CN112280685B

CN112280685B - 一种可提高微藻缩醛磷脂含量的方法及rna干扰片段

Info

Publication number: CN112280685B
Application number: CN202011172720.8A
Authority: CN
Inventors: 胡晗华; 潘玉芳
Original assignee: Institute of Hydrobiology of CAS
Current assignee: Institute of Hydrobiology of CAS
Priority date: 2020-10-28
Filing date: 2020-10-28
Publication date: 2022-05-13
Anticipated expiration: 2040-10-28
Also published as: CN112280685A

Abstract

本发明涉及一种提高微藻中的缩醛磷脂含量的方法，包括使所述微藻中的磷脂:甘油二酯脂酰基转移酶下调表达的步骤；还涉及可提高微拟球藻中的缩醛磷脂含量的RNA干扰片段，包括一对反向重复区，所述反向重复区的序列与nPDAT基因的mRNA序列同源；还涉及上述RNA干扰片段的表达载体。本发明通过对微拟球藻进行遗传改造，下调了微拟球藻中nPDAT基因的表达，使微拟球藻中的缩醛磷脂含量从约50nmol/g干重大幅提高到约150nmol/g，并在培养过程中，优化了培养条件，进一步将缩醛磷脂含量提高约360nmol/g，为实现使用微藻商业化生产缩醛磷脂提供一种可能的途径。

Description

一种可提高微藻缩醛磷脂含量的方法及RNA干扰片段

技术领域

本发明涉及生物合成领域，更特别地，涉及一种提高微藻中缩醛磷脂含量的方法、RNA干扰片段及表达载体。

背景技术

缩醛磷脂具有两条脂肪酸链，与普通的磷脂不同之处在于，其sn-1位存在特殊的烯醚键结构。现有研究表明，缩醛磷脂在代谢过程中表现出了多种生理功能，包括质膜流动调节功能、抗氧化功能、多不饱和脂肪酸储存功能和信息传导功能等。有研究发现，缩醛磷脂的水平降低可能导致例如老年痴呆多种疾病。还有研究发现，有研究发现缩醛磷脂对肿瘤细胞具有选择毒性。由此可见，缩醛磷脂可用于一些疾病的预防和治疗，还可以用作保健品提高人体机能。

缩醛磷脂主要存在于哺乳动物和鸟类中，在海参、扇贝等低等海洋生物中也有发现。从动物组织中提取缩醛磷脂操作繁琐，成本高。然而，目前的研究显示，细菌、微藻等单细胞生物中的缩醛磷脂含量极低，无法用于商业生产。

因此，需要一种提高例如微藻等单细胞生物中的缩醛磷脂含量的方法。

发明内容

为解决以上问题，本发明提供了一种提高微藻中的缩醛磷脂含量的方法，包括使所述微藻中的磷脂:甘油二酯脂酰基转移酶下调表达的步骤。

在一个具体实施方案中，通过敲降的方法下调所述磷脂:甘油二酯脂酰基转移酶的表达。

在一个具体实施方案中，所述微藻为微拟球藻。

在一个优选实施方案中，所述方法还包括在所述微拟球藻培养过程中向培养物中通入C0₂的步骤。

本发明通过对微拟球藻进行遗传改造，下调了微拟球藻中nPDAT基因的表达，大幅提高微藻尤其是微拟球藻中的缩醛磷脂含量，并在培养过程中，优化了培养条件，为实现使用微藻商业化生产缩醛磷脂提供一种可能的途径。

本发明还提供了一种可提高微拟球藻中的缩醛磷脂含量的RNA干扰片段，包括一对反向互补区，所述反向互补区的序列与nPDAT基因的mRNA序列同源。

在一个优选实施方案中，所述反向互补区的序列分别为SEQ ID NO:5所示序列及其反向互补序列。

在一个具体实施方案中，所述RNA干扰片段为shRNA。

在一个优选实施方案中，所述RNA干扰片段的序列如SEQ ID NO:5所示。

本发明还提供了一种可提高微拟球藻中的缩醛磷脂含量的表达载体，其特征在于，包括权利要求4-7中任一项所述的RNA干扰片段的表达框。

在一个具体实施方案中，所述表达框包括编码所述RNA干扰片段的基因，以及驱动所述基因表达的启动子。

在一个优选实施方案中，所述启动子的序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明设计的RNA干扰片段通过表达载体导入到微拟球藻细胞中后，可大幅下调微拟球藻中nPDAT基因的表达，由此产生的转化子在生长上不受影响，但是缩醛磷脂含量大幅提高。

附图说明

图1微拟球藻野生型(WT)和突变株(PDAT-KD2和PDAT-KD4)中nPDAT基因的mRNA水平统计图；

图2为微拟球藻野生型(WT)和突变株(PDAT-KD2和PDAT-KD4)的生长曲线；

图3为微拟球藻野生型(WT)和突变株(PDAT-KD4)培养不同时间后缩醛磷脂含量的统计图；

图4为微拟球藻突变株(PDAT-KD4)在不同培养条件下培养5天后缩醛磷脂含量的统计图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

我们以模式生物海洋微拟球藻Nannochloropsis oceanica MBIC10090为基础进行研究，显示野生型海洋微拟球藻中的缩醛磷脂含量极低(低于50nmol/g干重)。在研究过程中，出人意料的是，当下调nPDAT基因(nPDAT基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，cDNA序列如SEQ ID NO:2所示)表达时，海洋微拟球藻中的缩醛磷脂含量大幅提高。为此，我们进一步做了以下研究。

1、nPDAT基因敲降突变株的构建

用RNA干扰的方法对微拟球藻nPDAT基因进行敲降。以β-tubulin为启动子(序列如SEQ ID NO:3所示)，驱动抗性基因(sh ble)和nPDAT基因长短片段表达。转录后nPDAT基因长短片段形成dsRNA，在细胞内被切割成21～25nt大小的siRNA，这些siRNA将作用于nPDAT的mRNA，引导RNA酶切割nPDAT的mRNA，从而下调细胞中nPDAT的表达。方法如下：

(1)以海洋微拟球藻cDNA为模板分别扩增nPDAT基因440bp和226bp片段。

(2)以海洋微拟球藻基因组DNA为模板，扩增β-tubulin(TUB)启动子片段，过柱回收备用。

(3)连接TUB启动子片段和载体骨架片段，转化，挑取单菌落，菌落PCR鉴定后送测序，提取质粒得到pKS-TUBp。

(4)在TUB启动子后连接两个nPDAT基因片段(440bp和226bp)，测序正确后得到干扰质粒。两个片段连接后可表达得到shRNA，序列如SEQ ID NO:4所示，包括一对反向重复序列(SEQ ID NO:5及其反向重复序列)。

(5)将上述干扰质粒通过电转化的方法转入到微拟球藻中，得到nPDAT基因敲降突变株转化子。

选用两个突变株(PDAT-KD2和PDAT-KD4)进行nPDAT基因mRNA水平检测，结果如图1所示，PDAT-KD4的nPDAT基因mRNA水平从第二天开始就显著低于野生型(WT)，PDAT-KD2的nPDAT基因mRNA水平在第2天和第5天与野生型差异不显著，但是到第8天，PDAT-KD2的nPDAT基因mRNA水平仅为野生型的约1/10。可见，两个敲降突变株均构建成功。

将两个突变株进行培养。将藻种接种于含有120mL人工海水的三角瓶中，于22℃恒温光照培养，光强约为120μmol photons m^-2s^-1，通空气培养。每两天取样测OD₇₃₀，绘制生长曲线。结果如图2所示，两个突变株的生长曲线与野生型相差不大，由此可见，突变株的生长不受影响。

2、nPDAT基因敲降突变株的缩醛磷脂含量

由于PDAT-KD4的敲降效果更好，后续实验选用该突变株进行。将培养3天、5天和7天的微藻培养物分别收集藻细胞，提取总脂，用于质谱检测。

实验所用仪器为岛津LC-20AD串联A B sciex Qtrap 4000质谱仪。极性脂测定采用shotgun-MS方法，该方法在电喷雾电离(electrospray ionization，ESI)技术的基础上改进，无需连接色谱仪，直接使用纳流泵连续进样。参数为：ESI电离源，进样流速20μl/min，反吹气27psi，离子源电压5400V，加热温度(TEM)350℃，辅助气49psi，扫描所有谱图均在正离子模式下采集，扫描范围：400～1000m/z。根据脂质种类采用相应的离子形式、去簇电压(Declustering Potential，DP)、碰撞电压(Collision Energy，CE)和标样。

结果如图3所示，藻株PDAT-KD2的缩醛磷脂(PME)含量远高于野生型。并且，该结果还显示，藻株PDAT-KD2培养7天后的藻细胞中缩醛磷脂含量显著低于培养3天和5天的缩醛磷脂含量(约150nmol/g干重)，培养培养3天和5天的缩醛磷脂含量之间没有显著性差异。鉴于生物量更高，我们选择5天作为培养时间进行进一步的培养条件优化。

3、培养条件优化

设置三个培养条件，条件2(Air组)与上文相同，条件1(Static组)的其他参数均与上文相同，但是不通入空气。条件3(CO₂组)的其他条件均与上文相同，但是把通入纯空气换成掺有2％CO₂的空气。

结果如图4所示，出人意料地，CO₂组藻细胞中的缩醛磷脂含量(约370nmol/g干重)远高于Air组。由此可见，使用通入C0₂的方法可大大提高突变株中的缩醛磷脂含量。

我们除了在人工海水中培养发现上述现象，在其他可用于培养微拟球藻的培养基(例如，天然海水培养基，商业海盐培养基等)中进行培养也发现类似的现象。

以上实验证明，对微拟球藻敲降nPDAT基因可大大提高藻细胞中的缩醛磷脂含量，在敲降突变株的培养过程中通入CO₂可大大提高突变株藻细胞中的缩醛磷脂含量。需要说明的是，以上实验中仅描述了通过RNAi的方法敲降nPDAT基因，但是该描述是举例说明的目的，本领域技术人员可通过任何方式敲降甚至敲除该基因，以下调或消除该基因的表达，从而获得具有更高缩醛磷脂含量的突变株。另外，上文中虽然列举具体的nPDAT基因序列，但是本发明不该被限制在该范围内，微拟球藻nPDAT基因及其同功能的突变体均应包含在本发明的保护范围内。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国科学院水生生物研究所

<120> 一种可提高微藻缩醛磷脂含量的方法及RNA干扰片段

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 943

<212> PRT

<213> Nannochloropsis oceanica MBIC10090

<400> 1

Met Ser Pro Gln Gly Glu Asp Gly Gly Pro Ala Asp Ser Thr Thr Thr

1 5 10 15

Arg Thr Thr Thr Ser Glu Ala Met Ala Met Pro Ala Gly Ala Ala Gly

20 25 30

Thr Ala Ala Thr Ser Ala Ser Asp Ser Pro Ser Ser His Gln Asp Glu

35 40 45

Gly Gly Gly Pro Thr Gln Thr Val His Arg Gly Pro His Pro Asp Ile

50 55 60

His Asp Gln Gly Asp Lys Thr Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Lys Asp

65 70 75 80

Arg Lys Leu Gln Asn Glu Ser Glu Asp Gln Gln Gln Gln Asp Thr Asp

85 90 95

Ser His Ala Ser Ser Arg Pro Thr Thr Pro Ile Asn Met Thr Pro Pro

100 105 110

Arg Ser Ser His Ala Arg Ser Pro Phe Gly Ala Gly Ser Pro Tyr Glu

115 120 125

His Thr Leu Thr Pro Ser Asn Ile Asp Ile Thr Val Leu Glu Gly Leu

130 135 140

Ala Ser Gly Val Gly Ser Asn Asn Gly Gly Pro Ser Arg Asp Asn Thr

145 150 155 160

Pro Ser Arg Ser Pro Ser Arg Arg Ser Arg His Ala Arg Arg Ala Lys

165 170 175

Ile Ala Ala Thr Thr Lys Lys Arg Lys Ile Leu Gly Ser Phe Ile Leu

180 185 190

Gly Ala Ile Phe Gly Met Ser Ile Leu Gly Trp Val Leu Arg His Lys

195 200 205

Tyr Pro Gln Tyr Val Pro Ser Leu Ser Pro Asn Leu Asn Leu Asn Ile

210 215 220

Ser Ala Val Leu Pro Ala Gly Phe Gly Leu Gly Leu Ser Ala Gly Glu

225 230 235 240

Leu Asn Ser Thr Ile Leu Thr Asp Ile Tyr Gly Tyr Met Ser Trp Ala

245 250 255

Ser Thr Pro Glu Thr Tyr Pro Gly Leu Gln Ala Ala Glu Lys Asn Tyr

260 265 270

Ser Ala Lys Tyr Ser Ile Val Leu Ile Pro Gly Phe Val Thr Thr Gly

275 280 285

Leu Glu Val Trp Gln Gly Glu Glu Cys Ala Ser Ser Leu Phe Arg Ser

290 295 300

Arg Leu Trp Gly Ala Val Ser Met Leu Gln Thr Met Leu Met Lys Pro

305 310 315 320

Glu Cys Trp Thr Lys His Met Ala Leu Asp Met Glu Thr Gly Leu Asp

325 330 335

Pro Pro Asn Ile Arg Ile Arg Ala Ala Gln Gly Leu Glu Ala Ala Asp

340 345 350

Phe Phe Met Pro Gly Phe Trp Val Trp Ala Arg Leu Ile Arg Asp Phe

355 360 365

Ala Ala Ile Gly Tyr Asp His Ser Asn Leu Ala Leu Gln Ser Tyr Asp

370 375 380

Trp Arg Leu Ser Leu His Asp Leu Glu Arg Arg Asp His Tyr Phe Thr

385 390 395 400

Gln Leu Met Trp Lys Ile Glu Gly Leu Val Lys Ile Asn Lys Glu Lys

405 410 415

Val Val Leu Val Ala His Ser Tyr Gly Ser Asn Val Ile Val Tyr Phe

420 425 430

Phe Ala Trp Val Glu Ser Pro Lys Gly Gly Asn Arg Gly Lys Lys Trp

435 440 445

Cys Glu Thr His Ile Lys Thr Phe Val Asn Ile Ala Gly Pro Leu Leu

450 455 460

Gly Val Val Lys Ser Ala Ser Ala Tyr Val Ser Gly Glu Met His Asp

465 470 475 480

Thr Ala Glu Leu Gly Pro Leu Glu Gly Ile Leu Phe Gly Lys Ser Asn

485 490 495

Asn Ala Phe His Arg Thr Asn Arg Arg Arg Leu Phe Arg Ser Trp Gly

500 505 510

Ser Leu Thr Ala Met Leu Pro Lys Gly Gly Asn Gln Leu Trp Gly Asn

515 520 525

Leu Thr His Ala Pro Glu Asp Leu Glu Trp Asp Val Val Val Ser Gly

530 535 540

Val Gly Gly Met Glu Gly Gly Met Glu Glu Thr Cys Leu Pro His Leu

545 550 555 560

Glu Lys Glu Thr Gly Thr Phe Ser Ser Glu Glu Met Glu Gly Lys Lys

565 570 575

Arg Glu Gly Thr Arg Asp Gly Glu Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr

580 585 590

Glu Ala Ala Thr Gly Ala Asp Gly Ile Thr Arg Glu Glu Gly Ala Arg

595 600 605

Gly Glu Gly Gly Glu Glu Ala Cys Ile Thr His Gly Glu Ala Arg Arg

610 615 620

His Pro Leu His His Gly Gln Ile Leu Glu Phe Thr Pro Leu Thr Pro

625 630 635 640

Leu Val Ala Asp Ala Asp Ala Ala His Ala Ala Ala Ala Pro Pro Asp

645 650 655

Arg Pro Pro Pro Arg Leu Ser Asp Thr Thr Ser Arg Pro Ser Lys Ser

660 665 670

Thr Asn Arg Ser Val Glu Gly Asp His Gln Thr Ala Lys Ser Ala Glu

675 680 685

Glu Ala Ala Ala Ala Thr Gln Pro Ala Ala Gln Val Glu Lys Asp Asp

690 695 700

Ala Ala Ser Ala Gly Ile Thr Ala Ser Leu Pro Pro Ser Asn Arg Thr

705 710 715 720

Cys Lys Glu Gly Lys Gly Gly Gly Pro Gly Gln Ala Arg Val Asn Trp

725 730 735

Thr Met Asp Asp Val Ile Arg Tyr Leu Ser Thr Asp Pro Glu Asp Pro

740 745 750

Tyr Leu Arg Arg Arg Met Thr Glu Asp Tyr Tyr Phe Gly Pro Pro Val

755 760 765

Arg Asp Phe Arg Arg Glu Lys His Val Lys Asp Asp Arg Lys Tyr Trp

770 775 780

Thr Asn Pro Leu Thr Val Gln Leu Pro Met Ala Pro Ser Met Gln Ile

785 790 795 800

Val Cys Phe Tyr Gly Val Gly Lys Ala Thr Glu Arg Ala Tyr Ile Tyr

805 810 815

Lys Gly Asp Thr Glu Gly Arg Pro Asp Val Met Asp Ile Ser Val Ser

820 825 830

Asp Ala Leu Arg Asn Ile Ser Gly Gly Val Val Lys Ala Glu Gly Asp

835 840 845

Gly Thr Val Thr Leu Met Ser Leu Gly Phe His Cys Ala Arg Leu Trp

850 855 860

Arg Glu Arg Val His Asn Pro Ala Gly Ile Gly Val Thr Thr Lys Glu

865 870 875 880

Leu Trp His Thr Thr Gly Gly Leu Leu Ser Met Arg Gly Asp Gly Gly

885 890 895

Ser Ala Asp His Val Asp Ile Met Gly Asn Thr Lys Met Ala Ala Asp

900 905 910

Leu Leu Lys Ile Val Ser Gly Gln Asp Glu Glu Glu Val Tyr Gly Gln

915 920 925

Asp Val Tyr Phe Ser Arg Ile Arg Glu Ile Ser Asp Lys Val Ser

930 935 940

<210> 2

<211> 2835

<212> DNA

<213> Nannochloropsis oceanica MBIC10090

<400> 2

atgagcccgc aaggagagga cggcggcccc gccgactcga cgacgacgag gacgacgacg 60

tctgaggcga tggccatgcc ggcaggagca gcagggacag cagccacatc tgcatcagac 120

agtcctagca gtcaccaaga tgaagggggt ggtcctaccc aaacggtcca ccgcgggcca 180

cacccggaca ttcacgacca gggggacaag acgaaaaaga agaaaaagaa gaggaaggat 240

agaaaactcc agaatgagag cgaggaccag cagcaacaag acaccgacag ccacgcatca 300

agtcgcccca ccactccgat caacatgacc cctccccgct catcccacgc ccgcagccct 360

ttcggcgctg gctctccata tgaacatacc ctcacacctt ccaacatcga cattaccgtc 420

ctggaaggac ttgccagcgg cgtgggcagc aataatggcg ggccttcccg tgacaacacc 480

cccagccgca gcccctcccg ccgctcacgt cacgctcgtc gggccaaaat cgccgctact 540

accaagaaac gtaaaatatt gggtagtttc atccttggtg ctatcttcgg aatgagcatt 600

ttggggtggg tacttcgtca caagtaccca cagtacgtcc cctccctctc ccccaacctg 660

aacctcaaca tctccgctgt cctccccgcg gggtttggcc tcggcctaag tgcgggggag 720

ttaaacagca ctatcctcac cgatatatat ggatacatgt cctgggcttc tactccggag 780

acgtacccgg gcctacaagc ggcagaaaag aattatagtg ccaagtattc aattgtctta 840

atcccggggt ttgtgacgac gggcttggag gtctggcagg gggaggagtg cgcgagcagc 900

ttgtttcgga gtcgcttgtg gggggcagtg agcatgttgc agaccatgct aatgaagccc 960

gagtgttgga cgaagcacat ggcgctcgac atggagacag ggctggaccc gcccaacata 1020

cggataagag cggcacaagg actggaggcc gcggacttct tcatgccagg gttttgggtt 1080

tgggcgcgtc ttattcgaga tttcgctgcg atcgggtacg atcattccaa tctcgccctt 1140

cagtcttacg actggcggct ctccctccac gacctcgagc gacgcgacca ctatttcacc 1200

cagctcatgt ggaagatcga gggcttggtg aagatcaata aggagaaggt ggtgctcgtt 1260

gcgcatagct acggctctaa cgtcatcgtc tatttctttg cctgggtcga atcccccaag 1320

ggcgggaacc ggggaaagaa gtggtgtgaa acgcacatta agacgtttgt caacattgcc 1380

gggccgttac tcggagtggt gaagagtgcc tcagcgtatg tgagtgggga gatgcatgat 1440

acagccgagc taggacctct ggaaggcatt ttgttcggca agagcaacaa cgcgttccat 1500

cggaccaacc gtcggcgttt gtttcgaagc tgggggagcc tgactgccat gctacccaag 1560

ggaggcaacc aattatgggg taatttgaca cacgctccgg aggatttgga atgggacgtg 1620

gtggtttcag gggtgggagg gatggaagga gggatggagg agacgtgttt gccgcatttg 1680

gagaaggaga cgggaacctt cagctcggag gagatggagg ggaagaagag ggaggggact 1740

cgggacgggg aacctgcagc agcagcagca gcaacagagg ctgcaacagg ggcagatggg 1800

atcacaagag aagaaggagc cagaggggaa ggaggagaag aggcctgtat cacgcatggt 1860

gaagcgcgtc ggcatcctct gcaccatgga cagatattgg agttcacccc gctcaccccc 1920

cttgtcgctg atgctgatgc tgcccatgct gctgctgctc ctcctgacag gccccctccg 1980

cggctttctg atactacgtc acgtccttcc aaaagcacga atcggagcgt ggaaggagac 2040

caccagacgg ctaaaagcgc cgaggaggca gcagccgcaa cccagccagc agctcaggtg 2100

gaaaaggacg atgcggcctc tgcgggtatc actgcctctc tgcctccttc gaacagaaca 2160

tgtaaggagg ggaagggggg cgggccgggc caggcaaggg tgaattggac gatggatgac 2220

gttattcgtt acttgagcac cgacccagag gacccttatt tgaggcgaag aatgacagag 2280

gattattact tcggcccgcc ggtgagggac tttcggaggg agaagcacgt gaaggatgat 2340

aggaagtact ggacgaaccc cttgactgtg caattaccca tggcaccctc catgcagatt 2400

gtgtgtttct atggtgtggg caaggcgacg gaacgggcgt atatttacaa gggagatacg 2460

gagggacggc cagacgtgat ggacataagc gtgagtgacg ctttgagaaa tatctcgggg 2520

ggggtcgtca aggcagaagg cgacgggacc gttacgctga tgtccctagg gtttcattgc 2580

gcacggctgt ggagggagag ggtgcacaat cccgctggca ttggcgtgac cacgaaagag 2640

ctgtggcata ccacgggtgg tttgctgtcg atgcgcgggg atggagggag tgcagatcat 2700

gttgatatca tggggaatac caagatggct gcggatttgt tgaaaattgt gagtgggcag 2760

gatgaggagg aggtgtatgg gcaagatgtg tatttttcga ggattcggga gatcagcgat 2820

aaagtgtctt tgtag 2835

<210> 3

<211> 564

<212> DNA

<213> Nannochloropsis oceanica MBIC10090

<400> 3

atcatatcgt gccacagcag attgggcccg cgtatcggca gatcgagcat ctatacagca 60

gccgcatcca gaaagccaac ttttggcttc tttgcttttg ccgcttttca gcccttgccc 120

tgcaggctgt gaggatcatg gcgcatggct ggtactcctt ttatacgcct tgacacacaa 180

agcacctagt atgttgtgcg ggaccggcgt atgcgtgggc agagaggcgc ggtcatggcg 240

tttgtgtgag cgagccgcgc cctccagctt tgtgaatttt tcgtgaaggc gaaaacgtgc 300

ctatcacact atcccacacg cttacaaaca agccacatag caacaacgcg agtacactta 360

tgtttcctac gttcgtgccc gcacgaaggg gcgtctgtga aggcgcaggg ctactctggg 420

ccctccaaat gatgtgcacg cttcccgtct cactttacac acttcctctt cactccttcc 480

gttcacatca acacacgcac aacttaagca cacatcagtc agcacccctt caacacactc 540

ctccctccaa ctagtctcaa ccat 564

<210> 4

<211> 668

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cugccuccuu cgaacagaac auguaaggag gggaaggggg gcgggccggg ccaggcaagg 60

gugaauugga cgauggauga cguuauucgu uacuugagca ccgacccaga ggacccuuau 120

uugaggcgaa gaaugacaga ggauuauuac uucggcccgc cggugaggga cuuucggagg 180

gagaagcacg ugaaggauga uaggaaguac uggacgaacc ccuugacugu gcaauuaccc 240

auggcacccu ccaugcagau uguguguuuc uauggugugg gcaaggcgac ggaacgggcg 300

uauauuuaca agggagauac ggagggacgg ccagacguga uggacauaag cgugagugac 360

gcuuugagaa auaucucggg gggggucguc aaggcagaag gcgacgggac cguuacgcug 420

augucccuag gguuucauug cgucaagggg uucguccagu acuuccuauc auccuucacg 480

ugcuucuccc uccgaaaguc ccucaccggc gggccgaagu aauaauccuc ugucauucuu 540

cgccucaaau aaggguccuc ugggucggug cucaaguaac gaauaacguc auccaucguc 600

caauucaccc uugccuggcc cggcccgccc cccuuccccu ccuuacaugu ucuguucgaa 660

ggaggcag 668

<210> 5

<211> 227

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cugccuccuu cgaacagaac auguaaggag gggaaggggg gcgggccggg ccaggcaagg 60

gugaauugga cgauggauga cguuauucgu uacuugagca ccgacccaga ggacccuuau 120

uugaggcgaa gaaugacaga ggauuauuac uucggcccgc cggugaggga cuuucggagg 180

gagaagcacg ugaaggauga uaggaaguac uggacgaacc ccuugac 227

Claims

1.一种提高微藻中的缩醛磷脂含量的方法，其特征在于，包括使所述微藻中的磷脂:甘油二酯脂酰基转移酶下调表达的步骤,所述微藻为海洋微拟球藻。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过敲降的方法下调所述磷脂:甘油二酯脂酰基转移酶的表达。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括在所述微拟球藻培养过程中向培养物中通入C0₂的步骤。

4.一种RNA干扰片段在提高海洋微拟球藻的缩醛磷脂含量中的应用，其特征在于，所述RNA干扰片段包括一对反向重复区，所述反向重复区的序列与nPDAT基因的mRNA序列同源。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述反向重复区的序列分别为SEQ ID NO:5所示序列和SEQ ID NO:5所示序列的反向互补序列。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述RNA干扰片段为shRNA，序列如SEQ IDNO:4所示。