CN117821506A - 一种转基因质粒及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种了转基因质粒及其构建方法，所述转基因质粒为含有新的增强子或者新的启动子，或者新的增强子与新的启动子组合的质粒，该质粒可以用于表达该质粒可构建全长mRNA转基因鼠，尤其适用于基因治疗领域的新药研发；此类特殊修饰的质粒，避免质粒DNA被小鼠体内核酸酶降解，利用此质粒能建立稳定表达的IVH(In Vivo Humanization)转基因鼠平台，能有效的提高制备小鼠肝脏稳定表达人源化基因，能实现各种人类肝脏基因引起疾病的高效和经济的人源化小鼠的建模。

Description

一种转基因质粒及其构建方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种特殊修饰的质粒及其构建方法，以及该质粒的应用。
背景技术
以下的背景技术介绍仅仅是一些背景常识的介绍，不会对本发明构成任何限制。
人类疾病的发生发展机制复杂，以人类细胞株进行的体外实验，虽然能了解不同分子之间的相互作用，信号通路涉及的分子，然而无法反映人类疾病的致病性和疾病的发生发展。动物模型的体内实验，能通过动物的表型、体重、病徵、生化指标、mRNA和蛋白表达等，反映人类疾病的致病因子和疾病的发生发展的关系，以及药物的治疗效果。动物模型当中，非人灵长类与人类的基因最相似，应是最理想的动物模型，然而实验成本昂贵；小鼠则是较经济的动物模型，然而存在的问题是，小鼠基因组与人类基因组的蛋白质编码区域平均85％相同，某些基因的一致性最高约99％，这对于蛋白药物此类胺基酸层次的研发影响比较小，但是对于对基因一致性有严格要求的小核酸类药物研发则无法满足。因此人源化小鼠模型，是药物临床前开发过程中重要研究工具。
目前，建立人源化小鼠模型的常用方法有以下几种：基因敲入人源化的转基因小鼠、通过AAV建立人源化的小鼠模型、通过IVH建立人源化的小鼠模型等。
基因敲入人源化的转基因小鼠。CRISPR-Cas9基因编辑技术的应用，将小鼠內源基因的基因组DNA替换为人源同源基因的基因组DNA，有时基因仅替换部分外显子并非全长；或是直接插入人源cDNA的策略。CRISPR介导同源重组技术的出现，提高了敲入外源DNA时的靶向性和成功率，因而可以直接进行受精卵注射，减少了筛选ES细胞克隆所需的时间和资源，加速了基因敲入人源化的转基因小鼠的构建，然而构建一个小鼠模型一般仍需要6-9个月，后续传统或IVF扩繁到足量小鼠供应实验，累计共需1年时间，相当耗时且成本高昂。此外，某些基因敲入人源化的转基因小鼠只表达某几个外显子，以表达外泌或膜外部分蛋白；甚至做了密码子优化，以更好地表达蛋白，并不适用于对核苷酸一致性严苛要求的小核酸药物体内筛选和评价。
通过AAV建立人源化的小鼠模型。通过将少于3.5Kb长度的人源化基因构建在AAV表达质粒、AAV辅助质粒以及AAV Rep-Cap血清型特异性质粒，进行三质粒转染到细胞中，包装病毒。收集的AAV病毒液进行纯化、浓缩以及病毒滴度检测。AAV以尾静脉注射感染小鼠造模，一般两周后能表达人源化基因。AAV的优势在于不同的血清型具备不同组织器官的特异性，例如AAV8对肝细胞具有更高的亲和力，AAV8与AAV2相较可以将3～4倍高的外源基因转导入肝细胞；尾静脉注射后，AAV8可在小鼠肝脏中转导多达90～95％的肝细胞。然而，AAV只能暂时性表达无法传代，而且包AAV病毒和纯化等技术门槛较高，对生物安全等级有要求，超离等仪器设备成本高，也需要一定的时间。
IVH转基因鼠模型。利用小鼠尾静脉流体力学注射(hydrodynamic injection或hydrodynamic gene delivery)，通过快速将大量液体注入血管中产生的动态压力的物理力来透化细胞膜并促进细胞内基因转移。IVH方法是在2～12秒的时间范围内，将表达人源化基因的质粒DNA，通过小鼠尾静脉注射入相当于小鼠体重的5～15％的溶液体积，由于注射引起的巨大水动力，肝孔扩大，使遗传物质进入肝细胞。一旦传递的遗传物质进入肝细胞，水动力压力减弱，肝孔闭合，遗传信息被留在细胞内。IVH建立人源化的小鼠模型，在小鼠肝脏表达人源化药物靶标，能极大提升药物疗效的效果评估，尤其适合于基因治疗领域药物的新药开发。与其他更为复杂的人源化小鼠模型相比，IVH建立人源化的小鼠模型可以大幅降低研发成本；并且在数周内完成建模，大量地缩短研发时间。
基于IVH途径建立的人源化小鼠模型在人类疾病的发病机理和基因治疗中发挥着不可估量的巨大作用，但是质粒DNA被小鼠体内核酸酶大量降解，最终能在肝脏组织表达的外源基因效率低，基因表达时间短稳定度差，这是束缚IVH建立人源化小鼠模型技术发展的主要因素。
这就需要对现有的IVH途径进行改进，克服现有技术的一些技术缺陷。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种含有新的增强子或者新的启动子，或者新的增强子与新的启动子组合的的质粒，该质粒可以用于表达该质粒可构建全长mRNA转基因鼠，尤其适用于基因治疗领域的新药研发。此类特殊修饰的质粒，避免质粒DNA被小鼠体内核酸酶降解，利用此质粒能建立稳定表达的IVH(In Vivo Humanization)转基因鼠平台，能有效地提高制备小鼠肝脏稳定表达人源化基因，能实现各种人类肝脏基因引起疾病的高效和经济的人源化小鼠的建模。
一方面，本发明提供了一种质粒载体，所述的载体包括增强子，所述的增强子的序列为SEQ NO：2所示的序列。
进一步地，所示的增强子序列的经甲基化修饰。
进一步地，所述的修饰比例为大于60％。
进一步地，所述的修饰比例为90％。
进一步地，增强子的序列中的胞嘧啶经过甲基化修饰。
进一步地，所述的修饰比例为90％。
因此，本发明提供了一种质粒载体，所述的载体包括增强子，所述的增强子的序列为MersI和MersIII组成的增强子。在一些方式中，所述MersI和MersIII组成的增强子为SEQNO：2所示的序列。在一些方式中，所示的增强子序列的经甲基化修饰，可以对胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤进行甲基化修饰。修饰的方式可以采用酶的方式或者基因合成的过程进行修饰。这里的甲基化修饰可以胞嘧啶上的修饰，修饰的比例大于60％，例如修饰比例为65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，100％中的任何一种修饰比例。
在一些方式中，增强子的序列中的胞嘧啶经过甲基化修饰，修饰的比例为大于60％，如修饰比例为65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，100％中的任何一种修饰比例。
进一步地，所述的载体还包括启动子，所述的启动子连接在增强子的3’端，所述的启动子选自-282/+36(长318nt)(SEQ NO：8)、ALB启动子-203/+25(长228nt)(SEQ NO：7)或者ALB启动子-170/+22(长192nt)(SEQ NO：6)中的任意一种。
进一步地，所述启动子的序列为SEQ NO：6所示的序列。
第二方面，本发明提供了一种质粒载体，所述的载体包括启动子，所述的启动子的序列为-282/+36(长318nt)(SEQ NO：8)、ALB启动子-203/+25(长228nt)(SEQ NO：7)或者ALB启动子-170/+22(长192nt)(SEQ NO：6)所示的序列。
进一步地，所述启动子的序列为SEQ NO：6所示的序列。
进一步地，所述的载体还包括在启动子的5’端连接有增强子，所述的增强子的序列为SEQ NO：1或者SEQ NO：2所述的序列。
第三方面，本发明提供了一种质粒载体，所述的载体从5’到3’端依次包括增强子以及启动子，所述的增强子的序列为SEQ NO：1或者SEQ NO：2所示的序列；启动子的序列为SEQ NO：6所示的序列。
进一步地，所述的增强子包括MersI和MersIII。
进一步地，所述的载体中还包括目的基因，该目的基因为希望在小鼠体内表达的基因。
进一步地，所述的目的基因包括P基因、PCSK9基因。
第四方面，本发明提供了一种小鼠，其中所述的小鼠包括如上任意一种实施方式所述的质粒载体。
进一步地，所述的质粒载体是经过去内毒素处理的质粒载体。
在一些方式中，所述的质粒载体包括人源目的基因，希望在小鼠体内表达的人源目的基因。
在一些方式中，所述的人源目的基因为P基因(SEQ NO：10)或者含有UTR序列的P基因(SEQ NO：9)。
在一些方式中，所述的5’端UTR序列如SEQ NO：11所示的序列，3’端的UTR序列如SEQ NO：12所示的序列。
在一些方式中，所述的PCSK9基因如SEQ NO：14(只含CDS不含UTR)或者序列SEQNO：13(含有UTR序列)所述的基因序列。在一些方式中，所述的质粒是经过去内毒素处理的质粒。在一些方式中，PCSK9基因的5’端UTR序列如SEQ NO：15所示的序列，3’端的UTR序列如SEQ NO：16所示的序列。
在一些方式中，所述的人源目的基因为含有UTR序列的S基因(SEQ NO：17)或者不含有UTR序列的S基因(SEQ NO：18)。在一些方式中S基因的所述的5’端UTR序列如SEQ NO：19所示的序列，3’端的UTR序列如SEQ NO：20所示的序列。
本发明的第五方面，提供一种制备含有前述质粒载体的小鼠，所述的方法包括：提供前述所述的质粒载体；提供小鼠；以5％葡萄糖水溶液(D5W)为溶剂，配制人源化目的P基因-pIVHmL质粒DNA注射液总体积为体重的10％、12％或15％，对小鼠进行静脉注射。在一些方式中，每只小鼠拟注射总体积为体重的12％液体，以D5W为溶剂，配制人源化目的基因-pIVHmL质粒DNA的量为10μg、20μg或30μg。在一些方式中，所述的质粒是经过去内毒素处理的质粒。
本发明的第六方面，所述的增强子或者启动子在用于制备用于转基因小鼠的质粒试剂的用途，所述的增强子为MersI和MersIII组成的增强子。在一些方式中，所述的增强子为SEQ NO：2所示的序列。在一些方式中，所述的启动子为-282/+36(长318nt)(SEQ NO：9)、ALB启动子-203/+25(长228nt)(SEQ NO：10)或者ALB启动子-170/+22(长192nt)(SEQ NO：8)中的任意一种。在一些方式中，所述的启动子为SEQ NO：6所示的序列。
有益效果
本发明构建过程简单、经济、有效且稳定表达于小鼠肝脏的质粒，该质粒可构建全长mRNA转基因鼠，尤其适用于基因治疗领域的新药研发。此类特殊修饰的质粒，避免质粒DNA被小鼠体内核酸酶降解，利用此质粒能建立稳定表达的IVH(In Vivo Humanization)转基因鼠平台，能有效的提高制备小鼠肝脏稳定表达人源化基因，能实现各种人类肝脏基因引起疾病的高效和经济的人源化小鼠的建模。
附图说明
图1：通过AFP增强子的组合和甲基化修饰比较在4周内小鼠肝脏的人源化PCSK9基因mRNA表达量。
图2：通过AFP增强子和ALB启动子长短的组合比较在4周内小鼠肝脏的人源化PCSK9基因mRNA表达量。
图3：高效建立IVH小鼠模型质粒pIVHmL的图谱。
图4：针对不同注射体积IVH建立人源化P基因-pIVHmL小鼠模型且比较在4周内小鼠肝脏的人源化P基因mRNA表达量。
图5：针对不同质粒DNA的量IVH建立人源化P基因-pIVHmL小鼠模型且比较在小鼠肝脏的人源化P基因mRNA表达量。
图6：针对质粒DNA去内毒素与否建立人源化P基因-pIVHmL小鼠模型且比较在4周内小鼠肝脏的人源化P基因mRNA表达量。
图7：通过IVH建立人源化P基因-pIVHmL小鼠模型其肝脏的人源化P基因mRNA持续表达8周。
图8：高效建立含有报导S基因的IVH小鼠模型，其质粒pIVHmL-S图谱。
图9：通过质粒pIVHmL-S建立IVH小鼠模型的展示。
详细说明
下面对本发明涉及的结构或这些所使用的技术术语做进一步的说明，如果没有特备指明，按照本领域的通用的一般术语进行理解和解释。
定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语所具有的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同。以下参考文献为本领域技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义：生物化学与分子生物学词典(Dictionary of Biochemistryand Molecular Biology)，(第2版)J.Stenesh(编著)，Wiley-Interscience(1989)；微生物学与分子生物学词典(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology)(第3版)，P.Singleton和D.Sainsbury(编著)，Wiley-Interscience(2007)；钱伯斯科技词典(Chambers Dictionary of Science and Technology)(第2版)，P.Walker(编著)，Chambers(2007)；遗传学词汇(Glossary of Genetics)(第5版)，R.Rieger等(编著)，Springer-Verlag(1991)；以及哈珀柯林斯生物学词典(The HarperCollins Dictionaryof Biology)，W.G.Hale和J.P.Margham，(编著)，HarperCollins(1991)。
尽管与本文所描述的类似或等效的任何方法和组合物可用于本发明的实践或检验，但本文描述了优选的方法和组合物。出于本发明的目的，下面为了清楚和便于参考起见对以下术语加以定义：根据长期以来的专利法惯例，当在本申请包括权利要求书中使用不带数量指示的指称物时，表示“一或多”。术语“约”和“近似”用于本文中时是可互换的，并且一般应理解为是指一个给定数字周围的数字范围，以及所叙述的数字范围内的所有数字(例如，“约5至15”意味着“约5至约15”，除非另有说明)。此外，本文中的所有数值范围应理解为包括该范围内的各个整数。
用于本文时，术语“缓冲剂”包括一种或多种组合物或其水溶液，当将酸或碱添加到包含所述缓冲剂的溶液或组合物中时，所述缓冲剂抵抗pH的波动。这种对pH变化的抗性是由于这种溶液的缓冲性质，并且可以是包含在所述组合物中的一种或多种特定化合物的功能。因此，表现出缓冲活性的溶液或其他组合物被称为缓冲剂或缓冲溶液。缓冲剂一般不具有无限的维持溶液或组合物的pH的能力；而是，它们通常能够将pH维持在一定范围内，例如约5至7的pH。
用于本文时，术语“DNA区段”是指已经从特定物种的总基因组DNA分离出来的DNA分子。因此，使用本文公开的组合物之一从生物样品获得的DNA区段是指一种或多种已经从从其获得它们的特定物种的总基因组DNA中分离出来或纯化出来的DNA区段。术语“DNA区段”内包括DNA区段和这种区段的较小片段，以及重组载体，包括例如质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。
术语“例如”用于本文时仅用于举例而非意图限制，并且不应被解释为仅仅是指在说明书中明确列举的那些项。用于本文时，术语“质粒”或“载体(vector)”是指由遗传物质(即核酸)组成的遗传构建体。通常，质粒或载体含有在细菌宿主细胞、例如大肠杆菌中有功能的复制起点，以及用于检测包含所述质粒的细菌宿主细胞的选择性标志。本发明的质粒和载体可包括一个或多个如本文所述的遗传元件，安排所述遗传元件使得插入的编码序列可在合适的表达细胞中转录和翻译。另外，所述质粒或载体可包括一个或多个核酸区段、基因、启动子、增强子、激活子、多克隆区或其任何组合，包括从一种或多种天然和/或人工来源获得或衍生的区段。
用于本发明的探针和引物可具有任何合适的长度。通过为序列分配数值，例如，第一个残基是1，第二个残基是2等，可以提出限定给定序列内含有的所有探针或引物的算法：n至n+y，其中n是从1到序列的最后一个数的整数，y是探针或引物的长度减去1，其中n+y不超过序列的最后一个数。因此，对于25个碱基对的探针或引物(即“25聚体”)而言，探针或引物的集合在序列的整个长度上对应于碱基1至25、碱基2至26、碱基3至27、碱基4至28等等。类似地，对于35个碱基对的探针或引物(即“35聚体”)而言，示例性的引物或探针序列包括但不限于在序列的整个长度上对应于碱基1至35、碱基2至36、碱基3至37、碱基4至38等等的序列。同样地，对于40聚体而言，这样的探针或引物可以对应于从第一个碱基对到bp 40、从序列的第二个bp到bp 41、从第三个bp到bp 42等等的核苷酸，而对于50聚体而言，这样的探针或引物可以对应于从bp 1至bp 50、从bp 2至bp 51、从bp 3至bp 52、从bp 4至bp 53延伸的核苷酸序列等。
UTR序列
3’-非翻译区(3’-UTR)：通常，术语“3’-UTR”是指人工核酸分子的一部分，其位于可读框的3’(即“下游”)，并且其不翻译为蛋白。通常，3’-UTR是mRNA的蛋白编码区(可读框(ORF)或编码序列(CDS))和聚腺苷酸序列之间的mRNA的一部分。在本发明的情况中，术语3’-UTR还可以包含这样的元件，其不在模板中编码，RNA由其转录，但在成熟过程中在转录后添加，例如聚腺苷酸序列。mRNA的3’-UTR不翻译为氨基酸序列。3′UTR序列通常由在基因表达过程中被转录为各自的mRNA的基因编码。基因组序列首先转录为包含任选内含子的成熟前mRNA。成熟前mRNA随后在成熟过程中进一步被加工为成熟mRNA。该成熟过程包含以下步骤：5′加帽、剪接成熟前mRNA以切除任选内含子和3′末端修饰(如成熟前mRNA 3′末端的聚腺苷酸化和任选的核酸内切酶/或核酸外切酶切割等)。在本发明范围内，3′-UTR对应于位于蛋白编码区终止密码子，优选紧接蛋白编码区终止密码子的3′端和mRNA的聚腺苷酸序列之间。术语“对应于”意为3′-UTR序列可以是如用于限定3′-UTR序列的mRNA序列中的RNA序列，或对应于此RNA序列的DNA序列中。在本发明范围内，术语“基因的3′-UTR”，为对应于源自该基因的成熟mRNA的3′-UTR的序列，所述成熟mRNA即通过基因转录和成熟前mRNA的成熟获得的mRNA。术语“基因的3′-UTR”包括3′-UTR的DNA序列和RNA序列(正义和反义链二者以及成熟和未成熟的二者)。优选3′UTR具有多于20，30，40或50个核苷酸的长度。3′-非翻译区(3′UTR)：3′UTR典型地是mRNA的一部分，其位于mRNA的蛋白编码区(即可读框)和多聚腺苷酸序列之间。mRNA的3′UTR不翻译为氨基酸序列。在本发明范围内，3′UTR对应于位于蛋白编码区终止密码子的3′端，优选紧接蛋白编码区终止密码子的3′端，并且向多聚腺苷酸序列的5′侧，优选向紧接多聚腺苷酸序列的5′侧的核苷酸延伸的成熟mRNA序列。术语“对应于”意为3′UTR序列可以是如用于限定3′UTR序列的mRNA序列中的RNA序列，或对应于此RNA序列的DNA序列中。在本发明范围内，术语“基因的3′UTR”，如“白蛋白基因的3′UTR”，为对应于源自该基因的成熟mRNA的3′UTR的序列，所述成熟mRNA即通过基因转录和成熟前mRNA的成熟获得的mRNA。术语“基因的3′UTR”包括3′UTR的DNA序列和RNA序列。
5’-非翻译区(5’-UTR)：通常，术语“5’-UTR”是指人工核酸分子的一部分，其位于可读框的5’(即“上游”)，并且其不翻译为蛋白。5’-UTR通常理解为信使RNA(mRNA)的特定区段，所述信使RNA位于mRNA的可读框的5’。通常，5’-UTR在转录起始位点起始并且在可读框的起始密码子之前的一个核苷酸处终止。优选地，所述5’UTR具有多于20，30，40或50个核苷酸的长度。5’-UTR可以包含用于控制基因表达的元件，也称为调控元件。所述调控元件可以是例如核糖体结合位点。5’-UTR可以被转录后修饰，例如通过加入5’-帽修饰。mRNA的5’-UTR不翻译为氨基酸序列。5’-UTR序列通常由基因表达过程中转录为各个mRNA的基因编码。基因组序列首先转录为成熟前mRNA，其包含任选的内含子。成熟前mRNA然后在成熟过程中进一步加工为成熟mRNA。该成熟过程包括以下步骤：5′加帽、剪接成熟前mRNA以切除任选内含子和3′末端修饰(如成熟前mRNA 3′末端的聚腺苷酸化和任选的核酸内切酶/或核酸外切酶切割等)。在本发明范围内，5′-UTR对应于位于起始密码子和例如5’-帽之间的成熟mRNA序列。优选地，5′-UTR对应于从位于5′帽的3′侧的核苷酸，更优选从紧邻5′帽的3′侧核苷酸，向位于蛋白编码区起始密码子5′侧的核苷酸，优选向紧接蛋白编码区起始密码子5′侧的核苷酸延伸的序列。紧接成熟mRNA 5′帽的3′侧的核苷酸典型地对应于转录起始位点。术语“对应于”意为5′-UTR序列可以是如用于限定5′-UTR序列的mRNA序列中的RNA序列，或与此RNA序列对应的DNA序列。在本发明范围内，术语“基因的5′-UTR”，是对应于源自该基因的成熟mRNA的5′-UTR的序列，所述成熟mRNA即通过基因转录和成熟前mRNA的成熟获得的mRNA。术语“基因的5′-UTR”包括5′-UTR的DNA序列和RNA序列(正义和反义链以及成熟和未成熟的二者)。
本发明涉及人工核酸分子，其包含可读框ORF，3’-非翻译区元件(3’-UTR元件)和/或5’-非翻译区元件(5’-UTR元件)和任选的聚腺苷酸序列和/或聚腺苷酸化-信号。
本发明还涉及包含3’-UTR元件和/或5’-UTR元件的载体，涉及包含所述人工核酸分子或所述载体的细胞，涉及包含所述人工核酸分子或所述载体的药物组合物，以及涉及包含所述人工核酸分子，所述载体和/或所述药物组合物的试剂盒，优选用于基因治疗和/或基因接种疫苗的领域。
作为mRNA稳定化的备选方案，已经发现天然存在的真核mRNA分子含有特征稳定化元件。例如，它们可以包含在其5＇末端(5＇-UTR)和/或在其3＇末端(3＇-UTR)的所谓非翻译区(UTR)以及其它结构特征，如5＇帽结构或3＇-聚腺苷酸尾。5＇-UTR和3＇-UTR二者都典型地从基因组DNA转录并且因此是成熟前(premature)mRNA元件。在mRNA加工过程中，成熟mRNA的特有结构特征，如5＇帽和3＇-聚腺苷酸尾(也称为多聚腺苷酸尾或聚腺苷酸序列)通常被添加于转录的(成熟前)mRNA。
3＇-聚腺苷酸尾典型地是添加在转录的mRNA的3＇末端的一段单调腺苷核苷酸序列。其可以包含至多约400个腺苷核苷酸。发现此种3＇-聚腺苷酸尾的长度对于个体mRNA的稳定性是可能的关键要素。此外，已显示α-球蛋白mRNA的3＇UTR可能是对于公知的α-球蛋白mRNA稳定性的重要因素(Rodgers等人，Regulatedα-globin mRNA decay is acytoplasmic eventproceeding through 3＇-to-5＇exosome-dependent decapping，RNA，8，第1526-1537页，2002)。α-球蛋白mRNA的3＇UTR明显参与特定核蛋白-复合物(α-复合物)的形成，其存在与mRNA体外稳定性相关(Wang等人，An mRNA stability complexfunctions with poly(A)-binding protein to stabilize mRNA in vitro，Molecularand Cellular biology，第19卷，第7期，1999年7月，第4552-4560页)。对于核糖体蛋白mRNA中的UTR已经进一步表明有趣的调节功能：在核糖体蛋白mRNA的5’-UTR控制生长相关的mRNA翻译的同时，该调节的严格性由核糖体蛋白mRNA中的各个3’-UTR赋予(Ledda等人，Effect of the 3’-UTR length on the translationalregulation of 5’-terminaloligopyrimidine mRNAs，Gene，第344卷，2005，p.213-220)。该机制促进核糖体蛋白的特异表达，所述核糖体蛋白通常以恒定的方式转录从而一些核糖体蛋白mRNA如核糖体蛋白S9或核糖体蛋白L32称为看家基因(Janovick-Guretzky等人，Housekeeping Gene Expressionin Bovine Liver is Affected by PhysiologicalState，Feed Intake，and DietaryTreatment，J.Dairy Sci.，Vol.90，2007，p.2246-2252)。核糖体蛋白的生长相关的表达模式因此主要是由于对翻译水平的调节。
术语“3’-UTR元件”是指包含源自3’-UTR或源自3’-UTR的变体或片段的核酸序列或由源自3’-UTR或源自3’-UTR的变体或片段的核酸序列组成的核酸序列。“3’-UTR元件”优选是指人工核酸序列，如人工mRNA的3’-UTR包含的核酸序列。因此，在本发明的意义中，优选地，3’-UTR元件可以由mRNA，优选人工mRNA的3’-UTR包含，或3’-UTR元件可以由各自的转录模板的3’-UTR包含。优选地，3’-UTR元件是对应于mRNA的3’-UTR，优选人工mRNA，如通过转录基因改造的载体构建体获得的mRNA的3’-UTR的核酸序列。优选地，本发明的意义中的3’-UTR元件作为3’-UTR行使功能或编码执行3’-UTR的功能的核苷酸序列。
因此，术语“5’-UTR元件”是指包含源自5’-UTR或5’-UTR的变体或片段的核酸序列或由源自5’-UTR或5’-UTR的变体或片段的核酸序列组成的核酸序列。“5’-UTR元件”优选是指人工核酸序列，如人工mRNA的5’-UTR包含的核酸序列。因此，在本发明的意义中，优选地，5’-UTR元件可以由mRNA，优选人工mRNA的5’-UTR包含，或5’-UTR元件可以由各自的转录模板的5’-UTR包含。优选地，5’-UTR元件是对应于mRNA的5’-UTR，优选人工mRNA，如通过转录基因改造的载体构建体获得的mRNA的5’-UTR的核酸序列。优选地，本发明的意义中的5’-UTR元件作为5’-UTR行使功能或编码执行5’-UTR的功能的核苷酸序列。
根据本发明的人工核酸分子中的3’-UTR元件和/或5’-UTR元件延长和/或增加从所述人工核酸分子的蛋白生产。因此，根据本发明的人工核酸分子可以尤其包含一下一种或者几种功能的3’-UTR元件和/或5’-UTR元件：增加从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件，延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件，增加和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件，增加从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件，延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件，增加和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件，增加从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件和增加从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件，增加从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件，增加从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件和增加和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件，延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件和增加从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件，延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件，延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件和增加和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件，增加和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件和增加从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件，增加和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件，或增加和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件和增加和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件。优选地，根据本发明的人工核酸分子包含延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件和/或增加从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件。优选地，根据本发明的人工核酸分子包含至少一个3’-UTR元件和至少一个5’-UTR元件，即延长和/或增加从所述人工核酸分子的蛋白生产并且源自稳定mRNA的至少一个3’-UTR元件和延长和/或增加从所述人工核酸分子的蛋白生产并且源自稳定mRNA的至少一个5’-UTR元件。“延长和/或增加从所述人工核酸分子的蛋白生产”通常是指与从缺少3’-UTR和/或5’-UTR或包含参比3’-UTR和/或参比5’-UTR(如天然与ORF组合存在的3’-UTR和/或5’-UTR)的各个参比核酸产生的蛋白的量相比，从具有各个3’-UTR元件和/或5’-UTR元件的根据本发明的人工核酸分子产生的蛋白的量。尤其是，与缺少3’-UTR和/或5’-UTR或包含参比3’-UTR和/或5’-UTR，如天然与ORF组合存在的3’-和/或5’-UTR的各个核酸相比，根据本发明的人工核酸分子的至少一个3’-UTR元件和/或5’-UTR元件延长从根据本发明的人工核酸分子，例如从根据本发明的mRNA的蛋白生产。尤其是，与缺少3’-和/或5’-UTR或包含参比3’-和/或5’-UTR，如天然与ORF组合存在的3’-和/或5’-UTR的各个核酸相比，根据本发明的人工核酸分子的至少一个3’-UTR元件和/或5’-UTR元件增加从根据本发明的人工核酸分子，例如从根据本发明的mRNA的蛋白生产，尤其是蛋白表达和/或总蛋白生产。优选地，与缺少3’-UTR和/或5’-UTR或包含参比3’-UTR和/或参比5’-UTR，如天然与ORF组合存在的3’-UTR和/或5’-UTR的各个核酸的翻译效率相比，根据本发明的人工核酸分子的所述至少一个3’-UTR元件和/或所述至少一个5’-UTR元件不消极影响核酸的翻译效率。甚至更优选地，与其天然情况下各个ORF编码的蛋白的翻译效率相比，翻译效率由3’-UTR和/或5’-UTR增强。本文中使用的术语“各个核酸分子”或“参比核酸分子”意为-除不同3’-UTR和/或5’-UTR之外-参比核酸分子是与包含3’-UTR元件和/或5’-UTR元件的本发明的人工核酸分子相当的，优选相同的。
具体实施方式
实施例子1.1：设计鼠源嵌合增强子和修饰，构建高效建立IVH小鼠模型的pIVHmL 质粒(含有常规TBG启动子：(SEQ NO：5))
通过AFP增强子MersII(SEQ NO：1)单独；MersI和MersIII(SEQ NO：2)的组合；以及MersI和MersIII的组合情况下再经过胞嘧啶经甲基化修饰(5mC)，以MersII(SEQ NO：1)为一倍作为基数比较在4周内小鼠肝脏的人源化PCSK9基因，包含5’UTR和3’UTR序列在内的(SEQ NO：13)mRNA表达量。
m5c的化学结构如下：
修饰的方法可以是，一般短链使用含有m5c单体直接合成，合成可以委托第三方专业机构合成，长链的话可能使用对应的甲基化酶。这些都是现有技术传统的方法而获得。本实施例子中，在SEQ NO：2序列中有95％的胞嘧啶经甲基化修饰。
具体过程如下：
1、通过体外合成获得MersI和MersIII(SEQ NO：2)组合的序列(未经过修饰)；通过上述方法获得95％的胞嘧啶经甲基化修饰的序列；以及单独的MersII(SEQ NO：1)(未经过修饰)。
2、含有增强体序列的pIVHmL质粒：通过体外基因合成上述的增强子或增强子加上启动子的序列，本发明采用三种增强体+启动子TBG，再通过AseI和KpnI酶切位点让质粒带上上述的不同的增强子序列，从而获得不同的pIVHmL质粒。具体操作方法都是本领域的一般技术人员按照质粒的操作方法都可以实现的。
3、PCSK9基因获得
3.1：以人PCSK9基因(Genebank ID：NM_001407241.1)为参考序列，设计以下引物，大写英文字GGCGCGCC和CTCGAG分别是AscI和XhoI的酶切序列。
正向：5’-agcaGGCGCGCCatgggcaccgtcagctcc-3’SEQ NO：21
反向：5’-gttaCTCGAGttaggacaacgtttgtttgttttta-3’SEQ NO：22
3.2：PCR扩增人PCSK9基因体系为：10X PCR buffer 2μl；dNTPs(10mM)0.4μl；MgSO4(25mM)0.8μl；正向引物(10μM)0.6μl；反向引物(10μM)0.6μl；含有人PCSK9基因的模版1μl；TOYOBO KOD Plus DNA Polymerase(1U/μl)0.4μl；补水至总体积20μl。
在PCR仪中按以下程序运行：94℃，5min；35个循环：94℃，30sec；62℃，30sec；68℃，1min；68℃，10min；4℃，终止程序，获得扩增产物(SEQ NO：14)。
3.3、酶切体系：10×NEB CutSmartbuffer10μl；AscI和XhoI各5μl；人PCSK9基因PCR扩增的产物10μl，获得不含酶切位点的目的基因片段。在扩增产物上的5’以及3‘端分别连接5’UTR(SEQ NO：15)和3’UTR(SEQ NO：16)，获得(SEQ NO：13)。酶切后跑0.8％Agarose胶，从胶体挖下预期片段，用胶回收试剂盒回收(逗点生物，MNP003-1)。
3.4、连接体系：酶切后的PCR产物3μl(SEQ NO：13)；酶切线性化的含有不同增强子的质粒：MersI和MersIII组合(不修饰)、MersI和MersIII(修饰)、MersII(不修饰)的载体DNA各1μl；5×Ligation buffer 2μl；T4DNA Ligase(3units/μl)1μl；补水至总体积10μl；16℃水浴1h。
3.5、将上述步骤得到的连接产物(三种不同的质粒)转化JM109感受态细胞(淼灵生物，G0005)，涂布于Kan+的LB平板，挑取阳性克隆接菌，37℃摇床摇菌过夜，质粒抽提试剂盒(逗点生物，MNP001-4)提取质粒并进行测序鉴定，得到人PCSK9基因-pIVHmL质粒(含有目标基因的三种质粒)。
4、转化小鼠的制备以及肝脏中表达水平结果：
6周龄BALC/c雄性小鼠标记和称重。每只小鼠拟注射总体积为体重的12％液体，以D5W为溶剂，配制人源化PCSK9基因-pIVHmL三种不同质粒DNA的量为10μg。肝脏取样、RNA提取和RT参见具体实施例子2的方法。
qPCR检测小鼠肝脏的人源化PCSK9基因mRNA表达量
(1)人类PCSK9基因的引物序列
正向：5’-GCAGGTTGGCAGCTGTTTTGC-3’SEQ NO：23
反向：5’-CTGCTTTAGAATGGGCTCCATGC-3’SEQ NO：24
(2)作为内参的小鼠GAPDH的引物序列
正向：5’-CATCACTGCCACCCAGAAGACTG-3’SEQ NO：25
反向：5’-ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3’。SEQ NO：26
分别考察三种不同质粒在1-7天，以及2-4周在肝脏中PCSK9基因的mRNA的表达量的变化。
其结果表明：MersI和MersIII的组合是比MersII单独作为增强子在第1天、第4天和第7天(1D、4D和7D)更好，经过分析，具有显著差异(P小于0.01)，但第2周(W表示week，周的意思)以后也有差异，具有统计学意义上的差异(P小于0.05)，数据显示MersI和MersIII的组合建模一周内较MersII高表达2-5倍，但4周后就被核酸酶清除了。这说明，MersI和MersIII的组合作为增强子可以增加P基因在肝脏的mRNA表达量。可以理解，mRNA表达量量增加，必然引起目标蛋白或者目标物质的增加。然而，若在MersI和MersIII的胞嘧啶通过人DNA甲基转移酶(DNMT)甲基化修饰(修饰的比例>60％以上，本实施例子修饰比例为95％，可以理解，修饰的比例可以是其它任何比例，我们经过试验发现，不同比例的修饰可以提高目的基因的稳定表达，这是一个优选的实施方式，但是当不含修饰的时候，MersI和MersIII的组合作为增强子，也具有提高表达的作用。)，躲开核酸酶辨识，虽然在一开始的第一天比不修饰的稍微少一些，但是从第2-7天，以及第二周到第四周4周可以稳定表达两倍多(图1)。这说明增强子修饰也起到重要的作用。
总之，从图1可以看出，当选择MersI和MersIII作为增强子，可以提高目的基因在小鼠肝脏中的显著表达，如果经过胞嘧啶甲基化修饰，不仅表达量增加，而且更加持久稳定。
实施例子1.2：设计包含的C/EBP和HNF1等结合位序列的鼠源ALB最小启动子。
以鼠源含ALB基因第1个外显子至第5个外显子和其5’调控区域(Genebank ID：AJ277794.1)为参考序列，注解和设计包含的C/EBP(5’-gtaggaaccaatgaaatgcgagg-3’(SEQNO：6)和HNF1(5’-gttaatgatctac-3’)(SEQ NO：7)等结合位序列的鼠源ALB最小启动子(-170/+22)(SEQ NO：8)。
通过Spe I和KpnI酶切位点的设计黏合在鼠源AFP不同增强子上(MersI和MersIII嵌合，或者MersII)的3’端，通过不同增强子与不同启动子的组合的方式获得不同的质粒，然后通过转基因小鼠，以PCSK9基因为目的基因(该实施例子里质粒的构建以及转移到小鼠的方法，具体参见实施例子1.1中的描述)，按照实施例子1.1的方法获得不同质粒的转基因小鼠，考察肝脏中P基因的mRNA的表达情况。肝脏取样、RNA提取和RT参见具体实施例子2的方法。
具体组合方式如下：三个不同的启动子：ALB启动子-282/+36(长318nt)(SEQ NO：9)、ALB启动子-203/+25(长228nt)(SEQ NO：10)、ALB启动子-170/+22(长192nt)(SEQ NO：8)以最长的ALB启动子-282/+36(长318nt)为一倍比较。
从图2可以看出，MersI和MersIII嵌合增强子结合，ALB启动子-170/+22(长192nt)的表达量最高，而且持续维持4周以上。而对于单独的MersII与三种不同的启动子的组合，其目的基因表达量都比较低，但是含有ALB启动子-170/+22(长192nt)的启动子总体都相对比较高，这说明LB启动子-170/+22(长192nt)单独具有增加表达量的能力。
鉴定出鼠源ALB最小启动子-170/+22(长192nt)在4周内肝脏的人源化P基因(实施例子1.1所使用的同样的基因序列)mRNA表达量能稳定维持2-3倍(图2)。以上增强子序列都没有经过甲基化修饰。
通过以上实验结果，最终设计出全新的、从未报道的鼠源AFP MersI和MersIII嵌合的增强子(SEQ NO：2)并做5mC序列修饰(90％的修饰比例)，协同鼠源ALB最小启动子的调控区域：-170/+22(长192nt)，根据上述设计元件使用核酸合成仪合成了pIVHmL质粒(如图3)。采用启动子的序列越短，则让质粒的容量增加，可以插入的目标基因的数目或者序列就越多，这样具有更高的利用率。
【实施例2】针对不同注射体积IVH建立人源化P基因-pIVHmL小鼠模型且比较在4周 内肝脏的人源化P基因(SEQ NO：9)mRNA表达量。
利用图3为最终的质粒，在该质粒中插入目的P基因，考察该质粒对于P基因的表达的效果的验证。具体如何把P基因插入到质粒中的过程，参见具体实施例子1.1中的步骤，最终获得阳性的质粒。
1、IVH建立人源化小鼠模型的步骤
(1)6周龄C57BL/6N雄性小鼠标记和称重。每只小鼠拟注射20μg的质粒DNA(人源化P基因-pIVHmL质粒DNA-阳性，pIVHmL质粒DNA-阴性)，以5％葡萄糖水溶液(D5W)为溶剂，配制人源化P基因-pIVHmL质粒DNA注射液总体积为体重的10％、12％或15％，作为阴性对照的pIVHmL质粒DNA注射液总体积为体重的12％，每组3只小鼠(n＝3)。按常规方法，进行小鼠尾静脉注射。
2、肝脏取样、RNA提取和RT
(1)小鼠在造模后的指定时间(1天、4天、7天、2周、3周、4周)进行安乐死，解剖取出肝脏。
(2)加入几颗小钢珠，利用高通量组织研磨器进行肝脏均质。
(3)取出均质后的肝脏约100mg，提取总量RNA。
(4)以反转录试剂盒(TOYOBO，FSK-101)将总量RNA转录为1st-cDNA。
(5)RT反应液配置完成后，将离心管放入PCR仪(杭州博日，TC-96/G/HB)中，设置程序步骤如下：
3、qPCR检测人源化P基因-pIVHmL小鼠肝脏的人源化P基因mRNA表达量(1)人类P基因的引物序列
正向：5’-GCCCCATACAACAAAATCAACCA-3’SEQ NO：27
反向：5’-ACTCAGGACTTGATGGTCACTG-3’SEQ NO：28
(2)作为内参的小鼠GAPDH的引物序列
正向：5’-CATCACTGCCACCCAGAAGACTG-3’SEQ NO：29
反向：5’-ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3’SEQ NO：30
(3)qPCR：以SYBR Green Realtime PCR Master Mix试剂盒(TOYOBO，QPK-201)将2.5μg的1st-cDNA进行qPCR。
(4)qPCR程序：以退火温度55℃，通过德国耶拿Analytikjena qTOWER3 96孔qPCR机器进行qPCR程序和相对定量分析。
4、使用10％、12％或15％体重的注射体积，其IVH建立人源化P基因-pIVHmL小鼠模型，在第4天(D4)、第7天(D7)、第14天即2周(W2)以及4周(W4)，12％体重的注射体积较10％或15％，在肝脏表达较高的人源化P基因mRNA(图4)。
因此，12％体重的注射体积是较佳的IVH条件。从图4可以看出，本发明的质粒可以在小鼠肝脏中成功表达P基因，在注射体积上，10％到15％都可以显著提高表达量。其中，12％12％体重的注射体积是较佳的IVH条件，对于P基因来讲。
【实施例3】针对不同质粒DNA的量IVH建立人源化P基因-pIVHmL小鼠模型且比较在 肝脏的人源化P基因mRNA表达量。实施例4的实施方式与实施例2类似，仅列出实施方式不同 处。
1、6周龄BALC/c雄性小鼠标记和称重。每只小鼠拟注射总体积为体重的12％液体，以D5W为溶剂，配制人源化P基因-pIVHmL质粒DNA的量为10μg、20μg或30μg，作为阴性对照的pIVHmL质粒DNA质粒的量为20μg，每组3只小鼠(n＝3)。其它方式与实施例子2相同。
2.使用10μg、20μg或30μg质粒DNA的量，其IVH建立人源化P基因-pIVHmL小鼠模型，一周内整体而言，20μg质粒DNA的量较10μg或30μg质粒DNA的量，在肝脏表达较高的人源化P基因mRNA(图5)。因此，20μg的质粒DNA量是较佳的IVH条件。
【实施例4】针对质粒DNA去内毒素与否建立人源化P基因-pIVHmL小鼠模型且比较 在4周内肝脏的人源化P基因mRNA表达量。
实施例4的实施方式与实施例2类似，仅列出实施方式不同处。
1、6周龄BALC/c雄性小鼠标记和称重。每只小鼠拟注射总体积为体重的10％液体，质粒DNA的量为20μg。人源化P基因-pIVHmL质粒DNA分为两组，一个未去内毒素，另一个以去内毒素质粒提取试剂盒提取(南京诺唯赞，DC202-01)；作为阴性对照的pIVHmL质粒DNA以去内毒素质粒提取试剂盒提取，每组3只小鼠(n＝3)。
2.P基因-pIVHmL质粒DNA去内毒素的组别，建立的人源化P基因-pIVHmL小鼠模型，在肝脏表达高于无去内毒素的组别(图6)。因此，去内毒素的质粒DNA是较佳的IVH条件。
【实施例5】通过IVH建立人源化P基因-pIVHmL小鼠模型其肝脏的人源化P基因mRNA 持续表达8周。
实施例5的实施方式与实施例2类似，仅列出实施方式不同处。
1、6周龄BALC/c雄性小鼠标记和称重。使用IVH最佳化的条件：每只小鼠拟注射总体积为体重的10％液体，质粒DNA的量为20μg。质粒分为两组，一为人源化P基因-pIVHmL质粒DNA，另一个作为阴性对照的pIVHmL质粒DNA，每组3只小鼠(n＝3)。
2.通过IVH建立人源化P基因-pIVHmL小鼠模型其肝脏的人源化P基因mRNA持续表达至8周，且在建模后W2至W8，稳定表达4倍高的表达量(图7)，证明pIVHmL质粒系统突破过去IVH过表达基因稳定度差的难题(图7)。
【实施例6】通过IVH建立pIVHmL-S小鼠模型其肝脏的S基因(SEQ NO：17)mRNA持续 表达4周。
实施例6的实施方式与实施例2类似，仅列出实施方式不同处。
1.通过pIVHmL质粒上MCS的AscI和XhoI酶切位点，基因克隆人源化S基因至pIVHmL质粒上，命名为pIVHmL-S。具体的插入方法与实施例子1.1相同。
2. 6周龄BALC/c雄性小鼠标记和称重。使用IVH最佳化的条件：每只小鼠拟注射总体积为体重的10％液体，质粒DNA的量为20μg。质粒分为两组，一为pIVHmL-S质粒DNA，另一个作为阴性对照的D5W组，每组3只小鼠(n＝3)。
3.通过IVH建立pIVHmL-S小鼠模型其肝脏的人源化S基因mRNA持续表达至4周，且在建模后W2至W4，稳定表达20多倍高的表达量(图9)，通过质粒pIVHmL-S展示了另一种IVH小鼠模型。
综上所述，本发明涉及生物医药技术领域，具体的说，本发明涉及基于一种特殊修饰的质粒，能降低质粒DNA被小鼠体内核酸酶降解，应用此质粒建立稳定表达的IVH小鼠平台。
本发明在增强子、启动子和序列核苷酸做了修饰，设计了鼠源MersI和MersIII增强子，为了提高外源基因在小鼠肝脏表达的特异性和表达量，修复肝细胞；设计鼠源ALB最小启动子，其包含的C/EBP和HNF1等结合位序列，为了促进外源人源化基因的转录，延长外源基因在小鼠肝脏的表达时间，根据上述设计元件使用核酸合成仪合成了pIVHmL质粒。
这一特殊修饰的质粒易于操作，通过MCS酶切位点可提供各种肝脏表达的外源基因克隆进质粒。本发明的实施案例应用人源化P基因-pIVHmL质粒，通过IVH在短时间建立了人源化P基因小鼠模型，且该模型持续表达6-8个月。因此，本发明涉及的pIVHmL质粒能有效实现各种人类肝脏疾病转基因鼠模型的构建。
可以理解，以上实施例子仅仅是少数的人源化基因进行证明本发明的质粒的效果，可理解，利用报告基因也证明具有效果，则说明其它的任何人源基因都有如此的效果，而这些效果是质粒本身的结构发生了变化而导致的。
本发明说明书中提到的所有专利和出版物都表示这些是本领域的公开技术，本发明可以使用。这里所引用的所有专利和出版物都被同样列在参考文献中，跟每一个出版物具体的单独被参考引用一样。这里所述的本发明可以在缺乏任何一种元素或多种元素，一种限制或多种限制的情况下实现，这里这种限制没有特别说明。例如这里每一个实例中术语“包含”，“实质由……组成”和“由……组成”可以用两者之一的其余2个术语代替。这里的所谓的“一个”仅仅表示“一”的意思，而不排除仅仅只是包括一个，也可以表示包括2个以上。这里采用的术语和表达方式所为描述方式，而不受其限制，这里也没有任何意图来指明此书描述的这些术语和解释排除了任何等同的特征，但是可以知道，可以在本发明和权利要求的范围内做任何合适的改变或修改。可以理解，本发明所描述的实施例子都是一些优选的实施例子和特点，任何本领域的一般技术人员都可以根据本发明描述的精髓下做一些更改和变化，这些更改和变化也被认为属于本发明的范围和独立权利要求以及附属权利要求所限制的范围内。

Claims (16)

1.一种质粒载体，所述的载体包括增强子，所述的增强子的序列为SEQ NO：2所示的序列。
2.根据权利要求1所述的载体，所示的增强子序列的经甲基化修饰。
3.根据权利要求2所述的载体，所述的修饰比例为大于60％。
4.根据权利要求2所述的载体，所述的修饰比例为大于90％。
5.根据权利要求2所述的载体，增强子的序列中的胞嘧啶经过甲基化修饰。
6.根据权利要求5所述的载体，所述的修饰比例为大于90％。
7.根据权利要求1所述的载体，所述的载体还包括启动子，所述的启动子连接在增强子的3’端，所述的启动子的序列为SEQ NO：6所示的序列。
8.一种质粒载体，所述的载体包括启动子，所述的启动子的序列为-282/+36(长318nt)(SEQ NO：8)、ALB启动子-203/+25(长228nt)(SEQ NO：7)或者ALB启动子-170/+22(长192nt)(SEQ NO：6)所示的序列。
9.根据权利要求7所述的质粒载体，所述的启动子的序列SEQ NO：6所示的序列。
10.根据权利要求7所述的质粒载体，所述的载体还包括在启动子的5’端连接有增强子，所述的增强子的序列为SEQ NO：1或者SEQ NO：2所述的序列。
11.一种质粒载体，所述的载体从5’到3’端依次包括增强子以及启动子，所述的增强子的序列为SEQ NO：1或者SEQ NO：2所示的序列；启动子的序列为SEQ NO：6所示的序列。
12.根据权利要求11所示的质粒载体，所述的增强子包括MersI和MersIII。
13.根据权利要求1-12之一所述的质粒载体，所述的载体中还包括目的基因，该目的基因为希望在小鼠体内表达的基因。
14.根据权利要求13所述的质粒载体，所述目的基因包括P基因、PCSK9基因。
15.一种小鼠，其中所述的小鼠包括权利要求1-11任一项所述的质粒载体。
16.根据权利要求15所述的小鼠，所述的质粒载体是经过去内毒素处理的质粒载体。
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