JP2015186454A - アワビvasa遺伝子マーカーおよび不稔化アワビの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】新規アワビvasa遺伝子マーカー、アワビvasa遺伝子およびタンパク質の発現を抑制するRNA分子、アワビvasa遺伝子の発現抑制方法並びにアワビの生殖細胞系列の発達抑制方法。また、不稔化アワビの製造方法、加えて、生殖細胞系列検出マーカーとしてのアワビvasa遺伝子の検出手段。
【選択図】なし
Description
本発明は、アワビvasa遺伝子マーカーに関し、また、アワビvasaタンパク質の発現を抑制するRNA分子およびこれを用いたアワビvasaタンパク質の発現抑制方法並びにアワビの生殖細胞系列の発達抑制方法に関する。さらに、本発明は、不稔化アワビの製造方法、加えて、生殖細胞系列検出マーカーに関する。
アワビはミミガイ科ハリオティス属(Haliotis)の大型巻貝の総称であり、世界中に約70種類存在する。日本国内では、クロアワビ(Haliotis discus discus)、エゾアワビ(Haliotis discus hannai)、マダカアワビ(Haliotis madaka)およびメガイアワビ(Haliotis gigantea)の4種が経済的価値の高い漁業上重要なアワビとして種苗生産および養殖の対象となっている。また、オーストラリアでは、ミミガイ(Haliotis asinina)が新たな養殖対象として期待されている。しかし、アワビ、特にエゾアワビは、成長が遅く出荷までにかかる期間が長い。そのため、アワビを効率的に生産するためにアワビの成長を促進する方法が数多く検討されている。
(1)下記から選択されるポリヌクレオチドからなる、アワビvasa遺伝子マーカー:
(a)配列番号3または4に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(b)配列番号3または4に記載の塩基配列において、1または複数個の塩基の挿入、置換、欠失、および/またはその一方または両末端への1または複数個の塩基の付加がなされた塩基配列からなるポリヌクレオチド、および
(c)配列番号3または4に記載の塩基配列と少なくとも80%の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(2)アワビvasaタンパク質の発現をRNA干渉により抑制しうるRNA分子であって、該RNA分子を構成する塩基配列が、上記(1)に記載のポリヌクレオチドおよびその一部の塩基配列並びにこれらの塩基配列に相補的な塩基配列からなる群から選択される塩基配列の相補配列からなるRNAに特異的にハイブリダイズする配列を含んでなるものである、RNA分子。
(3)RNA分子を構成する塩基配列が、配列番号3または4に記載の塩基配列およびその一部の塩基配列並びにこれらの塩基配列に相補的な塩基配列からなる群から選択される塩基配列を含んでなるものである、上記(2)に記載のRNA分子。
(4)RNA分子が二本鎖RNAである、上記(2)または(3)に記載のRNA分子。
(5)上記(2)〜(4)のいずれかに記載のRNA分子を含んでなる、アワビvasa遺伝子発現抑制剤。
(6)上記(2)〜(4)のいずれかに記載のRNA分子を、アワビの未受精卵、受精卵または生殖巣に導入する工程を含んでなる、未受精卵、受精卵または生殖巣の細胞におけるアワビvasa遺伝子の発現抑制方法。
(7)上記(2)〜(4)のいずれかに記載のRNA分子を、アワビの生殖巣に導入する工程を含んでなる、アワビの生殖細胞系列の発達抑制方法。
(8)下記:
(a)vasa遺伝子の発現抑制処理を施した未受精卵と、別の個体から採取した精子とを人工受精することにより、受精卵を得る工程、
(b)卵巣にvasa遺伝子の発現抑制処理を施し、該卵巣から摘出または産卵誘発により得た未受精卵と、別の個体から採取した精子とを人工受精することにより、受精卵を得る工程、および
(c)受精卵にvasa遺伝子の発現抑制処理を施して、vasa遺伝子発現抑制処理受精卵を得る工程のいずれかの工程を含んでなる、不稔化アワビの製造方法。
(9)vasa遺伝子の発現抑制処理を上記(2)〜(4)のいずれかに記載のRNA分子により行う、上記(8)に記載の製造方法。
(10)上記(1)に記載のポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、vasa遺伝子検出用プライマーまたはプローブ。
(b)配列番号3または4に記載の塩基配列において、1または複数個の塩基の挿入、置換、欠失、および/またはその一方または両末端への1または複数個の塩基の付加がなされた塩基配列からなるポリヌクレオチド;および
(c)配列番号3または4に記載の塩基配列と少なくとも80%の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド。
(a)vasa遺伝子の発現抑制処理を施した未受精卵と、別の個体から採取した精子とを人工受精することにより、受精卵を得る工程、
(b)卵巣にvasa遺伝子の発現抑制処理を施し、該卵巣から摘出または産卵誘発により得た未受精卵と、別の個体から採取した精子とを人工受精することにより、受精卵を得る工程、および
(c)受精卵にvasa遺伝子の発現抑制処理を施して、vasa遺伝子発現抑制処理受精卵を得る工程。
(1)各種アワビのcDNAの合成
エゾアワビ(岩手県より入手)の卵巣、クロアワビ(千葉県より入手)の未受精卵、マダカアワビ(千葉県より入手)の未受精卵、およびメガイアワビ(千葉県より入手)の卵巣から、ISOGEN(ニッポンジーン社製)を用いて全RNAを抽出した。得られたそれぞれの全RNA5μgから、逆転写酵素としてSuper ScriptIII(Invitrogen社製)を用いてcDNAを合成し、各種アワビのcDNAとした。
ミミガイ(H. asinina)、アズマニシキガイ(Chlamys farreri)およびマガキ(Crassostrea gigas)の軟体動物種における既知のvasa遺伝子の塩基配列を比較し、相同性が高くvasaタンパク質をコードする遺伝子が保存されていると期待される領域を選択し、下記表1に記載のとおり2セットの縮重プライマーを設計した。
得られたエゾアワビvasa遺伝子(vasaRNAi1(配列番号3)の塩基配列に基づいて、エゾアワビ成体各組織[4年齢(推定)](生殖巣(卵巣または精巣)、鰓、心臓、外套膜、貝殻筋)および未受精卵での発現を下記表2のプライマーおよび条件でExTaq (TAKARA社製)を用いてRT−PCRにより解析した。結果を図1に示す。
上記(2)で得られた各種アワビのvasa遺伝子配列およびアミノ酸配列を比較した。結果をvasa遺伝子配列について図3および4、アミノ酸配列について図5および6に示す。またエゾアワビのvasa遺伝子を示すvasaRNAi1(配列番号3、748bp)およびvasaRNAi2(配列番号4、572bp)と、他のアワビ種のvasa遺伝子の配列、および既知のミミガイのvasa遺伝子の塩基配列との相違数を下記表4および5に示す。さらにエゾアワビのvasa遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を示すvasaRNAi1(配列番号1)およびvasaRNAi2(配列番号2)と、他のアワビ種のvasaアミノ酸配列、および既知のミミガイのvasaアミノ酸塩基配列との相違数を下記表6および7に示す。
(1)アワビのvasa遺伝子発現阻害剤(Abalone vasa dsRNA)の合成
上記実施例1(2)で得られたエゾアワビvasaRNAi1遺伝子を有するプラスミド(vasaRNAi1プラスミド)を鋳型に用いてPCR反応を行い、直鎖型プラスミドDNAを作成した。得られた直鎖型プラスミドDNA1μgを鋳型として、MEGAscript T7 transcription kit(Invitrogen社製)を用いて一本鎖センスRNAおよびアンチセンスRNAを合成した。合成したセンスRNA鎖とアンチセンスRNA鎖を等量混合し、100℃で1分間熱処理した。その後、室温で10時間静置し二本鎖RNAのアニーリングを行った。二本鎖RNA(dsRNA)はアガロースゲル電気泳動により確認後、使用時まで−80℃で保存した。
各種アワビ(エゾアワビ(4年齢)、クロアワビ(1または4年齢)、メガイアワビ(5年齢))は、vasa遺伝子発現抑制処理前、海水(15〜22℃)で飼育した。上記実施例2(1)で調製した二本鎖RNA溶液に注射用緩衝液(10mM Tris−HCl、10mM NaCl)を加え所望の濃度になるように調整した。
得られたそれぞれの試料は、実施例1(1)同様にISOGENを用いて全RNAを抽出した。未受精卵は50個を1プールとし、卵巣、精巣は50mgを原料として抽出した。外套膜は50mgを原料として抽出した。
(4)不稔化アワビ稚貝の作出
上記(3)のクロアワビの個体No.4〜7の未受精卵に、vasa遺伝子発現抑制処理を行っていない通常の種苗生産方法により得られた各種精子を交配し、人工受精を行い、不稔化処理を行ったエゾアワビおよびクロアワビの受精卵(vasa遺伝子発現抑制処理済み)を得た。受精卵を発生させ、5mm程度の稚貝を得た。
通常のエゾアワビを従来の人工種苗生産方法に従って、産卵誘発と人工受精を行い、未受精卵(0時間)、受精卵(受精後1時間)、8細胞期(受精後6時間)、桑実胚(受精後9時間)、トロコフォア幼生(受精後15時間)、ベリンジャー幼生(受精後24時間)などの未受精卵から幼生までの初期発生過程でのvasa遺伝子発現量の変化を、下記表11のプライマーおよび条件で、リアルタイムPCRにより定量的に調べた。結果を図7に示す。
Claims (10)
- 下記から選択されるポリヌクレオチドからなる、アワビvasa遺伝子マーカー:
(a)配列番号3または4に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(b)配列番号3または4に記載の塩基配列において、1または複数個の塩基の挿入、置換、欠失、および/またはその一方または両末端への1または複数個の塩基の付加がなされた塩基配列からなるポリヌクレオチド、および
(c)配列番号3または4に記載の塩基配列と少なくとも80%の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド。 - アワビvasaタンパク質の発現をRNA干渉により抑制しうるRNA分子であって、該RNA分子を構成する塩基配列が、請求項1に記載のポリヌクレオチドおよびその一部の塩基配列並びにこれらの塩基配列に相補的な塩基配列からなる群から選択される塩基配列の相補配列からなるRNAに特異的にハイブリダイズする配列を含んでなるものである、RNA分子。
- RNA分子を構成する塩基配列が、配列番号3または4に記載の塩基配列およびその一部の塩基配列並びにこれらの塩基配列に相補的な塩基配列からなる群から選択される塩基配列を含んでなるものである、請求項2に記載のRNA分子。
- RNA分子が二本鎖RNAである、請求項2または3に記載のRNA分子。
- 請求項2〜4のいずれか一項に記載のRNA分子を含んでなる、アワビvasa遺伝子発現抑制剤。
- 請求項2〜4のいずれか一項に記載のRNA分子を、アワビの未受精卵、受精卵または生殖巣に導入する工程を含んでなる、未受精卵、受精卵または生殖巣の細胞におけるアワビvasa遺伝子の発現抑制方法。
- 請求項2〜4のいずれか一項に記載のRNA分子を、アワビの生殖巣に導入する工程を含んでなる、アワビの生殖細胞系列の発達抑制方法。
- (a)vasa遺伝子の発現抑制処理を施した未受精卵と、別の個体から採取した精子とを人工受精することにより、受精卵を得る工程、
(b)卵巣にvasa遺伝子の発現抑制処理を施し、該卵巣から摘出または産卵誘発により得た未受精卵と、別の個体から採取した精子とを人工受精することにより、受精卵を得る工程、および
(c)受精卵にvasa遺伝子の発現抑制処理を施して、vasa遺伝子発現抑制処理受精卵を得る工程のいずれかの工程を含んでなる、不稔化アワビの製造方法。 - vasa遺伝子の発現抑制処理を請求項2〜4のいずれか一項に記載のRNA分子により行う、請求項8に記載の製造方法。
- 請求項1に記載のポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドの相補配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、vasa遺伝子検出用プライマーまたはプローブ。
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