CN106591311B - 核酸及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请提出了一种分离的核酸，该核酸含有miRNA靶基因结合位点序列。发明人发现，利用根据本发明实施例的分离的核酸可实现miRNA的下调，尤其对高CG含量(CG含量高达90％)的miRNA，其下调效率相对于现有技术显著提高。

Description

核酸及其用途
技术领域
本发明涉及生物领域，具体的，本发明涉及分离的核酸、下调细胞中miRNA的方法以及建立miRNA稳定下调细胞系的方法。
背景技术
microRNA(miRNA)是一类由真核生物内源性表达产生的单链非编码RNA。miRNA能够以碱基互补配对的方式结合靶基因转录的mRNA的3’UTR区，极少数结合于5’UTR区或者ORF区，使靶基因的mRNA降解，或者抑制其翻译，从而下调目的蛋白的表达，来调节基因的表达，单个microRNA分子可调控的靶基因数量为200个以上，并且已有很多证据表明miRNA在造血分化中，肿瘤发生，炎症反应等各个生理以及病例情况下，都发挥了重要作用。但是目前仍有许多miRNA的生物学功能和相应的分子机制需要被实验证实，因此miRNA的表达量的调节具有着十分重大的意义。特别是miRNA的功能性下调或缺失可以充分暴露出内源性miRNA的功能。
目前已有的miRNA的下调方法有以下三种：基因敲除，miRNA inhibitor和miRNA海绵。
基因敲除就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞中编码该miRNA的基因组上某一确定的位点，可以特异的靶向和敲除单个的miRNA分子的上游编码基因，来削弱内源miRNA的基因的沉默效应，以达到定点修饰改造染色体上某一基因目的的一种技术。
miRNA inhibitor是化学修饰的专门针对细胞中特异的靶miRNA的寡核苷酸，与其靶向的miRNA互补配对，作为mRNA结合的竞争性抑制剂，由于inhibitor也是一条寡核苷酸，会被细胞内的RNase降解，所以不能持续维持对miRNA的抑制作用。
2007年，麻省理工大学的Phillip Sharp及他的同事利用相似的原理，开发出一种长期抑制miRNA基因的高效方法，称之为miRNA海绵(miRNA sponge)，miRNA海绵是一条mRNA，其3’非翻译区(UTR)包含若干个miRNA靶定位点(通常是成熟miRNA的反向互补序列)，这样它就无法与天然靶点结合。更重要的是，这些靶定位点在RISC切割位点有一些错配。这样，抑制剂mRNA就不会被降解，而与RISC稳定结合，让它远离天然的mRNA靶点。
然而，目前对于miRNA的功能性敲除的方法仍需改进。
发明内容
本发明是基于发明人对以下问题和事实的发现而提出的：
发明人在实验中发现，当采用miRNA海绵技术去实现对高CG含量的miRNA的持续下调时，由于大量单纯重复的序列导致了mRNA合成的难度大，所合成的mRNA下调miRNA的效果并不理想。为了克服这个技术难点，发明人只将miRNA靶基因结合位点序列顺序合成出并首尾连接，发明人惊喜地发现，所获得的核苷酸序列导入受体细胞中，依然可实现对受体细胞中miRNA的高效下调，尤其对于含有高CG含量的miRNA，不仅mRNA合成的难度大大降低，所获得的核苷酸序列对于高CG含量的miRNA的下调效果也异常显著。
基于此，在本发明的第一方面，发明人提出了一种分离的核酸。根据本发明的实施例，所述核酸含有miRNA靶基因结合位点序列。发明人发现，利用根据本发明实施例的分离的核酸可实现miRNA的下调，尤其对高CG含量的miRNA(CG含量高达90％)，其下调效率相对于现有技术显著提高。
根据本发明的实施例，上述分离的核酸还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述miRNA靶基因结合位点序列包括miRNA靶基因互补配对序列和miRNA靶基因辅助结合位点序列，所述miRNA靶基因辅助结合位点序列位于所述miRNA靶基因互补配对序列的5’端和/或3’端。需要说明的是，所述“miRNA靶基因互补配对序列”为miRNA与靶基因的结合位点上的能够互补配对的部分；所述“miRNA靶基因辅助结合位点序列”为除了miRNA与靶基因的结合位点上的互补配对的碱基以外的其它碱基序列，具有辅助识别结合位点的功能。发明人发现，所述miRNA靶基因结合位点序列包括miRNA靶基因互补配对序列和miRNA靶基因辅助结合位点序列，使得本申请的分离的核酸对miRNA的吸附、靶向效果进一步增强。
根据本发明的实施，所述miRNA靶基因结合位点序列的长度为15～40bp。
根据本发明的实施例，所述miRNA靶基因结合位点序列的数量为至少一个。需要说明的是，本申请的分离的核酸上的至少一个的miRNA靶基因结合位点序列的连接顺序不受特别限制。
根据本发明的实施例，所述相邻两个miRNA靶基因结合位点序列之间是由连接序列连接的。
根据本发明的实施例，所述连接序列由至少一个碱基组成。连接序列的长度在本发明实施例的分离的核酸中不受特别限制，只要连接序列不干扰miRNA靶基因结合位点序列与miRNA的吸附和靶向，分离的核酸能够实现对目标miRNA特异性下调即可。
根据本发明的实施例，所述连接序列由至少一个A和/或T组成。根据本发明的具体实施例，连接序列碱基的可为任何碱基，而选择A和/或T组成作为连接序列的待选碱基，可有效控制本发明实施例的分离的核酸中的CG含量，进而可有效降低分离核酸的合成难度，以及有效增加分离核酸的下调miRNA的效果。
根据本发明的实施例，所述连接序列具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
AA(SEQ ID NO：1)。
根据本发明具体的实施例，所述miRNA为miR-1915-3p。利用根据本发明实施例的分离的核酸，可高效实现具有高GC含量的miR-1915-3p的下调，进而为进一步研究内源性miR-1915-3p的功能奠定了良好的技术基础。
根据本发明的实施例，所述核酸具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
GACCAUCUUUCCAACCCCUGGGGAAGACAAAUGUCUCAGCUCACUUCCCUGGGACAUUCAAAAGCUGGCCCUGCCUCCUGGGAAGAUGAAAGAGCACUUUGCAACUCCCUGGGUAAGAGAAACUUGCAUUUCUUUGCCCUGGGGGCUGUAAUGGCUGGGCCUGUCACCCUGGGGCCCUAAGGGAAGGAACAGAGGCCCUGGGCCCUUCAAUGAAGGUUUCCUCGUCCCUGGGCAAUUAAUUCAGCAAGAGGUGACCCUGGGAGCGUAAUGGUUCCCCACGCAGCCCUGGGGCUUGG。(SEQ ID NO：2)。
根据本发明的实施例，具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的分离的核酸可实现细胞内miR-1915-3p的高效下调，进而为进一步研究内源性miR-1915-3p的功能奠定了良好的技术基础。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，所述构建体携带前面所述的核酸。利用根据本发明实施例的构建体，可将前面所述的核酸采用本领域技术人员所熟知的方式导入受体细胞中，进而实现前面所述核酸在受体细胞中的稳定表达，所述核酸在受体细胞中可实现对miRNA的稳定和持续地下调，尤其对高CG含量的miRNA(CG含量高达90％)的下调效果尤为显著。
根据本发明的实施例，上述构建体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述构建体的载体为pCDNA 3.1。pCDNA 3.1可携带前面所述的核酸在真核细胞中的高效表达，进而实现对真核细胞中miRNA的稳定和持续地下调。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种下调细胞中miRNA的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将前面所述的核酸或前面所述的构建体导入受体细胞中，任选地，所述miRNA为miR-1915-3p，任选地，所述导入是通过电转、转染、转化的至少之一种方式进行的。如前所述，前面所述的核酸或构建体导入受体细胞，可实现miRNA的稳定和持续地下调，尤其对高GC含量的miRNA(CG含量高达90％)的下调更加显著。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种上调靶基因蛋白表达的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将前面所述的核酸或前面所述的构建体导入受体细胞中，任选地，所述导入是通过电转、转染、转化的至少之一种方式进行的。miRNA能够以碱基互补配对的方式结合靶基因转录的mRNA的3’UTR区，极少数结合于5’UTR区或者ORF区，使靶基因的mRNA降解，或者抑制其翻译，从而下调目的蛋白的表达。如前所述，前面所述的核酸或构建体在受体细胞中，能够实现受体细胞中miRNA高效而稳定的下调，进而miRNA抑制靶基因蛋白表达的功能被抑制，靶基因的蛋白表达量上调。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种建立miRNA稳定下调细胞系的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将前面所述的构建体导入受体细胞中，以便获得重组细胞；以及对所述受体细胞进行筛选，以便获得miRNA稳定下调的细胞系，其中，所述构建体携带有药物抗性基因，所述筛选是利用药物进行的，任选地，所述抗性基因为puromycin抗性基因或neomycin抗性基因。发明人通过实现发现，采用上述方法，可以得到miRNA稳定下调的稳定细胞系，细胞中miRNA的下调效果不会随着细胞的扩增而衰减。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞是通过将前面所述的核酸或前面所述的构建体导入受体细胞中获得的。本发明实施例的重组细胞中的miRNA得到了稳定下调，尤其是高GC含量的miRNA的下调效果更加显著。
附图说明
图1是根据本发明实施例的所合成的片段用EcoRⅠ和EcoRⅤ酶切后的琼脂糖凝胶电泳图和质粒图谱；
图2是根据本发明实施例的为转染了空载质粒的K562细胞和转染了携带目的片段质粒的K562细胞的miR-1915-3p表达量的实时定量PCR结果图；以及
图3是根据本发明实施例的为转染了空载质粒的UT-7细胞和转染了携带目的片段质粒的UT-7细胞的miR-1915-3p表达量的实时定量PCR结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。
实施例1 miRNA功能性下调序列的设计。
在明确需要功能性下调的miRNA后，查询出目前已有报道或可以被预测出的其能够结合的靶基因的结合序列，并将靶基因的结合序列串联连接。
以CG含量较高，功能性下调难度较大的miR-1915-3p为例，靶基因个别结合位点序列如表1所示。
表1：
设计出的能够使miR-1915-3p功能性下调的序列如下所示：
下划线为miRNA靶基因结合位点序列，下划线加粗部分为miRNA靶基因互补配对序列，加粗斜体部分分别为EcoRⅠ和EcoRⅤ的识别位点。
实施例2 miRNA功能性下调质粒的构建
1、按照实施例1的设计，合成该序列。
2、将实施例1所合成的片段通过EcoRⅠ和EcoRⅤ的双酶切(图1为实施例1所合成的片段用EcoRⅠ和EcoRⅤ酶切后的琼脂糖凝胶电泳图)，并将其连接入目的质粒中(质粒图谱如图1所示)。
连接入质粒pCDNA3.1中，酶切体系如表2所示。
表2：
组成成分 数量
质粒 4μg
EcoRⅠ 10IU
EcoRⅤ 10IU
10×Buffer 4μl
水 加至40μl
将酶切体系的成分充分混匀，37℃孵育5小时
3、纯化回收
将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，用普通DNA产物纯化试剂盒进行纯化回收。
4、质粒的连接
将4μl回收的小片段(目的片段)，1μl回收的大片段(载体)和5μl连接酶混合液solutionⅠ充分混匀，16℃孵育连接2小时。
5、质粒的转化
将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂板，37℃过夜培养，挑取阳性克隆菌斑摇菌扩增，提取质粒，进行酶切鉴定和测序，筛选阳性克隆。
实施例3 miRNA功能性下调质粒的功能验证
1、稳定下调表达miR-1915-3p的细胞系的建立
(1)人白血病细胞(如K562细胞或UT-7细胞)以添加10％胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基培养，每3天1：5传代。将白血病细胞系细胞离心后计数，用培养基重悬至细胞密度为3×105个/ml，按照每孔1.5ml加入标记好的6孔板中；
(2)取入4μg纯化的质粒并用Opti-MEM培养基补足至250μl(EP管1)，混匀；另取一个1.5ml EP管，加入240μl Opti-MEM培养基和10μl Lipofectamine 2000(EP管2)，轻弹混匀，室温静置5min；
(3)将EP管1和2中的液体混合，轻柔混匀，室温静置20min后，将液体对应的逐滴加入准备好的6孔板中的细胞悬液中，轻柔震荡混匀后将细胞置于37℃，5％CO2培养箱中静置培养；
(4)12小时后，将细胞取出，离心，换液，重悬后继续培养48小时；
(5)视细胞生长状态，确定药物筛选时间，当转染的细胞生长状态良好时，将细胞离心取出，视质粒抗性进行相应药物筛选，neomycin抗性质粒持续使用含G418的K562培养基，puromycin抗性质粒持续使用含puromycin的培养基，3-4周，2-3天换液一次。
2、细胞系中miR-1915-3p表达量的检测如下所述：
(1)获得细胞系cDNA
a、Trizol法提取个细胞中的总RNA
b、miRNA的反转录，反转录体系如表3所示：
表3：
反应条件如下所示：
顶盖温度：LID＝104℃，
逆转录反应：37℃，1h，
酶失活反应：95℃，5min，
冷却至4℃。
反应完成后，得到的cDNA溶液于-20℃保存，并可直接或稀释后用于PCR扩增反应。
(2)实时定量PCR检测miRNA
所用实时定量PCR引物由上海英骏公司合成，引物序列如表4所示：
表4：
基因 序列(5’-3’)
U3 R：CGCTTCGGCAGCACATATACTA(SEQ ID NO:4)
U6 F：CGCTTCGGCAGCACATATACTA(SEQ ID NO:5)
miR-1915-3p F：CCCCAGGGCGACGCGGCGGG(SEQ ID NO:6)
所有基因的表达都以U6基因的表达量作为内参进行分析。
其中，每个样品设置三个重复，实时定量PCR反应体系如表5所示，充分离心、混匀。
表5：
组成成分 加入量
All-in-oneq-PCRMix 10μl
H<sub>2</sub>O 8μl
cDNA 1μl
miRNA引物 0.5μl
U3 0.5μl
将样品置于实时定量PCR仪中，并按如下程序进行实时定量PCR，
顶盖温度：LID＝104℃，
预变性：95℃10min，
扩增循环：94℃15s，55℃30s，70℃30s重复40个循环，
读取溶解曲线：55℃-95℃10s重复75个循环(每个循环递增0.5℃)
冷却至4℃。
3)收集数据，用BIO-RADiQ5软件进行分析。
检测结果如图2和图3所示，其中对照组为转染了空载质粒的细胞，实验组为转染了携带目的片段(实施例1所合成的序列)质粒的细胞。结果显示，实验组细胞中的miR-1915-3p表达量相比于对照组细胞显著下调。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 华南生物医药研究院
<120> 核酸及其用途
<130> PIDC3166080
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 连接序列的核苷酸序列
<400> 1
aa 2
<210> 2
<211> 296
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 分离核酸的核苷酸序列
<400> 2
gaccaucuuu ccaaccccug gggaagacaa augucucagc ucacuucccu gggacauuca 60
aaagcuggcc cugccuccug ggaagaugaa agagcacuuu gcaacucccu ggguaagaga 120
aacuugcauu ucuuugcccu gggggcugua auggcugggc cugucacccu ggggcccuaa 180
gggaaggaac agaggcccug ggcccuucaa ugaagguuuc cucgucccug ggcaauuaau 240
ucagcaagag gugacccugg gagcguaaug guuccccacg cagcccuggg gcuugg 296
<210> 3
<211> 308
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 带有酶切位点的分离核酸的核苷酸序列
<400> 3
gaattcgacc aucuuuccaa ccccugggga agacaaaugu cucagcucac uucccuggga 60
cauucaaaag cuggcccugc cuccugggaa gaugaaagag cacuuugcaa cucccugggu 120
aagagaaacu ugcauuucuu ugcccugggg gcuguaaugg cugggccugu cacccugggg 180
cccuaaggga aggaacagag gcccugggcc cuucaaugaa gguuuccucg ucccugggca 240
auuaauucag caagagguga cccugggagc guaaugguuc cccacgcagc ccuggggcuu 300
gggatatc 308
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> U3上游引物
<400> 4
cgcttcggca gcacatatac ta 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> U6下游引物
<400> 5
cgcttcggca gcacatatac ta 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> miR-1915-3p下游引物
<400> 6
ccccagggcg acgcggcggg 20

Claims (9)

1.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示。
2.一种构建体，其特征在于，携带权利要求1所述的核酸。
3.根据权利要求2所述的构建体，其特征在于，所述构建体的载体为pCDNA 3.1。
4.一种下调细胞中miR-1915-3p的方法，所述方法用于疾病的非治疗目的，其特征在于，包括：将权利要求1所述的核酸或权利要求2或3所述的构建体导入受体细胞中。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述导入是通过电转、转染、转化的至少之一种方式进行的。
6.一种上调靶基因蛋白表达的方法，所述方法用于疾病的非治疗目的，其特征在于，包括：将权利要求1所述的核酸或权利要求2或3所述的构建体导入受体细胞中。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述导入是通过电转、转染、转化的至少之一种方式进行的。
8.一种建立miR-1915-3p稳定下调细胞系的方法，其特征在于，包括：
将权利要求2或3所述的构建体导入受体细胞中，以便获得重组细胞；以及
对所述受体细胞进行筛选，以便获得miR-1915-3p稳定下调的细胞系，
其中，所述构建体携带有药物抗性基因，所述筛选是利用药物进行的。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述抗性基因为puromycin抗性基因或neomycin抗性基因。
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