CN110438153B - 通过抑制肌肉组织mstn基因表达获得快长青鲫的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因表达技术领域，公开了一种通过抑制肌肉组织mstn基因表达获得快长青鲫的方法，构建转基因载体，在转基因载体中肌肉组织特异表达启动子和csy4系统相结合，在启动子的下游插入靶基因的反向DNA序列；当转基因元件整合到宿主基因组后，转录产生两段和靶基因mRNA不同部位互补的RNA片段，形成的antisense‑RNA/mRNA二聚体被内源性核酸酶识别并切割降解，导致靶基因mRNA水平的降低，获得所需的某些表型或生化特征。通过实验表明，两段反义RNA导致实验组mstn mRNA水平显著降低；分别在出膜后取样，每次称10条鱼，取平均体重；出膜后20天对照组和实验组，实验组中，鱼个体较为粗壮，体长和体高均显著大于对照鱼。
Description
技术领域
本发明属于基因表达技术领域，尤其涉及一种通过抑制肌肉组织mstn基因表达获得快长青鲫的方法。
背景技术
目前抑制内源基因表达的技术主要有MO技术、RNAi技术和CRISPR/Cas9基因编辑技术。MO技术是一种反义技术，其原理是人工将核苷酸中的五碳糖环用一个吗啡环代替，同时对磷酸基团也做了改变，获得一种DNA分子类似物，这种类似物可以以碱基互补配对的方式与RNA结合，从而阻止核糖体与RNA的结合，使得基因在表达水平被阻断。MO技术抑制效果很明显，但是其只能通过体外合成后导入受精卵或细胞，短暂(有效期约4天)的抑制基因的表达，故多用于胚胎发育早期基因功能的研究；RNAi技术是将同源双链RNA导入细胞内，抑制目的基因表达的技术，但是通过表达载体获得siRNA时，启动子的选择严重受限，只能使用依赖RNA聚合酶III的启动子，目前可用的只有泛表达启动子，如人源和鼠源U6启动子和人源H1启动子等，且这些启动子的活性较弱，很难得到大量的siRNA；CRISPR/Cas9基因编辑技术是目前使用最为广泛的一种技术，可以完全沉默基因表达，但是我们选择的目的基因，不但具有抑制肌肉生长的功能，还有促进脂肪代谢等功能，因此完全沉默可能会影响鱼类脂肪代谢。反义RNA技术在转基因载体构建上比较简单，可以选择依赖RNA聚合酶II启动子(真核生物基因表达均有RNA聚合酶II的启动子驱动)，选择范围比较广，可以使用肌肉组织特异性表达的启动子。另外，为了产生足够的反义RNA，我们引入csy4系统，使得在启动子活性一定的情况下，产生更多的反义RNA。综上述所，我们选择利用在肌肉特异表达启动子mylz2驱动mstn反义RNA的转录，同时为了一定程度上增强抑制效果，我们将反义RNA技术和csy4系统相结合，同时获得两种不同的反义RNA的技术方案，适合于青鲫快长育种。
鱼类是人类所需优质蛋白质的重要来源之一。鱼类肌肉组织既是鱼类的运动器官，也是人类所需的优质蛋白。鱼类养殖实质上就是采用适合的养殖技术，最大限度地促进鱼类肌纤维细胞的快速增殖，促使肌肉组织快速生长发育，达到增加生产效益目的。另外，提高鱼类生长率，不但可以缩短上市时间，提高单位时间内的养殖产量，还可以一定程度上降低鱼类发病率，从而降低养殖风险。
肌肉生长抑制素(myostatin，mstn)又称生长分化因子8(growthanddifferentiation factor-8,gdf-8)，在多种生物肌肉生长中起负向调节作用。例如在牛、小鼠、狗和人中，该基因功能的全部或部分丧失均会导致肌肉量的显著增加。在斑马鱼、青鳉及虹鳟中，敲除该基因也得到相似结果。因此，mstn基因不仅是哺乳动物改良育种的靶标基因，也可能是水产养殖鱼类品种改良的关键靶标基因。因为青鲫为洞庭湖独有鲫种，分布范围不广泛，使得对青鲫的研究甚少，对青鲫研究大多限于形态学分类、生殖方式以及繁育技术等方面。青鲫中的研究较少。青鲫虽然营养价值高，但相比四大家鱼，生长速度缓慢，是影响其养殖效益的主要因素，因此，提高青鲫生长速度，可以很大程度上提高青鲫养殖效益。反义RNA技术是指通过体外合成或构建人工载体在体内转录生成一段RNA，该RNA和内源靶基因的mRNA或pre-mRNA互补结合，从而实现在转录、加工成熟或翻译水平上抑制内源基因的表达目的的一种技术。
综上所述，现有技术存在的问题是：目前该基因在青鲫中的研究较少。
解决上述技术问题的难度：
1.克隆获得青鲫mstn序列及反义RNA的作用位点的确定。因为目前没有参考序列，基因克隆难度很大，目前我们只得到部分mstn序列。获得序列后通过序列结构分析确定反义RNA的作用位点。
2.启动子的选择。Mstn基因虽然在肌肉中表达量最高，但是在其他组织中也有表达，说明该基因在其他组织中也有功能，如促进脂肪代谢等，因此我们只能抑制肌肉组织中的mstn表达，实现肌肉组织细胞的快速分裂和生长，而不影响其他组织中mstn的功能。因此启动子的选择尤为重要，首先保证肌肉组织特异表达，其次其启动活性要能满足要求，即可获得足够的反义RNA。
3.特异表达mylz2启动子与csy4系统相结合，在启动子活性一定的情况下，增加反义RNA的量，增强抑制效果。
4.利用tol2转座子增加目的基因片段插入基因组中的效率。
解决上述技术问题的意义：青鲫虽然具有营养价值高抗逆能力强等多种优良性状，但相比四大家鱼，生长速度缓慢，是影响其养殖效益的主要因素，因此，提高青鲫生长速度，可以很大程度上提高青鲫养殖效益。另外，提高鱼类生长率，不但可以缩短上市时间，提高单位时间内的养殖产量，还可以一定程度上降低鱼类发病率，从而降低养殖风险。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种通过抑制肌肉组织mstn基因表达获得快长青鲫的方法。
本发明是这样实现的，一种通过抑制肌肉组织mstn基因表达获得快长青鲫的方法，所述通过抑制肌肉组织mstn基因表达获得快长青鲫的方法包括以下步骤：
第一步，构建转基因载体，在转基因载体中的启动子下游插入靶基因的反向DNA序列；
第二步，当转基因元件整合到宿主基因组后，转录产生两段和靶基因mRNA不同部位互补的RNA片段，形成的antisense-RNA/mRNA二聚体被内源性核酸酶识别并切割降解，导致靶基因mRNA水平的降低或翻译受阻，获得所需的某些表型或生化特征。
进一步，所述通过抑制肌肉组织mstn基因表达获得快长青鲫的方法的青鲫mstn基因部分序列克隆，提取青鲫肌肉组织总RNA、反转录为cDNA、以cDNA为模板，引物为：SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2。
进一步，所述通过抑制肌肉组织mstn基因表达获得快长青鲫的方法经过PCR扩增后获得序列SEQ ID NO：3。
进一步，所述通过抑制肌肉组织mstn基因表达获得快长青鲫的方法的含有反义mstn基因载体的序列为SEQ ID NO：4。
进一步，所述通过抑制肌肉组织mstn基因表达获得快长青鲫的方法，CSY4蛋白特异识别CSY4蛋白识别序列(csy4s)，并从csy4s下游将RNA切断，序列转录后，转录表达出CSY4蛋白，并将RNA且成3段，其中csy4 RNA被降解，另外两段RNA则为mstn基因的反义RNA序列，反义RNA序列和细胞内的mstn mRNA互不结合形成部分双链，导致降解，同时阻止转录继续进行。
进一步，所述通过抑制肌肉组织mstn基因表达获得快长青鲫的方法的转基因载体为含有肌肉组织特异表达mylz2启动子质粒载体，通过BamHI和NotI酶切，目的基因片段插入其中，形成转基因载体，含有主要的元件为Tol2-mylz2-csy4-csy4s-as/mstn-csy4s-as/mstn-Poly A-Tol2。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述通过抑制肌肉组织mstn基因表达获得快长青鲫的方法的转基因家系建立方法，所述转基因鱼家系建立方法包括：
(1)在显微注射前，进行转基因载体处理，包括去毒性处理和防串联处理；
(2)体外合成Tol2转座酶mRNA；
(3)对青鲫胚胎显微注射所述转基因载体处理后的质粒DNA和所述Tol2转座酶mRNA；
(4)将显微注射后的青鲫胚胎作为P0代，所述P0代养殖性成熟后，通过与野生鲫鱼雌鱼测交得到后代F1代，将所述F1代阳性个体饲养至性成熟后采用自交获得纯合F2代。
进一步，所述转基因鱼杂交方法具体方法如下：
首先，将带有转座酶基因的396载体，用NotⅠ限制性内切酶线性化，然后用SP6体外转录试剂盒进行体外转录；
其次，进行DNA模板的去除及反应终止；
最后，纯化。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明提供了一种利用反义RNA技术抑制特异组织中基因表达的方法，而且将特异表达启动子和csy4系统相结合，解决了由于启动子活性不足，产生不了足够反义RNA的问题，同时，组织特异性抑制基因表达，解决了多功能基因利用中容易产生非目的性状的问题。本发明所利用的靶基因mstn主要在肌肉中表达，但在脑、肝脏和肠中也有少量表达，因此，该基因在青鲫中除抑制肌肉细胞分裂增长外，在其他组织中也具有一定的功能，因此，利用肌肉组织特异启动子仅仅抑制肌肉中mstn的表达是明智的。
附图说明
图1是本发明实施例提供的通过抑制肌肉组织mstn基因表达获得快长青鲫的方法流程图。
图2是本发明实施例提供的转基因载体示意图。
图3是本发明实施例提供的反义RNA导致实验组mstn mRNA水平显著降低示意图。
图4是本发明实施例提供的mstn基因被抑制实验组体重显著高于对照组示意图。
图5是本发明实施例提供的出膜后20天对照组和实验组图片示意图；
图中：(a)对照组；(b)实验组。
图6是本发明实施例提供的青鲫不同组织中mstn基因mRNA水平示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种通过抑制肌肉组织mstn基因表达获得快长青鲫的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的通过抑制肌肉组织mstn基因表达获得快长青鲫的方法包括以下步骤：
S101：mstn基因克隆；
S102：反义RNA靶位点的分析；
S103：启动子的筛选；
S104：肌肉组织特异表达启动子与csy4系统联合使用；
S105：转基因载体的构建，在转基因载体启动子下游插入两段靶基因的反向DNA序列；
S106：转录产生两段和靶基因mRNA不同部位互补的RNA片段，形成所需的某些表型或生化特征。
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的描述。
1、青鲫mstn基因部分序列克隆；
提取青鲫肌肉组织总RNA--反转录为cDNA--以cDNA为模板，引物如下：
SEQ ID NO：1，mstn-F：5’-GAGGATCCGACTCGACTCATAGGCTCC-3’(下划线为BamHI及其保护碱基)
SEQ ID NO：2，mstn-R：5’-TCGCGGCCGCCAAGGGAAGGCGGATCGT-3’(下划线为NotI及其保护碱基)
经过PCR扩增后获得如下序列SEQ ID NO：3：
GACTCGACTCATAGGCTCCAACATCAGCCGGGACGTGGTCAAGCAGCTTTTACCCAAAGCACCGCCTTTGCAACAACTACTGGATCAGTACGATGTTCTGGGGGATGACAGTAAGGATGGAGCTATGGAAGAGGATGATGAACATGCCACCACAGAGACCATCATGACCATGGCCACAGAGCCTGACCCCATCGTTCAAGTAGATCGGAAACCGAAGTGTTGTTTTTTCTCCTTCAGTCCGAAGATCCAAGCGAACCGGATCGTAAGAGCGCAGCTCTGGGTTCATCTGAGACCGGCGGAAGAAACGACCACTGTTTTCTTACAGATATCACGGCTGATGCCTGTCACGGACGGAGGAAGGCACATACGAATACGATCCCTGAAGATCGACGTGAACGCAGCAGTGACGTCTTGGCAGAGTATAGACGTCAAACAGGTGCTCACGGTGTGGTTAAGACAACCACCCCCCGCGCGCCCCTGTTTGACGTCTATACTCTGCCAAGACGTCACTGCTGCGTTCCGTCGATCTTCAGGGATCGTATTCGTATGCGCCTTCCTCCGTCCGTGACAGGCATCAGCGTGATGTCTGTAAGAAAAACAGCGGGAGTTTCTTCGCCGAACTCAAATTAATCCAATAGTTGCGCTCTTACGATCCGCCTTCCCTTG
2、含有反义mstn基因载体的设计SEQ ID NO：4：
CCATGGATCCATGGGTGATCATTATCTGGATATTCGGCTGAGGCCTGATCCAGAGTTCCCACCTGCGCAGCTGATGTCTGTCCTTTTTGGCAAACTTCATCAGGCCCTGGTTGCCCAGGGCGGAGATCGGATAGGGGTAAGCTTTCCAGACCTCGACGAAAGCCGGAGCCGCCTGGGAGAACGCCTGCGGATCCACGCTTCTGCCGACGATCTGAGAGCCTTGCTGGCAAGGCCATGGCTTGAGGGGCTCCGGGATCACCTGCAGTTTGGCGAACCCGCCGTTGTTCCCCACCCAACCCCTTATCGGCAGGTGTCTAGAGTGCAGGCCAAATCTAATCCAGAACGGCTGCGACGGCGACTCATGCGGCGACATGATCTTAGCGAGGAAGAGGCCCGAAAAAGAATCCCTGATACCGTGGCCCGCGCCCTTGACTTGCCTTTTGTCACACTGCGGTCCCAGAGTACGGGGCAGCATTTCAGACTTTTCATTCGACACGGGCCACTGCAAGTTACCGCCGAAGAAGGAGGCTTTACTTGTTATGGACTCTCCAAGGGAGGTTTCGTGCCCTGGTTTTAAGTTCACTGCCGTATAGGCAGCTGAGCTGAGTATCCGAGGTTGTAGTCGGCCCTGCACCAGTTCGTCGAAAATGGGTTTCGTGGCGGAAACGTTGTTGATGACCTAGTCATGCTACAAGACGTTCACTGCCGTATAGGCAGTTCTGCAGTGACGACGCAAGGCAGCTAGAAGTCCCTAGCATAAGCATACGCGGAAGGAGGCAGGCACTGTCCGTAGTCGCACTACAGACATTCTTTTTGTGATCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTGCGGCCGCGG
识别后能从识别序列(csy4s)下游(识别序列和下游序列的连接处)将RNA切断，因此上述序列转录后，转录表达出CSY4蛋白，并将RNA且成3段，其中csy4 RNA被降解，另外两段RNA则为mstn基因的反义RNA序列，反义RNA序列(黑色碱基)可以和细胞内的mstn mRNA互不结合形成部分双链，进而影响mstn mRNA的稳定性，导致其降解，同时也阻止了转录继续进行，该序列为公司直接合成。
3、转基因载体的构建
所用载体如图2所示，所用载体为含有肌肉组织特异表达mylz2启动子质粒载体，通过BamHI和NotI酶切，目的基因片段插入其中，形成转基因载体，含有主要的元件为Tol2-mylz2-csy4-csy4s-as/mstn-csy4s-as/mstn-Poly A-Tol2，如图2所示：
4、显微注射获得转基因鱼：
(1)在显微注射前，进行所述转基因载体处理，其包括去毒性处理和防串联处理；
(2)体外合成Tol2转座酶mRNA，具体方法如下：
首先，将带有转座酶基因的396载体，用NotⅠ限制性内切酶线性化，然后用SP6体外转录试剂盒进行体外转录；
其次，进行DNA模板的去除及反应终止；
最后，纯化；
(3)对青鲫胚胎显微注射所述转基因载体处理后的质粒DNA和所述Tol2转座酶mRNA；
(4)将显微注射后的青鲫胚胎作为P0代，所述P0代养殖性成熟后，通过与野生雌鱼测交得到后代F1代，将所述F1代阳性个体饲养至性成熟后采用自交获得纯合F2代。
下面结合实验对本发明的技术效果作详细的描述。
实验结果：
1、抑制肌肉组织中mstn mRNA水平检测，方法荧光定量PCR具体操作步骤：
提取青鲫肌肉组织总RNA，反转录为cDNA，以此为模板，利用引物：
SEQ ID NO：5，RT-mstn-F:5’-CCTTCAGTCCGAAGATCCAA-3’；
SEQ ID NO：6，RT-mstn-R:5’-TCTTAACCACACCGTGAGCA-3’；
退火温度58度，长度227bp，所用试剂为TAKARA(SYBR)；以odc为参照基因的实时荧光定量PCR；
引物用Primer Premier 5软件设计或(5’-3’):
SEQ ID NO：7，RT-odc-F:5’-ACACTATGACGGCTTGCACCG-3’；
SEQ ID NO：8，RT-odc-R:5’-CCCACTGACTGCACGATCTGG-3’；
反应体系如下：(模板cDNA为稀释5倍的原液)；
2xSYBR Green Supermix10ul
正向引物(10mM)0.4ul
反向引物(10mM)0.4ul
cDNA 1ul
dd H2O 8.2ul
反应条件如下：95℃，3min；(94℃，15s；58℃，15s；72℃，45s；40个循环)；如图3所示，反义RNA导致实验组mstn mRNA水平显著降低。
2、mstn基因被抑制实验组体重显著高于对照组
检测方法：分别在出膜后5、10、15、20、25、30、40天取样，每次称10条鱼，取平均体重，如图4所示。
3、出膜后20天对照组和实验组图片，如图5所示，从图5可知：实验组中，鱼个体较为粗壮，体长和体高均大于对照鱼。
表1实验分组
下面结合实验对本发明的技术效果作详细的描述。
本实验操作方法：利用荧光定量PCR技术，具体操作步骤：
(1)提取青鲫脑、性腺、心脏、肝脏、脾脏、肠和肌肉组织总RNA，反转录为cDNA，以此为模板，利用引物：
SEQ ID NO：5，RT-mstn-F:5’-CCTTCAGTCCGAAGATCCAA-3’；
SEQ ID NO：6，RT-mstn-R:5’-TCTTAACCACACCGTGAGCA-3’；
(2)退火温度58度，长度227bp，所用试剂为TAKARA(SYBR)；以odc为参照基因的实时荧光定量PCR；
引物用Primer Premier 5软件设计或(5’-3’):
SEQ ID NO：7，RT-odc-F:5’-ACACTATGACGGCTTGCACCG-3’；
SEQ ID NO：8，RT-odc-R:5’-CCCACTGACTGCACGATCTGG-3’；
(3)反应体系如下：(模板cDNA为稀释5倍的原液)；
2xSYBR Green Supermix10ul
正向引物(10mM)0.4ul
反向引物(10mM)0.4ul
cDNA 1ul
dd H2O 8.2ul
反应条件如下：95℃，3min；(94℃，15s；58℃，15s；72℃，45s；40个循环)；如图6所示，mstn mRNA水平在肌肉组织中最高。其中在脑、肝脏和肠中也有表达。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖南文理学院
<120> 通过抑制肌肉组织mstn基因表达获得快长青鲫的方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaggatccga ctcgactcat aggctcc 27
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcgcggccgc caagggaagg cggatcgt 28
<210> 3
<211> 666
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gactcgactc ataggctcca acatcagccg ggacgtggtc aagcagcttt tacccaaagc 60
accgcctttg caacaactac tggatcagta cgatgttctg ggggatgaca gtaaggatgg 120
agctatggaa gaggatgatg aacatgccac cacagagacc atcatgacca tggccacaga 180
gcctgacccc atcgttcaag tagatcggaa accgaagtgt tgttttttct ccttcagtcc 240
gaagatccaa gcgaaccgga tcgtaagagc gcagctctgg gttcatctga gaccggcgga 300
agaaacgacc actgttttct tacagatatc acggctgatg cctgtcacgg acggaggaag 360
gcacatacga atacgatccc tgaagatcga cgtgaacgca gcagtgacgt cttggcagag 420
tatagacgtc aaacaggtgc tcacggtgtg gttaagacaa ccaccccccg cgcgcccctg 480
tttgacgtct atactctgcc aagacgtcac tgctgcgttc cgtcgatctt cagggatcgt 540
attcgtatgc gccttcctcc gtccgtgaca ggcatcagcg tgatgtctgt aagaaaaaca 600
gcgggagttt cttcgccgaa ctcaaattaa tccaatagtt gcgctcttac gatccgcctt 660
cccttg 666
<210> 4
<211> 1023
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccatggatcc atgggtgatc attatctgga tattcggctg aggcctgatc cagagttccc 60
acctgcgcag ctgatgtctg tcctttttgg caaacttcat caggccctgg ttgcccaggg 120
cggagatcgg ataggggtaa gctttccaga cctcgacgaa agccggagcc gcctgggaga 180
acgcctgcgg atccacgctt ctgccgacga tctgagagcc ttgctggcaa ggccatggct 240
tgaggggctc cgggatcacc tgcagtttgg cgaacccgcc gttgttcccc acccaacccc 300
ttatcggcag gtgtctagag tgcaggccaa atctaatcca gaacggctgc gacggcgact 360
catgcggcga catgatctta gcgaggaaga ggcccgaaaa agaatccctg ataccgtggc 420
ccgcgccctt gacttgcctt ttgtcacact gcggtcccag agtacggggc agcatttcag 480
acttttcatt cgacacgggc cactgcaagt taccgccgaa gaaggaggct ttacttgtta 540
tggactctcc aagggaggtt tcgtgccctg gttttaagtt cactgccgta taggcagctg 600
agctgagtat ccgaggttgt agtcggccct gcaccagttc gtcgaaaatg ggtttcgtgg 660
cggaaacgtt gttgatgacc tagtcatgct acaagacgtt cactgccgta taggcagttc 720
tgcagtgacg acgcaaggca gctagaagtc cctagcataa gcatacgcgg aaggaggcag 780
gcactgtccg tagtcgcact acagacattc tttttgtgat ccagacatga taagatacat 840
tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat 900
ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa 960
caattgcatt cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt tttgcggccg 1020
cgg 1023
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccttcagtcc gaagatccaa 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcttaaccac accgtgagca 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acactatgac ggcttgcacc g 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cccactgact gcacgatctg g 21
Claims (4)
1.一种通过抑制肌肉组织mstn基因表达获得快长青鲫的方法，其特征在于，所述通过抑制肌肉组织mstn基因表达获得快长青鲫的方法包括以下步骤：
第一步，构建转基因载体，在转基因载体中的启动子下游插入靶基因的反向DNA序列；
第二步，将反义RNA技术和csy4系统相结合，使之一次产生2种不同的反义RNA，同时作用于目的基因；当转基因元件整合到宿主基因组后，转录产生两段和靶基因mRNA不同部位互补的RNA片段，形成的antisense-RNA/mRNA二聚体被内源性核酸酶识别并切割降解导致靶基因mRNA水平的降低，获得所需的表型或生化特征；
所述通过抑制肌肉组织mstn基因表达获得快长青鲫的方法还包括青鲫mstn基因部分序列克隆，包括：提取青鲫肌肉组织总RNA、反转录为cDNA、以cDNA为模板，引物为：SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2；
识别后能从识别序列下游将RNA切断，序列转录后，转录表达出CSY4蛋白，并将RNA切成3段，其中csy4RNA被降解，另外两段RNA则为mstn基因的反义RNA序列，反义RNA序列和mstnmRNA互补结合形成部分双链，导致降解，同时阻止转录继续进行；
经过PCR扩增后获得序列SEQ ID NO：3；
含有反义mstn基因载体的序列为SEQ ID NO：4。
2.如权利要求1所述的通过抑制肌肉组织mstn基因表达获得快长青鲫的方法，其特征在于，转基因载体为含有肌肉组织特异表达mylz2启动子质粒载体，通过BamHI和NotI酶切，目的基因片段插入其中，形成转基因载体，含有主要的元件为Tol2-mylz2-csy4-csy4s-as/mstn-csy4s-as/mstn-PolyA-Tol2。
3.一种应用权利要求1所述通过抑制肌肉组织mstn基因表达获得快长青鲫的方法的转基因鱼家系建立方法，其特征在于，所述转基因鱼家系建立方法包括：
(1)在显微注射前，进行转基因载体处理，包括去毒性处理和防串联处理；
(2)体外合成Tol2转座酶mRNA；
(3)对青鲫胚胎显微注射所述转基因载体处理后的质粒DNA和所述Tol2转座酶mRNA；
(4)将显微注射后的青鲫胚胎作为P0代，所述P0代养殖性成熟后，通过与野生雌鱼测交得到后代F1代，将所述F1代阳性个体饲养至性成熟后采用自交获得纯合F2代。
4.如权利要求3所述的转基因鱼家系建立方法，其特征在于，所述的转基因鱼家系建立方法，其特征在于，所述转基因鱼家系建立方法具体方法如下：
首先，将带有转座酶基因的396载体，用NotⅠ限制性内切酶线性化，然后用SP6体外转录试剂盒进行体外转录；
其次，进行DNA模板的去除及反应终止；
最后，纯化。
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN1871017A (zh) * | 2002-09-16 | 2006-11-29 | 约翰霍普金斯大学 | 肌生长抑制素的金属蛋白酶活化以及调节肌生长抑制素活性的方法 |
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|---|---|---|---|---|
| WO2016061481A1 (en) * | 2014-10-17 | 2016-04-21 | The Penn State Research Foundation | Methods and compositions for multiplex rna guided genome editing and other rna technologies |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| RNA干扰技术在鱼类中的研究进展;韩林强等;《南方水产》;20090605(第03期);第67-73页 * |
| Suppression of myostatin with vector-based RNA interference causes a double-muscle effect in transgenic zebrafish;Chiou-Yueh Lee等;《Biochemical and Biophysical Research Communications》;20090725;第387卷;摘要、第767页材料和方法部分 * |
| 淇河鲫肌肉生长抑制素基因的克隆与表达;田雪等;《水产学报》;20170131;第41卷(第1期);第11-20页 * |
Also Published As
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