JP6273753B2 - 変異rna発現用線状二本鎖dna - Google Patents
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Description
[1](a)RNA発現用DNA配列の上流領域を欠失した下流領域からなる配列1の5’末端領域に変異を有する配列1’と、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、前記RNA発現用DNA配列の上流領域からなる配列2とを順次備えた変異RNA発現用線状二本鎖DNAa;(b)前記配列1と、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、前記配列2の3’末端領域に変異を有する配列2’とを順次備えた変異RNA発現用線状二本鎖DNAb;(c)前記配列1’と、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、前記配列2’とを順次備えた変異RNA発現用線状二本鎖DNAc;の(a)〜(c)のいずれか記載の変異RNA発現用線状二本鎖DNAや、
[2]配列1の5’末端領域が、配列1の5’末端から50塩基以内の領域であり、かつ、配列2の3’末端領域が、配列2の3’末端から50塩基以内の領域であることを特徴とする上記[1]記載の変異RNA発現用線状二本鎖DNAや、
[3]ターミネータ配列が、シミアンウイルス40(SV40)のターミネータ配列であることを特徴とする上記[1]又は[2]記載の変異RNA発現用線状二本鎖DNAや、
[4]プロモータ配列が、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)のプロモータ配列であることを特徴とする上記[1]〜[3]のいずれか記載の変異RNA発現用線状二本鎖DNAや、
[5]プラスミドの複製開始点又は薬剤耐性遺伝子を含まないことを特徴とする上記[1]〜[4]のいずれか記載の変異RNA発現用線状二本鎖DNAや、
[6]変異RNA発現用線状二本鎖DNAの長さが200〜5000塩基であることを特徴とする上記[1]〜[5]のいずれか記載の変異RNA発現用線状二本鎖DNAに関する。
[8]細胞が哺乳動物細胞であることを特徴とする上記[7]記載の形質転換細胞の製造方法に関する。
(a)RNA発現用DNA配列の上流領域を欠失した下流領域からなる配列1(以下、単に「配列1」ということがある)の5’末端領域に変異を有する配列1’(以下、単に「配列1’」ということがある)と、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、前記RNA発現用DNA配列の上流領域からなる配列2(以下、単に「配列2」ということがある)とを順次備えた変異RNA発現用線状二本鎖DNAa;
(b)前記配列1と、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、前記配列2の3’末端領域に変異を有する配列2’(以下、単に「配列2’」ということがある)とを順次備えた変異RNA発現用線状二本鎖DNAb;
(c)前記配列1’と、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、前記配列2’とを順次備えた変異RNA発現用線状二本鎖DNAc;
の(a)〜(c)のいずれか記載の変異RNA発現用線状二本鎖DNAであれば特に制限されず、本発明の変異RNA発現用線状二本鎖DNAは環状化させることなくそのまま細胞内に導入するだけで、細胞内で変異RNAを発現させることが可能である。
(g)配列1と、ターミネータ配列と、リンカー配列とを順次備えた線状二本鎖DNAgを作製する工程;
(h)リンカー配列と、プロモータ配列と、配列2とを順次備えた線状二本鎖DNAhを作製する工程;
(i)線状二本鎖DNAg及び線状二本鎖DNAhをテンプレートとして、線状二本鎖DNAgにおける配列1の5’末端領域のセンス鎖配列に変異を導入した配列を含むフォワードプライマーiと、線状二本鎖DNAhの配列2における3’末端領域のアンチセンス鎖配列に変異を導入した配列を含むリバースプライマーiを用いてPCRを行う工程;
の工程(g)〜(i)を備えた変異RNA発現用線状DNAを製造する方法を挙げることができる。図1に例1の概要を示す。
(j)配列1と、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、配列2とを順次備えた線状二本鎖DNAjを作製する工程;
(k)線状二本鎖DNAjをテンプレートとして、線状二本鎖DNAjにおける配列1の5’末端領域のセンス鎖配列に変異を導入した配列を含むフォワードプライマーkと、線状二本鎖DNAjの配列2における3’末端領域のアンチセンス鎖配列に変異を導入した配列を含むリバースプライマーkを用いてPCRを行う工程;
の工程(j)及び(k)を備えた変異RNA発現用線状DNAを製造する方法も挙げることができる。図2に例2の概要を示す。
(l)プロモータ配列とRNA発現用DNA配列とターミネータ配列を順次備えた二本鎖DNAをテンプレートとして、(A)環状化配列fとプロモータ配列の5’末端領域のセンス鎖配列とを順次備えた環状化用フォワードプライマーと、前記環状化配列fに相補的に結合可能な環状化配列rとターミネータ配列の3’末端領域のアンチセンス鎖配列とを順次備えた環状化用リバースプライマー、(B)ターミネータ配列の3’末端領域のセンス鎖配列とプロモータ配列の5’末端領域のセンス鎖配列とを順次備えた環状化用フォワードプライマーと、ターミネータ配列の3’末端領域のアンチセンス鎖配列からなる環状化用リバースプライマー、(C)プロモータ配列の5’末端領域のセンス鎖配列からなる環状化用フォワードプライマーと、プロモータ配列の5’末端領域のアンチセンス鎖配列とターミネータ配列の3’末端領域のアンチセンス鎖配列とを順次備えた環状化用リバースプライマー、の(A)〜(C)のいずれかの組み合わせのプライマーを用いてPCRを行う工程;
(m)工程(l)で得られた線状二本鎖DNAにおける両末端の互いに相補的に結合可能な配列が自己結合することで線状二本鎖DNAが環状化した環状化二本鎖DNAを得る工程;
(n)工程(m)で得られた環状化二本鎖DNAをテンプレートとして、環状化二本鎖DNA中のRNA発現用DNA配列の一部の配列のセンス鎖配列に変異を導入した配列を含む線状化用フォワードプライマーと、前記線状化用フォワードプライマーがアニールするRNA発現用DNA配列中の5’末端の上流側に隣接する一塩基及び該一塩基の上流側のRNA発現用DNA配列の一部の配列のアンチセンス鎖配列に変異を導入した線状化用リバースプライマーを用いてPCRを行う工程;
の工程(l)〜(n)を備えた変異RNA発現用線状二本鎖DNAを製造する方法を挙げることができる。
(1)配列1’の5’末端領域のセンス鎖配列を含むフォワードプライマー1’(以下、「フォワードプライマー1’ということがある」)と、配列2の3’末端領域のアンチセンス鎖配列に変異を導入した配列を含むリバースプライマー2M(以下、「リバースプライマー2Mということがある」)、
(2)配列1’の5末端領域のセンス鎖配列に変異を導入した配列を含むフォワードプライマー1’M(以下、「フォワードプライマー1’Mということがある」)と、配列2の3’末端領域のアンチセンス鎖配列を含むリバースプライマー2(以下、「リバースプライマー2ということがある」)、
(3)前記フォワードプライマー1’Mと、前記リバースプライマー2M、
のフォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせのいずれかを用いてPCRを行う方法を挙げることができる。
(4)配列1の5末端領域のセンス鎖配列を含むフォワードプライマー1(以下、「フォワードプライマー1ということがある」)と、配列2’の3’末端領域のアンチセンス鎖配列に変異を導入した配列を含むリバースプライマー2’M(以下、「リバースプライマー2’Mということがある」)、
(5)配列1の5末端領域のセンス鎖配列に変異を導入した配列を含むフォワードプライマー1M(以下、「フォワードプライマー1Mということがある」)と、配列2’の3’末端領域のアンチセンス鎖配列を含むリバースプライマー2’(以下、「リバースプライマー2’ということがある」)、
(6)前記フォワードプライマー1Mと、前記リバースプライマー2’M、
のフォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせのいずれかを用いてPCRを行う方法も挙げることができる。
(7)前記フォワードプライマー1’と、前記リバースプライマー2’M、
(8)前記フォワードプライマー1’Mと、前記リバースプライマー2’、
(9)前記フォワードプライマー1’Mと、前記リバースプライマー2’M、
のフォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせのいずれかを用いてPCRを行う方法も挙げることができる。
(リンカー配列と、CMVプロモータ配列と、EGFPタンパク質をコードする遺伝子配列の上流領域からなる配列2とを順次備えた線状二本鎖DNAの作製)
pEGFP−C1(クロンテック社製:図5)をテンプレートとして、表1に記載の配列番号2〜7に示されるフォワードプライマーと配列番号8に示されるリバースプライマーを用いてPCRを行い、リンカー配列と、CMVプロモータ配列と、EGFPタンパク質をコードする遺伝子配列の上流領域からなる配列2とを順次備えた線状二本鎖DNA No.o−3〜No.o−8をそれぞれ作製した。PCR反応はGXLポリメーラーゼ(タカラバイオ社製)を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度は、テンプレート0.5pg/μl、フォワードプライマー0.3μM、リバースプライマー0.3μMに調製し、icyclerサーマルサイクーラー(BIO−RAD社製)を用いて98℃10秒、60℃15秒、68℃2分のサイクルを30回行った。作製した線状二本鎖DNA No.o−3〜No.o−8のアガロース電気泳動の結果を図6に示す。
pEGFP−C1(クロンテック社製)をテンプレートとして、表2に記載の配列番号9に示されるフォワードプライマーと配列番号10に示されるリバースプライマーを用いてPCRを行い、EGFPタンパク質をコードする遺伝子配列の下流領域からなる配列1と、SV40ターミネータ配列と、リンカー配列とを順次備えた線状二本鎖DNA No.o−9を、配列番号9に示されるフォワードプライマーと配列番号11に示されるリバースプライマーを用いてPCRを行い、EGFPタンパク質をコードする遺伝子配列の下流領域からなる配列1と、SV40ターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖DNA No.o−10をそれぞれ作製した。PCR反応は、上記と同様に行った。作製した線状二本鎖DNA No.o−9〜No.o−10のアガロース電気泳動の結果を図6に示す。
下記表3中のテンプレート欄に記載した2種類の線状二本鎖DNAであるNo.o−3とNo.o−9、No.o−4とNo.o−9、No.o−5とNo.o−9、No.o−6とNo.o−9、No.o−7とNo.o−9、No.o−8とNo.o−10をそれぞれテンプレートとして、配列番号9に示すフォワードプライマーと配列番号8に示されるリバースプライマーを用いてそれぞれPCRを行い、EGFPタンパク質をコードする遺伝子配列の下流領域からなる配列1と、SV40ターミネータ配列と、リンカー配列と、CMVプロモータ配列と、EGFPタンパク質をコードする遺伝子配列の上流領域からなる配列2とを順次備えた非変異RNA発現用線状二本鎖DNA No.o−35〜No.o−40を作製した。PCR反応は、98℃10秒、60℃15秒、68℃5分のサイクルを30回行った以外は、前述の線状二本鎖DNAの作製におけると同様に行った。作製した線状二本鎖DNAのアガロース電気泳動の結果を図7に、配置図を図8に示す。なお、図8における数字は、図5に示すように、pEGFP−C1のEGFP遺伝子の開始コドンのアデニンの位置を1とした場合のpEGFP−C1上の塩基の位置を示し、例えば1018はpEGFP−C1のEGFP遺伝子の開始コドンのアデニンの位置を1とした場合の下流側の1018番目の塩基を示し、−600はpEGFP−C1のEGFP遺伝子の開始コドンのアデニンの位置を1とした場合の上流側の600番目の塩基を示す。線状二本鎖DNA No.o−35〜o−40の長さは、No.o−35が1631塩基、No.o−36が2031塩基、No.o−37が3031塩基、No.o−38が4031塩基、No.o−39が4748塩基、No.o−40が1631塩基である。
HeLa細胞を4000細胞/wellになるように96wellプレートに播種して18時間培養後、上記で得られた線状二本鎖DNA No.o−35〜No.o−40のそれぞれ30pmolをFuGENE(登録商標)HD Transfection Reagentキット(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)により各細胞に導入し、24時間後に蛍光顕微鏡で観察した。
蛍光顕微鏡の観察結果を図9に示す。線状二本鎖DNA No.o−40、o−35、o−36では300msの露光時間で緑蛍光が観察され、No.o−37、o−38、o−39では1sの露光時間で緑蛍光が少し観察された。上記結果より、配列1と、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、配列2とを順次備えた非変異RNA発現用線状二本鎖DNAをそのまま細胞内に導入することで、細胞内でRNAが発現すること、及び、前記線状二本鎖DNAの長さが短いほど細胞内におけるRNA発現量が多いことが明らかとなった。
pEGFP−C1(クロンテック社製)をテンプレートとして、配列番号9に示されるフォワードプライマーと配列番号10に示されるリバースプライマー、及び、配列番号12に示されるフォワードプライマーと配列番号10に示されるリバースプライマーを用いてそれぞれPCRを行い、EGFPタンパク質をコードする遺伝子配列の下流領域からなる配列1と、SV40ターミネータ配列と、リンカー配列とを順次備えた線状二本鎖DNA No.T−18、T−39を作製した。PCR反応はGXLポリメーラーゼ(タカラバイオ社製)を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度は、テンプレート50pg/μl、フォワードプライマー0.3μM、リバースプライマー0.3μMに調製し、icyclerサーマルサイクーラー(BIO−RAD社製)を用いて98℃10秒、55℃15秒、68℃2分のサイクルを30回行った。作製した線状二本鎖DNA No.T−18、T−39のアガロース電気泳動の結果を図10に示す。
pEGFP−C1(クロンテック社製)をテンプレートとして、配列番号13に示されるフォワードプライマーと配列番号8に示されるリバースプライマー、及び、配列番号13に示されるフォワードプライマーと配列番号14に示されるリバースプライマーを用いてそれぞれPCRを行い、リンカー配列と、CMPプロモータ配列と、EGFPタンパク質をコードする遺伝子配列の上流領域からなる配列2とを順次備えた線状二本鎖DNA No.T−15、T−38を作製した。PCR反応は上記と同様の反応溶液組成にて、98℃10秒、55℃15秒、68℃2分のサイクルを30回行った。作製した線状二本鎖DNA No.T−15、T−38のアガロース電気泳動の結果を図10に示す。
上記で作製した線状二本鎖DNA No.T−15及びT−18をテンプレートとして、配列番号15に示されるフォワードプライマー及び配列番号16に示されるリバースプライマーを用いてPCRを行い、EGFPタンパク質をコードする遺伝子配列の下流領域の5’末端領域に変異を有する配列1’と、SV40ターミネータ配列と、リンカー配列と、CMVプロモータ配列と、EGFPタンパク質をコードする遺伝子配列の上流領域の3’末端領域に変異を有する配列2’とを順次備えた変異RNA発現用線状二本鎖DNA No.T−48を作製した。作製した線状二本鎖DNA No.T−48の配置図を図11(b)に示し、アガロース電気泳動の結果を図12に示す。PCR反応はGXLポリメーラーゼ(タカラバイオ社製)を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度は、テンプレートそれぞれ0.5pg/μl、フォワードプライマー0.3μM、リバースプライマー0.3μMに調製し、icyclerサーマルサイクーラー(BIO−RAD社製)を用いて98℃10秒、65℃15秒、68℃3分のサイクルを30回行った。
上記で作製した線状二本鎖DNA No.T−38及びT39をテンプレートとして、配列番号18に示されるフォワードプライマーと配列番号12に示されるリバースプライマーを用いてPCRを行い、EGFPタンパク質をコードする遺伝子配列の下流領域からなる配列1と、SV40ターミネータ配列と、リンカー配列と、CMVプロモータ配列と、EGFPタンパク質をコードする遺伝子配列の上流領域の3’末端領域に変異を有する配列2’とを順次備えた変異RNA発現用線状二本鎖DNA No.T−44を作製した。作製した線状二本鎖DNA No.T−44の配置図を図11(d)に示し、アガロース電気泳動の結果を図12に示す。PCR反応はGXLポリメーラーゼ(タカラバイオ社製)を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度は、テンプレートそれぞれ0.5pg/μl、フォワードプライマー0.3μM、リバースプライマー0.3μMに調製し、icyclerサーマルサイクーラー(BIO−RAD社製)を用いて98℃10秒、65℃15秒、68℃3分のサイクルを30回行った。なお、線状二本鎖DNA No.T−44はEGFPタンパク質をコードする遺伝子配列の上流領域からなる配列2の3’末端領域において、EGFPのアミノ酸配列(配列番号17)における163番目のリジン(K)をコードする配列をグルタミン(Q)をコードする配列に置換し、164番目のバリン(V)をコードする配列をアラニン(A)をコードする配列に置換した配列であり、EGFPタンパク質において、163番目のリジン(K)をグルタミン(Q)に、164番目のバリン(V)をアラニン(A)に置換しても緑蛍光の発光能力は失われないことが知られている。
上記で作製した線状二本鎖DNA No.T−15及びT18をテンプレートとして、配列番号8に示されるフォワードプライマーと配列番号9に示されるリバースプライマーを用いてPCRを行い、EGFPタンパク質をコードする遺伝子配列の下流領域からなる配列1と、SV40ターミネータ配列と、配列番号1に示すリンカー配列と、CMVプロモータ配列と、EGFPタンパク質をコードする遺伝子配列の上流領域からなる配列2とを順次備えた非変異RNA発現用線状二本鎖DNA No.T−45を作製した。
HEK293細胞、HeLa細胞、COS−7細胞、NIH3T3細胞をそれぞれ2000細胞/wellになるように96wellプレートに播種して18時間培養後、上記で得られた線状二本鎖DNA No.T−45、T−48、T−43、T−44のそれぞれ100ngをFuGENE(登録商標)HD Transfection Reagentキット(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)により各細胞に導入し、24時間後に蛍光顕微鏡で観察した。観察結果を図13に示す。
図13より、線状二本鎖DNA No.T−44を導入したHEK293細胞、HeLa細胞、COS−7細胞、NIH3T3細胞のいずれにおいても緑蛍光が観察され、本発明の変異RNA発現用線状二本鎖DNAを細胞内にそのまま導入すると、変異を有するRNAが細胞内で発現していることが明らかとなった。また、本発明の変異RNA発現用線状二本鎖DNAを細胞に導入した場合の変異RNAの発現量は、変異を有さないRNA発現用線状二本鎖DNAを細胞に導入した場合のRNA発現量と同程度であることが確認できた。さらに、線状二本鎖DNA No.T−48を導入した各細胞においては緑蛍光が観察されなかったことから、本発明の変異RNA発現用線状二本鎖DNAを細胞に導入すると、変異が有効に機能していることが明らかとなった。
Claims (6)
- DNAを細胞内に導入し、前記DNAに対応するRNAが発現する形質転換細胞を製造する方法であって、前記細胞が哺乳動物細胞であり、前記DNAが以下の(a)〜(c)のいずれか記載の変異RNAをコードする線状二本鎖DNAであることを特徴とする形質転換細胞の製造方法。
(a)RNAをコードするDNA配列内の上流領域を欠失した下流領域からなる配列1の5’末端領域に変異を有する配列1’と、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、前記RNAをコードするDNA配列内の上流領域からなる配列2とを順次備えた変異RNAをコードする線状二本鎖DNAa;
(b)前記配列1と、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、前記配列2の3’末端領域に変異を有する配列2’とを順次備えた変異RNAをコードする線状二本鎖DNAb;(c)前記配列1’と、ターミネータ配列と、プロモータ配列と、前記配列2’とを順次備えた変異RNAをコードする線状二本鎖DNAc; - 配列1の5’末端領域が、配列1の5’末端から50塩基以内の領域であり、かつ、配列2の3’末端領域が、配列2の3’末端から50塩基以内の領域であることを特徴とする請求項1記載の形質転換細胞の製造方法。
- ターミネータ配列が、シミアンウイルス40(SV40)のターミネータ配列であることを特徴とする請求項1又は2記載の形質転換細胞の製造方法。
- プロモータ配列が、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)のプロモータ配列であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか記載の形質転換細胞の製造方法。
- 変異RNAをコードする線状二本鎖DNAが、プラスミドの複製開始点又は薬剤耐性遺伝子を含まないことを特徴とする請求項1〜4のいずれか記載の形質転換細胞の製造方法。
- 変異RNAをコードする線状二本鎖DNAの長さが200〜3000塩基であることを特徴とする請求項1〜5のいずれか記載の形質転換細胞の製造方法。
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