CN115948391A - 一种靶向鸡甲基化转移酶基因METTL16的siRNA、试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了靶向鸡甲基化转移酶基因METTL16的siRNA及其应用，其正义链的序列为5’‑CUCACACGGAAUUCUGUCA‑3’，反义链的序列为5’‑UGACAGAAUUCCGUGUGAG‑3’。同时，本发明还公开了含有特异性敲降鸡METTL16基因表达的siRNA的试剂盒，以及含有编码特异性敲降鸡METTL16基因表达的siRNA的核苷酸序列的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。本发明的siRNA通过特异性干扰鸡METTL16基因表达来鉴定基因功能，可应用于优质鸡的遗传育种以及为人类疾病研究提供参考数据，具有很大的经济价值和科研价值。

Description

一种靶向鸡甲基化转移酶基因METTL16的siRNA、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于siRNA技术领域，涉及靶向鸡甲基化转移酶METTL16基因的siRNA、试剂盒及其应用。

背景技术

肌纤维是肌肉的基本构成单位，不同肌纤维类型组成赋予了不同肌肉群特定的生理特性和功能。肌纤维类型不仅与运动、肌肉代谢疾病(如肥胖症、2型糖尿病、肌肉萎缩等)密切相关，还与畜禽肉品质有着密切联系。总体上，慢肌纤维含量多的肌肉品质要优于快白肌纤维含量多的肌肉。

研究表明，RNA甲基化修饰，尤其是N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladen osine,m6A)是真核生物体内广泛存在的RNA水平表观遗传修饰，在细胞分化、发育和压力应答等多种生理功能中均有重要作用。参与m6A甲基化修饰的酶有甲基化转移酶(Writers)、去甲基化酶(Erasers)和甲基化阅读蛋白(Readers)，其中甲基化转移酶上保守的motif能催化RNA上的腺苷酸发生m6A甲基化修饰，而去甲基化酶主要作用是对已经发生m6A修饰的碱基进行去甲基化修饰，阅读蛋白主要功能是识别发生m6A修饰的碱基，从而激活下游的调控通路如RNA降解、miRNA加工等。研究表明，RNA m6A修饰在鸡肌纤维类型形成及转化中可能发挥重要作用。

鸡一直是生命科学研究中极有价值的模式动物。在鸡骨骼肌中开展肌纤维类型形成及转化的分子遗传学基础研究，其成果不仅对提升我国家禽产品的市场竞争力具有重要意义，而且对于揭示人类骨骼肌代谢功能异常引起的肌肉相关疾病的分子机理也具有很好的借鉴价值。但是现有技术中并未有利用siRNA干扰鸡甲基化转移酶METTL16基因表达的相关报道。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提供了靶向鸡甲基化转移酶基因METTL16的siRNA、试剂盒及其应用。

第一方面，本发明提供了一种靶向鸡甲基化转移酶基因METTL16的siRNA，其特征在于，所述siRNA的正义链的序列为5’-CUCACACGGAAUUCUGUCA-3’(SEQ NO.1)，反义链的序列为5’-UGACAGAAUUCCGUGUGAG-3’(SEQ NO.2)。

进一步地，所述正义链和反义链的3’端还添加有两个垂悬碱基dT。

第二方面，本发明提供了含有编码本发明第一方面所述的靶向鸡甲基化转移酶基因METTL16的siRNA的核苷酸序列的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。

第三方面，本发明还提供了一种含有本发明第一方面所述的靶向鸡甲基化转移酶基因METTL16的siRNA的试剂盒。

进一步地，所述试剂盒还包括用于检测鸡甲基化转移酶基因METTL16表达的引物组。

第四方面，本发明还提供了本发明第一方面所述的siRNA、本发明第二方面所述的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌、本发明第三方面所述的试剂盒在鉴定鸡甲基化转移酶基因METTL16功能中的应用。

本发明相对于现有技术而言，提供了一种能够靶向鸡甲基化转移酶基因METTL16的siRNA，将其转入鸡成肌细胞后可以有效降低鸡甲基化转移酶基因METTL16的表达，抑制效率达到50％以上，可见其敲降效率很高。本发明的siRNA通过特异性敲降鸡甲基化转移酶基因METTL16的表达来鉴定基因功能，可应用于优质鸡的遗传育种以及为人类疾病研究提供参考数据，具有很大的经济价值和科研价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1是不同siRNA在原代成肌细胞增殖期和分化期干扰鸡METTL16基因表达的效率，其中，*表示干扰组与NC对照组相比，差异显著(P<0.05)；**表示干扰组与NC对照组相比，差异极显著(P<0.01)；

图2是CCK-8检测鸡成肌细胞中METTL16基因表达敲低后对细胞增殖的影响，同一时间点干扰组与NC对照组比较，*表示差异显著(P<0.05)；

图3是CCL检测鸡成肌细胞中METTL16基因表达敲低后对细胞增殖的影响，同一时间点干扰组与NC对照组比较，相同字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；

图4是检测鸡成肌细胞中METTL16基因表达敲低后对细胞增殖分化相关基因表达的影响，其中，*表示干扰组与NC对照组相比，差异显著(P<0.05)；

图5是鸡METTL16基因表达敲低后RNA-seq筛选的差异表达基因个数；

图6是鸡METTL16基因表达敲低后差异表达基因的KEGG富集分析；

图7是鸡METTL16基因的mRNA序列与其它物种METTL16基因mRNA序列同源性分析图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。以下实施例中如无特别说明，均为常规方法，所用的试剂均为市售试剂。

实施例1靶向鸡METTL16基因siRNA最佳序列筛选

1.1 siRNA设计

根据NCBI在线数据库，获得鸡METTL16基因mRNA序列信息(登录号：NM_001031602.2)，采用优化的siCatchTM siRNA设计软件，设计3对靶向鸡METTL16基因CDS区的siRNA。设计时从靶基因起始密码子AUG下游100bp的核苷酸开始搜寻理想的siRNA，避开外显子与外显子的交界区域。为了增强siRNA双链复合体的稳定性，在每对siRNA的正义链和反义链3’端添加2个垂悬碱基dT，由广州锐博生物科技有限公司合成。设计获得的3对siRNA的序列如表1所示，3对siRNA靶向的序列如表2所示，靶点分别起始于541、852、962。

表13对siRNA的序列

表23对siRNA的靶向序列

siRNA	靶向序列(5’-3’)	起始位点	序列编号
				METTL16 siRNA1	GGATGCACTGAAAGAAGAA	541	SEQ ID NO.7
METTL16siRNA2	CTCACACGGAATTCTGTCA	852	SEQ ID NO.8
				METTL16siRNA3	CCTCGAAAGCCAATTACAT	962	SEQ ID NO.9

1.2 siRNA转染原代鸡成肌细胞

从动物组织中分离提取的原代细胞保持了细胞在体内许多重要生物学特征和功能，因此原代细胞不仅被广泛应用于分子、细胞生物学和生物医学基础研究，而且在生物医药领域更具有不可替代性的作用。但相对于细胞系，原代细胞难培养、外源基因转染效率低。本实施例以从11胚龄鸡胚腿肌分离提取的原代鸡成肌细胞为转染细胞，分别在细胞增殖期和分化期转染siRNA。

(1)增殖期转染

将分离提取的原代鸡成肌细胞以1×10⁵个细胞/孔的密度接种24孔培养板，培养过夜后，在细胞处于增殖期时，借助转染试剂Lipofectamine 3000将3对靶向鸡METTL16基因的siRNA转染和阴性对照siRNA NC分别转染入鸡成肌细胞，每组设4个重复孔，转染浓度为100n mol/L。

(2)分化期转染

将分离提取的原代鸡成肌细胞以3×10⁵个细胞/孔的密度接种24孔培养板，待细胞密度生长至70-90％时，用含有5％马血清的培养基替代含有20％胎牛血清的培养基，诱导细胞分化，培养1d后，借助转染试剂Lipofectamine 3000将3对靶向鸡METTL16基因的siRNA转染和阴性对照siRNA NC分别转染入鸡成肌细胞，每组设4个重复孔，转染浓度为100n mol/L。

1.3 RNA提取和cDNA制备

转染48h后，每孔用PBS清洗2次，选择南京诺唯赞生物科技股份有限公司提取细胞总RNA的试剂RNAisolater Total RNA Extraction Reagent收集和提取转染细胞的总RNA。核酸定量仪测定RNA浓度。按照南京诺唯赞生物科技股份有限公司的HiScriptⅢRTSuperMix for qPCR说明书进行cDNA合成。

1.4实时荧光定量PCR检测siRNA干扰效率

选择南京诺唯赞生物科技股份有限公司的HiScriptⅢRT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)试剂采用SYBR GreenΙ法进行实时荧光定量PCR检测siRNA特异性干扰鸡METTL16基因表达的效率。实时荧光定量PCR反应的体系如表3所示。每个样品设置3个重复。

表3实时荧光定量PCR反应的体系

检测鸡METTL16基因表达的引物对核酸序列如下：

上游引物：5’-GAGGTTGCGGTGGTACAGTT-3’(SEQ ID NO.10)

下游引物：5’-TGCCAGTGCCCATCTCATAGT-3’(SEQ ID NO.11)

检测鸡内参ACTB基因表达的引物对核酸序列如下：

上游引物：5’-TGCTGTGTTCCCATCTATCG-3’(SEQ ID NO.12)

下游引物：5’-TTGGTGACAATACCGTGTTCA-3’(SEQ ID NO.13)

3对siRNA特异性干扰鸡METTL16基因表达的效率结果见图1。由图1可见，3对siRNA对增殖期、分化期鸡原代细胞中METTL16基因表达的抑制效率，均是siRNA2干扰效率最好，与NC对照组相比，siRNA2的抑制效率均达50％以上，极显著(P<0.01)抑制鸡成肌细胞中鸡METTL16基因的表达，后续实验选择siRNA2用于研究鸡METTL16基因功能。siRNA2的正义链为SEQ ID NO.1所示的碱基序列5’-CUCACACGGAAUUCUGUCA-3’，所述siRNA的反义链为SEQID NO.2所示的碱基序列5’-UGACAGAAUUCCGUGUGAG-3’，正义链和反义链的3’端还添加有两个垂悬碱基dT。

实施例2 METTL16基因敲低表达后对细胞增殖的影响

选择南京诺唯赞生物科技股份有限公司的细胞增殖检测试剂CCK-8CellCounting Kit(CCK-8)和Cell Counting-Lite 2.0Luminescent Cell Viability Assay(CCL)检测鸡成肌细胞中METTL16基因敲低表达后对细胞增殖能力的影响，CCK-8检测结果见图2，CCL检测结果见图3。由图2和图3可见，在转染siRNA 2后36h和48h，METTL16基因敲低表达组的细胞增殖能力显著低于对照组，提示，METTL16有促进鸡成肌细胞增殖的作用。

实施例3 METTL16基因敲低表达后对细胞增殖、分化相关基因表达的影响

参考实施例1中1.4实时荧光定量PCR法检测鸡METTL16基因敲低表达后对鸡成肌细胞增殖相关基因Pax7和分化相关基因MyoD1表达的影响，结果见图4。由图4可见，鸡成肌细胞中METTL16基因敲低表达后，显著抑制Pax7和MyoD1基因的表达。

检测鸡Pax7基因表达的引物对核酸序列如下：

上游引物：5’-TCAGCAACCGACGAGCAAG-3’(SEQ ID NO.14)

下游引物：5’-ATGGTGGATGGTGGCAAGG-3’(SEQ ID NO.15)

检测鸡内参MyoD1基因表达的引物对核酸序列如下：

上游引物：5’-CAACGCCATCCGCTACAT-3’(SEQ ID NO.16)

下游引物：5’-GTCGAGGCTGGAAACAAC-3’(SEQ ID NO.17)

实施例4鸡METTL16基因敲低表达后差异表达基因的功能分析

用RNA-seq法分析鸡METTL16基因敲低表达后的差异表达基因，以P<0.05为筛选标准，结果共筛到950个差异表达基因，见图5。由图5可见，相对于NC对照组，鸡METTL16基因敲低表达后，有432个基因上调表达，518个基因下调表达。

进一步用KEGG数据库对差异的表达基因进行功能分析，以P<0.05为筛选标准，结果共富集到9个信号通路，见图6。由图6可见，鸡METTL16基因敲低表达后筛选的差异基因被显著富集到FoxO、胰岛素抵抗等信号通路。

实施例5鸡METTL16基因的mRNA序列与其它物种METTL16基因mRNA序列同源性分析

在NCBI中，将鸡METTL16基因mRNA序列与人、小鼠、鸭及鹅物种中METTL16基因mRNA序列进行同源性分析，结果见图7所示，鸡METTL16基因mRNA序列与人METTL16基因mRNA序列同源性仅为77.79％，与小鼠METTL16基因mRNA序列同源性仅为76.99％，与鸭METTL16基因mRNA序列同源性为86.39％，与鹅METTL16基因mRNA序列同源性为86.47％。可见，鸡METTL16基因mRNA序列与其他物种中的METTL16基因mRNA序列同源性并不高，在针对鸡METTL16基因mRNA选择靶向位点以及siRNA涉及过程中，上述物种的METTL16基因mRNA序列并没有参考价值。

除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

Claims (6)

1.一种靶向鸡甲基化转移酶基因METTL16的siRNA，其特征在于，所述siRNA的正义链的序列为5’-CUCACACGGAAUUCUGUCA-3’(SEQ NO.1)，反义链的序列为5’-UGACAGAAUUCCGUGUGAG-3’(SEQ NO.2)。

2.根据权利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述正义链和反义链的3’端还添加有两个垂悬碱基dT。

3.含有编码权利要求1或2所述的靶向鸡甲基化转移酶基因METTL16的siRNA的核苷酸序列的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。

4.一种含有权利要求1或2所述的靶向鸡甲基化转移酶基因METTL16的siRNA的试剂盒。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于检测鸡甲基化转移酶基因METTL16表达的引物组。

6.权利要求1或2所述的siRNA、权利要求3所述的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌、权利要求4或5所述的试剂盒在鉴定鸡甲基化转移酶基因METTL16功能中的应用。

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