CN112159477B - 一种靶向Frizzled-7的抗体融合蛋白及其制备方法与用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种靶向Frizzled‑7的抗体融合蛋白及其制备方法与用途，属于生物工程领域。与现有技术相比，本发明将靶向Fzd7人源化抗体SHH002‑hu1和MICA蛋白通过基因工程的方式融合表达，此设计首次将靶向Fzd7治疗和免疫激活相结合，利用融合蛋白的抗体部分，与阳性表达Fzd7的肿瘤细胞结合，将MICA分子锚定在肿瘤细胞表面；再利用MICA特异性结合NK细胞表面膜受体NKG2D，将NK细胞聚集到肿瘤病灶并激活NK细胞发挥对肿瘤细胞的杀伤效应，从而避免肿瘤在常规抗体治疗的免疫逃逸，同时增强抗体的抗肿瘤效应。

Description

一种靶向Frizzled-7的抗体融合蛋白及其制备方法与用途
技术领域
本发明属于生物工程领域，尤其是涉及一种靶向Frizzled-7的抗体融合蛋白及其制备方法与用途。
背景技术
自然杀伤(NK)细胞是先天性免疫系统发挥细胞毒性作用的细胞，在肿瘤免疫监视中起到关键性作用，是肿瘤免疫治疗中的一个重要工具。NK细胞的激活由活化性受体和抑制性受体间的平衡所调节，NK细胞的主要活化性受体包括Fc片段受体(FcγRIIIa)和NKG2D。激活和重建机体肿瘤免疫作用的一种常规药物是抗体，目前临床上广泛使用的抗肿瘤抗体大多为IgG1型，可通过Fc片段与FcγRIIIa结合激活NK细胞发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)。然而，这些抗体的ADCC效应存在很大的差异；Zhang等研究发现，FcγRIIIa基因的多态性导致其与Fc片段亲和力的不同或下降，从而导致病人对抗体反应差异(Zhang W et al,FCGR2A andFCGR3A polymorphisms associated with clinical outcome of epidermal growthfactor receptor expressing metastatic colorectal cancer patients treated withsingle-agent cetuximab,2006,J Clin Oncol,24:3028)。为提高抗体Fc片段对NK细胞的识别力，科研工作者通过蛋白质工程技术突变抗体的Fc片段氨基酸，改变Fc片段的糖基化程度等；然而，上述努力都无法避免FcγRIIIa多态性带来的个体对抗体反应的差异。
免疫监视作用的另一个重要机制就是肿瘤细胞表面MHC-I相关抗原分子(MICA/B)的表达。MICA/B是NK细胞和CD8+ T细胞表面活化型受体NKG2D的配体(Waldhauer I et al,NK cells and cancer immunosurveillance,2008,Oncogene,27:5932-5943；Nausch N,etal,NKG2D ligands in tumor immunity,2008,Oncogene,27:5944-5958)，NK细胞或CD8+ T细胞借NKG2D与MICA/B的相互作用而与肿瘤细胞靠近、结合，进而通过释放细胞因子等诱导肿瘤细胞的溶解。理论上MICA呈阳性的肿瘤细胞在机体的免疫机制中难以逃逸；临床发现大多数的上皮肿瘤患者肿瘤组织中MICA蛋白表达都为阳性，暗示在这类患者体内存在MICA-NKG2D受体系统功能性妥协，允许肿瘤细胞在MICA表达阳性的基础上增殖。Wu等研究发现血清可溶性MICA水平的显著升高，导致了NK细胞的功能缺陷，并进一步指出可溶性MICA由肿瘤细胞表面MICA的脱落产生，肿瘤细胞逃脱免疫即发生免疫逃逸(Wu JD et al,Prevalent expression of the immunostimulatory MHC class I chain-relatedmolecule is counteracted by shedding in prostate cancer,2004,J Clin Invest,114:560-568；Wu JD et al,Obstructing shedding of the immunostimulatory MHCclass I chain-related gene B prevents tumor formation,2009,Clin Cancer Res,15:632-640)。经文献调研发现，在上述大多MICA呈阳性的上皮性肿瘤细胞中均存在Fzd7高表达，包括三阴性乳腺癌(Triple-Negative Breast Cancer,TNBC)、肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)、非小细胞肺癌(Non Small Cell Lung Cancer,NSCLC)等(Yang L et al,FZD7has a critical role in cell proliferation in triplenegative breast cancer,2011,Oncogene,30:4437-4446；King TD et al,Frizzled7asan emerging target for cancer Therapy,2012,Cell Signal,24:846-851；Polakis P,Drugging Wnt signalling in cancer,2012,EMBO J,31:2737-2746)。
Fzd7为Wnt信号通路的关键膜受体，是Fzd蛋白家族成员之一，其与Wnt结合并在共受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(Low-density lipoprotein receptor-relatedprotein 5/6,LRP5/6)的作用下激活经典Wnt/β-catenin信号通路，调控肿瘤发生发展。研究表明Fzd7异常表达于不同种类的癌症中(包括TNBC、NSCLC、HCC、胰腺癌等)，其通过介导Wnt通路参与肿瘤的侵袭和转移，且对肿瘤血管生成也有调节作用，对Fzd7进行基因敲除可以显著抑制肿瘤细胞增殖、移植瘤生长及血管新生。Wnt信号和肿瘤干细胞行为也存在密切联系，Fzd7就是肿瘤干细胞标记物之一，且这些肿瘤干细胞中Fzd7的上调与肿瘤化疗耐受以及病人的低生存率显著相关(Barker N et al.,Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer,2009,Nature,457:608-11)。另外Fzd7的“context-specific functions”暗示了选择性靶向Fzd7可以在不影响正常组织稳态的前提下治疗癌症。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向Frizzled-7的抗体融合蛋白及其制备方法与用途。
本发明的靶向Frizzled-7的抗体融合蛋白是可与肿瘤细胞表面Frizzled-7(Fzd7)受体蛋白及NK细胞活化型受体(NKG2D)特异结合的高亲和力抗体融合蛋白。该融合蛋白由人源化靶向Fzd7抗体及重组人MICA蛋白两个半分子通过柔性短肽(G4S)链接而成，其能和Wnt3a竞争性与细胞表面Fzd7结合，阻断Wnt/β-catenin信号通路，抑制Fzd7+肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，并且可增强NK细胞对靶细胞的杀伤作用，是一种具有靶向Fzd7+肿瘤细胞和激活机体免疫监视作用的高特异性基因工程融合蛋白。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明提供一种靶向Frizzled-7的抗体融合蛋白，所述融合蛋白由人源化抗Fzd7的全长抗体SHH002-hu1及NKG2D的配体MICA蛋白通过柔性短肽链接而成。
靶向Frizzled-7的抗体融合蛋白也简写为SHH002-hu1-MICA。
进一步地，靶向Frizzled-7的抗体融合蛋白由两条链组成，其中一条链由SHH002-hu1抗体重链和MICA蛋白通过柔性短肽连接而成，其氨基酸序列表为SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；另一条链为SHH002-hu1抗体的轻链，其氨基酸序列为SEQ IDNO.3所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。
进一步地，所述柔性短肽选择为G4S(由4个Gly及1个Ser构成的柔性短肽GGGGS)。
进一步地，所述融合蛋白为特异性结合人Fzd7及NKG2D蛋白，能抑制Fzd7+肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，且能够有效招募NK细胞并激活NK细胞对肿瘤靶细胞的杀伤作用，其介导的免疫监视作用强于母体单抗SHH002-hu1。
本发明还提供一种分离的核酸，可以编码靶向Frizzled-7的抗体融合蛋白SHH002-hu1-MICA。
本发明还提供一组重组表达载体，含有靶向Frizzled-7的抗体融合蛋白SHH002-hu1-MICA的核酸序列。
本发明还提供一种重组宿主细胞EXPICHO-S，含上述重组表达载体。
本发明还提供一种靶向Frizzled-7的抗体融合蛋白SHH002-hu1-MICA的制备方法，包括以下步骤：
分别以SHH002-hu1重轻链基因，MICA基因及pcDNA3.4质粒为模板，设计并合成引物进行PCR扩增；
融合蛋白SHH002-hu1-MICA的构建以SHH002-hu1重链基因H’为基础，进行重叠PCR延伸扩增获得完整的H’-MICA基因。
PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的基因；
PCR扩增终产物及载体pcDNA3.4用限制性内切酶进行双酶切，酶切产物切胶回收后，用T4连接酶16℃过夜连接，获得重组质粒H’-MICA-pcDNA3.4；
同时将SHH002-hu1轻链基因L’与载体pcDNA3.4链接，获得重组质粒L’-pcDNA3.4；
将重组质粒H’-MICA-pcDNA3.4和L’-pcDNA3.4分别转化大肠杆菌DH5a感受态，涂布平板，次日挑取单克隆双酶切及测序鉴定；
将重组质粒H’-MICA-pcDNA3.4、L’-pcDNA3.4用脂质体转染试剂瞬时转染入EXPICHO-S细胞，更换无血清培养基进行蛋白表达。
进一步地，本发明还提供用于分离纯化上述的融合蛋白SHH002-hu1-MICA的纯化方法，具体而言，取细胞培养上清，8000rpm离心15min，0.22μm滤膜过滤样品用Protein A柱进行纯化。
本发明还提供一种靶向Frizzled-7的抗体融合蛋白的应用，所述靶向Frizzled-7的抗体融合蛋白用于制备治疗癌症的药物的应用。
进一步地，靶向Frizzled-7的抗体融合蛋白可选择性地与Fzd7/NKG2D结合，抑制Fzd7与其配体的结合阻断Wnt信号通路，且可以通过锚定在肿瘤细胞膜表面的MICA与NK细胞表面NKG2D结合，激活NKG2D途径介导的免疫监视功能。
在创造本申请的过程中，发明人通过研究，推测靶向Fzd7的抗体可能作为有效的载体连接MICA蛋白，激活NKG2D途径，从而恢复NK细胞的免疫监视作用。
以对肿瘤免疫监视系统的激活为目标，本发明将一种发明人之前自主研发的靶向Fzd7人源化抗体SHH002-hu1(目前已经公开，该专利申请号为201911078254.4，公开号为CN111138539A)和MICA蛋白通过基因工程的方式融合表达，此设计首次将靶向Fzd7治疗和免疫激活相结合，为相关研究中的一次创新。将MICA蛋白用柔性连接肽(由4个Gly及1个Ser构成的柔性短肽G4S)连接在SHH002-hu1 Fc的末端，构建表达融合抗体蛋白SHH002-hu1-MICA，如图1所示，利用融合蛋白的抗体部分，与阳性表达Fzd7的肿瘤细胞结合，将MICA分子锚定在肿瘤细胞表面；再利用MICA特异性结合NK细胞表面膜受体NKG2D，将NK细胞聚集到肿瘤病灶并激活NK细胞发挥对肿瘤细胞的杀伤效应，从而避免肿瘤在常规抗体治疗的免疫逃逸，同时增强抗体的抗肿瘤效应。
本发明，由人源化靶向Fzd7抗体及重组人MICA蛋白两个半分子通过柔性短肽链接而成的融合蛋白一方面能通过靶向Fzd7的抗体特异性阻断Wnt信号通路，精准靶向肿瘤病灶；另一方面能有效激活机体自身免疫功能，重建NKG2D途径的NK细胞免疫监视作用，防止肿瘤免疫逃逸的发生，能够在较低的剂量达到预期的抗肿瘤效果，为TNBC、NSCLC、HCC等恶性肿瘤提供安全有效的临床治疗候选方案。
同时，由人源化靶向Fzd7抗体及重组人MICA蛋白两个半分子通过柔性短肽链接而成的融合蛋白的开发，为抗肿瘤抗体的临床应用提供一种新的设计思路。
与现有技术相比，本发明利用PCR技术将筛选获得的MICA蛋白α1，α2和α3胞外结构域与本申请发明人课题组自主研发的靶向Fzd7人源化全长抗体SHH002-hu1进行克隆重组，构建Fzd7全长抗体/MICA融合蛋白重组载体；脂质体转染试剂瞬时转染到EXPICHO-S细胞，对目的蛋白进行表达；收集细胞培养液，低温离心取上清，将上清过Protein A柱进行分离纯化；SDS-PAGE电泳鉴定分离纯化得到的融合蛋白SHH002-hu1-MICA；分子排阻色谱法SEC-HPLC对纯化后的融合蛋白纯度进行检测，生物膜层干涉技术(Biolayer Interferometry,BLI)对SHH002-hu1-MICA与重组人Fzd7蛋白及NKG2D蛋白的亲和力常数进行测定；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)法检测实验证实融合蛋白能够增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，其诱导产生的细胞毒效应优于母体单抗SHH002-hu1诱导产生的效应。
附图说明
图1为SHH002-hu1-MICA结构示意图。
图2为H’-MICA-pcDNA3.4重组质粒构建过程。
图2A：人MICA基因的扩增。以pUC57-MICA为模板，PCR扩增人MICA基因后核酸电泳检测，并对目的片段进行胶回收，Lane1：MICA(850bp)。
图2B：H’基因的扩增。以pcDNA3.4-SHH002-hu1-HC(IgG1)为模板，PCR扩增H’基因后核酸电泳检测，并对目的片段进行胶回收，Lane1-3：H’(1450bp)。
图2C：H’与MICA片段的链接与扩增。以上述扩增获得的MICA及H’片段为模板，overlap PCR扩增H’-MICA片段，扩增产物经纯化后连接T载体，转化感受态细胞DH5a，随机挑选11个克隆进行PCR验证，Lane1-11分别对应11个克隆的PCR结果(2300bp)。结果表明11个克隆均为阳性克隆，选取1-4号克隆进行测序。
图3为4号克隆序列比对结果。
将上述1-4号克隆送测序，经序列比对，4号克隆序列完全正确。
图4为SHH002-hu1-MICA的SDS-PAGE电泳及SEC-HPLC的检测结果。
图4A：融合蛋白SHH002-hu1-MICA的电泳检测结果。泳道1-5为非还原样品，泳道6-10为还原样品。Lane1：N/A质控，Lane2：SHH002-hu1-MICA，Lane3：N/A质控，Lane4：SHH002-hu1，Lane5：IPI阳性对照抗体；Lane6：SHH002-hu1-MICA，Lane7：N/A质控，Lane8：N/A质控，Lane9：SHH002-hu1，Lane10：IPI阳性对照抗体。还原条件下SHH002-hu1-MICA分别在80kDa和25kDa处出现目标条带，说明H’-MICA与L’链均表达正确，纯度均大于98％；非还原条件下SHH002-hu1-MICA在210kDa处出现目的条带，说明融合蛋白装配正确，且纯度大于95％，完全装配的主带明显。
图4B：融合蛋白SHH002-hu1-MICA的SEC-HPLC检测结果。上图：IPI阳性对照抗体的SEC-HPLC色谱图，参比品出峰时间10.9min，峰型对称，基线平稳，系统适应性通过。下图：SHH002-hu1-MICA的SEC-HPLC色谱图，目的蛋白出峰时间8.4min，基线平稳，目的蛋白的占比为85％，有少部分高聚体产生。
图5为Fortebio仪器测得的SHH002-hu1-MICA分别与rhFzd7和rhNKG2D-Fc蛋白结合解离动力学过程拟合曲线图。
图5A：SHH002-hu1-MICA与rhFzd7结合解离动力学过程拟合曲线。
图5B：SHH002-hu1与rhFzd7结合解离动力学过程拟合曲线。0s到300s表示结合，300s到900s表示解离，图中的7条曲线从上到下分别表示固定相与1000nM、500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM和15.625nM浓度的rhFzd7结合的曲线。每个rhFzd7浓度都两条曲线，光滑红色曲线为计算机拟合所得，另外一条曲线是仪器实际测定曲线。Fortebio仪器算法计算出SHH002-hu1-MICA及SHH002-hu1与rhFzd7的亲和动力学常数KD均<1.0×10-12M；SHH002-hu1-MICA与rhFzd7的结合常数ka为1.22×104(1/Ms)，解离常数kd<1.0×10-7(1/s)；SHH002-hu1与rhFzd7的结合常数ka为1.1×104(1/Ms)，解离常数kd<1.0×10-7(1/s)；因此融合蛋白与母体单抗相比，其与抗原Fzd7的亲和力未丢失。
图5C：SHH002-hu1-MICA与rhNKG2D-Fc结合解离动力学过程拟合曲线。360s到660s表示结合，660s到960s表示解离，图中的3条曲线从上到下分别表示固定相SHH002-hu1-MICA与300nM、100nM和33.33nM浓度的rhNKG2D-Fc结合的曲线，光滑黑色曲线为计算机拟合所得，另外一条曲线是仪器实际测定曲线。
图5D：rhMICA-His与rhNKG2D-Fc结合解离动力学过程拟合曲线。0s到300s表示结合，300s到900s表示解离，图中的3条曲线从上到下分别表示固定相rhNKG2D-Fc与11.1nM，3.7nM和1.23nM浓度的rhMICA-His结合的曲线，光滑红色曲线为计算机拟合所得，另外一条曲线是仪器实际测定曲线。Fortebio仪器算法计算出SHH002-hu1-MICA与rhNKG2D-Fc的亲和力常数KD为4.52×10-8M，结合常数ka为2.81×104(1/Ms)，解离常数kd为1.27×10-3(1/s)；rhMICA-His与rhNKG2D-Fc的亲和力常数KD为1.26×10-9M，结合常数ka为1.19×106(1/Ms)，解离常数kd为1.5×10-3(1/s)；因此融合蛋白与MICA蛋白相比，其与NKG2D的亲和力的变化在可接受范围内。
图6为融合蛋白SHH002-hu1-MICA介导的NK92细胞对MDA-MB-231细胞杀伤作用的结果，以母体单抗SHH002-hu1和rhMICA作为对照。
结果表明SHH002-hu1-MICA和SHH002-hu1均可以介导NK92细胞对MDA-MB-231细胞的杀伤作用，且随着效应细胞(NK92)/靶细胞(MDA-MB-231)(效靶比)的增加，杀伤作用增强(data were presented as the mean±SD,n＝3,*p<0.05，**p<0.01)；在相同效靶比的情况下，对比control组和rhMICA组，SHH002-hu1-MICA和SHH002-hu1组NK92细胞对MDA-MB-231细胞的杀伤作用明显增强(data were presented as the mean±SD,n＝3,#p<0.05，##p<0.01)，并且SHH002-hu1-MICA介导的杀伤作用也明显强于SHH002-hu1(data werepresented as the mean±SD,n＝3,#p<0.05)。因此，得出结论：MICA半分子的融入，可以明显增强母体单抗SHH002-hu1介导的NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：融合蛋白SHH002-hu1-MICA的构建
首先从genebank中获得编码人MICA蛋白α1，α2和α3胞外结构域的基因序列(GeneID：100507436，protein：Q29983)，以其为模板，设计引物，正向引物MICA-F:GAGCCTGTCTCCTGGCAAAGGAGGTG，反向引物pcDNA3.4-3R:GTTGATTGTCGAGATATCAAATTATC，PCR扩增MICA’片段。融合蛋白SHH002-hu1-MICA的重链构建以SHH002-hu1重链基因H’及MICA’基因为模板，进行重叠PCR延伸扩增获得完整的H’-MICA基因，正向引物insert-F：GCTACGCGTGTCCACTCC，反向引物IgG1-3R：TTTGCCAGGAGACAGGCTCAGGGACTTC。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的基因。PCR扩增终产物及载体pcDNA3.4用限制性内切酶进行双酶切，酶切产物切胶回收后，用T4连接酶16℃过夜连接，获得重组质粒H’-MICA-pcDNA3.4。同时将SHH002-hu1轻链基因L’与载体pcDNA3.4链接，获得重组质粒L’-pcDNA3.4。将重组质粒H’-MICA-pcDNA3.4和L’-pcDNA3.4分别转化大肠杆菌DH5a感受态，涂布平板，次日挑取单克隆双酶切及测序鉴定。
其中，由SHH002-hu1抗体重链和MICA蛋白通过柔性短肽连接而成的一条链，简称为H’-MICA，其氨基酸序列表为SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；另一条链为SHH002-hu1抗体的轻链，其氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列为SEQ IDNO.4所示。
实施例2：融合蛋白SHH002-hu1-MICA的表达、纯化、鉴定
将重组质粒H’-MICA-pcDNA3.4、L-pcDNA3.4用脂质体转染试剂瞬时转染入EXPICHO-S细胞，更换无血清培养基进行蛋白表达。
一、取细胞培养上清，8000rpm离心15min，0.22μm滤膜过滤样品用Protein A柱进行纯化。用100mM甘氨酸缓冲液(pH 3.5，pH 2.7)洗脱，收集洗脱峰；并用1M Tris缓冲液(pH9.0)中和收集物。纯化后蛋白用SDS-PAGE电泳法在非还原和还原条件下分别鉴定SHH002-hu1-MICA的分子量。
二、使用Agilent HPLC 1100仪器通过SEC-HPLC法进一步验证纯化后融合蛋白SHH002-hu1-MICA的纯度。选择分子排阻色谱柱为：TSKgelG3000SWXL；柱温：20℃；进样量：10μL；检测器参数：检测波长280nm，带宽16nm，参比波长360nm，带宽100nm，峰宽(响应时间)>0.1min(2s)；狭缝4nm；负吸光度基线100mAU；系统适应性标准：参比品蛋白IPI出峰时间10.9min，峰型对称，基线平稳。
图2为H’-MICA-pcDNA3.4重组质粒构建过程。
图2A：人MICA基因的扩增。以pUC57-MICA为模板，PCR扩增人MICA基因后核酸电泳检测，并对目的片段进行胶回收，Lane1：MICA(850bp)。
图2B：H’基因的扩增。以pcDNA3.4-SHH002-hu1-HC(IgG1)为模板，PCR扩增H’基因后核酸电泳检测，并对目的片段进行胶回收，Lane1-3：H’(1450bp)。
图2C：H’与MICA片段的链接与扩增。以上述扩增获得的MICA及H’片段为模板，overlap PCR扩增H’-MICA片段，扩增产物经纯化后连接T载体，转化感受态细胞DH5a，随机挑选11个克隆进行PCR验证，Lane1-11分别对应11个克隆的PCR结果(2300bp)。结果表明11个克隆均为阳性克隆，选取1-4号克隆进行测序。
图3为4号克隆序列比对结果。
将上述1-4号克隆送测序，经序列比对，4号克隆序列完全正确。
图4为SHH002-hu1-MICA的SDS-PAGE电泳及SEC-HPLC的检测结果。
图4A：融合蛋白SHH002-hu1-MICA的电泳检测结果。泳道1-5为非还原样品，泳道6-10为还原样品。Lane1：N/A质控，Lane2：SHH002-hu1-MICA，Lane3：N/A质控，Lane4：SHH002-hu1，Lane5：IPI阳性对照抗体；Lane6：SHH002-hu1-MICA，Lane7：N/A质控，Lane8：N/A质控，Lane9：SHH002-hu1，Lane10：IPI阳性对照抗体。还原条件下SHH002-hu1-MICA分别在80kDa和25kDa处出现目标条带，说明H’-MICA与L’链均表达正确，纯度均大于98％；非还原条件下SHH002-hu1-MICA在210kDa处出现目的条带，说明融合蛋白装配正确，且纯度大于95％，完全装配的主带明显。
图4B：融合蛋白SHH002-hu1-MICA的SEC-HPLC检测结果。上图：IPI阳性对照抗体的SEC-HPLC色谱图，参比品出峰时间10.9min，峰型对称，基线平稳，系统适应性通过。下图：SHH002-hu1-MICA的SEC-HPLC色谱图，目的蛋白出峰时间8.4min，基线平稳，目的蛋白的占比为85％，有少部分高聚体产生。
实施例3：融合蛋白SHH002-hu1-MICA的BLI实验
使用蛋白质相互作用仪Fortebio Octet Red96通过BLI法验证SHH002-hu1-MICA分别与rhFzd7蛋白和rhNKG2D-Fc蛋白的亲和力。
一、溶液配制：PBST buffer：0.025％Tween 20以pH 7.2的PBS溶解；固定相工作溶液：SHH002-hu1-MICA/SHH002-hu1用PBST buffer配制成100nM；rhFzd7工作溶液：rhFzd7用PBST buffer配制成1000nM、500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM和15.625nM；rhNKG2D工作溶液：rhNKG2D-Fc用PBST buffer配制成300nM、100nM和33nM。
二、操作流程：打开Fortebio仪器及相关软件，选择Advance Kientics实验模式。首先利用Anti-Human Fab-CH1 2nd Generation(FAB2G)Sensor捕获SHH002-hu1-MICA/SHH002-hu1，然后利用捕获的融合蛋白/母体抗体结合不同浓度的抗原rhFzd7/rhNKG2D-Fc，接着在缓冲液中进行解离，最后通过仪器算法计算出亲和动力学常数KD。作为对照，rhMICA-His与rhNKG2D-Fc的亲和力常数测定过程如下：首先利用Anti-Human IgG FcCapture(AHC)Sensor捕捉rhNKG2D-Fc蛋白，然后利用捕获的rhNKG2D-Fc蛋白分别结合11.1nM，3.7nM，1.23nM的rhMICA-His蛋白，接着在缓冲液中进行解离，最后计算出亲和动力学常数KD。
图5为Fortebio仪器测得的SHH002-hu1-MICA分别与rhFzd7和rhNKG2D-Fc蛋白结合解离动力学过程拟合曲线图。
图5A：SHH002-hu1-MICA与rhFzd7结合解离动力学过程拟合曲线。
图5B：SHH002-hu1与rhFzd7结合解离动力学过程拟合曲线。0s到300s表示结合，300s到900s表示解离，图中的7条曲线从上到下分别表示固定相与1000nM、500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM和15.625nM浓度的rhFzd7结合的曲线。每个rhFzd7浓度都两条曲线，光滑红色曲线为计算机拟合所得，另外一条曲线是仪器实际测定曲线。Fortebio仪器算法计算出SHH002-hu1-MICA及SHH002-hu1与rhFzd7的亲和动力学常数KD均<1.0×10-12M；SHH002-hu1-MICA与rhFzd7的结合常数ka为1.22×104(1/Ms)，解离常数kd<1.0×10-7(1/s)；SHH002-hu1与rhFzd7的结合常数ka为1.1×104(1/Ms)，解离常数kd<1.0×10-7(1/s)；因此融合蛋白与母体单抗相比，其与抗原Fzd7的亲和力未丢失。
图5C：SHH002-hu1-MICA与rhNKG2D-Fc结合解离动力学过程拟合曲线。360s到660s表示结合，660s到960s表示解离，图中的3条曲线从上到下分别表示固定相SHH002-hu1-MICA与300nM、100nM和33.33nM浓度的rhNKG2D-Fc结合的曲线，光滑黑色曲线为计算机拟合所得，另外一条曲线是仪器实际测定曲线。
图5D：rhMICA-His与rhNKG2D-Fc结合解离动力学过程拟合曲线。0s到300s表示结合，300s到900s表示解离，图中的3条曲线从上到下分别表示固定相rhNKG2D-Fc与11.1nM，3.7nM和1.23nM浓度的rhMICA-His结合的曲线，光滑红色曲线为计算机拟合所得，另外一条曲线是仪器实际测定曲线。Fortebio仪器算法计算出SHH002-hu1-MICA与rhNKG2D-Fc的亲和力常数KD为4.52×10-8M，结合常数ka为2.81×104(1/Ms)，解离常数kd为1.27×10-3(1/s)；rhMICA-His与rhNKG2D-Fc的亲和力常数KD为1.26×10-9M，结合常数ka为1.19×106(1/Ms)，解离常数kd为1.5×10-3(1/s)；因此融合蛋白与MICA蛋白相比，其与NKG2D的亲和力的变化在可接受范围内。
实施例4：LDH法检测SHH002-hu1-MICA/SHH002-hu1介导的NK细胞对TNBC细胞MDA-MB-231的毒性作用
该实验中将SHH002-hu1-MICA/SHH002-hu1与高表达Fzd7的MDA-MB-231细胞及NK92细胞混合后作用4h后，利用细胞毒性检测试剂盒进行检测。利用SPSS软件对实验数据进行分析，以评估融合蛋白/母体单抗介导NK92细胞对MDA-MB-231细胞产生的杀伤效应。将MDA-MB-231细胞、NK92细胞按比例加入96孔板中，再将融合蛋白或母体单抗或阴性对照rhMICA-His按100nM加入孔板中作用4h，250g离心平板4min后，将50μL上清液转移到酶分析板中，把配好的底物按50μL/孔加到酶分析板中，盖好平板，室温避光孵育30min，向每孔中加入50μL终止液，在490nm记录吸光值。按照公式％cytotoxicity＝((experimental-effector spontaneous-target spontaneous)/(target maximum-target spontaneous))×100计算细胞毒性，利用软件分析结果。
图6为融合蛋白SHH002-hu1-MICA介导的NK92细胞对MDA-MB-231细胞杀伤作用的结果，以母体单抗SHH002-hu1和rhMICA作为对照。
结果表明SHH002-hu1-MICA和SHH002-hu1均可以介导NK92细胞对MDA-MB-231细胞的杀伤作用，且随着效应细胞(NK92)/靶细胞(MDA-MB-231)(效靶比)的增加，杀伤作用增强(data were presented as the mean±SD,n＝3,*p<0.05，**p<0.01)；在相同效靶比的情况下，对比control组和rhMICA组，SHH002-hu1-MICA和SHH002-hu1组NK92细胞对MDA-MB-231细胞的杀伤作用明显增强(data were presented as the mean±SD,n＝3,#p<0.05，##p<0.01)，并且SHH002-hu1-MICA介导的杀伤作用也明显强于SHH002-hu1(data werepresented as the mean±SD,n＝3,#p<0.05)。因此，得出结论：MICA半分子的融入，可以明显增强母体单抗SHH002-hu1介导的NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 上海健康医学院
<120> 一种靶向Frizzled-7的抗体融合蛋白及其制备方法与用途
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 734
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Ala Thr Val Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Ser Glu Pro His Ser Leu Arg Tyr Asn Leu Thr Val Leu Ser Trp
450 455 460
Asp Gly Ser Val Gln Ser Gly Phe Leu Ala Glu Val His Leu Asp Gly
465 470 475 480
Gln Pro Phe Leu Arg Tyr Asp Arg Gln Lys Cys Arg Ala Lys Pro Gln
485 490 495
Gly Gln Trp Ala Glu Asp Val Leu Gly Asn Lys Thr Trp Asp Arg Glu
500 505 510
Thr Arg Asp Leu Thr Gly Asn Gly Lys Asp Leu Arg Met Thr Leu Ala
515 520 525
His Ile Lys Asp Gln Lys Glu Gly Leu His Ser Leu Gln Glu Ile Arg
530 535 540
Val Cys Glu Ile His Glu Asp Asn Ser Thr Arg Ser Ser Gln His Phe
545 550 555 560
Tyr Tyr Asp Gly Glu Leu Phe Leu Ser Gln Asn Leu Glu Thr Glu Glu
565 570 575
Trp Thr Val Pro Gln Ser Ser Arg Ala Gln Thr Leu Ala Met Asn Val
580 585 590
Arg Asn Phe Leu Lys Glu Asp Ala Met Lys Thr Lys Thr His Tyr His
595 600 605
Ala Met His Ala Asp Cys Leu Gln Glu Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Ser
610 615 620
Gly Val Val Leu Arg Arg Thr Val Pro Pro Met Val Asn Val Thr Arg
625 630 635 640
Ser Glu Ala Ser Glu Gly Asn Ile Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Ser
645 650 655
Phe Tyr Pro Arg Asn Ile Ile Leu Thr Trp Arg Gln Asp Gly Val Ser
660 665 670
Leu Ser His Asp Thr Gln Gln Trp Gly Asp Val Leu Pro Asp Gly Asn
675 680 685
Gly Thr Tyr Gln Thr Trp Val Ala Thr Arg Ile Cys Arg Gly Glu Glu
690 695 700
Gln Arg Phe Thr Cys Tyr Met Glu His Ser Gly Asn His Ser Thr His
705 710 715 720
Pro Val Pro Ser Gly Lys Val Leu Val Leu Gln Ser His Trp
725 730
<210> 2
<211> 2208
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caggtgcagc tggtgcagtc cggcgctgag gtgaagaagc ccggcgctag cgtgaagatg 60
agctgtaagg cctccggcta caccttcacc acctacacca tgcactgggt gaggcaggcc 120
cctggccagg gactggagtg gatcggctat atcaaccctc ggagcggcta caccaactat 180
aatcagaagt tccagggccg ggccaccgtg accgccgata agtccaccag caccgcttac 240
atggagctga gctccctgag gtccgaggac accgccgtgt attattgcgc taggcggggc 300
tacttcgatt attggggcca gggcaccacc gtgaccgtgt ccagcgcttc caccaagggc 360
ccctccgtgt tccccctggc tccctcttcc aagagcacca gcggcggcac cgctgctctg 420
ggatgtctgg tgaaggacta cttccctgag cctgtgaccg tgtcctggaa ttccggcgcc 480
ctgacctccg gcgtgcacac attccctgct gtgctgcagt cctccggcct gtatagcctg 540
tcctccgtgg tgacagtgcc tagctccagc ctgggcaccc agacctatat ctgcaacgtg 600
aaccacaagc ctagcaatac caaggtggac aagaaggtgg agcctaagag ctgcgacaag 660
acccacacct gtcctccatg tcctgctcca gaactgctcg gcggaccttc cgtgttcctg 720
tttcctccaa agcctaagga caccctgatg atcagcagaa cccctgaagt gacctgcgtg 780
gtggtggatg tgtcccacga ggatcccgaa gtgaagttca attggtacgt ggacggcgtg 840
gaagtgcaca acgccaagac caagcctaga gaggaacagt acaacagcac ctacagagtg 900
gtgtccgtgc tgaccgtgct gcaccaggat tggctgaacg gcaaagagta caagtgcaag 960
gtgtccaaca aggccctgcc tgctcctatc gagaaaacca tcagcaaggc caagggccag 1020
cctagggaac cccaggttta cacactgcct ccaagcaggg acgagctgac caagaatcag 1080
gtgtccctga cctgcctggt caagggcttc tacccttccg atatcgccgt ggaatgggag 1140
agcaatggcc agcctgagaa caactacaag acaacccctc ctgtgctgga cagcgacggc 1200
tcattcttcc tgtacagcaa gctgacagtg gacaagagca gatggcagca gggcaacgtg 1260
ttcagctgca gcgtgatgca cgaggccctg cacaaccact acacccagaa gtccctgagc 1320
ctgtctcctg gcaaaggagg tggtggaagt gagccccaca gcctgcggta caacctgacc 1380
gtcctgtcct gggacggaag cgtccagagc ggctttctgg ctgaggtgca cctggacggc 1440
cagcctttcc tgcggtacga ccggcagaaa tgtcgggcta aaccccaggg ccagtgggct 1500
gaggatgtcc tgggcaacaa gacatgggac cgggagacca gggacctcac aggcaacggc 1560
aaggacctcc ggatgacact ggcccacatc aaggaccaga aggaaggcct gcacagcctg 1620
caggagatcc gggtgtgcga aatccacgag gacaactcca cccggtcctc ccagcacttc 1680
tactacgacg gcgaactctt cctgtcccag aatctggaga ccgaagagtg gacagtgcct 1740
cagagcagca gggcccaaac cctcgccatg aacgtgcgga acttcctgaa ggaggacgcc 1800
atgaagacca agacccacta ccatgccatg catgccgact gtctgcagga actgaggagg 1860
tacctggagt ccggcgtggt cctcaggagg acagtgcctc ccatggtcaa cgtgacacgg 1920
agcgaagcct ccgagggaaa catcaccgtg acctgcaggg cctcctcctt ctaccccagg 1980
aacatcatcc tgacctggag gcaagacggc gtgagcctct cccatgacac ccagcagtgg 2040
ggcgatgtgc tgcctgacgg caacggcaca taccaaacct gggtggctac ccggatttgt 2100
aggggcgaag agcagcggtt cacctgctac atggaacaca gcggaaacca ctccacacac 2160
cctgtcccca gcggcaaagt cctggtgctg cagagccact ggtgataa 2208
<210> 3
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Tyr
20 25 30
Gly Asn Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Val Gln Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 4
<211> 654
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gatatccagc tgacccagag ccctagctcc ctgtccgtgt ccgtgggcga tcgggccacc 60
atcacctgtc gggcctccga gtccgtggac gactatggca ataccttcat gcactggtac 120
cagcagaagc ctggcaaggc tcccaagctg ctgatctacc tggcctccaa cctgcagagc 180
ggcgtgcctt ccaggttctc cggcagcggc agccggaccg acttcaccct gaccatcagc 240
agcgtgcagg ctgaggacgc cgccacctat tactgccagc agaataatga ggatccttat 300
accttcggcc agggcaccaa gctggagatc aagaggaccg tggctgcccc cagcgtgttc 360
atcttccctc ctagcgacga gcagctgaag agcggcaccg ctagcgtggt gtgtctgctg 420
aataacttct atcccaggga ggccaaggtg cagtggaagg tggataacgc cctgcagagc 480
ggcaactccc aggagtccgt gaccgagcag gactccaagg acagcaccta ctccctgagc 540
tccaccctga ccctgtccaa ggctgattat gagaagcaca aggtgtatgc ttgcgaggtg 600
acacaccagg gcctgtccag ccctgtgacc aagagcttca accggggcga gtgc 654

Claims (7)

1.一种靶向Frizzled-7的抗体融合蛋白，其特征在于，靶向Frizzled-7的抗体融合蛋白由两条链组成，其中一条链由SHH002-hu1抗体重链和NKG2D的配体MICA蛋白通过柔性短肽连接而成，其氨基酸序列表为SEQ ID NO.1所示；另一条链为SHH002-hu1抗体的轻链，其氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。
2.一种分离的核酸，其特征在于，编码如权利要求1所述靶向Frizzled-7的抗体融合蛋白。
3.一组重组表达载体，其特征在于，含有如权利要求1所述靶向Frizzled-7的抗体融合蛋白的核酸序列。
4.一种重组宿主细胞EXPICHO-S，其特征在于，含有如权利要求3所述重组表达载体。
5.一种如权利要求1所述靶向Frizzled-7的抗体融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
分别以SHH002-hu1重轻链基因，MICA基因及pcDNA3.4质粒为模板，设计并合成引物进行PCR扩增；
PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的基因；
PCR扩增终产物及载体pcDNA3.4用限制性内切酶进行双酶切，酶切产物切胶回收后，用T4连接酶连接，获得重组质粒H’-MICA-pcDNA3.4；
同时将SHH002-hu1轻链基因L’与载体pcDNA3.4链接，获得重组质粒L’-pcDNA3.4；
将重组质粒H’-MICA-pcDNA3.4和L’-pcDNA3.4分别转化大肠杆菌DH5a感受态，涂布平板，次日挑取单克隆双酶切及测序鉴定；
将重组质粒H’-MICA-pcDNA3.4、L’-pcDNA3.4用脂质体转染试剂瞬时转染入EXPICHO-S细胞，更换无血清培养基进行蛋白表达。
6.根据权利要求5所述靶向Frizzled-7的抗体融合蛋白的制备方法，其特征在于，还包括分离纯化融合蛋白的纯化方法，取细胞培养上清，离心，0.22μm滤膜过滤样品用ProteinA柱进行纯化。
7.一种如权利要求1所述靶向Frizzled-7的抗体融合蛋白的应用，其特征在于，所述靶向Frizzled-7的抗体融合蛋白用于制备治疗癌症的药物的应用。
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