CN114621953A - 一种特异性抑制鸡CTGF基因表达的siRNA及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种特异性抑制鸡CTGF基因表达的siRNA及其应用。本发明的siRNA的正义链和反义链序列分别如SEQ ID NO.1和2所示。该siRNA干扰的CTGF靶序列如SEQ ID NO.3所示。该siRNA分子的反义链可特异性地与抑制鸡CTGF基因的mRNA结合，降解mRNA，从而干扰转录后翻译过程，促进鸡前脂肪细胞分化。利用本发明提供的siRNA干扰鸡CTGF基因，转录水平上的干扰效率高、特异性好，与基因敲除技术相比灵敏度高、操作简便、实验周期短、价格低廉，为研究禽类CTGF基因的功能和调控机制提供直接有效的实验工具。

Description

一种特异性抑制鸡CTGF基因表达的siRNA及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种特异性抑制鸡CTGF基因表达的siRNA及其应用。
背景技术
RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是指是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)诱发的、同源高效特异性降解的现象。21～25nt大小的短序列双链RNA分子通过与目的基因单链mRNA互补结合，启动靶基因降解程序，诱导靶序列的mRNA降解，阻断靶基因表达，细胞表现特定基因的缺陷表型。该技术简单易行，具备高效性、特异性、位置效应、高稳定性、可传播性、浓度时间依赖性等优势，是基因功能研究中最受关注的研究工具之一，已被广泛用于探索基因功能和家禽遗传育种领域。
结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)基因是CCN家族成员之一，是一种广泛存在于各组织器官、兼备细胞自分泌与外分泌传播途径的细胞因子。研究表明人和小鼠等哺乳动物的CTGF在细胞外基质的形成、细胞的黏附和迁移、血管形成、细胞的增殖与纤维化等过程中具有重要作用，拥有广泛而重要的临床意义。中国公开号：CN113943737A，公开了鸡CTGF基因在抑制鸡前脂肪细胞分化的应用；然而，由于现有技术中尚无关于特异性抑制鸡CTGF基因表达的siRNA，阻碍了科研工作者对禽类CTGF基因的功能和调控机制研究，导致人类对禽类CTGF基因的功能和调控机制不清楚。
发明内容
基于以上不足之处，本发明的目的在于提供一种能够特异性抑制鸡CTGF基因表达的siRNA，用于研究禽类CTGF基因的功能和调控机制。该siRNA分子的正、反义链可特异性地与抑制鸡CTGF基因的mRNA结合，降解mRNA，从而干扰转录后翻译过程，促进鸡前脂肪细胞分化。
本发明所采用的技术方案如下：一种特异性抑制鸡CTGF基因表达的siRNA，其正义链和反义链序列分别为：
正义链5‘-CCAGGGUCACCAACGAUAAUGCUUU-3’(SEQ ID NO.1)，
反义链5‘-AAAGCAUUAUCGUUGGUGACCCUGG-3’(SEQ ID NO.2)，
所述的siRNA作用于CTGF基因的mRNA靶序列为：5‘-GGGTCACCAACGATAATGC-3’(SEQID NO.3)。
本发明的另一目的是提供一种如上所述siRNA在制备促进鸡前脂肪细胞分化药物或饲料添加剂的应用。
本发明的有益效果及优点为：利用本发明提供的siRNA干扰鸡CTGF基因，转录水平上的干扰效率高、特异性好，与基因敲除技术相比灵敏度高、操作简便、实验周期短、价格低廉，为研究禽类CTGF基因的功能和调控机制提供直接有效的实验工具。
附图说明
图1为FAM-siCTGF(荧光标记的siRNA)暗场观察到的转染效率视野图。
图2为FAM-siCTGF(荧光标记的siRNA)明场观察到的转染效率视野图。
图3为Real-timePCR方法确定siRNA干扰效果图。
图4为Real-timePCR技术(转录水平)检测干扰CTGF基因对鸡前脂肪细胞分化过程中正向调控因子mRNA的影响图。
图5为Real-timePCR技术(转录水平)检测干扰CTGF基因对鸡前脂肪细胞分化过程中负向调控因子mRNA的影响图。
图6为Western Blot技术(翻译水平)检测干扰CTGF基因对鸡前脂肪细胞分化过程中正向调控因子蛋白的影响图。
图7为Western Blot技术(翻译水平)检测干扰CTGF基因对鸡前脂肪细胞分化过程中正向调控因子蛋白的定量结果图。
图8为油红O染色技术检测干扰CTGF基因对鸡前脂肪细胞分化过程中细胞脂滴沉积的影响图。
图9为油红O染色技术检测干扰CTGF基因对鸡前脂肪细胞分化过程中细胞脂滴沉积的定量结果图。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，无特殊说明，均为常规生化试剂公司购买得到。
实施例1：细胞培养
永生化的鸡前脂肪细胞系(ICP2)保存在我们的实验室中。将细胞在补充有10％胎牛血清(Gibco)的DMEM/F12培养基(Gibco，Grand Island，NY，美国)中培养，并保持在37℃，5％湿润的CO2气氛中。
实施例2：总RNA提取及Real-time PCR
(1)总RNA提取
1)取出12孔板，弃掉培养基，用PBS洗3遍。
2)在六孔板的每孔加1mL的Trizol，摇匀，置于冰上静置5min，在震荡板上震15min。
3)吹打细胞，将培养板中的Trizol移入DEPC处理过的1.5mL EP管中，震荡15s。
4)每1mL的Trizol中加入0.2mL的氯仿，用力震荡15s，室温静置5min。
5)4℃，12000rpm，离心15min。
6)将上层水相转移到新的DEPC处理过的1.5mL EP管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min。
7)4℃，12000rpm，离心10min。
8)弃上清，加入1mL现配的75％乙醇，震荡洗涤RNA一次。
9)4℃，7500rpm，离心5min。
10)弃上清，将装有RNA沉淀的1.5mL离心管置于超净台中风机干燥10min。
11)向RNA沉淀中加入20μL DEPC水进行溶解。
12)紫外分光光度计测定RNA的浓度，然后立即用于反转录或-80℃保存。
(2)反转录
按照PrimeScriptTMRT reagent Kitwith gDNA Eraser(TAKARA)试剂盒说明书进行两步法操作。去除基因组DNA反应条件见表1。
表1去除基因组DNA反应体系
Figure BDA0003518408900000031
去除基因组DNA反应条件：42℃ 2min；置于冰上。RNA反转录反应体系见表2。
表2反转录PCR反应体系
Figure BDA0003518408900000032
RNA反转录反应条件：37℃，5min；85℃，5min；4℃保存。
(3)Real-time PCR
按照FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)试剂盒说明书操作，Real-time PCR反应体系见表3。
表3Real-time PCR反应体系
Figure BDA0003518408900000041
将上述试剂充分混合，分装到96孔板中(10μL/孔)。反应条件为95℃，10min；40cycles95℃，15s，60℃，1min，40个循环。
以TBP为内参，采用2–△CT方法计算目的基因的相对表达量，其中ΔCT＝CT(目的基因)–CT(TBP)。各基因Real-time PCR引物序列如表4：
表4Real-time PCR引物
Figure BDA0003518408900000042
Figure BDA0003518408900000051
实施例3：总蛋白的提取及Western blot
(1)总蛋白的提取
1)以12孔板为例，融解Western及IP细胞裂解液，混匀。取1mL裂解液，在使用前数分钟内加入10μL 100nM的PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。
2)收细胞，加PBS洗3遍，每孔加入75μL的Western及IP细胞裂解液，用100ul移液枪吹打数下，使裂解液与细胞充分接触，置于4°冰箱，裂解30min。
3)充分裂解后，4℃ 12000rpm离心5min，取上清移入新的EP管中，即为细胞的总蛋白。
(2)Western blot
1)采用BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)测定所收集的蛋白浓度，并将测定的蛋白调整至同等浓度，加入适量的5X SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，100℃加热煮沸5min，以充分变性蛋白。
2)待蛋白样品冷却到室温后，每个样品上样20μL，按照75V，40min；120V，45min进行常规电泳。
3)电泳结束后，将海绵、转膜滤纸、胶和NC膜按顺序放入转膜槽中，接通电源，按照0.2A的恒定电流进行转膜1h。
4)将NC膜置于含有5％脱脂奶粉的PBST(封闭液)中，室温在摇床上摇2h。
5)用PBST洗去NC膜上的封闭液，并将NC膜孵育在含有一抗的稀释液中，放置4℃冰箱过夜。
6)用PBST洗膜3次，每次10min；然后将膜孵育在含二抗的封闭液中，室温在摇床上摇1h。
7)用PBST洗膜3次，每次10min，然后用BeyoECL Star(特超敏ECL化学发光试剂盒)进行化学发光成像仪检测。
实施例4：油红O染色、提取比色及蛋白校正
(1)油红O染色、提取比色
1)除去细胞中的培养基，用PBS清洗3次。每孔加入1mL 4％多聚甲醛固定液(6孔板)，4℃固定30min；此时配制油红O工作液，即油红O原液和去离子水按照3:2的比例混合均匀后，用滤纸过滤(现用现配)。
2)弃去固定液，PBS温和洗涤3次，放入65℃烘箱中烘干。
3)油红O染色工作液避光染色15min。
4)弃去油红O染色液，PBS温和洗涤3次，每孔加入1mL 60％异丙醇，立即弃掉，PBS洗涤3次。
5)每孔加入2mL PBS，倒置显微镜下拍照、存图。
6)弃去PBS，每孔加入1mL 100％异丙醇，用于溶解被染细胞里的油红O，置于水平摇床上晃动15min。
7)用酶标仪在510nm处测定OD值。
(2)蛋白校正
1)取出细胞培养板，弃培养基。
2)用PBS洗细胞2次。
3)12孔板每孔加300μl胰酶消化液，37℃1min，至细胞状态呈流沙状。
4)加入1ml完全培养液中和消化液，反应体系全部移至DEPC处理后的1.5mL离心管中。
5)2000rpm，离心7min，弃去上清。
6)加入1mL PBS，轻轻吹打，重悬细胞。
7)4000rpm，离心10min，弃去上清，-80℃保存。
8)取出冻存的细胞，冰浴助融，加入适量的含有1mM PMSF的细胞裂解液充分震荡直至没有细胞团块，冰上静置30min。
9)12000rpm离心5min，取上清。
10)取少量上清，用BCA方法测定蛋白浓度。
11)用油红O提取比色所得OD值/对应蛋白量，即得到油红O提取比色的校正结果。
实施例5：si-CTGF转染鸡前脂肪细胞系
鸡CTGF基因的干扰片段(si-CTGF)及阴性对照序列(si-NC)均由百奥迈科生物技术有限公司合成。将ICP2细胞接种在12孔板中，待细胞生长至40％的汇合度时，采用
Figure BDA0003518408900000071
2000(美国Invitrogen公司)进行siCTGF及si-NC的转染，具体操作参照
Figure BDA0003518408900000072
2000试剂盒说明书进行。
Figure BDA0003518408900000073
实施例6：si-CTGF转染效率的检测
为了检测干扰片段的转染效率，将ICP2细胞接种在12孔板中，待细胞生长至40％的汇合度时进行油酸诱导细胞分化，向细胞里转染FAM-siCTGF(荧光标记的siRNA)，同时设置si-NC(阴性对照组)和Mock(空白对照组)，具体操作参照
Figure BDA0003518408900000074
2000试剂盒说明书进行。转染6h后用荧光显微镜观察siRNA转染效率，图1-2为FAM-siCTGF(荧光标记的siRNA)转染效率示意图，图1是暗场观察到的视野，图2是明场观察到的视野。
实施例7：si-CTGF干扰效率的检测
为了检测干扰片段的干扰效果，待ICP2系细胞汇合度达到40％左右时进行油酸诱导细胞分化，同时将siCTGF(实验组)转染到细胞中，设立si-NC(阴性对照组)和Mock(空白对照组)，转染48h后，提取细胞中的RNA，利用Real-time PCR的方法检测si-CTGF的干扰效果。如图3结果显示，si-CTGF具有很好的干扰效果，可作为研究禽类CTGF基因的功能和调控机制直接有效的实验工具。
实施例8：干扰CTGF基因对鸡前脂肪细胞分化标志基因mRNA的检测
待ICP2系细胞汇合度达到40％左右时进行油酸诱导细胞分化，同时将siCTGF(实验组)转染到细胞中，设立si-NC(阴性对照组)和Mock(空白对照组)，转染48h后，利用Real-time PCR的方法检测鸡前脂肪细胞分化过程中分化标志基因的表达水平。结果显示，干扰组PPARr、AP2、C/EBP/β的表达量显著高于阴性对照组和空白对照组(P<0.05或P<0.01，图4)，干扰组CATA2的表达量显著低于阴性对照组和空白对照组(<0.05或P<0.01，图6)；PLIN、KLF的表达量无显著变化(图4-5)。
实施例9：干扰CTGF基因对鸡前脂肪细胞分化标志基因蛋白的检测
待ICP2系细胞汇合度达到40％左右时进行油酸诱导细胞分化，同时将siCTGF(实验组)转染到细胞中，设立si-NC(阴性对照组)和Mock(空白对照组)，转染48h后利用Western blot的方法检测鸡前脂肪细胞分化过程中分化标志基因(PPARr、c/EBPβ)的蛋白表达水平。结果显示，干扰组PPARr、C/EBP/β的表达量显著高于对照组(P<0.05)(图6-7)。
实施例10：干扰CTGF基因对鸡前脂肪细胞脂滴沉积的检测
待ICP2系细胞汇合度达到40％左右时进行油酸诱导，同时将siCTGF(实验组)转染到细胞中，设立si-NC(阴性对照组)和Mock(空白对照组)，转染48h后，进行油红O染色和油红O染色的提取比色(对细胞数目进行了校正)，计算鸡前脂肪细胞脂滴沉积含量。结果显示，干扰组中细胞的脂滴沉积极显著高于阴性对照组和空白对照组(P<0.01)(图8-9)。
序列表
<110> 东北农业大学
<120> 一种特异性抑制鸡CTGF基因表达的siRNA及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccagggucac caacgauaau gcuuu 25
<210> 2
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaagcauuau cguuggugac ccugg 25
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gggtcaccaa cgataatgc 19

Claims (2)

1.一种特异性抑制鸡CTGF基因表达的siRNA，其特征在于，其正义链和反义链序列分别为：
正义链如SEQ ID NO.1所示，
反义链如SEQ ID NO.2所示，
所述的siRNA作用于CTGF基因的mRNA靶序列为：
如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的siRNA在制备促进鸡前脂肪细胞分化药物或饲料添加剂的应用。
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