JP2015112086A

JP2015112086A - 形質転換細胞の製造方法

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Publication number: JP2015112086A
Application number: JP2013258265A
Authority: JP
Inventors: 美紀子中村; Mikiko Nakamura; 赤田　倫治; Tomoharu Akata; 倫治赤田; 尚司星田; Shoji Hoshida
Original assignee: Yamaguchi University NUC
Current assignee: Yamaguchi University NUC
Priority date: 2013-12-13
Filing date: 2013-12-13
Publication date: 2015-06-22

Abstract

【課題】プロモータ配列とＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列を予め連結することなく、細胞内で目的とするＲＮＡを発現可能な形質転換細胞を短時間かつ簡潔に製造する方法を提供すること。
【解決手段】プロモータ配列を有する線状二本鎖ＤＮＡ、及び、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡとを細胞内に導入することで、細胞内で目的とするＲＮＡを発現する形質転換細胞を製造する。かかる製造方法により、目的とするＲＮＡを発現する形質転換細胞を短時間かつ簡潔に製造することができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、形質転換細胞の製造方法に関し、より詳しくは、プロモータ配列からなる線状二本鎖ＤＮＡ、及び、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡを細胞内に導入し、前記ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列由来のＲＮＡを発現させる形質転換細胞の製造方法に関する。

形質転換細胞を作製して該細胞内で目的遺伝子などを発現させるには、プロモータ配列と目的遺伝子配列とターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡを作製し、かかるＤＮＡコンストラクトを、ベクターを介して細胞に導入する方法が一般的である。この方法を用いる場合には、プロモータ配列と目的遺伝子配列とターミネータ配列とを順次備えるようにＤＮＡを連結する必要がある。現在、ＤＮＡを連結するために最も一般的に用いられている手法は、ＤＮＡリガーゼを用いて、平滑末端を有するＤＮＡ分子同士又は相補的な突出末端を有するＤＮＡ分子同士を結合させるものである。

この手法を応用した形質転換細胞の作製方法として、Ｃｏｈｅｎ−Ｂｏｙｅｒ法（非特許文献１参照）が知られており、この方法では、インサートＤＮＡとベクターとをそれぞれ制限酵素で切断して精製した後にＤＮＡリガーゼによって連結して目的のコンストラクトを作製し、該コンストラクトにより大腸菌を形質転換している。しかし、Ｃｏｈｅｎ−Ｂｏｙｅｒ法においては、形質転換用のコンストラクトを作製するために制限酵素とＤＮＡリガーゼによるＤＮＡの連結という煩雑なｉｎｖｉｔｒｏ操作を必要とし、さらに、形質転換後の大腸菌コロニーの中から目的のコンストラクトを含む大腸菌を選択するために多くの時間が必要とされていた。

Ｃｏｈｅｎ−Ｂｏｙｅｒ法に代わる、制限酵素やＤＮＡリガーゼを使用しない形質転換細胞の作製方法として、ｉｎｖｉｔｒｏ相同組換え法や、ｉｎｖｉｖｏ相同組換え法が開発されている。上記ｉｎｖｉｔｒｏ相同組換え法は、特定の組換え酵素と該酵素の認識配列を使用することによりＤＮＡ分子をつなぎ合わせるものであり、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＧａｔｅｗａｙ法や、タカラバイオ社のＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング法などが知られている。しかし、これらの方法は、予め用意した線状化ベクターとインサートＤＮＡを上記特定の酵素で結合する点で本質的にはＣｏｈｅｎ−Ｂｏｙｅｒ法と大差なく、線状化ベクターの調製や大腸菌内での環状化が必要であり、さらにインサートＤＮＡの両端及びベクターに特定のＤＮＡ配列が存在する必要があった。

一方、前述のようなＤＮＡコンストラクトを、ベクターを介さずに細胞に導入して形質転換細胞を作製する方法として、プロモータ配列、目的遺伝子配列、発現マーカー及びポリアデニレーションシグナル配列から構成されるＤＮＡ断片を環状化して動物細胞に導入する方法が提案されている（特許文献１参照）。この特許文献１記載の方法を用いれば、ベクターを介さずに形質転換細胞を作製して細胞内で目的とする遺伝子を発現させることが可能となるが、各配列（プロモータ配列、目的遺伝子配列、発現マーカー、ポリアデニレーションシグナル配列）の両端に制限酵素サイト或いはアニーリング配列をそれぞれ組み込み、ＰＣＲにより上記ＤＮＡ断片を構築し、次いでその５’末端へのリン酸の付加、若しくは制限酵素により突出末端を作製してセルフライゲーションによる環状化を行う必要があった。

近年、本発明者らは、同じくベクターを介さずに形質転換細胞を作製する方法として、特定のターミネータ配列を含む高発現用リバースプライマーを用いて作製した、プロモータ配列、目的ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列、特定ターミネータ配列を順次備えた線状二本鎖ＤＮＡを動物細胞に導入する方法を提案した（特許文献２参照）。この特許文献２の方法では、制限酵素サイトやアニーリング配列を導入することなく、また煩雑な環状化操作を行うこともなく、ＰＣＲのみによってターミネータ配列をＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の下流に連結でき、得られた線状二本鎖ＤＮＡを動物細胞に導入することで形質転換細胞を得ることが可能となるが、ＰＣＲを行う際は、プロモータ配列と目的ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とを順次備えたテンプレートを予め用意する必要があるため、テンプレートがない場合やプロモータ配列を変える場合にはまだ改良されるべき点があった。

また、本発明者らは、自律複製配列を含まない２種以上の線状二本鎖ＤＮＡをクルイベロマイセス・マルシアヌスに導入し、該２種以上の線状二本鎖ＤＮＡからなるＤＮＡ連結体により発現するマーカー遺伝子の発現を指標として所望のＤＮＡ連結体を含む形質転換体を選択する形質転換酵母の製造方法を提案した（特許文献３参照）。この特許文献３の方法では、プロモータ配列とマーカーをコードする遺伝子の上流配列を順次備えた線状二本鎖ＤＮＡと、マーカーをコードする遺伝子の上流配列を欠損した配列と所望の有用物質をコードする配列を順次備えた線状二本鎖ＤＮＡとをクルイベロマイセス・マルシアヌスに導入することで、２つの線状二本鎖ＤＮＡをクルイベロマイセス・マルシアヌス内で連結させてマーカー遺伝子を発現させている。

特開２００４−１４１０２５号公報国際公開第２０１２／１４７３７０号パンフレット国際公開第２０１１／１１４６１３号パンフレット

Cohen SN et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70, 3240-3244 (1973)

本発明の課題は、プロモータ配列とＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列を予め連結することなく、細胞内で目的とするＲＮＡを発現可能な形質転換細胞を短時間かつ簡潔に製造する方法を提供することにある。

本発明者らは、前述の課題を解決すべく鋭意検討を行った中で、様々な２つの線状二本鎖ＤＮＡを作製して哺乳動物細胞に導入したところ、意外にも、プロモータ配列からなる線状二本鎖ＤＮＡ、及び、タンパク質をコードする遺伝子配列とターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡを細胞内に導入した場合において、細胞内で目的とするタンパク質が発現していることを見いだし、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、［１］プロモータ配列からなる線状二本鎖ＤＮＡ、及び、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡを細胞内に導入し、前記ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列由来のＲＮＡを発現させることを特徴とする形質転換細胞の製造方法や、［２］細胞が哺乳動物細胞であることを特徴とする上記［１］記載の形質転換細胞の製造方法に関する。

本発明によると、細胞内で遺伝子などを発現させる場合や、プロモータアッセイを行う場合や、プロモータ配列中の発現制御に関わる配列を解析する場合に、プロモータ配列と遺伝子などをコードする配列とを連結する工程や、プラスミドを作製する工程が不要となる。特に、マイクロアレイや次世代シーケンサーによるｍＲＮＡの網羅的な解析において、レポーター遺伝子を用いたプロモータ活性の検出によってｍＲＮＡの発現量を調べる場合、本発明を利用することで短時間且つ低コストでプロモータ活性の検出が可能となる点で有用である。

ＣＭＶプロモータ配列からなる線状二本鎖ＤＮＡ（ＣＭＶｐ）、分泌型ルシフェラーゼをコードする遺伝子配列とＳＶ４０ターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（Ｇｌｕｃ−Ｓｖｔｅｒ）、ＣＭＶｐ及びＧｌｕｃ−Ｓｖｔｅｒ（ＣＭＶｐ＋Ｇｌｕｃ−Ｓｖｔｅｒ）、ＣＭＶプロモータ配列と分泌型ルシフェラーゼをコードする遺伝子配列とＳＶ４０ターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（ＣＭＶｐ−Ｇｌｕｃ−Ｓｖｔｅｒ）のそれぞれをヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３細胞）に導入してルシフェラーゼ発現量を調べた結果を示す図である。横軸は導入した線状二本鎖ＤＮＡ、縦軸は分泌型ルシフェラーゼ活性（ｃｏｕｎｔｓ／ｓｅｃ／μｌ）を示す。ＣＭＶｐ、Ｇｌｕｃ−Ｓｖｔｅｒ、ＣＭＶｐ＋Ｇｌｕｃ−Ｓｖｔｅｒ、ＣＭＶｐ−Ｇｌｕｃ−Ｓｖｔｅｒのそれぞれをヒト子宮頸部類上皮腫細胞（ＨｅＬａ細胞）に導入してルシフェラーゼ発現量を調べた結果を示す図である。横軸は導入した線状二本鎖ＤＮＡ、縦軸は分泌型ルシフェラーゼ活性（ｃｏｕｎｔｓ／ｓｅｃ／μｌ）を示す。ＣＭＶｐ、Ｇｌｕｃ−Ｓｖｔｅｒ、ＣＭＶｐ＋Ｇｌｕｃ−Ｓｖｔｅｒ、ＣＭＶｐ−Ｇｌｕｃ−Ｓｖｔｅｒのそれぞれをアフリカミドリザル腎臓由来細胞（ＣＯＳ−７細胞）に導入してルシフェラーゼ発現量を調べた結果を示す図である。横軸は導入した線状二本鎖ＤＮＡ、縦軸は分泌型ルシフェラーゼ活性（ｃｏｕｎｔｓ／ｓｅｃ／μｌ）を示す。左から順に、ＣＭＶプロモータ配列の３’末端領域の６０塩基のみの配列とＧＦＰ遺伝子をコードする配列とＳＶ４０ターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（ＣＭＶｐ−６０−ＥＧＦＰ−Ｓｖｔｅｒ）、ＣＭＶｐ及びＣＭＶｐ−６０−ＥＧＦＰ−Ｓｖｔｅｒ（ＣＭＶｐ＋ＣＭＶｐ−６０−ＥＧＦＰ−Ｓｖｔｅｒ）、ＣＭＶプロモータ配列とＧＦＰ遺伝子をコードする配列とＳＶ４０ターミネータ配列を順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（ＣＭＶｐ−ＥＧＦＰ−Ｓｖｔｅｒ）をそれぞれＨＥＫ２９３細胞に導入し、４８時間後に蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。

本発明の形質転換細胞の製造方法としては、プロモータ配列からなる線状二本鎖ＤＮＡ、及び、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡを細胞内に導入し、前記ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列由来のＲＮＡを発現させる形質転換細胞の製造方法であればよく、かかる形質転換細胞の製造方法により、プロモータ配列と遺伝子などをコードする配列とを予め連結することなく、細胞内でＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列のＲＮＡを発現させることが可能となる。

本発明において、プロモータ配列としては、ＲＮＡの発現を行う目的、ＲＮＡを発現させる哺乳動物などの細胞の種類、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の種類、ターミネータ配列の種類などにより適宜選択することができるが、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ配列、ヒト伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモータ配列、シミアンウイルス（ＳＶ４０）プロモータ配列、アデノウイルス後期（Adenovirus Major Late、ＡＭＬ）のＡＭＬプロモータ配列、ＳＶ４０及びＨＴＬＶ−１ＬＴＲの融合プロモータであるＳＲαプロモータ配列、ヒトユビキチンＣプロモータ配列、α−アクチンプロモータ配列、β−アクチンプロモータ配列、Ｕ６プロモータ配列、Ｈ１プロモータ配列、テトラサイクリンによってＲＮＡ発現が抑制されるＴｅｔ−Ｏｆｆプロモータ配列、テトラサイクリンによってＲＮＡ発現が誘導されるＴｅｔ−Ｏｎプロモータ配列、亜鉛などの金属や種々の刺激により誘導されるメタロチオネインプロモータ配列、活性酸素により誘導されるＡＲＥプロモータ配列を例示することができ、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ配列をより好適に例示することができる。

本発明において、プロモータ配列からなる線状二本鎖ＤＮＡには、プロモータ配列のみからなる線状二本鎖ＤＮＡの他、形質転換細胞においてＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列のＲＮＡを発現しうる限り、プロモータの部分配列からなる線状二本鎖ＤＮＡや、プロモータ配列に塩基の置換、欠損、又は挿入を含む線状二本鎖ＤＮＡや、プロモータ配列の上流（５’末端側）又は下流（３’末端側）に任意の塩基が連結した線状二本鎖ＤＮＡも便宜上含まれるが、プロモータ配列のみからなる線状二本鎖ＤＮＡを好適に例示することができる。また、プロモータ配列からなる線状二本鎖ＤＮＡの長さ（塩基）としては、３０〜１００００塩基、好ましくは１００〜２０００塩基、より好ましくは２００〜１５００塩基を例示することができる。

本発明において、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列としては、ＲＮＡを発現しうる線状二本鎖ＤＮＡ配列であればよく、タンパク質をコードする遺伝子配列の他、ｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌｈａｉｒｐｉｎＲＮＡ）発現配列、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ）発現配列、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ）、核酸アプタマー発現配列、デゴイ発現配列、アンチセンスオリゴヌクレオチド発現配列、リボザイム発現配列などの機能性核酸を発現するＤＮＡ配列を例示することができる。そして、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列がタンパク質をコードする遺伝子配列の場合、ＲＮＡの発現はタンパク質の発現と言い換えることができる。

本発明によって製造された形質転換細胞により細胞内でタンパク質を発現させる場合は、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列として、タンパク質をコードする遺伝子配列を選択でき、タンパク質をコードする遺伝子配列としては、用途に合わせて全長の遺伝子配列でも、その一部でもよい。また、その由来はいかなる生物から単離された遺伝子でも、遺伝子工学的に作製された人工的な遺伝子でもよく、遺伝子における５’末端の開始コドン及び３’末端の停止コドンは、適宜、含んでも含まなくてもよい。

本発明によって製造された形質転換細胞により細胞内のタンパク質の発現をノックダウンする場合、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列としては、タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡの発現を抑制できるｓｈＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列や、ｓｉＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列や、アンチセンスオリゴヌクレオチド発現用ＤＮＡ配列を選択することができ、本発明によって製造された形質転換細胞により細胞内のタンパク質の活性化作用を阻害又は抑制する場合は、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列として、タンパク質の活性化作用を阻害又は抑制できる核酸アプタマー発現用ＤＮＡ配列や、リボザイム発現用ＤＮＡ配列を選択することができ、上記配列は、それぞれ標的ＲＮＡの配列や、その転写因子が結合し得る配列の情報に基づいて常法により設計することができる。

本発明において、ターミネータ配列としては、ＲＮＡの発現を行う目的、ＲＮＡ発現を行う細胞の種類、プロモータの種類、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の種類などによって適宜選択することができ、天然に存在するターミネータ配列であっても、データベース上の配列に基づいて人工的に合成したターミネータ配列であってもよい。人工的に合成したターミネータ配列を用いる場合、ＲＮＡの発現量を高める観点から、好ましくは長さ４０〜２５０塩基、より好ましくは４０〜２００塩基、さらに好ましくは６０〜１２０塩基、中でも７０〜１２０塩基からなり、１番目の塩基がＡ（アデニン）、Ｔ（チミン）、又はＧ（グアニン）であり、２番目の塩基がＡ、Ｔ、又はＧであり、３番目の塩基がＴであり、４番目の塩基がＡであり、５番目の塩基がＡであり、６番目の塩基がＡであり、７番目の塩基がＡ、Ｔ、Ｇ、又はＣ（シトシン）であり、８番目の塩基がＡ、Ｔ、Ｇ、又はＣであり、９番目の塩基がＡ、Ｇ、又はＣである、（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｔ／Ｇ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｇ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むターミネータ配列を好適に例示することができ、Ａ，（Ａ／Ｔ），Ｔ，Ａ，Ａ，Ａ，（Ａ／Ｔ／Ｇ），（Ａ／Ｇ／Ｃ），（Ａ／Ｃ）の連続した９塩基の配列を含むターミネータ配列をより好適に例示することができ、かかる連続した９塩基が１又は２以上含まれていてもよい。

このようなターミネータ配列としては、例えば、前述の特許文献２に記載された配列などの当業者に公知の配列が挙げられるが、ラビットβ−グロビン（β−ｇｌｏｂｉｎ）ターミネータ配列又はシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ターミネータ配列の一部であって上記の長さ及び配列を有するものを好ましく挙げることができ、この中から適宜選択することが好ましい。例えば、ラビットβ−グロビンターミネータ配列（配列番号１）の塩基配列における塩基番号１２１〜１９０番目、１２１〜１８０番目、１２１〜２００番目、１２１〜２２０番目、１３０〜１９０番目の各塩基配列や、ＳＶ４０ターミネータ配列（配列番号２）の塩基配列における塩基番号１３０〜２０８番目、１２１〜２２０番目、１３０〜２２０番目の各塩基配列をより好ましく挙げることができる。

また、天然に存在するターミネータ配列を用いる場合、本発明のターミネータ配列としては、ウィルスのターミネータ配列であっても、大腸菌、枯草菌などの原核生物のターミネータ配列であっても、酵母、マウス、ヒトなどの真核生物のターミネータ配列であってもよく、具体的には、ラビットβ−グロビン（β−ｇｌｏｂｉｎ）ターミネータ配列、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ターミネータ配列、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ターミネータ配列、ＨＳＶ・ＴＫターミネータ配列、ＣＹＣ１ターミネータ配列、ＡＤＨターミネータ配列、ＳＰＡターミネータ配列、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子ターミネータ配列、カリフラワー・モザイク・ウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ遺伝子のターミネータ配列、トウモロコシ由来のＺｅｉｎ遺伝子ターミネータ配列、ルビスコ小サブユニット（ＳＳＵ）遺伝子ターミネータ配列、サブクローバー・スタント・ウイルス（ＳＣＳＶ）遺伝子ターミネータ配列、ＬａｃＺアルファターミネータ配列、ｐｏｌｙＴターミネータ配列などを例示することができ、ＲＮＡの発現量を高める観点からは、好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ターミネータ配列を例示することができる。

本発明において、プロモータ配列からなる線状二本鎖ＤＮＡ、及び、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡを導入する細胞としては、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などを例示することができ、中でも哺乳動物細胞を好適に例示することができる。かかる哺乳動物細胞としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、イヌなどの哺乳動物由来の細胞であればよく、具体的にはＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＮＩＨ由来のマウス胎仔由来繊維芽細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３細胞）、ヒト骨肉腫細胞（ＨＯＳ細胞）、培養ヒト骨芽細胞（ＳａＭ−１細胞）、ヒト白血球Ｔ細胞（ｊｕｒｋａｔ細胞）、ヒト乳癌培養樹立細胞（ＭＣＦ−７細胞）、ヒト肝臓ガン由来細胞（ＨｅｐＧ２細胞）、ヒト結腸癌由来細胞（ＣａＣＯ−２細胞）、ヒト骨芽細胞（ＳａＯＳ細胞）、ヒト慢性骨髄性白血病細胞（Ｋ５６２細胞）、サル腎由来細胞（ＣＶ−１細胞）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＯＳ−１細胞）、マウス由来線維芽細胞（Ｌ９２９細胞）、マウス奇形腫細胞（Ｆ９細胞）、マウス骨芽様細胞（ＭＣ−３Ｔ３−Ｅ１細胞）、ラット副腎髄質褐色腫（ＰＣ−１２細胞）、ラット骨芽細胞様細胞（ＲＯＳ１７／２．８細胞）、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞（ＣＨＯ−Ｋ１細胞）、ハムスター腎細胞（ＢＨＫ−２１細胞）などを例示することができ、中でもＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞が好ましい。また、上記哺乳動物細胞には、株化Ｂリンパ芽球（ＥＢ３細胞）などの胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や、組織から採取した初代培養細胞も含まれる。

本発明のＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡとしては、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の下流（３’末端側）にターミネータ配列が動作可能に連結された線状二本鎖ＤＮＡであればよく、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とターミネータ配列の間、又はターミネータ配列の下流にいかなる構成因子を含んでもよく、例えば、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とターミネータ配列の間にはシグナルペプチド又はタグペプチドをコードする配列を含んでもよく、ターミネータ配列の下流にはタグペプチドをコードする配列を含んでもよい。シグナルペプチドとしては、ゴルジ体移行シグナルペプチド、細胞膜移行シグナルペプチド、ミトコンドリア移行シグナルペプチド、核移行シグナルペプチド、シナプス移行シグナルペプチド、核小体移行シグナルペプチド、核膜移行シグナルペプチド、ペルオキシソーム移行シグナルペプチドなどを好適に例示することができ、タグペプチドとしては、ＦＬＡＧタグペプチド、ＨＡタグペプチド、ＭＹＣタグペプチド、ＧＦＰタグペプチド、ＭＢＰタグペプチド、ＧＳＴタグペプチド、ＨＩＳタグ、ＳＮＡＰタグ、ＡＣＰタグ、ＣＬＩＰタグ、ＴＡＰタグ、Ｖ５タグなどを好適に例示することができる。

また、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の上流には、プロモータ配列の３’末端領域の一部の配列からなる配列を備えてもよく、かかる配列の長さとしては、１〜２００塩基を例示することができ、１〜８０塩基を好適に例示することができ、１〜６０塩基をより好適に例示することができる。

ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡを作製する方法としては特に制限されないが、例えば、前述の特許文献２に記載された当業者に公知のターミネータ配列を含む高発現用リバースプライマーを用いて作製する方法や、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とターミネータ配列とを順次備えた配列を含む二本鎖ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ法で作製する方法や、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とターミネータ配列をフュージョンＰＣＲ法（特開２００９−２６８３６０号公報）で連結して作製する方法を例示することができる。ターミネータ配列を含む高発現用リバースプライマーを用いる方法としては、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列をテンプレートとして、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の５’末端領域の配列からなるフォワードプライマーと、前述のターミネータ配列とＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の３’末端領域の配列とを順次含むＤＮＡ配列の相補配列からなるリバースプライマーを用いてＰＣＲを行う方法を例示することができる。また、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とターミネータ配列とを順次備えた配列を含む二本鎖ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ法で作製する方法としては、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡを含む線状若しくは環状の二本鎖ＤＮＡをテンプレートとして、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列の５’末端領域の配列からなるフォワードプライマーと、ターミネータ配列の３’末端領域の相補配列からなるリバースプライマーを用いてＰＣＲを行う方法を例示することができる。

プロモータ配列からなる線状二本鎖ＤＮＡ、及び、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡを細胞内に導入する方法としては、ＤＮＡを哺乳動物などの細胞内に導入する一般的な方法であればよく、リポソーム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法などを例示することができ、ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＲｅａｇｅｎｔ（登録商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（登録商標）TｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（キアゲン社製）、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）などの市販のトランスフェクション試薬並びに当技術分野で広く用いられている手法を用いることができる。

また、細胞内に導入するプロモータ配列からなる線状二本鎖ＤＮＡ、及び、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とターミネータ配列とを順次有する線状二本鎖ＤＮＡは、同時に細胞に導入してもよく、いずれか一方を先に細胞に導入し、その後、他方を前記細胞に導入してもよいが、同時に細胞内に導入することが好ましい。プロモータ配列からなる線状二本鎖ＤＮＡと、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とターミネータ配列とを順次有する線状二本鎖ＤＮＡの濃度は、形質転換細胞においてＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列のＲＮＡを発現しうる限り特に制限されないが、プロモータ配列からなる線状二本鎖ＤＮＡの濃度に対してＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とターミネータ配列とを順次有する線状二本鎖ＤＮＡの濃度が０．２〜５倍、好ましくは０．５〜２倍であることを例示することができる。

（ＣＭＶプロモータ配列からなる線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社製）をテンプレートとして、配列番号３（pEGFP-600）に示されるフォワードプライマーと、配列番号４（CMVpc）に示されるリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＣＭＶプロモータ配列からなる線状二本鎖ＤＮＡ（ＣＭＶｐ）を作製した。ＰＣＲ反応はＧＸＬポリメーラーゼ（タカラバイオ社製）を用いてその推奨プロトコールに準じて行った。それぞれの最終濃度は、テンプレート１００ｐｇ／μｌ、フォワードプライマー０．３μＭ、リバースプライマー０．３μＭに調製し、ｉｃｙｃｌｅｒサーマルサイクーラー（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて９８℃１０秒、６０℃１５秒、６８℃２分のサイクルを３０回行った。

（分泌型ルシフェラーゼをコードする遺伝子配列とターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＣＭＶ−Ｇｌｕｃ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）をテンプレートとして、配列番号５（NotI-hGluc+2529）に示されるフォワードプライマーと、配列番号６（pCMV-Gluc+1160c）に示されるリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られた線状二本鎖ＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩで消化してセルフライゲーションを行い、ＣＭＶプロモータと分泌型ルシフェラーゼをコードする遺伝子配列とＳＶ４０ターミネータ配列とを順次備えたプラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶ−Ｇｌｕｃ−Ｓｖｔｅｒ）を作製した。次に、作製したｐＣＭＶ−Ｇｌｕｃ−Ｓｖｔｅｒをテンプレートとして、配列番号７（hGLuc+1）に示されるフォワードプライマーと、配列番号８（pEGFP+1018c）に示されるリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、分泌型ルシフェラーゼをコードする遺伝子配列とＳＶ４０ターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（Ｇｌｕｃ−Ｓｖｔｅｒ）を作製した。ＰＣＲの反応条件は、前述のＣＭＶｐを作製した場合と同様である。

（ＣＭＶプロモータ配列と分泌型ルシフェラーゼをコードする遺伝子配列とターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ作製）
前述のとおり作製したｐＣＭＶ−Ｇｌｕｃ−Ｓｖｔｅｒをテンプレートとして、配列番号３（pEGFP-600）に示されるフォワードプライマーと、配列番号８（pEGFP+1018c）に示されるリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＣＭＶプロモータ配列と分泌型ルシフェラーゼをコードする遺伝子配列とＳＶ４０ターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（ＣＭＶｐ−Ｇｌｕｃ−Ｓｖｔｅｒ）を作製した。ＰＣＲの反応条件は、上記ＣＭＶｐを作製した場合と同様である。

（細胞への導入及びルシフェラーゼ活性の測定）
ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ−７細胞を２０００細胞／ｗｅｌｌになるように９６ｗｅｌｌプレートにそれぞれ播種して１８時間培養後、上記で得られたＣＭＶｐ２０ｎｇ及びＧｌｕｃ−Ｓｖｔｅｒ各２０ｎｇ（合計４０ｎｇ）、ＣＭＶｐ２０ｎｇ、Ｇｌｕｃ−Ｓｖｔｅｒ２０ｎｇ、ＣＭＶｐ−Ｇｌｕｃ−Ｓｖｔｅｒ２０ｎｇをそれぞれ、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）により各細胞に導入し、２４時間後に採取した培養上清に含まれる分泌型ルシフェラーゼをＢｉｏＬｕｘＧａｕｓｓｉａＬｕｃｉｆｅｒａｓｅａｓｓａｙｋｉｔ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）とＣｅｎｔｒｏＬＢ９６０（ベルトールド社製）を用いて測定した。ＨＥＫ２９３細胞に導入した結果を図１に、ＨｅＬａ細胞に導入した結果を図２に、ＣＯＳ−７細胞に導入した結果を図３に示す。

（結果）
図１〜３に示すように、いずれの細胞においても、ＣＭＶプロモータ配列からなる線状二本鎖ＤＮＡ（ＣＭＶｐ）のみや、分泌型ルシフェラーゼをコードする遺伝子配列とＳＶ４０ターミネータ配列をと順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（Ｇｌｕｃ−Ｓｖｔｅｒ）のみを導入した場合にはルシフェラーゼの活性が殆ど検出されなかったが、プロモータ配列からなる線状二本鎖ＤＮＡ及び分泌型ルシフェラーゼ遺伝子をコードする配列とＳＶ４０ターミネータ配列とを順次備えたＤＮＡ（ＣＭＶｐ＋Ｇｌｕｃ−ＳＶｔｅｒ）を細胞に導入した場合には、いずれの細胞に導入した場合においても、ルシフェラーゼの活性が検出され、細胞内でルシフェラーゼが発現していることが明らかとなった。上記結果により、プロモータ配列からなる線状二本鎖ＤＮＡ、及び、タンパク質をコードする遺伝子配列とターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡとをそれぞれ細胞内に導入するだけで、細胞内でタンパク質を発現する形質転換細胞を短時間かつ簡潔に製造できることが明らかとなった。

（ＣＭＶプロモータ配列からなる線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社製）をテンプレートとして、配列番号３（pEGFP-600）に示されるフォワードプライマーと、配列番号４（CMVpc）に示されるリバースプライマーを用いて実施例１と同様にＰＣＲを行い、ＣＭＶｐを作製した。

（ＣＭＶプロモータ配列の一部の配列とＧＦＰをコードする遺伝子配列とＳＶ４０ターミネータ配列を順次備えた線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社製）をテンプレートとして、配列番号９（pEGFP-60）に示されるフォワードプライマーと、配列番号８（pEGFP+1018c）に示されるリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＣＭＶプロモータ配列の３’末端領域の６０塩基のみの配列とＧＦＰ遺伝子をコードする配列とＳＶ４０ターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（ＣＭＶｐ−６０−ＥＧＦＰ−Ｓｖｔｅｒ）を作製した。ＰＣＲの反応条件は、実施例１と同様である。なお、ＣＭＶプロモータ配列の３’末端領域の６０塩基のみの配列だけでは、プロモータとしての機能を有しないことが知られている。

（ＣＭＶプロモータ配列とＧＦＰをコードする遺伝子配列とＳＶ４０ターミネータ配列を順次備えた線状二本鎖ＤＮＡの作製）
ｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クロンテック社製）をテンプレートとして、配列番号３（pEGFP-600）に示されるフォワードプライマーと、配列番号８（pEGFP+1018c）に示されるリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＣＭＶプロモータ配列とＧＦＰ遺伝子をコードする配列とＳＶ４０ターミネータ配列を順次備えた線状二本鎖ＤＮＡ（ＣＭＶｐ−ＥＧＦＰ−Ｓｖｔｅｒ）を作製した。ＰＣＲの反応条件は、実施例１と同様である。

（細胞への導入及びルシフェラーゼ発現の測定）
上記で得られたＣＭＶｐ５０ｎｇ及びＣＭＶｐ−６０−ＥＧＦＰ−Ｓｖｔｅｒ各５０ｎｇ（合計１００ｎｇ）、ＣＭＶｐ−６０−ＥＧＦＰ−Ｓｖｔｅｒ５０ｎｇ、ＣＭＶｐ−ＥＧＦＰ−Ｓｖｔｅｒ５０ｎｇをそれぞれＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて各ＨＥＫ２９３細胞に導入し、４８時間後に蛍光顕微鏡で観察した。結果を図４に示す。

（結果）
図４に示すように、ＣＭＶｐ−６０−ＥＧＦＰ−Ｓｖｔｅｒを導入した細胞では蛍光が観察されなかったが、ＣＭＶｐ及びＣＭＶｐ−６０−ＥＧＦＰ−Ｓｖｔｅｒを導入した細胞では蛍光が観察された。上記結果から、プロモータ配列からなる線状二本鎖ＤＮＡ、及び、タンパク質をコードする遺伝子配列とターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡをそれぞれ細胞に導入するだけで、細胞内でタンパク質を発現する形質転換細胞を短時間かつ簡潔に製造できることが明らかとなった。また、タンパク質をコードする遺伝子配列とターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡの上流に６０塩基の配列を有していても、細胞内でタンパク質が発現することが明らかとなった。

本発明の形質転換細胞の製造方法は、目的とするＲＮＡを発現する形質転換細胞を短時間かつ簡潔に製造することができるものであり、細胞内で遺伝子などを発現させる場合や、プロモータアッセイを行う場合や、プロモータ配列中の発現制御に関わる配列を解析する場合において産業上の有用性は高い。

Claims

プロモータ配列からなる線状二本鎖ＤＮＡ、及び、ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列とターミネータ配列とを順次備えた線状二本鎖ＤＮＡを細胞内に導入し、前記ＲＮＡ発現用ＤＮＡ配列由来のＲＮＡを発現させることを特徴とする形質転換細胞の製造方法。
細胞が哺乳動物細胞であることを特徴とする請求項１記載の形質転換細胞の製造方法。