KR20070031907A - 응고 인자의 개선된 모듈레이터 - Google Patents

응고 인자의 개선된 모듈레이터 Download PDF

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KR20070031907A
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Abstract

본 발명은 응고를 억제하는 개선된 핵산 리간드 및 이상적인 응고 모듈레이터를 제공하는 개선된 핵산의 모듈레이터를 제공한다. 이들 핵산 리간드 및 모듈레이트는 특히 수술 또는 관상동맥 바이패스 등의 치료 요법을 받는 숙주에서의 응고 억제에 유용하다.
핵산 리간드

Description

응고 인자의 개선된 모듈레이터 {IMPROVED MODULATORS OF COAGULATION FACTORS}
(관련 출원의 상호 참조)
본 출원은 2004년 4월 22일자로 출원된 미국 가출원 제60/564,873호의 우선권을 주장한다.
본 발명은 핵산 리간드 (예: 아프타머)와 함께 응고 인자의 생리학적 활성을 조절하는 개선제, 조성물 및 방법에 관한 것이다.
혈전 사상을 치료하고 예방하기 위한 상당한 노력에도 불구하고, 동맥 혈전증은 계속해서 선진국의 성인 인구의 주된 사망 원인이 되고 있다. 혈전증을 치료하기 위한 많은 의료 전략이 존재하지만, 입수가능한 약제는 생체 이용성 및 효능의 치료 평가 항목을 충족시키지 못한다 (참조문헌: Feuerstein et al. (1999) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 19: 2554-2562).
통상적인 상황하에서, 혈관을 라이닝하는 혈관 내피 세포에 대한 손상은 일반적으로 응고 "캐스케이드"로 불리우는 사상 시퀀스를 통해 지혈 반응을 유발한다. 캐스케이드는 가용성 피브리노겐을, 혈소판과 함께 혈액 성분의 혈관 외 방출을 방지하는 국부적인 응혈괴 또는 혈전을 형성하는 불용성 피브린으로 전환시킨 다. 상처가 치유된 다음에, 응혈괴 용해, 및 혈관 보전 및 혈류 회복이 일어날 수 있다.
혈액 응고 개시는 두 가지의 개별 경로로부터 일어난다: 내인성 및 외인성 경로. 내인성 경로는 혈액 감염 인자와 글래스 등의 인위적으로 음전하를 띤 표면과의 접촉에 의해 시험관내에서 유발될 수 있다. 이와는 대조적으로, 외인성 경로는 통상 순환계와 격리되는 조직 인자 (TF)가 손상 후에 혈액과 접촉하면, 생체내 또는 시험관내에서 개시될 수 있다. 혈액에 노출된 TF는 인자 IX ("FIX") 및 인자 X ("FX")의 인자 VIIa ("FVIIa") 촉매에 의한 활성화에 대한 보조 인자로서 작용한다. 이는 FXa 및 트롬빈의 신속한 생성을 유도하고, 이어서 피브린 괴를 형성하도록 중합시킨다. 내인성 및 외인성 경로는 응혈촉진제 표면 상에 다종 단백질 복합체가 집합하는 특징이 있고, 이는 반응을 손상 부위에 국한시킨다 (참조문헌: Mann, K. G. et al. (1990) Blood 76:1).
항응고 요법:
글리코사미노글리칸, 헤파린 및 헤파란 황산뿐만 아니라, 와파린 등의 쿠마린계 약제는 통상 항응고제로서 사용된다. 와파린, 쿠마린 유도체는 프로트롬빈 및 다른 비타민 K 의존성 응고 인자의 비타민 K 의존성 번역후 변형과 경쟁함으로써 작용한다. 이의 작용은 헤파린보다 약간 느리고 긴 지속 효과가 있다. 쿠마린계 약제는 트롬빈과, 인자 VII, IX, 및 X와, 단백질 C 및 S의 기능에 필요한 비타민 K 의존성 카르복실화 반응을 억제함으로써 응고를 억제한다. 이들 약제는 비타민 K의 퀴논 유도체의 활성 히드로퀴논 형태로의 환원을 억제하는 작용을 갖는다. 쿠마린계 약제의 작용 모드로 인해, 최대 효과를 실현하는데 수일이 걸린다. 헤파린은 항트롬빈 III에 결합하여 이를 활성화시킨 다음, 응고 캐스케이드의 세린 프로테아제를 억제시킨다. 부분적으로 이들의 효능으로 인해, 헤파린 및 LMW 헤파린은 단점이 있다. 제어되지 않는 출혈은 연속 주입을 받는 환자의 7% 이하 및 주어진 간헐적인 주사를 받는 환자의 14% 이하에서 관찰되는 주 합병증이다. 환자가 출혈 위험에 처하지 않고서 효능을 달성하는 치료 범위는 좁으며, 약 1 내지 3 ㎍ 헤파린/ml 혈장이다. 4 ㎍/ml의 헤파린을 초과하는 농도에서는 응고 활성이 검출될 수 없다. 그리하여, 환자의 혈장 농도를 치료 범위 내로 유지시키는데 고도의 주의가 요구되어야 한다.
몇몇 그룹은 응고 캐스케이드를 조절하는데 응고 인자에 항체를 사용해왔다. 예를 들면, 국제특허출원공개 제 WO 03/093422호 (Schering Aktiengesellschaft)는 조직 인자 (TF) 단독보다는 인자 VIIa/조직 인자 (FVIIa/TF) 복합체에 대하여 더 큰 친화성을 갖고서 결합하는 항체를 개시하고 있다. 이들 항체는 인자 VII 및 인자 X와 함께 조직 인자에 결합하는데 경쟁하지 않고 FX 활성화를 억제하는 하는 것으로 알려져 있다.
미국 특허 제6,001,820호 (Hamilton Civic Hospitals Research Development Inc.)는 (1) 응혈괴 상태의 피브린 또는 다른 표면에 결합하나, 유리 트롬빈에 대하여 다만 최소한의 저해 활성을 갖는 트롬빈을 선택적으로 불활성시킬 수 있고, (2) 고유 테나아제 복합체 (intrinsic tenase complex)의 집합을 억제함으로써 인자 IXa에 의해 인자 X의 활성화를 억제할 수 있으며, (3) 인자 XIa에 의해 인자 IX 의 활성화를 억제할 수 있는 헤파린 공동 인자 II 특이성 촉매를 제공한다.
아프타머:
핵산은 통상적으로 주로 생물학적 과정에서 정보 제공 역할을 하는 것으로 여겨져 왔다. 과거 10년간에는 핵산의 삼차원 구조가 단백질과 상호 작용하여 단백질을 조절하는 능력을 부여할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 핵산 리간드 또는 "아프타머"는 고도의 친화성 및 특이성을 갖고서 소정의 리간드에 결합할 수 있는 짧은 DNA 또는 RNA 올리고머이다. 한 클래스로서, 아프타머의 삼차원 구조는 단량체이든 중합체이든 간에 아프타머가 화합물에 결합하여 실질적으로 화합물의 리간드로서 작용할 수 있도록 충분히 가변적이다. 아프타머는 특히 암 치료 및 혈액 응고 조절에 있어서 유망한 새로운 진단 및 치료 화합물로서 부상되었다.
핵산 리간드는 "시스터매틱 이벌루션 오브 리간드 바이 익스퍼넨셜 인리치먼트 (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) (SELEX)".로 불리우는 방법에 관련된 방법을 통해 동정될 수 있다. SELEX는 원하는 결합 친화성 및 선택성 기준을 달성하도록 후보 올리고뉴클레오티드 혼합물로부터의 단백질 결합 핵산의 선택, 및 결합, 분할 및 증폭의 단계적 반복을 포함한다. SELEX 프로세스는 처음에는 미국 특허 제5,475,096호 (Gold 및 Tuerk), 이후에는 미국 특허 제5,270,163호에 기재되었다 (참조 문헌: WO 91/19813; Tuerk et al. (1990) Science 249:505-10).
다수의 제3자는 아프타머의 동정, 제조 및 용도를 포함하는 특허를 출원하여 획득하였다. 상술한 바와 같이, 골드 및 투에르크 (Gold 및 Tuerk)는 아프타머를 분리하기 위한 SELEX 방법을 처음으로 개발한 것으로 일반적으로 평가받고 있으며, 이들의 방법은 미국 특허 제5,670,637호, 제5,696,249호, 제5,843,653호, 제6,110,900호 및 제5,270,163호를 포함하여 다수의 미국 특허에 기재되어 있다. 토마스 브뤼스 (Thomas Bruice) 등은 아프타머의 제조방법을 미국 특허 제5,686,242호에 보고한 바, 스크리닝 시퀀스 시에 랜덤 올리고뉴클레오티드를 절대적으로 사용하므로 이는 골드 및 투에르크에 의해 보고된 최초 SELEX 프로세스와는 상이하다. 미국 특허 제5,686,242호에서 스크린되는 올리고뉴클레오티드는 SELEX 프로세스에서 스크린되는 올리고뉴클레오티드에 존재하는 올리고뉴클레오티드 프라이머가 부족하다.
다수의 특허 (Gold et al.) 는 아프타머 내지 트롬빈을 포함하는 청구항을 포함한다. 예를 들면, 미국 특허 제5,670,637호는 단백질에 결합하는 아프타머를 포함하는 청구항을 포함한다. 미국 특허 제5,696,249호는 SELEX 프로세스에서 의해 제조되는 아프타머를 청구하고 있다. 미국 특허 제5,756,291호 및 제5,582,981호 (O'Toole)는 규정된 6개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 표식 아프타머를 이용하여 트롬빈을 검출하기 위한 방법을 개시하여 청구하고 있다. 미국 특허 제5,476,766호 및 제6,177,557호는 SELEX를 이용하여 트롬빈의 핵산 리간드 용액을 동정하기 위한 화합물 및 방법을 개시하고 있다.
WO 02/26932 (Sullenger, Rusconi, Kontos and White)는 지혈 및 기타 생물학적 사상의 변형에 유용한 응고 인자, E2F 패밀리 전사 인자, Angl, Ang2, 및 단편 또는 이의 펩티드, 전사 인자, 자기 면역성 항체 및 세포 표면 수용체에 결합하 는 RNA 아프타머를 기재하고 있다 (참조 문헌: Rusconi et al, Thrombosis and Haemostasis 83: 841-848 (2000), White et al, J. Clin Invest 106: 929-34 (2000), Ishizaki et al, Nat Med 2: 1386-1389 (1996), 및 Lee et al, Nat. Biotechnol. 15: 41-45 (1997)).
아프타머의 변형:
국제특허공개 제WO 02/096926호 (Duke University)는 모듈레이터의 투여를 통해 핵산 리간드의 생물 활성을 조절하기 위한 약제 및 방법을 기재하고 있다. 상기 공보는 핵산일 수 있는 모듈레이터에 의해 제어되는 아프타머를 기재하고 있다. 조절가능한 아프타머는 응고, 연장 인자 2 활성 또는 혈관신생을 억제하는 것이 중요한 질환의 치료에 유용한 것으로 기재되어 있다. 응고를 제어하는 조절가능한 아프타머는 혈소판 수용체뿐만 아니라, 아프타머 내지 응고 인자 VII 또는 VIIa, VIII 또는 VIIIa, IX 또는 IXa, V 또는 Va, X 또는 Xa, 이들 인자와 함께 형성된 복합체를 포함한다. 모듈레이터는 리간드가 이의 효과를 발휘하는 동안에 이의 표적에 대한 핵산 리간드의 결합을 변화시키거나, 핵산 리간드를 분해시키거나, 아니면 쪼개거나 대사하거나 파괴시킬 수 있다. 모듈레이터는 최적 치료를 달성하는 방법에 있어서 의사의 진단은 물론, 환자의 경과를 포함하여, 각종 인자에 의거하여 필요에 따라 즉시 투여될 수 있다.
아프타머의 최대 유용성:
아프타머가 유용한 치료제가 되기 위해서는, 단백질에 단단히 결합하고, 길항제가 요구되는 단백질의 특정 기능을 억제하지 않으며, 유해한 부작용을 갖지 않 아야 한다. 변형되지 않은 RNA는 혈액에 리보뉴클레아제가 풍부하기 때문에 실제적으로 치료제로서 사용되지 않는다. 1본쇄 RNA 및 DNA의 변형은 혈액 중에서 안정한 분자를 생성할 수 있고, 공지된 아프타머는 각 피리미딘 뉴클레오티드 내에 2'F 또는 2'NH2 기를 갖는다.
그러나, 특수 변형이 아프타머를 어떻게 변화시키는가를 예측할 수 없다. 특히, 추가 한정이 요구되면, 조절가능한 아프타머와 마찬가지로, 하나 이상의 변형이 아프타머 리간드를 조절하고 동시에 해독제 결합에 의해 계속해서 조절되도록 아프타머의 능력에 영향을 미치는가를 예측할 수 있는 기술은 없다.
치료제로서의 아프타머의 성공적인 사용은 이들의 효능 및 특이성은 물론, 경제면에 의존한다. 현재 입수가능한 아프타머의 가장 성공적인 동물 실험에 의거하여 추정하면, 1 내지 2 mg/kg 체중의 아프타머 투여량은 대개 유효량 (VEGF, PDGF, L-셀렉틴 및 P-셀렉틴을 억제하는 아프타머에 대한 실험으로부터 유도됨)이다. 체중 70 kg의 성인에 대해서는, 이는 각 주입된 투여량이 70 내지 140 mg인 것을 의미한다. 장기 이식, 심근 경색, 독소 또는 패혈성 쇼크, 혈관 형성 또는 폐색전증 치료 등의 급성 징후에 관해서는 15일간 3일마다 제품 값으로 $700 내지 $1400을 필요로 한다. 명백히, 만성 징후에 관해서는 제품 비용이 문제가 되므로, 아프타머의 제조 비용을 절감할 필요가 있다.
변형된 아프타머를 얻도록 기본 적인 SELEX 프로세스를 변형시키는 각종 방법이 개발되어 왔다. 예를 들면, 개선된 특성을 나타내는 아프타머를 얻기 위한 SELEX 프로세스에 있어서의 변형 뉴클레오티드의 사용에 대하여 기재한 특허가 있 다. 미국 특허 제5,660,985호는 향상된 생체내 안정성을 나타내는 것으로 알려진 2'-변형 뉴클레오티드를 제공한다. 미국 특허 제6,083,696호는 비핵산 기능 단위에 공유 결합된 올리고뉴클레오티드가 표적 분자를 결합시키도록 이들의 능력을 스크린하는 "블렌드된" SELEX 프로세스를 개시하고 있다. 기타 특허는 이들의 사이즈를 줄이거나, 이들의 안정성을 증대시키거나 표적 결합 친화성을 증대시키도록 아프타머에 대한 포스트 SELEX 변형 (post-SELEX modification)을 기재하고 있다 (참조문헌: 미국 특허 제5,817,785호 및 제5,648,214호).
미국 특허 제5,245,022호 (Weis et al.)는 폴리알킬렌글리콜에 의해 말단 치환되는 약 12 내지 25개의 염기의 올리고뉴클레오티드를 개시하고 있다. 이들 변형 올리고뉴클레오티드는 엑소뉴클레아제 활성에 저항성이 있는 것으로 보고되어 있다.
미국 특허 제5,670,633호 및 제6,005,087호 (Cook et al.)는 RNA 또는 DNA 염기 서열에 상보적인 내열성 2'-플루오로 올리고뉴클레오티드를 기재하고 있다. 미국 특허 제6,222,025호 및 제5,760,202호 (Cook et al.)는 2'-O 치환된 피리미딘 및 변형 피리미딘을 함유하는 올리고머의 합성에 대하여 기재하고 있다. 유럽 특허 출원 제0 593 901 B1호는 말단 3', 3'- 및 5', 5'-뉴클레오시드 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드 및 리보자임 유사체를 개시하고 있다. 미국 특허 제6,011,020호 (Gold et al.)는 폴리에틸렌글리콜에 의해 변형되는 아프타머를 개시하여 청구하고 있다.
현재는 항응고 치료를 요하는 환자, 특히, 수술 중이나 의료 개입 시에 환자 를 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것이 반드시 필요하다.
따라서, 본 발명의 목적은 항응고 치료를 요하는 환자, 특히, 수술 중이나 의료 개입 시에 환자를 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 하나의 목적은 항응고 요법의 치료 효과, 약물 동태 및 활성 지속 시간의 보다 더 정확한 컨트롤을 제공하는데 있다.
항응고 요법에 관한 개선된 핵산 리간드뿐만 아니라, 리간드가 이의 효과를 여전히 발휘하는 동안에 이의 표적에 대한 핵산 리간드의 결합을 변화시키거나, 핵산 리간드를 분해시키거나, 아니면 쪼개거나 대사하거나 파괴시키는 해독제와 결합한 개선된 핵산 리간드가 개시되어 있다. 이들 개선된 아프타머는 사람 또는 수의 외과 수술시를 포함하여, 생체내 적용시에 유리한 항응혈성을 제공한다. 아프타머의 항응고 기능은 외과 의사 또는 기타 의료 전문가에 의해 요구될 때에 이의 해독제 투여시에 편리하게 중화된다는 것이다.
본 발명의 한 측면에 있어서, 혈액 응고 캐스케이드 중에서의 인자에 대한 개선된 핵산 리간드 또는 아프타머가 제공된다. 몇몇 실시형태에 있어서는, 인자는 인자 IX (FIX) 또는 분해 산물 인자 IXa (FIXa)를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서는, 아프타머는 "고유 테나아제 복합체" 로도 알려진, 인자 VIIIa (FVIIIa)와 함께 FIXa에 의해 형성되는 복합체에 대한 리간드이다. 몇몇 실시형태에 있어서는, 아프타머는 FIXa와 FVIIIa 사이의 복합체 형성을 억제하는 리간드이다. 부실시형태에 있어서, 본 발명의 아프타머는 FIX와 FVIIIa의 복합체에 결합하여, 인자 X (FX)의 활성화를 억제한다. 아프타머는 추가의 칼슘의 존재하 또는 부재하에 FIX, FIXa 또는 FVIIIa와 함께 형성된 복합체와 상호작용할 수 있다. 아프타머는 또한 세포막에서 복합체의 인자와 상호작용할 수 있다. 일실시형태에 있어서는, 아프타머는 막 표면에서 고유 테나아제 복합체에 결합한다.
본 발명의 또 하나의 측면에 있어서, 본 발명자는 응고 인자 IX (FIX)의 유전자 산물 및 이의 분해 산물, 인자 IXa (FIXa)의 개선된 아프타머를 발견했다. 일실시형태에 있어서, 핵산 리간드는 왓슨-크릭 염기 짝지음을 통해 분자의 또 하나의 영역에 결합하는 하나 이상의 영역 (스템) 및 생리조건하에서 분자의 다른 영역에 결합하지 않는 하나 이상의 영역 (루프)을 포함한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 핵산 리간드는 2개의 스템 (스템 1 및 스템 2) 및 2개의 루프 (루프 1 및 루프 2)를 포함한다. 전형적으로, 스템 1은 길이가 1 내지 15 또는 1 내지 20개의 뉴클레오티드쌍이다. 스템 1은 또한 길이가 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개의 뉴클레오티드이다. 일반적으로, 스템 2는 길이가 1 내지 10개의 뉴클레오티드이다. 스템 2는 또한 길이가 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개의 뉴클레오티드이다. 루프 1 및 루프 2의 길이는 또한 변화될 수 있다. 루프 2는 길이가 10개의 뉴클레오티드일 수 있으나, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 8개 이하의 뉴클레오티드일 수 있다. 루프 1의 길이는 변화될 수도 있고, 일실시형태에 있어서는 5'-3' 방향의 10 또는 9개의 뉴클레오티드와, 3'-5' 방향의 1개의 뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 인자 IX 유전자 산물의 아프타머는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 이의 조합물로 구성될 수 있다. 일반적으로, 개선된 아프타머는 길이가 25개 이상의 뉴클레오티드이고, 통상적으로 길이가 35 내지 40개보다 길지 않은 뉴클레오티드이다. 일실시형태에 있어서, 아프타머는 길이가 25, 30, 35, 또는 40개 이상의 뉴클레오티드이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 스템 1의 서열은 5'-3' 방향의 5개의 뉴클레오티드를 포함한다. 부실시형태에 있어서, 스템 1은 5'-3' 방향의 3개의 구아닌 (G) 잔기를 포함한다.
개선된 아프타머는 "자살 위치"를 포함할 수 있다. 일실시형태에 있어서, 이 위치는 해독제가 개선된 아프타머에 결합할 때에 1본쇄로 되어 불안정해지고, 혈액 또는 간장 엔도뉴클레아제 등의 순환 중에 효소에 의해 해독제의 결합시에 개선된 아프타머가 분해함으로써, 활성 아프타머가 순환되는 것을 효과적으로 피할 수 있다. 자살 위치는 수산화되는 스템 2의 구아닌에 있을 수 있다. 일실시형태에 있어서, 뉴클레오티드는 해독제와 결합할 때까지는 2본쇄 구조로 되어 있고, 1본쇄로 되며, 해독제의 결합 시의 분해에 사용할 수 있다.
일실시형태에 있어서, 아프타머는 뉴클레오티드 서열 gugg 및 상보 서열 ccac를 포함한다. 일실시형태에 있어서, 인자 IX의 아프타머는 뉴클레오티드 서열: gugga cuauacc gcg uaaugc ugc c uccac t (서열번호 19)로 구성된다.
본 발명의 또 하나의 실시형태는 본 발명의 아프타머와 짝을 이루는 해독제 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 해독제 올리고뉴클레오티드는 적어도 일부의 아프타머에 상보적일 수 있다. 해독제는 예를 들면 하기 서열로 구성된다: (5'-3') 서열: cgcgguauaguccccau (Apt/AD; 서열번호 1); (5'-3') 서열: cgcgguauaguccc (Apt6/AD; 서열번호 2); (5'-3') 서열: cgcgguauaguccac (Apt7/AD; 서열번호 3); (5'-3') 서열: cgcgguauaguccauc (Apt8/AD; 서열번호 4); (5'-3') 서열: cgcgguauagucag (Apt9/AD; 서열번호 5); (5'-3') 서열: cgcgguauagucagg (AptlO/AD; 서열번호 6); (5'-3') 서열: cgcgguauagucagag (Aptll/AD; 서열번호 7); (5'-3') 서열: cgcgguauaguccucac (Aptl4/AD; 서열번호 8), 또는 이의 변형체 또는 유도체. 특정 실시형태에 있어서, 해독제는 필수적으로 상기 서열 중 하나로 이루어지거나, 또는 주로 상기 서열 중 하나로 이루어진다.
해독제 서열은 해독제가 아프타머에 충분히 결합하거나 하이브리다이즈하여 이의 활성을 중화하는 한, 개선된 항응고 아프타머와 완전히 상보적일 필요는 없다.
본 발명의 아프타머 쌍은 하기 서열을 포함한다:
Figure 112006085711327-PCT00001
"SED ID NO:": 서열번호
더욱더 안정하고 생물활성을 지닌 개선된 아프타머-해독제 쌍은 아프타머 또는 해독제, 또는 양쪽에 대한 이차 변형을 포함으로써 발생된다. 일실시형태에 있어서, 인자 IX의 개선된 아프타머는 하나 이상의 2'-O-메틸 변형 뉴클레오티드를 포함한다. 또 하나의 실시형태에 있어서, 개선된 아프타머는 하나 이상의 2'-O- 메틸 및 하나 이상의 2'-플루오로 변형체를 포함한다. 또 하나의 실시형태에 있어서, 아프타머 및 해독제는 2'-플루오로 변형체를 포함하지 않는다. 또 다른 실시형태에 있어서, 개선된 아프타머는 한 스템 상에 하나 이상의 2'-O-메틸 및 하나 이상의 2'-플루오로 변형체를 포함한다. 일실시형태에 있어서, 스템 2의 하나 이상의 구아닌은 히드록실 당 (2'-OH)를 포함한다. 또 하나의 실시형태에 있어서, 개선된 아프타머의 스템 1 또는 스템 2 중의 하나 이상의 우리딘은 2'-플루오로 또는 2'-0-메틸로 변형된다. 또 하나의 실시형태에 있어서, 개선된 아프타머의 스템 2 중의 하나 이상의 시티딘은 2'-플루오로 변형된다.
개선된 아프타머 및 해독제는 또한 수용성 폴리머로 변형되는 뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 폴리머는 폴리에틸렌글리콜, 폴리아민, 폴리에테르, 폴리무수물, 폴리에스테르, 또는 다른 생분해성 약제학적으로 허용가능한 폴리머를 포함할 수 있다.
본 발명은 FIX, FIXa, 또는 고유 테나아제 복합체에 결합하는 개선된 아프타머의 용도를 포함한다. 이러한 결합은 시험관내 또는 생체내일 수 있다. FIX, FIXa 또는 테나아제 복합체에 결합함으로써, 단백질 또는 복합체의 생물 활성을 억제할 수 있다.
일실시형태에 있어서, 개선된 아프타머는 FIX로서 동일한 유전자 산물로부터 유도되는 FIXa에 결합함으로써 혈액 응고를 억제시킨다. 본 발명은 혈액 응고를 억제하도록 본 발명의 개선된 아프타머를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 또 하나의 실시형태는 치료 요법시에 개선된 아프타머 및 해독제를 사용하는 방법을 제공한다.
일실시형태에 있어서, 본 발명의 개선된 아프타머의 해독제는 개선된 아프타머의 항응고 효과를 역전시키도록 이를 필요로 하는 포유동물에 제공된다. 개선된 아프타머 및 아프타머-해독제 쌍은 최적 치료를 달성하는 방법에 있어서 의사의 진단은 물론, 환자의 경과를 포함하여, 각종 인자에 의거하여 필요에 따라 즉시 투여될 수 있다. 그리하여, 본 발명은 혈액 응고용 핵산 리간드 요법 시에 조절가능한 개선된 치료 요법을 포함한다. 일실시예에 있어서, 해독제는 의사 또는 기타 의료 전문가에 의해 요구될 때에 개선된 아프타머의 효과를 중화시켜서 항응고 활성을 멈추도록 제공된다. 또 하나의 실시형태에 있어서, 혈액 응고 인자의 개선된 아프타머 및 해독제는 순차적 단계로 투여되는데, 아프타머를 투여하고, 해독제를 사용하여, 개선된 아프타머의 활성을 제한한 다음에, 이어서 아프타머를 필요로 하는 환자에게 재투여한다는 것이다. 일실시형태에 있어서, 해독제는 개선된 아프타머에 결합하거나 하이브리다이즈함으로써 이러한 중화 효과를 달성한다.
개선된 아프타머는 응고 유발 사상 (coagulation-inducing event)을 일으키거나 초래하는 심혈관 질환을 앓고 있거나 앓을 위험성이 있거나, 수술 요법을 포함하는 심혈관 요법 (intervention) 중이거나 가능성이 있는 환자에게 투여될 수 있다. 이의 예로는 급성 심근 경색 (심장 발작), 뇌혈관 장애 (발작), 허혈, 혈관 형성, CABG (관상동맥 바이패스 그라프트), 심폐 바이패스, 심장 바이패스 장치 순환 시 및 신장 투석을 받는 환자에 있어서의 혈전 형성, 불안정 협심증, 폐색전증, 심부 정맥 혈전증, 동맥 혈전증, 및 파종성 혈관 응고 증후군을 들 수 있다.
개선된 아프타머는 또한 응고 유발 염증을 예방하도록 투여될 수 있다. 초기 염증은 응고 캐스케이드의 활성화에 의해 유발된다. 따라서, 개선된 아프타머는 염증 성분, 예를 들면, 죽상경화증, 급성 관증후군 (ACS), 재관류 상해를 가져오는 심근 경색을 포함하는 심혈관 질환을 치료하거나, 혈관형성후 재협착과 관련된 유해 사상을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
도 1은 후술하는 Apt A, 1-39의 제안된 이차원 구조의 개략도이다. 도 1a는 아프타머 Apt A 및 1-5의 개략도이다. 도 lb는 아프타머 6-11의 개략도이다. 도 lc는 아프타머 Apt 12-17의 개략도이다. 도 1d는 아프타머 Apt 18-20의 개략도이다. 도 1e는 Apt 21의 개략도이다. 도 1f는 아프타머 Apt 22-29의 개략도이다. 도 1g는 Apt 30-34의 개략도이다. 도 lh는 Apt 35-39의 개략도이다.
도 2는 아프타머 Apt A 및 Apt 1-5의 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (APTT) 테스트 분석 (상부 패널) 및 해독제 AptA-AD에 의한 중화능의 결과의 그래프이다.
도 3은 아프타머 Apt 2 및 6-8의 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (APTT) 테스트 분석 (하부 패널) 및 해독제에 의한 중화능 (상부 패널)의 결과의 그래프이다.
도 4는 아프타머 Apt 2 및 9-11의 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (APTT) 테스트 분석 (좌측 패널) 및 해독제에 의한 중화능 (우측 패널)의 결과의 그래프이다.
도 5는 아프타머 Apt A, 2 및 12-17의 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (APTT) 테스트 분석 (좌측 패널) 및 해독제에 의한 중화능 (우측 패널)의 결과의 그래프이다.
도 6은 아프타머 Apt 2, 15, 16 및 21의 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (APTT) 테스트 분석 (좌측 패널) 및 해독제에 의한 중화능 (우측 패널)의 결과의 그래프이다.
도 7은 아프타머 Apt 2 및 16-20의 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (APTT) 테스트 분석 (좌측 패널) 및 해독제에 의한 중화능 (우측 패널)의 결과의 그래프이다.
도 8은 페질레이트된 (pegylated) Apt 16 및 19와, 콜레스테롤로 변형된 Apt A (chol-A)와 비교하여 나타낸 페질레이트된 AptA의 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (APTT) 테스트 분석의 결과의 그래프이다. 좌측 패널은 응고 인자 IX의 아프타머 컨트롤이고, 우측 패널은 해독제에 의한 중화능이다.
도 9는 아프타머 Apt 2, 16 및 22-27의 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (APTT) 테스트 분석 (좌측 패널) 및 해독제에 의한 중화능 (우측 패널)의 결과의 그래프이다.
도 10a는 아프타머 Apt 2 및 30-33의 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (APTT) 테스트 분석 (좌측 패널), Apt 2, 30 및 33의 해독제에 의한 중화능 (우측 패널)의 결과의 그래프이고, 도 10b는 아프타머 Apt 2, 30, 33 및 34의 APTT 테스트 분석 (좌측 패널) 및 해독제에 의한 중화능 (우측 패널)의 결과의 그래프이다.
도 11은 아프타머 Apt A, 2, 19 및 35-39의 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (APTT) 테스트 분석 (좌측 패널), 및 Apt A, 19, 35, 38 및 39의 해독제에 의한 중화능 (우측 패널)의 결과의 그래프이다.
도 12는 아프타머 Apt 2, 34, 39 및 Peg-19의 해독제 분석에 의한 중화능의 결과의 그래프이다.
도 13은 CH-AptA 및 PEG-AptA와 비교하여 나타낸 PEG-Apt39의 시험관내 항응고 활성의 결과의 그래프이다.
도 14는 돼지의 PEG-Apt39의 전신 항응고 활성 (14a) 및 중화능 (14b)의 그래프이다. 각각의 응고 분석값의 변화는 이 동물에 대한 어느 시점에서의 응고 시간과 주입전 베이스라인 사이의 차이다. PEG-Apt39 처리 동물은 n=2이고 CH-AptA 처리 동물은 n=3이다. 전혈 ACT값은 하부 패널에, 혈장 APTT값은 상부 패널에 도시된다.
도 15는 돼지의 PEG-Apt39의 전신 항응고 활성 (14a) 및 중화능 (14b)의 그래프이다. 각각의 응고 분석값의 변화는 이 동물에 대한 어느 시점에서의 응고 시 간과 주입전 베이스라인 사이의 차이다. PEG-Apt39 처리 동물은 n=2이다. 이 실험으로부터의 데이터는 도 3에 나타낸 PEG-Apt39의 항응고 및 중화 데이터와 비교한 것이다. 전혈 ACT값은 하부 패널에, 혈장 APTT값은 상부 패널에 도시된다.
도 16은 실시예 9에 기재된 바와 같이 Apt39 투여에 의한 원숭이의 전신 항응고의 그래프이다. 원숭이의 항응고 레벨은 APTT로 모니터되었다. 15 mg/kg로 처리된 동물에 관해서는, Apt39 데이터는 평균값 ± SEM으로 나타낸다. 5 및 30-mg/kg 투여량의 동물에 관해서는, 이들 각 투여량에는 다만 2마리의 동물이 주어지기 때문에, 데이터는 평균값 ± 범위로서 나타낸다.
도 17는 실시예 9에 기재된 바와 같이, Apt39 투여에 의한 원숭이의 전신 항응고 및 해독제 Apt7AD로 역전되는 상태의 그래프이다. 원숭이의 항응고 레벨은 APTT로 모니터되었다. Apt39 투여후 t=3 시간에서 Apt7AD가 투여되었다. 데이터는 평균값 ± SEM으로 나타낸다.
1. 정의
"핵산 리간드" 또는 "아프타머"는 삼차원 구조를 형성할 수 있는 핵산으로, 리간드로서 표적 분자와 상호작용할 수 있다. 상기 용어는 동일한 환경에서의 다른 물질이 올리고뉴클레오티드와 복합체를 형성하지 않는 환경에서 대상으로 하는 표적 분자와 복합체를 형성할 수 있는 특이적 결합 영역을 갖는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 결합 특이성은 일반적으로 환경 중에서의 아프타머 및 다른 물질, 또는 미반응 분자에 관한 해리상수와 비교하여, 표적용 아프타머의 해리상수 (Kd)로 정의된다. 통상적으로, 표적에 관한 아프타머의 Kd는 미반응 물질 또는 환경 중의 공존 물질에 관한 Kd보다 10배 , 50배, 100배, 또는 200배 작을 것이다.
"아프타머 해독제 쌍"은 표적 분자의 특정 아프타머, 및 아프타머가 이의 표적과 더 이상 상호작용하지 않도록 아프타머의 삼차원 구조를 변화시키는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것으로 여겨진다. 해독제는 아프타머의 일부와 상보적인 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 해독제는 아프타머의 구조를 변화시켜서, 생리조건하에서 아프타머의 표적 결합능을 10 내지 100%, 20 내지 100%, 25%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%, 또는 10과 100% 사이 범위의 비율로 줄일 수 있다. 해독제는 또한 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 삼차원 구조를 형성할 수 있다. 이 표적은 아프타머의 표적과 동일하거나 상이할 수 있다.
"해독제", "조절제" 또는 "모듈레이터"는 원하는 방법으로 아프타머를 결합할 수 있고, 아프타머와의 상호작용을 변화시킬 수 있으며, 아프타머와 이의 표적 분자와의 상호작용을 변화시킬 수 있는 (예: 아프타머의 구조를 변화시키는 것) 약제학적으로 허용가능한 약제를 말한다.
용어 "결합 활성" 및 "결합 친화성"은 표적에 결합하거나 결합하지 않는 리간드 분자의 성향을 의미하는 것으로 여겨진다. 상기 상호작용 에너지는 "결합 활성" 및 "결합 친화성" 에 있어서 중요한데, 이들이 상호작용하는 파트너의 필요한 농도, 이들 파트너가 결합할 수 있는 비율 및 용액 중의 결합 및 유리 분자의 상대 농도를 한정하기 때문이다. 결합 특이성은 일반적으로 환경 중에서의 아프타머 및 다른 물질, 또는 미반응 분자에 관한 해리상수와 비교하여, 핵산 리간드의 해독제의 비교 해리상수 (Kd)로 정의된다.
본 명세서에서는 "컨센서스 서열"은 2개 이상의 핵산 서열의 하나 이상의 영역에 발견되는 뉴클레오티드 서열 또는 영역 (이는 인접 뉴클레오티드로 구성되거나 구성되지 않을 수 있다)을 말한다. 컨센서스 서열은 길이가 3개의 뉴클레오티드로 짧을 수 있다. 또한 컨센서스 서열 사이에 산재된 길이가 수백개의 염기로 이루어진 뉴클레오티드 서열 또는 폴리머와 함께, 하나 이상의 비인접 서열로 구성될 수 있다. 컨센서스 서열은 개개의 핵산 종 사이의 서열 비교에 의해 동정될 수 있다. 이 비교는 서열 정보로부터 이차 및 삼차 구조를 모델링하기 위한 컴퓨터 프로그램 및 기타 도구에 의해 촉진될 수 있다. 일반적으로, 컨센서스 서열은 적어도 약 3 내지 20개의 뉴클레오티드, 더욱 통상적으로는 6 내지 10개의 뉴클레오티드를 포함할 것이다.
용어 "심혈관 질환" 및 "심혈관 질환류"는 당해 기술분야의 숙련가에 의해 용이하게 이해되는 심혈관 질환을 의미하는 것으로 여겨진다. 특별히 고찰된 심혈관 질환의 비제한적인 예로는 죽상경화증, 혈전성 소인 (thrombophilia), 색전증, 심근 경색 (예: 심근 경색증), 혈전증, 협심증, 발작, 패혈성 쇼크, 고혈압, 고콜레스테롤혈증, 재협착 및 당뇨병 (및 이와 관련된 당뇨병 망막증)을 들 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다. 심혈관 질환은 진행한 심혈관 질환의 치료 뿐만 아니라, 조기 발증의 심혈관 질환의 치료 등과 같은 진행 단계에서 치료될 수 있다. 응고를 조절함으로써 심혈관 질환의 악화를 억제하는데 행해지는 치료 방법도 본 발명에 포함된다.
2. 인자 IX의 아프타머
본 발명은 혈액 응고 캐스케이드의 특이적 인자와의 상호작용을 통해 혈액 응고를 조절하는 개선된 핵산 리간드 또는 아프타머를 제공한다. 본 발명은 또한 응고를 조정하기 위한 개선된 아프타머-해독제 쌍을 제공한다. 개선된 아프타머는 표적 인자 IX 유전자 산물 (인자 IXa를 포함)을 타겟하여, 다른 혈액 응고 인자 표적과 관련된 비특이적 부작용을 감소시킨다. 응고 캐스케이드의 대부분의 인자는 다양한 생리적 역할을 지닌 광역 스펙트럼의 단백질 (즉, 트롬빈)이다.
상해와 혈액과 혈괴 형성 사이의 일어나는 사상은 주의 깊게 조절되어 연결된 일련의 반응이다. 세포에 의한 응고 모델에 있어서, 조직 인자를 갖는 세포 (단핵세포, 대식세포, 내피세포)에서 개시된다. FVIIa (조직 인자와 복합체를 이룸)의 존재하에서, FIX 및 FX의 활성화는 프로트롬빈으로부터 소량의 트롬빈을 발생시킨다 (이어서, FV를 활성화시킴). 증폭 단계 (초회 감작 단계라고도 함)에 있어서, 생성된 소량의 트롬빈은 혈소판을 활성화시켜서, FVa, FXIa 및 FVIIIa를 방출시킨다. 최종 응고 단계, 전파에 있어서, FIXa는 FVIIIa와 복합체를 형성하여, FX를 활성화시킨다. FXa-FVa 복합체는 칼슘 및 인지질 기질 (프로트롬비나제 복합체)의 존재하에서 트롬빈 발생을 돌발시킨다.
세포에 의한 항응고 모델은 응고 프로테아제 표적을 규정하는데 도움이 되어왔다. 대부분의 선행 연구는 트롬빈 등의 각종 인자를 통한 혈액 응고에 집중되어 왔다. 트롬빈은 신체 전체에 걸친 효과를 갖는 광범위하게 작용하는 단백질이다. 따라서, 트롬빈 억제제는 응고에 대한 효과 이외에도 예상치 못한 부작용을 갖는다. 트롬빈은 내피세포를 활성화하여 백혈구 침윤 및 부종을 유발하고, 또한 성상세포 및 소교세포를 활성화하여 병소성 염증을 전파하고 잠재 신경 독성 작용을 일으킨다.
본 발명자는 인자 IXa가 특히 응고 개시 및 전파 단계에 관여하기 때문에 매력적인 표적을 나타낸다는 것을 결정하였다. 반복적인 시험관내 선택 기술은 고 친화성으로 FIXa와 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 동정하는데 사용되어 왔다 (Kd 0.65 ± 0.2 nM). 실험적 연구는 FIXa가 지혈 및 혈전증에 중요한 역할을 한다는 것을 제시하고 있다. 토끼에게 정제된 FIXa를 주입하면, 혈전증 (Gitel et al. (1977) PNAS 74: 3028-32; Gurewich et al. (1979) Thromb. Rsch. 14: 931-940)을 유발시킨다. 이와는 대조적으로, 활성 부위가 블록된 FIXa는 혈전 형성을 예방하여, 동맥내 관상동맥 혈전증 (Lowe (2001) Brit. J. Haem. 115: 507-513)을 감소시킨다.
인자 IX의 항체는 또한 고유 테나아제 복합체의 기능, 인자 XIa 및 조직 인자 : 인자 VIIa 복합체에 의한 효소원 인자 IX의 활성화를 저해하여, 기니피그 및 래트의 혈장에 있어서의 활성화 부분 트롬보플라스틴 응고 시간 (APTT)을 강력하게 억제한다 (Refino, C.J., et al., (1999) Thromb and Haemost, 82:1188-1195; Feuerstein GZ, et al. (1999) Arterioscler Thromb Vasc Biol 19(10):2554-62; Toomey JR, et al. (2000) Thromb Res. 100(1):73-9).
일실시형태에 있어서, 본 발명은 혈액 응고 캐스케이드의 인자의 핵산 리간 드 또는 아프타머를 제공한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 인자는 인자 IX (FIX) 또는 분해 산물 인자 IXa (FIXa)를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 아프타머는 "고유 테나아제 복합체"로도 알려진, 인자 VIIIa (FVIIIa)와 함께 FIXa에 의해 형성되는 복합체의 리간드이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 아프타머는 FIXa와 FVIIIa 사이의 복합체 형성을 억제하는 리간드이다. 부실시형태에 있어서, 본 발명의 아프타머는 FIX와 FVIIIa의 복합체에 결합하여, 인자 X (FX)의 활성화를 억제한다. 아프타머는 추가 칼슘의 존재하 또는 부재하에서 FIX, FIXa, 또는 FVIIIa와 함께 형성된 복합체와 상호작용할 수 있다. 아프타머는 또한 세포막에서 복합체의 인자와 상호작용할 수 있다. 일실시형태에 있어서, 아프타머는 막표면에서 고유 테나아제 복합체에 결합한다.
일실시형태에 있어서, 본 발명자는 응고 인자 IX (FIX)의 유전자 산물 및 이의 분해 산물, 인자 IXa (FIXa)의 개선된 아프타머를 발견했다. 일실시형태에 있어서, 핵산 리간드는 왓슨-크릭 염기 짝지음을 통해 분자의 또 하나의 영역에 결합하는 하나 이상의 영역 (스템) 및 생리조건하에서 분자의 다른 영역에 결합하지 않는 하나 이상의 영역 (루프)을 포함한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 핵산 리간드는 2개의 스템 (스템 1 및 스템 2) 및 2개의 루프 (루프 1 및 루프 2)를 포함한다. 일실시형태에 있어서, 스템 1은 길이가 1 내지 20개의 뉴클레오티드이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 스템 1은 길이가 1 내지 10개의 뉴클레오티드이다. 또 하나의 부실시형태에 있어서, 스템 1은 길이가 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개의 뉴클레오티드이다. 또 하나의 실시형태에 있어서, 스템 2는 길이가 1 내지 20개의 뉴클레 오티드이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 스템 2는 길이가 1 내지 10개의 뉴클레오티드이다. 또 하나의 부실시형태에 있어서, 스템 2는 길이가 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개의 뉴클레오티드이다.
본 발명의 인자 IX 유전자 산물의 아프타머는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 이의 조합물로 구성될 수 있다. 일반적으로, 개선된 아프타머는 길이가 25개 이상의 뉴클레오티드이고, 통상적으로 길이가 35 내지 40개보다 길지 않은 뉴클레오티드이다. 일실시형태에 있어서, 아프타머는 길이가 25, 30, 35, 또는 40개 이상의 뉴클레오티드이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 스템 1의 서열은 5'-3' 방향의 5개의 뉴클레오티드를 포함한다. 부실시형태에 있어서, 스템 1은 5'-3' 방향의 3개의 구아닌 (G) 잔기를 포함한다.
일실시형태에 있어서, 아프타머는 뉴클레오티드 서열 gugg 및 상보 서열 ccac를 포함한다. 단일 표적 분자에 대한 다수의 별개의 아프타머 서열을 얻어 배열될 때에, 서열은 "컨센서스 서열"에 대하여 조사될 수 있다. 본 명세서에서는 "컨센서스 서열"은 2개 이상의 아프타머의 하나 이상의 영역에 발견되는 뉴클레오티드 서열 또는 영역 (이는 인접 뉴클레오티드로 구성되거나 구성되지 않을 수 있다)을 의미하며, 이의 존재는 아프타머/표적 결합 또는 아프타머 구조와 관련될 수 있다.
컨센서스 서열은 길이가 3개의 뉴클레오티드로 짧을 수 있다. 또한 컨센서스 서열 사이에 산재된 길이가 수백개의 염기로 이루어진 뉴클레오티드 서열 또는 폴리머와 함께, 하나 이상의 비인접 서열로 구성될 수 있다. 컨센서스 서열은 개 개의 핵산 종 사이의 서열 비교에 의해 동정될 수 있다. 이 비교는 서열 정보로부터 이차 및 삼차 구조를 모델링하기 위한 컴퓨터 프로그램 및 기타 도구에 의해 촉진될 수 있다. 일반적으로, 컨센서스 서열은 적어도 약 3 내지 20개의 뉴클레오티드, 더욱 통상적으로는 6 내지 10개의 뉴클레오티드를 포함할 것이다. 혼합물 중의 올리고뉴클레오티드는 모두 이러한 위치에서 동일한 뉴클레오티드를 가질 수 없다; 예를 들면, 컨센서스 서열은 공지된 비율의 특수 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 컨센서스 서열은 일련의 4개의 위치로 구성되는데, 혼합물 중의 모든 멤버의 제 1 위치는 A이고, 제 2 위치는 25% A, 35% T 및 40% C이고, 제 3 위치는 모든 올리고뉴클레오티드에서 T이며, 제 4 위치는 50%의 올리고뉴클레오티드에서는 G이고, 50%의 올리고뉴클레오티드에서는 C이다.
구체적인 실시형태에 있어서, 아프타머는 하기 서열번호의 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
Figure 112006085711327-PCT00002
Figure 112006085711327-PCT00003
"SeqID": 서열번호; "~mer": ~량체; "sequence": 서열
일실시형태에 있어서, 인자 IX 의 아프타머는 본질적으로 뉴클레오티드 서열: gugga cuauacc gcg uaaugc ugc c uccac t (서열번호 19)로 구성된다.
3. 아프타머 해독제
혈액 응고 인자의 억제를 해제시킬 수 있는 것이 중요하다. 치명적인 질환은 인자 IX 등의 혈액 응고 인자의 과잉 억제로부터 생길 수 있다. 예를 들면, 혈우병 B은 인자 IX의 결핍으로부터 발병할 수 있다. 혈우병 B에 걸린 모든 환자에 대해서는 응고 시간을 연장하고 인자 IX 응고 활성을 감소시켰다. 혈우병 A와 마찬가지로, 혈우병 B는 중도 (severe), 중등도 및 경도 형태가 있고, 혈장의 인자 IX 활성을 반영한다.
따라서, 본 발명의 또 하나의 실시형태는 본 발명의 아프타머와 쌍을 이루는 해독제를 포함한다. 해독제 또는 모듈레이터는 원하는 방법으로 아프타머를 결합할 수 있고, 아프타머와의 상호작용을 변화시킬 수 있으며, 아프타머와 이의 표적 분자와의 상호작용을 변화시킬 수 있는 (예를 들면, 아프타머의 구조를 변화시킴으로써) 약제학적으로 허용가능한 약제를 포함한다. 이러한 해독제의 예로는 (A) 일부 이상의 아프타머 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드 (리보자임 또는 DNA자임 또는 펩티드 핵산 (PNAs)을 포함), (B) 핵산 결합 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 (핵산 결합 트리펩티드 포함 (참조: 일반적으로 Hwang et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 12997), 및 (C) 올리고당 (예: 아미노글리코시드 (참조: 일반적으로 Davis et al. (1993) Chapter 8, p. 185, RNA World, Cold Spring Harbor Laboratory Press, eds. Gestlaad and Atkins; Werstuck et al. (1998) Sciende 282: 296; 미국 특허 제5,935,776호 및 제5,534,408호) (또한, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 해독제 종류를 개시하는 하기 문헌을 참조한다: Chase et al. (1986) Ann. Rev. Biochem. 56: 103, Eichorn et al. (1968) J. Am.Chein. Soc. 90: 7323, Dale et al. (1975) Biochemistry 14: 2447 and Lippard et al. (1978) Acc. Chem. Res. 11:211).
일실시형태에 있어서, 해독제 올리고뉴클레오티드는 아프타머의 항응고 활성을 적어도 25%, 50%, 75%, 80% 또는 90%로 역전시키거나 중화시킨다. 해독제는 통상 실질적으로 1 μM 미만, 또는 0.1 μM 미만, 더욱 바람직하게는 0.01 μM 미만의 해독제 농도로 용액 중의 핵산 리간드에 결합하는 능력을 갖는다. 일실시형태에 있어서, 해독제는 아프타머의 생물 활성을 50%로 감소시킨다.
상보 올리고뉴클레오티드:
일실시형태에 있어서, 본 발명의 개선된 해독제는 표적으로 하는 아프타머 서열의 적어도 일부에 상보적인 서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드이다. 절대 상보성은 요구되지 않는다. 일실시형태의 서열은 아프타머와 하이브리다이즈할 수 있도록 충분한 상보성을 갖는다. 하이브리다이즈하는 능력은 상보성 및 안티센스 핵산의 길이에 의존할 것이다. 유리하게도, 해독제 올리고뉴클레오티드는 표적 아프타머의 6 내지 25개의 연속적인 뉴클레오티드, 바람직하게는 8 내지 20개의 연속적인 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 10 내지 15개의 연속적인 뉴클레오티드에 상보적인 서열로 구성된다. 구체적으로, 해독제는 길이가 적어도 10 내지 25개의 뉴클레오티드, 적어도 15 내지 25개, 적어도 20 내지 25, 적어도 14, 17 또는 적어도 25개의 뉴클레오티드이다. 본 발명의 해독제는 1본쇄로 된 DNA 또는 RNA 또는 키메라 혼합물, 또는 이의 유도체 또는 변형체일 수 있다.
짧은 올리고뉴클레오티드의 상보적인 쌍의 결합에 의한 2본쇄의 형성은 일반 적으로 1×106과 3×105 M1s1 사이의 2차 회합 속도를 갖는 상당히 빠른 반응이다. 짧은 2본쇄의 안정성은 2본쇄의 길이 및 염기 조성에 매우 의존적일 수 있다. 짧은 핵산 2본쇄의 형성에 관한 열역학 파라미터는 엄밀하게 측정되어, 모든 가능한 염기쌍에 대하여 최단 인접 규칙이 구해져서, 자유 에너지 Tm의 정밀한 예측이 행해지므로, 소정의 올리고리보뉴클레오티드 2본쇄의 반감기가 계산될 수 있다 (예: Xia et al. (1998) Biochein. 37: 14719; 참조: Eguchi et al. (1991) Antigensis RNA, Annu. Rev. Biochem. 60:631).
구체적인 실시형태에 있어서, 본 발명은 응고 경로의 성분을 타겟하는 개선된 아프타머, 특히 FIX 및 FIXa의 아프타머의 항응고 및 항혈전 효과를 특히 신속하게 역전시키는 개선된 해독제를 제공한다. 해독제는 의사 또는 다른 의료 관계자에 의해 아프타머 활성을 역전시키도록 투여될 수 있다. 구체적인 실시형태에 있어서, 본 발명에 의한 해독제는 서열: (5'-3') 서열: cgcgguauaguccccau (Apt/AD; 서열번호 1); (5'-3') 서열: cgcgguauaguccc (Apt6/AD 서열번호 2); (5'-3') 서열: cgcgguauaguccac (Apt7/AD; 서열번호 3); (5'-3') 서열: cgcgguauaguccauc (Apt8/AD; 서열번호 4); (5'-3') 서열: cgcgguauagucag (Apt9/AD; 서열번호 5); (5'-3') 서열: cgcgguauagucagg (AptlO/AD; 서열번호 6); (5'-3') 서열: cgcgguauagucagag (Aptll/AD; 서열번호 7); (5'-3') 서열: cgcgguauaguccucac (Aptl4/AD; 서열번호 8)에 대응하는 핵산, 또는 이의 변형체 또는 유도체이다. 해독제 서열은 대응하는 아프타머의 서열과 적어도 20%, 50%, 75% 또는 90%의 상동성을 나타낼 수 있다. 일실시형태에 있어서, 안티센스 서열은 별 개로 투여된다.
안티센스 기술은 예를 들면 문헌 (참조: Okano, et al. (1991) J. Neurochem. 56:560 and "Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression," (1988) CRC Press, Boca Raton, FL)에 토의되어 있다. 일실시형태에 있어서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 해독제는 유리하게도 아프타머의 1본쇄 영역에서 타겟된다. 이는 핵형성을 촉진할 수 있고, 따라서 아프타머 활성 조절 속도는 일반적으로 표적 아프타머보다 더 많은 염기쌍을 포함하는 분자간 2본쇄를 유도한다. 본 발명의 인자 IXa의 아프타머는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 디자인하도록 사용되어도 된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 아프타머와 하이브리다이즈하여, 인자 IXa에 대한 아프타머의 결합을 블록한다.
본 발명의 개선된 아프타머의 개선된 해독제를 디자인하기 위해서는, 각종 방법은 최적 결합 부위를 결정하도록 사용될 수 있다. 상보 올리고뉴클레오티드는 아프타머 주위에 "워킹 (walking)"될 수 있다. 이러한 "워킹" 절차는 최소 컨센서스 리간드 서열이 소정의 개선된 아프타머에 대하여 결정된 후에, 최소 컨센서스 리간드 서열에 랜덤 서열을 가하고, 별개이나 인접하는 도메인 등의 표적과 추가 접촉을 전개하는 것을 포함한다. 워킹 실험은 순차적으로 행해지는 2개의 실험을 포함할 수 있다. 후보 혼합물의 각 멤버가 관심 대상의 핵산 리간드에 대응하는 고정 핵산 영역을 갖는 새로운 후보 혼합물이 생성된다. 후보 혼합물의 각 멤버는 또한 서열의 랜덤화 영역을 포함한다. 이 방법에 따르면, 표적의 하나 이상의 결합 도메인에 결합할 수 있는 영역을 포함하는 "확대" 핵산 리간드로도 불리우는 것 을 동정할 수 있다.
당에 있어서의 변화는 해독제 안정성에 영향을 줄 수 있는데, 부분적으로는 20-플루오로 또는 20-메톡시 등의 RNA형 올리고뉴클레오티드를 가져오는 당 변형으로 리보뉴클레아제 H의 기질로서 작용하는 것으로 보여지지 않기 때문이다. 염기에 대한 당의 배향에 있어서의 변화도 리보뉴클레아제 H 활성화에 영향을 줄 수 있다. 또한, 골격 변형은 리보뉴클레아제 H를 활성화시키도록 올리고뉴클레오티드의 능력에 영향을 준다. 메틸포스포네이트는 이를 활성화시키는데 반해, 포스포로티오에이트는 우수한 기질이다. 또한, 키메라 분자는 RNA에 결합하여 리보뉴클레아제 H를 활성화시키는 올리고뉴클레오티드로서 연구조사되어 왔다. 예를 들면, 20-메톡시포스포네이트의 윙 및 데옥시올리고뉴클레오티드의 5개의 베이스 갭 (five-base gap)을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 이들의 표적 RNA에 결합하여, 리보뉴클레아제 H를 활성화시킨다.
일실시형태에 있어서, 길이가 약 15개의 뉴클레오티드로 된 2'-O-메틸 변형된 해독제 (예: 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드)가 사용될 수 있고, 이의 상보성은 아프타머에 대한 약 5개의 뉴클레오티드에 의해 스태거 (stagger)된다 (예: 뉴클레오티드 1-15, 6-20, 11-25 등에 상보적인 올리고뉴클레오티드). 하이브리다이제이션 효율에 대한 개선된 아프타머의 삼차 구조의 영향을 예측하기가 곤란하다. 하기의 실시예에 기재된 분석을 이용하여, 특정 아프타머에 하이브리다이즈하는 상이한 올리고뉴클레오티드의 능력을 평가할 수 있다. 아프타머의 이의 표적 분자로부터의 해리속도 또는 이것과의 결합속도를 증가시키는 상이한 올리고뉴클레오티드 해독제의 능력은 또한 BIACORE 분석을 이용하는 동역학적 연구를 행함으로써 측정될 수 있다. 아프타머와 이의 표적 분자 사이의 상호작용을 원하는 방법으로 변화시키는데, 올리고뉴클레오티드 해독제를 5 내지 50배 몰량 이하의 과량의 올리고뉴클레오티드를 필요로 한다.
본 발명의 해독제는 다른 분자, 예를 들면 펩티드, 하이브리다이제이션 트리거된 (hybridizationtriggered) 가교제, 수송제, 하이브리다이제이션 트리거된 분해제 등에 컨쥬게이트되어도 된다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 임의로 하나 이상의 변형된 염기 부분, 즉 5-플루오로우라실, 5-플루오로시토신, 5-브로모우라실, 5-브로모시토신, 5-클로로우라실, 5-클로로시토신, 5-요오도우라실, 5-요오도시토신, 5-메틸시토신, 5-메틸우라실, 하이포크산틴, 크산틴, 4-아세틸시토신, 5-(카복시히드록시메틸)우라실, 5-카복시메틸아민-O-메틸 티오우리딘, 5-카복시메틸아민-O-메틸우라실, 디히드로우라실, 베타-D-칼락토실퀴오신 (galactosylqueosine), 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 6-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아민-O-메틸우라실, 5-메톡시아민-0-메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀴오신, 5'-메톡시카복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 5-메톡시시토신, 2-메틸티오-N&이소펜테닐아데닌, 우라실옥시아세트산 (v), 부톡소신, 슈도우라실, 퀴오신, 2-티오시토신, 5-메틸티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산메틸 에스테르, 우라실옥시아세트산 (v), 5-메틸티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-카복시프로필)우르데 일, (acp3)w 및 2,6-디아미노퓨린 중에서 선택되는 1종을 들 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다.
해독제는 또한 아라비노스, 2-플루오로아라비노스, 크실로스, 헥소스, 2'- 플루오로리보스, 2'-O-메틸리보스, 2'-O-메톡시에틸리보스, 2'-O-프로필리보스, 2'-0- 메틸티오에틸리보스, 2'-O-디에틸아미노옥시에틸리보스, 2'-O-(3-아미노프로필)리보스, 2'-0-(디메틸아미노프로필)리보스, 2'-O-(메틸아세트아미도)리보스 및 2'-O-(디메틸아미노에틸옥시에틸)리보스를 포함하는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 변형 당 부분을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 또 하나의 실시형태에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미도티오에이트, 포스포르아미데이트, 포스포르디아이니데이트, 메틸포스포네이트, 알킬 포스포트리에스테르, 및 포름아세탈 또는 이의 유사체를 포함하는 군 중에서 선택되나, 이들에 한정되지 않는 하나 이상의 변형 포스페이트 골격으로 구성된다.
리보자임 및 DNA자임:
개선된 아프타머 또는 해독제는 또한 효소 핵산일 수 있다. 이러한 리보자임 또는 DNA자임은 처음에 표적 RNA 또는 DNA (참조문헌: 미국 특허 제5,180,818호(Cech))에 결합한 다음에, 표적을 분해함으로써 작용한다. 효소 핵산은 반복적으로 새로운 표적에 결합하여 분해함으로써, RNA 아프타머를 불활성화시킬 수 있다. 각각 상이한 특이성을 나타내는 5개 이상의 부류의 리보자임이 있다. 해독제의 경우에는, 효소 활성은 보완되거나, 개선된 아프타머의 "자살 위치"의 도입 대 신에 이용될 수 있다.
리보자임의 효소 특성은 치료상의 처치를 행하는데 필요한 리보자임의 유효 농도가 안티센스 올리고뉴클레오티드의 유효 농도보다 낮기 때문에, 다른 기술에 비하여 유리할 것이다. 단일 리보자임 분자는 많은 표적 RNA 분자를 분해할 수 있다. 또한, 리보자임은 고도의 특이성 억제제로, 억제 특이성은 결합의 염기 짝지음 메카니즘 뿐만 아니라, 분자가 이것이 결합되는 RNA 발현을 억제하는 메카니즘에도 의존한다. 즉, 억제는 RNA 표적의 분해로 인해 일어나므로, 특이성은 비표적 RNA의 분해 속도에 대한 표적 RNA의 분해 속도의 비율로서 정의된다. 분해 메카니즘은 염기 짝지음에 관여하는 메카니즘에 추가되는 인자에 의존한다. 그리하여, 리보자임 작용 특이성은 동일한 RNA 부위에 결합되는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 그것보다 크다.
촉매 분자의 또 하나의 부류는 "DNA자임"로 불리운다. DNA자임은 1본쇄로, RNA 및 DNA를 분해한다. DNA자임에 대한 일반적인 모델이 제안되어, "10-23" 모델로서 알려져 있다. 간단히 "10-23 DNA자임"로도 불리우는 "10-23" 모델에 관한 DNA자임은 각각 7 내지 9개의 데옥시리보뉴클레오티드로 된 2개의 기질 인식 도메인의 측면에 배치되는 15개의 데옥시리보뉴클레오티드의 촉매 도메인을 갖는다. 시험관내 분석에 따르면, 이러한 형태의 DNA자임은 생리조건하에서 퓨린:피리미딘 접합부에서 이의 기질 RNA를 효과적으로 분해할 수 있다. 본 명세서에서, "DNA자임"은 DNA 또는 RNA일 수 있는 별개의 표적 핵산 서열을 명확히 인식하여 분해하는 DNA 분자를 의미한다.
적합한 핵산:
본 발명의 또 하나의 측면에 있어서, 개선된 아프타머의 해독제는 펩티드 핵산 (PNAs)이다. PNAs는 올리고뉴클레오티드와 유사한 화합물이나, 올리고뉴클레오티드의 데옥시리보스 골격이 펩티드 골격으로 교체된다는 점에서 조성이 다르다. . 각 펩티드 골격의 서브유닛은 천연 또는 비천연 핵산염기에 결합된다.
PNAs은 이들의 비치환된 올리고뉴클레오티드 카운터파트보다 대응하는 개선된 아프타머에 더욱더 단단하게 결합하기 때문에 빠르게 작용하는 해독제로서 유리할 수 있다. PNAs는 DNA 및 RNA에 결합하고, 생성된 PNA/DNA 또는 PNA/RNA 2본쇄는 이들의 높은 융점 (Tm)에 의해 명백한 바와 같이 대응하는 DNA/DNA 또는 DNA/RNA 2본쇄보다 더 단단하게 결합된다. PNA/DNA(RNA) 2본쇄의 또 하나의 이점은 Tm이 실질적으로 염 농도에 무관하다는 것이다. PNAs가 골격이 당이기 보다는 슈도펩티드인 DNA의 유사체이므로, 이들은 DNA의 거동을 모방하고 상보 핵산 쇄에 결합한다.
PNAs는 핵산염기 아데닌, 시토신, 구아닌, 티민 및 우라실이 메틸렌카보닐기를 통해 결합되어 있는 아미노산 반복 단위, N-(2-아미노에틸)-글리신으로 구성되는 합성 폴리아미드이다. 다른 많은 것들 중에서 슈도 이소시토신, 5-메틸시토신 및 2,6-디아미노퓨린, 이노신, 우라실, 5-메틸시토신, 티오우라실, 2,6-디아미노퓨린, 브로모티민, 아자아데닌 또는 아자구아닌 등의 천연 및 비천연 핵산염기는 또한 PNA 신톤에 혼입될 수 있다. PNAs는 t-Boc/벤질 보호 전략에 따라 보호되는 단량체 (PNA 신톤)로부터 가장 통상적으로 합성되며, 성장 폴리머의 골격 아미노기가 핵산염기의 t-부틸옥시카보닐(t-Boc)기 및 환외 아미노기로 보호되며, 존재한다면, 벤질옥시카보닐(벤질)기로 보호된다. t-Boc/벤질 전략을 이용하여 보호된 PNA 신톤이 현재 입수가능하다.
모르폴리노 핵산 (MNAs)도 모르폴리노가 뉴클레아제에 대하여 완전히 내성을 나타내고, S-DNAs를 플레이그 (plague)하는 대부분 또는 모든 비안티센스 (non-antisense) 효과가 없는 것으로 보이기 때문에, 해독제 제법에 유리할 수 있다. MNAs는 각각 6원환 모르폴린환에 결합되는 4개의 유전자 염기 (아데닌, 시토신, 구아닌, 및 티민)를 포함하는 모르폴리노 서브유닛으로부터 조립된다. 서브유닛은 비이온성 포스포로디아미데이트 서브유닛간 결합에 의해 결합되어, MNA를 제공한다. 이들 MNAs는 이온 결합에 의해 결합되는 5원환 리보스 또는 데옥시리보스 골격 부분을 갖는 RNA, DNA 및 이들의 유사체 보다 실질적으로 우수한 안티센스 특성을 가질 수 있다 (참조: wwwgene-tools.com/Morpholinos/body_morpholinos.HTML).
미국 특허 제6,153,737호 (Manoharan et al.)는 결합된 뉴클레오시드가 펩티드, 단백질, 수용성 비타민 또는 지용성 비타민과 작용화하는 유도체화된 올리고뉴클레오티드이다. 상기 공보는 복합체의 핵막으로의 선택적 도입을 돕는 펩티드 또는 단백질 서열에 의해 올리고뉴클레오티드의 변형에 의한 안티센스 치료법에 관한 것이다. 유사하게는, 수용성 및 지용성 비타민은 세포막을 가로질러 안티센스 치료제 또는 진단제를 수송하는데 사용될 수 있다.
로크된 핵산 (LNAs)은 또한 본 발명의 해독제를 제조하는데 사용될 수 있다. LNAs는 핵산 특성을 향상시키기 위한 최유력 후보로 만드는 특성을 갖는 신규한 부 류의 DNA 유사체이다. LNA 단량체는 RNA-단량체와 구조적으로 유사한 이환식 화합물이다. LNAs는 DNA 및 RNA의 화학적 성상을 공유하고, 수용성을 나타내며, 겔 전기영동에 의해 분리되고, 에탄올 침전될 수 있다 (Tetrahedron, 54, 3607-3630 (1998)). 그러나, DNA 또는 RNA 올리고로의 LNA 단량체의 도입으로, 동시에 왓슨-크릭 염기 짝지음 규칙을 따르면서 상보 DNA 또는 RNA를 갖는 2본쇄의 고도의 열안전성을 가져온다. 3' 위치 LNA(s)을 포함하는 프라이머가 효소 연장반응, 예를 들면 PCR 반응의 기질인 것과 동시에, LNA 올리고머로 형성된 2본쇄의 이러한 고도의 열안정성은 이들 화합물이 본 발명의 해독제에 적합하게 한다 (LNAs의 예로는 미국 특허 제6,316,198호 참조).
다른 실시형태에 있어서, 안정화된 핵산은 PCO (슈도사이클릭 올리고핵산염기), 또는 2'-O,4'-C-에틸렌 가교 핵산 (ENA)일 수 있다.
4. 변형
본 발명의 개선된 아프타머 및 아프타머-해독제 조합체는 특수 당 잔기를 치환하고, 아프타머의 조성 및 아프타머의 특수 영역의 사이즈를 변화시키고, 해독제에 의해 훨씬 더 효과적으로 억제될 수 있는 아프타머를 디자인함으로써 변형된다. 아프타머의 디자인은 아프타머의 이차 구조 (도 1 참조) 및 이차 구조와 해독제 컨트롤 사이의 관계의 인지를 포함한다. 핵산을 변형하는 통상적인 방법과는 달리, 본 발명에 포함된 FIX 유전자 산물의 개선된 아프타머의 디자인은 해독제 컨트롤의 고려를 포함한다. 컨트롤된 아프타머는 혈액 순환 중에 안정해야 하고 또한 컨트롤된 해독제가 아닐 정도로 안정하지 않으면 안된다. 아프타머는 절단에 의해 변 형될 수 있으나, 해독제는 절단될 때에 각 아프타머를 컨트롤하도록 디자인될 필요가 있다. 또한, 특정 변형, 특히 스템 및 루프의 계면에서는 2'-플루오로로부터 변형될 수 없거나, 또는 아프타머는 활성을 잃을 수 있다.
일실시형태에 있어서, 디자인은 아프타머 또는 해독제, 이들 양쪽의 2'-히드록실 함량을 감소시키는 것을 포함한다. 또 하나의 실시형태에 있어서, 디자인은 아프타머 또는 해독제, 이들 양쪽의 플루오로 함량을 감소시키는 것으로 포함한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 디자인은 아프타머 또는 해독제, 이들 양쪽의 O-메틸 함량을 증가시키는 것으로 포함한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 디자인은 아프타머의 사이즈를 감소시키는 것으로 포함한다. 또 하나의 실시형태에 있어서, 해독제의 사이즈는 아프타머의 사이에 관하여 변화된다. 또 다른 실시형태에 있어서, 구아닌 스트링은 4개 미만의 구아닌, 3개 미만의 구아닌, 2개 미만의 구아닌 또는 구아닌을 포함하지 않는 것으로 감소된다. 그러나, 이러한 변화의 공동 효과는 충분한 활성을 제공하나 해독제에 의해 용이하게 중화되는 항응고제를 생성시키는 과제를 충족시켜야 한다.
또 다른 실시형태는 쌍을 이룬 해독제에 의해 더욱 효과적인 조절을 할 수 있는 "자살 위치"를 갖는 아프타머를 디자인하는 방법을 포함한다. 일실시형태에 있어서, 이 위치는 해독제가 개선된 아프타머에 결합할 때에 1본쇄로 되어 불안정해지고, 혈액 또는 간장 엔도뉴클레아제 등의 순환 중에 효소에 의해 해독제의 결합시에 개선된 아프타머가 분해함으로써, 활성 아프타머가 순환되는 것을 효과적으로 피할 수 있다. 자살 위치는 일실시형태에 있어서 수산화되는 스템 2 중의 구아 닌에 있을 수 있다. 일실시형태에 있어서, 아프타머는 해독제와 결합할 때까지는 2본쇄 구조로 되어 있고, 1본쇄로 되며, 해독제의 결합 시의 분해에 사용할 수 있다.
본 발명자는 아프타머 또는 해독제, 또는 이들 양쪽에 대한 이차 변형을 포함으로써 안정하고 생물활성을 지닌 아프타머-해독제 쌍을 발견하였다. 구체적인 실시형태에 있어서, 인자 IX의 아프타머는 변형 뉴클레오티드를 포함한다. 일실시형태에 있어서, 아프타머는 하나 이상의 2'-O-메틸기를 포함한다. 또 하나의 실시형태에 있어서, 아프타머 및 해독제는 하나 이상의 2'-O-메틸 및 하나 이상의 2'-플루오로 변형체를 포함한다. 또 하나의 실시형태에 있어서, 아프타머 및 해독제는 2'-플루오로 변형체를 포함하지 않는다. 또 다른 실시형태에 있어서, 아프타머는 이의 스템 상에 하나 이상의 2'-O-메틸 및 하나 이상의 2'-플루오로 변형체를 포함한다. 아프타머는 또한 수용성 폴리머로 변형되는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 폴리머는 폴리에틸렌글리콜, 폴리아민, 폴리에스테르, 폴리무수물, 폴리에테르, 또는 다른 수용성 약제학적으로 허용가능한 폴리머를 포함할 수 있다.
FIX 억제제의 소정의 아프타머 서열 내의 퓨린은 통상의 2'히드록실 당에 대한 2'-O-메틸 당의 치환을 허용할 수 있다 (실시예 1, 도 1). 본 발명자는 아프타머가 3개의 부류에 속하는 것을 알아냈다: (1) 항응고 활성의 획득 (Apt-4); (2) 활성의 중간 정도의 손실 (Apt-1,2, 및 3) ; 및 (3) 활성의 심각한 손실 (Apt 5) (도 2). Apt-5로부터의 데이터는 2'히드록실 퓨린에 대하여 2'-0-메틸 퓨린으로 완전히 치환되는 효과가 섹터 치환 단독보다 상당히 크다는 것을 나타낸다 (도 2). 이러한 아프타머의 경우에는, 섹터 사이의 상호작용을 제안하거나, 또는 하나의 섹터 내의 치환으로 인한 손상이 추가 변형에 의해 악화되는 것이 가능하다는 것이다 (즉, 하나의 섹터는 아킬레스 건이다). Apt-1, 2 및 3에 의해 나타내는 향상된 해독제 컨트롤은 해독제 결합 부위 내로의 2'0-메틸 잔기의 도입이 아프타머에 결합하기 위한 해독제 올리고뉴클레오티드의 능력을 향상시킨다는 것을 제안한다. 이는 각 쇄에서 2'-O-메틸 RNA 잔기를 포함하는 2본쇄에 관찰되는 열역학적 안정성의 증가와 일치하고, 2'-O-메틸-2'-O-메틸 쇄의 2본쇄가 2'O-메틸-2'플루오로 쇄로 구성되는 2본쇄보다 더욱 열역학적으로 안정하다는 것으로 제안한다. 택일적인 결론으로는 Apt-1, 2 및 3의 활성이 감소되면, 소정시간에서 혈장 내에서 아프타머가 훨씬 더 "자유롭게"되므로, 훨씬 더 용이하게 해독제 올리고뉴클레오티드에 의해 결합된다는 것이다.
또 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 아프타머는 변형된 피리미딘 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 스템 1 내에서 2'플루오로피리미딘을 2'-O-메틸로 치환한 바, 활성이 향상되었고 더 큰 치환 레벨을 허용하는 화합물이 산출되었다. Apt 31 및 32에 대한 Apt 30 및 33의 활성 비교로부터, C16가 2'플루오로 당을 함유하고 G25가 2'히드록실 당을 함유하는 것이 필요하다는 것이 증명된다 (도 16a). Apt 31과 32 사이에 관찰된 활성은 스템 2의 잔존 위치가 2'-0-메틸 당을 함유할 수 있다는 것을 제안한다. 실제로, Apt 31은 Apt 32보다 약간 더 큰 효능을 갖는 것으로 나타나는데, C16에서는 2'플루오로를, G25에서는 2'히드록실을, 잔존하는 잔기 2'-O-메틸을 갖는 화합물이 Apt 33보다 더 큰 효능을 나타낸다는 것을 보여준 다. Apt 33은 Apt 30보다 훨씬 더 용이하게 중화될 수 있는데, 아프타머의 해독제 결합 부위 내의 추가 2'-O-메틸 잔기는 해독제 결합을 향상시킨다. Apt 34는 2'-O-메틸 뉴클레오시드 보다는 2'플루오로서의 C16을 갖는다 (도 16b). 90% 중화 (~5:1 대 10:1)를 달성하는데 34가 모체 AptA 화합물보다 덜 과도한 양의 해독제를 요하지만, 치환에 의해 항응고 활성 (Apt 34를 Apt 33와 비교)이 증가되나, 적당한 정도의 "중화능"의 손실을 가져왔다 (도 16b). 두가지 결과는 2'-O-메틸 치환으로 인한 스템 2의 안정성의 증가와 일치한다. 이러한 치환에 의해 합성 비용이 감소되고 증가된 스템 안정성으로 인한 증가된 아프타머 변형을 행할 수 있게 하는 것으로 보이기 때문에, 다른 것들은 명백히 2'-플루오로피리미딘의 2'-O-메틸 치환을 행하지 않는다는 것은 놀랍다.
일실시형태에 있어서, 아프타머의 스템 2에서의 하나 이상의 구아닌은 히드록실 당 (2'-OH)을 포함한다. 일실시형태에 있어서, 스템 1 또는 스템 2에서의 하나 이상의 우리딘은 변형 염기이다. 이것은 2'-플루오로(2'-F) 또는 2'-O-메틸 (2'-OCH3) 변형체일 수 있다 일실시형태에 있어서, 스템 1 또는 스템 2에서의 하나 이상의 우리딘은 2'-O-메틸 변형된다. 일실시형태에 있어서, 스템 2에서의 하나 이상의 시티딘은 변형된다. 일실시형태에 있어서, 스템 2에서의 하나 이상의 시티딘은 2'-플루오로 변형된다.
그러나, Apt 12와 Apt 13 및 17의 항응고 활성의 비교 (도 6)로부터, Apt 6-11에 관찰된 활성 손실이 하나 이상의 필수 잔기에서의 2'-O-메틸 치환의 존재로 인한 것임을 입증한다 (도 7). Apt 12에 대한 Apt 14의 항응고 활성의 비교는 항 응고 활성에 대한 큰 영향을 끼치지 않고 스템 1 내의 4개의 연속 구아노신 스트레치가 변경될 수 있다는 것을 나타낸다. Apt 15 및 16과 Apt 2, 12 및 17의 비교는 a) 스템 1 의 상부의 폐쇄 A-U 쌍을 제외하고는 스템 1 내의 각 위치에서의 2'-O-메틸 당의 존재가 활성을 향상시킨다는 것을 증명하고, b) 이 염기쌍의 U 당이 효능을 보유하도록 아프타머에 대하여 2'-플루오로이어야 한다는 것을 증명하며, c) 이 염기쌍의 A 당이 항응고 활성에 대한 큰 영향을 끼치지 않고 2'-O-메틸 당일 수 있다. 실제로, Apt 16은 실질적으로 완전 효능을 보유한다.
데이터는 2본쇄의 2개의 쇄가 주로 2'-0-메틸 잔기를 포함할 때와는 대조적으로, 스템 1이 2'-O-메틸-2'플루오로 스템일 때에 해독제가 훨씬 더 용이하게 아프타머와 결합할 수 있는 것을 제안한다. 이는 2개의 쇄의 2'-O-메틸 잔기로 구성되는 2본쇄가 주로 2'-O-메틸 쇄 및 주로 2'플루오로 쇄로 구성되는 것보다 훨씬 더 안정하다는 점과 일치한다. Apt 15에 대한 Apt 16의 향상된 항응고 활성은 또한 이것과 일치한다. 또는, 14, 15 및 16 사이의 중화능의 차이는 이들 2개의 화합물과 비교하여, Apt 16의 향상된 효능으로 인한 것일 수 있다. 그럼에도 불구하고, 적어도 AptA 뿐만 아니라, 모두가 중화된다. Apt 14 및 15의 항응고 활성이 유사하다는 사실에 기초하여, 스템 1의 상부의 A 당은 2'-O-메틸 치환되었다 (Apt 21, 도 8).
이러한 아데노신 잔기에서의 2'-O-메틸 당의 치환은 주로 2'-O-메틸 스템의 백그라운드에서 충분히 허용된다 (도 9). 실제로, Apt 21의 효능은 Apt 16과 15 사이의 중간이다. Apt 21의 해독제 중화는 Apt 16에 비하여 향상된다 (특히, 도 9 의 2.5:1 및 5:1 AD:약제 데이터 포인트 참조).
당 변형은 안정성을 확보하나, 치료효과가 있도록 아프타머에 대한 약물 동태를 보증하지는 않는다. 건강인에 있어서, 아프타머는 아마도 신장 배출을 통해 정맥 주사후 수분내에 혈장으로부터 제거된다. 주사후 수시간 내지 수일간 무상 아프타머를 유지하기 위해서는 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 등의 큰 고분자에 이들을 컨쥬게이트함으로써 달성된다. 또 하나의 실시형태에 있어서, 아프타머 혈장 클리어런스는 또한 리포솜에 매립함으로써 감소된다.
본 발명의 핵산 아프타머는 또한 스템 및 루프 사이즈를 변화시킴으로써 변경될 수 있다. 4개, 5개 또는 6개의 2-0-메틸 변형된 염기 쌍 스템 1 영역은 항응고 활성 및 해독제 컨트롤의 변화 레벨을 보여준다 (실시예 2, 도 3 내지 5 참조). 스템 1 돌연변이체 (도 3)는 APTT 분석에서 측정된 바와 같이 항응고 활성 손실을 나타낸다 (도 4 및 5). 모든 스템 1 변이체는 2'-O-메틸 퓨린/2'플루오로 피리미딘 화합물 Apt 5보다 작은 활성을 나타내는데, 스템 1 내의 피리미딘 중 하나가 효능을 보유하도록 화합물에 대하여 2'플루오로 당을 함유해야 한다는 것을 말해준다. 그러나, 5개의 염기쌍 스템 1 구성체 (Apt 10 및 7)는 6개의 염기쌍보다 훨씬 더 용이하게 컨트롤된 해독제인 것으로 나타난다. 데이터는 5개의 염기쌍으로 된 스템 1이 해독제 중화를 향상시키는데 4개, 6개 또는 7개의 염기쌍으로 구성되는 것보다 바람직할 것이다.
해독제의 표적화에 관해서는, 개선된 아프타머는 또한 올리고뉴클레오티드 해독제와의 결합을 향상시키기 위해 1본쇄 테일 (3' 또는 5')을 포함하도록 변형될 수 있다. 적절한 테일은 1 내지 20개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 1 내지 10개의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 1 내지 5개의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 3 내지 5개의 뉴클레오티드 (예: 2'-O-메틸 서열 등의 변형 뉴클레오티드)로 구성될 수 있다. 테일된 (tailed) 아프타머는 1본쇄 테일의 부가가 아프타머의 활성 구조를 붕괴시키지 않는다는 것을 검증하도록 결합 및 생물학적 검정에서 테스트될 수 있다 (예를 들면, 후술하는 바와 같이). 테일 서열과 함께 1, 3 또는 5개의 염기쌍을 형성할 수 있는 일련의 올리고뉴클레오티드 (예를 들면 2'-O-메틸 올리고뉴클레오티드)가 디자인되어, 아프타머의 이의 표적 분자로부터의 해리속도 또는 이것과의 결합속도를 증가시키는 이의 능력뿐만 아니라, 테일된 아프타머 단독과 결합하는 이의 능력을 테스트할 수 있다. 스크램블 서열 컨트롤을 사용하여, 효과가 2본쇄 형성으로 인한 것으로 비특이성 효과가 아닌 것을 검증할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 해독제는 직접 투여될 수 있다 (예를 들면, 단독 또는 리포솜 제제 중 또는 담체와 복합체를 형성, 예: PEG)) (예를 들면, 미국 특허 제6,147,204호 및 제6,011,020호 참조). 놀랍게도, PEG 분자를 첨가하면, 스템 1의 길이가 짧을수록 인자 IX에 대한 아프타머 결합을 감소시키지 않고, 실제로 페질레이트된 쇼트된 스템 1은 중화능을 증가시키는 것으로 나타나는데, 아마도 훨씬 효과적인 치료법을 제공할 것이다. 도 10은 5개의 염기쌍 스템을 갖는 페질레이트된 아프타머 (Apt 19)의 활성 및 중화능을 도시한다. Apt 19는 7개의 염기쌍 스템 1을 갖는 페질레이트된 Aptl6과 매우 유사한 항응고 활성을 가지나, 이의 활성의 약 90%가 약제에 대한 해독제의 25:1의 과잉량 만으로 중화될 수 있다.
따라서, 일실시형태에 있어서, 개선된 아프타머 또는 해독제는 본 명세서에 기재된 바와 같이, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 등의 비면역원성 고분자량 화합물 또는 다른 수용성 약제학적으로 허용가능한 폴리머에 결합될 수 있다. 일실시형태에 있어서, 아프타머 또는 해독제는 공유 결합을 통해 PEG 분자와 결합되어 있다. 공유 결합이 사용되는 경우에는 PEG는 개선된 아프타머 또는 해독제에 다양한 위치에 공유 결합될 수 있다. 또 하나의 실시형태에 있어서, 올리고뉴클레오티드 아프타머 또는 해독제는 말레이미드 또는 비닐술폰 작용성을 통해 5'-티올에 결합된다. 일실시형태에 있어서, 다수의 개선된 아프타머 또는 해독제는 단일 PEG 분자와 결합될 수 있다. 개선된 아프타머 및 해독제는 동일하거나 상이한 서열 및 변형일 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 다수의 PEG 분자는 서로 결합될 수 있다. 이러한 실시형태에 있어서, 동일한 표적 또는 상이한 표적에 대한 하나 이상의 아프타머 또는 해독제는 각 PEG 분자와 결합될 수 있다. 동일한 표적에 특이적인 다수의 아프타머 또는 해독제가 PEG에 결합되는 실시형태에 있어서는, 동일한 표적 사이의 특이성 상호작용을 일으키도록 동일한 표적을 서로 아주 근접하게 할 가능성이 있다. 상이한 타겟에 특이적인 다수의 아프타머 또는 해독제가 PEG에 결합하는 경우에는, 표적 사이의 특이성 상호작용을 일으키도록 별개의 표적을 서로 아주 근접하게 할 가능성이 있다. 또한, PEG와 결합된 동일한 표적 또는 상이한 표적에 대한 아프타머 또는 해독제인 실시형태에 있어서는, 약제는 또한 PEG와 결합될 수 있다. 그리하여, 복합체는 링커로서 작용하는 PEG와 함께 표적 약제 도입을 제공할 것이다.
본 발명의 아프타머 또는 해독제는 또한 일차 또는 이차 히드록실기 등의 작용기에 공유 결합되는 다른 컨쥬게이트기를 포함할 수 있다. 본 발명의 컨쥬게이트기로는 폴리아민, 폴리아미드, 폴리에틸렌글리콜, 폴리에테르, 올리고머의 약리학적 특성을 향상시키는 기 및 올리고머의 약물속도론적 특성을 향상시키는 기를 들 수 있다. 본 발명과 관련하여, 약리학적 특성을 향상시키는 기로는 올리고머 생체이용성을 향상시키고, 올리고머 분해 저항성을 향상시키고/시키거나, RNA와의 서열 특이성 하이브리다이제이션을 증강시키는 기를 들 수 있다.
구체적인 실시형태에 있어서, 아프타머는 하기 서열 중 어느 하나로 된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. ("A" 는 2'OH A; "a"는 2'-O-메틸 A; "G"는 2'-OH G; "g"는 2'-0-메틸 G; "C"는 2'-플루오로 C; "c"는 2'-O-메틸 C; "U"는 2'플루오로 U; "u"는 2'-0-메틸 U; 및 "T"는 역 2'H T이다.)
Figure 112006085711327-PCT00004
Figure 112006085711327-PCT00005
"SeqID": 서열번호
구체적인 일실시형태에 있어서, 인자 IX의 아프타머는 실질적으로 뉴클레오티드 서열: gugga CUaUaCC gCg UaaUgC uGc C Uccac T (Apt39; 서열번호 59)로 구성된다.
본 명세서에 기재된 개선된 아프타머는 당해 기술분야에 공지된 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 아프타머를 제조하기 위해 사용될 수 있는 대규모 제조방법을 기재하는 미국 특허가 발표되었다. 예를 들면, 미국 특허 제 4,973,679호, 제4,668,777호 및 제4,415,732호 (Caruthers et al.)는 올리고뉴클레오티드의 제조에 유용한 포스포르아미다이트 화합물을 기재한다. 다른 일련의 특허에 있어서, 무기 고분자 지지제를 이용하여 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법을 개시되어 있다 (미국 특허 제4,500,707호, 제4,458,066호 및 제5,153,319호 (Caruthers et al.) 참조). 또 다른 일련의 특허에 있어서, 올리고뉴클레오티드를 제조하도록 사용될 수 있는 뉴클레오시드 포스포로디티오에이트가 개시되어 있다 (미국 특허 제 5,278,302호, 제5,453,496호 및 제5,602,244호 (Caruthers et al.) 참조).
5. 사용 방법
개선된 아프타머를 이용한 응고 조절:
본 발명은 FIX, FIXa, 또는 고유 테나아제 복합체에 결합하기 위한 개선된 아프타머의 용도를 포함한다. 결합은 시험관내 또는 생체내일 수 있다. FIX, FIXa 또는 테나아제 복합체에 대한 결합으로, 단백질 또는 복합체의 생물 활성을 억제시킬 수 있다. 개선된 아프타머는 심부 정맥 혈전증, 동맥 혈전증, 수술후 혈 전증, 관상동맥 바이패스 그라프트 (CABG), 경피 관상동맥 혈관형성 (PTCA), 발작, 종양 전이, 염증, 패혈성 쇼크, 저혈압, ARDS, 폐색전증, 파종성 혈관 응고 증후군 (DIC), 혈관 재협착, 혈소판 침착, 심근 경색, 혈관신생 등의 질환을 치료하거나, 또는 혈전증의 위험이 있는 동맥경화성 혈관을 갖는 포유동물의 예방적 치료를 위해 사용될 수 있다.
일실시형태에 있어서, 개선된 아프타머는 FIXa에 결함으로써 혈액 응고를 억제시킨다. 본 발명은 본 발명의 아프타머를 혈액 응고를 억제하도록 이를 필요로 하는 포유동물, 예를 들면 사람에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 또 하나의 실시형태는 치료 요법시에 투여에 적합한 아프타머를 이용하는 방법을 제공한다.
응고 조절을 요하는 포유동물에 있어서의 개선된 조절 응고 방법이 제공된다. 일실시형태에 있어서, 방법은 (a) 선택적으로 응고 경로 FIX, FIXa, 또는 고유 테나아제 복합체에 선택적으로 결합하거나, 또는 고유 테나아제 복합체의 서브유닛을 억제하는 (즉, FIX, FIXa, FVIII 결합 또는 FX의 활성화) 개선된 아프타머의 유효량을, 이를 필요로 하는 온혈 척추동물 또는 포유동물에게 투여한 단계; (b) 단계 (a)에서의 아프타머 투여를 통해 온혈 척추동물의 응고 경로 인자의 생물 활성을 조절하는 단계; 및 (c) 아프타머의 효과를 역전시키도록 개선된 해독제를 제공하는 단계를 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 온혈 척추동물 또는 포유동물은 사람이다.
본 명세서에서, 용어 "포유동물"은 사람, 또는 돼지, 양, 소, 설치류, 유제 동물, 새끼 돼지, 면양, 새끼 양, 염소, 축우, 사슴, 노새, 말, 원숭이, 개, 고양이, 래트, 및 마우스를 포함하나 이들에 한정되지 않는 사람 이외의 포유동물을 의미한다.
중요한 고려 대상 범위는 혈장 반감기이다. 변형은 개선된 아프타머의 생체내 반감기를 수분 내지 12 시간 이상 변화시킬 수 있다. 본 발명의 개선된 아프타머는 특정 시간 및 장소에서 혈관 손상이 일어나서, 상대적인 짧은 프로트롬보틱 (prothrombotic) 자극을 유발하는 경피 관상동맥 인터벤션 (intervention)을 치료하도록 사용될 수 있다. 이는 또한 경동맥 혈관 형성술을 따르는 경우일 것이다. 또 하나의 실시형태에 있어서, 개선된 아프타머는 관상동맥 바이패스 이식술 및 혈액 투석에 이용되는 체외 순환에 사용될 수 있다. 후자 조건은 동정맥 (AV) 단락의 고유 혈전 형성 때문에 약간 복잡하다. 본 발명의 아프타머는 또한 정맥 혈전 색전증, 인공 심장 밸브 교체, 심방 세동, 및 예상컨대 이전의 질환을 갖고 있는 환자 중에서 심혈관 질환의 일차 또는 이차 예방, 불리한 위험 인자, 문서화된 멀티베드 (multibed) 혈관 질환, 혈관 염증 (동맥경화성 혈관 장애의 초기 단계)를 치료하는데 사용될 수 있다.
온혈 척추동물의 심혈관 질환을 치료하는 방법도 제공된다. 이 방법은 선택적으로 응고 경로 인자 IX, IXa, 또는 고유 테나아제 복합체에 선택적으로 결합하거나, 또는 고유 테나아제 복합체의 서브유닛을 억제하는 (즉, FIX, FIXa, FVIII 결합 또는 FX의 활성화) 개선된 아프타머의 유효량을, 심혈관 질환을 앓는 척추동물 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 아프타머를 투여하여, 척추동물 대상의 심 혈관 질환을 치료한다. 이 방법은 또한 해독제의 투여에 의해 개선된 아프타머의 효과를 역전시키도록 해독제를 제공하는 것을 포함한다.
개선된 아프타머는 혈액 응고 치료를 요하는 포유동물에 투여될 수 있다. 본 발명은 혈액 응고를 억제하도록 포유동물을 아프타머로 치료하는 방법을 제공한다. 이와 쌍을 이루는 해독제는 아프타머의 효과를 역전시키도록 투여될 수 있다. 이러한 발견의 이점은 혈액 응고가 즉시 컨트롤될 수 있고 포유동물 자체의 대사작용에 의존하지 않는다는 것이다.
본 발명의 조성물 및 방법은 심장 바이패스 장치 순환 시 및 신장 투석을 받는 환자에 있어서의 혈전 형성을 예방하고, 불안정 협심증, 급성 심근 경색 (심장 발작), 뇌혈관 장애 (발작), 폐색전증, 심부 정맥 혈전증, 동맥 혈전증, CABG 수술 및 파종성 혈관 응고 증후군 등의 혈전 관련 심혈관 질환을 앓고 있거나 앓을 위험이 있는 환자를 치료하기 위해 특히 유용하다.
혈관 형성, 불안정 협심증, 폐색전증, 심부 정맥 혈전증, 동맥 혈전증, 및 파종성 혈관 응고 증후군을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 개선된 아프타머 및 해독제는 FIX 또는 FIX로 조절되는 캐스케이드와 관련된 다른 심혈관 질환을 억제할 수 있다. 응고는 허혈성 심혈관 질환에 중용한 역할을 한다. 연구 결과로부터, 극도의 응고성 저하는 허혈성 심혈관 질환으로부터 보호해준다는 것을 알 수 있다. 혈우병 환자에 발견되는 가벼운 정도의 응고성 감소로, 치명적인 허혈성 심질환에 대하여 보호 효과를 갖는다 (Sramek A, et al. (2003) Lancet 362 (9381): 351-4 ; Bilora F, et al. (1999) Clin Appl Thromb Hemost. 5(4):232-5).
아프타머는 응고 유발 염증을 예방하는데 투여될 수 있다. 염증은 급성 심근 경색 (AMI)을 앓는 환자의 혈전용해요법에 의해 유발되며, 미소혈관 장애 및 재관류 상해의 원인이 될 것이다. 본 발명의 개선된 아프타머는 이러한 초기 염증 반응을 억제할 수 있다. 일실시형태에 있어서, 본 발명의 개선된 아프타머를 이를 필요로 하는 포유동물에게 투여함으로써 초기 염증 반응을 감소시키는 방법이 제공된다.
본 발명의 개선된 아프타머 및 해독제는 죽상경화증을 억제하도록 사용될 수 있다. 죽상경화증의 몇몇 유해 사상은 파열성 플라크와 관련되어 있는데, 이는 죽상경화증과 관련된 발병 및 사망의 주원인이다. 통상적인 관상동맥 심질환 위험 인자 이외에도, 응고 인자 IX 활성화 펩티드 및 피브리노겐 관상동맥 심질환의 위험과 전적으로 관련될 수 있다 (R. Rosenberg et al. (2001) Thromb Haemost 86: 41-50; JA Cooper et al. (2000) Circulation 102: 2816-2822). 내인성 경로는 내피층의 제거하여 SMCs 및 대식세포를 혈류에 노출시킨 후에 동맥경화성 병변의 혈전 형을 상당히 향상시킬 것이다 (Ananyeva NM et al. (2002) Blood 99: 4475-4485). 또한, 개선된 아프타머는 또한 염증과 관련된 급성 관증후군 (ACS)을 앓는 포유동물의 발병을 예방하도록 제공될 수 있다.
특정 임상 시나리오에 있어서, 접촉 경로는 혈액 응고의 주 경로가 된다. 이들은 혈액 제제가 혈액과 심폐 바이패스 (CPB) 회로의 접촉과 같은 신체로부터 제거되고 옥시제너레이터가 CPB 동안에 그 후에 염증 상태를 유발시키는 외과적 처 치를 포함한다. 유전역학 및 전향 임상 연구는 신장 장해, 심방 세동, 발작, 장 손상 및 신경 손상을 포함하는 CPB의 다수의 부작용을 갖는 관상동맥 혈관 재생술 시에 염증 반응의 크기와 관련되었다. 응고 경로의 활성화에 의해 유발되는 염증 반응은 혈괴 형성에 있어서의 역할 이외에도 염증 유발 및 세포증식 시그널 전달 단백질인 응고 인자 Xa 및 트롬빈에 의해 조절된다. 개선된 아프타머는 또한 혈관형성후 재협착과 관련된 부작용을 예방하도록 투여될 수 있다.
개선된 아프타머-해독제 쌍에 의한 응고 조절:
혈전 질환을 앓거나 응고 유발 사상 시의 환자를 치료하는 많은 과제 중에, 항응고약 요법과 관련된 출혈의 잠재적 위험이 있다. 출혈 위험에 놓이는 메카니즘은 복잡하나, 의심할 여지 없이 약물 변동 (혈전 형성도 또는 혈전 부담도에 대한 과도한 항응고 효과), 약물 농도와 항응고 효과 사이의 비교적 양호하지 못한 상관관계, 광범위한 지혈 장애의 타협 (혈소판 성능, 혈관 완전성, 응고 다단계) 및 제한된 항응고제의 작용 컨트롤의 함수이다.
3개 이상의 임상 시나리오는 항혈전 또는 항응고 핵산 리간드의 활성을 역전시키는 능력이 요구된다는 것이다. 첫번째 경우는 항응고제 또는 항혈전 치료가 두개내 또는 소화관 출혈을 포함하는 출혈을 유도할 때이다. 동정시에, 더 안전한 표적 단백질은 이러한 위험을 줄이지만, 이러한 종류의 출혈 사상으로부터의 발병 또는 사망의 위험은 간과할 수는 없다. 두번째 경우는 항혈전 치료를 받는 환자에게 응급 수술이 요구될 때이다. 이러한 임상 증상은 GPIIb/IIIa 억제제의 범위하에서 경피 관상동맥 인터벤션을 행하는 동안에 응급 관상동맥 바이패스 그라프트 (CABG)을 요하는 일정 비율의 환자에게 일어난다. 이러한 증상에서의 현행 방식은2 내지 4 시간이 소요되는 화합물 (에프티피바티드 등의 소분자 길항제)의 처분을 행하거나, 혈소판 주입 (앱식시맵 (Abciximab) 치료용)을 행한다. 세번째 경우는 항응고 핵산 리간드가 심폐 바이패스 처치시에 사용될 때이다. 바이패스 환자는 수술후 출혈에 걸리기 쉽다. 각 경우에는 해독제 (예: 항응고제 또는 항혈전 핵산 리간드를 표적으로 하는 본 발명의 올리고뉴클레오티드 해독제)를 통한 화합물의 항응고 효과를 심하게 역전시킴으로써, 항응고 또는 항혈전 화합물의 더욱 안전하고 개선된 의학적 컨트롤을 할 수 있다.
본 발명자는 혈액 응고 캐스케이드의 단백질을 정확하게 조절하는 개선된 아프타머-해독제 쌍을 발견하였다. 일실시형태에 있어서, 본 발명의 해독제는 아프타머의 효과를 역전시키도록 본 발명의 아프타머 투여 후에, 이를 필요로 하는 포유동물에게 제공된다. 아프타머 및 아프타머-해독제 쌍은 최적 치료를 달성하는 방법에 있어서 의사의 진단은 물론, 환자의 경과를 포함하여, 각종 인자에 의거하여 필요에 따라 즉시 투여될 수 있다. 그리하여, 본 발명은 혈액 응고용 핵산 리간드 요법 시에 조절가능한 개선된 치료 요법을 개시한다.
수술을 받고 있는 개인은 또한 본 발명의 개선된 아프타머 및 해독제의 사용을 통해 일어나는 타겟 응고 조절을 필요로 한다. 특정한 실시형태에 있어서, 아프타머는 일반 외과 수술을 받고 있는 환자에게 투여된다. 특정한 다른 실시형태에 있어서, 아프타머는 관상동맥 심질환을 포함할 수 있는 심혈관 질환을 앓고 있는 환자에게 투여된다. 환자는 바이패스 수술 또는 경피 관상동맥 인터벤션을 포 함하는 치료를 받을 수 있다. 본 발명의 아프타머로 치료될 수 있는 포유동물은 또한 응고 요법을 요하는 신체 외상을 입은 환자를 포함할 수 있다.
환자의 수술전 평가에 의해, 약제 유발성, 후천성, 또는 유전성 혈액 응고 이상증을 식별할 수 있다. 항응고 요법에 주목할 점은 주술기 (perioperative period)에 관한 것이다. 주요 응고 장해를 치료하는데 있어서의 추가의 종종 간과되는 관리 전략은 혈액 성분에 있어서의 응고 인자의 비용 및 반감기를 고려하는데 있다. 출혈 예방은 응고 및 염증 과정의 컨트롤 조작에 의해 가능하게 된다. 또한, 환자 진단이 종종 어렵기 때문에, 본 발명의 조절가능한 개선된 아프타머 및 해독제 쌍은 특히 부정확한 진료의 경우에, 치료를 즉시 행할 수 않을 수 있다. 예를 들면, 심근 경색 증상은 급성 관상동맥 해리 증상을 꼭 그대로 모방할 수 있다 (참조문헌: Scarabeo et al. (2002) Italian Heart Journal 3: 490-494). 심근 경색 진단은 즉시 항응고제를 요하는데, 급성 관상동맥 해리에서는 반대의 징조를 나타낸다. 본 명세서에 기재된 개선된 아프타머-해독제 쌍을 사용하여, 의료 관계자에 의한 실수를 용이하게 역전시킬 수 있다.
발작에서의 혈관 개방을 회복하는 약제도 뇌출혈 (ICH)의 위험을 증대시킨다. 인자 IXa가 응고의 내인성 경로의 중요한 매개자이기 때문에, 목적으로 하는 인자 IXa 의존성 응고 억제는 ICH를 제한하는 외인성 지혈 메카니즘을 손상시키지 않고서 발작시의 미소혈관 혈전증을 억제할 수 있다. 본 발명의 개선된 아프타머 및 해독제는 심혈관 질환 및 외과 수술과 관련된 발작을 억제시키는데 사용될 수 있다.
투여:
조직의 심혈관 질환을 치료하기 위한 방법은 심혈관 질환이 발생하거나, 발생할 위험이 있는 조직을, 해독제의 투여에 의해 아프타머의 효과를 역전시키도록 개선된 해독제를 제공할뿐만 아니라, 응고 인자를 결합할 수 있는 개선된 아프타머의 치료학적 유효량을 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 고려한다. 그리하여, 이 방법은 해독제의 투여에 의해 아프타머의 효과를 역전시키도록 해독제를 제공하는 방법뿐만 아니라, RNA 아프타머를 함유하는 생리학적으로 허용가능한 조성물의 치료학적 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
해독제 투여 용량 범위는 해독제의 형태에 의존하고, 의사 또는 다른 의료 관계자에 의해 산정될 수 있다. 일반적으로, 용량은 환자의 연령, 상태, 성별 및 병의 정도에 따라 다르며, 당해 기술분야의 전문가에 의해 결정될 수 있다. 합병증인 경우에 개인 의사도 용량을 조정할 수 있다.
일반적으로, 치료학적 유효량은 핵산 리간드의 효과의 측정가능한 조절을 행하는데 충분한 해독제의 양으로 응고 조절 양 또는 염증조절 양을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 개선된 아프타머의 바람직한 투여 방식은 비경구, 정맥내, 피내, 관절내, 활액낭내, 지주막하, 동맥내, 심장내, 근육내, 피하, 안와내, 낭내, 척수강내, 흉골내, 국소, 경피 패치, 직장, 질 또는 요도 좌약, 복막, 경피, 비강 스프레이, 수술에 의한 이식, 인터널 서지컬 페인트 (internal surgical paint), 수액 펌프 또는 카테터를 통해서이다. 일실시형태에 있어서, 약제 및 담체는 임플란트, 큰 환약, 미립자, 미소구, 나노입자 또는 나노구 등의 서방 제제로 투여된다.
본 발명의 해독제는 바람직하게는 장기에 걸쳐서 주사 또는 점진적 주입에 의해 비경구적으로 투여될 수 있다. 치료할 조직이 전신 투여에 의해 통상 체내에서 발작될 수 있어서, 대부분의 경우에 치료 조성물의 정맥내 투여에 의해 치료될 수 있지만, 표적으로 하는 조직이 표적 분자를 함유할 가능성이 있는 다른 조직 및 전달 기술이 제공된다. 그리하여, 본 발명의 해독제는 통상적으로 경구 투여, 혈관 조직에 국소 투여, 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 강내 투여, 경피 투여될 수 있고, 연동 기술에 의해 전달될 수 있다. 상술한 바와 같이, 약제학적 조성물은 경구적으로, 혈관 조직에 국소적으로, 정맥내로, 복강내로, 근육내로, 피하로, 강내, 경피적으로 등의 다양한 경로에 의해 개인에게 제공되어, 연동 기술에 의해 전달될 수 있다. 혈관 조직으로의 국소 투여에 대한 대표적인 비제한적인 방법은 (1) 예를 들면, 제거 또는 바이패스되는 손상 또는 병변 혈관 조직편 대신에 코팅되거나 함침된 혈관을 이식함으로써, 혈관 조직을 생체내에서 전달을 위해 핵산 리간드를 포함하는 겔로 코팅하거나 함침시키고; (2) 카테터에 의해 전달을 요하는 혈관에 전달하며; (3) 환자에게 이식되는 혈관으로 핵산 리간드 조성물을 펌프하는 것을 포함한다. 또는, 핵산 리간드는 마이크로인젝션 또는 리포솜 캡슐화에 의해 세포내로 도입될 수 있다. 유리하게는, 본 발명의 핵산 리간드는 1일 1회 용량으로 투여될 수 있고, 또는 전체 1일 복용량을 수회로 분할하여 투여될 수 있다. 그 후에, 해독제는 해독제의 투여에 의해 핵산 리간드의 효과를 변화시키도록 적절한 수단에 의해 제공된다.
조성물:
본 발명의 아프타머 및 해독제는 개선된 아프타머, 해독제 또는 모듈레이터, 및 약제학적으로 허용가능한 담체 이외에도, 희석제 또는 부형제를 함유할 수 있는 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 조성물의 정확한 성상은 적어도 부분적으로 개선된 아프타머 및 해독제의 성상 및 투여 경로에 따를 것이다. 최적 투여 방식은 당해 기술분야의 전문가에 의해 용이하게 확증되어, 개선된 아프타머, 해독제 조합, 환자 및 원하는 효과에 따라 변화할 수 있다.
제제 처방에 관한 표준 정보는 문헌에 기재되어 있다 (참조 문헌: Ansel, et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Sixth Edition, Williams & Wilkins, 1995). 본 발명의 아프타머 및 해독제를 포함하는 치료 조성물은 예를 들면, 단위 용량의 주사와 같이, 통상적으로 정맥내 투여된다. 용어 "단위 용량"은 본 발명의 치료 조성물에 관련하여 사용되는 경우에는 대상에게 단위 용량으로서 적합한 신체상 개별 단위를 말하며, 각 단위는 필요한 희석제 (즉, 담체 또는 비히클)와 관련하여 원하는 치료 효과를 얻도록 계산된 소정량의 활성물질을 함유한다.
조성물은 용량 처방과 적합한 방식으로 치료학적 유효량으로 투여된다. 투여량은 치료 대상, 활성 성분을 이용하기 위한 대상 시스템의 용량 및 원하는 치료 효과 정도에 따라 다르다. 투여에 필요한 활성성분의 정확한 양은 전문가의 판단에 따르며, 각 개인에게 따라 특유하다. 그러나, 전신 투여에 적합한 용량 범위는 본 명세서에 개시되며, 투여 경로에 따라 다르다. 적절한 투여 방법도 가변적이 나, 전형적으로 초기 투여에 이어서, 후속 주입 또는 다른 투여에 의해 1시간 이상의 간격으로 반복 투여된다. 또는, 생체내 치료에 지정된 범위로 혈액 농도를 유지하기에 충분한 연속 정맥내 주사가 고려된다.
본 발명의 아프타머 또는 해독제를 포함하는 약제학적으로 유용한 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체의 혼합 등의 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 이러한 담체 및 제형화 방법의 예는 문헌 (참조: Remington's Pharmaceutical Sciences)에서 발견될 수 있다. 효과적인 투여에 적합한 약제학적으로 허용가능한 조성물을 얻기 위해서는, 이러한 조성물은 유효량의 아프타머를 함유할 것이다. 이러한 조성물은 하나 이상의 아프타머 또는 해독제의 혼합물을 함유할 수 있다.
본 발명의 개선된 아프타머의 유효량은 개인의 상태, 체중, 성별 및 연령 등의 각종 인자에 따라 변화할 수 있다. 다른 인자로는 투여 방식을 포함한다. 일반적으로, 조성물은 체중에 따라 조절된 용량, 예를 들면 약 0.1 mg/kg 체중 내지 약 100 mg/kg 체중의 범위의 용량으로 투여될 것이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 용량은 약 0.5 mg/kg 체중 내지 50 mg/kg 체중이다. 구체적인 실시형태에 있어서, 용량은 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 및 1 mg/kg 체중 사이의 용량이다. 구체적인 용량 단위는 1 ng 내지 1 g의 범위일 수 있으나, 보다 통상적으로 약 0.01 ㎍, 0.1 ㎍, 1 ㎍, 10 ㎍, 100 ㎍, 500 ㎍ 또는 1 g이거나, 이들 사이의 양이다.
환자에게 전달될 항체의 유효량은 개인의 상태, 체중, 성별, 연령 및 투여되는 핵산 리간드의 양 등의 각종 인자에 따라 다를 것이다. 일실시형태에 있어 서, 해독제는 0.5 내지 50 mg/kg의 범위이다. 또 하나의 실시형태에 있어서, 전달되는 해독제는 0.5 내지 10, 0.5 내지 5, 1 내지 10 또는 1 내지 5 mg/kg이다. 일반적으로, 전달되는 해독제는 전달되는 아프타머의 양의 이상이다. 전형적으로, 해독제의 양은 아프타머의 양의 약 1 내지 약 20배이다. 특정 실시형태에 있어서는, 해독제는 환자에게 전달되는 아프타머 양의 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10배이다.
약제학적 조성물 중의 아프타머와 해독제의 조합물은 치료학적 유효량, 즉 응고 조절 반응을 일으키는데 충분한 양, 또는 예방적 유효량, 즉 응고 인자가 응고 캐스케이드에서 작용하는 것을 방지하는데 충분한 양으로 투여된다. 치료학적 유효량 및 예방적 유효량은 모듈레이터에 따라 변화할 수 있다. 약제학적 조성물은 1회 또는 반복 투여될 수 있다.
개선된 해독제의 활성이 지속적이므로, 일단 해독제에 의해 원하는 정도의 핵산 리간드 조절이 달성되면, 해독제의 주입이 종료될 수 있고, 잔존 해독제가 사람이나 동물을 치료할 수 있다. 이 때문에, 필요에 따라 핵산 리간드로 계속해서 재치료할 수 있다. 또는, 본 발명의 해독제의 특성이성을 고려하여, 후속 치료는 제2의 다른 개선된 아프타머/해독제 쌍의 사용을 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 방법에 따라 합성되거나 동정되는 해독제는 잠재적인 독성을 최소화하면서, 응고에 있어서의 핵산 리간드 활성의 최적 조절을 얻도록 일상적인 테스트에 의해 규정된 적정 용량으로 단독으로 사용될 수 있다. 또한, 다른 약제의 동시 투여 또는 연속 투여가 바람직할 수 있다. 하나 이상의 활성물질에 의한 조합 치료에 관해서는, 활성물질이 개별 용량 제제인 경우에는, 활성물질은 동시에 또는 별개로 서로 교체적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 개선된 아프타머 및 해독제를 이용하는 용법은 환자의 타입, 인종, 연령, 체중, 성별 및 병상을 포함하는 인자; 치료 상태의 중증도; 투여 경로; 환자의 신장 기능 및 간기능; 및 사용되는 특수 조합에 따라 선택된다. 통상의 기량을 갖는 의사는 병상의 진행을 저지하는데 필요한 아프타머의 유효량을 용이하게 결정하여 처방할 수 있다. 독성없이 효능을 산출하는 범위내의 조합의 농도를 달성하는데 있어서의 최적 정확도는 표적 부위에 대한 아프타머 및 해독제의 이용가능성의 동태를 기초로 한 처방을 요한다. 이는 모듈레이터의 분배, 평형 및 제거를 고려한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상세히 기재된 조합물은 활성성분을 형성할 수 있고, 전형적으로 목적으로 하는 투여 형태, 즉 경구용 정제, 캡슐, 엘릭시르, 시럽, 좌약, 겔 등에 관하여 적절히 선택되고 통상적인 약무에 일치하는 적절한 약제학적 희석제, 부형제 또는 담체 (총괄하여 "담체" 물질이라 칭한다)와 혼합하여 투여된다.
예를 들면, 정제 또는 캡슐 형태의 경구 투여에 관해서는, 활성 약제 성분은 에탄올, 글리세롤 및 물 등의 경구용 비독성의 약제학적으로 허용가능한 불활성 담체와 조합될 수 있다. 또한, 경우에 따라, 적절한 결합제, 윤활제, 붕괴제 및 착색제가 또한 혼합물에 혼입될 수 있다. 적절한 결합제로는 전분, 젤라틴, 글루코스 또는 베타 락토스 등의 천연당, 감미료, 아카시아, 트래거켄스 또는 알긴산나트륨 등의 천연 및 합성 검, 카복시메틸셀룰로스, 폴리에틸렌글리콜 및 왁스를 들 수 있고, 이들에 한정되지 않는다. 이들 투약 형태에 사용되는 윤활제로는 올레인산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨 및 염화나트륨을 들 수 있고, 이들에 한정되지 않는다. 붕괴제는 전분, 메틸 셀룰로스, 한천, 벤토나이트 및 크산탄 검을 들 수 있고, 이들에 한정되지 않는다.
액체 형태로는, 활성 약제 성분은 예를 들면 트래거켄스, 아카시아 및 메틸셀룰로스의 합성 및 천연 검 등의 적절히 풍미가 가해진 현탁제 또는 분산제에 조합될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 분산제로는 글리세린을 들 수 있다. 비경구 투여에 관해서는, 멸균 현탁액 및 멸균 용액이 요구된다. 일반적으로 적절한 방부제를 함유하는 등장제는 정맥내 투여를 요할 때에 사용된다.
활성 약제 성분을 함유하는 국소용 제제는 예를 들면, 알콜성 용액, 국소용 세제, 클린싱 크림, 스킨 겔, 스킨 로션, 및 크림 또는 겔 제형의 샴푸를 제조하기 위해, 알콜, 알로에 베라 겔, 알란토인, 글리세린, 비타민 A 및 E 오일, 광유, PPG2 미리스틸프로피오네이트 등의 당해 기술분야에 공지된 각종 담체 물질과 혼합될 수 있다.
본 발명의 아프타머 및 해독제는 또한 작은 단층 베시클 (vesicle), 큰 단층 베시클 및 다층 베시클 등의 리포솜 전달 시스템의 형태로 투여될 수 있다. 리포솜은 콜레스테롤, 스테아릴아민 또는 포스파티딜콜린 등의 각종 인지질로 형성될 수 있다.
본 발명의 아프타머 및 해독제는 또한 표적가능한 약제 담체로서 가용성 폴 리머와 결합될 수 있다. 이러한 폴리머로는 폴리비닐피롤리돈, 피란 공중합체, 폴리히드록시프로필메타크릴아미드페놀, 폴리히드록시에틸아스파르타미드페놀, 또는 팔미토일 잔기로 치환된 폴리에틸렌옥시드폴리리신을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 아프타머 및 해독제는 약제의 방출 제어를 달성하는데 유용한 생분해성 폴리머 부류, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 폴리락트산, 폴리엡실론카프로락톤, 폴리히드록시부티르산, 폴리오르토에스테르, 폴리아세탈, 폴리디히드로피란, 폴리시아노아크릴레이트 및 히드로겔의 가교 또는 양친매성 블록 공중합체에 결합 (바람직하게는 공유 결합을 통해)될 수 있다. 콜레스테롤 및 유사 분자는 생체이용성을 증가하여 연장하도록 아프타머에 결합될 수 있다.
본 발명의 특정 실시형태에 있어서, 복합체는 리포솜의 표면과 결합된 표적 핵산 리간드(들)를 갖는 리포솜 및 캡슐형 치료제 또는 진단제를 포함한다. 미리 형성된 리포솜은 핵산 리간드와 결합하도록 변형될 수 있다. 예를 들면, 양이온성 리포솜은 정전상호작용을 통해 핵산 리간드와 결합한다. 또는, 콜레스테롤 등의 지용성 화합물에 결합된 핵산은 미리 형성된 리포솜에 가해지고, 이것에 의해 콜레스테롤이 리포솜막과 결합하게 된다. 또는, 핵산은 리포솜의 제형화시에 리포솜과 결합될 수 있다. 바람직하게는, 핵산은 미리 형성된 리포솜에 의해 리포솜과 결합된다.
본 발명의 특정한 측면은 하기의 비제한적인 실시예에서 더욱 상세히 설명될 수 있다.
(실시예)
응고용 아프타머의 테스트:
하기의 테스트는 응고 인자를 억제하는 변형된 아프타머 및 해독제의 능력을 평가하기 위해 이용된다.
활성화 응고 시간 테스트 (ACT)는 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (APTT) 테스트와 유사한 스크리닝 검사이나, 신선한 전혈 샘플을 이용하여 행해진다. ACT는 고용량의 헤파린 (예: CPB 및 PTCA) 투여를 포함하는 등의 응고 상태 임상진단법과 관련하여, 환자의 응고 상태를 모니터할 수 있다.
활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 테스트 (APTT)는 자동 혈액응고측정기, 예를 들면 STA 혈액응고측정기 (MDA/96/23; Diagnostica Stago 제), 또는 이 회사 제품의 다른 혈액응고측정기 또는 당해 기술분야에 공지된 다른 측정기를 이용하여 보통 행해지는 통상적인 중앙 검사 테스트이다. 이 테스트는 혈장 샘플을 이용하여 행해지는데, 내인성 경로가 인지질, 활성제 (엘라그산, 카올린 또는 미분 실리카) 및 Ca2 +의 첨가에 의해 활성화된다.
출혈 시간 테스트는 지혈 장해, 폰 빌레브란드 병 (von Willebrand's disease) 및 혈관 장해의 진단에 사용될 수 있다. 이는 또한 수술하기 전에 혈소판 이상을 스크린하도록 사용될 수 있다. 이 테스트는 팔뚝에 작은 절개 자국을 내고 상처 부위로부터 혈액을 제거함으로써 행해진다. 출혈이 멈추는데 걸리는 시간을 기록하는데, 규제 대상에 있어서는 약 3.5분간이다. 출혈 시간 연장은 질적 또는 양적 혈소판 결함을 나타낸다.
1935년에 퀵 (Quick)에 의해 처음으로 기술되었던 프로트롬빈 시간 테스트 (PT)는 혈액 또는 혈장의 조직 인자 유도 응고시간을 측정한다. 이는 외인성 응고 경로의 완전성을 평가하도록 스크리닝 검사로서 이용되고, 응고 인자 I, II, V, VII, 및 X에 민감하다. 이 테스트는 트롬보플라스틴 및 Ca2 +를 환자 샘플에 첨가하여, 혈전 형성에 대한 시간을 측정함으로써 행해질 수 있다. 연장된 응고 시간은 외인성 경로의 하나 이상의 응고 인자에 대한 억제제의 존재 또는 하나 이상의 응고 인자 결핍을 말해준다. 그러나, PT 응고 시간은 또한 와파린 요법시의 환자 또는 비타민 K 결핍 또는 간기능 장해 환자에게 연장될 수 있다. PT 테스트는 외인성 응고 경로의 평가를 제공할 수 있고, 경구 항응고 요법을 모니터하는데 널리 사용된다.
트롬빈 응고 시간 테스트 (TCT)는 정상적인 혈장 컨트롤 속도와 비교한 환자의 혈전 형성 속도를 측정한다. 이 테스트는 표준 양의 트롬빈을, 혈소판이 격감된 환자의 혈장에 첨가하여, 혈전 형성에 요하는 시간을 측정함으로써 행해질 수 있다. 이 테스트는 파종성 혈관 응고 증후군 (DIC) 및 간질환의 진단에 있어서의 보조자로서 사용되어 왔다.
또한 환자의 응고 상태의 진단시에 사용될 수 있는 다수의 테스트가 있다. 이들은 2개의 카테고리로 분류된다: 복합 테스트, 몇가지는 상술한 스크리닝 검사 및 면역학적 검정에 기초한 것이다. 복합 테스트는 APTT, PT, 및 TCT 테스트 등의 임상 검사에 기초한 특이적 인자 검사를 포함한다. 하나의 검사는 활성화 인자 IXa 또는 인자 IXa-항트롬빈 III 복합체의 레벨을 측정한다. 이들 측정은 인자 IXa 또는 인자 VII-조직 매개 복합체의 레벨을 측정하는데 사용된다. 활성화 단백 질 C 내성, 항트롬빈, 단백질 C 결핍 및 단백질 S 결핍에 대한 분석은 또한 이 그룹의 일부이다. 단백질 C 및 S의 헤테로성 (heterogeneous) 결핍 및 활성화 단백질 C에 대한 내성을 갖는 무증상자는 대조군과 비교하여, 상당히 상승된 프로트롬빈 단편 F1.2의 레벨을 갖는다.
실시예 1: 섹터의 2'-히드록실 당의 2'-O-메틸로의 치환
2'-히드록실 퓨린은 퓨린 잔기가 존재하는 4개의 이차 구조 단위에서 2'-O-메틸 퓨린으로 치환되었다: 스템 1 (Apt 1); 루프 1 (Apt 2); 스템 2 (Apt 3); 루프 2 (Apt 4) (도 1a 참조).
절차: AptA 유도체 Apt 1-5의 항응고 활성은 1 μM 내지 저 나노몰 범위의 화합물 농도에 대한 표준 APTT 응고 분석으로 평가되었다 (도 2). Apt 1-5의 "중화능"은 5 μM 이하의 범위의 AptA 해독제 농도에 대한 표준 APTT 해독제 분석 (AptA AD; 서열 목록 참조)으로 평가되었다 (도 2). 이들 분석에 있어서, AptA 및 유도체의 농도는 125 nM로 고정되었다.
Apt 4는 항응고 활성의 획득을 나타내고 (도 2); Apt 1-3은 활성의 중정도의 손실을 나타내며; Apt 5는 활성의 격심한 손실을 나타냈다. Apt 1-3은 향상된 중화를 나타내는데, 이는 해독제 결합 부위 내로의 2'-O-메틸 잔기의 도입이 아프타머에 결합하는 해독제 올리고뉴클레오티드의 능력을 향상시킨다는 것을 나타낸다.
서열 목록:
Figure 112006085711327-PCT00006
Figure 112006085711327-PCT00007
"Length": 길이; "sequence": 서열; "SEQ ID NO:": 서열번호
"A": 2'OH 아데닌; "a": 2'-O-메틸 아데닌; "G": 2'OH 구아닌; "g": 2'-O-메틸 구아닌; "C": 2'플루오로-시티딘; "c": 2'-O-메틸 시티딘; "U": 2'플루오로-우리딘; "u": 2'- O-메틸 우리딘; "T": 역 2'H 티미딘.
실시예 2: 스템 1 변형
스템 1 변이체의 2개의 "패밀리"가 디자인되었다 (Apt 6-8 및 9-11; 도 1b). 이는 4, 5, 및 6개의 염기쌍 스템으로 구성된다. 모든 구성체는 Apt-2 백그라운드로 디자인되었다. 스템 1 서열은 해독제가 최소 이차 구조를 포함하도록 이것에 대한 상보 해독제 올리고뉴클레오티드를 디자인하는 능력 및 적절한 이차 구조를 가정하는 아프타머의 능력에 대하여 평가되었다.
스템은 완전히 2'-O-메틸 변형되었다. 해독제 올리고뉴클레오티드는 AptA AD와 동일한 레지스터에서 각각의 표적 아프타머에 결합하는 Apt 6-11에 특이적으로 디자인되었다 (이하의 서열 목록 참조).
실험: Apt 6-11의 항응고 활성은 1 μM 내지 저 나노몰 범위의 화합물 농도에 대한 표준 APTT 응고 분석으로 평가되었다. Apt 6-11의 해독제 컨트롤은 5 μM 이하의 범위의 AptA 해독제 농도에 대한 표준 APTT 해독제 분석으로 평가되었다. 이들 분석에 있어서, Apt 2, 및 Apt 6-11의 농도는 250 nM (표준 AptA 및 Apt 2 실험에 관한 125 nM과는 대조적으로)로 고정되었다.
Apt 6-8은 항응고 활성 손실을 나타내나 (도 3), 모두 유사한 활성 레벨을 나타낸다. 그리하여, 스템 길이는 활성 손실의 주원인이 아니다. 5개의 염기쌍 스템 1 구성체 (Apt 10 및 Apt 7)는 Apt 2보다 훨씬 더 중화능을 갖는 것으로 나타난다 (도 3 및 4). 데이터는 5개의 염기쌍으로 된 스템 1은 해독제 중화를 향상시키기에 4, 6 또는 7개의 염기쌍으로 구성되는 것보다 바람직하다는 것을 보여준다.
서열 목록:
Figure 112006085711327-PCT00008
"Length": 길이; "SEQ ID NO:": 서열번호
"A": 2'OH 아데닌; "a": 2'-O-메틸 아데닌; "G": 2'OH 구아닌; "g": 2'-O-메틸 구아닌; "C": 2'플루오로-시티딘; "c": 2'-O-메틸 시티딘; "U": 2'플루오로-우리딘; "u": 2'- O-메틸 우리딘; "T": 역 2'H 티미딘.
실시예 3: 스템 1 당화학
Apt 12-17의 항응고 활성은 1 μM 내지 저 나노몰 범위의 화합물 농도에 대한 표준 APTT 응고 분석으로 평가되었다. Apt 12-17의 "중화능"은 5 μM 이하의 범위의 해독제 농도에 대한 표준 APTT 해독제 분석으로 평가되었다. Apt 12, 14, 15, 및 16에 관해서는 아프타머 농도가 이들 분석에서 125 nM로 고정되었고, Apt 13 및 17에 관해서는 아프타머 농도가 250 nM로 고정되었다.
Apt 12와 Apt 13 및 Apt 17의 항응고 활성의 비교 (도 5)로부터, Apt 6-11에 관찰된 활성 손실이 하나 이상의 필수 잔기에서의 2'-O-메틸 치환의 존재로 인한 것임을 입증한다. Apt 12에 대한 Apt 14의 항응고 활성의 비교는 항응고 활성에 대한 큰 영향을 끼치지 않고 스템 1 내의 4개의 연속 구아노신 스트레치가 변경될 수 있다는 것을 나타낸다. Apt 15 및 16과 Apt 2, 12 및 17의 비교는 a) 스템 1 의 상부의 폐쇄 A-U 쌍을 제외하고는 스템 1 내의 각 위치에서의 2'-O-메틸 당의 존재가 활성을 향상시킨다는 것을 입증하고, b) 이 염기쌍의 U 당이 효능을 보유하도록 아프타머에 대하여 2'-플루오로이어야 한다는 것을 입증하며, c) 이 염기쌍의 A 당이 항응고 활성에 대한 큰 영향을 주지 않는 2'-O-메틸 당일 수 있다. 실제로, Apt 16은 실질적으로 완전 효능을 보유한다.
Apt 14-16과 Apt 14/AD의 중화에 대한 비교는 2본쇄의 2개의 쇄가 주로 2'-0-메틸 잔기를 포함할 때와는 대조적으로, 스템 1이 2'-O-메틸-2'플루오로 스템일 때에 해독제가 훨씬 더 용이하게 아프타머와 결합할 수 있는 것을 나타낸다. Apt 21은 스템 1의 상부의 A 당이 2'-O-메틸 치환되도록 설계되었다 (도 6). 이러한 아데노신 잔기에서의 2'-O-메틸 당의 치환은 주로 2'-O-메틸 스템의 백그라운드에서 충분히 허용된다 (도 6). Apt 21의 해독제 중화는 Apt 16에 비하여 향상된다 (특히, 도 4의 2.5:1 및 5:1 AD:약제 데이터 포인트 참조).
서열 목록:
Figure 112006085711327-PCT00009
Figure 112006085711327-PCT00010
"Length": 길이; "sequence": 서열; "SEQ ID NO:": 서열번호
"A": 2'OH 아데닌; "a": 2'-O-메틸 아데닌; "G": 2'OH 구아닌; "g": 2'-O-메틸 구아닌; "C": 2'플루오로-시티딘; "c": 2'-O-메틸 시티딘; "U": 2'플루오로-우리딘; "u": 2'- O-메틸 우리딘; "T": 역 2'H 티미딘.
실시예 4: 스템 1의 길이 감소
Apt 18-20의 항응고 활성은 1 μM 내지 저 나노몰 범위의 화합물 농도에 대 한 표준 APTT 응고 분석으로 평가되었다. Apt 18-20의 "중화능"은 5 μM 이하의 범위의 해독제 농도 (18-20에 대하여, 각각 해독제 6, 7 및 8)에 대한 표준 APTT 해독제 분석으로 평가되었다. 아프타머 농도는 이들 분석에서 125 nM로 고정되었다.
각각의 아프타머 (Apt 18-20)는 Apt 2와 같거나 더 강력한 것으로, 강력한 항응고제이다 (도 7). 또한, 이 3개는 이들 각각의 해독제 올리고뉴클레오티드에 의해 용이하게 중화된다. Apt 19는 페질레이트된 종류의 항응고 활성에 대하여 평가되었다. PEG Apt 19 및 대조용으로서의 PEG-Apt 16가 사용된다 (PEG는 고상 합성 시에 아프타머에 가해진 C6 아미노 링커에 대한 컨쥬게이션을 통해 5'말단에 부가되는 40KDa 폴리에틸렌글리콜 mPEG2-NHS 에스테르 (MW 40 kDa; Nektar/Shearwater 2Z3XOT01)이다). 도 8로부터, 스템 1의 길이는 40KDa PEG 부가가 AptA 및 AptA 유도체의 활성에 영향을 주는 것에 대해서는 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있다. PEG Apt 19 및 16의 항응고 활성은 실질적으로 모체 AptA 서열의 페질레이트된 (PEG AptA) 및 콜레스테롤로 변형된 (CH-AptA) 종류의 항응고 활성과 동일하다. 또한, Apt 19와 마찬가지로, PEG Apt 19는 이의 매치된 해독제 (7 AD)에 의해 AptA, Apt 16 또는 이들 화합물의 PEG 또는 콜레스테롤로 변형된 종류보다 훨씬 더 용이하게 중화된다. 도 8은 2.5:1의 AD:아프타머에서 PEG Apt 19의 약 90% 역전을 나타낸다. % 역전 기준 보다는 APTT가 절대적으로 상이하다는 것에 주목한다. PEG Apt 19 + 2.5:1 7AD:아프타머로 처리된 혈장의 APTT는 베이스라인보다 4 내지 5초 이상에 지나지 않다.
서열 목록:
Figure 112006085711327-PCT00011
"Length": 길이; "sequence": 서열; "SEQ ID NO:": 서열번호
"A": 2'OH 아데닌; "a": 2'-O-메틸 아데닌; "G": 2'OH 구아닌; "g": 2'-O-메틸 구아닌; "C": 2'플루오로-시티딘; "c": 2'-O-메틸 시티딘; "U": 2'플루오로-우리딘; "u": 2'- O-메틸 우리딘; "T": 역 2'H 티미딘; "P": mPEG2-NHS 에스테르 MW 40 kDa (Nektar/Shearwater 2Z3XOT01) ; "L": C6 아미노 링커
실시예 5: 스템 2 및 루프 2 치환
스템 2 및 루프 2에 있어서의 잔기에 대한 최적 당 조성물을 평가하는 2개 조의 변이체. Apt 16 백그라운드의 제 1 조. Apt 16 백그라운드의 제 2 조, 그러나 AptA에 발견된 헥사뉴클레오티드 루프를 FIXa 아프타머 9.20에 발견된 테트라루프 (Rusconi et al Nature 419, p.90-94, 2002 및 도 1 참조)로 치환. Apt 4에 대한 연구조사에 따르면, 루프 2 내의 2'-O-메틸 퓨린 치환으로 AptA 효능이 향상되 는 반면에, 스템 2의 2'-O-메틸 퓨린 치환으로 효능의 중간 정도의 손실을 가져오며, 2'-O-메틸 퓨린 스템 1과 관련하여, 스템 2 및 루프 2 내의 2'-O-메틸 퓨린의 동시 치환으로 AptA 효능의 상당한 감소를 가져온다는 것을 알 수 있다 (Apt 5). 따라서, 스템 2 (Apt 22, 26) 및 루프 2 (Apt 23, 27)에서 2'-O-메틸 퓨린을 독립적으로 치환한다 (도 9). 스템 2 및 루프 2 (Apt 24, Apt 28) 내에서 퓨린의 2'-O-메틸 치환이 완료되나, 스템 2의 베이스에서의 G가 2'히드록실이 이 위치에서 요구되는 경우에는 2'히드록실 (Apt 25, 29)로서 존재하는 것으로 재평가되었다.
Apt 22-29의 항응고 활성은 1 μM 내지 저 나노몰 범위의 화합물 농도에 대한 표준 APTT 응고 분석으로 평가되었다. Apt 22-29의 "중화능"은 5 μM 이하의 범위의 해독제 농도에 대한 표준 APTT 해독제 분석으로 평가되었다. 아프타머 농도는 아프타머 농도가 250 nM로 고정되는 Apt 24를 제외하고는 이들 분석에서 125 nM로 고정되었다.
Apt 3으로 사전에 관찰된 바와 같이, 루프 2 내의 2'-O-메틸 퓨린의 치환은 향상된 효능을 가져온다 (Apt 23, Apt 23을 16과 비교) (도 9). 마찬가지로, 스템 2로의 2'-O-메틸 퓨린의 치환은 중간 정도의 활성 손실을 가져온다 (Apt 22, 24) (도 14). Apt 24는 Apt 5보다 상당히 강력하다. 스템 2의 베이스에서의 G 잔기에 2'히드록실을 유지시키면 (Apt 25), Apt 24와 비교하여 향상된 활성을 가져오지 않는데, 이는 a) 이 잔기에서의 2'-O-메틸 당의 치환이 Apt 22 및 24 내에서 문제없고, b) 이 잔기의 당이 2'-O-메틸일 수 있다는 것을 나타낸다. AptA에 존재하는 헥사뉴클레오티드 루프를 9.20 테트라루프로 치환하면, 활성 손실을 가져온다 (Apt 26-29). Apt 23의 해독제 중화는 Apt 16에 비하여 감소되나, 여전히 AptA와 동등하다.
서열 목록:
Figure 112006085711327-PCT00012
"Length": 길이; "sequence": 서열; "SEQ ID NO:": 서열번호
실시예 6: 스템 2 당화학
Apt 30-33의 항응고 활성은 1 μM 내지 저 나노몰 범위의 화합물 농도에 대한 표준 APTT 응고 분석으로 평가되었다. Apt 30 및 33의 "중화능"은 5 μM 이하의 범위의 해독제 농도 (Apt 14 AD)에 대한 표준 APTT 해독제 분석으로 평가되었다. 아프타머 농도는 이들 분석에서 125 nM로 고정되었다 (도 10 참조).
Apt 31 및 32에 대한 Apt 30 및 33의 활성 비교로부터, C16이 2'플루오로 당 을, G25가 2'히드록실 당을 함유해야 한다는 것을 입증한다 (도 10a). Apt 31과 32 사이에 관찰된 활성은 스템 2 내의 잔존 위치가 2'-O-메틸 당을 함유할 수 있다는 것을 말해준다. 실제로, Apt 31은 Apt 32보다 약간 더 큰 효능을 갖는 것으로 나타나는데, 이는 C16에서의 2'플루오로, G25에서의 2'히드록실 및 잔류 잔기 2'-O-메틸을 갖는 화합물이 Apt 33보다 더 강력한 효능을 나타낼 것이라는 것을 보여준다. 그럼에도 불구하고, Apt 33은 Apt 2보다 더 큰 활성을 나타내고, 모체 AptA와 완전히 동등하다. Apt 33은 Apt 30보다 훨씬 더 용이하게 중화가능한데, 이는 아프타머의 해독제 결합 부위 내의 추가의 2'-O-메틸 잔기가 해독제 결합을 향상시킨다는 것을 나타낸다.
Apt 34는 2'-O-메틸보다는 2'플루오로를 포함하는 C16을 갖는다 (도 lOb). 항응고 활성이 증가된다 (Apt 34를 Apt 33과 비교). 그러나, 34가 90% 중화 (~5:1 대 10:1)를 달성하는데 모체 AptA 화합물보다 덜 과량의 해독제를 필요로 하지만, 치환에 의해 적은 "중화능"의 손실을 가져온다.
서열 목록:
Figure 112006085711327-PCT00013
"Length": 길이; "sequence": 서열; "SEQ ID NO:": 서열번호
실시예 7: 개별 염기 변형
Apt 35-39는 모체 AptA와 비교되었다 (AptA 스템 1에 기초하여 넘버링): 1) Apt 30 내지 31: 차이는 C16, G17, U24, G25, C26이다. 2) Apt 30 내지 32: 차이는 C16, G17, G25이다. 3) Apt 31 내지 32: 차이는 U24, C26이다.
Apt 35-39의 항응고 활성은 1 μM 내지 저 나노몰 범위의 화합물 농도에 대한 표준 APTT 응고 분석으로 평가되었다. Apt 35, 38 및 39의 "중화능"은 5 μM 이하의 범위의 해독제 농도 (Apt 7 AD)에 대한 표준 APTT 해독제 분석으로 평가되었다. 아프타머 농도는 이들 분석에서 125 nM로 고정되었다 (도 11).
Apt 35-39: Apt 39의 항응고 활성은 Apt 19 및 Apt 19 백그라운드에서의 모든 다른 스템 2 최적화 구성체보다 우수하다 (도 11). 결과는 Apt 34를 이용하여 얻어진 결과와 일치하였다. 또한, Apt 39의 효능은 모체 AptA에 상당하고 Apt 2보다 크다. Apt7AD 에 의한 Apt 39의 중화는 우수하고, Apt 19의 중화와 유사하다 (도 12). 게다가, Apt 39의 당 최적화 및 절단에 의해, 모체 AptA 및 Apt 2보다 더 적은 과잉량의 해독제:약제로 중화된 화합물을 산출하였다 (도 11).
서열 목록:
Figure 112006085711327-PCT00014
"Length": 길이; "sequence": 서열; "SEQ ID NO:": 서열번호
실시예 8: 비히클을 전달하기 위한 아프타머의 컨쥬게이션
테스트되는 항응고제는 6-탄소 NH2 링커를 통해 아프타머 서열의 5'말단에 컨쥬게이트된 40 KDa 폴리에틸렌글리콜 (PEG)을 갖는 Apt39이다 (PEG-Apt39). 해독제는 Apt7AD이다.
PEG-Apt39의 항응고 활성은 1 μM 내지 저 나노몰 범위의 화합물 농도에 대한 표준 APTT 응고 분석으로 평가되었다. Apt39의 항응고 활성은 모체 AptA의 2개의 제형, Apt S (5' 콜레스테롤 변형) 및 PEG-AptA (5' 40KDa PEG 변형)와 비교되었다. 이러한 연구조사에 있어서, "아프타머" 부분의 분자량 만을 사용하여, 각 화합물의 농도를 계산하였다. PEG-Apt39의 "중화능"은 5 μM 이하의 범위의 해독제 농도 (Apt7AD)에 대한 표준 APTT 해독제 분석으로 평가되었다. 아프타머 농도는 이들 분석에서 125 nM로 고정되었다).
PEG-Apt39의 시험관내 항응고 활성은 실질적으로 CH-AptA 및 PEG-AptA와 동등하다 (도 13).
생체내 연구:
본 연구는 a) 항응고 활성의 효능 및 내구성 및 b) 항응고 활성의 중화에 관하여 돼지의 PEG-Apt39의 생체내 항응고제 및 해독제 중화 활성을, CH-AptA를 이용하여 얻어진 이전의 데이터와 비교한다. 3개의 실험군 (각각에 대하여 n=2 동물)은 a) 전신 항응고; b) 전신 항응고 및 약제 중화; 및 c) 전신 항응고, 약제 중화 및 재항응고이다.
실험: 6마리의 신생 새끼 돼지 (1주령, 2.5 내지 3.5 kg)는 3개의 실험군에 임의로 배정되었다. 대퇴 동맥 및 정맥 라인을 새끼 돼지에게 배치하였다. 동맥 라인을 사용하여, 혈압 및 동맥혈 샘플링을 모니터하였다. 정맥 라인을 사용하여, 지정된 약제 및 테스트 화합물을 투여하였다. 새끼 돼지의 온도를 비인두 (nasopharyngeal) 온도 프로브로 모니터하였다.
PEG-Apt39의 용량은 각 동물에 대하여 0.5 mg/kg (핵산 성분의 분자량만을 기초로 한 아프타머의 용량; 10,103.2 Da)이었다. CH-AptA를 이용한 이전의 실험에 있어서, 아프타머 용량은 또한 0.5 mg/kg (핵산 성분의 분자량만을 기초로 한 아프타머의 용량)이었다. Apt7 AD가 해독제로서 사용된 실험에 있어서는, 해독제 용량은 3 mg/kg이었다. AptA AD가 사용된 CH-AptA를 이용한 실험과 비교하면, 해독제 용량은 5 mg/kg이었다.
a) 전신 항응고
PEG-Apt39를 주입하기 전에 미리 주입된 혈액 샘플을 취한 다음에, 약제를 주입하고 (주입 시간은 t=0이다) 혈액 샘플을 주입후 5, 15, 25, 60, 90, 120 및 150분 후에 제거하였다. 제조업자 지시에 의해 헤모크론 801 쥬니어 및 글래스 활성화 플립-톱 튜브 (glass-activated flip-top tube)를 이용하여 전혈에서 뽑아낸 혈액을 둘로 나눈 직후에, 활성화 응고 시간 (ACT's)을 그 위치에서 행하였다. 그 다음에, 혈액 샘플을 시트르산 바큐테이너 튜브 (citrated vacutainer tube)로 이송하여 얼음위에서 보관하였다. 혈소판 결핍 혈장을 준비하여, APTT 및 PT 분석을 표준 프로토콜로 행하였다 (도 14a).
PEG-Apt39의 생체내 항응고 효능은 CH-AptA보다 우수하다. 또한, 시간에 대한 항응고 활성의 손실은 CH-AptA와 비교하여 PEG-Apt39에 대하여 감소된다. 이들 결과는 시험관내 항응고 활성 연구와 대조적으로, 이는 PEG-Apt39 및 CH-AptA의 항응고 활성이 풀 (pooled) 사람 혈장의 시험관내에서 동등하다는 것을 입증한다.
b) 전신 항응고 및 약제 중화
PEG-Apt39를 주입하기 전에 미리 주입된 혈액 샘플을 취한 다음에, 약제를 주입하고 (0.5 mg/kg; 주입 시간은 t=0이다) 혈액 샘플을 약제 주입후 5 및 15분 후에 제거하였다. 약제 주입후 t=15분에서, REG1 S7 AD를 투여하고 (3 mg/kg) 추가 혈액 샘플을 약제 주입후 25, 60, 90, 120 및 150 분후에 제거하였다. 제조업자 지시에 의해 헤모크론 801 쥬니어 및 글래스 활성화 플립-톱 튜브를 이용하여 전혈에서 뽑아낸 혈액을 둘로 나눈 직후에, 활성화 응고 시간 (ACT's)을 그 위치에서 행하였다. 그 다음에, 혈액 샘플을 시트르산 바큐테이너 튜브로 이송하여 얼음 위에서 보관하였다. 혈소판 결핍 혈장을 준비하여, APTT 및 PT 분석을 표준 프로토콜로 행하였다.
실질적으로 PEG-Apt39의 항응고 활성의 완전한 중화는 3 mg/kg Apt7 AD의 투여후 10분 이내에 달성되었다. 항응고 활성은 나머지 실험을 통해 중화되었다 (약제 중화의 초기 실연 후 2시간 5분). 그리하여, PEG-Apt39의 중화는 PEG-Apt39의 유사한 중화 레벨이 해독제의 40% 이하의 용량으로 달성될 수 있기 때문에 (3 mg/kg Apt7 AD 대 5 mg/kg REG1 AD), CH-AptA의 중화보다 우수하다. 이러한 생체내 데이터는 PEG-Apt39가 AptA의 이전의 제형보다 매치된 해독제에 의해 훨씬 더 용이하게 중화되는 풀 사람 혈장의 시험관내 실험과 일치한다 (도 14b).
c) 전신 항응고, 약제 중화 및 재항응고
PEG-Apt39를 주입하기 전에 미리 주입된 혈액 샘플을 취한 다음에, 약제를 주입하고 (0.5 mg/kg; 주입 시간은 t=0이다) 혈액 샘플을 약제 주입후 5 및 15분 후에 제거하였다. 약제 주입후 t=15분에서, Apt7 AD를 투여하고 (3 mg/kg) 추가 혈액 샘플을 약제 주입후 25 및 40 분후에 제거하였다. 약제 주입후 t=45분에서 (30분후 해독제 투여), PEG-Apt39를 재투여하고 (0.5 mg/kg) 추가 혈액 샘플을 약제 주입후 50, 60, 90, 120 및 150분후에 제거하였다. 제조업자 지시에 의해 헤모크론 801 쥬니어 및 글래스 활성화 플립-톱 튜브를 이용하여 전혈에서 뽑아낸 혈액을 둘로 나눈 직후에, 활성화 응고 시간 (ACT's)을 그 위치에서 행하였다. 그 다음에, 혈액 샘플을 시트르산 바큐테이너 튜브로 이송하여 얼음위에서 보관하였다. 혈소판 결핍 혈장을 준비하여, APTT 및 PT 분석을 표준 프로토콜로 행하였다 (도 15).
토기 약제 용량의 중화에 이은 PEG-Apt39의 재투여는 중화하는 해독제의 투여후 30분 이내에 실현가능하다. 제 1 및 제 2 용량 투여 후에 달성된 항응고의 레벨은 서로 동등한 것으로 나타나는데, 이는 약제 용량의 제 2 투여시에 순환 혈액 중에 "유리" 해독제가 거의 잔존하지 않다는 것을 보여준다.
실시예 9: 혈장에서의 아프타머 복합체 제제의 정량화
혈장 중의 아프타머 레벨은 검출용 효소면역측정법 (ELISA)을 이용한 샌드위치형 하이브리다이제이션 분석을 이용하여 측정된다. 아프타머의 정량화는 2개의 올리고뉴클레오티드 프로브, DNA 포획 프로브 및 2'O메틸 RNA 검출 프로브를 이용한다. DNA 포획 프로브는 길이가 15개의 뉴클레오티드로, 아프타머의 3' 말단 15개의 뉴클레오티드와 상보적이고, 이의 5' 말단에 비오틴 부분을 포함하며, 이 프로브를 함유하는 올리고뉴클레오티드 복합체를 아비딘으로 코팅된 표면에 포획할 수 있다. 2'O메틸 RNA 검출 프로브는 또한 길이가 15개의 뉴클레오티드로, 해독제가 결합되는 아프타머의 일부와 상보적이고, 표준 효소 결합 형광 발생 효소/기질 시약을 사용하여 이 프로브를 함유하는 복합체를 검출할 수 있는 디곡시게닌 부분을 함유한다.
아프타머의 정량화는 혈장 중의 아프타머에 대한 포획 및 검출 프로브의 하이브리다이제이션 및 5' 비오틴기에 의해 뉴트라비딘으로 코팅된 마이크로타이터 플레이트의 표면에서의 복합체의 차후의 고정화에 의해 달성된다. 디곡시게닌으로 표식한 2'-O-메틸 RNA 프로브의 측정은 기질의 형광을 촉진시키는 알칼리성 포스파타아제와 컨쥬게이트된 안티디곡시게닌 항체를 이용하여 플레이트 고정화 반응 후에 행해진다. 그 다음에, 형광 강도를 측정하는데, 이의 시그널은 교정 표준물질 및 검정 샘플에 존재하는 아프타머의 양에 정비례한다.
필리핀 원숭이 혈장의 아프타머 Apt39 (서열번호 88)의 시험관내 항응고 활성은 APTT 분석에서의 시간 대 응고의 농도 의존성 연장에 의해 반영된다. 혈장 FIX 분석을 행하여, 원숭이 혈장의 Apt39 APTT 용량 반응 곡선을 해석하였다. 표 A에 나타낸 바와 같이, 원숭이 혈장의 APTT는 FIX 레벨에 민감하다. 그러나, FIX 레벨 감소에 대한 반응의 크기는 작다. FIX 레벨의 75% 감소로 APTT가 1.4배 증가되고, FIX 레벨의 >95% 감소로 APTT가 배가되며, 혈장 FIX 레벨의 99.9% 감소로 APTT가 2.5배 증가된다.
표 A: 필리핀 원숭이 혈장의 FIX 활성 분석 표준 곡선
% FIX 레벨 APTT 응고 시간 응고 시간 증가 배율
100* 35.1 1.0
50 41.9 1.2
25 49.4 1.4
12.5 55.9 1.6
6.25 62.2 1.8
3.13 68.0 1.9
1.56 74.7 2.1
0.78 77.7 2.2
0.39 83.8 2.4
0.098 88.1 2.5
*100% FIX 레벨은 완충액 중의 정상의 풀(pooled) 필리핀 원숭이 혈장의 1:5 희석을 나타낸다. 사람 FIX 결핍 혈장 (George King Biomedical)을 FIX 결핍 혈장의 공급원으로서 사용하였다.
표 A의 데이터로부터, 원숭이의 혈장 FIX 활성의 약 90%를 억제하는데 ~6 g/mL Apt39가 필요하고 (즉, 이 농도 APTT의 1.6배 증가를 가져온다), 혈장 FIX 활 성의 >95% 억제는 10 내지 12 ㎍/mL의 Apt39 농도에서 일어난다는 것을 알 수 있다.
필리핀 원숭이의 Apt39 및 Apt7AD의 생체내 활성:
Apt39 및 Apt39/Apt7AD 복합체의 항응혈성과 이들 화합물의 혈장 레벨 사이의 관계는 원숭이로 평가되었다. 간략하게, 12마리의 원숭이를 3개의 처리군에 할당하였다. 1군은 항 FIXa 아프타머 Apt39을 수용하고, 2군은 해독제 Apt7AD를 수용하며, 3군은 Apt39로 처리하고 3시간 후에 Apt7AD로 처리되었다. 용량은 2개의 양의 테스트 물질을 통해 단계적으로 증대되는데, 제 1 용량은 연구조사 4일째에 , 제 2 용량은 연구조사 13일째에 취해졌다. 아프타머에 대한 용량 반응을 용이하게 이해할 수 있도록, 1군에 할당된 4마리의 원숭이를 13일째에 2개의 군으로 세분되는데, 2마리는 저 용량 (la 군, 5 mg/kg), 또 2마리는 고용량 (1b 군, 30 mg/kg)을 투여했다.
도 16에 도시된 바와 같이, 5 내지 30 mg/kg 범위의 용량으로 Apt39를 투여한 결과, 원숭이가 최중도 (profound) 항응고 레벨을 나타냈다. 각 용량 레벨에서의 평균 APTT는 아프타머 투여후 0.25 내지 24 시간 후에 60초를 초과하는데, 이는 원숭이의 <0.1% 정상 혈장 FIX 레벨과 동등하다. Apt39 투여에 반응하여 용량 의존성 APTT 증가가 있다. 그러나, 용량 반응은 Apt39 투여후 6시간 시점까지, 아프타머 혈장 레벨이 시험관내 APTT 용량 반응 곡선이 플래토 (~40 내지 50 g/mL; 표 B 참조)에 이르는 농도를 초과한다는 점으로 인해 즉시 나타나지 않는다. 투여후 6시간을 초과하는 시간에서, 아프타머 농도가 이 레벨 이하로 감소하기 때문에, 용 량 반응이 훨씬 더 분명해진다. APTT는 5 및 15 mg/kg 용량을 투여한 원숭이의 베이스라인으로 복귀될 때까지 행해졌다. 평균 APTT는 5-mg/kg 용량 레벨에서 120시간, 15-mg/kg 용량 레벨에서 192 시간에서 베이스라인으로 복귀되고, 시험관내 APTT 용량 반응 곡선 (데이터 도시되지 않음) 및 관찰된 원숭이의 약 12시간의 반감기와 일치한다 (표 B 참조). 전혈 활성화 응고 시간 (ACT) 데이터는 APTT 데이터 (데이터 도시되지 않음)를 반영하였다.
1a 군 동물에서의 투여후 24 시간 후의 평균 Apt39 농도와 이들 동물의 평균APTT는 상당히 일치한다. 24 시간에서 5 mg/kg로 처리된 동물의 평균 아프타머 농도는 15.9 ㎍/mL이고, 평균 APTT는 61.1 초이었다.
표 B: 1군 Apt39 혈장 레벨 (㎍/mL)
주입후 시간 (hours) 1군 용량 레벨 (동물/용량 레벨)
5 mg/kg (n=2)* 15 mg/kg (n=4) 30 mg/kg (n=2)*
투약 전 0.2 <0.04 0.2
0.25 59.8 179.8 ± 28.9 465.5
3 66.6 145.6 ± 32.5 328.9
6 42.1 101.5 ± 13.4 275.3
24 15.9 51.1 ± 11.2 164.6
*13일째의 투약에 관해서는, 동물을 1a 군 (5 mg/kg) 및 1b 군 (30 mg/kg)으로 분할하였다. 이들 용량 레벨에 관해서는, 용량 레벨 당 2개의 군의 동물에 대한 평균 혈장 레벨이 보고되어 있다. 투약 전 시점에서의 1a 군 및 1b 군 동물에 존재하는 Apt 39는 4일째의 15 mg/kg 용량의 잔류 Apt 39이다. 분석의 LLOQ는 <0.04 ㎍/mL이다.
해독제 만으로 처리된 2군의 동물에 있어서, 평균 APTT 및 ACT는 테스트된 각 용량 레벨 (30 및 60 mg/kg)에서의 해독제 투여에 의해 영향을 받지 않았다. 톡시코키네틱 (toxicokinetic) 데이터를, 투여후 처음 24시간에 대하여 여러 시점에서 수집하였다. 표 C에 도시된 바와 같이, 4일째에 30 mg/kg 또는 13일째에 60 mg/kg을 주입한 후 0.25 시간에서 해독제를 복용하는 동물의 혈장에, 낮지만 측정 가능한 레벨의 해독제가 존재하였다. 해독제의 투약 후 레벨은 정맥 주사 후의 아프타머 (1군)의 농도에 비해 매우 낮았다.
표 C: 2군 Apt7AD 혈장 레벨 (㎍/mL)
Apt39 주입후 시간 (hours) 2군 용량 레벨 (4마리의 동물/용량)
30 mg/kg 60 mg/kg
투약 전 <0.01 <0.01
3.25 0.4 ± 0.1 0.6 ± 0.5
6 0.02 ± 0.01* <0.02***
24 0.01 ± 0.01** 0.01***
* 0.01의 <LLOQ에서의 1마리의 동물이 계산에 포함됨. ** 0.01의 <LLOQ에서의 3마리의 동물이 계산에 포함됨. *** LLOQ의 평균
아프타머로 처리된 후 3시간 후에 해독제로 처리된 동물 (3군)의 APTT 데이터는 도 17에 도시된다. 아프타머 만으로 처리된 동물의 데이터에 따르면, 이들 용량 레벨의 아프타머를 투여한 결과, 최중도의 항응고 레벨을 산출하였고, 투여후 0.25 및 3시간에서의 평균 APTT는 2개의 용량 레벨에서 실질적으로 완전한 FIX 억제와 일치한다. 이어서, Apt7AD를 투여한 결과, 원숭이의 Apt39의 항응고 효과를 신속하게 완전히 중화시켰고, 평균 APTT는 Apt7AD 투여후 15분 이내에 베이스라인으로 복귀되었다. 30/60 mg/kg Apt39/Apt7AD로 처리된 3군 동물에 있어서, APTT는 아프타머 투여후 5일간 행해졌다. 이 기간에 걸쳐서 수집된 APTT 데이터는 아프타머의 항응고 효과가 내구적으로 중화되고, 120시간 또는 원숭이의 아프타머의 약 10 반감기에 걸쳐서 리바운드 항응고 증거가 없다는 것을 나타낸다 (도 17).
톡시코키네틱 데이터를, 3군 동물에서의 Apt39 투여후 24시간 동안 수집하였다 (표 D). 3군 동물에 대해서는, 유리 아프타머 및 복합 아프타머 혈장 농도를 측정하였다. 해독제 투여후 15분 이내에, 유리 아프타머의 평균 농도는 이용된 분 석의 최저정량한계 (LLOQ) 이하의 레벨에 대하여 5,000 내지 10,000배 감소되었다. 유리 아프타머 레벨의 감소와 동시에, 복합 아프타머의 평균 혈장 농도는 각각 15/30 및 30/60 mg/kg 용량 레벨에서 분석의 LLOQ 이하로부터 ~125 내지 220 ㎍/mL로 증가되었는데, 이는 유리 Apt39 농도의 급속한 감소가 Apt7AD의 결합으로 인한 것임을 나타낸다. 유리 아프타머의 농도는 해독제 투여 후 3시간이면 분석의 LLOQ 이하로 되는데, APTT 결과와 일치한다. 해독제 투여 후 21시간에서, 매우 낮은 레벨의 Apt39가 여러 마리의 동물에게서 검출가능했다 (0.17 g/mL 이하에 지나지 않는 평균).
표 D: 3군 유리 및 복합 Apt389 혈장 레벨 (㎍/mL)
Apt39 주입후 시간 (hours) 3군 용량 레벨
15/30 mg/kg Apt39+Apt7AD 30/60 mg/kg Apt39+Apt7AD
유리 Apt39 복합 Apt39 유리 Apt39 복합 Apt39
투약 전 <0.04 ND 0.05 ± 0.01 ND
0.25 280.2 ± 64.3 ND 467.6 ± 67 ND
3.0 214.6 ± 31.8 < 0.04 488.4 ± 68.6 < 0.04
3.25 < 0.04 125.1 ± 7.9 < 0.04 218.2 ± 27.2
6 < 0.04 98.7 ±20.5 < 0.04 184.8 ± 28.9
24 0.14 ± 0.08* 8.3 ± 4.5 <0.04±0.01** 22.3 ± 12
* 0.04 ㎍/mL의 <LLOQ에서의 1마리의 동물이 계산에 포함됨. ** 0.04 ㎍/mL의 <LLOQ에서의 3마리의 동물이 계산에 포함됨. Apt7AD는 혈액을 뽑아낸 후 3시간 직후에 t=3에서 투여됨. (ND) 측정되지 않음
본 발명은 각종 구체적인 바람직한 실시형태 및 기법에 대하여 기술되었다. 본 발명의 의도 및 범위내에서 각종 변경 및 변형이 이루어질 수 있다는 것을 알 수 것이다.

Claims (35)

  1. 서열번호 10 내지 서열번호 59의 서열로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 핵산 서열을 포함하는 분리 핵산.
  2. 제 1 항에 있어서, 서열은 서열번호 19를 포함하는 분리 핵산.
  3. 제 1 항에 있어서, 서열은 서열번호 59를 포함하는 분리 핵산.
  4. 제 1 항에 있어서, 5'에서 3' 방향으로 5개의 뉴클레오티드로 구성되는 제 1 스템 및 제 2 스템으로 구성되는 삼차원 구조를 포함하는 분리 핵산.
  5. 제 3 항에 있어서, 제 1 스템은 3개의 구아닌 잔기를 포함하는 분리 핵산.
  6. 제 3 항에 있어서, 제 1 루프는 5'에서 3' 방향으로 10개 또는 9개의 뉴클레오티드를 포함하는 분리 핵산.
  7. 제 3 항에 있어서, 뉴클레오티드는 해독제의 결합시에 1본쇄로 되는 자살 위치를 추가로 포함하는 분리 핵산.
  8. 서열번호 10 내지 서열번호 59 중에서 선택되는 서열을 포함하는 핵산에 결합하는 분리 핵산.
  9. 서열번호 2 내지 서열번호 8 중에서 선택되는 핵산 서열을 포함하는 분리 핵산.
  10. 제 1 항 또는 제 9 항에 있어서, 하나 이상의 2'-O-메틸 변형 뉴클레오티드를 포함하는 분리 핵산.
  11. 제 1 항 또는 제 9 항에 있어서, 하나 이상의 2'-플루오로 변형체를 포함하는 분리 핵산.
  12. 제 1 항 또는 제 9 항에 있어서, 2'-플루오로 변형체를 포함하지 않는 분리 핵산.
  13. 제 3 항에 있어서, 히드록실 당 (2'-OH)을 포함하는 제 2 스템에 하나 이상의 구아닌을 포함하는 분리 핵산.
  14. 제 1 항에 있어서, 2'- 플루오로 또는 2'-O-메틸로 변형된 하나 이상의 우리딘을 포함하는 분리 핵산.
  15. 제 4 항에 있어서, 2'-플루오로 변형된 스템 2에 하나 이상의 시티딘을 포함하는 분리 핵산.
  16. 제 1 항 또는 제 9 항에 있어서, 수용성 폴리머로 변형되는 분리 핵산.
  17. 제 16 항에 있어서, 폴리머는 폴리에틸렌글리콜인 분리 핵산.
  18. 서열번호 10 내지 서열번호 59로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 핵산 서열을 포함하는 유효량의 핵산 리간드를, 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합하여 이루어지는 약제학적 조성물.
  19. 서열번호 2 내지 서열번호 8로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 핵산 서열을 갖는 유효량의 핵산을, 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합하여 이루어지는 약제학적 조성물.
  20. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서, 전신 투여에 적합한 약제학적 조성물.
  21. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서, 정맥내 투여에 적합한 약제학적 조성물.
  22. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서, 경구 투여에 적합한 약제학적 조성물.
  23. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서, 비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물.
  24. 응고 억제를 요하는 숙주의 응고 억제용 약제의 제조에서의, 서열번호 10 내지 서열번호 59로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 핵산 서열을 포함하는 유효량의 제 1 핵산 리간드의 용도.
  25. 응고 조절을 요하는 숙주의 응고 조절용 약제의 제조에서의, 서열번호 10 내지 서열번호 590으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 핵산 서열을 포함하는 유효량의 제 1 핵산 리간드 및 서열번호 1 내지 서열번호 8로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 핵산 서열을 포함하는 유효량의 제 2 핵산 리간드의 용도.
  26. 제 24 항 또는 제 25 항에 있어서, 제 1 핵산 서열은 서열번호 19를 포함하는 용도.
  27. 제 24 항 또는 제 25 항에 있어서, 제 1 핵산 서열은 서열번호 59를 포함하는 용도.
  28. 제 25 항에 있어서, 제 2 핵산 서열은 서열번호 3을 포함하는 용도.
  29. 제 24 항 또는 제 25 항에 있어서, 숙주는 치료 요법을 받는 용도.
  30. 제 24 항 또는 제 25 항에 있어서, 숙주는 수술 요법을 받는 용도.
  31. 제 24 항 또는 제 25 항에 있어서, 숙주는 심혈관 질환을 앓고 있거나 앓을 위험성이 있거나 심혈관 요법 (intervention) 중이거나 가능성이 있는 용도.
  32. 제 24 항 또는 제 25 항에 있어서, 숙주는 급성 심근 경색 (심장 발작), 뇌혈관 장애 (발작), 허혈, 혈관 형성, CABG (관상동맥 바이패스 그라프트), 심폐 바이패스, 심장 바이패스 장치 순환 시 및 신장 투석을 받는 환자에 있어서의 혈전 형성, 불안정 협심증, 폐색전증, 심부 정맥 혈전증, 동맥 혈전증 및 파종성 혈관 응고 증후군으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 질환을 앓고 있거나 앓을 위험성이 있는 용도.
  33. 응고 유발 염증 예방용 약제의 제조에서의, 서열번호 10 내지 서열번호 59로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 핵산 서열을 포함하는 유효량의 핵산 리간드의 용도.
  34. 제 33 항에 있어서, 응고 유발 염증은 죽상경화증, 급성 관증후군 (ACS), 심 근 경색, 재관류 상해 및 혈관형성후 재협착으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 질환과 관련되는 용도.
  35. 제 33 항에 있어서, 숙주에 대한 서열번호 1 내지 서열번호 8의 핵산의 유효량을 추가로 포함하는 용도.
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