JP2023073997A - 循環ｒｎａプラットフォーム、その用途、および操作されたｄｎａからの製造プロセス - Google Patents

Abstract

【課題】遺伝子操作されたＤＮＡから環状ＲＮＡを製造するプロセス、得られる真核細胞内での効率的な翻訳が可能な環状ＲＮＡプラットフォーム、およびそれらの使用を提供する。【解決手段】操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡであって、線形化制限酵素、細菌選択システム、および細菌複製起点を含む合成ＤＮＡ骨格、ならびにＲＮＡポリメラーゼプロモーター、環状化配列、５’ＤＮＡスペーサー、制限酵素認識配列を、特定の順序で含む、少環状ＲＮＡモジュール足場、翻訳開始配列、第２の制限酵素認識配列、少なくとも１つのコード配列、第３の制限酵素認識配列、３’ＤＮＡスペーサー、および２番目の環状化配列を含み、前記環状化配列は、核酸に相補的な相同領域配列および／またはＲＮＡライゲーションが可能なタンパク質ベースのシステムを含む、操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡを提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、一般に、環状ＲＮＡ分子を生成する可能性を有する遺伝子操作されたＤＮＡ技術に関し、特に、遺伝子操作されたＤＮＡから環状ＲＮＡを製造するプロセス、得られる真核細胞内での効率的な翻訳が可能な環状ＲＮＡプラットフォーム、およびそれらの使用に関する。

リニア ＲＮＡ
核酸コード化薬物の概念は、２０ 年以上前に、 ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写された （ＩＶＴ） メッセンジャー ＲＮＡ （ｍＲＮＡ） またはプラスミド ＤＮＡ （ｐＤＮＡ） をマウスの骨格筋に直接注入すると、コードされたタンパク質。当時、ｍＲＮＡ は ＤＮＡ よりも安定性が低いため、ｍＲＮＡ ベースの医薬品は開発されていなかったため、この分野は ＤＮＡ ベースの技術に焦点を当てていました。それにもかかわらず、ｍＲＮＡ は １９６１ 年の発見以来、いくつかの疾患について一貫した研究の対象となってきました。

ｍＲＮＡ の発見後の最初の数十年間、主な焦点は真核細胞内のこれらの分子の構造的および機能的側面と代謝を理解することでした。また、これらの数十年間で、ｍＲＮＡ 工学用に作成されたいくつかのツールにより、これらの分子はより広範な研究コミュニティにとってよりアクセスしやすくなりました。 １９９０ 年代に、ｍＲＮＡ 分子の前臨床調査が開始され、その結果、長年にわたって蓄積されたこの知識により、最近の科学的および技術的進歩により、ｍＲＮＡ に関連する障害のいくつかに対処し、克服することが可能になりました。高レベルのリサイクルまたはターンオーバーの対象となる生物学的分子の）および望ましくない免疫原性。

ＩＶＴ ｍＲＮＡ ベースの治療と、ｐＤＮＡ などの他の核酸ベースの治療との間には、いくつかの重要な違いがあります。 ＩＶＴ ｍＲＮＡ分子は、機能するために核に入る必要はなく、細胞質に到達すると、これらの分子はすぐに翻訳されます。代わりに、ｐＤＮＡ は核に到達して ｍＲＮＡ に転写される必要があり、ｍＲＮＡ は次に細胞質に輸送されて翻訳される必要があります。さらに、ｐＤＮＡ やウイルスベクターとは異なり、ｍＲＮＡは宿主ゲノムに組み込まれる可能性がないため、挿入変異誘発のリスクが回避されます。それは、真核生物のゲノムに豊富にあるが、異なる経路によって強くサイレンシングされる配列である転移因子のレトロトランスクリプターゼおよびインテグラーゼの作用によって媒介される非標準的なイベントによってのみ可能であり、この可能性は他の細胞ｍＲＮＡの可能性と同じです。 ．いくつかの医療および製薬用途では、ＩＶＴ ｍＲＮＡ が短期間 （約 １ 週間） のみ活性であり、その後自然に完全に分解されることが有利です。さらに、ＩＶＴ ｍＲＮＡ の製造は簡単で安価であるため、ＩＶＴ ｍＲＮＡ ベースの治療法が最近大きな関心を集めています。

ＩＶＴ ｍＲＮＡ は、がん、感染症、心臓病学、内分泌学、および血液学の治療および予防分野において、広範な前臨床および臨床研究を受けてきました。 ＩＶＴ ｍＲＮＡ ベースの治療法の背後にある主な概念は、特定の疾患状態を予防または変更するために患者の細胞、組織、または臓器に遺伝子コード配列を導入することです。

ＩＶＴ ｍＲＮＡ を使用するには ２ つのアプローチがあります。 １ つのアプローチは、ＩＶＴ ｍＲＮＡ をｅｘ ｖｉｖｏで患者の細胞に導入することです（たとえば、細胞が以前に患者の体から抽出されている場合）。そして、これらの一過性にトランスフェクトされた細胞は、患者に再投与されます。もう １ つのアプローチは、筋肉内注射や腫瘍内送達などのさまざまな投与経路を使用して、ＩＶＴ－ｍＲＮＡ 分子を患者の細胞にｉｎ ｖｉｖｏ投与することです。どちらのアプローチも、感染症などのいくつかの病気の治療と予防、またはがんなどの遺伝性疾患の治療に使用されています。

ｍＲＮＡ分子が細胞質内に入ると、薬理学的に活性な産物であるコード化されたタンパク質が、トランスフェクトされた細胞の自然な機構を使用して翻訳されます。 ＩＶＴ で生成された ｍＲＮＡ は、真核細胞由来の天然に存在し、成熟し、処理された内因性 ｍＲＮＡ 分子に似るように設計されています。その結果、ＩＶＴ ｍＲＮＡ は一本鎖であり、５’ キャップ、開始コドンと停止コドンが隣接し、非翻訳領域も隣接するオープン リーディング フレーム （ＯＲＦ） を持ち、最後に ３’ ポリ （Ａ） テールを持ちます。これらの分子は、スプライシングが行われる細胞内区画である核を通過しないため、イントロンは望ましくありません。

は、線形化されたプラスミドまたは線形 ＰＣＲ 産物である ＤＮＡ テンプレートからのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応によって無細胞系で合成されます。 ＤＮＡ テンプレートは、５’ キャップを除くすべての構造要素と機能要素をエンコードします。 ＩＶＴは、ヌクレオチドの存在下でＴ７、ＳＰ６、Ｔ４およびＴ３ファージＲＮＡポリメラーゼを用いて行うことができ、転写後、ワクシニアキャッピング酵素などのキャッピング酵素を用いてＲＮＡを酵素的にキャッピングする。次に、ＤＮＡ鋳型をＤＮａｓｅ消化に供し、得られたｍＲＮＡ分子を当技術分野で周知の方法によって精製する。

ＩＶＴ ｍＲＮＡの薬力学的活性は細胞質で行われます。核内で産生され、核外輸送によって細胞質に入る内因性ｍＲＮＡとは対照的に、ＩＶＴ ｍＲＮＡは細胞の外側から細胞質に入る必要があります。

ＩＶＴ ｍＲＮＡ の細胞質バイオアベイラビリティは、細胞外空間に豊富に存在する非常に活性なユビキタス ＲＮａｓｅ と細胞膜による急速な分解によって制限され、負に帯電した ｍＲＮＡ 分子の細胞質への侵入を妨げます。真核細胞は、裸の ｍＲＮＡ 分子を積極的に飲み込むことができます。ただし、ほとんどの細胞タイプでは、この取り込み率は最小限です （１０，０００ 分子に １ 未満）。患者の細胞への ＩＶＴ ｍＲＮＡ 分子のトランスフェクションは、ｍＲＮＡ 分子を ＲＮａｓｅ による分解から保護し、細胞取り込みプロセスにも役立つポリマーまたは脂質ナノ粒子と複合体を形成することにより、大幅に改善できます。あるいは、インビトロ、インビボ、および細胞へのエクスビボｍＲＮＡ導入に使用できるエレクトロポレーションなどの他の技術があります。
ＩＶＴ ｍＲＮＡ が細胞質内に入ると、その薬理学は、内因性 ｍＲＮＡ の安定性と翻訳を調節するのと同じ複雑な細胞メカニズムによって支配されます。 ＩＶＴ ｍＲＮＡ から翻訳されたポリペプチドは、翻訳後修飾を受けることができ、その後、成熟タンパク質は生物活性化合物と見なされます。 ＩＶＴ ｍＲＮＡ およびタンパク質産物の半減期は、ｍＲＮＡ ベースの治療薬物動態の重要な決定要因です。

ＩＶＴ ｍＲＮＡにコードされたタンパク質が翻訳されると、その目的地は局在化シグナルによって決定されます。これらは、ポリペプチドを目的の細胞内コンパートメントに誘導するために遺伝子工学によって自然にまたは人工的に導入され、分泌経路に送られ、隣接する細胞に作用するか、血流に放出された場合は離れた器官または組織に作用します。

免疫原性アプローチのための ＩＶＴ ｍＲＮＡ 分子の処理経路は、その薬力学の決定に不可欠です。内因的に生成されたタンパク質の運命と同様に、ＩＶＴ ｍＲＮＡ にコードされたポリペプチドはプロテアソーム分解を受け、主要組織適合遺伝子複合体 （ＭＨＣ） クラス Ｉ 分子のコンテキストで ＣＤ８＋ Ｔ 細胞に提示されます。一般に、細胞内タンパク質が ＭＨＣ クラス ＩＩ にロードされて Ｔ ヘルパー細胞応答を誘導することはありません。しかし、抗原コード配列に分泌シグナルを導入することにより、分泌シグナルがタンパク質を細胞外空間にリダイレクトするため、Ｔ ヘルパー細胞応答が達成され、ＭＨＣ クラス ＩＩ 負荷が達成されます。

予防効果または治療効果に必要な ＩＶＴ ｍＲＮＡ の量と治療期間は、アプリケーションごとに異なる可能性がある多くの要因に依存します。例えば、ナノグラムからマイクログラムの量のＩＶＴ ｍＲＮＡは、ヒトおよび非ヒト霊長類における免疫応答の効率的な誘導に十分である可能性があります。対照的に、全身的に活性な成長因子、ホルモン、またはモノクローナル抗体の送達には、ミリグラムまたはグラムの量のタンパク質が必要になる場合があります。 ＩＶＴ ｍＲＮＡの翻訳効力および細胞内安定性は、ｍＲＮＡ単位当たりのタンパク質量の増加を達成するために最適化することができる。

、細胞内安定性を改善し、翻訳効率を高めるために変更されています。これらの改善により、数分から数日の範囲のより長い時間枠で、大幅に高いレベルのコード化されたタンパク質の産生がもたらされます。

には、転写プロセス中に ｍＲＮＡ の５’末端に結合する ７－メチルグアノシン （ｍ７Ｇ） キャップがあります。 ｍＲＮＡ が転写され、成熟し、細胞質に配置されると、翻訳開始因子 ４Ｅ （ＥＩＦ４Ｅ） が効率的な翻訳のために ５’ キャップに結合する必要があります。 ＤＣＰ１、ＤＣＰ２、または ＤＣＰＳ などのデキャッピング酵素は、ｍＲＮＡ の崩壊を調節します。合成後に ＩＶＴ ｍＲＮＡ をキャップするために最もよく使用されるアプローチは、ワクシニア ウイルス由来のキャッピング酵素を使用してキャッピングを実行することであり、結果として得られるキャップ構造は内因性真核生物のキャップと同一です。

ｍＲＮＡ を使用した初期の研究は、ｍ７ＧｐｐｐＧ キャップ類似体を使用して行われました。ただし、実質的な ｍ７ＧｐｐｐＧ キャップ類似体は逆方向で ＩＶＴ ｍＲＮＡ に組み込まれるため、翻訳機構によって認識されず、翻訳活性が低下します。アンチリバース キャップ類似体 （ＡＲＣＡ； ｍ２７，３’－ＧｐｐｐＧ） が開発され、逆方向での取り込みを回避するために導入されたため、いくつかの細胞タイプで優れた翻訳効率が示されました。ホスホロチオエート含有ＡＲＣＡなどの他のＡＲＣＡキャップ類似体が開発され、ＤＣＰ２酵素に対する耐性を付与し、したがって半減期を延長します。これらの戦略により、より効率的なキャッピングが可能になりますが、プロセス全体のコストが大幅に増加します。

ポリ （Ａ）テールは、５’ キャップ、内部リボソーム侵入部位、およびその他の決定基と相乗的に、ｍＲＮＡ の安定性と翻訳効率を調節します。ポリ （Ａ） テールは、転写を受けるか、組換え型ポリ （Ａ） ポリメラーゼによって追加される ＤＮＡ テンプレートによってコードされ、後者の方法では、コルジセピン （３’－デオキシアデノシン） などの修飾類似体を追加できるため、ポリ （Ａ） による脱デニル化が阻害されます。 ）特異的ヌクレアーゼ。酵素によるポリアデニル化は、各 ＲＮＡ 調製において、ポリ （Ａ） テールの長さが異なる ＲＮＡ 種の混合物が存在するため、好ましくありません。対照的に、ＩＶＴ は、定義されたポリ （Ａ） テール長を持つ ＤＮＡ テンプレートから ｍＲＮＡ を生成し、同じポリ （Ａ） テール長を持つ ＲＮＡ 種を生成します。最適なポリ （Ａ） テールの長さは １２０ ～ １５０ ヌクレオチドです。

細胞内の ＩＶＴ ｍＲＮＡ の翻訳効率と安定性を高めるための他の最適化戦略が存在します。たとえば、内因性 ｍＲＮＡ などの翻訳と安定性を調節する調節配列を含む ５’ および ３’ ＵＴＲ の組み込みなどです。たとえば、多くの ＩＶＴ で生成された治療用 ｍＲＮＡ 分子は、 α － およびβ －グロビンの ３’－ＵＴＲ を持ち、 β －グロビン ３’－ＵＴＲ 配列の安定化効果は、頭部に配置された２ つのヒトβ －グロビン ３’－ＵＴＲを使用することによってさらに増強されます。 －テール向き。さらに、内因性およびウイルスの ５’ および ３’ ＵＴＲ のいくつかの領域は、ｍＲＮＡ の安定性と翻訳効率を高めます。伸長因子 １ α （ｅＥＦ１Ａ） ｍＲＮＡ ３’ ＵＴＲ およびオルソポックス ウイルス ｍＲＮＡ の ５’ ＵＴＲ エレメントは、デキャッピングおよび ３’－５’ エキソヌクレアーゼ分解を阻害します。しかし、ｍＲＮＡ の不安定化は、タンパク質発現の持続時間を制限するために望ましい場合もあります。この効果は、３’ＵＴＲ への ＡＵ リッチ エレメントの組み込みによって達成できます。したがって、急速な ｍＲＮＡ 分解によるタンパク質発現の持続時間が短くなります。

翻訳効率は、コドン組成によっても影響を受ける可能性があります。コドン最適化として知られるプロセスである、まれなコドンを頻繁に使用するコドンに置き換えると、同じ ｔＲＮＡ が再利用されるため発現収量が向上し、翻訳が加速されます。コドン コンテキスト （隣接するヌクレオチドとコドン） も翻訳効率と伸長率に影響します。ただし、最適化されたコドンを使用しない正当な理由がいくつかあります。最も重要なのは、一部のタンパク質が適切なフォールディングのために低い翻訳速度を必要とすることです。これは、まれなコドンによって保証されます。したがって、ＩＶＴ ｍＲＮＡコード化ワクチンが元のオープンリーディングフレーム配列を維持することは有益であり得る。強力な Ｔ 細胞エピトープは、ＩＶＴ ｍＲＮＡ がリボソーム フレーム シフトによって異なるフレームに翻訳される場合、または翻訳が内部または ＣＵＧ 開始コドンから開始される場合に生成される可能性があり、コドンの最適化により、これらの重要な抗原ペプチドの変動源が排除されます。

ＩＶＴ ｍＲＮＡ の強力な免疫刺激効果と固有のアジュバント活性は、予防ワクチン接種に追加された利点であり、強力な抗原特異的細胞性および体液性免疫応答につながります。これらの ｍＲＮＡ 分子によって生成される免疫応答の種類は、トランスフェクション分子で形成されるナノ粒子のサイズなど、さまざまな要因に依存します。ただし、自然免疫応答の活性化は大きな欠点です。内因性真核生物 ＲＮＡ センサーと免疫認識に関与する構造 ＲＮＡ 要素の特定における最近の進歩は、ＩＶＴ ｍＲＮＡ による免疫活性化を増強する機会、または免疫応答を活性化しない ｍＲＮＡ 分子を作成する機会を提供します。

ＩＶＴ ｍＲＮＡ には、パターン認識受容体を活性化することによる免疫刺激が含まれます。パターン認識受容体は、ウイルス ＲＮＡ を自然に識別し、いくつかのダウンストリーム効果を誘導することによって応答します。エンドソーム コンパートメント内の Ｔｏｌｌ 様受容体 ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、および ＴＬＲ８ は、免疫細胞内でエンドサイトーシスされた ＩＶＴ ｍＲＮＡ によって活性化され、インターフェロンの分泌を誘導します。 ＴＬＲ３ は二本鎖 ＲＮＡ （ｄｓＲＮＡ） を認識し、ＴＬＲ７ と ＴＬＲ８ は一本鎖 ＲＮＡ （ｓｓＲＮＡ） を認識します。 Ｐｏｌｙ（Ｕ） は最も強力なインターフェロン誘導因子であり、ＴＬＲ７ を介して作用します。対照的に、非免疫細胞では、細胞質レチノイン酸誘導性遺伝子 Ｉ タンパク質 （ＲＩＧ－Ｉ） やメラノーマ分化関連タンパク質 ５ （ＭＤＡ５） などのサイトゾル受容体がインターフェロンの発現を誘導します。 ＲＩＧ－Ｉ は短い二本鎖の ５’ 三リン酸 ＲＮＡ 分子によって活性化されますが、ＭＤＡ５ は長い ｄｓＲＮＡ と ２’－Ｏ－メチル化を欠くウイルス ｍＲＮＡ に応答します。細胞質 ＲＮＡ センサーは、免疫刺激を媒介し、ｍＲＮＡ の翻訳効率と抗ウイルス活性に影響を与えます。プロテインキナーゼ ＲＮＡ 活性化 （ＰＫＲ） は、真核生物の翻訳開始因子 ２ αをリン酸化し、グローバルな ｍＲＮＡ 翻訳を阻害します。

非免疫原性 ＩＶＴ ｍＲＮＡ は、プソイドウリジン、２－チオウリジン、５－メチルウリジン、５－メチルシチジン、または Ｎ６－メチルアデノシンなどの天然に存在する修飾ヌクレオシドを組み込むことによって作成できます。このアプローチは、固有のアジュバント活性と翻訳に対する阻害効果の両方を抑制することが示されています。

いくつかの細胞型は、スカベンジャー受容体を介したエンドサイトーシスによって取り込まれた裸の ｍＲＮＡ を自発的に取り込むことができ、リソソームに蓄積します。そこから少量の ｍＲＮＡ が細胞質に漏れるだけです。ほとんどの細胞では、ｍＲＮＡ の積極的な取り込みは非効率的であり、低用量の ｍＲＮＡ では飽和します。 ｍＲＮＡ の送達に関連する主な課題は ２ つあります。ｉ） 多数の細胞に到達すること。および ｉｉ） コードされたタンパク質の高収量を達成します。 ＩＶＴ ｍＲＮＡ などの外因性 ｍＲＮＡ は、トランスフェクションによって、筋肉や皮下細胞などのいくつかの細胞タイプ、および肝臓などのいくつかの臓器に送達できます。トランスフェクションは、多くの種類のポリマー、リポソーム送達プラットフォーム、およびエレクトロポレーションを使用して実行できます。

インビトロトランスフェクション戦略は、ＲＮａｓｅ媒介分解からｍＲＮＡを保護し、細胞への侵入を容易にする医薬製剤の開発から恩恵を受けてきました。ポリエチレンイミンまたはカチオン性ポリペプチドおよびデンドリマーなどのポリマーは市販されており、細胞を高効率でトランスフェクトするために使用できます。一方、エレクトロポレーションなどの代替方法も、造血細胞などのいくつかの細胞タイプのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクションの好ましい戦略として確立されています。

ネイキッド ｍＲＮＡ ワクチンやプロタミン複合 ｍＲＮＡ ワクチンなどの他のｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクション戦略も、最近ではいくつかの臨床試験で使用されています。ただし、裸の ｍＲＮＡ は、樹状細胞以外の細胞タイプで高収量のタンパク質発現を達成するには不十分な場合があります。

細胞内の安定性と翻訳効率を改善するために以前に説明された努力と開発にもかかわらず、安定性、タンパク質発現の持続時間、したがって産生されるタンパク質の量をさらに改善する線形ＲＮＡの代替物が発見されました。

環状ＲＮＡ
円形共有結合閉鎖 ＲＮＡ （ｃｉｒｃＲＮＡ） は、５’－キャップと ３’－ポリ （Ａ）テールを欠いており、医薬組成物に配合した場合、およびｉｎ ｖｉｖｏで投与した場合、線形 ｍＲＮＡ 対応物と比較して非常に安定しています。これらの操作された ｃｉｒｃＲＮＡ 分子は、タンパク質発現量の改善と免疫原性の低下を伴うより長い翻訳活性を示すため、用量あたりのタンパク質産生がより高く効率的になります。さらに、これらの環状分子は、線状の ｍＲＮＡ 分子と比較してより小さなトポロジー構造を示すため、脂質ナノ粒子にカプセル化したり、より効率的かつ簡単な方法でさまざまなポリマーと複合体を形成したりできます。

いくつかの配列依存性および細胞メカニズムが存在し、直鎖状 ＲＮＡ の環状化を可能にし、非コード環状転写物のサブクラスに場所を与えます。何千もの遺伝子が、発生段階や病態生理学的条件で調節されている場合でも、組織または細胞型に特異的な方法で環状 ＲＮＡ を発現することが示されています。

機能性 ＲＮＡ 分子は、タンパク質をコードする転写物を含むだけではありません。実際、ゲノムの １ ～ ２％ のみが、後でタンパク質に翻訳される転写物をコードしていることが知られています。ほとんどの ＲＮＡ 分子は、実際には非コード転写物であり、ヒト細胞内で幅広い調節機能を発揮します。最初の環状 ＲＮＡ 分子は １９７６ 年頃に植物のウイロイドで観察され、長い間、それらは転写ジャンクであると考えられていました。しかし、２０１２ 年頃、ハイスループット トランスクリプトーム シーケンス、バイオインフォマティクス、および個々の ｃｉｒｃＲＮＡ の焦点を絞った分子特性解析により、それらの遍在性が明らかになり、ｃｉｒｃＲＮＡ が機能分子であることを示唆する証拠が明らかになりました。実際、それらは非コード ＲＮＡ の新しいクラスとして記述されています。現在、 ３２，０００ を超えるエキソン ｃｉｒｃＲＮＡ に注釈が付けられています。それらは動的で、進化的に保存されており、特定の細胞タイプに特異的である可能性があります。それらの環状化メカニズムには、例えば「スクランブルエクソン」が最後に結合した ＤＣＣ 腫瘍抑制遺伝子など、線状前駆体 ＲＮＡ のバックスプライシングと呼ばれるプロセスによって、共有結合で閉じた一本鎖ＲＮＡを転写する遺伝子が関与します。

自然界では、ＲＮＡ 環状化のプロセスは選択的スプライシングのメカニズムに基づいています。オルタナティブ スプライシングは、ｍＲＮＡ がさまざまな調節機能を提示したり、異なる細胞機能、局在化、または特性を持つ可能性のあるさまざまなタンパク質バリアント （アイソフォーム） を直接合成したりすることを可能にするプロセスです。たとえば、少なくとも ３８ の異なる ｃｉｒｃＲＮＡ を生成することがよく知られている ＴＴＮ 遺伝子など、いくつかの環状転写産物を発現する遺伝子が存在します。 ＲＮＡ 環状化は、スプライシングによって結合されたイントロンおよびエクソン要素のパターンを再配置して、ｍＲＮＡ コード配列を変更することによって発生します。言い換えると、エクソンの末端（スプライスドナー部位）が同じエクソンの末端（単一エクソンｃｉｒｃＲＮＡ）または上流のエクソンの末端（複数エクソンｃｉｒｃＲＮＡ）に結合すると、閉じたＲＮＡループが形成されます。スプライシング イベントによって生成されるｉｎ ｖｉｖｏ ｃｉｒｃＲＮＡ は、古細菌のスプライシングから生成される ｔＲＮＡ および ｒＲＮＡ イントロンなど、エキソンまたはイントロンのいずれかになります。 ＣｉｒｃＲＮＡ分子は、いくつかのウイルス、ウイロイド、およびウイロイド様サテライトに現れます。 ＲＮＡ 分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ環状化には、３’－５’ ホスホジエステル結合の分子内形成が含まれ、直鎖状 ＲＮＡ 前駆体の ３’ 末端と ５’ 末端が近接している必要があります。

より長い線形遺伝子と多数の ｃｉｒｃＲＮＡ アイソフォームとの間には相関関係があります。たとえば、遺伝子座のエクソン ２ は、ｃｉｒｃＲＮＡｓ に特に頻繁に存在します。いくつかの ｃｉｒｃＲＮＡ には複数のエクソンが含まれており、バック スプライス サイト内に約 １００ のエクソンを保持することもあり、サイズは １００ 塩基から数キロベースまでさまざまです。ほとんどの ｃｉｒｃＲＮＡ は、線形対応物から生成され、構成的エクソンに由来します。それらは多くの場合、標準的なスプライソソームが関与していることを示唆する ＧＴ／ＡＧ 標準的なスプライス モチーフを含み、ほとんどが転写後に形成されますが、いくつかのケースでは共転写的に起こることが示されています。 ＲＢＰ Ｑｕａｋｉｎｇ （ＱＫＩ） や ＲＢＰ Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ （ＭＢＬ） などの ＲＮＡ 結合タンパク質は、隣接するイントロンのハイブリダイゼーションを促進することにより、さまざまな ｃｉｒｃＲＮＡ の形成を助けます。前者は異なる遺伝子座からの転写物に作用することが示されているのに対し、後者は遺伝子座ｃｉｒｃＭｂｌからの転写物を環状化します。 ｃｉｒｃＲＮＡの細胞力価を調節するための他の例が知られています。そのような例の １ つは、ＲＮＡ 編集酵素 ＡＤＡＲ （ＲＮＡ に作用するアデノシン デアミナーゼ） です。これは、ＲＮＡ プロセシングで Ａ から Ｉ への置換を仲介するだけでなく、高度に発現されたときにさまざまな ｃｉｒｃＲＮＡ 力価をダウンレギュレートすることでも知られています。二本鎖 ＲＮＡ （ｄｓＲＮＡ） に結合する ＲＮＡ ヘリカーゼ ＤＨＸ９ （ＤＥｘＨ－Ｂｏｘ Ｈｅｌｉｃａｓｅ９） は、多くの ｃｉｒｃＲＮＡ の形成に関与し、ＡＤＡＲ ｐ１５０ アイソフォームと相互作用することが示されている別の例です。

合成生物学を使用して、治療効果のある目的のタンパク質をコードできる新しい ｃｉｒｃＲＮＡ 分子を作成できます。

ＣｉｒｃＲＮＡは、遍在するエキソヌクレアーゼによる分解から保護されているため、非常に安定した分子です。合成生物学を使用して、治療効果のある目的のタンパク質をコードできる新しい ｃｉｒｃＲＮＡ 分子を作成できます。共有結合で閉じた ｃｉｒｃＲＮＡ 分子は、アンチセンスＲＮＡ、アプタマー、リボザイム、または ｓｉＲＮＡ の生成などの用途にも有益である可能性があります。

ＲＮＡ の生体内環状化
エキソンｃｉｒｃＲＮＡの形成
スプライセオソームは、２ 段階のメカニズムによって真核細胞の一次転写産物からイントロンを除去するように作用します。最初のステップでは、イントロン内の定義されたアデノシンの ２’－ＯＨ グループ （分岐点アデノシンとして示される） が ５’ スプライス サイトを攻撃し、５’エクソンで遊離の ３’－ＯＨ グループを生成し、ラリアット中間。 ２ 番目のステップでは、生成された ３’－ＯＨ グループの ３’－スプライスサイトへの求核攻撃が行われ、切り出されたラリアット イントロンと ２ つの結合されたエクソンから構成される線形 ＲＮＡ が生成されます。エキソンｃｉｒｃＲＮＡはスプライシングから生じる場合があります。 １９９１ 年に ｃｉｒｃＲＮＡ が初めて観察された後、数千の内因性 ｃｉｒｃＲＮＡ が哺乳動物細胞で同定されました。これらは豊富で進化的に保存されています。

直接バックスプライシングは、エクソンが非標準的な方法でスプライシングされるエクソンのスクランブリングまたはシャッフルのために「ミススプライシング」と呼ばれていました。それにもかかわらず、ｃｉｒｃＲＮＡはミススプライシングイベントに起因するのではなく、目的によって生成される可能性があるため、適切な用語は「バックスプライシング」である必要があります．直接逆スプライシングでは、下流のエクソンの ３’ テールを、同じエクソンまたは通常は上流にあるエクソンの ５’ ヘッドに結合します。下流のスプライス ドナーはスプライスされていない上流のスプライス アクセプターとペアになり、その結果、エクソンは環状化されます。

別のメカニズムには、エクソンスキッピングから生成されたエクソンを含むラリアットの作成が含まれます。これは、その後内部スプライシングを受け、それによってイントロンが除去され、ｃｉｒｃＲＮＡ が生成されます。どちらのメカニズムも ｉｎ ｖｉｖｏ で実行できます。

最近の発見は、隣接するイントロン配列がエクソン環状化に必要であることを示しています。さらに、線状スプライシングと環状化が互いに競合することが実証されました。

インビボでｃｉｒｃＲＮＡ を生成するために設計されています。

イントロンｃｉｒｃＲＮＡの形成
グループ ＩＩ に属する自己スプライシング イントロンは、分岐したラリアット中間体とラリアット イントロンを生成し、２’， ５’－ホスホジエステル結合の形成を通じて環状化が発生しますが、これらは ＲＮＡ サークルとして切除されるという証拠があります。サークルの形成には、トランス スプライシング メカニズムなどを使用して、３’ エクソンを事前に解放する必要があります。イントロンの末端 ２’－ＯＨ グループは、５’ エクソン イントロン ジャンクション （５’ スプライス サイト） を攻撃し、環状化されたイントロンと ５’ エクソンを生成します。

は、５’ スプライス部位への求核攻撃によってスプライシングを開始し、次にイントロンの ５’ 末端に結合するようになる外部求核剤としてグアノシン （ ｅｘｏＧ ） を最初に動員することにより、自己スプライスをイントロン化します。

２ 番目のエステル交換反応では、エクソンがライゲーションされ、直線状の触媒イントロンが放出されます。切除された直線状のイントロンは、イントロンの ５’ 末端近くのホスホジエステル結合に対する ３’ 末端グアノシンの求核攻撃によって環状化されます。 ． ５’ 末端配列が解放され、イントロンが環状化されます。切断されたリン酸の前にある ３ つのヌクレオチドのペアリングは、環状化で攻撃されるリン酸を定義し、その結果、短い半減期を持つさまざまな切断されたイントロンに基づく円が生成されます。完全長のイントロン サークルの形成は、グループ Ｉ に属するすべてのタイプのイントロンの一般的な特徴です。

ＲＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ 循環化
ｉｎ ｖｉｔｒｏ での ｃｉｒｃＲＮＡ 生成を可能にする方法の需要により、 ＲＮＡ 環状化のための化学的および酵素的ツールが開発されました。

化学的方法
核酸鎖のケミカルライゲーションは、臭化シアン （ ＢｒＣＮ ） を ２－（Ｎ－モルホリノ）－エタンスルホン酸 （ＭＥＳ） などのモルホリノ誘導体と一緒に使用して、末端 ５’－ヒドロキシルと ３ ’－リン酸基。ホスホジエステル結合の形成をサポートする他の化学物質があります。ただし、 ＢｒＣＮ は最も使用される試薬です。ケミカルライゲーションは、典型的には、２つの末端と相互作用し、環状化を助けるオリゴヌクレオチドスプリントの使用を伴います。分子間ライゲーションは非常に競合的な反応ですが、カテナリー内ライゲーションを促進するために、環状化する核酸の濃度を低くすることで抑制できます。天然の ３’－５’ ホスホジエステル結合の代わりに ２’－５’ ホスホジエステル結合が形成されることは、ＲＮＡ 鎖のケミカルライゲーションに関連するさらに深刻な副反応であり、２’－デオキシ糖部分を持つオリゴヌクレオチドを使用することで回避できます。 ３’末端。

前世紀の最後の １０ 年間に、ホスホラミダイト化学に基づく長さ ２ ～ ２１ ヌクレオチドの ｃｉｒｃＲＮＡ の固相合成が開発されましたが、結合できるヌクレオチドは ２１ を超えないため、この方法は ＲＮＡ 環状化には使用されませんでした。

酵素法
合成核酸のいくつかの酵素的ライゲーションが開発されています。天然に存在するさまざまなリガーゼが、一本鎖および二本鎖の核酸のニックを連結することができ、そのすべてが Ｔ４ バクテリオファージ ゲノムにコードされています。これらのリガーゼは、ＡＴＰ 依存性反応において、ＤＮＡ または ＲＮＡ の ５’－リン酸 （ドナー） と ３’－ヒドロキシル （アクセプター） 末端基の間のホスホジエステル結合の形成を触媒します。

線状前駆体の ５’ 末端は、選択した化学的または酵素的方法とは無関係に、正しい環状化のためにリン酸化する必要があります。 ＩＶＴ ＲＮＡ を調製する場合は、５’－三リン酸末端をポリヌクレオチド キナーゼで除去する必要があります。 ５’ モノリン酸化直鎖 ＲＮＡ 基質を得るために、Ｔ７ ＲＮＡ ポリメラーゼを使用したＧＭＰプライミングＩＶＴを使用できます。これらの方法は、５００ ヌクレオチド未満の ＲＮＡ に対して選択されます。一方、大きな基板を環状化する必要がある場合は、スプリント結紮法よりも ＰＩＥ （Ｐｅｒｍｕｔｅｄ Ｉｎｔｒｏｎ－Ｅｘｏｎ） 戦略の方が適している可能性があります。

Ｔ４リガーゼが選択された方法である場合、一本鎖領域はライゲーションされないため、ライゲーション部位は二本鎖領域内にある必要があります。そのため、オリゴヌクレオチドスプリントを使用して、ライゲーション部位の周りに二本鎖セグメントを取得し、自由端のアプローチを確保することができます。効率的なライゲーション反応のためには、スプリントの長さ、化学量論、および温度条件を調整する必要があります。

他の Ｔ４ リガーゼを使用して、核酸のライゲーションを達成することができます。たとえば、一本鎖 ＲＮＡ 分子の ３’－５’ ホスホジエステル結合の形成を助ける Ｔ４ ＲＮＡ リガーゼ １ です。ただし、大きな制限は、分子間ライゲーションが環状化と大きく競合することです。 Ｔ４ ＲＮＡ リガーゼ １は、ライゲーション部位のドナーおよびアクセプター ヌクレオチドにいくつかの優先順位があります。このリガーゼは、短いおよび長い ＲＮＡ 分子の環状化に使用されています。ハンマーヘッド型リボザイムなどの非コード ＲＮＡ は、このリガーゼを使用して線形オリゴヌクレオチドから効率的に合成されています。

Ｔ４ ＲＮＡ リガーゼ ２ は、分子間および分子内ライゲーション活性を持っています。ただし、Ｔ４ ＲＮＡ リガーゼ １ と比較すると、後者は二本鎖 ＲＮＡ 基質のニックを結合するのにはるかに効率的です。

これらの ３ つのよく知られている Ｔ４ ＲＮＡ リガーゼとは別に、小麦胚芽由来の ｔＲＮＡ リガーゼや Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ 由来のリガーゼなど、ＲＮＡ 環状化を実行できる他のリガーゼがあります。別のリガーゼ （Ｐａｐ１０２０） がピロコッカスで発見されました ａｂｙｓｓｉであり、これは ｉｎ ｖｉｔｒｏ でオリゴヌクレオチドの ＡＴＰ 依存性環状化を行います。
ウイロイドやその他の小さな感染性 ＲＮＡ は、二重ローリング サークル反応を使用して複製します。この方法は、ヘアピン リボザイムの自己スプライシング活性と共に使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｉｒｃＲＮＡ を生成できます。

化学的および酵素的ライゲーション法とは対照的に、ＰＩＥ （Ｐｅｒｍｕｔｅｄ Ｉｎｔｒｏｎ－Ｅｘｏｎ） として知られるグループ Ｉ 自己スプライシング イントロン システムは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ および ｉｎ ｖｉｖｏ での ｃｉｒｃＲＮＡ 分子の形成を可能にします。 Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｓｐｐ や Ａｎａｂａｅｎａ ｓｐｐ などの生物や、Ｔ４ ファージなどのウイルスに由来するグループ Ｉ イントロン前駆体 ＲＮＡ がいくつかあります。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ での環状 ＲＮＡ エキソン。エクソン配列は、グループ Ｉ イントロン自己スプライシング システムからの外来配列に置き換えて、目的の環状配列を作成できます。これは、エクソン配列が自己スプライシング反応に関与していないために可能です。 Ｐｅｒｍｕｔｅｄ Ｉｎｔｒｏｎ－Ｅｘｏｎ メソッドには、定義されたスプライス部位での ２ つのエステル交換反応が含まれ、スプライシング後、末端が連結されて環状 ＲＮＡ 分子が形成されます。より具体的には、最初のエステル交換により、配列の ３’ 末端配列 （５’ ハーフ イントロン） が解放されます。その後、３’ ハーフ エクソンの遊離 ３’ ＯＨ グループは、２ 回目のエステル交換反応中に３’ スプライス部位を攻撃し、ｃｉｒｃＲＮＡ 分子を生成します。この方法は、ＲＮＡ アプタマー、ハンマーヘッド型リボザイム、およびデルタ型肝炎リボザイムを生成するために使用されています。

グループ ＩＩ イントロンは、逆スプライシング用に変更できるため、ｃｉｒｃＲＮＡ 分子が生成されます。酵母の自己スプライシング グループ ＩＩ イントロンは、環状 ＲＮＡ 分子の形成を触媒できます。この方法では、エクソンを連続的に再配置する必要があり、分岐点を上流に配置し、イントロン配列をエクソンに隣接させる必要があります。この方法では、２ つのエステル交換反応による分子の環状化が可能になります。このグループ ＩＩ 法は、グループ Ｉ イントロン法よりもはるかに効率的です。ただし、このアプローチでは、ライゲーション部位で ２’－５’ ホスホジエステル結合が形成されます。

結論として、ｃｉｒｃＲＮＡ の製造には主に ２ つの方法があります。つまり、１） 化学的方法 （臭化シアンなどの試薬を使用）、および ２） Ｔ４ リガーゼなどのいくつかの生物またはウイルスから取得したリガーゼの使用を含む酵素的方法です。または順列イントロン － エクソン法（ＰＩＥ）。ただし、これらすべての手法には、少量の ｃｉｒｃＲＮＡ 分子が生成され、副産物が存在するという欠点があります。さらに、化学的方法は、循環化反応後にさらに除去する必要がある非生理学的ライゲーション部位と保護基を持つｃｉｒｃＲＮＡを生成するｉｎ ｖｉｔｒｏ化学反応に依存しています。さらに、これらの方法は、より大きなサイズの ＲＮＡ 分子が関与する場合には効率的ではないため、治療への応用が制限されます。さらに、他社によって説明されている方法論は、スプライシング イベント後に共有結合で閉じたｃｒｉｃＲＮＡ分子にとどまる相補的配列を使用する ＰＩＥ 法を使用した ＲＮＡ 分子の環状化に依存しているため、望ましくない免疫を活性化する可能性のある安定した二本鎖幹 ＲＮＡ セグメントを形成します。コードされたタンパク質の発現をダウンレギュレートします。

既存のソリューションのいずれも、安定性が向上し、半減期が増加したと同時に、上記の目的を妨げる可能性のある二本鎖分子内幹 ＲＮＡ セグメントを含まない、高収量の環状 ＲＮＡ 製造システムおよびプロセスを提供することはできません。したがって、ＲＮＡ の循環を最適化するためのアプローチが必要です。

まとめ
本開示は、第１の態様において、以下を含む操作された親円形共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡ （配列番号１；図１）を提供する：
少なくとも２つのエンドヌクレアーゼ認識配列、少なくとも１つの細菌選択システム、および少なくとも１つの細菌複製起点を含む合成ＤＮＡ骨格（図２ ）、および；
少なくとも １ つの ＲＮＡ ポリメラーゼ プロモーター、少なくとも ２ つの環状化配列 （ｃｉｒＳＥＱ１ および ｃｉｒｃＳＥＱ２； 以下を参照）、少なくとも ２ つの ＤＮＡ スペーサー、少なくとも １ つの翻訳開始配列、少なくとも ４ つの制限酵素認識配列、少なくとも３つのマルチクローニングサイトと少なくとも１つのコード配列（図３ ）。

本発明の第２の態様では、第１の環状化配列（ｃｉｒＳＥＱ１）は、少なくとも第１の制限酵素認識配列（ＲＥ１Ａ）、エキソンセグメント（エキソンＩ）に作動可能に連結された第１の相同領域（ＨＲ１Ｂ） 、および置換された自己スプライシングおよび自己触媒グループ Ｉ イントロン － エクソン システムに由来するイントロン セグメント （イントロン Ｉ）、２ 番目の制限酵素認識配列 （ＲＥ１Ｂ） および ２ 番目の相同領域 （ＨＲ１Ａ） （図 ４ ） 。

本発明の第３の態様では、第２の環状化配列（ｃｉｒＳＥＱ２）は、第１の制限酵素認識配列（ＲＥ２Ａ）、エキソンセグメント（エキソンＩＩ）およびイントロンに作動可能に連結された少なくとも第１の相同領域（ＨＲ２Ｂ）によって構成される。置換された自己スプライシングおよび自己触媒グループ Ｉ イントロン － エクソン システムに由来するセグメント （イントロン ＩＩ）、２ 番目の相同領域 （ＨＲ２Ａ） および ２ 番目の制限酵素認識配列 （ＲＥ２Ｂ） （図 ５ ） 。

本発明の第４の態様では、第１の環状化配列ｃｉｒＳＥＱ１の第１の相同領域ＨＲ１Ａは、第２の環状化配列ｃｉｒＳＥＱ２の第２の相同領域ＨＲ２Ａに相補的である（図６ ） 。

本発明の第５の態様では、第１の環状化配列ｃｉｒＳＥＱ１の第２の相同性領域ＨＲ１Ｂは、第２の環状化配列ｃｉｒＳＥＱ２の第１の相同性領域ＨＲ２Ｂに相補的である（図６） 。

本発明の第６の態様では、少なくとも以下の工程を含む環状ＲＮＡの製造方法を記載する：
を。本発明の操作された親円形共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡを適切な細菌株に形質転換し、前記親プラスミドに含まれる細菌選択系によって組換えクローンを選択すること；
ｂ．得られた組換え細菌を成長条件でのインキュベーションに供して、適切な分子量を生成するために操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミド ＤＮＡ の複製を可能にする。
ｃ．得られた操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミド ＤＮＡ分子を分離および精製する。
ｄ． ＲＮＡライゲーションＤＮＡザイム、ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９－ＤＮＡリガーゼ、およびイントロン－エクソン媒介ライゲーションからなる群から適切なライゲーションシステムを選択すること；
ｅ．精製された操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミド ＤＮＡ を適切な制限酵素で消化する。
ｆ．操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡ の線形化された環状 ＲＮＡ モジュール足場を精製します。
ｇ．線状ＲＮＡ分子を生成するために、精製された線状化された環状ＲＮＡモジュール足場をインビトロ転写反応に供する工程；
ｈ．選択された適切な環状化法に線状 ＲＮＡ 分子を供する。と、
私。得られた環状ＲＮＡを精製し、

本発明の第７の態様によれば、以下を含む第１の環状ＲＮＡ製造プロセスが提供される：
本発明の操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡ（図１ ）；と、
ザイム。

本発明のさらなる態様において、環状ＲＮＡを製造するためのプロセスのステップｄにおいて選択されたライゲーション系がＲＮＡライゲーションＤＮＡザイムである場合、前記ＤＮＡザイムは、線状ＲＮＡの環状化のためのライゲーション反応を支持するために、少なくとも以下の３つのセクションを含む。 ＲＮＡ （図 ７ ）。

ＤＮＡｚＨＲ２Ａ；配列番号４ ）の５’遊離末端を標的とする相補的領域である；
２番目のセクションはコアであり、ＲＮＡがライゲーションされるのに理想的な環境を作り出す安定した立体空間構造を提供する能力を備えたＤＮＡザイムの一部であり、そのようなコアは、それらの組み合わせ内で相乗効果を持つヌクレオチドで構成されています。ワトソン－クリック塩基対形成による ２ つの ＲＮＡ 基質のハイブリダイゼーションを可能にします。と、
第３のセクションは、連結される標的ＲＮＡの３’遊離末端を標的とする相補的領域である（ ＤＮＡｚＨＲ１Ｂ；配列番号３ ）。

本発明の第８の態様によれば、以下を含む第２の環状ＲＮＡ製造プロセスが提供される：
本発明の操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡ（図１ ）；と、
ＨＲ１ＡおよびＨＲ２Ｂに相補的な合成ｇＲＮＡと複合体を形成し、ペプチドリンカーによってＤＮＡリガーゼに融合されたｄＣａｓ９を含む融合タンパク質。

本発明のさらなる態様では、環状ＲＮＡを製造するためのプロセスのステップｄで選択されたライゲーションシステムがＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９－ＤＮＡリガーゼシステムである場合、合成融合タンパク質は、ペプチドリンカーによってＤＮＡリガーゼに融合されたｄＣａｓ９を含み、 ｃｉｒｃＳＥＱ－ＨＲ１Ａ および ｃｉｒｃＳＥＱ－ＨＲ２Ｂ に相同な合成 ｇＲＮＡ と複合体を形成し、リガーゼ活性のターゲティングを提供して末端を結合し、線形 ＲＮＡ 分子を環状化します （図 ８ ） 。

本発明の第９の態様によれば、以下を含む第３の環状ＲＮＡ製造プロセスが提供される：
完全なｃｉｒＳＥＱ１およびｃｉｒＳＥＱ２配列および適切な緩衝液を有する本発明の操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡ（図１ ）。
上記第３環状ＲＮＡ製造工程 を使用して、ｃｉｒｃＳＥＱ１ （図 ４ ） および ｃｉｒｃＳＥＱ２ （図 ５ ）に示す無傷の配列を含む自己スプライシング プロセスによって ｃｉｒｃＲＮＡ 分子を生成できます。

本発明のさらなる態様は、上記で提供される新規プロセスのいずれかまたはそれらの組み合わせによって製造される任意の環状ＲＮＡプラットフォーム（ｃｉｒＲＮＡ）である。

本発明は、添付の図面を参照して詳細な説明でさらに説明される。
図１は 本発明による操作された親プラスミドＤＮＡ ｐＳＹＴＥｃＲＮＡの例示的な実施形態の概略図。 図２は ｐＳＹＴＥｃＲＮＡ の合成 ＤＮＡ バックボーンの模式図。 図３は ｐＳＹＴＥｃＲＮＡ の環状 ＲＮＡ モジュール足場の模式図。 図４は、ｐＳＹＴＥｃＲＮＡ の ｃｉｒｃＳＥＱ１ 配列の模式図です。 図５は、ｐＳＹＴＥｃＲＮＡ の ｃｉｒｃＳＥＱ２ 配列の模式図です。 図６は、本発明のいくつかの実施形態による、線状ＩＶＴ生成ＲＮＡ分子におけるＨＲ領域（ＨＲ１Ａ／ＨＲ２ＡおよびＨＲ１Ｂ／ＨＲ２Ｂ）の自己アニーリングの詳細図である。また、自己スプライシング イントロン － エクソンの向きについても詳しく説明します。 図７は、本発明のいくつかの実施形態による、その遺伝子配列を含むＳＹＴＥ－ＤＮＡｚＲＬ１６ ＤＮＡザイムの模式図である。 図８は、線形 ＲＮＡ モジュール足場の ＨＲ１Ａ および ＨＲ２Ｂ 領域に相補的な操作された ｇＲＮＡ に関連する ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９－ＤＮＡ リガーゼ キメラの概略図です。 図９は、本発明のいくつかの実施形態による、ＲＮＡ連結ＤＮＡザイムを使用するｃｉｒＲＮＡ産生プロセスの概略図である。 図１０は、本発明のいくつかの実施形態による、ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９－ＤＮＡリガーゼｇＲＮＡ－ＨＲ複合体を使用するｃｉｒＲＮＡ産生プロセスの概略図である。 図１１ は、自己相補的イントロン － エクソン媒介 ＲＮＡ ライゲーション法を使用した ｃｉｒｃＲＮＡ 製造プロセスの概略図です。 図１２は、本発明のいくつかの実施形態による、その遺伝子配列を含む、ＳＹＴＥ－ＤＮＡｚＲＬ１２ ＤＮＡザイムの模式図である。 図１３は、線状ＲＮＡの環状化のためのＤＮＡｚｙｍｅ媒介ＲＮＡライゲーション反応の模式図である。 図１４は、本発明の実施形態に従ってＲＮＡを環状化するためにＤＮＡｚｙｍｅを使用した場合の時間に対するＲＮＡライゲーション収量を表すグラフである。 図１５は、ＰＣＲによって生成された線状化されたプラスミドＤＮＡ鋳型を示す分析用アガロースゲル電気泳動である。画像は、線形 ｐＳＹＴＥｃＲＮＡ－ＴｕｒｂｏＧＦＰ ＰＣＲ 産物を示しています。 図１６は、ＲＮＡｓｅ Ｆｒｅｅ － ＤＮＡｓｅ Ｉ で以前に処理した ｐＳＹＴＥｃＲＮＡ から ＩＶＴ によって生成された線形 ＲＮＡ を示す分析用アガロースゲル電気泳動です。 図１７ は、ＲＮＡｓｅ Ｒ で処理した後、ＤＮＡｚｙｍｅ を介した ＲＮＡ 環状化で生成された ｃｉｒｃＲＮＡ 分子の存在を確認する分析用アガロースゲル電気泳動です。 図１８は、ＲＮＡｓｅ Ｒ で処理した後、ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９－ＤＮＡＬｉｇａｓｅ を介した ＲＮＡ 環化によって生成された ｃｉｒｃＲＮＡ 分子の存在を確認する分析用アガロースゲル電気泳動です。 図１９は、自己相補的イントロン－エクソン媒介ライゲーションＲＮＡ環状化によって生成されたｃｉｒＲＮＡ分子の存在を確認する分析アガロースゲル電気泳動である。 図２０は、ＤＮＡｚｙｍｅ媒介ＲＮＡライゲーション法についてｑＰＣＲによって得られたｃｉｒＲＮＡ／全ＲＮＡの比を表すグラフである。 図２１は、 ＤＮＡｚｙｍｅ媒介ＲＮＡライゲーション法のためのＱｕｂｉｔ（商標）ＲＮＡ Ｂｒｏａｄ ｒａｎｇｅキットを使用して定量化された、蛍光分析によって測定されたｃｉｒＲＮＡ分子の正規化された質量を表すグラフである。 図２２は、ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９－ＤＮＡリガーゼ媒介ＲＮＡライゲーション法についてｑＰＣＲによって得られたｃｉｒＲＮＡ／全ＲＮＡの比を表すグラフである。 図２３は、ＤＮＡｚｙｍｅ媒介ＲＮＡライゲーション法のためのＱｕｂｉｔ（商標）ＲＮＡ Ｂｒｏａｄ ｒａｎｇｅ ｋｉｔを使用して定量化された、蛍光分析によって測定されたｃｉｒＲＮＡ分子の正規化された質量を表すグラフである。 図２４は、自己相補的イントロン－エクソン媒介ライゲーションＲＮＡ環状化法についてｑＰＣＲによって得られたｃｉｒＲＮＡ／全ＲＮＡの比を表すグラフである。 図２５ は、自己相補的イントロン－エクソン媒介ライゲーション ＲＮＡ 環状化法のための Ｑｕｂｉｔ^ＴＭ ＲＮＡ Ｂｒｏａｄ ｒａｎｇｅ キットを使用して定量化された、蛍光測定法によって測定された ｃｉｒｃＲＮＡ 分子の正規化された質量を表すグラフです。 図２６ は、非修飾ヌクレオチドおよび自己相補的イントロン－エクソン媒介環状化を使用して生成された線状未修飾 ＲＮＡ 分子、線状修飾 ＲＮＡ 分子、および ｃｉｒｃＲＮＡ 分子である、非腫瘍ＨＥＫ ２９３ 細胞株におけるトランスフェクション発現アッセイにおける ＧＬｕｃ 活性をグラフで表したものです。メソッドが使用されました。正規化された ＧＬｕｃ 活性を １４４ 時間 （６ 日間） 測定しました。 図２７は、黒色腫ＳＫ－ＭＥＬ－２８細胞系におけるトランスフェクション発現アッセイにおけるＧＬｕｃ活性をグラフで表し、直鎖未修飾ＲＮＡ分子、直鎖修飾ＲＮＡ分子、および非修飾ヌクレオチドおよび自己相補的イントロン－エクソンを使用して生成されたｃｉｒＲＮＡ分子である。媒介循環法を使用した。正規化された ＧＬｕｃ 活性を １４４ 時間 （６ 日間） 測定しました。 図２８ は、蛍光のネガティブ コントロールとして、 ｔｕｒｂｏＧＦＰレポーター遺伝子および ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ配列をコードする ｃｉｒｃＲＮＡ でトランスフェクトされた細胞の蛍光顕微鏡分析を示しています。本明細書で説明する例示的な実施形態は、さまざまな修正および代替形態を受け入れることができるが、特定の実施形態を例として図面に示し、以下で詳細に説明する。しかしながら、本明細書に記載された例示的な実施形態は、開示された特定の形態に限定されることを意図していない。

発明の詳細な説明
本発明の一般的な動作特性および利点は、好ましい実施形態に関連してこの節でより詳細に説明されるが、これらは本発明を限定するものではなく、例示としてのみ考慮されるべきである。

本明細書に記載されているように、新しい操作された環状 ＲＮＡ （ｃｉｒｃＲＮＡ） プラットフォーム、その製造プロセス、およびその使用が開発されました。本明細書に記載のｃｉｒｃＲＮＡ分子は、必要なすべての配列を含む操作された親プラスミドＤＮＡベクターに由来するｉｎ ｖｉｔｒｏで転写された線形ＲＮＡ分子の環状化によって生成されます。これらの ｃｉｒｃＲＮＡ 分子は、共有結合を介して連続的な環状構造を形成するポリリボヌクレオチドであり、原核細胞および真核細胞内で翻訳できる非コード配列およびコード配列を保持できます。

循環トポロジーにより、ｃｉｒｃＲＮＡ は安定性が向上し、半減期が長くなり、不要な免疫原性が減少し、タンパク質発現量が増加し、線形 ＲＮＡ と比較して機能が向上します。

環状化の結果として、ｃｉｒｃＲＮＡ には、治療薬としての使用を非常に魅力的にするいくつかの特徴が含まれています。例えば、環状の共有結合で閉じたポリリボヌクレオチドは、線状 ＲＮＡ 分子と比較して、エキソヌクレアーゼによる分解の影響を大幅に受けにくく、したがって、薬学的組成物およびユビキタス エキソヌクレアーゼが存在する細胞外空間でより安定しています。図 １７ ～ １９に示すように、ｃｉｒｃＲＮＡ 分子をエキソヌクレアーゼとインキュベートすることで安定性の向上が証明されており、分解は観察されていません。さらに、ｃｉｒｃＲＮＡ分子は室温で水道水に保存されており、分解は発生していません。

いくつかの実施形態では、環状の共有結合で閉じたＲＮＡ分子は、非天然であり得、組換えＤＮＡ技術、および化学合成または酵素合成によって生成され得る、親の環状共有結合で閉じたデオキシリボ核酸プラスミドから転写される。

さらに、環状共有結合閉鎖ＲＮＡを産生するために使用されるデオキシリボ核酸分子は、天然に存在する核酸配列の遺伝子配列、天然には通常見出されない改変バージョン、またはそれらの組み合わせ（例えば、キメラ分子、融合タンパク質またはデノボ生成）を含むことができる。デオキシリボ核酸分子は、部位特異的突然変異誘発、化学誘発突然変異、目的の核酸フラグメントの制限酵素切断、核酸フラグメントのライゲーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ ） 変異誘発、増幅、目的の遺伝子配列のライゲーション、化学合成、または酵素合成。

環状ＲＮＡ分子は、以下に記載する新規方法のいずれかによる直鎖状ＲＮＡ分子の環状化によって生成することができる。形成されたホスホジエステル結合は、分子内結合または分子間結合であり、完全に機能的なコンカテマーを生成します。
本発明の第１の態様によれば、以下を含む操作された環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡが提供される（図１ ）：
少なくとも２つのエンドヌクレアーゼ認識配列（ＬＲＥ、 Ｌｉｎｅａｒｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ ）、少なくとも１つの細菌選択システム、および少なくとも１つの細菌複製起点を含む合成ＤＮＡ骨格（図２ ）、および；
少なくとも １ つの ＲＮＡ ポリメラーゼ プロモーター、少なくとも １ つの環状化配列 （ｃｉｒｃＳＥＱ１）、少なくとも １ つの ５’ ＤＮＡ スペーサー、少なくとも １ つの複数の制限酵素認識配列 （ＭＣＳ１） を次の順序で含む、少なくとも １ つの環状 ＲＮＡ モジュール足場）、少なくとも １ つの翻訳開始配列、少なくとも ２ 番目の複数の制限酵素認識配列 （ＭＣＳ２）、少なくとも １ つのコード配列、少なくとも ３ 番目の複数の制限酵素認識配列 （ＭＣＳ３）、および少なくとも １ つの ３’ ＤＮＡ スペーサー （図 ３ ）。前記環状化配列は、ＲＮＡライゲーションが可能な核酸および／またはタンパク質ベースのシステムに相補的な相同領域配列を含み、前記システムは、ＲＮＡライゲーションＤＮＡザイム、ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９－ＤＮＡリガーゼ、およびイントロン－エクソン媒介ライゲーションからなる群から選択される。

翻訳開始配列（例えば、ＩＲＥＳ）および目的のコーディング配列は、非コーディングスペーサーによって隣接され、さらに、５’でｃｉｒＳＥＱ１および３’でｃｉｒＳＥＱ２として示される環状化配列によって隣接される。さらに、ＲＮＡプロモーターは、図３に示すようにｃｉｒｃＳＥＱ１の上流に位置する。独自の制限酵素認識部位 （ＬＲＥ Ｌｉｎｅａｒｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ ） は、ＲＮＡ プロモーター配列の上流で ｃｉｒｃＳＥＱ２ 配列の後にあり、 ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応の前に ＤＮＡ ベクターを直線化できます。操作されたプラスミドは、選択システムおよび細菌の複製起点を含む合成ＤＮＡ骨格を保有しています。

いくつかの実施形態では、細菌の複製起点は、ｐＭＢ１起点、ｐＭＢ１ ＊ 誘導体起点、ｐＢＲ３２２起点、ＣｏｌＥ１起点、ＣｏｌＥ１ ＊ 派生起点およびＦ１起点から選択することができるが、これらに限定されない。好ましくは、細菌の複製起点は、高コピー数の複製起点であるｐＭＢ１ ＊ 誘導体を含む。

いくつかの実施形態では、細菌選択系は、細菌内で抗生物質耐性遺伝子を発現することができる転写単位を含む。例として、抗生物質耐性遺伝子は、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ポリミキシン Ｂ 耐性遺伝子。好ましい実施形態では、抗生物質耐性遺伝子はアンピシリン耐性遺伝子である。

本明細書に記載の親環状共有結合閉鎖合成プラスミド ＤＮＡ は、 ３ つの異なる製造プロセスを可能にするように設計されました。環状 ＲＮＡ 分子の製造。そのために、環状化シーケンス ｃｉｒｃＳＥＱ１ （図 ４ ） および ｃｉｒｃＳＥＱ２ （図 ５ ） は、３ つの製造プロセスのいずれかによる環状化に必要なすべての配列を保持するように設計されました。

ＤＮＡｚｙｍｅ を介した製造プロセスと ＣＲＩＳＰＲ－ｄＣａｓ９－Ｌｉｇａｓｅ を介した製造プロセスの両方で、３ 番目のプロセス （自己スプライシングを介した環状化） に関与するエキソンとイントロン、およびいくつかの相同領域を ｃｉｒｃＳＥＱ１ と ｃｉｒｃＳＥＱ２ から除去してから、 ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応が起こります。この「ｃｉｒｃＳＥＱ´ｓ トリミング」により、相同領域 ＨＲ１Ａ および ＨＲ２Ｂ のみが、それぞれｉｎ ｖｉｔｒｏ で転写された線形 ＲＮＡ 分子の ５’ および ３’ 領域として残ります。したがって、これらの領域は、ＤＮＡｚｙｍｅ 相同領域 ＤＮＡｚＨＲ２Ａ および ＤＮＡｚＨＲ１Ｂ （図 ７ ）、または ＣＲＩＳＰＲ－ｄＣａｓ９－ＤＮＡ リガーゼ キメラにロードされた ｇＲＮＡ （ＨＲ２Ａ－１Ｂ） （図 ８ ）のいずれかによって結合されるアンカー配列として機能します。

本発明の第２の態様では、第１の環状化配列（ｃｉｒＳＥＱ１）は、少なくとも第１の制限酵素認識配列（ＲＥ１Ａ）、エクソンセグメント（エクソンＩ）およびイントロンに作動可能に連結された第１の相同領域（ＨＲ１Ｂ）から構成される。置換された自己スプライシングおよび自己触媒グループ Ｉ イントロン － エクソン システムに由来するセグメント （イントロン Ｉ）、２ 番目の制限酵素認識配列 （ＲＥ１Ｂ） および ２ 番目の相同領域 （ＨＲ１Ａ） （図 ４） 。

本発明の第３の態様では、第２の環状化配列（ｃｉｒＳＥＱ２）は、第１の制限酵素認識配列（ＲＥ２Ａ）、エキソンセグメント（エキソンＩＩ）およびイントロンに作動可能に連結された少なくとも第１の相同領域（ＨＲ２Ｂ）から構成される。置換された自己スプライシングおよび自己触媒グループ Ｉ イントロン － エクソン システムに由来するセグメント （イントロン ＩＩ）、２ 番目の相同領域 （ＨＲ２Ａ） および ２ 番目の制限酵素認識配列 （ＲＥ２Ｂ） （図 ５ ） 。

本発明の第４の態様では、第１の環状化配列ｃｉｒＳＥＱ１の第１の相同領域ＨＲ１Ａは、第２の環状化配列ｃｉｒＳＥＱ２の第２の相同領域ＨＲ２Ａに相補的である（図６ ） 。

本発明の第５の態様では、第１の環状化配列ｃｉｒＳＥＱ１の第２の相同性領域ＨＲ１Ｂは、第２の環状化配列ｃｉｒＳＥＱ２の第１の相同性領域ＨＲ２Ｂに相補的である（図６ ） 。

いくつかの実施形態では、ｃｉｒＳＥＱ１ ＨＲ１Ａ配列は、アデニン、チミン、グアニン、およびシトシンから選択することができる少なくとも１０個のランダムなヌクレオチドから構成される。好ましい実施形態では、配列は配列番号２である。

いくつかの実施形態では、ｃｉｒＳＥＱ１ ＨＲ１Ｂ配列は、アデニン、チミン、グアニン、およびシトシンから選択することができる少なくとも１０個のランダムなヌクレオチドから構成される。好ましい実施形態では、配列は配列番号３である。

いくつかの実施形態では、ｃｉｒＳＥＱ２ ＨＲ２Ａ配列は、アデニン、チミン、グアニン、およびシトシンから選択することができる少なくとも１０個のランダムなヌクレオチドから構成される。好ましい実施形態では、配列は配列番号４である。

いくつかの実施形態では、ｃｉｒＳＥＱ２ ＨＲ２Ｂ配列は、アデニン、チミン、グアニン、およびシトシンから選択することができる少なくとも１０個のランダムなヌクレオチドから構成される。好ましい実施形態では、配列は配列番号５である。

いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターはウイルス性であってもよく、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ４ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、およびＫ１１ ＲＮＡポリメラーゼから選択されるが、これらに限定されない。プロモーター。好ましい実施形態では、選択されたウイルスＲＮＡポリメラーゼプロモーターはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターである。

内部リボソーム侵入部位 （ＩＲＥＳ） 遺伝要素は、真核生物のリボソームに結合して翻訳開始を促進することができる任意の ＲＮＡ 配列を含みます。 ＩＲＥＳは、その非限定的な例を参照して、以下でより詳細に説明される。

コード配列は、特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を指す。好ましいコード配列は、以下により詳細に記載されている。

本明細書で使用される用語「スペーサー」または「スペーサー配列」は、２つの遺伝子配列を互いに物理的に分離する非コード遺伝子配列を指す。いくつかの実施形態では、環状プラスミドＤＮＡは、少なくとも１つのスペーサー配列を含む。他の実施形態では、プラスミドＤＮＡは、２つ以上のスペーサー配列を含む。

線状化制限酵素）として示される適切な制限酵素に供して、それらの固有の制限酵素部位でＤＮＡ分子を切断することを含む。

他の実施形態によれば、ＤＮＡ分子を線状化するステップは、プラスミドＤＮＡを標準的なＰＣＲ反応に供することを含む。

本明細書に記載されるように、「適切な緩衝液」という用語は、ライゲーション反応が起こるのを可能にする任意の緩衝液を指す。

本明細書に記載されるように、「適切な細菌」という用語は、操作された環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡに存在する細菌の複製起点を認識し、そのＤＮＡを複製することができる任意の細菌を指す。適切な細菌の非限定的な例は： ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０、 Ｅ．ｃｏｌｉ ＮｏｖａＢｌｕｅ 、 Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ、およびＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂなど。好ましい実施形態では、適切に選択された細菌は、大腸菌ＴＯＰ１０細菌である。

本発明の第６の態様では、少なくとも以下の工程を含む環状ＲＮＡの製造方法を記載する：
を。本発明の操作された親円形共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡを適切な細菌株に形質転換し、前記親プラスミドに含まれる細菌選択系によって組換えクローンを選択すること；
ｂ．得られた組換え細菌を成長条件でのインキュベーションに供して、適切な分子量を生成するために操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミド ＤＮＡ の複製を可能にする。
ｃ．得られた操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミド ＤＮＡ分子を分離および精製する。
ｄ． ＲＮＡライゲーションＤＮＡザイム、ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９－ＤＮＡリガーゼ、およびイントロン－エクソン媒介ライゲーションからなる群から適切なライゲーションシステムを選択すること；
ｅ．精製された操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミド ＤＮＡ を適切な制限酵素で消化する。
ｆ．操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡ の線形化された環状 ＲＮＡ モジュール足場を精製します。
ｇ．線状ＲＮＡ分子を生成するために、精製された線状化された環状ＲＮＡモジュール足場をインビトロ転写反応に供する工程；
ｈ．選択された適切な環状化法に線状 ＲＮＡ 分子を供する。と、
私。得られた環状ＲＮＡを精製し、
ＤＮＡｚｙｍｅ を介した ＲＮＡ 環状化 （ ＤＭＲＣ ）

インビトロ選択によって実験室で生成された、ＤＮＡザイムまたはデオキシリボザイムとも呼ばれる、ＤＮＡでできた酵素を含む。

一本鎖 ＤＮＡ の定義された配列は、ｃｉｒｃＲＮＡ を生成するためにホスホジエステル結合を作成する ＲＮＡ 分子のライゲーションを触媒する活性部位アーキテクチャの形成を媒介するように設計されています （図 １２および１３ ） 。

ＤＮＡザイム
ＤＮＡ は、相補的な Ａ－Ｔ および Ｇ－Ｃ 塩基対の水素結合およびスタッキング相互作用によって結合された ２ つの逆平行ホスホジエステル単鎖の有名なワトソン クリック二重らせんの形で最もよく知られています。しかし、ＤＮＡ が三次元構造を形成する能力は、遺伝情報を保存し、次世代に忠実に伝達することを主な目的とする静的二重らせんをはるかに超えています。一本鎖ＤＮＡの定義された配列に保存された情報が、化学変換を触媒する活性部位構造の形成に利用できることは、現在十分に確立されています。
当初、ＤＮＡザイムはリボヌクレオチドホスホジエステル結合の部位特異的切断を触媒することしか知られていませんでしたが、近年、さまざまな直鎖および分岐構造の核酸フラグメントのライゲーションのための新しいホスホジエステル結合の形成を触媒するように設計されました。 ２ つの ＲＮＡ フラグメント間のネイティブ ３’－５’－ホスホジエステル結合の ＤＮＡ 触媒による形成は、Ｔ４ ＲＮＡ リガーゼなどのタンパク質酵素を機能的に模倣し、大きな合成 ＲＮＡ へのタンパク質を含まないアクセスを容易にします。 ＤＮＡ 酵素は、ワトソン－クリック塩基対形成を介してその ２ つの ＲＮＡ 基質にハイブリダイズし、１ つの ＲＮＡ フラグメント （アクセプター ＲＮＡ） の ３’－ヒドロキシ基の位置選択的活性化を与え、活性化された ５’－リン酸基での求核攻撃を行います。図 １３に示すように、２ 番目の ＲＮＡ フラグメント （ドナー ＲＮＡ） 。 ＤＮＡｚｙｍｅｓ は、基質としてリン酸基と、Ｍｇ ^２＋や Ｚｎ ^２＋などの二価金属イオンを必要とするため、ＤＮＡ ポリメラーゼとも比較されます。 ホスホジエステル結合を生成するため。

ＤＮＡベースの酵素はペプチド基質に作用することができ、アミノ酸側鎖の共有結合修飾、チロシンアジド－アデニル化、ペプチドＴｙｒのリン酸化、ペプチドＴｙｒの脱リン酸化、またはリン酸化アミノ酸鎖の共有結合修飾が可能です。他のＤＮＡザイムは、他の基質に作用することができ、アミドおよびエステルを加水分解し、ポルフィリン核をグリコシル化または金属化し、ディールス・アルダー反応を行うことができます。 ＤＮＡｚｙｍｅｓ は ＤＮＡ 基質にも作用し、チミン二量体修復、ＤＮＡ 浄化、ＤＮＡ リン酸化、ＤＮＡ キャッピング、ＤＮＡ 切断、および ＤＮＡ ライゲーションが可能であり、最後に、ＤＮＡｚｙｍｅｓ は ＲＮＡ 分子に作用し、ＲＮＡ を切断することができます。分子とライゲーションも同様です。

ＲＮＡ ライゲーションが可能な ＤＮＡ ベースの酵素は生化学的に詳しく調査され、９ＤＢ１ ＤＮＡ 酵素は、Ｘ 線結晶構造解析によって三次元構造が決定された最初の ＤＮＡ 触媒でした。この構造は、長距離のワトソン－クリック塩基対と非標準的な水素結合相互作用を含む触媒コアの ３１ ｎｔ 二重シュードノット アーキテクチャを明らかにしましたが、これは生化学的データからは予測できませんでした （図 ７ ） 。この構造はまた、ライゲーションの位置選択性を説明し、活性化メカニズムにおける ＤＮＡ バックボーンの重要なホスホジエステルの関与を提案し、計算解析によってさらに調査されました。

目的の ＲＮＡ ライゲーションの触媒活性を持つ ＤＮＡ 酵素は、 ４０ 個のランダム コア ヌクレオチドを含む ＤＮＡ ライブラリーからのｉｎ ｖｉｔｒｏ選択によって同定されました。後続の選択ラウンドで増幅される－５’－ライゲーション産物。現在、ＤＮＡｚｙｍｅｓ の唯一知られているアプリケーションは、より長い線形フラグメントを形成するために、線形 ＲＮＡ の小さなフラグメントを連結することです。したがって、環状 ＲＮＡ を生成するための ＤＮＡｚｙｍｅ の使用は、ＲＮＡ 分子を高効率で環状化する新しい方法です。

ＤＮＡ 酵素の実用的なアプリケーションの重要な側面は、受け入れられた ＲＮＡ シーケンスの観点からの基質の優先度と、活性化されたリン酸基を持つドナー基質へのアクセス可能性です。

したがって、選択されたライゲーションシステムがＲＮＡライゲーションＤＮＡザイムである場合、前記ＤＮＡザイムは少なくとも以下の３つのセクションを含む：
第１のセクションは、連結される標的ＲＮＡの５’自由末端を標的とする相補的領域である（ＤＮＡｚ－ＨＲ２Ａ；配列番号４ ）；
２番目のセクションはコアであり、ＲＮＡがライゲーションされるのに理想的な環境を作り出す安定した立体空間構造を提供する能力を備えたＤＮＡザイムの一部であり、そのようなコアは、それらの組み合わせ内で相乗効果を持つヌクレオチドで構成されています。ワトソン－クリック塩基対形成による ２ つの ＲＮＡ 基質のハイブリダイゼーションを可能にします。と、
第３のセクションは、連結される標的ＲＮＡの３’遊離末端を標的とする相補的領域である（ＤＮＡｚ－ＨＲ１Ｂ；配列番号３ ）。

好ましい実施形態では、ＤＮＡザイムコアは特に４０個のヌクレオチドからなる。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択実験からコンセンサス配列として出現しました。選択手順では、線状 ＲＮＡ 基質の末端が相補的な ＤＮＡｚｙｍｅ 配列に結合していました。 ＲＮＡ基質は、核酸酵素によって触媒されるＲＮＡライゲーション反応において、典型的には２’－または３’－ヒドロキシルと反応する５’－三リン酸基を有する。 １０ラウンドの選択の後、ＳＹＴＥ－ＤＮＡｚＲＬ１２（配列番号８ ）は、活性クローンの配列を整列させることによって同定され、図７に示されるように、化学合成によって独立して調製された．同じセレクションも用意されていました。 ＳＹＴＥ－ＤＮＡｚＲＬ１２ を介した ＲＮＡ ライゲーション反応は、９０％ 以上の収率で急速に進行し、 ｋ _ｏｂｓ ～ ０．５ ｍｉｎ ^－１、３７ °Ｃ、４０ ｍＭ ＭｇＣｌ _２ （図 １４ ）。

標的ＲＮＡは、その３’遊離末端に求核剤として働く３’－ヒドロキシ基を含み得る。また、標的ＲＮＡは任意のヌクレオチドで終わることができるが、以下の優先順位の降順が好ましい：Ａ＞Ｇ＞Ｕ＞Ｃ。 ＤＮＡザイム相補領域は、任意の長さであってよく、グアニン－シトシン（ＧＣ）のパーセンテージは、２０％～８０％の範囲、好ましくは２０％～６０％の範囲、さらにより好ましくは４０％の範囲である。 ６０％に。

５’遊離末端は、好ましくは三リン酸化されており、グアニンが好ましいが、任意のヌクレオチドで開始することができる。 ＤＮＡザイム相補領域は、任意の長さであってよく、グアニン－シトシン（ＧＣ）のパーセンテージは、２０％～８０％の範囲、好ましくは２０％～６０％の範囲、さらにより好ましくは４０％の範囲である。 ６０％に。

図 １２に示すように、配列優先の理由を明らかにしました。いくつかのデオキシリボザイムは、５’－アデニル化 ＲＮＡ および ＤＮＡ と ２’，５’－分岐核酸構造を形成することが知られています。しかし、本発明のＳＹＴＥ－ＤＮＡｚＲＬ１２デオキシリボザイムを５’－ｐｐｐＲＮＡの代わりに５’－ＡｐｐＲＮＡで試験した場合、低いライゲーション収率しか得られなかった（５’－ｐｐｐＲＮＡで＞９５％と比較して＜１０％）。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ で広範囲のコーディングおよび非コーディング ＲＮＡ を効率的に環状化するように合理的に設計されました。

図９に示すように、インビトロ転写反応が行われると直鎖ＲＮＡ分子が生成され、直鎖ＲＮＡ分子をＤＮＡザイムおよび適切な緩衝液と混合した後、環状化反応が起こる。

好ましい実施形態では、適切な緩衝液は、３７℃の温度で、４０ｍＭ ＭｇＣｌ２（Ｍｇ＋２）、５０ｍＭ ＣＨＥＳ、ｐＨ９．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌからなる。あるいは、より低いｋ _ｏｂｓを有する５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５の添加は、減少したｐＨ値に基づいて予想される。

生物学的に活性なタンパク質は、真核細胞でこれらの ｃｉｒｃＲＮＡ から生成できます。これらの新規に設計されたｃｉｒｃＲＮＡは、アフィニティークロマトグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィーによって精製できます。

ＤＮＡｚｙｍｅ を介した ＲＮＡ 環化 （ ＤＭＲＣ ）に関する一般的な実験上の考慮事項
Ｔ７ ＲＮＡ ポリメラーゼ （ＮＥＢ） によるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって ５’－三リン酸を含む線形 ＲＮＡ テンプレートが調製されました。操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミド ＤＮＡ テンプレートは、ＧｅｎｅＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｎｃ． によって合成されました。選択された制限酵素による消化、電気泳動、およびアガロースゲルからの精製により、 ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のテンプレートとして使用される線形二本鎖 ＤＮＡ 分子が提供されました。

ＮＥＢ の ＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ キットに含まれている Ｔ７ ＲＮＡ ポリメラーゼを使用しましたが、ＳＰ６ や Ｔ３ などのさまざまな ＲＮＡ ポリメラーゼによって転写が行われる可能性があります。採用した複製起点は、ｐＭＢ１起点の高コピー数変異体であり、選択カセットは、アンピシリン耐性遺伝子を発現できる転写ユニットを含んでいた。他の実施形態では、クロラムフェニコールおよびカナマイシンなどの選択遺伝子として、ＣｏｌＥ１およびｐＢＲ３２２などのいくつかの異なる複製起点を使用することができる。

前述のように、親環状共有結合合成プラスミド ＤＮＡ は、３ つの製造プロセス （すなわち、ＤＮＡｚｙｍｅ を介した ＲＮＡ 環状化、ＣＲＩＳＰＲ－ｄＣａｓ９－Ｌｉｇａｓｅ を介した ＲＮＡ 環状化、および自己スプライシング） のいずれかによる環状化に必要なすべての配列を持っています。を介した ＲＮＡ 環状化）。上記の ＲＮＡ 環状化反応が最初の ２ つのプロセス （ＤＮＡｚｙｍｅ を介した ＲＮＡ 環状化、ＣＲＩＳＰＲ－ｄＣａｓ９－Ｌｉｇａｓｅ を介した） のいずれかによって実行される場合、関与する配列を除去するために、まず ｃｉｒｃＳＥＱ 領域を「トリミング」する必要があります。 ３ 番目の方法 （自己スプライシングを介した ＲＮＡ 環状化）。この目的のために、適切な特定の制限酵素認識配列がｃｉｒｃＳＥＱに含まれていました（すなわち、ＲＥ１Ａ、ＲＥ１Ｂ、ＲＥ２Ａ、およびＲＥ２Ｂ；図４および５）。

相同領域ＨＲ１Ａ（配列番号２）および相同領域ＨＲ２Ｂ（配列番号３）のＲＮＡ基質配列は、多様なプロトタイプを用いた選択実験から得られたコンセンサス様式で定義された。 ＲＮＡ 末端はライゲーション効率に影響を与えることが示されましたが、異なる内部相同性配列にはかなりの違いがなく、方法にダイナミズムと適応性を付与するランダムである可能性があります。好みの端は、５’－ＰＰＰ－ＧＧＡ および ＧＧＡ－３’ です。

すべての速度論的アッセイについて、ＨＲ１Ａ基質は、 γ ^３２Ｐ－ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）で５’－ ^３２ Ｐ放射標識した。 ＨＲ２ Ａ：ＤＮＡｚ ：ＨＲ１Ｂ の比率は１：５：１ で、ＤＮＡｚ （ＤＮＡｚｙｍｅ） の濃度は ～０．５ μＭ でした。 ｋ _ｏｂｓと最終収量の値は、収量対時間のデータを一次反応速度論、収量 ＝ Ｙ（１－ｅ ^－ｋｔ ） に直接当てはめることによって得られました。ここで、ｋ ＝ ｋ _ｏｂｓおよび Ｙ ＝ 最終収量です。 Ｍｇ ^２＋を用いたアッセイの標準インキュベーション条件は、 ３７ °Ｃ で１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、２ ｍＭ ＫＣｌ、および ４０ ｍＭ ＭｇＣｌ _２を含む ５０ ｍＭ ＣＨＥＳ、ｐＨ ９．０ でした。あるいは、５０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．５ は効果的でしたが、低い ｋ _ｏｂｓであり（データは示していません）、これはｐＨ 値の低下に基づいて予想されました。金属イオン Ｍｇ ^２＋は、触媒活性構造を確立するために必要な三分子複合体の成分間の特定の相互作用を媒介すると推定されます。

分析規模アッセイの詳細な手順は、Ｍｇ ^２＋依存性デオキシリボザイムについて次のとおりでした。 １ ｐｍｏｌ の ＨＲ２Ａ 基質、５ ｐｍｏｌ の ＳＹＴＥ－ＤＮＡｚＲＬ１２、および １ ｐｍｏｌ の ＨＲ１Ｂ 基質 （ＨＲ２ Ａ：ＤＮＡｚ ：ＨＲ１Ｂ ＝ １：５：１） を ７ μＬ の ５ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．５ に含むサンプルを調製しました。 １５ ｍＭ ＮａＣｌ、および ０．１ ｍＭ ＥＤＴＡ。サンプルを ９５ °Ｃ で ３ 分間加熱した後、氷上で ５ 分間冷却してアニールしました。容量を、５０ ｍＭ ＣＨＥＳ、ｐＨ ９．０、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、２ ｍＭ ＫＣｌ、および ４０ ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含む １０ μＬ に増やしました。 １０ μＬ の反応溶液を ３７ °Ｃ でインキュベートしました。適切な時点で、１ μＬ のアリコートを ８ μＬ の停止液 （８０％ ホルムアミド、１ × ＴＢ ［各 Ｔｒｉｓ およびホウ酸、ｐＨ ８．３］、５０ ｍＭ ＥＤＴＡ、および各 ０．０２５％ キシレンシアノールおよびブロモフェノール） でクエンチしました。青）。基質と生成物は、ＴＡＥ 中の １％ アガロースゲルを使用して分離し、ＵＶ 光で可視化しました。

したがって、本発明の第７の態様では、第１の環状ＲＮＡ製造プロセスが提供され（図９ ）、前記プロセスは少なくとも以下の段階を含む：
を。本発明の操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡを適切な細菌株に形質転換し、親プラスミドに含まれる細菌選択系によって組換えクローンを選択すること、
ｂ．適切な質量の分子を生成するために、操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡの複製を可能にするために、組換え細菌を増殖条件でインキュベーションに供すること。
ｃ．得られた操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミド ＤＮＡ分子を分離および精製する。
ｄ．精製された操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミド ＤＮＡ を ＲＥ１Ａ 制限酵素および ＲＥ１Ｂ 制限酵素で消化して、エクソン Ｉ、イントロン Ｉ、および ＨＲ１Ｂ を含む最初の ｃｉｒｃＳＥＱ 領域 （ｃｉｒｃＳＥＱ１） 内の ＤＮＡ の一部を除去し、続いてゲル電気泳動精製を行うｃｉｒｃＳＥＱ１でトリミングされた線形化された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡの。
ｅ．ゲル電気泳動で精製されたｃｉｒｃＳＥＱ１トリミングされた線形化された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡを再結合します。
ｆ． ｃｉｒｃＳＥＱ１でトリミングされた親環状共有結合合成プラスミドＤＮＡを適切な細菌株に形質転換し、親プラスミドに含まれる細菌選択システムによって組換えクローンを選択すること、
ｇ．得られた ｃｉｒｃＳＥＱ１ トリミングされた親環状共有結合閉鎖合成プラスミド ＤＮＡ分子を分離および精製します。
ｈ． ｃｉｒｃＳＥＱ１ でトリミングされた親環状共有結合閉鎖合成プラスミド ＤＮＡ を ＲＥ２Ａ および ＲＥ２Ｂ で消化して、エクソン ＩＩ、イントロン ＩＩ、および ＨＲ２Ａ を含む ２ 番目の ｃｉｒｃＳＥＱ 領域 （ｃｉｒｃＳＥＱ２） 内の ＤＮＡ の一部を除去し、続いて ｃｉｒｃＳＥＱ１ のゲル電気泳動精製を行うβトリミングされた直線化された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡ。
私。ゲル電気泳動で精製されたｃｉｒｃＳＥＱ１ ／ ２でトリミングされた親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡ分子を再連結します。
ｊ． ｃｉｒｃＳＥＱ１／２ でトリミングされた親環状共有結合合成プラスミド ＤＮＡ を適切な細菌株に変換し、親プラスミドに含まれる細菌選択システムによって組換えクローンを選択します。
ｋ．操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミド ＤＮＡ を ｃｉｒｃＳＥＱ１／２ トリミング領域で分離および精製する。
ｌ． ｃｉｒｃＳＥＱ１／２ でトリミングされた親環状共有結合閉鎖合成プラスミド ＤＮＡ を制限酵素 （ＬＲＥ： Ｌｉｎｅａｒｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅｓ ）の組み合わせで消化します。
メートル。適切な方法で環状ＲＮＡモジュールの足場を精製し、
ｎ．線状 ＲＮＡ 分子を生成するために、線状化された ｃｉｒｃＳＥＱ１／２ トリミングされた親環状共有結合閉鎖合成プラスミド ＤＮＡ （環状 ＲＮＡ モジュール足場） をインビトロ転写反応にかける。
ｏ．環状化を促進するために、線状化された ＲＮＡ 分子を適切なバッファー中で ＤＮＡｚｙｍｅ ライゲーション反応にかける。
ｐ。環状 ＲＮＡ 分子の精製

操作された ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９－Ｌｉｇａｓｅ を介した ＲＮＡ 環化 （ ＣｄＣ－ＬＭＲＣ ）
本発明の他の実施形態では、ＲＮＡの環状化は、ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９－ＤＮＡリガーゼ系の活性によって達成される。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ として知られる原核生物の免疫機構に由来する技術は複数あり、さまざまなアプローチで遺伝子工学およびゲノム工学を支援します。最も直接的なアプリケーションには、任意の細胞内の任意のゲノム遺伝子座を標的とするヌクレアーゼ システムとしてカスタマイズ可能なガイド ＲＮＡ と共にＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の Ｃａｓ９ タンパク質を使用することが含まれます。二本鎖切断 （ＤＳＢ） の導入は、非相同末端結合 （ＮＨＥＪ） または相同組換え （ＨＲ） による突然変異の導入を支援します。ただし、ヌクレアーゼ活性に欠陥のある Ｃａｓ９ 変異体も生成されており （ｄｅａｄ Ｃａｓ９ またはより簡単に ｄＣａｓ９ として知られています）、核酸を標的とする活性のシャトルとしてのみ機能します。この意味で、特にＣＲＩＳＰＲｉまたはＣＲＩＳＰＲａとして知られる分野が、遺伝子発現を調節するために出現しました。

これは、ＤＮＡ であれ ＲＮＡ であれ、核酸を調節および／または修飾する酵素活性を持つさまざまなタンパク質因子を ｄＣａｓ９ に融合できることを意味します。

いくつかの実施形態によれば、ｄＣａｓ９はＴ４ ＤＮＡリガーゼと融合される。図１０に示すように、このタンパク質は、ＩＶＴによって生成された線状ＲＮＡ分子の末端に位置する相同領域（ＨＲ１ＡおよびＨＲ２Ｂ）に向けられたガイドＲＮＡと組み合わされ、その環状化を支援します。

ＤＮＡｚｙｍｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ ＲＮＡ Ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ （ ＤＭＲＣ ）に関する一般的な実験的考慮事項に記載されているように、転写された ＲＮＡ が ＤＮＡｚｙｍｅ または ＣＲＩＳＰＲ によって環状化される場合、親環状共有結合閉鎖合成プラスミド ＤＮＡ は最初にそのｃｉｒＳＥＱ領域で「トリミング」されなければなりません。 ／ｄＣａｓ９／リガーゼ法。したがって、 ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写から得られた線形 ＲＮＡ は、 ｇＲＮＡ と ｄＣａｓ９－Ｌｉｇａｓｅ の複合体で処理することによって環状化されます。

このプロセスは、線形 ＲＮＡ をテンプレートとして使用し、ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９－Ｌｉｇａｓｅ 融合を ＲＮＡ ライゲーションと環状化を支援するシステムとして使用し、上記の親環状共有結合閉鎖操作 ｃｉｒｃＳＥＱ１／２ トリミング プラスミド ＤＮＡ と共に使用できます。 ＣＤＳ （コード配列） または非 ＣＤＳ がバックボーンにクローン化されると、増幅および線形化のステップが必要になります。 ＤＮＡ が線形化されると、ＩＶＴ （ ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写） が実行され、線形 ＲＮＡ 分子が得られます。次に、図 １０に示すように、これらの分子を ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９－Ｌｉｇａｓｅ ｇＲＮＡ－ＨＲ 複合体に曝露して、ライゲーション反応を起こさせます。線状ＲＮＡ分子の線状自由末端が連結されると、共有結合で閉じたＲＮＡ分子が生成され、ＨＰＬＣまたはアフィニティーカラムなどの当技術分野で既知のクロマトグラフィー法を使用して精製することができる。

したがって、選択されたライゲーションシステムがＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９－ＤＮＡＬｉｇａｓｅシステムである場合、このシステムは、ペプチドリンカーによってＤＮＡリガーゼに融合されたｄＣａｓ９を含む合成融合タンパク質であり、ＨＲ１ＡおよびＨＲ２Ｂに相補的な合成ｇＲＮＡと複合体を形成し、リガーゼ活性により末端を結合し、直鎖状 ＲＮＡ 分子を環状化します。

本発明の第８の態様によれば、少なくとも以下のステップを含む、第２の環状ＲＮＡ製造プロセスが提供される（図１０）：
を。本発明の操作された親円形共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡを適切な細菌株に形質転換し、親プラスミドに含まれる細菌選択系によって組換えクローンを選択すること；
ｂ．適切な質量の分子を生成するために、遺伝子操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミド ＤＮＡ の複製を可能にする増殖条件で組換え細菌をインキュベーションに供する工程；
ｃ．得られた操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミド ＤＮＡ分子を分離および精製する。
ｄ．精製された操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミド ＤＮＡ を ＲＥ１Ａ 制限酵素および ＲＥ１Ｂ 制限酵素で消化して、エクソン Ｉ、イントロン Ｉ、および ＨＲ１Ｂ を含む最初の ｃｉｒｃＳＥＱ 領域 （ｃｉｒｃＳＥＱ１） 内のＤＮＡ の一部を除去し、続いてゲル電気泳動精製を行うｃｉｒｃＳＥＱ１でトリミングされた線形化された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡの。
ｅ．ゲル電気泳動で精製されたｃｉｒｃＳＥＱ１トリミングされた線形化された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡを再結合します。
ｆ． ｃｉｒｃＳＥＱ１でトリミングされた親環状共有結合合成プラスミドＤＮＡを適切な細菌株に形質転換し、親プラスミドに含まれる細菌選択システムによって組換えクローンを選択する。
ｇ．得られた ｃｉｒｃＳＥＱ１ トリミングされた親環状共有結合閉鎖合成プラスミド ＤＮＡ分子を分離および精製します。
ｈ． ｃｉｒｃＳＥＱ１ でトリミングされた親環状共有結合閉鎖合成プラスミド ＤＮＡ を ＲＥ２Ａ および ＲＥ２Ｂ で消化して、エクソン ＩＩ、イントロン ＩＩ、および ＨＲ２Ａ を含む ２ 番目の ｃｉｒｃＳＥＱ 領域 （ｃｉｒｃＳＥＱ２） 内の ＤＮＡ の一部を除去し、続いて ｃｉｒｃＳＥＱ１ のゲル電気泳動精製を行うβトリミングされた直線化された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡ。
私。ゲル電気泳動で精製されたｃｉｒｃＳＥＱ１ ／ ２でトリミングされた親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡ分子を再連結します。
ｊ． ｃｉｒｃＳＥＱ１／２ でトリミングされた親環状共有結合合成プラスミド ＤＮＡ を適切な細菌株に変換し、親プラスミドに含まれる細菌選択システムによって組換えクローンを選択します。
ｋ．操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミド ＤＮＡ を ｃｉｒｃＳＥＱ１／２ トリミング領域で分離および精製する。
ｌ． ｃｉｒｃＳＥＱ１／２ でトリミングされた親環状共有結合閉鎖合成プラスミド ＤＮＡ を制限酵素 （ＬＲＥ： Ｌｉｎｅａｒｉｚａｔｉｏｎ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅｓ ）の組み合わせで消化します。
メートル。適切な方法で環状ＲＮＡモジュールの足場を精製し、
ｎ．線状ＲＮＡを生成するために、線状化された ｃｉｒｃＳＥＱ１／２ トリミングされた親環状共有結合閉鎖合成プラスミド ＤＮＡ （環状 ＲＮＡ モジュール足場） をインビトロ転写反応に供する。
ｏ．その環状化のために線形ＲＮＡ分子をｄＣａｓ９ ／ ＤＮＡリガーゼキメラに供する。
ｐ。環状化された ＲＮＡ 分子を精製します。

自己相補的イントロン － エクソン媒介ライゲーション （ ＳＣＩＥＭＬ ）
いくつかの実施形態では、自己相補的イントロン－エクソン媒介ライゲーション環状化方法は、環状化配列ｃｉｒＳＥＱ１およびｃｉｒＳＥＱ２に存在する操作された置換イントロン－エクソン自己スプライシングリボザイムを含む。操作されたリボザイムは、３’近位のグループＩイントロン由来の配列を含む。前記配列は、スプライス部位ジヌクレオチドおよび隣接する天然エクソン配列を有する３’イントロン断片を含む。 ５’イントロンフラグメントは、５’スプライス部位ジヌクレオチドおよび隣接する天然エクソンに対応する配列を含む５’近位グループＩイントロン由来配列を含む。

本発明の他の実施形態では、ライゲーション法は、操作されたリボザイム配列および相同領域を有する完全な環状化配列（ｃｉｒＳＥＱ１およびｃｉｒＳＥＱ２）を含む。

図 ４に示すように、５’ で ＨＲ１Ｂ および ３’ で ＨＲ１Ａ として示される相同領域が隣接する操作されたリボザイムで構成されます。一方、ｃｉｒＳＥＱ２配列は、図５に示されるように、５’でＨＲ２Ｂおよび３’でＨＲ２Ａとして示される相同領域が隣接する操作されたリボザイムから構成される。

いくつかの実施形態によれば、完全なｃｉｒＳＥＱ１配列は、互いに連結され、以下の配列様式で配置された以下の要素を含む：
ＨＲ１Ａ （相同性領域 １Ａ）
グループ Ｉ イントロン （イントロン Ｉ） およびエキソン （エキソン Ｉ） 配列の一部で構成される操作されたリボザイム
ＨＲ１Ｂ （ホモロジー領域 １Ｂ）
いくつかの実施形態によれば、完全なｃｉｒＳＥＱ２配列は、互いに連結され、以下の配列様式で配置された以下の要素を含む：
ＨＲ２Ｂ （ホモロジー領域 ２Ｂ）
エクソン （エクソン ＩＩ） の一部とグループ Ｉ イントロン （イントロン ＩＩ） 配列の一部で構成される操作されたリボザイム
ＨＲ２Ａ （ホモロジー領域 ２Ａ）

いくつかの実施形態では、順列自己スプライシンググループＩイントロンフラグメントは、Ｔ４ファージグループＩイントロン、アナベナグループＩイントロン、およびアゾアルクス細菌グループＩイントロンから選択することができるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、選択されたグループＩイントロンフラグメントはアナベナグループＩイントロンである。

いくつかの実施形態では、ｃｉｒＳＥＱ１（配列番号１０ ）は、互いに作動可能に連結され、以下の配列に配置された以下の要素を含む：
ＨＲ１Ｂとして示される５ ’相同領域；
隣接するエキソンの一部である ３’ スプライス部位ジヌクレオチドを含む ３’ 順列自己スプライシング グループ Ｉ イントロン フラグメント。と、
ＨＲ１Ａ として示される ５’ 相同領域。

いくつかの実施形態では、ｃｉｒＳＥＱ２（配列番号１１ ）は、互いに作動可能に連結され、以下の配列に配置された以下の要素を含む：
ＨＲ２Ｂとして示される３’相同性領域；
隣接するエクソンの一部である５’スプライス部位ジヌクレオチドを含む、５’置換自己スプライシンググループＩイントロンフラグメント。と、
ＨＲ２Ａとして示される３’相同領域。

いくつかの実施形態によれば、ＤＮＡ分子を線状化するステップは、プラスミドＤＮＡを適切な制限酵素に供して、固有の制限酵素部位でＤＮＡ分子を切断することを含む。

他の実施形態によれば、ＤＮＡ分子を線状化するステップは、プラスミドＤＮＡをＰＣＲ反応に供することを含む。

このプロセスは、得られた環状ＲＮＡ分子を、好ましくは当技術分野で知られている関心対象の任意のクロマトグラフィー法によって精製するステップをさらに含んでもよい。

いくつかの実施形態では、ｃｉｒＲＮＡ分子を精製するステップは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムにおいて、好ましくはｐＨ範囲４～１０で、トリス－ＥＤＴＡまたはクエン酸緩衝液中のサイズ排除カラムを通してｃｉｒＲＮＡを含む溶液を流すことを含む。 ８ 約 ０．０１ ～ １０ ｍＬ／ｍｉｎ の流速で。

前述のステップは、 ｃｉｒｃＲＮＡを含む溶液をサイズ排除カラムに通した後、ｃｉｒｃＲＮＡをホスファターゼで処理することをさらに含み、それによって、医薬品製剤に適した精製されたｃｉｒｃＲＮＡ分子を生成する。ホスファターゼ処理に続いて ＲＮａｓｅ Ｒ 処理を行うことができます。

得られた精製されたｃｉｒｃＲＮＡは、ナノ粒子に製剤化することができます。

いくつかの実施形態によれば、プロセスは、天然または非天然の修飾ヌクレオチドを用いて実行できるインビトロ転写反応と、ｃｉｒＲＮＡ前駆体ＩＶＴ生成ＲＮＡ分子を適切な緩衝液および制御された条件でインキュベートするステップとをさらに含む。適切な緩衝液は、マグネシウムイオンおよびグアノシンヌクレオチドまたはヌクレオシド（修飾または非修飾のいずれか）を含み得る。いくつかの実施形態では、「制御された条件」は、摂氏２０度から５０度の間の温度を指す。

プラスミド ＤＮＡ テンプレートが制限酵素部位または ＰＣＲ 反応によって線形化され、精製されると、 ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応が実行されて線形 ＲＮＡ 分子が生成されます。これらの分子が生成されると、５’ および ３’ でリボザイムに隣接する自己相補配列 （ＨＲ１Ｂ、ＨＲ１Ａ、ＨＲ２Ｂ、および ＨＲ２Ａ） が自己アニールし、自己触媒リボザイム配列を自己スプライシングおよび自己スプライシングを可能にするのに十分な距離に近づけます。図１１で理解できるように、ライゲーション反応。その結果、円形の共有結合で閉じた ＲＮＡ 分子が生成され、ＨＰＬＣ やアフィニティーカラムなどのクロマトグラフィー法によってさらに精製することができます。

個々の線状 ＲＮＡ 分子のアニーリングによって生成されるコンカテマーが発生する可能性があり、その結果、多転写単位の環状 ＲＮＡ 分子が生成される可能性があります。これらのコンカテマーは翻訳能力があり、生物系で組換えタンパク質を生成できるため、問題にはなりません。

自己相補的イントロン－エクソン媒介ライゲーション （ ＳＣＩＥＭＬ ） は、二本鎖ステム配列の分子内形成を伴わずに生理的な共有結合で閉じた環状 ＲＮＡ 分子の形成を可能にする新しいライゲーション技術であり、したがって、不要な免疫応答とコードされたタンパク質発現のダウンレギュレーションを回避します。

従って、選択されたライゲーションシステムがイントロン－エクソン媒介ライゲーションシステムである場合、完全なｃｉｒＳＥＱ１およびｃｉｒＳＥＱ２配列および適切な緩衝液を有する操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡが使用される。
本発明の第９の態様では、第３の環状ＲＮＡ製造プロセスが提供され（図１１）、ここで前記プロセスは、少なくとも以下の段階を含む：
を。操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミド ＤＮＡ を適切な細菌株に形質転換し、親プラスミドに含まれる細菌選択システムによって組換えクローンを選択する。
ｂ．適切な質量の分子を生成するために、遺伝子操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミド ＤＮＡ の複製を可能にする増殖条件で組換え細菌をインキュベーションに供すること。
ｃ．得られた操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミド ＤＮＡ分子を分離および精製する。
ｄ．精製された操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミド ＤＮＡ を適切な制限酵素で消化する。
ｅ．線形化された環状 ＲＮＡ モジュールの足場を浄化します。
ｆ．線状ＲＮＡ分子を生成するために、線状化された環状ＲＮＡモジュール足場をインビトロ転写反応に供する工程；
ｇ．環状 ＲＮＡ 分子を生成するために、ｃｉｒｃＳＥＱ１ および ｃｉｒｃＳＥＱ２ 配列内の相同配列 ＨＲ１Ａ－ＨＲ２Ａ および ＨＲ１Ｂ－ＨＲ２Ｂ のセルフペアリングを可能にするために、線形化された ＲＮＡ を適切なバッファーにさらし、続いて自発的な自己触媒的自己スプライシング イベントを行います。
ｈ．環状化された ＲＮＡ 分子を精製します。

本発明のさらなる態様は、上記で提供される新規プロセスのいずれかまたはそれらの組み合わせによって製造される任意の環状ＲＮＡプラットフォーム（ｃｉｒＲＮＡ）である。

以下に説明する詳細は、本発明の前述の異なる態様すべてに有効である。

転写ユニット
１． ＩＲＥＳ
藻類、または原生動物を含むがこれらに限定されない生物由来のＤＮＡ配列に由来する。
ＥＣＭＶ ）、コクサッキーウイルスＢ３（ＣＶＢ３）、タウラ症候群ウイルス（ＴＳＶ）、トリアトーマウイルス（ＴＶ）、ヒトマスタデノウイルスＣを含むがこれらに限定されないウイルスに少なくとも部分的に由来する配列である。 （ ＨＡｄＶ －Ｃ）、ヒトアデノウイルス ５ （ＨＡｄＶ５）、ヒトアデノウイルス ７ （ＨＡｄＶ７）、ヒトマスタデノウイルスＢ （ ＨＡｄＶ －Ｂ）、ＧＢ 型肝炎ウイルス Ｂ （ ＨＧＢＶ －Ｂ）、ＨＰＶ３１、ヒトポリオウイルス ３ （ＨＰＶ－３）、ヒトパピローマウイルス１１型（ＨＰＶ１１）、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ－２）、シミアンＴリンパ球向性ウイルス１（ＳＴＬＶｓ－１）、ヒトパルボウイルスＢ１９（ＨＰＢ１９）、ヒトベータヘルペスウイルス６Ｂ （ＨＨＶ－６Ｂ）、ヒトアルファヘルペスウイルス３ （ＨＨＶ－３）、ヒトパピローマウイルス ４１ 型 （ＨＰＶ４１）、ヒトパピローマウイルス ６ｂ 型 （ＨＰＶ６ｂ）、アルファパピローマウイルス ７、フレンドマウス白血病ウイルス、ヘイロウイルス（ ＴｈＶ ）、ラウス肉腫ウイルス （ＲＳＶ） 、ヒトマスタデノウイルスＦ （ ＨＡｄｖ －Ｆ）、ヒトパピローマウイルス ４ 型 （ＨＰＶ４）、ヒトパピローマウイルス ６３ 型 （ＰＨＶ６３）、ヒトマスタデノウイルスＡ、ネコ免疫欠乏症ウイルス （ＦＩＶ）、ヒト Ｔ リンパ球向性ウイルス ２ （ＨＴＬＶ－２）、ヤーグシークテヒツジ レトロウイルス （ ＪＳＲＶ ）、脾臓病巣形成ウイルス （ ＳＦＦＶ ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス （ ＭＭＴＶ ）、マウス骨肉腫ウイルス （ＭＯＶ）、ヒツジレンチウイルス （ＯＬＶ／ ＯｖＬＶ ）、リスザルレトロウイルス （ ＳＭＲＶ ）、ヒトパピローマウイルス １６ 型 （ＨＰＶ１６）、ヒトパピローマウイルス ５ 型 （ＨＰＶ５）、ヒトポリオーマウイルス １、狂犬病リッサウイルス、シミアン免疫不全ウイルス （ＳＩＶ）、ヒトパピローマウイルス １０ 型 （ＨＰＶ１０） ）、ヒトパピローマウイルス２６型（ＨＰＶ２６）、ヒトパピローマウイルス３２型（ＨＰＶ３２）、ヒトパピローマウイルス３４型（ＨＰＶ３４）、マールブルグ・マルグルグウイルス、エンテロウイルスＡ 、ライノウイルスＡ、ヒトベータヘルペスウイルス６Ａ（ＨＨＶ－６Ａ）、アカゲザルポリオーマウイルス１、スネークヘッドレトロウイルス （ ＳｎＲＶ ）、ウシ フォーミー ウイルス （ ＢＦＶ ）、ショウジョウバエ Ｃ ウイルス （ＤＣＶ）、ヘンドラヘニパウイルス（ ＨｅＶ ）、愛知ウイルス １ （ＡｉＶ－１）、インフルエンザ Ｂ ウイルス （ ＩＢＶ ）、ザイール エボラウイルス （ ＺＥＢＯＶ ）、ヒト コロナウイルス ２２９Ｅ （ＨＣｏＶ－２２９Ｅ）、ニパ ヘニパウイルス（ ＮｉＶ ）、ヒトレスピロウイルス１ （ＨＰＩＶ－１）、モドックウイルス （ ＭＯＤＶ ）、スーダンエボラウイルス、ヒトパルボウイルス ４ Ｇ１、ロタウイルス Ｃ、ヒトガンマヘルペスウイルス４ （エプスタイン－バーウイルス）。
ＩＲＥＳ 、カニス・ループス・ファミアリスを含むがこれらに限定されないウイルスに少なくとも部分的に由来する配列である ＩＲＥＳ ， キイロショウジョウバエＩＲＥＳ ， Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ ＩＲＥＳ 、 Ｍｕｓ ｐａｈａｒｉ ＩＲＥＳ 、 Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＩＲＥＳ 、 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＩＲＥＳ 、 Ｚｅａ ｍａｙｓ ＩＲＥＳ 、 Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ ＩＲＥＳ 、 Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ ＩＲＥＳ ．
いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳエレメントは、新規の合成ＩＲＥＳ、例えば、とりわけＳＹＴＥ－ＩＲＥＳ１、ＳＹＴＥ－ＩＲＥＳ２、ＳＹＴＥ－ＩＲＥＳ３、ＳＹＴＥ－ＩＲＥＳ４を含む。

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つまたは複数のオープンリーディングフレームに隣接する少なくとも１つのＩＲＥＳを含む。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳは、１つまたは複数のオープンリーディングフレームの両側に隣接する。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、各オープンリーディングフレームの片側または両側に少なくとも１つのＩＲＥＳ配列を含む。

２． ミレス
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、別のキャップ非依存性メカニズムによって翻訳され得る。いくつかの実施形態では、キャップ非依存性機構は、環状ポリリボヌクレオチド内のアデノシン塩基、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）の６位の窒素のメチル化によって媒介される。

Ｎ６－メチルアデノシン （ｍ６Ａ） は、いくつかの真核生物の ｍＲＮＡ に見られる可逆的なエピトランスクリプトーム修飾であり、５’ 非翻訳領域 （５’ＵＴＲ） に存在する場合、単一の ｍ６Ａ であってもキャップ非依存性翻訳を促進します。これらの部位は、ｍ６Ａ 誘導性リボソーム結合部位 （ＭＩＲＥＳ） と呼ばれます。

ＭＩＲＥＳ は、開始因子 ｅＩＦ３ の直接結合が関与するメカニズムによって、ストレス条件下での選択的な ｍＲＮＡ 翻訳を刺激します。 ＭＩＲＥＳ 依存の翻訳開始には、 ＲＲＡＣＨ （Ｒ ＝ グアニンまたはアデニン、Ｈ ＝ アデニンまたはシトシンまたはチミン） 開始コドンに近い ｍ６Ａ 修飾のコンセンサス モチーフが含まれている必要があります。

ｍ６Ａ機構により、環状ポリリボヌクレオチドを自己または内因性としてマークできます。 ＲＮＡ分子の化学的または酵素的環状化を使用する場合、不要な免疫応答を避けるためにｍ６Ａ依存翻訳を使用することが有益です。 ｍ６Ａ ＲＲＡＣＨモチーフが環状ポリリボヌクレオチドに組み込まれている場合、ＲＩＧ－１ を介した免疫原性は、変異した ｍ６Ａ ＲＲＡＣＨモチーフと比較して１０，０００ 倍減少します。環状ポリリボヌクレオチドを ｍ６Ａ ＲＲＡＣＨモチーフで自己としてマークすることは、これらの分子が治療薬として使用される場合、重要なパラメータを構成します。

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、開始コドンに近い１つまたは複数のｍ６Ａ部位を有し得る。

３． 未翻訳地域 （ＵＴＲ）
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、転写できるが翻訳されない遺伝子配列である非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むことができる。

いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームの翻訳開始配列の上流に１つまたは複数のＵＴＲ配列を含めることができる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＵＴＲ配列が発現配列の下流に含まれ得る。

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、アデノシンおよびウリジンの埋め込まれたトランシェを有する少なくとも１つのＵＴＲ配列を含む。いくつかの実施形態では、これらのＡＵリッチエレメント（ ＡＲＥ ）は、環状ポリリボヌクレオチドの発現率を増加させ得る。

いくつかの実施形態では、 ＵＴＲ ＡＲＥの導入、除去または改変は、環状ポリリボヌクレオチドの安定性、免疫原性および翻訳速度を調節するのに有用であり得る。

は、コード配列の翻訳を調節し得るＡＲＥの１つ以上のコピーを含み得る。

ＡＲＥを除去して細胞内安定性を調節し、したがってコード配列の翻訳を調節するように操作することができる。

任意の遺伝子および任意の生物由来の任意のＵＴＲが、環状ポリリボヌクレオチドのそれぞれの隣接領域に組み込まれ得ることが理解されるべきである。さらに、任意の既知の遺伝子の複数の野生型 ＵＴＲ を利用することができます。野生型遺伝子の変異体ではない人工ＵＴＲを提供することも本発明の範囲内である。

いくつかの実施形態では、 ＵＴＲまたはその一部は、それらが選択された場所と同じ向きまたは変更された向きまたは位置に配置され得る。

いくつかの実施形態では、５’または３’ＵＴＲは、 １つまたは複数の他の５’または３’ＵＴＲと反転、短縮、延長、および／またはキメラ化され得る。

この特許で使用されているように、ＵＴＲ配列に言及する場合の「変更された」という用語は、ＵＴＲ配列が参照配列に対して何らかの形で変更されたことを意味する。

いくつかの実施形態では、２つ以上の５’および／または３’ＵＴＲを使用することができる。たとえば、「ダブル」ＵＴＲ は、同じ ＵＴＲ の ２ つのコピーが連続して、または実質的に連続してエンコードされている ＵＴＲ です。

４． 関心のある配列
目的の配列は、コード化された翻訳能力のある遺伝子配列であっても、コード化されていない翻訳能力のない遺伝子配列であってもよい。

を。翻訳コンピテントコーディングシーケンス
ｉ．翻訳開始
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリペプチドをコードすることができ、限定されないが、開始コドンなどの翻訳開始配列を含み得る。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、オープンリーディングフレームに隣接する少なくとも１つの翻訳開始配列を含む。いくつかの実施形態では、開始コドンは非コード開始コドンである。いくつかの実施形態では、翻訳開始遺伝子配列は、シャイン・ダルガーノまたはコザック配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、シャイン・ダルガーノまたはコザック配列は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に隣接していてもよい。いくつかの実施形態では、翻訳開始配列は、各オープンリーディングフレームの片側または両側に配置され得る。いくつかの実施形態では、翻訳開始配列は、環状ポリリボヌクレオチドにコンフォメーションの柔軟性を提供することができる。

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの開始コドンを含み得、翻訳は、最初の開始コドンで開始し得るか、または最初の開始コドンの下流で開始し得る。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドの翻訳は、 ＡＡＧ 、 ＡＣＧ 、ＡＧＧ、ＡＴＡ／ＡＵＡ、ＡＴＴ／ ＡＵＵ 、 ＣＴＧ ／ ＣＵＧ 、ＧＴＧ／ ＧＵＧ 、およびＴＴＧ／うぐ。いくつかの実施形態では、翻訳は、細胞型、細胞条件、およびストレス条件などであるがこれらに限定されない選択的条件下で開始することができる。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、リピート関連非ＡＵＧ（ＲＡＮ）配列で翻訳を開始することができる。

ｉｉ．コーディングシーケンス
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、生物製剤、抗体、抗原、治療用ペプチドまたはポリペプチド、細胞透過性ペプチド、分泌タンパク質、細胞膜固定タンパク質から選択されるがこれらに限定されない、目的の原核生物および／または真核生物のペプチドまたはポリペプチドをコードすることができる。細胞質タンパク質、細胞骨格タンパク質、細胞内膜結合タンパク質、核タンパク質、任意のヒト疾患に関連するタンパク質、治療適応が特定されていないが、研究および発見の分野で有用性があるヒトゲノムによってコードされる部分またはタンパク質を標的とするタンパク質．

本明細書で示されるように、「治療用タンパク質」は、生物に投与された場合に、治療、診断および／または予防効果を有し、および／または所望の生物学的および／または薬理学的効果を誘発するタンパク質を指す。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドは、１つまたは複数の生物製剤をコードし得る。本明細書で使用される場合、「生物製剤」は、本明細書で提供される方法によって産生され、重篤な疾患または病状を予防、診断、軽減、治療、または治癒するために使用され得るペプチドまたはポリペプチドである。

本発明によれば、生物製剤には、ワクチン、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、キメラ抗原受容体、アレルゲン、血液成分、遺伝子治療、哺乳動物器官、組織または細胞産物が含まれるが、これらに限定されない。サイトカイン、免疫調節剤、成長因子、酵素などがあります。

いくつかの実施形態では、１つまたは複数の生物製剤を、本発明の環状ポリリボヌクレオチドによってコード化し、翻訳することができる。

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、１つまたは複数の抗体断片およびそれらの組み合わせをコードすることができる。 「抗体」という用語は、Ｆｃ領域を有する全長抗体、ポリエピトープ特異性を有する抗体、二重特異性抗体、ダイアボディ、一本鎖分子、 ＶＨＨ抗体および抗体フラグメント。本明細書に記載されるように、「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、「抗体」という用語と交換可能に使用される。本明細書に記載されるように、「モノクローナル抗体」という用語は、同一の抗体集団から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原部位に向けられています。

いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種に由来する抗体と相同であるか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに対応する「キメラ」抗体を含む。

ＩｇＤ 、 ＩｇＥ 、ＩｇＧ、およびＩｇＭのいずれかを含み得、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる重鎖を含む。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４などであるがこれらに限定されない抗体の任意のサブクラスを含み得る。

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）、 Ｆｖ 、ダイアボディ、線状抗体、ナノボディ、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、単鎖フラグメント可変、多重特異性抗体、またはそれらの組み合わせ。

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、現在市場に出ているかまたは開発中の１つまたは複数の抗体配列をコードし得る。

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、免疫学、内分泌学、皮膚学、腫瘍学、筋骨格、呼吸器、中枢神経系、胃腸および感染症などのいくつかの治療分野における疾患を治療または予防するための抗体をコードし得るが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドは、１つまたは複数のワクチン抗原をコードし得る。

本明細書で示されるように、「ワクチン抗原」は、特定の疾患または感染病原体に対する免疫を改善するペプチドまたはポリペプチドを指す。

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、１つまたは複数のワクチン抗原をコードし得る。いくつかの実施形態では、コードされる抗原は、癌、アレルギー、および感染症などであるがこれらに限定されない多くの治療分野における疾患を治療または予防するために使用され得る。

いくつかの実施形態では、本発明の環状ポリリボヌクレオチドは、微生物、植物、無脊椎動物、両生類、鳥類、魚類、および哺乳動物などであるがこれらに限定されない広範囲の動物から単離された１つまたは複数の抗菌ペプチドをコードし得る。

いくつかの実施形態において、本発明の環状ポリリボヌクレオチドは、ウイルス侵入の細胞融合をブロックし得る抗菌ペプチドをコードし得る。いくつかの実施形態では、抗菌ペプチドは、ウイルスがコードするタンパク質の一部であり得る。

いくつかの実施形態では、本発明に記載の環状ポリリボヌクレオチドは、１つまたは複数の細胞透過性ペプチドをコードし得る。本明細書で使用される場合、「細胞透過性ペプチド」は、他のポリペプチドまたは分子の細胞取り込みを促進し得るポリペプチドを指す。いくつかの実施形態において、細胞透過性ペプチドは、完全にまたは部分的に標識され得る。いくつかの実施形態では、細胞透過性ペプチドはシグナルペプチドを含み得る。本明細書で使用する「シグナル配列」とは、タンパク質の翻訳中に新生タンパク質のアミノ末端に結合し、例えばポリペプチドの分泌を可能にするアミノ酸残基の配列を指す。いくつかの実施形態では、シグナル配列を使用して、細胞透過性ペプチドの分泌をシグナル伝達することができる。

いくつかの実施形態では、本発明に記載の環状ポリリボヌクレオチドは、融合タンパク質をコードし得る。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、目的の２つのタンパク質を作動可能に連結することによって作成することができる。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」とは、細胞に導入されたときに複合体の発現を可能にするような方法での２つのタンパク質の結合を指す。

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、原形質膜固定タンパク質、細胞質タンパク質または細胞骨格タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは核タンパク質をコードする。

いくつかの実施形態では、本発明の環状ポリリボヌクレオチドは、哺乳動物の疾患に関連するタンパク質をコードし、発現することができる。いくつかの実施形態では、哺乳動物の疾患はヒトの疾患である。

ＴＡＬＥＮなどであるがこれらに限定されないタンパク質をコードし得る

本明細書に記載されるように、ポリペプチドは、単一分子であってもよいし、二量体、三量体、または四量体などであるがこれらに限定されない多分子複合体であってもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはまた、会合または連結され得る単鎖または多重鎖ポリペプチドを含み得る。

インビボで線状または環状ＲＮＡ分子の複数のコピーを増幅および生成することができるウイルスまたは非ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする。

好ましい実施形態では、自己増幅環状ＲＮＡ分子を生成するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、フラビウイルス、麻疹ウイルス、アルファウイルス、およびバクテリオファージ由来の非構造タンパク質（ ＮＳＰ ）から選択することができるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、親プラスミドＤＮＡに埋め込まれたコード配列は、宿主生物とは異なる生物に由来し得るペプチドまたはポリペプチドの効率的な翻訳を可能にするために最適化されたコドンであり得る。

ｉｉｉ．リボスイッチ
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、１つまたは複数のリボスイッチを含む。

リボスイッチは小さな標的分子に直接結合できる ＲＮＡ 配列であり、その分子への結合は ＲＮＡ 翻訳に直接影響を与えるため、リボスイッチを含む環状ポリリボヌクレオチドは、その標的分子。

いくつかの実施形態では、リボスイッチは、特定の分子に対してアプタマー様の親和性を有し得るため、これらのリボスイッチは、バルク量から分子を隔離するために使用され得る。

いくつかの実施形態では、リボスイッチは、転写終結、翻訳開始の阻害、ｍＲＮＡの自己切断、スプライシング経路の変更、遺伝子発現を活性化または不活性化するためのトリガー分子への結合を含むがこれらに限定されない遺伝子発現に影響を及ぼし得る。 ．

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、遺伝子発現を活性化、非活性化、または遮断し得る条件に供され得る。リボソーム結合部位をブロックすると、発現が変化する可能性があります。

いくつかの実施形態では、分子またはその類似体に結合する環状ポリリボヌクレオチドは、リボスイッチの性質に応じて、 ＲＮＡ分子の発現を減少または防止、促進または増加させることができる。

ｉｖ．アプタザイム
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、１つまたは複数のアプタザイムを含むことができる。

アプタザイムは、アプタマー領域がアロステリック制御要素として使用され、触媒 ＲＮＡ リボザイム配列に結合できる条件付き遺伝子発現に使用できる遺伝子スイッチです。

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、特定の細胞状態下で活性であるアプタザイムを含む。いくつかの実施形態では、特定の細胞状態には、ウイルス感染、またはウイルス核酸またはウイルスタンパク質の存在が含まれるが、これらに限定されない。

リボザイム、またはリボ核酸酵素は、化学反応を触媒する ＲＮＡ 分子です。自然界に見られる多くのリボザイムは、それら自身のホスホジエステル結合の加水分解、または他の ＲＮＡ または ＤＮＡ 結合の加水分解を触媒します。リボザイムは、アミノ酸側鎖の共有結合修飾、チロシンアジド－アデニル化、リン酸化、脱リン酸化、リン酸化アミノ酸側鎖の共有結合修飾、アミドおよびエステル加水分解、ディールスなどの他のタイプの化学反応を触媒することができます。 －アルダー反応、グリコシル化、ポルフィリン金属化、ＲＮＡ 切断、ＲＮＡ ライゲーション、チミンダイマー修復、ＤＮＡ 浄化、ＤＮＡ リン酸化、ＤＮＡ キャッピング、ＤＮＡ 切断、および ＤＮＡ ライゲーション。

いくつかの実施形態では、リボザイムおよびアプタマーの多くのコピーを非コードＲＮＡ内に配置することが有利であり得る。

ＶＬリボザイム、リードザイム、およびヘアピンリボザイムが含まれ得る。

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドにコードされるアプタザイムはまた、遺伝子発現の自己調節を可能にし得る。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチド遺伝子発現は、同じポリリボヌクレオチド配列にコードされる産物によって活性化されるアプタザイムの存在によって自動調節され得る。いくつかの実施形態では、アプタザイムの活性は、ポリリボヌクレオチドまたは任意の他の細胞高分子内にコードされるタンパク質産物の蓄積に敏感であり得る。

ｖ．２Ａ ペプチド
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、１つまたは複数の２Ａペプチドを含むことができる。

ウイルス由来の自己切断 ２Ａ ペプチドは、 サイズが小さく、自己切断能力があるため、多シストロン性ＲＮＡ 治療用分子です。ほとんどの ２Ａ ペプチドは １６ ～ ２０ 個のアミノ酸で構成され、ウイルス ＲＮＡ から取得されます。マルチシストロン性ベクターを生成するために使用される最も一般的な ２Ａ ペプチドは、Ｆ２Ａ （口蹄疫ウイルス）、Ｅ２Ａ （馬鼻炎ウイルス）、Ｐ２Ａ （豚テッショウイルス－１）、および Ｔ２Ａ （これらのウイルス） です。 アサイグナウイルス）。 ２Ａ ペプチド切断はプロテアーゼによって媒介されませんが、リボソーム スキップ メカニズムによって媒介されます。これらのペプチドの切断部位は、２Ａ の Ｃ 末端グリシンと ２Ｂ の Ｎ 末端プロリンの間に位置しています。このプロセスは、タンパク質合成中にリボソーム内で行われ、切断部位でのこれらのアミノ酸間の通常のペプチド結合の形成が阻害されますが、リボソームの解離が起こらないため、切断はその後のタンパク質の翻訳には影響しません．

と、２Ａ 切断反応の阻害率が低下するため、効率的な切断反応を提供できます。フリン切断部位やグリシン － セリン － グリシン （ ＧＳＧ ） スペーサーの柔軟なリンカーなどの追加のスペーサー配列を挿入すると、より良い切断が得られます。

マルチシストロン性ベクターを作成する場合は、２Ａ ペプチド配列を Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ の順序で組み合わせるのが最適です。

ｂ．非コーディング シーケンス
ｉ． 規制核酸
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、調節核酸をコードする少なくとも１つの発現配列を含み得る。いくつかの実施形態では、調節核酸配列は、内因性または外因性遺伝子の発現を改変し得る。いくつかの実施形態では、調節核酸は、限定されないが、 ｅｘＲＮＡ 、 ｈｎＲＮＡ 、 ＩｎｃＲＮＡ 、マイクロＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｃＲＮＡ、 ＹＲＮＡ 、 ｐｉＲＮＡなどの調節非コードＲＮＡを含むことができる。 ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、 ｉＲＮＡ ．いくつかの実施形態では、調節非コードＲＮＡ配列は、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡなどの内因性遺伝子配列または外因性遺伝子配列にハイブリダイズし得る。

いくつかの実施形態では、非コード調節ＲＮＡ配列は、特定のＤＮＡ配列を認識し得るガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含み得る。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、天然に存在するｃｒＲＮＡ－ ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を模倣し、ヌクレアーゼに結合するｔｒａｃｒＲＮＡと、ヌクレアーゼを編集対象の配列に誘導する少なくとも１つのｃｒＲＮＡとの両方を含み得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡおよびｓｇＲＮＡは、遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの一部として使用される。

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、１つまたは複数のペプチドまたはポリペプチドをコードする配列、１つまたは複数の調節配列、１つまたは複数の調節核酸、１つまたは複数の非コードＲＮＡ、１つまたは複数の発現配列、およびそれらの任意の組み合わせを含むことができる。 ．

配達
いくつかの実施形態では、期待される有効性を達成するために、ｃｉｒＲＮＡは、既知の方法によって適切な送達ビヒクルとともに処方され得る。これらの送達ビヒクルには、ポリマー、ポリマー担体、膜脂質二重層、リポソーム、脂質ナノ粒子、タンパク質ナノ粒子、ウイルス由来エンベロープ、および／またはカプシドが含まれますが、これらに限定されません。いくつかの実施形態では、送達方法は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、および／または融合を含み得る。

いくつかの実施形態では、薬学的組成物または製剤は、投与の形態、例えば、全身、局所、腫瘍内、腫瘍周囲、皮下、筋肉内を指す。適切な形態は、部分的には、例えば経口、吸入または注射による使用または侵入経路に依存する。これらの組成物または製剤は、医薬組成物を製造するための当技術分野で知られている任意の方法に従って調製される。

環状ポリリボヌクレオチドの用途
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドをワクチンプラットフォームとして使用することができる。いくつかの実施形態では、ｃｉｒＲＮＡワクチンは、抗原配列を含み得る。

いくつかの実施形態では、ｃｉｒＲＮＡ分子は、遺伝子疾患、代謝疾患、血液学、神経学、腫瘍学、免疫学、心臓病学、呼吸器学、胃腸病学、眼科学、筋骨格障害、および皮膚学などの領域の治療薬として使用され得るが、これらに限定されない。

アッセイと実験
インビトロ転写により線形ＲＮＡを生成するための組換え環状共有結合プラスミドＤＮＡテンプレートは、インシリコで設計され、 ＧｅｎｅＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｎｃ．によって化学的に合成され、分子的にクローニングされ、配列決定されました．

ＤＮＡｚｙｍｅは、 ４０個のランダムヌクレオチドを含むＤＮＡのランダムライブラリーからのインビトロ選択によって実験室で生成された。開始テンプレート オリゴヌクレオチドは、 Ｍａｃｒｏｇｅｎによって化学合成されました。

タンパク質複合体 ｄＣａｓ９－ＤＮＡＬｉｇａｓｅ は、ｐＥＴ２８ａ プラスミド内の合成された操作配列を使用して大腸菌 ＢＬ２１（ＤＥ３） で生成され、 ＨＲ１／ＨＲ２ に相補的なＧｕｉｄｅＲＮＡ は、研究室でのインビトロ転写によって生成されました。

ＤＮＡｚｙｍｅ を介した ＲＮＡ 環状化
ｐＳＹＴＥｃＲＮＡ プラスミドを大腸菌ＴＯＰ１０ で増幅し、精製して定量した後、目的の配列を線形化するために ＰＣＲ 反応にかけました。図 １５に示すように、ＤＮＡ 分子の存在を可視化するために分析用アガロースゲル電気泳動を行いました。

図 １６に示すように、線形化および精製した後、ＤＮＡ 分子をＩｎ ｖｉｔｒｏ転写反応にかけ、線形 ＲＮＡ 分子を生成しました。

線状 ＲＮＡ 分子が正しく生成されたら、それらを ＤＮＡｚｙｍｅ ＳＹＴＥ－ＤＮＡｚＲＬ１２ で処理して、線状 ＲＮＡ 末端のライゲーションを可能にし、共有結合で閉じた環状ポリリボヌクレオチドを生成しました。環状化を確認するために、ＲＮａｓｅ フリーの ＤＮＡｓｅ Ｉ で処理して ＳＹＴＥ－ＤＮＡｚＲＬ１２ を消化し、ｃｉｒｃＲＮＡ 精製後、ＲＮＡｓｅ Ｒ で ２ 回目の酵素処理を行いました。図 １７に示すように、 ｃｉｒｃＲＮＡ 分子は ＲＮＡｓｅ Ｒ 酵素によって消化されず、コントロールとして使用された線形 ＲＮＡ 分子は、この酵素にさらされると完全に分解されました。

ＳＹＴＥ－ＤＮＡｚＲＬ１２ によって媒介される環状化の効率を測定するために、図 ２０に示すように、逆転写酵素を使用した ｃＤＮＡ 合成の後にＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ を実行しました。このために、２ 組のプライマーを使用しました。それらの １ つは、線形または環状 ＲＮＡ 分子から増幅産物を生成します。対照的に、もう一方のペアは、環状になった直鎖状分子の末端間の結合領域のみを増幅します。

別の実験を行って、蛍光分析によって ＲＮＡ 質量を測定しました。このために、図 ２１ に示すように、Ｑｕｂｉｔ^ＴＭ ＲＮＡ Ｂｒｏａｄ ｒａｎｇｅ ｋｉｔ を使用して ＲＮＡ サンプルを定量しました。

設計された ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９－Ｌｉｇａｓｅ を介した ＲＮＡ 環状化
大腸菌ＴＯＰ１０で増幅し、精製して定量化したら、目的の配列を線形化するために ＰＣＲ 反応にかけました。図 １５に示すように、アンプリコンの存在を可視化するために分析用アガロースゲル電気泳動を実施しました。

Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応にかけ、線形 ＲＮＡ 分子を生成しました。

線形 ＲＮＡ 分子が正しく生成されたら、それらを ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９－ＤＮＡＬｉｇａｓｅ ｇＲＮＡ－ＨＲ 複合体で処理して、ＲＮＡ 末端のライゲーションを可能にし、共有結合で閉じた環状ポリリボヌクレオチドを生じさせました。環状化を確認するために、精製ステップを実行し、ｃｉｒｃＲＮＡ 精製後、ＲＮＡｓｅ Ｒ による ２ 回目の酵素処理を実行しました。図 １８に示すように、 ｃｉｒｃＲＮＡ 分子は ＲＮＡｓｅ Ｒ 酵素によって消化されず、コントロールとして使用された線形 ＲＮＡ 分子は、この酵素にさらされると完全に分解されました。

ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９－ＤＮＡＬｉｇａｓｅ 法によって媒介される環状化の効率を測定するために、図 ２２に示すように、逆転写酵素を使用した ｃＤＮＡ 合成の後にＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ を実行しました。このために、２ 組のプライマーを使用しました。それらの １ つは、線状または環状の ＲＮＡ 分子から増幅産物を生成することができます。対照的に、もう一方のペアは、環状になった直鎖状分子の末端間の結合領域のみを増幅します。

別の実験を行って、蛍光分析によって ＲＮＡ 質量を測定しました。このために、図 ２３に示すように、Ｑｕｂｉｔ^ＴＭ ＲＮＡ Ｂｒｏａｄ ｒａｎｇｅ ｋｉｔ を使用して ＲＮＡ サンプルを定量しました。

自己相補的イントロン － エクソン媒介ライゲーション （ ＳＣＩＥＭＬ ）
大腸菌ＴＯＰ１０で増幅し、精製して定量化したら、目的の配列を線形化するために ＰＣＲ 反応にかけました。図 １５に示すように、線形化されたアンプリコンの存在を視覚化するために、分析用アガロースゲル電気泳動を実施しました。

Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応にかけ、線形 ＲＮＡ 分子を生成しました。

インビトロ転写反応の後、適切な緩衝液を添加して、自己ハイブリダイゼーションおよびリボザイムを自己アニーリング、自己スプライス、および自己ライゲートに許可し、ｃｉｒｃＲＮＡ分子を生成しました。これらのステップの後、ＲＮＡｓｅ Ｒ による処理を行い、結果を図 １９に示します。

自己相補的イントロン－エクソン媒介ライゲーション法によって媒介される環状化の効率を測定するために、図 ２４に見られるように、逆転写酵素を使用した ｃＤＮＡ 合成後にＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ を実施しました。このために、２ 組のプライマーを使用しました。それらの １ つは、直鎖状または環状の ＲＮＡ 分子から増幅産物を生成することができます。対照的に、もう一方のペアは、環状になった直鎖状分子の末端間の結合領域のみを増幅します。

別の実験を行って、蛍光分析によって ＲＮＡ 質量を測定しました。このために、図 ２５ に示すように、Ｑｕｂｉｔ^ＴＭ ＲＮＡ Ｂｒｏａｄ ｒａｎｇｅ ｋｉｔ を使用して ＲＮＡ サンプルを定量しました。

翻訳効率
いくつかの実施形態では、本発明で提供される環状ポリリボヌクレオチドの翻訳効率は、線状対応物よりも高い。

ｃｉｒｃＲＮＡの翻訳をその線形ｍＲＮＡ対応物と比較するために、発現アッセイを実施しました。簡単に説明すると、非腫瘍性ＨＥＫ ２９３ 細胞株とメラノーマＳＫ－ＭＥＬ－２８ 細胞株に、非修飾ヌクレオチドと自己相補的イントロン － エクソン媒介ライゲーションを使用して生成された線形非修飾 ＲＮＡ 分子、線形修飾 ＲＮＡ 分子、および ｃｉｒｃＲＮＡ 分子をトランスフェクトしました。方法、すべてターボＧＦＰをコードする（配列番号１２ ）。 Ｇｌｕｃ活性 （ ＲＬＵ ） を １４４ 時間 （６ 日間） 測定したところ、ｃｉｒｃＲＮＡ 分子はより効率的であり、線形 ＲＮＡ 分子と比較して ２ 倍の時間レポータータンパク質を発現できたため、約 ２ 倍の組換えタンパク質が得られました。図 ２９ と ３０に示します。

用語
本明細書で使用されるとき、冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ’」は、冠詞が使用される文脈が別段のことを明確に示さない限り、「少なくとも１つ」を意味する。本明細書で使用される「核酸」という用語は、ヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドから構成されるポリマーを意味する。

本明細書で使用される「リボ核酸」、「ＲＮＡ」および「ポリリボヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドから構成されるポリマーを意味する。

「環状ポリリボヌクレオチド」、「ｃｉｒｃＲＮＡ」、および「環状ＲＮＡ」という用語は、本特許を通じて交換可能に使用される。

本明細書で使用される「デオキシリボ核酸」、「ＤＮＡ」、「ポリデオキシリボヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドから構成されるポリマーを意味する。

「環状共有結合ＤＮＡ」、「環状共有結合プラスミドＤＮＡ」、「ｐＤＮＡ」および「プラスミドＤＮＡ」という用語は、本特許を通じて交換可能に使用される。

「オリゴヌクレオチド」という用語は、長さが約２ヌクレオチドから約２００ヌクレオチドまでの範囲の一本鎖または二本鎖ヌクレオチド多量体を意味する。適切なオリゴヌクレオチドは、ホスホラミダイト法または酵素法などの化学的方法によって調製することができる。

「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドモノマーから構成される一本鎖または二本鎖のポリマーを指す。

「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって連結されたＤ構成またはＬ構成のアミノ酸の単鎖から構成される化合物を指す。

「相補的」という用語は、分子とその標的の相互作用表面を指す。したがって、プローブとターゲットは相補的であると言えます。

「ハイブリダイゼーション」という用語は、核酸の２つ以上の相補鎖間の非共有配列特異的相互作用を確立して、二重鎖と呼ばれる単一のハイブリッドにするプロセスを指す。

「相同アーム」という用語は、１）少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）で塩基対を形成すると予測される任意の連続配列である。 ％、約 １００％） ＲＮＡ 内の別の配列 （別の相同性アームなど）。 ２） 少なくとも ７ ｎｔ の長さで、２５０ ｎｔ を超えないもの。 ３）３’イントロンフラグメントの前に隣接するか、またはその中に含まれる、および／または５’イントロンフラグメントの後に隣接するか、またはその中に含まれる。および、場合により、４）ＲＮＡ中の意図しない配列との５０％未満（例えば、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満）の塩基対形成を有すると予測される（例えば、非相同アーム配列）。 「強力な相同性アーム」とは、ＲＮＡ中の別の相同性アームと塩基対を形成した場合に、摂氏５０度を超えるＴｍを有する相同性アームを指す。

「アニール」という用語は、一本鎖核酸配列が水素結合により相補的配列と対になり、二本鎖核酸配列を形成するプロセスを指す。これには、再生として知られる、熱変性した相補鎖の再形成が含まれます。

「標的」という用語は、所与のプローブに対する親和性を有する分子を指す。標的は、天然または人工の分子である可能性があります。

「プロモーター」、「調節エレメント」または「調節配列」という用語は、転写部位の開始点から上流または下流に位置し、開始するＲＮＡポリメラーゼおよび他のタンパク質の認識および結合に関与する領域または遺伝子配列を指す。転写プロセス。選択されたプロモーターには、細菌プロモーター、ウイルスプロモーター、哺乳動物プロモーター、酵母プロモーター、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

「調節エレメント」という用語は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、および転写終結シグナル、ポリアデニル化シグナルおよびポリ－Ｕ配列などであるがこれらに限定されない他の発現制御エレメントを含むことを意図している。調節要素には、多種多様な細胞型、組織、または器官において核酸配列の構成的発現を指令するもの、および特定の細胞型、組織、または器官のみにおいて核酸配列の発現を指令するもの、例えば、限定されないが、細胞特異的調節配列、組織特異的調節配列、および器官特異的調節配列。

細胞特異的プロモーターは、リンパ球、筋細胞、ケラチノサイト、および線維芽細胞などであるがこれらに限定されない目的の所望の細胞型における核酸配列の発現を指示することができる。組織特異的プロモーターは、筋肉、ニューロン、骨、皮膚、および血液などであるがこれらに限定されない目的の所望の組織における核酸配列の発現を指示することができる。臓器特異的プロモーターは、肝臓、脳、心臓、肺、および腎臓などであるがこれらに限定されない所望の臓器における核酸配列の発現を指示することができる。
調節要素はまた、細胞周期および発生段階などであるがこれらに限定されない、時間依存的な方法で発現を指示する場合もある。

ＷＰＲＥエンハンサー、ＣＭＶエンハンサー、およびＨＴＬＶ－ＬＴＲエンハンサーを含むがこれらに限定されないエンハンサー要素も、用語「調節エレメント」に包含される。

いくつかの実施形態では、プロモーターおよび調節要素は、新規の専有配列を含み得る。
「組換え」という用語は、ヒトが操作した核酸を指すが、タンパク質（「組換えタンパク質」）に関しては、組換え核酸によってコードされるタンパク質である。

いくつかの実施形態では、組換え転写単位は、遺伝子産物をコードするオープンリーディングフレームであり得る第２の核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、組換え転写単位は、これらの核酸が自然界で見出される可能性が極めて低いような方法で組み合わされた核酸を含み得る。

「転写単位」という用語は、細胞に導入されると、ＲＮＡまたはポリペプチドの転写および／または翻訳をもたらす核酸構築物を指す。

いくつかの実施形態では、転写ユニットは、オープンリーディングフレームに作動可能に連結されたターミネーターまたは終結配列を含む。

いくつかの実施形態では、転写単位は、少なくとも１つの合成または非天然プロモーター、少なくとも１つの合成または非天然コード配列、および少なくとも１つの合成または非天然ターミネーターを含む。

「コドン最適化」という用語は、配列によってコードされるポリペプチドを変更することなく、選択された生物の典型的なコドン使用頻度を反映する、核酸配列のオープンリーディングフレームにおけるコドンの変更を指す。最適化は、少なくとも１つ、または１つ以上、またはかなりの数のコドンを、その選択された生物の遺伝子でより頻繁に使用される１つまたは複数のコドンで置き換えることを含む。

核酸配列は、それが別の核酸配列と機能的な関係に置かれるとき、「作動可能に連結される」。

本明細書で使用される場合、「宿主」は個体を意味し、ネコおよびイヌなどの飼いならされた動物を含むことができるが、これらに限定されない。牛、馬、豚、羊、山羊などの家畜。マウス、ウサギ、ラット、モルモットなどの実験動物。ヒト、ヒト以外の霊長類、および霊長類などの哺乳類；げっ歯類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類などのその他の動物。

いくつかの実施形態では、「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」および「ｃｒＲＮＡ」という用語は、本明細書全体を通して交換可能に使用される。

配列表
配列番号１
長さ： ３０４５
タイプ： ＤＮＡ
有機体：人工
特徴： ｐＳＹＴＥｃＲＮＡ
その他の情報： ｃｉｒｃＲＮＡ 転写テンプレート プラスミド ＤＮＡ
シーケンス： １
ＧＴＣＣＧＴＴＧＴＴＴＡＴＴＴＴＴＣＴＡＡＡＴＡＣＡＴＴＣＡＡＡＴＡＴＧＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＴＧＡＧＡＣＡＡＴＡＡＣＣＣＴＧＡＴＡＡＡＴＧＣＴＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＴＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＧＡＧＴＡＴＧＡＧＴＡＴＴＣＡＡＣＡＴＴＴＣＣＧＴＧＴＣＧＣＣＣＴＴＡＴＴＣＣＣＴＴＴＴＴＴＧＣＧＧＣＡＴＴＴＴＧＣＣＴＴＣＣＴＧＴＴＴＴＴＧＣＴＣＡＣＣＣＡＧＡＡＡＣＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＧＴＡＡＡＡＧＡＴＧＣＴＧＡＡＧＡＴＣＡＧＴＴＧＧＧＴＧＣＡＣＧＡＧＴＧＧＧＴＴＡＣＡＴ ＣＧＡＡＣＴＧＧＡＴＣＴＣＡＡＣＡＧＣＧＧＴＡＡＧＡＴＣＣＴＴＧＡＧＡＧＴＴＴＴＣＧＣＣＣＣＧＡＡＧＡＡＣＧＴＴＴＣＣＣＡＡＴＧＡＴＧＡＧＣＡＣＴＴＴＴＡＡＡＧＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＴＧＧＣＧＣＧＧＴＡＴＴＡＴＣＣＣＧＴＧＴＴＧＡＣＧＣＣＧＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＡＣＴＣＧＧＴＣＧＣＣＧＣＡＴＡＣＡＣＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＡＴＧＡＣＴＴＧＧＴＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＣＣＡＧＴＣＡＣＡＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＴＴＡＣＧＧＡＴＧＧＣＡＴＧＡＣＡＧＴＡＡＧＡＧＡＡＴＴＡＴＧＣＡＧＴＧＣＴＧＣＣＡＴＡＡＣＣＡＴＧＡＧＴＧＡＴＡＡＣＡＣＴＧＣＧＧＣＣＡＡＣＴＴＡＣＴＴＣＴＧＡＣＡＡＣＧＡＴＣＧＧＡＧＧＡＣＣＧＡＡＧＧＡＧＣＴＡＡＣＣＧＣＴＴＴＴＴＴＧＣＡＣＡＡＣＡＴＧＧＧＧＧＡＴＣＡＴＧＴＡＡＣＴＣＧＣＣＴＴＧＡＴＣＧＴＴＧＧＧＡＡＣＣＧＧＡＧＣＴＧＡＡＴＧＡＡＧＣＣＡＴＡＣＣＡＡＡＣＧＡＣＧＡＧＣＧＴＧＡＣＡＣＣＡＣＧＡＴＧＣＣＴＧＴＡＧＣＡＡＴＧＧＣＡＡＣＡＡＣＧＴＴＧＣＧＣＡＡＡＣＴＡＴＴＡＡＣＴＧＧＣＧＡＡＣＴＡＣＴＴＡＣＴＣＴＡＧＣＴＴＣＣＣＧＧＣＡＡＣＡＡＴＴＡＡＴＡＧＡＣＴＧＧＡＴＧＧＡＧＧＣＧＧＡＴＡＡＡＧＴＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＴＴＣＴＧＣＧＣＴＣＧＧＣＣＣＴＴＣＣＧＧＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴＴＡＴＴＧＣＴＧＡＴＡＡＡＴＣＴＧＧＡＧＣＣＧＧＴＧＡＧＣＧＴＧＧＧＴＣＴＣＧＣＧＧＴＡＴＣＡＴＴＧＣＡＧＣＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＡＴＧＧＴＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＧＴＡＴＣＧＴＡＧＴＴＡＴＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＧＧＧＡＧＴＣＡＧＧＣＡＡＣＴＡＴＧＧＡＴＧＡＡＣＧＡＡＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＣＧＣＴＧＡＧＡＴＡＧＧＴＧＣＣＴＣＡＣＴＧＡＴＴＡＡＧＣＡＴＴＧＧＴＡＡＣＴＧＴＣＡＧＡＣＣＡＡＧＴＴＴＡＣＴＣＡＴＡＴＡＴＡＣＴＴＴＡＧＡＴＴＧＡＴＴＴＣＣＴＴＡＧＧＡＣＴＧＡＧＣＧＴＣＡＡＣＣＣＣＧＴＡＧＡＡＡＡＧＡＴＣＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＴＴＧＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＣＴＧＣＧＣＧＴＡＡＴＣＴＧＣＴＧＣＴＴＧＣＡＡＡＣＡＡＡＡＡＡＡＣＣＡＣＣＧＣＴＡＣＣＡＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴＧＴＴＴＧＣＣＧＧＡＴＣＡＡＧＡＧＣＴＡＣＣＡＡＣＴＣＴＴＴＴＴＣＣＧＡＡＧＧＴＡＡＣＴＧＧＣＴＴＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＣＡＧＡＴＡＣＣＡＡＡＴＡＣＴＧＴＣＣＴＴＣＴＡＧＴＧＴＡＧＣＣＧＴＡＧＴＴＡＧＧＣＣＡＣＣＡＣＴＴＣＡＡＧＡＡＣＴＣＴＧＴＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＡＣＣＴＣＧＣＴＣＴＧＣＴＡＡＴＣＣＴＧＴＴＡＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣＡＧＴＧＧＣＧＡＴＡＡＧＴＣＧＴＧＴＣＴＴＡＣＣＧＧＧＴＴＧＧＡＣＴＣＡＡＧＡＣＧＡＴＡＧＴＴＡＣＣＧＧＡＴＡＡＧＧＣＧＣＡＧＣＧＧＴＣＧＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＧＧＧＧＴＴＣＧＴＧＣＡＣＡＣＡＧＣＣＣＡＧＣＴＴＧＧＡＧＣＧＡＡＣＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＧＡＡＣＴＧＡＧＡＴＡＣＣＴＡＣＡＧＣＧＴＧＡＧＣＴＡＴＧＡＧＡＡＡＧＣＧＣＣＡＣＧＣＴＴＣＣＣＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡＡＧＧＣＧＧＡＣＡＧＧＴＡＴＣＣＧＧＴＡＡＧＣＧＧＣＡＧＧＧＴＣＧＧＡＡＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧＣＡＣＧＡＧＧＧＡＧＣＴＴＣＣＡＧＧＧＧＧＡＡＡＣＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＴＴＴＡＴＡＧＴＣＣＴＧＴＣＧＧＧＴＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＣＴＧＡＣＴＴＧＡＧＣＧＴＣＧＡＴＴＴＴＴＧＴＧＡＴＧＣＴＣＧＴＣＡＧＧＧＧＧＧＣＧＧＡＧＣＣＴＡＴＧＧＡＡＡＡＡＣＧＣＣＡＧＣＡＡＣＧＣＧＧＣＣＴＴＴＴＴＡＣＧＧＴＴＣＣＴＧＧＣＣＴＴＴＴＧＣＴＧＧＣＣＴＴＴＴＧＣＴＣＡＣＧＡＡＴＴＡＡＴＴＣＡＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＣＡＴＡＴＴＴＧＡＡＴＧＴＡＴＴＴＡＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＧＣＧＣＡＣＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＡＣＡＡＣＡＧＡＴＡＡＣＴＴＡＣＡＧＣＴＡＴＣＧＧＡＡＧＧＴＧＣＡＧＡＧＡＣＴＣＧＡＣＧＧＧＡＧＣＴＡＣＣＣＴＡＡＣＧＴＣＡＡＧＡＣＧＡＧＧＧＴＡＡＡＧＡＴＧＡＧＡＧＴＣＣＡＡＴＴＣＴＣＡＡＡＧＣＣＡＡＴＡＧＧＣＡＧＴＡＧＣＧＡＡＡＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＡＡＧＡＡＡＡＴＣＣＧＴＴＧＡＣＣＴＴＡＡＡＣＧＧＴＣＧＴＧＴＧＧＧＴＴＣＡＡＧＴＣＣＣＴＣＣＡＣＣＣＣＣＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＣＣＧＧＧＴＣＴＡＧＡＡＡＡＣＧＣＡＡＴＡＧＣＧＧＡＡＡＡＡＣＴＴＴＡＡＡＣＡＴＴＡＡＡＡＣＣＣＣＣＣＴＣＴＣＣＣＴＣＣＣＣＣＣＣＴＡＡＣＧＴＴＡＣＴＧＧＣＣＧＡＡＧＣＣＧＣＴＴＧＧＡＡＴＡＡＧＧＣＣＧＧＴＧＴＧＣＧＴＴＴＧＴＣＴＡＴＡＴＧＴＴＡＴＴＴＴＣＣＡＣＣＡＴＡＴＴＧＣＣＧＴＣＴＴＴＴＧＧＣＡＡＴＧＴＧＡＧＧＧＣＣＣＧＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＴＣＴＴＣＴＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＴＣＣＴＡＧＧＧＧＴＣＴＴＴＣＣＣＣＴＣＴＣＧＣＣＡＡＡＧＧＡＡＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＧＴＴＧＡＡＴＧＴＣＧＴＧＡＡＧＧＡＡＧＣＡＧＴＴＣＣＴＣＴＧＧＡＡＧＣＴＴＣＴＴＧＡＡＧＡＣＡＡＡＣＡＡＣＧＴＣＴＧＴＡＧＣＧＡＣＣＣＴＴＴＧＣＡＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＣＣＡＣＣＴＧＧＣＧＡＣＡＧＧＴＧＣＣＴＣＴＧＣＧＧＣＣＡＡＡＡＧＣＣＡＣＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＡＧＧＣＧＧＣＡＣＡＡＣＣＣＣＡＧＴＧＣＣＡＣＧＴＴＧＴＧＡＧＴＴＧＧＡＴＡＧＴＴＧＴＧＧＡＡＡＧＡＧＴＣＡＡＡＴＧＧＣＴＣＴＣＣＴＣＡＡＧＣＧＴＡＴＴＣＡＡＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＡＡＧＧＡＴＧＣＣＣＡＧＡＡＧＧＴＡＣＣＣＣＡＴＴＧＴＡＴＧＧＧＡＴＣＴＧＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＧＧＴＧＣＡＣＡＴＧＣＴＴＴＡＣＡＴＧＴＧＴＴＴＡＧＴＣＧＡＧＧＴＴＡＡＡＡＡＡＣＧＴＣＴＡＧＧＣＣＣＣＣＣＧＡＡＣＣＡＣＧＧＧＧＡＣＧＴＧＧＴＴＴＴＣＣＴＴＴＧＡＡＡＡＡＣＡＣＧＡＴＧＡＴＡＡＴＡＴＧＧＣＣＡＣＡＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＧＣＴＧＴＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＴＣＴＧＴＡＧＣＴＣＧＡＧＣＴＧＴＡＡＴＴＴＡＣＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＡＣＧＧＣＴＴＡＡＡＴＧＣＣＴＡＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＧＡＡＧＡＧＡＡＡＡＧＣＡＡＧＴＴＣＴＴＧＴＡＡＧＴＴＴＡＡＣＣＡＴＡＡＡＴＴＴＧＣＣＡＧＣＣＡＣＧＧＣＡＡＧＣＴＡＧＡＣＧＣＴＡＣＧＧＡＣＴＴＡＡＡＴＡＡＴＴＧＡＧＣＣＴＴＡＧＡＧＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＴＴＡＡＧＴＧＧＡＴＡＣＴＣＴＣＡＡＡＣＴＣＡＧＧＧＡＡＡＣＣＴＡＡＡＴＣＴＡＧＣＧＡＴＡＧＡＣＡＡＧＧＣＡＡＴＣＣＴＧＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＡＡＧＴＡＧＴＡＡＴＴＡＧＴＡＡＧＴＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＴＡＡＣＡＧＣＡＴＡＴＣＴＡＧ

配列番号２
長さ： １７
タイプ： ＤＮＡ
有機体：人工
特徴： ＨＲ１Ａ
その他の情報：相同性領域 １Ａ
シーケンス： ２
ＧＧＡＣＡＡＧＡＴＣＧＣＧＣＧＧＡ

配列番号３
長さ： １７
タイプ： ＤＮＡ
有機体：人工
特徴： ＨＲ１Ｂ
その他の情報：相同性領域 １Ｂ
シーケンス： ３
ＡＧＴＧＣＡＣＧＡＧＴＣＴＣＡＧＧ

配列番号４
長さ： １７
タイプ： ＤＮＡ
有機体：人工
特徴： ＨＲ２Ａ
その他の情報：相同性領域 ２Ａ
シーケンス： ４
ＣＣＴＧＴＴＣＴＡＧＣＧＣＧＣＣＴ

配列番号５
長さ： １７
タイプ： ＤＮＡ
有機体：人工
特徴： ＨＲ２Ｂ
その他の情報：ホモロジー領域 ２Ｂ
シーケンス： ５
ＴＣＡＣＧＴＧＣＴＣＡＧＡＧＴＣＣ

配列番号６
長さ： １７
タイプ： ＤＮＡ
有機体：人工
特徴： ＤＮＡｚ－ＨＲ１／ｇＲＮＡ－ＨＲ１
その他の情報： ＤＮＡｚｉｍｅ ／ ｇｕｉｄｅＲＮＡホモロジー領域 ＨＲ１
シーケンス： ６
ＧＧＡＣＴＣＴＧＡＧＣＡＣＧＴＧＡ

配列番号７
長さ： １７
タイプ： ＤＮＡ
有機体：人工
特徴： ＤＮＡｚ－ＨＲ２／ｇＲＮＡ－ＨＲ２
その他の情報： ＤＮＡｚｉｍｅ ／ ｇｕｉｄｅＲＮＡホモロジー領域 ＨＲ２
シーケンス： ７
ＧＧＡＣＡＡＧＡＴＣＧＣＧＣＧＧＡ

配列番号８
長さ： ７４
タイプ： ＤＮＡ
有機体：人工
特徴： ＳＹＴＥ－ＤＮＡｚＲＬ１２
その他の情報： ＳＹＴＥ－ＤＮＡｚＲＬ１２ ＲＮＡ ｌｉｇａｔｉｎｇ ＤＮＡｚｙｍｅ
シーケンス： ８
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＣＣＧＣＴＴＧＡＴＡＣＣＧＡＧＣＧＴＣＧＧＣＡＡＴＧＣＣＧＴＧＴＴＧＡＴＴＧＡＴＧＡＴＣＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ

配列番号９
長さ： ６７
タイプ： ＤＮＡ
有機体：人工
特徴： ＳＹＴＥ－ＤＮＡｚＲＬ１６
その他の情報： ＳＹＴＥ－ＤＮＡｚＲＬ１６ ＲＮＡ ｌｉｇａｔｉｎｇ ＤＮＡｚｙｍｅ
シーケンス： ９
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＧＡＴＧＣＡＴＡＣＡＴＣＧＣＴＧＣＧＣＡＴＡＧＣＧＣＡＧＴＡＣＡＴＡＣＡＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ

配列番号１０
長さ： ２６１
タイプ： ＤＮＡ
有機体：人工
機能： ＣｉｒｃＳＥＱ１
その他の情報： ｐＳＹＴＥｃＲＮＡ 環状化シーケンス １
シーケンス： １０
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＡＣＡＡＣＡＧＡＴＡＡＣＴＴＡＣＡＧＣＴＡＴＣＧＧＡＡＧＧＴＧＣＡＧＡＧＡＣＴＣＧＡＣＧＧＧＡＧＣＴＡＣＣＣＴＡＡＣＧＴＣＡＡＧＡＣＧＡＧＧＧＴＡＡＡＧＡＴＧＡＧＡＧＴＣＣＡＡＴＴＣＴＣＡＡＡＧＣＣＡＡＴＡＧＧＣＡＧＴＡＧＣＧＡＡＡＧＣＴＧＣＧＧＧＡＧＡＡＧＡＡＡＡＴＣＣＧＴＴＧＡＣＣＴＴＡＡＡＣＧＧＴＣＧＴＧＧＧＴＴＣＡＡＧＴＣＣＣＴＣＣＡＣＣＣＣＣＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ

配列番号１１
長さ： ２７１
タイプ： ＤＮＡ
有機体：人工
機能： ＣｉｒｃＳＥＱ２
その他の情報： ｐＳＹＴＥｃＲＮＡ 環状化シーケンス ２
シーケンス： １１
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＧＡＮＡＧＡＡＡＡＡＧＣＡＡＧＴＴＣＴＴＧＴＡＡＧＴＴＴＡＡＣＣＡＴＡＡＡＴＴＴＧＣＣＡＧＣＣＡＣＧＧＣＡＡＧＣＴＡＧＡＣＧＣＴＡＣＧＧＡＣＴＴＡＡＡＴＡＡＴＴＧＡＧＣＣＴＴＡＧＡＧＡＡＧＡＡＡＡＴＴＴＣＴＴＴＡＡＧＴＧＧＡＴＡＣＴＣＴＣＡＡＡＣＴＣＡＧＧＧＡＡＡＣＣＴＡＡＡＴＣＴＡＧＣＧＡＴＡＧＡＣＡＡＧＧＣＡＡＴＣＣＴＧＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＡＡＧＴＡＧＴＡＡＴＴＡＧＴＡＡＧＴＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ

配列番号１２
長さ： １５７４
タイプ： ＲＮＡ
有機体：人工
機能： ｃｉｒｃＲＮＡ－ ｔｕｒｂｏＧＦＰ
その他の情報： ＴｕｒｂｏＧＦＰをエンコードする環状ポリリボヌクレオチド
シーケンス： １１
ＧＡＡＡＡＵＣＣＧＵＵＧＡＣＣＵＵＡＡＡＣＧＧＵＣＧＵＧＵＧＧＧＵＵＣＡＡＧＵＣＣＣＵＣＣＡＣＣＣＣＣＡＡＵＵＡＧＧＡＧＡＣＵＡＧＡＧＧＡＣＧＧＵＧＡＧＡＧＵＧＡＣＣＡＧＡＵＧＡＧＡＵＡＡＡＣＧＣＡＡＵＡＧＣＧＧＡＡＡ ＡＡＣＵＵＵＡＡＡＣＡＵＵＡＡＡＡＣＣＣＣＣＣＵＣＵＣＣＣＵＣＣＣＣＣＣＣＵＡＡＣＧＵＵＡＣＵＧＧＣＣＧＡＡＧＣＣＧＣＵＵＧＧＡＡＵＡＡＧＧＣＣＧＧＵＧＵＧＣＧＵＵＵＧＵＣＵＡＵＡＵＧＵＵＡＵＵＵＵＣＣＡＣＣＡＵＡＵＵＧＣＣＧＵＣＵＵＵＵＧＧＣＡＡＵＧＵＧＡＧＧＧＣＣＣＧＧＡＡＡＣＣＵＧＧＣＣＣＵＧＵＣＵＵＣＵＵＧＡＣＧＡＧＣＡＵＵＣＣＵＡＧＧＧＧＵＣＵＵＵＣＣＣＣＵＣＵＣＧＣＣＡＡＡＧＧＡＡＵＧＣＡＡＧＧＵＣＵＧＵＵＧＡＡＵＧＵＣＧＵＧＡＡＧＧＡＡＧＣＡＧＵＵＣＣＵＣＵＧＧＡＡＧＣＵＵＣＵＵＧＡＡＧＡＣＡＡＡＣＡＡＣＧＵＣＵＧＵＡＧＣＧＡＣＣＣＵＵＵＧＣＡＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＣＣＡＣＣＵＧＧＣＧＡＣＡＧＧＵＧＣＣＵＣＵＧＣＧＧＣＣＡＡＡＡＧＣＣＡＣＧＵＧＵＡＵＡＡＧＡＵＡＣＡＣＣＵＧＣＡＡＡＧＧＣＧＧＣＡＣＡＡＣＣＣＣＡＧＵＧＣＣＡＣＧＵＵＧＵＧＡＧＵＵＧＧＡＵＡＧＵＵＧＵＧＧＡＡＡＧＡＧＵＣＡＡＡＵＧＧＣＵＣＵＣＣＵＣＡＡＧＣＧＵＡＵＵＣＡＡＣＡＡＧＧＧＧＣＵＧＡＡＧＧＡＵＧＣＣＣＡＧＡＡＧＧＵＡＣＣＣＣＡＵＵＧＵＡＵＧＧＧＡＵＣＵＧＡＵＣＵＧＧＧＧＣＣＵＣＧＧＵＧＣＡＣＡＵＧＣＵＵＵＡＣＡＵＧＵＧＵＵＵＡＧＵＣＧＡＧＧＵＵＡＡＡＡＡＡＣＧＵＣＵＡＧＧＣＣＣＣＣＣＧＡＡＣＣＡＣＧＧＧＧＡＣＧＵＧＧＵＵＵＵＣＣＵＵＵＧＡＡＡＡＡＣＡＣＧＡＵＧＡＵＡＡＵＡＵＧＧＣＣＡＣＡＡＣＣＡＵＧＧＡＧＡＧＣＧＡＣＧＡＧＡＧＣＧＧＣＣＵＧＣＣＣＧＣＣＡＵＧＧＡＧＡＵＣＧＡＧＵＧＣＣＧＣＡＵＣＡＣＣＧＧＣＡＣＣＣＵＧＡＡＣＧＧＣＧＵＧＧＡＧＵＵＣＧＡＧＣＵＧＧＵＧＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＧＣＡＣＣＣＣＣＧＡＧＣＡＧＧＧＣＣＧＣＡＵＧＡＣＣＡＡＣＡＡＧＡＵＧＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＡＡＧＧＣＧＣＣＣＵＧＡＣＣＵＵＣＡＧＣＣＣＣＵＡＣＣＵＧＣＵＧＡＧＣＣＡＣＧＵＧＡＵＧＧＧＣＵＡＣＧＧＣＵＵＣＵＡＣＣＡＣＵＵＣＧＧＣＡＣＣＵＡＣＣＣＣＡＧＣＧＧＣＵＡＣＧＡＧＡＡＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＧＣＣＡＵＣＡＡＣＡＡＣＧＧＣＧＧＣＵＡＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＣＧＣＡＵＣＧＡＧＡＡＧＵＡＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＧＧＣＧＵＧＣＵＧＣＡＣＧＵＧＡＧＣＵＵＣＡＧＣＵＡＣＣＧＣＵＡＣＧＡＧＧＣＣＧＧＣＣＧＣＧＵＧＡＵＣＧＧＣＧＡＣＵＵＣＡＡＧＧＵＧＡＵＧＧＧＣＡＣＣＧＧＣＵＵＣＣＣＣＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＵＧＡＵＣＵＵＣＡＣＣＧＡＣＡＡＧＡＵＣＡＵＣＣＧＣＡＧＣＡＡＣＧＣＣＡＣＣＧＵＧＧＡＧＣＡＣＣＵＧＣＡＣＣＣＣＡＵＧＧＧＣＧＡＵＡＡＣＧＡＵＣＵＧＧＡＵＧＧＣＡＧＣＵＵＣＡＣＣＣＧＣＡＣＣＵＵＣＡＧＣＣＵＧＣＧＣＧＡＣＧＧＣＧＧＣＵＡＣＵＡＣＡＧＣＵＣＣＧＵＧＧＵＧＧＡＣＡＧＣＣＡＣＡＵＧＣＡＣＵＵＣＡＡＧＡＧＣＧＣＣＡＵＣＣＡＣＣＣＣＡＧＣＡＵＣＣＵＧＣＡＧＡＡＣＧＧＧＧＧＣＣＣＣＡＵＧＵＵＣＧＣＣＵＵＣＣＧＣＣＧＣＧＵＧＧＡＧＧＡＧＧＡＵＣＡＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＧＡＧＣＵＧＧＧＣＡＵＣＧＵＧＧＡＧＵＡＣＣＡＧＣＡＣＧＣＣＵＵＣＡＡＧＡＣＣＣＣＧＧＡＵＧＣＡＧＡＵＧＣＣＧＧＵＧＡＡＧＡＡＵＡＡＵＣＵＡＧＡＣＵＣＧＡＧＣＵＧＵＡＡＵＵＵＡＣＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＡＣＧＧＣＵＵＡＡＡＵＧＣＣＵＡＡＵＡＵＡＡＵＡＵＡＣＧＵＣＵＡＧＡＣＵＣＣＣＡＡＵＣＵＣＧＧＡＣＵＣＵＡＡＧＣＣＵＧＡＡＧＡＧＡＡＡＡＧＣＡＡＧＵＵＣＵＵＧＵＡＡＧＵＵＵＡＡＣＣＡＵＡＡＡＵＵＵＧＣＣＡＧＣＣＡＣＧＧＣＡＡＧＣＵＡＧＡＣＧＣＵＡＣＧＧＡＣＵＵＡ

Claims (13)

1. 以下を含む操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡ：
   少なくとも２つの線形化制限酵素（ＬＲＥ）、少なくとも１つの細菌選択システム、および少なくとも１つの細菌複製起点を含む合成ＤＮＡ骨格、および；
   少なくとも １ つの ＲＮＡ ポリメラーゼ プロモーター、少なくとも １ つの環状化配列 （ｃｉｒｃＳＥＱ１）、少なくとも １ つの ５’ ＤＮＡ スペーサー、少なくとも １ つの制限酵素認識配列 （ＭＣＳ１） を次の順序で含む、少なくとも １ つの環状 ＲＮＡ モジュール足場、少なくとも１つの翻訳開始配列、少なくとも第２の制限酵素認識配列（ＭＣＳ２）、少なくとも１つのコード配列、少なくとも第３の制限酵素認識配列（ＭＣＳ３）、少なくとも１つの３’ＤＮＡスペーサー、および少なくとも１つの２ 番目の環状化シーケンス （ｃｉｒｃＳＥＱ２）；
   ここで、前記環状化配列は、核酸に相補的な相同領域配列および／またはＲＮＡライゲーションが可能なタンパク質ベースのシステムを含み、前記システムは、ＲＮＡライゲーションＤＮＡｚｙｍｅ媒介環状化システム、ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９－ＤＮＡからなる群から選択される、 －リガーゼ媒介環状化システム、または自己スプライシングイントロン－エクソン媒介環状化システム。
2. 細菌選択系が、細菌内で抗生物質耐性遺伝子を発現することができる転写ユニットを含む、請求項１に記載の操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡ。
3. 抗生物質耐性遺伝子が、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ポリミキシン Ｂ 耐性遺伝子。
4. 細菌の複製起点が、ｐＭＢ１起点、ｐＭＢ１＊誘導体起点、ｐＢＲ３２２起点、ＣｏｌＥ１起点、ＣｏｌＥ１＊派生起点およびＦ１起点からなる群から選択される、請求項１に記載の操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡ。
5. ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがウイルス性であり、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ４ ＲＮＡからなる群から選択される、請求項１に記載の操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡ。ポリメラーゼ プロモーター、および Ｋ１１ ＲＮＡ ポリメラーゼ プロモーター。
6. 請求項１に記載の操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡであって、
   － 少なくとも１つの環状ＲＮＡモジュール足場の少なくとも２つの環状化配列の第１の環状化配列（ｃｉｒｃＳＥＱ１）は、少なくとも、第１の制限酵素認識配列（ＲＥ１Ａ）、第１の相同性領域（ＨＲ１Ｂ）に作動可能に連結されて構成される、置換された自己スプライシングおよび自己触媒グループ Ｉ イントロン － エクソン システムに由来するエクソン セグメント （エクソン Ｉ） およびイントロン セグメント （イントロン Ｉ）、第 ２ の制限酵素認識配列 （ＲＥ１Ｂ）、および第 ２ の相同領域 （ＨＲ１Ａ）。と、
   －少なくとも１つの環状ＲＮＡモジュール足場の少なくとも２つの環状化配列の第２の環状化配列（ｃｉｒｃＳＥＱ２）は、少なくとも：第１の制限酵素認識配列（ＲＥ２Ａ）に作動可能に連結された第１の相同領域（ＨＲ２Ｂ）、置換された自己スプライシングおよび自己触媒グループ Ｉ イントロン － エクソン システムに由来するエクソン セグメント （エクソン ＩＩ） およびイントロン セグメント （イントロン ＩＩ）、２ 番目の相同領域 （ＨＲ２Ａ） および ２ 番目の制限酵素認識配列 （ＲＥ２Ｂ）。
7. 請求項６に記載の操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡであって：
   － 第１の環状配列ｃｉｒｃＳＥＱ１の第１の相同領域ＨＲ１Ａは、第２の環状配列ｃｉｒｃＳＥＱ２の第２の相同領域ＨＲ２Ａに相補的である。と、
   － 第１の環状化配列ｃｉｒＳＥＱ１の第２の相同性領域ＨＲ１Ｂは、第２の環状化配列ｃｉｒＳＥＱ２の第１の相同性領域ＨＲ２Ｂに相補的である。
8. 少なくとも以下の工程を含む環状ＲＮＡの製造方法：
   プラスミドに含まれる細菌選択系によって組換えクローンを選択する工程；
   得られた組換え細菌を成長条件でのインキュベーションに供して、適切な分子量を生成するために操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミド ＤＮＡ の複製を可能にする。
   得られた操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミド ＤＮＡ分子を分離および精製する。
   ライゲーションからなる群から適切なＲＮＡライゲーションシステムを選択すること；
   精製された操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミド ＤＮＡ を線形化制限酵素 （ＬＲＥ ） で消化する。
   操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡ の線形化された環状 ＲＮＡ モジュール足場を精製します。
   ＲＮＡ分子を生成するために、精製された線状化された環状ＲＮＡモジュール足場をインビトロ転写反応に供する工程；
   線状 ＲＮＡ 分子を選択した ＲＮＡ ライゲーション システムにかける。と、
   得られた環状 ＲＮＡ を精製します。
9. ＲＮＡライゲーションシステムがＲＮＡライゲーションＤＮＡザイムから選択される場合、ステップｄの後に、そのｃｉｒＳＥＱ領域（ｃｉｒｃＳＥＱ１およびｃｉｒｃＳＥＱ２）において親円形の共有結合的に閉じた合成プラスミドＤＮＡをトリミングするステップをさらに含む、請求項８に記載の環状ＲＮＡを製造するためのプロセス。 ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９／リガーゼ。
10. 請求項９に記載の環状ＲＮＡの製造方法であって、前記環状ＲＮＡの製造方法は、
    ａ．精製された操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミド ＤＮＡ を ＲＥ１Ａ制限酵素および ＲＥ１Ｂ制限酵素で消化して、エクソン Ｉ、イントロン Ｉ、および ＨＲ１Ｂ セグメントを含む最初の ｃｉｒｃＳＥＱ 領域 （ｃｉｒｃＳＥＱ１） 内の ＤＮＡ の一部を除去し、続いてゲル化する－ｃｉｒｃＳＥＱ１ でトリミングされた線形化された親円形の共有結合的に閉じた合成プラスミドＤＮＡ の電気泳動精製。
    ｂ．ゲル電気泳動で精製されたｃｉｒｃＳＥＱ１トリミングされた線形化された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡを再結合します。
    ｃ．ｃｉｒｃＳＥＱ１でトリミングされた親環状共有結合合成プラスミドＤＮＡを適切な細菌株に形質転換し、親プラスミドに含まれる細菌選択システムによって組換えクローンを選択すること、
    ｄ．得られた ｃｉｒｃＳＥＱ１ トリミングされた親環状共有結合閉鎖合成プラスミド ＤＮＡ分子を分離および精製します。
    ｅ．ｃｉｒｃＳＥＱ１ でトリミングされた親環状共有結合閉鎖合成プラスミド ＤＮＡ を ＲＥ２Ａ制限酵素および ＲＥ２Ｂ制限酵素で消化して、エクソン ＩＩ、イントロン ＩＩ、および ＨＲ２Ａ セグメントを含む ２ 番目の ｃｉｒｃＳＥＱ 領域 （ｃｉｒｃＳＥＱ２） 内の ＤＮＡ の一部を除去し、続いてゲル化します。 ｃｉｒｃＳＥＱ１／２ トリミングされた線形化された親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡ の電気泳動精製。
    ｆ．ゲル電気泳動で精製されたｃｉｒｃＳＥＱ１ ／ ２でトリミングされた親環状共有結合閉鎖合成プラスミドＤＮＡ分子を再連結します。
    ｇ．ｃｉｒｃＳＥＱ１／２ でトリミングされた親環状共有結合合成プラスミド ＤＮＡ を適切な細菌株に変換し、親プラスミドに含まれる細菌選択システムによって組換えクローンを選択します。と
    ｈ．操作された親環状共有結合閉鎖合成プラスミド ＤＮＡ を ｃｉｒｃＳＥＱ１／２ トリミング領域で分離および精製します。
11. 選択されたライゲーションシステムがＲＮＡライゲーションＤＮＡザイムであり、ＲＮＡライゲーションＤＮＡザイムが少なくとも以下のものを含む、請求項１０に記載の環状ＲＮＡを製造するためのプロセス：
    第１のセクションは、連結される標的ＲＮＡの３’自由末端を標的とする相補的領域であり；
    対形成を介した ２ つの ＲＮＡ 基質のハイブリダイゼーションを可能にする組み合わせ内の相乗作用を有するヌクレオチドからなり、と、
    第３のセクションは、ライゲーションされる標的ＲＮＡの５’自由末端を標的とする相補的領域である。と、
    ここで、環状ＲＮＡを製造するプロセスは、線状化されたＲＮＡ分子を、その環状化のために適切な緩衝液中でＤＮＡザイムライゲーション反応に供することをさらに含む。
12. 選択されたライゲーション系がＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９－ＤＮＡＬｉｇａｓｅ系であり、ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９－ＤＮＡＬｉｇａｓｅ系が、ペプチドリンカーによってＤＮＡリガーゼに融合されたｄＣａｓ９を含む合成融合タンパク質である、請求項１０に記載の環状ＲＮＡの製造方法。親プラスミドのそれぞれの ｃｉｒｃＳＥＱ１ および ｃｉｒｃＳＥＱ２ 配列のＨＲ１Ａ および ＨＲ２Ｂ 領域に相同な合成 ｃｒＲＮＡ との複合体は、リガーゼ活性のターゲティングを提供し、末端を結合して直鎖状 ＲＮＡ 分子を環状化します。環状ＲＮＡを製造する方法は、線状ＲＮＡ分子を環状化のためにｄＣａｓ９／ＤＮＡリガーゼキメラに供することをさらに含む。
13. 選択されたライゲーション系がイントロン－エクソン媒介ライゲーションであり、環状ＲＮＡを製造するためのプロセスが、自己対合を可能にするために、線形化されたＲＮＡを適切な緩衝液に供する工程をさらに含む、請求項８記載の環状ＲＮＡを製造するためのプロセス。親プラスミドに由来するｃｉｒｃＳＥＱ１ および ｃｉｒｃＳＥＱ２ 配列内の相同領域 ＨＲ１Ａ－ＨＲ２Ａ および ＨＲ１Ｂ－ＨＲ２Ｂ と、それに続く環状 ＲＮＡ 分子を生成するための自発的な自己触媒的自己スプライシング イベント。

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