CN114891789B - 一种小菜蛾dsRNA的合成方法及其应用 - Google Patents

一种小菜蛾dsRNA的合成方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种小菜蛾dsRNA的合成方法及其应用，首先从小菜蛾中克隆了小菜蛾CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein)PxCEBPα，并对小菜蛾海藻糖酶基因转录因子基因PxCEBPα设计引物，合成了用于干扰小菜蛾海藻糖酶基因转录因子PxCEBPα的dsRNA，且运用注射法将dsRNA导入小菜蛾对小菜蛾海藻糖酶基因转录因子PxCEBPα进行RNAi。本发明为更深入理解小菜蛾能量代谢与抗药性之间的关系、以此为新靶标创制高效低毒安全的药剂提供科学依据。

Description

一种小菜蛾dsRNA的合成方法及其应用
技术领域
本发明涉及昆虫生长发育调控和基因工程领域，更具体涉及一种小菜蛾转录因子PxCEBPα的dsRNA与应用。
背景技术
小菜蛾是一种世界性危害的十字花科蔬菜和作物的重大农业害虫，每年在全球造成的经济损失高达40-50亿美元。长期使用杀虫剂导致昆虫对杀虫剂抗性快速进化，给害虫防控带来很大的困难。
昆虫的许多组织存在海藻糖酶，主要将海藻糖水解为葡萄糖为正常生理活动提供能量；通过调控几丁质合成途径来控制昆虫的蜕皮过程；通过与激素协同作用，调控昆虫体内海藻糖和葡萄糖等糖类物质的浓度，从而有效保护体内细胞适应并渡过相应的逆境，提高其抵御外界逆境能力。干扰昆虫海藻糖酶基因表达，可以打破昆虫体内的代谢平衡，是害虫防治的有效策略。
CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT enhancer binding protein，C/EBP)是一个转录因子家族，属于碱性区亮氨酸拉链(basic region/leucine zipper，bZIP)蛋白家族，包括C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPγ、C/EBPδ、C/EBPε和C/EBPζ等蛋白,主要通过调节靶细胞基因转录，在细胞生长分化、细胞周期调控、免疫应答、炎症反应、能量代谢、肿瘤发生及凋亡等过程发挥着重要作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是对十字花科蔬菜害虫小菜蛾抗药性治理。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种与海藻糖酶基因相结合的转录因子。
本发明提供的转录因子来源于小菜蛾Plutella xylostella(L.)，其名称为PxCEBPα：
技术方案：一种小菜蛾dsRNA的合成方法，包括以下步骤：
S1从小菜蛾中克隆小菜蛾CCAAT增强子结合蛋白PxCEBPα；
S2对小菜蛾海藻糖酶基因转录因子基因PxCEBPα进行设计引物，合成了用于干扰小菜蛾海藻糖酶基因转录因子PxCEBPα的dsRNA；
S3运用注射法将dsRNA导入小菜蛾对小菜蛾海藻糖酶基因转录因子PxCEBPα进行RNAi。
进一步的：S101根据小菜蛾转录组数据库中预测的PxTreh1和PxTreh2的部分序列；
S102分别设计特异性引物，以小菜蛾总RNA转录所得的cDNA为模板，扩增获得了417bp的PxTreh1基因片段和831bp的PxTreh2基因片段。
进一步的：步骤S2中包括：
S201以S102中所述PxTreh1基因片段和PxTreh2基因片段作为核心序列，设计基因特异引物配合接头引物进行5'RACE扩增，分别获得了675bp PxTreh1和445bp PxTreh2的cDNA 5'端序列；
S202将S201中RACE扩增所得的序列在小菜蛾基因组数据库中进行搜索，得到了两个DNA片段：scaffold NW_011952223.1和NW_011952162.1；
S203根据S202中序列信息设计多条特异性引物，以小菜蛾基因组DNA为模板，用高保真酶扩增PxTreh1和PxTreh2，获得5'RACE序列上游2kb的DNA序列；
S204通过将每个启动子序列连接到萤火虫荧光素酶报告基因序列来确定推定启动子的功能，使用PCR扩增pGL3-Basic质粒中的每个启动子区域，纯化PCR产物，PCR产物转化大肠杆菌DH5α菌株，筛选出阳性克隆并测序确认。
进一步的，步骤S3中包括：
S301将截短的启动子片段通过无缝克隆插入到pGL3-Basic载体中,预测PxTreh启动子中转录因子结合的潜在顺式作用元件,预测C/EBPα会结合两个PxTreh启动子；
S302基于C/EBPα的保守结构域设计具有T7启动子序列的引物,使用显微注射工具将dsC/EBPα基因注射到4龄1天的小菜蛾,dsEGFP用作阴性/阳性对照；
S303采用qRT-PCR方法分别检测注射dsC/EBPα和dsEGFP后PxTreh1和PxTreh2基因的表达情况。
以上方法具体包括：根据小菜蛾转录组数据库中预测的PxTreh1和PxTreh2的部分序列，分别设计特异性引物，以小菜蛾总RNA转录所得的cDNA为模板，扩增获得了417bp的PxTreh1基因片段和831bp的PxTreh2基因片段。利用Invitrogen公司RLM-RACE Kit试剂盒，以上述两个基因片段作为核心序列，设计基因特异引物配合接头引物进行5'RACE扩增，其中引物R2用于第一轮扩增，R3、R4、R5用于二轮扩增。选择R4的扩增产物进行克隆、测序，最终分别获得了675bp PxTreh1和445bp PxTreh2的cDNA 5'端序列(内含起始密码子)。
2、将RACE所得序列在小菜蛾基因组数据库中进行搜索，得到了两个DNA片段：scaffold NW_011952223.1和NW_011952162.1。根据这些序列信息设计多条特异性引物，以小菜蛾基因组DNA为模板，用高保真酶扩增PxTreh1和PxTreh2所得5'RACE序列上游2kb左右的DNA序列。其中，PxTreh1获得了ATG上游共1964bp序列(见图4)，斜体为RACE所得序列，转录起始位点为标黄的碱基G。PxTreh2的RACE所得445bp序列经与小菜蛾基因组数据比对，在ATG上游252与253bp之间发现存在一个长达12kb的内含子，并且PCR扩增、测序该内含子3'端的1kb序列，证实其确实存在。因此，我们跨过该内含子，在其上游的RACE序列基础上继续扩增获得了1891bp的5'端侧翼序列(见图5)。图中斜体字母为RACE所得序列，PxTreh2的转录起始位点即为标黄的A碱基。在转录起始位点上游-43bp和-49bp分别发现了两个CAATbox元件(下划线标示)。
3、通过将每个启动子序列连接到萤火虫荧光素酶报告基因序列来确定推定启动子的功能。对于PxTreh1启动子，前体荧光素酶构建体包含731(-329-402)、828(-426-402)、889(-487-402)、947(-545-402)、1012(-610-402))和1590(-1188-402)个碱基。对于PxTreh2启动子，启动子-荧光素酶构建体包含286(-90-196)、337(-141-196)、399(-203-196)、450(-254-196)、511(-315-196)、1121(-925-196)、1648(-1452-196)和2088(-1892-196)碱基。使用PCR扩增pGL3-Basic质粒中的每个启动子区域，并使用琼脂糖凝胶电泳和Fast PureGel DNA Extraction Mini Kit纯化PCR产物。PCR产物转化大肠杆菌DH5α菌株，筛选出阳性克隆并测序确认。
4、将截短的启动子片段通过无缝克隆插入到pGL3-Basic载体中。使用JASPAR数据库(http://jaspar.genereg.net)预测PxTreh启动子中转录因子结合的潜在顺式作用元件。预测C/EBPα会结合两个PxTreh启动子。小菜蛾中C/EBPα的编码序列(CDS)从GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中提取，登录号为LOC105380784。序列分析表明，编码的氨基酸序列与参考序列一致。使用相应的特异性引物扩增全长CDS(表1)。反应条件为95℃预变性3min，95℃变性15s，35个循环，60℃退火15s，72℃延伸30s，72℃延伸5min。
5、基于C/EBPα的保守结构域设计具有T7启动子序列的引物(表1。使用MEGAscriptRNAi试剂盒(Ambion，Austin，Texas，USA)合成C/EBPαdsRNA(dsC/EBPα)。使用显微注射工具(WPI,Sarasota,FL,USA)将dsC/EBPα基因注射到4龄1天的小菜蛾。dsEGFP用作阴性/阳性对照。每只幼虫注射150ng dsRNA，24小时后采集样本，实验至少独立进行3次。
6、采用qRT-PCR方法分别检测注射dsC/EBPα和dsEGFP后PxTreh1和PxTreh2基因的表达情况。
7、使用Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid System(Clontech,Mountain View,CA,USA)进行Y1H测定以探索C/EBPα和PxTreh2之间的直接相互作用。含有PxTreh2(-203–196)的诱饵质粒pAbAi-CRE用BstBI线性化并整合到Y1HGold酵母中以产生诱饵种群。使用SD/-Ura培养基选择成功的转化体。SD/-Ura培养基上抑制诱饵种群正常生长的最低AbA浓度为100ng/mL诱饵人口。在补充有100ng/mL AbA的SD/-Leu培养基上进行转化体的选择。阳性对照是用pGADT7-p53和pAbAi-p53质粒转化的Y1HGold菌株，阴性对照是用空pGADT7和pAbAi-CRE质粒转化的Y1HGold菌株。
进一步的，所述小菜蛾海藻糖酶基因转录因子为PxC/EBPα蛋白质。
进一步的，小菜蛾转录因子PxCEBPα通过调节海藻糖酶的表达来介导小菜蛾对不利环境压力源的适应性。
进一步的，所述降低小菜蛾中转录因子C/EBPα的表达量和/或活性的方法是将抑制小菜蛾海藻糖酶基因表达的物质导入昆虫；
所述抑制小菜蛾海藻糖酶基因表达的物质为小菜蛾中转录因子C/EBPα的dsRNA。
上述方法中，所述导入的方式为注射。
上述方法在防治害虫中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的有益效果：
本发明从小菜蛾中克隆到了小菜蛾海藻糖酶基因上游的启动子序列，预测到了转录因子体内C/EBPα，并利用RNAi干扰实验证明了C/EBPα让海藻糖酶基因PxTreh1和PxTreh2低表达，同时海藻糖酶活性下降导致小菜蛾体内能量失衡或面对逆境的适应性降低。进一步表明小菜蛾转录因子PxCEBPα通过调节海藻糖酶的表达来介导小菜蛾对不利环境压力源的适应性。本发明为更深入理解小菜蛾能量代谢与抗药性之间的关系、以此为新靶标创制高效低毒安全的药剂提供科学依据。
附图说明
图1是小菜蛾海藻糖酶基因1(PxTreh1)启动子的克隆和转录起始位点的分析；
图2是小菜蛾海藻糖酶基因2(PxTreh2)启动子启动子的克隆和转录起始位点的分析图3是小菜蛾海藻糖酶基因1(PxTreh1)启动子截短活性。。
图4是小菜蛾海藻糖酶基因2(PxTreh2)启动子截短活性；
图5是C/EBPα在小菜蛾敏感品系(Bt-s)、Bt抗性品系(Bt-R)和汉寿田间品系的表达情况；
图6是C/EBPα对小菜蛾体内海藻糖酶基因表达的影响图7dsC/EBPα干扰后对PxTreh1和PxTreh2的表达量的影响；
图8是Y1H实验验证C/EBPα与结合位点的直接结合。
图9是C/EBPα的序列。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
实施例1昆虫和细胞培养
田间小菜蛾昆虫采集于中国湖南省汉寿县(111.975E，28.957N)，并在湖南农业生物技术研究所的昆虫馆中于25±1℃、65％±5％相对湿度和饲喂条件下饲养。光周期为16小时。幼虫在卷心菜叶子上，而成虫则喂食5％的蜂蜜水溶液。在第四龄幼虫的第2天提取用于克隆海藻糖酶基因的RNA。Bt敏感菌株和Bt抗性小菜蛾菌株来自于中国农业科学院蔬菜花卉研究所惠赠。
实施例2 qRT-PCR
按照制造商的方案(Vazyme，南京，中国)，使用RNA分离器总RNA提取试剂从不同样品中提取总RNA。使用NanoDropTM 1000(Thermo,Wilmington,DE,USA)对提取的RNA进行定量。使用1μg RNA样品和HiScript Q RT SuperMix(+gDNAwiper)合成cDNA。总反应体积为20μL。合成的cDNA保存在-80℃备用。使用FastStart Essential DNA Green Master试剂盒(Roche，Basel，Switzerland)对不同生命阶段的小菜蛾cDNA样品进行定量分析。从总RNA逆转录的15ng cDNA样品用作PCR模板。使用表1中列出的特异性引物扩增PxTreh基因。扩增小菜蛾核糖体蛋白S4(rpS4，XM_011555372)并用作不同昆虫生长阶段定量PCR分析的内部对照[34,35]。延伸因子1(EF1,EF417849)也被放大并用于验证定量结果(引物如表1所示)。96PCR仪器(Roche Molec-ular Systems,Inc.,Basel,Switzerland)用于基因表达分析。两步扩增过程是在95℃初始变性30s，随后在95℃变性10s，然后在59℃退火30s进行的。该过程进行了40个循环。使用2-ΔΔCT方法计算基因的相对表达。
实施例3 5'RNA连接酶介导的cDNA末端快速扩增(5'RLM-RACE)
PxTreh1(XM_038109193)和PxTreh2(XM_038109919.1)基因使用基于从小菜蛾RNA合成的cDNA的特异性引物扩增。使用First Choice RLM-RACE试剂盒(Invitrogen，ThermoFisher Scientific，USA)确定PxTreh基因的转录起始位点。简而言之，按照制造商的说明，使用RNA分离器总RNA提取试剂(Vazyme Co.，Ltd.，南京，中国)从一日三龄小菜蛾幼虫中提取总RNA，并用小牛肠磷酸酶(CIP)处理以去除在降解的mRNA和结构RNA的5'端磷酸化。然后纯化RNA并用烟草酸焦磷酸(TAP)处理以去除全长mRNA的5'-7-甲基鸟嘌呤帽，留下5'-单磷酸部分。使用T4 RNA连接酶将45个碱基RNA接头寡核苷酸连接到无帽mRNA。使用随机引发的逆转录反应合成cDNA。使用嵌套PCR扩增PxTreh mRNA的全长5'非翻译区。与试剂盒一起购买了两个对应于RNA接头的有义引物，反义引物(外引物和内引物，表1)对PxTreh mRNA具有特异性。使用5'-RACE锚定引物和PxTreh外引物进行第一次PCR(表1)。使用5'-RACE和PxTreh内引物进行第二次嵌套PCR(表1)。扩增条件包括：95℃初始变性3min，95℃15s变性30个循环，60℃退火15s，72℃延伸45s，最后72℃延伸5分钟。在克隆到pCE-Zero载体(Vazyme，南京，中国)之前，使用Fast Pure Gel DNA Extraction Mini Kit(Vazyme，南京，中国)纯化最终产物。使用Sanger测序确认5'未翻译的PxTreh区域。
表1.本研究中使用的寡核苷酸引物
实施例4启动子和转录因子的克隆
在P.xylostella基因组数据库中搜索了RACE序列。获得了两个DNA片段：支架NW_011952223.1和NW_011952162.1。引物是根据基因序列设计的(表1)。将截短的启动子片段通过无缝克隆插入到pGL3-Basic载体中。
使用JASPAR数据库(http://jaspar.genereg.net)预测PxTreh启动子中TF结合的潜在CRE。预计C/EBPα会结合两个PxTreh启动子。P.xylostella中C/EBPα的编码序列(CDS)从GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中提取，登录号为LOC105380784。序列分析表明，编码的氨基酸序列与参考序列一致。使用相应的特异性引物扩增全长CDS(表1)。反应条件为95℃预变性3min，95℃变性15s，35个循环，60℃退火15s，72℃延伸30s，72℃延伸5min。
实施例5海藻糖酶基因启动子截短
通过将每个启动子序列连接到萤火虫荧光素酶报告基因序列来确定推定启动子的功能。对于Pxtreh1启动子，前体荧光素酶构建体包含731(-329-402)、828(-426-402)、889(-487-402)、947(-545-402)、1012(-610-402))和1590(-1188-402)个碱基。对于Pxtreh2启动子，启动子-荧光素酶构建体包含286(-90-196)、337(-141-196)、399(-203-196)、450(-254-196)、511(-315-196)、1121(-925-196)、1648(-1452-196)和2088(-1892-196)碱基。使用PCR扩增pGL3-Basic质粒中的每个启动子区域，并使用琼脂糖凝胶电泳和Fast Pure Gel DNA Extraction Mini Kit纯化PCR产物。PCR产物转化大肠杆菌DH5α菌株，筛选出阳性克隆并测序确认。
实施例6双荧光素酶活性检测
参考Promega双荧光素酶报告基因检测系统试剂盒说明书进行实验。
(1)细胞转染：细胞提前一天接种于24孔板中，转染时每孔取0.6μg DNA(含0.6μg萤火虫荧光素酶重组检测质粒和1ng海肾荧光素酶表达质粒pRL-OpIE2)和50μL无添加Grace培养基混匀，同时取2μL Lipofectamine 2000(Invitrogen)和50μL无添加Grace培养基混匀，室温静置5min，之后将二者混匀，室温放置25min后缓慢滴入用无添加Grace培养基换液后的细胞中；28℃培养4h，换含8％FBS的SF900 II培养基继续培养。
(2)细胞裂解：细胞转染48h后，将培养板取出，去除SF-900II培养基,用冰冷的PBS洗一次，彻底吸去残留缓冲液后。24孔板每孔加入被动裂解液(PLB)100μL，至水平摇床室温裂解15min，收集裂解液，4℃12000g离心5min取上清用于荧光素酶活性测定。
(3)酶活测定：测定仪器：BioTek Synergy 2酶标液；参数设置：激发光480nm，发射光528nm，积分时间10s。测定体系如下：30μL PLB裂解液中加入15μL细胞裂解液，之后先加入30μL萤火虫荧光素酶底物LAR测出萤火虫荧光强度的数值，再加入30μL stop&Gobuffer，测定海肾荧光强度的数值。最后取二者的比值作为启动子活性的评价指标，每个处理做3个重复，实验重复3次。
实施例7Y1H(酵母单杂试验)
使用Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid System(Clontech,Mountain View,CA,USA)进行Y1H测定以探索C/EBPα和PxTreh2之间的直接相互作用。含有PxTreh2(-203–196)的诱饵质粒pAbAi-CRE用BstBI线性化并整合到Y1HGold酵母中以产生诱饵种群。使用SD/-Ura培养基选择成功的转化体。SD/-Ura培养基上抑制诱饵种群正常生长的最低AbA浓度为100ng/mL诱饵人口。在补充有100ng/mL AbA的SD/-Leu培养基上进行转化体的选择。阳性对照是用pGADT7-p53和pAbAi-p53质粒转化的Y1HGold菌株，阴性对照是用空pGADT7和pAbAi-CRE质粒转化的Y1HGold菌株。
实施例8dsRNA合成和RNA干扰
基于C/EBPα的保守结构域设计具有T7启动子序列的引物(表1)。使用MEGAscriptRNAi试剂盒(Ambion，Austin，Texas，USA)合成C/EBPαdsRNA(dsC/EBPα)。使用显微注射工具(WPI,Sarasota,FL,USA)将dsC/EBPα基因注射到4龄1天的小菜蛾体内。dsEGFP用作阴性/阳性对照。每只幼虫注射150ng dsRNA，24小时后采集样本，实验至少独立进行3次。
如图1和图2所示，通过5’RLM-RACE获得了PxTreh1(675bp)和PxTreh2(445bp)的cDNA 5’末端序列，并确定了转录起始位点。通过5’RACE获得的序列在小菜蛾基因组数据库中进行检索，确定了两个DNA片段(scaffold NW_011952223.1和NW_011952162.1)，扩增分别得到了PxTreh1(1188bp)和PxTreh2(1891bp)的启动子序列。分别获得并克隆到pGL3-Basic载体中。同时，从JASPAR数据库中预测出顺式作用元件，PxTreh1启动子中有5个顺式作用元件(-252、-346、-391、-486和+250)，PxTreh2启动子中有1个顺式作用元件(-111)。
图1-图2为5’RLM-RACE获得的序列，1号位置核碱基表示转录起始位点，顺式作用元件CAAT框用加粗黑色下划线标记，转录因子结合位点用加粗和下划线标记。骨架字母序列来自RACE。
如图3所示，为准确分析PxTreh1启动子活性区域，构建了6个含有PxTreh1启动子的pGL3-Basic重组质粒，包括P(-1188至+402)、P(-610至+402)、P(-545至+402)、P(-487至+402)、P(-426至+402)和P(-329至+402)。将pGL3基载体与pRL-OpIE2质粒共转染Hi5细胞，测定双荧光素酶活性。研究发现与P(-487至+402)的启动子活性相比，P(-426至+402)使启动子活性降低了84.3％，提示从-487到+402区域可能是调控启动子活性的主要区段。
如图4所示，构建了8个基于PxTreh2的pGL3-Basic重组质粒载体，包括P(-1892至+196)、P(-1452至+196)、P(-925至+196)、P(-315至+196)、P(-254至+196)、P(-203至+196)、P(-141至+196)、P(-90至+196)。当启动子从5’端的-203截短到–141时，PxTreh1启动子的活性显著降低，而在-90到+196区域没有发现转录活性，这些研究表明PxTreh2启动子活性的元件位于-203～+196区域内。
如图5所示，基于JASPAR数据库的预测，发现转录因子C/EBPα可以调节两个海藻糖酶基因启动子的表达(图3)，为了验证这一预测，测定了不同小菜蛾群体中C/EBPα表达的表达水平，结果表明，与小菜蛾敏感品系(Bt-S)相比，小菜蛾Bt抗性(Bt-R)品系显著上调2.06倍，汉寿田间种群(HS)种群显著上调6.87倍。提示C/EBPα可能调节海藻糖酶基因的表达。
如图6所示，构建了基于pEGFP-N1的C/EBPα表达载体，并与PxTreh1的P(-487至402)和PxTreh2的P(-203至196)共转染，与EGFP组共表达相比，C/EBPα与PxTreh1的P(-487至402)共表达显著增加了10.60倍，C/EBPα与PxTreh2的P(-203至196)的共表达显著增加了13.21倍。这些数据表明转录因子C/EBPα增强了PxTreh1和PxTreh2启动子的活性，表明转录因子C/EBPα参与了小菜蛾幼虫海藻糖酶基因的表达调控。
如图7所示，进行C/EBPα的RNA干扰(RNAi)试验以确认C/EBPα对体内PxTreh1和PxTreh2表达的调节作用。dsPxC/EBPαRNA注射后24h，C/EBPα的表达明显下降。与注射GFPdsRNA相比，RNA干扰PxC/EBPα显著降低了PxTreh1和PxTreh2的表达(p<0.01)，分别降低了33.05％和57.76％。
如图8所示，进一步进行酵母单杂交(Y1H)测定以探索C/EBPα和PxTreh2启动子区域之间的相互作用。将pGADT7-C/EBPα质粒转染到诱饵pAbAi-TRE2菌株中。在SD/-Leu和SD/-Leu/Aba 100ng/mL组中观察到菌落，表明宿主成功转化。AbAr报告基因的表达也被激活，表明C/EBPα和PxTreh2启动子区域之间存在相互作用如图9所示，参考GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，克隆了小菜蛾C/EBPα基因序列，比对分析表明编码的氨基酸序列与参考序列基本一致。
以上实施方式仅用于说明本发明，而非对本发明的限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行各种组合、修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (3)

1.一种小菜蛾转录因子PxCEBPα的dsRNA在治理小菜蛾对苏云金芽孢杆菌抗性中的应用，其特征在于，所述dsRNA由具有T7启动子的正向引物TGGACGAGCTCAACGGCCAG 和反向引物TGAGCAGAGGAGGCAGCAGC扩增得到的产物经体外反转录得到。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括运用注射法将dsRNA导入小菜蛾。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述注射法为显微注射法。
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敲减CCAAT/增强子结合蛋白α通过增加O-GlcNAc糖基化水平促进肝癌细胞体外增殖;李文姣等;实用肝脏病杂志(第04期);全文 *

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