KR20240038198A - 인슐린 분비 베타세포 분화 유도 항체 및 이를 유효성분으로 포함하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
인슐린 분비 베타세포 분화 유도 항체 및 이를 유효성분으로 포함하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 골수 조혈 줄기세포를 인슐린 분비 베타세포로 분화 유도하는 특징이 있는 항체에 관한 것으로서, 상기 항체는 막 결합 단백질인 페리오스틴(Periostin;POSTN)을 표적 항원으로 한다. 본 발명의 항체를 이용하여 분화된 베타 세포는 췌장으로 이동하여 인슐린을 분비할 수 있어, 당뇨병 또는 이와 관련돤 대사성 질환의 치료제로 적용할 수 있다. 또한, 부작용이 적고 체내 반감기가 긴 항체의 사용은 종래 치료제들의 단점을 보완하고 치료 효과를 향상시킬 수 있다. 게다가 본 발명의 항체를 이용하여 POSTN 효능제(agonist)의 발굴용 진단키트로도 활용가능하다.
Description
본 발명은 인슐린 분비 베타세포 분화 유도 항체 및 이를 유효성분으로 포함하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
대사성 질환은 운동부족, 과잉영양 등 생활습관이 원인이 되는 병으로 비만, 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 지방간, 심장병 등을 유발하는 것으로 알려져 있다. 그 중 당뇨병은 인슐린의 결핍이나 인슐린 저항성에서 기인되는 당대사에 이상이 발생하는 대사성 질환이다. 당뇨병이 수년간 지속되면 녹내장, 시력상실, 자율신경장애, 신부전, 협심증, 심근경색증, 고혈압, 뇌졸중 등의 합병증을 유발할 수도 있다. 당뇨병에는 인슐린을 분비하는 췌장의 베타 세포가 파괴되어 당뇨가 유발되는 인슐린 의존형 즉, 제 1형 당뇨가 있고 베타 세포는 정상이나 인슐린 리셉터의 저항성에서 유발되는 인슐린 비의존형 즉, 제 2형 당뇨가 있고, 효율적인 인슐린 분비가 이루어지지 못하는 당내성 이상, 임신성 당뇨병 등이 있다. 현대 사회에서 식습관의 변화로 인한 비만이 급격히 상승하여, 비만으로 인한 인슐린의 저항성으로 제 2형 당뇨 환자들이 증가하고 있다.
한편, 최근 세포 내 조합 항체 라이브러리로부터 기능 작용제를 선별하여 세포의 분화를 조절하는 방법이 연구되고 있다. 특히 골수 조혈 줄기 세포(HSC)와 같이 자가 재생 및 다중 효능을 가진 세포의 분화를 제어하는 것은 성인의 질병, 특히 감염 및 자가면역의 발달 및 면역학적 질병의 치료에 매우 중요할 수 있다.
이에 본 발명에서는 108개의 조합 항체 라이브러리로 형질전환된 골수 조혈 줄기 세포를 이용하여 페리오스틴에 특이적으로 결합하는 신규 항체가 골수 조혈 줄기 세포를 인슐린 분비 베타 세포로 분화를 유도하는 것과 상기 항체의 특징을 확인함으로써 당뇨병과 같은 대사성 질환의 치료 가능성을 입증하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 인슐린 분비 베타세포 분화 유도 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 신규 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 대사성 질환 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 상보성 결정 영역(CDR)1, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역(VH); 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역(VJ);을 포함하는 단일클론 인간항체 P1 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단일클론 인간항체 P1 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 cDNA를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 cDNA를 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 바이러스 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환된 세포를 배지 내에서 배양하는 단계; 및 상기 배양된 세포 또는 배양 배지로부터 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수 및 정제하는 단계;를 포함하는 인간항체 P1 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 페리오스틴(Periostin;POSTN) 효능제(agonist)를 유효성분으로 포함하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 세포주에 실험물질을 처리하는 단계; 상기 실험물질이 처리된 세포주에서 페리오스틴의 발현 또는 활성화 정도를 측정하는 단계; 및 대조구 시료와 비교하여 상기 페리오스틴의 발현 또는 활성화 정도가 증가된 시험물질을 선별하는 단계;
를 포함하고, 상기 시험물질의 선별에 단일클론 인간항체 P1을 사용하는 것을 특징으로 하는 대사성 질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 발명자들은 페리오스틴(Periostin;POSTN) 효능제(agonist)인 신규 P1 항체가 골수 줄기세포를 인슐린 분비 베타세포로 분화 유도하는 것을 확인한 바, 당뇨병과 같은 대사성 질환의 예방 내지 치료에 활용할 수 있음을 확인하며 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서 사용된 용어 “ScFv(single-chain Fv, 단일사슬단편항체 또는 항체 단편)”는 경쇄 및 중쇄의 가변영역을 연결한 항체이다. 경우에 따라서, 15개 내외의 아미노산이 연결된 펩타이드 사슬로 이루어진 링커(linker, 연결부위)를 포함할 수 있으며, 이때, ScFv는 경쇄 가변영역-연결부위-중쇄 가변영역, 또는 중쇄 가변영역- 연결부위-경쇄 가변영역의 구조를 가질 수 있으며, 원 항체와 동일 혹은 유사한 항원특이성을 가진다.
본 발명에서 사용된 용어 “가변영역(variable region)”은 항원과 특이적으로 결합하는 기능을 수행하면서 서열상의 많은 변이를 보이는 부위를 의미하는데, 대체로 상보성 결정 영역(complementarity determining regions; CDR)과 프레임워크 영역(framework region; FR)을 포함한다.
본 발명에서 사용된 용어 “항체(또는 ScFv) 라이브러리”는 서로 다른 서열을 가지는 다양한 항체 유전자들의 집합이다. 항체 라이브러리로부터 임의의 항원에 대해 특이적 항체를 분리하기 위해서는 매우 높은 다양성이 요구되며, 서로 다른 항체 클론들로 이루어진 라이브러리가 구축되어 사용된다. 이러한 항체라이브러리를 이루는 항체 유전자는 예를 들어, 파지미드(phagemid) 벡터에 클로닝되어 형질전환체(대장균)에 형질주입 될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 “인간항체”는 광범위하게는 인간의 면역글로불린으로부터 유래된 가변영역(CDR 및 FR)을 포함하는 항체를 의미하고, 보다 좁은 범위로는 인간의 면역글로불린으로부터 유래된 가변영역 및 불변영역(constant region)을 포함하는 항체를 의미한다. 상기 인간항체는 전체 항체(whole) 형태일 뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 상기 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결된 형태가 될 수 있는데, 바람직하게는 단일 클론 항체가 될 수 있다. 아울러, 상기 항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 이중쇄 Fv(dsFv), scFv 등을 포함할 수 있다. 상기 항체 단편 중 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 포함할 수 있고, 상기 Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 포함한다는 점에서 Fab와 구별될 수 있으며, 상기 F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 형성한다는 점에서 다른 단편과 구별될 수 있다. 한편, 상기 Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각을 의미하고, 통상적으로 단쇄 Fv(scFv)와 이중쇄 Fv(dsFv)로 구별되는데, 상기 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결된 형태가 될 수 있고, 상기 이중쇄 Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결된 형태가 될 수 있다. 이들 기능적인 단편은 다양한 방법으로 제조될 수 있는데, 통상적으로는 효소를 이용한 항체 단백질의 가수분해를 통해 제조될 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하며 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있으며, 이들 재조합 기술은 당업계에 이미 공지되어 있다.
상기 인간항체는 모든 구성요소가 인간으로부터 유래되었기 때문에, 기존의 인간화 항체 또는 마우스 항체에 비해서 면역화 반응이 일어날 확률이 적어서 인간에게 투여하였을 경우 원하지 않는 면역반응이 일어나지 않는 장점이 있으므로, 인간을 대상으로 하는 치료용 항체로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 “단일클론 항체”는 단일한 항원성 부위(단일 에피토프)에 대해서 지시되어 이와 특이적인 결합을 하는 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상 본 발명의 단일 클론 항체는 페리오스틴(Periostin;POSTN)에 특이적으로 결합하므로, 페리오스틴을 인식하는 단백질 분자이다.
항원의 특정 에피토프(epitope)를 인식하여 항원-항체 복합체를 형성하는 항체의 주요 부위는 중쇄 및 경쇄의 가변영역, 특히 CDR이 이러한 복합체 형성에 기여하므로, 본 발명은 상기한 본 발명의 단일 클론 항체의 가변영역, 특히 CDR을 포함하는 이의 키메릭(chimeric) 항체, 인간화(humanized) 항체 등을 본 발명의 범위에 포함한다. 또한, 본 발명은 상기한 바와 같은 결합 특성을 갖는 한 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편들을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
이에, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 상보성 결정 영역(CDR)1, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역(VH); 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역(VJ);을 포함하는 단일클론 인간항체 P1 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
상기 중쇄 가변영역은 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되고, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시될 수 있다.
상기 단일클론 인간항체 P1 또는 이의 항원 단편은 페리오스틴(Periostin;POSTN)에 특이적으로 결합할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 단일클론 인간항체 P1 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 cDNA를 제공한다.
상기 cDNA는 중쇄 가변영역을 코딩하는 서열번호 9의 염기서열 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 서열번호 10의 염기서열로 표시될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 cDNA를 포함하는 재조합 바이러스 벡터 및 상기 재조합 바이러스 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환된 세포를 배지 내에서 배양하는 단계; 및 상기 배양된 세포 또는 배양 배지로부터 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수 및 정제하는 단계;를 포함하는 인간항체 P1 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 페리오스틴 효능제(agonist)를 유효성분으로 포함하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 페리오스틴 효능제는 상기 단일클론 인간항체 P1, 이의 항원 결합 단편 및 페리오스틴 기질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
상기 대사성 질환은 비만 또는 당뇨병일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
상기 페리오스틴 효능제는 인슐린 분비 베타세포로 분화 유도할 수 있다. 베타세포는 인슐린 분비를 유도하여 당뇨병 등의 대사성 질환을 예방 내지 치료할 수 있다.
본 발명의 조성물이 약학 조성물인 경우, 투여를 위하여, 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형 제제는 상기 유효성분 외에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 과제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로솔, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 시간에 따라 다르지만, 당 업자에 의해 적절하게 선택될 수 있는 바, 상기 조성물의 일일 투여량은 바람직하게는 0.001 mg/kg 내지 50 mg/kg이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 세포주에 실험물질을 처리하는 단계; 상기 실험물질이 처리된 세포주에서 페리오스틴(Periostin;POSTN)의 발현 또는 활성화 정도를 측정하는 단계; 및 대조구 시료와 비교하여 상기 페리오스틴의 발현 또는 활성화 정도가 증가된 시험물질을 선별하는 단계;를 포함하고,
상기 시험물질의 선별에 본 발명의 단일클론 인간항체 P1을 사용하는 것을 특징으로 하는 대사성 질환 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용된 용어 “시험물질”은 유전자의 발현량에 영향을 미치거나, 단백질의 발현 또는 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 후보 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 인슐린 분비 베타세포 분화 유도용 조성물에 관한 것이며, 상기 조성물은 시약조성물 또는 의약조성물 또는 건강기능 식품조성물로 제공될 수 있다.
본 발명은 줄기세포를 인슐린 분비 베타세포로 분화 유도하는 특징이 있는 항체에 관한 것으로서, 상기 항체는 막 결합 단백질인 페리오스틴(Periostin;POSTN)을 표적 항원으로 한다. 본 발명의 항체를 이용하여 분화된 베타 세포는 췌장으로 이동하여 인슐린을 분비할 수 있어, 당뇨병 또는 이와 관련돤 대사성 질환의 치료제로 적용할 수 있다. 또한, 부작용이 적고 체내 반감기가 긴 항체의 사용은 종래 치료제들의 단점을 보완하고 치료 효과를 향상시킬 수 있다. 게다가 본 발명의 항체를 이용하여 페리오스틴(Periostin;POSTN) 효능제의 발굴용 진단키트로도 활용가능하다.
도 1은 세포 표면의 원형질막에 결합하는 형태의 108개의 고유한 인간 ScFv 항체 유전자 라이브러리가 포함된 렌티바이러스 벡터들을 마우스 골수 세포에 감염시키는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 세포의 이동을 조절하는 효능제 항체에 관한 것으로, 도 2a는 골수에서 췌장으로의 세포 이동을 나타내는 모식도이고, 도2b와 도 2c는 P1 항체 처리된 tdTomato+세포가 회수한 췌장에서 확인됨을 광학현미경으로 관찰한 것이다.
도 3은 P1 항체로 인해 분화된 췌장 내 세포의 면역조직화학 염색 분석 결과로서, 도 3a는 Insulin과 PDX-1 발현 상태를 확인한 것이고, 도 3b는 글루카곤의 발현 상태를 확인한 것이다.
도 4는 P1 항체 처리된 인간 CD34+ 세포의 분화 상태를 확인한 결과로서, 도 4a는 분화유도된 세포를 광학현미경으로 관찰한 것이고, 도 4b는 분화유도된 세포의 인슐린 발현 상태를 웨스턴 블록으로 확인한 것이며, 도 4c의 유세포 분석을 통해 인슐린, PDX-1 및 Nkx-6.1의 발현 상태를 확인한 것이다.
도 5는 P1 항체의 표적 및 신호전달 단백질을 확인한 결과로서, 도 5a는 페리오스틴(Periostin; POSTN)이 P1 항체의 표적 항원임을 웨스턴 블롯으로 확인한 것이며, 도 5b는 베타 세포 관련 유전자인 POSTN, IGTB1, ACTB를 RNA 시퀀싱을 통해 확인한 것이며, 도 5c는 P1 항체의 베타세포의 분화에 AKT와 ERK의 인산화가 관련됨을 웨스턴 블롯으로 확인한 것이다.
도 6 및 도 7은 본 발명의 P1 항체의 아미노산 서열 및 염기서열 정보를 나타낸 것이다.
도 2는 세포의 이동을 조절하는 효능제 항체에 관한 것으로, 도 2a는 골수에서 췌장으로의 세포 이동을 나타내는 모식도이고, 도2b와 도 2c는 P1 항체 처리된 tdTomato+세포가 회수한 췌장에서 확인됨을 광학현미경으로 관찰한 것이다.
도 3은 P1 항체로 인해 분화된 췌장 내 세포의 면역조직화학 염색 분석 결과로서, 도 3a는 Insulin과 PDX-1 발현 상태를 확인한 것이고, 도 3b는 글루카곤의 발현 상태를 확인한 것이다.
도 4는 P1 항체 처리된 인간 CD34+ 세포의 분화 상태를 확인한 결과로서, 도 4a는 분화유도된 세포를 광학현미경으로 관찰한 것이고, 도 4b는 분화유도된 세포의 인슐린 발현 상태를 웨스턴 블록으로 확인한 것이며, 도 4c의 유세포 분석을 통해 인슐린, PDX-1 및 Nkx-6.1의 발현 상태를 확인한 것이다.
도 5는 P1 항체의 표적 및 신호전달 단백질을 확인한 결과로서, 도 5a는 페리오스틴(Periostin; POSTN)이 P1 항체의 표적 항원임을 웨스턴 블롯으로 확인한 것이며, 도 5b는 베타 세포 관련 유전자인 POSTN, IGTB1, ACTB를 RNA 시퀀싱을 통해 확인한 것이며, 도 5c는 P1 항체의 베타세포의 분화에 AKT와 ERK의 인산화가 관련됨을 웨스턴 블롯으로 확인한 것이다.
도 6 및 도 7은 본 발명의 P1 항체의 아미노산 서열 및 염기서열 정보를 나타낸 것이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
실시예 1: 마우스 및 세포주
마우스는 C57BL/6J와 B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm9(CAG-ttdTomato)Hze /J(The Jackson laboratory)를 사용하였다. 마우스는 Scripps Research Institute의 동물실험윤리위원회(The Animal Care and Use Committee)의 승인을 받은 프로토콜에 따라 보관 및 취급하였다.
HEK293T 세포주는 10%(v/v) FCS(fetal calf serum), 페니실린 및 스트렙토마이신(Gibco-Invitrogen)이 포함된 DMEM 배지에서 배양하였으며, Expi293F 세포주는 Expi293 Expression 배지(Gibco-Invitrogen)에서 배양하였다. 인간 CD34+ 세포(All-Cells)와 마우스 골수 세포는 사이토카인 칵테일 100(STEMCELL Technologies)이 포함된 StemSpan 무혈청 배지, StemSpan 무혈청 배지, 또는, 1%(v/v) FBS(fetal bovine serum)이 포함된 RPMI 배지에서 배양하였다.
실시예 2: 조합 항체 라이브러리(combinatorial antibody libraries) 및 형질 도입
Single-chain Fv(ScFv) 유전자는 naive 인간 조합 항체 라이브러리(1 X 1011 라이브러리 다양성)로부터 획득하였고, 렌티바이러스 벡터에 서브 클로닝하였다. 렌티바이러스 벡터를 pCMVD8.91 및 pVSVg 바이러스 패키징 벡터와 1:1:1의 함량비로 HEK293T 세포에 공동 형질감염시켜 렌바이러스를 생산하였다. 마우스 골수세포는 렌티바이러스와 함께 37℃에서 3일 동안 배양하였다.
실시예 3: 골수 이식
골수세포를 2의 감염 다중도에서 렌티바이러스 항체 라이브러리로 형질감염시키고, 치사량의 방사선으로 조사된 마우스에 이식하였다. 골수 이식 마우스는 1주에서 6개월 동안 사육하였다. 이 후 골수 이식 마우스로부터 췌장 조직의 랑게르한스 섬(islets of Langerhans)을 채취하고, 고정 및 회수하여 -80℃에서 냉동하고, 랑게르한스 섬으로부터 획득한 항체 유전자는 렌티바이러스 벡터에 맞춤화된 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시킨 후 전기영동을 수행하여 분석하였다.
실시예 4: scFv-Fc 단백질의 정제
ScFv-Fc 태그 융합 단백질을 코딩하는 벡터를 Expi293F 세포로 형질감염시켰다. AKTAxpress purifier(GE)를 가지는 HiTrap Protein G HP 컬럼을 사용하여 상층액의 항체를 정제하였다. 완충액을 PBS(Dulbecco, pH 7.4)로 교환하고, 정제된 단백질은 4℃에서 보관하였다.
실시예 5: 웨스턴 블롯
세포를 PBS로 세척한 다음 용해 완충액(50 mM Hepes, pH 7.2, 150 mM NaCl, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 10%(v/v) 글리세롤, 1%(v/v) Triton X-100)에 용해시켰다. 용해물은 4℃, 12,000 x g에서 15분 동안 원심분리 하였다. 단백질은 Laemmli 샘플 완충액(95℃에서 5분)으로 변성시키고, SDS/PAGE로 분리한 후, iBlot 블로팅 시스템(Invitrogen)을 사용하여 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 이동시켰다. 이후 멤브레인을 항체와 3시간 동안 항온 반응하기 전에 5%(w/v) BSA 및 트윈 20이 포함된 인산완충식염수(PBST)로 30분 동안 블로킹하였다. 블로킹 이후 1차 항체 반응 후, 각각에 대한 2차 항체를 반응하고, 이어서 멤브레인을 PBST로 세척하고 ECL로 현상하였다.
웨스턴 블롯은 골수 세포 대비 페리오스틴(Periostin;POSTN)이 단백질의 동정을 위해 사용되었다. 이 때 신호전달 단백질에 대한 인산화 반응도 확인하였으며, phospho-AKT, ERK 및 p38(Cell Signaling Technology)로 수행하였다. 각 반응의 하우스키핑 유전자로는 β-액틴을 사용하였다.
실시예 6: 유세포 분석 및 세포 분류
세포를 Insulin, PDX-1 및 Nkx-6.1에 대한 각각의 항체로 염색하고, 각 세포를 LSRII 유세포 분석기(Becton Dickinson)로 분석하였다.
실시예 7: 면역조직화학 및 면역 형광 공초점 현미경
면역조직화학은 수평으로 절단된 냉동 췌장 조직의 랑게르한스 섬 절편에서 수행하였다. 항체는 4% 말 혈청 및 0.2% Triton-X100을 포함하는 1x PBS로 희석하였으며, 분석용 1차 항체로는 Guinea pig anti-Insulin (1:1000, Dako), goat anti-PDX-1 (1:1000, R&D systems), mouse anti-Nkx-6.1 (1:1000, DSHB), mouse anti-Glucagon-1 (1:1000, Thermo fisher)를 사용하였다.
랑게르한스 섬 절편은 1차 항체와 함께 밤새 반응시키고 세척한 후 2차 항체(1:250, Invitrogen)와 1시간 동안 항온에서 반응시켰다. 절편과 커버슬립은 DAPI(ThermoFisher)가 포함된 anti-fade mounting 배지로 유리 슬라이드 위에 마운팅하였다. 공초점 현미경 검사는 Zeiss LSM 710 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 수행하였다.
실시예 8: 질량분석법(mass spectrometry)
마우스 골수세포를 준비하고 용해 완충액에 용해시켰다. 이후 용해물을 H3 항체와 함께 4℃에서 2시간 동안 반응시키고, protein G-Sepharose beads(Pierce) 50 μL와 반응시켰다. 용리액은 2-kV 전기 스프레이 전압을 갖는 나노 이온 소스로부터 선형 트랩 사중극자 질량 분석기로 도입하였다. 분석 방법은 400~2,000 m/z 범위의 전체 MS 스캔으로 구성한 다음, 전체 MS 스캔에서 가장 강력한 3가지 이온에 대한 datadependent MS/MS로 구성하였다. 선형 트랩 사중극자로부터의 미가공 데이터는 MASCOT(http://www.matrixscience.com/) 검색 엔진을 가지는 IPI 인간 FASTA 데이터베이스를 사용하여 분석하였다.
실시예 9: RNA 시퀀싱 및 데이터 분석
P1 항체로 처리된 인간 CD34+ 세포로부터 총 RNA를 분리하였다(이 때 비교군으로 isotype Ab 및 vehicle Ab 처리군 세포도 같이 실험하였다).
Illumina NEBNext Ultra ™ Directional RNA Library Prep Kit를 사용하여 RNAseq 라이브러리에서 총 RNA 시료를 준비하였다.
간략하게, 각 시료에서 500 ng의 총 RNA를 polyA로 선택하고, 이중가닥 cDNA를 합성한 다음, 시퀀싱 어댑터의 단편화 및 연장을 수행하였다. 이후 라이브러리를 바코드 PCR 프라이머로 15 사이클 증폭시키고, 정제한 후, Illumina NextSeq500에 로드하기 전에, 75개의 염기 단일 판독 시퀀싱을 위해 AMPure XP beads를 사용하여 크기를 선택하였다. 인간 전사체의 발현 수준은 Salmon(BioRxiv)을 사용하여 측정하였다. 히트맵은 Cluster3 및 JavaTreeView를 사용하여 작성하였다. 차별적으로 발현된 유전자의 기능 분석은 Ingenuity Pathway Analysis 소프트웨어(Ingenuity Systems Inc.)를 사용하여 분석하였다.
실험예 1: 세포 이동을 조절하는
in vivo
항체의 선별
본 발명에서는 골수세포가 췌장 조직으로 이동하도록 유도하는 효능제 항체를 선별하기 위해 in vivo 연구를 수행하였다. 도 1과 같이, 세포 표면의 원형질막에 결합하는 형태의 108개의 고유한 인간 ScFv 항체 유전자 라이브러리가 포함된 렌티바이러스 벡터들을 마우스 골수 세포에 감염시켰다.
감염된 세포를 치사량으로 방사선 조사된 C57BL/6J 마우스에 이식하여 췌장의 랑게르한스 섬으로의 세포 이동을 확인하였다. 7일 후, PBS로 관류한 마우스의 췌장 조직을 수득하고 게놈 DNA를 추출하였다. PCR 분석을 수행하여 췌장으로 이동한 인간 ScFv 항체 유전자를 확인하였고 이 중에서 P1 항체가 선별되었다. 이 과정은 도 1에 나타내었으며, P1 항체의 정보는 도 6 및 도 7에 나타내었다.
실험예 2: P1 항체의 효능 확인 - 골수 세포의 랑게르한스섬으로의 이동 유도
P1 항체가 골수에서 랑게르한스 섬으로 세포의 이동을 유도하는지 여부를 확인하기 위해, P1 항체 유전자를 포유동물 발현 벡터에 클로닝하고 P1 항체를 정제하였다. 공여 세포로 사용하기 위한 tdTomato+ (골수세포)를 방사선 조사된 C57BL6 마우스로 이식하고, 이어서, P1 항체(50 μg/마우스 i.p. 2회/주, 총 3주)를 이식된 C57BL6 마우스에 주사하였다.
이후, 도 2a의 모식도와 같이 췌장을 채취하여 tdTomato+가 곳곳에 발현하는 세포가 있는지를 확인하였다.
이를 위해, 췌장의 랑게르한스 섬을 광학현미경으로 관찰한 바, P1 항체가 주입된 마우스의 공여세포인 tdTomato+가 랑게르한스 섬으로 이동한 것이 도 2b 및 도 2c와 같이 확인된다.
다음으로는 랑게르한스 섬으로 이동한 골수세포의 상태를 관찰하기 위해, 면역조직화학 염색하여 그 결과를 분석하였다.
이에 도 3a와 같이, P1 항체가 주입된 tdTomato+ 세포가 랑게르한스 섬으로 잘 이동하였고 Insulin+ 및 PDX-1+ 상태임을 확인할 수 있다. 그러나 P1 항체가 아닌 대조군 항체와 반응한 골수세포는 이러한 Insulin과 PDX-1 발현이 확인되지 않는다.
또한, 한편으로 이렇게 랑게르한스 섬으로 이동한 세포가 알파 세포일 수 있기에 도 3b와 같이 글루카곤으로 염색하였으나, 글루카곤은 발현되지 않았다.
실험예 3: 항체를 이용한 인간 조혈줄기세포 CD34
+
의 베타 세포로의 분화 유도
정제된 P1 항체의 직접적인 기능을 확인하기 위해, 인간 CD34+ 세포를 P1 항체와 in vitro에서 2주간 배양하였고 세포의 모양을 관찰하였다.
그 결과, 도 4a와 같이 정제된 항체가 CD34+ 세포를 베타 세포와 유사한 형태로 세포 분화를 유도하는 것을 확인하였다(도 4a).
또한 이 상태의 세포의 인슐린 분비 상태를 웨스턴 블롯으로 확인한 바, 도 4b와 같이 대조군 세포에 비해 P1 항체가 처리된 세포에서 인슐린 분비가 현저하게 증가되어 있음을 확인할 수 있다. 도 4c의 유세포 분석 결과를 통해서도 P1 항체가 처리된 세포에서 인슐린, PDX-1 및 Nkx-6.1의 발현이 확인되어, 베타 세포와 유사한 상태로 분화됨을 알 수 있다.
실험예 4: P1 항체의 표적 동정
P1 항체의 표적 단백질을 동정하기 위해, Expi293F 세포에서 재조합 P1 항체를 생산하였다. 정제된 P1 항체를 마우스 골수에 처리하고, 세포 용해물로부터 면역 복합체를 protein A/G 컬럼으로 포획하였다. SDS 겔 염색 및 질량 분석기를 이용하여 항체와 반응하는 6개의 후보 단백질을 동정하였다.
이 단백질 중에서 페리오스틴(Periostin; POSTN)이 P1 항체의 표적 항원임을 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 즉, 도 5a의 결과와 같이 P1 항체는 마우스 골수(M BM)뿐만 아니라 정제된 페리오스틴(Periostin; POSTN) 단백질과 결합하는 것을 알 수 있다.
마찬가지로 P1 항체가 처리된 마우스 골수로부터 RNA 전사체를 분리하여 시퀀싱한 후, 항체 처리되지 않은 대조군 세포와 비교하였다.
유전자 분석 결과는 이전의 베타 세포 실험 결과와 비교 분석한 바, 도 5b와 같이, 베타 세포 관련 유전자인 POSTN, IGTB1, ACTB가 현저한 양으로 발현하는 것을 확인할 수 있었다.
P1 항체의 처리로 인한 세포의 분화 유도가 어떠한 신호전달을 통해 유도되는지를 웨스턴 블록을 통해 확인한 바, 도 5c와 같이 베타세포의 분화에 관련이 있다고 알려진 AKT와 ERK의 인산화를 통해 유도되는 것 또한 알 수 있었다. 물론 이와 같은 인산화 현상은 대조군에서는 전혀 확인되지 않았다.
이와 같은 결과를 통해 본 발명을 통해 발굴된 P1 항체가 인슐린 분비 베타 세포의 분화를 유도함을 입증할 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (12)
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 상보성 결정 영역(CDR)1, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3를 포함하는 중쇄 가변영역(VH); 및
서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 CDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 CDR2 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역(VJ);
을 포함하는 단일클론 인간항체 P1 또는 이의 항원 결합 단편. - 제1항에 있어서,
상기 중쇄 가변영역은 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되고, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 단일클론 인간항체 P1 또는 이의 항원 결합 단편. - 제1항에 있어서,
상기 단일클론 인간항체 P1 또는 이의 항원 결합 단편은 페리오스틴(Periostin;POSTN)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 단일클론 인간항체 P1 또는 이의 항원 결합 단편. - 제1항의 단일클론 인간항체 P1 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 cDNA.
- 제4항에 있어서,
상기 cDNA는 중쇄 가변영역을 코딩하는 서열번호 9의 염기서열 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 cDNA. - 제5항에 따른 cDNA를 포함하는 재조합 바이러스 벡터.
- 제6항에 따른 재조합 바이러스 벡터로 형질전환된 세포.
- 제7항에 따른 형질전환된 세포를 배지 내에서 배양하는 단계; 및 상기 배양된 세포 또는 배양 배지로부터 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수 및 정제하는 단계;를 포함하는 인간항체 P1 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법.
- 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따른 단일클론 인간항체 P1 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제9항에 있어서,
상기 단일클론 인간항체 P1은 페리오스틴(Periostin;POSTN) 효능제로서, 골수 줄기세포를 인슐린 분비 베타세포로 분화 유도하는 것을 특징으로 하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제9항에 있어서,
상기 대사성 질환은 비만 또는 당뇨병인 것을 특징으로 하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 세포주에 실험물질을 처리하는 단계;
상기 실험물질이 처리된 세포주에서 페리오스틴(Periostin;POSTN)의 발현 또는 활성화 정도를 측정하는 단계; 및
대조구 시료와 비교하여 상기 페리오스틴(Periostin;POSTN) 의 발현 또는 활성화 정도가 증가된 시험물질을 선별하는 단계;를 포함하고,
상기 시험물질의 선별에 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따른 단일클론 인간항체 P1을 사용하는 것을 특징으로 하는 대사성 질환 치료제 스크리닝 방법.
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| KR20210108972A (ko) | 2018-12-14 | 2021-09-03 | 베링거 잉겔하임 아이오 캐나다 인크. | 항페리오스틴 항체 및 이의 용도 |
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2022
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