PT1692182E - Anticorpos de cd20 com uma afinidade de ligação acrescida ao receptor fc e uma função efectora acrescida - Google Patents

Anticorpos de cd20 com uma afinidade de ligação acrescida ao receptor fc e uma função efectora acrescida Download PDF

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PT1692182E
PT1692182E PT04798998T PT04798998T PT1692182E PT 1692182 E PT1692182 E PT 1692182E PT 04798998 T PT04798998 T PT 04798998T PT 04798998 T PT04798998 T PT 04798998T PT 1692182 E PT1692182 E PT 1692182E
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cells
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PT04798998T
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Pablo Umana
Peter Bruenker
Ekkehard Moessner
Claudia Ferrara Koller
Tobias Suter
Ursula Puentener
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Roche Glycart Ag
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Description

DESCRIÇÃO
ANTICORPOS DE CD20 COM UMA AFINIDADE DE LIGAÇÃO
ACRESCIDA AO RECEPTOR FC E UMA FUNÇÃO EFECTORA
ACRESCIDA
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Domínio da invenção A presente invenção tem por objecto moléculas de ligação ao antigénio (MLAs). Em formas de realização particulares, a presente invenção tem por objecto anticorpos monoclonais recombinantes, nomeadamente anticorpos humanizados específicos para CD20 humanas. Além disso, a presente invenção tem por objecto moléculas de ácidos nucleicos que codificam essas MLAs e vectores e células hospedeiras que contêm essas moléculas de ácidos nucleicos. A presente invenção ainda tem por objecto processos para a produção das MLAs da presente invenção e processos de utilização dessas MLAs no tratamento de doenças. Além disso, a presente invenção tem por objecto MLAs com a glicosilação modificada com propriedades terapêuticas melhoradas, incluindo anticorpos com uma ligação acrescida ao receptor Fc e uma função efectora aumentada. Técnica anterior 0 sistema imunitário e anticorpos anti-CD20 0 sistema imunitário dos vertebrados, incluindo o dos seres humanos, consiste num certo número de órgãos e tipos 1 de células, que se desenvolvem de modo a reconhecerem com precisão e especificidade e a se ligarem e destruírem microrganismos exógenos ("antigénios") · Os linfócitos são críticos para a função apropriada do sistema imunitário. Estas células são produzidas no timo, baço e medula óssea (adulto) e representa cerca de 30 % do total dos glóbulos brancos presentes no sistema circulatório dos seres humanos adultos. Há duas subpopulações principais de linfócitos: células T e células B. As células T são responsáveis pela imunidade mediada pelas células, enquanto as células B são responsáveis pela produção de anticorpos (imunidade humoral). Contudo, numa resposta imunitária típica, as células T e as células B funcionam interdependentemente: as células T são activadas quando o receptor da célula T se liga a fragmentos de um antigénio que se ligam às glicoproteínas do complexo principal de histo-compatibilidade ("CPH") na superfície de uma célula que apresenta antigénios, activação essa que causa a libertação de mediadores biológicos ("interleucinas"), que estimulam as células B para as diferenciar e produzir anticorpos ("imunoglobulinas") contra o antigénio.
Cada célula B dentro do hospedeiro expressa um anticorpo de um tipo particular e com uma certa especificidade e as diferentes células B expressam anticorpos específicos para os diferentes antigénios. A proliferação de células B e a produção de anticorpos reforça uma reacção ao antigénio exógeno e normalmente cessam ambas (ou decrescem substancialmente) logo que o antigénio exógeno tenha sido neutralizado. Ocasionalmente, contudo, a proliferação de uma célula B particular continuará sem parar; essa proliferação pode resultar num cancro referido como "linfoma das células B." 2
As células T e as células B compreendem ambas proteínas da superfície das células que podem ser utilizadas como "marcadores" para a diferenciação e a identificação. Um desses marcadores de células B humanas é o antigénio Bp35 de diferenciação restrita dos linfócitos B, referido como "CD20". CD20 é expresso durante o desenvolvimento inicial de células pré-B e permanece até à diferenciação das células do plasma. Especificamente, a molécula de CD20 pode regular uma etapa no processo de activação que é necessária para iniciar o ciclo das células e a sua diferenciação e é normalmente expressa a níveis muito elevados em células B neoplásicas ("tumor"). Dado que CD20 está presente em níveis elevados em células B "malignas", isto é, as células B cuja proliferação imparável pode levar a linfomas de células B, o antigénio da superfície CD20 tem o potencial para servir como um candidato para "atingir"os linfomas de células B.
Na sua essência, esse atingir do alvo pode ser generalizado como se segue: introduzem-se, num paciente, anticorpos específicos para os antigénios da superfície de CD20 de células B, por exemplo, por meio de uma injecção. Estes anticorpos anti-CD20 ligam-se especificamente ao antigénio da superfície de células de (ostensivamente) tanto células B normais como malignas; o anticorpo anti-CD20 que se liga ao antigénio da superfície das células de CD20 pode levar à destruição e à diminuição das células B neoplásicas. Adicionalmente, os agentes químicos ou os marcadores radioactivos que têm o potencial para destruir o tumor podem ser conjugados com o anticorpo anti-CD20 de tal modo que o agente é "libertado" especificamente, por exemplo, para as células B neoplásicas. Independentemente da abordagem, um primeiro objectivo consiste em destruir o tumor: a abordagem específica pode ser determinada pelo 3 anticorpo anti-CD20 particular que é utilizado e, assim, as abordagens disponíveis para atingir o antigénio CD20 podem variar consideravelmente.
Os anticorpos monoclonais (Acsm) não conjugados podem ser medicamentos úteis para o tratamento do cancro, como foi demonstrado pela aprovação, pela U. S. Food and Drug Administration, de rituximab (Rituxan™; IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA, e Genentech Inc., San Francisco, CA) , para o tratamento de células B positivas para CD20, linfoma não de Hodgkin folicular ou de baixo grau, trastuzumab (Herceptin™; Genentech Inc,) para o tratamento de cancro da mama avançado (Grillo-Lopez, A.-J., et al, Semin. Oncol 26: 66-73 (1999); Goldenberg, Μ. M., Clin. Ther. 21: 309-18 (1999)), gemtuzumab (Mylotarg™, Celltech/Wyeth-Ayerst) para o tratamento de leucemia mielóide aguda reincidente e alemtuzumab (CAMPATH™, Millenium Pharmaceuticals/Schering AG) para o tratamento de leucemia linfocitica crónica das células B. O sucesso deste produtos baseia-se não apenas na sua eficácia mas também nos seus extraordinários perfis de segurança (Grillo-Lopez, A.-J., et al., Semin. Oncol. 26: 66-73 (1999); Goldenberg, Μ. M., Clin. Ther. 21: 309-18 (1999)). Apesar dos feitos destes fármacos, há hoje em dia um grande interesse na obtenção de actividades do anticorpo mais especificas do que é conseguido normalmente por meio da terapia com Acm não conjugado. O anticorpo monoclonal de murino, B-Lyl, é outro anticorpo conhecido por ser especifico para CD20 humano. (Poppema, S. e Visser, L., Biotest Bulletin 3: 131-139 (1987)). A patente WO 03/11878 descreve a engenharia de glicosilação de anticorpos, utilizando como exemplo C2B8 (rituxan). Este documento não menciona B-Lyl. Polyak e tal., Blood (2002), p. 3256-3262 estudaram os epitopos aos quais se ligam os vários anticorpos anti-CD20. Utilizaram 4 um B-Lyl completamente de murino como um dos painéis de 16 anticorpos em experiências para analisar a reactividade com uma região particular na ansa extracelular de CD20 e para analisar a capacidade para induzir a agregação homotípica de células e deslocar CD20 para a membrana da célula. Contudo, não providenciam uma sequência para B-Lyl e não fazem as proteínas de fusão que compreendem porções da sequência de B-Lyl, tal como anticorpos quiméricos, humanizados ou glicosilados por engenharia, que retêm a capacidade de ligar CD20. Cragg e tal., Blood (2003), p. 1045-1052, correlacionaram a lise mediada pelo complemento por vários anticorpos anti-CD20, incluindo rituximab, com a segregação de CD20 para microdominios da membrana. Davies e tal., Biotechnology and Bioengineering - Combinatorial Chemistry (2001), p. 288-294 expressou GnTIII de rato em células de OHC que expressam rituximab. Nem sequer mencionam B-Lyl de murino, deixando apenas a produção de polipéptidos de fusão que compreendem as sequências de B-Lyl ou de anticorpos do tipo II glicosilados por engenharia. A patente US 2003/0.007.097 tem por objecto anticorpos recombinantes co-expresos com GnTIII, mas o único exemplo de trabalho é dirigido à expressão de GnTIII em cálulas que expressam rituximab. O anticorpo B-Lyl não é descrito. A patente WO 00/67796 tem por objecto processos de tratamento de doenças autoimunes com antagonistas que se ligam a marcadores da superfície de células B (por exemplo, anticorpos anti-CD20). Os exemplos são sirigidos a rituximab. O anticorpo B-Lyl não é descrito.
Os resultados de um certo número de estudos sugerem que os mecanismos dependentes do receptor Fc contribuem substancialmente para a acção de anticorpos citotóxicos contra tumores e indicam que um anticorpo óptimo contra tumores ligar-se-á preferencialmente a receptores Fc de 5 activação e, minimamente, ao seu parceiro inibidor FcyRIIB. (Clynes, R. A., et al., Nature Medicine 6 (4): 443-446 (2000); Kalergis, A. M., e Ravetch, J. V., J. Exp. Med. 195 (12): 1653-1659 (Junho 2002). Por exemplo, os resultados de pelo menos um estudo sugerem que o receptor FcYRIIIa em particular está fortemente associado à eficácia da terapia de anticorpos. (Cartron, G., et al., Blood 99 (3): 754-757 (Fevereiro 2002)). Esse estudo mostrou que os pacientes homozigóticos para FcYRIIIa têm uma resposta melhor a rituximab do que os pacientes heterozigóticos. Os autores concluíram que uma resposta superior era devida a uma ligação melhor, in vivo, do anticorpo a FcYRIIIa, o que resultou numa melhor actividade de CCDA contra células de linfoma. (Cartron, G., et al., Blood 99 (3): 754-757 (Fevereiro 2002)). Já foram relatadas várias tentativas para atingir o antigénio da superfície de CD20. O anticorpo monoclonal de murino (rato) 1F5 (um anticorpo anti-CD20) foi supostamente administrado por infusão intravenosa contínua a pacientes com linfoma das células B. Está descrito que foram necessários níveis extremamente altos (> 2 gramas) de 1F5 para diminuir as células de tumor em circulação e os resultados foram descritos como "transitórios". Press et al., "Monoclonal Antibody 1F5 (Anti-CD20) Serotherapy of Human B-Cell Lymphomas." Blood 69/2: 584-591 (1987). Um problema potencial com esta abordagem é que os anticorpos monoclonais não humanos (por exemplo, anticorpos monoclonais de murinos) normalmente perdem a funcionalidade efectora humana, isto é, são incapazes, inter alia, de mediar a lise dependente do complemento ou de realizar a lise de células-alvo humanas através da toxicidade celular dependente do anticorpo ou a fagocitose mediada pelo receptor Fc. Além disso, os anticorpos monoclonais não 6 humanos podem ser reconhecidos pelo hospedeiro humano como uma proteina exógena; por isso, injecções repetidas desses anticorpos estranhos podem levar à indução de respostas imunitárias que levam a reacções perigosas de hipersensibilidade. Para os anticorpos monoclonais à base de murino, isto é muitas vezes referido como uma resposta do anticorpo humano anti-murganho ou uma "RAHA, HAMA na terminologia inglesa". Adicionalmente, estes anticorpos "estranhos" podem ser atacados pelo sistema imunitário do hospedeiro tal como estão, com efeito podem ser neutralizados antes de atingirem o sitio-alvo.
Uma outra abordagem relatada para melhorar a capacidade de anticorpos monoclonais de murino para serem eficazes no tratamento de distúrbios de células B tem consistido em conjugar um marcador radioactivo ou uma toxina com o anticorpo de tal modo que o marcador ou a toxina fiquem localizados no sítio do tumor. Por exemplo, o anticorpo 1F5, referenciado antes, tem sido "marcado" com iodo 131 ("131I") e foi avaliado quanto à biodistribuição em dois pacientes. Ver Eary, J. F. et al.,"Imaging and Treatment of B-Cell Lymphoma"J. Nuc. Med. 31/8: 1257-1268 (1990); ver também, Press, O. W. et al., "Treatment of Refractory Non-Hodgkin's Lymphoma with Radiolabeled MB-1 (Anti-CD37) Antibody" J. Clin. One. 7/8: 1027-1038 (1989) (indicação de que um paciente tratado cpm 1F-5 marcado com 131I atinge uma "resposta parcial"); Goldenberg, D. M. et al., "Targeting, Dosimetry and Radioimmunotherapy of B- Cell Lymphomas with Iodine-131-Labeled LL2 Monoclonal Antibody" Clin. One. 9/4: 548-564 (1991) (três em oito pacientes que receberam múltiplas injecções relataram ter desenvolvido uma resposta RAHA); Appelbaum, F. R. "Radiolabeled Monoclonal Antibodies in the Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma" Hem./One. Clinics of N. A. 5/5: 1013-1025 (1991) 7 (artigo de revisão); Press, 0. W. et al. "Radiolabeled-Antibody Therapy of B-Cell Lymphoma with Autologous Bone Marrow Support. "NewEngland J. Med. 329/17: 1219-12223 (1993) (anticorpo 1F5 e BI anti-CD20 marcado com iodo-131); e Kaminski, M. G. et al. "Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphoma with 1311 Anti-Bl (Anti-CD-20) Antibody". New England J. Med. 329/7 (1993) (anticorpo BI anti-CD-20 marcado com iodo-131; designado daqui para a frente por "Kaminski"). Também se conjugaram toxinas (isto é, agentes quimioterapêuticos tais como doxorubicina ou mitomicina C) com anticorpos. Ver, por exemplo, o pedido de patente publicada PCT WO 92/07466 (publicado em 14 de Maio de 1992).
Os anticorpos quiméricos que compreendem porções de anticorpos de duas ou mais espécies diferentes (por exemplo, murganhos e seres humanos) têm sido desenvolvidos como uma alternativa a anticorpos "conjugados". Por exemplo, Liu, A. Y. et al, "Production of a Mouse-Human Chimeric Monoclonal Antibody to CD20 with Potent Fc-Dependent Biologic Activity"J. Immun. 139/10: 3521-3526 (1987), descreve um anticorpo quimérico de murganho/ser humano dirigido contra o antigénio CD20. Ver também, a publicação PCT No. WO 88/04936. Por exemplo, a rituximab (RITUXAN ®), um anticorpo quimérico anti-CD20, já foi aprovado para o tratamento de linfoma não de Hodgkins.
Dada a expressão de CD20 pelos linfomas de células B, este antigénio pode servir como um candidato para "atingir" esses linfomas. Na sua essência, esse atingir do alvo pode ser generalizado como se segue: administra-se a um paciente anticorpos específicos para antigénios da superfície de CD20 nas células B. Estes anticorpos anti-CD20 ligam-se especificamente ao antigénio CD20 (ostensivamente) de células B, tanto normais como malignas e o anticorpo que se liga ao antigénio à superfície das células de CD20 resulta na destruição e na diminuição das células B tumorigénicas. Adicionalmente, os agentes químicos, as citotoxinas ou os agentes radioactivos podem ligar-se directamente ou indirectamente ao anticorpo anti-CD20 de tal modo que o agente é "libertado" selectivamente para o antigénio CD20 que expressam as células B. Com estas duas abordagens, o objectivo primário é destruir o tumor. A abordagem específica dependerá do anticorpo anti-CD20 particular que é utilizado. Assim, é evidente que as várias abordagens para atingir o antigénio CD20 podem variar consideravelmente. 0 anticorpo rituximab (RITUXAN®) é um domínio constante de murino gama 1 humano quimérico tratado por engenharia genética, dirigido contra o antigénio humano CD20. Este anticorpo quimérico contém domínios constantes gama 1 humano e é identificado pelo nome de "C2B8" na pat. U.S. No. 5.736.137 (Andersen et. al.) publicada em 17 de Abril de 1998, concedida à IDEC Pharmaceuticals Corporation. 0 RITUXAN® está aprovado para o tratamento de pacientes com linfoma de células B não de Hodgkin, positiva para CD20, refractário em baixo grau ou reincidente. Os estudos do mecanismo de acção in vitro mostraram que o RITUXAN® exibe citotoxicidade dependente do complemento humano (CDC) (Reff et. al, Blood 83 (2): 435-445 (1994)). Adicionalmente, exibe uma actividade significativa em ensaios que medem a citotoxicidade celular dependente do anticorpo (CCDA). 0 RITUXAN® mostrou possuir actividade anti-proliferativa em ensaios de incorporação de timidina e uma capacidade limitada para induzir directamente a apoptose, enquanto os anticorpos de CD20 não (Maloney et. al, Blood 88 (10): 637a (1996)). 9
Glicosilação do anticorpo 0 componente de oligossacárido pode afectar significativamente as propriedades relevantes para a eficácia de uma glicoproteina terapêutica, incluindo a estabilidade fisica, a resistência ao ataque da protease, as interacções com o sistema imunitário, a farmacocinética e a actividade biológica especifica Essas propriedades podem depender não apenas da presença ou da ausência, mas também das estruturas especificas dos oligossacáridos. Pode-se fazer algumas generalizações entre a estrutura de oligossacáridos e a função da glicoproteina. Por exemplo, algumas estruturas de oligossacáridos medeiam o rápido desaparecimento da glicoproteina da corrente sanguínea através de interacções com proteínas específicas de ligação aos hidratos de carbono, enquanto outros se podem ligar por meio de anticorpos e provocar reacções imunitárias indesejadas. (Jenkins et al., Nature Biotechnol. 14: 975-81 (1996)).
As células de mamíferos são as células hospedeiras preferidas para a produção de glicoproteínas terapêuticas, devido à sua capacidade para glicosilar proteínas na maior parte compatível com aplicações em seres humanos. (Cumming et al., Glycobiology 1: 115-30 (1991); Jenkins et al., Nature Biotechnol. 14: 975-81 (1996)). As bactérias só muito raramente glicosilam proteínas e, tal como outros tipos comuns de hospedeiros, tal como leveduras, fungos filamentosos, células de plantas e de insectos, produzindo modelos de glicosilação associados com o rápido desaparecimento na corrente sanguínea, interacções imunitárias indesejáveis e, nalguns casos, actividade biológica reduzida. Entre as células de mamíferos, as células mais utilizadas nas últimas duas décadas foram as 10 células de ovário de hamster chinês (OHC) . Para além de fornecerem modelos de glicosilação apropriados, estas células permitem a geração consistente de linhas de células clonais, altamente produtivas, geneticamente estáveis. Pode-se fazer culturas com elevadas densidades em bioreactores simples utilizando um meio isento de soro e permitindo o desenvolvimento de bioprocessos seguros e reprodutíveis. Outras células de animais utilizadas normalmente incluem as células de rim de hamster bebé (RHB), células de mieloma de murganho NSO e SP2/0. Mais recentemente, a produção de animais transgénicos também foi testada. (Jenkins et al., Nature Biotechnol. 14: 975-81 (1996)).
Todos os anticorpos contêm estruturas de hidratos de carbono em posições conservadas nas regiões constantes de cadeia pesada, em que cada isotipo possui uma série distinta de hidratos de carbono ligados a N, que afectam de forma diferente a junção das proteínas, a secreção ou a actividade funcional. (Wright, A., e Morrison, S. L., Trends Biotech.15: 26-32 (1997)). A estrutura dos hidratos de carbono ligados a N varia consideravelmente, consoante o grau de tratamento e pode incluir manose superior, com ramificações múltiplas, assim como um complexo biantenário (bi-ramifiçado) de oligossacáridos. (Wright, A., e Morrison, S. L., Trends Biotech. 15: 26-32 (1997)). Normalmente, há um tratamento heterogéneo das estruturas nucleares do oligossacárido ligadas a um sítio de glicosilação particular de tal modo que mesmo os anticorpos monoclonais existem como glicoformas múltiplas. Do mesmo modo, tem-se demonstrado que as principais diferenças na glicosilação dos anticorpos ocorrem entre as linhas de células e vêem-se diferenças ainda que menores para uma dada linha de células que cresce em diferentes condições de 11 cultura. (Lifely, M. R. et al., Glycobiology 5 (8): 813-22 (1995)) .
Uma maneira de obter grandes aumentos de potência, enquanto se mantém um processo de produção simples e evitando potencialmente efeitos colaterais significativos e indesejáveis, consiste em aumentar as funções efectoras mediadas por células naturais de anticorpos monoclonais por meio de engenharia dos seus componentes de oligossacáridos tal como descrito em Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17: 176-180 (1999) e pat. U. S. No. 6.602.684. Os anticorpos do tipo IgGl, os mais vulgarmente utilizados na imunoterapia do cancro, são glicoproteínas que têm um sitio de glicosilação conservado, ligado a N em Asn297 em cada domínio CH2. Os dois complexos biantenários de oligossacáridos ligados a Asn297 estão enterrados entre os domínios CH2, formando contactos extensivos com a estrutura do polipéptido e a sua presença é essencial para o anticorpo mediar funções efectoras tal como a citotoxicidade celular dependente do anticorpo (CCDA) (Lifely, M. R. , et al., Glycobiology 5: 813-822 (1995); Jefferis, R-, et al., Immunol Rev. 163: 59-76 (1998); (Wright, A. , e Morrison, S . L. , Trends Biotechnol. 15: 26- 32 (1997)).
Os requerentes mostraram previamente que a sobre-expressão em células de ovário de hamster chinês (OHC) da β (1,4)-N-acetilglicosaminiltransferase III ("GnTIII"), uma glicosiltransferase que catalisa a formação de oligossacáridos bi-ramifiçados, o que aumenta significativamente a actividade de CCDA in vitro de um anticorpo monoclonal quimérico anti-neuroblastoma (chCE7) produzido por meio de engenharia das células de OHC. (Ver Umana, P. et al., Nature Biotechnol. 17: 176-180 (1999); e 12 a publicação internacional No. WO 99/54342. 0 anticorpo chCE7 pertence a uma grande classe de Acsm não conjugados que têm uma alta afinidade e especificidade para o tumor, mas têm uma potência demasiado baixa para ser útil sob o ponto de vista clinico quando produzido em linhas de células industriais normalizadas a que falta a enzima GnTIII (Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17: 176-180 (1999)). Esse estudo foi o primeiro a mostrar que os grandes aumentos da actividade de CCDA podiam ser obtidos por engenharia das células que produzem o anticorpo para expressar GnTIII, o que leva também a um aumento na proporção de oligossacáridos, biramifiçados, associados à região constante (Fc), incluindo os oligossacáridos, biramifiçados não fucosilados, acima dos niveis encontrados em anticorpos de ocorrência natural.
Permanece a necessidade de abordagens terapêuticas reforçadas para atingir o antigénio CD20 para o tratamento de linfomas de células B em primatas, incluindo, mas não se limitando a seres humanos.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO O reconhecimento do tremendo potencial terapêutico das moléculas de ligação ao antigénio (MLAs) que têm a especificidade de ligação do anticorpo B-Lyl de murino e que foram glicosiladas por engenharia para aumentar a afinidade de ligação do receptor Fc e a função efectora, os requerentes desenvolveram um processo para a produção dessas MLAs. Inter alia, este processo envolve a produção recombinante de anticorpos quiméricos ou dos seus fragmentos quiméricos. A eficácia destas MLAs é ainda aumentada por meio de engenharia do perfil de glicosilação da região Fc do anticorpo. 13
Descreve-se um polinucleótido isolado compreende: (a) uma sequência seleccionada a partir de um grupo que consiste em: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7. (RDCs VP_!) ; (b) uma sequência seleccionada no grupo que consiste em: SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 23. (RDCs VP_2) ; e SEQ ID NO: 24. Noutro aspecto, a presente invenção tem por objecto um polipéptido isolado que compreende a SEQ ID NO.: 8, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10. (CDRs VL) . Numa das formas de realização, qualquer um destes polinucleótidos codifica um polipéptido de fusão.
Também tem por objecto um polinucleótido isolado que compreende a SEQ ID NO.: 3, um polinucleótido isolado que compreende a SEQ ID NO.: 4. ou polinucleótido isolado que compreende uma sequência seleccionada no grupo que consiste nas SEQ ID No: 29, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO : 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO : 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69; e SEQ ID NO: 71. Também tem por obj ecto um polinucleótido isolado que compreende a SEQ ID NO.: 75. Num enquadramento, esses polinucleótidos codificam polipéptidos de fusão.
Também tem por objecto um polinucleótido isolado que compreende uma sequência com pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO: 3, em que o referido polinucleótido isolado codifica um polipéptido de fusão. Num outro aspecto, também tem por objecto um polinucleótido isolado que compreende uma sequência com pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO: 4, em que o referido polinucleótido isolado codifica um polipéptido de fusão. Também tem por objecto um polinucleótido isolado que 14
compreende uma sequência com pelo menos 80 % de identidade com uma sequência seleccionada no grupo que consiste na SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO 69; e SEQ ID NO : 71, em que o referido polinucleótido isolado codifica um polipéptido de fusão. Num aspecto adicional, também tem por objecto um polinucleótido isolado que compreende uma sequência com pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO: 75, em que o referido polinucleótido isolado codifica um polipéptido de fusão.
Também tem por objecto um polinucleótido que compreende SEQ ID NO: 11 (cadeia pesada completa) ou polinucleótidos com uma identidade de 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 99 % com a SEQ ID NO: 11, assim como um polinucleótido que compreende SEQ ID NO: 12 (cadeia leve completa) ou polinucleótidos com uma identidade de 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 99 % com a SEQ ID NO: 12.
Também tem por objecto um polipéptido isolado codificando um polipéptido quimérico com a SEQ ID No.: 1. Num enaquadramento, o polinucleótido compreende uma sequência que codifica um polipéptido com a sequência da SEQ ID No.: 1; e uma sequência que codifica um polipéptido com a sequência de uma região Fc do anticorpo ou um seu fragmento, a partir de uma espécie diferente de murganho. Também tem por objecto um polipéptido isolado que codifica um polipéptido quimérico com uma sequência seleccionada no grupo que consiste nas SEQ ID No.: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ 15 ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70; e SEQ ID NO: 72. Num enquadramento, o polinucleótido compreende uma sequência que codifica um polipéptido com uma sequência seleccionada no grupo que consiste na SEQ ID No.: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70; e SEQ ID NO: 72; e uma sequência que codifica um polipéptido com a sequência de uma região Fc do anticorpo ou de um seu fragmento, a partir de uma espécie diferente da de murganho.
Ainda noutro aspecto, um polinucleótido isolado que codifica um polipéptido quimérico com a SEQ ID No.: 2. Num enquadramento, tem por objecto o polinucleótido que compreende uma sequência que codifica um polipéptido com a sequência da SEQ ID No.: 2; e uma sequência que codifica um polipéptido com a sequência de uma região Fc do anticorpo ou de um seu fragmento, a partir de uma espécie diferente da de murganho. Ainda noutro aspecto, tem por objecto um polinucleótido isolado que codifica um polipéptido quimérico com a SEQ ID No.: 76. Num enquadramento, o polinucleótido compreende uma sequência que codifica um polipéptido com a sequência da SEQ ID No.: 76; e uma sequência que codifica um polipéptido com a sequência de uma região Fc do anticorpo ou de um seu fragmento, a partir de uma espécie diferente da de murganho. 16
Também tem por objecto um polipéptido isolado compreendendo uma sequência que codifica um polipéptido com a região VH do anticorpo B-Lyl de murino ou as suas variantes funcionais e uma sequência que codifica um polipéptido com a sequência de uma região Fc do anticorpo ou um seu fragmento, a partir de espécies diferentes da de murganho. Num outro aspecto, tem por objecto, um polinucleótido isolado compreendendo uma sequência que codifica um polipéptido com a região VL do anticorpo B-Lyl de murino ou as suas variantes funcionais e uma sequência que codifica um polipéptido com a sequência de uma região Fc do anticorpo ou um seu fragmento, a partir de espécies diferentes das de murganho. A presente invenção ainda tem por objecto um vector de expressão que compreende qualquer um dos polinucleótidos isolados descritos antes e uma célula hospedeira, de acordo com as reivindicações 12 a 17 que compreende esse vector de expressão. Num outro aspecto, a presente invenção tem por objecto uma célula hospedeira de acordo com uma qualquer das reivindicações 12 a 17.
Também tem por objecto um polipéptido isolado compreendendo (a) uma sequência seleccionada no grupo que consiste na SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 17 (RDCsVp-i) ; (b) uma sequência seleccionada num grupo que consiste na SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27 (RDCs VP-2) ; e SEQ ID NO: 28, em que o referido polipéptido é um polipéptido de fusão. Noutro aspecto, a presente invenção tem por objecto um polipéptido isolado que compreende a SEQ ID NO.: 18, a SEQ ID NO: 19 e a SEQ ID NO: 20. (RDCs VL) , em que o referido polipéptido é um polipéptido de fusão. 17
A presente invenção também tem por objecto um polipéptido quimérico que compreende a sequência da SEQ ID NO.: 1 ou uma sua variante e um polipéptido quimérico que compreende a sequência da SEQ ID NO.: 2 ou uma sua variante. Num enquadramento, qualquer um destes polipéptidos ainda compreende uma região humana Fc. Também tem por objecto um polipéptido quimérico que compreende uma sequência seleccionada no grupo que consiste nas SEQ ID
No : 3C , SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO : 40, SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO : 48, SEQ ID NO : 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO : 56, SEQ ID NO : 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO : 64, SEQ ID NO : 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70 ; e SEQ ID NO: 72 OU uma sua variante e um polipéptido quimérico que compreende a sequência da SEQ ID NO.: 76 ou uma sua variante. Num enquadramento, qualquer um destes polipéptidos ainda compreende uma região humana Fc.
Também tem por objecto um polipéptido que compreende uma sequência derivada do anticorpo B-Lyl de murino e uma sequência derivada de um polipéptido heterólogo e uma molécula de ligação ao antigénio que compreende esse polipéptido. A molécula de ligação ao antigénio é um anticorpo. 0 anticorpo é humanizado.
Também tem por objecto um polipéptido um polipéptido isolado que compreende a SEQ ID NO.: 13 ou uma sua variante e um polipéptido isolado que compreende a SEQ ID NO.: 14.
Também tem por objecto uma MLA, que é capaz de competir com o anticorpo B-Lyl de murino para a ligação a CD20 e que é quimérico. Num enquadramento, a MLA é um anticorpo ou um seu fragmento. Num outro enquadramento, a MLA é um anticorpo recombinante que compreende uma região 18
Vp com uma sequência de aminoácidos seleccionada no grupo nas SEQ ID NO. : 1, SEQ ID NO : 30, SEQ ID NO: 32 , SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO : 38, SEQ ID NO: 40 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO: 48 , SEQ ID NO: O LO SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO : 54, SEQ ID NO: 56 , SEQ ID NO: 00 LO SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO : 62, SEQ ID NO: 64 , SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO : 68 , SEQ ID NO: 70; 2 SEQ ID NO: 72. Num outro enquadramento, a MLA é um anticorpo recombinante que compreende uma região VL com a sequência de aminoácidos seleccionada no grupo que consiste na SEQ ID NO.: 2 e a SEQ ID NO: 76. A MLA é um anticorpo recombinante que é humanizado. Noutro enquadramento, a MLA é um anticorpo recombinante que compreende uma região humana Fc. Num outro enquadramento, qualquer uma das MLAs discutidas antes pode ser conjugada com uma parte tal como uma toxina ou um marcador de rádio. A presente invenção tem ainda por objecto uma MLA da presente invenção, tendo a referida MLA oligossacáridos modificados. Num enquadramento, os oligossacáridos modificados têm uma fucosilação reduzida quando comparada com os oligossacáridos não modificados. Noutros enquadramentos, os oligossacáridos modificados são hibridos ou complexos. Num outro enquadramento, a MLA tem uma proporção acrescida de oligossacáridos não fucosilados ou biramifiçados, oligossacáridos não fucosilados na região Fc da referida molécula. Num enquadramento, os oligossacáridos não fucosilados, biramifiçados são hibridos. Num outro enquadramento, os oligossacáridos não fucosilados, biramifiçados são complexos. Num enquadramento, pelo menos 20 % dos oligossacáridos na região Fc do referido polipéptido são não fucosilados ou biramifiçados não fucosilados. Em enquadramentos mais preferidos, pelo menos 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 7 0% ou 75 19 ou mais dos oligossacáridos são não fucosilados ou biramifiçados não fucosilados.
Tem também por objecto um polinucleótido que codifica qualquer um das MLAs discutidos antes e que expressa vectores e células que compreendem esse polinucleótido.
Tem também por objecto um processo para a produção de uma MLA, que é capaz de competir com o anticorpo B-Lyl de murino quanto à ligação a CD20 e em que a referida MLA é quimérica; compreendendo o referido processo: (a) a cultura de uma células hospedeira que compreende um polinucleótido que codifica uma MLA da presente invenção num meio em condições que permitem a expressão do referido polinucleótido codificando a referida MLA; e (b) a recuperação da referida MLA a partir da cultura resultante.
Num outro aspecto, a presente invenção tem por objecto uma composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 18, que compreende a MLA da presente invenção. Considera-se que a composição farmacêutica pode ainda compreender um veiculo ou um adjuvante, aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico ou uma combinação deles.
Num outro aspecto, a presente invenção pode ser utilizada num processo para o tratamento de uma doença que pode ser tratada por meio da depleção das células B. 0 processo compreende a administração de uma quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico da MLA da presente invenção a um ser humano que dela necessite. Num enquadramento preferido, a doença é tratada por administração de uma MLA que é um anticorpo quimérico ou um fragmento quimérico de um anticorpo. 20
Também tem por objecto uma célula hospedeira tratada por engenharia para expressar pelo menos um ácido nucleico que codifica um polipéptido tendo a actividade de GnTIII numa quantidade suficiente para modificar os oligossacáridos na região Fc produzida pela célula hospedeira, em que a MLA é capaz de competir com o anticorpo B-Lyl de murino quanto à ligação a CD20 e em que a MLA é quimérica. Num enquadramento, o polipéptido que tem actividade de GnTIII é um polipéptido de fusão. Noutro enquadramento, a MLA produzida pela célula hospedeira é um anticorpo ou um fragmento de anticorpo. Noutro outro enquadramento, a MLA compreende uma região equivalente à região Fc de uma IgG humana.
Também tem por objecto um polipéptido isolado que compreende pelo menos uma região de determinação de complementaridade do anticorpo B-Lyl de murino ou uma variante ou uma sua forma truncada contendo pelo menos os residuos que determinam a especificidade da referida região de determinação de complementaridade, em que o referido polinucleótido isolado codifica um polipéptido de fusão. Preferencialmente, esses polinucleótidos isolados codificam um polipéptido de fusão que é uma molécula de ligação ao antigénio. Num enquadramento, o polinucleótido compreende três regiões de determinação de complementaridade do anticorpo B-Lyl de murino ou as suas variantes ou as suas formas truncadas contendo pelo menos os residuos que determinam a especificidade para cada uma das referidas três regiões de determinação de complementaridade. Noutro enquadramento, o polinucleótido codifica toda a região variável de um anticorpo quimérico de cadeia leve ou pesada (por exemplo, humanizado). 21
Também tem por objecto uma molécula que combina com o antigénio que compreende pelo menos uma região de determinação de complementaridade do anticorpo B-Lyl de murino ou uma variante ou uma sua forma truncada contendo pelo menos os resíduos que determinam a especificidade para a referida região de determinação de complementaridade e que compreende uma sequência derivada de um polipéptido heterólogo. Num enquadramento, a molécula de ligação ao antigénio compreende três regiões de determinação de complementaridade do anticorpo B-Lyl de murino ou as suas variantes ou as suas formas truncadas contendo pelo menos os resíduos que determinam a especificidade para cada uma das referidas três regiões de determinação de complementaridade. Num outro aspecto, a molécula de ligação ao antigénio compreende a região variável de uma cadeia leve ou uma cadeia pesada de um anticorpo. Num enquadramento particularmente útil, a molécula de ligação ao antigénio é um anticorpo quimérico, por exemplo, humanizado. Essas moléculas de ligação ao antigénio podem ser utilizadas no tratamento de doenças, incluindo linfomas de células B. A presente invenção é o primeiro exemplo conhecido em que o anticorpo anti-CD20 do tipo II foi tratado por engenharia para comportar funções efectoras aumentadas tais como CCDA, retendo, ao mesmo tempo, uma capacidade potente de apoptose. De acordo com isto, a presente invenção tem por objecto um anticorpo anti-CD20 do tipo II tratado por engenharia tendo uma CCDA aumentada em resultado da referida engenharia e sem perda da capacidade substancial para induzir a apoptose. Num enquadramento, os anticorpos anti-CD-20 do tipo II foram tratados por engenharia para terem um modelo alterado de glicosilação na região Fc. Num enquadramento particular, a glicosilação alterada 22 compreende um nível elevado de resíduos do complexo biramifiçados na região Fc. Num outro enquadramento particular, a glicosilação alterada compreende um nível reduzido de resíduos de fucose na região Fc. Noutro enquadramento, os anticorpos anti-CD20 do tipo II sofreram uma engenharia dos polipéptidos. A presente invenção tem ainda por objecto processos para a produção desses anticorpos do tipo II que sofreram uma engenharia e os processos de utilização desses anticorpos no tratamento de vários distúrbios das células B, incluindo linfomas das células B. A célula hospedeira da presente invenção pode seleccionar-se no grupo que inclui, mas não se limita a células de OHC, células de RHB, células de NSO, células de SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de murganho P3X63, células de PER, células de PER.C6 ou uma células de hibridoma. Num enquadramento, a célula hospedeira da presente invenção compreende ainda um polinucleótido transfectado compreendendo um polinucleótido que codifica a região VL do anticorpo B-Lyl de murino ou as suas variantes e uma sequência que codifica uma região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina humana. Num outro enquadramento, a células hospedeira da presente invenção compreende um polinucleótido transfectado compreendendo um polinucleótido que codifica a região VP do anticorpo B-Lyl de murino ou as suas variantes e uma sequência que codifica uma região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina humana.
Num outro aspecto, a presente invenção tem por objecto uma célula hospedeira que produz uma MLA que exibe uma afinidade de ligação acrescida ao receptor Fc e/ou uma função efectora aumentada em resultado da modificação dos 23 seus oligossacáridos. Num enquadramento, a afinidade de ligação está aumentada para um receptor Fc, particularmente o receptor FcyRIIIA. A função efectora contemplada aqui pode ser seleccionada a partir do grupo que inclui, mas não se limita a citotoxicidade celular aumentada, mediada por Fc; ligação melhorada às células AN; ligação aumentada aos macrófagos; ligação aumentada às células polimorfo-nucleares; ligação aumentada aos monócitos; apoptose aumentada por indução da sinalização directa; maturação aumentada das células dendriticas; e iniciação aumentada das células T.
Num outro enquadramento, a células hospedeira da presente invenção compreende pelo menos um ácido nucleico que codifica um polipéptido com actividade de GnTIII que está operacionalmente ligado a um elemento promotor constitutivo.
Num outro aspecto, a presente invenção tem por objecto um processo para a produção de uma MLA numa célula hospedeira, compreendendo: (a) a cultura de uma células hospedeira tratada por engenharia para expressar pelo menos um polinucleótido que codifica um polipéptido de fusão com uma actividade de GnTIII em condições que permitem a produção da referida MLA e que permitem a modificação dos oligossacáridos presentes na região Fc da referida MLA; e (b) o isolamento da referida MLA; em que a referida MLA é capaz de competir com o anticorpo B-Lyl de murino quanto à ligação a CD20 e em que a referida MLA é quimérica. Num enquadramento, o polipéptido com actividade de GnTIII é um polipéptido de fusão, preferencialmente compreendendo o dominio catalítico de GnTIII e o dominio de localização de Golgi de um polipéptido residente de um Golgi heterólogo seleccionado no grupo que consiste no dominio de 24 localização de manosidase II, o domínio de localização de β(1,2)-N-acetilglucosaminiltransferase I ("GnTI"), o domínio de localização de manosidase I, o domínio de localização de β(1,2)-N-acetilglucosaminiltransferase II ("GnTII") e o domínio de localização do núcleo cxl-6 de fucosiltransferase. Preferencialmente, o domínio de localização de Golgi é de manosidase II ou de GnTI.
Num outro aspecto, a presente invenção tem por objecto um processo para modificar o perfil de glicosilação de uma MLA anti-CD20 produzida por uma células hospedeira que compreende a introdução na célula hospedeira de pelo menos um ácido nucleico ou de um vector de expressão da presente invenção. Num enquadramento, a MLA é um anticorpo ou um seu fragmento; preferencialmente compreendendo a região Fc de uma IgG. Alternativamente, o polipéptido é uma proteína de fusão que inclui uma região equivalente à região Fc de uma IgG humana.
Num aspecto, a presente invenção tem por objecto um anticorpo quimérico, recombinante ou um seu fragmento, capaz de competir com um anticorpo B-Lyl de murino na ligação a CD20 e tendo uma fucosilação reduzida.
Noutro aspecto, a presente invenção tem por objecto um processo de modificação da glicosilação do anticorpo recombinante ou de um seu fragmento, da presente invenção, por meio da utilização de um polipéptido de fusão com actividade de GnTIII e compreendendo o domínio de localização de Golgi de um polipéptido heterólogo residente em Golgi. Num enquadramento, os polipéptidos de fusão da presente invenção compreendem o domínio catalítico de GnTIII. Noutro enquadramento, o domínio de localização de Golgi selecciona-se no grupo que consiste em: o domínio de 25 localização de manosidase II, o domínio de localização de GnTI, o domínio de localização de manosidase I, o domínio de localização de GnTII e o domínio de localização do núcleo oíI-6 core de fucosiltransferase. Preferencialmente, o domínio de localização de Golgi é de manosidase II ou de GnTI.
Num enquadramento, o processo da presente invenção tem por objecto produzir um anticorpo quimérico recombinante ou um seu fragmento, com oligossacáridos modificados em que os referidos oligossacáridos modificados têm uma fucosilação reduzida quando comparada com a dos oligossacáridos não modificados. De acordo com a presente invenção, estes oligossacáridos modificados podem ser híbridos ou complexos. Noutro enquadramento, o processo da presente invenção tem por objecto produzir um anticorpo quimérico recombinante ou um seu fragmento, com uma proporção aumentada de oligossacáridos biramifiçados não fucosilados na região Fc do referido polipéptido. Num enquadramento, os oligossacáridos não fucosilados, biramifiçados são híbridos. Noutro enquadramento, os oligossacáridos não fucosilados, bissectados são complexos. Ainda noutro enquadramento, o processo da presente invenção tem por objecto produzir um anticorpo quimérico recombinante ou um seu fragmento, com pelo menos 20 % de oligossacáridos biramifiçados não fucosilados na região Fc do referido polipéptido que está biramifiçado e não está fucosilado. Num enquadramento preferido, pelo menos 30 % dos oligossacáridos na região Fc do referido polipéptido são não fucosilados, biramifiçados. Num outro enquadramento preferido, pelo menos 35 % dos oligossacáridos na região Fc do referido polipéptido não são fucosilados e são biramifiçados. 26
Num outro aspecto, a presente invenção tem por objecto um anticorpo quimérico recombinante ou um seu fragmento que exibe uma afinidade de ligação acrescida ao receptor Fc e/ou uma função efectora aumentada em resultado da modificação dos seus oligossacáridos. Num enquadramento, a afinidade de ligação é acrescida para um receptor de activação de Fc. Ainda noutro enquadramento, o receptor de Fc é o receptor de activação de Fcy, particularmente, o receptor de FcyRIIIA. A função efectora contemplada aqui pode ser seleccionada a partir do grupo que inclui, mas não se limita a citotoxicidade celular aumentada mediada por Fc; ligação melhorada às células AN; ligação aumentada aos macrófagos; ligação aumentada às células polimorfo-nucleares; ligação aumentada aos monócitos; apoptose aumentada por indução da sinalização directa; maturação aumentada das células dendríticas; e iniciação aumentada das células T.
Num outro aspecto, a presente invenção tem por objecto um fragmento de anticorpo quimérico, recombinante, com uma especificidade de ligação ao anticorpo B-Lyl de murino e contendo a região Fc, que é tratado por engenharia para aumentar a função efectora produzida por qualquer um dos processos da presente invenção.
Ainda noutro aspecto, a presente invenção tem por objecto uma proteina de fusão que inclui um polipéptido com a sequência da SEQ ID No.: 1 e uma região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina e tratado por engenharia para aumentar a sua função efectora, produzido por qualquer um dos processos da presente invenção.
Noutro aspecto, a presente invenção tem por objecto uma proteina de fusão que inclui um polipéptido com a 27 sequência da SEQ ID No.: 2 e uma região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina e tratada por engenharia para aumentar a sua função efectora, produzida por qualquer um dos processos da presente invenção.
Num aspecto, a presente invenção tem por objecto uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo quimérico, recombinante, produzido por qualquer um dos processos da presente invenção e um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Num outro aspecto, a presente invenção tem por objecto uma composição farmacêutica que compreende um fragmento de um anticorpo quimérico, recombinante, produzido por qualquer um dos processos da presente invenção e um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Num outro aspecto, a presente invenção tem por objecto uma composição farmacêutica que compreende uma proteína de fusão, produzida por qualquer um dos processos da presente invenção e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. A presente invenção pode ser utilizada num processo de tratamento de uma doença que se pode tratar por meio da depleção das células B, compreendendo a administração de uma quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico de um anticorpo quimérico, recombinante ou de um seu fragmento, produzido por qualquer um dos processos da presente invenção, a um ser humano que dele necessite.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS FIG 1. Nucleótido (SEQ ID NO: 2) e sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) da região VP do B-Lyl de murino. FIG 2. Nucleótido (SEQ ID NO: 4) e sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 3) da região VL do B-Lyl de murino. 28 FIG 3. Ligação de rituximab® (0) e B-Lyl qu. (Δ) a CD20 nas células de linfoma B de Raji. FIG 4. Depleção das células B por meio de rituximab® (0) e B-Lyl qu. (Δ) no sangue completo de três classes diferentes do genótipo de FcYRIIIa-158V/F: (A) sangue completo de um dador F/F, homozigótico para o receptor de afinidade mais baixa; (B) sangue completo de um dador F/V, heterozigótico para o receptor de afinidade; e (C) sangue completo de um dador, V/V, homozigótico para o receptor de maior afinidade. FIG 5. Nucleótido (SEQ ID NO: 11) e sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 13) da cadeia pesada de um anticorpo quimérico anti-CD20. FIG 6. Nucleótido (SEQ ID NO: 12) e sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 14) da cadeia leve de um anticorpo quimérico anti-CD20. FIG 7. Nucleótido e sequências de aminoácidos das RDCs do anticorpo B-Lyl de murino. (A) RDCs previstas para a região VP. (B) RDCs previstas para a região VL. FIG 8. Perfil de MALDI-TOF de um anticorpo quimérico B-Lyl glicosilado por engenharia. (A) Quadro detalhando as percentagens dos picos específicos; (B) Espectro para o anticorpo quimérico B-Lyl glicosilado por engenharia; (C) Espectro para o anticorpo quimérico B-Lyl glicosilado por por engenharia, tratado com Endo-H. FIG 9. Ligação de diferentes anticorpos humanizados anti-CD20 a células B de Raji. As diferenças entre a estrutura de B-HH2 e as estruturas de B-HL8 e de B-HL11 29 estão localizadas nas regiões 1 e 2 do sistema sendo idênticas as três RDCs. B-HL8 e B-HL11 têm as suas sequências de RS1 e RS2 derivadas da classe VH3 humana, enquanto o sistema completo de B-HH2 é um derivado de VH1 humano. B-HL11 é um derivado de B-HL8 com a mutação única GlulGln, sendo Gin o residuo de aminoácido na estrutura de B-HH2. Isto significa que a permuta de GlulGln não altera a afinidade nem a intensidade da ligação. As outras diferenças entre B-HH2 e B-HL8 são resíduos de 14 RS, a partir dos quais um ou mais irão influenciar o comportamento de ligação ao antigénio deste anticorpo. FIG 10. Ligação do anticorpo humanizado anti-CD-20, BHL4-KV1, às células-alvo de Raji. A estrutura de B-HL4 deriva do anticorpo B-HH2 por substituição de RS1 de B-HH2 com a sequência da linha germinal humana VH1_45. Esta estrutura mostra uma capacidade de ligação ao antigénio muitíssimo diminuída, apesar de ter diferentes aminoácidos apenas em três posições dentro de RS1. Estes resíduos estão localizados nas posições 2, 14, e 30 de acordo com a numeração de Kabat. Destas, a posição 30 parece ser a posição mais influente, dado que faz parte da definição de Chothia de RDCl. FIG 11. Comparação do comportamento de ligação entre B-HH1, B-HH2, B-HH3 e o anticorpo parental B-Lyl. Os dados mostram que todos os Acs mostram um valor de CE50 similar, mas a estrutura de B-HH1 liga-se com uma intensidade/ estequiometria inferior do que as variantes B-HH2 e B-HH3. B-HH1 pode distinguir-se de B-HH2 e de B-HH3 pelas suas regiões RDCl e RDC2 parcialmente humanas (definição de Kabat), assim como pelo polimorfismo Ala/Tre na posição 28 (numeração de Kabat). Isto indica que tanto a posição 28, 30 como a RDC1 completa e/ou a RDC2 completa são importantes para a interacção anticorpo/antigénio. FIG 12. Comparação de B-HL1, B-HH1 e do anticorpo parental B-lyl. Os dados mostraram a ausência de qualquer actividade de ligação na estrutura de B-HL1 e cerca de metade da intensidade/estequiometria de ligação de B-HH1 comparada com B-lyl. Tanto B-HL1, assim como B-HH1, foram concebidos com base nos sistemas dos receptores derivados da classe VH1 humana. Entre outras diferenças, a posição 71 (numeração de Kabat) da estrutura de B-HL1 tem uma diferença impressionante, indicando a sua importância potencial para a ligação ao antigénio. FIG 13. Análise fluorocitométrica da capacidade do anticorpo anti-CD20 para o seu antigénio. Os dados mostraram que as estruturas de B-HL2 e de B-HL3 não exibem actividade de ligação a CD-20. FIG 14. Apoptose de anticorpos anti-CD20 nas células Z-138 MCL. FIG 15. Apoptose por anticorpos anti-CD20. Detalhes dos ensaios: semearam-se 5 x 105 células/poço em placas de 24 poços (5 x 105 células/ml) em meio de cultura. Adicionou-se aos poços 10 mg do respectivo Ac, SBF para o controlo negativo ou um controlo positivo de camptotecina (CPT) 5mM. Fez-se a incubação das amostras (16 h), coraram-se com AnnV-FITC e analisaram-se por SCAF. O ensaio foi feito em triplicado. (*): Sinal para apenas o SBF subtraido (apenas SBF deu 8 % e 2 % de AnnV+ para as células PR-1 e Z-138, respectivamente). Os anticorpos utilizados foram: C2B8 (quimérico, não glicosilado por engenharia); BHH2-KV1 (humanizado, não glicosilado por engenharia). Nota: este 31 ensaio não envolve quaisquer células efectoras adicionais, apenas alvos mais anticorpo ou controlos. FIG 16. Morte das células-alvo por meio de anticorpos anti-CD20 com células efectoras imunitárias. Detalhes dos ensaios: depleção das células B em sangue completo normal, incubação durante a noite e análise para CD19+/CD3+ por meio de SCAF. CCDA utilizando CMSPs como células efectoras, incubação durante 4 h, relação células efectoras - células-alvo de 25:1, morte das células-alvo medidas por retenção de calceina relativamente à lise com detergente (100 %) e à lise sem Ac (0 %). Anticorpos utilizados: C2B8 (quimérico, forma não glicosilada por engenharia); BHH2-KVl-p (humanizado, forma não glicosilada por engenharia de BHH2-KV1); BHH2-KV1-GE (humanizado, forma glicosilada por engenharia de BHH2-KV1). FIG 17. Perfil de MALDI/TOF-EM de oligossacáridos de Fc libertados de PNGaseF do anticorpo CD20 anti-humano de B-Lyl de IgGI humanizado de BHH2-KV1, não glicosilado por engenharia, não modificado. FIG 18. Perfil de MALDI/TOF-EM de oligossacáridos de FC libertados de PNGaseF do anticorpo CD20 anti-humano B-Lyl de IgGI, humanizado de BHH2-KVlgl, glicosilado por engenharia. A glicosilação por engenharia é feita por co-expressão em células hospedeiras de genes de anticorpos e genes que codificam enzimas com actividade catalítica de β-1,4-N-acetilglicosaminiltransferase III (GnT-III). FIG 19. Perfil de MALDI/TOF-EM de oligossacáridos de Fc libertados de PNGaseF do anticorpo CD20 anti-humano B-Lyl de IgGI, humanizado de BHH2-KVlg2, glicosilado por engenharia. A glicosilação por engenharia é feita por co- 32 expressão em células hospedeiras de genes de anticorpos e genes que codificam a enzima com actividade catalítica de β-l, 4-N-acetilglicosaminiltransferase III (GnT-111) e que codificam a enzima com actividade catalítica de a-manosidase II de Golgi. FIG 20. Ligação de anticorpos não glicosilados por engenharia e anticorpos glicosilados por engenharia ao receptor humano FcgammaRIIIa exibido na superfície de células recombinantes de OHC-CD16. FIG 21. Apoptose de anticorpos anti-CD20 glicosilados por engenharia de Fc e sem ser de Fc em células Z-138 MCL. Detalhes dos ensaios: semearam-se 5 x 105 células/poço em placas de 24 poços (5 x 105 células/ml) em meio de cultura. Adicionou-se aos poços 10 mg do respectivo Ac, SBF para o controlo negativo. Fez-se a incubação das amostras (16 h), coraram-se com AnnV-FITC e analisaram-se por SCAF. O ensaio foi feito em triplicado. Acs utilizados: C2B8 = rituximab (quimérico, não glicosilados por engenharia, a mesma que a forma comercial); BHH2-KV1 (humanizado, não glicosilados por engenharia, ver a figura 6 para o perfil de glicosilação); BHH2-KVlgl (humanizado, glicosilado por engenharia, ver a figura. 7 para o perfil de glicosilação); BHH2-KVlg2 (humanizado, glicosilado por engenharia, ver a figura 8 para o perfil de glicosilação). Nota: Este ensaio não envolve quaisquer células efectoras adicionais, apenas alvos mais anticorpo ou controlos. (*): Sinal apenas para o SBF subtraído. 33
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Os termos são utilizados aqui tal como são genericamente utilizados na técnica, a menos que sejam definidos de outra forma, como se segue.
Tal como se utiliza aqui, o termo anticorpo é entendido como incluindo todas as moléculas de anticorpo, incluindo anticorpos monoclonais, policlonais e multi-específicos (por exemplo, bi-específicos) assim como fragmentos de anticorpos com a região Fc e retendo a especificidade de ligação e as proteínas de fusão que incluem uma região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina e que retêm a especificidade de ligação. Também estão abrangidos os anticorpos quiméricos, humanizados e primatizados.
Tal como se utiliza aqui, a expressão região Fc é entendida como referindo-se a uma região de terminal C de uma cadeia pesada de uma IgG. Embora as fronteiras da região Fc de uma cadeia pesada de IgG possam variar ligeiramente, a região Fc de cadeia pesada da IgG humana define-se normalmente como estendendo-se desde o resíduo de aminoácido na posição Cis226 até ao terminal de carboxilo.
Tal como se utiliza aqui, a expressão região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina é entendida como incluindo as variantes alélicas de ocorrência natural da região Fc de uma imunoglobulina assim como as variantes com alterações que produzem substituições, adições ou eliminações mas que não diminuem substancialmente a capacidade da imunoglobulina para mediar funções efectoras (tal como citotoxicidade células dependente do anticorpo). Por exemplo, pode-se eliminar um ou mais aminoácidos do 34 terminal N ou do terminal C da região Fc de uma imunoglobulina sem perda substancial da função biológica. Essas variantes podem ser seleccionadas de acordo com as regras gerais conhecidas na técnica para terem um efeito minimo na actividade. (Ver, por exemplo, Bowie, J. U. et al., Science 247: 1306-10 (1990).
Tal como se utiliza aqui, a expressão molécula de ligação ao antigénio refere-se, no seu sentido mais lato, a uma molécula que se liga especificamente a um determinante antigénico. Mais especificamente, uma molécula de ligação ao antigénio gue se liga a CD20 é uma molécula que se liga especificamente a uma fosfoproteina não glicosilada da superfície das células, de 35.000 Daltons, normalmente designada como o antigénio Bp35 de diferenciação restrita dos linfócitos B humanos, normalmente referido como CD20. Por "liga-se especificamente" entende-se que a ligação é selectiva para o antigénio e pode ser discriminadas de interacções não especificas ou não desejadas.
Tal como se utilizam aqui, os termos fusão e quimérico, quando utilizados em referência a polipéptidos tais como MLAs referem-se a polipéptidos que compreendem sequências de aminoácidos derivadas de dois ou mais polipéptidos heterólogos, tal como porções de anticorpos de espécies diferentes. Para as MLAs quiméricas, por exemplo, os componentes da ligação que não são antigénio podem derivar de uma grande variedade de espécies, incluindo primatas tais como chimpanzés e seres humanos. A região constante da MLA quimérica é, mais preferencialmente, praticamente idêntica à região constante de um anticorpo humano natural; a região variável do anticorpo quimérico é, mais preferencialmente, praticamente idêntica à do anticorpo recombinante anti-CD-20 que comporta a sequência 35 de aminoácidos da região variável de B-Lyl de murino. Os anticorpos humanizados são a forma particularmente preferida do anticorpo de fusão ou quimérico.
Tal como se utiliza aqui, um polipéptido com "actividade de GnTIII" refere-se a polipéptidos que são capazes de catalisar a adição de um resíduo de N-acetilglicosamina (GlcNAc) na ligação de β-1-4 ao manósido ligado a β do núcleo de trimanosilo dos oligossacáridos ligados a N. Isto inclui polipéptidos de fusão que exibem actividade enzimática similar, mas não necessariamente idêntica a uma actividade de β(1,4)-N-acetilglicosaminil-transferase III, também conhecida como β-l,4-manosil-glicoprotein-4-beta-N-acetilglicosaminil-transferase (EC 2.4.1.144), de acordo com a Comissão de Nomenclatura da União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (NC-IUBMB), quando medido num ensaio biológico partucular, com ou sem dependência da dose. No caso em que existe dependência da dose, não precisa de ser idêntica à de GnTIII, mas em vez disso precisa de ser similar à da dependente da dose numa dada actividade, quando comparada com a de GnTIII (isto é, o polipéptido candidato exibirá uma actividade maior ou não mais do que cerca de 25 vezes menos e, preferencialmente, não mais do que dez vezes menos actividade e mais preferencialmente, não mais do que cerca de três vezes menos de actividade relativamente a GnTIII.)
Tal como se utiliza aqui, o termo variante (ou análogo) refere-se a um polipéptido que difere do polipéptido da presente invenção, citado especificamente, pelas inserções, eliminações e substituições de aminoácidos, criadas utilizando, por exemplo, técnicas de ADN recombinante. As variantes das MLAs da presente invenção incluem moléculas de ligação ao antigénio 36 quiméricas, primatizadas ou humanizadas em que um ou mais resíduos de aminoácidos estão modificados por substituição, adição e/ou eliminação de tal modo que não afecte substancialmente a afinidade de ligação ao antigénio (por exemplo, CD20) . A orientação para a determinação de quais os resíduos de aminoácidos que podem ser substituídos, adicionados ou eliminados, sem abolir actividades com interesse, pode ser encontrada comparando a sequência do polipéptido particular com a dos péptidos homólogos e minimizando o número de alterações da sequência de aminoácidos feitas em regiões de elevada homologia (regiões conservadas) ou por substituição de aminoácidos com uma sequência de consenso.
Alternativamente, as variantes recombinantes que codificam estes polipéptidos ou polipéptidos semelhantes podem ser sintetizadas ou seleccionadas fazendo uso da "redundância" no código genético. Várias substituições do codão, tal como as alterações silenciosas que produzem vários sítios de restrição, podem ser introduzidas para optimizar a clonagem num plasmido ou num vector virai ou a expressão num sistema particular procariótico ou eucariótico. As mutações na sequência dos polinucleótidos pode estar reflectida no polipéptido ou nos domínios de outros péptidos adicionados ao polipéptido para modificar as propriedades de qualquer parte do polipéptido, para alterar características tais como as afinidades de ligação ao ligando, afinidades inter-cadeias ou taxa de degradação/renovação.
Preferencialmente, as "substituições" de aminoácidos são o resultado da substituição de um aminoácido por outro aminoácido tendo propriedades estruturais e/ou químicas similares, isto é, substituições conservadoras de 37 aminoácidos. As substituições "conservadoras" de aminoácidos podem ser feitas com base na semelhança da polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou natureza anfifática dos residuos envolvidos. Por exemplo, os aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina; os aminoácidos polares neutros incluem glicina, serina, treonina, cisteina, tirosina, asparagina e glutamina; os aminoácidos carregados positivamente (básicos) incluem arginina, lisina e histidina; e os aminoácidos carregados negativamente (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico. As "inserções" ou "eliminações" estão preferencialmente no intervalo de cerca de 1 a 20 aminoácidos, mais preferencialmente 1 a 10 aminoácidos. A variação permitida pode ser determinada experimentalmente fazendo sistematicamente inserções, eliminações ou substituições de aminoácidos numa molécula de polipéptido utilizando técnicas de ADN recombinante e avaliando as variantes recombinantes resultantes no que respeita à actividade.
Tal como utilizado aqui, o termo humanizado é utilizado para se referir a uma molécula de ligação ao antigénio derivada de uma molécula de ligação ao antigénio não humana, por exemplo, um anticorpo de murino, que retém ou retém substancialmente as propriedades de ligação ao antigénio da molécula parental mas que é menos imunogénica nos seres humanos. Isto pode conseguir-se por meio de vários processos incluindo (a) o enxerto de todos os domínios variáveis não humanos em regiões constantes humanas para gerar anticorpos quiméricos, (b) o enxerto de apenas as RDCs não humanas em sistemas humanos e regiões constantes com ou sem retenção dos residuos estruturais 38 críticos (por exemplo, os que são importantes para a retenção de uma boa afinidade de ligação ao antigénio ou funções de anticorpo) ou (c) transplantando todos os domínios variáveis não humanos, mas "cobrindo-os" com uma secção semelhante a uma secção humana por substituição dos resíduos da superfície. Esses processos estão descritos em Jones et al., Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 81: 6851-6855 (1984); Morrison e Oi, Adv. Immunol., 44: 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28: 489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31: 169-217, (1994). Há geralmente 3 regiões de determinação de complementaridade ou RDCs, (RDC1, RDC2 e RDC3) em cada um dos domínios variáveis de cadeia pesada e leve de um anticorpo, que são flanqueados por quatro subregiões estruturais (isto é, RS1, RS2, RS3 e RS4) em cada um dos domínios variáveis de cadeia pesada e leve de um anticorpo: RS1-RDC1-RS2-RDC2-RS3-RDC3-RS4. Pode-se encontrar uma discussão sobre os anticorpos humanizados, inter alia, na patente U.S. No. 6.632.927 e no pedido de patente U.S. publicado No. 2003/0175269.
Do mesmo modo, tal como utilizado aqui, o termo primatizado é utilizado para referir a uma molécula de ligação ao antigénio derivada de uma molécula de ligação ao antigénio, não pertencente a um primata, por exemplo, um anticorpo de murino, que retém ou retém substancialmente as propriedades de ligação ao antigénio da molécula parental mas que é menos imunogénica nos primatas.
No caso em que há duas ou mais definições de um termo que é utilizado e/ou aceite na técnica, a definição do termo, tal como se utiliza aqui, é entendida como incluindo todos esses significados a menos que explicitamente seja dito o contrário. Um exemplo específico é a utilização da 39 expressão "região de determinação de complementaridade" ("RDC") para descrever os sitios de combinação do antigénio não contíguos encontrados dentro da região variável dos polipéptidos tanto de cadeia pesada como de cadeia leve. Esta região particular já foi descrita por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) e por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987), em que as definições incluem a sobreposição ou subconjuntos de residuos de aminoácidos quando comparados uns com os outros. Apesar disso, a aplicação de qualquer uma das definições para referir uma RDC de um anticorpo ou das suas variantes é entendida como estando dentro do âmbito do termo tal como definido e utilizado aqui. Os residuos de aminoácidos apropriados que englobam as RDCs, tal como definido para cada uma das referências citadas antes, estão estabelecidos no quadro I a seguir para comparação. Os números exactos de residuos que englobam uma RDC particular irão variar consoante a sequência e a dimensão da RDC. Os especialistas na técnica podem determinar por rotina quais os residuos que compreendem uma RDC particular dada a sequência de aminoácidos da região variável do anticorpo. QUADRO 1. Definições da RDC1
Kabat Chothia Acm Vp RDC1 31-35 26-32 26-35 VP RDC2 50-65 52-58 50-58 VP RDC2 95-102 95-102 95-102 VL RDC1 24-34 26-32 VL RDC2 50-56 50-52 VL RDC3 89-97 91-96 1 A numeração de todas as definições de RDC no quadro lestá de acordo com as convenções de numeração estabelecidas por Kabat et al. (ver a seguir). 40
Kabat et al. também definiram um sistema de numeração para as sequências do dominio variável que é aplicável a qualquer anticorpo. Um especialista nesta técnica pode, sem ambiguidade, aplicar este sistema de "numeração de Kabat" a qualquer sequência de dominio variável, sem depender de quaisquer dados experimentais para além da própria sequência. Tal como se utiliza aqui, a "numeração de Kabat" refere-se ao sistema de numeração estabelecido por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). A menos que seja especificado de outra forma, as referências à numeração das posições especificas dos resíduos de aminoácidos numa MLA estão de acordo com o sistema de numeração de Kabat. As sequências da lista de sequências (isto é, SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 78) não estão numeradas de acordo com o sistema de numeração de Kabat.
Por meio de um ácido nucleico ou de um polinucleótido com uma sequência de nucleótidos, por exemplo, pelo menos 95 % "idêntica" a uma sequência de nucleótidos de referência da presente invenção, entende-se que a sequência de nucleótidos do polinucleótido é idêntica à sequência de referência excepto no facto de a sequência de polinucleótidos poder incluir até cinco mutações pontuais por cada 100 nucleótidos da sequência de nucleótidos de referência. Por outras palavras, para se obter um polinucleótido com uma sequência de nucleótidos pelo menos 95 % idêntica a uma sequência de nucleótidos de referência, até 5 % dos nucleótidos na sequência de referência podem ser eliminadas ou substituídas por outros nucleótidos ou por um número de nucleótidos até 5 % do total de nucleótidos na sequência de referência podem ser inseridos na sequência de referência. A sequência de pesquisa pode 41 ser toda a sequência mostrada em uma qualquer das FIG. 24 ou FIG. 25.
Como uma matéria prática, se qualquer molécula de ácido nucleico particular ou polipéptido for pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98% ou 99 % idêntica a uma sequência de nucleótidos ou uma sequência de polipéptidos da presente invenção pode ser determinada convencionalmente utilizando programas de computador conhecidos. Um processo preferido para a determinação da melhor concordância entre uma sequência de pesquisa (uma sequência da presente invenção) e uma sequência subalterna, também referida como um alinhamento de sequência global, pode ser determinada utilizando o programa de computador FASTDB com base no algoritmo de Brutlag et al., Comp. App. Biosci. 6: 237-245 (1990). Num alinhamento de sequências as sequências de pesquisa e a subalterna são ambas sequências de ADN. Pode-se comparar uma sequência de ARN convertendo U's em T's. O resultado do referido alinhamento global da sequência é dado em percentagem de identidade. Os parâmetros preferidos utilizados num alinhamento por FASTDB de sequências de ADN para calcular a identidade percentual são: Matriz=Unitária, conjunto de variáveis k = 4, Penalização de desem-parelhamento = 1, Penalização de junção =30, Comprimento do grupo aleatório = 0, Pontuação do corte =1, Penalização do intervalo = 5, Penalização da dimensão do intervalo de 0,05, Dimensão da janela =500 ou o comprimento da sequência subalterna de nucleótidos, seja qual for é menor.
Se a sequência subalterna é mais pequena do que a sequência de pesquisa por causa das eliminações em 5' ou 3', não por causa das eliminações internas, deve-se fazer uma correcção manual dos resultados. Isto passa-se porque o programa FASTDB não tem em conta as truncagens em 5' e 3' 42 da sequência subalterna quando calcula a percentagem de identidade. Para as sequências subalternas truncadas nas extremidades 5' ou 3', relativamente à sequência subalterna, a percentagem de identidade é corrigida por meio do cálculo do número de bases da sequência de pesquisa que estão em 5' e 3'da sequência subalterna, que não estão emparelhadas/alinhadas, como uma percentagem do total de bases da sequência de pesquisa. Determina-se através dos resultados do alinhamento de sequências do FASTDB se um nucleótido está emparelhado/alinhado. Esta percentagem é então subtraída da percentagem de identidade, calculada pelo programa anterior FASTDB utilizando os parâmetros especificados, para se chegar a uma pontuação final da identidade percentual. Esta pontuação corrigida é que é utilizada para os fins da presente invenção. Apenas as bases fora das bases de 5' e 3' da sequência subalterna, tal como é exibido pelo alinhamento do FASTDB, que não estão emparelhadas/alinhadas com a sequência de pesquisa, são calculadas para os fins do ajustamento manual da pontuação da identidade percentual.
Por exemplo, alinha-se uma sequência subalterna de 90 bases com uma sequência de pesquisa de 100 bases para determinar a percentagem de identidade. As eliminações ocorrem na extremidade 5' da sequência subalterna e por isso o alinhamento de FASTDB não mostra um emparelhamento/ alinhamento das primeiras 10 bases na extremidade 5'. As 10 bases desemparelhadas representam 10 % da sequência (número de bases nas extremidades 5' e 3' que não estão emparelhadas/número total de bases na sequência de pesquisa) por isso subtrai-se 10 % da pontuação da percentagem de identidade calculada pelo programa FASTDB. Se as 90 bases remanescentes estiverem perfeitamente emparelhadas, a percentagem final de identidade será de 90 43 %. Noutro exemplo, compara-se uma sequência subalterna de 90 bases com uma sequência de pesquisa de 100 bases. Neste momento as eliminações são eliminações internas de modo que não há bases nas extremidades 5' ou 3' da sequência subalterna que não estejam emparelhadas/alinhadas com a sequência de pesquisa. Neste caso, calcula-se a percentagem de identidade por meio do FASTDB e não é corriqida manualmente. Mais uma vez, apenas as bases de 5' e 3' da sequência subalterna que não estão emparelhadas/alinhadas com a sequência de pesquisa são corriqidas manualmente. Para os fins da presente invenção não se fazem outras correcções manuais.
Por meio de um polipéptido com uma sequência de aminoácidos, pelo menos 95 % "idêntica" a uma sequência de aminoácido de pesquisa da presente invenção, entende-se que a sequência de aminoácidos do polipéptido subalterno é idêntica à sequência de pesquisa excepto no facto de a sequência subalterna do polipéptido poder incluir até cinco alterações de aminoácidos por cada 100 aminoácidos da sequência de aminoácidos de pesquisa. Por outras palavras, para se obter um polipéptido , com uma sequência de aminoácidos pelo menos 95 % idêntica à sequência de aminoácidos de pesquisa, até 5 % dos resíduos de aminoácidos na sequência de entrada podem ser inseridos, eliminados ou substituídos por outros aminoácidos. Estas alterações da sequência de referência podem ocorrer nas posições do terminal amino ou carboxilo da sequência de aminoácidos de referência ou em qualquer parte entre essas posições terminais, interespaçadas quer individualmente entre os resíduos na sequência de referência ou em um ou mais qrupos contíguos dentro da sequência de referência. 44
Na prática, quando qualquer polipéptido particular é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntico a um polipéptido de referência, pode ser determinado convencionalmente utilizando programas de computador conhecidos. Um processo preferido para a determinação da maior concordância entre uma sequência de pesquisa (uma sequência da presente invenção) e uma sequência de entrada, também referido como um alinhamento global da sequência, pode ser determinada utilizando o programa de computador FASTDB com base no algoritmo de Brutlag et al., Comp. App. Biosci. 6: 237-245 (1990). Num alinhamento de sequências, as sequências de pesquisa e a de entrada ou são ambas sequências de nucleótidos ou são ambas sequências de aminoácidos. O resultado do referido alinhamento global das sequências é dado em percentagem de identidade. Os parâmetros preferidos utilizados num alinhamento de aminoácidos feito por meio de FASTDB são: Matriz = PAM 0, conjunto de variáveis k = 2, Penalização de desemparelhamento = 1, Penalização de junção = 20, Comprimento aleatório do grupo = 0, Pontuação do corte = 1, Dimensão da janela = comprimento da sequência, Penalização do intervalo = 5, Penalização da dimensão do intervalo = 0,05 Dimensão da janela =500 ou o comprimento da sequência de aminoácidos de entrada, seja qual for é menor.
Se a sequência de entrada é mais pequena do que a sequência de pesquisa por causa das eliminações dos terminais N ou C, não por causa das eliminações internas, deve fazer-se uma correcção manual aos resultados. Isto passa-se porque o programa FASTDB não tem em conta as truncagens dos terminais N e C da sequência de entrada quando se calcula a percentagem global de identidade. Para as sequências de entrada truncadas nos terminais N e C, relativamente à sequência de pesquisa, a percentagem de 45 identidade é corrigida por meio do cálculo do número de residuos da sequência de pesquisa que estão nos terminais N e C da sequência subalterna, que não estão emparelhados/ alinhados, com um residuo subalterno correspondente, como uma percentagem do total de bases da sequência de pesquisa. Determina-se através dos resultados do alinhamento de sequências do FASTDB se um nucleótido está emparelhado /alinhado. Esta percentagem é então subtraída da percentagem de identidade, calculada pelo programa anterior FASTDB utilizando parâmetros especificados, para se chegar a uma pontuação final da identidade percentual. Esta pontuação da percentagem final de identidade é a que é utilizada para os fins da presente invenção. Apenas os residuos dos terminais N e C da sequência em questão, que não estão emparelhados/alinhados com a sequência de pesquisa são considerados para os fins do ajustamento manual da pontuação da percentagem de identidade. Isto é, apenas as posições dos residuos de pesquisa fora dos residuos mais afastados dos terminais N e C da sequência em questão.
Por exemplo, uma sequência em questão, com 90 bases é alinhada com uma sequência de pesquisa de 100 bases para determinar a percentagem de identidade. As eliminações ocorrem no terminal N da sequência em questão e por isso o alinhamento de FASTDB não mostra um emparelhamento/ alinhamento dos primeiros 10 residuos no terminal N. Os 10 residuos desemparelhadas representam 10 % da sequência (número de resíduos nos terminais N e C não emparelhados/ número total de residuos na sequência de pesquisa) por isso subtrai-se 10 % da pontuação da percentagem de identidade calculada pelo programa FASTDB. Se os 90 resíduos remanescentes estiverem perfeitamente emparelhados, a percentagem final de identidade será de 90 %. Noutro 46 exemplo, compara-se uma sequência em questão de 90 resíduos com uma sequência de pesquisa de 100 resíduos. Neste caso as eliminações são eliminações internas de modo que não há resíduos nos terminais N e C da sequência em questão que não estão emparelhados/alinhados com a sequência de pesquisa. Neste caso, calcula-se a percentagem de identidade por meio do FASTDB e não é corrigida manualmente. Mais uma vez, apenas as posições dos residuos fora das extremidades dos terminais N e C da sequência em questão, tal como exibido no alinhamento de FASTDB, que não estão emparelhadas/alinhadas com a sequência de pesquisa são corrigidas manualmente. Para os fins da presente invenção não se fazem outras correcções manuais.
Tal como se utiliza aqui, um ácido nucleico que "híbrida em condições severas" com uma sequência de ácidos nucleicos da presente invenção, refere-se a um polinucleótido que híbrida numa incubação feita durante a noite a 42° C numa solução que compreende 50 % de formamida, 5x SSC (NaCl 750 mM, citrato de sódio 75 mM) , fosfato de sódio 50 mM (pH 7,6), 5x solução de Denhardt, sulfato de dextrano a 10 % e 20 yg/ml de ADN de esperma de salmão cortado e desnaturado, seguido de uma lavagem dos filtros em 0,1 x SSC a cerca de 65 °C.
Tal como se utiliza aqui, a expressão domínio de localização de Golgi refere-se à sequência de aminoácidos de um polipéptido residente em Golgi que é responsável pela ancoragem dos polipéptido na localização dentro do complexo de Golgi. Geralmente, os domínios de localização compreendem "caudas" terminais de aminoácidos de uma enzima. 47
Tal como utilizada aqui, a expressão função efectora refere-se às actividades biológicas que se podem atribuir à região Fc (uma região natural Fc da sequência ou uma região Fc variante da sequência de aminoácidos) de um anticorpo. Exemplos de funções efectoras do anticorpo incluem, mas não se limitam a afinidade de ligação ao receptor Fc, citotoxicidade células dependente do anticorpo (CCDA), fagocitose celular dependente do anticorpo (FCDA), secreção de citocina, absorção do antigénio mediada pelo complexo imunitário por meio de células que apresentam antigénios, desregulação de receptores da superfície das células, etc.
Tal como se utilizam aqui, os termos engenharia, tratado por engenharia e glicosilação por engenharia são considerados como incluindo qualquer manipulação do modelo de glicosilação de um polipéptido recombinante ou de ocorrência natural ou de um seu fragmento. A engenharia de glicosilação inclui a engenharia metabólica do mecanismo de glicosilação de uma célula, incluindo manipulações genéticas das vias de síntese dos oligossacáridos para se conseguir uma glicosilação alterada das glicoproteínas expressas nas células. Além disso, a engenharia de glicosilação inclui os efeitos de mutações e o ambiente celular na glicosilação.
Tal como se utiliza aqui, a expressão células hospedeiras cobre qualquer tipo de sistema celular que pode ser tratado por engenharia para gerar os polipéptidos e as moléculas de ligação ao antigénio da presente invenção. Num enquadramento, a célula hospedeira é tratada por engenharia para permitir a produção de uma molécula de ligação ao antigénio com glicoformas modificadas. Num enquadramento preferido, a molécula de ligação ao antigénio é um anticorpo, um fragmento de anticorpo ou uma proteína de 48 fusão. Em certos enquadramentos, as células hospedeiras foram ainda manipuladas para expressar niveis crescentes de um ou mais polipéptidos com actividade de GnTIII. As células hospedeiras incluem células de cultura, por exemplo, células de mamíferos de cultura, tais como células de OHC, células de RHB, células de NSO, células de SP2/0, de células de mieloma YO, células de mieloma de murganho P3X63, células de PER, células de PER.C6 ou células de hibridoma, células de levedura, células de insecto e células de plantas, para nomear apenas algumas, mas também as células compreendidas dentro de um animal transgénico, uma planta transgénica ou cultura ou tecidos plantas de ou de animais.
Tal como se utiliza aqui, a expressão citotoxicidade celular mediada por Fc inclui citotoxicidade celular dependente do anticorpo e citotoxicidade celular mediada por uma proteína de fusão de Fc solúvel contendo uma região Fc humana. É uma mecanismo imunitário que leva à lise das "células atingidas pelo anticorpo" por meio de "células efectoras imunitárias humanas" em que:
As células efectoras imunitárias humanas são uma população de leucócitos que exibe receptores de Fc na sua superfície através da qual se ligam a uma região Fc de anticorpos ou a proteínas de fusão de Fc e desempenham funções efectoras. Essa população pode incluir, mas não se limita a células mononucleares de sangue periférico (CMSP) e/ou células assassinas naturais (AN).
As células atingidas pelo anticorpo são células ligadas pelos anticorpos ou pelas proteínas de fusão de Fc. Os anticorpos ou as proteínas de fusão de Fc ligam-se às 49 células-alvo por via da parte da proteína do terminal N à região Fc.
Tal como se utiliza aqui, a expressão citotoxicidade células aumentada mediada por Fc define-se quer como um aumento do número de "células atingidas pelo anticorpo" que são submetidas a lise num dado momento, a uma dada concentração do anticorpo ou de uma proteína de fusão de Fc, num meio que circunda as células-alvo, pelo mecanismo da citotoxicidade celular mediada por Fc definido antes e/ou uma redução na concentração de anticorpo ou da proteína de fusão de Fc, no meio que circunda as células-alvo, necessário para se conseguir a lise de um dado número de "células atingidas pelo anticorpo", num dado momento, por meio do mecanismo da citotoxicidade celular mediada por Fc. 0 aumento da citotoxicidade celular mediada por Fc é relativo à citotoxicidade celular mediada pelo mesmo anticorpo ou proteína de fusão de Fc, produzida pelo mesmo tipo de células hospedeiras, utilizando a mesma produção padrão, purificação, formulação e processos de armazenagem, que são conhecidos dos especialistas na técnica, mas que não tenha sido produzido por células hospedeiras tratadas por engenharia para expressar a glicosiltransferase GnTIII pelos processos descritos aqui.
Por anticorpo com uma citotoxicidade dependente do anticorpo (CCDA) acrescida entende-se um anticorpo, tal como o termo foi definido aqui, tendo uma CCDA acrescida conforme determinado por qualquer processo apropriado conhecido dos especialistas na técnica. Uma vez aceite, o ensaio de CCDA in vitro faz-se como se segue: 50 1) o ensaio utiliza células-alvo que são conhecidas por expressarem o antigénio-alvo reconhecido pela região de ligação do antigénio do anticorpo; 2) o ensaio utiliza células mononucleares de sangue periférico (CMSPs) humanas, isoladas do sangue de um dador saudável escolhido aleatoriamente, como células efectoras; 3) o ensaio realiza-se de acordo com o protocolo que se segue: i) isolam-se as CMSPs utilizando processos de centrifugação de densidade padrão e faz-se com elas uma suspensão a 5 x 106 células/ml em meio de cultura de células RPMI; ii) as células-alvo crescem por meio de processos padrão de cultura de tecidos, colhem-se na fase de crescimento exponencial com uma viabilidade superior a 90 %, lavam-se em meio de cultura de células RPMI, marcam-se com 100 micro-Curies de 51Cr, lavam-se duas vezes com meio de cultura de células e voltam a suspender-se em meio de cultura de células a uma densidade de 105 células/ml; iii) 100 microlitros da suspensão anterior de células-alvo são transferidos para cada um dos poços de uma placa microtituladora de 96 poços; iv) O anticorpo é diluído em série a partir de 4000 ng/ml até 0,04 ng/ml em meio de cultura de células e adiciona-se às células-alvo 50 microlitros das soluções de anticorpo resultantes, na placa microtituladora de 96 poços, fazendo o ensaio em triplicado com 51 várias concentrações de anticorpo, cobrindo toda a gama anterior de concentrações; v) para os controlos de libertação máxima (LM), mais 3 poços na placa, contendo as células-alvo marcadas, receberam 50 microlitros de uma solução aquosa a 2 % (V/V) de detergente não iónico (Nonidet, Sigma, St. Louis), em vez da solução de anticorpo (ponto iv anterior); vi) para os controlos de libertação espontânea (LE) , mais 3 poços na placa, contendo as células-alvo marcadas, receberam 50 microlitros de meio de cultura de células RPMI em vez da solução de anticorpo (ponto iv anterior); vii) faz-se então a centrifugação da placa microtituladora de 96 poços a 50 x g durante 1 minuto e faz-se a sua incubação durante 1 hora a 4 °C; viii) adiciona-se 50 microlitros da suspensão de CMSP (ponto i anterior) a cada poço para se obter uma relação célula efectora: células-alvo de 25: 1 e colocam-se as placas numa incubadora em atmosfera de CO2 a 5 % a 37°C durante 4 horas; ix) colhe-se o sobrenadante, isento de células, de cada poço e quantifica-se a radio-actividade experimentalmente libertada (REL) utilizando um contador gama; x) calcula-se a percentagem especifica de lise para cada concentração de anticorpo de acordo com a fórmula (REL-LM)/(LM-LE) x 100, em que REL é a radioactividade média quantificada (ver ponto ix anterior) para 52 é a essa concentração de anticorpo, LM radioactividade média quantificada (ver ponto ix anterior) para os controlos de LM (ver ponto v anterior) e LE é a radioactividade média quantificada (ver ponto ix anterior) para os controlos de LE (ver ponto vi anterior); 4) define-se "CCDA aumentada" quer como um aumento na percentagem máxima da lise especifica observada dentro da gama de concentrações de anticorpo ensaiada antes e/ou uma redução na concentração de anticorpo necessária para alcançar metade da percentagem máxima da lise específica observada dentro da gama de concentrações de anticorpo ensaiadas antes. 0 aumento de CCDA é relativo à CCDA, medida com o ensaio anterior, mediado pelo mesmo anticorpo, produzida pelo mesmo tipo de células hospedeiras, utilizando a mesma produção padrão, purificação, formulação e processos de armazenagem, que são conhecidos dos especialistas na técnica, mas que não tenham sido produzidos por células hospedeiras tratadas por engenharia para sobre-expressar GnTIII.
Num aspecto, a presente invenção tem por objecto moléculas de ligação ao antigénio com a especificidade de ligação do anticorpo B-Lyl de murino e para descobrir que as suas funções efectoras podem ser melhoradas por uma glicosilação alterada. Num enquadramento, a molécula de ligação ao antigénio é um anticorpo quimérico. Num enquadramento preferido, a presente invenção tem por objecto um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, compreendendo as RDCs ilustradas na figura 7. Especificamente, num enquadramento preferido, a presente 53 invenção tem por objecto um polinucleótido isolado que compreende: (a) uma sequência seleccionada a partir de um grupo que consiste na: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7. (RDCs VP_i); e (b) uma sequência seleccionada a partir de um grupo que consiste na: SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 23. (RDCs VP_2) ; e SEQ ID NO: 24. Noutro enquadramento preferido, a presente invenção tem por objecto um polinucleótido isolado que compreende a SEQ ID NO.: 8, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10. (CDRs VL) . Numa das formas de realização, qualquer um destes polinucleótidos codifica um polipéptido de fusão.
Noutro enquadramento, a molécula de ligação ao antigénio compreende o domínio VP do anticorpo B-Lyl de murino ilustrado na figura 1 ou uma sua variante; e um polipéptido que não é de murino. Noutro enquadramento preferido, a molécula de ligação ao antigénio compreende o domínio VL do anticorpo B-Lyl de murino ilustrado na figura 2 ou uma sua variante; e um polipéptido que não é de murino.
Noutro aspecto, a moléculas de ligação ao antigénio compreende uma ou mais RDCs truncadas de Bly-1. Essas RDCs truncadas conterão, no mínimo, resíduos de aminoácidos de determinação de especificidade para uma dada RDC. Por "resíduo de determinação de especificidade" entende-se os resíduos que estão directamente envolvidos na interacçao com o antigénio. Em geral, apenas cerca de um quinto a um terço dos resíduos, numa dada RDC, participam na ligação ao antigénio. Estes resíduos de determinação de especificidade numa RDC em particular podem ser identificados, por exemplo, por computação dos contactos interatómicos de um modelo em três dimensões e a determinação da variabilidade de sequências numa dada posição do resíduo, de acordo com 54 os processos descritos em Padlan et al., FASEB J. 9 (1) : 133-139 (1995).
De acordo com isto, a presente invenção também tem por objecto um polinucleótido isolado que compreende pelo menos uma região de determinação de complementaridade do anticorpo B-Lyl de murino ou uma variante ou uma sua forma truncada contendo pelo menos os residuos que determinam a especificidade para a referida região de determinação de complementaridade, em que o referido polinucleótido isolado codifica um polipéptido de fusão. Preferencialmente, esses polinucleótidos isolados codificam um polipéptido de fusão que é uma molécula de ligação ao antigénio. Num enquadramento, o polinucleótido compreende três regiões de determinação de complementaridade do anticorpo B-Lyl de murino ou as suas variantes ou as suas formas truncadas contendo pelo menos os residuos que determinam a especificidade para cada uma das referidas três regiões de determinação de complementaridade. Noutro enquadramento, o polinucleótido codifica toda a região variável de cadeia leve ou pesada de um anticorpo quimérico (por exemplo, humanizado). A presente invenção tem ainda por objecto polipéptidos codificados por esses polinucleótidos.
Noutro enquadramento, a molécula que combina o antigénio compreende pelo menos uma região de determinação de complementaridade do anticorpo B-Lyl de murino ou uma variante ou uma sua forma truncada contendo pelo menos os resíduos que determinam a especificidade para a referida região de determinação de complementaridade e compreendem uma sequência derivada de polipéptido heterólogo. Num enquadramento, a molécula de ligação ao antigénio compreende três regiões de determinação de complementaridade do anticorpo B-Lyl de murino ou as suas 55 variantes ou as suas formas truncadas contendo pelo menos os resíduos que determinam a especificidade para cada uma das referidas três regiões de determinação de complementaridade. Num outro aspecto, a molécula de ligação ao antigénio compreende a região variável de uma cadeia leve ou de uma cadeia pesada de um anticorpo. Num enquadramento particularmente útil, a molécula de ligação ao antigénio é um anticorpo quimérico, por exemplo, humanizado. Também tem por objecto os processos de produção dessas moléculas de ligação ao antigénio e a sua utilização no tratamento de doenças, incluindo linfomas de células B.
Sabe-se que estão envolvidos vários mecanismos na eficácia terapêutica de anticorpos anti-CD20, incluindo a citotoxicidade celular dependente do anticorpo (CCDA), a citotoxicidade dependente do complemento (CDC) e a indução da paragem do crescimento ou da apoptose. Por exemplo, a maioria das evidências experimentais indicam que o rituximab opera através de mecanismos efectores convencionais medidos pelos ensaios da CDC e da CCDA. Do mesmo modo, verificou-se que a resistência de diferentes células de linfoma a rituximab in vivo é função da sua sensibilidade a CDC in vitro. Pelo contrário, o modo de acção in vivo de outro anticorpo que tenha sido aprovado para utilização terapêutica, Bl, não requer nem complemento nem actividade das células assassinas naturais (AN) . Por isso, a eficácia de Bl in vivo é devida à sua capacidade para induzir uma apoptose potente.
Em geral, os anticorpos monoclonais anti-CD20 caem em duas categorias distintas com base no seu mecanismo de acção na erradicação de células de linfoma. Os anticorpos anti-CD20 do tipo I utilizam principalmente o complemento para matar as células-alvo, enquanto os anticorpos do tipo 56 II operam por meio de diferentes mecanismos, principalmente a apoptose. 0 rituximab e o 1F5 são exemplos de anticorpos anti-CD20 do tipo I, enquanto BI é um exemplo de um anticorpo do tipo II . Ver, por exemplo, Cragg, M. S. e Glennie, M. J. , Blood 103 (7) : 2738-2743 (Abril 2004); Teeling, J. L. et al. , Blood 104 (6): 1793-1800 (Setembro de 2004) . A presente invenção é o primeiro exemplo conhecido em que um anticorpo anti-CD20 do tipo II foi tratado por engenharia para comportar funções efectoras aumentadas tais como CCDA, retendo, ao mesmo tempo, uma capacidade potente de apoptose. De acordo com isto, a presente invenção tem por objecto um anticorpo anti-CD20 do tipo II tratado por engenharia e tendo uma CCDA aumentada em resultado da referida engenharia e sem perda da capacidade substancial para induzir a apoptose. Num enquadramento, os anticorpos anti-CD-20 do tipo II foram tratados por engenharia para ter um modelo alterado de glicosilação na região Fc. Num enquadramento particular, a glicosilação alterada compreende um nivel elevado de residuo do complexo biramifiçado na região Fc. Num enquadramento particular, a glicosilação alterada compreende um nivel reduzido de resíduos de fucose na região Fc. Ver a pub. do pedido de patente U.S. No. 2004 0093621 para Shitara et al. Noutro enquadramento, os anticorpos anti-CD20 do tipo II sofreram engenharia dos polipéptidos como é explicado na pat. U.S. No. 6.737.056 para Presta ou na pub. do pedido de patente U.S. No. 2004 0185045 (Macrogenics) ou a pub. do pedido de pat. U.S. No. 2004 0132101 (Xencor) . A presente invenção ainda tem por objecto processos para a produção desses anticorpos do tipo II tratados por engenharia e processos para a utilização desses anticorpos no tratamento de vários distúrbios das células B, incluindo linfornas das células B. 57
Os anticorpos quiméricos de murganho/seres humanos já foram descritos. Ver, por exemplo, Morrison, S. L. et ai., PNAS II: 6851-6854 (Novembro de 1984); publicação da patente europeia No. 173494; Boulianna, G. L, et al., Nature 312: 642 (Dezembro de 1984); Neubeiger, M. S. et al., Nature 314: 268 (Março de 1985); publicação da patente europeia No. 125023; Tan et al., J. Immunol. 135: 8564 (Novembro de 1985); Sun, L. K et al., Hybridoma 5 (1): 517 (1986); Sahagan et al., J. Immunol. 137: 1066- 1074 (1986). Ver, de uma forma geral, Muron, Nature 312: 597 (Dezembro 1984) ; Dickson, Genetic Engineering News 5 (3) (Março de 1985) ; Marx, Science 229: 455 (Agosto de 1985); e Morrison, Science 229: 1202-1207 (Setembro de 1985). Robinson et al., na publicação PCT número WO/88104936 descreve um anticorpo quimérico com uma região humana constante e uma região variável de murino, com especificidade para um epítope de CD20; a porção de murino do anticorpo quimérico das referências de Robinson deriva do anticorpo monoclonal de murganho 2H7 (gama 2b, kapa). Embora as notas de referência que descrevem o anticorpo quimérico seja um "candidato excelente" para o tratamento de distúrbios das células B, esta afirmação pode ser vista como não mais do que uma sugestão para os especialistas na técnica para determinar se esta sugestão é ou não precisa para este anticorpo particular, particularmente porque na referência faltam alguns dados para suportar uma afirmação de eficácia terapêutica e, mais importante do que isso, dados que utilizem mamíferos de ordem superior tal como primatas ou seres humanos.
As metodologias para gerar anticorpos quiméricos estão disponíveis para os especialistas na técnica. Por exemplo, as cadeias leves e pesadas podem ser expressas separadamente, utilizando, por exemplo, cadeias leves de 58 imunoglobulina e cadeias pesadas de imunoglobulina em plasmidos separados ou num único vector (por exemplo, policistrónico). Estes podem ser purificados e combinados in vitro em anticorpos completos; as metodologias para alcançar essa junção já foram descritas. Ver, por exemplo, Scharff, M., Harvey Lectures 69: 125 (1974). Os parâmetros da reacção in vitro para a formação dos anticorpos de IgG a partir de cadeias leves e pesadas isoladas reduzidas já foram descritos. Ver, por exemplo, Sears et al., Biochem. 16 (9) : 2016-25 (1977) .
Num enquadramento particularmente preferido, a MLA quimérica da presente invenção é um anticorpo humanizado. Os processos para a humanização dos anticorpos não humanos são conhecidos na técnica. Por exemplo, as MLAs humanizadas da presente invenção podem ser preparadas de acordo com os processos da pat. U.S. No. 5.225.539 para Winter, pat. U.S. No. 6.180.370 para Queen et al. ou a pat. U.S. No. 6.632.927 para Adair et al. Preferencialmente, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidos nele introduzidos a partir de uma fonte que não é humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são muitas vezes referidos como resíduos de "importação", que são normalmente retirados de um domínio variável de "importação". A humanização pode ser realizada, essencialmente, seguindo o processo de Winter e dos seus colaboradores (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), substituindo as sequências da região hipervariável pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. De acordo com isto, esses anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (pat. U.S. No. 4.816.567) em que praticamente menos do que um domínio variável humano intacto tenha sido substituído 59 pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são normalmente anticorpos humanos em que alguns resíduos de regiões hipervariáveis e possivelmente alguns resíduos de RS são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores. Os anticorpos anti-CD20 humanizados em questão conterão regiões constantes de imunoglobulina humana. A escolha dos domínios humanos variáveis, tanto leves como pesados, que se utilizam na preparação de anticorpos humanizados, é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o processo chamado "melhor ajustado", a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é rastreada contra uma base de dados completa de sequências humanas conhecidas, de domínio variável. A sequência humana que estiver mais próxima da do roedor é então aceite como a região de estrutura (RE) humana para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et al., J Mol. Biol., 196: 901 (1987)). Outro processo para seleccionar a sequência da estrutura humana consiste em comparar a sequência de cada sub-região individual da estrutura completa do roedor (isto é, RS1, RS2, RS3 e RS4) ou alguma combinação das subregiões individuais (por exemplo, RS1 e RS2) contra uma base de dados de sequências conhecidas de região variável humana que corresponde à subregião estrutural (por exemplo, conforme determinado pela numeração de Kabat) e escolher a sequência humana para cada subregião ou combinação que esteja mais próxima da do roedor (Leung publicação do pedido de patente U.S. No. 2003/0040606A1, publicada em 27 de Fev. de 2003) . Outro processo utiliza uma região estrutural particular derivada da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas. Pode-se utilizar o mesmo quadro 60 para vários anticorpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al. Immunol., 151: 2623 (1993)). É ainda importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção de uma elevada afinidade para o antigénio e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objectivo, de acordo com um processo preferido, os anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das sequências parentais e vários produtos humanizados conceptuais utilizando modelos a três dimensões das sequências parentais e das humanizadas. Os modelos a três dimensões da imunoglobulina estão normalmente disponíveis e são familiares para os especialistas nesta técnica. Existem disponíveis programas de computador que ilustram e exibem estruturas conformacionais, prováveis, em três dimensões das sequências candidatas de imunoglobulina que foram seleccionadas. A inspecção destas imagens permite a análise do provável papel dos resíduos no funcionamento da sequência candidata de imunoglobulina, isto é, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata para se ligar ao seu antigénio. Deste modo, podem seleccionar-se os resíduos de RS e podem combinar-se a partir de sequências receptoras e importadas de modo a conseguir-se a característica desejada do anticorpo, tal como afinidade acrescida para os antigénio-alvo. Em geral, os resíduos das regiões hipervariáveis estão directamente e na maior parte dos casos profundamente envolvidos na influência da ligação ao antigénio
Noutro enquadramento, as moléculas de ligação ao antigénio da presente invenção são tratadas por engenharia para terem uma afinidade de ligação aumentada de acordo, 61 por exemplo, com os processos descritos na pub. do pedido de pat. U.S. No. 2004/0132066 para Balint et ai.
Num enquadramento, a molécula de ligação ao antigénio da presente invenção é conjugada com uma parte adicional, tal como um marcador de rádio ou uma toxina. Essas MLAs conjugadas podem ser produzidas por numerosos processos que são bem conhecidos na técnica.
Pode-se aplicar, na presente invenção, uma variedade de radionuclideos e os especialistas na matéria estão creditados com a capacidade de facilmente determinar qual radionuclideo é mais apropriado sob uma variedade de circunstâncias. Por exemplo, o 131iodo é um radionuclideo bem conhecido utilizado para a imunoterapia dirigida ao alvo. Contudo, a utilidade clinica do 131iodo pode estar limitada por vários factores incluindo: semi-período de vida fisico de oito dias; desalogenação do anticorpo iodado tanto no sangue como nos sitios do tumor; e caracteristicas de emissão (por exemplo, componente gama grande) que podem ser subóptimos para a deposição da dose localizada no tumor. Com o advento de agentes quelantes superiores, a oportunidade para ligar grupos quelantes de metal a proteínas aumentaram as oportunidades para utilizar outros radionuclideos tais como li:Líndio e 90ítrio. O 90itrio providencia vários benefícios para a utilização em aplicações radioimunoterapêuticas: o semi-período de vida de 64 horas do 90ítrio é suficientemente longo para permitir a acumulação do anticorpo pelo tumor e, ao contrário, por exemplo, do 131iodo, 90ítrio é um puro emissor beta de elevada energia sem ser acompanhado por uma radiação gama quando começa a diminuir, com um intervalo no tecido de 100 a 1000 diâmetros de célula. Além disso, a quantidade mínima da radiação de penetração permite a 62 administração a um doente em ambulatório de anticorpos marcados com 90itrio. Adicionalmente, a internalização do anticorpo marcado não é necessária para matar as células e a emissão local da radiação de ionização deve ser letal para células adjacentes do tumor a que falta o antigénio-alvo.
As doses para o tratamento com doses únicas eficazes (isto é, quantidades efectivas sob o ponto de vista terapêutico) de anticorpos anti-CD20 marcados com 90itrio varia entre cerca de 5 e cerca de 75 mCi, mais preferencialmente entre cerca de 10 e cerca de 40 mCi. As doses para o tratamento ablativo fora da medula com doses únicas eficazes de anticorpos anti-CD20 marcados com 131iodo varia entre cerca de 5 e cerca de 70 mCi, mais preferencialmente entre cerca de 5 e cerca de 40 mCi. As doses para o tratamento ablativo com doses únicas eficazes (isto é, pode requerer uma transplantação de medula óssea autóloga) de anticorpos anti-CD20 marcados com 131iodo variam entre cerca de 30 e cerca de 600 mCi, mais preferencialmente entre cerca de 50 e menos do que cerca de 500 mCi. Em conjugação com um anticorpo quimérico anti-CD20, pertencendo aos anticorpos de murino face a um semi-período de vida em circulação mais longo, as doses únicas eficazes para o tratamento ablativo fora da medula, de anticorpos quiméricos anti-CD20 marcados com 131iodo variam entre cerca de 5 e cerca de 40 mCi, mais preferencialmente menos do que cerca de 30 mCi. Os critérios de visualização por exemplo, para o marcador 111indio, são normalmente inferiores a 5 mCi.
No que respeita aos anticorpos anti-CD20 radio-marcados, a terapia que os utiliza pode também ocorrer utilizando um único tratamento terapêutico ou utilizando 63 múltiplos tratamentos. Por causa do componente de radionuclídeo, é preferível que, antes do tratamento, se "colham" células estaminais periféricas ("CEP") ou medula
óssea ("MO") no caso de pacientes que experimentam potencialmente uma toxicidade fatal da medula óssea resultante da radiação. Colhe-se a MO e/ou as CEM utilizando técnicas normalizadas e depois purgam-se e congelam-se para uma possível re-infusão. Adicionalmente, é preferível que antes do tratamento se faça no paciente um estudo dosimétrico de diagnóstico utilizando um anticorpo de diagnóstico marcado (por exemplo, utilizando 111índio) cuja finalidade consiste em assegurar que o anticorpo marcado sob o ponto de vista terapêutico (por exemplo, utilizando 90ítrio) não se torne descenessariamente "concentrado" em qualquer órgão ou tecido normais. A presente invenção também tem por objecto um polinucleótido isolado que codifica um polipéptido com uma sequência de aminoácidos como se mostra no quadro 3 a seguir. Também se descreve um ácido nucleico isolado que compreende uma sequência que codifica um polipéptido com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das estruturas do quadro 3 com substituições conservadoras de aminoácidos. 64
ESTRUTURA QUADRO 2
SEQUENCIA DE NUCLEOTIDOS
SEQ ID NO 29
GAAGCCTGGGAGnCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGG
CTTCCGGATACACCrrcÀGCTATTCTTGGATGAGCT
GGOTGCGOCAOOCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGG
ATGGG ACGG A TCTTTCCCGGCG ATGGGGATACTGA
CTACGCACAGAAÃTTCCAAfíGAAGAGTCACAATTA
CCGCCGAC AAATCCACT AGCAC AGCCTATATGG AG
CTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTA
TGTTTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCT 31 B-HH2
CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGCGCTGAAGTTAA
ATGGGACGGATCTTTCCCGGCGATGGGGATACTGA
TT ACTGTGCA AGA A ATGTCTITGATGGTT ACTGGCT TGTTTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCT CCTCA 33
CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGCGCTGAAGTTAA GAAGCCTGfíGAGTTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGG CITCCGGATACGCCTTCAGCYATTCTTGGATGAACT GGGTGCGGCAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGG ATGGGACGGATCTTTCCCGGCGATGGGGATACTGA CT ÀCÃATGGGAA ATTCAAGGGCAGAGTCACA ATT A CCGCCGACAAATCCACTAGCACAGCCTATATGGAG CTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTA TCTGTGTGCAAGAAATGTCTTTGATGGTTACTGGCT TGTT 65
ESTRUTURA (continuação)
SEQUENCIA DE NUCLEOTIDOS
SEQ ID NO
CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGCGCTGAAGTTAA
TGGGTGCGGCAGOCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTG
GATGGGACGGATCTTTCCCGGCGATGGGGATACTG
ACTACAATGGGAAA1TCAAGGGCAGAGTCACAATT
ACCGCCGACAAATCCACTAGCACAGCCTATATGGA
GCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGT
ATTACTGTGCAAGAAATGTCTTTGATGGTTACTGGC
TTGTTTACTGGGGCCAGGGAACCCTOGTCACCGTCT
CCTCA 37
GAAGCCTGGCGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGG
CTTCCGGATACACCTTCAGCTATTCTTQGATOAACT
GGGTGCGGCAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGG
ATGGGACGGATCTTTCCCGGCGATGGGGATACTGA
CTACAATGGGAAATTCAAGGGCAGAGTCACAATTA
CCTCA 39
GAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGG
CTTCCGGATACACCTTCACCTATTCTTGGATGCACT
GGGTGCGGCAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGG
ATGGGACGGATCTTTCCCGGCGATGGGGATACTGA
CTACGCACAGAAATTCCAAGGAAGAGTCACAATGA
CACGGGACACGTCCACTTCCACCGTCTATATGGAG
CTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTA
TTACTGTGCAAGAAATGTCTTrGATGGTTACTGGCT
CCTCA
TGT CCGG ATACA CCTT C ACCT ATTCTT GG ATGC A CT
GGGTGCAGCAGGCCCCTGGAAAGGGGCTCGAGTG
GATGGGACGGATCTTTCCCGGCGATGGGGATACTG
ACTACGCAGAGAAATTCCAAGGAAGAGTCACAATC
ACAGCCGACACGTCCACTGACACCGCCTATATGGA
GCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGT
ATTACTGTGCA ACC A ATGTCTTTGATGGTTACTGGC
TTGTTTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCT
CCTCA 66
ESTRUTURA
Ti TTTT o (continuação)
SEQUENCIA DE NUCLEOTIDOS
SEQ ID NO 43
OAAGCCTGGGGCCACCGTGAAGATCTCCTGCAAGG
GATGGGACGGATCTTTCCCGGCGATGGGGATACTG ACTACAATGGGAAATTCAAGGGAAGAGTCACAATC
acagccgacacgtccactgacaccgcctatatgga GCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGT
TTGTTTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTGACCGTCT CCTCA R-HH 9 45
CTTCCGGATACACCTTCAGCTATTCTTGGATGAACT GGGTGCGGCAGGGCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGG ATGGGACGGATCTTTCCCGGCGATGGGGATACTGA GTAGAATGGGAAATTCAAGGGCAGAGTCACAATTA CCGCCGACAAATCCACTAGCACAGCCTATAIGGAG CTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTA TTACTGTGCAAGAÁATGTCTTTGATGGTTACTGGCT
CCTCA
CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGCGCTGAAGTTAA GAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGOTCTCCTGCAAGG CTTCCGGATACACCTTCACCTATTCTTGGATGCACT GGGTGCGGCAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGG ATGGGACGGATCTTTCCCGGCGATGGGGATACTGA
CACGGGACACGTCCACTTCCACCGTCTATATGGAG
ttactgtgcaagaAatgtctttgatggttactggct TGTTTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCT CCTCA
B-HL2 | GAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGCGCTGAAGTTAA GAAGCCTGGGGCCACCGTGAAGATCTCCTGCAAGG TGTCCGGAT ACACCTTC ACCT ATTCTTGGATGCACT GGGTGCAGCAGGCCCCTGGAAAGGGGCTCGAGTG GATGGGACGGATCTTTCCCGGCGATGGGGATACTG ACTACGCAGAGAAATTCCAAGGAAGAGTCACAATC
GCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGT
TTGTTTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCT 47 49 67 (continuação)
ESTRUTURA
SEQUENCIA DE NUCLEOTIDOS
SEQ ID NO
GAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGCGCTGAAGTTAA 51
TGTCCGGATACACCTTCACCT ATTCTTGO ATGA ACT GGGTGCAGCAGGCCCCTGGAAAGGGGCTCGAGTG GATGGGACGGATCTTTCCCGGCGATGGGGATACTG ACTACAATGGGAAATTCAAGGGAAGAGTCACAATC ACAGCCGACACGTCCACTGACACCGCCTATATGGA GCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGT ATT ACTGTGCA ACCAATGTCTTTGATGGTTACTGGC TTGTTTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCT CCTCA
R-HT.Zl I CAGATGCAATTGGTGCAGTCTGGCGCTGAAGTTAA GAAGACCGGGAGTTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGG CTTCCGGATACACCTTCACCTATTCTTGGATGAGCT GGGTGCGGCAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGG 53
CTACGCACAGAAATTCCAAGGAAGAGTCACAATTA CCGCCGACAAATCCACTAGCACAGCCTATATGGAG CTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCOTGTA TTACTGTGCAAGAAATGTCTTTGATGGTTACTGGCT TGTTTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCT CCTCAGCTAGCACC
B-HL8 GAAGTGGAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGT CAAGCCTGGCGGGTCCCTGCGGCTCTCCTGTGCAG CCTCTGGATTCACATTTAGCTATTCTTGGATGAACT 3GAAAG(
GTGGGACGGATCmrCCGGGCGATGGGGATACTGA 3CL
CCGCCGACAAATCCACTAGCACAGCCTATATGGAG CTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTA TGTTTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCT CCTCA
CGGAA1TCGGCCCACCGGTGGCCACCATGGACTGG
AGGAGCCCACTCCGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTG GAGGAGGCTTGGTCAAGCGTGGCGGGTCCCTGCGG
TCTTGGATGAACTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGAAA GGGCCTCGAGTGGGTGGGACGGATCTTTCCCGGCG
A TGGGG AT AC TG A CTACAATQGG A AATTCA AGGGC AGAGTCACAATTACCGCCGACAAATCCACTAGCAC AGCCTATATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGG ACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGAAATGTCTTT 55 57 68
ESTRUTURA (continuação)
SEQUENCIA DE NUCLEOTIDOS
SEQ ID NO 59
CAAGCCTGGCGGGTCCCTGCGGCTCTCCTGTGCAG
CCTCTGGATTCACATTTAGCTATTCTrGGATGAACT
TGTTTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCT CCTCA 61
CGGAATTCGGCCCACCGGTGGCCACCATGGACTGG
ACCTGGAGGATCCTCTTCTTGGTGGCÁGCAGCCAC
GAGCAGGCTTGGTCAAGCCTGGCGGGTCCCTGCGG
CTCTCCTGCGCAGCCTCTGGATrCACATTTAGCTAT
TCTTGGATGAACTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGAAA
GOGCCTCGAGTGGGTGGGACGGATCTTTCCCGGCG
ACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGAAATGTCTTT G ATGGTT ACTGGCTTGTTTACTGGGGCC AGG G A AC 63
CGGAATTCGGCCCACCGGTGGCCACCATGGACTGG
ACCTGGAGGATCCTCTTCTTGGTGGCAGCAGCCAC
AGGAGCTCACTCCGAAGTGCAGCTCGTCGAGTCTG
GAGGAGGGGTGGTCAAGCCTGGCGGGTCCCTGCGG
CTCTCCTGCGCAGCCTCTGGATTCACATTTAGCTAT
TCTTGGATGÀACTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGAAA
GGGCCTCGAGTGGGTGGGACGGATCTTTCCCGGCG
ATGGGGATACTGACTACAATGGGAAATTCAAGGGC
AGAGTCACAATTACCGCCGACAAATCCACTAGCAC
A GCCT AT ATGG AGCTGAGC AGCCTGAGATCTGAGG
ACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGAAATGTCTTT
GATGGTTACTGGCrrGTTTACTGGGGCCAGGGAAC 69 (continuação) ESTRUTURA SEQUÊNCIA DE NUCLEÓTIDOS SEQ ID NO CGGAATTCGGCCCACCGGTGGCCACCATGGACTGG ACCTGGAGGATCCTCTTCTTGGTGGCAGCAGCCAC aggagctcactccgaagiocagctggtcgagtccg GAGGAGGCTTGAAGAAGCCTGGCGGGTCCCTGCGG CTCTCCTGCGCAGCCTCTGGATTCACATTTAGCTAT TCTTGGATGAACTGGGTGCGGCAGGC1CCTGGAAA GGGCCTCGAGTGGGTGGGACGGATCTTTCCCGGCG ATGGGGATACTGACTACAATGGGAAATTCAAGGGC AGAGTCACÁATTACCGCCGAGAAATCCACTAGCAC AGCCTATATGGAGCTGAGCÀGCCTGAGATGTGAGG agacggccgtgtattactgtgcaagaaátgtcttt gatggttactggcttgtttactggggccagggaac cctggtcaccgtctcctcagctagcgaattctcga 65 ACCTGGAGGATCCTC^CTrGGTGGGAGCAGCCAC AGGAGCCCACTCCGAAGTGCAGCTGfiTGGAGTCTG GAGGAGGCTTGGTCAAGCCTGGCTCTTCCCTGCGG CTCTCCTGCGCAGCCTCTGGATTCACATTTAGCTAT TCITGGATGAACTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGAAA GGGCCTCGAGTGGGTGGGACGGATCTTTCCCGGCG ATGGGGATACTGACTACAATGGGAAATTCAAGGGC AGAGTCACAATTACCGCCGACAAATCCACTAGCAC AGCCTATATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGG ACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGAAATGTCTTT GATGGTTACTGGCTTGTTTACTGGGGCCAGGGAAC GCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCGAATTCTCGA 67 CGGAÃTfCGGCCCACCGGTGGCCACCATGGACTGG ACCTGGAGGATCCTCTTCTTGGTGGCAGCAGCCAC AGGAGCCCACTCCGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTG GAGGAGGCTrGGTCAAGCCTGGCGGGTCCCTGCGG GTCAGCTGCGCÁGCCTCTGGATTCACATTTAGCTAT TCTTGGATGAACTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGAAA GGGCCTCG A GTGGGTGGG ACGG ATCTTTCCCGGCG ATGGGGATÁCTGACTACAATGGGA AATTCAAGGGC A GA GTC AC A ATTACC GCCG AC A A A TCC ACT A GC AC A C ACGGCCGTGT A TT ACTGTGC A AG A A AT GTCTTT GATGGTTACTGGCIfTGTTTACTGGGGCCAGGGAAC CCl^QGT^CCIl CTG£.. C.JjC — 69 70 (continuação) ESTRUTURA SEQUÊNCIA DE NUCLEÓTIDOS SEQ ID NO CGGAATTCGGCCCACCGGTGGCCACCATGGACTGG acctggaggatcctcttcttggtggcagcagccac aggagcccactccgaagtgcagctggtggagtctg gaggaggcttggtcaagcctggcgggtccctgcgg TCTTGGATGAACTGGGTGCGGGAGGCTCCTGGAAA GGGGCTCGAGTGGGTGGGACGGATCTTTCCCGGCG ATGGGGATACTGACTACAATGGGAAATTCAAGGGC AGCCrATATGGAGCTGAGCAGCCTGAGÃrCTGAGG ACACGGGCGTGTATTACTGTGCAAGAAATGTCTTT GATGGTTACTGG€T1'G1TTACTGGGGCCAGGGAAC CCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCGAATTCTCGA 71 ATGGACTGGACCTGGAGGATCCTCTTCTTGGTGGC VP 73 GATÂTCGTGATGACCCAGACTCCACTCTCCCTGCCC GTCACCCCTGGAGAGCCCGCCAGCATTAGCTGCAG GTCTAGCAÃGAGCCTCTTGCACAGCAATGGCATCA CTTATTTGT ATTGGT ACCTGCA A AAGCCAGGGCAG TCTCCACAGCTCCTGÀTTTATCAAATGTCCAACCTT GTCTCTGGCGTCCCTGACCGGTTCTCCGGATCCGGG TCAGGGACTGATrrCACACTGAAAATCAGCAGGGT GGAGGGTGAGGATGTTGGAGTTTATTACTGCGCTC agaatctagaacttccttacaccttcggcggaggg ACCAAGGTGG AGATGAAACGTACGGTG 75 Socmônni a ATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGCCT CCTGCTGCTCTGGTTCCCAGGTGCCAGGTGT VL 77 71 QUADRO 3 ESTRUTURA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS SEQ ID NO OVOLVOSGAE\ 4KKPGSSVKVSCKASGYTPSYSWMSWVR 30 Õ AFGÕOLE WMORIFPGDG DTD Y AO iCFOOR VTITÀDKSTS VTVSS iDT A V YY C ARNVFDGY WLVY WGOGtX, "R — RR 9 OVOLVOSGAE /KK.PGSSVK.VSCKASGYAFSYSWMNWV ! 32 ROAPGOGLEWMGR3FPGDGDTDYNGKFKGRVTÍTADKS TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGOG i TI.VTVSS Ο V ΟΪ, VOSG A E VK KPGS SVKV SC KA SG Y A FS Y S WMN W V 34 ROAPGOGLF.WMGRÍFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKS TSTAYMFLSSLRSEDTAVYLCARNVFDGYWLVYWGOGT LVTVSS _1_ 72 (continuação) ESTRUTURA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS SEQ ID NO OVOLVOSGAEV1 KKPGASVKVSCKVSGYAFSYSWMNWV 36 R O A PO OGLE W ív GRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKS TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGOG TLVTVSS OVOLVOSGAEVKKPG SS VK V SCKÂSG Y A PS Y S WMS WV 38 ROAPGOGLF.WMGRÍFPGDGDTDYNGKFKGRVTrTADKS TST A YMELS SLRSEDTA VYY C ARNVFDG Y WLVY W GOG TLVTVSS OVGLVÕSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVR 40 OAPGOGLEWMGRÍFPGDGDTDYNGKFKGRVTITàDKSTS TAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGOGTL VTVSS 'OVÓLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWÍSWVR 42 OAPGOGLEWMGRSFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKSTS T A YMEl .SSl .R SEDT A VYY C ARNVFDG YWL V Y WGOGT L VTVSS OVOLVÕSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTYSWMNWV 44 ROAPGOGLEWMGRÍFPGDGDTBYNGKFKGRVTJTADKS TLVTVSS .>ÍSOTAVYYC.ARNVFPG.Y,WtV ÒV OLV OSG AF. VK K PG AS VK V SCKA SG YTFS Y S WMN WV 46 ROAPGOGLEWMGRÍFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKS TSTAYMRLSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGOG TLVTVSS OVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTYSWMHWV 48 RGAPGOGLEWMGRIFPGDGDTDYAOKFOGRVTMTRDT STSWYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGO GTLVTVSS EVOLVOSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTYSWMHWV 50 OOA PG KGLE WMGR1FPGDG DTDY A EKFOGR VTITADTS TDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATNVFDGYWLVYWGOG TLVTVSS EVOLVOSGAEvicKPGATVKlSCKVSGYTFTYSWMNWV 52 OOAPGKGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTÍTADTS TDTAYMELSSLRSEDTAWYCATNVFDGYWLVYWGOG TLVTVSS OMOLVOSGAEVKKTGSSVKVSCKASGYTFTYSWMSWV 54 ROaPGOGLEWMGRIFPGDGDTDYAOKFOGRVTJTADJCS TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVPDGYWLVYWGOG p TVSS___ 73 (continuação) ESTRUTURA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS SEQ ID NO EVOLVESGGGLV* ÍPGGSLRLSCAASGFTFSYSWMNWVR 56 OAPGKGLEWVGRJFFGDGDTDYNGKFKGRVTITADKST ST A YMF.I SS! R SF.DTAV YYCARNVFDG YWLVYWGOGT LVTVSS EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFAFSYSWMNWVR 58 OAPGKGLEWVGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTÍTADKSTS TAYMELSSLRSEDTAVYYCÀRNVFDGYWLVYWGQGTL VTVSS Ο V ÓL V ESGGGL VKPGG SLRLSCA A SGFTF SY SWMNWVR 60 OAPGKGLEWVGRIFPGDGDTDYNGííFKGRVTITADKST STAYMEL.SSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGOGT mm 1 EVOLVESGAGLVKTGGSLRLSCAASGFTFSYSWMNWVR 62 OAPGKGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKST ST A YMF.I .SST ,R SF.DT A V YYC A RNVFDG YWLVYWGOGT EVOLVE SGGG V VKPG G SLRLSC A A SGFTFS Y S WMN W V R 1 64 OAPGKG LE WMGR.IFPGDGDTDYNGKFKGR VTIT ADKST! TAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGOGTL VTVSS E VOLVESGGG LK K PGGSI..RLSC A A SGFTFS YS WMN W VR 68 QAPGKGI ,.F.WMGRIFPGDGDTDYNG KTKGRVTITADKSTÍ T A YMELSSLR SEDTA V YYC ARNVFDGY WL VY WGOGTL VTVSS | F VO L V ESGGG LV ltPGSSLRLSC A A SG F TF S YS W MN W V R 70 OAPGRGLEWMGRTFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKST STAYMELSSLRSEDTAWYCARNVFDGYWLVYWGOGT LVTVSS EVOLVKSGGGLVKPGGSI.RVSCAASGFTFSYSWMNWVR 720 OAPGKGLRWMGftIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKSTS TAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGOGTL VTVSS Seque MDWTWRILFLVÂAATGAHS de sinal VP 1 74 DTVMTÕTPI.SLPVTPGEPASÍSCRSSKSLLHSNGITYLYWY 76 LQKPGOSPOLLIYOMSNLVSGVPDRFSGSGSGTDFTLKIS RVEAEDVGVYYCAONLELPYTFGGGTKVEIKRTV Sequência MDMR\ de sincix v±j 'PAQLLGLLLLWFPGARC 78 74
Também tem por objecto um polinucleótido isolado que compreende uma sequência que codifica um polipéptido que tem a sequência de aminoácidos ilustrada na FIG. 1 ou na FIG. 2. Também tem por objecto um ácido nucleico isolado que compreende uma sequência que codifica um polipéptido com a sequência de aminoácidos de uma qualquer das FIG. 1, FIG. 2, FIG. 5 ou FIG. 6 com substituições conservadoras de aminoácidos.
Noutro enquadramento, a presente invenção tem por objecto um vector de expressão e/ou uma célula hospedeira, de acordo com as reivindicações, que compreende um ou mais polinucleótidos isolados.
Geralmente, qualquer tipo de linha de células de cultura pode ser utilizado para expressar a MLA da presente invenção. Num enquadramento preferido, células de OHC, células RHB, células de NSO, células de SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de murganho P3X63, células de PER, células de PER.C6 ou células de hibridoma, outras células de mamíferos, células de leveduras, células de insectos ou células de plantas são utilizadas como linhas de células antecedentes para gerar as células hospedeiras tratadas por engenharia da presente invenção. A eficácia terapêutica das MLAs da presente invenção pode ser melhorada quando se produzem numa célula hospedeira que ainda expressa um polinucleótido que codifica um polipéptido com actividade de GnTIII. Num enquadramento preferido, o polipéptido que tem actividade de GnTIII é um polipéptido de fusão que compreende um dominio de localização de Golgi de um polipéptido residente em Golgi. Noutro enquadramento preferido, a expressão das MLAs da presente invenção numa célula hospedeira que 75 expressa um polinucleótido que codifica um polipéptido com actividade de GnTIII resulta em MLAs com uma afinidade de ligação acrescida ao receptor Fc e uma função efectora aumentada. De acordo com isto, num enquadramento, a presente invenção tem por objecto uma célula hospedeira que compreende (a) um ácido nucleico isolado que compreende uma sequência que codifica um polipéptido com actividade de GnTIII; e (b) um polinucleótido isolado codificando uma MLA da presente invenção, tal como um anticorpo quimérico ou humanizado que se liga a CD20 humana. Num enquadramento preferido, o polipéptido com actividade de GnTIII é um polipéptido de fusão que compreende o dominio catalítico de GnTIII e o dominio de localização de Golgi é o dominio de localização de manosidase II. Os processos para gerar esses polipéptidos de fusão e a sua utilização para produzir anticorpos com funções efectoras aumentadas estão descritos no pedido provisório de pat. U.S. No. 60/495.142. Noutro enquadramento preferido, a MLA quimérica é um anticorpo quimérico ou um seu fragmento, com a especificidade de ligação do anticorpo B-LYl de murino. Num enquadramento particularmente preferido, o anticorpo quimérico compreende um Fc humano. Noutro enquadramento preferido, o anticorpo é primatizado ou humanizado.
Num enquadramento, um ou vários polinucleótidos que codificam MLA da presente invenção podem ser expressos sob o controlo de um promotor constitutivo ou, alternativamente, um sistema de expressão regulado. Os sistemas de expressão regulados apropriados incluem, mas não se limitam a sistema de expressão regulada de tetraciclina , um sistema de expressão indutivel de ecdisona, um sistema de expressão a que falta a ligação, um sistema de expressão indutivel de glicocorticóide e um sistema de expressão indutivel de metalotioneina metálica. 76
Se vários ácidos nucleicos diferentes que codificam uma MLA da presente invenção estão compreendidos dentro do sistema da célula hospedeira, alguns deles podem ser expressos sob o controlo de um promotor constitutivo, enquanto outros são expressos sob o controlo de um promotor regulado. 0 nivel de expressão máximo é considerado como sendo o nivel mais alto possível da expressão de polipéptidos estáveis que não tenha efeitos adversos significativos na taxa de crescimento das células e será determinado por experimentação de rotina. Os níveis de expressão são determinados por processos geralmente conhecidos na técnica, incluindo a análise de "Western blot" utilizando um anticorpo específico para a MLA ou um anticorpo específico para um marcador de péptido fundido com a MLA; e a análise de "Northern blot". Numa outra alternativa, o polinucleótido pode estar operacionalmente ligado a um gene repórter; os níveis de expressão de uma MLA quimérica têm praticamente a mesma especificidade de ligação do anticorpo B-Lyl de murino e são determinados medindo um sinal correlacionado com o nível de expressão do gene repórter. 0 gene repórter pode ser transcrito em conjunto com os ácidos nucleicos que codificam o referido polipéptido de fusão como uma molécula única de ARNm; as respectivas sequências de codificação podem estar ligadas quer por meio de um sítio de entrada interna do ribosoma (SEIR) ou por meio de um melhorador de tradução independente da cobertura (MTIC). 0 gene repórter pode ser traduzido em conjunto com pelo menos um ácido nucleico que codifica uma MLA quimérica tendo praticamente a mesma especificidade de ligação do anticorpo B-Lyl de murino de tal modo que se forma uma cadeia única de polipéptido. Os ácidos nucleicos que codificam as LMAs da presente invenção podem estar operacionalmente ligados ao gene repórter sob o controlo de um único promotor, de tal maneira que o ácido nucleico que 77 codifica o polipéptido de fusão e o gene repórter são transcritos numa molécula de ARN que alternativamente é dividida em duas moléculas de ARN mensageiro (ARNm); um das ARNm resultantes é traduzida na referida proteína repórter e o outro é traduzido no referido polipéptido de fusão.
Os processos que são bem conhecidos pelos especialistas na matéria podem ser utilizados para construir vectores de expressão contendo a sequência de codificação de uma MLA com praticamente a mesma especificidade de ligação do anticorpo B-Lyl de murino em conjunto com sinais de controlo apropriados de transcrição/translação. Estes processos incluem técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas de síntese e recombinação/recombinação genética in vivo. Ver, por exemplo, as técnicas descritas em Maniatis et al., MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. (1989) e Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates e Wiley Interscience, N.Y (1989).
Pode-se utilizar uma variedade de sistemas de vector de expressão do hospedeiro para expressar a sequência de codificação das LMAs da presente invenção. Preferencialmente, as células de mamíferos são utilizadas como sistemas de células hospedeiras transfectados com ADN recombinante de plasmido ou vectores de expressão de ADN de cosmidos contendo a sequência de codificação da proteína de interesse e a sequência de codificação do polipéptido de fusão. Mais preferencialmente, células de OHC, células de RHB, células de NSO, células de SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de murganho P3X63, células de PER, células de PER.C6 ou células de hibridoma, outras células de mamíferos, células de leveduras, células de insectos ou 78 células de plantas são utilizadas como o sistema de células hospedeiras. Alguns exemplos de sistemas de expressão e processos de selecção estão descritos nas referências que se seguem e nas referências nelas contidas: Borth et al., Bioteclanol. Bioen. 71 (4): 266-73 (2000-2001), em Werner et al., Arzneimittelforschung/Drug Res. 48 (8): 870-80 (1998), em Andersen e Krummen, Curr. Op. Biotechnol. 13: 117-123 (2002), em Chadd e Chamow, Curr. Op. Biotechnol. 12: 188-194 (2001), e em Giddings, Curr. Op. Biotechnol. 12: 450-454 (2001). Em enquadramentos alternativos, podem considerar-se outros sistemas de células hospedeiras eucarióticas, incluindo células de levedura transformadas com vectores recombinantes de expressão de leveduras contendo a sequência de codificação de uma MLA da presente invenção; sistemas de células de insectos infectados com vectores virais de expressão recombinante (por exemplo, baculovirus) contendo a sequência de codificação de uma MLA quimérica tendo praticamente a mesma especificidade de ligação do anticorpo B-Lyl de murino; sistemas de células de plantas infectados com vectores de expressão de virus recombinante (por exemplo, virus do mosaico da couve-flor, VNCf; virus do mosaico do tabaco, VMT) ou transformados com vectores de expressão recombinantes de plasmidos (por exemplo, plasmido Ti) contendo a sequência de codificação da MLA da presente invenção; ou sistemas de células de animais infectados com vectores de expressão recombinante de virus (por exemplo, adenovirus, virus vaccinia) incluindo as linhas de células tratadas por engenharia para conter cópias múltiplas do ADN que codifica uma MLA quimérica tendo praticamente a mesma especificidade de ligação do anticorpo B-Lyl de murino quer amplificados de forma estável (OHC/dhfr) ou amplificados de forma instável em cromossomas de minutos duplos (por exemplo, linhas de células de murino). Num enquadramento, o vector que 79 compreende os polinucleótidos que codificam a MLA da presente invenção é policistrónico. Também num enquadramento, a MLA discutida antes é um anticorpo ou um seu fragmento. Num enquadramento preferido, a LMA é um anticorpo humanizado.
Para os processos da presente invenção, prefere-se geralmente a expressão estável em relação à expressão temporária porque normalmente atinge resultados mais reprodutíveis e também é mais manuseável para a produção em grande escala. Em vez de utilizar vectores de expressão que contêm origens virais de replicação, as células hospedeiras podem ser transformadas com os respectivos ácidos nucleicos de codificação controlados pelos elementos de controlo de expressão apropriados (por exemplo, promotor, melhorador, sequências, terminadores de transcrição, sitios de poliadenilação, etc.) e um marcador seleccionável. No seguimento da introdução do ADN estranho, as células tratadas por engenharia podem deixar-se a crescer durante 1-2 dias em meio enriquecido e depois ligam-se a um meio selectivo. 0 marcador seleccionável no plasmido recombinante confere resistência à selecção das células que integraram de forma estável o plasmido nos seus cromossomas e crescem para formar focos que, por sua vez, podem ser clonados e expandidos em linhas de células.
Pode-se utilizar um certo número de sistemas de selecção, incluindo, mas não se limitando a genes de timidina-cinase do virus do herpes simplex (Wigler et al., Cell 11: 223 (1977)), fosforibosiltransferase de hipoxantina-guanina (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 48: 2026 (1962)) e fosforibosiltransferase de adenina (Lowy et al., Cell 22: 817 (1980)), que podem ser utilizado em células tk~, hgprt" ou aprt~, 80 respectivamente. Também se pode utilizar a resistência de antimetabolitos como a base de selecção para dhfr, que confere resistência a genes de metotrexato (Wigler et al., Natl. Acad. Sei. USA 77: 3567 (1989); 0'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 1527 (1981)); gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 2072 (1981)); neo que confere resistência ao aminoglicósido G-418 (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150: 1 (1981)); e hygro, que confere resistência a higromicina (Santerre et al., Gene 30: 147 (1984). Recentemente, descreveram-se genes seleccionáveis adicionais, nomeadamente trpB, que permite que as células utilizem índole em vez de triptofano; hisD, que permite que as células utilizem histinol em vez de histidina (Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 8047 (1988)); o sistema de glutamina-sintase; e ODC (ornitina-descarboxilase) que confere resistência ao inibidor de ornitina-descarboxilase, 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue, em: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed. (1987)). A presente invenção tem ainda por objecto um processo para modificar o perfil de glicosilação das MLAs da presente invenção que são produzidas por uma célula hospedeira, compreendendo a expressão na referida célula hospedeira de um ácido nucleico que codifica uma LMA da presente invenção e um ácido nucleico que codifica um polipéptido com actividade de GnTIII ou um vector que compreende esses ácidos nucleicos. Preferencialmente, o polipéptido modificado é IgG ou um seu fragmento compreendendo a região Fc. Num enquadramento particularmente preferido, a LMA é um anticorpo humanizado ou um seu fragmento. 81
As MLAs modificadas produzidas pelas células hospedeiras da presente invenção exibem uma maior afinidade de ligação ao receptor Fc e/ou uma função efectora aumentada em resultado da modificação. Num enquadramento particularmente preferido, a LMA é um anticorpo humanizado ou um seu fragmento contendo a região Fc. Preferencialmente, a afinidade de ligação aumentada ao receptor Fc é a ligação aumentada a um receptor de activação Fcy, tal como o receptor FcYRIIIa. 0 aumento da função efectora é preferencialmente um aumento em um ou mais dos seguintes factores: aumento da citotoxicidade celular dependente do anticorpo, aumento da fagocitose celular dependente do anticorpo (FCDA), aumento da secreção de citocina, aumento da absorção do antigénio mediada pelo complexo imunitário por meio das células que apresentam o antigénio, aumento da citotoxicidade celular mediada por Fc, aumento da ligação a células AN, aumento da ligação a macrófagos, aumento da ligação a células polimorfonucleares (PMNs), aumento na ligação a monócitos, aumento na reticulação de anticorpos ligados ao alvo, aumento da sinalização directa que induz a apoptose, aumento da maturação das células dendriticas e aumento da iniciação das células T. A presente invenção tem ainda por objecto um processo para a produção de uma MLA da presente invenção, com oligossacáridos modificados numa célula hospedeira que compreende (a) a cultura de uma célula hospedeira tratada por engenharia para expressar pelo menos um ácido nucleico que codifica um polipéptido que tem actividade de GnTIII em condições que permitem a produção de uma MLA de acordo com a presente invenção, em que o referido polipéptido que tem actividade de GnTIII é expresso numa quantidade suficiente para modificar os oligossacáridos na região Fc da referida 82 MLA produzida pela referida células hospedeira; e (b) o isolamento da referida MLA. Num enquadramento preferido, o polipéptido que tem actividade de GnTIII é um polipétido de fusão que compreende o domínio catalítico de GnTIII. Num enquadramento particularmente preferido, o polipéptido de fusão compreende ainda um domínio de localização de Golgi de um polipéptido residente em Golgi.
Preferencialmente, o domínio de localização de Golgi é o domínio de localização de manosidase II ou GnTI. Alternativamente, o domínio de localização de Golgi selecciona-se no grupo que consiste em: domínio de localização de manosidase I, domínio de localização de GnTII e domínio de localização de uma fucosiltransferase do núcleo oíI-6. As MLAs produzidas pelos processos da presente invenção aumentam a afinidade de ligação ao receptor Fc e/ou aumentam a função efectora. Preferencialmente, o aumento da função efectora é um ou mais dos seguintes: aumento da citotoxicidade celular mediada por Fc (incluindo aumento da citotoxicidade celular dependente do anticorpo), aumento da fagocitose celular dependente do anticorpo (FCDA), aumento da secreção de citocina, aumento da absorção do antigénio mediada pelo complexo imunitário por meio das células que apresentam o antigénio, aumento da ligação a células AN, aumento da ligação a macrófagos, aumento na ligação a monócitos, aumento da ligação a células polimorfonucleares, aumento da sinalização directa que induz a apoptose, aumento na reticulação de anticorpos ligados ao alvo, aumento da maturação das células dendríticas ou aumento da iniciação das células T. 0 aumento da afinidade de ligação ao receptor Fc é preferencialmente aumentado pela ligação aos receptores de activação de Fc tais como FcYRIIIa. Num enquadramento 83 particularmente preferido, a LMA é um anticorpo humanizado ou um seu fragmento.
Num outro enquadramento, a presente invenção tem por objecto uma MLA quimérica tendo praticamente a mesma especificidade de ligação do anticorpo B-Lyl de murino produzido pelos processos da presente invenção que aumentam a proporção de oligossacáridos biramifiçados na região Fc do referido polipéptido. Considera-se que essa LMA engloba anticorpos e os seus fragmentos que compreendem a região Fc. Num enquadramento preferido, a LMA é um anticorpo humanizado. Num enquadramento, a percentagem de oligossacáridos biramifiçados na região Fc da MLA é pelo menos 50 %, mais preferencialmente, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 % ou pelo menos 90 % e mais preferencial pelo menos 90-95 % do total de oligossacáridos. Ainda noutro enquadramento, a MLA produzida pelos processos da presente invenção tem uma proporção de aumento dos oligossacáridos não fucosilados na região Fc como resultado da modificação dos seus oligossacáridos pelos processos da presente invenção. Num enquadramento, a percentagem de oligossacáridos não fucosilados é pelo menos 50 %, preferencialmente, pelo menos 60 % a 70 %, mais preferencialmente 75 %. Os oligossacáridos não fucosilados podem ser do tipo híbrido ou complexo. Num enquadramento particularmente preferido, a LMA produzida pelas células hospedeiras e os processos da presente invenção tem um aumento da proporção de oligossacáridos não fucosilados biramifiçados da região Fc. Os oligossacáridos não fucosilados, biramifiçados podem ser híbridos ou complexos. Especificamente, os processos da presente invenção podem ser utilizados para produzir MLAs em que pelo menos 15 %, mais preferencialmente pelo menos 20 %, mais preferencialmente pelo menos 25 %, mais 84 preferencialmente pelo menos 30 %, mais preferencialmente pelo menos 35 % dos oligossacáridos na região Fc das MLA biramifiçadas e não estão fucosiladas. Os processos da presente invenção podem também ser utilizados para produzir polipéptidos em que pelo menos 15 %, mais preferencialmente pelo menos 20 %, mais preferencialmente pelo menos 25 %, mais preferencialmente pelo menos 30 %, mais preferencialmente pelo menos 35 % dos oligossacáridos na região Fc do polipéptido são biramifiçados, hibridos e não estão fucosilados.
Num outro enquadramento, a presente invenção tem por objecto uma MLA quimérica com praticamente a mesma especificidade de ligação do anticorpo B-Lyl de murino, tratado por engenharia pata ter uma função efectora aumentada e/ou uma afinidade de ligação ao receptor Fc aumentada, produzida pelos processos da presente invenção. Preferencialmente, o aumento da função efectora é um ou mais dos seguintes: aumento da citotoxicidade celular mediada por Fc (incluindo aumento da citotoxicidade celular dependente do anticorpo), aumento da fagocitose celular dependente do anticorpo (FCDA), aumento da secreção de citocina, aumento da absorção do antigénio mediada pelo complexo imunitário por meio das células que apresentam o antigénio, aumento da ligação a células AN, aumento da ligação a macrófagos, aumento na ligação a monócitos, aumento da ligação a células polimorfonucleares, aumento da sinalização directa que induz a apoptose, aumento na reticulação de anticorpos ligados ao alvo, aumento da maturação das células dendriticas ou aumento da iniciação das células T. Num enquadramento preferido, o aumento da afinidade de ligação ao receptor Fc é um aumento da ligação a um receptor de activação Fc, mais preferencialmente FcYRIIIa. Num enquadramento, a MLA é um anticorpo, um 85 fragmento de anticorpo contendo a região Fc ou uma proteína de fusão que inclui uma região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina. Num enquadramento particularmente preferido, a LMA é um anticorpo humanizado. A presente invenção tem ainda por objecto composições farmacêuticas que compreendem as MLAs da presente invenção e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. A presente invenção tem ainda por objecto a utilização dessas composições farmacêuticas no processo de tratamento do cancro. Especificamente, a presente invenção tem por objecto um processo para o tratamento de cancro que compreende a administração de uma quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico da composição farmacêutica da presente invenção. A presente invenção tem ainda por objecto processos para a geração e a utilização de sistemas de células hospedeiras para a produção de glicoformas das MLAs da presente invenção, tendo uma maior afinidade de ligação ao receptor Fc, preferencialmente um aumento da ligação aos receptores de activação de Fc e/ou com funções efectoras aumentadas, incluindo a citotoxicidade celular dependente do anticorpo. A metodologia da glicosilação por engenharia que pode ser utilizada com as MLAs da presente invenção já foi descrita com grande detalhe na pat. U.S. No. 6.602.684 e no pedido provisório de patente U.S. No. 60/441.307 e na WO 2004/065540. As MLAs da presente invenção podem, alternativamente, ser glicosiladas por engenharia para terem poucos resíduos de fucose na região Fc de acordo com as técnicas descritas na EP 1176195 AI. 86
Geração de linhas de células para a produção de proteínas com o modelo de glicosilação alterado. A presente invenção tem por objecto sistemas de expressão de células hospedeiras para a geração de MLAs da presente invenção com modelos de glicosilação modificados. Em particular, a presente invenção providencia sistemas de células hospedeiras para a geração de glicoformas das MLAs da presente invenção com um melhor valor terapêutico. Por isso, a presente invenção providencia sistemas de expressão de células hospedeiras seleccionadas ou tratadas por engenharia para expressarem um polipéptido com actividade de GnTIII. Num enquadramento, o polipéptido que tem actividade de GnTIII é um polipéptido de fusão que compreende um domínio de localização de Golgi de um polipéptido heterólogo residente em Golgi. Especificamente, esses sistemas de expressão de células hospedeiras podem ser tratados por engenharia para compreenderem uma molécula de ácido nucleico recombinante codificando um polipéptido comportando GnTIII, ligado operacionalmente a um sistema promotor constitutivo ou regulado.
Num enquadramento específico, a presente invenção providencia uma célula hospedeira que tenha sido tratada por engenharia para expressar pelo menos um ácido nucleico que codifica um polipéptido de fusão com actividade de GnTIII e que compreende o domínio de localização de Golgi de um polipéptido heterólogo residente em Golgi. Num aspecto, a célula hospedeira é tratada por engenharia com uma molécula de ácido nucleico que compreende pelo menos um gene que codifica um polipéptido de fusão com actividade de GnTIII e que compreende o domínio de localização de Golgi de um polipéptido heterólogo residente em Golgi. 87
Geralmente, qualquer tipo de linha de células de cultura, incluindo as linhas de células discutidas antes, pode ser utilizado como o ponto de partida para tratar por engenharia as linhas de células hospedeiras da presente invenção. Num enquadramento preferido, as células de OHC, células de RHB, células de NSO, células de SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de murganho P3X63, células de PER, células de PER.C6 ou células de hibridoma, outras células de mamíferos, células de leveduras, células de insectos ou células de plantas são utilizadas como linhas de células antecedentes para gerar as células hospedeiras tratadas por engenharia da presente invenção.
Entende-se que a presente invenção engloba quaisquer células hospedeiras tratadas por engenharia que expressam um polipéptido com actividade de GnTIII, incluindo um polipéptido de fusão que compreende o domínio de localização de Golgi de um polipéptido heterólogo residente em Golgi tal como definido aqui.
Um ou vários ácidos nucleicos que codificam um polipéptido com actividade de GnTIII podem ser expressos sob o controlo de um promotor constitutivo ou, alternativamente, um sistema de expressão regulado. Esses sistemas são bem conhecidos na técnica e incluem os sistemas discutidos antes. Se vários ácidos nucleicos diferentes que codificam polipéptidos de fusão com actividade de GnTIII e compreendendo o domínio de localização de Golgi de um polipéptido heterólogo residente em Golgi estão contidos dentro do sistema de células hospedeiras, alguns deles podem ser expressos sob o controlo de um promotor constitutivo, enquanto outros são expressos sob o controlo de um promotor regulado. Os níveis de expressão dos polipéptidos de fusão que têm actividade 88 de GnTIII são determinados por processos geralmente conhecidos na técnica, incluindo análise de Western blot, análise de Northern blot, análise de expressão do gene repórter ou medição da actividade de GnTIII. Alternativamente, pode-se utilizar uma lectina que se liga aos produtos biossintéticos de GnTIII, por exemplo, lectina E4-PHA. Alternativamente, pode-se utilizar um ensaio funcional que mede o aumento da ligação ao receptor Fc ou o aumento da função efectora mediado pelos anticorpos produzidos pelas células tratadas por engenharia com o ácido nucleico que codifica um polipéptido com actividade de GnTIII.
Identificação dos transfectantes ou dos transformantes que expressam a proteina com um modelo de glicosilação modificado
As células hospedeiras que contêm a sequência de codificação de uma MLA quimérica com praticamente a mesma especificidade de ligação do anticorpo B-Lyl de murino e que expressa os produtos do gene activo sob o ponto de vista biológico podem ser identificadas por meio de pelo menos quatro abordagens gerais; (a) hibridação de ADN-ADN ou ADN-ARN; (b) a presença ou a ausência de funções do gene "marcador"; (c) avaliação do nível de transcrição medido pela expressão dos respectivos transcritos de ARNm na célula hospedeira; e (d) detecção do produto do gene medida por imuno-ensaio ou pela sua actividade biológica.
Na primeira abordagem, a presença de sequências de codificação de uma LMA quimérica com praticamente a mesma especificidade de ligação do anticorpo B-Lyl de murino e a sequência de codificação do polipéptido com actividade de GnTIII pode ser detectada por hibridação de ADN-ADN ou ADN- 89 ARN utilizando sondas que compreendem sequências de nucleótidos que são homólogas das respectivas sequências de codificação, respectivamente ou porções delas ou derivados delas.
Na segunda abordagem, o vector de expressão recombinante/sistema hospedeiro pode ser identificado e seleccionado com base na presença ou na ausência de certas funções de genes "marcadores" (por exemplo, actividade de timidina-cinase, resistência a antibióticos, resistência a metotrexato, fenótipos de transformação, formação de corpos de oclusão em baculovirus, etc.). Por exemplo, se a sequência de codificação da MLA da presente invenção ou um seu fragmento e a sequência de codificação do polipéptido com actividade de GnTIII são inseridas dentro de uma sequência de gene marcador do vector, os recombinantes contendo as respectivas sequências de codificação podem ser identificados pela ausência da função do gene marcador. Alternativamente, pode-se colocar um gene marcador em tandem com as sequências de codificação sob o controlo do mesmo promotor ou de promotores diferentes utilizados para controlar a expressão das sequências de codificação. A expressão do marcador em resposta à indução ou à selecção indica a expressão da sequência de codificação da MLA da presente invenção e a sequência de codificação do polipéptido com actividade de GnTIII.
Na terceira abordagem, a actividade transcricional para a região de codificação das MLA da presente invenção ou um seu fragmento e a sequência de codificação do polipéptido com actividade de GnTIII pode ser avaliada por ensaios de hibridação. Por exemplo, pode-se isolar o ARN e analisar por "Northern blot" utilizando uma sonda homóloga das sequências de codificação da MLA da presente invenção 90 ou um seu fragmento e a sequência de codificação do polipéptido com actividade de GnTIII ou as suas porções particulares. Alternativamente, o total de ácidos nucleicos da célula hospedeira pode ser extraido e avaliado por hibridação dessas sondas.
Na quarta abordagem, a expressão dos produtos de proteína pode ser avaliada imunologicamente, por exemplo por "Western blots", imuno-ensaios tal como radioimuno-precipitação ou imuno-ensaios ligados a enzimas. 0 último ensaio para avaliar o sucesso do sistema de expressão, contudo, envolve a detecção dos produtos de genes activos sob o ponto de vista biológico.
Geração e utilização de MLAs com uma função efectora aumentada incluindo citotxicidade celular dependente do anticorpo
Em enquadramentos preferidos, a presente invenção providencia glicoformas de MLAs quiméricas praticamente com a mesma especificidade de ligação do anticorpo B-Lyl de murino e uma função efectora aumentada incluindo citotxicidade celular dependente do anticorpo. A engenharia de glicosilação de anticorpos já foi descrita previamente. (Ver, por exemplo, a patente U.S. No. 6.602.684.
Os ensaios clínicos de anticorpos monoclonais (Acsm) não conjugados para o tratamento de vários tipos de cancro deram recentemente resultados encorajantes. Dillman, Câncer Biother. & Radiopharm. 12: 223-25 (1997); Deo et al., Immunology Today 18: 127 (1997). Já foi aprovada uma IgGl quimérica não conjugada para linfomas não de Hodgkin de grau baixo ou folicular. Dillman, Câncer Biother. & Radiopharm. 12: 223-25 (1997), enquanto outro Acm não 91 conjugado, uma IgGl humanizada para atingir tumores sólidos da mama, também tem estado a mostrar resultados promissores em ensaios clinicos da fase III. Deo et al., Immunology Today 18: 127 (1997) . Os antigénios destes dois Acsm são altamente expressos nas respectivas células de tumor e os anticorpos medeiam uma potente destruição do tumor por células efectoras in vitro e in vivo. Pelo contrário, muitos outros Acsm não conjugados, com especificidade fina para o tumor, não podem desencadear funções efectoras de potência suficiente para serem clinicamente úteis. Frost et al. , Câncer 80: 317-33 (1997); Surfus et al. , J. Immunother. 19: 184-91 (1996). Para alguns destes Acsm fracos, está normalmente a ser ensaiada uma terapia concorrente com citocinas adjuvantes. A adição de citocinas pode estimular a citotoxicidade celular dependente do anticorpo (CCDA) aumentando a actividade o número de linfócitos em circulação. Frost et al., Câncer 80: 317-33 (1997); Surfus et al., J. Immunother. 19: 184-91 (1996). A CCDA, um ataque litico nas células-alvo do anticorpo, é desencadeada após a ligação dos receptores de leucócitos à região constante (Fc) dos anticorpos. Deo et al., Immunology Today 18: 127 (1997).
Uma abordagem diferente, mas complementar, para aumentar a actividade de CCDA das IgGls não conjugadas consiste em tratar por engenharia a região Fc do anticorpo. Estudos sobre a engenharia das proteínas têm mostrado que FcyRs interage com a região charneira inferior do domínio CH2 de IgG. Lund et al., J. Immunol. 157: 4963-69 (1996). Contudo, a ligação de FcyR também requer a presença de oligossacáridos ligados covalentemente em Asn 297 conservado na região CH2. Lund et al., J. Immunol. 157: 4963-69 (1996); Wright e Morrison, Trends Biotech. 15: 26-31 (1997), sugerindo que quer os oligossacáridos quer os 92 polipéptidos contribuem ambos directamente para o sitio de interacção ou o que é necessário para manter uma conformação do polipéptido da CH2 activa. A modificação da estrutura do oligossacárido pode por isso ser explorada como meio de aumentar a afinidade da interacção.
Uma molécula de IgG comporta dois oligossacáridos ligados a N na sua região Fc, um em cada cadeia pesada. Tal como qualquer glicoproteina, um anticorpo é produzido como uma população de glicoformas que partilham a mesma estrutura de polipéptido mas têm diferentes oligossacáridos ligados aos sitios de glicosilação. Os oligossacáridos que se encontram normalmente na região Fc da IgG do soro são do tipo de complexo bi-antenário (Wormald et al., Biochemistry 36: 130-38 (1997), com um baixo nivel de ácido siálico terminal e bifurcando a N-acetilglicosamina (GlcNAc) e um grau variável de galactosilação terminal e de fucosilação nuclear. Alguns estudos sugerem que a estrutura minima de hidratos de carbono requerida para a ligação a FcyR está dentro do núcleo do oligossacárido. Lund et al., J. Immunol. 157: 4963-69 (1996)
As linhas de células derivadas de murganhos ou de hamsteres utilizadas na indústria e na academia para a produção de Acsm terapêuticos não conjugados normalmente ligam os determinantes de oligossacáridos necessários aos sitios Fc. As IgGs expressas nestas linhas de células contudo, não têm a divisão de GlcNAc encontrada em pequenas quantidades das IgGs do soro. Lifely et al., Glycobiology 318: 813-22 (1995). Ao contrário, observou-se recentemente que uma IgGl humanizada (CAMPATH-1H), produzida a partir de mieloma, comportava GlcNAc dividida em algumas das suas glicoformas. Lifely et al., Glycobiology 318: 813-22 (1995) . O anticorpo derivado de células de rato atingiu uma 93 actividade máxima de CCDA in vitro como os anticorpos CAMPATH-1H produzidos em linhas de células padrão, mas s concentrações de anticorpo significativamente mais baixas. 0 antigénio CAMPATH está normalmente presente em niveis elevados em células de linfoma e este Acm quimérico tem actividade de CCDA elevada na ausência de um GlcNAc bifurcado. Lifely et al., Glycobiology 318: 813-22 (1995). No percurso da glicosilação ligado a N, adiciona-se GlcNAc bifurcada por meio de GnTIII. Schachter, Biochem. Cell Biol. 64: 163-81 (1986).
Estudos anteriores utilizaram uma linha de células de OHC produzindo um único anticorpo que foi previamente tratado por engenharia para expressar, de uma maneira regulada externamente, diferentes niveis de uma enzima clonada de gene GnT III (Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17: 176-180 (1999)). Esta abordagem estabelece, pela primeira vez, uma correlação rigorosa entre a expressão de GnTIII e a actividade de CCDA do anticorpo modificado. Assim, a presente invenção contempla um anticorpo recombinante, quimérico ou um seu fragmento com a especificidade de ligação do anticorpo B-Lyl de murino, com a glicosilação alterada resultante do aumento da actividade de GnTIII. O aumento da actividade de GnTIII resulta num aumento da percentagem dos oligossacáridos bifurcados, assim como numa diminuição na percentagem dos resíduos de fucose, na região Fc da MLA. Este anticorpo ou um seu fragmento têm uma afinidade de ligação ao receptor Fc aumentada e uma função efectora aumentada. Além disso, a presente invenção tem por objecto um fragmento de anticorpo e proteínas de fusão que compreendem uma região que é equivalente à região Fc das imunoglobulinas. 94
Aplicações terapêuticas das MLAs produzidas de acordo com os processos da presente invenção.
As MLAS da presente invenção podem ser utilizadas isoladamente para atingir e matar as células de tumor in vivo. As MLAs também podem ser utilizadas em conjunto com um agente terapêutico apropriado para tratar o carcinoma humano. Por exemplo, as MLAs podem ser utilizadas em combinação com processos de tratamento normalizados ou convencionais tais como quimioterapia, terapia de radiação ou podem ser conjugadas ou ligadas a um fármaco terapêutico ou a uma toxina, assim como a uma linfocina ou a um factor inibidor do crescimento do tumor, para a libertação do agente terapêutico no sitio do carcinoma. Os conjugados das MLAs da presente invenção que são da maior importância são (1) imunotoxinas (conjugadas com a MLA e uma parte citotóxica) e (2) MLAs marcadas (por exemplo marcadas com rádio, marcadas com enzimas ou marcadas com fluorocromos) em que o marcador providencia um meio para identificar complexos imunitários que incluem a MLA marcada. As MLAs podem também ser utilizadas para induzir a lise através do processo natural do complemento e para interagir com as células citotóxicas dependente do anticorpo normalmente presentes. A parte citotóxica da imuno-toxina pode ser um fármaco citotóxico ou uma toxina activa sob o ponto de vista enzimático de origem bacteriana ou com origem numa planta ou um fragmento activo sob o ponto de vista enzimático ("cadeia A") dessa toxina. As toxinas activas sob o ponto de vista enzimático e os seus fragmentos utilizados são a cadeia A da difteria, fragmentos activos não ligados da toxina difteria, a cadeia A da exotoxina (da Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de ricina, cadeia A de abrina, cadeia 95 A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina e enomicina. Noutro enquadramento, as MLAs estão conjugadas com fármacos anti-cancro de moléculas pequenas. Os conjugados de MLA e essas partes citotóxicas são preparados utilizando uma variedade de agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais. Exemplos desses reagentes são SPDP, IT, derivados bifuncionais de imidoésteres tal como cloridrato de adipimidato de dimetilo, ésteres activos tais como suberato de disuccinimidilo, aldeídos tais como glutaraldeído, compostos de bis-azido tais como bis(p-azidobenzoil)-hexanodiamina, derivados de bis-diazónio tal como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina, di-isocianatos tais como 2,β-di-isocianato de tolileno e compostos de flúor bis-activos tal como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno. A porção de lise de uma toxina pode juntar-se ao fragmento Fab das MLAs. São conhecidas na técnica outras toxinas adicionais, como é evidente, por exemplo, da publicação do pedido de patente U.S. No. 2002/0128448.
Noutro enquadramento, uma MLA quimérica glicosilada por engenharia com praticamente a mesma especificidade de ligação do anticorpo B-Lyl de murino, está conjugada com a cadeia A de ricina. Mais vantajoso, a cadeia A de ricina está desglicosilada e é produzida através de meios recombinantes. Um processo vantajoso para produzir a imunotoxina de ricina está descrito em Vitetta et al., Science 238, 1098 (1987).
Quando utilizado para matar células de cancro humano in vitro para fins de diagnóstico, os conjugados serão 96 normalmente adicionados ao meio de cultura de células numa concentração de pelo menos cerca de 10 nM. A formulação e o modo de administração para a utilização in vitro não são críticos. Serão utilizadas normalmente formulações aquosas que são compatíveis com o meio de cultura ou de perfusão. A citotoxicidade pode ser lida por técnicas convencionais para determinar a presença ou o qrau do cancro.
Como se discutiu antes, um produto radio-farmacêutico citotóxico para o tratamento de cancro pode ser preparado por conjugação de um isótopo radioactivo (por exemplo, I, Y, Pr) com uma MLA quimérica, glicosilada por engenharia tendo praticamente a mesma especificidade de ligação do anticorpo B-Lyl de murino. A expressão "parte citotóxica", tal como se utiliza aqui, entende-se que inclui esses isótopos.
Noutro enquadramento, carregam-se os liposomas com um fármaco citotóxico e revestem-se os liposomas com as MLAs da presente invenção. Pelo facto de haver muitas moléculas CD20 na superfície das células B malignas, este processo permite a libertação de grandes quantidades de fármacos para corrigir o tipo de célula.
As técnicas para a conjugação desses agentes terapêuticos com anticorpos são bem conhecidas (ver, por exemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Câncer Therapy", em Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", em Controller Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Mareei Dekker, Inc. 1987); Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Câncer Therapy: A Review", em Monoclonal 97
Antibodies 84: Biological And Clinicai Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); e Thorpe et al.,"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982)).
Ainda outras aplicações terapêuticas para as MLAs da presente invenção incluem a conjugação ou a ligação, por exemplo, por técnicas de ADN recombinante com uma enzima capaz de converter um pro-fármaco num fármaco citotóxico e a utilização desses conjugados de anticorpo - enzima em combinação com o pró-fármaco para converter o pró-fármaco num agente citotóxico no sitio do tumor (ver, por exemplo, Senter et al.,"Anti-Tumor Effects of Antibody-alkaline Phosphatase", Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 4842-46 (1988); "Enhancement of the in vitro and in vivo Antitumor Activites of Phosphorylated Mitocycin C and Etoposide Derivatives by Monoclonal Antibody-Alkaline Phosphatase Conjugates", Câncer Research 49: 5789-5792 (1989); e Senter,"Activation of Prodrugs by Antibody-Enzyme Conjugates: A New Approach to Câncer Therapy," FASEB J. 4: 188-193 (1990)).
Ainda outra utilização terapêutica para as MLAs da presente invenção envolve a utilização, quer não conjugado, na presença do complemento ou como parte de um conjugado de anticorpo-fármaco ou anticorpo-toxina, para eliminar as células de tumor a partir da medula óssea de pacientes com cancro. De acordo com esta abordagem, a medula óssea autóloga pode ser purgada ex vivo por meio do tratamento com o anticorpo e a medula infusa novamente no paciente [ver, por exemplo, Ramsay et al.,"Bone Marrow Purging Using Monoclonal Antibodies", J. Clin. Inmmunol., 8 (2): 81-88 (1988)] . 98
Além disso, considera-se que a presente invenção compreende uma imuno-toxina de cadeia simples que compreende os domínios de liqação do antiqénio que permitem praticamente a mesma especificidade de liqação do anticorpo B-Lyl de murino (por exemplo, polipéptidos que compreendem RDCs do anticorpo B-Lyl de murino) e compreende ainda um polipéptido de toxina. As imunotoxinas de cadeia simples da presente invenção podem ser utilizadas para tratar carcinoma humano in vivo.
Do mesmo modo, pode-se utilizar uma proteína de fusão que compreende pelo menos a região de ligação do antigénio de uma MLA da presente invenção combinada com pelo menos uma porção funcionalmente activa de uma segunda proteína com actividade anti-tumor, por exemplo, uma linfocina ou oncostatina, para tratar carcinoma humano in vivo. A presente invenção pode ser utilizada para matar selectivamente as células de tumor que expressam CD20. Este processo compreende a reacção do imuno-conjugado (por exemplo, a imunotoxina) da presente invenção com as referidas células de tumor. Estas células de tumor podem ser de um carcinoma humano.
Adicionalmente, a presente invenção pode ser utilizada para tratar de carcinomas (por exemplo, carcinomas humanos) in vivo. Este processo compreende a administração, a um indivíduo, de uma quantidade efectiva sob o ponto de vista farmacêutico de uma composição contendo pelo menos um dos imuno-conjugados (por exemplo, a imunotoxina) da presente invenção.
Num outro aspecto, a presente invenção pode ser utilizada num processo melhorado para tratar distúrbios 99 proliferativos das células B incluindo linfoma das células B, assim como uma doença auto-imune produzida totalmente ou em parte por anticorpos patogénicos, com base na depleção das células B, compreendendo a administração de uma quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico de uma MLA da presente invenção a um ser humano que dela necessite. A MLA é um anticorpo anti-CD20 com uma glicosilação por engenharia com uma especificidade de ligação praticamente igual à do anticorpo B-Lyl de murino. Exemplos de doenças ou distúrbios autoimunes incluem, mas não se limitam a trombocitopénias mediadas pela imunidade, tal como púrpura trombocitopénica idiopática aguda e púrpura trombocitopénica idiopática crónica, dermato-miosite, coreia de Sydenham, nefrite do lúpus, febre reumática, sindromes poliglandulares, púrpura de Henoch-Schonlein, nefrite post-estreptocóccica, eritema nodoso, arterite de Takayasu, doença de Addison, eritema multiforme, poliarterite nodosa, espondilite anquilosante, sindrome de Goodpasture, tromboangite ubiterans, cirrose biliar primária, tiroidite de Hashimoto, tirotoxicose, hepatite activa crónica, polimiosite/dermatomiosite, policondrite, pamphigus vulgaris, granulomatose de Wegener, nefropatia membranosa, esclerose lateral amiotrófica, tabes dorsal, polimialgia, anemia perniciosa, glomerulonefrite rapidamente progressiva e alveolite fibrosante, respostas inflamatórias tal como doenças inflamatórias da pele incluindo psoriase e dermatite (por exemplo dermatite atópica); esclerodermia sistémica e esclerose; respostas associadas a doenças inflamatórias do intestino (tal como doença de Crohn e colite ulcerosa); sindrome da insuficiência respiratória (incluindo sindrome de insuficiência respiratória do adulto; SIRA); dermatite; meningite; encefalite; uveíte; colite; glomerulonefrite; estados clinicos alérgicos tal como eczema e asma e outros 100 estados clínicos envolvendo infiltração das células T e respostas inflamatórias crónicas; aterosclerose; deficiência de adesão leucocitária; artrite reumatóide; lúpus eritematoso sistémico (LES); diabetes mellitus (por exemplo diabetes mellitus do tipo I ou diabetes mellitus dependente de insulina); esclerose múltipla; síndrome de Reynaud; tiroidite autoimune; encefalomielite alérgica; síndrome de Sorgen; diabetes juvenil; e respostas imunitárias associadas com hipersensibilidade aguda e retardada e mediada por citocinas e linfócitos T normalmente encontrados na tuberculose, sarcoidose, polimiosite, granulomatose e vasculite; anemia perniciosa (doença de Addison); doenças envolvendo diapedese leucocitária; distúrbios inflamatórios do sistema nervoso central (SNC); síndrome de traumatismos em vários órgãos; anemia hemolítica (incluindo mas não se limitando a crioglobinémia ou anemia positiva de Coombs); miastenia gravis; doenças mediadas pelo complexo de antigénio-anticorpo; doenças da membrana basal anti-glomerular; síndrome antifosfolípidos; neurite alérgica; doença de Graves; síndrome miasténico de Lambert-Eaton; penfigóide bolhoso; pênfigo; autoimmune poliendocrinopatias auto-imunes; doença de Reiter; rigidez muscular espasmódica; doença de Behcet; arterite das células gigantes; nefrite do complexo imunitário; nefropatia de IgA; polineuropatias de IgM; púrpura trombocitopénica imunitária (PTI) ou trombocitopénia autoimunitária, etc. Neste aspecto da presente invenção, as LMAs da presente invenção são utilizadas para depletar o sangue de células B normais por um período mais prolongado.
De acordo com a prática da presente invenção, o indivíduo pode ser um ser humano, indivíduos equinos, suínos, bovinos, murinos, caninos, felinos e aves. Também 101 estão incluídos na presente invenção outros animais de sangue quente. A presente invenção pode ser utilizada em processos para a inibição do crescimento de células de tumor humano, tratando o tumor num indivíduo e tratando um tipo de doença proliferativa num indivíduo. Estes processos compreendem a administração ao indivíduo de uma quantidade efectiva da composição da presente invenção.
Por isso é evidente que a presente invenção engloba composições farmacêuticas, combinações e processos para o tratamento de carcinomas humanos, tal como linfomas de células B. Por exemplo, a presente invenção inclui composições farmacêuticas para serem utilizadas no tratamento de carcinomas humanos que compreendem uma quantidade efectiva sob o ponto de vista farmacêutico de um anticorpo da presente invenção e um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
As composições de MLA da presente invenção podem ser administradas utilizando modos de administração convencionais incluindo, mas não se limitando a administração intravenosa, intraperitoneal, oral, intralinfática ou directamente no tumor. Prefere-se a administração intravenosa.
Num dos aspectos da presente invenção, as formulações terapêuticas que contêm MLAs da presente invenção são preparadas para serem armazenadas misturando eventualmente um anticorpo que tenha o grau de pureza desejado com veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), sob a forma de 102 formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis não são tóxicos para os receptores nas doses e concentrações utilizadas e incluem tampões tais como tampões de fosfato, de citrato e de outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzilo e amónio; cloreto de hexametónio; cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil-parabenos tais como metil- ou propil-parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipéptidos de baixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacáridos, dissacáridos e outros hidratos de carbono incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, tre-halose ou sorbitol; contra-iões formando sais tal como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou tensioactivos não iónicos tal como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietileno-glicol (PEG).
Exemplos de formulações de MLA anti-CD20 estão descritos na W098/56418. Esta publicação descreve uma formulação líquida em doses múltiplas compreendendo 40 mg/mL de rituximab, acetato 25 mM, tre-halose 150 mM, álcool benzílico a 0,9 %, polisorbato 20 a 0,02 % a pH 5,0 que tem um período mínimo de vida de dois anos armazenado a 2-8 °C. Uma outra formulação de interesse anti-CD20 compreende 10 mg/mL de rituximab em 9,0 mg/mL de cloreto de sódio, 7,35 mg/mL de di-hidrato de citrato de sódio, 0,7 mg/mL de polisorbato 80 e água esterilizada para injecção, 103 a ρΗ 6,5. Na presente invenção, o RITUXAN® será substituído por uma MLA da presente invenção.
As formulações liofilizadas adaptadas para administração subcutânea estão descritas na W097/04801. Essas formulações liofilizadas podem ser reconstituídas com um diluente apropriado até terem uma concentração elevada de proteína e a formulação reconstituída pode ser administrada subcutaneamente ao mamífero a ser tratado.
Essa formulação pode também conter mais de que um composto activo conforme necessário para a indicação particular a ser tratada, preferencialmente os que têm actividades complementares que não afectem adversamente nenhum deles. Por exemplo, pode ser desejável providenciar ainda um agente citotóxico, um agente quimioterapêutico, uma citocina ou um agente imunossupressor (por exemplo um que actue nas células T, tal como ciclosporina ou um anticorpo que se liga às células T, por exemplo, um que se ligue a LFA-1). A quantidade efectiva desses outros agentes depende da quantidade de antagonista presente na formulação, o tipo de doença ou distúrbio ou o tratamento e outros factores discutidos antes. São geralmente utilizados nas mesmas dosagens e com vias de administração tal como as utilizadas aqui antes ou cerca de 1 a 99 % das dosagens utilizadas até aqui.
Os ingredientes activos podem também estar incluídos em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou de gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas coloidais de libertação de fármacos (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, 104 microemulsões, nano-partícuias e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Essas técnicas estão descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).
Podem preparar-se preparações de libertação sustentada. Exemplos apropriados de preparações de libertação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o antagonista, matrizes essas que estão sob a forma de artigos moldados, por exemplo, películas ou microcápsulas. Exemplos de matrizes libertação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) ou poli (álcool vinílico)), polilactídeos (pat. U.S. No. 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e Yetil-L-glutamato, acetato de etileno-vinilo não degradável, copolímeros degradáveis de ácido láctico-ácido glicólico tais como LUPRON DEPOT™ (microesferas injectáveis compostos por copolímeros de ácido láctico - ácido glicólico e acetato de leuprolide) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
As formulações a ser utilizadas para administração in vivo devem ser esterilizadas. Consegue-se isto facilmente por filtração através de membranas de filtração esterilizadas.
As composições da presente invenção podem ser numa variedade de formas de dosagem que incluem, mas não se limitam a soluções ou suspensões líquidas, comprimidos, pílulas, pós, supositórios, microcápsulas ou microvesícuias poliméricas, lipossomas e soluções injectáveis ou infusíveis. A forma preferida depende do modo de administração e da aplicação terapêutica. 105
As composições da presente invenção incluem também preferencialmente veiculos e adjuvantes conhecidos na técnica e convencionais, aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico tal como albumina do soro, permutadores de iões, alumina, lecitina, substâncias tampão tais como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potássio e sais ou electrólitos tais como sulfato de protamina. 0 modo de administração mais eficaz e o regime de dosagem para as composições farmacêuticas da presente invenção dependem da severidade e do decurso da doença, da saúde do paciente e da resposta ao tratamento e da decisão do médico assistente. De acordo com isto, as doses das composições devem ser determinadas individualmente, de acordo com o paciente. Apesar disso, uma dose eficaz das composições da presente invenção estarão geralmente no intervalo desde cerca de 0,01 a cerca de 2000 mg/kg.
As moléculas descritas aqui podem estar numa variedade de formas de dosagem que incluem, mas não se limitam a soluções ou suspensões liquidas, comprimidos, pílulas, pós, supositórios, microcápsulas ou microvesículas poliméricas, lipossomas e soluções injectáveis ou infusíveis. A forma preferida depende do modo de administração e da aplicação terapêutica. A composição compreendendo uma MLA da presente invenção será formulada, doseada e administrada de uma forma consistente com as boas práticas médicas. Os factores a ter em consideração neste contexto incluem a doença ou o distúrbio particular a ser tratado, o mamífero particular a ser tratado, o estado clínico individual do paciente, a causa da doença ou do distúrbio, o sítio de libertação do agente, o processo de administração, o horário de 106 administração e outros factores conhecidos pelos clinicos. A quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico do antagonista a ser administrada deverá ser guiada por essas considerações.
Como proposta genérica, a quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico do anticorpo administrado parentericamente, por dose, estará no intervalo de cerca de 0,1 a 20 mg/kg de peso do corpo do paciente por dia, sendo que o intervalo inicial tipico de antagonista utilizado deve estar no intervalo de cerca de 2 a 10 mg/kg.
Num enquadramento preferido, a MLA é um anticorpo, preferencialmente um anticorpo humanizado. As doses apropriadas para esse anticorpo não conjugado estão, por exemplo, no intervalo de cerca de 20 mg/m2 a cerca de 1000 mg/m2. Num enquadramento, a dose de anticorpo difere da presentemente recomendada para o RITUXANO®. Por exemplo, pode-se administrar ao paciente uma ou mais doses de praticamente menos do que 375 mg/m2 do anticorpo, por exemplo, em que a dose está no intervalo de cerca de 20 mg/m2 a cerca de 250 mg/m2, por exemplo de cerca de 50 mg/m2 a cerca de 200 mg/m2.
Além disso, pode-se administrar um ou mais doses iniciais do anticorpo seguidas de uma ou mais doses subsequentes, em que a dose em mg/m2 do anticorpo nas doses subsequentes excede a dose em mg/m2 do anticorpo nas doses iniciais. Por exemplo, a dose inicial pode estar no intervalo de cerca de 20 mg/m2 até cerca de 250 mg/m2 (por exemplo, desde cerca de 50 mg/m2 até cerca de 200mg/m2) e a dose subsequente pode estar no intervalo de cerca de 250 mg/m2 até cerca de 1000 mg/m2. 107
Tal como se fez notar antes, contudo, estas quantidades de MLA sugeridas estão submetidas a uma grande dose de discrição terapêutica. 0 factor chave na selecção de uma dose apropriada e do esquema é o resultado obtido, conforme indicado antes. Por exemplo, podem ser necessárias doses mais elevadas inicialmente para o tratamento de doenças agudas e do seu progresso. Para se obter os resultados mais eficazes, consoante a doença ou 0 distúrbio, o antagonista é administrado logo ao primeiro sinal, diagnóstico, aparecimento ou ocorrência da doença ou do distúrbio quanto possivel ou durante remissões da doença ou do distúrbio. A MLA da presente invenção é administrada por qualquer meio apropriado, incluindo as vias parentérica, subcutânea, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal e, se desejado, para o tratamento imunossupressor local, administração intralesional. As infusões parentéricas incluem a administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. Além disso, o antagonista pode ser administrado apropriadamente por infusão por impulsos, por exemplo com doses cada vez mais pequenas do antagonista. Preferencialmente, a dose é dada por injecções, mais preferencialmente por injecções intravenosas ou subcutâneas, dependendo, em parte do facto de a administração ser breve ou crónica.
Pode-se administrar outros compostos, tal como agentes citotóxicos, agentes quimioterapêuticos, agentes imunossupressores e/ou citocinas com os antagonistas presentes. A administração combinada inclui a co-administração, utilizando formulações separadas ou uma formulação farmacêutica única e a administração consecutiva em qualquer ordem, em que há preferencialmente um período 108 de tempo em que ambos (ou todos) os agentes activos exerçam simultaneamente as suas actividades biológicas.
Será claro que a dose da composição da presente invenção necessária para se conseguirem curas pode ainda ser reduzida com uma optimização da posologia.
De acordo com a prática da presente invenção, o veiculo farmacêutico pode ser um veiculo sob a forma de um lipido. 0 veiculo sob a forma de um lipido pode ser um fosfolipido. Além disso, o veiculo lipido pode ser um ácido gordo. 0 veiculo sob a forma de um lipido pode também ser um detergente. Tal como se utiliza aqui, um detergente é qualquer substância que altera a tensão superficial de um liquido, geralmente baixando-a.
Num exemplo da presente invenção, o detergente pode ser um detergente não iónico. Exemplos de detergentes não iónicos incluem, mas não se limitam a polisorbato 80 (também conhecido como Tween 80 ou (mono-oleato de polioxietileno-sorbitano), Brij e Triton (por exemplo Triton WR-1339 e Triton A-20).
Alternativamente, o detergente pode ser um detergente iónico. Um exemplo de um detergente iónico inclui, mas não se limita a brometo de alquiltrimetilamónio.
Adicionalmente, de acordo com a presente invenção, o veiculo de lipido pode ser um lipossoma. Tal como se utiliza no presente pedido de patente, um "lipossoma" é qualquer vesicula ligada à membrana que contém qualquer molécula da presente invenção ou as suas combinações. 109
Nos enquadramentos que se sequem, mencionam-se aspectos específicos que são importantes.
Item 1: Um polinucelótido isolado que compreende a. uma sequência seleccionada nogrupo que consiste em: SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 6 e SEQ ID NO: 7; e b. uma sequência seleccionada no grupo que consiste em SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 23; e c. sequência ID NO: 24.
Item 2: Um polinucleótido isolado que compreende a SEQ ID NO.:8, SEQ ID NO.: 9 e SEQ ID NO: ID.
Item 3: Um polinucleótido isolado de acordo com o item 1 ou o item 2, que codifica um polipéptido de fusão.
Item 4: Um polinucleótido isolado que compreende a SEQ ID NO.:3.
Item 5: Um polinucleótido isolado que compreende a SEQ ID NO.:4.
Item 6: Um polinucleótido isolado de acordo com o item 4 ou o item 5, em que o referido polinucleótido isolado codifica um polipéptido de fusão.
Item 7: Um polinucleótido isolado que compreende uma sequência com pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO: 3, em que o referido polinucleótido isolado codifica um polipéptido de fusão.
Item 8: Um polinucleótido isolado que compreende uma sequência com pelo menos 80 % de identidade com a SEQ 110 ID NO: 4, em que o referido polinucleótido isolado codifica um polipéptido de fusão.
Item 9: Um polinucelótido isolado que compreende a. uma sequência que codifica um polipéptido com a sequência da SEQ ID NO.: dl; e b. uma sequência que codifica um polipéptido com a sequência de uma região Fc do anticorpo ou de um seu fragmento, a partir de uma espécie diferente de murganho.
Item 10: Um polinucelótido isolado que compreende a. uma sequência que codifica um polipéptido com a sequência da SEQ ID NO.: 2; e b. uma sequência que codifica um polipéptido com a sequência de uma região Fc do anticorpo ou de um seu fragmento, a partir de uma espécie diferente de murganho.
Item 11: Um polinucelótido isolado que codifica um polipéptido com a sequência da SEQ ID NO.: 1.
Item 12: Um polinucelótido isolado que codifica um polipéptido com a sequência da SEQ ID NO.: 2.
Item 13: Um polinucleótido isolado que compreende a SEQ ID NO.: 11.
Item 14: Um polinucleótido isolado que compreende a SEQ ID NO.: 12. 111 uma
Item 15: Um polinucleótido isolado que compreende sequência com pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO.: 11 ou a SEQ ID NO.: 12.
Item 16: Um polinucleótido isolado que compreende uma sequência com pelo menos 85 % de identidade com a SEQ ID NO.: 11 ou com a SEQ ID NO.: 12.
Item 17: Um polinucleótido isolado que compreende uma sequência com pelo menos 90 % de identidade com a SEQ ID NO.: 11 ou com a SEQ ID NO.: 12.
Item 18: Um polinucleótido isolado que compreende uma sequência com pelo menos 95 % de identidade com a SEQ ID NO.: 11 ou a SEQ ID NO.: 12.
Item 19: Um polinucleótido isolado que compreende uma sequência com pelo menos 99 % de identidade com a SEQ ID NO.: 11 ou a SEQ ID NO.: 12.
Item 20: Um polinucleótido isolado que compreende uma sequência que codifica um polipéptido com a SEQ ID NO: 13 (cadeia pesada aa).
Item 21: Um polinucleótido isolado que compreende uma sequência que codifica um polipéptido com a SEQ ID NO: 14 (cadeia leve aa) .
Item 22: Um polinucelótido isolado que compreende a. uma sequência que codifica um polipéptido com a região VP do anticorpo B-Lyl de murino ou as suas variantes; e 112 b. uma sequência que codifica um polipéptido com a sequência de uma região Fc do anticorpo ou de um seu fragmento, a partir de uma espécie diferente de murganho.
Item 23: Um polinucelótido isolado que compreende a. uma sequência que codifica um polipéptido com a região VL do anticorpo B-Lyl de murino ou as suas variantes; e b. uma sequência que codifica um polipéptido com a sequência de uma região Fc do anticorpo ou de um seu fragmento, a partir de uma espécie diferente de murganho.
Item 24: Um vector de expressão que compreende um polinucleótido isolado de acordo com um qualquer dos itens 1-23.
Item 25: 0 vector do item 24, em que o referido vector é policistrónico.
Item 26: Uma célula hospedeira que compreende o vector de expressão do item 24.
Item 27: Uma célula hospedeira que compreende um polinucleótido isolado de acordo com um qualquer dos itens 1-23.
Item 28: Um polipéptido que compreende uma sequência derivada do anticorpo B-Lyl de murino e uma sequência derivada de um polipéptido heterólogo. 113
Item 29:
Uma molécula de ligação ao antigénio compreendendo o polipéptido do item 28.
Item 30: Uma molécula de ligação ao antigénio de acordo com o item 29, gue se liga a CD20 humana.
Item 31: Uma molécula de ligação ao antigénio de acordo com o item 29, que se liga a um anticorpo.
Item 32: Uma molécula de ligação ao antigénio de acordo com o item 31, que se liga a um anticorpo quimérico.
Item 33: Uma molécula de ligação ao antigénio de acordo com o item 31, que se liga a um anticorpo humanizado.
Item 34: Uma molécula de ligação ao antigénio de acordo com o item 31, que se liga a um anticorpo primatizado.
Item 35: Um polipéptido quimérico que compreende a sequência da SEQ ID NO: 1 ou uma sua variante.
Item 36: Um polipéptido quimérico que compreende a sequência da SEQ ID NO: 2 ou uma sua variante.
Item 37: Um polipéptido quimérico que compreende: d. um polipéptido com uma sequência seleccionada no grupo que consiste em: SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 e SEQ ID NO: 17; e e. um polipéptido com uma sequência seleccionada no grupo que consiste em: SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26 e SEQ ID NO: 27; e f . SEQ ID NO:2 8. 114
Item 38: Um polipéptido quimérico, de acordo com o item 37, compreendendo ainda uma estrutura da região variável de cadeia pesada, em que a referida estrutura compreende um residuo de alanina na posição 71, de acordo com a numeração de Kabat.
Item 39: Um polipéptido quimérico, de acordo com o item 37, compreendendo ainda uma estrutura da região variável de cadeia pesada, em que a referida estrutura compreende um residuo de arginina na posição 94, de acordo com a numeração de Kabat.
Item 40: Um polipéptido quimérico compreendendo as SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 20.
Item 41: Um polipéptido isolado que compreende a SEQ ID NO: 13 ou uma sua variante.
Item 42: Um polipéptido isolado que compreende a SEQ ID NO: 14 ou uma sua variante.
Item 43: O polipéptido isolado de acordo com um qualquer dos itens 35-40, em que o referido polipéptido é um polipéptido de fusão.
Item 44: Uma molécula de ligação ao antigénio compreendendo o polipéptido do item 43.
Item 45: A molécula de ligação ao antigénio do item 44, em que a referida molécula de ligação ao antigénio é um anticorpo.
Item 46: O anticorpo do item 45, em que o referido anticorpo é um anticorpo primatizado. 115
Item 47: 0 anticorpo do item 45, em que o referido anticorpo é um anticorpo humanizado.
Item 48: A molécula de ligação ao antigénio do item 44, em que a referida molécula de ligação ao antigénio é um fragmento de anticorpo.
Item 49: 0 fragmento de anticorpo do item 48, em que o referido fragmento de anticorpo é primatizado.
Item 50: A molécula de ligação ao antigénio do item 48, em que o referido fragmento de anticorpo é humanizado.
Item 51: Uma molécula de ligação ao antigénio, que é capaz de concorrer com o anticorpo B-Lyl de murino para a ligação a CD20, em que a referida molécula de ligação ao antigénio é quimérica.
Item 52: A molécula de ligação ao antigénio do item 51, em que a referida molécula de ligação do antigénio é um anticorpo.
Item 53: A molécula de ligação ao antigénio do item 52, em que o referido anticorpo é primatizado.
Item 54: A molécula de ligação ao antigénio do item 51, em que o referido anticorpo recombinante é humanizado.
Item 55: A molécula de ligação ao antigénio do item 51, em que o referido anticorpo recombinante compreende uma região Fc humana. 116
Item 56: A molécula de ligação ao antigénio do item 55, em que a referida região humana Fc é uma região Fc de IgG humana.
Item 57: Uma molécula de ligação ao antigénio dos itens 29-34 ou 44-56, em que a referida molécula de ligação ao antigénio tem uma região Fc com oligossacáridos modificados.
Item 58: Uma molécula de ligação ao antigénio de acordo com o item 57, em que a referida região Fc tenha sido modificada para ter resíduos de fucose reduzidos quando comparada com a molécula de ligação ao antigénio não modificada.
Item 59: Uma molécula de ligação ao antigénio de acordo com o item 57 em que a referida região Fc tem uma proporção aumentada de oligossacáridos bifurcados.
Item 60: Uma molécula de ligação ao antigénio de acordo com o item 59, em que os referidos oligossacáridos modificados são complexos bifurcados.
Item 61: Uma molécula de ligação ao antigénio de acordo com o item 57, em que os referidos oligossacáridos modificados têm uma proporção aumentada de oligossacáridos bifurcados, não fucosilados na região Fc da referida molécula de ligação ao antigénio.
Item 62: Uma molécula de ligação ao antigénio de acordo com o item 61, em que os referidos oligossacáridos bifurcados não fucosilados são híbridos. 117
Item 63: Uma molécula de ligação ao antigénio de acordo com o item 61, em que os referidos oligossacáridos bifurcados não fucosilados são complexos.
Item 64: Uma molécula de ligação ao antigénio de acordo com o item 57, em que pelo menos 20 % dos oligossacáridos na região Fc dos referidos polipéptidos são bifurcados não fucosilados.
Item 65: Uma molécula de ligação ao antigénio de acordo com o item 57, em que pelo menos 30 % dos oligossacáridos na região Fc dos referidos polipéptidos são bifurcados não fucosilados.
Item 66: Uma molécula de ligação ao antigénio de acordo com o item 57, em que pelo menos 35 % dos oligossacáridos na região Fc dos referidos polipéptidos são bifurcados não fucosilados.
Item 67: Uma molécula de ligação ao antigénio de acordo com o item 57, em que pelo menos 70 % dos oligossacáridos na região Fc dos referidos polipéptidos são bifurcados não fucosilados.
Item 68: Um processo de produção de uma molécula de ligação ao antigénio, que é capaz de concorrer com o anticorpo B-Lyl de murino para a ligação a CD20 humana e em que a referida molécula de ligação ao antigénio é quimérica; em que o referido processo compreende a. a cultura de uma célula hospedeira do item 26 ou do item 27 num meio em condições que permitem a expressão do referido polinucleótido que codifica a referida molécula de ligação ao antigénio; e 118 b. a recuperação da referida molécula de ligação ao antigénio da cultura resultante.
Item 69: Processo do item 68, em que a referida molécula de ligação ao antigénio é um anticorpo.
Item 70: Composição farmacêutica compreendendo a molécula de ligação ao antigénio de acordo com um qualquer dos itens 29-34 ou 46-67 e um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
Item 71: Composição farmacêutica do item 70, em que a referida composição ainda compreende um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
Item 72: Composição farmacêutica do item 70, em que a referida composição ainda compreende um adjuvante.
Item 73: Um processo de tratamento de um distúrbio que se pode tratar por uma depleção das células B compreendendo a administração de uma quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico da composição farmacêutica de um qualquer dos itens 70-72 a um ser humano que dela necessite.
Item 74: Uma célula hospedeira tratada por engenharia para expressar pelo menos um ácido nucleico que codifica um polipéptido com actividade de β(1,4)-Ν-acetilglicosaminiltransferase III numa quantidade suficiente para modificar os oligossacáridos na região Fc de um polipéptido produzido pela referida célula hospedeira, em que o referido polipéptido é uma molécula de ligação ao antigénio de acordo com qualquer um dos itens 44-67. 119
Item 75: Célula hospedeira do item 74, em que 0 referido polipéptido com actividade de β(1,4)-Ν- acetil- glicosaminiltransferase III é um polipéptido de fusão • Item 76: Célula hospedeira do item 74, em que a referida molécula de ligação ao antigénio é um anticorpo • Item 77: Célula hospedeira do item 74, em que a referida molécula de ligação ao antigénio é um fragmento de anticorpo. Item 7 8: Célula hospedeira do item 74, em que a referida molécula de ligação ao antigénio compreende uma região equivalente à região Fc de uma IgG humana. Item 79: Célula hospedeira do item 74, em que a referida molécula de ligação ao antigénio produzida pela referida célula hospedeira exibe uma afinidade de ligação ao receptor Fc aumentada, em resultado da referida modificação.
Item 80: Célula hospedeira do item 74, em que a referida molécula de ligação ao antigénio produzida pela referida célula hospedeira exibe uma função efectora aumentada, em resultado da referida modificação.
Item 81: Uma célula hospedeira de acordo com o item 75, em que o referido polipéptido de fusão compreende o dominio catalítico de β (1,4)-N-acetilglicosaminil-transferase III. 120
Item 82: Uma célula hospedeira de acordo com o item 75, em que o referido polipéptido de fusão ainda compreende o domínio de localização de Golgi de um polipéptido heterólogo residente em Golgi.
Item 83: Uma célula hospedeira de acordo com o item 82, em que o referido domínio de localização Golgi é o domínio de localização de manosidase II.
Item 84: Uma célula hospedeira de acordo com o item 82, em que o referido domínio de localização Golgi é domínio de localização de β(1,2)-N-acetilglicosaminil-transferase I.
Item 85: Uma célula hospedeira de acordo com o item 82, em que o referido domínio de localização de Golgi é o domínio de localização de β(1,2)-N-acetilglicosaminil-transferase II.
Item 86: Uma célula hospedeira de acordo com o item 82, em que o referido domínio de localização de Golgi é o domínio de localização de manosidase I.
Item 87: Uma célula hospedeira de acordo com o item 82, em que o referido domínio de localização de Golgi é o domínio de localização do núcleo cxl-6 de fucosil-transferase.
Item 88: Uma célula hospedeira de acordo com o item 80, em que a referida função efectora aumentada é uma citotoxicidade celular aumentada mediada por Fc. 121
Item 89: Uma célula hospedeira de acordo com o item 80, em que a referida função efectora aumentada é uma ligação aumentada às células AN.
Item 90: Uma célula hospedeira de acordo com o item 80, em que a referida função efectora aumentada é uma ligação aumentada aos macrófagos.
Item 91: Uma célula hospedeira de acordo com o item 80, em que a referida função efectora aumentada é uma ligação aumentada às células polimorfonucleares.
Item 92: Uma célula hospedeira, de acordo com o item 80, em que a referida função efectora aumentada é uma ligação aumentada aos monócitos.
Item 93: Uma célula hospedeira, de acordo com o item 80, em que o referido aumento da função efectora é um aumento da sinalização directa que induz apoptose.
Item 94: Uma célula hospedeira de acordo com o item 80, em que a referida função efectora aumentada é uma maturação aumentada das células dendriticas.
Item 95: Uma célula hospedeira, de acordo com o item 80, em que a referida função efectora aumentada é uma iniciação aumentada das células T.
Item 96: Uma célula hospedeira de acordo com o item 79, em que o referido receptor de Fc é um receptor de activação de Fcy. 122
Item 97: Uma célula hospedeira, de acordo com o item 79, em que o referido receptor de Fc receptor é um receptor de FcyRIIIA.
Item 98: Uma célula hospedeira, de acordo com o item 74, em que a referida célula hospedeira é uma célula de OHC, uma célula de RHB, uma célula de NSO, uma célula de SP2/0, uma célula de mieloma YO, uma célula de mieloma de murganho P3X63, uma célula de PER, uma célula de PER.C6 ou uma célula de hibridoma.
Item 99: A célula hospedeira do item 74, compreendendo ainda pelo menos um polinucleótido transfectado codificando um polipéptido de acordo com um qualquer dos itens 28 e 35-41 e em que o referido ácido nucleico compreende uma sequência que codifica uma região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina humana.
Item 100: A célula hospedeira do item 74, em que pelo menos um dos referidos ácido nucleicos que codifica um polipéptido com actividade de β(1,4)-N-acetil- glicosaminiltransferase III está ligado operacionalmente a um elemento promotor constitutivo.
Item 101: A célula hospedeira do item 100, em que o referido polipéptido, que tem actividade de β(1,4)-Ν-acetilglicosaminiltransferase III, é um polipéptido de fusão.
Item 102: Um processo para a produção de uma molécula de ligação ao antigénio com oligossacáridos modificados numa célula hospedeira, em que o referi processo compreende: 123 a. a cultura de uma célula hospedeira tratada por engenharia para expressar pelo menos um ácido nucleico que codifica um polipéptido que tem actividade de β (1,4)-N-acetilglicosaminil- transferase III em condições que permitem a produção da referida molécula de ligação ao antigénio e que permitem a modificação dos oligossacáridos presentes na região Fc da referida molécula de ligação ao antigénio; e b. o isolamento da referida molécula de ligação ao antigénio em que a referida molécula de ligação ao antigénio é capaz de concorrer com o anticorpo B-Lyl de murino para a ligação a CD2 0 e em que a referida molécula de ligação ao antigénio ou um seu fragmento são quiméricos.
Item 103: Processo de acordo com o item 102, em que os referidos oligossacáridos modificados têm uma fucosilação reduzida quando comparados com os oligossacáridos não modificados.
Item 104: Processo de acordo com o item 102, em que os referidos oligossacáridos modificados são hibridos.
Item 105: Processo de acordo com o item 102, em que os referidos oligossacáridos modificados são complexos.
Item 106: Processo de acordo com o item 102, em que o referido anticorpo recombinante ou um seu fragmento, produzidos pelas referida células hospedeiras têm uma proporção aumentada de oligossacáridos bifurcados, não fucosilados na região Fc do referido polipéptido. 124
Item 107: Processo de acordo com o item 106, em que os referidos oligossacáridos bifurcados, não fucosilados são híbridos.
Item 108: Processo de acordo com o item 106, em que os referidos oligossacáridos bifurcados, não fucosilados são complexos.
Item 109: Processo de acordo com o item 102, em que pelo menos 20 % dos oligossacáridos na região Fc do referido polipéptido são bifurcados e não fucosilados.
Item 110: Um processo de acordo com o item 102, em que pelo menos 30 % dos oligossacáridos na região Fc do referido polipéptido são bifurcados e não fucosilados.
Item 111: Processo de acordo com o item 102, em que pelo menos 35% dos oligossacáridos na região Fc do referido polipéptido são bifurcados e não fucosilados.
Item 112: Uma molécula de ligação ao antigénio tratada por engenharia para ter uma função efectora aumentada produzida pelo processo de acordo com um qualquer dos itens 102-111.
Item 113: A molécula de ligação do antigénio do item 112, em que a referida molécula de ligação do antigénio é um anticorpo.
Item 114: Um anticorpo tratado por engenharia para ter uma afinidade de ligação ao receptor Fc aumentada, produzido pelo processo de acordo com um qualquer dos itens 102-111. 125
Item 115: A molécula de ligação do antigénio do item 114, em que a referida molécula de ligação do antigénio é um anticorpo.
Item 116: Uma molécula de ligação ao antigénio, de acordo com o item 112, em que a referida função efectora aumentada é uma citotoxicidade celular aumentada mediada por Fc.
Item 117: Uma molécula de ligação ao antigénio, de acordo com o item 112, em que a referida função efectora aumentada é uma ligação aumentada às células AN.
Item 118: Uma molécula de ligação ao antigénio, de acordo com o item 112, em que a referida função efectora aumentada é uma ligação aumentada aos macrófagos.
Item 119: Uma molécula de ligação ao antigénio, de acordo com o item 112, em que a referida função efectora aumentada é uma ligação aumentada aos monócitos.
Item 120: Uma molécula de ligação ao antigénio, de acordo com o item 112, em que a referida função efectora aumentada é uma ligação aumentada às células polimorfonucleares.
Item 121: Uma molécula de ligação ao antigénio, de acordo com o item 112, em que a referida função efectora aumentada é uma sinalização directa que induz apoptose. 126
Item 122: Uma molécula de ligação ao antigénio, de acordo com o item 112, em que a referida função efectora aumentada é uma maturação aumentada das células dendriticas.
Item 123: Uma molécula de ligação ao antigénio, de acordo com o item 112, em que a referida função efectora aumentada é uma iniciação aumentada das células T.
Item 124: Uma molécula de ligação ao antigénio de acordo com o 114, em que o referido receptor de Fc é um receptor de activação de Fc.
Item 125: Uma molécula de ligação ao antigénio de acordo com o item 114, em que o referido receptor de Fc é um receptor de FcYRllla.
Item 126: Uma molécula de ligação ao antigénio produzida pelo processo de qualquer um dos itens 102 a 111, em que a referida molécula de ligação ao antigénio é um fragmento de anticorpo contendo a região Fc que é tratado por engenharia para ter uma função efectora aumentada.
Item 127: Uma molécula de ligação ao antigénio produzida pelo processo de acordo com qualquer um dos itens 102 a 111, em que a referida molécula de ligação ao antigénio é uma proteína de fusão que inclui um polipéptido que tem a sequência da SEQ ID NO: 1 e uma região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina e é tratada por engenharia para ter uma função efectora aumentada. 127
Item 128: Uma molécula de ligação ao antigénio produzida pelo processo de acordo com qualquer um dos itens 102 a 111, em que a referida molécula de ligação ao antigénio é uma proteína de fusão que inclui um polipéptido que tem uma sequência seleccionada no grupo que consiste nas SEQ ID No: 30; SEQ ID No: 32; SEQ ID No: 34; SEQ ID No: 36; SEQ ID No: 38; SEQ ID No: 40; SEQ ID No: 42; SEQ ID No: 44; SEQ ID No: 46; SEQ ID No: 48; SEQ ID No: 50; SEQ ID No: 52; SEQ ID No: 54; SEQ ID No: 56; SEQ ID No: 58; SEQ ID NO: 60; SEQ ID No: 62; SEQ ID No: 64; SEQ ID No: 66; SEQ ID No: 68; SEQ ID No: 70; e SEQ ID No: 72 e uma região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina e é tratada por engenharia para ter uma função efectora aumentada.
Item 129: Uma molécula de ligação ao antigénio produzida pelo processo de acordo com qualquer um dos itens 102 a 111, em que a referida molécula de ligação ao antigénio é uma proteína de fusão que inclui um polipéptido que tem a sequência da SEQ ID NO: 3 e uma região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina que é tratada por engenharia para ter uma função efectora aumentada.
Item 130: Uma molécula de ligação ao antigénio produzida pelo processo de acordo com qualquer um dos itens 102 a 111, em que a referida molécula de ligação ao antigénio é uma proteína de fusão que inclui um polipéptido que tem a sequência da SEQ ID NO: 76 e uma região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina e é tratada por engenharia para ter uma função efectora aumentada. 128
Item 131: Uma composição farmacêutica compreendendo a molécula de ligação ao antigénio de acordo com um qualquer dos itens 112 a 130 e um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
Item 132: Uma composição farmacêutica compreendendo o fragmento de anticorpo do item 126 e um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
Item 133: Composição farmacêutica compreendendo a proteina de fusão de um qualquer dos itens 127 a 130 e um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
Item 134: Um processo de tratamento de uma doença que se pode tratar por uma depleção das células B compreendendo a administração de uma quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico da molécula de ligação ao antigénio de acordo com qualquer dos itens 112 a 130 a um ser humano que dele necessite.
Item 135: Um polinucleótido isolado de acordo com 0 item 4 ou 5 compreendendo ainda uma sequência de codificação de uma região constante de cadeia leve ou pesada de um anticorpo humano.
Item 136: Um polinucleótido isolado que compreende uma sequência com pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO: 24, em que o referido polinucleótido isolado codifica um polipéptido de fusão.
Item 137: Uma célula hospedeira que co-expressa um polinucleótido isolado de acordo com o item 136 e um polinucleótido que compreende uma sequência que 129 codifica a região variáve anticorpo.
Item 138: Uma molécula de acordo com o item 57, em oligossacáridos na região Fc
Item 139: Uma molécula de acordo com o item 57, em oligossacáridos na região Fc
Item 140: Uma molécula de acordo com o item 57, em oligossacáridos na região Fc
Item 141: Uma molécula de acordo com o item 57, em oligossacáridos na região Fc
Item 142: Uma molécula de acordo com o item 57, em oligossacáridos na região Fc
Item 143: Uma molécula de acordo com o item 57, em oligossacáridos na região Fc
Item 144: Uma molécula de acordo com o item 57, em oligossacáridos na região Fc
Item 145: Uma molécula de acordo com o item 57, em oligossacáridos na região Fc 1 da cadeia leve de um ligação ao antigénio de que pelo menos 50 % dos são bifurcados. ligação ao antigénio de que pelo menos 60 % dos são bifurcados. ligação ao antigénio de que pelo menos 7 0 % dos são bifurcados. ligação ao antigénio de que pelo menos 80 % dos são bifurcados. ligação ao antigénio de que pelo menos 90 % dos são bifurcados. ligação ao antigénio de que pelo menos 50 % dos são não fucosilados. ligação ao antigénio de que pelo menos 60 % dos não são fucosilados. ligação ao antigénio de que pelo menos 70 % dos são não fucosilados. 130
Item 146: Uma molécula de ligação ao antigénio de acordo com o item 57, em que pelo menos 75 % dos oligossacáridos na região Fc são não fucosilados.
Item 147: Um processo de acordo com o item 73, em que o referido distúrbio é um linfoma das células B.
Item 148: Um polinucleótido isolado compreendendo uma sequência seleccionada no grupo que consiste nas SEQ ID No: 29; SEQ ID No: 31; SEQ ID No: 33; SEQ ID No: 35; SEQ ID No: 37; SEQ ID No: 39; SEQ ID No: 41; SEQ ID No: 43; SEQ ID No: 45; SEQ ID No: 47; SEQ ID No: 49; SEQ ID No: 51; SEQ ID No: 53; SEQ ID No: 55; SEQ ID No: 57; SEQ ID No: 59; SEQ ID No: 61; SEQ ID No: 63; SEQ ID No: 65; SEQ ID No: 67; SEQ ID No: 69; e SEQ ID No: 71.
Item 149: Um polinucleótido isolado de acordo com o item 148, em que o referido polinucleótido isolado compreende a SEQ ID NO: 31.
Item 150: Um polinucleótido isolado de acordo com o item 148, em que o referido polinucleótido isolado compreende a SEQ ID NO: 55.
Item 151: Um polinucleótido isolado de acordo com o item 148, em que o referido polinucleótido isolado compreende a SEQ ID NO: 59.
Item 152: Um polinucleótido isolado que compreende a SEQ ID NO: 75.
Item 153: Um polinucleótido isolado de acordo com o item 148 ou 149, em que o referido polinucleótido isolado codifica um polipéptido de fusão. 131
Item 154: Um polinucelótido isolado que compreende a) uma sequência que codifica um polipéptido com uma sequência seleccionada no grupo que consiste nas SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 56; e SEQ ID NO: 60; e b) uma sequência que codifica um polipéptido com a sequência da SEQ ID NO.: 76.
Item 155: Um polinucelótido isolado que compreende uma sequência com pelo menos 80 % de identidade com uma sequência seleccionada no grupo que consiste nas SEQ ID No: 29; SEQ ID No: 31; SEQ ID No: 33; SEQ ID No: 35; SEQ ID No: 37; SEQ ID No: 39; SEQ ID No: 41; SEQ ID No: 43; SEQ ID No: 45; SEQ ID No: 47; SEQ ID No: 49; SEQ ID No: 51; SEQ ID No: 53; SEQ ID No: 55; SEQ ID No: 57; SEQ ID No: 59; SEQ ID No: 61; SEQ ID No: 63; SEQ ID No: 65; SEQ ID No: 67; SEQ ID No: 69; e SEQ ID No: 71, em que o referido polinucelótido isolado codifica um polipéptido de fusão.
Item 156: Um polinucleótido isolado que compreende uma sequência com pelo menos 80 % de identidade com a SEQ ID NO: 75, em que o referido polinucleótido isolado codifica um polipéptido de fusão.
Item 157: Um polinucelótido isolado que compreende uma sequência com pelo menos 85 % de identidade com uma sequência seleccionada no grupo que consiste nas SEQ ID No: 29; SEQ ID No: 31; SEQ ID No: 33; SEQ ID No: 35; SEQ ID No: 37; SEQ ID No: 39; SEQ ID No: 41; SEQ ID No: 43; SEQ ID No: 45; SEQ ID No: 47; SEQ ID No: 49; SEQ ID No: 51; SEQ ID No: 53; SEQ ID No: 55; SEQ ID No: 57; 132 SEQ ID No: 59; SEQ ID No: 61; SEQ ID No: 63; SEQ ID No: 65; SEQ ID No: 67; SEQ ID No: 69; e SEQ ID No: 71.
Item 158: Um polinucleótido isolado que compreende uma sequência com pelo menos 85 % de identidade com a SEQ ID NO.: 75.
Item 159: Um polinucelótido isolado que compreende uma sequência com pelo menos 90 % de identidade com uma sequência seleccionada no grupo que consiste nas SEQ ID No: 29; SEQ ID No: 31; SEQ ID No: 33; SEQ ID No: 35; SEQ ID No: 37; SEQ ID No: 39; SEQ ID No: 41; SEQ ID No: 43; SEQ ID No: 45; SEQ ID No: 47; SEQ ID No: 49; SEQ ID No: 51; SEQ ID No: 53; SEQ ID No: 55; SEQ ID No: 57; SEQ ID No: 59; SEQ ID No: 61; SEQ ID No: 63; SEQ ID No: 65; SEQ ID No: 67; SEQ ID No: 69; e SEQ ID No: 71.
Item 160: Um polinucleótido isolado que compreende uma sequência com pelo menos 90 % de identidade com a SEQ ID NO.: 75.
Item 161: Um polinucelótido isolado que compreende uma sequência com pelo menos 95 % de identidade com uma sequência seleccionada no grupo que consiste nas SEQ ID No: 29; SEQ ID No: 31; SEQ ID No: 33; SEQ ID No: 35; SEQ ID No: 37; SEQ ID No: 39; SEQ ID No: 41; SEQ ID No: 43; SEQ ID No: 45; SEQ ID No: 47; SEQ ID No: 49; SEQ ID No: 51; SEQ ID No: 53; SEQ ID No: 55; SEQ ID No: 57; SEQ ID No: 59; SEQ ID No: 61; SEQ ID No: 63; SEQ ID No: 65; SEQ ID No: 67; SEQ ID No: 69; e SEQ ID No: 71.
Item 162: Um polinucleótido isolado que compreende uma sequência com pelo menos 95 % de identidade com a SEQ ID NO.: 75. 133
Item 163: Um polinucelótido isolado que compreende uma sequência com pelo menos 99 % de identidade com uma
sequência seleccionada no grupo que consiste nas SEQ ID
No: 29; SEQ ID No: 31; SEQ ID No: 33; SEQ ID No: 35; SEQ ID No: 37; SEQ ID No: 39; SEQ ID No: 41; SEQ ID No:
43; SEQ ID No: 45; SEQ ID No: 47; SEQ ID No: 49; SEQ ID
No: 51; SEQ ID No: 53; SEQ ID No: 55; SEQ ID No: 57; SEQ ID No: 59; SEQ ID No: 61; SEQ ID No: 63; SEQ ID No: 65; SEQ ID No: 67; SEQ ID No: 69; e SEQ ID No: 71.
Item 164: Um polinucleótido isolado que compreende uma sequência com pelo menos 99 % de identidade com a SEQ ID NO.: 75.
Item 165: Um polinucelótido isolado que compreende a) uma sequência que codifica um polipéptido com uma sequência sele ccionada no grupo que consi ste nas SEQ ID NO: 30; SEQ ID No: 32; SEQ ID No: 34; SEQ ID No: 36; SEQ ID No : 38 i; SEQ ID No: 40; SEQ ID No: 42; SEQ ID No: 44; SEQ ID No: 4 6; SEQ ID No: 48; SEQ ID No: 50; SEQ ID No : 52; SEQ ID No: 54; SEQ ID No: 56; SEQ ID No : 58 !; SEQ ID No: 60; SEQ ID No: 62; SEQ ID No: 64; SEQ ID No: 66; SEQ ID No: 05 CO SEQ ID No: 70; e SEQ ID No: 72 e b) uma sequência que codifica um polipéptido com a sequência de uma região Fc do anticorpo ou de um seu fragmento, a partir de uma espécie diferente de murganho.
Item 166: Um polinucelótido isolado que compreende a) uma sequência que codifica um polipéptido com a sequência da SEQ ID NO.: 76; e 134 b) uma sequência que codifica um polipéptido com a sequência de uma região Fc do anticorpo ou de um seu fragmento, a partir de uma espécie diferente de murganho.
Item 167: Um polinucleótido isolado codificando um polipéptido com uma sequência seleccionada no grupo que consiste nas SEQ ID No: 30; SEQ ID No: 32; SEQ ID No: 34; SEQ ID No: 36; SEQ ID No: 38; SEQ ID No: 40; SEQ ID No: 42; SEQ ID No: 44; SEQ ID No: 46; SEQ ID No: 48; SEQ ID No: 50; SEQ ID No: 52; SEQ ID No: 54; SEQ ID No:
56; SEQ ID No: 58; SEQ ID No: 60; SEQ ID No: 62; SEQ ID
No: 64; SEQ ID No: 66; SEQ ID No: 68; SEQ ID No: 70; e SEQ ID No: 72.
Item 168: Um polinucelótido isolado que codifica um polipéptido com a sequência da SEQ ID NO.: 76.
Item 169: Um polinucelótido isolado que compreende uma sequência que codifica um polipéptido com uma sequência seleccionada no grupo que consiste nas SEQ ID No: 30; SEQ ID No: 32; SEQ ID No: 34; SEQ ID No: 36; SEQ ID No:
38; SEQ ID No: 40; SEQ ID No: 42; SEQ ID No: 44; SEQ ID
No: 46; SEQ ID No: 48; SEQ ID No: 50; SEQ ID No: 52; SEQ ID No: 54; SEQ ID No: 56; SEQ ID No: 58; SEQ ID No:
60; SEQ ID No: 62; SEQ ID No: 64; SEQ ID No: 66; SEQ ID
No: 68; SEQ ID No: 70; e SEQ ID No: 72.
Item 170: Um polinucleótido isolado que compreende uma sequência que codifica um polipéptido com a SEQ ID NO: 135 76.
Item 171: Um vector de expressão que compreende um polinucleótido isolado de acordo com um qualquer dos itens 148-170.
Item 172: O vector do item 171, em que o referido vector é policistrónico.
Item 173: Uma célula hospedeira que compreende o vector de expressão do item 171.
Item 174: Uma célula hospedeira que compreende um polinucleótido isolado de acordo com um qualquer dos itens 148-170.
Item 175: Um polinucleótido humanizado compreendendo uma sequência seleccionada no qrupo que consiste nas SEQ ID No: 30; SEQ ID No: 32; SEQ ID No: 34; SEQ ID No:
36; SEQ ID No: 38; SEQ ID No: 40; SEQ ID No: 42; SEQ ID
No: 44; SEQ ID No: 46; SEQ ID No: 48; SEQ ID No: 50; SEQ ID No: 52; SEQ ID No: 54; SEQ ID No: 56; SEQ ID No:
58; SEQ ID No: 60; SEQ ID No: 62; SEQ ID No: 64; SEQ ID
No: 66; SEQ ID No: 68; SEQ ID No: 70; e SEQ ID No: 72 ou uma sua variante.
Item 176: Um polipéptido humanizado que compreende a sequência da SEQ ID NO: 76 ou uma sua variante.
Item 177: Um polinucelótido isolado que compreende uma sequência seleccionada no grupo que consiste nas SEQ ID
No: 30; SEQ ID No: 32; SEQ ID No: 34; SEQ ID No: 36; SEQ ID No: 38; SEQ ID No: 40; SEQ ID No: 42; SEQ ID No:
44; SEQ ID No: 46; SEQ ID No: 48; SEQ ID No: 50; SEQ ID
No: 52; SEQ ID No: 54; SEQ ID No: 56; SEQ ID No: 58; SEQ ID No: 60; SEQ ID No: 62; SEQ ID No: 64; SEQ ID No: 136 66; SEQ ID No: 68; SEQ ID No: 70; e SEQ ID No: 72; ou uma sua variante.
Item 178: Um polipéptido isolado que compreende a SEQ ID NO: 76 ou uma sua variante.
Item 179: O polipéptido isolado de acordo com um qualquer dos itens 177-178, em que o referido polipéptido é um polipéptido de fusão.
Item 180: Uma molécula de ligação ao antigénio compreendendo o polipéptido do item 179.
Item 181: A molécula de ligação do antigénio do item 180, em que a referida molécula de ligação do antigénio é um anticorpo.
Item 182: 0 anticorpo do item 181, em que o referido anticorpo é um anticorpo humanizado.
Item 183: A molécula de ligação ao antigénio do item 180, em que a referida molécula de ligação ao antigénio é um fragmento de anticorpo.
Item 184: A molécula de ligação ao antigénio do item 183, em que o referido fragmento de anticorpo é humanizado.
Item 185: A molécula de ligação do antigénio do item 180, em que a referida molécula de ligação do antigénio é um anticorpo recombinante. 137
Item 186: A molécula de ligação ao antigénio do item 185, em que o referido anticorpo recombinante é humanizado.
Item 187: A molécula de ligação ao antigénio do item 180, em que o referido anticorpo recombinante compreende uma região Fc humana.
Item 188: A molécula de ligação ao antigénio do item 187, em que a referida região Fc humana é uma região Fc de IgG humana.
Item 189: Uma molécula de ligação ao antigénio de qualquer um dos itens 180-188, em que a referida molécula de ligação ao antigénio com uma região Fc com oligossacáridos modificados.
Item 190: Uma molécula de ligação ao antigénio de acordo com o item 189, em que a referida região Fc tenha sido modificada para ter residuos de fucose reduzidos quando comparados com a molécula de ligação ao antigénio não modificada.
Item 191: Uma molécula de ligação ao antigénio de acordo com o item 189, em que a referida região Fc tem uma proporção aumentada de oligossacáridos bifurcados.
Item 192: Uma molécula de ligação ao antigénio de acordo com o item 189, em que os referidos oligossacáridos modificados são complexos bifurcados.
Item 193: Uma molécula de ligação ao antigénio de acordo com o item 189, em que os referidos oligossacáridos modificados têm uma proporção aumentada 138 3, não fucosilados na de ligação ao antigénio. ligação ao antigénio de em que os referidos não fucosilados são ligação ao antigénio de em que os referidos não fucosilados são ligação ao antigénio de que pelo menos 20 % dos dos referidos polipéptidos s. de oligossacáridos bifurcado região Fc da referida molécul
Item 194: Uma molécula de acordo com o item 193, oligossacáridos bifurcados híbridos.
Item 195: Uma molécula de acordo com o item 193, oligossacáridos bifurcados complexos.
Item 196: Uma molécula de acordo com o item 189, em oligossacáridos na região Fc são bifurcados não fucosilad(
Item 197: Uma molécula de ligação ao antigénio de acordo com o item 189, em que pelo menos 30 % dos oligossacáridos na região Fc dos referidos polipéptidos são bifurcados não fucosilados.
Item 198: Uma molécula de ligação ao antigénio de acordo com o item 189, em que pelo menos 35 % dos oligossacáridos na região Fc dos referidos polipéptidos são bifurcados não fucosilados.
Item 199: Uma molécula de ligação ao antigénio de acordo com o item 189, em que pelo menos 70 % dos oligossacáridos na região Fc dos referidos polipéptidos são bifurcados não fucosilados. 139
Item 200: Um processo de produção de uma molécula de ligação ao antigénio, que é capaz de concorrer com o anticorpo B-Lyl de murino para a ligação a CD20 humana, em que a referida molécula de ligação ao antigénio é quimérica; em que o referido processo compreende a) a cultura de uma célula hospedeira do item 173 ou do item 174 num meio e em condições que permitem a expressão do referido polinucleótido que codifica a referida molécula de ligação ao antigénio; e b) a recuperação da referida molécula de ligação ao antigénio.
Item 201: O processo do item 200, em que a referida molécula de ligação ao antigénio é um anticorpo.
Item 202: Processo do item 200, em que a referida molécula quimérica de ligação ao antigénio é humanizada.
Item 203: Uma composição farmacêutica compreendendo a molécula de ligação ao antigénio de acordo com um qualquer dos itens 189-199 e um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
Item 204: A composição farmacêutica do item 203, em que a referida composição ainda compreende um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
Item 205: Composição farmacêutica do item 203, em que a referida composição ainda compreende um adjuvante.
Item 206: Um processo de tratamento de um distúrbio que se pode tratar por uma depleção das células B 140 compreendendo a administração de uma quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico da composição farmacêutica de um qualquer dos itens 203-205 a um ser humano que dela necessite.
Item 207: Uma células hospedeira tratada por engenharia para expressar pelo menos um ácido nucleico que codifica um polipéptido com actividade de β(1,4)-Ν-acetilglicosaminiltransferase III numa quantidade suficiente para modificar os oligossacáridos da região Fc de um polipéptido produzido pela referida célula hospedeira, em que o referido polipéptido é uma molécula de ligação ao antigénio de acordo com qualquer um dos itens 180-197.
Item 208: A célula hospedeira do item 207, em que o referido polipéptido que tem actividade de β(1,4)-Ν-acetilglicosaminiltransferase III é um polipéptido de fusão.
Item 209: A célula hospedeira do item 207, em que a referida molécula de ligação ao antigénio é um anticorpo.
Item 210: Célula hospedeira do item 207, em que a referida molécula de ligação ao antigénio é um fragmento de anticorpo.
Item 211: A célula hospedeira do item 207, em que a referida molécula de ligação ao antigénio compreende uma região equivalente à região Fc de uma IgG humana.
Item 212: A célula hospedeira do item 207, em que a referida molécula de ligação ao antigénio produzida 141 pela referida célula hospedeira exibe uma afinidade de ligação ao receptor Fc aumentada, em resultado da referida modificação.
Item 213: Célula hospedeira do item 207, em que a referida molécula de ligação ao antigénio produzida pela referida célula hospedeira exibe uma função efectora aumentada, em resultado da referida modificação.
Item 214: Uma célula hospedeira de acordo com o item 208, em que o referido polipéptido de fusão compreende o domínio catalítico de β (1,4)-N-acetilglicosaminil-transferase III.
Item 215: Uma célula hospedeira de acordo com o item 208, em que o referido polipéptido de fusão ainda compreende o domínio de localização de Golgi de um polipéptido heterólogo residente em Golgi.
Item 216: Uma célula hospedeira de acordo com o item 215, em que o referido domínio de localização Golgi é o domínio de localização de manosidase II.
Item 217: Uma célula hospedeira de acordo com o item 215, em que o referido domínio de localização Golgi é o domínio de localização de β(1,2)-N-acetilglicosaminil-transferase I.
Item 218: Uma célula hospedeira de acordo com o item 215, em que o referido domínio de localização Golgi é domínio de localização de β (1,2)-N-acetilglicosaminil-transferase II. 142
Item 219: Uma célula hospedeira de acordo com o item 215, em que o referido dominio de localização de Golgi é o dominio de localização de manosidase I.
Ltem é o de Ltem uma Ltem uma Ltem uma Ltem : um Ltem uma Ltem b um
Item 220: Uma célula hospedeira de acordo com o 215, em que o referido dominio de localização Golgi dominio de localização do núcelo al-6 fucosiltransferase.
Item 221: Uma célula hospedeira de acordo com o 213, em que a referida função efectora aumentada é citotoxicidade celular aumentada mediada por Fc.
Item 222: Uma célula hospedeira de acordo com o 213, em que a referida função efectora aumentada é ligação aumentada às células AN.
Item 223: Uma célula hospedeira de acordo com o 213, em que a referida função efectora aumentada é ligação aumentada aos macrófagos.
Item 224: Uma célula hospedeira de acordo com o 213, em que a referida função efectora aumentada < aumento das células polimorfonucleares.
Item 225: Uma célula hospedeira de acordo com o 213, em que a referida função efectora aumentada é ligação aumentada aos monócitos.
Item 22 6: Uma célula hospedeira de acordo com o 213, em que o referido aumento da função efectora aumento da sinalização directa que induz apoptose. 143
Item 227: Uma célula hospedeira de acordo com o item 213, em que a referida função efectora aumentada é uma maturação aumentada das células dendriticas.
Item 228: Uma célula hospedeira de acordo com o item 213, em que a referida função efectora aumentada é uma iniciação aumentada das células T.
Item 22 9: Uma célula hospedeira de acordo com o item 212, em que o referido receptor de Fc é um receptor de activação de Fcy.
Item 230: Uma célula hospedeira de acordo com o item 212, em que o referido receptor de Fc receptor é um receptor de FcyRIIIA.
Item 231: Uma célula hospedeira de acordo com o item 207, em que a referida célula hospedeira é uma célula de OHC, uma célula de RHB, uma célula de NSO, uma célula de SP2/0, uma célula de mieloma YO, uma célula de mieloma de murganho P3X63, uma célula de PER, uma célula de PER.C6 ou uma célula de hibridoma.
Item 232: A célula hospedeira do item 207, compreendendo ainda pelo menos um polinucleótido transfectado codificando um polipéptido de acordo com um qualquer dos itens 28 e 35-41 e em que o referido ácido nucleico compreende uma sequência que codifica uma região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina humana.
Item 233: A célula hospedeira do item 207, em que pelo menos um dos referidos ácido nucleicos que codifica um polipéptido com actividade de β(1,4)-N-acetil- 144 glicosaminiltransferase III está ligado operacionalmente a um elemento promotor constitutivo.
Item 234: A célula hospedeira do item 233, em que o referido polipéptido que tem actividade de β(1,4)-Ν-acetilglicosaminiltransferase III é um polipéptido de fusão.
Item 235: Uma molécula de ligação ao antigénio de acordo com o item 189, em que pelo menos 50 % dos oligossacáridos na região Fc são bifurcados. Item 236: Uma molécula de ligação ao antigénio de acordo com o item 189, em que pelo menos 60 % dos oligossacáridos na região Fc são bifurcados. Item 237: Uma molécula de ligação ao antigénio de acordo com o item 189, em que pelo menos 7 0 % dos oligossacáridos na região Fc são bifurcados. Item 238: Uma molécula de ligação ao antigénio de acordo com o item 189, em que pelo menos 80 % dos oligossacáridos na região Fc são bifurcados. Item 239: Uma molécula de ligação ao antigénio de acordo com o item 189, em que pelo menos 90 % dos oligossacáridos na região Fc são bifurcados. Item 240: Uma molécula de ligação ao antigénio de acordo com o item 189, em que pelo menos 50 % dos oligossacáridos na região Fc são não fucosilados. 145
Item 241: Uma molécula de acordo com o item 189, em oligossacáridos na região Fc
Item 242: Uma molécula de acordo com o item 189, em oligossacáridos na região Fc
Item 243: Uma molécula de acordo com o item 189, em oligossacáridos na região Fc
Item 244: Um processo de acc o referido distúrbio é um li ligação ao antigénio de gue pelo menos 60 % dos são não fucosilados. ligação ao antigénio de que pelo menos 70 % dos são não fucosilados. ligação ao antigénio de que pelo menos 75 % dos são não fucosilados. cdo com o item 206, em que forna das células B.
Item 245: Um polinucleótido isolado que compreende pelo menos uma região de determinação de complementaridade do anticorpo B-Lyl de murino ou uma sua variante ou uma sua forma truncada contendo pelo menos os resíduos que determinam a especificidade para a referida região de determinação de complementaridade, em que o referido polinucleótido isolado codifica um polipéptido de fusão.
Item 246: Um polinucleótido, isolado de acordo com o item 245, em que a referida região de determinação de complementaridade se selecciona no grupo que consiste em: [LISTA DE TODAS AS SEQUÊNCIAS DAS RDC DE B-Lyl].
Item 247: Um polinucleótido isolado, de acordo com o item 245, em que o referido polinucleótido isolado codifica uma molécula de ligação do antigénio. 146
Item 248: Um polinucleótido isolado que compreende pelo menos três regiões de determinação de complementaridade do anticorpo B-Lyl de murino ou as suas variantes ou as suas formas truncadas contendo pelo menos os residuos que determinam a especificidade para cada uma das referidas três regiões de determinação de complementaridade, em que o referido polinucleótido isolado codifica um polipéptido de fusão.
Item 249: Um polinucleótido isolado, de acordo com o item 248, em que as referidas regiões de determinação de complementaridade compreendem pelo menos uma sequência que se selecciona no grupo que consiste em: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7; e pelo menos uma sequência selecciona-se no grupo que consiste em: SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, e SEQ ID NO: 23; e SEQ ID NO: 24 ou as variantes ou as formas truncadas das referidas sequências que contêm pelo menos os residuos de determinação de especificidade para cada uma das referidas regiões de determinação de complementaridade.
Item 250: Um polipéptido isolado codificado pelos polinucleótidos isolados de um qualquer dos itens 245-249.
Item 251: Uma molécula de ligação ao antigénio que compreende pelo menos uma região de determinação de complementaridade do anticorpo B-Lyl de murino ou uma sua variante ou uma sua forma truncada contendo pelo menos os residuos que determinam a especificidade para a referida região de determinação de complementaridade e ainda compreende uma sequência derivada de polipéptido heterólogo. 147
Item 252: Uma molécula de ligação ao antigénio de acordo com o item 251, em que a referida molécula de ligação ao antigénio compreende pelo menos três regiões de determinação de complementaridade do anticorpo B-Lyl de murino ou as suas variantes ou as suas formas truncadas contendo pelo menos os residuos de determinação de especificidade para cada uma das referidas regiões de determinação de complementaridade.
Item 253: Uma molécula de ligação ao antigénio de acordo com o item 252 em que a referida molécula de ligação ao antigénio compreende a região variável de uma cadeia leve ou pesada de anticorpo.
Item 254: Uma molécula de ligação ao antigénio de acordo com o item 252 em que a referida molécula de ligação ao antigénio é um anticorpo quimérico ou humanizado.
Item 255: Um anticorpo anti-CD20 do tipo II tratado por engenharia com uma CCDA aumentada em resultado da referida engenharia sem perder praticamente a capacidade de induzir a apoptose de células-alvo.
Item 256: Um anticorpo anti-CD20 do tipo II tratado por engenharia, de acordo com o item 255, em que o referido anticorpo tenha sido tratado por engenharia para ter um modelo alterado de glicosilação na região Fc.
Item 257: Um anticorpo anti-CD20 do tipo II de acordo com o item 256, em que a referida glicosilação alterada é um aumento na quantidade dos oligossacáridos complexos bifurcados. 148
Item 258: Um anticorpo anti-CD20 do tipo II, de acordo com o item 256, em que a referida glicosilação alterada ser uma diminuição dos resíduos de fucose.
Item 259: Um anticorpo anti-CD20 do tipo II tratado por engenharia, de acordo com o item 255, em que o referido anticorpo tenha sido tratado por engenharia para ter uma sequência de aminoácidos alterada na região Fc.
Os exemplos que se seguem explicam a presente invenção com mais detalhe. As preparações e os exemplos que se seguem são dados para permitir aos especialistas na matéria que compreendam de uma forma mais clara e para que possam por em prática a presente invenção. Na verdade, várias modificações da presente invenção, para além das descritas aqui, tornar-se-ão evidentes para os especialistas na matéria a partir da descrição anterior e dos desenhos que a acompanham.
EXEMPLOS
[NOTA: A menos que seja especificado de outra forma, as referências à numeração das posições específicas dos resíduos de aminoácidos nos exemplos que se seguem estão de acordo com o sistema de numeração de Kabat. EXEMPLO 1
Materiais e métodos
Clonagem e expressão do anticorpo recombinante B-Lyl
As células de hibridoma que expressam B-Lyl cresceram em RPMI contendo SBF a 10 % e L-glutamina 4 mM. Colheram-se 149 6 χ 106 células com uma viabilidade > 90 % e isolou-se o ARN total utilizando um estojo Qiagen RNAeasy midi. Amplificaram-se os ADNcs que codificam as cadeias variáveis leves e pesadas de B-Lyl por meio de RCP-TI. A reacção de RCP-TI foi realizada utilizando as condições seguintes: 30 min a 50 °C durante a sintese do primeiro filamento de ADNc; 15 min a 95 °C de desnaturação inicial; 30 ciclos de 1 min a 94 °C, 1 min a 45 °C, 1,5 min a 72 °C; e uma etapa de elongação final durante 10 min a 72 °C. A dimensão esperada dos produtos de RCP foi confirmada por electroforese em gel. Os produtos de RCP foram clonados em vectores apropriados de E. coli e a sequenciação do ADN confirmou que se isolaram os genes que codificam as cadeias variáveis leve e pesada.
Para a construção dos vectores quiméricos de expressão de B-Lyl, fundiram-se as sequências de sinal sintéticas e os sitios de restrição apropriados com as cadeias variáveis por reacções adicionais de RCP. Depois de uma confirmação final da sequência correcta de cadeias variáveis de ADN, combinaram-se com as regiões constantes da correspondente IgGl humana. Logo que os genes foram produzidos, foram clonados sob o controlo do promotor MPSV e a montante de um sitio poliA sintético, utilizando dois vectores separados, um para cada cadeia, resultando nos plasmidos pETR1808 (vector de expressão de cadeia pesada) e pETR1813 (vector de expressão de cadeia leve). Cada vector comportava uma sequência de EBV OriP. O B-Lyl quimérico foi produzido co-transfectando células HEK293-EBNA com vectores pETR1808 e pETR1813 utilizando uma abordagem de transfecção de fosfato de cálcio. As células HEK293-EBNA de crescimento exponencial foram transfectadas pelo processo do fosfato de cálcio. As 150 células cresceram como culturas em monocamadas aderentes em frascos T utilizando um meio de cultura DMEM complementado com SBF a 10 % e foram transfectadas quando estavam com uma confluência entre 50 e 80 %. Para a transfecção de um frasco T75, semearam-se 8 milhões de células 24 horas antes da transfecção em 14 ml de meio de cultura DMEM complementado com SBF (a 10 % V/V final), 250 pg/ml de neomicina e colocaram-se as células em placa a 37 °C numa incubadora numa atmosfera de CO2 a 5 % durante a noite. Para cada frasco T75 a ser transfectado, preparou-se uma solução de ADN, CaCl2 e água misturando 47 pg do ADN total do vector do plasmido dividido igualmente entre os vectores de expressão de cadeia leve e pesada, 235 μΐ de uma solução de CaCl2 1M e adicionou-se água até a um volume final de 469 μΐ. A esta solução, adicionou-se 469 μΐ de uma solução de HEPES 50mM, NaCl 280 mM, Na2HP04 1,5 mM a pH 7,05, misturou-se imediatamente durante 10 seg e deixou-se em repouso à temperatura ambiente durante 20 seg. Diluiu-se a suspensão com 12 ml de DMEM complementado com SBF a 2 % e adicionou-se ao T75 em lugar do meio existente. Incubaram-se as células a 37 °C, C02 a 5 % durante cerca de 17 a 20 horas, depois substituiu-se o meio com 12 ml de DMEM, SBF a 10%. Para a produção do anticorpo não modificado "B-Lyl qu", as células foram transfectadas apenas com os vectores de expressão do anticorpo pETR1808 e pETR1813 numa relação de 1:1. Para a produção do anticorpo glicosilado por engenharia "B-Lyl qu", as células foram co-transfectadas com quatro plasmidos, dois para a expressão de anticorpos (pETR1808 e pETRl813) , um para a expressão de um polipéptido de fusão GnTIII (pETR1519) e um para a expressão de manosidase II (pCLF9) numa relação de 4:4:1:1, respectivamente. No 5o dia após a transfecção, colheu-se o sobrenadante, centrifugou-se durante 5 min a 1200 rpm, 151 seguida de uma segunda centrifugação durante 10 min a 4000 rpm e manteve-se a 4 °C. O B-Lyl qu. e o B-Lyl-ge qu. foram purificados a partir do sobrenadante da cultura utilizando três etapas cromatográficas sequenciais, cromatografia da proteína A, cromatografia de permuta iónica e uma etapa de cromatografia de exclusão de dimensão numa coluna Superdex 200 (Amersham Pharmacia) permutando o tampão com uma solução salina tamponada com fosfato e colheu-se o pico do anticorpo monomérico a partir desta última etapa. A concentração do anticorpo foi estimada utilizando um espectrofotómetro a partir da densidade óptica a 280 mn.
Análise dos oligossacáridos
Os oligossacáridos foram libertados enzimaticamente a partir dos anticorpos por digestão de PNGaseF, com os anticorpos a ser imobilizados numa membrana de PVDF ou numa solução. A solução de digestão resultante, contendo os oligossacáridos libertados quer preparados directamente para a análise por MALDI/TOF-EM ou foi depois digerida com a glicosidade de EndoH antes da preparação da amostra para a análise por MALDI/TOF-EM.
Processo de libertação de oligossacáridos para os anticorpos imobilizados na membrana de PVDF
Molharam-se os poços de uma placa com 96 poços feitos com uma membrana de PVDF (Immobilon P, Millipore, Bedford, Massachusetts) com 100 μΐ de metanol e verteu-se o líquido através da membrana de PVDF utilizando vácuo aplicado a um 152 colector de vácuo Multiscreen (Millipore, Bedford, Massachusetts). Lavaram-se as membranas de PVDF três vezes com 300 μΐ de água. Lavaram-se então os poços com 50 μΐ de tampão RCM (Ureia 8M, Tris 360mM, EDTA 3,2mM, a pH 8,6) . Carregou-se entre 30-40 pg de anticorpo num poço contendo 10 μΐ de tampão RCM. O liquido no poço escoou através da membrana por aplicação de vácuo e em seguida lavou-se a membrana duas vezes com 50 μΐ de tampão RCM. Realizou-se a redução das pontes de di-sulfureto por adição de 50 μΐ de ditiotreitol 0,1M em RCM e fez-se a incubação a 37 °C durante 1 h.
No seguimento da redução, aplicou-se vácuo para eliminar a solução de ditiotreitol dos poços. Lavaram-se os poços três vezes com 300 μΐ de água antes de realizar a carboximetilação dos resíduos de cisteína por adição de 50 μΐ de ácido iodoacético 0,1M em tampão de RCM e a incubação à temperatura ambiente no escuro durante 30 min.
Depois da carboximetilação, despejaram-se os poços por meio de vácuo e em seguida lavaram-se três vezes com 300 μΐ de água. A membrana de PVDF foi então bloqueada para evitar a adsorção da endoglicosidase, por meio da incubação de 100 μΐ de uma solução aquosa a 1 % de polivinilpirrolidona 360 à temperatura ambiente durante 1 hora. Eliminou-se então o reagente de bloqueio por meio de um vácuo ligeiro seguido de três lavagens com 300 μΐ de água.
Os oligossacáridos ligados a N foram libertados por adição de 2,5 mU de péptido-N-glicosidase F (N-Glycanase recombinate, GLYKO, Novato, CA) e 0,1 um de Sialidase (GLYKO, Novato, CA), para eliminar quaisquer resíduos potenciais carregados de monossacáridos, num volume final 153 de 25 μΐ em NaHCC>3 20mM, pH 7,0) . Realizou-se a digestão durante 3 horas a 37 °C.
Processo de libertação de oligossacáridos para anticorpos em solução
Misturou-se entre 40 e 50 yg de anticorpo com 2,5 mU de PNGaseF (Glyko, E.U.A.) em Tris 2 mM, a pH 7,0 num volume final de 25 microlitros e incubou-se a mistura durante 3 horas a 37 °C.
Utilização da digestão de endoglicosidase H dos oligossacáridos libertados de PNGaseF para a atribuição das estruturas de oligossacáridos híbridos bifurcados com os picos dos oligossacáridos neutros de MALDI/TOF-EM
Os oligossacáridos libertados de PNGaseF foram em seguida digeridos com endoglicosidase H (EC3.2.1.96). Para a digestão de EndoH, adicionou-se 15 mU de EndoH (Roche, Suíça) ao produto da digestão de PNGaseF (anticorpo em solução do processo anterior) para se obter um volume final de 30 microlitros e fez-se a incubação da mistura durante 3 horas a 37 °C. EndoH cliva entre os resíduos de N- acetilglucosamina do núcleo da chitobiose dos oligossacáridos ligados a N. A enzima pode apenas digerir oligomanose e a maior parto dos glicanos do tipo híbrido, enquanto os oligossacáridos do tipo complexo não estão hidrolisados.
Preparação da amostra para MALDI/TOF-EM
Os produtos da digestão enzimática contendo os oligossacáridos libertados foram incubados durante mais 3 h à temperatura ambiente depois da adição de ácido acético 154 até a uma concentração final de 150 mM e passaram em seguida através de 0,6 ml de uma resina permutadora de catiões (resina AG50W-X8, forma de hidrogénio, 100-200 mesh, BioRad, Suiça) armazenada numa coluna de cromatografia de micro-bio-spin (BioRad, Suiça) para eliminar catiões e proteínas. Aplicou-se um microlitro da amostra resultante a uma placa-alvo de aço inoxidável e misturou-se na placa com 1 μΐ de uma matriz de sDHB. Preparou-se a matriz de sDHB dissolvendo 2 mg de ácido 2,5-di-hidroxibenzóico mais 0,1 mg de ácido 5-metoxisalicilico em 1 ml de etanol/cloreto de sódio aquoso 10 mM a 1:1 (v/v) . Secaram-se as amostras ao ar, aplicou-se 0,2 μΐ de etanol e finalmente deixaram-se as amostras recristalizarem ao ar.
MALDI/TOF-EM O espectrómetro de massa de MALDI-TOF utilizado para obter o espectro de massa foi um Voyager Elite (Perspective Biosystems). O instrumento foi utilizado com uma configuração linear, com uma aceleração de 20 kV e um atraso de 80 ns. Utilizou-se uma calibração externa com padrões de oligossacáridos para a atribuição da massa dos iões. Os espectros resultantes de 200 disparos de laser foram somados para se obter o espectro final.
Depleção das células B de sangue completo
Repartiu-se em alíquotas 495 μΐ de sangue heparinizado de um dador saudável em tubos de poliestireno de 5 ml, adicionaram-se amostras de 5 μΐ de anticorpo concentrado 100 vezes (1-1000 ng/ml de concentração final) ou apenas SBF e incubaram-se os tubos a 37 °. Passadas 24 h, transferiu-se 50 μΐ de sangue para um tubo fresco e corou- 155 se com anti-CD3-FITC, anti-CD19-PE e anti-CD45-CyChrome (Becton-Dickinson) durante 15 min à temperatura ambiente, no escuro. Antes da análise, adicionou-se 500 μΐ de tampão de SCAF (SBF contendo FCS a 2% e EDTA 5 mM) aos tubos. A fluorescência de CD3-FITC e de CD19-PE das amostras de sangue foi analisada por citometria de fluxo estabelecendo-se um limite no CD45-CyChrome. Determinou-se a depleção das células B fazendo um gráfico relacionando as células B CD19+ com as células T CD3+.
Ligação de anticorpos anti-CD20 a células de Raji
Transferiram-se 500.000 em 180 μΐ de tampão de SCAF (SBF contendo FCS a 2% e EDTA 5mM) para tubos de poliestireno de 5 ml e adicionaram-se amostras de 20 ul de anticorpos anti-CD20 concentrado 10 vezes (1-5000 ng/ml de concentração final) ou adicionou-se apenas SBF e incubaram-se os tubos a 4 °C durante 30min. Em seguida, lavaram-se as amostras duas vezes com tampão de SCAF e transformaram-se em péletes a 300 x g durante 3min. Aspirou-se o sobrenadante e retiraram-se as células em 100 Φ1 de tampão de SCAF e adicionou-se 1 μΐ de fragmentos de F(ab')2-FITC específicos anti-Fc (Jackson Immune Research Laboratories, EUA) e incubaram-se os tubos a 4 °C durante 30min. Lavaram-se as amostras duas vezes com tampão de SCAF e recolheram-se em 500 μΐ de tampão de SCAF contendo 0,5 pg/ml de PI para análise por citometria de fluxo. Determinou-se a ligação fazendo um gráfico da média geométrica da fluorescência em função das concentrações de anticorpo. EXEMPLO 2
Abordagem do receptor com elevada homologia 156 A pesquisa do sistema do receptor do anticorpo com elevada homologia foi realizada alinhando as sequências da proteína de B-Lyl de murganho com uma colecção de sequências de linhas germinais humanas e recuperando a sequência humana que exibir a mais elevada identidade de sequência. Aqui, a sequência de VP1_10 da base de dados VBase foi escolhida como a sequência do receptor do sistema de cadeia pesada e a sequência VK_2_40 foi escolhida por ser o aceitador do sistema para a cadeia leve. Nestes dois sistemas aceitadores, enxertaram-se as três regiões de determinação de complementaridade (RDCs) dos domínios variáveis pesados e leves de murganho. Dado que a região 4 do sistema não faz parte da região variável do gene V da linha germinal, o alinhamento para essa posição foi feito individualmente. A região JH4 foi escolhida para a cadeia pesada e a região JK4 foi escolhida para a cadeia leve. A modelação molecular do domínio designado da imunoglobulina revelou um sítio a requerer potencialmente resíduos de aminoácidos de murino em vez de aminoácidos humanos externos à RDC. A re-introdução dos resíduos de aminoácidosde murino no sistema humano irá gerar as chamadas mutações reversas. Por exemplo, o resíduo de aminoácido do receptor humano na posição 27 de Kabat foi mutado de forma reversa para um resíduo de tirosina. As variantes humanizadas do anticorpo foram concebidas quer incluindo quer omitindo as mutações reversas. A cadeia leve do anticorpo humanizado não requer quaisquer mutações reversas. Depois de se terem concebido as sequências de proteína, sintetizaram-se as sequências de ADN que codificam estas proteínas tal como se detalha a seguir. 157
Abordagem do sistema misto
Para evitar a introdução de mutações reversas em posições criticas dos resíduos de aminoácidos (critico para reter uma boa afinidade de ligação ao antigénio ou as funções do anticorpo) do sistema receptor humano, investigou-se se toda a região 1 do sistema (RS1) ou as regiões 1 (RS1) e 2 (RS2) do sistema, em conjunto, podem ser substituídas por sequências de anticorpos humanos tendo já residuos de dador ou os seus equivalentes funcionais, nessas posições importantes na sequência da linha germinal humana natural. Com esta finalidade, os sistemas 1 e 2 de VP da sequência Blyl de murganho foram alinhados individualmente com as sequências da linha germinal humana. Aqui, a mais alta identidade de sequência não é importante e não foi utilizada para escolher sistemas receptores, mas em vez disso o emparelhamento de vários residuos críticos foi assumido como sendo mais importante. Esses residuos críticos compreendem os resíduos 24, 71 e 94 (numeração de Kabat) e também os resíduos nas posições 27, 28 e 30 (numeração de Kabat) , que caem fora da definição da RDC1 dada por Kabat, mas muitas vezes estão envolvidas na ligação do antigénio. A sequência VH_3_15 de IMGT foi escolhida como apropriada. Depois de se terem concebido as sequências de proteína, sintetizaram-se as sequências de ADN que codificam estas proteínas tal como se detalha a seguir. Utilizando esta abordagem não são necessárias mutações reversas nem para a cadeia leve nem para a cadeia pesada, de modo a reter bons níveis de ligação ao antigénio. 158 Síntese dos genes do anticorpo
Depois de ter concebido a sequência de aminoácidos para a região V do anticorpo humanizado, a sequência de ADN tinha de ser gerada. Os dados da sequência de ADN das regiões individuais do sistema foram encontrados nas bases de dados para as sequências das linhas germinais humanas. A sequência de ADN das regiões RDC foi retirada dos correspondentes dados de ADNc de murino. Com estas sequências, toda a sequência de ADN estava virtualmente montada. Tendo estes dados da sequência de ADN, introduziram-se os sítios de restrição de diagnóstico na sequência virtual, introduzindo mutações silenciosas, criando sítios de reconhecimento para as endonucleases de restrição. Para se obter a cadeia física do ADN, realizou-se a síntese do gene (por exemplo, Wheeler et al. 1995) . Neste processo, os oligonucleótidos foram concebidos a partir dos genes de interesse, de tal modo que uma série de oligonucleótidos deriva do filamento de codificação e uma outra série deriva do filamento que não codifica. As extremidades 3' e 5' de cada oligonucleótido (excepto o primeiro e o último na fila) mostram sempre sequências de complementaridade com dois iniciadores derivados do filamento oposto. Quando se colocam estes oligonucleótidos num tampão de reacção apropriado para qualquer polimerase estável ao calor e adicionando Mg2+, dNTPs e uma polimerase de ADN, cada oligonucleótido prolonga-se a partir da sua extremidade 3'. A extremidade 3', recentemente formada, do primeiro iniciador que hibrida com o iniciador seguinte do filamento oposto e prolongando mais a sua sequência em condições apropriadas para a elongação da cadeia de ADN dependente da matriz. 0 produto final foi clonado num vector convencional para a propagação em E. coli. 159
Produção do anticorpo
As sequências lideres humanas, de cadeia pesada e de cadeia leve (para a secreção) foram adicionadas a montante das anteriores sequências de reqiões variáveis e foram acopladas a montante das sequências de cadeia pesada e de cadeia leve da constante kapa da IgGl humana respectivamente, utilizando técnicas normalizadas de biologia molecular. As sequências completas de ADN de cadeia pesada e de cadeia leve do anticorpo foram subclonadas nos vectores de expressão de mamifero (um para a cadeia leve e um para a cadeia pesada) sob o controlo do promotor MPSV e a montante de um sitio sintético de poliA, comportando cada vector uma sequência de EBVOriP, tal como descrito no exemplo 1 anterior. Os anticorpos foram produzidos tal como descrito no exemplo 1 anterior, nomeadamente co-transfectando HEK293-EBNA com os vectores de expressão de cadeia leve e de cadeia pesada do anticorpo de mamífero, colhendo o meio de cultura condicionado 5 a 7 dias após a transfecção e purificando os anticorpos segregados por cromatografia de afinidade da proteína A, seguida de cromatografia de permuta de catiões e uma etapa final de cromatografia por exclusão da dimensão para isolar anticorpos monoméricos puros de IgGl. Os anticorpos foram formulados em fosfato de potássio 25 mM, cloreto de sódio 125 mM, solução de glicina 100 mM a pH 6,7. As variantes glicosiladas por engenharia das variantes de anticorpos humanizados foram produzidas por co-transfecção dos vectores de expressão do anticorpo em conjunto com vectores de expressão de GnT-III glicosiltransferase ou em conjunto com os vectores de expressão de GnT-III mais um vector de expressão de manosidase II de Golgi, tal como descrito para o anticorpo quimérico no exemplo 1 anterior. Os anticorpos glicosilados por engenharia foram purificados e formulados 160 tal como descrito antes para os anticorpos não glicosilados por engenharia. Os oligossacáridos ligados à região Fc dos anticorpos foram analisados por MALDI/TOF-EM tal como se descreve a seguir.
Análise de oligossacáridos
Processo de libertação de oligossacáridos para anticorpos em solução. Misturou-se entre 40 e 50 yg de anticorpo com 2,5 mU de PNGaseF (Glyko, E.U.A.) em Tris 2 mM, a pH 7,0 num volume final de 25 microlitros e incubou-se a mistura durante 3 horas a 37 °C.
Preparação da amostra para MALDI/TOF-EM
Os produtos da digestão enzimática contendo os oligossacáridos libertados foram incubados durante mais 3 h à temperatura ambiente depois da adição de ácido acético até a uma concentração final de 150 mM e passaram em seguida através de 0,6 ml de uma resina permutadora de catiões (resina AG50W-X8, forma de hidrogénio, 100- 200 mesh, BioRad, Suíça) armazenada numa coluna de cromatografia de micro-bio-spin (BioRad, Suiça) para eliminar catiões e proteínas. Aplicou-se um microlitro da amostra resultante a uma placa-alvo de aço inoxidável e misturou-se na placa com 1 μΐ de uma matriz de sDHB. Preparou-se a matriz de sDHB dissolvendo 2 mg de ácido 2,5-di-hidroxibenzóico mais 0,1 mg de ácido 5-metoxisalicílico em 1 ml de etanol/cloreto de sódio aquoso 10 mM a 1 : 1 (v/v) . Secaram-se as amostras ao ar, aplicou-se 0,2 μΐ de etanol e finalmente deixaram-se as amostras recristalizarem ao ar. 161
MALDI/TOF-EM O espectrómetro de massa de MALDI-TOF utilizado para obter o espectro de massa foi um Voyager Elite (Perspective Biosystems). 0 instrumento foi utilizado com uma configuração linear, com uma aceleração de 20 kV e um atraso de 80 ns. Utilizou-se uma calibração externa com padrões de oligossacáridos para a atribuição da massa dos iões. Os espectros de 200 disparos de laser foram somados para se obter o espectro final.
Ensaio de ligação do antigénio
As variantes de anticorpo monomérico, humanizado, purificado foram ensaiadas quanto à ligação a CD20 humana em células-alvo de linfoma de células B de Raj i utilizando um ensaio à base de citometria de fluxo, tal como descrito antes para o anticorpo quimérico B-Lyl no exemplo 1.
Ligação de variantes glicosiladas de IgGl monoméricas a linhas de NA e linhas de células de OHC que expressam FcyRIIIA
Isolaram-se células AN humanas a partir de células mononucleares de sangue periférico (CMSP) recentemente isoladas, aplicando um enriquecimento de selecção negativa para as células positivas a CD16 e CD56 (sistema MACS, Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach/Alemanha). A pureza determinada pela expressão de CD56 situou-se entre 88-95 %. As células AN recentemente isoladas foram incubadas em SBF sem iões de cálcio nem de magnésio (3 x 105 células/ml) durante 20 minutos a 37°C para eliminar a IgG associada às células NA. Incubaram-se as células a 106 células/ml a diferentes concentrações de anticorpo anti-CD20 (0, 0,1, 162 0,3, 1, 3,10 yg/ml) em SBF, ASB a 0,1 %. Depois de várias lavagens detectou-se a ligação do anticorpo foi detectado por incubação com 1:200 de F(ab')2 de cabra anti-humano conjugado com FITC, IgG especifica de F(ab')2 (Jackson ImmunoReasearch, West Grove, PA/EUA) e CD56-PE anti-humano (BD Biosciences, Allschwil/Suiça). Os fragmentos 3G8F(ab')2 anti-FcgammaRIIIA (Ancell, Bayport, MN/EUA) foram adicionados a uma concentração de 10 yg/ml para concorrer com a ligação das variantes de glicosilação do anticorpo (3 yg/ml). A intensidade da fluorescência relativa às variantes do anticorpo de ligação foi determinada para as células positivas para CD56 num FACSCalibur (BD Biosciences, Allschwil/Suiça). As células de OHC foram transfectadas por electroporação (280 V, 950 yF, 0,4 cm) com um vector de expressão que codifica para a cadeia cx e a cadeia γ de FcgammaRIIIA-Vall58. Os transfectantes foram seleccionados por adição de 6 yg/ml de puromicina e analisaram-se os clones estáveis por SCAF utilizando 10 μΐ do anticorpo monoclonal FcgammaRIII 3G8 anti conjugado de FITC (BD Biosciences, Allschwil/Suiça) para 106 células. A ligação de IgGl às células de OHC que expressam FcgammaRIIIA-Vall58 foi feita de maneira análoga à ligação das células NA descrita antes.
Ensaio de CCDA
Utilizaram-se células mononucleares de sangue periférico (CMSP) como células efectoras e prepararam-se utilizando Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, M063178 EUA) e seguindo praticamente as instruções do fabricante. Em resumo, colheu-se sangue venoso com seringas heparinizadas de voluntários. Diluiu-se o sangue a 1:0,75-1,3 com SBF (não contendo Ca++ ou Mg++) e dispôs-se em camadas em Histopaque-1077. Centrifugou-se o gradiente a 163 400 x g durante 30 min à temperatura ambiente (TA) sem quebras. Lavou-se a interfase contendo as CMSP com SBF (50 ml para as células dos dois gradientes) e colheu-se por centrifugação a 300 x g durante 10 minutos à TA. Depois de uma nova suspensão dos péletes com SBF, contaram-se as CMSP e lavaram-se uma segunda vez por centrifugação a 200 x g durante 10 minutos à TA. As células foram então novamente suspensas no meio apropriado para os processos subsequentes. A relação utilizada entre o efector e o alvo para o ensaio de CCDA foi de 25:1 e de 10:1 para as CMSP e AN, respectivamente. As células efectoras foram preparadas em meio AIM-V a uma concentração apropriada de modo a adicionar 50 μΐ por poço das placas de 96 poços de fundo redondo. As células-alvo foram células B de linfoma humano (por exemplo, células de Raji) que cresceram em DMEM contendo 10 % de FCS. Lavaram-se as células-alvo em SBF, contaram-se e suspenderam-se novamente em AIM-V a 0,3 milhões por ml de modo a adicionar 30.000 células em 100 μΐ por micro-poço. Diluiram-se os anticorpos em AIM-V, adicionou-se 50 μΐ à células-alvo pré-postas em placa e deixou-se ligarem-se aos alvos durante 10 minutos à TA. Depois adicionam-se as células efectoras e faz-se a incubação das placas durante 4 horas a 37 °C em atmosfera humidificada contendo CO2 a 5 %. Avaliou-se a morte das células-alvo medindo o lactato-desidrogenase (LDH) libertado a partir de células danificadas utilizando o estojo de detecção de citotoxicidade (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Suiça). Passadas 4 horas de incubação, centrifugaram-se as placas a 800 x g. Transferiu-se 100 μΐ de sobrenadante de cada poço para uma nova placa de 96 poços de fundo redondo e transparente. Adicionou-se a cada poço 100 μΐ de tampão do substrato corado do estojo. Os 164 valores de Vmax da reacção da cor foram determinados num leitor de ELISA a 490 nm durante pelo menos 10 min utilizando o programa de computador SOFTmax PRO (Molecular Devices, Sunnyvale, CA94089, EUA) . Mediu-se a libertação espontânea de LDHa partir dos poços contendo apenas células-alvo e células efectoras mas sem anticorpos. Determinou-se a libertação máxima a partir dos poços contendo apenas células-alvo e Triton X-100 a 1 %. A percentagem de células mortas por mediação do anticorpo especifico foi calculada como se segue: ((x-LE)/(LM-LE) *100, em que x representa a média de Vmax a uma concentração especifica do anticorpo, LE representa a média de Vmax da libertação espontânea e LM representa a média de Vmax da libertação máxima.
Ensaio de citotoxicidade dependente do complemento
Contaram-se as células-alvo, lavaram-se com SBF, voltaram a suspender-se em AIM-V (Invitrogen) a 1 milhão de células por ml. Colocaram-se em placa 50 μΐ de células por poço numa placa de 96 poços de fundo redondo. Prepararam-se as diluições do anticorpo em AIM-V e adicionou-se 50 μΐ às células. Deixou-se os anticorpos ligarem-se às células durante 10 minutos à temperatura ambiente. Descongelou-se complemento de soro humano (Quidel), diluiu-se 3 vezes com AIM-V e adicionou-se em 50 μΐ aos poços. Preparou-se complemento de coelho (Cedarlane Laboratories) tal como descrito pelo fabricante, diluiu-se 3 vezes com AIM-V e adicionou-se em 50 μΐ aos poços. Como controlo, aqueceram-se fontes de complemento durante 30 min a 56 °C antes da adição ao ensaio. Incubaram-se as placas de ensaio durante 2h a 37 °C. Determinou-se a morte das células medindo a libertação de LDH. Em resumo, centrifugaram-se as placas a 300 x g durante 3 min. Transferiu-se 50 μΐ de sobrenadante 165 por poço para uma nova placa de 96 poços e adicionou-se 50 μΐ do reagente de ensaio do estojo de citotoxicidade (Roche). Uma medição cinética com o leitor de ELISA determinou o Vmax correspondendo à concentração de LDH no sobrenadante. Determinou-se a libertação máxima por incubação das células na presença de Trition X-100 a 1 %.
Ensaio de depleção das células B em sangue completo
Realizou-se a depleção de células B normais em sangue completo por meio de anticorpos anti-CD20 tal como descrito no exemplo 1 anterior.
Ensaio da apoptose
Avaliou-se a potência apoptótica dos anticorpos por incubação do anticorpo a 10 yg/ml (condições de saturação no que respeita à ligação do antigénio) com as células-alvo (a uma concentração de células-alvo de 5 x 105 células/ml) durante a noite (16-24 h). Coraram-se as amostras com AnnV-FITC e analisou-se por SCAF. O ensaio foi feito em triplicado. A detecção realiza-se por citometria de fluxo no seguimento do aparecimento de marcadores apoptóticos como anexina V e fosfatidil-serina. O controlo negativo (sem apoptose induzida) não contém qualquer anticorpo, mas apenas solução salina tamponada com fosfato. O controlo positivo (apoptose máxima) contém 5 micromolar do indutor forte de apoptose camptotecina (CPT). 166
Resultados e discussão
Comparação da ligação ao antigénio humano de CD20 das variantes de anticorpo B-HH1, B-HH2, B-HH3, quer complexados com a cadeia leve quimérica de B-Lyl (mVL, tal como descrito no exemplo 1 anterior) ou com a cadeia leve quimérica de B-Lyl (KV1) e o anticorpo quimérico, parental B-Lyl qu. (descrito no exemplo 1 anterior) mostra que todos os anticorpos têm um valor de CE50 similar, mas a estrutura de B-HH1 liga-se a uma intensidade/estequiometria inferior às das variantes B-HH2 e B-HH3 (figura 11) . B-HHl pode distinguir-se de B-HH2 e de B-HH3 pelas suas regiões RDC1 e RDC2 parcialmente humanas (definição de Kabat), assim como o polimorfismo de Ala/Tre na posição 28 (numeração de Kabat) . Isto indica que qualquer uma das posições 28, a RDCl completa e/ou a RDC2 completa são importantes para a interacção anticorpo/antigénio. A comparação de B-HL1, B-HHl e do anticorpo parental quimérico B-Lyl qu. mostrou a ausência de qualquer actividade de ligação na estrutura de B-HL1 e cerca de metade da intensidade/estequiometria de B-HHl comparada com a de B-lyl (figura 12) . Tanto B-HL1, assim como B-HHl, foram concebidos com base nas estruturas aceitadoras derivadas da classe VH1 humana. Entre outras diferenças, a posição 71 (numeração de Kabat; a posição 71 de Kabat corresponde à posição 72 da SEQ ID NO.: 48) da estrutura de B-HL1 tem uma diferença impressionante, indicando a sua potencial importância para a ligação ao antigénio.
Quando se comparam os dados da ligação do antigénio das figuras 9 a 13, as variantes BHH2-KV1, BHLB-KV1 e BHL11-KV1 mostram a melhor actividade de ligação, entre as diferentes variantes humanizadas do anticorpo, em relação a 167 CD20 humano na superfície das células humanas. As diferenças entre B-HH2, por um lado e B-HL8 e B-HL11 por outro lado, estão localizadas apenas nas regiões RS1 e RS2, sendo idênticas as três RDCs (comparar, por exemplo, as SEQ ID NOs: 32, 56 e 60, que não estão numeradas de acordo com Kabat, mas cuja numeração de Kabat pode ser facilmente determinada por um especialista na matéria). B-HL8 e B-HL11 têm as suas sequências de RS1 e RS2 derivadas da classe VH3 humana, enquanto o sistema completo de B-HH2 é um derivado de VH1 humano. B-HL11 é um derivado de B-HL8 com uma única mutação de GlulGln (a posição 1 é a mesma tanto na numeração de Kabat como no sistema de numeração convencional utilizado na lista de sequências), sendo Gin o resíduo de aminoácido na estrutura de B-HH2. Isto significa que a permuta de GlulGln não altera a afinidade de ligação nem a sua intensidade. As outras diferenças entre B-HH2 e B-HL8 são 14 resíduos do sistema, dos quais um ou mais irão influenciar o comportamento de ligação ao antigénio deste anticorpo. A estrutura de B-HL4 deriva do anticorpo B-HH2 por substituição de RS1 de B-HH2 pela sequência da linha germinal humana VH1_45. Esta estrutura mostra uma capacidade de ligação ao antigénio muitíssimo diminuída, apesar de ter diferentes aminoácidos apenas em três posições dentro de RS1. Estes resíduos estão localizados nas posições 2, 14 e 30 (numeração de Kabat) . Destas, a posição 30 pode ser uma posição influente, dado que faz parte da definição de Chothia de RDC1. A análise global de todas as curvas de ligação das figuras 9 a 13 indica que os resíduos de cadeia pesada de B-Lyl humanizado (numeração de Kabat) são importantes para a ligação a CD20: N35 (extremidade da RDC1 de Kabat), RDC1 completa de Kabat, RDC2 completa de Kabat e RDC3 completa de Kabat, resíduos 168 Α71 e R94 (neste caso R94 não pode ser substituído por uma treonina) e Y27. A28 e S30 também contribuem mas em menor grau. Além disso, RDC3 de Kabat e todos os resíduos canónicos são importantes para a ligação ao antigénio. Não foram introduzidas mutações reversas na cadeia leve humanizada, que tem enxertadas as RDC1, RDC2 e RDC3 completas de Kabat. Na indução da apoptose (figuras 14, 15 e 21), a variante mais potente foi a variante de B-Lyl humanizado BHH2-KV1 (ainda mais potente do que o B-Lyl quimérico original e muito mais potente do que um anticorpo com uma sequência idêntica a rituximab, C2B8). Outras variantes humanizadas (derivados de BHL8) que podem recuperar a apoptose aumentada são: B-HL12 a B-HL17 (ver quadro) e BHH8 (sistemas mistos) e BHH9 ("sistemas mistos" com uma mutação reversa, S30T). As posições 9 e 48 (numeração de Kabat) podem contactar o antigénio. As variantes BHH4 a BHH7 são outras variantes de B-Lyl humanizado que não introduzem sequências adicionais não humanas.
Propriedades importantes do anticorpo B-Lyl humanizado são ao do anticorpo anti-CD20 do tipo II tal como definido em Cragg, M. S. e Glennie, M. J., Blood 103 (7): 2738-2743 (Abril 2004). Por isso não induziu, após a ligação a CD20, qualquer resistência significativa à extracção de detergente não iónico de CD20 a partir da superfície de células humanas CD20+, utilizando o ensaio descrito para este fim em Polyak, M. J. e Deans, J. P., Blood 99 (9): 3256-3262 (2002). Na verdade induziu uma resistência menos significativa à extracção de detergentes não iónicos de CD20 do que o anticorpo C2B8 (outro anticorpo anti-CD20 com uma sequência idêntica a rituximab, (ver a pub. da pat. U.S. No. 2003 0003097 para Reff) . Tal como esperado de um anticorpo anti-CD20 do tipo II, B-Lyl humanizado não teve 169 qualquer actividade significativa de lise mediada pelo complemento e certamente uma maior actividade de lise mediada pelo complemento do que o anticorpo anti-CD20 C2B8 (IgGl quimérica com uma sequência idêntica a rituximab). Uma outra propriedade importante do anticorpo B-Lyl humanizado consiste no facto de ser muito potente no ensaio de agregação homotípica. Neste ensaio, as células humanas positivas a CD20, as células de Daudi, foram incubadas em meio de cultura de células durante até 24 horas a 37 °C em atmosfera de CO2 a 5 % numa incubadora de células de mamifero tal como descrito em detalhe (referência de Deans), com o anticorpo a uma concentração de 1 micrograma por ml e, em paralelo, a uma concentração de 5 microgramas por ml. Como comparação, controlo, fez-se uma incubação paralela das células em condições idênticas mas utilizando o anticorpo C2B8 anti-CD20. Em momentos diferentes, incluindo 8 horas e 24 horas de incubação, fez-se uma inspecção visual das células utilizando um microscópio. Verificou-se que o anticorpo B-Lyl humanizado levou a uma forte agregação homotipica, sendo os agregados significativamente maiores do que os induzidos por adição do anticorpo de controlo C2B8. Além disso, e consistente com o facto de o anticorpo ser anti-CD20 do tipo II, induziu niveis mais elevados de apoptose quando as células humanas positivas a CD20 foram incubadas com o anticorpo humanizado B-Lyl, relativamente a um controlo em condições idênticas utilizando o anticorpo quimérico de IgGl, C2B8, com uma sequência idêntica à de rituximab.
As variantes dos anticorpos humanizados, glicosilados por engenharia, foram produzidas por co-expressão de glicosiltransferase de GnTIII, em conjunto com os genes do anticorpo, em células de mamíferos. Isto levou a um aumento da fracção de oligossacáridos não fucosilados ligados à 170 região Fc dos anticorpos, incluindo oligossacáridos não fucosilados bifurcados, tal como já foi descrito na WO 2004/065540 (figuras 17-19). Os anticorpos glicosilados por engenharia tinham níveis de ligação aos receptores humanos FcgammaRIII (figura 20) significativamente mais elevados, assim como a actividade de CCDA (figura 16), relativamente ao anticorpo não glicosilado por engenharia e relativamente ao anticorpo C2B8. O anticorpo humanizado B-Lyl foi também mais potente na indução da depleção de células B humanas num ensaio com sangue completo (figura 16) do que o anticorpo de controlo C2B8. Isto foi verdade tanto para o anticorpo B-Lyl não glicosilado por engenharia como para a versão glicosilada por engenharia. O anticorpo glicosilado por engenharia foi aproximadamente 1000 vezes mais potente do que o anticorpo de controlo anti-CD20, C2B8, na depleção de células B num ensaio com sangue completo. Esta comparação é importante tanto para as formas humanizadas não glicosiladas por engenharia como para as glicosiladas por engenharia do anticorpo B-Lyl, porque mostrou que em ensaios que combinam actividades dependentes do receptor Fc, tal como CCDA, mais a lise mediada pelo complemento, mais a indução da apoptose, sendo ambas essas formas de B-Lyl significativamente mais potentes do que C2B8, embora ambas as formas de B-Lyl tenham uma actividade de lise, mediada pelo complemento, dramaticamente mais baixa. A CCDA, as actividades de morte das células dependente do receptor Fc e a indução da apoptose estavam presentes nesta actividade superior das variantes do anticorpo humanizado B-Lyl. Além disso, no ensaio da apoptose, tanto as formas glicosiladas por engenharia como as não glicosiladas do anticorpo anti-CD20 do tipo II foram potentes, com as variantes tratadas por engenharia com Fc com uma afinidade acrescida para os receptores de Fcgamma sendo ainda mais potentes na indução da apoptose do que a variante não 171 tratada por engenharia com Fc e sendo todas as variantes significativamente mais potentes do que o anticorpo de controlo. 0 mecanismo exacto para um aumento da agregação homotipica e a indução da apoptose mediada por anticorpos anti-CD20 do tipo II não é conhecido e, concomitante, a ligação a outras moléculas na superfície das células positivas a CD20, tal como receptores gama de Fc, pode influenciar esta propriedade importante. Foi por isso importante demonstrar que os anticorpos anti-CD20 do tipo II que tinham sido tratados por engenharia na sua região Fc, para uma afinidade de ligação aumentada para os receptores gama de Fc, incluindo FcgammaRIII e com a actividade associada de CCDA aumentada, ainda eram capazes de induzir uma apoptose forte, ainda maior do que a dos não tratados por enqenharia não com Fc e induzir uma agregação homotipica. A indução da apoptose é importante tanto in vivo, como as localizações no corpo em que as células-alvo positivas a CD20 podem ser encontradas, mas como o acesso a células positivas a FcgammaRIII é mais difícil do que no sangue, essas localizações são, por exemplo, nódulos linfáticos. Nessas localizações, a indução da apoptose pelo próprio anticorpo anti-CD20 pode ser crucial para uma boa eficácia da terapia do anticorpo anti-CD20 em seres humanos, tanto para o tratamento de condições hematológicas malignas tal como linfomas não de Hodgkins e leucemia linfocítica crónica das células B e para o tratamento de doenças autoimunes tal como artrite reumatóide e lúpus, por via da abordagem da depleção das células B. A afinidade de ligação aumentada a FcgammaRIII e uma CCDA maior do anticorpo humanizado anti-CD20 do tipo II tratado por engenharia com Fc também pode ser um atributo muito importante para essas terapias. Finalmente, a actividade de lise, mediada pelo complemento, reduzida ou negligenciável, destes anticorpos anti-CD-20 do tipo II, incluindo as 172 variantes humanizadas tratadas por engenharia de Fc, podem também ser uma importante activação do complemento mais elevada por anticorpos anti-CD20 têm estado correlacionada com um aumento de efeitos secundários indesejáveis.
LISTA DE SEQUÊNCIAS
<110> GlycArt Biotechnology AG
Umana, Pablo
Bruenker, Peter
Suter, Tobias
Puentener, Ursula
Moessner, Ekkehard
Ferrara, Claudia <120> Moléculas de ligação ao antigénio com uma afinidade acrescida de ligação ao receptor Fc e uma função efectora aumentada <130> 1975.029PC01 <160> 78 <170> Patentin versão 3.3 <210> 1 <211> 112 <212> PRT <213> Mus sp. <4 0 0> 1 173
Gly Pro Glu X>eu Vai Lys Pro Gly Ala Ser Vai Lys Ile Ser Cys Lys 3. 5 10 15 ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser Trp Met Asr< Trp Vai Lys Leu 20 35 30
Ar9 Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie Glv Arg lie Phe Pro Oly RSp 35 40 45
Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr 50 55 S0
Ala Asp Lys ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gin Leu Thr Ser Leu Thr 55 70 75 30
Ser Vai Asp Ser Ala Vai Tyr Leu Cys Ala Arg Asn Vai Phe Asp Gly 85 50 9S
Tyr Trp Leu vai Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu vai Thr Vai Ser Ala 100 105 110 <212> ADN <213> Mus sp. <400> 2 ggaectgaac tggtgaagcc tggggeetea gtgaagattt cetgeaaago t tetggctae 50 gcafcteagtt actcttggao gaacrgggtg aaactgaggc ctggacaggg tcttgagtgg 130 attggaegga tttttectgg agatggggat actgaceaca atgggaaatt eaagggeaag .180 gceacacfcga cfcgctgacaa atecfcecaac aeagcctaca tgeaaeteac cageetgace 240 fcctgtggact cfcgcggfccta tttatgtgca ag&aatgtct Ctgatggtta cfcggfcfcagtt 300 taccggggcc aagggactct ggtcactgte Cctgca 336 <210> 3 <211> 103 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 3 174
Asn Pro Vai Thsr Leu Gly Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser 15 10 15
Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu 20 25 30
Gin Lvs Pro Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Gin Met Ser Asn 35 40 45
Leu Vai Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr 50 55 é0
Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai 65 70 75 80
Tyr Tyr Cys Ala Gin Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly 85 90 95
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 120 180 240 300 308 catagfcaatg gcatcactta tttgcatcgg tatccgcaga agccaggcca gtoccctcag ctcctgattt atcagatgtc caaccttgtc tcaggagccc cagacaggtt cagtagcagt gggteaggaa. etgatttcac actgagaatc agcagagcgg aggctgagga tgtgggfcgtt tattactgfcg ctcaaaatcc, agaaetteeg tacacgt.tcg gaggggggac caagetggaa ataaaacgg <210> 5 <211> 15 <212> ADN <213> Mus sp. <400> 5 tactcttgga tgaac 15 <210> 6 <211> 18 <212> ADN <213> Mus sp. 175 <4 Ο 0> 6 ggcta< sgcat tcagttac <210> 7 <211> 30 <212> ADN <213> Mus sp. <4 0 0> 7 ggcta< sgcat tcagttactc <210> 8 <211> 48 <212> ADN <213> Mus sp. <4 0 0> 8 aggtctagta agagtctcct <210> 9 <211> 21 <212> ADN <213> Mus sp. <4 0 0> 9 cagatgtcca accttgtctc <210> 10 <211> 27 <212> ADN <213> Mus sp. <4 0 0> 10 21 30 48 gctcaaaatc tagaacttcc gtacacg 27 176 <210> 11
<211> 1407 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> ADNc quimérico de murganho-humano <400> 11 atgggttsjga gcctcatctt gcfccttcctt gtcgctgttg ceacgcgtgt cctgtccgag 60 gteaagctgc agcagtctgg acctgaactg gtgaagcctg gggccfccagt gaagatttcc 120 tgcaaagctt etggctacgc attcagfefeac tcfctggafcga actgggfcgaa actgaggcct ISO ggacagggtc ttoagtgeat: tggacggart ttfccctggag atggggatac tgactãcaat 240 gggaaatfcca agggcaaggc eacactgact gctgaeaaat cctccaaeac agectaeafcg 300 caacteacca gcctgacctc tgcggactct gcggtetatt tatgtgcaag aaatgfcctfct 360 gafcggttaet ggttagtcta ctggggccaa gggactctgg teactgtctc tgcagctagc 420 accaaçggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcea agagcacctc tssgggcaca 480 gcggccctgg gctgcctggt eaaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 540 tcaggcgccc tgaccagcgg egtgcacaec ttcccggctg tçctaeagtc ctcaggactc 600 tactcectca gcagcgfeggt gacegtgcce tccagcagct tgggcaccea gacctacatc 660 tgcaacgtga atcaca&gcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagcaga gcecaaatet 720 tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcácctg aactectggg gggaeegtca 780 gtctccctct eccceccaaa acccaaggac aceefccafcga fcctcccggac ccctgaggtc 340 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccccgagg tcaagttcaa ctggcaegtg SOO gacggcgtgg aggtgcafcaa tgecaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 960 taccgtgtgg tcagcgtcct caecgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1020 aagtgeaagg tctecaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctceaaagcc 1080 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc caccccggga tgagctgâcc 1140 aagaaceãgg tcagcctgac cfcgcctggtc ããággcttct atcccagcga catcgecgtg 1200 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aacfcacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1260 tccgãcggct ccfclcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg açaagageag gtggcagcag 1320 gggaacgtct tcfccafcgctc cgtgacgcat gaggctctgc acaaccacta caegeagaag 13 80 agcctetccc tgtetccggg taaatga 14 07 177 <220> <223> ADNc quimérico de murganho-humano <4 0 0> 12 atggattttc aggtgeagat tatcagcttc ctgctaatca gfcgcttcagt cataatgtcc 50 agaggagaca tcgtgcccac ccaa&ctaca aatccagtea ctcttggaac atcagcttcc 120 atctcctgca ggtctagtaa gagtctccca catagtaatg gcatcactta cttgtactgg ISO tatctgcaga agccaggcca gtetceteag ctcctgattt atcagatgfcc caaccttgtc 240 tcaggagfccc cagacaggtt cagtageagt gggtcaggaa ct.gattfccac actgagaate 300 agcagagtgg aggccgagga tgrgggtgtt tattactgfcg ctcaaaatct agaacttccg 360 tacacgttcg saggggggac caagccggaa ataaaacgta cgsfcgsetgc accatctgt-c 420 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa cfcgcctctgt tgtgtgcctg 480 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gKacagtgga aggfcggataa cgccetccaa 540 tcgggtaact cccaggagag tgtcaeagag caggacagca aggacagcac cfcacagccte 600 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcct3cgaa 660 gtcacccatc agggcctgag ctcgeccgtc acaaagagct teaacagggg agagcgttag 720
<210> 13 <211> 468 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> ADNc quimérico de murganho-humano <400> 13 178
Met Gly Trp Ser Leu Jle Leu Leu Phe Leu Vai Ala Vai Ala Thr Arg IS 10 IS
Vai Leu Ser Glu vai Lys Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Vai Lys 20 25 30
Pro Gly Ala Ser Vai Lys He Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe 35 40 45
Ser Tyr Ser Trp Met Asπ Trp Vai Lys Leu Arg Pro Gly Gin Gly Leu 50 55 60
Glu Trp Ile Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn 65 70 75 80
Gly
Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn 85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gin Leu Thr Ser
10C
Leu Thr Ser Vai Asp Ser Ala Vai 105 110
Tyr Leu Cys Ala Arg Asn Vai Phe 115 120
Asp Gly Tyr Trp Leu Vai Tyr Trp 125
Gly Gin Gly Thr Leu Vai Thr vai 130 135
Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro 140
Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser 145 150
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 155 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys 165
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr 170 175
Vai Ser Trp Asn Ser G.ly Ala Leu 180
Thr Ser Gly vai Kis Thr Phe Pro 185 130
Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu 195 200
Tyr Ser Leu Ser Ser vai Vai Thr 205
Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 210 215
Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Vai Asn 220
Kis Lys Pro Ser Asn Thr Lys vai 225 230
Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser 235 240 179
Pro Glu Leu Leu 2SS
Cys Asp Lys Thr Bis Thr Cys Pro Pro Cys Pro 245 250 ;iy Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 260 255 270
Het Xle Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser 275 280 285
His Glu Asp Pro Slu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Qly Vai 01« 290 295 300
Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr 395 310 31S 320
Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn 325 330 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai 340
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 345 3S0 lie Giu Lys Thr He Ser Lys Ala 355 360
Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin 365
Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 370 375
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai 380
Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly 385 390 phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Vai 395 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro 405
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 410 415
Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 420 425 Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe
Ser Lys Leu Thr 430 435 440
Ser Cys Ser Vai 445
Ser Leu Ser Leu
Met His Glu Ala Leu His Asa His Tyr Thr Gin Lys 450 455 460
Ser Pro Gly Lys 465 180 <210> 14
<211> 239 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> ADNc quimérico de murganho-humano <4 0 0> 14
Met Aap Phe Gin vai Gin lie íle 1 5
Ser Phe Leu Leu Xle Ser Ala Ser 10 15
Vai lie Met Ser Arg Gly Asp lie 20
Vai Leu Thr Gin Thr Thr Asn Pro 25 30
Vai Thr Leu Gly Thr Ser Ala Ser 35 40
Ile Ser Cys Arg Ser' Ser Lys Ser 4 5
Leu Leu His Ser Asn Gly lie Thr
Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gin Lys 181 50 55 60
Pro Gly Gin Ser Pro Gin Leu Leu lie Tyr Gin Het Ser Asn Leu Vai 65 70 75 80
Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95
Thr Leu Arg lie Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr 100 105 110
Cys Ala Gin Asn Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 115 120 125
Leu Glu Ile Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe xle Phe Pro 130 135 140
Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu 145 150 155 160
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp 165 170 175
Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp 180 185 190
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin 210 215 220
Gly Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Mus sp. <4 0 0> 15 182
Tir Ser Trp Met Asn 1 5 <210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> Mus sp. <4 0 0> 16
Gli Tir Ala Fen Ser Tir 1 5 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Mus sp. <4 0 0> 17
Qly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser Trp Met Asn 1 5 10 <211> 16 <212> PRT <213> Mus sp. <4 0 0> 18
Arg Ser Ser Lye Ser Leu l.su His Ser Asn Giy Ile Tht: Tyr Leu Tyr 1 S 10 IS <210> 19 <211> 7 183 <212> PRT <213> Mus sp. <4 0 0> 19 Gin 1 Met Ser Asη Leu Vai 5 Ser <210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> Mus sp . <4 0 0> 20 Ala 1 Gin Asn Le\i Glu I>eu 5 Pro Tyr Thr <210> 21 <211> 51 <212> ADN <213> Mus sp . <4 0 0> 21 cggatttttc ctggagatgg ggatactgac <210> 22 <211> 24 <212> ADN <213> Mus sp. <4 0 0> 22 tttcctggag atggggatac tgac <210> 23 <211> 30 24 184
<212> ADN <213> Mus sp. <4 0 0> 23 cggatttttc ctggagatgg ggatactgac <210> 24 <211> 30 <212> ADN <213> Mus sp. <4 0 0> 24 aatgtctttg atggttactg gttagtttac <210> 25 <211> 17 <212> PRT <213> Mus sp. <4Ο0> 25
Arg Ile Phe Pro 0.1 v Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Aso Gly hys Phe Lys 1 5 10 15
Gly <210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Mus sp. <4 0 0> 26 Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp 1 5 185 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 27
Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp 15 10 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 28
Asa Vai Phe Asp Gly Tyr Trp teu Vai Tyr 1 5 10 <210> 29 <211> 357 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> ADNc quimérico de murganho-humano <400> 29 eaggtgcaaC tggtgcagtc tggegctgaa gcCaagaagc ctgggagtcc agcgaaggtc 60 tcctgcaagg cttccggatâ caecttcagc tattettgga. tgagctgggt gcggcaggcc 120 cctggacaag ggctcgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac ISO geacagaaat tccaaggaag agtcaeaatt accgccgaca aatecactag eacagccfcat 240 atggagctga gcagcctgag afccfcgaggac acggccgtgc atcactgcgc aagaaafcgtc 300 tttgatggtt actggcttgfc fctactggggc cagggaaccc cggteaeegfc ctcctca 357 186 <210> 30 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> ADNc quimérico de murganho-humano <400> 30
Gla Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Qlu Vai hys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15
Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30
Xrp Mee Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Lee Glu Trp Met 3S 40 45
Gly Arg He 5?he Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Ala Gin Lys phe 50 55 60
Gin Gly Arg Vai Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr ser Thr Ala Tyr 65 70 75 SÔ
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 S0 35
Ala Arg Asn Vai Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Vai Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 ' 110
Thr Leu Vai Thr vai Ser Ser 115 <210> 31 <211> 357 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> ADNc quimérico de murganho-humano 187 <400> 31 eaggtgcaat tggtgcagtc tggcgctgaa gttaagaagc ccgggagttc agtgaaggte eo teetgeaagg cttccggata cgecttcagc tattcttgga tgaactgggt gcggcaggcc 120 eetggacaag ggctegagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180 aatgggaaat teasgggcag agtcacaatt accgccgaca aatccaetag cacagectat 240 atggagccga gcagcctgag atctgagg&c acggccgtgt attactgtgc aagaaatgtc 300 tttgatggtt aetggctfcgt ttactgggge cagggaaccc tggtcacegt ctcetcâ 357 <210> 32 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polipéptido quimérico de murganho-humano <400> 32
Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ser 1 S 10 15
Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser 20 25 30
Trp Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 5-5 60
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Gin Vai Gin teu Vai Gin Ser Gly Ala Slu Vai Lys Lys Pro Gly Ser χ s 10 15
Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser 20 25 30 189
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Gin Vai Gin Leu VaI Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ais 1 5 10 15
Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Vai ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser 20 25 30
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Ala Arg Asn Vai í?he Asp Gly Tyr Trp Leu vai Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
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Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ser 5 10 15
Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser 20 25 30
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Ala Arg Asn Vai Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Vai Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 39 <211> 357 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> ADNc quimérico de murganho-humano 192 <400> 39 tggcgctgaa gttaagaagc cgccfctcagc tat.cettgga gatgggacgg atcfcttcccg agtcacaatt accgccgaca acctgaggae acggccgtgt ttactggggc cagggaaccc ctgggagttc agfcgaaggfcc 60 fceaaetgggt gcggcaggcg 120 gegacgggga tactgactac 180 aatccactag cacagcctat 240 actactgtgc aagaaatgtc 300 tggtcaccgt cfcccfcea 35? caggtgcaat tggtgcagtc ccctgcaagg ctcccggata cetggacaag ggctcgagtg aatgggaaat tcaagggcag atggagctga gcagcctgag tttgacggtfc actggcfctgt <210> 40 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polipéptido quimérico de murganho-humano <400> 40 01« Val Gin t*u Vai Gin Ser Gly· Ala <51 u Vai Lys Lya Pro 01·/ Ser 1 5 10 3.5
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Gin val Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 1 S 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Fhe Thr Tyr Ser 20 25 30
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 45 <211> 357 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> ADNc quimérico de murganho-humano <400> 45 caggtgcaat tggtgcagtc tggcgetgaa gctaagaagc ctggcgcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg ettccggafca caccttcagc tattectgga tgaacfcgggc goggcaggcc 120 cctggacaag ggctcgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac ieo aatgggaaat tcaagggcag agtcacaatt acegecgaca aatccactag cacagcctat 240 atggagctga gcagcccgag atctgaggac acggccgtgt actacfcgtgc aagaaatgtc 300 tttgatggtt actggcttgt ttactggggc çagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357 196 <210> 46 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polipéptido quimérico de murganho-humano <400> 46
Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 1 s 10 15
Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30
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Ala Arg Asn Vai Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Vai Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu val Thr Vai Ser Ser 115 <210> 47 <211> 357 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> ADNc quimérico de murganho-humano 197 <400> 47 so 120 130 240 300 3S7 caggtgcaafc tggtgcagtc Cggcgctgaa gttaagaagc ctggggectc agtgsaggtc tcctgeaagg cttccggata caccttcace tafctcttgga tgcractgggt gcggcaggcc cccggacaag ggctcgagtg gatgggacgg acctttcccg gcgatgggga tactgactac gcacagaaat tecaaggaag agtcaeaatg acscgggaca cgtccacCtc eaccgtccat atggagctga gcagcctgag atcfcgaggac acggccgtgt attacfcgfcge aagaaatgfcc tttgatggtt actggcttgt tCactggggc cagggaeccc tggtcaccgt ctcctca <210> 48 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Polipéptido quimérico de murganho-humano <400> 48
Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Vai Lys vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ph<= Thr Tyr Ser 20 25 30
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Ala Arg Asn Vai Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Vai Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
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Glu Vai Gin Leu Vai Gin Ser 61y Ala 61« Vai Lys Lys Pro G1 y Ala X 5 10 15
Thr Vai Lys Ile Ser Cys Lys Vai Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Ser 20 25 30
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Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Vai Thr lie Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 S0
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 50 SS
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Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 51 <211> 357 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> ADNc quimérico de murganho-humano <400> 51 gaggtgcaafc tggtgcagtc tggcgctgaa gttaagaagc ctggggccac cgtgaagatc 50 tcctgcaagg tgfcccggata cacctrcacc tattertgga tgaactgggt gcagcaggcc 120 aatgggaaat fccaagggaag agtcacaatc aeagccgaca cgtecactga eaccgcctat. 240 atggagctga gcagcetgag atctgaggae acggccgtgt attaçtgfcgc aaccaatgtc 300 tttgafcggtt actggcttgfc ttactggggc eagggaaccc tggtcaccgt cccctca 357 200 <210> 52 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Polipéptido quimérico de murganho-humano <400> 52
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Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 10 15
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Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly 105 3.10
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Gin Met Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Giv. Vai. Lys Lys Thr Gly Ser 1 5 10 15
Ser Vai Lys Vai Ser Cy s Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Ser 20 25 * 30
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Ala Arg Asn Vai Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Vai Tyr Trp Gly Gin Gly 100 X0S lio
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Glu val Gin Leu vai Glu ser Gly Gly Gly Leu vai Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser 30 25 30
Trp Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45
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Ala Arg Asn Vai Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Vai Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Lee Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 57 <211> 456 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> ADNc quimérico de murganho-humano <400> 57 cggaattcgg cccaccggtg gceaccatgg actggacctg gaggatcetc ttcttggfcgg 60 cagcagecac aggagcccac tccgaagtgc agctggtgga gtctggagga ggcttggtea 120 agcctggcgg gtccctgcgg ctctcctgtg cagcctctgg attcgcattc agctactctt 180 ggatgaactg ggcgcggcag gctcctggaa agggccccga 9tgggtggga cggatctttc 240 ccggcgatgg ggatactgac tacaatggga aattcaaggg cagagtcaca attaecgccg 300 acaaatccac tagcacagcc fcatatggagc tgagcagcct gagatctgag gacacggecg 360 tgtattactg tgcaagaaat gCctttgatg gttactggct tgtttactgg ggccagggaa 420 Pcctggtcac cgtctcctca gctagrgaat tcfccga 456 204 <210> 58 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Polipéptido quimérico de murganho-humano <400> 58
Glu Vai GIíí Leu Vai Glu Ser Gly Giy Gly Lee Vai Lys Pro Gly Gly 1 S 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Tyr Ser 20 25 30
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Gly Arg lie Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 30 35
Ala Arg Asn Vai Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Vai Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 59 <211> 357 <212> ADN <213> Artificial <22 0> de murganho-humano <223> ADNc quimérico 205 <4Ο0> 59 caggtgcagc tggtggagtc tggaggaagc fctggteaagc ctggcgggtc- cctgcggctc 60 Ccctgtgcag cctccggatt cacatttagc fcatfccttgga tgaaetgggt gcggcaggct 120 cctggaaagg gcctcgagtg 39tgggacgg atcttteccg gcgatgggga taetgaet.ae 180 aatgggaaat tcaagggcag agtcacaate accgccgaca aatceactag cacagcctat 240 atggagetga geagectgag acctgaggac acggccgtgt. attactgcgc aagaaatgte 309 fcttgac.ggtt actggcttgfc tcactgggge cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 35? <210> 60 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Polipéptido quimérico de murganho-humano <400> 60 GXíj Vai Gin Leu Vai 01« Ser Gly Gly Sly Leu Vai Lys Pr o Gly Gly 1 S 10 is
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Lys Gly Arg Vai Thr Ile Thr Ala Asp Lye Ser Thr ger Thr Ala Tyr 65 70 75 gÓ
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp TJsr Ala Vai Tyr Tyr Cvs 8S So 95
Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 61 206 <211> 456 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> ADNc quimérico de murganho-humano <400> 61 gccaccatgg aetggacctg gaggatcctc ttettggtgg 60 tccgaagtgc agctcgcgga gtcfcggagca ggcttggtca 120 ctcccctgcg cagcctctgg attcacattt agctattctt ISO gctcctggaa agggcctcga gtgggtggga cggatcttte 240 tacaatggga aattcaaggg cagagtcaca attaccgccg 300 tatatggagc tgagcagcct gagatetgag gacaeggeeg 360 gcctctgatg gteactggct tgcttacfcgg ggccagggaa 420 gctagegaat tctcga 456 cggaattcgg eagcagccac agcctggcgg ggafcgaaetg ccggcgatgg aeaaaeccac egtafetaccg ccctggtcae cccaeeggfcg aggagctcac gtccctgcgg ggtgcggcãg ggatactgac tagcacagcc tgcaagaaac cgtcccccca <210> 62 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Polipéptido quimérico de murganho-humano <400> 62
Glu Vai Gin Lc-n Vai Glu Ser Gly Ala Sly Leu Vai Lys Pro Gly GI', 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Pbe Thr Phe Ser Tyr Ser 20 2S 30
Trp Mefc Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Giu Trp Met 35 40 4S
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 50 207
Lys Gly Arg val Thr Ile Thr Ala Asp Lye Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 so Het Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 AI â Aí 3 Asn Vai Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Vai Tyr Trp Gly Glu Gly 100 105 110 Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 63 <211> 456 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> ADNc quimérico de murganho-humano <400> 63 cggaatfccgg cccaccggtg gccaccatgg actggacctg gaggatcctc ttcttggtgg SO cageageeac aggagctcac tccgaagcgc agctcgtega gtctggagga ggcgtggcca 120 agcctggegg gtcectgcgg ctcccccgcg cagcctctgg attcacattt agctattett 180 ggatgaactg ggtgcggcag gctcccggaa agggcctcgã gtgggfcggga cggatcfctfcc 240 ccggcgatgg ggatactgac tacaatggga aattcaaggg cagagteaca actaccgccg 300 acaaatccae tagcacagcc fcãtafcggagc tgageagect gagatetgag gaeacggccg 360 tgtafctactg tgcaagaaat gtctctgatg gctaetggct tgttcacfcgg ggecagggaa 420 ccetggt.cac egtcteccca getagegaat tcfccga 456 <210> 64 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial 208 <220> <223> Polipéptido quimérico de murganho humano <400> 64
Glu val Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai hys Pro Gly Gly χ s 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser
Trp Nec Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro GJy Lys Gly Leu Glu Trp mi 35 40 45
Gly Arg He Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 so
Lya Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr ¢5 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Giv Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 S5
Leu Val Tyr Trp Gly Gin Gly 110
Ala Arg Asn val Phe Asp Gly Tyr Trp 100 105
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 65 <211> 456 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> ADNc quimérico de murganho-humano <400> 65 209 eggaafctegg cccaccggrg gccaccatgg actggacctg gaggatecte ttettggtgg 60 eagcagceae aggagetcac Eccgaagtgc agctggtegs gtecggagga ggcttgaaga 1:20 agectggcgg gtcectgcgg ctctcctgcg cagcctctgg aEtcacattt agctattcet 180 ggargaaetg ggtgcggcag gctcctggaa agggcctcga gtqggtggga eggatcfcttc 240 ccggcgatgg ggataefcgac tacaatggga aafctcaaggg eagagtcaca attaccgccg 300 acaaatccac tagcacagcc catatggagc tgagcagcee gagatctgag gacacggccg 360 tgtattactg tgcaagaaat gtetttgatg gttactggct tgttcacegg ggceagggaa 420 cecfcggccac cgtctcctca getagcgaat tctcga 456 <210> 66 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Polipéptido quimérico de murganho-humano <400> 66
Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly 1 s
Gly Gly Leu Lys Ly s Fro Gly Gly 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr ser 25 30
Trp Met Asr. Trp vai Arg Gin Ala 35 40
Fro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Het 45
Gly Arg lie Phe Pre Gly Asp Gly S0 55
Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 60
Lys Gly Arg Vai Thr Xle Thr Ala 65 70
Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr vs 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 SC 95
Ala Arg Asri Vai Phe Aso Gly Tyr Trp Leu Vai Tyr Trp Gly Gin Gly 3.00 105 110
Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 210 <210> 67 <211> 456 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> ADNc quimérico de murganho-humano <400> 67 cggaaetcgg cceaecggtg gccaccatgg actggacctg gaggatcctc ttcttggtgg £0 cagcagccac aggagcccac tccgaagtgc agctggtgga gtctggagga ggettggtca 120 agcetggctc ttccctgcgg ctctectgcg cagcctctgg attcacatct agctactctfc 180 ggatgaactg ggtgcggcag gctcctggaa agggcctcga gtgggtggga cggatctttc 230 ecggcgatgg ggacacCgac tacaatggga aattcaaggg cagagtcaca actaccgccg 3oo acaaatccac tageacagcc tatatggagc tgagcagcct gagatcfcgag gacacggccg 360 tgcattactg tgeaagaaat gtctttgatg gttactggct tgtctactgg ggccagggaa 420 ccctggtcac cgtctcctca gctagcgaat tctcga 455 <210> 68 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polipéptido quimérico de murganho-humano <400> 68 211
Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pr o Gly Ser 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ais Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30
Trp Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ket 35 40 45
Gly Arg Ile Pbe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp 50 55
Tyr Asn Gly Lys Phe 60
Lys Gly Arg Vai Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 ?0 75 80
Met Glu Leu Sér Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr 85 90
Ala Vai Tyr Tyr Cys 95
Ala Arg Asn Vai Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Vai 100 105
Tyr Trp Gly Gin Gly 110
Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 69 <211> 456 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> ADNc quimérico de murganho-humano <400> 69 cggaa fcfccgg cccaccggtg geeaceatgg actggacctg gaggatcctc ttctfcggtgg 60 cagcagccac aggagcccac tccgaagfcgc agetggtgga gfcctggagga ggccfcggtca ISO agcecggcgg gtccctgcgg gtcagctgcg cagcetctgg attcacattt agctattctt ISO ggatgaactg ggtgcggcag gctcctgg&a agggccccga gtgggtggga cggatcfcttc 240 ccggegatgg ggataetgac taeaatggga aafcteaaggg cagagteacá attaccgecg 300 aeaaatceac tagcaeagec tatafcggagc tgagcagcct gagatctgag gacatggecg 360 tgt&ttactg tgcaagaaat gtctttgatg gttactggct tgtttactgg ggecagggaa 420 ccetggtcac cgtctcctca getagcgaat tctcga 456 <210> 70 212 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Polipéptido quimérico de murganho-humano <400> 70
Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pro Sly Gly 15 10 IS
Ser Leu Arg Vai Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30
Trp Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lye Gly Leu Glu Trp Me ir. 35 40 45
Gly Arg lie Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 S5 60
Lys Gly Arg Vai Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 ?ô ?5 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asn Vai Phe Asp Gly Tyr Trp Léu Vai Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 11$ <210> 71 <211> 456 <212> ADN <213> Artificial <22 0> de murganho-humano <223> ADNc quimérico <400> 71 213 eggaatc.cgg cccaccggtg geeaccatgg actggacctg gaggatcctc ttcttggtgg cagcagccac aggagcccac tecgaagtgc agctggcgga gtctggagga ggcttggfcca agcctggcgg gtccctgcgg ctctcctgcg cagcctctgg attcacafctfc agctattctt ggatgaactg ggrgcggcag gctcctggaa agggcctcga gtgggtggga cggatctttc aca&atceae fcagcacagcc tatatggagc tgagcagcct gagatctgag gacacggccg tgtattactg tgcaagaaat gtccttgatg gttactggct fcgtttactgg ggccagggaa eectggteac cgtctcccca gctagcgaat ectcga 60 X20 130 240 350 420 4 56 <210> 72 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Polipéptido quimérico de murganho-humano <400> 72
Glu vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly i g 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 20
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser 25 30
Trp Met Asn Trp Vai Arg Gin Ala 35 40
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met '55
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp SlY 50 55
Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 60
Lys Gly Arg Vai Thr ile Thr Ala S5 70
Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg ser 85
Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 30 55
Ala Arg Asn Vai Phe Asp Gly Tyr 3.00
Trp Leu Vai Tyr Trp Gly Gin Gly 105 110
Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 214 <210> 73 <211> 57 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 73 atggactgga cctggaggat cctcttcttg gtggcagcag ccacaggagc ccactcc 57 <210> 74 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74
Het Asp Trp Thr Trp Arg lie Lew Phe i>eu Vai Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15
Ala Kis Ser <210> 75 <211> 345 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> ADNc quimérico de murganho-humano <4 0 0> 75 gatatcgtga tgacecagae cecactctcc ccgccegtca cccctggaga geccgeeagc 60 attagçogca ggtctagcaa gagcctcttg caoagcaatg gcatcactta tttgtattgg 120 tacetgcaaa agccagggca gtctecacag ctccegattt atcaaatgec caaccttgtc ISO tctggcgtcc ctgaccggtt ctccggatcc gggtcaggea etgattccac aetgaaaatc 240 agcagggtgg aggctgagga tgttggagtt tactactgcg ctcagaatct agaacttcct 100 taeaccttcg gcggagggac caaggtggag atcaaacgta cggtg 345 215 <210> 76 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Polipéptido quimérico de murganho-humano <400> 76
Asp Ile Vai Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Pro Gly 15 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30
Asn Gly He Thr Tyr Leu Tyr Trp :iyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Gin Met Ser Asn Leu Vai Ser Gly Vai Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly S.er Gly Ser Gly- Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80
Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Ala Gin Asn 85 90 95
Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105 110
Arg Thr Vai 115
<210> 77 <211> 66 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 77 216 60 65 aeggacatga gggtccccgc Ccagctcctg ggccccccgc fcgetcrggtt eccaggtgec aggr.gt.
<210> 78 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78
Met Asp Met Arg Vai Pro Ala Gin Leu Leu Oly Leu Leu Leu Leu Trp 1 S 10 15
Phe Pro 61 y Ala Arg Cya 20
Lisboa, 6 de Maio de 2010. 217

Claims (20)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo anti-CD20 do tipo II, humanizado, glicosilado por engenharia, com uma CCDA (citotoxicidade celular dependente do anticorpo) acrescida em resultado da referida engenharia de glicosilação e com uma capacidade acrescida para induzir apoptose de células-alvo no seguimento da respectiva humanização, caracterizado pelo facto de o referido anticorpo compreender uma região variável de cadeia pesada compreendendo regiões de determinação de complementaridade (RDCs) do anticorpo de murino B-Lyl, em que: a. a RDC1 de cadeia pesada é a SEQ ID NO: 16; b. a RDC2 de cadeia pesada é a SEQ ID NO: 26; e c. a RDC3 de cadeia pesada é a SEQ ID NO: 28; em que as regiões do sistema (RSs) da região variável de cadeia pesada RS1, RS2 e RS3 do referido anticorpo são sequências humanas de RS codificadas pela sequência da linha germinal humana de VH1_10 e a região variável RS4 de cadeia pesada do referido anticorpo ser uma sequência de RS humana codificada pela sequência da linha germinal de JH4 humana e em que o referido anticorpo ainda compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo as RDCs do anticorpo de murino B-Lyl, em que: d. a RDC1 de cadeia leve é a SEQ ID NO: 18; e. a RDC2 de cadeia leve é a SEQ ID NO: 19; e f. a RDC3 de cadeia leve é a SEQ ID NO: 20, em que as RSs das regiões variáveis de cadeia leve RS1, RS2 e RS3 do referido anticorpo são sequências humanas 1 de RS codificadas pela sequência da linha germinal humana de VH1_2_40 e a região variável RS4 de cadeia leve do referido anticorpo ser uma sequência de RS humana codificada pela sequência da linha germinal humana de JK4.
  2. 2. Anticorpo da reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido anticorpo compreender um polipéptido isolado compreendendo a sequência da região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 32 ou da SEQ ID NO: 40.
  3. 3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o referido anticorpo compreender um polipéptido isolado compreendendo uma sequência da região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 40.
  4. 4. Anticorpo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1-3, caracterizado pelo facto de o referido anticorpo compreender um polipéptido isolado compreendendo uma sequência da região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 76.
  5. 5. Anticorpo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1-4, caracterizado pelo facto de o referido anticorpo compreender um primeiro polipéptido isolado compreendendo uma sequência da região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 32 ou da SEQ ID NO: 40 e um segundo polipéptido isolado compreendendo uma sequência da região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 76.
  6. 6. Anticorpo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1-5, caracterizado pelo facto de o referido anticorpo compreender um primeiro polipéptido isolado 2 compreendendo uma sequência da região variável de cadeia peada da SEQ ID NO: 40 e um segundo polipéptido isolado compreendendo uma sequência da região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 76.
  7. 7. Anticorpo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1-6, caracterizado pelo facto de o referido anticorpo ter sido glicosilado por engenharia para aumentar a quantidade de oligossacáridos complexos bifurcados.
  8. 8. Anticorpo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1-7, caracterizado pelo facto de o referido anticorpo ter sido glicosilado por engenharia para diminuir a quantidade de resíduos de fucose.
  9. 9. Anticorpo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1-8, caracterizado pelo facto de o referido anticorpo ter uma região Fc com oligossacáridos modificados.
  10. 10. Anticorpo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de pelo menos 20 % dos oligossacáridos na região Fe do referido polipéptido serem não fucosilados e bifurcados.
  11. 11. Anticorpo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de pelo menos 50 % dos oligossacáridos na região Fc serem não fucosilados.
  12. 12. Célula hospedeira caracterizada pelo facto de expressar pelo menos um ácido nucleico que codifica um polipéptido com actividade de β(1,4)-Ν- acetilglicosaminiltransferase III numa quantidade suficiente para glicosilar por engenharia a região Fc de um polipéptido produzido pela referida célula 3 hospedeira, em que o referido polipéptido é o anticorpo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1-11.
  13. 13. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo facto de o referido anticorpo, produzido pela referida célula hospedeira exibir uma afinidade aumentada de ligação ao receptor Fc, em resultado da referida glicosilação por engenharia.
  14. 14. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo facto de o referido receptor de Fc ser o receptor FcyRIIIA.
  15. 15. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo facto de o referido anticorpo, produzido pela referida célula hospedeira exibir uma função efectora aumentada em resultado da referida glicosilação por engenharia.
  16. 16. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo facto de a referida função efectora aumentada ser uma sinalização directa aumentada que induz apoptose.
  17. 17. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo facto de compreender ainda pelo menos um polinucleótido transfectado codificando um polipéptido de acordo com um qualquer das reivindicações 2, 3, 5 ou 6 e em que o referido ácido nucleico compreende uma sequência que codifica uma região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina humana. 4
  18. 18. Composição farmacêutica caracterizada pelo facto de compreender um anticorpo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1-11 e um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
  19. 19. Anticorpo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1-11 caracterizado pelo facto de se utilizar como medicamento para tratar linfoma de células B.
  20. 20. Utilização do anticorpo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1-11 caracterizado pelo facto de se destinar ao fabrico de um medicamento para tratar linfoma de células B. Lisboa, 6 de Maio de 2010. 5
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