ES2345470T3 - Ligandos de acido nucleico de afinidad elevada de la proteina c5 del sistema de complemento. - Google Patents

Ligandos de acido nucleico de afinidad elevada de la proteina c5 del sistema de complemento. Download PDF

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Abstract

Ligando de ácido nucleico que se une específicamente y con afinidad elevada a la proteína C5 del Sistema de Complemento y que es un inhibidor de la división de la proteína C5 en C5a y c5b, en el que dicho ligando comprende la secuencia: CGCCGCGGUCUCAGGCGCUGAGUCUGAGUUUACCUGCG o una secuencia que tiene un grado de homología primaria de secuencia superior a un 80%.

Description

Ligandos de ácido nucleico de afinidad elevada de la proteína C5 del sistema de complemento.
Campo de la invención
En la presente invención se describen métodos para identificar y preparar ligandos de Ácido nucleico de afinidad elevada para Proteínas del Sistema de complemento. El método utilizado aquí para identificar dichos Ligandos de Ácido Nucleico se denomina SELEX^{TM}, un acrónimo para la Evolución Sistemática de Ligandos mediante enriquecimiento Exponencial. En la presente invención se describen métodos para identificar y preparar ligandos de Ácido nucleico de afinidad elevada para Proteínas del Sistema de complemento C5. La presente invención incluye Ligandos de Ácido Nucleico de afinidad elevada de C5. También se describen ligandos de ARN de C5. También se describen Ligandos de Ácido Nucleico que inhiben y/o activan el Sistema de complemento. Los oligonucleótidos de la presente invención son útiles como agentes farmacéuticos o de diagnóstico.
Antecedentes de la invención
El sistema de complemento comprende un grupo de por lo menos 20 proteínas plasmáticas y de membrana que actúan conjuntamente en un sistema n casada regulado para atacar formas extracelulares de patógenos (Janeway et al. (1994) Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. Current Biology Ltd, San Francisco, pp. 8:35-8:55; Morgan (1995) Crit. Rev. in Clin Lab. Sci. 32(3):265-298). Existen dos cascadas de activación enzimática distintas, los mecanismos clásico y alternativo, y un mecanismo no enzimático conocido como mecanismo de ataque de membrana.
El mecanismo clásico es desencadenado habitualmente por un anticuerpo unido a una partícula exógena. Comprende diversos componentes C1, C4, C2, C3 y C5 (indicados por orden en el mecanismo). El inicio del mecanismo clásico del Sistema de complemento aparece tras la unión y activación del primer componente del complemento (C1) por los activadores inmune y no inmune (Cooper (1985) Adv. Immunol. 37:151). C1 comprende un complejo dependiente de calcio de los componentes C1q, C1r y C1s, y es activado a través de la unión del componente C1q. C1q contiene seis subunidades idénticas y cada subunidad comprende tres cadenas (las cadenas A, B y C). Cada cadena tiene una región de cabeza globular que está conectada a una cola de tipo colágeno. La unión y activación de C1q por los complejos antígeno-anticuerpo tiene lugar a través de la región de cabeza globular de C1q. Numerosos activadores de C1q que no son anticuerpos, incluyendo proteínas, lípidos y ácidos nucleicos (Reid et al. (1993) The Natural Immune System: Humoral Factors. E. Sim. ed. IRL Press, Oxford. p. 151) se unen y activan a través de un sitio distinto en la región de la cola de tipo colágeno.
Los activadores C1q que no son anticuerpos incluyen la proteína C reactiva (CRP) (Jiang et al. (1991) J. Immunol. 146: 2324) y la proteína amiloide del plasma (SAP) (Bristow et al. (1986) Mol. Immunol. 23; 1045); éstos activarán C1q cuando se agregan mediante la unión a fosfolípido o carbohidrato, respectivamente. CRP o SAP monoméricas no activan C1q. C1q también se activa a través de la unión al péptido amiloide agregado (Schultz et al. (1994) Neurosci. Lett. 175:99: Snyder et al. (1994) Exp. Neurol. 128:136), un componente de placas observado en la enfermedad de Alzheimer (Jiang et al. (1994) J. Immunol.152:5050; Eikelenboom y Stam (1982) Acta Neuropathol (Berl) 57:239: Eikelenboom et al. (1989) Virchows Arch. [B] 56:259: Rogers et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10016: Dietzschold et al. (1995) J. Neurol. Sci. 130:11). La activación de C1q podría agravar el tejido dañado asociado con la enfermedad de Alzheimer. Estos activadores se unen a C1q en su región de tipo colágeno, distante de la región del grupo de cabeza donde se unen los activadores de inmunoglobulina. Otras proteínas que se unen a la región de tipo colágeno de C1q incluyen colágeno (Menzel et al. (1981) Biochim. Biophys. Acta 670:265), fibronectina (Reid et al. (1984) Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand. Sect. C 92 (Suppl. 284):11), laminina (Bohnsack et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3824), fibrinógeno y fibrina (Entwistle et al. (1988) Biochem. 27:507), rsgp41 de VIH (Stoiber et al. (1995) Mol. Immunol. 32:371), actina (Nishioka et al. (1982) Biochem. Biophys. Res. Commun. 108:1307) y glicoproteína del tabaco (Koethe et al. (1995) J. Immunol. 155:826).
C1q también se une y se puede activar por carbohidratos aniónicos (Hughes-Jones et al. (1978) Immunology 34: 459) incluyendo mucopolisacáridos (Almeda et al. (1983) J. Biol. Chem. 258:785), fucanos (Blondin et al. (1994) Mol. Immunol. 31:247), proteoglicanos (Silvestri et al. (1981) J. Biol. Chem. 256:7383), y por lípidos incluyendo lipopolisacáridos (LPS) (Zohair et al. (1989) Biochem. J. 257:865; Stoiber et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:294). Tanto el ADN (Schravendijk y Dwek (1982) Mol. Immunol. 19:1179: Rosenberg et al. (1988) J. Rheumatol 15:1091; Uwatoko et al. (1990) J. Immunol. 144:3484) como el ARN (Acton et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:3530) también se pueden unir y potencialmente activar C1q. Los componentes intracelulares que activan C1q incluyen membranas celulares y subcelulares (Linder (1981) J. Immunol. 126:648: Pinckard et al. (1973) J. Immunol. 110:1376; Storrs et al. (1981) J. Biol. Chem. 256:10924; Giclas et al. (1979) J. Immunol. 122:146; Storrs et al. (1983) J. Immunol. 131:416), filamentos intermedios (Linder et al. (1979) Nature 278:176) y actina (Nishioka et al. (1982) Biochem. Biophys. Res. Commun. 108:1307). Todas estas interacciones utilizarían el mecanismo clásico para la protección contra infección bacteriana (o viral) o como respuesta al daño en el tejido (Li et al. (1994) J. Immunol. 152:2995) en ausencia de anticuerpo.
Un sitio de unión para los activadores que no son anticuerpos incluyendo CRP (Jiang et al. (1991) J. Immunol. 146:2324), SAP (Ying et al. (1993) J. Immunol. 150:169), peptide amiloide (Newman (1994) Curr. Biol. 4:462) y ADN (Jiang et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:25597) se ha localizado en el extremo amino de la cadena A de C1q en los residuos 14-26. Un péptido sintético que comprende esta secuencia inhibe de manera eficaz tanto la unión como la activación. El péptido 14-26 contiene diversos residuos básicos y se empareja con uno de los motivos de unión de heparina (Yabkowitz et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:10888: Cardin et al. (1989) Arteriosclerosis 9:21). El péptido es también altamente homogéneo con el péptido 145-156 acetilcolinesterasa con cola de colágeno: este sitio se asocia con la unión a membrana basal de sulfato de heparina (Deprez et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:11043). También puede estar implicado un segundo sitio de la cadena A de Ciq en los residuos 76-92 en una unión más débil; este sitio está en la unión de la región de cabeza globular y la cola de tipo colágeno.
La segunda cascada enzimáticamente activada, conocida como mecanismo alternativo, es una ruta rápida independiente de anticuerpos para la activación y amplificación del Sistema de complemento. El mecanismo alternativo comprende diversos componentes: C3, Factor B y Factor D. La activación del mecanismo alternativo tiene lugar cuando C3b, una forma por división proteolítica de C3, se une a una superficie activante, tal como una bacteria. El Factor B se une a entonces a C3b y se divide por el Factor D para producir la enzima activa, Ba. La enzima Ba divide entonces más C3 a C3b, produciendo una deposición amplia de complejos C3b-Ba en la superficie activante. Cuando se deposita un segundo C3b, que forma un complejo C3b-C3b-Ba, la enzima puede dividir entonces C5 y desencadenar la activación del mecanismo terminal.
El mecanismo terminal no enzimático, también conocido como mecanismo de ataque de membrana, comprende los componentes C5, C6, C7, C8 y C9. La activación de este mecanismo de ataque de membrana tiene lugar cuando el componente C5 es dividido enzimáticamente por el mecanismo clásico o alternativo para producir el polipéptido pequeño C5a (9 kDa) y el fragmento C5b grande (200 kDa). El polipéptido C5a se une a un receptor acoplado a la proteína G de 7 transmembrana que se describió originalmente en leucocitos y ahora se sabe que se expresa en un conjunto de tejidos que incluyen hepatocitos (Haviland et al. (1995) J. Immunol. 154:1861) y neuronas (Gasque et al. (1997) Am. J. Pathol. 150:31). La molécula C5a es el componente quimiotáctico primario del Sistema de Complemento humano y puede desencadenar una variedad de respuestas biológicas incluyendo la quimiotaxis de leucocitos, la contracción de músculos lisos, la activación de mecanismos de transducción de señal intracelular, adhesión neutrófilo-endotelio (Mulligan et al. (1997) J. Immunol. 158:1857), liberación de mediadores de citoquinas y lípidos y formación de oxidantes. El fragmento de C5b más grande se une secuencialmente a componentes posteriores para formar el complejo de ataque de membrana de C5b-9 (MAC). EL MAC de C5b-9 puede lisar directamente eritrocitos y en cantidades más elevadas es lítico para leucocitos y perjudicial para tejidos, tales como músculo, células epiteliales y endoteliales (Stahl et al. (1997) Circ. Res. 76:575). En cantidades sublíticas el MAC puede estimular el favorecimiento de la expresión de moléculas de adhesión, el aumento del calcio intracelular y la liberación de citoquinas (Ward (1996) Am. J. Pathol. 149:1079). Además, el MAC de C5b-9 puede estimular células, tales como células endoteliales y plaquetas, sin causar lisis celular. Los efectos no líticos de C5a y el MAC de C5b-9 son algunas veces bastantes similares.
El Sistema de complemento tiene un papel importante en la defensa contra infección bacteriana y viral, y posiblemente en la vigilancia inmune contra tumores. Esto se demuestra más claramente en humanos que presentan una deficiencia en componentes de los complementos. Los individuos que presentan una deficiencia en los componentes iniciales (C1, C4, C2 o C3) padecen de infecciones recurrentes, mientras que los individuos que presentan una deficiencia en los componentes tardíos (C5 a C9) son susceptibles de una infección por nisseria. El mecanismo clásico de los complementos se activa en las bacterias mediante anticuerpos, mediante la unión de CRP o SAP o mediante la activación directa a través de LPS. El mecanismo alternativo de los complementos se activa a través de la unión de C3 al recubrimiento celular. El complemento se puede activar mediante virus a través de anticuerpos y también se puede activar en células infectadas por virus, ya que éstas son reconocidas como exógenas. De una manera similar, las células transformadas se pueden reconocer como exógenas y se pueden lisar mediante el Sistema de complemento o dirigirse a la purificación inmune.
La activación del Sistema de complemento se puede utilizar y se ha utilizado para fines terapéuticos. Los anticuerpos que se produjeron contra células tumorales se utilizaron a continuación para activar el Sistema de complemento y provocar el rechazo de tumores. Además, el Sistema de complemento se utiliza junto con anticuerpos policlonales o monoclonales para eliminar los linfocitos no deseados. Por ejemplo, se utilizan globulina antilinfocitos o anticuerpos monoclonales anti-células T antes del transplante de órganos para eliminar linfocitos que sino mediarían en el rechazo.
Aunque el sistema de complemento tiene un papel importante en el mantenimiento de la salud, tiene el potencial de causar o contribuir a la enfermedad. El Sistema de complemento está implicado en numerosas enfermedades o patologías renales, reumatológicas, neurológicas, dermatológicas, hematológicas, vasculares/pulmonares, alergia, infecciosas, biocompatibilidad/shock y otras enfermedades o patologías (Morgan (1995) Crit. Rev, in Clin Lab. Sci. 32(3):265-298: Matis and Rollins (1995) Nature Medicine 1(8):839-842). El Sistema de complemento no es necesariamente la única causa del estado patológico, pero puede ser uno de diversos factores, cada uno de los cuales contribuye a la patogénesis.
Se han desarrollado varios agentes farmacéuticos que inhiben el Sistema de complemento in vivo, sin embargo, muchos causan toxicidad o son inhibidores débiles (Morgan (1995) Crit. Rev. en Clin Lab. Sci. 32(3):265-298). Se ha observado que las heparinas, K76COOH y mesilato de nafamostato son eficaces en estudios de animales (Morgan (1995) Crit. Rev. en Clin Lab. Sci. 32(3):265-298). Se han desarrollado o están bajo consideración formas recombinantes de inhibidores naturales del Sistema de complemento y ente éstos se incluyen el Receptor de Complemento 1 (CR1) de proteínas reguladores de membrana, Factor Acelerador de la Degradación (DAF), Proteína cofactor de la Membrana (MCP) y CD59.
C5 es una diana atractiva para el desarrollo de un inhibidor del Sistema de complemento, ya que ambos mecanismos clásico y alternativo convergen en el componente C5 (Matis y Rollins (1995) Nature Medicine 1(8):839-842). Además, la inhibición de la división de C5 bloquea los efectos de tanto C5a como C5b sobre leucocitos y tejido, tal como células endoteliales (Ward (1996) Am. J. Pathol. 149:1079); de este modo, la inhibición de C5 puede tener ventajas terapéuticas en un conjunto de enfermedades y situaciones, incluyendo la inflamación del pulmón (Mulligan et al. (1998) J. Clin. Invest. 98:503), activación del complemento extracorpóreo (Rinder et al. (1995) J. Clin. Invest. 96:1564) o activación del complemento mediado por anticuerpo (Biesecker et al. (1989) J. Immunol. 142:2654). Matis y Rollins ((1995) Nature Medicine 1(8):839-842) han desarrollado anticuerpos monoclonales específicos de C5 como agentes biofarmacéuticos anti-inflamatorios, y Biesecker et. al., (1998) mostraron que se podían producir aptámeros mediante SELEX para inhibir el componente C5 del complemento humano (molecular Immunology 35 (6-7):334). Tanto C5a como MAC están implicados en la inflamación aguda y crónica asociada con la enfermedad humana, y se ha confirmado su papel en estados patológicos en modelos animales. C5a es necesario para la lesión vascular de pulmón dependiente de complemento y neutrófilo (Ward (1997) J. Lab. Clin. Med. 129:400; Mulligan et al. (1998) J. Clin. Invest. 98:503), y se asocia con la activación de neutrófilos y plaquetas en el shock y la lesión en los glúteos (Schmid et al. (1997) Shock 8:119). El MAC media en la lesión del músculo en la miastenia gravis autoinmune aguda (Biesecker y Gomez (1989) J. Immunol. 142:2654), rechazo de órganos en el transplante (Baldwin et al. (1995) Transplantation 59:797; Brauer et al. (1995) Transplantation 59:288; Takahashi et al. (1997) Immunol. Res. 16:273) y lesión renal en glomerulonefritis autoinmune (Biesecker (1981) J. Exp. Med. 39:1779; Nangaku (1997) Kidney Int. 52:1570). Tanto c5a como el MAC están implicados en la isquemia aguda de miocardio (Homeister y Lucchesi (1994) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 34:17), lesión aguda del SNC (Bednar et al. (1997) J. Neurosurg. 86:139) y crónica (Morgan (1997) Exp. Clin. Immunogenet. 14:19), activación de leucocitos durante la circulación extracorpórea (Sun et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23:2909; Spycher and Nydegger (1995) Infushionsther. Transfusionsmed. 22:36) y en lesión tisular asociada con enfermedades autoinmunes incluyendo artritis y lupus (Wang et al. (1996) Immunology 93:8563). De este modo, la inhibición de la división de C5 evita la generación de dos actividades potencialmente perjudiciales del Sistema de complemento. La inhibición de la liberación de C5a elimina la actividad quimiotáctica y vasoactiva principal del Sistema de complemento y la inhibición de la formación de C5b bloquea el ensamblaje del MAC de C5b-9 citolítico. Además, la inhibición de C5 evita la lesión por el Sistema de complemento dejando intactos importantes mecanismos de defensa y purificación del Sistema de complemento, tales como la actividad fagocítica de C3 y C1q, la depuración de los complejos inmunes y la respuesta inmune innata (Carrol (1998) Ann. Rev. Immunol. 16:545).
C3 es una diana atractiva para el desarrollo de un inhibidor del Sistema de complemento, ya que es común para ambos mecanismos. La inhibición de C3 utilizando versiones recombinantes de un inhibidor natural (Kalli et al. (1994) Springer Semin. Immunopathol. 15:417) puede evitar la lesión tisular mediada por células (Mulligan et al. (1992) J. Immunol. 148:1479) y se ha demostrado que tiene un beneficio terapéutico en enfermedades, tales como el infarto de miocardio (Weisman et al. (1990) Science 249: 146) y la isquemia/reperfusión del hígado (Chavez-Cartaya et al. (1995) Transplantation 59:1047). El control de C3 limita la mayoría de actividades biológicas del Sistema de complemento, la mayoría de inhibidores naturales, incluyendo DAF, MCP, CR1 y la diana C3 del Factor H.
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SELEX^{TM}
Se ha desarrollado un método para la evolución in vitro de moléculas de ácido nucleico con una unión altamente específica a moléculas diana. Este método, Evolución Sistemática de Ligandos mediante Enriquecimiento Exponencial, denominado el proceso SELEX, se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos No. de Serie 07/536,428, solicitada el 11 de junio de 1990, titulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment", ya abandonada. La solicitud de Patentes de Estados Unidos No. de Serie. 07/714,131, solicitada el 10 de junio de 1991, titulada "Nucleic Acid Ligands", ahora la Patente de Estados Unidos No. 5,475,096, la solicitud de Patentes de Estados Unidos No. de Serie. 07/931,473, solicitada el 17 de agosto de 1992, titulada "Methods for Identifying Nucleic Acid Ligands", ahora la Patente de Estados Unidos No. 5,270,163 (véase también WO 91/19813), cada una de las cuales se incorpora específicamente por referencia en su totalidad. Cada una de estas solicitudes, referidas en general en la presente invención como las Solicitudes de Patentes de SELEX, describe un método fundamentalmente nuevo para producir un ligando de ácido nucleico para cualquier molécula diana deseada.
El método SELEX implica la selección entre una mezcla de oligonucleótidos candidatos e iteraciones por etapas de la unión, separación y amplificación, utilizando el mismo esquema de selección general, para conseguir prácticamente cualquier criterio deseado de afinidad de unión y selectividad. Partiendo de una mezcla de ácidos nucleicos, que comprenden preferiblemente un segmento de secuencia aleatoria, el método SELEX incluye las etapas de poner en contacto la mezcla con la diana en las condiciones favorables para la unión, separar los ácidos nucleicos no unidos de los ácidos nucleicos que se han unido específicamente a moléculas diana, disociar los complejos ácido nucleico-diana, amplificar los ácidos nucleicos disociados de los complejos ácido nucleico-diana para obtener una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida en ligandos, y a continuación, repetir las etapas de unión, separación, disociación y amplificación durante tantos ciclos como se desee para obtener ligandos de ácidos nucleicos de afinidad elevada altamente específicos con la molécula diana.
El método SELEX básico se ha modificado para conseguir una serie de objetivos específicos. Por ejemplo, la Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 07/960,093, solicitada el 14 de octubre de 1992, titulada "Method for Selecting Nucleic Acids on the Basis of Structure", ya abandonada (véase también la Patente de Estados Unidos No. 5.707.796), describe el uso de método SELEX conjuntamente con electroforesis en gel para seleccionar moléculas de ácido nucleico con características estructurales específicas, tales como ADN curvado. La Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 08/123,935, solicitada el 17 de septiembre de 1993, titulada "Photoselection of Nucleic Acid Ligands", ya abandonada (véase también la Patente de Estados Unidos No. 5.763.177) describe un método basado en SELEX para la selección de ligandos de ácidos nucleicos que contienen grupos fotoreactivos capaces de unirse y/o fotoreticularse y/o fotoinactivar una molécula diana. La Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 08/134,028, solicitada el 7 de octubre de 1993, titulada "High-Affinity Nucleic Acid Ligands That Discriminate Between Theophylline and Caffeine", ya abandonada (véase también la Patente de Estados Unidos No. 5.580.737) describe un método para identificar ligandos de ácido nucleico altamente específicos capaces de discriminar entre moléculas estrechamente relacionadas, denominadas Contra-SELEX. La Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie No. 08/143,564, solicitada el 25 de octubre de 1993, titulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Solution SELEX", ya abandonada (véase también la Patente de Estados Unidos No. 5.567.588) y la Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 08/792.075, solicitada el 31 de enero de 1997, titulada "Flow Cell SELEX", ahora la Patente de Estados Unidos No. 5.861.254 describen métodos basados en SELEX que consiguen una separación altamente eficaz entre oligonucleótidos que tienen una afinidad elevada y baja por una molécula diana. La Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 07/964624, solicitada el 21 de octubre de 1992, titulada "Nucleic Acid Ligands to HIV-RT and HIV-1 Rev.", ahora la Patente de Estados Unidos No. 5.496.938, describe métodos para obtener mejores Ligandos de Ácido Nucleico después que se haya realizado el proceso SELEX. La Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 08/400.440 solicitada el 8 de marzo de 1995, titulada "Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment: Chemi-SELEX", ahora la Patente de Estados Unidos No. 5.705.337, describe métodos para unir covalentemente un ligando a su diana.
El método SELEX comprende la identificación de ligandos de ácido nucleico de afinidad elevada que contienen nucleótidos modificados que confieren características mejoradas al ligando, tales como una estabilidad in vivo mejorada o características de liberación mejoradas. Entre los ejemplos de dichas modificaciones se incluyen sustituciones químicas en la ribosa y/o fosfato y/o posiciones de las bases. Los ligandos de ácido nucleico identificados por SELEX que contienen nucleótidos modificados se describen en la Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 08/117,991, solicitada el 8 de septiembre de 1993, titulada "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides", ya abandonada (véase también la Patente de Estados Unidos No. 5.660.985) que describe oligonucleótidos que contienen derivados de nucleótidos modificados químicamente en las posiciones 5 y 2' de las pirimidinas. La Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 08/134,028, ahora la Patente de Estados Unidos No. 5.580.737, supra describe ligandos de ácido nucleico altamente específicos que contienen uno o más nucleótidos modificados con 2'-amino (2'-NH_{2}), 2'-fluoro (2'-F), y/o 2'-O-metilo (2'-OMe). La Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 08/264,029, solicitada el 22 de junio de 1994, titulada "Novel Method of Preparation of 2' Modified Pyrimidine Intramolecular Nucleophilic Displacement", ya abandonada, describe oligonucleótidos que contienen diversas pirimidinas modificadas en 2'.
El método SELEX comprende combinar oligonucleótidos seleccionados con otros oligonucleótidos seleccionados y unidades funcionales que no son oligonucleótidos tal como se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 08/284,063, solicitada el 2 de agosto de 1994, titulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chimeric SELEX", ahora la Patente de Estados Unidos No. 5.637.459 y la Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 08/234,997, solicitada el 28 de abril de 1994, titulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Blended SELEX", ahora la Patente de Estados Unidos No. 5.683.867, respectivamente. Estas solicitudes permiten la combinación del amplio espectro de formas y otras propiedades, y las propiedades de amplificación y replicación eficaces de oligonucleótidos con las propiedades deseadas de otras moléculas.
Breve resumen de la invención
La descripción incluye métodos de identificación y producción de Ligandos de Ácido Nucleico para la Proteína del Sistema de Complemento C5 y proteínas homólogas y los Ligandos de Ácido Nucleico identificados y producidos de esta manera. Por proteínas homólogas se entiende un grado en la identidad de la secuencia de aminoácidos del 80% o más. En la presente se ejemplifica un método de identificación y producción de Ligandos de Ácido Nucleico para C5, y los Ligandos de Ácido Nucleico producidos de esta manera. Se proporcionan secuencias de ligando de Ácido Nucleico que son capaces de unirse específicamente a C5. En particular, se proporcionan secuencias de ARN capaces de unirse específicamente a C5. Se incluyen específicamente en la descripción secuencias de ligando de ARN mostradas en las Tablas 2-6,8,10 y 12-13 y las Figuras 5A-B (SEC ID NOS: 5-155 y 160-196). En la invención se incluyen Ligandos de Ácido nucleico que inhiben la función de proteínas del Sistema de Complemento. En la invención se incluyen específicamente ligandos de ARN que inhiben la función de C5. También se incluyen Ligandos de Ácido Nucleico que inhiben y/o activan el Sistema de Complemento.
Se incluye además en esta descripción un método de identificación de Ligandos de Ácido Nucleico y secuencias de Ligandos de Ácido Nucleico para Proteínas del Sistema de complemento que comprende las etapas de (a) preparar una Mezcla de candidatos de Ácidos Nucleicos, (b) poner en contacto la Mezcla de Candidatos de Ácidos Nucleicos con una Proteína del Sistema de complemento, (c) separar ente miembros de dicha Mezcla de Candidatos en base a la afinidad de dicha Proteína del Sistema de complemento, y (d) amplificar las moléculas seleccionadas para producir una mezcla de Ácidos Nucleicos enriquecido por secuencias de Ácidos Nucleicos con una afinidad relativamente más elevada para la unión a dicha Proteína del Sistema de complemento.
También se describe un método de identificación de Ligandos de Ácido Nucleico y secuencias de Ligandos de Ácido Nucleico para C5, que comprende las etapas de (a) preparar una Mezcla de candidatos de Ácidos Nucleicos, (b) poner en contacto la Mezcla de Candidatos de Ácidos Nucleicos con C5, (c) separar ente miembros de dicha Mezcla de Candidatos en base a la afinidad a C5, y (d) amplificar las moléculas seleccionadas para producir una mezcla de Ácidos Nucleicos enriquecido por secuencias de Ácidos Nucleicos con una afinidad relativamente más elevada para la unión a C5.
La presente invención incluye los ligandos de ARN para C5 identificados según el método descrito anteriormente. También se describen aquí ligandos de ARN para C1q, incluyendo aquellos ligandos mostrados en la Tabla 2 (SEC ID NOS:5-20) y la Tabla 6 (SEC ID NOS: 84-155) y los ligando de ARN para C3, incluyendo aquellos con las secuencias mostradas en la Tabla 3 (SEC ID NOS:21-46) que se incluyen para ayudar a entender la invención, aunque no forman parte de la invención. Los ligandos de ARN para C5 se muestran en la tabla 4 (SEC ID NOS:47-74), Tabla 5 (SEC ID NOS:76-83), Tabla 8 (SEC ID NOS:75. 160-162), Tabla 10 (SEC ID NOS:163-189), Tabla 12 (SEC ID NOS:190-192), Tabla 13 (SEC ID NOS:194-196) y las Figuras 5A-B (SEC ID NOS: 160 y 193). También se incluyen ligandos de ARN para C5 que son sustancialmente homólogos con cualquiera de los ligandos determinados y que tienen sustancialmente la misma capacidad de unión a C5, e inhiben la función de C5. También se incluyen en la invención Ligandos de Ácido Nucleico para C5 que tiene sustancialmente la misma forma estructural que los ligandos presentados aquí y que tienen sustancialmente la misma capacidad para unirse a C5 e inhibir la función de C5.
La presente invención también incluye secuencias de nucleótidos modificadas basadas en los ligandos de ARN identificados aquí y mezclas de los mismos.
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Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra los resultados de un ensayo de inhibición en el que los ligandos de ARN 2'-F C12 (SEC ID NO:59), A6 (SEC ID NO: 48), K7 (SEC ID NO:50), C9 (SEC ID NO:58), E5c (SEC ID NO:47) y F8 (SEC ID NO:49) para C5 humano se incubaron con eritrocitos de oveja recubiertos de anticuerpo y suero completo humano. Los resultados se presentan como densidad óptica (DO) frente a la concentración de ligando en nM.
La figura 2 muestra el % de generación de C5a como función de la concentración de clon C6 (SEC ID NO:51).
La figura 3A muestra un gel de secuenciación del clon C6 marcado con 5'-quinasa (SEC ID NO:51) después de hidrólisis alcalina o digestión con T1 nucleasa. La secuencia 3' (marcada en el extremo 5') se alinea con la escalera de la hidrólisis alcalina. A la izquierda se encuentra la escalera T1 y a la derecha se encuentra ARN seleccionado con concentraciones 5x y 1 x de C5. El límite en el que la extracción de una base elimina la unión se muestra mediante una flecha. El asterisco muestra una G que es hipersensible a T1.
La figura 3B muestra un gel de secuenciación del clon C6 ligado a 3'-pCp después de hidrólisis alcalina o digestión con T1 nucleasa.
La secuencia 5' (marcada en el extremo 3') se alinea con la escalera de hidrólisis alcalina. Las bandas de T1 y proteína, el límite y nucleótidos G hipersensibles son tal como se describen para la figura 3A.
La figura 4 muestra los resultados del ensayo de interferencia de 2'-O-metilo. Las posiciones en las que las purinas 2'-OH se pueden sustituir por 2'-O-metilo se determinaron a partir de la interferencia de unión. Se representa la proporción de (la intensidad de las bandas seleccionadas por la proteína)/(la intensidad de banda para oligonucleótidos no seleccionados por la proteína) con un ajuste de curva lineal (círculos blancos). También se representa la misma proporción para nucleótidos 2'-OH:2'-OMe mezclados (círculos negros).
La figura 5A muestra la estructura propuesta del truncado de 38 unidades (SEC ID NO:160) del clon C6 (SEC ID NO:51) junto con bases alternativas.
La figura 5B muestra el patrón de sustitución de 2'-O-metilo de un truncado de 38 unidades (SEC ID NO:193 de clon C6 (SEC ID NO:51). Las posiciones en las que se pueden realizar las sustituciones 2'-OMe se muestran en negrita. Las posiciones que deben ser 2'-OH están subrayadas.
La figura 6 muestra el % de hemólisis frente a la concentración de ligando de ácido nucleico (mm) para un truncado de 38 unidades del clon YL-13 (SEC ID NO:175) sin la sustitución 2'-OMe (SEC ID NO:194; círculos blancos), con una sustitución 2'-OMe en la posición 20 (SEC ID NO:195; círculos negros) y con sustituciones 2'-OMe en las posiciones 2, 7, 8, 13. 14, 15, 20, 21, 22, 26, 27, 28, 36 y 38 (SEC ID NO:196: círculos negros).
Descripción detallada de la invención
La presente solicitud describe Ligandos de Ácido Nucleico para la Proteína del Sistema de complemento C5 identificados en general según el método conocido como SELEX. Tal como se ha afirmado anteriormente, la tecnología SELEX se describe en detalle en las Solicitudes de Patentes de SELEX.
Ciertos términos utilizados para describir la invención se definen tal como se indica a continuación:
"Ligando de ácido nucleico", tal como se utiliza en la presente invención, es un ácido nucleico no natural que presenta una acción deseable sobre una diana. Una acción deseable incluye, pero sin limitación, la unión a la diana, el cambio catalítico de la diana, la reacción con la diana, de manera que modifica/altera la diana o la actividad funcional de la diana, la unión covalente a la diana como en un inhibidor suicida, y facilitar la reacción entre la diana y otra molécula. En la realización preferida, la acción deseable es la unión específica por una molécula diana, siendo dicha molécula diana una estructura química tridimensional diferente de un polinucleótido que se une a un Ligando de Ácido Nucleico a través de un mecanismo que depende predominantemente del emparejamiento de bases Watson/Crick o la unión en triple hélice, donde el Ligando de Ácido Nucleico no es un ácido nucleico que tenga la función fisiológica conocida de estar unida por la molécula diana. Los Ligandos de Ácido Nucleico incluyen ácidos nucleicos que se identifican a partir de una mezcla de candidatos de ácidos nucleicos, siendo dicho Ligando de Ácido Nucleico un ligando de una diana determinada, mediante el método que comprende a) poner en contacto la mezcla de candidatos con la diana, donde los ácidos nucleicos que tienen una mayor afinidad por la diana en relación con la mezcla de candidatos se pueden separar del resto de la mezcla de candidatos; b) separar los ácidos nucleicos de mayor afinidad del resto de la mezcla de candidatos, y c) amplificar los ácidos nucleicos de mayor afinidad para producir una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida en ligando.
"Mezcla de candidatos" es una mezcla de ácidos nucleicos de secuencia diferente a partir de la cual se selecciona un ligando deseado. La fuente de la mezcla de candidatos puede ser ácidos nucleicos o fragmentos de los mismos de origen natural, ácidos nucleicos sintetizados químicamente, ácidos nucleicos sintetizados químicamente o ácidos nucleicos producidos mediante la combinación de las técnicas anteriores. En una realización preferida, cada ácido nucleico tiene secuencias fijadas que rodean una región aleatoria para facilitar el proceso de amplificación.
"Ácido nucleico" significa ADN, ARN, de cadena única o cadena doble y cualquier modificación química de los mismos. Las modificaciones incluyen, pero sin limitación, aquellas que proporcionan otros grupos químicos que incorporan carga adicional, polarizabilidad, enlaces de hidrógeno, interacción electrostática, y fluxionalidad a bases de Ligandos de Ácidos Nucleicos o al Ligando de Ácido Nucleico como tal. Dichas modificaciones incluyen, pero sin limitación, modificaciones de azúcares en la posición 2', modificaciones de pirimidina en la posición 5, modificaciones de purina en la posición 8, modificaciones en aminas exocíclicas, sustitución de 4-tiouridina, sustitución de 5-bromo o 5-yodo-uracilo, modificaciones en el esqueleto, metilaciones, combinaciones inusuales de emparejamiento de bases, tales como las isobases isocitidina e isoguanidina y similares. Las modificaciones también pueden incluir modificaciones en 3' y 5', tales como terminadores de cadena.
La metodología "SELEX" implica la combinación de la selección de Ligandos de Ácido Nucleico que interaccionan con una diana de una manera deseable, por ejemplo, uniéndose a una proteína, con la amplificación de los ácidos nucleicos seleccionados. El ciclo iterativo de las etapas de selección/amplificación permite la selección de uno o un pequeño número de ácidos nucleicos que interaccionan más fuertemente con la diana de un grupo que contiene una cantidad muy elevada de ácidos nucleicos. Se continúa con el ciclo del procedimiento de selección/amplificación hasta que se consigue un objetivo seleccionado. En la presente invención, la metodología SELEX se utiliza para obtener Ligando de Ácido Nucleico para C5. La metodología SELEX se describe en las Solicitudes de Patente de
SELEX.
"Diana" significa cualquier compuesto o molécula de interés para los que se desea un ligando. Una diana puede ser una proteína, péptido, carbohidrato, polisacárido, glicoproteína, hormona, receptor, antígeno, anticuerpo, virus, sustrato, metabolito, análogo de estado de transición, cofactor, inhibidor, fármaco, colorante, nutriente, factor de crecimiento, etc., sin limitación. En esta solicitud, la diana es la Proteína del Sistema de Complemento C5.
"Proteína del Sistema de Complemento" significa cualquier proteína o complemento del Sistema de Complemento que incluye, pero sin limitación, C1, C1q, C1r, C1s, C2, C3, C3a. C3b. C4. C4a, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, Factor B (B), Factor D (D), Factor H (H) y receptores de los mismos, y otras proteínas de control/inhibidores solubles y de membrana.
"Sistema de Complemento" es un conjunto de proteínas plasmáticas y de membrana que actúan juntas en un sistema en cascada regulado para atacar formas extracelulares de patógenos o células infectadas o transformadas y en la purificación de reactivos inmunes o debris celular. El Sistema de Complemento se puede activar espontáneamente en ciertos patógenos o mediante la unión del anticuerpo al patógeno. El patógeno se recubre con Proteínas del Sistema de Complemento (opsonizado) para la captación y destrucción. El patógeno también se puede lisar directamente y eliminar. Mecanismos similares reconocen células infectadas, transformadas o dañadas. El Sistema de Complemento también participa en la purificación de reactivos inmunes y debris celular.
El proceso SELEX se describe en la Solicitud de Patentes de Estados Unidos No. de Serie 07/536,428, solicitada el 11 de junio de 1990, titulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment", ya abandonada, la solicitud de Patentes de Estados Unidos No. de Serie. 07/714,131, solicitada el 10 de junio de 1991, titulada "Nucleic Acid Ligands", ahora la Patente de Estados Unidos No. 5,475,096, la solicitud de Patentes de Estados Unidos No. de Serie. 07/931,473, solicitada el 17 de agosto de 1992, titulada "Nucleic Acid Ligands", ahora la Patente de Estados Unidos No. 5,270,163 (véase también WO 91/19813). Estas aplicaciones se denominan colectivamente Solicitudes de Patente de SELEX.
En su forma más básica, el proceso SELEX se puede definir mediante la siguiente serie de etapas:
1) Se prepara una mezcla de candidatos de ácidos nucleicos de diferente secuencia. La mezcla de candidatos incluye generalmente regiones de secuencias fijadas, es decir, cada uno de los miembros de la mezcla de candidatos contiene las mismas secuencias en la misma localización) y las regiones de secuencias aleatorias. Las regiones de secuencia fija se seleccionan: (a) para ayudar en las etapas de amplificación descritas a continuación, (b) para mimetizar una secuencia conocida por unirse a la diana, o (c) para aumentar la concentración de una disposición estructural determinada de los ácidos nucleicos en la mezcla de candidatos. Las secuencias aleatorias pueden ser totalmente aleatorias (es decir, la probabilidad de encontrar una base en cualquier posición es una de cuatro) o sólo parcialmente aleatoria (por ejemplo, la probabilidad de encontrar una base en cualquier localización se puede seleccionar a cualquier nivel entre 0 y el 100 por cien).
2) La mezcla de candidatos se pone en contacto con la Diana seleccionada en condiciones favorables para la unión entre la diana y los miembros de la mezcla de candidatos. En estas circunstancias, la interacción entre la diana y los ácidos nucleicos de la mezcla de candidatos se puede considerar que forma parejas de ácido nucleico-diana entre la diana y los ácidos nucleicos que tienen la mayor afinidad por la diana.
3) Los ácidos nucleicos con la mayor afinidad por la diana se separan de los ácidos nucleicos con menor afinidad a la diana. Debido a que sólo un número extremadamente pequeño de secuencias (y posiblemente sólo una molécula de ácido nucleico) que corresponden a los ácidos nucleicos de afinidad más elevada existen en la mezcla de candidatos, es generalmente deseable establecer el criterio de separación, de manera que se retiene una cantidad significativa de los ácidos nucleicos en la mezcla de candidatos (aproximadamente 5-50%) durante la separación.
4) Los ácidos nucleicos seleccionados durante la separación que tienen la afinidad relativamente más elevada por la diana se amplifican a continuación para crear una nueva mezcla de candidatos que se enriquece en ácidos nucleicos que tienen una afinidad relativamente más elevada por la diana.
5) Mediante la repetición de las etapas de separación y amplificación anteriores, la mezcla de candidatos recién formada contiene cada vez menos secuencias de unión débil, y el grado medio de afinidad de los ácidos nucleicos por la diana generalmente aumentará. Tomado en su extremo, el proceso SELEX producirá una mezcla de candidatos que contiene uno o un pequeño número de ácidos nucleicos que representan los ácidos nucleicos de la mezcla de candidatos original que tienen la afinidad más elevada por la molécula diana.
Las Solicitudes de Patentes SELEX se describen y elaboran en este proceso con mayor detalle. Se incluyen dianas que se pueden utilizar en el proceso: métodos para separar Ácidos Nucleicos en una Mezcla de Candidatos; y métodos para amplificar Ácidos Nucleicos separados para generar una mezcla de candidatos enriquecida. Las Solicitudes de Patentes de SELEX también describen ligandos obtenidos para un conjunto de especies diana, incluyendo tanto Dianas proteína en las que la proteína es y no es una proteína de unión a Ácido Nucleico.
El método SELEX comprende además combinar Ligandos de Ácido Nucleico seleccionados con compuestos lipofílicos o no inmunogénicos de peso molecular elevado en un complejo de diagnóstico o terapéutico tal como se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos No. de Serie 08/434,465, solicitada el 4 de mayo de 1995, titulada "Nucleic Acid Ligand Complexes", ahora Patente de Estados Unidos No. 5,859,228. Los ligandos de Ácido Nucleico VEGF que están asociados con un compuesto Lipofílico, tal como diacil glicerol o dialquil glicerol, en un complejo de diagnóstico o terapéutico se describen en la Solicitud de Patente de Estados Unidos No. de Serie 08/739,109 (US 5, 859, 228), solicitada el 25 de octubre de 1996, titulada "Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Nucleic Acid Ligand Complexes". Los ligandos de Ácido Nucleico VEGF que están asociados con un Compuesto Lipofílico, tal como un lípido de glicerol, o un compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado, tal como polialquilenglicol, se describen adicionalmente en la Solicitud de Patente de Estados Unidos No. de Serie 08/897,351 (US 6, 051, 698), solicitada el 21 de Julio de 1997, titulada "Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Nucleic Acid Ligand Complexes". Los ligandos de Ácido Nucleico VEGF que están asociados con un compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado o un compuesto lipofílico también se describen en la PCT/US97/18944, solicitada el 17 de octubre de 1997, titulada "Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Nucleic Acid Ligand Complexes".
Ciertas realizaciones de la presente invención proporcionan un complejo que comprende uno o más Ligando de Ácido Nucleico para Proteína del Sistema de complemento C5 unidos covalentemente con un compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado o un compuesto lipofílico. Un complejo, tal como se utiliza aquí, describe la entidad molecular formada mediante la unión covalente del Ligando de Ácido Nucleico de una Proteína del Sistema de complemento a un compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado. Un compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado es un compuesto entre aproximadamente 100 Da a 1.000.000 Da, más preferiblemente aproximadamente 1000 Da a 500.000 Da, y los más preferiblemente aproximadamente 1000 Da a 200.000 Da, que habitualmente no generan una respuesta inmunogénica. Para los objetivos de la presente invención, una respuesta inmunogénica es aquella que provoca que el organismo produzca proteínas de anticuerpos. En una realización preferida de la invención, el compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado es polialquilenglicol. En la realización más preferida, el polialquilenglicol es polietilenglicol (PEG), Más preferiblemente, el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 10-80 K. Lo más preferible, el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 20-45 K. En ciertas realizaciones de la presente invención, el compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado también puede ser un Ligando de Ácido Nucleico.
Otra realización de la presente invención se refiere a complejos comprendidos de un Ligando de Ácido Nucleico para la Proteína del sistema de complemento C5 y un compuesto lipofílico. Los compuestos lipofílicos son compuestos que tienen la tendencia de asociarse con o dividirse en lípido y/u otros materiales o fases con constantes dieléctricas bajas, incluyendo estructuras que están comprendidas sustancialmente de componentes lipofílicos. Los compuestos lipofílicos incluyen lípidos, así como compuestos que no contienen lípidos que tienen la tendencia de asociarse con lípidos (y/o otros materiales o fases con constantes dieléctricas bajas). El colesterol, fosfolípido, y lípidos de gliceroles, tales como dialquil glicerol, diacil glicerol y lípidos de glicerol amida son ejemplos adicionales de compuestos lipofílicos. En una realización preferida, el compuesto lipofílico es un lípido de glicerol.
El compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado o compuesto lipofílico se pueden unir covalentemente a un conjunto de posiciones en el Ligando de Ácido Nucleico para la Proteína del Sistema de complemento C5, tal como un grupo amino exocíclico en la base, la posición 5 de un nucleótidos de pirimidina, la posición 8 de un nucleótido de purina, el grupo hidroxilo del fosfato, o un grupo hidroxilo u otro grupo en los extremos 5' ó 3' del Ligando de Ácido Nucleico para la Proteína del Sistema de complemento C5. En realizaciones en las que el compuesto lipofílico es un lípido de glicerol o el compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado es polialquilenglicol o polietilenglicol, preferiblemente el compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado está unido al hidroxilo 5' ó 3 del grupo fosfato del mismo. En la realización más preferida, el compuesto lipofílico o el compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado está unido al hidroxilo 5' del grupo fosfato del Ligando de Ácido Nucleico. La unión del compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado o compuesto lipofílico para el Ligando de Ácido Nucleico para la Proteína del Sistema de complemento C5 se puede realizar directamente o con la utilización de enlazadores o
espaciadores.
Un enlazador es una entidad molecular que conecta dos o más entidades moleculares a través de enlaces covalentes o interacciones no covalentes y pueden permitir la separación espacial de las entidades moléculas de una manera que conserva las propiedades funcionales de una o más de las entidades moleculares. Un enlazador también se puede referir como un espaciador.
El complejo que comprende un Ligando de Ácido Nucleico para la Proteína del Sistema de complemento C5 y un compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado o compuesto lipofílico se puede asociar además con una construcción lipídica. Las construcciones lipídicas son estructuras que contienen lípidos, fosfolípidos o derivados de los mismos que comprenden una variedad de diferentes disposiciones estructurales que se sabe que los lípidos adoptan en suspensión acuosa. Estas estructuras incluyen, pero sin limitación, vesículas de bicapa lipídica, micelas, liposomas, emulsiones, lazos y láminas de lípidos, y se pueden complejar con un conjunto de fármacos y componentes que se sabe que son farmacéuticamente aceptables. En una realización preferida, la construcción lipídica es un liposoma. El liposoma preferido es unilamelar y tiene un tamaño relativo inferior a 200 nm. Los componentes adicionales comunes en construcciones lipídicas incluyen colesterol y alfatocoferol, entre otros. Las construcciones lipídicas se pueden utilizar solas o en cualquier combinación que un experto en la materia entendería que proporcionaría las características deseadas para una aplicación particular. Además, los aspectos técnicos de las construcciones lipídicas y la formación de liposomas son conocidas en la técnica y se puede utilizar cualquiera de los métodos utilizados habitualmente en la técnica para la presente invención.
Los métodos descritos en la presente invención y los Ligandos de Ácido Nucleico identificados por dichos métodos son útiles para fines terapéuticos y de diagnóstico. Los usos terapéuticos incluyen el tratamiento o prevención de enfermedades o patologías médicas en pacientes humanas, específicamente enfermedades o patologías causadas por la activación del Sistema de complemento. El Sistema de complemento no tiene que ser la única causa del estado patológico, pero pueden ser uno de varios factores, cada uno de los cuales contribuye a la patogénesis. Dichas enfermedades o patologías incluyen, pero sin limitación, enfermedades renales, tales como nefritis lúpica y glomerulonefritis membranoproliferativa (MPGN), nefritis membranosa, nefropatía de IgA; enfermedades reumatológicas, tales como artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (SLE), síndrome de Behcet, artritis reumatoide juvenil, síndrome de Sjögren y esclerosis sistémica; enfermedades neurológicas, tales comomiastenia gravis; esclerosis múltiple, lupus cerebral, síndrome de Guillain-Barré y enfermedad de Alzheimer; enfermedades dermatológicas, tales como Penfigo/penfigoides, reacciones fototóxicas, vasculitis y quemaduras térmicas; enfermedades hematológicas, tales como hemoglobinuria nocturna paroximal (PNH), multinuclearidad eritroblástica hereditaria con prueba de lisis del suero acidificado positiva (HEMPAS) y púrpura trombocitopénica idiopática (ITP);enfermedades de biocompatibilidad/shock, tales como síndrome post-bypass, síndrome de insuficiencia respiratoria adulta (ARDS), reacciones al catéter, anafilaxis, rechazo a transplante, pre-eclampsia, hemodiálisis y almacenamiento de plaquetas; enfermedades vasculares/pulmonares, tales como aterosclerosis, infarto de miocardio, apoplejía y lesión por reperfusión; alergias, tales como anafilaxis, asma y reacciones de la piel; infección, tales como choque séptico, infección viral e infección bacteriana; y otras patologías, tales como ateroma, inflamación intestinal, tiroiditis, infertilidad, hemoglobinuria nocturna paroximal (PNH) y anemia hemolítica.
El Sistema de complemento se puede inhibir en diversos puntos en la cascada de activación mediante el reconocimiento de diferente componentes. La inhibición de C1q bloquearía la iniciación mediante mecanismos con anticuerpos o sin anticuerpos. Los anticuerpos activan C1q en muchas enfermedades incluyendo, SLE, miastenia gravis y artritis. La activación del Sistema de complemento sin anticuerpos tiene lugar en muchas enfermedades incluyendo la enfermedad de Alzheimer, infarto de miocardio y choque séptico. El bloqueo de C1q podría prevenir la lesión tisular mediada por complemento en estas enfermedades.
El Complemento también se puede activar en ausencia de anticuerpos directamente en el estadio C3. La activación de superficies que incluyen bacterias, partículas de virus o células dañadas pueden desencadenar la activación del Sistema de complemento que no requiere C1q. Un inhibidor de C3 podría prevenir la activación y el daño del Sistema de complemento en estas situaciones.
En otros casos, la inhibición de C5 es la más útil. La activación del Sistema de complemento mediante los mecanismos de C1q o C3 conduce a la activación de C5, de manera que la inhibición de C5 podría evitar el daño mediado por el Sistema de complemento por cualquiera de los mecanismos. Sin embargo, tanto C1q como C3 son importantes en la defensa normal frente a microorganismos y en la purificación de componentes inmunes y tejido dañado, mientras que C5 es generalmente prescindible para esta función. Por lo tanto, C5 se puede inhibir a corto plazo o largo plazo y el papel predictivo del Sistema de Complemento no se vería comprometido, mientras que la inhibición a largo plazo de C1q o C3 no es deseable. Finalmente, los fragmentos de C5 C5a y C5b provocan directamente la mayor parte de la lesión tisular y la enfermedad asociada con una activación no deseadas del Sistema de complemento. Por lo tanto, la inhibición de C5 es el modo más directo de producto un efecto terapéutico.
En otros casos, la activación del Sistema de complemento es deseable en el tratamiento o prevención de enfermedades o patologías médicas en pacientes humanos. Por ejemplo, la activación del Sistema de complemento es deseable en el tratamiento de infecciones bacterianas o virales y tumores. Además, la activación del Sistema de complemento en células T antes del transplante podría evitar el rechazo de un órgano o tejido mediante la eliminación de las células T que median en el rechazo.
Además, los Ligandos de Ácido Nucleico que se unen a las Dianas de la superficie celular podrían hacerse más eficaces proporcionándoles la capacidad de activar el Sistema de complemento. La unión del Ácido Nucleico inhibiría entonces la función de la Diana y también eliminaría la célula, por ejemplo, mediante la lisis de completo de ataque de membrana y la depuración celular a través de la opsonización. Los Ligandos de Ácido Nucleico podían activar el Sistema de complemento a través de los mecanismos clásico o alternativo.
La citólisis del Sistema de complemento mediada por el Ligando de Ácido Nucleico se podría utilizar de diversas maneras, por ejemplo mediante: a) la citólisis directa de células tumorales; b) lisis de microorganismos reconocidos o células infectadas; y c) eliminación de linfocitos o subgrupos de linfocitos. Los Ligandos de Ácido Nucleico podrían sustituir anticuerpos utilizados actualmente para estos objetivos.
La utilización diagnóstica puede incluir aplicaciones de diagnóstico tanto in vivo o in vitro. El método SELEX, en general, y las adaptaciones específicas del método SELEX enseñado aquí, son particularmente adecuadas para las aplicaciones de diagnóstico. El método SELEX identifica Ligandos de Ácido Nucleico que son capaces de unirse a diana con una afinidad elevada y con una especificidad sorprendente. Estas características son, naturalmente, las propiedades deseadas que un experto en la materia buscaría en un ligando de diagnóstico.
Los Ligandos de Ácido Nucleico de la presente invención se pueden adaptar de manera rutinaria para fines de diagnóstico según cualquiera de las técnicas utilizadas por los expertos en la materia. Los agentes de diagnóstico sólo necesitan ser capaces de permitir al usuario identificar la presencia de una diana determinada en un lugar o concentración particular. Simplemente la capacidad para formar parejas de unión con la diana puede ser suficiente para desencadenar una señal positiva para fines de diagnóstico. Los expertos en la materia también serían capaces de adaptar cualquier Ligando de Ácido Nucleico mediante procedimientos conocidos en la técnica para incorporar una etiqueta de marcaje con el fin de rastrear la presencia de dicho ligando. Dicha etiqueta se podría utilizar en una serie de procedimientos de diagnóstico. Los Ligandos de Ácido Nucleico para C5 descritos en la presente invención se pueden utilizar específicamente para la identificación de la proteína C1q, C3 o C5.
El proceso SELEX proporciona ligandos de afinidad elevada de una molécula diana. Esto representa un logro único que no tiene precedentes en el campo de la búsqueda de Ácidos Nucleicos. La presente invención aplica el procedimiento SELEX a la diana específica C5, que es parte del mecanismo terminal. En la sección de Ejemplo siguiente, se describen parámetros experimentales utilizados para aislar e identificar los Ligandos de Ácido Nucleico para C5.
Con el fin de producir Ácidos Nucleicos deseables para su uso como agente farmacéutico, se prefiere que el Ligando de Ácido Nucleico (1) se una a la diana de una manera capaz de conseguir el efecto deseado en la diana; (2) sea tan pequeño como sea posible para obtener el efecto deseado; (3) sea tan estable como sea posible; y (4) sea un ligando específico para la diana elegida. En la mayoría de situaciones, se prefiere que el Ligando de Ácido Nucleico tiene la afinidad más elevada posible para la Diana.
Los agentes farmacéuticos, que incluyen, pero sin limitación, moléculas pequeñas, oligonucleótidos antisentido, nucleósidos y polipéptidos, pueden activar el Sistema de Complemento de una manera deseada. Los Ligandos de Ácido Nucleico para Proteínas del Sistema de Complemento se podrían utilizar como profilácticos mediante inhibición transitoria del Sistema de Complemento, de manera que se podría administrar un agente farmacéutico y conseguir una cantidad terapéuticamente eficaz sin producir los efectos secundarios no deseables de activación del Sistema de complemento.
En la Solicitud de Patente de Estados Unidos de No. de Serie 07/964.624 en trámite y cedida conjuntamente presentada el 21 de octubre de 1992, ahora la Patente de Estados Unidos No. 5,496,938, (la Patente '938) titulada "Nucleic Acid Ligands to HIV-RT and HIV-1 REV", se describen métodos para obtener Ligandos de Ácido Nucleico mejorados después de realizar el SELEX.
En la presente invención, se realizaron experimentos SELEX con el fin de identificar ARN con una afinidad elevada específica, aunque no son parte de la invención, también se describen aquí ligandos de ácido nucleico para C1q y C3, que son útiles para entender la invención. C5 de una biblioteca degenerada que contiene 30 ó 50 posiciones aleatorias (30N o 50 N). La presente invención incluye ligandos de ARN específicos para C1q mostrados en la Tabla 2 (SEC ID NOS:5-20) y Tabla 6 (SEC ID NOS: 84-155), identificados por el método descrito en los Ejemplos 2 y 6, los ligandos de ARN específicos para C3 mostrados en la Tabla 3 (SEC ID NOS:21-46), identificados por el método descrito en el Ejemplo 3, y los ligandos de ARN específicos para C5 mostrados en la Tabla 4 (SEC ID NOS:47-74), Tabla 5 (SEC ID NOS:76-83). Tabla 8 (SEC ID NOS:75 160-162). Tabla 10 (SEC ID NOS: 163-189), Tabla 12 (SEC ID NOS:190-192), Tabla 13 (SEC ID NOS:194-196) y las figuras 5A-B (SEC ID NOS:160 y 193) identificadas por los métodos descritos en los Ejemplos 2, 5, 6 y 7. La presente invención incluye además ligandos de ARN para C5 que inhiben la función de C5. El alcance de los ligandos cubiertos por la presente invención se extiende a todos los Ligandos de Ácido Nucleico de C5, modificados y no modificados, identificados según el procedimiento SELEX. Más específicamente, la presente invención incluye secuencias de Ácido Nucleico que son sustancialmente homólogas a los ligandos mostrados en la Tablas 2-6, 8, 10 y 12-13 y las figuras 5AB (SEC ID NOS:5-155 y 160-196). Por sustancialmente homólogas, se entiende un grado de homología de secuencia primaria que supera el 70%, más preferiblemente que supera el 80%, e incluso más preferiblemente que supera el 90%, 95% ó 99%. El porcentaje de homología tal como se describe aquí se calcula como el porcentaje de nucleótidos hallados en la menor de las dos secuencias que se alinean con residuos de nucleótidos idénticos en la secuencia que se compara cuando se puede introducir un espacio en una longitud de 10 nucleótidos para ayudar en la alineación. Una revisión de las homologías de secuencia de los ligandos de C1q mostrados en la Tabla 2 (SEC ID NOS:5-20) y Tabla 6 (SEC ID NOS:84-155) muestra que las secuencias con una homología primaria nula o escasa pueden tener sustancialmente la misma capacidad de unirse a C1q. De manera similar, una revisión de las homologías de secuencia de los ligandos de C3 mostrados en la Tabla 3 (SEC ID NOS:21-46) muestra que las secuencias con una homología primaria nula o escasa pueden tener sustancialmente la misma capacidad de unirse a C3. De manera similar, una revisión de las homologías de secuencia de los ligandos de C5 mostrados en la Tabla 4 (SEC ID NOS:47-74), Tabla (SEC ID NOS:76-83), Tabla 8 (SEC ID NOS:75, 160-162), Tabla 10 (SEC ID NOS: 163-189), Tabla 12 (SEC ID NOS:190-192), Tabla 13 (SEC ID NOS:194-196) y las figuras 5A-B (SEC ID NOS: 160 y 193) muestra que las secuencias con una homología primaria nula o escasa pueden tener sustancialmente la misma capacidad de unirse a C5. Por estas razones, la presente invención incluye Ligandos de Ácido Nucleico que tiene sustancialmente la misma estructura y capacidad de unirse a C5 que los Ligandos de Ácido Nucleico mostrados en la Tabla 4 (SEC ID NOS:47-74), Tabla 5 (SEC ID NOS:76-83), Tabla 8 (SEC ID NOS:75, 160-162), Tabla 10 (SEC ID NOS:163-189), Tabla 12 (SEC ID NOS:190-192), Tabla 13 (SEC ID NOS:194-196) y las Figuras 5A-B (SEC ID NOS:160 y 193). Sustancialmente la misma capacidad de unirse a C5 significa que la afinidad se encuentra en uno o dos órdenes de magnitud de la afinidad de los ligandos descritos aquí. Es bien conocida por los expertos en la materia la determinación de si una secuencia determinada - sustancialmente homóloga con las descritas específicamente aquí - tiene sustancialmente la misma capacidad de unirse a C5.
La presente invención también incluye Ligandos de Ácido Nucleico que tiene sustancialmente la misma estructura o motivos estructurales postulados. Se pueden postular sustancialmente la misma estructura o motivos estructurales mediante la alineación de secuencias utilizando el programa de Zukerfold (véase Zucker (1989) Science 244:48-52). Tal como se conoce en la técnica, se pueden utilizar otros programas informáticos para predecir la estructura y motivos estructurales secundarios. También se pueden postular sustancialmente la misma estructura o motivo estructura de Ligandos de Ácido Nucleico en solución o como una estructura unida utilizando RMN u otras técnicas conocidas en el sector.
Un problema potencial hallado en el uso terapéutico, profiláctico y diagnóstico in vivo de Ácido Nucleicos es que los oligonucleótidos en su forma fosfodiéster se pueden degradar rápidamente en los fluidos corporales mediante enzimas intracelulares y extracelulares, tales como endonucleasas y exonucleasas antes de que se manifieste el efecto deseado. Se pueden realizar varias modificaciones químicas del Ligando de Ácido Nucleico para incrementar la estabilidad in vivo del Ligando de Ácido Nucleico o para potenciar o mediar la liberación del Ligando de Ácido Nucleico. Véase, por ejemplo, la Solicitud de Patentes de Estados Unidos de No. de Serie 08/117,991, presentada el 8 de septiembre de 993, titulada "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides", ahora abandonada (véase también la Patente de Estados Unidos No. 5,660,985) y la Solicitud de Patentes de Estados Unidos de No. de Serie 08/434,465, presentada el 4 de Mayo de 1995 titulada "Nucleic Acid Ligand Complexes". Entre las modificaciones de los Ligandos de Ácido Nucleico contempladas en la presente invención se incluyen, pero sin limitación, aquellas que proporcionan otros grupos químicos que incorporan una carga adicional, polarizabilidad, hidrofobicidad, enlace de hidrógeno, interacción electrostática, y fluxionalidad a las bases del Ligando de Ácido Nucleico o al Ligando de Ácido Nucleico como tal. Entre dichas modificaciones se incluyen, pero sin limitación, modificaciones en la posición 2' del azúcar, modificaciones en la posición 5 de la pirimidina, modificaciones en posición 8 de la purina, modificaciones en las aminas exocíclicas, sustitución de 4-tiouridina, sustitución de 5-bromo o 5-yodo-uracilo, modificaciones del esqueleto, modificaciones de fosforotioato o alquil fosfato, mutilaciones, combinaciones inusuales de emparejamientos de bases, tales como las isobases isocitidina e isoguanidina y similares. Las modificaciones también pueden incluir modificaciones 3' y 5', tales como terminadores de cadena.
Cuando se derivan Ligandos de Ácido Nucleico mediante el método SELEX las modificaciones pueden ser modificaciones pre-SELX o post-SELEX. Las modificaciones pre-SELEX producen Ligandos de Ácido Nucleico con especificidad por su diana SELEX y una mejor estabilidad in vivo. Las modificaciones post-SELEX realizadas a Ligandos de Ácido Nucleico en 2'-OH pueden dar lugar a una mejor estabilidad in vivo sin afectar de manera adversa a la capacidad de unión del Ligando de Ácido Nucleico. Las modificaciones preferidas de los Ligandos de Ácido Nucleico de la presente invención son las terminaciones de cadena con 5' y 30 fosforotioato y/o la unión de fosfodiéster invertida 3'-3' en el extremo 3'. En una realización preferida, la modificación preferida del Ligando de Ácido Nucleico es una unión fosfodiéster invertida 3'-3' en el extremo 3'. Se prefiere la modificación adicional 2'-fluoro (2'-F) y/o 2'-amino (2'-NH_{2}) y/o 2'-Ometil (2'-OMe) de algunos o todos los nucleótidos. Se describen aquí Ligandos de Ácido Nucleico que se modificaron en 2'-NH_{2} o modificado en 2'-F y se incorporaron en el proceso SELEX. También se describen aquí Ligandos de Ácido Nucleico modificados en 2'-F derivados del proceso SELEX que se modificaron para comprender 2'-OMe purinas en modificaciones post-SELEX. Los expertos en la materia conocen otras modificaciones. Dichas modificaciones pueden ser post-SELEX (modificación de ligandos no modificados identificados previamente) o mediante la incorporación en el proceso SELEX.
Tal como se ha descrito anteriormente, debido a su capacidad de unirse selectivamente a C5, los Ligandos de Ácido Nucleico para C5 descritos en la presente invención son útiles como agentes farmacéuticos. La presente invención, por tanto, también incluye un método para tratar enfermedades mediadas por el Sistema de complemento mediante la administración de un Ligando de Ácido Nucleico de unión a una Proteína del Sistema de complemento o proteínas homólogas.
Los Ligandos de Ácido Nucleico para C5 podrían inhibir la activación del Sistema de complemento en la enfermedad de Alzheimer o el infarto de miocardio, tanto si el Sistema de complemento es activado a través de C1q por mecanismos con anticuerpos o sin anticuerpos, o si es independiente de C1q a través del mecanismo alternativo. De este modo, los Ligandos de Ácido Nucleico de la presente invención se pueden ser útiles en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer o el infarto de miocardio.
Las composiciones terapéuticas de los Ligandos de Ácido Nucleico se pueden administrar parenteralmente mediante inyección, aunque también se prevén otras formas de administración eficaces, tales como la inyección intraarticular, vapores inhalantes, formulaciones oralmente activas, iontoforesis transdérmicas o supositorios. Un portador preferido es una solución salina fisiológica, pero se contempla que se pueden utilizar otros portadores farmacéuticamente aceptables. En una realización preferida, se prevé que el portador y el Ligando de Ácido Nucleico constituyan una formulación de liberación lenta fisiológicamente compatible. El disolvente primario en dicho portador puede se de naturaleza acuosa o no acuosa. Además, el portador puede contener otros excipientes farmacológicamente aceptables para modificar o mantener el pH, la osmolaridad, la viscosidad, la claridad, el color, la esterilidad, la estabilidad, la velocidad de disolución, o el olor de la formulación. De manera similar, el portador puede contener otros excipientes farmacológicamente aceptables para modificar o mantener la estabilidad, velocidad de disolución, liberación o absorción del ligando. Dichos excipientes son aquellas sustancias utilizadas normalmente y de forma habitual para formular dosificaciones para la administración parenteral en dosis unitarias o en forma de multidosis.
Una vez se ha formulado la composición terapéutica, se puede almacenar en viales estériles como una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido o polvo deshidratado o liofilizado. Dichas formulaciones se pueden almacenar en una forma que está lista para su uso o que requiere la reconstitución inmediatamente antes de la administración. La forma de administrar las formulaciones que contienen Ligandos de Ácido Nucleico para liberación sistémica puede ser por vía subcutánea, intramuscular, intravenosa, intranasal o supositorio vaginal o rectal.
Los siguientes Ejemplos se proporcionan para explicar e ilustrar la presente invención y no pretenden ser limitantes de la invención. Estos Ejemplos describen el uso de la metodología SELEX para identificar ligandos de ARN de afinidad elevada para C1q, C3 y C5. El Ejemplo 1 describe varios materiales y procedimientos experimentales utilizados en el Ejemplo 2. El Ejemplo 2 describe la generación de Ligandos de Ácido Nucleico 2'-F de la proteína del Sistema de complemento C5. El Ejemplo 3 describe un ensayo de la inhibición hemolítica para ligandos de ARN 2'-F para C5. El Ejemplo 4 describe un ensayo de la inhibición de liberación de C5a por un Ligando de Ácido Nucleico (clon C6) para C5 humano. El Ejemplo 5 describe experimentos en el límite realizados para determinar la secuencia de unión mínima de los Ligandos de Ácido Nucleico a C5 humano. El Ejemplo 6 describe un experimento SELEX predispuesto realizado para mejorar la afinidad del Ligando de Ácido Nucleico utilizando una secuencia truncada de 42 unidades del clon C6 como secuencia aleatoria en el molde. El Ejemplo 7 describe los resultados de las sustituciones 2'-OMe purina en un Ligando de Ácido Nucleico para C5 humano en un ensayo de interferencia. El Ejemplo 8 describe la estructura de un truncado de 38 unidades de un Ligando de Ácido Nucleico para C5 humana. El Ejemplo 9 describe un ensayo homolítico de Ligandos de Ácido Nucleico para C5 humana sustituidos con 2'-OMe purina.
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Ejemplo 1
Procedimientos experimentales
Este ejemplo proporciona los procedimientos generales seguidos e incorporados en el Ejemplo 2, para la identificación de ligandos 2'-F para C3 y C5.
A. Productos bioquímicos
Se obtuvo suero de cobayas con deficiencia en C1q, C3, C5 y C4 de Quidel (San Diego, CA). La albúmina de suero bovino (BSA), anti-BSA de conejo, CRP. SAP y péptidos amiloides 1-40 y 1-42 se obtuvieron de Sigma (St. Louis. MO). Los nucleótidos GTP, ATP y desoxinucleótidos se obtuvieron de Pharmacia (Uppsala, Suecia). La Taq polimerasa se obtuvo de Perkin-Elmer (Norwalk. CT). Los nucleótidos modificados 2'-NH_{2}-CTP y 2'-NH_{2}-UTP, y 2'-F-CTP y 2'-F-UTP, se prepararon tal como se describe en Jellinek et al. (1995) Biochem. 34:11363. La transcriptasa inversa aviar se obtuvo de Life Sciences (St. Petersburg. FL) y la T7 ARN polimerasa de USB (Cleveland, OH). Se obtuvieron filtros de nitrocelulosa de Millipore (Bedford. MA). Todos los productos químicos eran del grado más elevado posible.
B. Procedimientos SELEX con ARN
El procedimiento SELEX se ha descrito en detalle en las Solicitudes de Patentes de SELEX (véase también Jellinek et al. (1995) Biochem. 34:11363; Jellinek et al. (1994) Biochem. 33:10450). Resumidamente, se sintetizó un molde de ADN con una región fijada en 5' que contenía el promotor T7, seguido de un tramo de 30 N a 50 N de secuencia aleatoria y, a continuación, con una región fijada en 3' (Tabla 1:SEC ID NOS:1 y 156). Para la ronda inicial del proceso SELEX, se transcribió in vitro 1 nmol (\sim1014 secuencias únicas) de ARN (Tabla 1; SEC ID NOS:2 y 157) mediante la T7 polimerasa (Milligan et al. (1987) Nucleic Acids Res. 12:785) utilizando GTP/ATP mezclados y nucleótidos 2'-NH_{2}-CTP/UTP o 2'-F-CTP/UTP, y con la adición de \alpha-[^{32}P]-ATP. Para ésta y las secuencias posteriores del proceso SELEX, el ARN se purificó mediante electroforesis en geles de acrilamida al 8% con urea 7 M, Tris-borato 10 mM, EDTA 2 mM, pH 8,3, tampón de electroforesis. Después de la autorradiografía, la banda que contenía el transcrito de ARN modificado marcado se escindió y se congeló a -70ºC, a continuación se añadieron 400 mL de NaCl 100 mM, EDTA 2 mM, el gel se molió y se centrifugó la emulsión a través de 2 cm de lana de vidrio (Rnase-free - Alltech Associates. Deerfield, IL) y dos filtros de nitrocelulosa. El ARN se precipitó mediante la adición de 1/5 vol de NH_{4}OAc 6,6 M, pH 7,7, más 2 vol. de etanol. El residuo se lavó dos veces con etanol al 80%, y se llevó a sequedad. El residuo de ADN seco se disolvió en solución salina tamponada de fosfato (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning. A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) que contenía MgCl_{2} 1 mM (MgPBS).
Para cada ronda del proceso de SELEX, se incubó el ARN con C1q, C3 o C5 en MgPBS durante 10 minutos a 37ºC. A continuación, la muestra se filtró a través de un filtro de nitrocelulosa de 43 mm y el filtro se lavó con 10 mL de MgPBS. Para las mismas rondas, el ARN diluido se humedeció previamente con filtros de nitrocelulosa durante la noche para reducir el ruido de fondo. Se desarrollaron cuatro muestras en paralelo para la mayoría de las rondas con menores cantidades (elegidas para que estuvieran en un intervalo adecuado para medir la unión) de ARN y C1q, C3 o C5 para medir la Kd de unión para cada muestra. Además, en cada ronda, se filtró una muestra de ARN sin proteína para determinar el ruido de fondo.
Los filtros se secaron al aire, se trocearon en tiras, se contaron y a continuación se extrajeron durante 60 minutos a 37ºC con 400 mL de SDS al 1%, 0,5 mg/mL de Proteinasa K (Boehringer Mannheim. Indianapolis. IN), 1,5 mM de DTT, 10 mM de EDTA. 0,1 M Tris, pH 7,5, con la adición de 40 mg de portador ARNt. El ARN acuoso se extrajo con fenol, fenol/cloroformo (1:1), y cloroformo y, a continuación, se precipitó tras la adición de NH_{4}OAc/EtOH como antes. El ARN se transcribió de forma inversa en un volumen de 50 mL entre 1 hora y toda la noche. El ADN se amplificó por PCR con cebadores específicos (Tabla 1: SEC ID NOS:3-4) en un volumen de 500 mL durante 12-14 ciclos, y a continuación se extrajo con fenol/cloroformo y se precipitó con NaOAc/EtOH. El residuo de ADN se tomó en H_{2}O y se transcribió una alícuota con T7 para la siguiente ronda del proceso de SELEX.
C. Clonación
El ADN de la ronda 12 o la ronda 14 se amplificó por PCR con cebadores que también contenían un sitio de unión para facilitar la clonación. El ADN se clonó en un vector pUC9 y se eligieron las colonias para el crecimiento durante la noche y las minipreparaciones del plásmido (PERFECTprep, 5'-3', Boulder, CO). Los plásmidos purificados se amplificaron por PCR con los cebadores originales 3' y 5' (como antes) y los productos se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning. A laborarory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). El ADN se transcribió utilizando T7 con \alpha[^{32}P]-ATP para preparar ARN radiomarcado para el análisis de unión y sin radiomarcador para preparar el ARN para estudios de inhibición.
D. Secuenciación
Los plásmidos purificados utilizando el kit PERFECTprep se secuenciaron con el kit de ciclado ABI dRhodamine Terminator (Perkin-Elmer). Las muestras se secuenciaron en el secuenciador de ADN ABI Prism 377 DNA.
E. Ensayos de unión
El ADN clonado individual se transcribió utilizando T7 con \alpha[^{32}P]-ATP y se purificó en gel [^{32}P]-2'-NH_{2}-ARN o 2'-F-ARN de longitud completa (como antes). El ARN se suspendió a aproximadamente 5.000 cpm por 30 mL de muestra (<10 pM), y se incubaron alícuotas con varias concentraciones de C1q, C3 o C5 en MgPBS durante 10 minutos a 37ºC. A continuación, las muestras se filtraron a través de nitrocelulosa, los filtros se lavaron con tampón y se secaron bajo una lámpara infrarroja y se contaron con la adición de fluido de centelleo (Ecoscint A, National Diagnostics, Atlanta, GA). Se desarrolló en paralelo una muestra base de ARN solo. Para medir la inhibición de la unión del ligando a C1q, el Ligando de Ácido Nucleico ARN más C1q más inhibidor (por ejemplo, sitio de los residuos 14-26 de la cadena A, SAP, péptido \beta-amiloide, CRP) se incubaron durante 10 minutos a 37ºC, y a continuación se filtraron. Los filtros se lavaron y se contaron.
También se midió la unión del ligando ARN a C1q en presencia de complejos inmunes, que bloquearían la unión de ligandos a los grupos de cabeza de C1q. Los complejos inmunes (IC) se formaron mezclando 620 mg de BSA en equivalencia con 1 mL de anti-BSA de conejo (Sigma, St. Louis. MO) más PEG 8000 añadido hasta un 1% de concentración final, y a continuación, las muestras se incubaron durante la noche a 4ºC. Los IC se pusieron en pélets mediante centrifugación a 12.000 rpm durante 10 minutos, se lavaron cinco veces con PBS y se suspendieron en 1 ml de MgPBS. Para la medición de la unión del clon de ARN de C1q a C1q-complejos inmunes (C1q-IC), 20 mL del [^{32}P]-ARN purificado más 20 mL del IC se mezclaron con 20 mL de C1q a varias concentraciones entre 10^{-11} y 10^{-7} M en MgPBS más Triton al 1%. Las muestras se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente, se microcentrifugaron y se contaron los pélets y sobrenadantes.
F. Ensayos hemolíticos
El agotamiento del Sistema de complemento se midió mediante el ensayo hemolítico de C4 tal como se ha descrito (Gaither et al. (1974) J. Immunol. 113:574). Todas las muestras se diluyeron y el ensayo se desarrolló en solución salina tamponada con veronal que contenía calcio, magnesio y gelatina al 1% (GVB-tampón de complemento). Para la medición del agotamiento de C4 mediante el agotamiento del péptido \beta-amiloide, se añadió el péptido a 250 mg/mL hasta una dilución de 1/8 del suero humano completo y, a continuación, se incubó durante 60 minutos a 37ºC. A continuación, la muestra se diluyó para el ensayo de actividad hemolítica de C4. Para el ensayo de inhibición del agotamiento de complemento mediado por el péptido \beta-amiloide por clones de 2'-NH_{2}-ARN de C1q, el Ligando de Ácido Nucleico de ARN de C1q se incluyó en la mezcla de incubación de péptido \beta-amiloide-suero completo humano y, a continuación, las cantidades de C4 analizadas anteriormente.
La inhibición del Sistema de complemento por Ligandos de Ácido Nucleico de C5 se midió utilizando suero humano y glóbulos rojos de oveja recubiertos de anticuerpo. Se incubaron glóbulos rojos con una dilución 1:40 de suero humano nuevo y con diluciones en serie de ligando de C5 durante 30 minutos a 37ºC. Las diluciones de suero y ligando se realizaron en tampón de complemento (véase el párrafo anterior). Después de la incubación, las muestras se diluyeron entonces con tampón a 4ºC que contenía EDTA para detener la reacción, y se cuantificó la liberación de hemoglobina a partir de la densidad óptica a 412 nm.
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Ejemplo 2
Ligandos de 2,2'-Fluoro Ácido Nucleico de la Proteína del Sistema de complemento C5
Con el fin de generar ligandos para la proteína complemento humana C5, se generó una biblioteca de aproximadamente 1014 ARN que contenía 30 nucleótidos de secuencia aleatoria contigua flanqueada por secuencias definidas. En este experimento, los nucleótidos aleatorios de 30N de la Mezcla de candidatos inicial comprendía bases 2'-F pirimidina. Resumidamente, se sintetizó un molde de ADN con una región fijada a 5' que contenía el promotor T7, seguido de un tramo de 30 N de secuencia aleatoria, y a continuación con una región fijada a 3' (Tabla 1; SEC ID NO: 1). Las rondas de selección y amplificación se llevaron a cabo tal como se ha descrito ene el ejemplo 1 utilizando técnicas conocidas en el sector. Las rondas iniciales del experimento SELEX se establecieron con concentraciones elevadas de 2'-F ARN (7,5 mM) y proteína (3 mM), ya que la unión de C5 a ARN no seleccionado era bastante baja. El experimento SELEX se diseñó para inducir la unión de ARN en el sitio de separación de C5a-C5b. El ARN y C5 se incubaron junto con pequeñas cantidades de tripsina con el razonamiento de que el tratamiento limitado con tripsina de C5 produce un único sitio de separación y genera una actividad de tipo C5a (Wetsel y Kolb (1983) J. Exp. Med. 157:2029). Esta separación condujo a un ligero incremento en la unión de ARN aleatorio. El aumento de la unión de ARN asociado estructuralmente con la exposición al dominio de tipo C5a podría desarrollar Ligandos de Ácido Nucleico que se unen próximos al sitio de la C5 convertasa y podría interferir o inhibir la separación de C5. El experimento SELEX se realizó simultáneamente sobre proteína nativa y sobre proteína tripsinizada de forma suave, de manera que el desarrollo del Ligando de Ácido Nucleico elegiría el ganador de mayor afinidad. Con este procedimiento, se desarrollarían el ganador con mayor afinidad contra las muestras múltiples de proteína y se podrían obtener múltiple aptámeros y aptámeros específicos con un único experimento SELEX.
Para cada ronda del proceso SELEX, se realizó el procedimiento en paralelo en tubos separados con un exceso de aproximadamente 5 veces de ARN en tampón solo o con la adición de tripsina entre 0,3 y 0,001 mg/mL. Las muestras se incubaron en MgPBS durante 45 minutos a 37ºC, y a continuación se filtraron a través de nitrocelulosa. Los filtros se lavaron, se secaron y se contaron, extrajeron y se transcribieron de forma inversa, a continuación se amplificaron por PCR y finalmente se transcribieron utilizando T7 in vitro en ARN utilizando los nucleótidos mezclados GTP/ATP y 2'-F-CTP/UTP y [^{32}P]-ATP. El ARN se purificó mediante electroforesis en geles de acrilamida al 8% con urea 7 M y tampón Tris-Borato EDTA (TBE). El ARN se aisló y se precipitó con NH_{4}OAc/etanol y, a continuación, se disolvió en solución salina tamponada con fosfato que contenía MgCl_{2} (MgPBS) 1 nM. Los filtros con la unión más elevada siguieron adelante. Al final de cada ronda, se agrupó todo el ARN que se unió a la proteína (con o sin tripsina). Se redujeron las concentraciones de proteína ARN con concentraciones finales de 2,5 nM y 10 nM, respectivamente. Se añadió tripsina a concentraciones entre 0,3 y 0,0001 mg/mL. La unión de base se monitorizó en cada ronda y empezando por la ronda cuatro el ARN transcrito se prehumedeció durante la noche con filtros de nitrocelulosa antes de las rondas SELEX para reducir el ruido de fondo (base).
En base a la unión de ARN a C5 nativo mediante el ensayo de nitrocelulosa, se clonó el ADN de la ronda 12 y se obtuvieron secuencias tal como se muestra en la Tabla 4 (SEC ID NOS:47-74). Las secuencias se agruparon según la homología y la función. Las secuencias del grupo I eran muy homogéneas y podrían haber surgido por la mutación por PCR a partir de una única secuencia original. Las afinidades de unión de los Ligandos de Ácido Nucleico del grupo I son muy similares y se muestran en la tabla 7. Los Ligandos de Ácido Nucleico del grupo II unidos en general con afinidad similar con lo Ligandos de Ácido Nucleico del grupo I, aunque también estaban presenten algunas uniones débiles. Las secuencias y longitud del grupo II son más diversas que los Ligandos de Ácido Nucleico del grupo I. Los Ligandos de Ácido Nucleico de C5 no se unen a otros componentes complemento que incluyen C1q, C3. o factores B, H, o D.
Los Ligandos de Ácido Nucleico de cada familia también se analizaron por la inhibición de la actividad del Sistema de complemento en ratas (Tabla 5; SEC ID NOS:76-83). Los Ligandos de Ácido Nucleico de la Familia I y la Familia III inhibieron el complemento de rata, mientras que el Ligando de Ácido Nucleico de la Familia II no lo hizo. Se puede utilizar un Ligando de Ácido Nucleico inhibidor para inhibir la actividad del Sistema de Complemento en varios modelos de enfermedad de rata incluyendo, pero sin limitación miastenia gravis, infarto de miocardio, glomerulonefritis, ARDS, artritis y transplante.
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Ejemplo 3
Inhibición hemolítica de Ligandos 2'-F ARN para C5
Los Ligandos de Ácido Nucleico 2'-F ARN para C5 (Ejemplo 2) se analizaron por la inhibición hemolítica mediante la inclusión de diluciones en un ensayo estándar para lisis de suero humano de eritrocitos de oveja recubiertos de anticuerpo. Las células de oveja se mezclaron con una dilución 1:40 de suero que contenía Ligando de Ácido Nucleico o tampón, y se incubaron durante 30 minutos a 37ºC. Después de la desactivación con tampón de EDTA frío, las muestras se centrifugaron y se leyeron los sobrenadantes a una DO de 412 nm. Los Ligandos de Ácido Nucleico del grupo I inhibieron hasta casi la línea base a 1 mM, con una Ki de 60-100 nM. Los resultados se muestran en la figura 1. Los resultados del ensayo de inhibición de la hemólisis sugirieron que los Ligandos de Ácido Nucleico 2'-F ARN para C5 reconocen un sitio específico en C5, donde bloquean la interacción de C5 con la C5 convertasa de Complemento. Estos resultados también confirmaron que los Ligandos de Ácido Nucleico 2'-F ARN son estables en el suero.
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Ejemplo 4
Inhibición de la liberación de C5a
La interacción de Ligando de Ácido Nucleico-C5 que inhibe la separación de C5 evitaría la formación del ensamblaje de C5b y MAC. La inhibición de la separación de C5 debería inhibir también la liberación de C5a, y esto se muestra en el siguiente experimento con el clon C6 (SEC ID NO:51) (Ejemplo 2). Para estos experimentos, las diluciones del clon C6 se incubaron con suero completo humano en GVB^{++} (solución salina tamponada con veronal que contenía calcio, magnesio y gelatina al 1%) más la adición de zymosan durante 30 minutos a 37ºC. A continuación, se desactivaron las muestras con tampón EDTA y se centrifugaron y se analizaron los sobrenadantes por C5a mediante radioinmunoensayo (RIA) (Wagner y Hugli (1984) Anal. Biochem. 136:75). Los resultados mostraron que el clon C6 inhibía la liberación de C5a con una Ki de aproximadamente 100 nM (Figura 2), mientras que el ARN del grupo aleatorio de control no produjo inhibición (datos no mostrados). Este ensayo también demostró la estabilidad en suero del clon C6.
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Ejemplo 5
Límites del clon C6
El clon C6 (SEC ID NO:51) (Ejemplo 2) se seleccionó para la determinación de una secuencia de unión mínima. Esto se realizó de las dos maneras siguientes.
1) Las secuencias mínimas de ARN (límites 5' y 3') requeridos para la unión del clon C6 a C5 se determinaron mediante la hidrólisis parcial del clon C6 y la determinación de la unión a proteína (Green et al. (1995) Chem. Biol. 2:683). Resumidamente, el clon C6 se sintetizó como 5'-[^{32}P]-quinasa marcada (para determinar el límite 3') o 3'-[^{32}P]-pCp marcada (para determinar el límite 5') y se purificaron los oligonucleótidos. A continuación, los oligonucleótidos se sometieron a hidrólisis alcalina, que divide los oligonucleótidos desde el extremo 3' hasta las bases de purina. El ARN parcialmente hidrolizado se incubó a continuación con C5, y se separó en nitrocelulosa el ARN que se unió a la proteína C5 y se eluyó de la proteína. El ARN separado junto con una escalera de ARN se desarrollaron sobre un gel de secuenciación de acrilamida al 8%/urea 7 M. Se determinó el límite en el que la eliminación de una o más bases reduciría o eliminaría la unión mediante la comparación de ARN seleccionado (ARN que se unió a C5) frente a ARN no seleccionado (ARN que no se unió a C5).
El ARN marcado se digirió también con T1 nucleasa (que divide los oligonucleótidos desde el extremo 3' hasta los residuos de A), se incubó con C5 y se dividió al igual que antes, para una segunda escalera. La figura 3ª muestra los resultados de la digestión del ARN marcado con 5' quinasa. En esta figura, la secuencia 3' (marcada en el extremo 5') se alinea con la escalera de hidrólisis alcalina. A la izquierda se encuentra la escalera T1 y a la derecha los ARN seleccionados con concentraciones 5x y 1 x de C5. El límite en el que la eliminación de una base elimina la unión se muestra mediante la flecha. El asterisco muestra una G que es hipersensible a T1. Otros nucleótidos G en las secuencias mínimas están protegidos de la digestión con T1. La figura 3B muestra los resultados del ARN unido a 3'-pCp. En esta figura, la secuencia 5' (marcada en el extremo 3') se alinea con la escalera de hidrólisis alcalina. Los carriles de T1 y proteína, el límite y nucleótidos G hipersensibles son tal como se describen para la figura 3A.
2) En un segundo experimento, los resultados obtenidos de los experimentos de los límites descritos anteriormente se utilizaron para construir Ligandos de Ácidos Nucleicos truncados sintéticos para C5. Se sintetizaron varios truncados entre 34 y 42 nucleótidos mediante la eliminación de residuos en ambos extremos del clon C6 (SEC ID NO:51), y se analizó la unión a C5 (tabla 8). El oligonucleótido más corto que se unió a C5 tenía 38 unidades (SEC ID NO: 160), que confirma el gel del límite y que proporciona una estructura preliminar y para el desarrollo posterior de Ligandos de Ácido Nucleico. En la secuencia mínima de 38 unidades, 30 bases eran originarias de la región aleatoria y ocho bases de la región fijada 5' del clon C6. La eliminación de una base de ambos extremos 5' y 3' del tramo de 38 unidades para producir un tramo de 36 unidades (SEC ID NO:161) redujo la unión. Un tramo de 34 unidades (SEC ID NO:162) no se unió. Otros oligonucleótidos con deleciones internas tampoco consiguieron unirse.
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Ejemplo 6
SELEX predispuesto
Se realizó un experimento de SELEX predispuesto para mejorar la afinidad de Ligando de Ácido Nucleico y para definir adicionalmente la estructura. Se utilizó la secuencia del truncado de 42 unidades (SEC ID Nº:75) del Ejemplo 9 (Tabla 8) como molde para el experimento de SELEX predispuesto. Se construyó un molde sintético que comprendía una región aleatoria de 42N flanqueada por nuevas regiones fijadas de n8 (Tabla 10; SEC ID Nº:163) y se sintetizaron (Oligos, etc., CT), en la que se predispuso la región aleatoria hacia el truncado de 42 unidades del clon C6 del primer experimento de SELEX. Se eligió una región aleatoria de 42 unidades en lugar de una secuencia mínima de 38 unidades, ya que las cuatro bases extra se prolongaron en una hélice terminal. Aunque no desea unirse a ninguna teoría, los inventores creyeron que aunque estas cuatro bases extra no fueron esenciales para la unión, se creyó deseable una hélice más larga para ayudar en la selección de la estructura de Ligando de Ácido Nucleico y en la reducción del posible uso de las regiones fijadas en la estructura de Ligando de Ácido Nucleico recién seleccionada. Se sintetizó cada base en la región aleatoria para que contuviera una fracción molar de 0,67 de la base correspondiente a la base en la secuencia de 42 unidades y una fracción molar de 0,125 de cada una de las otras tres bases. Se realizó un experimento de SELEX predispuesto tal y como se describe para el experimento de SELEX estándar en el Ejemplo 1. Se realizó la amplificación por PCR utilizando cebadores mostrados en la Tabla 1 (SEC ID
NºS:158-159).
Se realizó el experimento de SELEX predispuesto con proteína de C5 nativa ya que el clon 6 ya inhibe la hemólisis y no se requiere el tratamiento con tripsina para la unión. La unión del grupo de ARN inicial a C5 fue muy baja, de modo que las concentraciones de proteína y ARN comenzaron en 2,6 \muM y 7,1 \muM, respectivamente, parecido al primer experimento de SELEX. La unión mejoró rápidamente en la ronda tres. Se redujeron gradualmente las concentraciones de ARN y proteína en cada ronda posterior hasta concentraciones finales en la ronda nueve de 62,5 pM y 31 pM, respectivamente. La unión del grupo de ARN a C5 fue aproximadamente de 5 nM (Tabla 9), en comparación con aproximadamente 100 nM para el grupo de ARN del primer experimento de SELEX. Algunas de las mejoras en la afinidad del grupo están causadas por la ausencia de ligandos de afinidad inferior, mutantes de tamaño y enlazadores básicos, que no se les permitió que acumularan concentraciones apreciables durante este experimento de SELEX más rápido.
Tras ocho rondas del proceso de SELEX predispuesto se mejoró el grupo de ARN en aproximadamente 20-50 veces sobre el grupo de la ronda doce del primer experimento de SELEX. Se estima que la mejora total en K_{d} del grupo aleatorio al grupo de ocho rondas del proceso de SELEX predispuesto es superior a 10^{5} veces. En la Tabla 10 se muestran las secuencias aisladas y clonadas del experimento de SELEX predispuesto (SEC ID NºS:164-189). En las secuencias mostradas en la Tabla 10, se separa de la secuencia mínima de 38 unidades el "stem" de parejas de dos bases que es prescindible para la unión. Estas bases no muestran una presión selectiva excepto para mantener el "stem". Ninguna de las secuencias encaja exactamente con la secuencia del molde original.
Se analizaron los clones del experimento de SELEX predispuesto y en la Tabla 11 se muestran las afinidades de unión representativas. La mayoría de clones se unen con una K_{d} de entre 10 y 20 nM y son ligandos de unión de mayor afinidad que el molde (SEC ID Nº:163). Uno de los clones, YL-13 (SEC ID Nº:175), se unió con aproximadamente 5 veces mayor afinidad que otros clones del experimento de SELEX predispuesto y con aproximadamente 10 veces mayor afinidad que el clon C6 (SEC ID Nº:51). Ninguna de las secuencias de Ligando de Ácido Nucleico encajó exactamente con la secuencia utilizada para el molde en el experimento de SELEX predispuesto. Algunas sustituciones de bases son únicas para este conjunto de secuencias del experimento de SELEX predispuesto y podrían justificar el aumento de la afinidad de Ligando de Ácido Nucleico.
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Ejemplo 7
Sustitución de 2'-O-Metilo para protección de nucleasa
Para estabilizar adicionalmente el Ligando de Ácido nucleico, se determinaron las posiciones en las que los nucleótidos 2'-OH-purina podían sustituirse con nucleósidos 2'-O-metilo resistentes a la nucleasa. Se utilizó un ensayo para evaluar simultáneamente diversas posiciones por interferencia de 2'-O-metilo siguiendo el procedimiento descrito por Green et al, (1995) Chem. Biol. 2:683.
En el ensayo de interferencia de 2'-O-metilo, se sintetizaron tres conjuntos de oligonucleótidos basados en un truncado de 38 unidades de secuencia YL-13 (SEC ID Nº:175) del experimento SELEX predispuesto. Estos conjuntos de secuencias, indicadas como M3010 (SEC ID Nº:190), M3020 (SEC ID Nº:191) y M3030 (SEC ID Nº:192) en la Tabla 12 se sintetizaron en un sintetizador de ARN automatizado de un modo en el cual se sintetizaron cada uno de los nucleótidos indicados mediante subrayado negrita en la Tabla 12, el 50% como un 2'-OH-nucleótido y el 50% como un nucleótido 2'-OMe-sustituido. Esto dio lugar a una mezcla de 2^{5} ó 32 secuencias diferentes para cada uno de los conjuntos M3010, M3020 y M3030.
Se marcaron con 5'-[^{32}P]-quinasa los oligonucleótidos 2'-OMe parcialmente sustituidos. Se seleccionaron los oligonucleótidos a 100 nM y 10 nM de C5 y la unión a proteína fue 10 veces mayor sobre la unión base al filtro. Se eluyeron los oligonucleótidos de la proteína, se hidrolizaron de forma alcalina y a continuación se desarrollaron en un gel de secuenciación de acrilamida al 20%/urea 7 M/TBE. En bandas adyacentes se desarrollaron oligonucleótidos no seleccionados con C5. Se cuantificaron las intensidades de banda con un InstantImager (Packard, Meriden, CT). Cuando se separaron estos oligonucleótidos en un gel de acrilamida, las posiciones OH:OMe mezcladas mostraron una intensidad del 50% de una posición 2'-OH completa, debido a que 2'-OMe es resistente a la hidrólisis. También son resistentes las 2'-F pirimidinas y no se muestran en el gel.
Para cada posición, se calculó la proporción de (la intensidad de las bandas seleccionadas mediante unión a proteína)/(intensidad de banda para oligonucleótido no seleccionado para proteína). Se representaron estas proporciones frente a la posición de nucleótido y se determinó un ajuste lineal (Figura 4, círculos blancos). Se realizó el mismo cálculo para oligonucleótidos 2'-OH/2'-OMe mezclados, y estas proporciones se compararon con la curva determinada previamente (Figura 4, círculos negros). Cuando la sustitución de 2'-OMe no interfería con la unión, la proporción estaba dentro de una desviación estándar de la proporción de 2'-OH. No obstante, cuando la sustitución de 2'-OMe interfería con la unión, la preferencia de unión por 2'-OH purina incrementó la proporción. Se determinaron dos nucleótidos en las posiciones 16 y 32 por requerir nucleótidos 2'-OH. De forma separada, se determinó el residuo g5 independientemente de requerir 2'-OH y se determinó el residuo G20 para permitir la sustitución de 2'-OMe, y éstos se utilizaron para normalizar las bandas. Se confirmaron estos resultados mediante la síntesis y el ensayo de oligonucleótidos sustituidos de 2'-OMe. Las posiciones de 2'-OH obligadas están en uno de los dos salientes ("bulge"), o en el bucle en la supuesta estructura plegable, sugiriendo que estas características están implicadas en la interacción de proteínas. Una vez se determinaron las posiciones de 2'-OMe admisibles, se sintetizaron los oligonucleótidos sustituidos y se midieron las afinidades de unión relativas.
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Ejemplo 8
Estructura de ligando de ácido nucleico C5 humano
En la Figura 5A se muestra el supuesto plegamiento y emparejamiento de bases, basados en los experimentos de truncamiento, sensibilidad a la nucleasa, patrones de sustitución de bases del experimento de SELEX predispuesto, y sustituciones de 2'-OMe, para el truncado de 38 unidades del clon C6 junto con bases alternativas. Las secuencias básicas son el truncado de 38 unidades (SEC ID Nº:160). Entre paréntesis están las variantes del primer experimento de SELEX. Entre corchetes estás las variantes del experimento de SELEX predispuesto. Las bases en minúscula derivan de la región fijada 5'-n7 del primer experimento de SELEX. Las bases en mayúscula derivan de la región aleatoria original.
La estructura de "stem"-bucle tiene entre 12 y 14 pares de bases: a) las pares de bases 5',3'-terminales propuestas (c1-a3, y U36-G38); b) pares de bases de "stem"-bucle (U11-U14 y G24-A27) están apoyados por cambios covariantes durante el procedimiento de SELEX predispuesto: y c) el "stem" medio (g7-C10 y G28-C34), que se conserva generalmente, U9-A32 que es invariante y g8-C33 conservado durante el procedimiento de SELEX predispuesto. El cambio u4\rightarrowc4 mejora la unión, y este cambio se encuentra en todos los clones del experimento de SELEX predispuesto, y las variantes G29, A29 se encuentran sólo en clones del experimento de SELEX predispuesto.
Generalmente se conserva el saliente UUU. Una secuencia original contenía dos bases U, sin reducción en la unión, y se descubrieron dos Ligandos de Ácido Nucleico con una única sustitución de base durante el experimento de SELEX predispuesto. Se conserva el par de bases C10-G28 después del saliente UUU. Esta región con un saliente y "stem" conservados está implicada probablemente en la interacción de proteínas. El "stem"-bucle de G15 a U23 está muy conservado, excepto las bases 19.
El patrón de sustitución de 2'-OMe concuerda con esta estructura (SEC ID Nº:193; Figura 5B). Se muestran en negrita las posiciones en las que se pueden hacer sustituciones de 2'-OMe. Se muestran subrayadas las tres posiciones que deben ser 2'-OH. Las bases de 2'OH obligadas en g5, G17 y A32 están en regiones salientes o bucles que podrían formar estructuras tridimensionales únicas requeridas para la unión a proteína. Las posiciones permitidas para la sustitución de 2'-OMe aparecen en regiones de "stem" en las que es más probable una estructura helicoidal estándar.
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Ejemplo 9
Ensayo hemolítico de Ligandos de Ácido Nucleico sustituidos con 2'-OMe para C5 humana
Se sintetizaron tres oligonucleótidos en base al clon YL-13 del experimento de SELEX predispuesto para comparar el efecto de la sustitución de 2'-OMe en la inhibición hemolítica: (1) un truncado de 38 unidades B2010 (SEC ID NO:194), en el que todos los nucleótidos fueron 2'-OH; (2) un truncado de 38 unidades en el que un nucleótido (posición 20) era un 2'-OMe-G (B2070; SEC ID NO: 195); y (3) un truncado de 38 unidades en el que se sintetizaron el número máximo de posiciones permisibles (posiciones 2, 7, 8, 13, 14, 15, 20, 21, 22, 26, 27, 28, 36 and 38) como 2'-OMe-G y 2'-OMe-A (M6040: SEC ID NO:196) tal como se muestra en la Tabla 13. Se analizaron en el ensayo hemolítico tal como se describe en el Ejemplo 7. Los resultados se muestran en la figura 6. Tal como se muestra en la figura 6, la K disminuyó con el aumento de sustitución 2'-O-Me. La K_{d} fue marginalmente mejor (datos no mostrados). Este experimento mostró que la estabilidad del ligando de ácido nucleico aumenta con la sustitución de 2'-OMe y que la inhibición in vivo a largo plazo del sistema de complemento es factible.
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TABLA 1
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TABLA 7 Afinidad de unión de los ligandos de ácido nucleico C5
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TABLA 8 Efecto del truncamiento del clon C6 en la unión a C5
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TABLA 9 Unión de grupos SELEX
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14
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TABLA 11 Afinidad de unión de clones del experimento de SELEX predispuesto
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TABLA 12 Secuencias basadas en YL-13 de SELEX predispuesto
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TABLA 13 Truncados basados en YL-13 para el ensayo hemolítico
18 
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Referencias citadas en la descripción
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<130> NEX 50 CIP2 PCT
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\hskip-.1em\dddseqskip
taatacgact cactataggg aggacgatgc gg 
\hfill
32 
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tcgggcgagt cgtctg 
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(80)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-NH2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
27 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(80)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-NH2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
28 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(80)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-NH2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm
29 
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(79)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-NH2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm
30 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(79)
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<223> Todas las c y u son 2'-NH2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
31 
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(81)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-NH_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
32 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 81
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<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(81)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-NH_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm
33 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(80)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-NH_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm
34 
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
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<222> (1)..(81)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-NH_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\hskip1cm
35 
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(78)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-H2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\hskip1cm
36 
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 62
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<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(62)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\hskip1cm
37 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
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<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\hskip1cm
38 
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(60)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggaggacga ugcggaacuc aaugggccga cuuuuuccgu guccucagac gacucgcccg 
\hfill
60 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(60)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggaggacga ugcggaacuc aaugggccga cuuuccgugg uccucagacg acucgcccga 
\hfill
60 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\hskip1cm
39 
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1a..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\hskip1cm
40 
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(60)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggaggacga ugcggaacuc aaugggccga cuuuuccgug guccucagac gacugcccga 
\hfill
60 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(60)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggaggacga ugcggacgca ggggaugcuc acuuugacuu uaggccagac gacucgcccg 
\hfill
60 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
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<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(60)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggaggacga ugcggacucg gcauucacua acuuuugcgc ucgucagacg acucgcccga 
\hfill
60 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\hskip1cm
41 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\hskip1cm
42 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\hskip1cm
43 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\hskip1cm
44 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\hskip1cm
45 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
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46 
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
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<223> Todas las c y u son 2'-F
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\hfill
60 
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
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gggaggacga ugcggcguca cgagcuuuau gcguucucug uggucagacg acucgcccga 
\hfill
60 
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
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\hfill
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52 
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
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<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
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<223> Todas las c y u son 2'-F
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggaggacga ugcgguggcg auuccaaguc uuccgugaac aucagacgac ucgcccga 
\hfill
58 
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
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<221> base modificada
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<223> Todas las c y u son 2'-F
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\hskip1cm
54 
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(62)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
55 
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> base modificada
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<222> (1)..(62)
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<223> Todas las c y u son 2'-F
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
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<223> Todas las c y u son 2'-F
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> base modificada
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<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
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<212> ARN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(62)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
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59 
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<212> ARN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(62)
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<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
60 
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(64)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
61 
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<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\hskip1cm
62 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\hskip1cm
63 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\hskip1cm
64 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\hskip1cm
65 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
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<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 59
\hskip1cm
66 
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<211> 62
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<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> base modificada
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<222> (1)..(62)
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<223> Todas las c y u son 2'-F
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\hskip1cm
69 
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\hfill
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gggaggacga ugcuguucag cauucagauc uucacgugug ucagacgacu cgcccga 
\hfill
57 
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggagggcgau ggggugagcg uguaaaaggu ugcgauagag ccucagacga cucgcccga 
\hfill
59 
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<221> base modificada
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<223> Todas las c y u son 2'-F
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74 
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<211> 61
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<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
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<212> ARN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
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\hskip1cm
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<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(42)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gacgaugcgg ucucaugcgu cgagugugag uuuaccuucg uc 
\hfill
42 
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(62)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\hskip1cm
78 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(62)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\hskip1cm
79 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
80 
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<211> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(62)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\hskip1cm
81 
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\hskip1cm
82 
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(62)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\hskip1cm
83 
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(70)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\hskip1cm
84 
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 70
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<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(70)
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<223> Todas las c y u son 2'-F
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<400> 83
\hskip1cm
85 
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<212> ARN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(62)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\hskip1cm
86 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
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<220>
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<221> base modificada
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
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<223> Todas las c y u son 2'-F
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
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60 
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<221> base modificada
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\hfill
59 
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89 
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90 
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
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<223> Todas las c y u son 2'-F
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
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<223> Todas las c y u son 2'-F
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
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<222> (1)..(61)
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<223> Todas las c y u son 2'-F
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
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<223> Todas las c y u son 2'-F
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<211> 61
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<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
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<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
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<212> ARN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
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<223> Todas las c y u son 2'-F
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98 
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<212> ARN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
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<223> Todas las c y u son 2'-F
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
99 
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<212> ARN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(59)
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<223> Todas las c y u son 2'-F
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggaggacga ugcggagaug gauggaagug cuagucuucu ggggucagac gacucgccc 
\hfill
59 
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<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(62)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> Todas las c y u son 2'-F
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 58
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<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> Todas las c y u son 2'-F
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill
58 
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<212> ARN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
103 
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(60)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill
60 
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 108
\hskip1cm
104 
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<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
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<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
105 
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 110
\hskip1cm
106 
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<212> ARN
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
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<220>
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<221> base modificada
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<222> (1)..(61)
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<223> Todas las c y u son 2'-F
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<212> ARN
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
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<222> (1)..(61)
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<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
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<221> base modificada
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109 
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<223> Todas las c y u son 2'-F
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
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<220>
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<221> base modificada
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<222> (1)..(60)
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<223> Todas las c y u son 2'-F
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\hskip-.1em\dddseqskip
ggaggacgau gcggauccgc aaaccgacag cucgaguucc gccucagacg acucgcccga 
\hfill
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<212> ARN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
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<220>
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<221> base modificada
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<220>
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<220>
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<223> Todas las c y u son 2'-F
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggaggacgau gcggaugaug acugaacgug cgacucgacc uggccagacg acucgcccga 
\hfill
60 
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
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<220>
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<221> base modificada
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<222> (1)..(60)
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<223> Todas las c y u son 2'-F
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggaggacgau gcggaugagg aggaagaguc ugaggugcug gggucagacg acucgcccga 
\hfill
60 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 61
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<212> ARN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
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<222> (1)..(61)
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<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 119
\hskip1cm
112 
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<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
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<222> (1)..(68)
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<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 120
\hskip1cm
113 
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<212> ARN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> base modificada
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<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 121
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggaggacga ugcggcagug aaaggcgagu uuucuccucu cccucagacg acucgcccga 
\hfill
60 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 61
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<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 122
\hskip1cm
114 
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<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 123
\hskip1cm
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<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 124
\hskip1cm
116 
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<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 125
\hskip1cm
117 
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<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(60)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 126
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggaggacga ugcggcauag uccggauacu agucaccagc cucguagacg acucgcccga 
\hfill
60 
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<211> 61
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<212> ARN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 127
\hskip1cm
118 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 128
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<211> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(65)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 128
\hskip1cm
119 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(67)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 129
\hskip1cm
120 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 130
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(58)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 130
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggaggacga ugcgggacuc cucgaccgac ucgaccggcu cgucagacga cucgccga 
\hfill
58 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 131
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 131
\hskip1cm
121 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 132
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 132
\hskip1cm
122 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 133
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(57)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggaggacga ugcgggaagu ggaaggguag uugugugacc ucagacgacu cgcccga 
\hfill
57 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> base modificada
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<222> (1)..(67)
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<223> Todas las c y u son 2'-F
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 134
\hskip1cm
123 
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<212> ARN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> base modificada
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
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\hskip1cm
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<212> ARN
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<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
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<212> ARN
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
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<223> Todas las c y u son 2'-F
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<223> Todas las c y u son 2'-F
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127 
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<223> Todas las c y u son 2'-F
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggaggacga ugcgguccgc aaguuuagca cucacugccu cgucagacga cucgcccga 
\hfill
59 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
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<223> Todas las c y u son 2'-F
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggaggacga ugcgguccac aucgaauuuu cuguccguuc gucagacgac ucgcccga 
\hfill
58 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ARN
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
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<222> (1)..(63)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 141
\hskip1cm
128 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(62)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 142
\hskip1cm
129 
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(63)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 143
\hskip1cm
130 
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 64
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<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(64)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 144
\hskip1cm
131 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
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<222> (1)..(60)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 145
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggaggacgau gcgguuccaa aucgucuaag caucgcucgc ucgucagacg acucgcccag 
\hfill
60 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(62)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 146
\hskip1cm
132 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(60)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 147
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggaggacga ugcgguucca caucgaauuu ucuguccgug ucgucagacg acucgcccga 
\hfill
60 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ARN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 148
\hskip1cm
133 
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 149
\hskip1cm
134 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
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<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(63)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 150
\hskip1cm
135 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 151
\hskip1cm
136 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 152
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137 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 153
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<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 153
\hskip1cm
138 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 154
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 154
\hskip1cm
139 
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(61)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 155
\hskip1cm
140 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 156
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<211> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 156
\hskip1cm
141 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 157
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(81)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-NH2
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 157
\hskip1cm
142 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 158
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip1.000000\baselineskip
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36 
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> base modificada
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<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> base modificada
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
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<221> base modificada
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\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(90)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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152 
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<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
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<223> Todas las c y u son 2'-F
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<212> ARN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
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\vskip0.400000\baselineskip
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156 
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<212> ARN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(90)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 177
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157 
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<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(90)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 178
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158 
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(90)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 179
\hskip1cm
159 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(90)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 180
\hskip1cm
160 
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(90)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
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<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(90)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 182
\hskip1cm
162 
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(90)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 183
\hskip1cm
163 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 184
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(90)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 184
\hskip1cm
164 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 185
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(90)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 185
\hskip1cm
165 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 186
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(90)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 186
\hskip1cm
166 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 187
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(90)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 187
\hskip1cm
167 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 188
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(90)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 188
\hskip1cm
168 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 189
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(90)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 189
\hskip1cm
169 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 190
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F. A y g en las posiciones 2, 8, 15, 22 y 28 son 50 % 2'-OH y 50% 2'-O-Metilo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 190
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcg 
\hfill
38 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 191
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(37)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'F. A y g en las posiciones 7, 13, 17, 27 y 36 son 50% 2'-OH y 50% 2'-O-Metilo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 191
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgccgcgguu cgggcgcuga gucugaguuu accugcg 
\hfill
37 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 192
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'F. A y g en las posiciones 15, 21, 26, 32 y 38 son 50% 2'-OH y 50% 2'-O-Metilo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 192
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcg 
\hfill
38 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 193
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'F. A y g en las posiciones 2, 7, 8, 13, 14, 15, 20, 21, 22, 26, 27, 28, 36 y 38 pueden ser 2'-O-Metilo. A y g en las posiciones 5, 17 y 32 deben ser 2'-OH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 193
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgaugcgguc ucaugcgucg agugugaguu uaccuucg 
\hfill
38 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 194
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 194
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcg 
\hfill
38 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 195
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(3B)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F. G en la posición 20 es 2'-O-Metilo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 195
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcg 
\hfill
38 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 196
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(38)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y u son 2'-F. A y g en las posiciones 2, 7, 8, 13, 14, 15, 20, 21, 22, 26, 27, 28, 36 y 38 son 2'-O-Metilo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 196
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcg 
\hfill
38 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 197
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(37)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y t son 2'-F. Todos los nucleótidos están unidos por una unión fosforotioato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 197
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggcggggcta cgtaccgggg ctttgtaaaa ccccgcc 
\hfill
37 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 198
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial: Ácido Nucleico
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> base modificada
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(25)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Todas las c y t son 2'-F. Todos los nucleótidos están unidos por una unión fosforotioato
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 198
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctctcgcacc catctctctc cttct 
\hfill
25

Claims (39)

1. Ligando de ácido nucleico que se une específicamente y con afinidad elevada a la proteína C5 del Sistema de Complemento y que es un inhibidor de la división de la proteína C5 en C5a y c5b, en el que dicho ligando comprende la secuencia:
CGCCGCGGUCUCAGGCGCUGAGUCUGAGUUUACCUGCG
o una secuencia que tiene un grado de homología primaria de secuencia superior a un 80%.
2. Ligando de ácido nucleico según la reivindicación 1, en el que el ligando de ácido nucleico es ARN.
3. Ligando de ácido nucleico según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en el que el ligando de ácido nucleico es de cadena única.
4. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el ligando de ácido nucleico está químicamente modificado.
5. Ligando de ácido nucleico según la reivindicación 4, en el que la modificación química se elige entre:
(i) modificaciones de azúcar en posición 2';
(ii) modificaciones de pirimidina en posición 5;
(iii) modificaciones de purina en la posición 8;
(iv) modificación en aminas exocíclicas;
(v) sustitución de 4-tiouridina;
(vi) sustitución de 5-bromo-uracilo;
(vii) sustitución de 5-yodo-uracilo;
(viii) modificaciones del esqueleto;
(ix) modificaciones de fosforotioato;
(x) modificaciones de alquil fosfato;
(xi) metilaciones;
(xii) terminación de cadena en 3';
(xiii) terminación de cadena en 5'.
6. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que algunos o todos los nucleótidos son 2'-fluoro (2'-F).
7. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que algunos o todos los nucleótidos son 2'-O-metilo (2'-OMe).
8. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que algunos o todos los nucleótidos son 2'-amino (2'-NH_{2}).
9. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en el que todas las bases pirimidina son 2'-fluoro (2'-F).
10. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que G5, G 17 y A32 son 2'-OH.
11. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el ligando tiene una terminación de cadena en 3'.
12. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el ligando tiene una unión fosfodiéster z3'-3' invertida en el extremo 3'.
13. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el ligando tiene una terminación de cadena en 5'.
14. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicho grado de homología primaria de secuencia es superior al 90%.
15. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicho grado de homología primaria de secuencia es superior al 95%.
16. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicho grado de homología primaria de secuencia es superior al 99%.
17. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicha secuencia se elige entre una de las SEC ID No. 190, 191, 192, 194, 195, 196.
18. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicho ligando de ácido nucleico se elige entre una de SEC ID No. 190, 191, 192, 194, 195, 196.
19. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ligando de ácido nucleico es la SEC ID No. 196 o un ligando de ácido nucleico que tiene sustancialmente la misma capacidad de unirse a la proteína C5 e inhibir la división de la proteína C5 en C5a y C5b que SEC ID No. 196.
20. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ligando de ácido nucleico es la SEC ID NO: 196.
21. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ligando de ácido nucleico es la SEC ID No. 194 o un ligando de ácido nucleico que tiene sustancialmente la misma capacidad de unirse a la proteína C5 e inhibir la división de la proteína C5 en C5a y C5b que SEC ID No. 194.
22. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ligando de ácido nucleico tiene una estructura "stem"-bucle.
23. Ligando de ácido nucleico según la reivindicación 22, en el que la estructura "stem"-bucle tiene un saliente UUU.
24. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, en el que el ligando está unido covalentemente con un compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado o un compuesto lipofílico.
25. Ligando de ácido nucleico según la reivindicación 24, en el que el compuesto no inmunogénico de peso molecular elevado es un polialquilenglicol.
26. Ligando de ácido nucleico según la reivindicación 25, en el que el polialquilenglicol es polietilenglicol (PEG).
27. Ligando de ácido nucleico según la reivindicación 26, en el que el PEG tiene un peso molecular de 10 - 80 KDa.
28. Ligando de ácido nucleico según la reivindicación 26, en el que el PEG tiene un peso molecular de 20 - 45 KDa.
29. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que está purificado y aislado.
30. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ligando de ácido nucleico es un inhibidor de la activación del Sistema de Complemento.
31. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la proteína C5 es proteína C5 humana.
32. Fármaco que comprende un ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
33. Fármaco según la reivindicación 32 que comprende un portador farmacéuticamente aceptable.
34. Ligando de ácido nucleico o fármaco según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33 para su uso en el tratamiento de una enfermedad.
35. Uso de un ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 en la fabricación de un fármaco para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad.
\newpage
36. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 para su uso como agente de diagnóstico in vitro.
37. Ligando de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 para su uso como agente de diagnóstico in vivo.
38. Uso de un ligando según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 en la fabricación de un agente de diagnóstico para el diagnóstico de una enfermedad.
39. Ligando, fármaco o uso según cualquiera de las reivindicaciones 34, 35 ó 38, en el que dicha enfermedad es la enfermedad de Alzheimer o un infarto de miocardio.
ES99906778T 1998-02-12 1999-02-05 Ligandos de acido nucleico de afinidad elevada de la proteina c5 del sistema de complemento. Expired - Lifetime ES2345470T3 (es)

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