CN111349616A - 一种筛选目标病毒相关宿主因子的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种筛选目标病毒相关宿主因子的方法及应用，属于基因文库构建与应用领域，利用载体系统和CRISPR文库创建特异性、覆盖全基因组或部分功能基因的可控型突变细胞库，对突变细胞库进行目标病毒的攻毒实验，收集存活细胞，获得抗病毒突变细胞库；对其进行深度测序，确定该目标病毒相关宿主因子。本发明的筛选方法简单高效、能在全基因组范围筛选目标病毒相关宿主因子，准确度高、可控性强，成本低，可实现规模化筛选。

Description

一种筛选目标病毒相关宿主因子的方法及应用
技术领域
本发明涉及CRISPR/Gas9技术领域，具体涉及利用CRISPR文库，制备突变细胞库等技术手段，规模化筛选禽流感病毒必需宿主因子或限制性宿主因子的方法。
背景技术
禽流感是由禽流感病毒引起的一种疾病，家禽感染后，可表现为呼吸道疾病和产蛋量下降，严重时导致全身性疾病，死亡率可达100％。禽流感的流行和爆发会造成家禽养殖业严重的经济损失。同时，禽流感病毒还可以感染人类和其他哺乳动物，对人类的生命安全和公共卫生造成巨大威胁。流感病毒存在多种亚型，并且会随时间和空间推移发生抗原漂移和变异，不断进化出新的亚型，所以传统的禽流感疫苗或抗病毒药物不能预防和治愈所有亚型的流感病毒感染。这就需要寻找宿主本身与流感病毒感染相关的因子，研究广谱的抗病毒方法。
宿主因子即宿主细胞中与病毒感染和复制过程相关的因子，通常可以分为两类：一类是限制性宿主因子，即抑制病毒感染和复制的宿主因子，如：干扰素及干扰素刺激因子等；另一类是支持病毒复制，病毒感染必需的宿主因子，如：细胞表面病毒受体等。目前已知与禽流感病毒感染相关的宿主因子：必需的宿主因子：唾液酸受体；蛋白合成相关如核糖体蛋白等；输入蛋白及输出蛋白等。限制性宿主因子：B4GALNT2，其为一种糖基转移酶，抑制禽流感病毒与细胞表面唾液酸受体结合；免疫相关因子如干扰素等。
之前的研究中，科学家通常针对个别宿主因子进行研究。RNAi技术成熟后，科学家通过设计针对全基因组的shRNAs下调功能基因表达，筛选流感病毒必需的宿主因子。但RNAi筛选存在成本高，技术难度大以及部分细胞类型不可用等缺点，制约了规模化筛选病毒相关宿主因子的工作。
新兴的CRISPR/Cas9技术将基因组编辑技术带上了一个新的台阶，也丰富了全基因组规模化筛选的工具。国内外研究者们已经开始尝试将此法运用到病毒相关宿主因子筛选的领域中。然而，目前利用CRISPR/Cas9技术规模化筛选病毒相关宿主因子的工作只能得到较少数的候选基因，并且不同筛选之间的重复性较低，可能原因是CRISPR文库、病毒毒株以及分析实验时间点的选取不同。
因此，目前亟需一种基因编辑效率更高、更为精确的CRISPR文库系统，并且能在全基因组范围内规模化筛选得到尽可能全面的流感病毒相关宿主因子的技术方案。
发明内容
本发明的目的是提供了一种筛选目标病毒相关宿主因子的方法，该方法可规模化地获得突变细胞库，并在全基因组范围内实现目标病毒相关宿主因子的筛选。
本发明提供的一种筛选目标病毒相关宿主因子的方法，包括以下步骤：
(1)利用载体系统和CRISPR文库创建覆盖靶向模式动物全基因组或部分功能基因的突变细胞库；
(2)对突变细胞库进行目标病毒的攻毒实验，收集存活细胞，获得抗病毒突变细胞库；
(3)对抗病毒突变细胞库进行深度测序，确定该目标病毒相关宿主因子。
步骤(1)中所述突变细胞库通过以下方法创建得到：
1)筛选优化的sgRNA序列，构建CRISPR文库；
2)将CRISPR文库中的sgRNA序列导入载体，构建载体-CRISPR文库，建立核酸酶蛋白表达系统；
3)将载体-CRISPR文库和核酸酶蛋白表达系统转染入细胞，筛选后剔除转基因阴性的细胞，得到突变细胞库。
优选地，步骤1)所述优化的sgRNA长度20nt，每个基因设计5-6条sgRNA。
步骤1)优化的sgRNA序列通过以下方法筛选得到：设计针对每个基因的sgRNA，在转录sgRNA的载体中，将PAM序列添加至sgRNA序列之后、茎环结构的转录终止序列之前；或
在转录sgRNA的载体中，将与U6之后sgRNA相同的sgRNA序列以及PAM序列添加至茎环结构的转录终止序列之后。
所述PAM序列为NGG或GGG。在本发明的一个实施例中，所述茎环结构的转录终止序列为GGGUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAACCUAAGGCUAGUCCG(SEQ ID NO.1)。
步骤1)所述CRISPR文库包括不同表型相关的功能基因亚文库，所述亚文库是通过将基因按照不同的表型特征系统分类而构建；
在本发明的一个实施例中，制备了优化的CRISPR文库，步骤如下：将构建好的CRISPR文库混合转染入细胞，收取细胞提取细胞中的基因组，对sgRNA以及PAM序列区域进行PCR和高通量测序，检测丢失的sgRNAs，其中所述丢失的sgRNAs为优化的sgRNAs，再将所述优化的sgRNAs重新进行合成，制备得到优化的CRISPR文库。
步骤2)所述载体为转座子载体，慢病毒载体或外源基因递呈载体；所述核酸酶蛋白为Cas9或Cpf1；所述核酸酶蛋白表达系统为条件性或药物敏感型核酸酶蛋白表达系统。
所述条件性或药物敏感型核酸酶蛋白表达系统为向培养基中添加强力霉素或三甲氧苄氨嘧啶，调节核酸酶蛋白的表达，以此根据所需，精确控制基因编辑的时间。
本发明提供的一种筛选病毒相关宿主因子的方法中，在转染细胞制备突变细胞库时，通过控制sgRNA整合到基因组上的数量，生产不同拷贝sgRNA的整合的突变细胞库；制备突变细胞库的基因编辑方法为基因敲除或基因敲入；所述细胞的原始来源为具备正常发育能力且对目标病毒易感的细胞。
本发明提供的一种筛选病毒相关宿主因子的方法中，步骤(2)对突变细胞库进行目标病毒的攻毒实验是根据细胞类型、目标病毒毒株及致病性调整初始细胞量、攻毒浓度和攻毒时间，收集存活细胞，获得抗病毒突变细胞库。
本发明提供的一种筛选病毒相关宿主因子的方法中，(3)对抗病毒突变细胞库进行深度测序，获得一系列候选的禽流感病毒相关宿主因子；对所述禽流感病毒相关宿主因子中得分较高且排名在前的宿主因子构建突变细胞系进行单独验证实验，确定该目标病毒相关宿主因子。
本发明进一步提供了上述方法筛选得到的目标病毒相关宿主因子在制备目标病毒防控药物或疫苗中的应用。
本发明进一步提供了上述方法筛选得到的目标病毒相关宿主因子在抗病动物遗传育种中的应用。
在本发明的实施例中，筛选得到的目标病毒相关宿主因子为：SEPT11，LGR5，SLC23A1，GOLPH3L，KCNH2，RBFOX3，TET3，FUT4，PPP6C，PREB，NCLN，RPS14。本发明提供了这些宿主因子在在制备目标病毒防控药物或疫苗中的应用。
在本发明的一个实施例中，所述的目标病毒为禽流感病毒。
本发明还提供了一种可调控型突变细胞库，其通过以下方法制备得到：1)筛选优化的sgRNA序列，构建CRISPR文库；2)将CRISPR文库中的sgRNA序列导入载体，构建载体-CRISPR文库，建立核酸酶蛋白表达系统；3)将核酸酶蛋白表达系统转染入细胞，筛选后剔除转基因阴性的细胞，得到突变细胞库。
进一步地，上述可调控型突变细胞库，其制备方法的步骤1)优化的sgRNA长度20nt，每个基因设计5-6条sgRNA。
步骤1)优化的sgRNA序列通过以下方法筛选得到：设计针对每个基因的sgRNA，在转录sgRNA的载体中，将PAM序列添加至sgRNA序列之后、茎环结构的转录终止序列之前；或
在转录sgRNA的载体中，将与U6之后sgRNA相同的sgRNA序列以及PAM序列添加至茎环结构的转录终止序列之后。
步骤1)所述CRISPR文库包括不同表型相关的功能基因亚文库，所述亚文库是通过将基因按照不同的表型特征系统分类而构建；
步骤2)所述载体为转座子载体，慢病毒载体或外源基因递呈载体；所述核酸酶蛋白为Cas9或Cpf1；所述核酸酶蛋白表达系统为条件性或药物敏感型核酸酶蛋白表达系统。所述条件性或药物敏感型核酸酶蛋白表达系统为向培养基中添加强力霉素或三甲氧苄氨嘧啶，调节核酸酶蛋白的表达，以此根据所需，精确控制基因编辑的时间。
本发明的有益效果在于：本发明提供的筛选方法简单高效、不同筛选间重复性可以达到60％以上，能在全基因组范围筛选目标病毒相关宿主因子，准确度高、可控性强，成本低，可实现规模化筛选，具有良好的实用性。
附图说明
图1为利用CRISPR/Cas9文库规模化制备突变细胞库的流程图。如图中所示，整个流程大致分为3步。第一步，针对鸡所有基因的外显子(Exon)区域设计最优的sgRNA文库；第二步，利用化学合成的方法合成sgRNA文库中的序列并将这些序列导入到PB载体中，构建质粒文库；第三步，通过细胞转染的方法将PB-CRISPR文库导入到鸡源细胞中，药物筛选后剔除转基因阴性的细胞，得到阳性细胞库。
图2为sgRNA转录元件序列的优化设计图，其中针对不同的sgRNAs，分别在其后添加了PAM序列：
hU6promoter+NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(20bp sgRNA序列)+GGGUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAACCUAAGGCUAGUCCG(茎环结构的转录终止序列)。
图3为sgRNA转录元件序列的优化设计图，其中针对不同的sgRNAs，分别在其后又添加了额外相对应的sgRNA和PAM序列：
hU6promoter+NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(20bp sgRNA序列)+GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG(茎环结构的转录终止序列)+CCN(PAM序列)+NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(额外相对应的sgRNA)。其中N为核苷酸A、T、C、G的任一种。
图4为筛选禽流感病毒相关宿主因子的整体流程。
图5A-图5C分别为规模化筛选禽流感病毒相关宿主因子所采用的质粒信息图。鸡PB-CRISPR文库中包含3个主要质粒。
pCRISPR-sg6-library为sgRNA文库的表达质粒，启动子是hU6；
pCRISPR-S10为Cas9的表达质粒，此质粒表达受DOX调控，只有DOX存在的情况下，rtTA3G才能激活TRE3G启动子，进而启动Cas9的表达，另外，该质粒带有neo药筛标记；pCAG-PBase-4PB
图6为单独验证DF1单克隆细胞系的打靶情况(举例PPP6C、PREB)，均发生碱基插入或缺失。
图7为单独验证DF1单克隆细胞系攻毒实验结果：A.攻毒后细胞存活率统计；B.攻毒后细胞上清病毒滴度检测；C.细胞免疫相关基因表达检测(干扰素β)；结果表明：候选基因突变后，DF1细胞产生了不同程度的针对禽流感病毒的抗病能力，具体表现为细胞存活增多，病毒滴度下降，免疫相关基因表达上调。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。若未特别指明，实施例中生化材料均为市售。
在详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于特定的生物系统或细胞类型。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不是限制性的。如本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个”，“一”和“该”除非另有明确规定，包括复数指示物。因此，例如，提及“细胞”包括两个或多个细胞或细胞的整个培养物的组合；对于“多核苷酸”的提及实际上包括该多核苷酸的许多拷贝。除非在本说明书的提醒中另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
实施例1基于CRISPR技术规模化制备突变细胞库的技术流程
本发明中突变细胞库制备的技术流程主要包括以下四个方面(如图1所示)：
第一，利用计算机辅助手段完成针对模式动物全基因组功能基因的sgRNA序列设计。其主要实验手段和关键技术就是利用计算机辅助设计并结合最新的生物信息学技术得到靶向动物全基因组任何DNA最优化的sgRNA序列列表。
第二，利用化学合成手段建立模式动物特异性全基因组sgRNA序列文库。其主要实验手段和关键技术包括利用得到的sgRNA序列信息指导高通量的DNA化学合成以及DNA合成后质粒“装配”成可永久保存、扩增和使用的物理文库。针对模式动物的全基因组约两万多个基因，设计了约10万条sgRNAs。针对每个基因，设计相应的5条sgRNAs，从而保证文库的打靶效率。这些sgRNAs已经克隆到了高效转染载体系统上，构成针对模式动物全基因组水平筛选的PB-CRISPR文库。
第三，设计基于模式动物CRISPR文库的全基因组正筛选和负筛选系统。全基因组正筛选文库即激活文库，利用CRISPR/Cas9系统及sgRNA激活某些基因的表达，用于筛选限制性宿主因子；负筛选文库即敲除文库，利用CRISPR/Cas9系统及sgRNA敲除某些基因，用于筛选必需的宿主因子。其主要实验手段和关键技术是根据不同的生物学问题设计、应用不同的研究策略和分析方法，目标是筛选得到全基因组范围内控制、影响相关表型或生物学问题的所有可能的基因或信号通路，为进一步深入、定点的基因组研究奠定基础。
其主要实验手段和关键技术具体包括：首先，将选取的目标病毒易感细胞，例如禽流感病毒易感细胞鸡DF1细胞解冻、传代扩大培养至电转所需的细胞量；采用转染的方式将基因文库例如CRISPR文库转至细胞中，细胞基因组中将会有不同拷贝数的载体插入。转染如电转完成后进行阳性克隆筛选，如G418药筛，筛选出电转阳性细胞，再扩大培养。电转2周后，对细胞进行DOX诱导，表达Cas9或者Cpf1核酸酶蛋白以便与转录的sgRNAs共同作用，从而达到破坏某些基因的作用。
其中，CRISPR文库可以是优化筛选过的，对靶向模式动物全基因组(或部分基因序列)的sgRNA转录元件序列进行优化筛选的具体设计包括：
针对不同的sgRNAs，分别在其后添加PAM序列，其中优化前的转录元件序列如下
hU6promoter+NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN(20bp sgRNA序列)+
GGGUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAACCUAAGGCUAGUCCG(颈环结构的转录终止序列)
优化后的转录元件序列为分别在不同的sgRNAs后添加PAM序列(如图2所示)；或针对不同的sgRNAs，分别在其后添加额外相对应的sgRNA和PAM序列(如图3所示)。
经过优化后的序列，在20bp sgRNA后形成了NGG(GGG)的PAM序列，该转录元件在转录出对应的sgRNA后，便识别PAM序列，与自身互补序列处结合，产生自我切割的效果。优化文库构建完成以后可先将其混合转染任何一种细胞，如果sgRNAs效率高，配合Cas9蛋白的表达，就会达到自我切割的目的。一段时间后，收取细胞提基因组，对sgRNA以及PAM序列区域进行PCR及NGS，检测丢失的sgRNAs，即为效率高的sgRNAs。然后将效率高的sgRNAs重新进行芯片合成，最终得到的文库效率会有极大提升，可以为后续大规模突变细胞库的制备节约很大的成本和时间。
在文库构建和制备大规模突变细胞库时，基因文库也可以为亚文库，具体而言，将基因按照不同的疾病系统分类，制备不同的亚库继而再分别制备突变细胞库，如此，目的明确，能够为大规模突变细胞库的制备节约成本和时间。
实施例2禽流感病毒相关宿主因子的规模化筛选
本发明中禽流感病毒相关宿主因子规模化筛选的主要步骤如图4所示，具体步骤如下：
1、针对鸡全基因组的16821个基因提取到28915个外显子，共设计112227891条sgRNA。长度均为20nt。
2、使用3种质粒，分别为表达gRNA和PB转座子的pCRISPR-sg6质粒文库；表达Cas9蛋白和PB转座子，带有neo药筛标签的pCRISPR-S10；表达PB转座酶的pCAG_PBase_4PB，如图5A、图5B、图5C所示。
3、制备CRISPR/Cas9文库突变细胞，即将上述3种质粒共同电转到DF1细胞中，通过G418筛选约2周后得到稳定转染的细胞；另外，将pCRISPR-S10及pCAG_PBase_4PB共同转染到DF1细胞中，通过G418筛选约2周后得到稳定转染的细胞作为转染对照组。
具体操作为：实验组：将pCRISPR-sg6质粒文库与pCRISPR-S10和pCAG_PBase_4PB共同电转DF1细胞，细胞量约为4×107。转染对照组：将pCRISPR-S10和pCAG_PBase_4PB共同电转DF1细胞，细胞量约为1×107；空白对照组：野生型DF1细胞，细胞量约为1×107。电转反应：细胞量：2×106/反应。质粒用量：实验组：每个反应pCRISPR-S10 3μg，pCRRISR-sg6-chicken library 3μg，pCAG-PBase-4PB 2μg。转染对照组：每个反应pCRISPR-S10 3μg，pCAG-PBase-4PB 2μg。
pCRISPR-S10带有neo药筛标记及诱导表达型Cas9蛋白，经过2周G418药筛(浓度：500μg/mL，观察到空白对照组细胞出现明显死亡后G418浓度降为350μg/mL)及1周Dox(浓度：2μg/mL)诱导Cas9蛋白表达后再扩大培养至细胞量约为108，收集各组细胞，实验组细胞即为CRISPR/Cas9文库突变细胞。
4、针对CRISPR/Cas9文库突变细胞以及野生型对照组、转染对照组细胞进行禽流感病毒攻毒实验：毒株为高致病性H5N6禽流感亚型(来自华南农业大学焦培荣实验室)，攻毒浓度为104，共进行三次平行筛选实验待转染对照组及野生型对照组细胞几乎全部死亡后(约48小时)，收集存活的CRISPR/Cas9文库突变细胞，提取基因组，对sgRNA片段PCR扩增后(这里的PCR扩增针对所有存活细胞中的所有sgRNA)进行深度测序(深度测序结果保留Z-score>2的全部sgRNA，再根据sgRNA的reads数由大到小进行排名，排名靠前的sgRNA对应的基因即为候选宿主因子)，得到禽流感病毒相关的候选宿主因子。
5、针对深度测序中得到的reads数、Z-score及针对同一基因不同sgRNA的出现次数对候选宿主因子进行排名，选择排名较高的基因(详见表1)进行后续验证实验。
6、制备单独候选宿主因子突变的DF1单克隆细胞系：针对每个单独候选宿主因子设计两条sgRNA，克隆到pCRISPR-sg6质粒上之后与pCRISPR-S10和pCAG_PBase_4PB共同电转DF1细胞，pCRISPR-S10带有neo药筛标记及诱导表达型Cas9蛋白，经过2周G418药筛及1周Dox诱导Cas9蛋白表达后对细胞进行稀释铺板，约两周后形成单克隆进行挑取培养，并提取单克隆细胞系基因组对候选宿主基因片段进行测序，检测打靶情况。
图6举例展示了DF1单克隆细胞系的打靶情况，均发生了碱基的插入或缺失。表1是排名靠前的候选宿主因子，第2-4列是该基因的不同sgRNA在三次平行筛选中出现的次数，最后一列代表排名。表1中，PREB、NCLN、RPS14三个基因是已有报道的禽流感病毒感染相关宿主因子，这里作为验证实验的正对照。
表1验证实验候选宿主因子及排名情况
Figure BDA0001918629880000111
7、对单独候选宿主因子突变的DF1单克隆细胞系进行H5N6毒株的攻毒验证实验，对攻毒后存活细胞进行存活率统计，并检测细胞上清病毒滴度及免疫相关基因的表达。如图7所示候选宿主因子突变后，DF1细胞产生了不同程度的针对禽流感病毒的抗病能力。
8、验证实验确定有效的禽流感病毒感染必需宿主因子后，利用鸡胚中分离的雄性原始生殖细胞(PGCs)及CRISPR系统制备单独必需宿主因子敲除的鸡原始生殖细胞系，配合显微注射技术获得G0代性腺嵌合体公鸡，通过自然交配可生产出多种G1代小鸡，实现抗病模式鸡的规模化制备。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种筛选目标病毒相关宿主因子的方法及应用
<130> KHP181116915.3
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggguuagagc uagaaauagc aaguuaaccu aaggcuaguc cg 42

Claims (9)

1.一种筛选目标病毒相关宿主因子的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)利用载体系统和CRISPR文库创建覆盖靶向模式动物全基因组或部分功能基因的突变细胞库；
(2)对突变细胞库进行目标病毒的攻毒实验，收集存活细胞，获得抗病毒突变细胞库；
(3)对抗病毒突变细胞库进行深度测序，确定该目标病毒相关宿主因子。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述突变细胞库通过以下方法创建得到：
1)筛选优化的sgRNA序列，构建CRISPR文库；
2)将CRISPR文库中的sgRNA序列导入载体，构建载体-CRISPR文库，建立核酸酶蛋白表达系统；
3)将载体-CRISPR文库和核酸酶蛋白表达系统转染入细胞，筛选后剔除转基因阴性的细胞，得到突变细胞库。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)所述优化的sgRNA长度20nt，每个基因设计5-6条sgRNA；
优化的sgRNA序列通过以下方法筛选得到：设计针对每个基因的sgRNA，在转录sgRNA的载体中，将PAM序列添加至sgRNA序列之后、茎环结构的转录终止序列之前；或在转录sgRNA的载体中，将与U6之后sgRNA相同的sgRNA序列以及PAM序列添加至茎环结构的转录终止序列之后；
所述茎环结构的转录终止序列如SEQ ID NO.1所示，所述PAM序列为NGG或GGG。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)所述CRISPR文库包括不同表型相关的功能基因亚文库，所述亚文库是通过将基因按照不同的表型特征系统分类而构建。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)所述载体为转座子载体，慢病毒载体或外源基因递呈载体；所述核酸酶蛋白为Cas9或Cpf1；所述核酸酶蛋白表达系统为条件性或药物敏感型核酸酶蛋白表达系统；
所述条件性或药物敏感型核酸酶蛋白表达系统为向培养基中添加强力霉素或三甲氧苄氨嘧啶，调节核酸酶蛋白的表达，以此根据所需，精确控制基因编辑的时间。
6.如权利要求2-5任一所述的方法，其特征在于，在转染细胞制备突变细胞库时，通过控制sgRNA整合到基因组上的数量，生产不同拷贝sgRNA的整合的突变细胞库；制备突变细胞库的基因编辑方法为基因敲除或基因敲入；所述细胞的原始来源为具备正常发育能力且对目标病毒易感的细胞。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，利用所述突变细胞库进行目标病毒攻毒实验，根据细胞类型、病毒毒株及致病性调整初始细胞量、攻毒浓度和攻毒时间。
8.权利要求1-7任一所述的方法筛选得到的目标病毒相关宿主因子在制备目标病毒防控药物或疫苗中的应用。
9.权利要求1-7任一所述的方法筛选得到的目标病毒相关宿主因子在抗病动物遗传育种中的应用。
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