Gly Glu 35 40 45 Ala Arg Phe Arg Lys Met Phe Glu Arg Gln Leu Lys Ala Gly Glu Val 50 55 60 Ala Asp Asn Ala Ala Ala Lys Pro Leu Ile Thr Thr Leu Leu Pro Lys 65 70 75 80 Met Ile Ala Arg Ile Asn Asp Trp Phe Glu Glu Val Lys Ala Lys Arg 85 90 95 Gly Lys Arg Pro Thr Ala Phe Gln Phe Leu Gln Glu Ile Lys Pro Glu 100 105 110 Ala Val Ala Tyr Ile Thr Ile Lys Thr Thr Leu Ala Cys Leu Thr Ser 115 120 125 Ala Asp Asn Thr Thr Val Gln Ala Val Ala Ser Ala Ile Gly Arg Ala 130 135 140 Ile Glu Asp Glu Ala Arg Phe Gly Arg Ile Arg Asp Leu Glu Ala Lys 145 150 155 160 His Phe Lys Lys Asn 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atcgacgccc acaagcagga aagcggcatt 2340 gcccccaact tcgtgcacag ccaggacggc agccacctga gaaagaccgt ggtgtgggct 2400 cacgagaagt acggcatcga gagcttcgcc ctgatccacg acagcttcgg caccattccc 2460 gccgacgccg ccaacctgtt caaggccgtg cgggagacaa tggtggacac ctacgagagc 2520 tgcgacgtgc tggccgactt ctacgaccag ttcgccgacc agctgcacga gagccagctg 2580 gacaagatgc ccgccctgcc cgccaagggg aacctgaacc tgcgggacat cctggaaagc 2640 gacttcgcct tcgcctga 2658 <210> 23 <211> 2667 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Open-reading frame of the pT3RNAP plasmid <400> 23 atggaattcc tcgagaacat catcgagaat atcgagaaga acgacttctc cgagatcgag 60 ctggccgcca tccccttcaa caccctggcc gaccactacg gctccgccct ggccaaagag 120 cagctggccc tggaacatga gtcctacgag ctgggcgagc ggcggttcct gaagatgctg 180 gaacggcagg ccaaggccgg cgagatcgcc gataacgccg ctgccaagcc cctgctggcc 240 accctgctgc ctaagctgac cacccggatc gtggaatggc tggaagagta cgcctccaag 300 aagggccgga agccctccgc ctacgcccct ctgcagctgc tgaagcctga agcctccgcc 360 ttcattaccc tgaaagtgat cctggcctcc ctgacctcca 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Lys Gly Asn Leu Asn Leu Arg Asp 1730 1735 1740 Ile Leu Glu Ser Asp Phe Ala Phe Ala 1745 1750 <210> 41 <211> 3588 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Open-reading frame of the pD12L-T7RNAP plasmid <400> 41 atggaattcg acgagatcgt gaagaacatc cgcgagggca cccacgtgct gctgcccttc 60 tacgagacac tgcccgagct gaacctgtcc ctgggcaagt cccccctgcc ctccctggaa 120 tacggcgcca actacttcct gcagatctcc agagtgaacg acctgaaccg gatgcccacc 180 gacatgctga agctgttcac ccacgacatc atgctgcccg agtccgacct ggacaaggtg 240 tacgagattc tgaagatcaa ctccgtgaag tactacggcc ggtccacaaa ggctgacgcc 300 gtggtggccg acctgtctgc ccggaacaag ctgttcaaga gagagcggga cgccatcaag 360 tccaacaacc acctgaccga gaacaacctg tacatctccg actacaagat gctgaccttc 420 gacgtgttcc ggcccctgtt cgacttcgtg aacgagaagt actgcatcat caagctgccc 480 accctgttcg gcagaggcgt gatcgacacc atgcggatct actgctccct gttcaagaac 540 gtgcggctgc tgaagtgcgt gtccgactcc tggctgaagg actccgccat catggtggcc 600 tccgacgtgt gcaagaagaa cctggacctg ttcatgtccc acgtgaagtc cgtgaccaag 660 tcatccagct ggaaggacgt gaactccgtg cagttctcca tcctgaacaa ccccgtggac 720 accgagttca tcaacaagtt tctggaattt tccaaccggg tgtacgaggc cctgtactac 780 gtgcactccc tgctgtactc ctccatgacc tccgactcca agtccatcga gaacaaacat 840 cagcgacggc tggtcaagct gctgctgggg cccggcggag gcggaagtgg aggcggagga 900 agcggagggg gaggatctgg cggcggaggc agcctcgaga acaccatcaa tatcgccaag 960 aacgacttca gcgacatcga gctggccgcc atccctttca acaccctggc cgaccactat 1020 ggcgagcggc tggccagaga acagctggcc ctggaacacg agagctacga aatgggcgag 1080 gcccggttcc ggaagatgtt cgagagacag ctgaaggccg gcgaggtggc cgataatgcc 1140 gccgctaagc ccctgatcac caccctgctg cccaagatga tcgcccggat caacgattgg 1200 ttcgaggaag tgaaggccaa gcggggcaag aggcccaccg ccttccagtt tctgcaggaa 1260 atcaagcccg aggccgtggc ctacatcacc atcaagacca ccctggcctg cctgaccagc 1320 gccgacaata ccaccgtgca ggctgtcgct tctgccatcg gcagagccat cgaggacgag 1380 gccagattcg gcagaatccg ggacctggaa gccaagcact tcaagaaaaa cgtggaggaa 1440 cagctgaaca agcgcgtggg ccacgtgtac aagaaagcct tcatgcaggt ggtggaggcc 1500 gacatgctga gcaagggcct gctgggcgga gaagcctggt ccagctggca caaagaggac 1560 agcatccacg tcggcgtgcg gtgcatcgag atgctgatcg agtcgaccgg catggtgtcc 1620 ctgcacaggc agaatgccgg cgtggtgggc caggacagcg agacaatcga actggccccc 1680 gagtatgccg aggccattgc cacaagagcc ggcgctctgg ccggcatcag ccccatgttc 1740 cagccctgcg tggtgcctcc taagccctgg acaggcatca caggcggcgg atactgggcc 1800 aacggcagac gccctctggc tctggtgcgg acccacagca agaaagccct gatgcgctac 1860 gaggacgtgt acatgcccga ggtgtacaag gccatcaaca ttgcccagaa caccgcctgg 1920 aagatcaaca agaaagtgct ggccgtggcc aatgtgatca ccaagtggaa gcactgcccc 1980 gtggaggaca tccccgccat cgagcgggag gaactgccca tgaagcccga ggacatcgac 2040 atgaaccccg aggccctgac agcctggaaa agggccgctg ccgccgtgta ccggaaggac 2100 aaggcccgga agtcccggcg gatcagcctg gagttcatgc tggaacaggc caacaagttc 2160 gccaaccaca aggccatttg gttcccttac aacatggact ggcggggcag agtgtacgcc 2220 gtgagcatgt tcaatccaca aggcaacgac atgaccaagg ggctgctgac cctggccaag 2280 ggcaagccca tcggcaaaga gggctactac tggctgaaga tccacggcgc caactgcgct 2340 ggcgtggaca aggtgccctt cccagagcgg atcaagttca tcgaggaaaa ccacgagaac 2400 atcatggcct gcgccaagag ccctctagaa aacacttggt gggccgagca ggacagcccc 2460 ttctgcttcc tggccttctg ctttgagtac gccggagtgc agcaccacgg cctgagctac 2520 aactgcagcc tgcccctggc cttcgatggc agctgcagcg gcatccagca cttcagcgcc 2580 atgctgaggg acgaagtggg cggcagagcc gtgaatctgc tgccaagcga gacagtgcag 2640 gacatctacg ggatcgtggc caagaaagtg aacgagatcc tgcaggccga cgccatcaac 2700 ggcaccgaca acgaggtggt gaccgtgacc gatgagaaca ccggcgagat cagcgagaaa 2760 gtgaagctcg gcaccaaggc cctggctggc cagtggctgg cctacggcgt gaccagatcc 2820 gtgaccaagc ggagcgtgat gacactggcc tatggcagca aagagttcgg cttccggcag 2880 caggtgctgg aagataccat ccagcctgcc atcgacagcg gcaaggggct gatgttcacc 2940 cagcccaacc aggccgctgg ctacatggcc aagctcatat gggagagcgt gtccgtgaca 3000 gtggtggccg ccgtggaggc catgaattgg ctgaagtccg ccgccaaact gctggccgct 3060 gaagtgaagg acaaaaagac cggcgaaatc ctgcggaaga gatgcgccgt gcactgggtg 3120 acccccgatg gcttccccgt gtggcaggag tacaagaagc ccatccagac ccggctgaac 3180 ctgatgttcc tgggccagtt cagactgcag cccaccatca acaccaacaa ggactccgag 3240 atcgacgccc acaagcagga aagcggcatt gcccccaact tcgtgcacag ccaggacggc 3300 agccacctga gaaagaccgt ggtgtgggct cacgagaagt acggcatcga gagcttcgcc 3360 ctgatccacg acagcttcgg caccattccc gccgacgccg ccaacctgtt caaggccgtg 3420 cgggagacaa tggtggacac ctacgagagc tgcgacgtgc tggccgactt ctacgaccag 3480 ttcgccgacc agctgcacga gagccagctg gacaagatgc ccgccctgcc cgccaagggg 3540 aacctgaacc tgcgggacat cctggaaagc gacttcgcct tcgcctga 3588 <210> 42 <211> 1195 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Protein sequence encoded by pD12L-T7RNAP plasmid <400> 42 Met Glu Phe Asp Glu Ile Val Lys Asn Ile Arg Glu Gly Thr His Val 1 5 10 15 Leu Leu Pro Phe Tyr Glu Thr Leu Pro Glu Leu Asn Leu Ser Leu Gly 20 25 30 Lys Ser Pro Leu Pro Ser Leu Glu Tyr Gly Ala Asn Tyr Phe Leu Gln 35 40 45 Ile Ser Arg Val Asn Asp Leu Asn Arg Met Pro Thr Asp Met Leu Lys 50 55 60 Leu Phe Thr His Asp Ile Met Leu Pro Glu Ser Asp Leu Asp Lys Val 65 70 75 80 Tyr Glu Ile Leu Lys Ile Asn Ser Val Lys Tyr Tyr Gly Arg Ser Thr 85 90 95 Lys Ala Asp Ala Val Val Ala Asp Leu Ser Ala Arg Asn Lys Leu Phe 100 105 110 Lys Arg Glu Arg Asp Ala Ile Lys Ser Asn Asn His Leu Thr Glu Asn 115 120 125 Asn Leu Tyr Ile Ser Asp Tyr Lys Met Leu Thr Phe Asp Val Phe Arg 130 135 140 Pro Leu Phe Asp Phe Val Asn Glu Lys Tyr Cys Ile Ile Lys Leu Pro 145 150 155 160 Thr Leu Phe Gly Arg Gly Val Ile Asp Thr Met Arg Ile Tyr Cys Ser 165 170 175 Leu Phe Lys Asn Val Arg Leu Leu Lys Cys Val Ser Asp Ser Trp Leu 180 185 190 Lys Asp Ser Ala Ile Met Val Ala Ser Asp Val Cys Lys Lys Asn Leu 195 200 205 Asp Leu Phe Met Ser His Val Lys Ser Val Thr Lys Ser Ser Ser Trp 210 215 220 Lys Asp Val Asn Ser Val Gln Phe Ser Ile Leu Asn Asn Pro Val Asp 225 230 235 240 Thr Glu Phe Ile Asn Lys Phe Leu Glu Phe Ser Asn Arg Val Tyr Glu 245 250 255 Ala Leu Tyr Tyr Val His Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Met Thr Ser Asp 260 265 270 Ser Lys Ser Ile Glu Asn Lys His Gln Arg Arg Leu Val Lys Leu Leu 275 280 285 Leu Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 290 295 300 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Glu Asn Thr Ile Asn Ile Ala Lys 305 310 315 320 Asn Asp Phe Ser Asp Ile Glu Leu Ala Ala Ile Pro Phe Asn Thr Leu 325 330 335 Ala Asp His Tyr Gly Glu Arg Leu Ala Arg Glu Gln Leu Ala Leu Glu 340 345 350 His Glu Ser Tyr Glu Met Gly Glu Ala Arg Phe Arg Lys Met Phe Glu 355 360 365 Arg Gln Leu Lys Ala Gly Glu Val Ala Asp Asn Ala Ala Ala Lys Pro 370 375 380 Leu Ile Thr Thr Leu Leu Pro Lys Met Ile Ala Arg Ile Asn Asp Trp 385 390 395 400 Phe Glu Glu Val Lys Ala Lys Arg Gly Lys Arg Pro Thr Ala Phe Gln 405 410 415 Phe Leu Gln Glu Ile Lys Pro Glu Ala Val Ala Tyr Ile Thr Ile Lys 420 425 430 Thr Thr Leu Ala Cys Leu Thr Ser Ala Asp Asn Thr Thr Val Gln Ala 435 440 445 Val Ala Ser Ala Ile Gly Arg Ala Ile Glu Asp Glu Ala Arg Phe Gly 450 455 460 Arg Ile Arg Asp Leu Glu Ala Lys His Phe Lys Lys Asn Val Glu Glu 465 470 475 480 Gln Leu Asn Lys Arg Val Gly His Val Tyr Lys Lys Ala Phe Met Gln 485 490 495 Val Val Glu Ala Asp Met Leu Ser Lys Gly Leu Leu Gly Gly Glu Ala 500 505 510 Trp Ser Ser Trp His Lys Glu Asp Ser Ile His Val Gly Val Arg Cys 515 520 525 Ile Glu Met Leu Ile Glu Ser Thr Gly Met Val Ser Leu His Arg Gln 530 535 540 Asn Ala Gly Val Val Gly Gln Asp Ser Glu Thr Ile Glu Leu Ala Pro 545 550 555 560 Glu Tyr Ala Glu Ala Ile Ala Thr Arg Ala Gly Ala Leu Ala Gly Ile 565 570 575 Ser Pro Met Phe Gln Pro Cys Val Val Pro Pro Lys Pro Trp Thr Gly 580 585 590 Ile Thr Gly Gly Gly Tyr Trp Ala Asn Gly Arg Arg Pro Leu Ala Leu 595 600 605 Val Arg Thr His Ser Lys Lys Ala Leu Met Arg Tyr Glu Asp Val Tyr 610 615 620 Met Pro Glu Val Tyr Lys Ala Ile Asn Ile Ala Gln Asn Thr Ala Trp 625 630 635 640 Lys Ile Asn Lys Lys Val Leu Ala Val Ala Asn Val Ile Thr Lys Trp 645 650 655 Lys His Cys Pro Val Glu Asp Ile Pro Ala Ile Glu Arg Glu Glu Leu 660 665 670 Pro Met Lys Pro Glu Asp Ile Asp Met Asn Pro Glu Ala Leu Thr Ala 675 680 685 Trp Lys Arg Ala Ala Ala Ala Val Tyr Arg Lys Asp Lys Ala Arg Lys 690 695 700 Ser Arg Arg Ile Ser Leu Glu Phe Met Leu Glu Gln Ala Asn Lys Phe 705 710 715 720 Ala Asn His Lys Ala Ile Trp Phe Pro Tyr Asn Met Asp Trp Arg Gly 725 730 735 Arg Val Tyr Ala Val Ser Met Phe Asn Pro Gln Gly Asn Asp Met Thr 740 745 750 Lys Gly Leu Leu Thr Leu Ala Lys Gly Lys Pro Ile Gly Lys Glu Gly 755 760 765 Tyr Tyr Trp Leu Lys Ile His Gly Ala Asn Cys Ala Gly Val Asp Lys 770 775 780 Val Pro Phe Pro Glu Arg Ile Lys Phe Ile Glu Glu Asn His Glu Asn 785 790 795 800 Ile Met Ala Cys Ala Lys Ser Pro Leu Glu Asn Thr Trp Trp Ala Glu 805 810 815 Gln Asp Ser Pro Phe Cys Phe Leu Ala Phe Cys Phe Glu Tyr Ala Gly 820 825 830 Val Gln His His Gly Leu Ser Tyr Asn Cys Ser Leu Pro Leu Ala Phe 835 840 845 Asp Gly Ser Cys Ser Gly Ile Gln His Phe Ser Ala Met Leu Arg Asp 850 855 860 Glu Val Gly Gly Arg Ala Val Asn Leu Leu Pro Ser Glu Thr Val Gln 865 870 875 880 Asp Ile Tyr Gly Ile Val Ala Lys Lys Val Asn Glu Ile Leu Gln Ala 885 890 895 Asp Ala Ile Asn Gly Thr Asp Asn Glu Val Val Thr Val Thr Asp Glu 900 905 910 Asn Thr Gly Glu Ile Ser Glu Lys Val Lys Leu Gly Thr Lys Ala Leu 915 920 925 Ala Gly Gln Trp Leu Ala Tyr Gly Val Thr Arg Ser Val Thr Lys Arg 930 935 940 Ser Val Met Thr Leu Ala Tyr Gly Ser Lys Glu Phe Gly Phe Arg Gln 945 950 955 960 Gln Val Leu Glu Asp Thr Ile Gln Pro Ala Ile Asp Ser Gly Lys Gly 965 970 975 Leu Met Phe Thr Gln Pro Asn Gln Ala Ala Gly Tyr Met Ala Lys Leu 980 985 990 Ile Trp Glu Ser Val Ser Val Thr Val Val Ala Ala Val Glu Ala Met 995 1000 1005 Asn Trp Leu Lys Ser Ala Ala Lys Leu Leu Ala Ala Glu Val Lys 1010 1015 1020 Asp Lys Lys Thr Gly Glu Ile Leu Arg Lys Arg Cys Ala Val His 1025 1030 1035 Trp Val Thr Pro Asp Gly Phe Pro Val Trp Gln Glu Tyr Lys Lys 1040 1045 1050 Pro Ile Gln Thr Arg Leu Asn Leu Met Phe Leu Gly Gln Phe Arg 1055 1060 1065 Leu Gln Pro Thr Ile Asn Thr Asn Lys Asp Ser Glu Ile Asp Ala 1070 1075 1080 His Lys Gln Glu Ser Gly Ile Ala Pro Asn Phe Val His Ser Gln 1085 1090 1095 Asp Gly Ser His Leu Arg Lys Thr Val Val Trp Ala His Glu Lys 1100 1105 1110 Tyr Gly Ile Glu Ser Phe Ala Leu Ile His Asp Ser Phe Gly Thr 1115 1120 1125 Ile Pro Ala Asp Ala Ala Asn Leu Phe Lys Ala Val Arg Glu Thr 1130 1135 1140 Met Val Asp Thr Tyr Glu Ser Cys Asp Val Leu Ala Asp Phe Tyr 1145 1150 1155 Asp Gln Phe Ala Asp Gln Leu His Glu Ser Gln Leu Asp Lys Met 1160 1165 1170 Pro Ala Leu Pro Ala Lys Gly Asn Leu Asn Leu Arg Asp Ile Leu 1175 1180 1185 Glu Ser Asp Phe Ala Phe Ala 1190 1195 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SI04364381 <400> 43 cagcggttga agggcaagga a 21 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SI04369344 <400> 44 atgcggaatg gaagcacgtt a 21 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SI04250162 <400> 45 atggtcgtgt ccggagctaa a 21 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SI04354420 <400> 46 cagcggcttc agcccaggtt a 21 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SI00055986 <400> 47 atggatttaa agggcggcta a 21 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SI03021508 <400> 48 ttcaaggttc tatgaccgaa a 21 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SI00055972 <400> 49 cagggttgtt aagttgtact a 21 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> SI00055979 <400> 50 taccatctgc agtattataa a 21

Claims (23)

  1. RNA 트리포스파타제의 촉매 도메인,
    구아닐릴트랜스퍼라제의 촉매 도메인,
    N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 촉매 도메인 및
    DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인을 포함하고,
    DNA-의존성 RNA 폴리머라제가 RNA 트리포스파타제의 촉매 도메인, 구아닐릴트랜스퍼라제의 촉매 도메인 또는 N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 촉매 도메인과 공유적 또는 비공유적으로 연결되는 키메라 효소.
  2. 제1항에 있어서, 세포질 키메라 효소임을 특징으로 하는, 키메라 효소.
  3. 제1항에 있어서, RNA 트리포스파타제의 상기 촉매 도메인, 구아닐릴트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인 및 N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인이 단량체에 포함되어 있는, 키메라 효소.
  4. 제1항에 있어서, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인이 단량체에 포함되어 있는, 키메라 효소.
  5. 제1항에 있어서, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인과, RNA 트리포스파타제의 상기 촉매 도메인, 구아닐릴트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인 및 N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 촉매 도메인이 단량체에 포함되어 있는, 키메라 효소.
  6. 제1항에 있어서, DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인이 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인인, 키메라 효소.
  7. 제1항에 있어서, RNA 트리포스파타제의 상기 촉매 도메인, 구아닐릴트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인 및 N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 상기 촉매 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 상기 촉매 도메인이 바이러스 캡핑 효소의 촉매 도메인인, 키메라 효소.
  8. 제1항에 있어서, 단량체성 효소임을 특징으로 하는, 키메라 효소.
  9. 제1항에 있어서, RNA 트리포스파타제의 촉매 도메인, 구아닐릴트랜스퍼라제의 촉매 도메인, N7-구아닌 메틸트랜스퍼라제의 촉매 도메인 및 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 촉매 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2개의 상기 촉매 도메인이 연결 펩티드에 의해 결합되어 있는, 키메라 효소.
  10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항의 키메라 효소를 인코딩하는, 분리된 핵산 분자 또는 이들의 혼합물.
  11. 제10항에 있어서, RNA 폴리머라제 II에 대한 프로모터 및 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인에 대한 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 프로모터에 작동적으로 연결되어 있는, 핵산 분자 또는 이들의 혼합물.
  12. 제10항의 핵산 분자 또는 이들의 혼합물을 포함하는 벡터.
  13. 제10항의 분리된 핵산 분자 또는 이들의 혼합물을 포함하는 숙주 세포.
  14. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항의 키메라 효소를 발현하는, 유전자 조작된 비사람(non-human) 진핵 생물.
  15. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 5'-말단 m7GpppN 캡을 갖는 RNA 분자를 생산하는데 사용하기 위한, 키메라 효소.
  16. DNA 서열에 의해 인코딩된 5'-말단 m7GpppN 캡을 갖는 RNA 분자를 숙주 세포에서 생산하는 시험관내 또는 생체외 방법으로서,
    상기 방법은 숙주 세포에서 제10항의 핵산 분자 또는 이들의 혼합물을 발현시키는 단계를 포함하고,
    상기 DNA 서열은 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 상기 촉매 도메인에 대한 프로모터에 작동적으로 연결되어 있는, 시험관내 또는 생체외 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 숙주 세포에서, 내인성 DNA-의존성 RNA 폴리머라제 또는 내인성 캡핑 효소의 적어도 하나의 서브유닛의 발현을 억제시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  18. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항의 키메라 효소를 포함하는, 5'-말단 m7GpppN 캡을 갖는 RNA 분자 생산용 키트.
  19. 제12항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  20. 제10항에 따른 분리된 핵산 분자 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 5'-말단 m7GpppN 캡을 갖는 RNA 분자 생산용 키트.
  21. 제12항에 따른 벡터를 포함하는, 5'-말단 m7GpppN 캡을 갖는 RNA 분자 생산용 키트.
  22. 제10항에 있어서, 유전자 치료에 사용되는, 분리된 핵산 분자 또는 이들의 혼합물.
  23. 제12항에 있어서, 유전자 치료에 사용되는 벡터.
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