CN104610440A - ABC转运蛋白基因ABCH1及其特异性dsRNA在小菜蛾防治和Bt抗性治理中的应用 - Google Patents

Abstract

ABC转运蛋白基因ABCH1及其特异性dsRNA在小菜蛾防治和Bt抗性治理中的应用。本发明公开了一种昆虫ABC转运蛋白和其编码基因ABCH1及其双链RNA(dsRNA)的应用，它可以特异性沉默ABCH1基因使Bt Cry1Ac杀虫蛋白敏感和抗性小菜蛾死亡。所述基因全长核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码如SEQ ID NO.2所示的蛋白；本发明还公开了的ABCH1基因特异片段，用于dsRNA的合成，该dsRNA注入Bt Cry1Ac杀虫蛋白敏感和抗性小菜蛾3龄初幼虫体腔后，小菜蛾在生长过程中发育迟缓，并最终导致小菜蛾在幼虫期和蛹期的死亡。本发明为基于RNA干扰的田间害虫防治和Bt抗性治理提供了新的靶标，因此具有良好的应用前景。

Description

ABC转运蛋白基因ABCH1及其特异性dsRNA在小菜蛾防治和Bt抗性治理中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及小菜蛾ABC转运蛋白基因及其特异性dsRNA在害虫防治和Bt抗性治理中的应用。

背景技术

农业害虫每年都在世界范围内严重危害农作物并引起巨大的经济损失。农业害虫的防治长期依赖化学杀虫剂，然而，化学杀虫剂的长期使用影响了非靶标生物的存活并导致了害虫抗药性、环境污染等一系列问题严重危害人类身体健康。虽然已有生物杀虫剂如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)等被应用于害虫防治中，但是其作用时间通常比较长且杀虫效果缓慢，推广面积较小。目前，Bt转基因抗虫作物（Bt作物）被认为是替代化学农药防治害虫的首选方法，且其2013年在世界范围内的推广面积已超过7500万公顷(James, 2013)。然而，最近田间检测结果显示多种害虫已对Bt作物产生了抗性(Tabashnik et al., 2011; Tabashnik et al., 2013)。因此，随着社会的不断发展，人们迫切需要更新型的害虫防治方法来结合或替代Bt作物实现现代农业的可持续发展。

RNA干扰(RNA interference, 简称RNAi)是一种由双链RNA(double-stranded RNA, 简称dsRNA)分子引起的转录后水平特异性基因沉默现象。RNA干扰发现后迅速成为了21世纪以来的十大热门科技之一并极大地促进了生物基因功能的研究，因此，该技术于2006年获得了诺贝尔生理及医学奖。令人兴奋地是，Nature Biotechnology杂志在2007年先后发表两篇著名的SCI论文表明可以利用转基因技术表达靶标害虫致死基因的dsRNA来控制害虫，从而开辟了利用RNA干扰技术防治田间害虫的新方法(Baum et al., 2007; Mao et al., 2007)。随后，在2008年，Price和Gatehouse提出了基于RNAi的害虫防治方法并讨论了该方法的优势：(1)特异性干扰害虫专一基因，对高等动物和人类安全；(2)杀虫具有专一性，对非靶标生物安全；(3)对环境无毒无害。目前，基于RNA干扰的害虫防治研究领域发展非常迅速，给现代农业生产带来了新的科技革命的希望。然而，尽管基于RNA干扰的害虫防治新方法具有很大优势，实现基于RNA干扰的害虫有效治理的关键是筛选出合适的对害虫高效致死的靶标基因。

昆虫的ABC转运蛋白(ATP-binding cassette transporter, 简称ABC transporter)基因超家族共包括ABCA-ABCH这8个亚家族，每个亚家族又包括多个基因，不同亚家族的基因具有不同的生物学功能。其中，ABCH亚家族是一个比较特殊的ABC转运蛋白亚家族，它只存在于无脊椎动物和脊椎动物硬骨鱼类中，高等动物和人类中没有该ABC转运蛋白亚家族的基因。ABCH1基因是ABCH亚家族中的一个基因，它可以参与昆虫的脂质转运等重要的生物学过程，本研究发现昆虫缺失该基因的表达后表现为明显的致死表型。由于高等动物和人类中并没有该ABC转运蛋白基因，故对该基因进行RNA干扰是非常安全的。由于该基因编码蛋白的跨膜结构域部分在不同昆虫中分化较大，因此可以在该区域设计特异性的dsRNA进行专一的害虫防治而不影响其他非靶标昆虫。更重要的是，我们研究发现该基因与昆虫Bt抗性无关，在Bt Cry1Ac杀虫蛋白抗性昆虫中对该基因进行RNA干扰后同样表现出明显的致死表型，这表明该基因可以同时用于昆虫防治和Bt抗性治理。

因此，以害虫关键生理功能基因ABCH1作为基于RNA干扰的害虫防治和Bt抗性治理的分子靶标，通过转基因技术抑制靶标害虫该基因表达的害虫防治新策略具有明显的商业价值和应用前景。

发明内容

针对以上现有化学防治技术存在的各种问题，本发明的目的是提供一种昆虫ABC转运蛋白基因ABCH1的序列及其dsRNA在防治小菜蛾和治理小菜蛾Bt抗性中的应用，相对于传统的化学防治技术，该技术具有高效低毒、安全可靠的优点。

本发明提供一种昆虫ABC转运蛋白基因ABCH1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该序列是在小菜蛾中肠转录组中搜索找到的一个基因片段的基础上，通过cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, 简称RACE)技术进一步克隆得到的全长cDNA序列。该cDNA序列全长3556bp，其中开放阅读框(open reading frame, 简称ORF)为2313bp，编码含有770个氨基酸的蛋白，该蛋白序列如SEQ ID NO.2所示，此外，其5′-UTR (untranslated region, 简称UTR)为110bp，3′-UTR为1133bp。

本发明还提供一种昆虫ABC转运蛋白基因ABCH1的基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，是根据SEQ ID NO.1的氨基酸序列SEQ ID NO.2分析得到的特有跨膜结构域(transmembrane domain, 简称TMD)，设计出含有23-bp的T7启动子的特异性正向引物SEQ ID NO.4和反向引物SEQ ID NO.5进行PCR扩增，然后将得到的PCR产物纯化后进一步使用T7 Ribomax^TM Express RNAi System (Promega, Madison, WI, USA)试剂盒并按照其说明书经体外反转录合成的。

本发明还提供一种dsRNA（由SEQ ID NO.3合成）在致死Bt Cry1Ac敏感和抗性小菜蛾中的应用：显微注射该dsRNA到小菜蛾3龄初幼虫体腔中，结果显示，该dsRNA可以特异性地沉默小菜蛾ABC转运蛋白基因ABCH1的mRNA表达，并导致小菜蛾在幼虫期和随后的蛹期死亡。由此可见，该dsRNA可以同时用于小菜蛾的防治和Bt抗性治理。

本研究通过注射发现害虫关键生理功能基因ABCH1的特异性dsRNA可以致死Bt敏感和抗性的害虫，从而证明ABCH1的特异性dsRNA可以作为基于RNA干扰的害虫防治和Bt抗性治理的分子靶标。可以通过转基因技术转入该害虫关键生理功能基因ABCH1的特异性dsRNA来抑制靶标害虫该基因的表达并致死靶标害虫，从而达到田间害虫治理的目的。因此，基于害虫关键生理功能基因ABCH1的转基因RNA干扰技术是一种害虫防治新策略，它具有明显的商业价值和应用前景。总结来说，本发明具有以下有益效果如下,

(1)特异性干扰害虫专一基因，对高等动物和人类安全；(2)杀虫具有专一性，对非靶标生物安全；(3)对环境无毒无害。因此，本发明相对于传统的害虫防治方法具有明显的技术优势。

附图说明

图1：为小菜蛾ABC转运蛋白基因ABCH1功能结构域分布示意图。长方形表示该基因的跨物种保守的核酸结合结构域(nucleotide-binding domain, 简称NBD)，竖条长方形表示该基因的物种特有的跨膜结构域(transmembrane domain, 简称TMD)中的6个跨膜区。本研究中设计的ABCH1基因特异性dsRNA区域已标出。

图2：小菜蛾Bt Cry1Ac敏感种群DBM1Ac-S和小菜蛾Cry1Ac抗性近等基因系种群NIL-R的4龄幼虫中肠的ABCH1基因mRNA的表达量检测，用L32基因作为内参基因，相同字母表示无显著性差异(P > 0.05; Holm-Sidak’s test; n = 3)。

图3：(A)小菜蛾Bt Cry1Ac敏感种群DBM1Ac-S的3龄初幼虫显微注射SEQ ID NO.3合成的dsRNA后，在0–120h内每隔24h检测一次ABCH1基因的mRNA表达量情况，用L32基因作为内参基因；(B)注射dsRNA后0–120h内每隔24h统计一次小菜蛾幼虫的死亡率情况。注射Buffer和dsEGFP的为两个实验对照组。

图4：(A)小菜蛾Bt Cry1Ac抗性近等基因系种群NIL-R的3龄初幼虫显微注射SEQ ID NO.3合成的dsRNA后，在48h检测一次ABCH1基因的mRNA表达量情况，L32基因作为内参基因，不同字母表示显著性差异(P < 0.05; Holm-Sidak’s test; n = 3)；(B)注射dsRNA后120h统计的小菜蛾幼虫死亡率情况，注射Buffer和dsEGFP的作为两个实验对照组。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步描述与说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实验前材料样品准备：

(1) 小菜蛾Bt杀虫蛋白敏感种群(DBM1Ac-S)：该小菜蛾种群在中国农业科学院蔬菜花卉研究所昆虫组昆虫饲养室内用无虫甘蓝苗进行继代饲养，期间未接触任何有毒杀虫剂，对Bt制剂及其产生的Cry类杀虫蛋白敏感。记载过小菜蛾Bt敏感种群(DBM1Ac-S)的非专利文献是：Yang, Z.X., Wu, Q.J., Wang, S.L., Chang, X.L., Wang, J.H., Guo, Z.J., Lei, Y.Y., Xu, B.Y., Zhang, Y.J. (2012) Expression of cadherin, aminopeptidase N and alkaline phosphatase genes in Cry1Ac-susceptible and Cry1Ac-resistant strains of Plutella xylostella (L.). Journal of Applied Entomology, 136, 539–548.

(2) 小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性近等基因系种群(NIL-R)：该种群是在敏感种群DBM1Ac-S和原始抗性种群DBM1Ac-R经过多达7次的多组单对杂交、回交及汰选后建立的与DBM1Ac-S敏感种群遗传背景高度相似的近等基因系Cry1Ac抗性种群，目前其Cry1Ac的抗性倍数相对于敏感种群DBM1Ac-S已高达4000倍。该种群建成后在本实验室内用Bt杀虫蛋白Cry1Ac进行持续抗性汰选，连续饲养至今。记载过该小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性近等基因系种群(NIL-R)的非专利文献是：Zhu, X., Lei, Y., Yang, Y., Baxter, S.W., Li, J., Wu, Q., Wang, S., Xie, W., Guo, Z., Fu, W., Zhang, Y. (2014) Construction and characterisation of near-isogenic Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) strains resistant to Cry1Ac toxin. Pest Management Science, DOI: 10.1002/ps.3785.

以上所用的2个种群包括小菜蛾Bt杀虫蛋白敏感种群(DBM1Ac-S)和小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性近等基因系种群(NIL-R)本实验室均有饲养和保存，可向公众发放用于实验研究。

上述两个小菜蛾种群均在室内进行隔离饲养，将蛹放入成虫饲养笼中（R=10 cm，L=40 cm），笼四周以80目的纱网包围，成虫羽化后，笼内挂浸过10%蜂蜜糖水的脱脂棉球一个，为成虫补充营养，让其在甘蓝苗或萝卜苗上产卵，卵孵化后再用靠接法转入新鲜的甘蓝苗上饲养。饲养温度是25±1°C，相对湿度为60%–70%，光周期为光照：黑暗=16h：8h。

实施例1：小菜蛾ABC转运蛋白基因ABCH1的克隆及Bt Cry1Ac抗敏差异比较

1. 小菜蛾ABCH1基因的序列克隆

(1) 小菜蛾ABCH1基因的序列在小菜蛾中肠转录组数据库中的搜索

基于本实验室小菜蛾中肠转录组数据库，采用生物信息学方法对小菜蛾ABCH1基因的序列进行搜索，经过序列分析及比对后，共获得1条小菜蛾ABCH1基因的序列片段，该cDNA 序列为ABCH1基因的中间序列片段。

(2) 小菜蛾ABCH1基因的全长cDNA序列获得

基于已获得小菜蛾ABCH1基因片段，采用Primer Premier 5.0软件设计3′, 5′-RACE引物。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。提取小菜蛾4龄幼虫总RNA，用RACE试剂盒(Clontech)合成RACE模板，用于全长cDNA序列克隆。经PCR扩增后，将得到PCR产物纯化并亚克隆转化到大肠杆菌中送测序。结果分析后，拼接得到小菜蛾ABCH1基因的cDNA全长序列，并进一步通过Primer Premier 5.0软件设计一个特异性全长引物进行验证，PCR克隆并测序验证后的全长序列如SEQ ID NO.1所示。

2. 小菜蛾ABCH1基因在Bt Cry1Ac抗敏种群中差异比较

(1) 小菜蛾ABCH1基因序列在Bt Cry1Ac抗敏种群中差异比较

提取小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac敏感种群DBM1Ac-S和小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性近等基因系种群NIL-R的4龄幼虫中肠总RNA，反转录合成cDNA后，利用ABCH1基因全长引物进行PCR克隆，连接转化后送测序，将测序得到的抗敏ABCH1基因全长序列进行序列差异比对分析。比对结果发现，两Bt Cry1Ac抗敏种群间ABCH1基因仅存在3个稳定的突变位点（请见表1），然而，这3个突变位点均为同义突变，所以它们不可能参与抗性。因此，小菜蛾ABCH1基因序列变异与小菜蛾Bt Cry1Ac抗性无关。

表1. 小菜蛾DBM1Ac-S和NIL-R的4龄幼虫中肠ABCH1基因序列突变检测

 注：表中位置是相对于小菜蛾ABCH1基因的cDNA或蛋白全长序列。

(2) 小菜蛾ABCH1基因表达量在Bt Cry1Ac抗敏种群中差异比较

提取小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac敏感种群DBM1Ac-S和小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性近等基因系种群NIL-R的4龄幼虫中肠总RNA，反转录合成cDNA后，以L32为内参基因，使用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR, 简称qPCR)技术检测目的基因ABCH1的相对表达量（图2）。结果显示，小菜蛾Bt Cry1Ac抗敏种群间ABCH1基因的表达量无显著性差异，这表明小菜蛾ABCH1基因表达量与小菜蛾Bt Cry1Ac抗性无关。

实施例2：小菜蛾ABCH1基因的dsRNA准备

(1) 小菜蛾ABCH1基因的dsRNA引物的设计

基于已克隆得到的小菜蛾ABCH1基因全长序列SEQ ID NO.1，使用Primer Premier 5.0软件，根据SEQ ID NO.1序列编码的氨基酸序列SEQ ID NO.2分析得到的特有跨膜结合域TMD（图1）设计出含有23-bp的T7启动子的特异性正向引物SEQ ID NO.4和反向引物SEQ ID NO.5。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

(2) 小菜蛾ABCH1基因的dsRNA的合成和注射前准备

利用上述引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，通过PCR扩增得到单一PCR产物，经进一步纯化后再使用T7 Ribomax^TM Express RNAi System (Promega, Madison, WI, USA)试剂盒并按照其说明书经体外反转录合成小菜蛾ABCH1基因的特异性dsRNA，使用注射缓冲液injection buffer [10 mM Tris–HCl (pH 7.0); 1 mM EDTA]溶解得到的dsRNA，该dsRNA样品通过1%琼脂糖凝胶电泳检验其纯度并进一步使用SpectraMax M2e酶标仪测定其终浓度。在显微注射前，将该dsRNA与25°C温浴处理20 min的Metafectene PRO转染试剂按照1:1的体积比充分混匀并调整终浓度为4.3μg/μl。

实施例3：小菜蛾ABCH1基因dsRNA导致小菜蛾幼虫和蛹期的致死表型

1. 小菜蛾ABCH1基因显微注射

将小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac敏感种群DBM1Ac-S和小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性近等基因系种群NIL-R的3龄初小菜蛾幼虫饥饿处理6h并冰冻麻醉30min后，将300μg (70μl)准备好的dsRNA溶液用Nanoliter 2000显微注射仪从幼虫腹部节间膜处注入体腔，每个处理组共注射90头，3次生物学重复（每个重复30头）。注射相同体积浓度的Buffer和dsEGFP（均混有处理组相同体积的Metafectene PRO转染试剂）至两个对照组体内，然后将注射后的小菜蛾置于正常的饲养条件中饲养。

2. 小菜蛾ABCH1基因沉默效果检测

对于小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac敏感种群DBM1Ac-S的3龄初幼虫，选择dsRNA注射后0–120h内每隔24h进行基因沉默效果检测，提取各虫体样品的总RNA并反转录成cDNA。使用RT-PCR技术检测目的基因ABCH1表达量情况，以L32作为内参基因校正样本cDNA的差异，结果显示在ABCH1基因dsRNA注入48h后出现最大的沉默效果，而且该沉默效果在其后可以维持至少48h（图3A）。

对于小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性近等基因系种群NIL-R的3龄初幼虫，选择dsRNA注射后48h进行基因沉默效果检测，提取各虫体样品的总RNA并反转录成cDNA，每组设置3个生物学重复。以L32为内参基因，使用qPCR技术检测目的基因ABCH1的相对表达量，以计算目的基因ABCH1的沉默效果。实验结果显示，小菜蛾幼虫在注入ABCH1基因的dsRNA 48h后，其ABCH1基因的表达量显著下降(> 90%)，这说明ABCH1基因的沉默效果非常显著（图4A）。

3. 小菜蛾在注入ABCH1基因的dsRNA后幼虫死亡率的观察

小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac敏感种群DBM1Ac-S的3龄初幼虫在注入ABCH1基因的dsRNA后0–120h内，小菜蛾的死亡率逐渐上升，在注射后120h时，死亡率已高达95%（图3B）。而小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性近等基因系种群NIL-R的3龄初幼虫在注入ABCH1基因的dsRNA后120h时，小菜蛾幼虫的死亡率也同样高达94%（图4B）。这些实验结果表明，ABCH1基因的dsRNA能同时致死Bt Cry1Ac敏感和抗性的小菜蛾幼虫。

4. 注入小菜蛾ABCH1基因dsRNA后小菜蛾蛹期生物学观察

对于小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac敏感种群DBM1Ac-S和小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性近等基因系种群NIL-R的3龄初幼虫在注入ABCH1基因的dsRNA 120h后存活的少量4龄幼虫，让其自然发育并观察其后续的生物学特性（表2）。结果显示，两种群存活小菜蛾幼虫化蛹率和蛹重均显著性下降，更重要的是，其羽化率均为0，即这些在ABCH1基因的dsRNA注射后存活的少量小菜蛾幼虫也都在蛹期死亡，这表明ABCH1基因dsRNA的3龄初注射不仅能致死大部分Bt Cry1Ac敏感和抗性的小菜蛾幼虫，同时也能导致后续存活的Bt Cry1Ac敏感和抗性的小菜蛾在蛹期全部死亡（表2），因此，ABCH1基因可以作为基于RNA干扰的小菜蛾防治和Bt抗性治理的靶标基因。

表2. 小菜蛾DBM1Ac-S和NIL-R的3龄初幼虫显微注射dsRNA后对存活4龄幼虫随后生物学参数的影响

注：表中不同的字母表示同一种群相同生物学参数具有显著性差异 (Holm-Sidak’s test; P < 0.05; n = 3)。

<110>  中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120>  ABC转运蛋白基因ABCH1及其特异性dsRNA在小菜蛾防治和Bt抗性治理中的应用

<160>  5

 

<210>  1

<211>  3556

<212>  DNA

<213>  小菜蛾

 

<220> 

<221>  起始密码子

<222> (111)..(113)

 

<220> 

<221>  终止密码子

<222> (2421)..(2423)

 

<220> 

<221>  多聚腺苷酸尾

<222> （(3518)..(3523)

 

<400> 1

TAATTGTGCAACGCGAGTGCCGATACTAATTAATTTCCGATCGAACCAGTGTGTGTTCTTTGTGCTTGTGCCGAGGAAGTGCATATGATACAGGAGCCGCCGGCCACACTATGCTTATAACGGAGAGCTCGCCGCCGTCGCCGCCGGGCGACGAGAAGGAGTCCAAGATGAGCCAGATACAGTTCTCACAGCCCTTCGACGAGGACGCCTCGGTGTGGTCGAAGCGGCAACAGGCGGTGTGCGTGAGACACGCCTACAAGCACTACGGCTCCAACAAGCGGCCCAACCACGTGCTCAGCAACCTCAACATGACCGTCGCCAAGGGGACCATCTACGGTCTGCTGGGCGCGTCGGGCTGCGGCAAGACGACGCTGCTGTCGTGCATCGTGGGGCGCCGCAAGCTCAACAGCGGGGAGATCTGGGTGCTGGGCGGCAAGCCCGGGACTAAAGGCTCGGGCGTGCCGGGCAAGCGCGTGGGCTACATGCCGCAGGAGATCGCGCTGTACGGAGAGTTCACCATCAAGGAGACCATGATGTACTTCGGCTGGATCTTCGGCATGAAGACGTCGGAGATCCTGGAGCGGCTGCGCTTCCTGCTGGACTTCCTCGACCTGCCCAGCGAGAACAGGATGGTCAAGAACCTCAGCGGCGGTCAGTCGCGGCGCGTGTCGTTCGCGGTGGCGCTGATGCACGACCCCGAGCTGCTGATCCTGGACGAGCCCACGGTGGGCGTGGACCCGCTGCTGCGCCAGTCCATCTGGACGCACCTCGTGCGCATCACCGGCGCCGCCGACAAGACCGTCATCATCACCACGCACTACATCGAGGAGGCGCGCCAGGCGCACACCATAGGTCTGATGCGGAGCGGGCGGCTGCTGGCGGAGCAGTCTCCTCAGGCGCTGCTGCAGATGTACAACTGCATCTCACTCGAAGACGTCTTCCTCAAGCTGTCCCGGAAACAGGCAGGTCAGTCCAACCAGGCGGTAGAGCTCCAAGTGGCGGGCGGGCTCGGGCTCACCAAGCTGTCGCGGCGCGAGGAGGCGCCCTACGCCCACGAGGATGCGCACGTCAAGGGGCTCAACTTCCACCAGAGCAAGGAGGTGCTCATCACGGACCACAATGGCGTTAGTAATGGCGATATTCCCGGCAAGATCGCGCCGAGCATGAAGGCCGACTGTGATGACTGCGGAGACTGCTTGAGTCCACTCCTGAATTTCACCTCCCGAGGGAAGATCAAGGCGCTGATCCAGAAGAACTTCCTGCGCATGTGGAGGAACATCGGGGTGATGCTGTTCATCTTCGTTCTGCCCGTCATGCAGGTCATCCTGTTCTGTCTCGCCATCGGACGGGACCCCGTCGGGCTGAGACTGGCGATAGTAAACAACGACGTGAACGTAGTGGACGGCTACTGTCCGTACAACAACACGTGCTCCATGAAGAACCTGTCCTGCCGCTACCTCGACCACCTCAAGAACCAGTCCATCATCAAGGAGTACTACGCCGACCTCGAAAGCGCCATCAACGCCGTCAAGGAGGGGCAGGCGTGGGGCGCCATCTACTTCAATGAGAATTATACAGACTCTCTGGTCGCGAGACTGGCTTTGGCTGACACTGCGGACGACGAGACCATCGAGTCGTCAGAAGTGCAGGTGTGGCTCGACATGTCCAACCAGCAGATCGGCCTCATGCTCAACCGAGACATACAGTTCTCATACAGGGACTTCGCTAAGAACTTGCTGTCGACTTGCGACTACAACCCGAAGGTGGGCGACATCCCGATCGACTTCAAGGAGCCCATCTACGGCGACACCAACCCCTCCTTCACTGACTTCGTCGCTCCCGGTGTTATTCTCACTATCGTGTTCTTCCTGGCGGTGGCGCTGACGTCGTCGGCGCTGATCGTGGAGCGCATGGAGGGGCTGCTGGACCGCTCGTGGGTGGCCGGCGTGTCCCCCGGGGAGATCCTGTTCTCGCACGTCGTCACGCAGTTCGTCGTCATGTGCGGCCAGACCGCGCTCGTGCTCGTGTTCATGATACTGGTGTTCGGCGTCAAGTGTAACGGGAATATCTTCTTTGTGGTCCTGTTGACGCTGCTGCAAGGTCTGTGCGGGATGTGCTTCGGCTTCGTAATCTCCGCCGCGTGCGAACTGGAACGAAACGCGATCCAGCTAGCACTCGGCTCATTCTACCCCACGCTTCTTCTGAGCGGGGTGATCTGGCCCATCGAGGGCATGCCGTGGATCCTGCGCTACATCTCCACGTGTCTGCCGCTGACTCTGGCGACCTCCTCGCTGCGGTCCATCCTGACCCGCGGCTGGCCCATCACCGACCCCGAGGTCTACATGGGCTTCATCTCCACCCTCATCTGGATCGCTCTGTTCCTCGTAGTCACCATCACAGTTCTAAGGTTCAAGAAAGGATAAGCTGGTCTCTAGTTGTTAAACTGCTCAATGTGCACGACACTCGGTGTCGCGGTGTAGGTTGTTAGAACTGCGAGTGGGCACGATGTTGGAGGCCTCACTCGGTTATTGCTCAAATCACAATGAACAAACTTTATGTTTCTAATATGGGTTTTAGATGTTTTAGCTAATTTGACTGTTAGGAGATGTAAATAGTAGATTTTGGTATTTATATTTGTAATTCGATTTAAGTACTTTAAGGCAGGTACTTGTATTTTATAATAGTTAAGGTGGTTCACTAGGGAATGTTAGCAACTATGATGCGTCAACGACTTTTAATGAATTTCTGTTTAATTTTATTATAAGACAAATGTATTTTTCATGGCTGAGGATTCTTATTACTATTTTTCACTAGGAAATGGATTATGAGCTAATTATATTTACGTTGAGATACCTGAATGAGCAAGTTACCATAGATAATAGGATGGTGCCATAGACAAGCAAGAATTTGTTGAACCTTTCTCCAAAGTCACTATCTTTCATTTTAATCTGACCTTTATTTTATCTGTTTCGCTTGCGAGCGGTGGTGCGAATTCGTATTTTAAAATTAATTTGATGTAGTTTTAACAAAATACGTAATGTCGAATAATGATGAGTAATCGAAATAATTATTATATTGAAAATTAATTTGGTACGTTTATATTAATCGATAAATCTAGTTTTATGTTGTAAGTCACAAATGGCATGTATTTGACAGCAAAAGTAGTATTTAAGTGAATATGTACAGATGTAAAATTTAGGACTTGTCGAGGTTTTTCAAAGACCTATATTGTAGCCTAGATTTTTATGTGACTAGGGTGTATATTAATATTATAGTTGTGGTGTGTGCTTTATGTTTTTTTATGAAACTGGATTAAGTTACGGGATAAAATGAACGTCCAACCAACATTGATGTTCAAATATTGGATCAGCTGTGGGCTGCTTCCTTCATCAGCTGTGGATTAACAAGACAGCTGACAGTTTCATAACAAAATGACAATTATTGCAATAAAATAACGTATTTAGAAGTGTCTGACTGTGATTATTTTTGCTAACATTGACATTTTTGTAATGATAGTAATAAACGATAATATTGTACCAAAAAAAAAAAAAAAAAA

 

<210>  2

<211>  770

<212>  氨基酸

 

<400>  2

Met Leu Ile Thr Glu Ser Ser Pro Pro Ser Pro Pro Gly Asp Glu Lys Glu Ser Lys Met Ser Gln Ile Gln Phe Ser Gln Pro Phe Asp Glu Asp Ala Ser Val Trp Ser Lys Arg Gln Gln Ala Val Cys Val Arg His Ala Tyr Lys His Tyr Gly Ser Asn Lys Arg Pro Asn His Val Leu Ser Asn Leu Asn Met Thr Val Ala Lys Gly Thr Ile Tyr Gly Leu Leu Gly Ala Ser Gly Cys Gly Lys Thr Thr Leu Leu Ser Cys Ile Val Gly Arg Arg Lys Leu Asn Ser Gly Glu Ile Trp Val Leu Gly Gly Lys Pro Gly Thr Lys Gly Ser Gly Val Pro Gly Lys Arg Val Gly Tyr Met Pro Gln Glu Ile Ala Leu Tyr Gly Glu Phe Thr Ile Lys Glu Thr Met Met Tyr Phe Gly Trp Ile Phe Gly Met Lys Thr Ser Glu Ile Leu Glu Arg Leu Arg Phe Leu Leu Asp Phe Leu Asp Leu Pro Ser Glu Asn Arg Met Val Lys Asn Leu Ser Gly Gly Gln Ser Arg Arg Val Ser Phe Ala Val Ala Leu Met His Asp Pro Glu Leu Leu Ile Leu Asp Glu Pro Thr Val Gly Val Asp Pro Leu Leu Arg Gln Ser Ile Trp Thr His Leu Val Arg Ile Thr Gly Ala Ala Asp Lys Thr Val Ile Ile Thr Thr His Tyr Ile Glu Glu Ala Arg Gln Ala His Thr Ile Gly Leu Met Arg Ser Gly Arg Leu Leu Ala Glu Gln Ser Pro Gln Ala Leu Leu Gln Met Tyr Asn Cys Ile Ser Leu Glu Asp Val Phe Leu Lys Leu Ser Arg Lys Gln Ala Gly Gln Ser Asn Gln Ala Val Glu Leu Gln Val Ala Gly Gly Leu Gly Leu Thr Lys Leu Ser Arg Arg Glu Glu Ala Pro Tyr Ala His Glu Asp Ala His Val Lys Gly Leu Asn Phe His Gln Ser Lys Glu Val Leu Ile Thr Asp His Asn Gly Val Ser Asn Gly Asp Ile Pro Gly Lys Ile Ala Pro Ser Met Lys Ala Asp Cys Asp Asp Cys Gly Asp Cys Leu Ser Pro Leu Leu Asn Phe Thr Ser Arg Gly Lys Ile Lys Ala Leu Ile Gln Lys Asn Phe Leu Arg Met Trp Arg Asn Ile Gly Val Met Leu Phe Ile Phe Val Leu Pro Val Met Gln Val Ile Leu Phe Cys Leu Ala Ile Gly Arg Asp Pro Val Gly Leu Arg Leu Ala Ile Val Asn Asn Asp Val Asn Val Val Asp Gly Tyr Cys Pro Tyr Asn Asn Thr Cys Ser Met Lys Asn Leu Ser Cys Arg Tyr Leu Asp His Leu Lys Asn Gln Ser Ile Ile Lys Glu Tyr Tyr Ala Asp Leu Glu Ser Ala Ile Asn Ala Val Lys Glu Gly Gln Ala Trp Gly Ala Ile Tyr Phe Asn Glu Asn Tyr Thr Asp Ser Leu Val Ala Arg Leu Ala Leu Ala Asp Thr Ala Asp Asp Glu Thr Ile Glu Ser Ser Glu Val Gln Val Trp Leu Asp Met Ser Asn Gln Gln Ile Gly Leu Met Leu Asn Arg Asp Ile Gln Phe Ser Tyr Arg Asp Phe Ala Lys Asn Leu Leu Ser Thr Cys Asp Tyr Asn Pro Lys Val Gly Asp Ile Pro Ile Asp Phe Lys Glu Pro Ile Tyr Gly Asp Thr Asn Pro Ser Phe Thr Asp Phe Val Ala Pro Gly Val Ile Leu Thr Ile Val Phe Phe Leu Ala Val Ala Leu Thr Ser Ser Ala Leu Ile Val Glu Arg Met Glu Gly Leu Leu Asp Arg Ser Trp Val Ala Gly Val Ser Pro Gly Glu Ile Leu Phe Ser His Val Val Thr Gln Phe Val Val Met Cys Gly Gln Thr Ala Leu Val Leu Val Phe Met Ile Leu Val Phe Gly Val Lys Cys Asn Gly Asn Ile Phe Phe Val Val Leu Leu Thr Leu Leu Gln Gly Leu Cys Gly Met Cys Phe Gly Phe Val Ile Ser Ala Ala Cys Glu Leu Glu Arg Asn Ala Ile Gln Leu Ala Leu Gly Ser Phe Tyr Pro Thr Leu Leu Leu Ser Gly Val Ile Trp Pro Ile Glu Gly Met Pro Trp Ile Leu Arg Tyr Ile Ser Thr Cys Leu Pro Leu Thr Leu Ala Thr Ser Ser Leu Arg Ser Ile Leu Thr Arg Gly Trp Pro Ile Thr Asp Pro Glu Val Tyr Met Gly Phe Ile Ser Thr Leu Ile Trp Ile Ala Leu Phe Leu Val Val Thr Ile Thr Val Leu Arg Phe Lys Lys Gly

 

<210>  3

<211>  492

<212>  DNA

 

<220> 

<221>  上游T7启动子

<222> (1)..(23)

 

<220> 

<221>  下游T7启动子

<222> (492)..(470)

<400> 3

TAATACGACTCACTATAGGGAGATGCGACTACAACCCGAAGGTGGGCGACATCCCGATCGACTTCAAGGAGCCCATCTACGGCGACACCAACCCCTCCTTCACTGACTTCGTCGCTCCCGGTGTTATTCTCACTATCGTGTTCTTCCTGGCGGTGGCGCTGACGTCGTCGGCGCTGATCGTGGAGCGCATGGAGGGGCTGCTGGACCGCTCGTGGGTGGCCGGCGTGTCCCCCGGGGAGATCCTGTTCTCGCACGTCGTCACGCAGTTCGTCGTCATGTGCGGCCAGACCGCGCTCGTGCTCGTGTTCATGATACTGGTGTTCGGCGTCAAGTGTAACGGGAATATCTTCTTTGTGGTCCTGTTGACGCTGCTGCAAGGTCTGTGCGGGATGTGCTTCGGCTTCGTAATCTCCGCCGCGTGCGAACTGGAACGAAACGCGATCCAGCTAGCACTCGGCTCATTCTACCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA

 

<210>  4

<211>  42

<212>  DNA

 

<220> 

<221>  T7启动子

<222> (1)..(23)

 

<400> 4

TAATACGACTCACTATAGGGAGATGCGACTACAACCCGAAGG

 

<210>  5

<211>  43

<212>  DNA

 

<220> 

<221>  T7启动子

<222> (1)..(23)

 

<400> 5

TAATACGACTCACTATAGGGAGAGGGTAGAATGAGCCGAGTGC

 

 

 

Claims (8)

1.一种昆虫ABC转运蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述昆虫ABC转运蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.一种昆虫ABC转运蛋白基因的基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.一种dsRNA，其特征在于：其是与权利要求2所述的基因中的跨膜结合域具有互补性。

6.如权利要求5所述的dsRNA，其特征在于：它是由含有23-bp的T7启动子的特异性正向引物SEQ ID NO.4和反向引物 SEQ ID NO.5扩增得到的PCR产物纯化后经体外反转录合成的。

7.根据权利要求5或6所述的dsRNA在防治小菜蛾和治理小菜蛾Bt抗性中的应用。

8.根据权利要求2或3所述昆虫ABC转运蛋白的编码基因在防治小菜蛾和治理小菜蛾Bt抗性中的应用，其特征在于：将其作为抑制靶标，通过dsRNA干扰抑制其表达。