CN113631571A - 抗骨膜蛋白抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本文描述了阻断骨膜蛋白功能的抗体。本文还描述了所述抗体在治疗癌症和改变肿瘤免疫特性中的用途。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年12月14日提交的美国临时申请序列号62/779,996和2019年9月11日提交的美国临时申请序列号62/899,075的权益,将其全部通过引用以其整体特此并入。
背景技术
骨膜蛋白(POSTN)是一种基质细胞蛋白,其参与许多生理过程,包括上皮-间质转化(EMT)、细胞-基质相互作用和炎症。POSTN在若干种病理环境中过表达,所述病理环境包括炎症、纤维化疾病和癌症,在其中它与不良预后相关。在癌症中,POSTN通常由基质细胞(如癌症相关成纤维细胞(CAF))表达,然而在癌症起始细胞(CIC)和MDSC中也已经报道了POSTN表达。POSTN通过结合其他基质细胞蛋白(如纤连蛋白和胶原蛋白)来调节细胞外重塑,并且充当整联蛋白受体配体以促进细胞存活、迁移/侵袭、EMT、血管生成和免疫细胞募集。假定POSTN通过作用于癌症生物学的多个方面来驱动肿瘤生长和进展,所述多个方面包括通过促进免疫排斥来抑制抗肿瘤免疫并通过肿瘤浸润髓系细胞增加免疫抑制。
发明内容
本文描述了抑制骨膜蛋白功能(如整联蛋白介导的细胞附着)的抗体。此类抗体可用于治疗癌症。本文所述的抗骨膜蛋白抗体降低了肿瘤的胶原蛋白含量,减少了抑制性髓系细胞群(如粒细胞和肿瘤相关巨噬细胞)的浸润,同时增加了巨噬细胞向M1表型的极化,并且增加了肿瘤浸润T细胞的积累和抗肿瘤特性。
本文描述了一种结合骨膜蛋白的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中所述抗体或所述抗体的抗原结合片段包含:免疫球蛋白重链CDR1(CDR-H1),其包含SEQ IDNO:1(GYTFTSYG)中所示的氨基酸序列;免疫球蛋白重链CDR2(CDR-H2),其包含SEQ ID NO:2(ISAYNGNT)、3(ISAYSGNT)、4(ISAYQGNT)、5(ISAYTGNT)或6(ISAYDGNT)中任一个中所示的氨基酸序列;免疫球蛋白重链CDR3(CDR-H3),其包含SEQ ID NO:7(DILVVPFDY)、8(DVLVVPFDY)或9(DMLVVPFDY)中任一个中所示的氨基酸序列;免疫球蛋白轻链CDR1(CDR-L1),其包含SEQID NO:10(SSDIGSNR)中所示的氨基酸序列;免疫球蛋白轻链CDR2(CDR-L2),其包含SEQ IDNO:11(SND)中所示的氨基酸序列;以及免疫球蛋白轻链CDR3(CDR-L3),其包含SEQ ID NO:12(AAWDDSLSTYV)中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述抗体或所述抗体的抗原结合片段包含:免疫球蛋白重链CDR1(CDR-H1),其包含SEQ ID NO:1(GYTFTSYG)中所示的氨基酸序列;免疫球蛋白重链CDR2(CDR-H2),其包含SEQ ID NO:2(ISAYNGNT)中所示的氨基酸序列;免疫球蛋白重链CDR3(CDR-H3),其包含SEQ ID NO:9(DMLVVPFDY)中所示的氨基酸序列;免疫球蛋白轻链CDR1(CDR-L1),其包含SEQ ID NO:10(SSDIGSNR)中所示的氨基酸序列;免疫球蛋白轻链CDR2(CDR-L2),其包含SEQ ID NO:11(SND)中所示的氨基酸序列;以及免疫球蛋白轻链CDR3(CDR-L3),其包含SEQ ID NO:12(AAWDDSLSTYV)中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段是人的、嵌合的或人源化的。在一些实施方案中,所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段是IgG抗体。在某些实施方案中,所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段包含一个或多个突变以降低所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段的一种或多种效应子功能。在某些实施方案中,降低所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段的一种或多种效应子功能的所述一个或多个突变包括选自以下的一个或多个突变或突变组:根据EU编号系统的IgG4的N434A、N434H、T307A/E380A/N434A、M252Y/S254T/T256E、433K/434F/436H、T250Q、T250F、M428L、M428F、T250Q/M428L、N434S、V308W、V308Y、V308F、M252Y/M428L、D259I/V308F、M428L/V308F、Q311V/N434S、T307Q/N434A、E258F/V427T、S228P、L235E、S228P/L235E/R409K、S228P/L235E、K370Q、K370E、G446缺失、K447缺失及其组合。在某些实施方案中,降低所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段的一种或多种效应子功能的所述一个或多个突变包括根据EU编号系统的IgG4的S228P、F234A和L235A突变。在一些实施方案中,所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段是Fab、F(ab)2、单结构域抗体或单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中,所述抗体或所述抗体的抗原结合片段包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区:其中所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列至少约90%、95%、97%、99%、或100%相同的氨基酸序列;并且其中所述免疫球蛋白轻链可变区包含与SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列至少约90%、95%、97%、99%、或100%相同的氨基酸序列,其中SEQ ID NO:13的氨基酸残基编号55处的氨基酸是天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸或天冬氨酸,并且其中SEQ ID NO:13的氨基酸残基编号100处的氨基酸是甲硫氨酸、异亮氨酸或缬氨酸。在一些实施方案中,所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段需要SEQ ID NO:15的以下残基中的至少一个来用于与骨膜蛋白的特异性结合:N276、R284、E288、L287、V295或K302。在一些实施方案中,所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段需要SEQ ID NO:15的以下残基中的至少两个、三个、四个或五个来用于与骨膜蛋白的特异性结合:N276、R284、E288、L287、V295或K302。在一些实施方案中,所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段需要SEQ ID NO:15的以下残基中的至少全部来用于与骨膜蛋白的特异性结合:N276、R284、E288、L287、V295或K302。本文还描述了一种药物组合物,其包含所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。在一些实施方案中,所述药物组合物被配制用于静脉内施用。在一些实施方案中,所述药物组合物被配制用于皮下施用。在一些实施方案中,所述药物组合物被配制用于瘤内施用。本文还描述了用于在降低肿瘤中的胶原蛋白含量中使用的所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或所述药物组合物。在一些实施方案中,所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或所述药物组合物用于在治疗癌症中使用。在一些实施方案中,所述癌症包括胶质母细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肾癌、头颈癌、卵巢癌、皮肤癌、胃癌、间皮瘤、肝癌、子宫内膜癌、结肠癌、宫颈癌、前列腺癌或肺癌。本文还描述了一种在个体中降低肿瘤中的胶原蛋白含量的方法,其包括向所述个体施用所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或所述药物组合物。本文还描述了一种在个体中增加肿瘤中的M1巨噬细胞表型和/或减少M2巨噬细胞表型的方法,其包括向所述个体施用所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或所述药物组合物。本文还描述了一种在个体中减少抑制性粒细胞髓系细胞和/或肿瘤相关巨噬细胞积累的方法,其包括向所述个体施用所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或所述药物组合物。本文还描述了一种增加个体的肿瘤中CD4+和/或CD8+T细胞的频率的方法,其包括向所述个体施用所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或所述药物组合物。本文还描述了一种在个体中增加通过CD8+T细胞的干扰素γ表达和/或释放所测量的肿瘤中CD8+T细胞的功能的方法,其包括向所述个体施用所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或所述药物组合物。本文还描述了一种治疗个体的癌症的方法,其包括向所述个体施用治疗有效量的所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或所述药物组合物。在一些实施方案中,所述癌症包括胶质母细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肾癌、头颈癌、卵巢癌、皮肤癌、胃癌、间皮瘤、肝癌、子宫内膜癌、结肠癌、宫颈癌、前列腺癌或肺癌。本文还描述了一种制备用于降低肿瘤中的胶原蛋白含量的组合物的方法,其包括将所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段与药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂混合。本文还描述了一种制备用于增加肿瘤中的M1巨噬细胞表型和/或减少M2巨噬细胞表型的组合物的方法,其包括将所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段与药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂混合。本文还描述了一种制备用于在个体中减少抑制性粒细胞髓系细胞和/或肿瘤相关巨噬细胞积累的组合物的方法,其包括将所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段与药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂混合。本文还描述了一种制备用于增加个体的肿瘤中CD4+和/或CD8+T细胞的频率的组合物的方法,其包括将所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段与药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂混合。本文还描述了一种制备用于在个体中增加通过CD8+T细胞的干扰素γ表达和/或释放所测量的肿瘤中CD8+T细胞的功能的组合物的方法,其包括将所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段与药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂混合。本文还描述了一种制备用于治疗癌症的组合物的方法,其包括将所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段与药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂混合。在一些实施方案中,所述癌症包括胶质母细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肾癌、头颈癌、卵巢癌、皮肤癌、胃癌、间皮瘤、肝癌、子宫内膜癌、结肠癌、宫颈癌、前列腺癌或肺癌。
本文还描述了一种结合骨膜蛋白的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区:其中所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列至少约90%、95%、97%、99%、或100%相同的氨基酸序列;并且其中所述免疫球蛋白轻链可变区包含与SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列至少约90%、95%、97%、99%、或100%相同的氨基酸序列,其中SEQ ID NO:13的氨基酸残基编号55是天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸或天冬氨酸,并且其中SEQ ID NO:13的氨基酸残基编号100是甲硫氨酸、异亮氨酸或缬氨酸。在一些实施方案中,所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段是人抗体。在一些实施方案中,所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段是IgG抗体。在某些实施方案中,所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段包含一个或多个突变以降低所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段的一种或多种效应子功能。在某些实施方案中,降低所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段的一种或多种效应子功能的所述一个或多个突变包括选自以下的一个或多个突变或突变组:根据EU编号系统的IgG4的N434A、N434H、T307A/E380A/N434A、M252Y/S254T/T256E、433K/434F/436H、T250Q、T250F、M428L、M428F、T250Q/M428L、N434S、V308W、V308Y、V308F、M252Y/M428L、D259I/V308F、M428L/V308F、Q311V/N434S、T307Q/N434A、E258F/V427T、S228P、L235E、S228P/L235E/R409K、S228P/L235E、K370Q、K370E、G446缺失、K447缺失及其组合。在某些实施方案中,降低所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段的一种或多种效应子功能的所述一个或多个突变包括根据EU编号系统的IgG4的S228P、F234A和L235A突变。在一些实施方案中,所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段是Fab、F(ab)2、单结构域抗体或单链可变片段(scFv)。本文还描述了一种药物组合物,其包含所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。在一些实施方案中,所述药物组合物被配制用于静脉内施用。在一些实施方案中,所述药物组合物被配制用于皮下施用。在一些实施方案中,所述药物组合物被配制用于瘤内施用。本文还描述了用于在降低肿瘤中的胶原蛋白含量中使用的所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或所述药物组合物。在一些实施方案中,所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或所述药物组合物用于在治疗癌症中使用。在一些实施方案中,所述癌症包括胶质母细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肾癌、头颈癌、卵巢癌、皮肤癌、胃癌、间皮瘤、肝癌、子宫内膜癌、结肠癌、宫颈癌、前列腺癌或肺癌。本文还描述了一种在个体中降低肿瘤中的胶原蛋白含量的方法,其包括向所述个体施用所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或所述药物组合物。本文还描述了一种在个体中增加肿瘤中的M1巨噬细胞表型和/或减少M2巨噬细胞表型的方法,其包括向所述个体施用所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或所述药物组合物。本文还描述了一种在个体中减少抑制性粒细胞髓系细胞和/或肿瘤相关巨噬细胞积累的方法,其包括向所述个体施用所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或所述药物组合物。本文还描述了一种增加个体的肿瘤中CD4+和/或CD8+T细胞的频率的方法,其包括向所述个体施用所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或所述药物组合物。本文还描述了一种在个体中增加如通过CD8+T细胞的干扰素γ表达和/或释放所测量的肿瘤中CD8+T细胞的功能的方法,其包括向所述个体施用所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或所述药物组合物。本文还描述了一种治疗个体的癌症的方法,其包括向所述个体施用治疗有效量的所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或所述药物组合物。在一些实施方案中,所述癌症包括胶质母细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肾癌、头颈癌、卵巢癌、皮肤癌、胃癌、间皮瘤、肝癌、子宫内膜癌、结肠癌、宫颈癌、前列腺癌或肺癌。本文还描述了一种制备用于降低肿瘤中的胶原蛋白含量的组合物的方法,其包括将所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段与药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂混合。本文还描述了一种制备用于增加肿瘤中的M1巨噬细胞表型和/或减少M2巨噬细胞表型的组合物的方法,其包括将所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段与药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂混合。本文还描述了一种制备用于在个体中减少抑制性粒细胞髓系细胞和/或肿瘤相关巨噬细胞积累的组合物的方法,其包括将所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段与药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂混合。本文还描述了一种制备用于在个体中增加肿瘤中CD4+和/或CD8+T细胞的频率的组合物的方法,其包括将所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段与药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂混合。本文还描述了一种制备用于在个体中增加如通过CD8+T细胞的干扰素γ表达和/或释放所测量的肿瘤中CD8+T细胞的功能的组合物的方法,其包括将所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段与药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂混合。本文还描述了一种制备用于治疗癌症的组合物的方法,其包括将所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段与药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂混合。在一些实施方案中,所述癌症包括胶质母细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肾癌、头颈癌、卵巢癌、皮肤癌、胃癌、间皮瘤、肝癌、子宫内膜癌、结肠癌、宫颈癌、前列腺癌或肺癌。
本文还描述了一种结合骨膜蛋白的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中当与骨膜蛋白结合时,所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段与骨膜蛋白的成束蛋白2(FAS2)结构域结合。在一些实施方案中,所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段与骨膜蛋白(SEQ ID NO:15)的在氨基酸残基276至302之间(并包括氨基酸残基276和302)的任何残基结合。在一些实施方案中,当与骨膜蛋白结合时,所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段与骨膜蛋白(SEQ ID NO:15)的以下残基中的至少一个结合:N276、R284、E288、L287、V295或K302。在一些实施方案中,当与骨膜蛋白结合时,所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段与骨膜蛋白(SEQ ID NO:15)的以下残基中的两个、三个、四个或五个结合:N276、R284、E288、L287、V295或K302。在一些实施方案中,当与骨膜蛋白结合时,所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段与骨膜蛋白(SEQ ID NO:15)的以下残基中的全部结合:N276、R284、E288、L287、V295或K302。在一些实施方案中,所述抗体或所述抗体的抗原结合片段包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区:其中所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列至少约90%、95%、97%、99%、或100%相同的氨基酸序列;并且其中所述免疫球蛋白轻链可变区包含与SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列至少约90%、95%、97%、99%、或100%相同的氨基酸序列,其中SEQ IDNO:13的氨基酸残基编号55是天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸或天冬氨酸,并且其中SEQ ID NO:13的氨基酸残基编号100是甲硫氨酸、异亮氨酸或缬氨酸。在一些实施方案中,所述抗体或所述抗体的抗原结合片段包含:免疫球蛋白重链CDR1(CDR-H1),其包含SEQ IDNO:1(GYTFTSYG)中所示的氨基酸序列;免疫球蛋白重链CDR2(CDR-H2),其包含SEQ ID NO:2(ISAYNGNT)、3(ISAYSGNT)、4(ISAYQGNT)、5(ISAYTGNT)或6(ISAYDGNT)中任一个中所示的氨基酸序列;免疫球蛋白重链CDR3(CDR-H3),其包含SEQ ID NO:7(DILVVPFDY)、8(DVLVVPFDY)或9(DMLVVPFDY)中任一个中所示的氨基酸序列;免疫球蛋白轻链CDR1(CDR-L1),其包含SEQID NO:10(SSDIGSNR)中所示的氨基酸序列;免疫球蛋白轻链CDR2(CDR-L2),其包含SEQ IDNO:11(SND)中所示的氨基酸序列;以及免疫球蛋白轻链CDR3(CDR-L3),其包含SEQ ID NO:12(AAWDDSLSTYV)中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中,在用人肺成纤维细胞和/或小鼠成纤维细胞进行的细胞粘附测定中,所述抗体具有小于约50纳摩尔的IC50。本文还描述了一种药物组合物,其包含所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。在一些实施方案中,所述药物组合物被配制用于静脉内施用。在一些实施方案中,所述药物组合物被配制用于皮下施用。在一些实施方案中,所述药物组合物被配制用于瘤内施用。本文还描述了用于在降低肿瘤中的胶原蛋白含量中使用的所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或所述药物组合物。在一些实施方案中,所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或所述药物组合物用于在治疗癌症中使用。在一些实施方案中,所述癌症包括胶质母细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肾癌、头颈癌、卵巢癌、皮肤癌、胃癌、间皮瘤、肝癌、子宫内膜癌、结肠癌、宫颈癌、前列腺癌或肺癌。本文还描述了一种在个体中降低肿瘤中的胶原蛋白含量的方法,其包括向所述个体施用所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或所述药物组合物。本文还描述了一种在个体中增加肿瘤中的M1巨噬细胞表型和/或减少M2巨噬细胞表型的方法,其包括向所述个体施用所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或所述药物组合物。本文还描述了一种在个体中减少抑制性粒细胞髓系细胞和/或肿瘤相关巨噬细胞积累的方法,其包括向所述个体施用所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或所述药物组合物。本文还描述了一种在个体中增加肿瘤中CD4+和/或CD8+T细胞的频率的方法,其包括向所述个体施用所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或所述药物组合物。本文还描述了一种在个体中增加如通过CD8+T细胞的干扰素γ表达和/或释放所测量的肿瘤中CD8+T细胞的功能的方法,其包括向所述个体施用所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或所述药物组合物。本文还描述了一种治疗个体的癌症的方法,其包括向所述个体施用治疗有效量的所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或所述药物组合物。在一些实施方案中,所述癌症包括胶质母细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肾癌、头颈癌、卵巢癌、皮肤癌、胃癌、间皮瘤、肝癌、子宫内膜癌、结肠癌、宫颈癌、前列腺癌或肺癌。本文还描述了一种制备用于降低肿瘤中的胶原蛋白含量的组合物的方法,其包括将所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段与药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂混合。本文还描述了一种制备用于增加肿瘤中的M1巨噬细胞表型和/或减少M2巨噬细胞表型的组合物的方法,其包括将所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段与药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂混合。本文还描述了一种制备用于在个体中减少抑制性粒细胞髓系细胞和/或肿瘤相关巨噬细胞积累的组合物的方法,其包括将所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段与药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂混合。本文还描述了一种制备用于增加个体的肿瘤中CD4+和/或CD8+T细胞的频率的组合物的方法,其包括将所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段与药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂混合。本文还描述了一种制备用于在个体中增加如通过CD8+T细胞的干扰素γ表达和/或释放所测量的肿瘤中CD8+T细胞的功能的组合物的方法,其包括将所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段与药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂混合。本文还描述了一种制备用于治疗癌症的组合物的方法,其包括将所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段与药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂混合。在一些实施方案中,所述癌症包括胶质母细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肾癌、头颈癌、卵巢癌、皮肤癌、胃癌、间皮瘤、肝癌、子宫内膜癌、结肠癌、宫颈癌、前列腺癌或肺癌。
本文还描述了一种核酸,其编码上述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段中的任一种。
本文还描述了一种细胞系,其包含上述核酸。在一些实施方案中,所述细胞系是中国仓鼠卵巢细胞系。本文还描述了一种产生所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段的方法,其包括将所述细胞系在细胞培养基中在足以允许表达和分泌所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段中的任一种的条件下孵育。
附图说明
本文所述的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。通过参考阐述其中利用了本文所述特征原理的说明性实施例的以下具体实施方式和附图将更好地理解本文所述的特征和特征优点,在所述附图中:
图1展示了在500nM的单一浓度下测试的78种序列独特的IgG对骨膜蛋白(POSTN)介导的细胞附着的抑制。
图2展示了用NB0828或媒介物对照治疗后,小鼠MB49膀胱癌模型中的肿瘤生长。
图3展示了NB0828治疗对瘤内髓系细胞积累的影响。将携带MB49肿瘤的小鼠如图2中所述那样用NB0828或媒介物治疗。数据呈现为总CD45+免疫浸润物的百分比。
图4展示了用NB0828治疗后,总肿瘤胶原蛋白含量的变化。将携带MB49肿瘤的小鼠如图2中所述那样治疗,并且如方法中所述那样评估终点MB49肿瘤的总肿瘤胶原蛋白含量。
图5展示了用NB0828或媒介物对照治疗后,小鼠CT26结肠癌模型中的肿瘤生长。
图6展示了在NB0828治疗的携带CT26肿瘤的小鼠中粒细胞/TAM(肿瘤相关巨噬细胞)的减少的瘤内积累和巨噬细胞向M1表型的偏斜。
图7展示了在NB0828治疗的携带CT26肿瘤的小鼠中CD8+和CD4+肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的增加的积累和增强的CD8+TIL功能。
图8展示了用NB0828或媒介物对照治疗后,小鼠MC38结肠癌模型中的肿瘤生长。
图9A至图9D说明,在MC38结肠癌模型中,NB0828减少了肿瘤相关巨噬细胞的总量(9A),同时增加了促炎性I型巨噬细胞(9B)和CD8+T细胞(9C)的频率,并且NB0828肿瘤功效依赖于CD8+T细胞(9D)。
图10展示了用于产生用于表位作图研究的转化生长因子β诱导蛋白(BIGH3)/骨膜蛋白嵌合体的示意图。
图11A至图11C展示了NB0828与骨膜蛋白FAS2结构域的结合。11A展示了NB0828与图10中产生的嵌合蛋白的结合,而图11B和图11C展示了NB0828与POSTN EMI-FAS4的FAS2结构域中的丙氨酸突变的结合。
图12展示了二聚POSTN EMI-FAS4的晶体结构,其中NB0828表位的位置被加框并且在下半区中进行放大。
图13A和图13B展示了人腱生蛋白C与骨膜蛋白的结合EC80和NB0828功能阻断活性(13A)、以及人I型胶原蛋白与骨膜蛋白的结合EC80和NB0828功能阻断活性(13B)。
图14A描绘了如通过免疫组织化学所测量的各种肿瘤类型中骨膜蛋白表达的现况。
图14B示出了在骨膜蛋白低、中和高表达乳腺癌样品上IHC染色的代表性描绘。
具体实施方式
本文描述了结合骨膜蛋白的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中所述抗体或所述抗体的抗原结合片段包含:(a)免疫球蛋白重链CDR1(CDR-H1),其包含SEQ IDNO:1(GYTFTSYG)中所示的氨基酸序列;(b)免疫球蛋白重链CDR2(CDR-H2),其包含SEQ IDNO:2(ISAYNGNT)、3(ISAYSGNT)、4(ISAYQGNT)、5(ISAYTGNT)或6(ISAYDGNT)中任一个中所示的氨基酸序列;(c)免疫球蛋白重链CDR3(CDR-H3),其包含SEQ ID NO:7(DILVVPFDY)、8(DVLVVPFDY)或9(DMLVVPFDY)中任一个中所示的氨基酸序列;(d)免疫球蛋白轻链CDR1(CDR-L1),其包含SEQ ID NO:10(SSDIGSNR)中所示的氨基酸序列;(e)免疫球蛋白轻链CDR2(CDR-L2),其包含SEQ ID NO:11(SND)中所示的氨基酸序列;以及(f)免疫球蛋白轻链CDR3(CDR-L3),其包含SEQ ID NO:12(AAWDDSLSTYV)中所示的氨基酸序列。
本文描述了结合骨膜蛋白的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中所述抗体或所述抗体的抗原结合片段包含以下中的任何一个、两个、三个、四个、五个或六个:(a)免疫球蛋白重链CDR1(CDR-H1),其包含SEQ ID NO:1(GYTFTSYG)中所示的氨基酸序列;(b)免疫球蛋白重链CDR2(CDR-H2),其包含SEQ ID NO:16(ISAYXGNT)中所示的氨基酸序列;(c)免疫球蛋白重链CDR3(CDR-H3),其包含SEQ ID NO:17(DXLVVPFDY)中所示的氨基酸序列;(d)免疫球蛋白轻链CDR1(CDR-L1),其包含SEQ ID NO:10(SSDIGSNR)中所示的氨基酸序列;(e)免疫球蛋白轻链CDR2(CDR-L2),其包含SEQ ID NO:11(SND)中所示的氨基酸序列;以及(f)免疫球蛋白轻链CDR3(CDR-L3),其包含SEQ ID NO:12(AAWDDSLSTYV)中所示的氨基酸序列,其中X是任何氨基酸残基。
本文描述了结合骨膜蛋白的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区:(a)其中所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列至少约90%、95%、97%、99%、或100%相同的氨基酸序列;并且(b)其中所述免疫球蛋白轻链可变区包含与SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列至少约90%、95%、97%、99%、或100%相同的氨基酸序列;其中SEQ ID NO:13的氨基酸残基编号55是天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸或天冬氨酸,或者其中SEQ ID NO:13的氨基酸残基编号100是甲硫氨酸、异亮氨酸或缬氨酸。
本文描述了结合骨膜蛋白的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区:(a)其中所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列至少约90%、95%、97%、99%、或100%相同的氨基酸序列;并且(b)其中所述免疫球蛋白轻链可变区包含与SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列至少约90%、95%、97%、99%、或100%相同的氨基酸序列。
本文描述了结合骨膜蛋白的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区:(a)其中所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列相同的氨基酸序列;并且(b)其中所述免疫球蛋白轻链可变区包含与SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
本文描述了与骨膜蛋白的成束蛋白2(FAS2)结构域结合的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段。在某些实施方案中,所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段在与骨膜蛋白结合时接触选自SEQ ID NO:15的氨基酸276至302的氨基酸残基。在某些实施方案中,所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段在与骨膜蛋白结合时接触SEQ ID NO:15的以下氨基酸残基之一:N276、R284、E288、L287、V295或K302。
在以下描述中,阐述了某些具体细节以便提供对各种实施方案的透彻理解。然而,本领域技术人员将理解,所提供的实施方案可以在没有这些细节的情况下实践。除非上下文另外要求,否则在整个说明书和随后的权利要求中,词语“包含(comprise)”及其变体如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”应以开放、包含性的含义解释,即“包括但不限于”。除非上下文另外明确规定,否则如在本说明书和所附权利要求中所用的,单数形式“一种/一个(a)”、“一种/一个(an)”和“所述”包括复数指示物。还应当注意,除非内容另外明确规定,否则术语“或”通常以其包括“和/或”的含义使用。此外,本文提供的标题仅是为了方便,并且不解释所要求保护的实施方案的范围或含义。
如本文所用,术语“约”是指在所述量附近10%或更少的量。
如本文所用,术语“个体”、“患者”或“受试者”是指被诊断患有、怀疑患有或有风险患上所述组合物和方法可用于治疗的至少一种疾病的个体。在某些实施方案中,个体是哺乳动物。在某些实施方案中,哺乳动物是小鼠、大鼠、兔、狗、猫、马、牛、绵羊、猪、山羊、美洲驼、羊驼或牦牛。在某些实施方案中,个体是人。
如本文所用,术语“治疗(treat)”或“治疗(treating)”是指对个体的生理或疾病状态的干预,所述干预被设计为或旨在减轻与所述生理或疾病状态相关的至少一种体征或症状。熟练技术人员将认识到,鉴于患有疾病的个体的异质群体,并非所有个体都将对给定的治疗有等同或完全反应。不管任何客观反应标准如何,个体都被认为是被治疗的。
所提供的抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如,双特异性抗体和多反应性抗体)和抗体片段。抗体包括抗体缀合物和包含抗体的分子(如嵌合分子)。因此,抗体包括但不限于全长和天然抗体,以及保留其结合特异性的其片段和部分,如其任何特异性结合部分,包括具有任何数量的免疫球蛋白类别和/或同种型(例如,IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE和IgM)的那些;及其生物学相关(抗原结合)片段或特异性结合部分,包括但不限于Fab、F(ab')2、Fv和scFv(单链或相关实体)。单克隆抗体通常是基本上同质抗体的组合物内的一种;因此,除了可能以少量存在的可能天然存在的突变之外,单克隆抗体组合物内包含的任何单独抗体都是相同的。多克隆抗体是包括通常针对两种或更多种不同决定簇(表位)的变化序列的不同抗体的制剂。单克隆抗体可以包含人IgG1恒定区。单克隆抗体可以包含人IgG4恒定区。
本文的术语“抗体”是以最广泛的含义使用,并且包括多克隆和单克隆抗体,包括完整抗体及其功能性(抗原结合)抗体片段,包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、单链抗体片段(包括单链可变片段(sFv或scFv))和单结构域抗体(例如,sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。所述术语涵盖免疫球蛋白的基因工程化和/或以其他方式修饰的形式,如胞内抗体、肽抗体、嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体和异源缀合抗体、多特异性(例如,双特异性)抗体、双抗体、三抗体和四抗体、串联二scFv、串联三scFv。除非另外说明,否则术语“抗体”应当理解为涵盖其功能性抗体片段。所述术语还涵盖完整或全长抗体,包括任何类别或亚类(包括IgG及其亚类、IgM、IgE、IgA和IgD)的抗体。抗体可以包含人IgG1恒定区。抗体可以包含人IgG4恒定区。
术语“互补决定区”和“CDR”(其与“高变区”或“HVR”同义)在本领域中已知是指抗体可变区内的氨基酸的非连续序列,其赋予抗原特异性和/或结合亲和力。通常,在每个重链可变区中有三个CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3),并且在每个轻链可变区中有三个CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。“框架区”和“FR”在本领域中已知是指重链和轻链的可变区的非CDR部分。通常,在每个全长重链可变区中有四个FR(FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4),并且在每个全长轻链可变区中有四个FR(FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4)。给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界可以使用许多熟知方案中的任一种容易地确定,所述方案包括以下文献中所述的那些:Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”第5版Public Health Service,National Institutes of Health,贝塞斯达,马里兰州(“Kabat”编号方案);Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案);MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996),“Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding site topography,”J.Mol.Biol.262,732-745.(“Contact”编号方案);Lefranc MP等人,“IMGT unique numbering for immunoglobulinand T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains,”DevComp Immunol,2003年1月;27(1):55-77(“IMGT”编号方案);Honegger A和Plückthun A,“Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains:anautomatic modeling and analysis tool,”J Mol Biol,2001年6月8号;309(3):657-70(“Aho”编号方案);以及Whitelegg NR和Rees AR,“WAM:an improved algorithm formodelling antibodies on the WEB,”Protein Eng.2000年12月;13(12):819-24(“AbM”编号方案)。
给定CDR或FR的边界可能根据用于鉴定的方案而变化。例如,Kabat方案是基于结构比对,而Chothia方案是基于结构信息。Kabat和Chothia方案的编号都是基于最常见的抗体区序列长度,其中通过插入字母(例如,“30a”)提供插入,并且在一些抗体中出现缺失。这两种方案将某些插入和缺失(“插入缺失(indel)”)放置在不同的位置,从而产生不同的编号。Contact方案是基于对复杂晶体结构的分析,并且在许多方面与Chothia编号方案相似。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构,其中每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个CDR(参见例如,Kindt等人Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007))。单个VH或VL结构域可以足以赋予抗原结合特异性。此外,可以使用来自结合特定抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合所述抗原的抗体,以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库(参见例如,Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993);Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991))。
所提供的抗体包括抗体片段。“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子,其包含完整抗体的结合完整抗体所结合的抗原的部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2;双抗体;线性抗体;单链抗体分子(例如,scFv或sFv);和从抗体片段形成的多特异性抗体。在特定实施方案中,抗体是包含可变重链区和/或可变轻链区的单链抗体片段,如scFv。
当在本文中使用时,术语“特异性结合”或“结合”是指由提及的抗体或片段的CDR的一个或多个氨基酸残基、或提及的抗体或片段的一个或多个可变区氨基酸残基介导的结合。如本文所用,关于抗体结合或与特定靶标结合的术语“接触(contact)”或“接触(contacts)”是指可变区或CDR的氨基酸残基在所叙述接触残基的5、4、3或更少埃的范围内。接触包括抗体的可变区或CDR的氨基酸残基与所叙述残基之间的氢键合、范德瓦尔斯相互作用以及盐桥形成。
抗体片段可以通过各种技术制备,所述技术包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞产生。在一些实施方案中,抗体是重组产生的片段,如包含不天然存在的排列的片段(如具有通过合成接头(例如,多肽接头)连接的两个或更多个抗体区或链的那些),和/或不通过酶消化天然存在的完整抗体产生的那些。在一些方面,抗体片段是scFv。
“人源化”抗体是这样的抗体,其中全部或基本上全部CDR氨基酸残基来源于非人CDR,并且全部或基本上全部FR氨基酸残基来源于人FR。人源化抗体任选地可以包括来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。非人抗体的“人源化形式”是指非人抗体的变体,其经历人源化以通常降低对人的免疫原性,同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。在一些实施方案中,人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如,CDR残基所来源的抗体)的相应残基取代,例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
所提供的抗体包括人抗体。“人抗体”是具有与由人或人细胞或者非人来源产生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体,所述非人来源利用人抗体库或其他人抗体编码序列(包括人抗体文库)。所述术语不包括包含非人抗原结合区的非人抗体的人源化形式,例如其中全部或基本上全部CDR是非人CDR的那些。
人抗体可以通过将免疫原施用至转基因动物来制备,所述转基因动物已经被修饰以响应于抗原激发而产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座,其替代内源免疫球蛋白基因座,或者其在染色体外存在或随机整合到动物的染色体中。在此类转基因动物中,通常已经使内源性免疫球蛋白基因座失活。人抗体也可以来源于或选自人抗体文库,包括噬菌体展示和无细胞文库,其含有来源于人库的抗体编码序列。在某些实施方案中,人抗体可以通过经由诸如噬菌体展示等方法进行连续轮次的选择来去除序列易感性或增加其亲和力。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换地用于指氨基酸残基的聚合物,并且不限于最小长度。多肽(包括所提供的抗体和抗体链以及其他肽(例如,接头和结合肽))可以包括含有天然和/或非天然氨基酸残基的氨基酸残基。所述术语还包括多肽的表达后修饰,例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。在一些方面,多肽可以含有关于原生或天然序列的修饰,只要蛋白质保持所需活性即可。这些修饰可能是故意的(如通过定点诱变),或者可能是偶然的(如通过产生蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增引起的错误)。
在某些实施方案中,本文提供了具有降低的效应子功能的抗体。如本文所用,短语“效应子功能”旨在包括由含Fc的蛋白质在与FcγR结合时所赋予的功能性能力。不受任何一种理论的束缚,Fc/FcγR复合物的形成将多种效应细胞募集至结合抗原的位点,通常导致细胞内不同的信号传导事件和重要的后续免疫应答。效应子功能是指抗体依赖性细胞毒性和补体依赖性细胞毒性两者。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消耗。例如,可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺少FcγR结合(因此可能缺少ADCC活性),但是保留FcRn结合能力。用于评估目的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性例子描述于美国专利号5,500,362和5,821,337中。可替代地,可以采用非放射性测定方法(例如,ACTITM和CytoTox非放射性细胞毒性测定)。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)、单核细胞、巨噬细胞和自然杀伤(NK)细胞。
关于参考多肽序列的序列同一性百分比(%)是在用以实现最大序列同一性百分比而比对序列和引入缺口(如果需要)并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分后,候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以多种已知方式来实现,例如使用可公开获得的计算机软件,如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。能够确定用于比对序列的适当参数,包括在所比较序列的全长上实现最大比对所需的算法。然而,出于本文的目的,使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸序列同一性%值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写,并且源代码已经以用户文档提交在美国版权局(U.S.CopyrightOffice),华盛顿,20559中,其中它在美国版权登记号TXU510087下进行了注册。ALIGN-2程序可从加利福尼亚州南旧金山的Genentech,Inc.公开获得,或者可以从源代码编译。应当编译ALIGN-2程序以在UNIX操作系统(包括数字UNIX V4.0D)上使用。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置,并且不改变。
在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下,给定氨基酸序列A与(to、with或against)给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性%(其可替代地可以用短语表示为与(to、with或against)给定氨基酸序列B具有或包含一定氨基酸序列同一性%的给定氨基酸序列A)如下计算:100乘以分数X/Y,其中X是通过序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B的比对中作为相同匹配得分的氨基酸残基数,并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。将理解的是,在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下,A与B的氨基酸序列同一性%将不等于B与A的氨基酸序列同一性%。除非另外明确说明,否则本文所用的全部氨基酸序列同一性%值如紧接上一段中所述那样使用ALIGN-2计算机程序获得。
在一些实施方案中,考虑了本文提供的抗体的氨基酸序列变体。变体通常与本文明确公开的多肽相差一个或多个取代、缺失、添加和/或插入。此类变体可以是天然存在的或可以是合成产生的,例如通过修饰本发明的以上多肽序列中的一个或多个并且评价如本文所述的多肽的一种或多种生物活性,和/或使用许多已知技术中的任一种。例如,可能需要改善抗体的结合亲和力和/或其他生物特性。可以通过向编码抗体的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如抗体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以获得最终的构建体,条件是最终的构建体具有所需的特征(例如,抗原结合)。
在一些实施方案中,提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。用于通过取代进行诱变的目的位点包括CDR和FR。可以将氨基酸取代引入目的抗体中,并且筛选产物的所需活性,例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC。
在一些实施方案中,取代、插入或缺失可以发生在一个或多个CDR内,其中取代、插入或缺失基本上不降低抗体与抗原的结合。例如,可以在CDR中进行基本上不降低结合亲和力的保守取代。此类改变可以在CDR“热点”之外。在变体VH和VL序列的一些实施方案中,每个CDR是未改变的。
可以在CDR中进行改变(例如,取代),例如以改善抗体亲和力。此类改变可以在体细胞成熟期间以较高的突变率在CDR编码密码子中进行(参见例如,Chowdhury,MethodsMol.Biol.207:179-196(2008)),并且可以测试所得变体的结合亲和力。亲和力成熟(例如,使用易错PCR、链改组、CDR的随机化或寡核苷酸定向诱变)可以用于改善抗体亲和力(参见例如,Hoogenboom等人于Methods in Molecular Biology 178:1-37(2001))。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性地鉴定参与抗原结合的CDR残基(参见例如,Cunningham和Wells Science,244:1081-1085(1989))。特别地,通常靶向CDR-H3和CDR-L3。可替代地或另外地,抗原-抗体复合物的晶体结构用于鉴定抗体和抗原之间的接触点。可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基作为取代候选物。可以筛选变体以确定它们是否含有所需的特性。
氨基酸序列插入和缺失包括长度范围从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合、以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入和缺失。末端插入的例子包括具有N末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括将抗体的N末端或C末端与酶(例如,用于ADEPT)或增加抗体的血清半衰期的多肽融合。抗体分子的序列内插入变体的例子包括在轻链中插入3个氨基酸。末端缺失的例子包括在轻链末端具有7个或更少氨基酸缺失的抗体。
在一些实施方案中,改变抗体以增加或减少其糖基化(例如,通过改变氨基酸序列使得产生或去除一个或多个糖基化位点)。可以改变附接至抗体Fc区的碳水化合物。来自哺乳动物细胞的天然抗体通常包含支链二天线寡糖,其通过N键联附接至Fc区CH2结构域的Asn297(参见例如,Wright等人TIBTECH 15:26-32(1997))。寡糖可以是各种碳水化合物,例如甘露糖、N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖、唾液酸、附接至二天线寡糖结构的茎中GlcNAc的岩藻糖。例如,可以对抗体中的寡糖进行修饰,以产生具有某些改善特性的抗体变体。抗体糖基化变体可以具有改善的ADCC和/或CDC功能。在一些实施方案中,提供了抗体变体,其具有缺少(直接或间接)附接至Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如,这种抗体中岩藻糖的量可以为1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。岩藻糖的量通过以下方式来确定:相对于附接至Asn297的所有糖结构的总和,计算在Asn297处糖链内的岩藻糖的平均量(参见例如WO 08/077546)。Asn297是指位于Fc区中约第297位的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号;参见例如,Edelman等人Proc Natl Acad Sci U S A.1969年5月;63(1):78–85)。然而,由于抗体中的微小序列变异,Asn297也可以位于第297位上游或下游约±3个氨基酸,即在第294位与第300位之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能(参见例如,Okazaki等人J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004);以及Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614(2004))。可以使用细胞系(例如,敲除细胞系)及其使用方法来产生去岩藻糖基化抗体,例如缺乏蛋白质岩藻糖基化的Lec13 CHO细胞和α-1,6-岩藻糖基转移酶基因(FUT8)敲除CHO细胞(参见例如,Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986);Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614(2004);Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006))。还包括其他抗体糖基化变体(参见例如美国专利号6,602,684)。
在一些实施方案中,可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文所提供的抗体的Fc区中,从而产生Fc区变体。本文的Fc区是免疫球蛋白重链的含有恒定区的至少一部分的C末端区。Fc区包括天然序列Fc区和变体Fc区。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如,取代)的人Fc区序列(例如,人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。
抗体可以具有增加的半衰期和改善的与新生儿Fc受体(FcRn)的结合(参见例如US2005/0014934)。此类抗体可以包含在其中具有改善Fc区与FcRn的结合的一个或多个取代的Fc区,并且包括在以下Fc区残基中的一个或多个处具有取代的那些:根据EU编号系统的238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434(参见例如美国专利号7,371,826)。还考虑了Fc区变体的其他例子(参见例如,Duncan和Winter,Nature 322:738-40(1988);美国专利号5,648,260和5,624,821;以及WO 94/29351)。
在一些实施方案中,可能需要产生半胱氨酸工程化的抗体,例如“thioMAb”,其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在一些实施方案中,被取代的残基存在于抗体的可及位点处。反应性硫醇基团可以定位于用于与其他部分(如药物部分或接头药物部分)缀合以产生免疫缀合物的位点处。在一些实施方案中,可以用半胱氨酸取代以下残基中的任何一个或多个:轻链的V205(Kabat编号);重链的A118(EU编号);和重链Fc区的S400(EU编号)。
在一些实施方案中,本文提供的抗体可以进一步被修饰以含有已知且可用的另外的非蛋白质部分。适合于衍生化抗体的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)、和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如,甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而可以在制造中具有优势。聚合物可以具有任何分子量,并且可以是有支链或无支链的。附接至抗体的聚合物的数量可以变化,并且如果附接两种或更多种聚合物,则它们可以是相同或不同的分子。
本文所述的抗体可以由核酸编码。核酸是一种类型的包含两个或更多个核苷酸碱基的多核苷酸。在某些实施方案中,核酸是可以用于将多肽编码多核苷酸转移到细胞中的载体的组分。如本文所用,术语“载体”是指能够转运与它连接的另一个核酸的核酸分子。一种类型的载体是基因组整合载体或“整合载体”,其可以被整合到宿主细胞的染色体DNA中。另一种类型的载体是“附加型”载体,例如能够进行染色体外复制的核酸。能够指导它们可操作地连接的基因的表达的载体在本文中称为“表达载体”。合适的载体包括质粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、病毒载体等。在表达载体中,用于控制转录的调节元件如启动子、增强子、聚腺苷酸化信号可以来源于哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因。也可以另外掺入在宿主中复制的能力(通常由复制起点赋予)以及有利于转化体识别的选择基因。可以采用来源于病毒如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等的载体。可以将质粒载体线性化以整合到染色体位置中。载体可以包含将位点特异性整合指导到基因组中的限定位置或一组受限制位点的序列(例如,AttP-AttB重组)。另外地,载体可以包含来源于可转座元件的序列。
如本文所用,术语“同源的”、“同源性”或“同源性百分比”当在本文中用于相对于参考序列描述氨基酸序列或核酸序列时可以使用由以下描述的公式来确定:Karlin和Altschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268,1990,如在Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877,1993中那样修改)。这种公式被并入Altschul等人(J.Mol.Biol.215:403-410,1990)的基本局部比对搜索工具(BLAST)程序中。可以使用截至本申请提交日最新版本的BLAST来确定序列的同源性百分比。
编码本文所述的抗体的核酸可以用于感染、转染、转化合适的细胞或以其他方式使合适的细胞是核酸转基因的,从而使得能够产生用于商业或治疗用途的抗体。用于从大规模细胞培养中产生抗体的标准细胞系和方法是本领域已知的。参见例如,Li等人,“Cellculture processes for monoclonal antibody production.”Mabs.2010年9月-10月;2(5):466–477。在某些实施方案中,细胞是真核细胞。在某些实施方案中,真核细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中,哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞、NS0鼠骨髓瘤细胞或细胞。在某些实施方案中,将编码抗体的核酸整合到可用于产生抗体的细胞的基因组基因座中。在某些实施方案中,本文描述了制备抗体的方法,其包括将包含编码抗体的核酸的细胞在足以允许产生和分泌所述抗体的条件下在体外培养。
在某些实施方案中,本文描述了主细胞库,其包含:(a)哺乳动物细胞系,其包含整合在基因组位置处的编码本文所述抗体的一种或多种核酸;和(b)冷冻保护剂。在某些实施方案中,冷冻保护剂包含甘油、DMSO或其组合。在某些实施方案中,主细胞库包含:(a)CHO细胞系,其包含整合在基因组位置处的编码抗体的核酸,所述抗体具有(i)与由SEQ ID NO:13所示的重链氨基酸序列至少90%相同的重链氨基酸序列;(ii)与由SEQ ID NO:14所示的轻链氨基酸序列至少90%相同的轻链氨基酸序列;以及(b)冷冻保护剂。在某些实施方案中,冷冻保护剂包含甘油、DMSO或其组合。在某些实施方案中,将主细胞库包含在能够承受液氮冷冻的合适的小瓶或容器中。
本文还描述了制备本文所述的抗体的方法。此类方法包括将包含编码抗体的核酸的细胞或细胞系在细胞培养基中在足以允许抗体表达和分泌的条件下孵育,以及进一步从细胞培养基中收获抗体。所述收获可以还包括一个或多个纯化步骤以去除活细胞、细胞碎片、非抗体蛋白或多肽、不希望的盐、缓冲液和培养基组分。在某些实施方案中,一个或多个另外的纯化步骤包括离心、超速离心、渗析、脱盐、蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或蛋白L纯化、和/或离子交换色谱。
抗骨膜蛋白抗体
本文描述了抑制骨膜蛋白(POSTN)功能的抗体。此类抗体可用于治疗癌症。本文所述的抗体降低了肿瘤的胶原蛋白含量,减少了粒细胞和肿瘤相关巨噬细胞的浸润同时增加了巨噬细胞向M1表型的极化,并且增加了肿瘤浸润T细胞的积累和抗肿瘤特性。在某些实施方案中,与未治疗或对照治疗相比,所述抗骨膜蛋白抗体将肿瘤胶原蛋白含量降低至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%或40%。在某些实施方案中,与未治疗或对照治疗相比,所述抗骨膜蛋白抗体将粒细胞和肿瘤相关巨噬细胞的浸润减少至少约20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%。在某些实施方案中,与未治疗或对照治疗相比,所述抗骨膜蛋白抗体将CD11b+细胞的浸润减少至少约20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%。在某些实施方案中,与未治疗或对照治疗相比,所述抗骨膜蛋白抗体将肿瘤相关巨噬细胞向M1型(CD11b+、MHC II类+、CD206-)的极化增加至少约20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%。在某些实施方案中,与未治疗或对照治疗相比,所述抗骨膜蛋白抗体将肿瘤中CD4+和/或CD8+T细胞的积累增加至少约20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%。在某些实施方案中,与未治疗或对照治疗相比,所述抗骨膜蛋白抗体将肿瘤浸润CD8+T细胞的干扰素γ的产生增加至少约20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%。
本文描述了结合骨膜蛋白的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中所述抗体或所述抗体的抗原结合片段包含:(a)免疫球蛋白重链CDR1(CDR-H1),其包含SEQ IDNO:1(GYTFTSYG)中所示的氨基酸序列;(b)免疫球蛋白重链CDR2(CDR-H2),其包含SEQ IDNO:16(ISAYXGNT)中所示的氨基酸序列;(c)免疫球蛋白重链CDR3(CDR-H3),其包含SEQ IDNO:17(DXLVVPFDY)中所示的氨基酸序列;(d)免疫球蛋白轻链CDR1(CDR-L1),其包含SEQ IDNO:10(SSDIGSNR)中所示的氨基酸序列;(e)免疫球蛋白轻链CDR2(CDR-L2),其包含SEQ IDNO:11(SND)中所示的氨基酸序列;或(f)免疫球蛋白轻链CDR3(CDR-L3),其包含SEQ ID NO:12(AAWDDSLSTYV)中所示的氨基酸序列;其中X是任何氨基酸。
本文描述了结合骨膜蛋白的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中所述抗体或所述抗体的抗原结合片段包含选自以下的任何一个、两个、三个、四个或五个互补决定区:(a)免疫球蛋白重链CDR1(CDR-H1),其包含SEQ ID NO:1(GYTFTSYG)中所示的氨基酸序列;(b)免疫球蛋白重链CDR2(CDR-H2),其包含SEQ ID NO:16(ISAYXGNT)中所示的氨基酸序列;(c)免疫球蛋白重链CDR3(CDR-H3),其包含SEQ ID NO:17(DXLVVPFDY)中所示的氨基酸序列;(d)免疫球蛋白轻链CDR1(CDR-L1),其包含SEQ ID NO:10(SSDIGSNR)中所示的氨基酸序列;(e)免疫球蛋白轻链CDR2(CDR-L2),其包含SEQ ID NO:11(SND)中所示的氨基酸序列;以及(f)免疫球蛋白轻链CDR3(CDR-L3),其包含SEQ ID NO:12(AAWDDSLSTYV)中所示的氨基酸序列;其中X是任何氨基酸。
本文描述了结合骨膜蛋白的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中所述抗体或所述抗体的抗原结合片段包含:(a)免疫球蛋白重链CDR1(CDR-H1),其包含SEQ IDNO:1(GYTFTSYG)中所示的氨基酸序列;(b)免疫球蛋白重链CDR2(CDR-H2),其包含SEQ IDNO:2(ISAYNGNT)、3(ISAYSGNT)、4(ISAYQGNT)、5(ISAYTGNT)或6(ISAYDGNT)中任一个中所示的氨基酸序列;(c)免疫球蛋白重链CDR3(CDR-H3),其包含SEQ ID NO:7(DILVVPFDY)、8(DVLVVPFDY)或9(DMLVVPFDY)中任一个中所示的氨基酸序列;(d)免疫球蛋白轻链CDR1(CDR-L1),其包含SEQ ID NO:10(SSDIGSNR)中所示的氨基酸序列;(e)免疫球蛋白轻链CDR2(CDR-L2),其包含SEQ ID NO:11(SND)中所示的氨基酸序列;以及(f)免疫球蛋白轻链CDR3(CDR-L3),其包含SEQ ID NO:12(AAWDDSLSTYV)中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中,所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在某些实施方案中,所述抗体是IgG抗体。在某些实施方案中,本文所述的抗体可以包含具有缺少或降低的效应子功能的Fc部分。在某些实施方案中,在用人肺成纤维细胞和/或小鼠成纤维细胞进行的细胞粘附测定中,所述抗体具有小于约50纳摩尔的IC50。在某些实施方案中,在用人肺成纤维细胞和/或小鼠成纤维细胞进行的细胞粘附测定中,所述抗体具有小于约40纳摩尔的IC50。在某些实施方案中,在用人肺成纤维细胞和/或小鼠成纤维细胞进行的细胞粘附测定中,所述抗体具有小于约30纳摩尔的IC50。
本文还描述了重组抗体或抗原结合片段,其中所述抗体或所述抗体的抗原结合片段包含:(a)免疫球蛋白重链CDR1(CDR-H1),其包含SEQ ID NO:1(GYTFTSYG)中所示的氨基酸序列;(b)免疫球蛋白重链CDR2(CDR-H2),其包含SEQ ID NO:2(ISAYNGNT)中所示的氨基酸序列;(c)免疫球蛋白重链CDR3(CDR-H3),其包含SEQ ID NO:9(DMLVVPFDY)中所示的氨基酸序列;(d)免疫球蛋白轻链CDR1(CDR-L1),其包含SEQ ID NO:10(SSDIGSNR)中所示的氨基酸序列;(e)免疫球蛋白轻链CDR2(CDR-L2),其包含SEQ ID NO:11(SND)中所示的氨基酸序列;以及(f)免疫球蛋白轻链CDR3(CDR-L3),其包含SEQ ID NO:12(AAWDDSLSTYV)中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中,所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在某些实施方案中,所述抗体是IgG抗体。在某些实施方案中,本文所述的抗体可以包含具有缺少或降低的效应子功能的Fc部分。在某些实施方案中,在用人肺成纤维细胞和/或小鼠成纤维细胞进行的细胞粘附测定中,所述抗体具有小于约50纳摩尔的IC50。在某些实施方案中,在用人肺成纤维细胞和/或小鼠成纤维细胞进行的细胞粘附测定中,所述抗体具有小于约40纳摩尔的IC50。在某些实施方案中,在用人肺成纤维细胞和/或小鼠成纤维细胞进行的细胞粘附测定中,所述抗体具有小于约30纳摩尔的IC50。
本文还描述了结合骨膜蛋白的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链:(a)其中所述免疫球蛋白重链包含与SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列至少约90%、95%、97%、99%、或100%相同的氨基酸序列;并且(b)其中所述免疫球蛋白轻链包含与SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列至少约90%、95%、97%、99%、或100%相同的氨基酸序列,其中SEQID NO:13的氨基酸残基编号55是天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸或天冬氨酸,并且其中SEQ ID NO:13的氨基酸残基编号100是甲硫氨酸、异亮氨酸或缬氨酸。在某些实施方案中,所述抗体是IgG抗体。在某些实施方案中,本文所述的抗体可以包含具有缺少或降低的效应子功能的Fc部分。在某些实施方案中,在用人肺成纤维细胞和/或小鼠成纤维细胞进行的细胞粘附测定中,所述抗体具有小于约50纳摩尔的IC50。在某些实施方案中,在用人肺成纤维细胞和/或小鼠成纤维细胞进行的细胞粘附测定中,所述抗体具有小于约40纳摩尔的IC50。在某些实施方案中,在用人肺成纤维细胞和/或小鼠成纤维细胞进行的细胞粘附测定中,所述抗体具有小于约30纳摩尔的IC50。
本文所述的抗体结合区(包括可变区和CDR区)可以适当地格式化为具有降低的效应子功能的抗体的一部分。在某些实施方案中,所述抗体可以是缺少Fc区的F(ab')2。在某些实施方案中,所述抗体可以包含对抗体重链恒定区的一个或多个突变,其降低效应子功能,如抗体依赖性细胞毒性或补体依赖性细胞毒性。在某些实施方案中,所述抗体可以包含IgG4恒定区。在某些实施方案中,降低所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段的一种或多种效应子功能的所述一个或多个突变包括选自以下的突变或突变组:根据EU编号系统的IgG4的N434A、N434H、T307A/E380A/N434A、M252Y/S254T/T256E、433K/434F/436H、T250Q、T250F、M428L、M428F、T250Q/M428L、N434S、V308W、V308Y、V308F、M252Y/M428L、D259I/V308F、M428L/V308F、Q311V/N434S、T307Q/N434A、E258F/V427T、S228P、L235E、S228P/L235E/R409K、S228P/L235E、K370Q、K370E、G446缺失、K447缺失及其任何组合。在某些实施方案中,所述抗体可以包含IgG4恒定区,其具有对应于根据EU编号系统的重链的S228P的突变。在某些实施方案中,所述抗体可以包含IgG4PAA恒定区,其具有对应于根据EU编号系统的重链的S228P、F234A和L235A的突变。参见Parekh等人“Development andvalidation of an antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity-reporter geneassay.”MAbs 2012年5月1日;4(3):310-318。
在一些实施方案中,相对于相应的野生型抗体,本文所述的抗体展现出降低的与Clq的亲和力。在一些实施方案中,抗体展现出的对Clq受体的亲和力与相应的野生型抗体相比低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍。
在一些实施方案中,本文所述的抗体展现出的对Clq的亲和力比相应的野生型抗体对Clq的亲和力低至少90%、至少80%、至少70%、至少60%、至少50%、至少40%、至少30%、至少20%、至少10%或至少5%。在一些实施方案中,本文所述的抗体展现出的对Clq的亲和力在约100nM至约100μΜ、或约100nM至约10μΜ、或约100nM至约1μΜ、或约1nM至约100μΜ、或约10nM至约100μΜ、或约1μΜ至约100μΜ、或约10μΜ至约100μΜ之间。在一些实施方案中,本文所述的抗体展现出的对Clq的亲和力大于1μΜ、大于5μΜ、大于10μΜ、大于25μΜ、大于50μΜ或大于100μΜ。
在一些实施方案中,与相应的野生型Fc抗体相比,本文所述的抗体展现出降低的CDC活性。在一些实施方案中,本文所述的抗体展现出的CDC活性比相应的野生型抗体的CDC活性低至少2倍、或至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍或至少100倍。在一些实施方案中,相对于相应的野生型抗体,本文所述的抗体展现出降低至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少100%、或至少200%、或至少300%、或至少400%、或至少500%的CDC活性。在一些实施方案中,本文所述的抗体不展现出可检测的CDC活性。在一些实施方案中,CDC活性的降低和/或消除可以归因于本文所述的抗体对Fc配体和/或受体的亲和力降低。
在本领域中应理解,生物疗法可能具有不良毒性问题,所述问题与指导免疫系统识别并攻击不想要的细胞和/或靶标的复杂性质相关。当识别和/或靶向攻击不发生在需要治疗的地方时,可能出现诸如不良毒性等后果。例如,非靶向组织的抗体染色可以指示潜在的毒性问题。在一些实施方案中,与相应的野生型抗体相比,本文所述的抗体展现出减少的非靶向组织染色。在一些实施方案中,本文所述的抗体展现出减少的非靶向组织染色,其比相应的野生型抗体的非靶向组织染色低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍。在一些实施方案中,本文所述的抗体展现出减少的非靶向组织染色,其相对于相应的野生型抗体减少至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少100%、或至少200%、或至少300%、或至少400%、或至少500%。
在一些实施方案中,与相应的野生型抗体相比,本文所述的抗体展现出降低的抗体相关毒性。在一些实施方案中,本文所述的抗体展现出的毒性比相应的野生型抗体的毒性低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍。在一些实施方案中,相对于相应的野生型抗体,本文所述的抗体展现出降低至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少100%、或至少200%、或至少300%、或至少400%、或至少500%的毒性。
在本领域中应理解,生物疗法可能具有凝血细胞聚集的不良影响。可以使用体外和体内测定来测量凝血细胞聚集。在一些实施方案中,与相应的野生型抗体相比,本文所述的抗体在体外测定中展现出减少的凝血细胞聚集。在一些实施方案中,本文所述的抗体在体外测定中展现出减少的凝血细胞聚集,其比相应的野生型抗体的凝血细胞聚集低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍。在一些实施方案中,本文所述的抗体在体外测定中展现出减少的凝血细胞聚集,其相对于相应的野生型抗体减少至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少100%、或至少200%、或至少300%、或至少400%、或至少500%。
在一些实施方案中,与相应的野生型抗体相比,本文所述的抗体展现出减少的体内凝血细胞聚集。在一些实施方案中,本文所述的抗体在体内测定中展现出减少的凝血细胞聚集,其比相应的野生型抗体的凝血细胞聚集低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍。在一些实施方案中,本文所述的抗体在体内测定中展现出减少的凝血细胞聚集,其相对于相应的野生型抗体减少至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少100%、或至少200%、或至少300%、或至少400%、或至少500%。
在一些实施方案中,与相应的野生型抗体相比,本文所述的抗体展现出减少的血小板激活和/或血小板聚集。
由治疗上有用的骨膜蛋白抗体结合的表位
本文描述了人骨膜蛋白的独特表位或区域,其在结合时抑制骨膜蛋白的生物活性(例如,整联蛋白介导的细胞附着)并改变肿瘤微环境(胶原蛋白重塑和免疫细胞的变化)。这种结合是抗体CDR氨基酸残基与骨膜蛋白中的氨基酸残基(例如,接触残基)之间的弱(范德瓦尔斯吸引力)、中等(氢键合)和强(盐桥)相互作用的组合。在某些实施方案中,接触残基是骨膜蛋白上的与抗骨膜蛋白抗体上的残基形成氢键的残基。在某些实施方案中,接触残基是骨膜蛋白上的与抗骨膜蛋白抗体上的残基形成盐桥的残基。在某些实施方案中,接触残基是骨膜蛋白上的与抗骨膜蛋白抗体上的残基产生范德瓦尔斯吸引力并且在抗骨膜蛋白抗体上的残基的至少5、4或3埃内的残基。
在某些实施方案中,本文所述的抗骨膜蛋白抗体不与腱生蛋白C或I型胶原蛋白结合。
在某些实施方案中,本文描述了结合骨膜蛋白(SEQ ID NO:15)的以下残基中的任何一个、两个、三个、四个、五个或六个的分离抗体:N276、R284、E288、L287、V295或K302。在某些实施方案中,本文描述了结合SEQ ID NO:15的以下残基中的全部的分离抗体:N276、R284、E288、L287、V295或K302。在某些实施方案中,所述抗体仅结合参与与所述抗体的强或中等相互作用的残基。在某些实施方案中,所述抗体仅结合参与与所述抗体的强相互作用的残基。在一些实施方案中,所述抗体增加了肿瘤部位中CD8+T细胞的干扰素γ表达和/或释放。在一些实施方案中,所述抗体减少了浸润性肿瘤中抑制性粒细胞髓系细胞和/或TAM(肿瘤相关巨噬细胞)的积累。在一些实施方案中,所述抗体在浸润性肿瘤中增加了促炎性M1巨噬细胞表型和/或减少了M2巨噬细胞表型。在一些实施方案中,所述抗体增加了至肿瘤部位的CD8+T细胞,在浸润性肿瘤中减少了TAM并增加了促炎性M1巨噬细胞表型。
在某些实施方案中,本文描述了包含具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中任一个中所示的氨基酸序列的CDR的抗体,其结合SEQ ID NO:15的以下残基中的任何一个、两个、三个、四个、五个或六个:N276、R284、E288、L287、V295或K302。在某些实施方案中,本文描述了包含具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中任一个中所示的氨基酸序列的CDR的抗体,其与SEQ ID NO:15的以下残基中的全部结合:N276、R284、E288、L287、V295或K302。在某些实施方案中,所述抗体仅结合参与与所述抗体的强或中等相互作用的残基。在某些实施方案中,所述抗体仅结合参与与所述抗体的强相互作用的残基。
在某些实施方案中,本文描述了包含不同于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中任一个中所示的氨基酸序列的CDR的抗体,其结合SEQ ID NO:15的以下残基中的任何一个、两个、三个、四个、五个或六个:N276、R284、E288、L287、V295或K302。在某些实施方案中,本文描述了包含不同于SEQ ID NO:11、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中任一个中所示的氨基酸序列的CDR的抗体,其结合SEQ ID NO:15的以下残基中的任何一个、两个、三个、四个、五个或六个:N276、R284、E288、L287、V295或K302。在某些实施方案中,所述抗体仅结合参与与所述抗体的强或中等相互作用的残基。在某些实施方案中,所述抗体仅结合参与与所述抗体的强相互作用的残基。
在某些实施方案中,本文描述了包含与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中任一个中所示的氨基酸序列相差1、2、3、4或5个氨基酸残基的CDR的抗体,其结合SEQID NO:15的以下残基中的任何一个、两个、三个、四个、五个或六个:N276、R284、E288、L287、V295或K302。在某些实施方案中,本文描述了包含不同于SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中任一个中所示的氨基酸序列的CDR的抗体,其结合SEQ ID NO:15的以下残基中的任何一个、两个、三个、四个、五个或六个:N276、R284、E288、L287、V295或K302。在某些实施方案中,所述抗体仅结合参与与所述抗体的强或中等相互作用的残基。在某些实施方案中,所述抗体仅结合参与与所述抗体的强相互作用的残基。
在某些实施方案中,本文描述了特异性结合骨膜蛋白的抗体,所述抗体包含与SEQID NO:13中所示的氨基酸序列至少约80%、约90%、约95%、约97%、约98%或约99%相同的人或人源化重链可变区氨基酸序列;和与SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列至少约80%、约90%、约95%、约97%、约98%或约99%相同的人或人源化轻链可变区氨基酸序列,并且结合SEQ ID NO:15的以下残基中的一个、两个、三个、四个、五个或六个:N276、R284、E288、L287、V295或K302。在某些实施方案中,本文描述了特异性结合骨膜蛋白的抗体,所述抗体包含与SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列至少约80%、约90%、约95%、约97%、约98%或约99%相同的人或人源化重链可变区氨基酸序列;和与SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列至少约80%、约90%、约95%、约97%、约98%或约99%相同的人或人源化轻链可变区氨基酸序列,并且结合SEQ ID NO:15的以下残基中的全部:N276、R284、E288、L287、V295或K302。在某些实施方案中,所述抗体仅结合参与与所述抗体的强或中等相互作用的残基。在某些实施方案中,所述抗体仅结合参与与所述抗体的强相互作用的残基。
在某些实施方案中,本文描述了抗体,所述抗体包含具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中任一个中所示的氨基酸序列的CDR,并且包含与SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列至少约80%、约90%、约95%、约97%、约98%或约99%相同的人或人源化重链可变区氨基酸序列;和与SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列至少约80%、约90%、约95%、约97%、约98%或约99%相同的人或人源化轻链可变区氨基酸序列,并且结合SEQ IDNO:15的以下残基中的任何一个、两个、三个、四个、五个或六个:N276、R284、E288、L287、V295或K302。在某些实施方案中,本文描述了包含具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中任一个中所示的氨基酸序列的CDR的抗体,其与SEQ ID NO:15的以下残基中的全部结合:N276、R284、E288、L287、V295或K302。在某些实施方案中,所述抗体仅结合参与与所述抗体的强或中等相互作用的残基。在某些实施方案中,所述抗体仅结合参与与所述抗体的强相互作用的残基。
在某些实施方案中,本文描述了特异性结合骨膜蛋白的抗体,所述抗体包含与SEQID NO:13中所示的氨基酸序列至少约80%、约90%、约95%、约97%、约98%或约99%相同的人或人源化重链可变区氨基酸序列,其中SEQ ID NO:13的氨基酸残基编号55是天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸或天冬氨酸,并且其中SEQ ID NO:13的氨基酸残基编号100是甲硫氨酸、异亮氨酸或缬氨酸;和与SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列至少约80%、约90%、约95%、约97%、约98%或约99%相同的人或人源化轻链可变区氨基酸序列,并且结合SEQ ID NO:15的以下残基中的一个、两个、三个、四个、五个或六个:N276、R284、E288、L287、V295或K302。在某些实施方案中,本文描述了特异性结合骨膜蛋白的抗体,所述抗体包含与SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列至少约80%、约90%、约95%、约97%、约98%或约99%相同的人或人源化重链可变区氨基酸序列,其中SEQ ID NO:13的氨基酸残基编号55是天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸或天冬氨酸,并且其中SEQ ID NO:13的氨基酸残基编号100是甲硫氨酸、异亮氨酸或缬氨酸;和与SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列至少约80%、约90%、约95%、约97%、约98%或约99%相同的人或人源化轻链可变区氨基酸序列,并且结合SEQ ID NO:15的以下残基中的全部:N276、R284、E288、L287、V295或K302。在某些实施方案中,所述抗体仅结合参与与所述抗体的强或中等相互作用的残基。在某些实施方案中,所述抗体仅结合参与与所述抗体的强相互作用的残基。
在某些实施方案中,本文描述了特异性结合骨膜蛋白的抗体,所述抗体包含具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中任一个中所示的氨基酸序列的CDR,以及与SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列至少约80%、约90%、约95%、约97%、约98%或约99%相同的人或人源化重链可变区氨基酸序列,其中SEQ ID NO:13的氨基酸残基编号55是天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸或天冬氨酸,并且其中SEQ ID NO:13的氨基酸残基编号100是甲硫氨酸、异亮氨酸或缬氨酸;和与SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列至少约80%、约90%、约95%、约97%、约98%或约99%相同的人或人源化轻链可变区氨基酸序列,并且结合SEQ ID NO:15的以下残基中的一个、两个、三个、四个、五个或六个:N276、R284、E288、L287、V295或K302。在某些实施方案中,本文描述了特异性结合骨膜蛋白的抗体,所述抗体包含具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中任一个中所示的氨基酸序列的CDR,以及与SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列至少约80%、约90%、约95%、约97%、约98%或约99%相同的人或人源化重链可变区氨基酸序列,其中SEQ ID NO:13的氨基酸残基编号55是天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸或天冬氨酸,并且其中SEQ ID NO:13的氨基酸残基编号100是甲硫氨酸、异亮氨酸或缬氨酸;和与SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列至少约80%、约90%、约95%、约97%、约98%或约99%相同的人或人源化轻链可变区氨基酸序列,并且结合SEQ ID NO:15的以下残基中的全部:N276、R284、E288、L287、V295或K302。在某些实施方案中,所述抗体仅结合参与与所述抗体的强或中等相互作用的残基。在某些实施方案中,所述抗体仅结合参与与所述抗体的强相互作用的残基。
在某些实施方案中,本文描述了抗体,所述抗体与如下抗体竞争结合,所述抗体包含具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中任一个中所示的氨基酸序列的CDR,并且结合SEQ ID NO:15的以下残基中的任何一个、两个、三个、四个、五个或六个:N276、R284、E288、L287、V295或K302。在某些实施方案中,本文描述了抗体,所述抗体与如下抗体竞争结合,所述抗体包含具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中任一个中所示的氨基酸序列的CDR,与SEQ ID NO:15的以下残基中的全部结合:N276、R284、E288、L287、V295或K302。在某些实施方案中,所述抗体仅结合参与与所述抗体的强或中等相互作用的残基。在某些实施方案中,所述抗体仅结合参与与所述抗体的强相互作用的残基。
在某些实施方案中,本文描述了抗体,所述抗体包含与如下抗体的结合区至少部分重叠的结合区,所述抗体包含具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中任一个中所示的氨基酸序列的CDR,并且结合SEQ ID NO:15的以下残基中的任何一个、两个、三个、四个、五个或六个:N276、R284、E288、L287、V295或K302。在某些实施方案中,本文描述了抗体,所述抗体包含与如下抗体的结合区至少部分重叠的结合区,所述抗体包含具有SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中任一个中所示的氨基酸序列的CDR,与SEQ ID NO:15的以下残基中的全部结合:N276、R284、E288、L287、V295或K302。在某些实施方案中,所述抗体仅结合参与与所述抗体的强或中等相互作用的残基。在某些实施方案中,所述抗体仅结合参与与所述抗体的强相互作用的残基。
在某些实施方案中,本文描述了抗体,所述抗体与如下抗体竞争结合,所述抗体包含与SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列至少约80%、约90%、约95%、约97%、约98%或约99%相同的人或人源化重链可变区氨基酸序列;和与SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列至少约80%、约90%、约95%、约97%、约98%或约99%相同的人或人源化轻链可变区氨基酸序列。
在某些实施方案中,本文描述了抗体,所述抗体包含与如下抗体的结合区至少部分重叠的结合区,所述抗体包含与SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列至少约80%、约90%、约95%、约97%、约98%或约99%相同的人或人源化重链可变区氨基酸序列;和与SEQ IDNO:14中所示的氨基酸序列至少约80%、约90%、约95%、约97%、约98%或约99%相同的人或人源化轻链可变区氨基酸序列。
在某些实施方案中,本文描述了抗体,所述抗体与如下抗体竞争结合,所述抗体包含具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中任一个中所示的氨基酸序列的CDR,并且包含与SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列至少约80%、约90%、约95%、约97%、约98%或约99%相同的人或人源化重链可变区氨基酸序列;和与SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列至少约80%、约90%、约95%、约97%、约98%或约99%相同的人或人源化轻链可变区氨基酸序列,并且结合SEQ ID NO:15的以下残基中的任何一个、两个、三个、四个、五个或六个:N276、R284、E288、L287、V295或K302。在某些实施方案中,本文描述了包含具有SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中任一个中所示的氨基酸序列的CDR的抗体,其与SEQID NO:15的以下残基中的全部结合:N276、R284、E288、L287、V295或K302。在某些实施方案中,所述抗体仅结合参与与所述抗体的强或中等相互作用的残基。在某些实施方案中,所述抗体仅结合参与与所述抗体的强相互作用的残基。
在某些实施方案中,本文描述了抗体,所述抗体包含与如下抗体的结合区至少部分重叠的结合区,所述抗体包含具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中任一个中所示的氨基酸序列的CDR,并且包含与SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列至少约80%、约90%、约95%、约97%、约98%或约99%相同的人或人源化重链可变区氨基酸序列;和与SEQID NO:14中所示的氨基酸序列至少约80%、约90%、约95%、约97%、约98%或约99%相同的人或人源化轻链可变区氨基酸序列,并且结合SEQ ID NO:15的以下残基中的任何一个、两个、三个、四个、五个或六个:N276、R284、E288、L287、V295或K302。在某些实施方案中,本文描述了包含具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中任一个中所示的氨基酸序列的CDR的抗体,其与SEQ ID NO:15的以下残基中的全部结合:N276、R284、E288、L287、V295或K302。在某些实施方案中,所述抗体仅结合参与与所述抗体的强或中等相互作用的残基。在某些实施方案中,所述抗体仅结合参与与所述抗体的强相互作用的残基。
在某些实施方案中,本文描述了抗体,所述抗体与如下抗体竞争结合,所述抗体包含具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中任一个中所示的氨基酸序列的CDR,并且包含与SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列至少约80%、约90%、约95%、约97%、约98%或约99%相同的人或人源化重链可变区氨基酸序列,其中SEQ ID NO:13的氨基酸残基编号55是天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸或天冬氨酸,并且其中SEQ ID NO:13的氨基酸残基编号100是甲硫氨酸、异亮氨酸或缬氨酸;和与SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列至少约80%、约90%、约95%、约97%、约98%或约99%相同的人或人源化轻链可变区氨基酸序列,并且结合SEQ ID NO:15的以下残基中的任何一个、两个、三个、四个、五个或六个:N276、R284、E288、L287、V295或K302。在某些实施方案中,本文描述了包含具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中任一个中所示的氨基酸序列的CDR的抗体,其与SEQ ID NO:15的以下残基中的全部结合:N276、R284、E288、L287、V295或K302。在某些实施方案中,所述抗体仅结合参与与所述抗体的强或中等相互作用的残基。在某些实施方案中,所述抗体仅结合参与与所述抗体的强相互作用的残基。
在某些实施方案中,本文描述了抗体,所述抗体包含与如下抗体的结合区至少部分重叠的结合区,所述抗体包含具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中任一个中所示的氨基酸序列的CDR,并且包含与SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列至少约80%、约90%、约95%、约97%、约98%或约99%相同的人或人源化重链可变区氨基酸序列,其中SEQID NO:13的残基编号55处的氨基酸是天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸或天冬氨酸,并且其中SEQ ID NO:13的残基100处的氨基酸是甲硫氨酸、异亮氨酸或缬氨酸;和与SEQ IDNO:14中所示的氨基酸序列至少约80%、约90%、约95%、约97%、约98%或约99%相同的人或人源化轻链可变区氨基酸序列,并且结合SEQ ID NO:15的以下残基中的任何一个、两个、三个、四个、五个或六个:N276、R284、E288、L287、V295或K302。在某些实施方案中,本文描述了包含具有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中任一个中所示的氨基酸序列的CDR的抗体,其与SEQ ID NO:15的以下残基中的全部结合:N276、R284、E288、L287、V295或K302。在某些实施方案中,所述抗体仅结合参与与所述抗体的强或中等相互作用的残基。在某些实施方案中,所述抗体仅结合参与与所述抗体的强相互作用的残基。
治疗方法
本文公开的抗体是可用于治疗癌症或肿瘤的抗体。治疗是指力求改善或减轻所治疗病症的方法。关于癌症,治疗包括但不限于肿瘤体积的减小、肿瘤体积生长的减少、无进展存活期或总体预期寿命的增加。在某些实施方案中,治疗将实现所治疗癌症的缓解。在某些实施方案中,治疗涵盖使用作为旨在防止先前治疗的癌症或肿瘤的复发或进展的预防或维持剂量。本领域技术人员应理解,虽然抗体可能是安全且有效的,但并非所有个体都将对所施用的治疗有等同反应,然而这些个体被认为是被治疗的。
可由本文所述的抗体治疗的肿瘤包括表达骨膜蛋白的那些。骨膜蛋白是细胞外基质的组分,其由癌症相关成纤维细胞分泌,并且因此,大多数肿瘤将表达或包含骨膜蛋白。在某些实施方案中,所治疗的肿瘤是骨膜蛋白阳性且具有可检测的骨膜蛋白或基于类似肿瘤的群体分析已知具有可检测的骨膜蛋白的肿瘤。在某些实施方案中,骨膜蛋白高肿瘤是具有约50或更高的IHC得分的肿瘤。
在某些实施方案中,所述癌症或肿瘤是实体癌症或肿瘤。在某些实施方案中,所述癌症或肿瘤是血液癌症或肿瘤。在某些实施方案中,所述癌症或肿瘤包括乳腺肿瘤、心脏肿瘤、肺部肿瘤、小肠肿瘤、结肠肿瘤、脾脏肿瘤、肾脏肿瘤、膀胱肿瘤、头部肿瘤、颈部肿瘤、卵巢肿瘤、前列腺肿瘤、脑肿瘤、胰腺肿瘤、皮肤肿瘤、骨肿瘤、骨髓肿瘤、血液肿瘤、胸腺肿瘤、子宫肿瘤、睾丸肿瘤或肝脏肿瘤。在某些实施方案中,可以用本发明的抗体治疗的肿瘤或癌症包括腺瘤、腺癌、血管肉瘤、星形细胞瘤、上皮癌、生殖细胞瘤、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、血管内皮瘤、血管肉瘤、血肿、肝母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、髓母细胞瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤和/或畸胎瘤。在某些实施方案中,所述肿瘤/癌症选自肢端雀斑样黑色素瘤、光化性角化病、腺癌、腺样囊性癌、腺瘤、腺肉瘤、腺鳞癌、星形细胞肿瘤、前庭大腺癌、基底细胞癌、支气管腺癌、毛细血管类癌、癌、癌肉瘤、胆管癌、软骨肉瘤、囊腺瘤、内胚窦瘤、子宫内膜增生、子宫内膜间质肉瘤、子宫内膜样腺癌、室管膜肉瘤、斯温肉瘤(Swing's sarcoma)、局灶性结节性增生、胃泌素瘤(gastronoma)、生殖细胞系肿瘤、胶质母细胞瘤、胰高血糖素瘤、血管母细胞瘤、血管内皮瘤、血管瘤、肝腺瘤、肝腺瘤病、肝细胞癌、胰岛素瘤(insulinite)、上皮内瘤样病变、上皮内鳞状细胞瘤样病变、侵袭性鳞状细胞癌、大细胞癌、脂肪肉瘤、肺癌、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞性白血病、平滑肌肉瘤、黑色素瘤、恶性黑色素瘤、恶性间皮肿瘤、神经鞘瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、间皮瘤、粘液表皮样癌、髓性白血病、神经母细胞瘤、神经上皮腺癌、结节性黑色素瘤、骨肉瘤、卵巢癌、乳头状浆液性腺癌、垂体瘤、浆细胞瘤、假性肉瘤、前列腺癌、肺母细胞瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、浆液性癌、鳞状细胞癌、小细胞癌、软组织癌、生长抑素分泌肿瘤、鳞癌、鳞状细胞癌、未分化癌、葡萄膜黑色素瘤、疣状癌、阴道/外阴癌、舒血管肠肽瘤(VIPoma)和肾母细胞瘤(Wilm's tumor)。在某些实施方案中,待用本发明的一种或多种抗体治疗的肿瘤/癌症包括脑癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌、结直肠癌、急性髓性白血病、前B细胞急性成淋巴细胞性白血病、膀胱癌、星形细胞瘤(优选II、III或IV级星形细胞瘤)、胶质母细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、小细胞癌和非小细胞癌(优选非小细胞肺癌)、肺腺癌、转移性黑色素瘤、非雄激素依赖性转移性前列腺癌、雄激素依赖性转移性前列腺癌、前列腺腺癌和乳腺癌(优选乳腺导管癌和/或乳腺癌)。在一些实施方案中,所述癌症包括胶质母细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肾癌、头颈癌、卵巢癌、皮肤癌、胃癌、间皮瘤、肝癌、子宫内膜癌、结肠癌、宫颈癌、前列腺癌或肺癌。在某些实施方案中,用本公开文本的抗体治疗的癌症包括胶质母细胞瘤。在某些实施方案中,用本公开文本的一种或多种抗体治疗的癌症包括胰腺癌。在某些实施方案中,用本公开文本的一种或多种抗体治疗的癌症包括卵巢癌。在某些实施方案中,用本公开文本的一种或多种抗体治疗的癌症包括肺癌。在某些实施方案中,用本公开文本的一种或多种抗体治疗的癌症包括鳞状细胞肺癌。在某些实施方案中,用本公开文本的一种或多种抗体治疗的癌症包括前列腺癌。在某些实施方案中,用本公开文本的一种或多种抗体治疗的癌症包括结肠癌。在某些实施方案中,所治疗的癌症包括胶质母细胞瘤、胰腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌或肺癌。在某一实施方案中,所述癌症对于其他治疗是难治性的。在某一实施方案中,所治疗的癌症是复发性的。在某一实施方案中,所述癌症是复发性/难治性胶质母细胞瘤、胰腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌或肺癌。
在某些实施方案中,所述抗体可以通过适合于施用含抗体的药物组合物的任何途径施用至有需要的受试者,所述任何途径诸如像皮下、腹膜内、静脉内、肌内、瘤内或脑内等。在某些实施方案中,静脉内施用所述抗体。在某些实施方案中,皮下施用所述抗体。在某些实施方案中,瘤内施用所述抗体。在某些实施方案中,按合适的剂量时间表(例如,每周、每周两次、每月、每月两次、每两周一次、每三周一次或每月一次等)施用所述抗体。在某些实施方案中,每三周一次施用所述抗体。可以按任何治疗有效量施用所述抗体。在某些实施方案中,治疗上可接受的量在约0.1mg/kg与约50mg/kg之间。在某些实施方案中,治疗上可接受的量在约1mg/kg与约40mg/kg之间。在某些实施方案中,治疗上可接受的量在约5mg/kg与约30mg/kg之间。治疗有效量包括足以减轻与待治疗的疾病或痛苦相关的一种或多种症状的那些量。
本文所述的抗骨膜蛋白抗体还可用于在个体中降低肿瘤中胶原蛋白含量的方法中。
本文所述的抗骨膜蛋白抗体还可用于在个体中增加肿瘤中的M1巨噬细胞表型和/或减少M2巨噬细胞表型的方法中。
本文所述的抗骨膜蛋白抗体还可用于在个体中减少抑制性粒细胞髓系细胞和/或肿瘤相关巨噬细胞积累的方法中。
本文所述的抗骨膜蛋白抗体还可用于增加个体的肿瘤中CD4+和/或CD8+T细胞的频率的方法中。
本文所述的抗骨膜蛋白抗体还可用于在个体中增加肿瘤中CD8+T细胞的干扰素γ表达和/或释放的方法中。
本文所述的抗体可用于制造用于在个体中降低肿瘤中胶原蛋白含量的药物。
本文所述的抗体可用于制造用于在个体中增加肿瘤中的M1巨噬细胞表型和/或减少M2巨噬细胞表型的药物。
本文所述的抗体可用于制造用于在个体中减少抑制性粒细胞髓系细胞和/或肿瘤相关巨噬细胞积累的药物。
本文所述的抗体可用于制造用于增加个体的肿瘤中CD4+和/或CD8+T细胞的频率的药物。
本文所述的抗体可用于制造用于在个体中增加肿瘤中CD8+T细胞的干扰素γ表达和/或释放的药物。
药学上可接受的赋形剂、载体和稀释剂
本文所述的抗体可以按对于施用至人个体足够纯的分离和纯化形式提供。
在某些实施方案中,将本公开文本的抗骨膜蛋白抗体包括在药物组合物中,所述药物组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体和稀释剂。在某些实施方案中,将本公开文本的抗体悬浮于无菌溶液中来施用。在某些实施方案中,所述溶液包含0.9%NaCl或5%右旋糖、葡萄糖或蔗糖。在某些实施方案中,所述溶液还包含以下中的一种或多种:缓冲剂,例如乙酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、琥珀酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐和羟甲基氨基甲烷(Tris);表面活性剂,例如聚山梨醇酯80(Tween 80)、聚山梨醇酯20(Tween 20)和泊洛沙姆188;多元醇/二糖/多糖,例如葡萄糖、右旋糖、甘露糖、甘露醇、山梨糖醇、蔗糖、海藻糖和葡聚糖40;氨基酸,例如甘氨酸或精氨酸;抗氧化剂,例如抗坏血酸、甲硫氨酸;或螯合剂,例如EDTA或EGTA。
在某些实施方案中,将本公开文本的抗体冻干运输/储存并在施用前重构。在某些实施方案中,冻干抗体配制品包含填充剂,如甘露醇、山梨糖醇、蔗糖、海藻糖、葡聚糖40或其组合。可以将冻干配制品包含在由玻璃或其他合适的非反应性材料构成的小瓶中。所述抗体在配制时(无论是否重构)可以在一定pH(通常小于7.0)下缓冲。在某些实施方案中,pH可以在4.5与6.5、4.5与6.0、4.5与5.5、4.5与5.0或5.0与6.0之间。
本文还描述了试剂盒,其包含在合适容器中的本文所述的一种或多种抗体以及选自以下的一种或多种另外的组分:使用说明书、稀释剂、赋形剂、载体和用于施用的装置。
在某些实施方案中,本文描述了制备癌症治疗剂的方法,其包括将一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂与本公开文本的抗体混合。在某些实施方案中,本文描述了制备用于储存或运输的癌症治疗剂的方法,其包括冻干本公开文本的一种或多种抗体。
实施例
以下说明性实施例代表本文所述的组合物和方法的实施方案,并不意味着以任何方式进行限制。
实施例1-抗体产生和筛选
进行噬菌体展示抗体发现活动,以使用全人噬菌体文库分离针对骨膜蛋白的结合物。简而言之,使用重组人骨膜蛋白、重组小鼠骨膜蛋白或其组合进行三轮淘选,其重点是鉴定小鼠交叉反应性结合物。从此淘选策略中,鉴定出与小鼠骨膜蛋白交叉反应的78种序列独特的ScFv,并且将其产生为人IgG1形式以在细胞附着测定中进行功能筛选。参见图1。
将重组人或小鼠骨膜蛋白在4℃下在96孔板上包被过夜。第二天,将板用PBS洗涤,并且在37℃下用2%BSA封闭1小时。封闭后,将抗体添加到板中并在37℃下孵育30min。孵育后,然后将50,000个IMR90人肺成纤维细胞或50,000个MLG小鼠成纤维细胞添加到孔中,并且允许在37℃下孵育2h。然后将板用PBS洗涤两次,并且使用IncuCyte平台测量孔的汇合度。从在500nM下的高浓度单剂量筛选中,21种IgG被鉴定为具有>50%抑制作用,如图1中所示,并且推进到结合筛选以确定与人和小鼠骨膜蛋白的相对亲和力,如下表1中所示。
为了确定对重组人或小鼠骨膜蛋白的相对亲和力,将这些蛋白质在4℃下在maxisorp板上包被过夜。第二天,将板在37℃下用酪蛋白封闭缓冲液封闭1h。将每种抗体的滴定物添加到板中,并且允许在室温下结合1h。将板用PBST洗涤4次,之后在室温下与HRP缀合的抗人Fc二抗一起孵育30min。然后将板再次用PBST洗涤4次,然后使用TMB底物和1M HCl进行显色。从此筛选中,选择4个克隆(表1,以粗体和斜体标记),所述克隆与人和小鼠骨膜蛋白两者的结合EC50值<1nM。
实施例2-NB0828和序列变体的产生
在细胞附着测定中以剂量反应重新测试4种候选物,以确定IC50值。从此筛选中,NB0627被鉴定为特别合适的IgG(表2)。
然后将NB0627转化为效应子沉默IgG4PAA同种型,从而产生先导候选物NB0828。NB0828的序列分析鉴定了VH区中的两个翻译后修饰易感位点。第一位点即脱酰胺化位点位于CDR-H2中,并且第二位点即氧化位点位于CDR-H3中。因此,为了去除这些易感位点,产生了若干种单突变体和双突变体,并且测量其结合和活性。NB0828及其变体的IC50和EC50值的结果汇总列出于表3中。
实施例3-NB0828在小鼠膀胱MB49和结肠CT26肿瘤模型中的体内功效
在两个独立的肿瘤模型即膀胱MB49和结肠CT26肿瘤模型中测试了NB0828的功效。简而言之,将250,000个MB49细胞皮内注射到雌性C57BL/6小鼠的侧腹中,或者将50,000个CT26细胞皮内注射到雌性Balb/c小鼠的侧腹中。肿瘤植入后3天,用NB0828(50mg/kg,3QW)或媒介物对照(PBS)对小鼠进行腹膜内治疗。按照卡尺测量每周两次评估肿瘤体积,并且将其计算为(长度x宽度2)/2。当肿瘤大小在任何单一方向上超过15mm时或由于作为人道终点的肿瘤溃疡,对小鼠实施安乐死。
如图2(MB49)和图5(CT26)中所示,NB0828在两种模型中都有减少肿瘤生长的作用。在MB49模型中,肿瘤生长的这种减少与如图3中所示的瘤内粒细胞髓系细胞的较低频率和如图4中所示的较低胶原蛋白含量相关。与MB49模型一样,CT26模型显示出粒细胞髓系细胞的减少。此外,NB0828降低了肿瘤浸润巨噬细胞的频率,并且由于NB0828的治疗,存在的巨噬细胞向M1表型偏斜,如图6中所示。在CT26小鼠模型中,NB0828治疗还与肿瘤浸润CD8+和CD4+T细胞的较高频率以及如通过干扰素γ的较高表达所测量的CD8+T细胞功能增加相关,如图7中所示。
免疫分型
如所描述的,从第3天开始,用NB0828或媒介物对照对携带MB49或CT26肿瘤的小鼠进行治疗。对于所示出的数据,分别在MB49和CT26的肿瘤植入后第20天和第18天进行免疫分型。使用手术刀片切除肿瘤,去除皮肤并进行机械破坏,之后使用Miltenyi小鼠肿瘤解离酶混合物进行酶消化。将消化的样品通过40μm过滤网,在RPMI中洗涤,之后在RPMI+10%FBS中进行第二次洗涤。然后将细胞重悬以进行计数,并且对最多2x106个白细胞/样品进行铺板和染色,以通过流式细胞仪进行分析。为了评价CT26模型中的CD8+肿瘤浸润淋巴细胞功能,将来自肿瘤的消化的单细胞悬浮液在37℃下在抗CD28和布雷非德菌素A存在下用AH1肽[H2-Ld限制性gp70(423-431)MuLV表位,即由CT26细胞表达的免疫显性CD8+T细胞表位]刺激5小时。刺激之后,通过标准表面/细胞内染色方法对细胞进行染色以使用流式细胞术检测CD8+T细胞对IFN-γ的产生。用于评估所示细胞群的流动染色面板包括在下表4中。使用活力染色剂(Thermo Fisher,Live/Dead可固定紫罗兰染色剂)来实现对仅活细胞事件的询问,并且包括泛白细胞标记CD45以实现对免疫隔室内群体的归一化。对目的免疫群体如下进行表型/功能定义:总髓系细胞(CD45+CD11b+)、粒细胞(CD45+CD11b+Gr-1高或CD45+CD11b+Ly6G+Ly6C低)、巨噬细胞(CD45+CD11b+Ly6G-Ly6C低/阴性F4/80+)、M1巨噬细胞(MHCII+CD206-)、M2巨噬细胞(MHC II-CD206+)、CD8+TIL(CD45+CD11b-CD3+CD90.2+CD8+)、CD4+TIL(CD45+CD11b-CD3+CD90.2+CD4+)、IFN-γ+CD8+TIL(CD45+CD11b-CD3+CD8+IFN-γ+)。使用中值荧光强度(MFI)来确定来自IFN-γ+CD8+TIL的IFN-γ染色强度。
胶原蛋白含量
通过使用Quickzyme总胶原蛋白测定定量羟脯氨酸来评估肿瘤的总胶原蛋白含量。为了制备样品,当肿瘤达到终点时,将MB49肿瘤从荷瘤小鼠中切除,并且在液氮中速冻并在分析前储存在-80C下。称重肿瘤材料,并且将其以200mg肿瘤/ml HCl重悬于6M HCl中,涡旋并在95C下孵育20h。将管冷却,以13,000RPM离心10分钟,并且收集上清液。将上清液根据制造商推荐的方案在Milli Q水中,之后在4M HCl中稀释,并且以技术重复进行铺板,以使用提供的缓冲液和检测试剂检测羟脯氨酸。测量OD570 nm值,并且将其与使用提供的胶原蛋白生成的标准曲线进行比较,以计算每个样品中胶原蛋白的量。将每个样品的计算的总胶原蛋白(μg)除以肿瘤输入的总质量(mg)以跨肿瘤样品归一化数据。
实施例4-NB0828在小鼠结肠MC38肿瘤模型中的体内功效
测试了NB0828在小鼠结肠MC38肿瘤模型中减少肿瘤生长的功效,其结果如图8中所示。简而言之,将200,000个MC38细胞皮内注射在雌性C57BL/6小鼠的侧腹中。肿瘤植入后3天,用NB0828(50mg/kg,3QW)或媒介物对照(PBS)对小鼠进行腹膜内治疗。对于CD8+T细胞的耗尽,对于前6剂(10mg/kg,3QW),将抗小鼠CD8a(克隆2.43)或IgG同种型对照(克隆LTF-2)连同NB0828一起递送。使用表5中列出的流动染色面板通过流式细胞术确认血液中T细胞的耗尽。使用与针对MB49和CT26模型所述的相同的方法测量肿瘤体积。NB0828在MC38模型中有效地减少肿瘤生长(图8)。NB0828还有效地改变肿瘤微环境以增加CD8+T细胞、降低肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的频率以及增加促炎性巨噬细胞的比率,如图9A和图9C中所示。NB0828在此模型中减少肿瘤生长的功效依赖于CD8+T细胞,因为在NB0828治疗期间CD8+T细胞的耗尽逆转了NB0828的有益作用,如9D中所示。总的来说,此数据表明,NB0828有效地减少了肿瘤生长,并且增加了至肿瘤部位的CD8+T细胞,在浸润性肿瘤中减少了TAM并增加了促炎性M1巨噬细胞表型。
免疫分型
使用手术刀片切除肿瘤,去除皮肤并进行机械破坏,之后使用Miltenyi小鼠肿瘤解离酶混合物进行酶消化(在37℃下在振荡平台上孵育45min)。将消化的样品通过40μm过滤网,在RPMI中洗涤,之后在RPMI+10%FBS中进行第二次洗涤。然后将细胞重悬以进行计数,并且对最多2x106个白细胞/样品进行铺板和染色,以通过流式细胞仪进行分析。为了评价MC38模型中的CD8+肿瘤浸润淋巴细胞(CD8+TIL)功能,将来自肿瘤的消化的单细胞悬浮液(最多2x106个白细胞/样品)在37℃下在抗CD28和布雷非德菌素A存在下用p15E肽[由MC38肿瘤表达的H2-Kb限制性p15E(604-611)MuLV表位]刺激5h。刺激之后,使用eBioscience细胞内Fix&Perm缓冲液套件,通过标准表面/细胞内染色方法对细胞进行染色以使用流式细胞术检测CD8+T细胞对IFN-γ的产生。用于评估所示细胞群的流动染色面板包括在下表中。使用活力染色剂(Thermo Fisher,Live/Dead可固定紫罗兰染色剂)来实现对仅活细胞事件的询问,并且包括泛白细胞标记CD45以实现对免疫隔室内群体的归一化。对于MC38中的研究,对报告的目的免疫群体如下进行表型/功能定义:总髓系细胞(CD45+CD11b+)、巨噬细胞(CD45+CD11b+Ly6G-Ly6C低/阴性F4/80+)、M1巨噬细胞(MHC II+)、M2巨噬细胞(MHC II-)、CD8+TIL(CD45+CD11b-CD3+SSC低CD8+)、IFN-γ+CD8+TIL(CD45+CD11b-CD3+SSC低CD8+IFN-γ+)。
实施例5-NB0828与骨膜蛋白(POSTN)的FAS2结构域结合
研究NB0828的结合区以进一步表征抗体。
BIGH3/POSTN嵌合蛋白的产生
按序列骨膜蛋白的最接近同源蛋白是转化生长因子-β诱导蛋白(BIGH3),其在蛋白质的EMI-FAS4区内具有48%的序列同源性。尽管这两种蛋白质之间的序列同源性较低,但总体结构域结构高度相似,包含一个EMI结构域和四个串联成束蛋白(FAS)结构域。NB0828以高亲和力与骨膜蛋白结合,但不与BIGH3结合。为了进一步表征NB0828的结合结构域,产生了BIGH3/POSTN嵌合蛋白,其中骨膜蛋白的每个结构域被BIGH3的相应结构域替代,从而产生了五种BIGH3/POSTN嵌合体(图10)。通过ELISA对这些蛋白质进行NB0828结合研究。如图11A中所示,NB0828保留与除了FAS2嵌合体之外的所有BIGH3/POSTN嵌合体的结合。当用BIGH3 FAS2结构域替代POSTN FAS2结构域时的这种可观察到的结合损失表明,NB0828与POSTN的FAS2结构域结合。
POSTN FAS2变体的产生
骨膜蛋白的FAS2结构域是由132个氨基酸构成的构象结构。产生了跨FAS2结构域的不同位置的单氨基酸取代(丙氨酸)变体,以进一步限定NB0828表位或结合区并鉴定关键接触残基(表5)。使用已公开的晶体结构(Liu等人,2018;PDB#5YJG),基于计算分析工具MOE中的表面暴露来鉴定用于诱变的残基。
在初始轮次中产生了跨越整个FAS2结构域的残基的23种丙氨酸变体。对这些变体进行NB0828结合研究,并且相对于测定内最大信号的损失>50%的变体被鉴定为对结合关键的残基。图11B展示了来自该筛选的结果。鉴定出代表NB0828结合的关键氨基酸的两种变体:NB1205(R284A)和NB1207(E288A)。鉴于这两个氨基酸的紧密接近(图12),产生了第二轮的11种另外的变体,从而更具体地集中于此区域内的残基上。图11C展示了来自第二次筛选的结果。根据来自第二次筛选的ELISA结果,鉴定出代表对NB0828结合关键的氨基酸的另外四种变体:NB1243(L287A)、NB1246(V295A)、NB1248(K302A)和NB1202(N276A)。值得注意的是,NB1190(D245A)(其非常接近于相对于最大信号截止值的损失>50%但没有降到以下)位于与剩余残基分开的环上,但在FAS2结构域内和NB0828结合环上与N276形成接触点(图12)。鉴于N276被鉴定为NB0828结合的关键残基,D245残基也可以是NB0828的接触残基,或者为NB0828表位环提供对结合重要的结构完整性。
跨物种的NB0828亲和力确定
确定了跨人、小鼠、大鼠和食蟹猴物种的NB0828的结合亲和力。NB0828亲和力是使用octet red系统确定的。简而言之,使用抗人Fc(AHC)生物传感器捕获NB0828,之后是对滴定量的重组人、小鼠、大鼠或食蟹猴骨膜蛋白(100nM→0nM;1:2稀释物)的关联。重组人、小鼠和大鼠骨膜蛋白是从R&D systems商业购买的,而食蟹猴骨膜蛋白是内部制得的。结果表明,跨这四个物种,NB0828与骨膜蛋白的亲和力高度相似,范围从0.1-0.5nM。此数据有力地支持上文详述的表位作图实验,因为在所述的NB0828结合环中的序列同一性跨这四个物种是100%。
实施例6-NB0828不阻断骨膜蛋白与腱生蛋白C和1型胶原蛋白的结合,但阻断细胞附着
为了确定NB0828是否阻断骨膜蛋白与细胞外蛋白即腱生蛋白C和I型胶原蛋白的结合,进行竞争性ELISA测定。将重组人骨膜蛋白(2ng/mL)在4℃下在maxisorp板上包被过夜。第二天,将板在37℃下用酪蛋白封闭缓冲液封闭1h。为了确定重组人腱生蛋白C和人I型胶原蛋白的结合EC80,使用EZ-LinkTM NHS-PEG4-生物素(Fisher)对蛋白质进行10:1生物素化,并且将每种生物素化蛋白的滴定物添加到板中并在室温下孵育1h。将板用PBST洗涤4次,之后使用亲和素-HRP检测30min。然后将板再次用PBST洗涤4次,并且使用TMB底物和1MHCl进行显色。使用Graphpad Prism 7软件确定每种蛋白质的EC80。对于竞争性ELISA,将NB0828、对照IgG或PBST的滴定物添加到板中,并且在室温下振荡孵育30min。然后将板用PBST洗涤4次,并且将结合EC80浓度的生物素化腱生蛋白C(0.9nM,13A,左)或胶原蛋白(100nM,13B,左)或预混合的封闭对照添加到板中。通过将EC80浓度的生物素化蛋白与重组人骨膜蛋白的滴定物混合来制备预混合的封闭对照,将其在室温下振荡孵育30min,之后添加到板中。然后将板在室温下振荡孵育1h,并且如上所述进行洗涤、检测和显色。
腱生蛋白C和I型胶原蛋白与骨膜蛋白结合,其EC80结合分别为0.9nM和100nM(图13A和图13B)。如图13A和图13B中所示,与预混合的阳性对照相比,NB0828不抑制骨膜蛋白与腱生蛋白C和I型胶原蛋白的结合。一并考虑,这些数据表明,NB0828不阻断骨膜蛋白与细胞外基质蛋白即腱生蛋白C和I型胶原蛋白的相互作用。
实施例7-跨人肿瘤适应症对骨膜蛋白表达的免疫组织化学(IHC)评价
为了跨不同人类癌症评估骨膜蛋白表达水平,进行免疫组织化学(IHC)现况研究。针对骨膜蛋白表达评价包含18种肿瘤适应症和大约750个单独样品的组织微阵列(TMA)。用1:50稀释的抗骨膜蛋白抗体EPR20806(Abcam目录id:ab215199,批次id:GR3192974-3)对样品进行染色。使用数字病理学方法(HALO,Indica labs)对染色进行定量,以计算IHC得分(IHC得分=[%低强度染色面积*1]+[%中等强度染色面积*2]+[%高强度染色面积*3])。基于跨所有样品的近似平均骨膜蛋白IHC得分,将低/高骨膜蛋白染色的分割点计算为50的骨膜蛋白IHC得分。现况研究展示了跨测试适应症和在测试适应症内的骨膜蛋白染色范围,其中胰腺癌、乳腺癌和鳞状肺癌显示出最高的骨膜蛋白染色水平(图14A)。骨膜蛋白高肿瘤在所有适应症中均存在,但处于不同的频率下(图14A)。乳腺癌中骨膜蛋白表达的代表性IHC图像示出于图14B中。一并考虑,这些数据证明,骨膜蛋白跨多种肿瘤类型广泛表达。
虽然在本文已经显示和描述了本发明的优选实施方案,但对于本领域技术人员而言将明显的是,此类实施方案仅通过举例的方式来提供。在不背离本发明的情况下,本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。应当理解的是,本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案可以用于实践本发明。
将本说明书中提及的所有出版物、专利申请、授权专利和其他文件均通过引用并入本文,如同具体且单独地指示将每个单独的出版物、专利申请、授权专利或其他文件通过引用以其整体并入一样。在通过引用并入的文本中包含的定义与本公开文本中的定义相抵触的程度上,将其排除。
Claims (66)
1.一种结合骨膜蛋白的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中所述抗体或所述抗体的抗原结合片段包含:
a)免疫球蛋白重链CDR1(CDR-H1),其包含SEQ ID NO:1(GYTFTSYG)中所示的氨基酸序列;
b)免疫球蛋白重链CDR2(CDR-H2),其包含SEQ ID NO:2(ISAYNGNT)、3(ISAYSGNT)、4(ISAYQGNT)、5(ISAYTGNT)或6(ISAYDGNT)中任一个中所示的氨基酸序列;
c)免疫球蛋白重链CDR3(CDR-H3),其包含SEQ ID NO:7(DILVVPFDY)、8(DVLVVPFDY)或9(DMLVVPFDY)中任一个中所示的氨基酸序列;
d)免疫球蛋白轻链CDR1(CDR-L1),其包含SEQ ID NO:10(SSDIGSNR)中所示的氨基酸序列;
e)免疫球蛋白轻链CDR2(CDR-L2),其包含SEQ ID NO:11(SND)中所示的氨基酸序列;以及
f)免疫球蛋白轻链CDR3(CDR-L3),其包含SEQ ID NO:12(AAWDDSLSTYV)中所示的氨基酸序列。
2.一种结合骨膜蛋白的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中所述抗体或所述抗体的抗原结合片段包含以下中的任何一个、两个、三个、四个、五个或六个:
a)免疫球蛋白重链CDR1(CDR-H1),其包含SEQ ID NO:1(GYTFTSYG)中所示的氨基酸序列;
b)免疫球蛋白重链CDR2(CDR-H2),其包含SEQ ID NO:16(ISAYXGNT)中所示的氨基酸序列;
c)免疫球蛋白重链CDR3(CDR-H3),其包含SEQ ID NO:17(DXLVVPFDY)中所示的氨基酸序列;
d)免疫球蛋白轻链CDR1(CDR-L1),其包含SEQ ID NO:10(SSDIGSNR)中所示的氨基酸序列;
e)免疫球蛋白轻链CDR2(CDR-L2),其包含SEQ ID NO:11(SND)中所示的氨基酸序列;以及
f)免疫球蛋白轻链CDR3(CDR-L3),其包含SEQ ID NO:12(AAWDDSLSTYV)中所示的氨基酸序列;
其中X是任何氨基酸残基。
3.根据权利要求1或2所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段包含:
a)免疫球蛋白重链CDR1(CDR-H1),其包含SEQ ID NO:1(GYTFTSYG)中所示的氨基酸序列;
b)免疫球蛋白重链CDR2(CDR-H2),其包含SEQ ID NO:2(ISAYNGNT)中所示的氨基酸序列;
c)免疫球蛋白重链CDR3(CDR-H3),其包含SEQ ID NO:9(DMLVVPFDY)中所示的氨基酸序列;
d)免疫球蛋白轻链CDR1(CDR-L1),其包含SEQ ID NO:10(SSDIGSNR)中所示的氨基酸序列;
e)免疫球蛋白轻链CDR2(CDR-L2),其包含SEQ ID NO:11(SND)中所示的氨基酸序列;以及
f)免疫球蛋白轻链CDR3(CDR-L3),其包含SEQ ID NO:12(AAWDDSLSTYV)中所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段是人的、嵌合的或人源化的。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段是IgG抗体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段包含一个或多个突变以降低所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段的一种或多种效应子功能。
7.根据权利要求6所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中降低所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段的一种或多种效应子功能的所述一个或多个突变包括选自以下的一个或多个突变或突变组:根据EU编号系统的IgG4的N434A、N434H、T307A/E380A/N434A、M252Y/S254T/T256E、433K/434F/436H、T250Q、T250F、M428L、M428F、T250Q/M428L、N434S、V308W、V308Y、V308F、M252Y/M428L、D259I/V308F、M428L/V308F、Q311V/N434S、T307Q/N434A、E258F/V427T、S228P、L235E、S228P/L235E/R409K、S228P/L235E、K370Q、K370E、G446缺失、K447缺失及其组合。
8.根据权利要求6所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中降低所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段的一种或多种效应子功能的所述多个突变包括:根据EU编号系统的IgG4的S228P、F234A和L235A突变。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段是Fab、F(ab)2、单结构域抗体或单链可变片段(scFv)。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区:
a)其中所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列至少约90%、95%、97%、99%、或100%相同的氨基酸序列;并且
b)其中所述免疫球蛋白轻链可变区包含与SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列至少约90%、95%、97%、99%、或100%相同的氨基酸序列;其中SEQ ID NO:13的氨基酸残基编号55是天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸或天冬氨酸,或者其中SEQ ID NO:13的氨基酸残基编号100是甲硫氨酸、异亮氨酸或缬氨酸。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段在与骨膜蛋白结合时接触SEQ ID NO:15的以下氨基酸残基之一:N276、R284、E288、L287、V295和K302。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段在与骨膜蛋白结合时接触SEQ ID NO:15的以下氨基酸残基中的两个、三个、四个或五个:N276、R284、E288、L287、V295和K302。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段在与骨膜蛋白结合时接触SEQ ID NO:15的以下氨基酸残基中的全部:N276、R284、E288、L287、V295和K302。
14.一种结合骨膜蛋白的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区:
a)其中所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列至少约90%、95%、97%、99%、或100%相同的氨基酸序列;并且
b)其中所述免疫球蛋白轻链可变区包含与SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列至少约90%、95%、97%、99%、或100%相同的氨基酸序列;其中SEQ ID NO:13的氨基酸残基编号55是天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸或天冬氨酸,或者其中SEQ ID NO:13的氨基酸编号100是甲硫氨酸、异亮氨酸或缬氨酸。
15.一种结合骨膜蛋白的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区:
a)其中所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列至少约90%、95%、97%、99%、或100%相同的氨基酸序列;并且
b)其中所述免疫球蛋白轻链可变区包含与SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列至少约90%、95%、97%、99%、或100%相同的氨基酸序列。
16.一种结合骨膜蛋白的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区:
a)其中所述免疫球蛋白重链可变区包含与SEQ ID NO:13中所示的氨基酸序列相同的氨基酸序列;并且
b)其中所述免疫球蛋白轻链可变区包含与SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列相同的氨基酸序列。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段是人的、人源化的或嵌合的。
18.根据权利要求14至17中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段是IgG抗体。
19.根据权利要求14至18中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段包含一个或多个突变以降低所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段的一种或多种效应子功能。
20.根据权利要求19所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中降低所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段的一种或多种效应子功能的所述一个或多个突变包括选自以下的一个或多个突变或突变组:根据EU编号系统的IgG4的N434A、N434H、T307A/E380A/N434A、M252Y/S254T/T256E、433K/434F/436H、T250Q、T250F、M428L、M428F、T250Q/M428L、N434S、V308W、V308Y、V308F、M252Y/M428L、D259I/V308F、M428L/V308F、Q311V/N434S、T307Q/N434A、E258F/V427T、S228P、L235E、S228P/L235E/R409K、S228P/L235E、K370Q、K370E、G446缺失、K447缺失及其组合。
21.根据权利要求19所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中降低所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段的一种或多种效应子功能的所述一个或多个突变包括:根据EU编号系统的IgG4的S228P、F234A和L235A突变。
22.根据权利要求14至16中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段是Fab、F(ab)2、单结构域抗体或单链可变片段(scFv)。
23.一种与骨膜蛋白的成束蛋白2(FAS2)结构域结合的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段。
24.根据权利要求23所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段在与骨膜蛋白结合时接触选自SEQ ID NO:15的氨基酸276至302的氨基酸残基。
25.根据权利要求23或24所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段在与骨膜蛋白结合时接触SEQ ID NO:15的以下氨基酸残基之一:N276、R284、E288、L287、V295或K302。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段在与骨膜蛋白结合时接触SEQ ID NO:15的以下氨基酸残基中的两个、三个、四个或五个:N276、R284、E288、L287、V295和K302。
27.根据权利要求23至26中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段在与骨膜蛋白结合时接触SEQ ID NO:15的以下氨基酸残基中的全部:N276、R284、E288、L287、V295或K302。
28.根据权利要求23至27中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中所述抗体或所述抗体的抗原结合片段包含:
a)免疫球蛋白重链CDR1(CDR-H1),其包含SEQ ID NO:1(GYTFTSYG)中所示的氨基酸序列;
b)免疫球蛋白重链CDR2(CDR-H2),其包含SEQ ID NO:2(ISAYNGNT)、3(ISAYSGNT)、4(ISAYQGNT)、5(ISAYTGNT)或6(ISAYDGNT)中任一个中所示的氨基酸序列;
c)免疫球蛋白重链CDR3(CDR-H3),其包含SEQ ID NO:7(DILVVPFDY)、8(DVLVVPFDY)或9(DMLVVPFDY)中任一个中所示的氨基酸序列;
d)免疫球蛋白轻链CDR1(CDR-L1),其包含SEQ ID NO:10(SSDIGSNR)中所示的氨基酸序列;
e)免疫球蛋白轻链CDR2(CDR-L2),其包含SEQ ID NO:11(SND)中所示的氨基酸序列;以及
f)免疫球蛋白轻链CDR3(CDR-L3),其包含SEQ ID NO:12(AAWDDSLSTYV)中所示的氨基酸序列。
29.根据权利要求23至28中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段是嵌合的、人源化的或人的。
30.根据权利要求23至29中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段是IgG抗体。
31.根据权利要求23至30中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段包含一个或多个突变以降低所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段的一种或多种效应子功能。
32.根据权利要求31所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中降低所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段的一种或多种效应子功能的所述一个或多个突变包括选自以下的一个或多个突变或突变组:根据EU编号系统的IgG4的N434A、N434H、T307A/E380A/N434A、M252Y/S254T/T256E、433K/434F/436H、T250Q、T250F、M428L、M428F、T250Q/M428L、N434S、V308W、V308Y、V308F、M252Y/M428L、D259I/V308F、M428L/V308F、Q311V/N434S、T307Q/N434A、E258F/V427T、S228P、L235E、S228P/L235E/R409K、S228P/L235E、K370Q、K370E、G446缺失、K447缺失及其组合。
33.根据权利要求31所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中降低所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段的一种或多种效应子功能的所述一个或多个突变包括根据EU编号系统的IgG4的S228P、F234A和L235A突变。
34.根据权利要求23至30中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中所述重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段是Fab、F(ab)2、单结构域抗体或单链可变片段(scFv)。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段,其中在用人肺成纤维细胞和/或小鼠成纤维细胞进行的细胞粘附测定中,所述抗体具有小于约50纳摩尔的IC50。
36.一种核酸,其编码根据权利要求1至35中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段。
37.一种细胞系,其包含根据权利要求36所述的核酸。
38.根据权利要求37所述的细胞系,其中所述细胞系是中国仓鼠卵巢细胞系。
39.一种药物组合物,其包含根据权利要求1至35中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
40.根据权利要求39所述的药物组合物,其被配制用于静脉内施用。
41.根据权利要求39所述的药物组合物,其被配制用于皮下施用。
42.根据权利要求39所述的药物组合物,其被配制用于瘤内施用。
43.一种在个体中降低肿瘤中的胶原蛋白含量的方法,其包括向所述个体施用根据权利要求1至35中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或根据权利要求39至42中任一项所述的药物组合物。
44.根据权利要求1至35中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或根据权利要求39至42中任一项所述的药物组合物,用于在降低肿瘤中的胶原蛋白含量中使用。
45.一种治疗个体的癌症的方法,其包括向所述个体施用根据权利要求1至35中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或根据权利要求39至42中任一项所述的药物组合物。
46.根据权利要求45所述的方法,其中所述癌症包括胶质母细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肾癌、头颈癌、卵巢癌、皮肤癌、胃癌、间皮瘤、肝癌、子宫内膜癌、结肠癌、宫颈癌、前列腺癌或肺癌。
47.根据权利要求1至35中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或根据权利要求39至42中任一项所述的药物组合物,用于在治疗癌症中使用。
48.根据权利要求47所述的用途,其中所述癌症包括胶质母细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肾癌、头颈癌、卵巢癌、皮肤癌、胃癌、间皮瘤、肝癌、子宫内膜癌、结肠癌、宫颈癌、前列腺癌或肺癌。
49.一种在个体中增加肿瘤中的M1巨噬细胞表型和/或减少M2巨噬细胞表型的方法,其包括向所述个体施用根据权利要求1至35中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或根据权利要求39至42中任一项所述的药物组合物。
50.根据权利要求1至35中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或根据权利要求39至42中任一项所述的药物组合物,用于在增加肿瘤中的M1巨噬细胞表型和/或减少M2巨噬细胞表型的方法中使用。
51.一种在个体中减少抑制性粒细胞髓系细胞和/或肿瘤相关巨噬细胞积累的方法,其包括向所述个体施用根据权利要求1至35中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或根据权利要求39至42中任一项所述的药物组合物。
52.根据权利要求1至35中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或根据权利要求39至42中任一项所述的药物组合物,用于在减少抑制性粒细胞髓系细胞和/或肿瘤相关巨噬细胞积累的方法中使用。
53.一种增加个体的肿瘤中CD4+和/或CD8+T细胞的频率的方法,其包括向所述个体施用根据权利要求1至35中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或根据权利要求39至42中任一项所述的药物组合物。
54.根据权利要求1至35中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或根据权利要求39至42中任一项所述的药物组合物,用于在增加肿瘤中CD4+和/或CD8+T细胞的频率的方法中使用。
55.一种在个体中增加肿瘤中CD8+T细胞的频率的方法,其包括向所述个体施用根据权利要求1至35中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或根据权利要求39至42中任一项所述的药物组合物。
56.根据权利要求1至35中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或根据权利要求39至42中任一项所述的药物组合物,用于在增加肿瘤中CD8+T细胞的频率的方法中使用。
57.一种在个体中增加如通过CD8+T细胞的干扰素γ表达和/或释放所测量的CD8+T细胞功能的方法,其包括向所述个体施用根据权利要求1至35中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或根据权利要求39至42中任一项所述的药物组合物。
58.根据权利要求1至35中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段或根据权利要求39至42中任一项所述的药物组合物,用于在增加如通过CD8+T细胞的干扰素γ表达和/或释放所测量的CD8+T细胞功能的方法中使用。
59.一种制备用于降低肿瘤中的胶原蛋白含量的组合物的方法,其包括将根据权利要求1至35中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段与药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂混合。
60.一种制备用于增加肿瘤中的M1巨噬细胞表型和/或减少M2巨噬细胞表型的组合物的方法,其包括将根据权利要求1至35中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段与药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂混合。
61.一种制备用于在个体中减少抑制性粒细胞髓系细胞和/或肿瘤相关巨噬细胞积累的组合物的方法,其包括将根据权利要求1至35中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段与药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂混合。
62.一种制备用于增加个体的肿瘤中CD4+和/或CD8+T细胞的频率的组合物的方法,其包括将根据权利要求1至35中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段与药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂混合。
63.一种制备用于在个体中增加肿瘤中CD8+T细胞的干扰素γ表达和/或释放的组合物的方法,其包括将根据权利要求1至35中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段与药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂混合。
64.一种制备用于治疗癌症的组合物的方法,其包括将根据权利要求1至35中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段与药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂混合。
65.根据权利要求64所述的方法,其中所述癌症包括胶质母细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肾癌、头颈癌、卵巢癌、皮肤癌、胃癌、间皮瘤、肝癌、子宫内膜癌、结肠癌、宫颈癌、前列腺癌或肺癌。
66.一种产生根据权利要求1至35中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段的方法,其包括将根据权利要求37或38所述的细胞系在细胞培养基中在足以允许表达和分泌根据权利要求1至35中任一项所述的重组抗体或所述重组抗体的抗原结合片段的条件下孵育。
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