CN115104559A - 一种artp诱变黑公子小丑鱼体色变红的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种ARTP诱变黑公子小丑鱼体色变红的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，采集黑公子小丑鱼受精卵；S2，进行ARTP照射，所述ARTP照射的参数为：射频输入功率为240‑320W，氦气流量为8‑12L/min，照射距离为1.8‑2.2mm，照射时间为3‑10min；S3，将ARTP照射后的受精卵进行孵化后培育成幼鱼，即得体色变红的小丑鱼。本发明方法能将黑公子小丑鱼体色由黑白相间诱变成红白相间，并具有可重复性。

Description

一种ARTP诱变黑公子小丑鱼体色变红的方法
技术领域
本发明涉及一种ARTP诱变黑公子小丑鱼体色变红的方法，属于观赏鱼育种技术领域。
背景技术
黑公子小丑鱼(Amphiprion ocellaris var)属于雀鲷科，双锯鱼属，分布于澳洲珊瑚区、达尔文海域。随着年龄增长体色会转为淡褐、黑褐色，至成鱼时则会呈现黑白相间的模样，且年龄越大色泽越黑。黑公子小丑鱼是公子小丑鱼因地域性而产生的变异种，是一种常见的海洋观赏鱼。但是，黑公子小丑鱼只是呈现黑白相间的模样，颜色不够丰富，降低了观赏性。若对黑公子小丑鱼进行诱变育种，使其体色艳丽，则可以增强其观赏性和商品价值。
ARTP是常温室压等离子体(Atmospheric and Room Temperature Plasma)的简称，能够在大气压下产生温度在25-40C之间的、具有高活性粒子(包括处于激发态的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等)浓度的等离子体射流。常压室温等离子体(ARTP)是一种以氦射频辉光放电等离子体射流(RF APGD)为核心部件的新型微生物突变系统。RF APGD可以在射频电源驱动的两个水冷裸露金属电极之间产生。工作时，等离子体气体(氦气纯度为99.99％或更高)流经两电极之间的放电区在外部射频电场的作用下将其电离，因此，在下游的等离子喷嘴处便形成了由多种化学性质活泼的粒子组成的非热等离子体射流。RFAPGD中各种化学性质活泼的粒子可以通过破坏碱基与核糖之间的C-N键、碱基上的氨基以及磷酸二酯键的P-O键来改变DNA序列。对ARTP诱变的发明表明，利用ARTP辐照是一种快速、有效、方便、多方位的方法，可以产生具有足够多样性的突变体文库，以改善微生物表型。ARTP诱变机理发明表明，与紫外诱变和化学诱变剂相比，ARTP能引起更强的DNA损伤，从而导致更高的突变率。ARTP已成功应用于细菌、真菌、微藻等100多种微生物的诱变育种中。但是，目前尚未见ARTP应用于海洋观赏鱼诱变育种相关报道。
发明内容
本发明提供了一种ARTP诱变黑公子小丑鱼体色变红的方法，可以有效解决上述问题。
本发明是这样实现的：
一种ARTP诱变黑公子小丑鱼体色变红的方法，包括以下步骤：
S1，采集黑公子小丑鱼受精卵；
S2，对受精卵进行ARTP照射，所述ARTP照射的参数为：射频输入功率为240-320W，氦气流量为8-12L/min，照射距离为1.8-2.2mm，照射时间为3-10min；
S3，将ARTP照射后的受精卵进行孵化后培育成幼鱼，即得体色变红的小丑鱼。
作为进一步改进的，步骤S1中，采集黑公子小丑鱼受精卵为在黑公子小丑鱼产卵受精1h后采集，采集后置于海水中充氧待用。
作为进一步改进的，步骤S3中，所述孵化为：将ARTP照射后的受精卵放置于海水中充氧，水温28-30℃，盐度26-28，pH8.0-8.2，氨氮<0.1mg/L，溶解氧≥5.8mg/L，光照周期为12L:12D，光照时间为6:00-18:00，每天换水30％。
作为进一步改进的，步骤S3中，所述培育包括以下步骤：
S31，初孵仔鱼移入培养桶，水温为27-29℃,盐度28-30，pH为8.0-8.2，氨氮量<0.1mg/L，溶解氧≥5.8mg/L，每天吸底并换水20％；孵化后的第1天至第7天投喂经小球藻强化的褶皱臂尾轮虫，轮虫的密度保持在8-12个/mL；第5天开始投喂经小球藻强化的卤虫幼体,卤虫幼体的密度控制在4-6个/mL；第10天开始投喂桡足类；20天后逐渐过渡到粉末饲料；
S32，一个月后，幼鱼移入循环水系统，每周换水20％，培育期间水温26-28℃，盐度30-32，pH8.0-8.2，氨氮<0.1mg/L，溶解氧≥5.8mg/L，水流控制在5000-7000L/H，光照周期为12L:12D，时间为6:00-18:00；每日分别在9:00和15:00投喂2次喂颗粒饲料。
作为进一步改进的，步骤S3中，所述体色变红的小丑鱼为体色红白相间的小丑鱼。
本发明的有益效果是：本发明的方法通过ARTP诱变黑公子小丑鱼，能够可重复得到使黑公子小丑鱼体色变成红白相间的小丑鱼，提高小丑鱼的观赏价值和商品价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是本发明对比例1例提供的受精卵未照射孵化的黑公子小丑鱼，体色为黑白相间。
图2是本发明实施例1-3提供的受精卵照射后孵化的变异的黑公子小丑鱼，体色为红白相间。
图3是本发明实施例4提供的2种黑公子小丑鱼受精卵、皮肤组织基因表达差异。图中ALDZ表示未照射受精卵，ALSY表示照射受精卵，AYDZ表示未照射小丑鱼黑色皮肤组织，AYSY表示照射小丑鱼变红皮肤组织。
图4是本发明实施例4提供的基于差异表达基因对2种样本和基因进行层次聚类图。图中ALDZ表示未照射受精卵，ALSY表示照射受精卵，AYDZ表示未照射小丑鱼黑色皮肤组织，AYSY表示照射小丑鱼变红皮肤组织。
图5是本发明实施例4提供的基于受精卵组、皮肤组织间差异表达基因GO Term生物学功能富集图。分别将未照射受精卵与照射受精卵、未照射鱼与照射鱼之间的差异基因进行生物学功能富集分析，结果以柱状图的形式体现；图中的纵坐标表示生物学功能类目，横坐标表示基因数量。
图6是本发明实施例4提供的参与色素生成的关键功能基因的验证图。其中，对2种黑公子小丑鱼皮肤中参与色素生成的关键功能基因进行了qPCR定量检测，并且与RNA-Seq结果进行了比较，结果显示qPCR检测的结果与RNA-Seq结果趋势一致；横坐标为基因名称、纵坐标为基因表达差异倍数的log2值。
具体实施方式
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
本发明实施例提供一种ARTP诱变黑公子小丑鱼体色变红的方法，包括以下步骤：
S1，采集黑公子小丑鱼受精卵；
S2，对受精卵进行ARTP照射，所述ARTP照射的参数为：射频输入功率为240-320W，氦气流量为8-12L/min，照射距离为1.8-2.2mm，照射时间为3-10min；此参数非常关键，在此参数的情况下，对受精卵进行ARTP低频短时间处理，只引起与肤色相关基因突变，克服基因诱变的随机性，能够稳定的产生体色红白相间的小丑鱼。
S3，将ARTP照射后的受精卵进行孵化后培育成幼鱼，即得体色变红的小丑鱼。
ARTP是一种新型、高效、安全、环保的诱变工具，突变率高于传统诱变剂。虽然ARTP诱变技术在微生物诱变育种中得到了广泛的应用，并证明了其有效性，但其在海洋观赏鱼繁养中的应用至今尚未见报道。本发明通过优化突变条件，首次将ARTP技术应用于黑公子小丑鱼的诱变育种。在相同的ARTP功率和工作气体流量下，ARTP处理时间与突变剂量相当。本发明通过优化ARTP处理时间、频率建立了黑公子小丑鱼ARTP诱变育种方法，成功得实现了将黑公子小丑鱼黑白相间的体色诱变为红白相间的体色，并且可重复实现。
作为进一步改进的，步骤S1中，采集黑公子小丑鱼受精卵为在黑公子小丑鱼产卵受精1h后采集，采集后置于海水中充氧待用。
作为进一步改进的，步骤S3中，所述孵化为：将ARTP照射后的受精卵放置于海水中充氧，水温28-30℃，盐度26-28，pH8.0-8.2，氨氮<0.1mg/L，溶解氧≥5.8mg/L，光照周期为12L:12D，光照时间为6:00-18:00，每天换水30％。此条件能提高受精卵的孵化率。
作为进一步改进的，步骤S3中，所述培育包括以下步骤：
S31，初孵仔鱼移入培养桶充氧，如100L塑料桶，水温为27-29℃,盐度28-30，pH8.0-8.2，氨氮量<0.1mg/L，溶解氧≥5.8mg/L，每天吸底并换水20％；孵化后的第1天至第7天投喂经小球藻强化的褶皱臂尾轮虫，轮虫的密度保持在8-12个/mL；第5天开始投喂经小球藻强化的卤虫幼体,卤虫幼体的密度控制在4-6个/mL；第10天开始投喂桡足类；20天后逐渐过渡到粉末饲料；
S32，一个月后，幼鱼移入循环水系统，如玻璃缸(L1000mm×W500mm×H2300mm，上下三层)循环水系统，每周换水20％，水流控制在5000-7000L/H，培育期间水温26-28℃，盐度30-32，pH8.0-8.2，氨氮<0.1mg/L，溶解氧≥5.8mg/L，光照周期为12L:12D，时间为6:00-18:00；每日分别在9:00和15:00投喂2次颗粒饲料。
此培育条件下，幼鱼的成活率最高。
作为进一步改进的，步骤S3中，所述体色变红的小丑鱼为体色红白相间的小丑鱼。
实施例1
收集受精后1h受精卵随机分为3组，每组100个，分别将受精卵放在装有海水(与受精卵孵化时海水一致)的玻璃载盘里，然后将载盘放置在等离子发生器载物台，进行ARTP照射。用的ARTP诱变仪是基于高纯氦气的ARTP诱变仪。将ARTP系统参数调整为：输入功率240W，氦气流量10L/min，照射距离1.8mm，照射时间3min。照射完后对受精卵进行孵化，孵化为：将ARTP照射后的受精卵放置于装有海水的容器中充氧，海水温度28-30℃，盐度26-28，pH8.0-8.2，氨氮<0.1mg/L，溶解氧≥5.8mg/L，光照周期为12L:12D，光照时间为6:00-18:00，每天换水30％。初孵仔鱼移入100L塑料桶充氧，仔鱼培养期间的水温为27-29℃,盐度28-30,pH8.0-8.2,氨氮<0.1mg/L,溶解氧≥5.8mg/L。加小球藻(Chlorella sp.)50000个/mL。每天吸底并换水20％；一个月的幼鱼移入玻璃缸(L1000mm×W500mm×H2300mm，上下三层)循环水系统，每周换水20％。培育期间水温26-28℃，盐度30-32，PH8.0-8.2，氨氮<0.1mg/L，溶解氧≥5.8mg/L,光照周期为12L:12D,时间为6:00～18:00.。每日分别在9:00和15:00投喂2次饲料。孵化后的第1天至第7天投喂经小球藻强化的褶皱臂尾轮虫(Brachionus plica-tilis)，轮虫的密度保持在10个/mL左右；第5天开始投喂经小球藻强化的卤虫(Artemia sp.)幼体，卤虫幼体的密度控制在5个/mL左右；第10天开始投喂桡足类；20天后逐渐过渡到粉末饲料，一个月后投喂颗粒饲料。
孵育90天后统计受精卵成活和幼鱼体色变红情况，结果如表1所示。孵化后幼鱼体色变成红白相间的鱼如图2所示。
实施例2
收集受精后1h受精卵随机分为3组，每组100个，分别将受精卵放在装有海水的玻璃载盘里，然后将载盘放置在等离子发生器载物台，进行ARTP照射。将ARTP系统参数调整为：输入功率280W，氦气流量10L/min，照射距离2mm，照射时间6min。其他操作同实施例1。
孵育90天后统计受精卵成活和幼鱼体色变红情况，结果如表1所示。孵化后幼鱼体色变成红白相间的鱼如图2所示。
实施例3
收集受精后1h受精卵随机分为3组，每组100个，分别将受精卵放在装有海水的玻璃载盘里，然后将载盘放置在等离子发生器载物台，进行ARTP照射。将ARTP系统参数调整为：输入功率320W，氦气流量10L/min，照射距离2.2mm，照射时间10min。其他操作同实施例1。
孵育90天后统计受精卵成活和幼鱼体色变红情况，结果如表1所示。孵化后幼鱼体色变成红白相间的鱼如图2所示。
对比例1
收集受精后1h受精卵随机分为3组，每组100个，进行孵化，与实施例1不同之处在于不进行ARTP照射，其他操作同实施例1。
孵育90天后统计受精卵成活和幼鱼体色变红情况，结果如表1所示。未突变的体色为黑白相间的鱼如图1所示。
实施例1-3及对比例1的实验数据如表1所示。
表1
Figure BDA0003760354210000091
由表1可知，在实施例1至3中，采用ARTP照射均能使体色黑白相间的小丑鱼变异为体色红白相间的小丑鱼，说明本发明的方法可以重复地实现将体色黑白相间的小丑鱼诱变成为体色红白相间的小丑鱼。随着ARTP照射的输入功率的增大和照射时间的延长，受精卵成活率略有降低，但成活率均为80％以上，保证了最终能够获得足够数目的体色红白相间的小丑鱼，使得本发明的方法的诱变成功率高，可操作性强。
实施例4转录组分析
取样方法：随机挑选了6尾的亚成鱼个体，包括3尾照射后突变红白相间的鱼(实施例1-3中随机挑选)和3尾未照射的黑白相间的鱼(对比例1)。在本研究中，将未照射的样本编号为ALDZ1、ALDZ2、ALDZ3，照射的样本编号为ALSY1、ALSY2和ALSY3。剥取了鱼的皮肤组织后将组织切成小块并在磷酸盐缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)中洗涤3次。将每份样品的皮肤组织均分为两份，将一份储存在液氮中备用，另一份用于提取总RNA。另外，受精卵分别收集照射卵和未照射卵各3个，将未照射受精卵样本编号为ALDZ1、ALDZ2、ALDZ3，照射卵样本编号为ALSY1、ALSY2和ALSY3，实验方法同鱼皮肤组织。
测序方法：使用TRIzol试剂(Invitrogen，加拿大)从皮肤、受精卵组织中提取总RNA后通过Agilent 2100方法检测RNA样品纯度、浓度和完整性。质量控制后，使用oligo(dT)磁珠从每个样品的1μg总RNA中分离带poly(A)的mRNA，随后采用超声处理成随机片段。使用TruSeq RNA文库制备试剂盒v2(Illumina，美国)构建cDNA文库，基于IlluminaHiSeqTM 2500高通量平台，以Pair-end 150bp双端测序模式对cDNA文库进行转录组测序。
为了获得高质量的数据，使用SolexaQA软件从原始读数数据中修剪接头和低质量reads。以眼斑双锯Amphiprion ocellaris(GenBank:NXFZ00000000.1)为参考基因组，利用HISAT2软件，将过滤后的转录组数据使用默认参数与参考基因组进行比对。通过BurrowsWheeler(BWA)软件将过滤后的基因组测序数据与参考基因组进行比对。
通过样品取样、RNA提取、文库构建和上机测序，本实验12份样品获得的原始reads数量在350×105-450×105之间，数据质控后99％的reads为可用reads。每个样品与参考基因组的比对率均大于78％。通过FPKM值估计皮肤、受精卵组织中基因的表达水平，结果显示，所有样品中基因表达的分布相似，表明没有系统性的基因表达差异。样本间的相关系数结果显示，所有样本都表现出良好的相关性，且同一组的样本表现出更强的相关性水平，表明每组都有良好的生物学重复。
差异表达基因的鉴定
本实验进一步比较受精卵、幼鱼鱼皮肤组织之间的转录组表达量来分析DEGs。分析方法为：使用Hisat2-build v21.0软件构建参考基因组的索引，使用HISAT v2.1.0将转录组数据比对至参考基因组。基于基因长度计算每个基因的表达量(FPKM)，并使用StringTie v1.3.5软件计算基因的读数计数。本发明中的差异表达基因(Differentiallyexpressed genes,DEGs)分析采用BH法校正的p值(<0.05)为标准阈值。如图3所示，结果显示，与未照射受精卵相比，照射组受精卵样品中有111个DEGs，其中包括43个上调基因和68个下调基因。与未照射幼鱼鱼皮肤样本相比，照射组鱼皮肤样本中总共有883个DEGs，包括254个上调基因和629个下调基因。利用全部基因的表达量对样本的关系进行层级聚类结果显示，相同组别的样品能聚为一类，说明这些组间的差异基因能够反映了组间的核心差异(图4)。
差异表达基因在与色素生成相关的生物过程中的功能作用
为了进一步解析ARTP照射黑公子小丑鱼皮肤中特异性DEGs的功能，本发明对未照射受精卵和照射受精卵相比的DEGs(标记为ALDZ-vs-ALSY)、红色皮肤和黑色皮肤相比的DEGs(标记为AYDZ-vs-AYSY)分别进行了GO功能富集和分析(图5)。分析方法为：以p值<0.05为阈值，分别使用GOseq R Bioconductor包和KOBAS 2.0对进异基因进行GO功能富集和KEGG通路富集分析。结果显示ALDZ-vs-ALSY和AYDZ-vs-AYSY的差异基因均在细胞进程、生物过程调节、生长调节、信号通路、发育进程、生物过程的负调控等存在显著的富集水平。同时，本发明也对这些差异基因进行了KEGG通路富集结果显示，细胞因子受体相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)、病毒蛋白与细胞因子及细胞因子受体的相互作用(Viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor)、细胞粘附分子(Cell adhesion molecules)、Th17细胞分化(Th17 cell differentiation)等存在富集显示。
使用实时荧光定量PCR进行差异表达基因验证
为了验证以上分析结果，本发明在ALDZ vs ALSY和AYDZ vs AYSY之间随机选择了7个DEGs(tyrp1、tyr、dct、pmel、Pomcb、Slc26a10、tyrp1)设计引物，通过荧光定量PCR相对定量法检测这些基因的表达情况，并与转录组分析结果进行比较，得到的基因表达量的结果与转录组测序所得结果趋势一致(图6)，证实了转录组分析结果的可靠性。具体方法为：通过Primer Premier 5.0软件设计靶基因(tyrp1、tyr、DCT、PMEL、Pomcb、Slc26a10、tyrp1)的引物，所设计的引物均在不同的外显子上，在qPCR检测中能避免基因组DNA污染。使用Promega公司的GoScriptTMReverse Transcriptase System试剂盒将总RNA逆转录合成cDNA。使用Maxima SYBR Green qPCR Mix(2X)进行qRT-PCR，总反应体积为20μl，包括10μlSYBR qPCR Mix、0.8μl正向引物、0.8μl反向引物、2μl cDNA和6.4μl无RNase的水。PCR扩增程序：95℃30s，95℃ 5s、59℃ 10s，72℃ 15s40个循环。通过Bio-Rad公司的iQ5软件检测荧光信号并计算熔解温度。以β-actin为对照，采用2-ΔΔCt法分析各靶基因的相对表达量。本实验对转录组测序样本的所有三个生物学重复均使用三个技术重复进行基因表达量验证。
本发明中，采用转录组测序技术来分析ARTP处理个体的突变基因，也是首次将转录组测序技术应用于ARTP诱导的海洋观赏鱼类突变体。在2种受精卵和皮肤组织两两比对的差异基因数目中，红色与黑色皮肤组织相比的差异基因数目最多，2种受精卵相比的次之，提示在皮肤组织从黑色到红色存在许多基因的表达受到抑制现象。本发明对2种受精卵和皮肤组织相比得到的DEGs进行了KEGG通路的功能富集分析，结果表明，这些DEGs参与了细胞外基质受体相互作用、黑色素生成、Hedgehog信号通路和Wnt信号通路的调控。有研究结果表明，许多细胞外基质受体相互作用基因可能影响早期色素细胞增殖和分化，进而影响黑色素细胞对肤色的调控。Wnt信号通路也与黑色素合成有关，已有研究表明，抑制Wnt/β-catenin信号通路会抑制黑色素生成。
有研究报道，黑色素合成中的核心功能基因出现基因突变是导致许多物种的体色变异现象的重要原因。研究结果显示，多数基因在黑色和红色样本之间表现出差异表达，并观察到参与黑色素合成的3个核心基因(tyr、tyrp1和dct)在红色皮肤样本中均出现基因表达量急剧下降现象。本发明发现有7个基因(tyr、tyrp1a、tyrp1b、dct、pmel、slc26a10和pomcb基因)的表达水平在黑色样品中最高，但却在红色样本出现下调。其中，负责编码酪氨酸酶的tyr基因是黑色素合成的限速酶；tyrp1基因是一种酪氨酸酶相关蛋白，特异性位于黑色素细胞中，参与黑色素合成；而dct基因作为络氨酸酶相关蛋白家族的重要成员，对黑色素生成过程中起重要作用。综上所述，本发明解析了黑公子小丑鱼突变体颜色皮肤组织的转录水平差异基因，发现了一批与黑色素生成密切相关的基因在红色皮肤组织中表达量明显下调的现象，这解释了体色黑白相间的小丑鱼能够稳定地突变为体色红白相间的小丑鱼的原因。
以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种ARTP诱变黑公子小丑鱼体色变红的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，采集黑公子小丑鱼受精卵；
S2，对受精卵进行ARTP照射，所述ARTP照射的参数为：射频输入功率为240-320W，氦气流量为8-12L/min，照射距离为1.8-2.2mm，照射时间为3-10min；
S3，将ARTP照射后的受精卵进行孵化后培育成幼鱼，即得体色变红的小丑鱼。
2.根据权利要求1所述的ARTP诱变黑公子小丑鱼体色变红的方法，其特征在于，步骤S1中，采集黑公子小丑鱼受精卵为在黑公子小丑鱼产卵受精1h后采集，采集后置于海水中充氧待用。
3.根据权利要求1所述的ARTP诱变黑公子小丑鱼体色变红的方法，其特征在于，步骤S3中，所述孵化为：将ARTP照射后的受精卵放置于海水中充氧，水温28-30℃，盐度26-28，pH8.0-8.2，氨氮<0.1mg/L，溶解氧≥5.8mg/L，光照周期为12L:12D，光照时间为6:00-18:00，每天换水30％。
4.根据权利要求1所述的ARTP诱变黑公子小丑鱼体色变红的方法，其特征在于，步骤S3中，所述培育包括以下步骤：
S31，初孵仔鱼移入培养桶充氧，水温27-29℃，，盐度28-30，pH8.0-8.2，氨氮<0.1mg/L，溶解氧≥5.8mg/L，每天吸底并换水20％；孵化后的第1天至第7天投喂经小球藻强化的褶皱臂尾轮虫，轮虫的密度保持在8-12个/mL；第5天开始投喂经小球藻强化的卤虫幼体,卤虫幼体的密度控制在4-6个/mL；第10天开始投喂桡足类；20天后逐渐过渡到粉末饲料；
S32，一个月后，幼鱼移入循环水系统，每周换水20％，培育期间水温26-28℃，盐度30-32，pH8.0-8.2，氨氮<0.1mg/L，溶解氧≥5.8mg/L，水流控制在5000-7000L/H，光照周期为12L:12D，时间为6:00-18:00；每日分别在9:00和15:00投喂2次颗粒饲料。
5.根据权利要求1所述的ARTP诱变黑公子小丑鱼体色变红的方法，其特征在于，步骤S3中，所述体色变红的小丑鱼为体色红白相间的小丑鱼。
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