CN111386038A

CN111386038A - 鱼类及鱼类的生产方法

Info

Publication number: CN111386038A
Application number: CN201880063206.5A
Authority: CN
Inventors: 木下政人; 吉浦康寿; 吉川广幸; 家户敬太郎
Original assignee: Kinki University; Kyoto University NUC
Current assignee: Kinki University; Kyoto University NUC
Priority date: 2017-09-28
Filing date: 2018-09-28
Publication date: 2020-07-07
Anticipated expiration: 2038-09-28
Also published as: JPWO2019066052A1; WO2019066052A1; JP7297214B2; CN111386038B; US20200253173A1

Abstract

提供生长得到促进的鱼类。本发明的鱼类的特征在于，黑素皮质素受体‑4(MC4R)基因已丧失功能。

Description

鱼类及鱼类的生产方法

技术领域

本发明涉及鱼类及鱼类的生产方法。

背景技术

红鳍东方鲀(Takifugurubripes)等鱼类中的一部分是通过养殖而供给的。其中，在通过养殖来繁育红鳍东方鲀的情况下，直至得到性成熟的成鱼为止，需要例如雄性2年、雌性3年这样的长期饲养。因此，在鱼类养殖时，需要缩短鱼类的饲养期(非专利文献1)。

另外，经养殖的红鳍东方鲀的成鱼等经养殖的鱼类的成鱼的体型小于天然成鱼。因此，需要增加成鱼的收量(重量)。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Shao Jun Du et.al,“Growth enhancement in transgenicatlantic salmon by the use of an“all fish”chimeric growth hormone geneconstruct”,1992,Biotechnology,Vol.10,pages 176-181

发明内容

发明要解决的问题

因此，本发明的目的在于，提供生长得到促进的鱼类。

用于解决问题的方案

为了达到上述目的，本发明的鱼类的特征在于，黑素皮质素受体-4(MC4R，Melanoeortin-4receptor)基因已丧失功能。

本发明的鱼类的生产方法(以下也称为“生产方法”)的特征在于，包括交配工序，所述交配工序使上述本发明的鱼类与其它鱼类进行交配。

发明的效果

根据本发明，可以提供与例如具有正常型的MC4R基因的鱼类相比生长得到促进的鱼类。

附图说明

图1为示出实施例1的MC4R基因已丧失功能的红鳍东方鲀的体重的图。

图2为示出实施例2的MC4R基因已丧失功能的星点东方鲀的体重的图。

图3为示出实施例4的MC4R基因已丧失功能的青鳉的体重的图。

图4为示出实施例5的MC4R基因已丧失功能的青鳉的摄食量的图。

具体实施方式

本发明的鱼类中，例如MC4R基因已部分缺失或完全缺失。

本发明的鱼类中，上述鱼类例如为选自由四齿鲀科、鲷科、鮨科及青鳉科组成的组中的至少一种鱼类。

本发明的鱼类例如用于养殖。

本发明的鱼类例如与包含正常型的MC4R基因的对照鱼类相比生长得到促进。

本发明的鱼类中，上述鱼类例如为上述鱼类的可食用部分。

本发明的生产方法例如包括繁育工序，所述繁育工序对通过上述交配工序得到的鱼类进行繁育。

本发明的生产方法例如在上述交配工序之前包括：

测定工序，其测定被检鱼类的生物试样的黑素皮质素受体-4(MC4R)的表达量；及，

被检鱼类筛选工序，其从上述被检鱼类中筛选出上述本发明的鱼类，

在上述被检鱼类筛选工序中，基于上述被检鱼类的生物试样的MC4R表达量和基准值筛选上述MC4R基因已丧失功能的被检鱼类。

本发明的生产方法例如在上述交配工序之前包括被检鱼类筛选工序，所述被检鱼类筛选工序从被检鱼类中筛选上述本发明的鱼类。

本发明的生产方法例如包括测定工序，其测定上述被检鱼类的生物试样的黑素皮质素受体-4(MC4R)的表达量，

本发明的生产方法例如在上述交配工序之前包括制作工序，所述制作工序由对象鱼类制作出上述本发明的鱼类，

上述制作工序包括突变工序，所述突变工序向上述对象鱼类的MC4R基因中导入功能丧失性突变。

在本发明的生产方法中，上述功能丧失性突变例如为上述MC4R基因的部分缺失突变或完全缺失突变。

在本发明的生产方法中，上述突变工序例如包括：

突变导入工序，其向上述对象鱼类的MC4R基因中导入突变；及，

突变筛选工序，其筛选通过上述突变导入工序得到的对象鱼类中的、MC4R基因中具有功能丧失性突变的对象鱼类。

本发明的生产方法例如包括测定工序，其测定上述突变导入工序后的对象鱼类的生物试样的MC4R表达量，

在上述突变筛选工序中，基于上述对象鱼类的生物试样的MC4R表达量和基准值筛选MC4R基因中具有功能丧失性突变的对象鱼类。

在本发明的生产方法中，上述MC4R表达量例如为上述MC4R基因的蛋白质的表达量。

在本发明的生产方法中，上述生物试样例如为脑。

＜鱼类＞

如上所述，本发明的鱼类的特征在于，黑素皮质素受体-4(MC4R)基因已丧失功能。本发明的鱼类的特征为MC4R基因已丧失功能，其它构成及条件没有特别限制。本发明的鱼类例如可以援引后述的本发明的生产方法、筛选方法、生长促进方法及突变MC4R基因的说明。

本发明人们进行了深入研究，结果发现，MC4R基因与鱼类的生长有关，具体而言，发现通过使MC4R基因丧失功能可促进鱼类的生长，从而做出了本发明。本发明的鱼类由于MC4R基因已丧失功能，因此与例如具有正常型的MC4R基因(以下也称为“正常MC4R基因”)且MC4R基因以外相同的鱼类(以下也称为“野生型鱼类”或“对照鱼类”)相比生长得到促进。上述生长可以为例如上述鱼类的体长的伸长、体重的增加、体积的增加及摄食量的增加中的任一种。因此，根据本发明的鱼类，与上述野生型鱼类相比，例如可以缩短达到目标生长阶段所需的饲养期，特别适合作为养殖用鱼类来使用。另外，虽然机制尚不清楚，但是本发明的鱼类与例如上述野生型鱼类相比达到性成熟所需的时间缩短。因此，根据本发明的鱼类，与例如上述野生型鱼类相比，能够以更短的时间达到可交配(例如采卵、采精)的程度，因此特别适合作为养殖用鱼类来使用。

本发明中，“鱼类”例如是指：被归类在脊椎动物亚门中的、除四足动物之外的动物组中的动物。作为具体例，上述鱼类可列举例如四齿鲀科(Tetraodontidae：puffers)、箱鲀科(Ostraciidae：boxfishes)、鲷科(Sparidae：sea breams and porgies)、鮨科(Serranidae：sea basses)、青鳉科(Oryziidae：medakas)、牙鲆科(Paralichthys)等鱼类。上述四齿鲀科的鱼类可列举例如：红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)、紫色东方鲀(Takifugu porphyreus)、星点东方鲀(Takifugu niphobles)等红鳍东方鲀属(Takifugu)；惠氏兔头鲀(Lagocephalus wheeleri)等兔头鲀属(Lagocephalus)等鱼类。上述箱鲀科的鱼类可列举例如无斑箱鲀(Ostracionimmaculatus)等箱鲀属的鱼类。上述鲷科的鱼类可列举例如：真鲷(Pagrusmajor)、赤鲷(Pagrusauratus)等真鲷属(Pagrus)；黑棘鲷(Acanthopagrusschlegelii)、黄鳍棘鲷(Acanthopagrus latus)等棘鲷(Acanthopagru) 属；黄鲷(连子鲷)(Dentex tumifrons)等黄鲷属(Dentex)等的鱼类。上述鮨科的鱼类可列举例如七带石斑鱼(Epinephelus septemfasciatus)、褐带石斑鱼(Epinephelus bruneus)、赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)、点带石斑鱼(Epinephelusmalabaricus)等石斑鱼属(Epinephelus)；豹纹鳃棘鲈(Plectropomus leopardus)等鳃棘鲈属(Plectropomus)等的鱼类。上述青鳉科的鱼类可列举例如青鳉(Oryzias latipes、Oryzias sakaizumii)、爪哇青鳉(Oryzias javanicus)等青鳉属(Oryzias)等的鱼类。上述牙鲆科的鱼类可列举例如牙鲆(Paralichthys olivaceus)等。本发明中，上述鱼类优选例如为用于养殖的鱼类。

本发明中，上述鱼类可以为上述鱼类的整体，也可以为其一部分(部分)。在为上述鱼类的整体的情况下，上述鱼类的生长阶段没有特别限制，可以为例如仔鱼(幼体)、稚鱼、未成熟鱼(幼鱼、小鱼)及成鱼中的任一者。上述鱼类的一部分没有特别限制，可列举例如上述鱼类的可食用部分。上述可食用部分可列举例如肌肉、食道、胃、幽门垂、肠管、精巢、卵巢、肝脏、脾脏、心脏、鳔、表皮等。

在本发明中，黑素皮质素受体-4(MC4R)基因可以为鱼类的MC4R基因。作为具体例，上述鱼类的MC4R基因可例示例如下述表1的MC4R基因(正常MC4R基因)。下述表1中的登录号为GenBank登录号。

[表1]

源自红鳍东方鲀的MC4R基因的mRNA(序列号1)

源自真鲷的MC4R基因的mRNA(序列号2)

源自星点东方鲀的MC4R基因的mRNA的部分序列(序列号3)

源自青鳉的MC4R基因的mRNA(序列号4)

本发明中，“功能丧失”是指例如：该基因原本所具有的功能减弱或消失的状态。上述MC4R基因的功能丧失是指例如：上述MC4R基因的功能减弱或消失、并且达到与上述野生型鱼类相比本发明的鱼类的生长得到促进的程度的状态。另外，上述MC4R基因的功能丧失是指例如：MC4R介导的信号转导下调或上述信号转导产生缺陷。上述MC4R基因的功能丧失具体可以是指例如上述MC4R基因的mRNA或MC4R蛋白的表达量下降的状态、或上述MC4R基因的mRNA或MC4R蛋白完全不表达的状态，可以是指有功能的MC4R基因的mRNA或MC4R蛋白的表达量下降的状态或完全不表达有功能的MC4R基因的mRNA或MC4R蛋白的状态。

上述鱼类例如在一对常染色体上分别具有上述MC4R基因。另外，通过使上述MC4R基因丧失功能而得到的、促进鱼类生长的性状例如为显性性状。因此，本发明的鱼类可以为例如一对常染色体的MC4R基因中的任一常染色体的MC4R基因丧失了功能，也可以为两个常染色体的MC4R基因丧失了功能。

上述MC4R基因的功能丧失例如可以是通过对上述正常MC4R基因导入突变、更具体为功能丧失性突变而引起的。上述突变的种类没有特别限制，可列举例如点突变、错义突变、无义突变、移码突变、碱基大量缺失(Large Deletion)等。作为具体例，上述MC4R基因的功能丧失例如可以通过对上述正常MC4R基因的碱基序列导入1个碱基以上的插入、缺失和/或置换等突变而引起。上述MC4R基因中的突变位置没有特别限制，可以设为与上述正常MC4R基因有关的任意区域，可列举例如：上述正常MC4R基因的启动子区域等表达调控区域、上述MC4R蛋白的跨膜区域、配体结合区域等编码MC4R蛋白的编码区、不编码上述MC4R蛋白的非编码区(例如内含子、增强子区域等)等。上述MC4R基因的功能丧失例如可以进一步促进上述鱼类的生长，因此优选通过上述MC4R基因的部分缺失或完全缺失而引起MC4R基因的功能丧失。上述部分缺失是指例如上述MC4R基因中的部分碱基序列缺失。上述MC4R基因中的部分缺失的位置没有特别限制，可以援引例如上述MC4R基因中的突变的位置的说明。另外，上述完全缺失是指例如上述MC4R基因中的全部碱基序列缺失、即编码MC4R蛋白的基因不存在。这种情况下，本发明的鱼类中，例如上述MC4R基因是完全缺失的。

上述MC4R基因的功能丧失例如可以通过利用常规方法向对象鱼类的基因组的MC4R基因导入突变而引起。上述突变导入法例如可以通过同源重组和使用了ZFN、TALEN、CRISPR-CAS9、CRISPR-CPF1等的基因组编辑技术等实施。上述突变导入法例如也可以通过定点诱变法等突变导入法实施。另外，上述突变导入法例如可以通过随机诱变法实施。上述随机诱变法可列举例如：照射α射线、β射线、γ射线、X射线等辐射线；利用甲磺酸乙酯(EMS)、乙基亚硝基脲(ENU，N-Ethyl-N-nitrosourea)等诱变剂的处理；重离子束等。需要说明的是，上述各突变导入法例如可以使用市售的试剂盒等实施。

本发明的鱼类例如也可以通过后述的本发明的生产方法、筛选方法及生长促进方法来生产。

＜鱼类的生产方法＞

如上所述，本发明的鱼类的生产方法的特征在于包括交配工序，其使上述本发明的鱼类与其它鱼类进行交配。本发明的生产方法的特征为在上述交配工序中使用上述本发明的鱼类，其它工序及条件没有特别限制。根据本发明的生产方法，例如可以生产与上述野生型鱼类相比生长得到促进的鱼类。具有上述功能丧失性突变的MC4R基因可经由本发明的鱼类的生殖细胞而被后代鱼类继承。因此，根据本发明的生产方法，例如可以通过使本发明的鱼类与其它鱼类进行交配，从而容易地生产继承了具有上述功能丧失性突变的MC4R基因、及继承了起因于具有上述功能丧失性突变的MC4R基因的性状的后代鱼类。本发明的生产方法例如可以援引上述本发明的鱼类、后述的筛选方法、生长促进方法及突变MC4R基因的说明。

在上述交配工序中，作为第一亲代使用的鱼类可以为上述本发明的鱼类。如上所述，上述本发明的鱼类也可以为例如通过后述的上述本发明的筛选方法及生长促进方法得到的鱼类。因此，例如，可以通过在上述交配工序之前从被检鱼类中筛选来准备上述本发明的鱼类。另外，例如，可以通过向对象鱼类的MC4R基因中导入功能丧失性突变来准备上述本发明的鱼类。

在从上述被检鱼类中筛选的情况下，本发明的生产方法例如包括被检鱼类筛选工序，其从上述被检鱼类中筛选上述本发明的鱼类。在上述被检鱼类筛选工序中，上述本发明的鱼类的筛选可以称为上述MC4R基因已丧失功能的被检鱼类的筛选。上述MC4R基因的功能丧失例如可以通过读取上述被检鱼类的MC4R基因的碱基序列、并与上述正常MC4R基因的碱基序列进行比较而实施。接着，例如在上述被检鱼类的MC4R基因的碱基序列相对于上述正常MC4R基因的碱基序列导入有功能丧失性突变的情况下，则筛选出上述被检鱼类作为本发明的鱼类。上述碱基序列的比较例如可以通过公知的碱基序列分析软件来实施。另外，在上述MC4R基因的功能丧失是通过对于上述正常MC4R基因的碱基序列导入1个碱基以上的插入、缺失和/或置换等突变而引起的情况下，例如可以使用能够检测至少1个突变的引物组、探针或这些的组合来实施。上述引物组及探针例如可以基于上述突变的种类用公知的设计方法来设计。另外，上述MC4R基因的功能丧失例如可以基于上述被检鱼类的MC4R基因的mRNA或MC4R蛋白的功能来判断、从而实施。进一步地，上述MC4R基因的功能丧失例如可以基于上述被检鱼类是否表达MC4R或MC4R表达量来判断、从而实施。

在基于上述MC4R表达量来判断的情况下，本发明的生产方法例如包括测定工序，其测定上述被检鱼类的生物试样的MC4R表达量，在上述被检鱼类筛选工序中，基于上述被检鱼类的生物试样的MC4R表达量和基准值来筛选上述MC4R基因已丧失功能的被检鱼类，从而可以实施。具体而言，上述已丧失功能的被检鱼类的筛选例如可以通过对比上述被检鱼类的生物试样的MC4R表达量与上述基准值来实施。

上述被检鱼类的生物试样没有特别限制，可以为例如上述被检鱼类的全身中的任一脏器，也可以为源自上述脏器的细胞。上述被检鱼类的生物试样可列举例如鳍、脑等。上述测定工序中使用的生物试样的种类例如可以为1种，也可以为两种以上。

上述测定工序中所测定的MC4R表达量可列举例如上述MC4R蛋白的表达量。上述MC4R蛋白的表达量可以通过例如紫外吸收法、二喹啉甲酸法等使用分光光度计的方法；ELISA、蛋白质印迹等公知的蛋白质定量方法来实施。

上述基准值可列举例如上述野生型鱼类的MC4R表达量、上述MC4R基因已丧失功能的鱼类(例如MC4R基因完全缺失鱼类)的MC4R表达量等。在使用上述已丧失功能的鱼类的MC4R基因表达量作为上述基准值时，上述已丧失功能的鱼类可以是例如分别位于一对染色体上的2个MC4R基因中的任一MC4R基因已丧失功能的鱼类，也可以是两个MC4R基因都已丧失功能的鱼类。作为上述基准值的MC4R表达量例如可以如下得到：通过与上述被检鱼类的生物试样同样的方法，测定在与上述被检鱼类的生物试样相同的条件下收集的生物试样的MC4R表达量，从而得到。上述基准值例如可以预先测定，也可以与上述被检鱼类的生物试样同时测定。

这种情况下，在上述被检鱼类筛选工序中，上述被检鱼类的MC4R基因是否已丧失功能的评价方法没有特别限制，可根据上述基准值的种类适宜决定。作为具体例，在上述被检鱼类的生物试样的MC4R表达量低于上述野生型鱼类的MC4R表达量的情况下、与上述MC4R基因已丧失功能的鱼类的MC4R表达量相同的情况下(没有显著性差异的情况下)、和/或低于已丧失功能的鱼类的MC4R表达量的情况下，可以将上述被检鱼类评价为上述MC4R基因已丧失功能。然后，筛选出被评价为上述MC4R基因已丧失功能的被检鱼类来作为例如上述本发明的鱼类。

在向上述对象鱼类的MC4R基因中导入功能丧失性突变的情况下，本发明的生产方法例如包括制作工序，其在上述交配工序之前由上述对象鱼类制作上述本发明的鱼类。上述制作工序例如包括突变工序，其向上述对象鱼类的MC4R基因中导入功能丧失性突变。功能丧失性突变向上述MC4R基因的导入例如可以通过对上述正常MC4R基因导入突变来实施。作为具体例，功能丧失性突变向上述MC4R基因的导入例如可以通过对上述正常MC4R基因的碱基序列导入1个碱基以上的插入、缺失和/或置换等突变来实施。在上述突变工序中，上述功能丧失性突变例如为上述MC4R基因的部分缺失突变或完全缺失突变。上述对象鱼类可列举例如上述野生型鱼类。上述突变的种类、突变的位置等可以援引上述本发明的鱼类中的上述突变的种类、突变的位置等的说明。

上述突变工序优选包括：突变导入工序，其向上述对象鱼类的MC4R基因导入突变；及突变筛选工序，其筛选出通过上述突变导入工序得到的对象鱼类中的、MC4R基因中具有功能丧失性突变的对象鱼类。上述突变工序中的功能丧失性突变导入法及上述突变导入工序中的突变导入法例如可以援引上述突变导入法的说明。

在上述突变筛选工序中，上述MC4R基因中有无功能丧失性突变例如可以通过评价上述MC4R基因的功能是否丧失来实施。上述MC4R基因的功能丧失例如可以通过读取上述对象鱼类的MC4R基因的碱基序列、并且与上述正常MC4R基因的碱基序列进行比较来实施。另外，上述MC4R基因的功能丧失例如可以通过基于上述对象鱼类的MC4R基因的mRNA或MC4R蛋白的功能进行判断、从而实施。进一步地，上述MC4R基因的功能丧失例如可以通过基于上述对象鱼类是否表达MC4R或MC4R表达量进行判断、从而实施。

在基于上述MC4R表达量进行判断时，本发明的生产方法例如包括测定工序，其测定上述突变导入后的对象鱼类的生物试样的MC4R表达量，在上述突变筛选工序中，可以基于上述对象鱼类的生物试样的MC4R表达量和基准值来筛选上述MC4R基因已丧失功能的对象鱼类，从而实施。上述测定工序及上述突变筛选工序例如可以与从上述被检鱼类中筛选时的上述测定工序及上述被检鱼类筛选工序同样地实施、可以将“被检鱼类”替换为“对象鱼类”、将“被检鱼类筛选工序”替换为“突变筛选工序”并援引其说明。然后，在上述是否已丧失功能的评价之后，例如筛选出被评价为上述MC4R基因已丧失功能的对象鱼类，来作为上述对象鱼类中的、MC4R基因中具有功能丧失性突变的对象鱼类、即上述本发明的鱼类。

如上所述，上述交配工序为使上述本发明的鱼类与其它鱼类进行交配的工序。用于交配的上述本发明的鱼类例如为与其它鱼类同种的鱼类。上述其它鱼类只要是能够与本发明的鱼类交配的鱼类即可，可以是例如上述具有正常MC4R基因的鱼类，也可以是具有已丧失功能的MC4R基因的鱼类。上述“能够交配”是指例如能够自然交配或人工交配。在上述交配工序中，上述本发明的鱼类与其它鱼类的交配方法没有特别限制，可以是雄鱼与雌鱼间的自然繁殖，也可以是使用雄鱼的配子(精子)及雌鱼的配子(卵)的人工繁殖。在通过上述人工繁殖而实施交配的情况下，例如从性成熟的本发明的鱼类及其它鱼类收集配子。然后，例如通过使源自一方鱼类的卵与源自另一方鱼类的精子进行受精，从而进行交配，即制作受精卵。另外，上述交配工序中，例如也可以通过将从上述MC4R基因已丧失功能的鱼类收集的生殖细胞等移植到另一鱼类中，使移植后的鱼类与其它鱼类交配，由此来得到上述MC4R基因已丧失功能的鱼类等。

本发明的生产方法例如包括繁育工序，其对通过上述交配工序得到的鱼类进行繁育。上述鱼类的繁育条件及繁育方法例如可以根据上述鱼类的生长阶段及上述鱼类的种类适宜决定。上述繁育工序中，例如可以繁育到上述鱼类的任意生长阶段。

＜生长得到促进的鱼类的筛选方法＞

本发明的生长得到促进的鱼类的筛选方法(以下也称为“筛选方法”)的特征在于，包括被检鱼类筛选工序，其从被检鱼类中筛选出黑素皮质素受体-4(MC4R)基因已丧失功能的被检鱼类。本发明的筛选方法的特征为筛选出上述MC4R基因已丧失功能的被检鱼类，其它工序及条件没有特别限制。根据本发明的筛选方法，例如特别是可以简便地筛选出适合于养殖的生长得到促进的鱼类。因此，本发明的筛选方法例如也可以称为生长得到促进的鱼类的生产方法。本发明的筛选方法例如可以援引上述本发明的鱼类、生产方法、后述的生长促进方法及突变MC4R基因的说明。

本发明的筛选方法中的被检鱼类筛选工序例如可以与上述本发明的生产方法中的被检鱼类筛选工序同样地实施，可以援引其说明。

本发明的筛选方法例如包括测定工序，其测定上述被检鱼类的生物试样的黑素皮质素受体-4(MC4R)的表达量，在上述被检鱼类筛选工序中，基于上述被检鱼类的生物试样的MC4R表达量和基准值来筛选上述MC4R基因已丧失功能的被检鱼类。

在本发明的筛选方法中，上述MC4R表达量例如为上述MC4R基因的蛋白质的表达量。

在本发明的筛选方法中，上述生物试样可列举例如鳍、脑等。

＜鱼类的生长促进方法＞

如上所述，本发明的鱼类的生长促进方法(以下也称为“生长促进方法”)的特征在于，包括突变工序，其向对象鱼类的黑素皮质素受体-4(MC4R)基因中导入功能丧失性突变。本发明的生长促进方法的特征为向MC4R基因中导入功能丧失性突变，其它工序及条件没有特别限制。根据本发明的生长促进方法，例如可以促进上述对象鱼类的生长。因此，本发明的筛选方法例如也可以称为生长得到促进的鱼类的生产方法。本发明的生长促进方法例如可以援引上述本发明的鱼类、生产方法、筛选方法及后述的突变MC4R基因的说明。

本发明的生长促进方法中的突变工序例如可以与上述本发明的生产方法中的突变工序同样地实施，可以援引其说明。

在本发明的生长促进方法中，上述功能丧失性突变例如为上述MC4R基因的部分缺失突变或完全缺失突变。

在本发明的生长促进方法中，上述突变工序例如包括：突变导入工序，其向上述对象鱼类的MC4R基因中导入突变；及突变筛选工序，其筛选出通过上述突变导入工序而得到的对象鱼类中的、MC4R基因中具有功能丧失性突变的对象鱼类。

本发明的生长促进方法例如包括测定工序，其测定上述突变导入工序后的对象鱼类的生物试样的MC4R表达量，在上述突变筛选工序中，基于上述对象鱼类的生物试样的MC4R表达量和基准值来筛选MC4R基因中具有功能丧失性突变的对象鱼类。

在本发明的生长促进方法中，上述MC4R表达量例如为上述MC4R基因的蛋白质的表达量。

在本发明的生长促进方法中，上述生物试样可列举例如鳍、脑等。

＜鱼类的突变型的黑素皮质素受体-4基因＞

如上所述，本发明的鱼类的突变型的黑素皮质素受体-4(MC4R)基因(以下也称为“突变MC4R基因”)的特征在于，在鱼类的MC4R基因中具有功能丧失性突变。本发明的突变MC4R基因的特征为在鱼类的MC4R基因中有功能丧失性突变，其它构成及条件没有特别限制。根据本发明的突变MC4R基因，例如可以促进鱼类的生长。本发明的突变MC4R基因例如可以援引上述本发明的鱼类、生产方法、筛选方法及生长促进方法的说明。

上述鱼类的MC4R基因为上述鱼类的正常MC4R基因。上述功能丧失性突变的种类没有特别限制，例如可以援引上述突变的说明。在本发明的突变MC4R基因中，上述功能丧失性突变例如为上述MC4R基因的部分缺失突变。

本发明的突变MC4R基因例如可以通过对上述正常MC4R基因导入功能丧失性突变来制造。上述功能丧失性突变的导入例如可列举上述突变导入法。

实施例

以下使用实施例详细说明本发明，但本发明不受实施例中记载的方式限定。

[实施例1]

制作MC4R基因已丧失功能的红鳍东方鲀，分别确认与野生型的红鳍东方鲀相比生长得到促进。

(1)受精卵的制作

对性成熟的雌性和雄性的红鳍东方鲀，肌肉内给药性激素(雌：des Gly10[D-Ala6]-LHRH,400μg/kg体重、雄：des Gly10[D-Ala6]-LHRH,200μg/kg体重或人绒毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin),500IU/kg体重)而实施性激素处理。在性激素处理后3-6天时，通过压迫腹部从雌性和雄性的红鳍东方鲀分别采集卵(未受精卵)及精子。对于得到的卵及精子进行人工授精，得到受精卵。

(2)功能丧失的红鳍东方鲀的制作

参照下述参考文献1，使用CRISPR-Cas9实施突变的导入。首先，通过以下的步骤制作SP6体外(in vitro)转录用的Cas9表达载体(pCS2+hSpCas9)。使用下述Cas9用引物组和pX330(Addgene Plasmid 42230)，通过PCR扩增编码按照用于人的方式进行了密码子优化的酿脓链球菌(S.pyogenes)的Cas9核酸酶的DNA序列。将得到的PCR产物克隆到pCS2+MT载体的限制性内切酶位点(BamHI/XbaI)，从而得到Cas9表达载体。需要说明的是，上述Cas9表达载体可从Addgene(http://www.addgene.org)获取。

参考文献1：Satoshi Ansai et.al,“Targeted mutagenesis using CRISPR/Cassystem in medaka”,Biology Open,2014,vol.3,pages 362-371

参考文献2：Turner,D.L.and Weintraub,H.“Expression of achaete-scutehomolog 3in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate.”,1994,Genes Dev,vol.8,pages 1434-1447.

CAS9用引物组

正向引物(hSpCas9FW、序列号5)

5’-GCAGGATCCGCCACCATGGACTATAAGGAC-3’

反向引物(hSpCas9RV、序列号6)

5’-AGTTCTAGATTACTTTTTCTTTTTTGCCTGGC-3’

通过以下的步骤制作单导RNA(sgRNA)的表达载体。在制作sgRNA表达载体时，使用在部分向导RNA序列的上游配置有T7启动子的pDR274载体(Addgene Plasmid 42250)。合成各sgRNA制作用寡聚DNA的1对，退火，然后将它们插入到pDR274载体中。使用T7 RNA聚合酶合成sgRNA1及sgRNA2，然后用RNA纯化盒(cartridge)纯化上述sgRNA1及sgRNA2。委托Operon Biotechnologies公司实施上述sgRNA制作用寡聚DNA的1对的合成。上述sgRNA1及sgRNA2在基因组上的靶位点如下述表2所示。需要说明的是，在上述序列号1的碱基序列中，第1个下划线所示的碱基序列为sgRNA1的靶序列，第2个下划线所示的碱基序列为与sgRNA2的靶序列互补的碱基序列。

[表2]

将上述sgRNA1制作用寡聚DNA的1对(1S及1AS)以终浓度分别为10mmol/L的方式添加到退火缓冲液中，使上述sgRNA1与互补链退火。上述退火缓冲液的组成为40mmol/LTris-HCl(pH8.0)、20mmol/L MgCl₂及50mmol/L NaCl。上述退火通过在95℃加热处理2分钟、然后用1小时缓慢冷却到25℃来实施。另外，对于上述sgRNA2也同样地进行退火。用限制性内切酶(BsaI-HF、New England Biolabs)处理pDR274载体，与退火后的sgRNA1及sgRNA2分别连接，从而得到sgRNA表达载体。

接着，用限制性内切酶(NotI)处理上述Cas9表达载体而使其线性化。然后使用线性化的Cas9表达载体及RNA合成试剂盒(mMessagemMachine SP6 Kit、Life Technologies)合成编码Cas9的capRNA(帽状RNA)(Cas9RNA)。使用RNA纯化试剂盒(RNeasy Mini Kit、Qiagen)对得到的capRNA进行纯化。

用限制性内切酶(DraI)处理上述sgRNA表达载体而使其线性化。然后使用线性化的sgRNA表达载体及RNA合成试剂盒(AmpliScribe(商标)T7-Flash(商标)TranscriptionKit、Epicentre)合成sgRNA1及sgRNA2。分别使用RNA纯化试剂盒(RNeasy Mini Kit、Qiagen)对得到的sgRNA1及sgRNA2进行纯化。

利用显微注射法向上述(1)中得到的单细胞期的受精卵的细胞质中导入2～10pgCas9RNA及1～5pg sgRNA1或sgRNA2，从而向MC4R基因中导入突变。其结果是，得到在下述序列号13～15的碱基序列(sgRNA1的靶序列)中缺失了下划线所示的5、7或13个碱基的个体(红鳍东方鲀品系1～3)及在下述序列号16～17的碱基序列(sgRNA2的靶序列)中缺失了下划线所示的4或5个碱基的个体(红鳍东方鲀品系4～5)、即导入了功能丧失性突变(功能缺失性突变)的个体。

红鳍东方鲀品系1

5’-CAGCAACGGGAGCCAAACCCCGG-3’(序列号13)

红鳍东方鲀品系2

5’-CAGCAACGGGAGCCAAACCCCGG-3’(序列号14)

红鳍东方鲀品系3

5’-CAGCAACGGGAGCCAAACCCCGG-3’(序列号15)

红鳍东方鲀品系4

5’-CATGCTCTTGATCAGCGTGGCGG-3’(序列号16)

红鳍东方鲀品系5

5’-CATGCTCTTGATCAGCGTGGCGG-3’(序列号17)

对上述导入后的受精卵进行培养、孵化，然后通过常规养殖方法进行饲养。另外，测定饲养开始后7、8、12、15、20及24个月的各个体(n＝49、49、48、48、45、17)的体重。对照除了无处理以外均同样进行并测定各个体(各月：n＝30)的体重。需要说明的是，对照由株式会社HIGASHIMARU进行饲养。将该结果示于下述表3及图1。

[表3]

	7个月	8个月	12个月	15个月	20个月	24个月
							实施例1	599.1	723.4	1031.9	1142.8	1746.3	2033
对照	126	165	415	605	960	-

(体重单位：g)

图1为示出MC4R基因已丧失功能的红鳍东方鲀的体重的图。图1中，横轴表示饲养期，纵轴表示体重。如图1及上述表3所示，在任一饲养期的情况下，实施例1的红鳍东方鲀与对照的红鳍东方鲀(野生型红鳍东方鲀)相比体重均显著增加。另外，已知上市供食用的野生型红鳍东方鲀的体重为1kg。由上述表3及图1可知，对照的红鳍东方鲀为了达到体重1kg需要20个月以上的饲养期。与此相对地，实施例1的红鳍东方鲀在12个月时达到体重1kg。即，实施例1的红鳍东方鲀与对照的红鳍东方鲀相比，以约2倍的生长速度生长。

由以上结果可知，本发明的鱼类与野生型鱼类相比，生长得到促进，因此例如可以缩短饲养期。

[实施例2]

制作MC4R基因已丧失功能的星点东方鲀，分别确认与野生型的星点东方鲀相比生长得到促进。

代替雌性和雄性的红鳍东方鲀，使用雌性和雄性的星点东方鲀，仅使用上述sgRNA2，除此以外同样地向MC4R基因中导入突变。其结果是，得到在下述碱基序列(sgRNA1的靶序列)中缺失了下划线所示的5或7个碱基的个体(星点东方鲀品系1～2)、即导入了功能缺失性突变的个体。需要说明的是，上述序列号3的碱基序列中的下划线所示的碱基序列为与sgRNA2的靶序列互补的碱基序列。

星点东方鲀品系1

5’-CATGCTCTTGATCAGCGTGGCGG-3’(序列号16)

星点东方鲀品系2

5’-CATGCTCTTGATCAGCGTGGCGG-3’(序列号17)

接着，除了使用上述导入后的星点东方鲀的受精卵以外与上述实施例1同样进行，测定饲养开始后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月及8个月时各个体(n＝17)的体重。另外，对照不进行处理，除此以外同样进行并测定各个体(n＝7)的体重。将其结果示于下述表4及图2。

[表4]

	2个月	3个月	4个月	5个月	6个月	7个月	8个月
								实施例2	1.8	4.5	7.1	8.9	12	13.3	15.5
对照	1.2	3.5	5.9	7.2	9.2	10.4	12.6

(体重单位：g)

图2为示出MC4R基因已丧失功能的星点东方鲀的体重的图。图2中，横轴表示饲养期，纵轴表示体重。如图2及上述表4所示，在任一饲养期的情况下，实施例2的星点东方鲀与对照的星点东方鲀(野生型的星点东方鲀)相比体重均显著增加。另外，在饲养期为8个月时，实施例2的星点东方鲀与野生型的星点东方鲀相比，体重为其1.23倍，显示出1.23倍的生长速度。

由以上结果可知，本发明的鱼类与野生型鱼类相比生长得到促进，因此例如可以缩短饲养期。

[实施例3]

对于MC4R基因已丧失功能的红鳍东方鲀及星点东方鲀，确认性成熟得到促进。

对于上述实施例1中得到的MC4R基因已丧失功能的雌的红鳍东方鲀(n＝3)，在饲养期为24个月时，实施上述性激素处理。然后，在性激素处理后3～6天时压迫腹部确认排卵的结果是，对于所有雌性红鳍东方鲀均确认到排卵。已知通常雌性野生型红鳍东方鲀的性成熟最少需要3年。与此相对地，雌性MC4R基因已丧失功能的红鳍东方鲀在2年时达到性成熟，可知性成熟得到促进。

接着，对于实施例2中得到的雄性星点东方鲀确认排精。其结果是，在饲养期为6个月时出现有排精的雄性星点东方鲀，在7个月时确认4个雄性个体排精，在8个月时确认5个雄性个体排精(共19个体，雌雄混合)。已知通常雄性野生型星点东方鲀的性成熟分别需要1年。与此相对地，雄性MC4R基因已丧失功能的星点东方鲀个体最早在6个月时达到性成熟，可知性成熟得到促进。

由以上结果可知，本发明的鱼类与野生型鱼类相比，性成熟得到促进。

[实施例4]

制作MC4R基因已丧失功能的青鳉，分别确认与野生型的青鳉相比生长得到促进。

通过下述参考文献3中记载的方法制作TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶，Transcription Activator-Like Effector Nuclease)。即，通过GoldenGate法制作用于合成与各靶序列特异地结合的2种TALEN(Left arm(左臂)及Right arm(右臂))RNA的质粒。该质粒具有SP6引物。使用上述RNA合成试剂盒(mMessagemMachine SP6 kit、Ambion/LifeTechnologies)合成TALEN-RNA，并利用RNA纯化柱(Qiagen RNeasy mini(Qiagen公司制)的旋转柱)对其进行纯化。

参考文献3：Satoshi Ansai et.al.,“Efficient Targeted Mutagenesis inMedaka Using Custom-Designed Transcription Activator-Like EffectorNucleases”,2013,vol.193,No.3,pages 739-749

[表5]

通过显微注射法(microinjection)将得到的TALEN-RNA导入到171个青鳉受精卵中。导入的RNA量设为5～15pg。将得到的受精卵饲养至长成成鱼。读取由上述成鱼得到的第2代(F2代)中的144个个体的MC4R基因的碱基序列，结果得到了在上述TALEN1的靶序列中缺失了下划线所示的7个碱基的个体及在上述TALEN2的靶序列中缺失了下划线所示的11个碱基的个体、即导入了功能缺失性突变的个体。对由这些个体得到的后代进行传代，建立MC4R基因已丧失功能的青鳉品系。以下也将缺失了7个碱基的个体的后代称为青鳉品系1、将缺失了11个碱基的个体的后代称为青鳉品系2。

接着，对源自青鳉品系1及青鳉品系2的10个青鳉个体，测定孵化后2周龄时的体重。另外，对照不进行处理，除此以外同样进行并测定体重。将其结果示于下述表6及图3。

[表6]

图3为示出MC4R基因已丧失功能的青鳉的体重的图。图3中，横轴表示青鳉的种类，纵轴表示体重。如图3及上述表6所示，实施例4的青鳉与对照的青鳉(野生型青鳉)相比体重均显著增加。

由以上的结果可知，本发明的鱼类与野生型鱼类相比生长得到促进，因此例如可以缩短饲养期。

[实施例5]

确认MC4R基因已丧失功能的青鳉与野生型的青鳉相比摄食量增加。

将上述青鳉品系1及2、以及对照的青鳉(野生型青鳉)分别向水槽中放入6条，给予测量了个体数的卤虫作为饵料。在上述投喂饵料后第4小时测量残留的卤虫数，通过与投喂时的差值来测量青鳉的摄食数。算出每100mg体重的青鳉所摄食的卤虫数作为摄食量。再实施2次同样的试验，算出3次试验的平均值。将该结果示于下述表7及图4。

[表7]

	野生型	青鳉品系1	青鳉品系2
				平均值	1506	2024	1839
标准偏差	150.6	166.2	103.6

(所摄食的卤虫数/100mg体重)

图4为示出MC4R基因已丧失功能的青鳉的摄食量的图。图4中，横轴表示青鳉的种类，纵轴表示摄食量。如图4及上述表7所示，实施例4的青鳉与对照的青鳉(野生型青鳉)相比摄食量均显著增加。

由以上的结果可知，本发明的鱼类与野生型鱼类相比摄食量增加，因此推测生长得到促进。但是本发明不受该推测任何限制。

[实施例6]

确认子代个体经由生殖细胞继承了MC4R基因的功能丧失、及子代个体的生长得到促进。

将上述实施例1的红鳍东方鲀品系3的红鳍东方鲀(雄：3条、雌：3条)饲养到性成熟。从性成熟后的各个体采集精子或未受精卵，与由野生型红鳍东方鲀采集的未受精卵或精子进行人工授精。将得到的受精卵在5天、20℃下培养。由得到的胚提取基因组DNA，分析上述基因组DNA的MC4R基因的碱基序列，从而研究各红鳍东方鲀的生殖细胞的基因组DNA是否继承了MC4R基因的功能缺失性突变。其结果是，获知3条雄鱼中的1个个体的生殖细胞的20％具有缺失了序列号15中下划线所示的13个碱基的突变。另外获知，3条雌鱼中的1个个体的生殖细胞的18％具有缺失了序列号15中下划线所示的13个碱基的突变。

接着，使生殖细胞继承了MC4R基因的功能缺失性突变的雄性个体及雌性个体交配，得到第2代(F2代)。将得到的F2代的50个个体饲养14个月。从上述饲养后的各个体中提取基因组DNA，分析上述基因组DNA中的MC4R基因的碱基序列。其结果是，F2代的个体中，10％的个体(5个个体)以纯合体形式具有缺失了序列号15中下划线所示的13个碱基的突变、即以纯合体形式具有突变MC4R基因。然后对以纯合体形式具有上述突变的各个体(n＝5)，测定饲养第14个月时的体重。需要说明的是，对照使用与实施例1同样的无处理的红鳍东方鲀，除此以外同样地测定各个体(n＝5)的体重。其结果是，以纯合体形式具有突变MC4R基因的第2代红鳍东方鲀与作为对照的红鳍东方鲀(野生型红鳍东方鲀)相比体重均显著增加。

由以上的结果可知，MC4R基因的功能丧失经由生殖细胞而被子代个体继承，且子代个体的生长得到促进。

以上参照实施方式及实施例说明了本发明，但是本发明不受上述实施方式及实施例限定。对于本发明的构成、细节，可以在本发明的范畴内进行本领域技术人员可理解的各种变更。

该申请基于2017年9月28日提出的日本申请特愿2017-187374主张优先权，其公开内容全部引入本申请。

产业上的可利用性

如上所述，本发明的鱼类由于MC4R基因已丧失功能，因此与例如上述野生型鱼类相比生长得到促进。因此，根据本发明的鱼类，与上述野生型鱼类相比例如可以缩短达到目标生长阶段所需的饲养期，特别适合作为养殖用鱼类来使用。另外，本发明的鱼类虽然机制未知，但例如与上述野生型鱼类相比达到性成熟所需的时间缩短。因此，根据本发明的鱼类，例如与上述野生型鱼类相比能够以更短的时间达到可交配(例如采卵、采精)的程度，因此特别适合作为养殖用鱼类来使用。因此，本发明例如在养殖等水产领域极有用。

序列表

<110> 国立大学法人京都大学(Kyoto University)

国立研究开发法人水产研究·教育机构（National Research and DevelopmentAgency Japan Fisheries Research and Education Agency）

学校法人近畿大学(Kinki University)

<120> 鱼类及鱼类的生产方法

<130> TF17096WO

<150> JP 2017-187374

<151> 2017-09-28

<160> 25

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 969

<212> DNA

<213> 红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)

<400> 1

atgaacgcca ccgatccccc tgggagggtg caggacttca gcaacgggag ccaaaccccg 60

gagacggact ttccaaacga ggagaaggaa tcgtctacgg gatgctacga gcagatgctg 120

atctccacgg aggtgttcct gactctggga atcatcagcc tgctggagaa catcctggtg 180

gtcgccgcta tagtgaagaa caagaatctc cactcgccca tgtacttttt catctgcagc 240

ctggccgtgg ccgacatgct cgtgagcgtc tccaacgcct ccgagacgat cgtcatagcg 300

ctcatcaaca gcggcacgct gaccatcccc gccacgctga tcaagagcat ggacaacgtg 360

tttgactcca tgatctgcag ctctttgctg gcgtccatct gcagcctgct cgccatcgcc 420

gtcgaccgct acatcaccat cttctacgcc ctgcgctacc acaacatcgt caccctgcgg 480

agagcctcgc tggtcatcag cagcatctgg acgtgctgca ccgtgtccgg cgtgctcttc 540

atcgtctact cggagagcac caccgtgctc atctgcctca tcaccatgtt cttcaccatg 600

ctggtgctca tggcctccct ctacgtccac atgttcctgc tggcgcgcct gcacatgaag 660

cggatcgcgg cgatgccggg caacgcgccc atccaccaga gagccaacct gaagggcgcc 720

atcaccctca ccatcctcct gggagtgttt gtggtctgct gggcgccttt cttccttcac 780

ctcatcctca tgatcacctg ccccaagaac ccatactgca cgtgcttcat gtcccacttc 840

aacatgtacc tcatcctcat catgtgcaac tccgtcatcg accccatcat ctacgccttt 900

cgcagccagg agatgagaaa aaccttcaag gagatcttct gctgctccca aatgctggtg 960

tgcatgtga 969

<210> 2

<211> 981

<212> DNA

<213> 真鲷(Pagrus major)

<400> 2

atgaacagca cagatctcca tggattgatc cagggctacc acaacaggag ccaaacgtca 60

gttttgcctc tgaacaaaga cttaccagcc gaggagaagg actcatcggc aggatgctac 120

gaacagctgc tgatttctac agaggtgttc ctcactctgg gcatcatcag cctgctggag 180

aacatcctgg ttgttgctgc aatcgtcaag aacaagaacc ttcactcgcc catgtacttc 240

ttcatctgta gcctcgctgt tgctgacatg ctcgtgagcg tctccaacgc ctccgagacc 300

atcgtcatag cgctcatcga tggaggcaac ctgaccatcc ccgccacgct gatcaagaac 360

atggacaatg tatttgactc tatgatctgt agctctctgt tagcgtctat ctgcagcttg 420

ctcgccatcg ccatcgatcg ctacatcacc atcttctacg cgctgcggta ccacaacatt 480

gtcaccctgc ggagagccat attggtcatc agcagcatct ggacgtgctg caccgtctct 540

ggcatcctct tcatcatcta ctcagagagc accacggtgc tcatctgcct catcaccatg 600

ttcttcacca tgctcgttct catggcgtcg ctctacgtgc acatgttcct tctggcgcgc 660

ttgcacatga agcggatcgc cgctctgccg ggcaacgcgc ccatccacca gcgggccaac 720

atgaagggcg ccatcaccct caccatcctc ctcggggtgt tcgtggtgtg ctgggcgccc 780

ttcttcctcc acctcatcct catgatcacc tgccccagga acccctactg cacctgcttc 840

atgtcccact tcaacatgta cctcatcctc atcatgtgca actccgtcat cgaccccatc 900

atctacgctt tccgcagcca ggagatgagg aagaccttca aggagatttt ctgctgctct 960

cacactttcc tgtgcgtgtg a 981

<210> 3

<211> 788

<212> DNA

<213> 星点东方鲀（Takifugu niphoble）

<400> 3

ggaggtgttc ctgactctgg gaatcatcag cctgctggag aacatcctgg tggtcgccgc 60

tatagtgaag aacaagaatc tccactcgcc catgtacttt ttcatctgca gcctggccgt 120

ggccgacatg ctcgtgagcg tctccaacgc ctccgagacg atcgtcatag cgctcatcaa 180

cagcggcacg ctcaccatcc ccgccacgct gatcaagagc atggacaacg tgtttgactc 240

catgatctgc agctccttgc tggcgtccat ctgcagcctg ctcgccatcg ccgtcgaccg 300

ctacatcacc atcttctacg ccctgcgcta ccacaacatc gtcaccctgc ggagagcctc 360

gctggtcatc agcagcatct ggacgtgctg caccgtgtcc ggcgtgctct tcatcgtcta 420

ctcggagagc accaccgtgc tcatctgcct catcaccatg ttcttcacca tgctggtgct 480

catggcctcc ctctacgtcc acatgttcct gctggcgcgc ctgcacatga agcggatcgc 540

ggcgatgccg ggcaacgcgc ccatccacca gagagccaac ctgaagggcg ccatcaccct 600

caccatcctc ctgggagtgt ttgtggtctg ctgggcgcct ttcttccttc acctcatcct 660

catgatcacc tgccccaaga acccatactg cacgtgcttc atgtcccact tcaacatgta 720

cctcatcctc atcatgtgca actccgtcat cgaccccatc atctacgcct ttcgcagcca 780

ggagatga 788

<210> 4

<211> 966

<212> DNA

<213> 青鳉(Oryzias latipes)

<400> 4

atgaactcca ctctgcctta tgggtcggtc cccaacagaa gcctctcctc ggccactctc 60

cctcctgacc tgggaggaca gaaagactcg tcggcgggat gctacgagca gcttctgatc 120

tccactgagg tcttcctcac tttgggcatc atcagcctgc tggagaacat cctggttgtt 180

gctgcgatcg ttaaaaacaa gaacctccac tcccccatgt actttttcat ctgcagcctc 240

gcagtagccg atatgttggt cagcgtctcc aacgcgtctg agaccatcgt catagcgctc 300

attaacggag gcaacctgag cattcctgtc aggctcatca agagcatgga caatgtgttt 360

gactccatga tctgcagctc tctgctggcc tccatctgca gcttgctggc cattgccgtt 420

gaccgctaca tcaccatctt ctacgctctg cgataccaca acatcgtgac gctgcggcga 480

gcagccgtgg tcatcagcag catctggacg tgctgcattg tgtcgggtat cctcttcatc 540

atctactcgg agagtaccac ggtgctcatc tgtctcatca ccatgttctt caccatgctg 600

gtgctcatgg cctccctcta tgtccacatg ttcctgctgg cacgtctgca catgaagcgg 660

atcgcggcgc tgccgggcaa cgcgcccatc caccagcggg cgaacatgaa gggcgccatc 720

accctcacca tcctcctcgg ggtgtttgtg gtgtgctggg cgccgttctt cctccacctc 780

atcctcatga tcacctgccc caggaaccct tactgcacct gcttcatgtc gcacttcaac 840

atgtacctca ttctcatcat gtgcaactcc gtcatcgacc ccatcatcta cgctttccgg 900

agccaggaga tgaggaaaac cttcaaggag atcttctgct gctccaacgc tctcctgtgt 960

gtgtga 966

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的寡核苷酸(hSpCas9FW)

<400> 5

gcaggatccg ccaccatgga ctataaggac 30

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的寡核苷酸(hSpCas9RV)

<400> 6

agttctagat tactttttct tttttgcctg gc 32

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)

<400> 7

cagcaacggg agccaaaccc cgg 23

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的寡核苷酸(sgRNA-FuguMC4R-1)

<400> 8

tagggcaacg ggagccaaac cc 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的寡核苷酸(sgRNA-FuguMC4R-1AS)

<400> 9

aaacgggttt ggctcccgtt gc 22

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)

<400> 10

catgctcttg atcagcgtgg cgg 23

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的寡核苷酸(sgRNA-FuguMC4R-2S)

<400> 11

taggtgctct tgatcagcgt gg 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的寡核苷酸(sgRNA-FuguMC4R-2AS)

<400> 12

aaacccacgc tgatcaagag ca 22

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)

<400> 13

cagcaacggg agccaaaccc cgg 23

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)

<400> 14

cagcaacggg agccaaaccc cgg 23

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)

<400> 15

cagcaacggg agccaaaccc cgg 23

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)

<400> 16

catgctcttg atcagcgtgg cgg 23

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)

<400> 17

catgctcttg atcagcgtgg cgg 23

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 星点东方鲀(Takifugu niphoble)

<400> 18

catgctcttg atcagcgtgg cgg 23

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 星点东方鲀(Takifugu niphoble)

<400> 19

catgctcttg atcagcgtgg cgg 23

<210> 20

<211> 49

<212> DNA

<213> 青鳉（Oryzias latipes)

<400> 20

tccactctgc cttatgggtc ggtccccaac agaagcctct cctcggcca 49

<210> 21

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的寡核苷酸(TALEN 左臂结合序列 1)

<400> 21

tccactctgc cttatgg 17

<210> 22

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的寡核苷酸(TALEN 右臂结合序列 1)

<400> 22

aagcctctcc tcggcca 17

<210> 23

<211> 50

<212> DNA

<213> 青鳉（Oryzias latipes）

<400> 23

tagccgatat gttggtcagc gtctccaacg cgtctgagac catcgtcata 50

<210> 24

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的寡核苷酸(TALEN 左臂结合序列 2)

<400> 24

tagccgatat gttggtc 17

<210> 25

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的寡核苷酸(TALEN 右臂结合序列 2)

<400> 25

ctgagaccat cgtcata 17

Claims

1.一种鱼类，其特征在于，黑素皮质素受体-4即MC4R基因已丧失功能。

2.根据权利要求1所述的鱼类，其中，MC4R基因部分缺失或完全缺失。

3.根据权利要求1或2所述的鱼类，其中，所述鱼类为选自由四齿鲀科、鲷科、鮨科及青鳉科组成的组中的至少一种鱼类。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的鱼类，其用于养殖。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的鱼类，其中，所述鱼类为所述鱼类的可食用部分。

6.一种鱼类的生产方法，其特征在于，其包括交配工序，所述交配工序使权利要求1至4中任一项所述的鱼类与其它鱼类进行交配。

7.根据权利要求6所述的生产方法，其包括繁育工序，所述繁育工序对通过所述交配工序而得到的鱼类进行繁育。

8.根据权利要求6或7所述的生产方法，其中，

在所述交配工序之前包括：

测定工序，其测定被检鱼类的生物试样的黑素皮质素受体-4即MC4R的表达量；及，

被检鱼类筛选工序，其从所述被检鱼类中筛选权利要求1至4中任一项所述的鱼类，

在所述被检鱼类筛选工序中，基于所述被检鱼类的生物试样的MC4R表达量和基准值筛选所述MC4R基因已丧失功能的被检鱼类。

9.根据权利要求6或7所述的生产方法，其在所述交配工序之前包括制作工序，

所述制作工序由对象鱼类制作权利要求1至4中任一项所述的鱼类，

所述制作工序包括突变工序，所述突变工序向所述对象鱼类的MC4R基因中导入功能丧失性突变。