MXPA06004836A - Anticuerpos cd20 con funcion del efector y afinidad de enlace al receptor fc mejoradas. - Google Patents

Anticuerpos cd20 con funcion del efector y afinidad de enlace al receptor fc mejoradas.

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MXPA06004836A
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binding molecule
polypeptide
antibody
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MXPA06004836A
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Ekkehard Mossner
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Glycart Biotechnology Ag
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Abstract

La presente invencion se refiere a moleculas de enlace a antigenos (ABM). En modalidades particulares, la presente invencion se refiere a anticuerpos monoclonales recombinantes, incluyendo anticuerpos quimericos, primatizados o humanizados especificos para el CD20 humano. Ademas, la presente invencion s refiere a moleculas de acidos nucleicos que codifican tales ABM, y vectores y celulas hospederas que comprenden tales moleculas de acidos nucleicos. La invencion se refiere ademas a metodos para la produccion de las ABM de la invencion, y a metodos de uso de estas ABM en el tratamiento de la enfermedad. Ademas, la presente invencion se refiere a ABM con glicosilacion modificada que tiene propiedades terapeuticas modificadas, incluyendo anticuerpos con funcion del efector incrementada y enlace al receptor Fc incrementado.

Description

ANTICUERPOS CD20 CON FUNCION DEL EFECTOR Y AFINIDAD DE ENLACE AL RECEPTOR FC MEJORADAS Campo de la Invención La presente invención se refiere a moléculas de enlace de antigeno (ABM por sus siglas en inglés) . En modalidades particulares, la presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales recombinantes, incluyendo anticuerpos quiméricos primatizados o humanizados específicos para el CD20 humano. Además, la presente invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos que codifican tales ABM, vectores y células hospederas que comprenden tales moléculas de ácidos nucleicos. La invención se refiere además a métodos para la producción de las ABM de la invención, y a métodos de usos de estas ABM en el tratamiento de enfermedades. Además, la presente invención se refiere a las ABM con una glicosilacion modificada que tienen propiedades terapéuticas mejoradas incluyendo anticuerpos con un enlace mejorado al receptor Fe y una función mejorada de efector.
Antecedentes de la Invención El Sistema Inmune y los Anticuerpos CD20. El sistema inmune de los vertebrados incluyendo los humanos, consiste de diversos órganos y tipos celulares que han evolucionado para reconocer específicamente y con Ref . : 172610 precisión, enlazar y destruir microorganismos externos invasores ("antigenos") . Los linfocitos son críticos para la función adecuada del sistema inmune. Estas células se producen en el timo, bazo y médula ósea (adulto) y representan alrededor de 30% de las células de glóbulos blancos totales presentes en el sistema circulatorio de los humanos adultos. Existen dos principales sub-poblaciones de linfocitos: células T y células B. Las células T son responsables de la inmunidad mediada por las células mientras que las células B son responsables de la producción de anticuerpos (inmunidad humoral) . Sin embargo, en una respuesta inmune típica, las células T y las células B funcionan independientemente: las células T se activan cuando el receptor de células T se enlaza a los fragmentos de un antígeno que se enlazan a las glicoproteínas del complejo de histocompatibilidad mayor ("MHC") sobre la superficie de una célula que presenta antígenos; tal activación provoca la liberación de mediadores biológicos ("interleucinas" ) las cuales estimulan las células B para diferenciar y producir anticuerpos ( "inmunoglobulina" ) contra el antígeno. Cada célula B dentro del hospedero expresa un anticuerpo de un tipo y especificidad particulares, y células B diferentes expresan anticuerpos específicos para antigenos diferentes. La proliferación de células B y la producción de anticuerpos forman un pico como una reacción para un antígeno externo, y ambas se suspenden típicamente (o disminuyen substancialmente) una vez que se ha neutralizado el antígeno externo. Sin embargo ocasionalmente, la proliferación de una célula B en particular continuará sin abatirse, tal proliferación puede resultar en un cáncer referido como linfoma de células B. Las células T y las células B comprenden ambas proteínas de superficie celular que se pueden utilizar como marcadores para la diferenciación e identificación. Uno de tales marcadores celulares humanos B es el antígeno de diferenciación restringido en los linfocitos de humanos Bp35, referido como "CD20" . El CD20 se expresa durante el desarrollo temprano de las primeras células B y permanece hasta la diferenciación celular en el plasma. Específicamente, la molécula CD20 puede regular una etapa en el proceso de activación que se requiere para el inicio del ciclo celular y la diferenciación y se expresa usualmente a niveles muy altos en las células de neoplásicas ("tumor"). Debido a que CD20 está presente a niveles elevados en las células B malignas, esto es, aquellas células B cuya proliferación sin abatir puede conducir al linfoma de células B, el antígeno de superficie CD20 tiene el potencial de servir como un candidato para el direccionamiento de linfomas de células B. En esencia, tal direccionamiento se puede generalizar como sigue: los anticuerpos específicos para el antigeno de superficie CD20 de las células B se introducen en un paciente por ejemplo por inyección. Estos anticuerpos CD20 se enlazan específicamente al antígeno de la superficie celular de CD20 tanto de células (ostensiblemente) normales como malignas; el anticuerpo CD20 enlazado al antígeno de superficie CD20 puede conducir a la destrucción y supresión de células B neoplásicas. Adicionalmente, los agentes químicos o etiquetas radioactivas que tienen el potencial para destruir el tumor se pueden conjugar al anticuerpo CD20 de manera tal que el agente se suministra específicamente a por ejemplo, las células B neoplásicas. Independientemente de este método, una meta principal es destruir el tumor: el método específico se puede determinar por el anticuerpo en particular anti-CD20 que se utiliza y así, pueden variar considerablemente los métodos disponibles para el direccionamiento del antígeno CD20. Los anticuerpos monoclonales no conjugados (mAbs) pueden ser medicinas útiles para el tratamiento del cáncer como se demuestra por la aprobación de la administración de fármacos y alimentos de EUA del Rituximab (Rituxan™; IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA, y Genentech Inc., San Francisco, CA) , para el tratamiento de linfoma que no es Hodgkin folicular o de bajo grado, de células B positivas CD20, Trastuzumab (Herceptín™; Genentech Inc,) para el tratamiento de cáncer de mama avanzado (Grillo-Lopez , A, -J. , et al, Semin. Oncol . 26:56-73 (1999) ; Goldenberg M.M. , Clin. Ther. 21:309-18 (1999)), Gemtuzumab (Mylotarg™, Celltech/Wyeth-Ayerst ) para el tratamiento de leucemia mieloide aguda recurrente y Alemtuzumab (CANPATH™, Millenium Pharmaceuticals/Schering AG) para el tratamiento de leucemia linfocítica crónica de células B. El éxito de estos productos se basa no solamente en su eficacia sino también en sus destacados perfiles de seguridad (Grillo-Lopez, A.-J., et al., Semin. Oncol 26:66-73 (1999) ; Goldenberg M.M. , Clin. Ther: 21:309-18 (1999)) . A pesar de los logros de estos fármacos, existe actualmente un gran interés en la obtención de una mayor actividad de anticuerpos específicos que la que se alcanza típicamente por una terapia no conjugada de mAb. El anticuerpo monoclonal murino, B-Lyl, es otro anticuerpo que se conoce que es específico para el CD20 humano. (Poppema, S. and Visser, L., Biotest Bulletin 3:132-139 (1987) ) . Los resultados de diversos estudios, sugieren que los mecanismos dependientes del receptor Fe contribuyen substancialmente a la acción de anticuerpos citotóxicos contra tumores e indican que un anticuerpo óptimo contra tumores se enlazaría preferentemente a los receptores de activación Fe y de manera mínima al compañero inhibidor FcyRIIB. (Clynes, R.A. , et al., Nature Medicine 6 (4) : 443-446 s (2000); Kalergis, A. . , and Ravetch, J.V. , J. Exp. Med. 195 (12) : 1653-1659 (Junio 2002). Por ejemplo, los resultados de al menos un estudio sugieren que el receptor FcyRIIIa en particular se asocia fuertemente con la eficacia de terapia de anticuerpos. (Cartron, G. , et al., Blodd 99 (3) : 754-757 (February 2002) ) . Ese estudio demostró que los pacientes homocigóticos para FcyRIIIa tienen una mejor respuesta para el Rituximab que los pacientes heterocigóticos . Los autores concluyeron que la respuesta superior se debe a un mejor enlace in vivo del anticuerpo para FcylIIa, lo cual resulta en una mejor actividad de ADCC contra las células de linfoma. (Cartron, G . , et al., Blodd 99 (3 ): 754-757 (Febrero 2002)). Se han reportado diversos intentos para atacar el antígeno de superficie CD20. El anticuerpo monoclonal murino (de ratón) y F5 (un anticuerpo CD20) se administró repetidamente por una infusión intravenosa continua a pacientes con linfoma de células B. Los niveles extremadamente altos (>2 gramos) de 1F5 se requirieron repetidamente para suprimir las células de tumor en circulación, y los resultados se describieron por ser "transitorios" Press et al., "Monoclonal Antibody 1F5 (Anti-CD20) Serotherapy of Human B-Cell Lymphomas" Blood 69/2:584-591 (1987) . Un problema potencial con este método es que los anticuerpos monoclonales no humanos (por ejemplo anticuerpos monoclonales murinos) carecen típicamente de la funcionalidad del efector humano, esto es, son incapaces de inter alia, mediar la lisis dependiente del complemento o lisar las células objetivo humanas a través de una toxicidad celular dependiente de anticuerpos o la fagocitosis mediada por el receptor Fe. Adicionalmente, los anticuerpos monoclonales no humanos se pueden reconocer por el hospedero humano como una proteína externa, por lo tanto, las inyecciones repetidas de tales anticuerpos externos pueden conducir a la inducción de respuestas inmunes que llevan a reacciones de hipersensibilidad perjudiciales. Para anticuerpos monoclonales de base murina, esto se refiere a menudo como una respuesta a anticuerpos anti-ratón humano o respuesta "HAMA" . Adicionalmente, estos anticuerpos externos se pueden atacar por el sistema inmune del hospedero, de manera tal que están en efecto neutralizados antes de que alcance su sitio obj etivo . Otro método reportado para mejorar la capacidad de los anticuerpos monoclonales murinos para ser efectivos en el tratamiento de trastornos de células B, ha sido conjugar una etiqueta o toxina radioactiva al anticuerpo de manera tal que la etiqueta o toxina se localice en el sitio del tumor. Por ejemplo, el anticuerpo 1F5 antes referenciado se ha etiquetado con yodo 131 (nl31I"), y se evaluó repetidamente por su biodistribución en dos paedentes. Ver Eary, J.F. et al., Imaging and Treatment of B-Cell Lymhoma" J. Nuc. Med. 31/8:1257-1268 (1990); ver, Press, O.W. et al., "Treatment of Refractory Non-Hodgkin' s Lymphoma ith Radiolabeled MB-1 (Anti-CD37) Antibody" J. Chin. Onc. 7/8:1027-1038 (1989) (indicación de que un paciente de tratado con IF5 etiquetado con 131I logró una respuesta parcial); Goldenberg D.M. et al., "Targeting, Dosimetry and Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphomas with Iodine-131 Labeled LL2 Monoclonal antibody" J. Clin. Onc. 9/4:548-564 (1991) (tres de ocho pacientes reciben inyecciones múltiples y se reporta que han desarrollado una respuesta HAMA) ; Appelbaum, P.R. "Radiolabeled Monoclonal antibodies in the Treatment de Non-Hodgkin' s Lymphoma" Hem. /Onc. Clinics of N.A. 5/:1013-1025 (1991) (artículo en revisión) ; Press, O.W. et al "Radiolabeled-Antibody Therapy of B-Cell Lymphoma with Autologous Bone Marrow Support. "New England J. Med. 329/17:1219-12223 (1993) (anticuerpo anti-CD20 etiquetado con yodo 131 y IF5 y Bl) ; aminski, M. G. et al "Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphoma with 131I Anti-Bl (Anti- CD20) Antibody". New England J. Med. 329/7(1993) (iodine-131 labeled anti-CD20 antibody Bl; hereinafter "Kaminski"). Las toxinas (esto es, agentes quimioterapeúticos tales como la doxorubicina o la mitomicina C) también se han conjugado con anticuerpos. Ver por ejemplo la solicitud PCT publicada WO 92/07466 (publicada el 14 de Mayo, 1992) . Los anticuerpos quiméricos que comprenden porciones de anticuerpos de dos o más especies diferentes (por ejemplo, ratón y humanos) se han desarrollado como una alternativa a los anticuerpos conjugados. Por ejemplo, Liu, A. Y. et al, "Production of a Mouse-Human Chimeric Monoclonal antibody to CD20 with Potent Fc-Dependent Biologic Activity" J. Immun. 139/10:3521-3526 (1987), describe un anticuerpo quimérico de ratón/humano dirigido contra el antígeno CD20. Ver también la publicación PCT No. WO 88/04936. Por ejemplo rituximab (RITUXAN®) , un anticuerpo quimérico anti-CD20 se ha aprobado para el tratamiento del linfoma que no es de Hodgkin. Dada la expresión de CD20 por los linfomas de células B, este antígeno puede servir como un candidato para direccionar tales linfomas. En esencia, tal direccionamiento se puede generalizar como sigue: los anticuerpos específicos para el antígeno de superficie CD20 en las células B, se administra a un paciente. Estos anticuerpos anti-CD20 se enlazan específicamente al antígeno CD20 de células B tanto (ostensiblemente) normales como malignas, y el anticuerpo enlazado al CD20 en la superficie celular resulta en al destrucción y supresión de células B tumorigénicas . Adicionalmente, los agentes químicos, agentes radioactivos o citotoxinas se pueden enlazar directa o indirectamente a la anticuerpo anti-CD20 de manera tal que el agente se suministre selectivamente a las células B que expresan el antígeno CD20. Con ambos de estos métodos, la meta primaria es destruir el tumor. El método específicos dependerá del anticuerpo anti-CD20 en particular que se utilice. Asi, es evidente que los diversos métodos de direccionamiento del antígeno CD20 pueden variar considerablemente. El anticuerpo de rituximab (RITUCAN®) , es un dominio constante murino gamma 1 humano quimérico preparado por ingeniería genética que contiene un anticuerpo monoclonal dirigido contra el antígeno CD20 humano. Este anticuerpo quimérico contiene dominios constantes gamma 1 humanos y se identifican por el nombre "C2B8" en la patente de EUA No. 5,736,137 (Andersen et.al.) concedida en Abril 17, 1998, cedida a IDEC Pharmaceutícals Corporation. El RITUXAN® se aprueba para el tratamiento de pacientes con linfoma que no es de Hodgkin de células B, positivo a CD20, de bajo grado refractario o folicular. El mecanismo in vitro de los estudios de acción ha demostrado que el RITUXAN® muestra una citotoxicidad dependiente del complemento humano (CDC) (Ref. et. Al, Blood 83(2): 435-445 (1994)). Adicionalmente, muestra una actividad importante en ensayos que miden la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) . RITUXAN® se ha demostrado que posee una actividad anti-proliferativa en ensayos de incorporación de timidina y una capacidad limitada para inducir la apoptosis directamente mientras que los anticuerpos CD20 no lo hacen ( aloney et . al, Blood 88 (10): 637a (1996)).
Glicosilación de Anticuerpos El componente de oligosacáridos puede afectar significativamente las propiedades relevantes para la eficacia de una glicoproteína terapéutica incluyendo la estabilidad física, resistencia al ataque de la proteasa, interacciones con el sistema inmune, farmacocinética y actividad biológica específica. Tales propiedades pueden depender no solamente de la presencia o ausencia sino también de las estructuras específicas de los oligosacáridos. Se pueden hacer algunas generalizaciones entre la estructura de oligosacáridos y la función de glicoproteínas . Por ejemplo, ciertas estructuras de oligosacáridos median la depuración rápida de la glicoproteína a partir del torrente sanguíneo a través de interacciones con proteína específica de enlace carbohidratos, mientras que otras se pueden enlazar por anticuerpos y activar reacciones inmunes indeseables (Jenkíns et al., Nature Biotechnol . 14:975-81 (1996)). Las células de mamífero son los hospederos preferidos para la producción de glicoproteínas terapéuticas debido a su capacidad para glicosilar proteínas en la forma más compatible para la aplicación humana (Cumming et al . , Glycobiology 1:115-30(1991); Jenkins et al., Nature Biotechnol. 14:975-81 (1996)). Las bacterias muy raramente glicosilan proteínas, y como otros tipos de hospederoes comunes, tales como levaduras, hongos filamentosos células de plantas y de insectos, resultan en patrones de glicosilacion asociados con la depuración rápida del torrente sanguíneo, interacciones inmunes indeseables y el algunos casos específicos, actividad biológica reducida. Entre las células de mamíferos, las células de ovario de hámster chino (CHO) se han usado más comunmente durante las últimas dos décadas . Además de dar patrones de glicosilacion adecuados, estas células permiten la generación consistente de líneas celulares clónales altamente productivas, genéticamente estable. Se pueden cultivar hasta densidades altas en bioreactores sencillos usando medios libre de suero, y permiten el desarrollo de bio-procesos seguros y reproducibles . Otras células animales comúnmente usadas incluyen células de riñon de hámster recién nacido (BHK) , células de mieloma de ratón NSO- y SP2/0. Más recientemente, también se ha probado la producción de animales transgénicos (Jenkins et al., Wature Biotechnol . 14:975-81 (1996)). Todos los anticuerpos contienen estructuras de carbohidratos en posiciones conservadas en las regiones constantes de cadena pesada, con cada isotipo que procesa un arreglo distinto de estructuras de carbohidratos ligadas en N, las cuales afectan de manera variable el ensamble de proteínas, la secreción o actividad funcional ( right, A., and Morrison, S.L., Trends Biotech. 15:26-32 (1997)). La estructura del carbohidrato unido ligado a N varía considerablemente, dependiendo del grado de procesamiento y puede incluir oligosacáridos complejos biantenarios así como múltiplemente ramificados de alta mañosa (Wright, A. , and orrison, S.L., Trends Biotech. 15:26-32 (1997)). Típicamente, existe un procesamiento heterogéneo de las estructura de oligosacáridos de núcleo unidas en un sito de glicosilación en particular, de manera tal que incluso los anticuerpos monoclonales existen como glicoformas múltiples. Similarmente, se ha demostrado que las diferencias importantes en la glicosilación de anticuerpos suceden entre líneas celulares, e incluso se observan diferencias menores para una línea celular dada que crece bajo condiciones diferentes de cultivo (Lifely, M.R. et al., Glycobiology 5 (8) :813-22 (1995) ) . Una forma de obtener grandes incrementos en potencia mientras se mantiene un proceso de producción sencillo, y se evitan potencialmente efectos colaterales indeseables importantes, es mejorar las funciones del efector naturales mediadas por células de los anticuerpos monoclonales al preparar por ingeniería su componentes de oligosacárido como se describe en Umaña, P. et al., Nature Biotechnol . 17:176-180 (1999) y en la patentes de EUA No. 6,602,684, los contenidos completos de las cuales se incorporan en la presente como referencia en su totalidad. Los anticuerpos de tipo IgGl, los anticuerpos más comúnmente usados en la inraunoterapia del cáncer, son glicoproteínas que tienen un sitio de glicosilación ligado en N conservado en Asn297 en cada dominio CH2. Los dos oligosacáridos biantenarios del complejo unidos a Asn297 se ocultan entre los dominios CH2, al formar contactos extensivos con la columna de polipéptidos, y su presencia es esencial para que el anticuerpo medie las funciones del efector tales como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (Lifely, M.R. et al., Glycobiology 6:813-822 (1995); Jefferis, R., et al., Immunol Rev. 163:59-76 (1998); right, A. and Mor ison, S.L., Trends Biotechnol . 15:26-32 (1997)). Los inventores actuales mostraron previamente que la sobre expresión en células de ovarios de hámster Chinos (CHO) de ß (1 , 4) -N-acetilglucosaminiltransferasa III ("Gn TIII"), una glicosiltransferasa o cataliza la formación de oligosacáridos diseccionados, incrementa significativamente la actividad in Vitro ADCC del anticuerpo monoclonal quimérico anti-neuroblastoma y (chCE7) producido por células CHO preparadas por ingeniería (ver, Umaña, P. et al., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999); y la Publicación Internacional No. WO 99/54342, los contenidos de las cuales se incorporan en la presente como referencia. El anticuerpo chCE7 pertenece a una clase grande de mAbs sin conjugar que tienen una alta afinidad y especificidad para tumores, pero tienen demasiada poca potencia para ser clínicamente útiles cuando se producen en líneas celulares estándar que carecen de la enzima GnTIII (Umana, P. et al., Mature Biotechnol . 17:176-180 (1999)). Ese estudio fue el primero en demostrar que los incrementos grandes de actividad de ADCC se pueden obtener por ingeniería de las células productoras de anticuerpos para expresar GnTIII, lo cual también conduce a un incremento en la proporción de oligosacáridos biseccionados asociados con al región constante (Fe) incluyendo oligosacáridos no fucosilados biseccionados, arriba de los niveles encontrados en anticuerpos que se presentan naturalmente. Permanece la necesidad de métodos terapéuticos mejorados que se dirijan al antígeno CD20 para el tratamiento de linfomas de células B en primates incluyendo pero no limitado a humanos .
Breve Descripción de la Invención Al reconocer el tremendo potencial terapéutico de las moléculas de enlace a antígenos (ABM) que tienen la especificidad de enlace del anticuerpo murino B-Lyl, y que se han preparado por glicoingeniería para potenciar el enlace del receptor Fe en su afinidad y función del efector, los inventores actuales desarrollaron un método de producción de tales ABMs . Inter alia, este método involucra producir anticuerpos quiméricos recombinantes o fragmentos quiméricos de los mismos. La eficacia de estos ABMs se potencia además por ingeniería del perfil de glicosilacion de la región del anticuerpo Fe . De esta manera en un aspecto, la invención se dirige a un polinucleótido aislado que comprende: (a) una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 6 y SEQ ID NO.: 7. (CDRs VH-X) ; (b) una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 23. (CDRs VH-2) ; y SEQ ID NO: 24. En otro aspecto, la invención se dirige a un polinucleótido aislado que comprende SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO.: 9 y SEQ ID NO.: 10. (CDRs VL) . En una modalidad, cualquiera de estos polinucleótidos codifica un polipeptido de fusión. En un aspecto adicional, la invención se dirige a un polinucleótido aislado que comprende SEQ ID NO: 3. En otro aspecto, la invención se dirige a un polinucleótido aislado que comprende SEQ ID NO: 4. En un aspecto adicional, la invención se dirige a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No: 29; SEQ ID No : 31 ; SEQ ID No: 33; SEQ ID No: 35; SEQ ID No: 37; SEQ ID No : 39; SEQ ID No: 41; SEQ ID No : 43; SEQ ID No: 45; SEQ ID No: 47; SEQ ID No: 49; SEQ ID No: 51 ; SEQ ID No: 53; SEQ ID No : 55; SEQ ID No: 57; SEQ ID No: 59; SEQ ID No: 61; SEQ ID No: 63; SEQ ID No: 65; SEQ ID No : 67; SEQ ID No: 69; y SEQ ID No: 71. En otro aspecto, la invención se dirige a un polinucleótido aislado que comprende SEQ ID No. : 75. En una modalidad, tales polinucleótidos codifican polipéptidos de fusión. La invención se dirige además a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que tiene al menos 80% de identidad para SEQ ID NO: 3, en donde el polinucleótido aislado codifica a un polipeptido de fusión. En un aspecto adicional, la invención se dirige a un polipeptido aislado que comprende una secuencia que tiene al menos 80% de identidad para SEQ ID NO: 4, en donde el polinucleótido aislado codifica un polipeptido de fusión. La invención se dirige además a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que tiene al menos 80% de identidad para una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No: 29; SEQ ID No: 31; SEQ ID No: 33; SEQ ID No: 35; SEQ ID No: 37; SEQ ID No: 39; SEQ ID No: 41; SEQ ID No: 43; SEQ ID No: 45; SEQ ID No: 47; SEQ ID No: 49; SEQ ID No: 51; SEQ ID No: 53; SEQ ID No : 55; SEQ ID No: 57; SEQ ID No: 59; SEQ ID No: 61; SEQ ID No: 63; SEQ ID No: 65; SEQ ID No: 67; SEQ ID No: 69; y SEQ ID No: 71, en donde el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión. En un aspecto adicional, la invención se dirige a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que tiene al menos 80% de identidad para SEQ ID NO: 75, en donde el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión. La invención se dirige además a un polinucleótido que comprende SEQ ID NO: 11 (cadena pesada entera) o a polinucleótidos que tienen 80%, 85%, 90%, 95% o 99% de identidad para SEQ ID NO: 11. La invención también se dirige a un polinucleótido que comprende SEQ ID NO: 12 (cadena ligera entera) o a polinucleótidos que tienen 80% 85%, 90%, 95% ó 99% de identidad para SEQ ID NO: 12. La invención también se dirige a un polinucleotido aislado que codifica un polipéptido quimérico que tiene la secuencia de SEQ ID No.: 1. En una modalidad, el polinucleótido comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID No.: 1; y una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de una región Fe de anticuerpos, o un fragmento de la misma a partir de una especie diferente al ratón. La invención también se dirige a un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido quimérico que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No: 30; SEQ ID No: 32; SEQ ID No: 34; SEQ ID No: 36; SEQ ID No: 38; SEQ ID No : 40; SEQ ID No: 42; SEQ ID No: 44; SEQ ID No: 46; SEQ ID No : 48; SEQ ID No: 50; SEQ ID No : 52; SEQ ID No: 54; SEQ ID No : 56; SEQ ID No: 58; SEQ ID No: 60; SEQ ID No: 62; SEQ ID No: 64; SEQ ID No: 66; SEQ ID No: 68; SEQ ID No: 70; y SEQ ID No : 72. En una modalidad, el polinucleótido comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No: 30; SEQ No: 32; SEQ ID No: 34; SEQ ID No: 36; SEQ ID No : 38; SEQ ID No : 40; SEQ ID No: 42; SEQ ID No: 44; SEQ ID No : 46; SEQ ID No: 48; SEQ ID No: 50; SEQ ID No: 52; SEQ ID No : 54; SEQ ID No: 56; SEQ ID No: 58; SEQ ID No: 60; SEQ ID No: 62; SEQ ID No: 64; SEQ ID No: 66; SEQ ID No: 68; SEQ ID No: 70; y SEQ ID No: 72; y una secuencia que codifica un polipeptido que tiene la secuencia de una región Fe de anticuerpos o un fragmento de la misma a partir de una especie diferente al ratón. Todavía en otro aspecto, la invención se dirige a un polinucleótido aislado que codifica a un polipéptido quimérico que tiene la secuencia de SEQ ID No.: 2. En una modalidad, el polinucleótido comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID No. : 2; y una secuencia que codifica a un polipéptido que tiene la secuencia de una región de anticuerpos Fe, o un fragmento del mismo, a partir de una especie diferente al ratón. Todavía en otro aspecto, la invención se dirige a un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido quimérico que tiene la secuencia de SEQ ID No.: 76. En una modalidad, el polinucleótido comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID No. : 76; y una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de una región de anticuerpos Fe, o un fragmento del mismo, a partir de una especie diferente al ratón. La invención también se dirige a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la región VH del anticuerpo murino B-Lyl, o variantes funcionales del mismo, y una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de una región de anticuerpos Fe o un fragmento del mismo, a partir de una especie diferente al ratón. En otro aspecto, la invención se dirige a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la región VL del anticuerpo murino B-Lyl, o variantes funcionales del mismo, y una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de una región de anticuerpos Fe o un fragmento del mismo a partir de una especie diferente al ratón. La invención se dirige además a un vector de expresión que comprende cualquiera de los polinucleótidos aislados antes descritos y a una célula hospedera que comprende tal vector de expresión. En un aspecto adicional, la invención se dirige a una célula hospedera que comprende cualquiera de los polinucleótidos aislados antes descritos. En un aspecto, la invención se dirige a un polipéptido aislado que comprende: (a) una secuencia seleccionada de un grupo que consiste de: SEQ ID NO. : 15, SEQ ID NO. : 16 y SEQ ID NO. : 17. (CDRs VH-i) ; (b) una secuencia seleccionada de un grupo que consiste de: SEQ ID NO. : 25, SEQ ID NO. : 26 y SEQ ID No.: 27 (CDRs VH-i) ; y SEQ ID NO.: 28, en donde el polipéptido es un polipéptido de fusión. En otro aspecto, la invención se dirige a un polipeptido aislado que comprende SEQ ID NO.: 18, SEQ ID NO.: 19 y SEQ ID NO . : 20. (CDRs VL) , en donde el polipeptido es un polipeptido de fusión. La invención también se dirige a un polipeptido quimérico que comprende la secuencia de SEQ ID NO. : 1 o una variante del mismo. La invención se dirige además a un polipeptido quimérico que comprende la secuencia de SEQ ID No.: 2 o una variante del mismo. En una modalidad, cualquiera de estos polipéptidos comprende además una región Fe humana. La invención se dirige también a un polipéptido quimérico que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No: 30; SEQ ID No: 32; SEQ ID No: 34; SEQ ID No: 36; SEQ ID No: 38; SEQ ID No: 40; SEQ ID No: 42; SEQ ID No: 44; SEQ ID No: 46; SEQ ID No: 48; SEQ ID No: 50; SEQ ID No: 52; SEQ ID No: 54; SEQ ID No: 56; SEQ ID No: 58; SEQ ID No: 60; SEQ ID No: 62; SEQ ID No: 64; SEQ ID No: 66; SEQ ID No : 68; SEQ ID No: 70; y SEQ ID No : 72, o una variante del mismo. La invención se dirige además a un polipéptido quimérico que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 76 o una variante del mismo. En una modalidad, cualquiera de estos polipéptidos comprende además una región Fe humana. En otro aspecto, la invención se dirige a un polipéptido que comprende una secuencia derivada del anticuerpo murino B-Lyl y una secuencia derivada de un polipéptido heterólogo y a una molécula de enlace a antigenos que comprenden tal polipéptido. En una modalidad, la molécula de enlace a antígenos es un anticuerpo. En una modalidad preferida el anticuerpo es quimérico. En otra modalidad preferida el anticuerpo es humanizado o primatizado. En un aspecto adicional, la invención se dirige a un polipéptido aislado que comprende SEQ ID NO: 13 o una variante del mismo. En otro aspecto, la invención se dirige a un polipéptido aislado que comprende SEQ ID NO: 14. En otro aspecto, la invención se dirige a un ABM, que puede competir con el anticuerpo murino B-Lyl para enlazarse a CD20 y que es quimérico. En una modalidad, la ABM es un anticuerpo o un fragmento del mismo. En una modalidad adicional la ABM es un anticuerpo recombinante que comprende una región VH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO. : 1; SEQ ID No: 30; SEQ ID No: 32; SEQ ID No: 34; SEQ ID No : 36; SEQ ID No: 38; SEQ ID No : 40; SEQ ID No : 42; SEQ ID NO: 44; SEQ ID No: 46; SEQ ID No : 48; SEQ ID No: 50; SEQ ID No: 52; SEQ ID No: 54; SEQ ID No : 56; SEQ ID No: 58; SEQ ID No: 60; SEQ ID No: 62; SEQ ID No : 64; SEQ ID No : 66; SEQ ID No: 68; SEQ ID No: 70; y SEQ ID No: 72. En otra modalidad, la ABM es un anticuerpo recombinante que comprende una región VL que tiene una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO. : 2 y SEQ ID NO: 76. En una modalidad adicional, la ABM es un anticuerpo recombinante que está primatizado. Todavía en "una modalidad adicional la ABM es un anticuerpo recombinante que está humanizado. En otra modalidad, la ABM es un anticuerpo recombinante que comprende una región humana Fe. En una modalidad adicional, cualquiera de las ABMs antes discutidas se pueden conjugar a una porción tal como una toxina o una radioetiqueta. La invención se refiere además a una ABM, la ABM tiene oligosacáridos modificados. En una modalidad, los oligosacáridos modificados tiene una fucosilacion reducida en comparación con los oligosacáridos no modificados. En otras modalidades, los oligosacáridos modificados son híbridos o complejos. En una modalidad adicional, la ABM tiene una proporción incrementada de oligosacáridos no fucusilados o biseccionados, oligosacáridos no fucosilados en la región FC de la molécula. En una modalidad, los oligosacáridos no fucosilados biseccionados son híbridos. En una modalidad adicional, los oligosacáidos no fucosilados biseccionados son complejos. En una modalidad, al menos 20% de los oligosacáridos en la región Fe del polipéptido son no fucosilados o biiseccionados, no fucosilados. En modalidades más preferidas, al menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% ó 75% o más de los oligosacáridos son no fucosilados o biseccionados, no fucosilados. La invención se refiere además a un polinucleótido que codifica cualquiera de las ABM antes discutidas, y a vectores de expresión y células que comprenden tal nucleotido. La invención se refiere además a un método de producción de una ABM que puede competir con el anticuerpo murino B-Lyl para enlazarse a CD20 y en donde la ABM es quimérica, el método comprende: (a) cultivar una célula hospedera que comprende un polinucleótido que codifica una ABM de la presente invención en un medio bajo condiciones que permitan la expresión del polinculeótido que codifica la ABM u (b) recuperar la ABM del cultivo resultante. En otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la ABM de la invención. Se contempla que la composición farmacéutica puede comprender además un portador farmacéuticamente aceptable, un adyuvante o una combinación del mismo. En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método de tratamiento de una enfermedad que se trata por supresión de células B. El método comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la ABM de la presente invención a un sujeto humano que necesita del mismo. En una modalidad preferida, la enfermedad se trata al administrar una ABM que es un anticuerpo quimérico o un fragmento quimérico de un anticuerpo. Todavía en otro aspecto, la invención se refiere a una célula hospedera preparada por ingeniería para expresar al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una actividad GnTIII en una cantidad suficiente para modificar los oligosacáridos en la región Fe producidos por la célula hospedera, en donde la ABM puede competir con el anticuerpo murino B-Lyl para el enlace á CD20 y en donde la ABM es quimérica. En una modalidad, el polipéptido que tiene actividad GnTIII es un polipéptido de fusión. En otra modalidad, la ABM producido por la célula hospedera es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. En una modalidad adicional, la ABM comprende una región equivalente a la región FC de un IgG humano. La invención también se dirige a un polinucleótido aislado que comprende al menos una región determinante de la complementariedad del anticuerpo murino B-Lyl o una forma variante o truncada del mismo que contiene al menos los residuos determinantes de la especificidad para la región determinante de la complementariedad en donde el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión. Preferiblemente, tales polinucleótidos aislados codifican un polipéptido de fusión que es una molécula de enlace a antígeno. En una modalidad, el polinucleótido comprende 3 regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo murino B-Lyl o variantes o formas truncadas del mismo que contienen al menos los residuos determinantes de la especificidad para cada una de las 3 regiones determinantes de la complementariedad. En otra modalidad, el polinculeótido codifica la región variable completa de la cadena ligera o pesada de un anticuerpo quimérico (por ejemplo humanizado) . La invención se dirige además a los polipéptidos codificados por tales polinucleótidos . En otra modalidad, la invención se dirige a una molécula que combina un antígeno que comprende al menos una región determinante de la complementariedad del anticuerpo murino B-Lyl, o una variante o forma truncada del mismo que contiene al menos los residuos determinantes de la especificidad para la región determinante de la complementariedad, y comprende una secuencia derivada de un polipéptido heterólogo. En una modalidad, la molécula de enlace a antígenos comprende 3 regiones determinantes de las complementariedad del anticuerpo murino B-LY1 o variantes o formas truncadas del mismo que contienen al menos los residuos determinantes de la especificidad para cada una de las 3 regiones determinantes de la complementariedad. En otro aspecto, la molécula de enlace a antígenos comprende la región variable de una cadena ligera o pesada de anticuerpos. En una modalidad particularmente útil, la molécula de enlace a antígenos es un anticuerpo quimérico por ejemplo humanizado. La invención también se dirige a métodos de elaboración de tales moléculas de enlace a antígenos y al uso de las mismas en el tratamiento de enfermedades incluyendo linfomas de células B. La presente invención es la primera instancia conocida en la cual un anticuerpos de tipo II anti-CD20 se ha preparado por ingeniería para tener incrementos en las funciones del efector tales como ADCC, mientras que todavía conservan una capacidad potente de apoptosis. De esta manera, la invención se dirige a un anticuerpo anti-CD20 de tipo II preparado por ingeniería que tiene un ADCC aumentado como resultado de la ingeniería y sin perdida de la capacidad substancial para reducir la apoptosis. En una modalidad, los anticuerpos anti-CD20 de tipo II se han preparado por ingeniería para tener un patrón alterado de glicosilación en la región Fe. En una modalidad en particular, la glicosilación alterada comprende un nivel creciente de residuos complejos biseccionados en la región Fe. En otra modalidad en particular, la glicosilación alterada comprende un nivel reducido de residuos de fucosa en la región Fe. En otra modalidad, los anticuerpos anti-CD20 de tipo II se han sometido a un ingeniería de polipéptidos . La invención se dirige además a métodos de elaboración de tales anticuerpos de tipo II preparados por ingeniería y a métodos de uso de tales anticuerpos en el tratamiento de diversos trastornos de células B, incluyendo linfornas de células B. La célula hospedera de la presente invención se puede seleccionar del grupo que incluye, pero no se limita a una células CHO, una células BH , una células NSO, una células SP2/0, una células de mieloma YO, una célula de mieloma de ratón P3X63, una células PER, una células PER.C6 o una células de hibridoma. En una modalidad, la células hospedera de la invención comprende además un polinucleótido transfectado que comprende un polinucleótido que codifica la región VL del anticuerpo murino B-Lyl o variantes del mismo y una secuencia que codifica una región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina humana. En otra modalidad, la célula hospedera de la invención comprende además un polinucleótido transfectado que comprende un polinucleótido que codifica la región VH del anticuerpo murino B-Lyl o variantes del mismo y una secuencia que codifica una región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina humana. En un aspecto adicional, la invención se dirige a una célula hospedera que produce una ABM que muestra una afinidad de enlace al receptor FC incrementada y/o una función del efector incrementada como resultado de la modificación de sus oligosacáridos . En una modalidad, la afinidad de enlace incrementada para es un receptor Fe particularmente el receptor FcyRIIIA. La función del efector aquí contemplada se puede seleccionar del grupo que incluye, pero no se limita a una citotoxicidad celular incrementada mediada por Fe, enlace incrementado a células NK; enlace incrementado a macrófagos; enlace incrementado a células poliformonucleares ; enlace incrementado para monocitos; apoptosis incrementada inductora de la señalización directa; maduración de células dendríticas incrementada y cebado incrementado de células T. En una modalidad adicional, la células hospedera de la presente invención comprende al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad GnTIII que se liga operativamente a un elementos promotor constitutivo. En otro aspecto, la invención se dirige a un método para producir una ABM en una célula hospedera, que comprende: (a) cultivar una célula hospedera preparada por ingeniería para expresar al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido de fusión que tiene actividad GnTIII bajo condiciones las cuales permitan la producción de la ABM y las cuales permitan la modificación de los oligosacáridos presentes en la región Fe. De la ABM; y (b) aislar la ABM, en donde la ABM puede competir con el anticuerpo murinonB-LYl para enlazarse a CD20 y en donde la ABM es quimérica. En una modalidad, el polipéptido que tiene actividad GnTIII es un polipéptido de fusión, preferiblemente que comprende el dominio catalítico de GnTIII y el dominio de localización Golgi de un polipéptido residente en Golgi heterólogo seleccionado del grupo que consiste del dominio de localización de la manosidasa II, el dominio de localización de ß (1, 2) -N-acetilglucosaminiltransferasa I ("GnTI"), el dominio de localización de manosidasa I, el dominio de localización de ß (1 , 2 ) -N-acetilglucosaminiltransferasa II ("GnTII") y el dominio de localización de la al-6 core fucosiltransferasa . Preferiblemente, el dominio de localización de Golgi es a partir de manosidasa II o GnTI . En un aspecto adicional, la invención se dirige a un método para modificar el perfil de glicosilación de un anti-CD20 de ABM producido por una célula hospedera que comprende introducir en la células hospedera al menos un ácido nucleico o vector de expresión de la invención. En una modalidad la ABM es un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende preferiblemente la región Fe de un IgG. Alternativamente, el polipéptido es una proteína de fusión que incluye una región equivalente a la región Fe de un IgG humano. En un aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo quimérico recombinante o un fragmento del mismo capaz de competir con el anticuerpo murino B-Lyl para enlazarse a CD20 y tener una fucosilación reducida. En otro aspecto, la presente invención se dirige a un método de modificación de la glicosilación del anticuerpo recombinante o un fragmento del mismo de la invención al usar un polipéptido de fusión que tenga actividad GnTII y que comprende el dominio de localización Golgi de un polipéptido residente Golgi heterólogo. En una modalidad, los polipéptidos de fusión de la invención comprenden el dominio catalítico de GnTII. En otra modalidad, el dominio de localización Golgi se selecciona del grupo que consiste del dominio de localización de manosidasa II, el dominio de localización GnTI, el dominio de localización de manosidasa I, el dominio de localización de GnTII y el dominio de localización de al-6 núcleo fucosiltransferasa. Preferiblemente, el dominio de localización Golgi es a partir de manosidasa II o GnTI . En una modalidad, el método de la invención se dirige hacia la producción de un anticuerpo quimérico recombinante o un fragmento del mismo con oligosacáridos modificados, en donde los oligosacáridos modificados tienen una fucosilación reducida cuando se comparan con los oligosacáridos no modificados . De acuerdo con la presente invención, estos oligosacáridos modificados puede ser híbridos o complejos. En otra modalidad, el método de la invención se dirige hacia la producción de un anticuerpo recombinante quimérico o un fragmento del mismo que tiene una proporción incrementada de oligosacáridos biseccionados no fucosilados en la región Fe del polipéptido. En una modalidad, los oligosacáridos no fucosilados biseccionados son híbridos . En otra modalidad, los oligosacáridos no fucosilados biseccionados son complejos. En una modalidad, adicional, el método de la invención se dirige hacia la producción de un anticuerpo quimérico recombinante o un fragmento del mismo que tiene al menos 20% de los oligosacáridos en la región Fe del polipéptido que son biseccionados no fucosilados. En una modalidad preferida, al menos 30% de los oligosacáridos en la región Fe del polipéptido son biseccionados no fucosilados. En otra modalidad preferida, en donde al menos 35% de los oligosacáridos en la región Fe del polipéptido son biseccionados no fucosilados. En un aspecto adicional, la invención se dirige a un anticuerpo recombinante quimérico o un fragmento del mismo que muestra una afinidad de enlace al receptor Fe incrementada y/o una función del efector incrementada como resultado de la modificación de sus oligosacáridos. En una modalidad, la afinidad de enlace incrementada es para un receptor activador FC. En una modalidad adicional el receptor Fe es un receptor activador de Fey particularmente el receptor FcyRIIIA. La función del efector contemplada en la presente se puede seleccionar del grupo que incluye, pero no se limita a la citotoxicidad celular mediada por Fe incrementada, el enlace incrementado a células N , el enlace incrementado a macrófagos, enlace incrementado a células polimorfonucleares , enlace incrementado a monocitos, apoptosis inductora de la señalización directa incrementada, maduración de células dendríticas incrementada y cebado de células T incrementado . En otro aspecto, la invención se dirige a un fragmento de anticuerpos quiméricos recombinantes que tienen la especi icidad de enlace del anticuerpo murino B-Lyl y contiene la región Fe que se prepara por ingeniería para tener una fusión del efector incrementada producida por cualquiera de los métodos de la presente invención. En otro aspecto, la presente invención se dirige a una proteína de fusión que incluye un polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1 y una región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina y preparada por ingeniería para tener una función del efector incrementada producida por cualquiera de los métodos de la presente invención. En otro aspecto, la presente invención se dirige a una proteína de fusión que incluye un polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2 y una región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina y preparada por ingeniería para tener una función del efector incrementada producida por cualquiera de los métodos de la presente invención. En un aspecto, la presente invención se dirige a una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo quimérico recombinante producido por cualquiera de los métodos de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto, la presente invención se dirige a una composición farmacéutica que comprende un fragmento de anticuerpo quimérico recombinante producido por cualquiera de los métodos de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto, la presente invención se dirige a una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión producida por cualquiera de los métodos de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable. La invención se dirige además a un método de tratamiento de una enfermedad que se trata por la supresión de células B que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo recombinante quimérico o fragmento del mismo producido por cualquiera de los métodos de la presente invención a un sujeto humano que necesita del mismo.
Breve Descripción de las Figuras FIG 1. Nucleótidos (SEQ ID NO : 3) y una secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 1) de la región VH del B-Lyl murino . FIG 2. Nucleótidos (SEQ ID NO: 4) y una secuencia de aminoácido (SEQ ID NO: 2) de la región VL del B-Lyl murino. FIG 3. Enlace de Rituximab® (0) y ch-B Lyl (?) a CD20 en células de linfoma B Raji FIG 4A-4C. Supresión de células B de Rituximab° (O) y ch-B_Lyl (?) en sangre entera de 3 diferentes clases del genotipo FcYRIIIa-158V/F : (A) sangre entera de un donador F/F, homocigotico para el receptor de afinidad inferior; (B) sangre entera de un donador F/V, heterocigótico para el receptor de afinidad; y (C) sangre entera de un donador V/V, homocigotico para el receptor de mayor afinidad. FIG 5A-5C. Nucleótido (SEQ ID NO: 11) y secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 13) de la cadena pesada de un anticuerpo anti-CD20 quimérico. FIG 6A-6B. Secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 12) y secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 14) de la cadena ligera de un anticuerpo anti-CD20 quimérico. FIG 7A-7B. Secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de los CDR de anticuerpo B-Lyl murinos . (A) CDR predichos para la región VH. (B) CDR predichos para la región VL. FIG 8A-8C. Perfil MALDI-TOF de un anticuerpo quimérico B-Lyl preparado por glicoingeniería . (A) Tabla que detalla los porcentajes de picos específicos. (B) Espectro del B-Lyl quimérico preparado por glicoingeniería. (C) Espectro para el B-Lyl quimérico preparado por glicoingeniería tratado con Endo-H. FIG 9. Enlace de diferentes anticuerpos humanizados anti-CD20 a las células B Raji. Las diferencias entre el constructo B-HH2 y los constructos B-HL8 y B-HL11 se localizan en las regiones de estructura 1 y 2 con todos los 3 CDR que son idénticos. B-HL8 y B-HL11 tienen sus secuencias FR1 y FR2 derivadas de la clase humana VH3 , mientras que la estructura completa B-HH2 es un VH1 humano derivado. B-HL11 es un derivado de B-HL8 con una mutación sencilla GlulGln con Gln que es el residuo de aminoácido en el constructo B-HH2. esto significa que el intercambio de GlulGln no altera la afinidad o intensidad de enlace. Las otras diferencias entre B-HH2 y B-HL8 son los residuos 14 FR, a partir de los cuales uno o más tendrán influencia en el comportamiento de enlace del antígeno de este anticuerpo. FIG 10. Enlace del anticuerpo humanizado anti-CD20 BHL4- V1 sobre células objetivo Raj i . El constructo B-HL4 se deriva del anticuerpo B-HH2 al reemplazar el FR1 del B-HH2 con aquel de la secuencia de la línea germinal humana VH1_45. Este constructo muestra una capacidad de enlace a antígenos altamente disminuida, a pesar de tener diferentes aminoácidos solamente en 3 posiciones dentro de FR1. estos residuos se localizan en las posiciones 2, 14 y 30 de acuerdo con la numeración de Kabat . De estas la posición 30 parece ser la posición de mayor influencia ya que es parte de una definición Chothia de CDR1. FIG 11. Comparación del comportamiento de enlace entre B-HH1, B-HH2, B-HH3 , y el anticuerpo parental, B-lyl . Los datos muestran que todos los Abs muestran un valor similar de EC50 pero el constructor B-HH1 se enlaza con una menor intensidad/estequiometría que las variantes B-HH2 y B-HH3. B-HH1 se puede distinguir de B-HH2 y B-HH3 por sus regiones parcialmente humanas CDR1 y CDR2 (definición de Kabat) así como el polimorfismo Ala/ Thr 28 (numeración de Kabat) . Esto indica que cualquiera de la posición 28, el CDR1 completo y/o el CDR2 completo son importantes para la interacción de anticuerpos/ ntigenos . FIG 12. La comparación de los anticuerpos parentales B-HL1, B-HHl,y el B-lyl. Los datos muestran la ausencia de cualquier actividad de enlace en el constructo B-HL1 y alrededor de la mitad de la intensidad/estequiometría de enlace de B-HH1 comparado con B-lyl. Ambos B-HL1, asi como B-HH1 , se diseñan con base en estructura del aceptor derivadas de la clase humana VH1. Entre otras diferencias, la posición 71 (numeración de Kabat) del constructo B-HL1 es una diferencia notable, lo que indica su importancia supuesta para el enlace de antígenos. FIG 13. Análisis fluorocitométrico de la capacidad del anticuerpo antí-CD20 a su antígeno. Los datos muestran que los constructos B-HL2 y B-HL3 no despliegan actividad de enlace CD-20. FIG 14. Apoptosis de los anticuerpos anti-CD20 en células Z-138 MCL. FIG 15. Apoptosis de los anticuerpos anti-CD20. detalles del ensayo: 5 x 10s células/pozo se sembraron en placas de 24-pozos (5 x 105 células/ml) en medio del cultivos. 10 mg de los respectivos Ab, PBS para el control negativo o 5mM de control positive de camptotecina (CPT) se agregaron a los pozos. Se incubaron las muestras o/n (16 h) , se tiñeron con AnnV-FITC y se analizaron por FACS . Se hizo en ensayo por triplicado (*) : Señal para PBS solamente substraída (PBS solo dio 8% y 2% AnnV+ por PR-1 y células Z-138 respectivamente) . Los anticuerpos usados fueron: C2B8 (quimérico sin glicoingeniería) BHH2- V1 (humanizado sin glicoingenieria) . Observación: este ensayo no involucra ningunas células efectoras adicionales solamente objetivos más anticuerpo o controles . FIG 16. Exterminio de células objetivo por anticuerpos anti-CD20 con células efectoras inmunes. Detalles del ensayo: supresión de células B en la incubación durante la noche de sangre entera normal y análisis para CD19+/CD3+ por FACS. ADCC al usar PBMCs como efectores, incubación por 4 horas, relación efector: objetivo de 25:1 exterminio del objetivo medido por la retención de calceína con relación a la lisis detergente (100%) y a la lisis sin Ab (0%) . Anticuerpos usados : C2B8 (quimérico sin forma de glicoingenieria) ; BHH2-KVl-wt (humanizado sin forma de glicoingenieria de BHH2-KV1) ; BHH2 -KV1-GE (humanizado forma de glicoingeniería deBHH2-kvl) .
FIG 17. Perfil MALDl/TOF- S de los oligosacáridos Fe liberados con PNGaseF de un anticuerpo antihumano CD20 IgGl B-lyl con BHH2-KV1 sin glicoingeniería. FIG 18. Perfil MALDI/TOF-MS de oligosacáridos Fe liberados con PNGaseF del anticuerpo C-D20 antihumano IgGl B-lyl humanizado BHH2-KV1 gl preparado con glicoingeniería. La glicoingeniería hecha por co-expresión en células hospederas de los genes de anticuerpos y la encima codificadora de genes con actividad catalítica de ß-1,4-?-acetilglucosaminiltransferasa III (GnT-III) .
PIG 19. Perfil MALDl/TOF-MS de oligosacáridos Fe liberados con PNGaseF del anticuerpo CD20 antihumano IgGl B-lyl humanizado BHH2-KV1 g2 preparado con glicoingeniería . La glicoingeniería hecha por co-expresión en células hospederas de los genes de anticuerpos y la encima codificadora de genes con actividad catalítica de ß-1,4-?-acetilglucosaminiltransferasa III (GnT-III) y una encima que codifica con la actividad catalítica de la a-manosidasa II de Golgi . FIG 20. Enlace de preparados por glicoingeniería y no preparados por glicoingeniería para el receptor humano Fcgamma IIIa desplegado en la superficie de células CH0-CD16 recombinantes . FIG 21. Apoptosis de los anticuerpos CD20 preparados por ingeniería Fe y no preparados por ingeniería Fe en las células Z-138 MCL . Detalles del ensayo: 5 x 105 células/pozos se sembraron en placas de 2 -pozos (5 x 105 células/ml) en medio de cultivos. 10 mg del Ab respectivo, PBS para el control negativo se agregaron a los pozos. Las muestras se incubaron o/n (16 h) , se tiñeron con AnnV-FITC y se analizaron por FACS . El ensayo se hizo por triplicado. Abs usado: C2B8 = rituximab (forma quimérica no preparada por glicoingeniería, igual que la forma comercial) BHH2-KV1 (humanizado, no preparado por glicoingeniería ver la figura 6 para el perfil de glicosilación) ; BHH2-KVlg2 (humanizado, preparado por glicoingeniería ver la figura 7 para el perfil de glicosilación) ; BHH2-kvlGl (humanizado, preparado por glicoingeniería ver la figura 8 para el perfil de glicosilación) . Observación: este ensayo no involucran ningunas células efectoras adicionales, solamente objetivos más anticuerpo o controles. (*) señal para el PBS solo substraído .
Descripción Detallada de la Invención Se usan términos en la presente como se usan generalmente en el arte menos que se defina de otra manera como sigue . Como se usa en la presente, el término anticuerpo pretende incluir moléculas enteras de anticuerpos incluyendo anticuerpos monoclonales, policlonales y multiespecíficos (por ejemplo biespecífieos) así como fragmentos de anticuerpos que tienen la región Fe y conservan especificidad de enlace y proteínas de fusión que incluyen una región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina y que conservan la especificidad de enlace. También se abarcan anticuerpos humanizados primatizados y quiméricos. Como se usa en la presente, el término región Fe pretende referirse a una región en la Terminal C de una cadena pesada IgG. Aunque las fronteras de la región Fe de una cadena pesada IgG pudieran variar ligeramente, la región Fe de cadena pesada IgG humana se define usualmente por extenderse desde el recibo de aminoácidos en la posición Cys226 hasta la terminación carboxilo. Como se usa en la presente, el término región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina pretende incluir variantes alelicas que se presentan naturalmente de la región Fe de una inmunoglobulina así como variantes que tienen alteraciones que producen sustituciones adiciones o eliminaciones pero que no disminuyen substancialmente la capacidad de la inmunoglobulina para mediar las funciones del efector (tal como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos) . Por ejemplo, se pueden suprimir uno o más aminoácidos de la terminación N o la terminación C de la región Fe de una inmunoglobulina sin una perdida substancial de la función biológica. Tales variantes se pueden seleccionar de acuerdo con las reglas generales conocidas en el arte de manera de tener un efecto mínimo en la actividad (Ver por ejemplo, Bowie, J.U. et al., Science 247:1306-10 (1990) . Como se usa en la presente, el término molécula de enlace de antígenos se refieren su sentido más amplio a una molécula que se enlaza específicamente a un determinante antigénico. Más específicamente, una molécula de enlace de antígenos que se enlaza a CD20, es una molécula la cual se enlaza específicamente a una fosfoproteína no glicosilada de superficie celular de 35,000 Daltones, típicamente designada como el antígeno Bp35 de diferenciación restringida de los linfocitos B humanos, referido comúnmente como CD20. Por enlace específicamente, significa que el enlace es selectivo para el antígeno y se puede discriminar de interacciones indeseables o no especificas Como se usa en la presente, los términos fusión y quimérico cuando se usan con referencia a polipéptidos tales como ABMs se refieren a polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos derivadas de dos o más polipéptidos heterólogos, tales como porciones de anticuerpos a partir de especies diferentes. Para las ABMs quiméricas por ejemplo, los componentes de enlace que no son antígenos se pueden derivar de una amplia variedad de especies incluyendo primates tales como chimpancés y humanos . La región constante de la ABM quimérica es más preferiblemente substancialmente idéntica a la región constante del anticuerpo humano natural; la región variable del anticuerpo quimérico es más preferiblemente substancialmente idéntica a aquella de un anticuerpo recombinante antiCD-20 que tiene la secuencia de aminoácidos de la región variable murina B-Lyl . Los anticuerpos humanizados son uniforma particularmente preferida de un anticuerpo de fusión o quimérico. Como se usa en la presente, un polipéptido que tiene actividad "GnTIII" se refiere a polipéptidos que pueden catalizar la adición de un recibo de N-acetilglucosamina en una ligadura (GlcNA) ß-1-4 al manósido ligado en ß del núcleo de trimanosilo de oligosacár do ligados en N. Esto incluye polipéptidos de fusión que muestran en actividad enzim tica similar a pero no necesariamente idéntica a una actividad de ß (1 , ) -N-acetilglucosaminiltransferasa III también conocida como la ß-1, 4) -manosil-glicoproteína 4-beta-N-acetilglucosaminil-transferasa (EC 2.4.1.144), de acuerdo con el comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología molecular (NC-IUBMB) , cuando se mide en un ensayo biológico en particular con o sin dependencia de la dosis. En el caso en donde existe la dependencia de la dosis, no necesita ser idéntica a aquella de GnTIII sino más bien sustancialmente similar a la dependencia de la dosis en una actividad dada cuando se compara a GnTIII (esto es, el polipéptido candidato mostrara una mayor actividad con no mas de alrededor de 25-veces menos y preferiblemente no más de alrededor de diez veces menos actividad y más preferiblemente no más de alrededor de tres veces menos actividad con relación al GnTIII) . Cornos se usa en la presente, el término variante (o análogo) se refiere a un polipéptido que difiere de un polipéptido específicamente mencionado de la invención por inserciones, eliminaciones y substituciones de aminoácidos creadas usando por ejemplo técnicas de ADN recombinantes . Las variantes de las ABMs de la presente invención incluyen moléculas de enlace a antígenos quiméricos privatizados o humanizados en donde uno o varios de los recibos de aminoácidos se modifican por substitución adición y/o imitación en una forma tal que no afectan substancialmente la afinidad de enlace a antigeno (por ejemplo CD20) . La guía para determinar cuales residuos de aminoácidos se pueden reemplazar; agregar o eliminar sin eliminar las actividades de interés, se pueden encontrar al comparar la secuencia del polipéptido particular con aquella de los p ptidos homólogos y minimizar el número de cambios en la secuencia de aminoácidos hecha en regiones de alta homología (regiones conservadas) o al reemplazar aminoácidos con la secuencia de consenso . Alternativamente, las variantes recombinantes que codifican estos polipéptidos iguales o similares, se pueden sintetizar o seleccionar al hacer uso de la "redundancia" en el código genético. Se pueden introducir diversas substituciones de codones, tales como los cambios y lentes los cuales producen diversos sitios de restricción, para optimizar la clonación en un vector viral o plásmido o la expresión de un sistema procariótico o eucariótico en particular. Las mutaciones en la secuencia de polinucleótidos se pueden reflejar en el polipéptido o los dominios de otros péptidos agregados al polipéptido, para modificar las propiedades de cualquier parte de polipéptido, para cambiar características tales como las afinidades de enlace a ligandos, afinidades entre cadenas o relación de degradación/retorno . Preferiblemente, las "sustituciones" de aminoácidos son el resultado del reemplazo de un aminoácido con otro aminoácido que tenga propiedades estructurales y/o químicas similares, esto es, reemplazos conservadores de aminoácidos. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos se pueden hacer sobre la base de similitud en polaridad carga solubilidad, capacidad hidrofóbica, capacidad hidrofílica y/o la naturaleza anfipática de los residuos involucrados. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) que incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanína, triptofano, y metionina los aminoácidos polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteina, tirosina, asparagina, y glutamina; los aminoácidos cargados positivamente (básico) incluyen arginina, lisina, e histidina; y los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Las inserciones o eliminaciones están preferiblemente en el rango de alrededor de 1 a 20 aminoácidos, más preferiblemente de 1 a 10 aminoácidos . La variación permitida se puede determinar experimentalmente al hacer sistemáticamente inserciones, eliminaciones o substituciones de aminoácidos en una molécula de polipép ido usando técnicas de ADN recombinante y ensayando las variantes recombinantes resultantes por su actividad. Como se usa en la presente, el término "humanizado" se usa para referirse a una molécula de enlace a antígenos derivada de una molécula de enlace a antigenos no humanos, por ejemplo un anticuerpo murino que conserva o conserva substancialmente las propiedades de enlace de antígenos de la molécula precursora pero la cual es menos inmunogénica en humanos. Esto se pude lograr por diversos métodos que incluyen (a) injertar los dominios completos de variable no humanos en las regiones constantes humanas para generar anticuerpos quiméricos, (b) injertar solamente los CDRs no humanos sobre la estructura humana y las regiones constantes con o sin retención de los residuos críticos de la estructura (por ejemplo, aquellos que son importantes para conservar una buena afinidad de enlace antígeno o funciones de anticuerpos) ó (c) transplantar los dominios de variable completos no humanos pero "formar una capa con ellos con una sección de tipo humano por reemplazo de los residuos de superficie. Tales métodos se describen en Jones et al., Morrison et al., Proc. Nati . Acad. Sci., 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. , 28: 489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, olec. Immun. , 31 (3 ): 1ß9-217 (1994), todos los cuales incorporan como referencia en la presente en su totalidad. Existen generalmente 3 regiones determinantes de la complementariedad o CDRs, (CDR1, CDR2 y CDR3) en cada uno de los dominios variables de cadena ligera y pesada de un anticuerpo, que están flanqueados por cuatro subregiones de estructura (por ejemplo, FR1, FR2, FR3 , y FR4) en cada uno de los dominios variables de cadena ligera y pesada de una anticuerpo: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3 -CDR3 -FR4. Se puede encontrar una discusión de los anticuerpos humanizados, Ínter alia, en la patente de EUA No. 6,632, 927, y en la solicitud publicada de EUA No. 2003/0175269, ambas de las cuales se incorporan en la presente como referencia en su totalidad. Similarmente, como se usa en la presente, el término primatizado se usa para referirse a una molécula de enlace antígenos derivada de una molécula de enlace antígenos que no es de primate, por ejemplo, una anticuerpo murino, que conserva o conserva substancialmente las propiedades de enlace a antígenos de la molécula precursora pero la cual es menos inmunogénica en primates. En el caso en donde hay dos o más definiciones de un término que se usa y/o acepta dentro del arte, la definición del término como se usa en la presente pretende incluir todos esos significados a menos que se establezca explícitamente lo contrario. Un ejemplo específico es el uso del término "región determinante de la complementariedad" ("CDR") para describir los sitios de combinación de antígenos no contiguos encontrados dentro de la región variable de los polipéptidos de cadena ligera y de cadena pesada. Esta región en particular se ha descrito por Kabat et al., U.S. Dep. of Health and Human Services, " Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) y por Chothia et al., J. Mol. Biol . 196:901-917 (1987), las cuales se incorporan en la presente como referencia, en donde las definiciones incluyen traslape o subconjuntos de residuos de aminoácidos cuando se comparan una con la otra. Sin embargo, la aplicación de cualquier definición ara referirse a un CDR de un anticuerpo o variante del mismo, se pretende que este dentro del alcance del término como se define y usa en la presente. Los residuos adecuados de aminoácidos los cuales abarcan los CDRs como se definen por cada una de las referencias antes citadas se establecen a continuación en la tabla I como comparación. Los números de residuos exactos que abarcan un CDR en particular variaran dependiendo de la secuencia y el tamaño de los CDR. Aquellos expertos en la técnica pueden determinen rutinariamente cuales residuos comprenden un CDR en particular dada la secuencia variable de aminoácidos de la región del anticuerpo.
TABLA 1. Definiciones1 CDR 1 la numeración de todas las definiciones CDR de la tabla 1 está de acuerdo con las convenciones de numeración establecidas por Kabat et al. (ver a continuación). Kabat et al . también definieron un sistema de numeración para secuencias de dominio variable que son aplicables a cualquier anticuerpo. Alguien experto ordinario en al técnica puede asignar de forma no ambigua este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia de dominio variable, sin basarse en ningún dato experimental mas allá de la secuencia misma. Como se usa en la presente, "la numeración de Kabat" se refiere al sistema de numeración establecido por Kabat et al., U.S. Dep. Of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983) . A menos que se especifique de otra manera, las referencias a la numeración de posiciones especificas de residuos de aminoácidos en un ABM son de acuerdo con el sistema de numeración de kabat. Las secuencias de listado de secuencias (esto es, SEQ ID NO : 1 hasta SEQ ID NO : 78) no se enumeran de acuerdo con el sistema de numeración de kabat . Por una ácido nucleico o polinucleótido que tiene una secuencia de nucleotidos al menos por ejemplo 95% idéntica a una secuencia del nucleótido de referencia de la presente invención, se pretende que la secuencia de nucleotidos del polinucleótido sea idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia de polinucleótidos pueda incluir hasta cinco mutaciones de punto de cada 100 nucleotidos de la secuencia de nucleotidos de referencia. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleotidos al menos 95% idéntica para una secuencia de nucleotidos de referencia, se puede eliminar o sustituir hasta el 5% de los nucleotidos en la secuencia de referencia con otro nucleótido, o un número de nucleotidos hasta el 5% de los nucleotidos totales en al secuencia de referencia se puede insertar dentro de la secuencia de referencia. La secuencia de consulta puede ser la secuencia completa que se muestra en cualquiera de F1G. 24 ó PIG. 25. Como un asunto práctico, ya sea que cualquier molécula o polipéptido particular de ácidos nucleicos sea de al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% a la secuencia de nucleotidos o a la secuencia de polipeptidos de la presente invención, se puede determinar convencionalmente usando programas de computadora conocidos . Un método preferido para determinar la mejor coincidencia global entre una secuencia de consulta (una secuencia de la presente invención) y una secuencia objetivo, también referida como una alineación de secuencia global, se puede determinar usando el programa de computadora PASTDB con base en el algoritmo de Brutlag et al., Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990). En una alineación de secuencias, las secuencias objetivo y de consulta son ambas secuencias de AND. Una secuencia de ARN se puede comparar al convertir las U's a las T's. El resultado de la alineación de secuencia global esta en identidad de porcentaje. Los parámetros preferidos usados en una alineación FASTDB de secuencias de AND para calcular la identidad del porcentaje son: Matriz=Unitaria, k-tuple=4, penalización por no coincidencia =1, penalización por unión =30, longitud del grupo aleatorio =0, calificación de corte =1, penalización por espacio =5, penalización por tamaño despacio 0.05, tamaño de ventana =500 o la longitud de la secuencia de nucleotidos objetivo la que sea más corta. Si la secuencia objetivo es más corta que la secuencia de consulta debido a las eliminaciones 5' ó 3', no debido a las eliminaciones internas, se debe hacer una corrección manual a los resultados. Esto se debe a que el programa FASTDB no cuenta por los truncamientos 5' y 3' de la secuencia objetivo cuando se calcula la identidad en porcentaje. Para la secuencia objetivo truncadas en las terminaciones 5 ' ó 3 ' , con relación a la secuencia de consulta, la identidad en porcentaje se corrige al calcular el número de bases de la secuencia de consulta que están 5 ' y 3' de la secuencia objetivo, que no están coincidentes/alineadas como un porcentaje de las bases totales de la secuencia de consulta. Si un nucleótido esta coincidente/alineado se determina por los resultados de la alineación de secuencias FASTDB. Luego se resta que a partir de la identidad de porcentaje calculada pro el programa anterior FASTDB usando los parámetros especificados para llegar a un registro final de identidad del porcentaje. Este registro corregido es lo que se usa para los propósitos de la presente invención. Solamente las bases fuera de las bases 5' y 3 ' de la secuencia objetivo cuando se despliega por la alineación FASTDB que no se coinciden /alinean con la secuencia de consulta se calculan para los prepósitos de ajustar manualmente el registro de identidad del porcentaje.
Por ejemplo, una secuencia objetivo de 90 bases se alinea a una secuencia de consulta de 100 bases para determinar la identidad de porcentaje. Las eliminaciones suceden en el extremo 5' de la secuencia objetivo por lo tanto, la alineación FASTDB no muestra una alineación/coincidencia de las primeras 10 bases en el extremo 5' . Las 10 bases sin aparear representan 10% de la secuencia (número de bases en los extremos 5 'y 3' que no coinciden/ número total de bases en la secuencia de consulta) de manera que se resta el 10% del registro de identidad de porcentaje calculado por el programa PASTDB. Si las restantes 90 bases coincidieran perfectamente la identidad final en porcentaje sería de 90%. En otro ejemplo, una secuencia objetivo de 90 bases se compara con una secuencia de consulta de 100 bases. Esta vez las eliminaciones son eliminaciones internas de manera que no haya bases en el 5 ' ó 31 de la secuencia objetivo que no coincidan/ se alineen con la consulta. En este caso, la identidad del porcentaje calculada por FASTDB no se corrige manualmente. Una vez más de nuevo, solamente las bases 5' y 3 ' de la secuencia objetivo que no coinciden/alinean con al secuencia de consulta se corrigen manualmente . No se van a hacer otras correcciones manuales para los propósitos de la presente invención. Por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos por ejemplo 95% "idéntica" con una secuencia de aminoácidos de consulta de la presente invención, se pretende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido objetivo sea idéntica a la secuencia de consulta excepto que la secuencia del polipéptido objetivo pueda incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de consulta. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos al menos 95% idénticas a una secuencia de aminoácidos de consulta, se pueden insertar, eliminar o sustituir hasta el 5% de los residuos de aminoácidos en la secuencia objetivo con otro aminoácido. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden suceder en las posiciones terminales amino o carboxi de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, esparcidas ya sea individualmente entre los residuos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Como un asunto práctico, ya sea que algún polipeptido en particular tenga al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntico a un polipéptido de referencia, se puede determinar convencionalmente usando programas de computadora conocidos. Un método preferido para determinar la mejor coincidencia global entre una secuencia de consulta (una secuencia de la presente invención) y una secuencia de objetivo, también referida como una alineación de secuencia global, se puede determinar usando el programa de computadora FASTDB con base en el algoritmo de Brutlag et al., Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990). En una alineación de secuencias, la secuencias objetivo y de consulta son ya sea ambas secuencias de nucleótidos o ambas secuencias de aminoácidos. El resultado de la alineación de secuencias global está en identidad de porcentaje. Los parámetros preferidos usados en la alineación de aminoácidos FASTDB son: Matriz=PAM 0, k-tuple=2, penalización por no coincidencia =1, penal zación por unión =20, longitud del grupo de aleatorio =0, registro de corte =1, ventana de tamaño = longitud de la secuencia, penalización por espacio =5, penalización por tamaño de espacio =0.05, tamaño de ventana =500 o la longitud de la secuencia de aminoácidos objetivo lo que sea más corto. Si la secuencia objetivo es más corta de la secuencia de consulta debido a eliminaciones en la Terminal N o C, no debido a las eliminaciones internas se debe hacer a los resultados una corrección manual . Esto se debe a que el programa FASTDB no cuenta por los truncamientos en la terminal C y en la terminal N de la secuencia objeto cuando se calcula la identidad de porcentaje global. Para las secuencias objeto truncadas en las terminaciones N y C, con relación a la secuencia de consulta, la identidad en porcentaje se corrige al calcular en número de residuos de la secuencia de consulta que son en la terminal N y la terminal C de la secuencia objetivo que no coinciden se alinean con un residuo objeto correspondiente como un porcentaje de la base total de la secuencia de consulta. Ya sea que un residuo coincida se alinee se determina por los resultados de la alineación de secuencias FASTDB. Luego se resta este porcentaje de la identidad de porcentaje calculada por el programa anterior FASTDB usando los parámetros especificados para llegar a un registro de identidad en porcentaje final. Este registro de identidad en porcentaje final es lo que se usa para los propósitos de la presente invención. Solamente los residuos para las terminaciones M y C de la secuencia objeto que no coinciden o se alinean con la secuencia de consulta, se consideran para los propósitos de ajustar manualmente el registro de identidad en porcentaje. Esto es, solamente las posiciones de residuo de consulta fuera de los residuos en la terminal N y C más alejados de la secuencia obj etivo . Por ejemplo, una secuencia objetivo del residuo de 90 aminoácidos se alinea con una secuencia de consulta de 100 residuos para determinar la identidad en porcentajes. La eliminación sucede en la terminación N de la secuencia objetivo y por lo tanto, la alineación FASTDB no muestra una coincidencia/alineación de los primeros 10 residuos en la terminación N. Los 10 residuos sin aparear representan 10% de las secuencias (número de residuos en las terminaciones N y C que no coinciden/número total de residuos en la secuencia de consulta) de manera que se resta el 10% del registro de la identidad en porcentaje calculado por el programa FASTDB. Si los restantes 90. residuos coincidieran perfectamente la identidad en porcentaje final sería de 90%. En otro ejemplo, una secuencia objetivo de 90 residuos se compara con una secuencia de consulta de 100 residuos. Esta vez, las eliminaciones son eliminaciones internas de manera que no hay residuos en las terminaciones N o C de la secuencia objetivo que no coinciden o se alinea con la consulta. Este caso, la identidad en porcentaje calculada por FASTDB no se corrige manualmente. Una vez de nuevo, solamente las posiciones del residuo fuera de los extremos terminales N y C de la secuencia objetivo como se despliegan en la alineación FASTDB que no coinciden o se alinean con la secuencia de consulta se corrigen manualmente. Ningunas otras correcciones manuales se van hacer para los propósitos de la presente invención. Como se usa en la presente, un ácido nucleico que se hibridiza bajo condiciones severas a una secuencia de ácidos nucleicos de la invención, se refiere a un polinucleótido que se hibridiza en una incubación durante la noche a 42 °C en una solución que comprende 50% de formamida, 5x SSC (750 m NaCl, 75 mM citrato de sodio), 50 mM fosfato de sodio (pH 7.6), solución Denhardt 5x, 10% de sulfato de dextrano y 20 µg/ml de ADN de esperma de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado, seguido por lavado de los filtros en 0. lx SSC a alrededor de 65°C. Como se usa en la presente, el término dominio de localización de Golgi se refiere a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido residente de Golgi que es responsable del anclaje del polipéptido en una ubicación dentro del complejo Golgi . Generalmente, los dominios de localización comprenden extremos en la terminal amino de una encima . Como se usa en la presente, el término función del efector se refiere a aquellas actividades biológicas que se atribuyen a la región Fe (una región Fe de secuencia nativa o una región Fe de una variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo. Los ejemplos de las funciones del efector de anticuerpo incluye, pero no se limita a afinidad de enlace del receptor Fe, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) , fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) , secreción de citosina, absorción de antigeno mediada por el complejo inmune por células que presentan antígenos, subregulación de los receptores de la superficie celular, etc. Como se usa en la presente, los términos ingeniería, preparado por ingeniería, ingeniero e ingeniería de glicosilacion se consideran que incluyen cualquier manipulación del patrón de glicosilacion de un polipéptido recombinante o que se presenta naturalmente o fragmento del mismo. La ingeniería por glicosilacion incluye la ingeniería metabólica en la maquinaría de glicosilacion de una célula que incluye las manipulaciones genéticas de las trayectorias de síntesis de oligosacáridos para alcanzar una glicosilacion alterada de glicoproteínas expresadas en la célula.
Adicionalmente, la ingeniería de glicosilación incluye los efectos de mutaciones y el ambiente celular en la glicosilación. Como se usa en la presente, el término célula hospedera cubre cualquier tipo de sistema celular el cual se puede preparar por ingeniería para generar los polipéptidos y moléculas de enlace a antígenos de la presente invención. En una modalidad, la célula hospedera se prepara por ingeniería para permitir la producción de una molécula de enlace a antigeno con glicoformas modificadas. En una modalidad preferida, la molécula de enlace a antígenos es un anticuerpo, fragmento de anticuerpos o proteína de fusión. En ciertas modalidades, las células hospederas se han manipulado además de expresar niveles incrementados de uno o más polipéptidos que tienen actividad GnTIII. Las células hospederas incluyen células cultivadas, por ejemplo células cultivadas de mamíferos tales como células CHO, células BHK, células NSO, células SP2/0 células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63 , células PER, células PER. C6 o células de hibridoma, células de levadura, células de insectos y células de plantas por nombrar solamente unas cuantas, pero también las células comprendidas dentro de un animal transgénico, planta transgénica o tejido animal o de planta cultivado . Como se usa en la presente, el término citotoxicidad celular mediada por Fe incluye la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y la citotoxicidad mediada por una proteína soluble de fusión Fe que contiene una región Fe humana. Es un mecanismo inmune que conduce a la lisis de "células objetivo de anticuerpos" por "células efectores humanas inmunes" en donde : Las células efectoras humanas inmunes son una población de leucocitos que despliegan receptores Fe en su superficie a través de la cual se enlaza a la región Fe de los anticuerpos o de proteínas de fusión Fe y efectúan funciones de efector. Tal población puede incluir, pero no se limita a células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y/o células exterminadoras naturales (NK) . Las células direccionadas de anticuerpos son células enlazadas por los anticuerpos o proteínas de fusión Fe. Los anticuerpos o proteínas de fusión Fe se enlazan a células objetivo por medio de la terminal N en la parte de la proteína a la región Fe . Como se usa en la presente, el término citotoxicidad celular mediada por Fe incrementada se define ya sea como un incremento en el número de células objetivo de anticuerpos que son lisadas en un tiempo dado a una concentración dada de anticuerpos o de una proteína de fusión Fe en el medio que rodea las células objetivo por el mecanismo de citotoxicidad celular mediada por Fe antes definido y/o una reducción en la concentración de anticuerpos o de la proteína de fusión Fe en el medio que rodea las células objetivo requeridas para lograr la lisis de un número dado de células de direccionamiento de anticuerpos en un tiempo dado por un mecanismo de citotoxicidad celular mediada por Fe. El incremento en la citotoxicidad celular mediada por Fe se relaciona con la citotoxicidad celular mediada por el mismo anticuerpo o la proteína de fusión Fe producida por el mismo tipo de células hospederas usando los mismos métodos de producción, purificación, formulación y almacenamiento estándar que se conocen por aquellos expertos en la técnica pero que no se han producido por células hospederas preparadas por ingeniería para expresar la glicosiltransferasa GnTIII por los métodos aquí descritos. Por anticuerpo que tiene una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo incrementada (ADCC) significa un anticuerpo como el término se define en la presente que tiene un ADCC incrementado cuando se determina por cualquier método adecuado conocido por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. Un ensayo aceptado in vitro ADCC es como sigue. 1) El ensayo utiliza células de direccionamiento que se sabe que expresan el antígeno objetivo reconocido por la región de enlace a antígenos del anticuerpo 2) El ensayo utiliza células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) aislada de sangre de un donador saludable elegido aleatoriamente como se células efectoras; 3) El ensayo se lleva a cabo de acuerdo con el siguiente protocolo: i) las PBMC se aislan usando procedimientos de centrifugación de densidad estándar y se suspenden a 5 x 106 células/ml en un medio de cultivo de células RPMI; ii) las células objetivo crecen por métodos de cultivo de tejidos estándar cosechados a partir de la fase de crecimiento exponencial con una viabilidad superior al 90% lavados en un medio de cultivo celular RPMI, etiquetado con 100 micro-Curies de 51Cr, lavados 2 veces con medio de cultivo celular y vueltos a suspender en medio de cultivo celular a una densidad de 105 células/ml iii) 100 microlitros de la suspensión de células objetivo finales anteriores se transfieren a cada pozo de una placa de microtitulación de 96 pozos; iv) el anticuerpo se diluye en serie a partir de 4000 ng/ml hastas 0.04 ng/ml en medio de cultivo de células y se agregan 50 microlitros de soluciones de anticuerpos resultantes a las células objetivo en la placa de microtitulación de 96 pozos probando por triplicado diversas concentraciones de anticuerpos que cubren el rango de concentración entero anterior; v) para los controles máximos de liberación (MR) , 3 pozos adicionales en la placa que contienen las células objetivo etiquetadas reciben 50 microlitros de una solución acuosa al 2% (V/V) de un detergente no iónico (Nonidet, Sigma, St. Louis) en lugar de una solución de anticuerpos (punto iv anterior) ; vi) para los controles de liberación espontáneos (SR) , 3 pozos adicionales en la placa contienen las células objetivo etiquetadas reciben 50 microlitros del medio de cultivo de células RPMI en lugar de la solución de anticuerpos (punto iv anterior) ; vii) la placa de microtitulación de 96 pozos luego se centrífuga a 50 x durante 1 minuto y se incuba por una hora a 4°C; viii) 50 microlitros de la suspensión PBMC (punto i anterior) se agregan a cada pozo para producir una relación de células objetivo: efector de 25:1 y las placas se colocan en un incubador bajo una atmósfera de C02 al 5% a 37°C por 4 horas; ix) el sobrenadante libre de células de cada pozo se cosecha y la radioactividad liberada experimentalmente se cuantifica usando un contador gamma; x) el porcentaje de lisis específica se calcula para cada concentración de anticuerpos de acuerdo con la fórmula (ER-MR) / (MR-SR) x 100, en donde ER es la radioactividad promedio cuantificada (ver el punto ix anterior) para esa concentración de anticuerpos, MR es la radioactividad promedio cuantificada (ver punto ix anterior) para los controles MR (ver le punto v anterior) , y SR es la radioactividad promedio cuantificada (ver el punto ix anterior) para los controles SR (ver el punto vi anterior) ; 4) "ADCC incrementada" se define ya sea como un incremento en el porcentaje máximo de la lisis específica observada dentro del rango de concentración de anticuerpos antes probado y/o una reducción en la concentración de anticuerpos requerida para lograr la mitad del porcentaje máximo del lisis específica observada dentro del rango de concentración de anticuerpos antes probados. El incremento en ADCC es relativo al ADCC medido con el ensayo anterior mediado por el mismo anticuerpo producido por el mismo tipo de células hospederas usando los mismos métodos de almacenamiento, producción, purificación y formulación estándar que se conocen por aquellos expertos en la técnica pero que no se han producido por las células hospederas preparadas por ingeniería para sobreexpresar GnTIII. En un aspecto, la presente invención se refiere a moléculas de enlace a antígenos que tienen la especificidad de enlace del anticuerpo murino B-Lyl y al descubrimiento de que sus funciones del efector se pueden mejorar por una glicosilación alterada. En una modalidad, la molécula de enlace a antígenos es un anticuerpo quimérico. En una modalidad preferida, la invención se dirige a un anticuerpo quimérico o un fragmento del mismo que comprende los CDR que se muestran en la figura 7. Específicamente en una modalidad preferida, la invención se dirige a un polinucleótido aislado que comprende: (a) una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6 y SEQ ID NO : 7. (CDR VH-I) ; y (b) una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 23. (CDR VH-2) ; y SEQ ID NO: 24. En otra modalidad preferida, la invención se dirige a un polinucleótido aislado que comprende SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10. (CDR VL) . En una modalidad cualquiera de estos polinucleótidos codifica un polipepotido de fusión. En otra modalidad, la molécula de enlace a antígenos comprende el dominio de VH del anticuerpo murino B-Lyl que se muestra en la figura 1, o una variante del mismo y un polipéptido no murino. En otra modalidad preferida la invención se dirige a una molécula de enlace a antígenos que comprende el dominio VL del anticuerpo murino B-Lyl que se muestra en la figura o una variante del mismo y un polipéptido no murino. En otro aspecto, la invención se dirige a moléculas de enlace a antígeno que comprenden uno o más CDR truncados de B-Lyl. Tales CDR truncados contendrán como mínimo los residuos de aminoácidos que determinan la especificidad para el CDR dado. Por "residuo determinante de la especificidad" significa aquellos residuos que se involucran directamente en la interacción con el antígeno. En general, solamente alrededor de una quinta parte hasta una tercera parte de los residuos en un CDR dado participan en el enlace al antígeno. Los residuos determinantes de la especificidad en un CDR en particular se pueden identificar mediante por ejemplo, el cálculo de contactos interatómicos a partir de un modelado tridimensional y la determinación de la variabilidad de secuencia en una posición dada del residuo de acuerdo con los métodos descritos en Padlan et al., FASEB J. 9(1): 133-139 (1995) , los contenidos de la cual se incorporan por ello como referencia en su totalidad. De esta manera la invención también se dirige a un polinucleótido aislado que comprende al menos una región determinante de la complementariedad del anticuerpo murino B-Lyl o una variante o forma truncada del mismo que contiene al menos los residuos determinantes de la especificidad para la región determinante de la complementariedad en donde el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión. Preferiblemente, tales polinucleótidos aislados codifican un polipéptido de fusión que es una molécula de enlace a antígenos . En una modalidad, el polinucleótido comprende 3 regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo murino B-Lyl o variantes o formas truncadas del mismo que contienen al menos los residuos determinantes de la especificidad para cada de las 3 regiones determinantes de la complementariedad. En otra modalidad, el polinucleótido codifica la región variable completa de la cadena ligera o pesada de un anticuerpo quimérico (por ejemplo humanizados). La invención se dirige además a los polipéptidos codificados por tales polinucleótidos . En otra modalidad, la invención se dirige a una molécula de combinación de antígenos que comprende al menos una región determinante de la complementariedad del anticuerpo m rino B-Lyl o una variante o forma truncada del mismo que contiene al menos los residuos determinantes de la especificidad para la región determinante de la complementariedad y comprende una secuencia derivada de un polipéptido heterólogo. En una modalidad, la molécula de enlace a antígenos comprende 3 regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo murino B-Lyl o variantes o formas truncadas del mismo que contienen al menos los residuos determinantes de la especificidad para cada una de las 3 regiones determinantes de la complementariedad. En otro aspecto, la molécula de enlace a antígenos comprende la región variable de una cadena ligera o pesada de anticuerpos. En una modalidad particularmente útil, la molécula de enlace a antígenos es un anticuerpo quimérico, por ejemplo humanizado. La invención también se dirige a métodos de elaboración de tales moléculas de enlace a antígenos y al uso de los mismos en el tratamiento de enfermedades incluyendo linfornas de células B.
Se conocen que están involucrados diversos mecanismos en la eficacia terapéutica de los anticuerpos anti-CD20 incluyendo la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) , citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) , y la inducción de una lesión por crecimiento o apoptosis. Por ejemplo, la mayoría de la evidencia experimental indica que rituximab opera a través de mecanismos efectores convencionales medidos por ensayos de CDC y ADCC. Similarmente, se ha demostrado que la resistencia de diferentes células de linfoma para rituximab in vivo es una función de su sensibilidad a CDC in vivo. En contraste, el modo de acción in vivo de otro anticuerpo que se ha aprobado para uso terapéutico, Bl no requiere ni la actividad celular del complemento ni tampoco de las células exterminadoras naturales (NK) . Más bien, la eficacia de Bl in vivo se debe a su capacidad para inducir una apoptosis potente . En general, los anticuerpos monoclonales anti-CD20 caen en 2 diferentes categorías con base en su mecanismo de acción para erradicar las células de linfoma. Los anticuerpos anti-CD20 de tipo I utilizan principalmente el complemento para exterminar células objetivo mientras que los anticuerpos tipo II operan por mecanismo diferentes principalmente apoptosis. Rituximab y 1F5 son ejemplos de anticuerpos anti-CD20 de tipo ,* I, mientras que Bl es un ejemplos de un anticuerpo de tipo II. Ver, por ejemplo Cragg, M.S. and Glennie, M. J., Blood 103 (7) :2738-2743 (Abril 2004)/ Teeling, J. L. et al., Blood 104(6): 1793-1800 (Septiembre 2004), los contenidos completos de la cual se incorporan por ello como referencia. La presente invención es el primer caso conocido en el cual un anticuerpos anti-CD20 de tipo II se ha preparado por ingeniería para tener funciones del efector con incrementos tales como ADCC mientras que conserva todavía una capacidad potente de apoptosis. De esta manera, la presente invención se dirige a un anticuerpo anti-CD20 de tipo II preparado por ingeniería que tiene una ADCC incrementada como resultado de la ingeniería y sin perdida de la capacidad substancial para inducir la apoptosis. En una modalidad, los anticuerpos anti-CD20 de tipo II se han preparado por ingeniería para tener un patrón alterado de glicosilación en la región Fe. En una modalidad en particular, la glicosilación alterada comprende un nivel creciente de residuos complejos en la región Fe. En otra modalidad en particular, la glicosilación alterada comprende un nivel reducido de residuos de fucosa en alregión Fe. Ver la Solicitud de Patente de EU No. de Publicación 2004 0093621 para Shitara et al., los contenidos completos de la cual se incorporan como referencia. En otra modalidad, los anticuerpos anti-CD20 de tipo II se han sometido a una ingeniería de polipéptidos como se enseña en la Patente de EUA No. 6,737,056 para Presta o la Publicación de la Solicitud de Patente de EU No. 2004 0185045 (Macrogenics) o Publicación de la Solicitud de Patente de EU No. 2004 0132101 (Xencor) los contenidos completos de cada una de las cuales se incorporan como referencia. La invención se dirige además a métodos de elaboración de tales anticuerpos de tipo II preparados por ingeniería y a métodos de uso de tales anticuerpos en el tratamiento de diversos trastornos de células B incluyendo linfomas de células B. Los anticuerpos humanos/ratón quiméricos se han descrito. Ver, por ejemplo, Morrison, S. L. et al., PNAS II: (November 1984) ; Publicación de Patente Europea No. 173494; Boulianna, G. L, at al., Nature 312:642 (Diciembre 1984); Neubeiger, M. S. et al., Nature 314:268 (Marzo 1985); Publicación de Patente Europea No. 125023; Tan et al., J. Immunol. 135: 8564 (Noviembre 1985); Sun, L. K et al., Hybridoma 5:517 (1986); Sahagan et al., J. Immunol. 137: 1066-1074 (1986). Ver generalmente, Muron, Nature 312:597 (December 1984); Dickson, Genetic Engineering News 5(3) (March 1985); Marx, Science 229:455 (Agosto 1985); and Morrison, Science 229: 1202-1207 (Septiembre 1985). obinson et al., en el número de publicación PCT WO/88104936 describe un anticuerpo quimérico con una región humana constante y una región de murina variable, que tiene especificidad para un epítopo de CD20; la porción murina del anticuerpo quimérico de las referencias Robinson se deriva del anticuerpo monoclonal de ratón 2H7 (gamma 2b, kappa) . Aunque la referencia señala que el anticuerpo quimérico descrito es un "candidato principal" para el tratamiento de trastornos con células B, esta declaración se puede ver como no más que una sugerencia para aquellos en el arte para determinar si esta sugerencia es o no precisa para este anticuerpo en particular, particularmente debido a que la referencia carece de algunos datos para soportar una afirmación de efectividad terapéutica y de manera importante, los datos que utilizan mamíferos de orden tales como primates o humanos. Las metodologías para generar anticuerpos quiméricos están disponibles para aquellos en el arte. Por ejemplo, las cadenas ligera y pesada se pueden expresar por separado al usar por ejemplo cadenas pesadas de inmunoglobulina y cadena ligera de inmunoglobulina en plásmidos separados o en un vector sencillo (por ejemplo, policistrónico) . Estos luego se pueden purificar y ensamblar in vitro en anticuerpos completos; sean descritos metodologías para lograr tal ensamble. Ver, por ejemplo Scharff, M. , Harvey Lecture 69:125 (1974) . Los parámetros de reacción in vitro para la formación de anticuerpos IgG a partir de cadenas ligera y pesada aisladas reducidas también sean descrito. Ver por ejemplo, Sears et al., Biochem. 16 (9): 2016-25 (1977). En una modalidad particularmente preferida, la AB quimérica de la presente invención es un anticuerpo humanizado. Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos se conocen en el arte. Por ejemplo, las AB s humanizadas de la presente invención se pueden preparar de acuerdo con los métodos de la patente de E.U.A. No. 5,225,539 para Winter, Patente de E.U.A. No. 5,180,370 para Queen et al., o Patente de E.U.A. No. S, 632, 927 para Adair et al., los contenidos completos de cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia. Preferiblemente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en el a partir de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos se refieren a menudo como residuos de importación, los cuales se toman típicamente de un dominio variable de importación. La humanización se puede efectuar esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), al substituir secuencias de región hipervariables por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. De esta manera, tales anticuerpos humanizados son anticuerpos quiméricos (Patente de E.U.A. No. 4,816,567) en donde substancialmente menos de un dominio variable humano intacto sea substituido por la secuencia correspondiente a partir de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los cuales algunos de los residuos hipervariables y posiblemente algunos residuos FR se substituyen por residuos a partir de sitios análogos en anticuerpos de roedores. Los anticuerpos anti-CD20 humanizados objetivo comprenderán regiones constantes de inmunoglobulina humana. La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados a usarse en la elaboración de anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad . De acuerdo al método denominado del mejora ajuste, la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se separa por exclusión contra la colección completa de secuencias conocidas del dominio variable humano. La secuencia humana que es más cercana a aquella del roedor luego se acepta como la región de estructura humana (FR) para el anticuerpo humanizada (Sims et al., J. Immunol . , 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 1996: 901 (1987)). Otro método de selección de la secuencia de estructura humana es comparar la secuencia de cada subregión individual de la estructura completa del roedor (esto es, FR1 , FR2 , FR3 , y FR4) o alguna de la combinación de las subregiones individuales (por ejemplo, FR1 y FR2 ) contra una colección de secuencias de región variable humana conocidas que corresponden a esa subregión de estructura (por ejemplo, cuando se determina por la numeración Kabat) , y escoger la secuencia humana para cada subregión o combinación que sea la más cercana a aquella del roedor (Leung Patente de E.U.A. publicación de la solicitud No. 2003/0040606A1 , publicada en 27 Febrero 2003) . Otro método utiliza una región de estructura particular derivada de una secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligera o pesada. La misma estructura se puede usar para diversos anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 (1993)). Además es importante que los anticuerpos se humanicen con la retención de alta afinidad para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr esta meta de acuerdo con un método preferido, se preparan los anticuerpos humanizados por un proceso de análisis de las secuencias precursoras y de diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias precursoras y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina están comúnmente disponibles y son familiares para aquellos expertos en la técnica. Los programas de computadora están disponibles los cuales ilustran y despliegan estructuras conformacionales probables de tres dimensiones de secuencias de inmunoglobulina candidatos seleccionada. La inspección de estos despliegues permite el análisis del rol probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidato, esto es., el análisis de los residuos que tiene influencia en la capacidad de inmunoglobulina candidato para enlazar a su antígeno. De esta manera, los residuos FR se pueden seleccionar y combinar a partir de la secuencia del receptor de importación de manera que la característica deseada del anticuerpo se alcance tal como una afinidad creciente para los antígenos objetivo. En general, los residuos de la región hipervariable están directamente y más substancialmente involucrados en tener influencia en el enlace de antígeno. En otra modalidad, las moléculas de enlace a antígenos de la presente invención se preparan por ingeniería para tener una afinidad de enlace potenciada de acuerdo a por ejemplo, los métodos descritos en la publicación de la solicitud de patente de E.U.A. No. 2004/0132066 para Balint et a., los contenidos completos de la cual se incorporan por ello como referencia. En una modalidad, la molécula de enlace al antígeno de la presente invención se conjuga con una porción adicional tal como una radio etiqueta o una toxina. Tales ABMs conjugadas se pueden producir por diversos métodos que son bien conocidos en el arte. Son aplicables una diversidad de radionúclidos a la presente invención y aquellos expertos en la técnica están acreditados con la capacidad para determinar fácilmente cual radionúclido es más adecuado bajo una diversidad de circunstancias. Por ejemplo, el yodo131 es un radionúclido bien conocido utilizado para inmunoterapia dirigida. Sin embargo, la utilidad clínica del yodo131 se puede limitar por diversos factores que incluyen: vida media física de 8 días; deshalogenación de un anticuerpo yodado tanto en la sangre como en los sitios de tumor; y características de emisión (por ejemplo, un componente gamma grande) el cual puede ser subóptimo para una deposición localizada de dosis en tumores . Con la llegada de agentes superiores para quelación, la oportunidad de unir grupos queladores de metal a las proteínas ha incrementado las oportunidades de utilizar otros radionúclidos tales como 11:Lindio y 90itrio. El 90itrio proporciona diversos beneficios para su uso en aplicaciones radioinmunoterapéuticas : La vida media de 64 horas de 90itrio es lo suficientemente larga para permitir la acumulación de los anticuerpos por el tumor y a diferencia de por ejemplo, 131yodo, 90itrio es un emisor beta puro de alta energía sin ninguna radiación gamma acompañante en su decaimiento, con un intervalo en el tejido de 100 hasta 1000 diámetros de células. Adicionalmente, la cantidad mínima de radiación por penetración permite la administración fuera del paciente de los anticuerpos etiquetados con el 90itrio. Adicionalmente, la internalización de anticuerpos etiquetados no se requiere para el exterminio celular, y la emisión local de radiación ionizante debe ser letal para las células de tumor adyacentes que carecen del antigeno objetivo. Las dosis efectivas de tratamiento sencillo (esto es, cantidades terapéuticamente efectivas) de anticuerpos anti-CD20 etiquetados con 90itrio están en el intervalo entre alrededor de 5 y alrededor de 75 mCi, más preferiblemente entre alrededor de 10 y alrededor de 40 mCi . Las dosis de ablación sencillas de tratamiento que no son en la medula de anticuerpos anti-CD20 etiquetados con yodo131 están en el intervalo desde 5 y alrededor de 70 mCi, más preferiblemente entre alrededor de 5 y alrededor de 40 mCi . Las dosis de ablación de tratamiento sencillas efectivas (esto es, pueden requerir un transplante autologo de médula ósea) de anticuerpos anti-CD20 etiquetados con yodo131 están en el intervalo desde alrededor de 30 y alrededor de 600 mCi, más preferiblemente entre alrededor de 50 y menos de alrededor de 500 raCi. En conjunto con un anticuerpo quimérico anti-CD20, debido a la vida media en circulación más prolongada vis-a-vis, anticuerpos murinos, una dosificación ablativa que no es para médula de tratamiento sencillo efectivo de anticuerpos anti-CD20 quiméricos etiquetados con yodo131 en el intervalo de entre alrededor de 5 y alrededor de 40, más preferiblemente menos de alrededor de 30 mCi . Criterios para formación de imagen para, por ejemplo, la etiqueta de indio111 son típicamente menores que alrededor de 5 mCi . Con respecto a los anticuerpos radio etiquetados anti-CD20, la terapia con ellos también puede suceder usando un tratamiento sencillo de terapia o usando tratamiento múltiples. Debido a el componente de radionúclidos , se prefiere que previo al tratamiento, se cosechen las células madre periféricas ("PSC") o de médula ósea ("BM") para pacientes que experimentan una toxicidad potencialmente fatal de médula ósea que resulte de la radiación. 3M y/o PSC se cosechan usando técnicas estándar y luego se purgan y se congelan para una reinfusión posible. Adicionalmente, es más preferido que previo al tratamiento se lleve a cabo una dosimetría de diagnóstico en un estudio al usar un anticuerpo etiquetado de diagnóstico (por ejemplo, al usar indio111) sobre el paciente, un propósito del cual es asegurar que el anticuerpo terapéuticamente etiquetado (por ejemplo, al usar itrio90) no se volverá innecesariamente concentrado en ningún órgano o tejido normal. En una modalidad preferida, la presente invención se dirige a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido como se muestra en' la tabla 3 a continuación. La invención se dirige a demás a un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia al menos 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia de nucleótidos que se muestran en la tabla 2 a continuación. En otra modalidad, la invención se dirige a un áticos nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a una secuencia de aminoácido en la tabla 3. Esta invención también abarca un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los constructos en la tabla 3 con substituciones conservadoras de aminoácidos .
Tabla 2 CONST UCTO SECUENCIA DE NUCLEOTÍDÜ B-HH1 CAGGTGCAATTGGTGC AQTC GQCGCTGAAGTTA A 29 GAAGCCTGGGAGTTCAGTGAÁGGTCTCCTGCAAG Cn^CCGGATACAflí rTnAGCTATTCTTGGATGAGCr GGGTGCGGCÁGGCCCCrGGACAAGGGCTCGAGTGQ ATGGGACGGATC rrCCCGGCGATGGGGATACTGA CTACGCACAGAAÁTTCCAAGGAAGAGTCACAAT A CCGCCGACAAATCCÁCTAGCACAGCCTATATGGAG CTGAGCAGCCTGAGATCTGAGOACACGGCJCGTGTA TTACTGTGCAAGAAATGTCTT GATGGTTAC GGCT TGTTTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCT CCTCA B-HH2 CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGCGCTGAAG1 AA 31 GAAGCCTGGGAGTTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGG CTTCCGGATACGCCTTCAGCTATTCTTGGATGAACT GGGTGCGGCAGGCCCCTGGÁCÁAGGGCTCGAGTGG ATGGGACGGATCT TCCCGGCGATGGGGATACTGA CTACAATGGGAAATTCAAGGGCAGAGTCACAATTA CCGCCGACAAATCCACTAGCACAGCCTATATGGAG CTGAGCAGCCTGAGATC GÁGGACACGGCCGTG A TTACTGTGCÁAGAAATGTCrrrGÁ GGTTACTGGCT TGTITACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCT CCTCA B-HH3 CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGCGCTGAAGTTAÁ 33 GAAGCCTGGGAGTTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGG CTrCCGGÁTACGCCTFCAGCTAlTCrTGGATGAACT GGGTGCGGCAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGG ATGGGACGGATCrrrCCCGGCGATGGGGATACTGA CTACAAfGGGÁÁATTCAAGGGCAGAGTCACAArrA GCGCCGACAAATCCACrAGCACAGCCTATATGGAG CTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTA IXTrGTGTGCAAGAAATGTCTTTGATGGT ACTGGCT TGTTTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCÁCCGTCT CCTCAGCTAGCACC B-HH4 CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGCGCTGAAGTTAA 35 GAAGCC GGAGCrT'CAGTGA GGTCTCCTGCAAGG CTCCGGATACGCGTTCAGCTATTCTTGGATGAACT GGGTGCGGCÁGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGG ATGGGACGGATCTTTCCCGGCGATGGGGATACTGA CTACAATGGGÁAATrCAAGGGCAGAGTCACAATTA CCGCCGACAAATCCACTAGCACAGCCTATATGGAG CTGÁGCAGGCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTA TrACTGTGCAAGAAATGTGTTTGATGGT ACTGGCr TGTTTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCT CCTCA CONST UCTO SECUENCIA DE NUCLEOTipO SEQIDNO B-HH5 CAGGTOAATTGGTdCAGTCTGQC CrGAÁeTTAA 37 GAAGCCTGGGAGrrCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGG ClTCCGGATACGCGTrCAGCrATTCTTGGATGAGCT GGGTGCGGCAGGCGCCTGGACAAGGGCTCGAGTG GATGGGACGGATCnTCCCGGCGATGGGGATACTG ACTACAATGGGAAATTCAAGGGCAGAGTCÁCAATT ACCGCCGÁCÁAATCCACTAGCACAQCCrATATQOA GCTGÁGCAGCCTGAGATCrGÁGGACACGGCCGTGT ATTACTGTGCAAGAAÁTGTCTTTGATGGTTACTGGC TTGT rACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCT CCTCA B-HEfó CAGGTGCAAT GGTGCAGTCTGGCGG GAAGTTAA 39 GAAGCCTGGQAGTTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGG CTI CGGATACGCCTTCAGCTA TCTXGGATCAATT GGGTGCGGCAGGCGCCTGGACAAGGGC CGAGTG GATCGGACGGATCTTTCCCGGCGATGGGGATACTG ACTACAATGGGAÁATTCAAGGGCAGAGTCÁCAAT ACCGCCGACAAATCCACTAGCÁCAGCCTATATGGA GCTGÁGCÁGGCTGAGÁTC GAGGACACGGCCGTGT ATTACTGTGCAAGAAATGTCT TGATGGI ACTGGC TTGTTTACTGGGGCCAGGGAACCC GGTCACCGTCT CCTCA B-BH7 CAGGTGCÁATTGGTGCAGTC GGCGCTGAÁGTTAA 41 GAAGCCTGGGAGT CAGTGAAGGTCreCTGCAAGG CTfCCGGATACGCCTTCAGCTATTCTTGGATCTCGT GGGTGCGGCÁGGCGCCTGGACAÁGGGCTCGAGTG GÁTGGGACGGATCTTTCCCGGCGATGGGGATACTG ÁCrACAATGGGAAAl CAAGGGCAGAGTCACAAT ACCGCCGACAAATCCACTAGCACAGCCTATATGGA GCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGT ATTACTGTGCAAGAAATG CT TGATGGTTACTGGC TrGTTTACTGGGGCCÁGGGAÁCCCTGGTCACCGTCT CCTCA B-HHS CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGCGCTGAAGTTAA 43 GAAGCCTGGCGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGG CTTCCGGATÁCACCTTCACATACAGCTGGATGÁAC TGGGTGCGGGAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTG GATGGGACGGATCTTTCCCGGCGATGGGGATACTG ACTACAATGGGAAATTCÁAGGGCAGAGTCAGAATT 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SECUENCIA DE AMINOACIDO SEO ID NO -HL2 OLVOSGÁEVKKPGÁ VinSCKVSGYI ySmíaWV 50 OOAPGKGLE MGRIFPGDGDTDyAEKFOGEyrirADTS TOTÁYMEtSSLRSEDTÁVWCÁ'mVEDGY LVY GOG TLVTVSS B-HL3 EVOLVOSGAEVKKPGATVOSí^VSGYTFTYS MJWV 52 OOAPGKGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKG VTITADTS mTA MELSSLRSEDTAYYYCA- VFDGYWLVY GOG ILVTVSS B-HL4 OMOLVOSGABVKKTGSSV VSCfASGYTT^SWMSWV 54 ROAPGOGLEWMGRIFPGDGD DYAOKFOGRVTI ADKS TSTAYNIELSSLRSBl>TAVYY(¾R VEDGYM,VYWGOG TLVTVSS B-HL8 EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFn?SYOTMNWVR 56 OAPGKGL GRIEPGDGDTDYNGICFKGRVTITADKST STAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVTFTJGYWLVYWGOGT LVTVSS B-HL10 EVOIJVESGGGLV ZPGGSLRLSCÁASGFÁFSYSWMNWVR 58 OA GKGÍ,BWGRTFPGDGDIDYNG H£GRVTITADK:STS TAY¾£EI£SLRSEDTAVYYCÁ:R'NVFDGYWLVYWGOGTL TVSS B-HL11 OVOL\nBSGGGLVKPGGSLRLSCAASGITFSYS &INWVR 60 OABGKGLBWVGRIEPGDGDTDYMGKFKGRVTITAB ST STAYl^«SSIRSF,]DTAyWCAR WDGYWI,VYWGGGT LVTVSS B-HL12 BVOLVESGAGLV PGGSLRLSCAASGJ^SYSWMN VR O PG^GLEWMGRETGDGDTOYNGKFKGRVTITADKST STAYMBLSSmSEDTAVYYCASlWinDGYWLVYWGOGT LVTVSS B-HLÍ3 BVOLVESGGGVV PGGSimSCAASGFiySYSWM WVR 64 OA GKGLBWMGIRIFPGDGDTDYNGKFKGRVOTADESTS TAYMELSSmSEDTAVWCARHWDGYWLVYVVGOGTL VTVSS B-HL14 BVOLVESGGGLSXPGGSLRl^CAASG IÍSYS MNWVR 66 OAPGKGLEWMGRIFPGDGDTDYNG F GRVTrrAD STS TAY EISSLRSEDTAVYYCARNVr^GY LVYWGGGTL VTVSS B-HLÍ5 EVOLVESGGGLVKPGSSm,SCAASGFTFSYSWMNWVR 68 OAPGKGLEWMGR!FPGDGDTDWGKB GRVTITADKST STAYMELSSLRSmTAVYYCARm^DGY LVYWGOGT LVTVSS B-HL16 EVOLVBSGGGLVKPGGSTRVSCAASGFTFSYSWMNWVR 20 OAPGKGLBmíGRIEPGDGDTDYNGKF GRVTITADISTS TAYMELSSLRSBDTAVYYCARN DGYWLVYWGOGTL VTVSS B-BL17 EVOLVESGGGLV JGGSIJRI^CAASGFTTSYS MNWVR 11 OARGKGLBmiGRIFPGDGDTDYNGES GRVTiTAD ST STAYMBLSSLRSEDTAVYYCARNWDGYWLVY GOGT LVTVSS Secuencia de MD TWRDLFLVAAATGAHS lá señal VH CONSTRUCTO SECUENCIA DE AMINOACIDO SEOBDNO B-K.V1 DIVMrOTPLSLPVTPQEPASTSn SgKSLLHSMOjETYLYWY 76 LOKPGOSPOLLIYOMSNLVSGWDRFSGSÜSGTDFrmg RVBAEDVGVYYCAONLir-PYTFGGGTKVEIKRTV Secuencia de MDMRVPAOI GLLLLWEfPGARC 71 señal VH En otra modalidad preferida, la presente invención se dirige a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que codifica a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la FIG. ó FIG. 2. la invención se dirige además a un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de al menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia de nucleótidos que se muestra en la FIG. 5 ó FIG. 6. En otra modalidad, la invención se dirige a un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos FIG. 5 ó FIG. 6. La invención también abarca un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las FIG. 1, FIG. 2, FIG. 5 ó FIG. 6 con sustituciones conservadoras de aminoácidos . En otra modalidad, la presente invención se dirige a un vector de expresión y/o células hospedera que comprende uno o más polinucleótidos aislados de la presente invención. Generalmente, se puede usar cualquier tipo de linea celular cultivada para expresar las ABM de la presente invención. En una modalidad preferida, las células CHO, células BHK, células NSO, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63 , células PER, células PER.C6 o células de hibridoma, otras células de mamíferos, células de levadura, células de insecto, o células de planta se usan como la línea celular de respaldo para generar las células hospederas preparadas por ingeniería de la invención.
La eficacia terapéutica de las ABM de la presente invención se puede potenciar al producirlas en una célula hospedera que exprese además un polinucleótido que codifica aun polipéptido que tiene la actividad GnTIII. En una modalidad preferida, el polipéptido que tiene la actividad GnTIII es un polipéptido de fusión que comprende el dominio de localización de Golgi de un polipéptido residente en Golgi . En otra modalidad preferida, la expresión de las ABM de la presente invención en una célula hospedera que expresa un polinucleótido que expresa a un polipéptido que tiene actividad GNTIII resulta en ABMs con una afinidad de enlace a el receptor Fe incrementada y una funsión del efector incrementada. De esta manera en una modalidad, la presente invención se dirige a una célula hospedera que comprende (a) un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un péptido que tiene actividad GnTIII; y (b) un polinucleótido aislado que codifica una ABM de la presente invención, tal como un anticuerpos quimérico, primatizado o humanizado que se enlaza a el CD20 humano. En una modalidad preferida, el polipéptido que tiene actividad GnTIII es un polipéptido de fusión que comprende el dominio catalítico de GnTIII y el dominio de localización Golgi es el dominio de localización de la manosidasa II. Los métodos para generar tales péptidos de fusión y su uso para producir anticuerpos con funciones del efector incrementadas se describen en la solicitud de patente provisional de E.U.A. No. 60/495,142, los contenidos completos de la cual se incorporan expresamente como referencia en la presente . En otra modalidad preferida, la ABM quimérica es un anticuerpo quimérico o un fragmento del mismo que tiene la especificidad de enlace del anticuerpo murino B-LY1. En una modalidad particularmente preferida, el anticuerpo quimérico comprende un Fe humano. En otra modalidad preferida, el anticuerpo esta primatizado o humanizado. En una modalidad, uno o varios polinucleótidos que codifican una ABM de la presente invención se pueden expresar bajo el control de un promotor constitutivo o alternativamente, un sistema de expresión regulado. Los sistema de expresión regulados adecuados incluyen, pero no se limitan a, sistema de expresión regulado con tetraciclina, un sistema de expresión inducible con ecdisona, un sistema de expresión de interrupción lac, un sistema de expresión inducible con glucocorticoides, un sistema promotor inducible con temperatura, y un sistema de expresión inducible con un metal de metalotioneina . Si se comprenden diversos ácidos nucleicos diferentes que codifiquen un ABM de la presente invención dentro del sistema de la célula hospedera, algunos de ellos se pueden expresar bajo el control de un promotor constitutivo mientras que otros se expresan bajo el control de un promotor regulado. El nivel de expresión máxima se considera que es el nivel más elevado posible de expresión estable de polipéptidos que no tiene un efecto adverso importante en la velocidad de crecimiento celular y se determinara usando experimentación de rutina. Los niveles de expresión se determinan por métodos generalmente conocidos en el arte, incluyendo un análisis de inmunotransferencia Western usando un anticuerpo específico para la ABM o un anticuerpo específico para la etiqueta de péptidos fusionada al ABM; y un análisis de inmunotransferencia Northern. En una alternativa adiciona, el polinucleótido se puede ligar operativamente a un gen reportero; los niveles de expresión de un ABM quimérico tienen substancialmente la misma especificidad de enlace del anticuerpo murino B-Lyl se determinan al medir una señal correlacionada con el nivel de expresión del gen reportero. El gen reportero se puede transcribir junto con los ácidos nucleicos que codifican el polipéptido de fusión como una molécula sencilla de ARNm; sus secuencias de codificación respectiva se pueden ligar ya sea por un sitio de entrada interno a ribosomas (IRES) o por un potenciador de la traducción independiente del cierre (CITE) . El gen reportero se pueden traducir junto con al menos un ácido nucleico que codifique una ABM quimérica que tiene substancialmente la misma especificidad de enlace del anticuerpo murino B-Lyl de manera tal que se forme una cadena sencilla de polipéptidos . Los ácidos nucleicos que codifiquen las ABM de la presente invención se pueden ligar operativamente al gen reportero bajo el control de un promotor sencillo de manera tal que el ácido nucleico que codifica el polipéptido de fusión y el gen reportero se transcriban en una molécula de ARN la cual se empalma alternativamente en dos moléculas separadas de ARN mensajero (ARNm) ; uno de los ARNm resultantes se traduce en la proteína reportera y el otro se traduce en el polipéptido de fusión. Los métodos que son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica se pueden usar para construir vectores de expresión que contengan las secuencia de codificación de una ABM que tenga substancialmente la misma especificidad de enlace del anticuerpo murino B-Lyl junto con las señales de control adecuadas de la transcripción y de la traducción. Estos métodos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación in vivo y recombinación genética. Ver por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis et al., MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989) and Ausubel et al., CURTEN PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience , N. Y. (1989) . Se pueden utilizar una diversidad de sistemas de vector de expresión hospedero para expresar la secuencia de codificación de las ABM de la presente invención. Preferiblemente, se usan células mamíferas como sistemas de células hospederas transíectadas con ADN de plásmido recombinante o vectores de expresión de ADN cósmido que contienen la secuencia de codificación de la proteína de interés y la secuencia de codificación del polipéptido de fusión. Más preferiblemente, las células CHO, células BKH, células NSO, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma, otras células de mamífero, células de levadura, células de insecto, o células de planta se usan como el sistema de célula hospedera. Algunos ejemplos de los sistemas de expresión y métodos de selección se describen en las siguientes referencias, y referencias en esta: Borth et al., Biotechnol. Bioen. 71 (4):266-73 (2000-2001), in Werner et al., Arzneimittelforschung/Drug Res. 48(8):870-80 (1998), in Andersen and Krummen, Curr. Op. Biotechnol . 13:117-123 (2002), in Chadd and Chamow, Curr. Op. Biotechnol. 12:188-194 (2001), and in Giddings, Curr. Op. Biotechnol. 12: 450-454 (2001). En modalidades alternativas, otros sistemas de célula hospedera eucariótica pueden contemplarse, incluyendo células de levadura transformadas con vectores de expresión de levadura recombinantes que contiene la secuencia de codificación de un ABM de la presente invención; sistemas de célula de insecto infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo baculovirus) que contienen la secuencia de codificación de la ABM quimérica que tiene substancialmente la misma especificidad de enlace del anticuerpo B-Lyl murino, sistemas de célula de planta infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo virus de mosaico de coliflor, CaMV; virus de mosaico de tabaco, TMV) o transformados con los vectores de expresión plásmidos recombinantes (por ejemplo plásmido Ti) que contiene la secuencia de codificación de la ABM de la invención; o sistemas de célula de animales infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, adenovirus, virus de vacuna) incluyendo líneas de células procesadas por ingeniería para contener copias múltiples del ADN que codifica la ABM quimérica que tiene substancialmente la misma especificidad de enlace del anticuerpo B-Lyl murino ya sea amplificado establemente (CHO/dhfr) o amplificado inestablemente en cromosomas de doble minuto (por ejemplo lineas de células de murino) . En otra modalidad, el vector comprende los polinucleótidos que codifica la ABM de la invención es policistrónico . También, en una modalidad, la ABM discutida arriba es un anticuerpo o fragmento de la misma. En una modalidad preferida, la ABM es un anticuerpo humanizado. Para los métodos de esta invención, la expresión estable generalmente se prefiere para la expresión transitoria debido a que típicamente alcanza resultados más reproducibles y también es más receptivo a una producción a gran escala. En vez de usar vectores de expresión que contienen orígenes virales de replicación, las células hospederas pueden transformarse con los respectivos ácidos nucleicos codificados controlados por elementos de control de expresión apropiados (por ejemplo, promotor, aumentador, secuencias, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador de selección. Después de la introducción del ADN externo, las células procesadas por ingeniería pueden permitirse que crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido, y luego se desvían a un medio selectivo. El marcador selección en el plásmido reco binante confiere resistencia a la selección y permite la selección de células que tienen integrado establemente el plásmido en sus cromosomas y crecen para formar focos que de nuevo pueden clonarse y expandirse en las lineas celulares. Un número de sistemas de selección pueden usarse incluyendo, pero no limitados a, genes de la timidina cinasa del virus de herpes simples ( igler et al., Cell 11:223 (1977) ) , hipoxantina-guanina fos oribosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, Proc . Nati. Acad. Sci . USA 48: 2026 (1962)), y adenina fosforibosiltransferasa (Lowy et al., Cell 22:817 (1980)), que pueden emplearse en células tk~, hgprt" o aprt", respectivamente. También, puede usarse resistencia antimetabolito como la base de selección para dhfr, que confiere resistencia a los genes de metotrexato (Wigler et al., Nati. Acad. Sci. USA 77:3567 (1998); O'Hare et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)); gpt, que confiere resistencia al ácido nicofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); neo, que confiere resistencia al aminoglicosido G-418 (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol.. 150:1 (1981)); e higro, que confiere resistencia a higromicina (Santerre et al., Gene 30:147 (1984) . Recientemente, se han descrito genes seleccionables adicionales, principalmente trpB, que permite que las células utilicen indol en lugar de triptof no; hisD, que permite que las células utilizan histinol en lugar de histidina (Hartman & Mulligan, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:8047 (1988)); el sistema de glutamina sintasa; y ODC (ornitina descarboxilasa) que confiere resistencia al inhibidor del ornitina descarboxilasa, 2 - (difluorometil) -DL-ornitina, DFMO (McConlogue, in: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed. (1987) ) . La presente invención se dirige además a un método para modificar el perfil de glicosilación de las ABM de la presente invención que se producen por una célula hospedera, que comprende expresar en la célula hospedera un ácido nucleico que codifica un ABM de la invención y un ácido nucleico que codifica el polipéptido con actividad GnTIII, o un vector que comprende tales ácidos nucleicos. Preferiblemente, el polipéptido modificado es IgG o un fragmento del mismo que comprende la región Fe. En una modalidad particularmente preferida, la ABM es un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo. Las ABM modificadas producidos por las células hospederas de la invención exhiben afinidad de enlace del receptor Fe y/o función efectora incrementada como resultado de la modificación. En una modalidad particularmente preferida, la ABM es un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo que contiene la región Fe. Preferiblemente, la afinidad de enlace del receptor Fe incrementada se incrementa enlazando a un receptor que activa Fcy, tal como el receptor FcyRIIIa. La función efectora incrementada es preferiblemente un incremento en uno o más de los siguientes : citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo incrementada, fagocitosis celular dependiente del anticuerpo incrementada (ADCP) , secreción de citosina incrementada, absorción del antígeno mediada por el complejo inmune incrementada por células que presentan antígeno, citotoxicidad celular mediada por Fe incrementada, enlace incrementado a células NK, enlace incrementado a macrófagos, enlace incrementado a células poli orfonucleares (PM s) , enlace incrementado a monocitos, reticulación incrementada de anticuerpos enlazados al objetivo, apoptosis inducida por la señalización directa incrementada, maduración celular dendritica incrementada y cebado de célula T incrementado. La presente invención también se dirige a un método para producir una ABM de la presente invención, que tiene oligosacáridos modificados en la célula hospedera que comprende (a) cultivar la célula hospedera producida por ingeniería para expresar al menos un ácido nucleico que codifica el polipéptido que tiene actividad GnTIII bajo condiciones que permiten la producción de un ABM de conformidad con la presente invención, en donde el polipéptido que tiene actividad GnTII se expresa en una cantidad suficiente para modificar los oligosacáridos en la región Fe de las ABM producidas por la célula hospedera; y (b) aislar la ABM. En una modalidad preferida, el polipéptido que tiene la actividad GnTIII es un polipéptido de fusión que comprende el dominio catalítico de GnTIII. En una modalidad particularmente preferida, el polipéptido de fusión comprende además el dominio de localización Golgi del polipéptido resiente Golgi. Preferiblemente, el dominio de localización Golgi es el dominio de localización de la manosidasa II o GnTI . Alterna ivamente, el dominio de localización Golgi se selecciona del grupo que consiste de: el dominio de localización de manosidasa I, el dominio de localización de GnTII, y el dominio de localización de una fucosiltransferasa del núcleo a 1-6. Las AB producidas por los métodos de la presente invención tiene una afinidad de enlace al receptor Fe incrementada y/o una función efectora incrementada. Preferiblemente, la función efectora incrementada es una o más de las siguientes: citoxicidad mediada por Fe incrementada (que incluye citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo incrementada) , fagocitosis celular dependiente del anticuerpo incrementada (ADCP) , secreción de citosina incrementada, absorción del antígeno mediada por el complejo inmune incrementada por células que presentan antígeno, enlace incrementado a células K, enlace incrementado a macrófagos, enlace incrementado a monocitos, enlace incrementado a células polimorfonucleares, apoptosis inducida por la señalización directa incrementada, reticulación incrementada de anticuerpos enlazados al objetivo, maduración de célula dendrítica incrementada, o cebado de célula T incrementado. La afinidad de enlace al receptor Fe incrementada se incrementa preferiblemente enlazando a receptores que activan Fe tal como FcyRIIIa. En una modalidad particularmente preferida, la ABM es un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo. En otra modalidad, la presente invención se dirige una ABM quimérica que tiene substancialmente la misma especificidad de enlace del anticuerpos B-Lyl murino producido por los métodos de la invención que tienen una proporción incrementada de oligosacáridos biseccionados en la región Fe del polipéptido. Se contempla que tal ABM abarque anticuerpos y fragmentos del mismo que comprenden la región Fe. En una modalidad preferida, la ABM es un anticuerpo humanizado. En una modalidad, el porcentaje de oligosacáridos biseccionados en la región Fe de la ABM es al menos 50%, más preferiblemente al menos 60%, al menos 70%, al menos 80% o al menos 90% y aún más preferiblemente al menos 90-95% de los oligosacáridos totales. Aún en otra modalidad, la ABM producido por los métodos de la invención tiene una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en la región Fe como resultado de la modificación de sus oligosacáridos por los métodos de la presente invención. En una modalidad, el porcentaje de oligosacáridos no fucosilados es de al menos 50%, preferiblemente al menos 60% hasta 70%, más preferiblemente al menos 75%. Los oligosacáridos no fucosilados pueden ser del tipo híbrido o de complejo. En una modalidad particularmente preferida, la ABM producida por las células hospederas y métodos de la invención tiene una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados biseccionados , en la región Fe. Los oligosacáridos no fucosilados, biseccionados pueden ser ya sea híbridos o de complejo. Específicamente, los métodos de la presente invención pueden usarse para producir ABM en los cuales al menos 15%, más preferiblemente al menos 20%, más preferiblemente al menos 25%, más preferiblemente al menos 30%, más preferiblemente al menos 35% de los oligosacáridos en la región Fe de la ABM son no fucosilados, biseccionados. Los métodos de la presente invención también pueden usarse para producir polipéptidos en los cuales al menos 15%, más preferiblemente al menos 20%, más preferiblemente al menos 25%, más preferiblemente al menos 30%, más preferiblemente al menos 35% de los oligosacáridos en la región Fe del polipéptido son no fucosilados híbridos biseccionados. En otra modalidad, la presente invención se dirige a una ABM quimérica que tiene substancialmente la misma especificidad de enlace del anticuerpo B-Lyl murino producido por ingeniería para tener una función efectora incrementada y/o afinidad de enlace del receptor Fe incrementada, producido por los métodos de la invención. Preferiblemente, la función efectora incrementada es una o más de las siguientes: citotoxicidad celular mediada por Fe incrementada (que incluye citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo incrementada) , fagocitosis celular dependiente del anticuerpo incrementada (ADCP) , secreción de citosina incrementada, absorción del antlgeno mediada por el complejo inmune incrementada por células que presentan antígeno, enlace incrementado a células NK, enlace incrementado a macrófagos, enlace incrementado a monocitos, enlace incrementado a células polimorfonucleares , apoptosis inducida por señalización directa incrementada, reticulado incrementado de anticuerpos enlazados al objetivo, maduración de célula dendrítica incrementada, o cebado de célula T incrementado. En una modalidad preferida, la afinidad de enlace al receptor Fe incrementada se incrementa al enlazar a un receptor que activa Fe, más preferiblemente FcyRIIIa. En una modalidad, la ABM es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo que contiene la región Fe o una proteina de fusión que incluye la región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina . En una modalidad particularmente preferida, la ABM es un anticuerpo humanizado. La presente invención se dirige además a composiciones farmacéuticas que comprenden las ABM de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable. La presente invención se dirige además al uso de tales composiciones farmacéuticas en un método para tratar el cáncer. Específicamente, la presente invención se dirige a un método para el tratamiento del cáncer que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica de la invención. La presente invención proporciona además métodos para la generación y el uso de sistemas de célula hospedera para la producción de glicoformas de las ABM de la presente invención, que tienen afinidad de enlace del receptor Fe incrementada, preferiblemente enlace incrementado a los receptores que activan Fe, y/o que tienen funciones efectoras incrementadas, incluyendo citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo. La metodología de glicoingeniería que puede usarse con las ABM de la presente invención se ha descrito en mayor detalle en la Patente E.U.A. No. 6,602,684 y la solicitud de Patente E.U.A. Provisional No. 60/441,307 y WO 2004/065540, los contenidos completos de cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. Las ABM de la presente invención pueden alternativamente procesarse por glicoingeniería para tener residuos de fucosa reducidos en la región Fe de conformidad con las técnicas descritas en EP 1 176 195 Al, los contenidos de las cuales se incorporan para referencia en la presente.
Generación de Líneas Celulares para la Producción de Proteínas con Patrón de Glicosilación Alterado La presente invención proporciona sistemas de expresión de células hospederas para la generación de las ABM de la presente invención que tienen patrones de glicosilación modificados. En particular, la presente invención proporciona sistemas de célula hospedera para la generación de glicoformas de las ABM de la presente invención que tienen un valor terapéutico mejorado. Por lo tanto, la invención proporciona sistemas de expresión de célula hospedera seleccionados o procesados por ingeniería para expresar un polipéptido que tiene actividad GnTIII. En una modalidad, el polipeptido que tienen actividad GnTIII es un polipéptido de fusión que comprende el dominio de localización Golgi de un polipéptido residente Golgi heterólogo. Específicamente, tales sistemas de expresión de célula hospedera pueden procesarse por ingeniería para comprende una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido que tiene GnTIII, ligado operativamente a un sistema promotor constitutivo o regulado . En una modalidad específica, la presente invención proporciona una célula hospedera que se ha procesado por ingeniería para expresar al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión que tiene actividad GnTIII y comprende el dominio de localización Golgi de un polipéptido residente Golgi. En un aspecto, la célula hospedera se procesa por ingeniería con una molécula de ácido nucleico que comprende al menos un gen que codifica un polipéptido de fusión que tiene actividad GnTIII y comprende el dominio de localización Golgi de un polipéptido residente Golgi . Generalmente, cualquier tipo de línea celular cultivada, incluyendo las lineas celulares discutidas arriba, pueden usarse como un respaldo para procesar por ingeniería las líneas de célula hospedera de la presente invención. En una modalidad preferida, las células CHO, células BHK, células NSO, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63 , células PER, células PE . C6 o células de hibridoma, otras células de mamífero, células de levadura, células de insectos, o células de plantas se usan como la línea celular de respaldo para generar las células hospederas procesadas por ingeniería de la invención. La invención se contempla que abarque cualquiera de las células hospederas procesadas por ingeniería que expresan el polipéptido que tiene actividad GnTII, incluyendo un polipéptido de fusión que comprende el dominio de localización Golgi de, polipéptido residente Golgi heterologo como se define en la presente . Uno o varios ácidos nucleicos que codifican el polipéptido que tiene actividad GnTIII pueden expresarse bajo el control de un promotor constitutivo o, alternativamente, un sistema de expresión regulado. Tales sistemas son bien conocidos en la técnica, e incluyen los sistemas discutidos arriba. Si varios polipéptidos de fusión que codifican ácidos nucleicos diferentes que tienen actividad GnTIII y que comprenden el dominio de localización Golgi de un polipeptido residente Golgi heterólogo están comprendidos dentro del sistema de célula hospedera, algunos de estos pueden expresarse bajo el control de un promotor constitutivo, mientras que otros se expresan bajo el control de un promotor regulador. Los niveles de expresión de los polipéptidos de fusión que tienen actividad GnTIII se determinan por métodos conocidos generalmente en la técnica, que incluyen análisis de manchado Western, análisis de manchado Northern, análisis de expresión del gen reportero o medición de la actividad GnTIII. Alternativamente, la lecitina puede emplearse la cual enlaza a productos biosintéticos del GnTIII, por ejemplo lectina E4-PHA. Alternativamente, el ensayo funcional que mide el incremento del enlace del receptor Fe o función efectora incrementada mediada por anticuerpos producidos por las células procesadas por ingeniería con el ácido nucleico que codifica el polipéptido con actividad GnTIII, pueden usarse .
Identificación de Transfectantes o Transformantes que Expresan la Proteína que Tiene un Patrón de Glicosilación Modificado Las células hospederas que contienen la secuencia de codificación de la ABM quimérica substancialmente tienen la misma especificidad de enlace del anticuerpo B-Lyl murino y que expresan los productos de gen biológicamente activados pueden identificarse por al menos cuatro enfoques; (a) hibridizacion ADN-ADN o ADN-ARN; (b) la presencia o ausencia de funciones de gen "marcador"; (c) evaluar el nivel de transcripción como se mide por la expresión de los transcriptos de ARNm respectivos en la célula hospedera; y (d) detección del producto de gen como se mide por el inmunoensayo o por su actividad biológica. En el primer enfoque, la presencia de la secuencia de codificación de la ABM quimérica substancialmente tiene la misma especificidad de enlaza del anticuerpo B-Lyl murino y la secuencia ide codificación del polipéptido que tiene actividad GnTIII puede detectarse por hibridizacion ADN-ADN o ADN-ARN usando sondas que comprenden secuencias de nucleotido que son homologas a las respectivas secuencias de codificación, respectivamente, o porciones o derivados de los mismos. En el segundo enfoque, el sistema vector/hospedero de expresión recombinante puede identificarse y seleccionarse con base en la presencia o ausencia de ciertas funciones del gen "marcador" (por ejemplo, actividad de timidina cinasa, resistencia a antibióticos, resistencia al metotrexato, fenotipo de transformación, formación de cuerpo de oclusión en baculovirus, etc) . Por ejemplo, si la secuencia de codificación de la ABM de la invención, o un fragmento de la misma, y la secuencia de codificación del polipeptido que tiene GnTIII se insertan dentro de la secuencia de gen marcador del vector, los recombinantes que contienen las respectivas secuencias de codificación pueden identificarse por la ausencia de la función del gen marcador. Alternativamente, el gen marcador puede colocarse en tándem con las secuencias de codificación bajo el control del mismo o diferente promotor usado para controlar la expresión de las secuencias de codificación. La expresión del marcador en respuesta a la inducción o selección indica la expresión de la secuencia de codificación de la ABM de la invención y la secuencia de codificación del polipeptido que tiene actividad GnTIII. En el tercer enfoque, la actividad transcripcional para la región de codificación de la ABM de la invención, o un fragmento del mismo, y la secuencia de codificación del polipéptido que tiene actividad GnTIII puede evaluarse por ensayos de hibridización. Por ejemplo, el ARN puede aislarse y analizarse por manchado Northern usando una sonda homologa a las secuencias de codificación de la ABM de la invención, o un fragmento de la misma, y la secuencia de codificación del polipéptido que tiene actividad GnTIII o porciones particulares de la misma. Alternativamente, los ácidos nucleicos totales de la célula hospedera pueden extraerse y evaluarse para la hibridización de tales sondas. En el cuarto enfoque, la expresión de los productos de proteínas pueden evaluarse inmunológicamente, por ejemplo, por manchados Western, inmunoensayos tales como radioinmunoprecipitación, inmunoensayos ligados a la enzima y los similares. La última prueba del éxito del sistema de expresión, sin embargo, involucra la detección de los productos de gen biológicamente activo.
Generación y Uso de ABM Que Tienen Función Efectora Incrementada Incluyendo Citotoxicidad Celular Dependiente del Anticuerpo En modalidades preferidas, la presente invención proporciona glicoformas de ABM quiméricas que tienen substancialmente la misma especificidad de enlace del anticuerpo B-Lyl murino y que tiene una función efectora incrementada que incluye citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo. La glicosilacion producida por ingeniería de los anticuerpos se ha descrito previamente. Ver, por ejemplo, Patente E.U.A. No. 6,602,684, incorporada en la presente para referencia en su totalidad. Los ensayos clínicos de anticuerpos monoclonales no conjugados (mAbs) para el tratamiento de algunos tipos de cáncer, recientemente han producido resultados alentadores. Dillman, Cáncer Biother. & Radiopharm. 12:223-25 (1997); Deo et al., Immunology Today 18:127 (1997). Un IgGl no conjugado, quimérico, se ha aprobado para linfoma no de Hodgkin de célula B folicular o de bajo grado. Dillman, Cáncer Biother. & Radiopharm. 12:223-25 (1997), mientras que otro mAb no conjugado, un IgGl humanizado dirigido a tumores de mama sólidos, también ha mostrado resultados prometedores en ensayos clínicos de fase III. Deo et al., Immunology Today 18:127 (1997) . Los antígenos de estos dos mAbs se expresan altamente en sus respectivas células de tumor y los anticuerpos median la destrucción de tumor potente por células efectoras in vitro e in vivo. En contraste, muchos no conjugados mAbs con especificidades de tumor finas no dispara las funciones efectoras de potencia suficiente para ser clínicamente útiles. Frost et al., Cáncer 80:317-33 (1997); Surfus et al., J. Immunother. 19:184-91 (1996). Para algunos de estos mAbs débiles, la terapia de citosina adjunta está actualmente probándose. La adición de las citoquinas puede estimular la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (DAC) al incrementar la actividad y número de linfocitos circulantes. Frost et al., Cáncer 80:317-33 (1997); Surfus et al., J. Immunother. 19:184-91 (1996). El DAC, un ataque lítico en células dirigidas al anticuerpo, se dispara durante el enlace de receptores de leucocito a la región constante (Fe) de anticuerpos. Deo et al., Immunology Today 18:127 (1997) . Un enfoque diferente, pero complementario, para incrementar la actividad DAC de los IgGl no conjugados es el procesar por ingeniería la región Fe del anticuerpo. Los estudios de procesamiento por ingeniería han mostrado que los FcyRs interactúan con la región de articulación inferior del dominio IgG CH2. Lund et al., J. Immunol . 157:4963-69 (1996). Sin embargo, el enlace FcyR también requiere la presencia de oligosacáridos enlazados covalentemente también requiere la presencia de oligosacáridos enlazados covalentes al Asn 297 conservado en la región CH2. Lund et al., J. Immunol. 157:4963-69 (1996); Wright and Morrison, Trends Biotech. 15:26-31 (1997), lo que sugiere que cualquiera del oligosacárido y polipéptido ambos contribuyen directamente al sitio de interacción o que el oligosacárido se requiere para mantener una conformación de polipéptido CH2 activa. La modificación de la estructura de oligosacárido puede por lo tanto explorarse como un medio para incrementar la afinidad de la interacción. Una molécula IgG porta dos oligosacáridos ligados a N en su región Fe, uno en cada cadena pesada. Como cualquier oligoprotelna, un anticuerpo se produce como una población de glicoformas que portan la misma estructura de polipéptido pero tienen diferentes oligosacáridos enlazados a los sitios de glicosilación . Los oligosacáridos normalmente encontrados en la región Fe del IgG de suero son del tipo complejo ci-antenario (Wormald et al . , Biochemistry 36:130-38 (1997), con un nivel bajo de ácido siálico terminal y N-acetilglucosamina biseccionado (GlcNAc) , y un grado variable de galactosilación terminal y fucosilación de núcleo. Algunos estudios sugieren que la estructura de carbonato mínima requerida para enlazar FcyR se encuentra dentro del núcleo de oligosacárido . Lund et al., J. Immunol. 157:4963-69 (1996). Las líneas de célula derivadas de ratón o hámster usadas en la industria y academia para la producción de mAbs terapéuticos no conjugados normalmente el enlace requiere determinantes de oligosacáridos a los sitios Fe. Los IgG expresados en estas líneas de células carecen, sin embargo, del GlcNAc biseccionado encontrado en bajas cantidades en IgG de suero. Lifely et al., Glycobiology 318:813:22 (1995). En contraste, se ha observado recientemente que el IgGl humanizado, producido por mieloma de rata (CAMPATH-1H) porta un GlcNAc biseccionado en algunas de sus glicoformas. Lifely et al., Glycobiology 318:813:22 (1995). El anticuerpo derivado de célula de rata alcanza una actividad DAC in vitro máxima similar como los anticuerpos CAMPATH-1H producidos en líneas de células estándar, pero a concentraciones de anticuerpo significativamente inferiores. El antígeno CAMPATH normalmente se presenta a niveles superiores en las células de linfoma, y su mAb quimérico tiene una alta actividad DAC en ausencia de GlcNAc biseccionado. Lifely et al., Glycobiology 318:813:22 (1995). En la trayectoria de glicosilacion ligada a N, el GlcNAc biseccionado se agrega por GnTIII. Schachter, Biochem. Cell Biol. 64:163-81 (1986). Estudios previos usando una línea de célula CHO que produce anticuerpo sencillo, que se produce por ingeniería previamente para expresar, en una forma externamente regulada, niveles diferentes de una enzima de gen GnT III clonada (Umana, P., et al., Nature Biotechnol . 17:176-180 (1999) ) . Este enfoque se establece para el primer momento de correlación rigurosa entre la expresión de GnTIII y la actividad DAC del anticuerpo modificado. De esta manera, la invención contempla un anticuerpo quimérico, recombinante, o fragmento del mismo con la especificidad de enlace del anticuerpo B-Lyl de murino, que tiene glicosilacion alterada que resulta de la actividad GnTIII incrementada. La actividad GnTIII incrementada resulta en un incremento en el porcentaje de oligosacáridos bíseccionados , así como una reducción en el porcentaje de residuos de fucosa, en la región Fe de la ABM. Este anticuerpo, o fragmento del mismo, tiene una afinidad de enlace al receptor Fe y una función efectora incrementada. Además, la invención se dirige a un fragmento de anticuerpo y proteínas de fusión que comprende una región que es equivalente a la región Fe de inmuno-globulinas .
Aplicaciones Terapéuticas de ABM Producidos De Conformidad con los Métodos de la Invención Las ABM de la presente pueden usarse solas para direccionar y eliminar células de tumor in vivo. Las ABM también pueden usarse en conjunto con un agente terapéutico apropiado para tratar el carcinoma humano. Por ejemplo, las ABM pueden usarse en combinación con métodos de tratamiento estándar o convencionales tales como quimioterapia, terapia de radiación o pueden conjugarse o ligarse a un fármaco terapéutico, o toxina, así como a una linfocina o un factor de crecimiento inhibidor de tumor, para administrar el agente terapéutico al sitio del carcinoma. Los conjugados de las ABM de esta invención que son de importancia primordial son (1) inmunotoxinas (conjugados de la ABM y una porción citotóxica) y (2) ABM etiquetadas (por ejemplo, radioetiquetados, etiquetados a la enzima, o etiquetados por fluorocromo) en los cuales la etiqueta proporciona un medio para identificar complejos inmunes que incluyen la ABM etiquetada. Las ABM también pueden usarse para inducir la lisis a través del proceso de complemento natural, y para interactuar con células citotóxicas dependientes del anticuerpo presentes normalmente . La porción citotóxica de la inmunotoxina puede ser un fármaco citotóxico o una toxina enzimaticamente activa de origen bacterial o de planta, o un fragmento enzimaticamente activo ("cadena A") de tal toxina. Las toxinas enzimaticamente activas y fragmentos de las mismas usadas son cadena de difteria A, fragmentos activos no enlazados de toxina de difteria, cadena de exotixina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modecina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolacca amercicana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcína, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina y enomicina. En otra modalidad, las ABM se conjugan a fármacos anticáncer de molécula pequeña. Los conjugados de la ABM y tales porciones citotóxicas se han usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncional . Los ejemplos de tales reactivos son SPDP, IT, derivados bifuncionales de imidoésteres tales como dimetil adipimidato HCl, esteres activos tales como disuccinimidil suberato, aldehidos tales como glutaraldehído, compuestos bi-azido tales como bis (p-azudobenzoil) hexandiamina, derivados de bis-diazonio tales como bis- (p-diazoniobezoil) -etilendiamina, diisocianatos tales como tolilen 2, 6-diisocianato, y compuestos de flúor bis-activos tales como 1 , 5-difluoro-2 , 4-dinitrobenceno . La porción lisada de una toxina puede unirse al fragmento Fab de las ABM. Las toxinas apropiadas adicionales se conocen en la técnica, como se hace evidente en, por ejemplo, la Solicitud de Patente E.U.A. publicada No. 2002/0128448, incorporada en la presente para referencia en su totalidad. En una modalidad, la ABM producida por glicoingeniería, quimérica, tiene substancialmente la misma especificidad de enlace del anticuerpo B-Lyl murino, se conjuga a la cadena de ricina A. Más ventajosamente, la cadena de ricina A se desglicosila y produce a través de medios recombinantes . Un método ventajoso para hacer la inmunotoxina de ricina se describe en Vitetta et al., Science 238, 1098 (1987), por ello incorporada para referencia. Cuando se usa para eliminar células de cáncer humano in vitro para propósitos de diagnóstico, los conjugados se agregan típicamente al medio de cultivo celular a una concentración de al menos alrededor de 10 nM. La formulación y modo de administración para uso in vitro no son críticos. Las formulaciones acuosas que son compatibles con el medio de cultivo o perfusión se usan normalmente. La citotoxicidad puede leerse por técnicas convencionales para determinar la presencia o grado del cáncer. Como se discute arriba, el radiof rmacéutico citotóxico para tratar el cáncer puede hacerse al conjugar un isótopo radioactivo (por ejemplo, I, Y, Pr) a un ABM procesado por glicoingeniería, quimérico, que tiene substancialmente la misma especificidad de enlace del anticuerpo B-Lyl murino. El término "porción citotóxica" como se usa en la presente, se pretende que incluya tales isótopos . En otra modalidad, las liposomas se rellenan con un fármaco citotóxico y las liposomas se recubren con las ABM de la presente invención. Debido a que hay muchas moléculas CD20 en la superficie de la célula B maligna, este método permite administran grandes cantidades del fármaco al tipo de célula correcto . Las técnicas para conjugar tales agentes terapéuticos a los anticuerpos son bien conocidas (ver, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cáncer Therapy" , en onoclonal Antibidies and Cáncer Therapy, eisfeld et al. (eds) , pp . 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2da ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Torpe, "Antibody Carries Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review" , en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol . Rev. , 62 :119-58 (1982) ) . Todavía otras aplicaciones terapéuticas para las ABM de la invención incluyen la conjugación o ligado, por ejemplo, por técnicas de ADN recombinante, a una enzima capaz de convertir un profármaco en un fármaco citotóxico y el uso de tal conjugado anticuerpo-enzima en combinación con el profármaco para convertir el profármaco a un agente citotóxico en el sitio de tumor (ver, por ejemplo, Senter et al., ¾Anti-Tumor Effects of Antibody-alkaline Phosphatase" , Proc. Nati. Acad. Sci . USA 85:4842-46 (1988); "Enhancement of the in vitro and in vivo Antitumor Activites of Phosphorilated Mitocycin C and Etoposides Derivatives by Monoclonal Antibody-Alkaline Phosphatase Conjugates", Cáncer Research 49:5789-5792 (1989); y Senter, "Activation of Prodrugs by Antibody-Enzyme Conjugates: A New Approach to Cáncer Therapy" FASEB J. 4:188-193 (1990)). Todavía otro uso terapéutico para las AB de la invención involucra el uso, ya sea no conjugado, en presencia de complemento, o como parte de un conjugado anticuerpo-fármaco o anticuerpo-toxina, para remover células de tumor de la médula ósea de pacientes con cáncer. De conformidad con este enfoque, la médula ósea autóloga puede purgarse ex vivo por el tratamiento con el anticuerpo y la médula colocarse de nuevo al paciente [ver, por ejemplo, Ramsay et al., "Bone Marrow Purging üsing Monoclonal Antibodies", J. Clin. Immunol., 8(2):81-88 (1988)]. Adicionalmente, se contempla que la invención comprende un dominio enlazado al antígeno que comprende una inmunotoxina de cadena sencilla que permite substancialmente la misma especificidad de enlace como el anticuerpo B-Lyl murino (por ejemplo, polipéptidos que comprende los CDR del anticuerpo B-Lyl murino) y comprende además un polipeptido de toxina. Las inmunotoxinas de cadena sencilla de la invención pueden usarse para tratar carcinoma humano in vivo.
Similarmente, una proteina de fusión que comprende por lo menos la región de enlace a antigenos de un ABM de la invención unido a por lo menos una porción funcionalmente activa de una segunda proteína que tiene actividad antitumor, por ejemplo, una linfocina u oncostatina, se puede usar para el tratamiento de carcinoma humano in vivo. La presente invención proporciona un método para eliminar selectivamente células de tumor que expresan CD20. Este método comprende la reacción del inmunoco jugado (por ejemplo, la inmunotoxina) de la invención con las células de tumor. Estas células de tumor pueden ser de un carcinoma humano . Adicionalmente, esta invención proporciona un método de tratamiento de carcinomas (por ejemplo, carcinomas humanos) in vivo. Este método comprende la administración a un sujeto de una cantidad farmacéuticamente efectiva de una composición que contiene por lo menos uno de los inmunoconjugados (por ejemplo, la inmunotoxina) de la invención.
En un aspecto más, la invención se dirige a un método mejorado para tratar trastornos proliferativos de células B que incluyen linfoma de células B, asi como una enfermedad autoinmune producida totalmente o en parte por los anticuerpos patogénicos, con base en el vaciado de las células B que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un ABM de la presente invención a un sujeto humano en necesidad de éste. En una modalidad preferida, la ABM es un anticuerpo anti-CD20 preparado por glicoingenieria con una especificidad de enlace sustancialmente la misma que la del anticuerpo B-Lyl de murino. En otra modalidad preferida el anticuerpo se humaniza. Ejemplos de enfermedades o trastornos autoinmunes incluyen, pero no se limitan a, trombocitopenias mediadas inmunes, tales como púrpura trombocitopénico idiopático agudo y púrpura trombocitopénico idiopático crónica, dermatomiositis, corea de Sidenham, lupus nefritis, fiebre reumática, síndromes poliglandulares, púrpura de Henoch-Schonlein, nefritis postestreptococal , eritema nodular, arteritis de Takayasu, enfermedad de Addison, eritema multiforme, poliarteritis nodosa, espondilitis anquilosante, síndrome de Goodpasture, tromboangitis ubiterans, cirrosis biliar primaria, tiroiditis de Hashimoto, tirotoxicosis, hepatitis activa crónica, polimiositis/dermatomiositis, policondritis , pénfigo vulgaris, granulornatosis de Wegener, nefropatla de membrana, esclerosis lateral amiotrófica, tabes dorsalis, polimialgia, anemia perniciosa, glomerulonefritis progresiva rápida y alveolitis fibrosa, respuestas inflamatorias tales como enfermedades de la piel inflamatorias que incluyen soriasis y dermatitis (por ejemplo, dermatitis atópica) ; escleroderma sistémico y esclerosis; respuestas asociadas con enfermedad de intestino inflamado (tales como enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa) ; síndromes de distensión respiratoria (que incluye síndrome de distensión respiratorio de adulto; ARDS) ; dermatitis; meningitis; encefalitis; uveitis; colitis; glomerulonefritis; condiciones alérgicas tales como eczema y asma y otras condiciones que involucran infiltración de células T y respuestas inflamatorias crónicas,-ateroesclerosis ; deficiencia de adhesión de leucocitos; artritis reumatoide; lupus sistémico eritematoso (SLE) ; diabetes mellitus (por ejemplo, diabetes mellitus tipo I o diabetes melllitus dependiente de insulina) ; esclerosis múltiple; síndrome de Reynaud; tiroiditis autoinmune; encefalomielitis alérgica; síndrome de Sjorgen; diabetes de comienzo juvenil; y respuestas inmunes asociadas con hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citocinas y linfocitos T comúnmente encontrados en tuberculosis, sarcoidosis, polimiositis, granulomatosis y vasculitis; anemia perniciosa (enfermedad de Addison) ; enfermedades que involucran diapedesis de leucocitos; trastorno inflamatorio del sistema nervioso central; síndrome de lesión de órgano múltiple; anemia hemolítica (que incluye, pero no se limita a crioglobinemia o anemia positiva de Coombs) ; miastenia gravis; enfermedades mediadas por el complejo antígeno-anticuerpo; enfermedad de membrana de basamento antiglomerula ; síndrome antifosfolípido ; neuritis alérgica; enfermedad de Graves; síndrome miasténico de Lambert-Eaton; penfigoide hulloso; pénfigo; poliendocrínopatías autoxnmunes; enfermedad de Reiter; síndrome de hombre rígido; enfermedad de Behcet; arteriris de célula gigante; nefritis de complejo inmune; nefropatía IgA; polineuropatías Ig ; púrpura trombocitopénica inmune (ITP) o trombocitopenia autoinmune, etc. En este aspecto de la invención, las ABM de la invención se usan para vaciar la sangre de células B normales por un período prolongado. De acuerdo con la práctica de esta invención, el sujeto puede ser un sujeto humano, equino, porcino, bovino, murino, canino, felino, y aviar. Otros animales de sangre caliente también se incluyen en esta invención. La invención del tema además proporciona métodos para inhibir el crecimiento de células de tumor humanas, tratando un tumor en un sujeto, y tratando una enfermedad de tipo proliferativa en un sujeto. Estos métodos comprenden la administración al sujeto de una cantidad efectiva de la composición de la invención. Por lo tanto, es palpable que la presente invención abarca composiciones farmacéuticas, combinaciones y métodos para tratamiento de carcinomas humanos, tales como linfoma de células B. Por ejemplo, la invención incluye composiciones farmacéuticas para uso en el tratamiento de carcinomas humano que comprenden una cantidad farmacéuticamente efectiva de un anticuerpo de la presente invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones ABM de la invención se pueden administrar usando modos convencionales de administración que incluyen, pero no se limitan a, intravenoso, intraperitoneal, oral intralinfático o administración directamente en el tumor. Se prefiere la administración intravenosa. En un aspecto de la invención, las formulaciones terapéuticas que contienen las ABM- de la invención se preparan para almacenar por mezclado un anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington' s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) ) , en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos para receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen soluciones amortiguadoras tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; los antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de benzetonio; fenol, alcohol de butilo o bencilo; parabenos de alquilo tales como parabeno de metilo o propilo; catecol ; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol; y m-cresol) ; polipéptidos de peso molecular bajo (menor que alrededor de 10 residuos) ; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílieos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes de quelacíón tales como EDTA; azúcares tales como sucrosa, manitol, trehalosa o sorbitol ; contraiones que forman sal tales como sodio; complejos de metal (por ejemplo, complejos de ZN-proteína) ; y/o tensoactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilén glicol (PEG) . Ejemplarmente las formulaciones de ABM anti-CD20 se describen en WO 98/56418, expresamente incorporada en la presente por referencia. Esta publicación describe una formulación multidosis que comprende 40 mg/mL de rituximab, 25 mM de acetato, 150 mM de trehalosa, 0.9% de alcohol de bencilo, 0.02% de polisorbato 20 a pH 5.0 que tiene una vida de anaquel mínima de dos años almacenada a 2-8 °C. Otra formulación anti-CD20 de interés comprende 10 mg/mL ¦ de rituxibam en 9.0 mg/mL de cloruro de sodio, 7.35 mg/mL de dihidrato de citrato de sodio, 0.7 mg/mL de polisorbato 80, y Agua Estéril para inyección, pH 6.5. En la presente invención, RITUXAN® será sustituido por un ABM de la presente invención . Las formulaciones liofilizadas adaptadas para administración subcutánea se describen en WO 97/04801. Tales formulaciones liofilizadas se pueden reconstituir con un diluyente apropiado a una concentración alta de proteínas y la formulación reconstituida se puede administrar subcutáneamente al mamífero para ser tratado. La formulación en la presente también puede contener más de un compuesto activo si es necesario para la indicación particular a ser tratada, preferiblemente aquellas con actividades complementarias que no afectan adversamente una a la otra. Por ejemplo, puede ser deseable además proporcionar un agente citotóxico, agente quimioterapéutico, citosina o agente inmunosupresivo (por ejemplo, uno el cual actúa en las células T, tal como ciclosporina o un anticuerpo que enlaza células T, por ejemplo, uno el cual enlaza LFA-l) . La cantidad efectiva de tales otros agentes depende- de la cantidad de antagonista presente en la formulación, el tipo de enfermedad o trastorno o tratamiento, y otros factores discutidos anteriormente. Generalmente se usan en las mismas dosis y con vias de administración como se usaron anteriormente en la presente o alrededor de 1 hasta 99% de las dosis empleadas hasta ahora. Los ingredientes activos también pueden ser atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimer zación interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacrilato) , respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nanoparticulas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Tales técnicas se desglosan en Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) . Se pueden preparar las preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos apropiados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el antagonista, tales matrices son en la forma de artículos formados, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietilmetacrilato) , o pollo (vinilalcohol) } , poliláctidos (Patente de EUA No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y yetil-L-glutamato, acetato de etilenvinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como el LUPRON DEPO (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolido) , y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico. Las formulaciones a ser usadas para administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estéril. Las composiciones de la invención pueden estar en una variedad de formas de dosificación las cuales incluyen, pero no se limitan a, soluciones o suspensiones líquidas, tabletas, pildoras, polvos, supositorios, microcápsulas poliméricas o microvesículas, liposomas, y soluciones inyectables o infusibles. La forma preferida depende del modo de administración y la aplicación terapéutica. Las composiciones de la invención preferiblemente también incluyen portadores y adyuvantes farmacéuticamente aceptables convencionales conocidos en la técnica tal como albúmina de suero humano, intercambiadores de iones, alúmina, lecitina, substancias de solución amortiguante tal como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, y sales o electrolitos tales como sulfato de protamina. El modo más efectivo de administración y régimen de dosis para las composiciones farmacéuticas de esta invención depende de la severidad y curso de la enfermedad, la salud del paciente y respuesta al tratamiento y el juicio del médico que trata. En consecuencia, las dosis de las composiciones deben ser tituladas para el paciente individual. No obstante, una dosis efectiva de las composiciones de esta invención generalmente estará en el rango de desde alrededor de 0.01 hasta alrededor de 2000 mg/kg. Las moléculas descritas en la presente pueden estar en una variedad de formas de dosificación las cuales incluyen, pero no se limitan a, soluciones líquidas o suspensiones, tabletas, pildoras, polvos, supositorios, microcápsulas poliméricas o microvesículas, liposomas, y soluciones inyectables o por infusión. La forma preferida depende del modo de administración y la aplicación terapéutica. La composición que comprende un AB de la presente invención será formulada, dosificada, y administrada en una forma consistente con la buena práctica médica. Los factores para consideración en este contexto incluyen enfermedad particular o trastorno a ser tratado, el mamífero particular que se trata, la condición clínica del paciente individual, la causa de la enfermedad o trastorno, el sitio de suministro del agente, el método de administración, el itinerario de administración, y otros factores conocidos por los practicantes médicos . La cantidad terapéuticamente efectiva del antagonista a ser administrada estará regida por tales consideraciones . Como una proposición general, la cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo administrado parenteralmente por dosis estará en el rango de desde alrededor de 0.1 hasta 20 mg/kg de peso corporal del paciente por día, con el rango inicial común de antagonista usado estando en el rango de desde alrededor de 2 hasta 10 mg/kg. En una modalidad preferida, la ABM es un anticuerpo, preferiblemente unas dosis apropiadas de anticuerpo humanizado para tal anticuerpo no conjugado están, por ejemplo, en el rango de desde alrededor de 20mg/m2 hasta alrededor de 1000 mg/m2. En una modalidad, la dosis del anticuerpo difiere de aquella recomendada actualmente para RITUXAN®. Por ejemplo, uno puede administrar al paciente una o más dosis de sustancialmente menos que 375 mg/m2 del anticuerpo, por ejemplo, cuando la dosis está en el rango de desde alrededor de 20 mg/m2 hasta alrededor de 250 mg/m2, por ejemplo desde alrededor de 50 mg/m2 hasta alrededor de 200 mg/m2. Más aún, se pueden administrar una o más dosis iniciales del anticuerpo seguidas por una o más dosis subsiguientes, en donde los mg/m2 de dosis del anticuerpo en la o las dosis subsiguientes excede los mg/m2 de dosis del anticuerpo en la o las dosis iniciales. Por ejemplo, la dosis inicial puede estar en el rango de desde alrededor de 20 mg/m2 hasta alrededor de 250 mg/m2 (por ejemplo, desde alrededor de 50 mg/m2 hasta alrededor de 200 mg/m2) y la dosis -subsiguiente puede estar en el rango de desde alrededor de 250 mg/m2 hasta alrededor de 1000 mg/m2. Sin embargo, como se notó anteriormente estas cantidades sugeridas de ABM están sujetas a un gran reparto de discreción terapéutica. El factor clave en la selección de una dosis apropiada e itinerario es el resultado obtenido, como se indicó anteriormente. Por ejemplo, las dosis relativamente más grandes se pueden necesitar inicialmente para el tratamiento de enfermedades en desarrollo y agudas . Para obtener los resultados más eficaces, dependiendo de la enfermedad o trastorno, el antagonista se administra lo más cercano al primer signo, diagnóstico, apariencia, u ocurrencia de la enfermedad o trastorno como sea posible o durante la remisión de la enfermedad o trastorno. La ABM de la presente invención se administra por medios apropiados, que incluyen parenteral, subcutáneo, intraperitoneal, intrapulinonario, e intranasal, y si se desea para tratamiento inmunosupresivo local, administración intralesional . Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscul r, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, o subcutánea. Además, el antagonista puede ser administrado apropiadamente por infusión de pulso, por ejemplo, con dosis que declinan del antagonista. Preferiblemente la dosificación se de por inyecciones, más preferiblemente inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. Se pueden administrar otros compuestos, tales como agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos, agentes inmunosupresivos y/o citocinas con los antagonistas de la presente. La administración combinada incluye coadministración, usando formulaciones separadas o una formulación farmacéutica única, y administración consecutiva en cualquier orden, en donde preferiblemente existe un período de tiempo mientras ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas. Será claro que la dosis de la composición de la invención requerida para lograr curaciones puede ser reducida además con optimización de itinerario. De acuerdo con la práctica de la invención, el portador farmacéutico puede ser un portador lipido. El portador lipido puede ser un fosfolípido. Además, el portador lipido puede ser un ácido graso. También el portador lipido puede ser un detergente. Como se usó en la presente, un detergente es cualquier sustancia que altera la tensión superficial de un liquido, generalmente diminuyéndola. En un ejemplo de la invención, el detergente puede ser un detergente no iónico. Ejemplos de detergentes no iónicos incluye, pero no se limitan a, polisorbato 80 (también conocido como Tween 20 o (monooleato de polioxietilenesorbitán) , Brij , y Tritón (por ejemplo Tritón WR-1339 y Tritón A-20) . Alternativamente, el detergente puede ser un detergente iónico. Un ejemplo de un detergente iónico incluye, pero no se limita a, bromuro de alquiltrimetilamonio . Adicionalmente, de acuerdo con la invención, el portador lípido puede ser un liposoma. Como se usa en esta aplicación, un "liposoma" es cualquier vesícula limitada por membrana la cual contiene cualquier molécula de la invención o combinaciones de estas. Los ejemplos a continuación explican la invención en más detalle. Las siguientes preparaciones y ejemplos se dan para posibilitar a aquellos expertos en la técnica a entender más claramente y practicar la presente invención. Sin embargo, la presente invención no está limitada en alcance por las modalidades ejemplificadas, las cuales se proyectan como ilustraciones de aspectos particulares de la invención solamente, y los métodos que son equivalentes funcionalmente están dentro del alcance de la invención. Verdaderamente, varias modificaciones de la invención, además de aquellas descritas aquí, se volverán palpables para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción precedente y el los dibujos que acompañan. Tales modificaciones se proyecta que caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anexadas.
EJEMPLOS [NOTA: A menos que se especifique de otra manera, las referencias a la numeración de posiciones de residuo de aminoácido en los siguientes Ejemplos están de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat . ] EJEMPLO 1 Materiales y Métodos . Clonación y Expresión de Anticuerpo Recombinante B-Lyl. Las células de hibridoma que expresan B-Lyl fueron crecidas en RPMI que contiene 10% de FBS y 4 mM de L-glutamina. 6 x 106 células con una viabilidad >90% se cosecharon y el ARN total se aisló usando un kit midi AR easy de Qiagen. Los cADN que codifican las cadenas ligeras y pesadas variables de B-Lyl se amplificaron por RT-PCR. La reacción RT-PCR se realizó usando las siguientes condiciones 30 minutos a 50 °C para la primera síntesis de cADN estándar; 15 min a 95 °C de desnaturalización inicial; 30 ciclos de 1 min a 94°C, 1 min a 45°C, 1.5 min a 72°C; y un paso de alargamiento final por 10 min a 72 °C. El tamaño esperado de los productos de PCR se confirmó por electroforesis de gel . Los productos de PCR se clonaron en vectores de E. coli apropiados y el secuenciamiento de ADN confirmó que las cadenas ligera y pesada variables que codifican genes fueron aisladas.
Para construcción de vectores de expresión de B-Lyl quiméricos, las secuencias de señal sintética y sitios de restricción apropiados se fusionaron a las cadenas variables mediante reacciones PCR adicionales . Después de una confirmación de la secuencia de ADN correcta de las cadenas variables, se combinaron con las regiones constantes IgGl humanas que corresponden. Una vez que los genes fueron construidos, se clonaron bajo control del promotor MPSV y en la dirección 5' de un sitio poliA sintético, usando dos vectores separados, uno de cada cadena, resultando en los plásmidos pETR1808 (vector de expresión de cadena pesada) y pETR1813 (vector de expresión de cadena ligera) . Cada vector portó una secuencia EBV OriP. El quimérico B-Lyl se produjo por co-transfección de células HEK293-EBNA con vectores pETR1808 y pETR1813 usando un método de transfección de fosfato de calcio. Exponencialmente el crecimiento de las células HEK293-EBNA fue transfectado por el método de fosfato de calcio. Las células se crecieron como cultivos de monocapa adherente en frascos T usando medio de cultivo DMEM suplementado con 10% de FCS, y fueron transfectadas cuando estuvieron entre 50 y 80% de confluencia. Para la transfección de un frasco T75, 8 millones de células fueron sembradas 24 horas antes de transfección en 14 mi de medio de cultivo DMEM suplementado con FCS (a 10% V/Vfinal) , 250 µg/ml de neomicina, y las células fueron colocadas a 37°C en un incubador con- un 5% de atmósfera de C02 durante la noche . Para cada matraz T75 a ser transfectado, una solución de ADN, CaCl2 y agua se preparo por mezclado de 47 ]iq de ADN de vector de plásmido total dividido igualmente entre los vectores de expresión de cadena ligera y pesada, 235 µ? de una solución de CaCl2 1M, y adición de agua a un volumen final de 469 µ?. A esta solución, se agregaron 469 µ? de un HEPES 50 mM, 280 mM de WaCl, 1.5 mM de solución Na2HP04 a pH 7.05, se mezclaron inmediatamente por 10 segundos y se dejaron reposar a temperatura ambiente por 20 segundos. La suspensión se diluyó con 12 mi de DMEM suplementado con 2% de FCS, y se agregaron al T75 en lugar del medio existente. Las células fueron incubadas a 37°C, 5% de C02 por alrededor de 17 a 20 horas, luego el medio se reemplazó con 12 mi de DMEM, 10% de FCS. Para la producción del anticuerpo no modificado wcHB-Lyl", las células fueron transfectadas solamente con vectores de expresión de anticuerpo pETR1808 y pETR1813 en una relación 1:1. Para la producción del anticuerpo preparado por glicoingeniería "chB-Lyl-ge" , las células fueron co-transfectadas con cuatro plásmidos, dos para expresión de anticuerpo (pETR1808 y pETR1813) , uno para una fusión de expresión de polipéptido GnTIII (pETR1519) , y uno para expresión de manosidasa II (pCLF9) en una relación de 4:4:1:1, respectivamente. En el día 5 de post-transfección, se cosechó el sobrenadante, se centrifugó por 5 min a 1200 rpm, seguida por una segunda centrifugación por 10 min a 4000 rpm y se mantuvo a 4°C. Los chB-Lyl y chB-Lyl-ge fueron purificados del sobrenadante del cultivo usando tres pasos cromatográficos secuenciales, cromatografía de Proteína A, cromatografía de intercambio de catión, y un paso de cromatografía de exclusión de tamaño en una columna Superdex 200 (Amersham Pharmacia) intercambiando la solución amortiguadora a solución amortiguadora salina de fosfato y recolectando el pico de anticuerpo monomérico de este último paso. La concentración de anticuerpo se estimó usando un espectrofotómetro de la absorbancia a 280 nm.
Análisis de Oligosacáridos . Los oligosacáridos fueron liberados enzimáticamente de los anticuerpos por digestión de PNGasaF, con los anticuerpos siendo ya sea inmovilizados en una membrana PVDF o en solución. La solución de digestión resultante que contiene los oligosacáridos liberados ya sea preparados directamente de análisis MALDI/TOF-MS o fueron además digeridos con EndoH glicosidasa antes de la preparación de la muestra para análisis MALDI/TOF-MS . Método de liberación de oligosacárido para anticuerpos inmovilizados por membrana PVDF. Los pozos de una placa de 96 pozos hechos con membrana PVDF (Immobilon P, Millipore, Bedford, Massachussets) fueron humectados con 100 µ? de metanol y el líquido fue extraído a través de la membrana PVDF usando vacío aplicado al múltiple de vacío de multipantalla (Millipore, Bedford, Massachussets) . Las membranas PVDF fueron lavadas tres veces con 300 µ? de agua. Los pozos fueron luego lavados con 50 µ? de solución amortiguadora RCM (8 M Urea, 360 mM Tris, 3,2 mM EDTA, pH 8.6). Entre 30-40 µg de anticuerpo fueron cargados en un pozo que contiene 10 µ? de solución amortiguadora RCM. El líquido en el pozo se extrajo a través de la membrana por aplicación de vacío, y la membrana fue lavada posteriormente dos veces con 50 µ? de solución amortiguadora RCM. La reducción de los puentes de disulfuro fue realizada por adición de 50 µ? de ditiotreitol 0.1 M en RCM e incubación a 37°C por 1 h. Después de la reducción, se aplicó un vacío para remover la solución de ditiotreitol del pozo. Los pozos fueron luego lavados tres veces con 300 µ? de agua antes de realizar la carboximetilación de los residuos de cisterna por adición de 50 µ? de ácido yodoacético 0.1M en solución amortiguadora RCM e incubación a temperatura ambiente en la oscuridad de 30 min. Después de la carboximetilación, los pozos fueron extraídos con vacío y posteriormente se lavaron tres veces con 300 µ? de agua. La membrana PVDF fue bloqueada luego, para prevenir la adsorción de la endoglicosidasa, por incubación de 100 µ? de una solución acuosa 1% de polivinilpirrolidona 360 a temperatura ambiente por 1 hora. El reactivo de bloqueo se removió luego por vacío suave seguido por tres lavados con 300 µ? de agua. Los oligosacáridos N-ligados fueron liberados por adición de 2.5 mU de péptido-N-glicosidasa F (N-Glicanasa recombinante, GLYKO, Novato, CA) y 0.1 mU de Sialidasa (GLYKO, Novato, CA) , para remover cualquier residuo de monosacárido cargado potencial, en un volumen final de 25 µ? en 20 mM de NaHC03, pH 7.0) . La digestión se realizó por 3 horas a 37°C.
Método de liberación de Oligosacáridos para anticuerpos en solución. Entre 40 y 50 µg de anticuerpo fueron mezclados con 2.5 mU de PNGasaF (Glyko, U.S.A.) en 2 mM de Tris, pH 7.0 en un volumen final de 25 microlitros, y la mezcla se incubó por 3 horas a 37°C.
Uso de digestión de Endoglicosidasa H de oligosacáridos liberados de PNGasaF para la asignación de estructuras de oligosacárido diseccionadas híbridas para picos de oligosacárido neutrales de MALDI/TOF-MS . Los oligosacaridos liberados de PNGasaF fueron digeridos subsecuentemente con Endoglicosidasa H (EC 3.2.1.96). Para la digestión de EndoH, se agregaron 15 mU de EndoH (Roche, Suiza) al digesto de PNGasaF (anticuerpo en solución del método anterior) para dar un volumen final de 30 microlitros , y la mezcla se incubó por 3 horas a 37 °C. El EndoH se desdobla entre los residuos de N-acetilglucosamina del núcleo de chitobiosa de oligosacáridos N-ligados. La enzima solamente puede digerir oligomanosa y más híbridos tipo glicans, considerando que el complejo tipo oligosacáridos no son hidrolizados .
Preparación de muestras para MALDI/TOF- S Los productos de digestión enzimáticos que contienen los oligosacáridos liberados fueron incubados por unas 3 horas más a temperatura ambiente después de la adición de ácido acético a una concentración final de 150 mM, y fueron pasados posteriormente a través de 0.6 mi de resina de intercambio catiónico (resina AG50 -X8, forma de hidrógeno, malla 100-200, Bio Rad, Suiza) empacado en una columna de cromatografía de micro-bio-espín (BioRad, Suiza) para remover cationes y proteínas. Un microlitro de la muestra resultante se aplicó a una placa objetivo de acero inoxidable, y se mezcló en la placa con 1 µ? de matriz sDHB. La matriz sDHB se preparó por disolución de 2 mg de ácido 2 , 5-dihidroxibenzóico más 0.1 mg de ácido 5-metoxisalicílico en 1 mi de etanol/10 ttiM de cloruro de sodio acuoso 1:1 (v/v) . Las muestras fueron secadas con aire, 0.2 µ? de etanol se aplicaron, y las muestras fueron dejadas finalmente para recristalizar bajo aire . MALDI/TOF-MS El espectrómetro de masas MALDI-TOF usado para obtener el espectro de masas fue un Voyager Elite (Perspective Biosystems) . El instrumento fue operado en la configuración lineal, con una aceleración de 20kV y 80 ns de retraso. La calibración externa usando estándares de oligosacárido se usó para asignar masa de los iones. El espectro de 200 disparos de láser fueron sumados para obtener el espectro final .
Vaciado de células B de la sangre entera. 495 µ? de sangre heparinizada de un donador saludable fue formada en alícuotas en tubos de poliestireno de 5 mi, 5 µ? de muestras de anticuerpo concentrada de 100 múltiplos (1-1000 ng/ml de concentración final) o PBS solamente fueron adicionado y los tubos fueron incubados a 37 °C. Después de 24h 50 µ? de sangre fueron transferidos a un tubo fresco y manchados con anti-CD3-FITC, anti-CD19-PE y anti-CD45-CyChrome (Becton-Dickinson) por 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Antes del análisis, 500 µ? de solución amortiguadora FACS (PBS que contiene 2% de FCS y 5 mM- de EDTA) se agregaron a los tubos. La fluorescencia de CD3-FITC y CD19-PE de las muestras de sangre fueron analizadas flowcytometrically por establecimiento de un umbral en CD45-CyChrome. El vaciado de células B se determinó por trazado de la relación de células B CD19÷ a células T CD3+. Enlace de anticuerpos anti-CD20 a Células Raji 500.000 en 180 µ? de solución amortiguadora FACS (PBS que contienen 2% de FCS y 5 mM de EDTA) fueron transferidos a tubos de poliestireno de 5 mi y solamente se agregaron 20 ul de muestras de anticuerpo anti-CD20 concentradas de 10 múltiplos (1-5000 ng/ml de concentración final) o PBS y los tubos fueron incubados a 4°C por 30 min. Posteriormente, las muestras fueron lavadas dos veces con solución amortiguadora FACS y peletizados a 300 x g por 3 minutos. El sobrenadante fue aspirado y las células fueron colocadas en 100 F1 de solución amortiguadora FACS y 1 µ? de fragmentos F(ab')2-FITC anti-Fc-específicos (Jackson ImmunoResearch Laboratories, USA) se agregaron y los tubos fueron incubados a 4°C por 30 min. Las muestras fueron lavadas dos veces con solución amortiguadora FACS y colocados en 500 µ? de solución amortiguadora FACS que contiene 0.5 g/ml de PI para análisis por Citometría de Flujo. El enlace fue determinado por trazado de la fluorescencia media geométrica contra las concentraciones del anticuerpo.
EJEMPLO 2 Método del Aceptor de Homología Alta. La búsqueda de la estructura del aceptor de anticuerpo de homología alta se realizó por alineación de la secuencia de proteina B-lyl de ratón a una colección de secuencias de línea de germen humano y seleccionando aquella secuencia humana que mostró la identidad de secuencia más alta. Aquí, la secuencia VH1-10 de la base de datos VBase se seleccionó como la secuencia de aceptor de estructura de cadena pesada, y la secuencia VK_2_40 se seleccionó para ser el aceptor de estructura para la cadena ligera. En estas dos estructuras de aceptador, las res regiones de determinación complementaria (CDR) de los dominios variables pesado y ligero de ratón fueron injertados. Puesto que la región de estructura 4 no es parte de la región variable del gen de la línea V de germen, la alineación para aquella posición se hizo individualmente. La región JH4 se seleccionó para la cadena pesada, y la región JK4 se seleccionó para la cadena ligera. El modelado molecular del dominio de inmunoglobulina diseñado reveló un punto que requiere potencialmente los residuos de aminoácido de murino en lugar de los humanos fuera del CDR. La reintroducción de residuos de aminoácido de murino dentro de la estructura humana podría generar las mutaciones anteriores así llamadas. Por ejemplo, el residuo de aminoácido aceptador humano en la posición 27 de abat fue mutada inversa a un residuo de tirosina. Las variantes de anticuerpo humanizadas fueron diseñadas para que ya sea incluyan u omitan las mutaciones inversas. La cadena ligera de anticuerpo humanizada no requirió ninguna mutación inversa. Después de haber diseñado las secuencias de proteína, las secuencias de ADN que codifican estas protexnas fueron sintetizadas como se detalla a continuación. Método de Estructura Mezclada. Con el propósito de evitar la introducción de mutaciones inversas en las posiciones de residuo de aminoácido crítico (crítico para retener buena afinidad de enlace a antígenos o funciones de anticuerpo) de la estructura de aceptor humano, se investigó si cualquiera de la región de estructura 1 (FR1) , o regiones de estructura 1 (FR1) y 2 (FR2) juntas, se podían reemplazar por secuencias de anticuerpo humano que ya tienen residuos donadores, o funcionalmente unos equivalentes, en aquellas posiciones importantes en la secuencia de línea de germen humana natural . Para este propósito, las estructuras VH 1 y 2 de la secuencia Blyl de ratón fueron alineadas individualmente a secuencias de línea de germen humanas. Aquí, la identidad de secuencia más alta no fue importante, y no se usó, para seleccionar las estructuras de aceptor, sino en su lugar la coincidencia de varios residuos críticos se asumió para ser más importante. Aquellos residuos críticos comprenden residuos de 24, 71, y 94 (numeración de abat) , y también aquellos residuos en la posición 27, 28 y 30 (numeración de Kabat), la cual se posiciona fuera de la definición de CDR1 por Kabat, pero a menudo están involucrados en enlace a antígenos . La secuencia IMGT VH_3_15 se seleccionó como una apropiada. Después de tener diseñadas las secuencias de proteína, las secuencias de ADN que codifican estas proteínas fueron sintetizadas como se detalla a continuación. Usando esta aproximación no fueron requeridas mutaciones inversas ya sea para cadena ligera o pesada, con el propósito de retener buenos niveles de enlace a antígenos .
Síntesis de los genes de anticuerpos . Después de haber diseñado la secuencia de aminoácidos de la región de anticuerpo V humanizada, la secuencia de ADN hubo de ser generada. Los datos de la secuencia de ADN de las regiones de estructura individual se encontraron en las bases de datos para secuencias de linea de germen humanas . La secuencia de ADN de las regiones CDR se tomó de los datos de cADN de murino que corresponden. Con estas secuencias, la secuencia de ADN total se ensambló virtualmente . Teniendo estos datos de secuencia de ADN, los sitios de restricción de diagnóstico fueron introducidos en la secuencia virtual, por introducción de mutaciones silenciosas, creación de sitios de reconocimiento para endonucleasas de restricción. Para obtener la cadena de ADN física, se realizó la síntesis de gen (por ejemplo, Wheeler y colaboradores, 1995) . En este método, los oligonucleotidos se diseñan de los genes de interés, tales, que unas series de oligonucleotidos se deriva de la codificación estándar, y otras series de la no codificación estándar. Las terminaciones 3' y 5' de cada oligonucleótido (excepto la más primera y la más última en la fila) siempre muestran secuencias complementarias a dos cebadores derivados del opuesto estándar. Cuando se ponen estos oligonucleotidos dentro de una solución amortiguadora de reacción apropiada para cualquier polimerasa estable de calentamiento, y agregando Mg2+, dNTP y una polimerasa de ADN, cada oligonucleótido se prolonga desde su terminación 3'. La terminación 3 ' formada recientemente de un cebador luego se fortalece con el siguiente cebador del opuesto estándar, y prolonga su secuencia más bajo condiciones apropiadas para alargamiento de cadena de ADN dependiente de plantilla. El producto final se clonó en un vector convencional para propagación en E. coli.
Producción de Anticuerpos Las secuencias líderes de cadena pesada y ligera humana (para secreción) se agregaron en la dirección 5' de las secuencias de región variable y estas fueron luego unidas en la dirección 5' de secuencias de cadena pesada y ligera de constante de kappa IgGl humanas, respectivamente, usando técnicas de biología molecular estándar. Las secuencias de ADN de cadena pesada y ligera de anticuerpo completo que resultan fueron subclonadas en vectores de expresión mamíferos (uno para la cadena ligera y uno para la cadena pesada) bajo el control del promotor MPSV y en la corriente 5' de un sitio de poliA sintético, cada vector que porte una secuencia de EBV OriP, como se describió en el Ejemplo 1 anterior. Los anticuerpos se produjeron como se describió en el Ejemplo 1 anterior, principalmente por cotransfección de HEK293-EBNA con los vectores de expresión de cadena pesada y ligera de anticuerpos de mamífero, cosechando el medio de cultivo acondicionado de 5 a 7 días después de la transfección, y purificando los anticuerpos secretados por cromatografía de afinidad de la Proteína A, seguido por cromatografía de intercambio de catión y un paso crornatográfico de exclusión de tamaño final para aislar los anticuerpos IgGl monoméricos puros. Los anticuerpos se formularon en una solución de pH S.7 de 25 mM de fosfato de potasio, 125 mM de cloruro de sodio, 100 mM de glicina. Las variantes preparadas por glicoingeniería de las variantes de anticuerpo humanizadas se produjeron por co-transfección de los vectores de expresión de anticuerpo junto con unos vectores de expresión de glicosiltransferasa GnT-III, o junto con un vector de expresión GnT-III más un vector de expresión de manosidasa II Golgi, como se describió para el anticuerpo quimérico en el Ejemplo 1 anterior. Los anticuerpos preparados por glicoingeniería se purificaron y formularon como se describió anteriormente para los anticuerpos no preparado por glicoingeniería. Los oligosacáridos acoplados a la región Fe de los anticuerpos se analizaron por MALDI/TOF-MS como se describe a continuación.
Análisis de Oligosacáridos Método de liberación de oligosacárido para anticuerpos en solución. Entre 40 y 50 pg de anticuerpo fueron mezclados con 2.5 mU de PNGasaF (Glyko, E.U.A.) en 2 mM de Tris, pH 7.0 en un volumen final de 25 microlitros, y la mezcla se incubó por 3 horas a 37 °C.
Preparación de la muestra para MALDI/TOF-MS Los productos de digestión enzimáticos que contienen los oligosacáridos liberados fueron incubados por unas 3 h más a temperatura ambiente después de la adición del ácido acético a una concentración final de 150 MM, y fueron pasados secuencialmente a través de 0.6 mi de resina de intercambio de cationes (resina AG50W-X8, forma de hidrógeno, malla 100-200, BioRad, Suiza) empacada en una columna de cromatografía de micro-bio-spin (BioRad, Suiza) para remover cationes y proteínas. Un microlitro de la muestra resultante se aplicó a una placa objetivo de acero inoxidable, y se mezcló en la placa con 1 µ? de matriz sDHB. La matriz sDHB se preparó por disolución de 2 mg de ácido 2 , 5-dihidroxibenzóico más 0.1 mg de ácido 5-metoxisalicílico en 1 mi de etanol/lOmM de cloruro de sodio acuoso 1:1 (v/v) . Las muestras fueron secadas en aire, 0.2 µ? de etanol se aplicaron, y las muestras fueron dejadas finalmente para recristalizar bajo aire.
MA.LDI/TOF-MS El espectrómetro de masas MALDI-TOP usado para obtener el espectro de masas fue un Voyager Elite (Perspective Biosystems) . El instrumento fue operado en la configuración lineal, con una aceleración de 20kV y 80 ns de retraso. La calibración externa usando estándares de oligosacárido se usó para asignar masa de los iones. El espectro de 200 disparos de láser fueron sumados para obtener el espectro final .
Ensayo de enlace a antígenos Las variantes de anticuerpo humanizadas monoméricas purificadas se evaluaron para enlace a CD20 humano en células objetivo de linfoma de células B de Raji usando un ensayo a base de citometría de flujo, como se describió para el anticuerpo B-lyl quimérico en el Ejemplo 1 anterior.
Enlace de glicovariantes de IgGq monoméricas para células NK y línea de célula CHO que expresan FcyRIIIA. La células NK humanas se aislaron de la células mononucleares de sangre periférica (PBMC) recientemente aislada ampliando una selección negativa que enriquece para las células CD16- y CD56-positivas (sistema MACS, Miltenyi Bistec GMBH, Bergisch Gladbach/Germany) . La pureza determinada por la expresión de CD56 estuvo entre 88-95%. Las células NK recientemente aisladas fueron incubadas en PBS sin iones de calcio y de magnesio (2 x 105 células/ml) por 20 minutos a 37 °C para remover el IgG asociado a células NK. Las células fueron incubadas a 106 células/ml en diferentes concentraciones de anticuerpo anti-CD20 (0, 0.1, 0.3, 1, 3, 10 pg/ml) en PBS, 0.1% BAS . Después de varios lavados el anticuerpo de enlace se detectó por incubación con 1:200 FITC-con ugado F(ab' )2 de cabra antihumano, F(ab')2 específico IgG (Jackson ImmunoReasearch, West Grove, PA/USA) y CD56-PE anti humano (BD Biosciences, Allschwil/Switzerland) . Los fragmentos de anti-FcgammaRIIIA 3G8 F(ab')2 (Ancell, Bayport, MN/USA) fueron agregados a una concentración de 10 pg/ml para competir en enlace de glicovariantes de anticuerpo (3 g/ml) . La intensidad de fluorescencia que se refiere a las variantes de anticuerpo enlazadas se determinó por células CD56-positivas en un FACSCalibur (BD Biosciences, Allsch il/Suiza) . Las células CHO fueron transfectadas por electroporacion (280 V, 950 }iF, 0.4 cm) con un vector de expresión que codifica para la cadena a y la cadena ? de FcgammaRIIIA-Vall58. Los productos de transfección fueron seleccionados por adición de 6 yg/ml de puromicina y los clones estables se analizaron por FACS usando 10 µ? de anticuerpo monoclonal 3G8 FITC-conjugado-anti-FcgammaRIII (BD Biosciences, Allschwil/S itzerland) para 106 células. El enlace de IgGl a las células CHO que expresan FcgammaRIIIA-Vall58 se realizó análogamente para el enlace de las células NK descritas anteriormente.
Ensayo ADCC Las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) se usaron como células efectoras y fueron preparadas usando Histopaque+1077 (Sigma Diagnostics Inc., St . Louis, Mo63178 USA) y siguiendo esencialmente las instrucciones del fabricante. En resumen, la sangre venosa se tomó con jeringas heparinizadas de voluntarios. La sangre se diluyó 1:0.75-1.3 con PBS (no conteniendo Ca++ o Mg++) y forma capas en Histopaque-1077. El gradiente fue centrifugado a 400 x g por 30 min a temperatura ambiente (RT) sin recesos. La interfase que contiene el PBMC se recolectó y lavó con PBS (50 mi por células de dos gradientes) y se cosechó por centrifugación a 300 x g por 10 minutos a R . Después de volver a suspender los peletizados con PBS, el PBMC se contó y lavó una segunda vez por centrifugación a 200 x g por 10 minutos a RT: Las células fueron luego vueltas a suspender en el medio apropiado para los procedimientos subsiguientes. El efector para la relación objetivo usada para los ensayos ADCC fue 25:1 y 10:1 para PBMC y células NK, respectivamente . Las células efectoras fueron preparadas en medio AIM-V a la concentración apropiada con el propósito de agregar 50 µ? por pozo de las placas de 96 pozos de fondo redondo. Las células objetivo fueron células de linfoma B humano (por ejemplo, células Raji) crecen en DMEM que contiene 10% de FCS . Las células objetivo fueron lavadas en PBS, contadas y vueltas a suspender en AIM-V a 0.3 millones por mi con el propósito de agregar 30?00 de células en 100 µ? por micro pozo. Los anticuerpos fueron diluidos en AIM-V, agregadas en 50 µ? a las células objetivo antes de emplacar y se permitieron enlazar a los objetivos por 10 minutos a RT. Luego las células efectoras fueron agregadas y la placa se incubó por 4 horas a 37°C en una atmósfera húmeda que contiene 5% de C02. La exterminación de las células objetivo se evaluó por medición de liberación de hidrogenasa lactate (LDH) de células dañadas usando un kit de detección de citotoxicidad (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Suiza) . Después de la incubación por 4 horas las placas fueron centrifugadas a 800 x g. 100 µ? de sobrenadante de cada pozo fueron transfectados a una placa de 96 pozos de fondo plano transparente nueva. 100 µ? de solución amortiguadora de sustrato de color del kit se agregaron por pozo. Los valores de Vmax de la reacción de color fueron determinadas en un lector ELISA a 490 nm por al menos 10 min usando el software SOFTmax PRO (Dispositivos Moleculares, Sunnyvale, CA94089, EUA) . La liberación de LDH espontánea se midió de los pozos que contienen solamente células objetivo y efectoras pero no anticuerpos. La liberación máxima se determinó de los pozos que contiene células objetivo solamente y 1% de Tritón X-100. El porcentaje de exterminación mediada por el anticuerpo especifico se calculó como sigue: ( (x-SR) / (MR-SR) *100 , donde x es la media de Vmax a una concentración de anticuerpo especifica, SR es la media de Vmax de la liberación espontánea y MR es la media de Vmax de la liberación máxima.
Ensayo de citotoxicidad dependiente del complemento. Las células objetivo se contaron, lavaron con PBS, volvieron a suspender en AIM-V (Invitrogen) a 1 millón de células por mi. 50 µ? de células se emplacaron por pozo en una placa de 96 pozos de fondo plano. Las diluciones de anticuerpo se prepararon en AIM-V y agregaron en 50 ul a las células. Los anticuerpos se dejaron para enlazar a las células por 10 minutos a temperatura ambiente. El complemento de suero humano (Quidel) se descongeló de manera fresca, se diluyó a 3 veces con AIM-V y se agregó en 50 µ? á los pozos.
El complemento de conejo (Cedarlane Laboratorios) se preparó como se describió por el fabricante, se diluyó a 3 veces con AIM-V y se agregó en 50 µ? a los pozos. Como un control, las fuentes de complemento fueron calentadas por 30 minutos a 56 °C antes de la adición para el ensayo. Las placas de ensayo se incubaron por 2 h a 37°G. El exterminio de células se determinó por medición de liberación de LDH. Brevemente, las placas fueron centrifugadas a 300 x g por 3 minutos. 50 µ? de sobrenadante por pozo fueron transferidos a una placa de 96 pozos nueva y 50 µ? del reactivo de ensayo del Kit de Citotoxicidad (Roche) se agregaron. Una medición cinética con el lector ELISA determinó el Vmax que corresponde con concentración de LDH en el sobrenadante. La liberación máxima se determinó por incubación de las células en presencia de 1% de Trition X-100.
Ensayo de vaciado de células B de la sangre completa. El vaciado de células B normales en sangre completa por los anticuerpos anti-CD20 se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1 anterior.
Ensayo de Apoptosis . La potencia apoptótica de los anticuerpos se ensayó por incubación del anticuerpo a 10 µ?/p?? (condiciones de saturación con respecto al enlace a antxgenos) con la células objetivo (a una concentración de célula objetivo de 5 x 105 células/ml) durante la noche (16-24 h) . Las muestras fueron manchadas con AMB-FITC y analizadas por FACS. El ensayo se hizo en triplicado. La detección se realiza por citometría de flujo al seguir la aparición de los marcadores apoptoticos similares a anexina V y serina fosfátida. El control negativo (apoptosis no inducida) no contiene ningún anticuerpo, sino solamente la solución amortiguadora salina de fosfato. El control positivo (apoptosis máxima) contiene 5 micromolar de la Camptothecin inductora de apoptosis fuerte (CPT) .
Resultados y Discusión. La comparación del enlace a antígeno CD20 humano de variantes de anticuerpo B-HH1, B-HH2, B-HH3 , ya sea formando complejo con la cadena ligera B-lyl quimérica (mVL, como se describió en el Ejemplo 1 anterior) o con la cadena ligera B-lyl humanizada ( V1) , y el anticuerpo quimérico padre chB-lyl (descrito en el Ejemplo 1 anterior) muestra que todos los anticuerpos tienen un valor de EC50 similar, pero el constructo B-HH1 enlaza con una intensidad menor/estequiometría que las variantes B-HH2 y B-HH3 (Figura 11) . B-HH1 se puede distinguir de B-HH2 y B-HH3 por sus regiones CDR1 y CDR2 parcialmente humana (definición de Kabat) , además del polimorfismo de Ala/Thhr en la posición 28 (numeración de Kabat) . Esto indica que ya sea la posición 28, el complemento CDR1, y/o el complemento CDR2 son importantes para la interacción anticuerpo/antígeno. La comparación del B-HL1, B-HH1, y el anticuerpo precursor chB-lyl quimérico mostró ausencia de cualquier actividad de enlace en el constructo B-HL1, y alrededor de la mitad de la intensidad de enlace/estequiometría del B-HH1 comparado con B-lyl (Figura 12) . Ambos, el B-HL1 además del B-HH1 se diseñan con base en las estructuras del aceptador derivado de la clase VH1 humana. Entre otras diferencias, la posición 71 (numeración de Kabat; la posición Kabat 71 corresponde a la posición 72 de SEQ ID NO: 8) del constructo B-HL1 es una diferencia de apariencia, que indica su importancia putativa para enlace a antígenos. Cuando se comparan los datos de enlace del antígeno de las Figuras 9 a 13, las variantes BHH2-KV1, BHL8-KV1, y BHL11-KV1 muestran la mejor afinidad de enlace, entre las variantes de anticuerpo humanizadas diferentes evaluadas, para CD20 humano en la superficie de las células humanas. Las diferencias entre B-HH2, por una parte, y B-HL8 y B-HL11 por la otra parte se localizan en las regiones FR1 y FR2 solamente, con los tres CDR siendo idénticos (comparado, por ejemplo, SEQ ID Nos: 32, 56, y 60, los cuales no están numerados de acuerdo con Kabat, pero cuya numeración de Kabat puede ser determinada fácilmente por uno de los expertos ordinarios) . B-HL8 y B-HL11 tienen sus secuencias FRl y FR2 derivadas de la clase VH3 humana, considerando que la estructura B-HH2 completa es derivada de VH1 humano. El B-HL11 es un derivado de B-HL8 con la mutación única GlulGln (la posición 1 es la misma en la numeración abat y el sistema de numeración convencional usado en el listado de secuencia) , con Gln siendo el residuo de aminoácido en el constructo B-HH2. Esto significa que el intercambio de GlulGln no altera la afinidad de enlace ni la intensidad. Las otras diferencias entre B-HH2 y B-HL8 son 14 residuos de estructura . De los cuales uno o más influirán el comportamiento de enlace del antígeno de esta anticuerpo. El constructo B-HL4 se deriva del anticuerpo B-HH2 por reemplazamiento de FRl del B-HH2 con aquel de la secuencia de línea de germen humano VH1_45. Este constructo muestra capacidad de enlace a antígenos disminuida grandemente, a pesar de tener aminoácidos diferentes en solamente tres posiciones dentro de FRl. Estos residuos están localizados en posiciones 2, 14, y 30 (numeración de Kabat) . De estos, la posición 30 puede ser una posición de influencia, puesto que esta es parte de la definición de Chothia de CDR1. El análisis general de todas las curvas de enlace de las Figuras 9 a 13 indican que los siguientes residuos de cadena pesada B-lyl humanizados (numeración de Kabat) son importantes para enlace de CD20.-N35 (terminación de CDR1 de Kabat), CDR1 de Kabat completo, CDR2 de Kabat completo y CDR3 de Kabat completo, residuos de A71 y R94 (en este caso R94 no se puede reemplazar por una treonina) y Y27. A28 y S30 también contribuyen en un menor grado. Además, CDR3 de Kabat y todos los residuos canónicos son importantes para enlace a antígenos. No fueron introducidas mutaciones inversas en la cadena ligera humanizada, la cual tuvo los CDR1, CDR2 y CDR3 de Kabat completos injertados. En inducción de apoptosis (Las Figuras 14, 15 y 21) , la variante más potente fue la variante de B-lyl humanizada BHH2-KV1 (aún más potente que el chB-lyl original y un lote más potente que un anticuerpo con una secuencia idéntica para rituximab, C2B8) . Otras variantes humanizadas (derivativas de BHL8) que pueden recuperar la apoptosis incrementada son B-HL12 hasta B-HL17 (ver Tabla) y BHH8 (estructuras mezcladas) y BHH9 ("estructuras mezcladas" con una mutación inversa, S30T) . Las posiciones 9 y 48 (numeración de Kabat) pueden contactar el antígeno. Las variantes BHH4 a BHH7 son otras variantes B-lyl humanizadas que no introducen secuencias no humanas adicionales. Propiedades importantes del anticuerpo B-lyl humanizado son que éste es un de anticuerpo anti-CD20 tipo II como se definió en Cragg, M.S. y Glennie, M. J. , Blood 103 (7) :2738-2743 (Abril 2004) . Por lo tanto este no induce, en enlace a CD20, cualquier resistencia significante para extracción de detergente no iónico de CD20 de la superficie de las células humanas CD20+, usando el ensayo descrito para este propósito en Polyak, M.J. y Deans, J. P., Blood 99 (9) : 3256-3262 (2002). Ciertamente este indujo resistencia menos significativamente a extracción de detergente no iónica de CD20 que la que hace el anticuerpo C2B8 (otro anticuerpo anti-CD20 con secuencia idéntica para rituximab, (Ver Publicación de Patente de EUA No. 2003 0003097 para Ref . ) . Como se esperaba de un anticuerpo anti-CD20 tipo II, el B-lyl humanizado no tuvo ninguna actividad de lisis mediada complementaria significante y ciertamente un lote de actividad de lisis mediada de complemento que el anticuerpo anti-CD20 C2B8 (IgGl quimérico con secuencia idéntica para rituximab) . Otra propiedad importante del anticuerpo B-lyl humanizado fue que fue muy potente en el ensayo de agregación homotipico. En este ensayo las células humanas CD20 positivas, células Daudi, se incubaron en medio de cultivo de célula por hasta 24 horas a 37°C en una atmósfera de 5% de C02 en un incubador de célula mamífera como se describió en detalle (referencia de Deans) , con el anticuerpo a una concentración de 1 microgramo por mi y en paralelo a una concentración de 5 microgramos por mi . Como una comparación, la incubación paralela de control de las células se hizo bajo condiciones idénticas pero usando el anticuerpo anti-CD20 C2B8. A diferentes tiempos, incluyendo 8 horas y 24 horas de incubación, las células fueron inspeccionadas visualmente usando un microscopio. Se encontró que el anticuerpo B-lyl humanizado lleva a agregación homotípica fuerte, con agregados que son significativamente más grandes que aquellos inducidos por adición del anticuerpo de control C2B8. Además, y consistente con el anticuerpo que es anti-CD20 tipo II, este indujo niveles más altos de apoptosis cuando las células humanas CD20 positivas se incubaron con el anticuerpo B-lyl humanizado, relativo a un control bajo condiciones idénticas usando el anticuerpo IgGl quimérico C2B8 con secuencia idéntica para rituximab. Las variantes preparadas por glicoingeniería de los anticuerpos humanizados se produjeron por co-expresión de glicosiltransferasa GnTIII, junto con los genes de anticuerpo, en células mamíferas . Esto llevó a un incremento en la fracción de oligosacáridos no fucosilados acoplados a la región Fe de los anticuerpos, que incluyen oligosacáridos no fucosilatados, como se ha descrito en WO 2004/065540 (Figuras 17-19) . Los anticuerpos preparados por glicoingeniería tuvieron niveles ¦ significativamente más altos de enlace a receptores FcgammaRIII humanos (Figura 20) y actividad ADCC además (Figura 16) , relativa al anticuerpo no preparado por glicoingeniería y relativo al anticuerpo C2B8. El anticuerpo B-lyl humanizado también fue más potente en vaciado de células B humanas de inducción en un ensayo de sangre completa (Figura 16) que el anticuerpo C2B8 de control. Esto fue verdadero para ambos, el anticuerpo B-lyl no preparado por glicoingeniería y para la versión glicodiseñada de este. El anticuerpo preparado por glicoingeniería fue aproximadamente 1000 veces más potente que el anticuerpo anti-CD20 de control C2B8 en vaciado de células B en el ensayo de sangre completa. Esta comparación es importante para ambas formas humanizadas no preparadas por glicoingeniería y la glicodiseñada de anticuerpo B-lyl, debido a que este mostró que en ensayos esas actividades dependientes del receptor Fe combinado, tal como ADCC, más lisis mediada de complemento, más inducción de apoptosis, que ambas formas de B-lyl fueron significativamente más potentes que C2B8 , a pesar de que ambas formas de B-lyl tiene dramáticamente menor actividad de lisis mediada de complemento. La ADCC, actividades exterminadoras de células dependientes de receptor Fe y apoptosis de inducción estuvieron presentes en esta actividad superior de las variantes de anticuerpo B-lyl humanizada. Además, en el ensayo de apoptosis, ambas formas la glicodiseñada y no glicodiseñada de este anticuerpo anti-CD20 tipo II fueron potentes, con las variantes Fe diseñadas con afinidad de enlace aumentada para receptores Fcgamma que son aún más potentes en inducción de apoptosis que la variante no-Fc-diseñada, y con todas las variantes que son significativamente más potentes que el anticuerpo de control C2B8. El mecanismo exacto para agregación homotlpica mejorada e inducción de apoptosis mediada por anticuerpos anti-CD20 tipo II no se conoce y el enlace concomitante a otras moléculas en la superficie de las células positivas CD20, tales como receptores Fe gamma, pueden influenciar esta propiedad importante. Por lo tanto fue importante demostrar que los anticuerpos anti-CD20 del tipo II que han sido diseñados en su región Fe para afinidad de enlace incrementada a receptores Fe gamma, incluyen Fcgamma RUI y con un incremento asociado en la actividad ADCC, estuvieron todavía disponibles para inducir apoptosis fuerte, aún más grande que el Fe no diseñado, y agregado homotipico. La inducción de apoptosis es importante tanto in vivo, como existen lugares en el cuerpo donde las células CD20 positivas objetivo se pueden encontrar, pero donde el acceso a las células FcgammaRIII-positivas es más difícil que en la sangre, tales lugares son, por ejemplo, ganglios linfáticos. En estos lugares, la inducción de apoptosis por el anticuerpo anti-CD20 por él mismo puede ser crucial para la buena eficacia de la terapia de anticuerpo anti-CD20 en humanos, ambas para el tratamiento de malignancias haematológicas tales como linfomas no de Hodgkins y leucemia limfocítica crónica de células B, y para el tratamiento de enfermedades autoinmunes tales como artritis reumatoide y lupus vía una aproximación de vaciado de células B. La afinidad de enlace aumentada para Fcgamma RUI y la ADCC más alta del anticuerpo anti-CD20 tipo II Fc-diseñado humanizado también puede ser un atributo muy importante para tales terapias. Finalmente, la actividad de lisis mediada de complemento despreciable o reducida de este anticuerpo anti-CD20 tipo II, que incluyen variantes Fe diseñadas y humanizadas, también puede ser activación de complemento más alta importante por anticuerpos anti-CD20 que han sido correlacionados con efectos colaterales indeseables incrementados. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un polinucleotido aislado caracterizado porque comprende : a. una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6 y SEQ ID NO: 7; y b. una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO:22 y SEQ ID NO: 23; y c. secuencia ID NO: 24. 2. Un polinucleotido aislado caracterizado porque comprende SEQ ID: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10. 3. Un polinucleotido aislado de conformidad con la reivindicación 1 o reivindicación 2, caracterizado porque codifica un polipeptido de fusión. 4. Un polinucleotido aislado caracterizado porque comprende SEQ ID No : 3. 5. Un polinucleotido aislado caracterizado porque comprende SEQ ID No: 4. 6. Un polinucleotido aislado de conformidad con la reivindicación 4 o 5, caracterizado porque el polinucleotido aislado codifica un polipeptido de fusión. 154 7. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia que tiene al menos 80% de identidad a SEQ ID NO:3, en donde el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión. 8. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia que tiene al menos 80% de identidad a SEQ ID NO:4, en donde el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión. 9. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende: a. una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID No:l; y b. una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de una región Fe de anticuerpos, o un fragmento de la misma, de una especie diferente al ratón. 10. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende a. una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID No:2; y b. una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de una región Fe de anticuerpos, o un fragmento de la misma, de una especie diferente al ratón. 11. Un polinucleótido aislado caracterizado porque codifica un polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1. 12. Un polinucleótido aislado caracterizado porque codifica un polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID No : 2. 13. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende SEQ ID NO: 11. 14. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende SEQ ID NO: 12. 15. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia que tiene al menos 80% de identidad a SEQ ID NO: 11 o a SEQ ID NO: 12. 16. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia que tiene al menos 85% de identidad a SEQ .ID NO: 11 o a SEQ ID NO: 12. 17. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia que tiene al menos 90% de identidad a SEQ ID NO: 11 o a SEQ ID NO: 12. 18. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia que tiene al menos 95% de identidad a SEQ ID NO: 11 o a SEQ ID NO: 12. 19. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia que tiene al menos 99% de identidad a SEQ ID NO: 11 o a SEQ ID NO: 12. 20. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene SEQ ID NO: 13 (cadena pesada aa) . 21. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia que codifica un polipeptido que tiene SEQ ID NO: 14 (cadena ligera aa) . 22. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende : a. una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la región VH del anticuerpo murino B-Lyl, o variantes del mismo; y b. una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de una región Fe de anticuerpos, o un fragmento de la misma, de una especie diferente al ratón. 23. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende : a. una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la región VL del anticuerpo murino B-Lyl, o variantes del mismo; y b. una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de una región Fe de anticuerpos, o un fragmento de la misma, de una especie diferente al ratón. 24. Un vector de expresión caracterizado porque comprende un polinucleótido aislado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-23. 25. El vector de confomidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el vector es policistrónico . 26. Una célula hospedera caracterizada porque comprende el vector de expresión de la reivindicación 24. 27. Una célula hospedera caracterizada porque comprende un polinucleótido aislado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-23. 28. Un polipéptido caracterizado porque comprende una secuencia derivada del anticuerpo murino B-Lyl y una secuencia derivada de un polipéptido heterólogo. 29. La molécula de enlace a antigenos caracterizada porque comprende el polipéptido de la reivindicación 28. 30. La molécula de enlace a antigenos de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque enlaza al CD20 humano . 31. La molécula de enlace a antigenos de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque es un anticuerpo. 32. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque es un anticuerpo quimérico . 33. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque es un anticuerpo humanizado . 34. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque es un anticuerpo prima izado . 35. Un polipéptido quimérico caracterizado porque comprende la secuencia de SEQ ID N0:1 o una variante de la misma . 36. Un polipéptido quimérico caracterizado porque comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2 o una variante de la misma . 37. Un polipéptido quimérico caracterizado porque comprende : a. un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 17; y b. un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 27; y c. SEQ ID NO: 28. 38. Un polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque comprende además una estructura de región de cadena pesada variable, en donde la estructura comprende un residuo de alanina en la posición 71, de acuerdo a la numeración de Kabat . 39. Un polipéptido quimérico de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque comprende además una región de estructura de cadena pesada variable, en donde la estructura comprende un residuo de arginina en la posición 94, de acuerdo a la numeración de Kabat. 40. Un polipéptido quimérico caracterizado porque comprende SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20. 41. Un polipéptido aislado caracterizado porque comprende SEQ ID NO: 13 o una variante de la misma. 42. Un polipéptido aislado caracterizado porque comprende SEQ ID NO: 14 o una variante de la misma. 43. El polipéptido aislado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 35-40, caracterizado porque el polipéptido es un polipéptido de fusión. 4 . La molécula de enlace a antigenos caracterizada porque comprende el polipéptido aislado de la reivindicación 43. 45. La molécula de enlace a antígenos de la reivindicación 44, caracterizada porque la molécula de enlace a antígenos es un anticuerpo. 46. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo primatizado . 47. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo humanizado . 48. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada porque la molécula de enlace a antigenos es un fragmento de anticuerpos . 49. El fragmento de anticuerpos de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque el fragmento de anticuerpos está primatizado. 50. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 48, caracterizada porque el fragmento de anticuerpos está humanizado. 51. La molécula de enlace a antígenos, la cual puede competir con el anticuerpo murino B-Lyl para enlace a CD20, caracterizada porgue la molécula de enlace a antígenos es quimérica. 52. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque la molécula de enlace a antígenos es un anticuerpo. 53. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 52, caracterizada porque el anticuerpo está primatizado . 54. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque el anticuerpo recombinante está humanizado. 55. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque el anticuerpo recombinante comprende una región Fe humana. 56. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 55, caracterizada porque la región Fe humana es una región IgG Fe humana. 57. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 29-34 o 44-56, caracterizada porque la molécula de enlace a antígenos tiene una región Fe con oligosacáridos modificados. 58. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 57, caracterizada porque la región Fe se ha modificado para tener residuos reducidos en fucosa en comparación con una molécula de enlace a antígenos no modificada . 59. La molécula de enlace a antigenos de conformidad con la reivindicación 57, caracterizada porque la región Fe tiene una proporción incrementada de oligosacáridos biseccionados . 60. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 59, caracterizada porque los oligosacáridos modificados están biseccionados en complejo. 61. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 57, caracterizada porque los oligosacáridos modificados tienen una proporción incrementada de oligosacáridos biseccionados, no fucosilados en la región Fe de la molécula de enlace a antígenos. 62. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 61, caracterizada porque los oligosacáridos biseccionados, no fucosilados son híbridos. 63. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 61, caracterizada porque los oligosacáridos biseccionados, no fucosilados son complejos. 6 . La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 57, caracterizada porque al menos 20% de los oligosacáridos en la región Fe del polipéptido están biseccionados , no fucosilados. 65. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 57, caracterizada porque al menos 30% de los oligosacáridos en la región Fe del polipéptido están biseccionados, no fucosilados. 66. La molécula de enlace a antxgenos de conformidad con la reivindicación 57, caracterizada porque al menos 35% de los oligosacáridos en la región Fe del polipéptido están biseccionados, no fucosilados. 67. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 57, caracterizada porque al menos 70% de los oligosacáridos en la región Fe del polipéptido están biseccionados, no fucosilados. 68. Un método de producción de la molécula de enlace a antígenos, la cual puede competir con el anticuerpo murino B-Lyl para enlace a CD20 humano, y en donde la molécula de enlace a antígenos es quimérica; el método caracterizado porque comprende a. cultivar la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 26 o reivindicación 27 en un medio bajo condiciones que permitan la expresión del polinucleótido que codifica la molécula de enlace a antígenos; y b. recuperar la molécula de enlace a antígenos del cultivo resultante. 69. El método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque la molécula de enlace a antígenos es un anticuerpo . 70. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende la molécula de enlace a antígenos de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 29-34 o 46-67 Y un portador farmacéuticamente aceptable. 71. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 70, caracterizada porque la composición comprende además un portador farmacéuticamente aceptable. 72. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 70, caracterizada porque la composición comprende además un adyuvante . 73. Un método de tratamiento de un trastorno que se trata por supresión de células B caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de composición farmacéutica de -conformidad con las reivindicaciones 70-72 a un sujeto humano que necesita del mismo . 74. Una célula hospedera preparada por ingeniería para expresar al menos un ácido nucleico que codifica a un polipéptido que tiene actividad de la ß(1,4)-?-acetilglucosaminil transferasa III en una cantidad suficiente para modificar los oligosacáridos en la región Fe de un polipéptido producido para la célula hospedera, caracterizada porque el polipéptido es la molécula de enlace a antígenos de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 44-67. 75. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 74, caracterizada porque el polipéptido que tiene actividad de la ß(1,4)-?- acetilglucosaminil transferasa III es un polipéptido de fusión. 76. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 74, caracterizada porque la molécula de enlace a antigenos es un anticuerpo. 77. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 74, caracterizada porque la molécula de enlace a antígenos es un fragmento de anticuerpos. 78. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 74, caracterizada porque la molécula de enlace a antígenos comprende una región equivalente a la región Fe de una IgG humana. 79. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 74, caracterizada porque la molécula de enlace a antígenos producida por la célula hospedera muestra una afinidad de enlace incrementada al receptor Fe como resultado de la modificación. 80. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 74, caracterizada porque la molécula de enlace a antígenos producida por la célula hospedera muestra una función incrementada del efector como un resultado de la modificación . 81. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 75, caracterizada porque el polipéptido de fusión comprende el dominio catalítico de ß(1,4)-?-acetilglucosaminil transferasa III. 82. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 75, caracterizada porque el polipéptido de fusión comprende además el dominio de localización de Golgi de un polipéptido heterologo residente en Golgi. 83. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 82, caracterizada porque el dominio de localización de Golgi es el dominio de localización de manosidasa II. 84. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 82, caracterizada porque el dominio de localización de Golgi es el dominio de localización de ß(1,2)-?- acetilglucosaminil transferasa I. 85. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 82, caracterizada porque el dominio de localización de Golgi es el dominio de localización de ß(1,2)-?- acetilglucosaminil transferasa II. 86. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 82, caracterizada porque el dominio de localización de Golgi es el dominio de localización de manosidasa I. 87. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 82, caracterizada porque el dominio de localización de Golgi es el dominio de localización de al-6 núcleo fucosiltransferasa . 88. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 80, caracterizada porque la función incrementada del efector es la citotoxicidad celular incrementada mediada por Fe. 89. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 80, caracterizada porque la función incrementada del efector es un enlace creciente a células NK. 90. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 80, caracterizada porque la función incrementada del efector es un enlace creciente a macrofagos . 91. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 80, caracterizada porque la función incrementada del efector es un enlace creciente a células polimorfonucleares . 92. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 80, caracterizada porque la función incrementada del efector es un enlace creciente a monocitos . 93. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 80, caracterizada porque la función incrementada del efector es apoptosis inductora de la señalización directa creciente. 9 . La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 80, caracterizada porque la función incrementada del efector es la maduración de células dendriticas incrementada. 95. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 80, caracterizada porque la función incrementada del efector es cebado de células T incrementado. 95. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 79, caracterizada porque el receptor Fe es el receptor activador Fcy. 97. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 79, caracterizada porque el receptor Fe es el receptor FcyRIIIA. 98. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 74, caracterizada porque la célula hospedera es una célula CHO, una célula BHK, una célula NSO, una célula SP2/0, una célula de mieloma YO, una célula de mieloma de ratón P3X63 , una célula PER, una célula PER.C6 o una célula de hibridoma. 99. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 74, caracterizada porque comprende además al menos un polinucleótido transfectado que codifica un polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 28 y 35-41, y en donde el ácido nucleico comprende una secuencia que codifica una región equivalente a la región Pe región de una inmunoglobulina humana. 100. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 74, caracterizada porque el al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de ß (1 , ) -N-acetilglucosaminil transferasa III se liga operativamente a un elemento promotor constitutivo. 101. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 100, caracterizada porque el polipéptido que tiene actividad de la ß (1 , 4) -N-acetilglucosaminil transferasa es un polipéptido de fusión. 102. Un método para producir la molécula de enlace a antígenos que tiene oligosacáridos modificados en una célula hospedera, el método caracterizado porque comprende: a . cultivar una célula hospedera preparada por ingeniería para expresar al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de la ß(1,4)-?-acetilglucosaminil transferasa III bajo condiciones que permitan la producción de la molécula de enlace a antígenos, y el cual permite la modificación de los oligosacáridos presentes en la región Fe de la molécula de enlace a antígenos; y b. aislar la molécula de enlace a antígenos en donde la molécula de enlace a antígenos puede competir con el anticuerpo murino para enlace a CD20 y en donde la molécula de enlace a antígenos o fragmento de la misma es quimérica. 103. El método de conformidad con la reivindicación 102, caracterizado porque los oligosacáridos modificados tienen fucosilación reducida en comparación con los oligosacáridos no modificados . 104. El método de conformidad con la reivindicación 102, caracterizado porque los oligosacáridos modificados son híbridos . 105. El método de conformidad con la reivindicación 102, caracterizado porque los oligosacáridos modificados son comple os. 106. El método de conformidad con la reivindicación 102, caracterizado porque el anticuerpo recombinante o fragmento del mismo producido por la célula hospedera tiene una proporción incrementada de oligosacáridos biseccionados, no fucosilados en la región Fe del polipéptido. 107. El método de conformidad con la reivindicación 106, caracterizado porque los oligosacáridos biseccionados, no fucosilados son híbridos. 108. El método de conformidad con la reivindicación 106, caracterizado porque los oligosacáridos biseccionados, no fucosilados son complejos. 109. El método de conformidad con la reivindicación 102, caracterizado porque al menos 20% de los oligosacáridos en la región Fe del polipéptido están biseccionados, no fucosilados. 110. El método de conformidad con la reivindicación 102, caracterizado porque al menos 30% de los oligosacáridos en la región Fe del polipéptido están biseccionados, no fucosilados . 111. El método de conformidad con la reivindicación 102, caracterizado porque al menos 35% de los oligosacáridos en la región Fe del polipéptido están biseccionados, no fucosilados . 112. La molécula de enlace a antxgenos preparada por ingeniería para tener función incrementada del efector caracterizada porque se produce por el método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 102-111. 113. La molécula de enlace a antxgenos de conformidad con la reivindicación 112, caracterizada porque la molécula de enlace a antlgenos es un anticuerpo 114. Un anticuerpo preparado por ingeniería para tener afinidad de enlace incrementada al receptor Fe, caracterizado porque se produce por el método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 102-111. 115. La molécula de enlace a antlgenos de conformidad con la reivindicación 114, caracterizada porque la molécula de enlace a antlgenos es un anticuerpo. 116. La molécula de enlace a antlgenos de conformidad con la reivindicación 112, caracterizada porque la función incrementada del efector es citotoxicidad celular incrementada mediada por Fe. 117. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 112, caracterizada porque la función incrementada del efector es un enlace creciente a células NK. 118. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 112, caracterizada porgue la función incrementada del efector es un enlace creciente a macrofagos. 119. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 112, caracterizada porgue la función incrementada del efector es un enlace creciente a monocitos . 120. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 112, caracterizada porgue la función incrementada del efector es un enlace creciente a células polimorfonucleares . 121. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 112, caracterizada porque la función incrementada del efector es apoptosis inductora de la señalización directa. 122. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 112, caracterizada porque la función incrementada del efector es la maduración de células dendríticas incrementada. 123. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 112, caracterizada porgue la función incrementada del efector es cebado de células T incrementado. 124. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 114, caracterizada porgue el receptor Fe es un receptor activador Fe. 125. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 114, caracterizada porque el receptor Fe es receptor FcyRIIIa. 12S. La molécula de enlace a antígenos producida por el método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 102 a 111, caracterizada porque la molécula de enlace a antígenos es un fragmento de anticuerpos que contiene la región Fe y preparada por ingeniería para tener función incrementada del efector. 127. La molécula de enlace a antígenos producida por el método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 102 a 111, caracterizada porque la molécula de enlace a antígenos es una proteína de fusión que incluye un polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID N0:1 y una región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina y preparada por ingeniería para tener función incrementada del efector. 128. La molécula de enlace a antígenos producida por el método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 102 a 111, caracterizada porque la molécula de enlace a antígenos es una proteína de fusión que incluye un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No: 30/ SEQ ID No: 32; SEQ ID No: 34; SEQ ID No:36; SEQ ID No:38; SEQ No:40; SEQ ID No:42; SEQ ID No: 44; SEQ ID No:46; SEQ ID No: 48; SEQ ID NO:50; SEQ ID No: 52; SEQ No: 54; SEQ ID No: 56; SEQ ID No: 58; SEQ ID No: 60; SEQ ID No: 62; SEQ ID No : 64 ; SEQ ID No: 66; SEQ ID No: 68; SEQ ID No: 70; y SEQ ID NO: 72, y una región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina y preparada por ingeniería para tener función incrementada del efector. 129. La molécula de enlace a antígenos producida por ele método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 102 a 111, caracterizada porque la molécula de enlace a antígenos es una proteína de fusión que incluye un polipeptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 3 y una región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina y preparada por ingeniería para tener función incrementada del efector . 130. La molécula de enlace a antígenos producida por el método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 102 a 111, caracterizada porque la molécula de enlace a antígenos es una proteína de fusión que incluye un polipeptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 76 y una región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina y preparada por ingeniería para tener función incrementada del efector. 131. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende la molécula de enlace a antígenos de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 112 a 130 y un portador farm céuticamente aceptable. 132. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el fragmento de anticuerpos de conformidad con la reivindicación 126 y un portador farmacéuticamente aceptable. 133. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende la proteína de fusión de conformidad con cualesquiera de la reivindicaciones 127 a 130 y un portador farmacéuticamente aceptable. 134. Un método de tratamiento de una enfermedad que se trata por la eliminación de células B, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del enlace a antigenos de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 112 a 130 a un sujeto humano que necesita del mismo. 135. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 4 o 5, caracterizado porque comprende además una secuencia que codifica una región constante de cadena pesada o ligera de anticuerpos humanos. 136. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia con al menos 80% de identidad a SEQ ID NO: 24, en donde el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión. 137. una célula hospedera caracterizada porque coexpresa un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 136 y un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de ún anticuerpo con cadena ligera. 138. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 57, caracterizada porque al menos 50% de los oligosacáridos en la región Fe están biseccionados . 139. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 57, caracterizada porque al menos 60% de los oligosacáridos en la región Fe están biseccionados. 140. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 57, caracterizada porque al menos 70% de los oligosacáridos en la región Fe están biseccionados. 141. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 57, caracterizada porque al menos 80% de los oligosacáridos en la región Fe están biseccionados. 142. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 57, caracterizada porque al menos 90% de los oligosacáridos en la región Fe están biseccionados. 143. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 57, caracterizada porque al menos 50% de los oligosacáridos en la región Fe no están fucosilados. 144. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 57, caracterizada porque al menos 60% de los oligosacáridos en la región Fc.no están fucosilados. 145. La molécula de enlace a antlgenos de conformidad con la reivindicación 57, caracterizada porque al menos 70% de los oligosacáridos en la región Pe no están f cosilados . 146. La molécula de enlace a ant genos de conformidad con la reivindicación 57, caracterizada porque al menos 75% de los oligosacáridos en la región Fe no están f cosilados . 147. Un método de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado porque el trastorno es un linfoma de células B. 148. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No: 29; SEQ ID No: 31; SEQ ID No:33; SEQ ID ??:35; SEQ ID No:37; SEQ ID No:39; SEQ ID No:41; SEQ ID ??:43; SEQ ID No: 45; SEQ ID No:47; SEQ ID ??:49; SEQ ID No: 51; SEQ ID No: 53; SEQ ID No:55; SEQ ID No:57; SEQ ID No:59; SEQ ID No: 61; SEQ ID No: 63; SEQ ID No: 65; SEQ ID No: 67; SEQ ID No: 69; y SEQ ID No: 71. 149. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 148, caracterizado porque el polinucleótido aislado comprende SEQ ID NO: 31. 150. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 148, caracterizado porque el polinucleótido aislado comprende SEQ ID NO: 55. 151. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 148, caracterizado porque el polinucleótido aislado comprende SEQ NO: 59. 152. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende SEQ ID No: 75. 153. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 148 o 149, caracterizado porque el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión. 15 . Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende : a) una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 56; y SEQ ID NO: 60; y b) una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 76 155. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia que tiene al menos 80% identidad a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No: 29; SEQ ID No: 31; SEQ ID No:33; SEQ ID No: 35; SEQ ID No: 37; SEQ ID No:39; SEQ ID NO.-41; SEQ ID NO:43; SEQ ID No: 45; SEQ ID No:47; SEQ ID ??:49; SEQ ID NO:51; SEQ ID No: 53; SEQ ID ??:55; SEQ ID ??:57; SEQ ID No: 59; SEQ ID No: 61; SEQ ID No : 63 ; SEQ ID No.-65; SEQ ID No: 67; SEQ ID No: 69; y SEQ ID No: 71, en donde el polinucleótido aislado codifica un polipéptido de fusión. 156. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia que tiene al menos 80% identidad a SEQ ID NO: 75, en donde el polinucleotído aislado codifica un polipeptido de fusión. 157. Un polinucleotído aislado caracterizado porque comprende una secuencia que tiene al menos 85% de identidad a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No :29; SEQ ID No: 31; SEQ ID No :33; SEQ ID No: 35; SEQ ID No :37; SEQ ID No: 39; SEQ ID No :41; SEQ ID No: 43; SEQ ID No :45; SEQ ID No: 47; SEQ ID No :49; SEQ ID No: 51; SEQ ID No :53; SEQ ID No: 55; SEQ ID No :57 ; SEQ ID No: 59; SEQ ID No :61; SEQ ID No: 63 ; SEQ ID No :65; SEQ ID No: 67; SEQ ID No :69; y SEQ ID No 71. 158. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia que tiene al menos 85% de identidad a SEQ ID No: 75. 159. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia que tiene al menos 90% identidad a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No:29; SEQ ID No:31; SEQ ID No:33; SEQ ID No 35; SEQ ID No:37; SEQ ID No:39; SEQ ID No:41; SEQ ID No 43; SEQ ID No: 45; SEQ ID No:47; SEQ ID No:49; SEQ ID No 51; SEQ ID No : 53 ; SEQ ID No:55; SEQ ID No:57; SEQ ID No 59; SEQ ID No: 61; SEQ ID No:63; SEQ ID No:65; SEQ ID No 67; SEQ ID No: 69; y SEQ ID NO:71. 160. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia que tiene al menos 90% identidad a SEQ ID No: 75. 161. Un polinucleotido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia que tiene al menos 95% identidad a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No :29; SEQ ID No: 31; SEQ ID NO :33; SEQ ID No: 35; SEQ ID No :37 ; SEQ ID No: 39; SEQ ID NO :41; SEQ ID No: 43; SEQ ID No :45; SEQ ID No: 47; SEQ ID No :49; SEQ ID No: 51; SEQ ID No :53; SEQ ID No: 55; SEQ ID NO :57; SEQ ID No: 59; SEQ ID No :61; SEQ ID No: 63; SEQ ID NO :65; SEQ ID No: 67; SEQ ID No : 69; Y SEQ ID No 71. 162. Un polinucleotido aislado caracterizado porque comprende una secuencia que tiene al menos 95% identidad a SEQ ID No: 75. 163. Un polinucleotido aislado caracterizado porque comprende una secuencia que tiene al menos 99% identidad a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No: 29; SEQ ID No: 31; SEQ ID No :33; SEQ ID No 35; SEQ ID No: 37; SEQ ID No: 39; SEQ ID NO :41; SEQ ID No 43; SEQ ID No: 45; SEQ ID No: 47; SEQ ID No :49; SEQ ID No 51; SEQ ID No: 53 ; SEQ ID No: 55; SEQ ID No •57; SEQ ID No 59; SEQ ID No: 61; SEQ ID No: 63 ; SEQ ID No :65; SEQ ID No 67; SEQ ID NO: 69; Y SEQ ID No 71. 164. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende una secuencia que tiene al menos 99% identidad a SEQ ID No: 75. 165. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende : a) una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No 30; SEQ ID No 32; SEQ ID No :34; SEQ ID No :36; SEQ ID No 38; SEQ ID No 40; SEQ ID No :42; SEQ ID No :44; SEQ ID No 46; SEQ ID No 48; SEQ ID No :50; SEQ ID No :52; SEQ ID No 54; SEQ ID NO 56; SEQ ID No :58; SEQ ID No :60; SEQ ID No 62; SEQ ID NO 64; SEQ ID No :66; SEQ ID No :68; SEQ ID No 70; y SEQ ID No :72; y b) una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de una región Fe de anticuerpos, o un fragmento del mismo, de una especie diferente al ratón. 166. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende : a) una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID No: 76; y b) una secuencia que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de una región Fe de anticuerpos, o un fragmento del mismo, de una especie diferente al ratón. 167. Un polinucleótido aislado caracterizado porque codifica un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No :30; SEQ ID No:32; SEQ ID No:34; SEQ ID No: 36; SEQ ID No:38; SEQ ID No:40; SEQ ID No: 42; SEQ ID No: 44; SEQ ID No:46; SEQ ID No: 48; SEQ ID No: 50; SEQ ID No: 52; SEQ ID No: 54; SEQ ID No:5S; SEQ ID No: 58; SEQ ID No: 60; SEQ ID No:62; SEQ ID No -.64; SEQ ID No: 66; SEQ ID No: 68; SEQ ID No: 70; y SEQ ID No: 72. 168. Un pollnucleótido aislado caracterizado porque codifica un polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID No: 76. 169. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No :30; SEQ ID No :32; SEQ ID No: 34; SEQ ID No: 36; SEQ ID No :38; SEQ ID No :40; SEQ ID No: 42; SEQ ID No: 44; SEQ ID No :46; SEQ ID No :48; SEQ ID No: 50; SEQ ID No: 52; SEQ ID No : 54 ; SEQ ID No :56; SEQ ID No: 58; SEQ ID No: 60; SEQ ID No :62; SEQ ID No :64; SEQ ID No: 66; SEQ ID No: 68; SEQ ID No :70; y SEQ ID No :72. 170. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende una secuencia que codifica un polipéptido que tiene SEQ ID NO: 76. 171. Un vector de expresión caracterizado porque comprende un polinucleótido aislado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 148-170. 172. El vector de conformidad con la reivindicación 171, caracterizado porque el vector es policistronico . 173. Una célula hospedera caracterizada porque comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 171. 174. Una célula hospedera caracterizada porque comprende un polinucleótido aislado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 148-170. 175. Un polipéptido humanizado caracterizado porque comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No: 30; SEQ ID No:32; SEQ ID No:34; SEQ ID No: 36; SEQ ID No: 38; SEQ ID No: 40; SEQ ID No: 42; SEQ ID No: 44; SEQ ID No:46; SEQ ID No:48; SEQ ID No:50; SEQ ID No:52; SEQ ID No:54; SEQ ID No: 56; SEQ ID No: 58; SEQ ID No: 60; SEQ ID No: 62; SEQ ID No: 64; SEQ ID No: 66; SEQ ID No: 68; SEQ ID No: 70; y SEQ ID No: 2, o una variante del mismo. 176. Un polipéptido humanizado caracterizado porque comprende la secuencia de SEQ ID NO: 76, o una variante del mismo. 177. Un polipéptido aislado caracterizado porque comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID No:30; SEQ ID No:32; SEQ ID No:34; SEQ ID No:36; SEQ ID No:38; SEQ ID No:40; SEQ ID No:42; SEQ ID No:44; SEQ ID No: 46; SEQ ID No:48; SEQ ID No:50; SEQ ID No: 52; SEQ ID No:54; SEQ ID No: 56; SEQ ID No: 58; SEQ ID No:60; SEQ ID No: 62; SEQ ID No : 64 ; SEQ ID No: 66; SEQ ID No : 68; SEQ ID No: 70; y SEQ ID No: 72, o una variante del mismo. 178. Un polipéptido aislado caracterizado porque comprende SEQ ID NO: 76, o una variante del mismo. 179. El polipeptido aislado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 177-178, caracterizado porque el polipéptido es un polipeptido de fusión. 180. La molécula de enlace a antígenos caracterizada porque comprende el polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 179. 181. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 180, caracterizada porque la molécula de enlace a antígenos es un anticuerpo. 182. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 181, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo humanizado . 183. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 180, caracterizada porque la molécula de enlace a antígenos es un fragmento de anticuerpos. 184. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 183, caracterizada porque el fragmento de anticuerpos está humanizado. 185. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 180, caracterizada porque la molécula de enlace a antígenos es un anticuerpo recombinante . 186. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 185, caracterizada porque el anticuerpo recombinante está humanizado. 187. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 180, caracterizada porque el anticuerpo recombinante comprende una región Fe humana. 188. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 187, caracterizada porque la región Fe humana es una región IgG Fe humana. 189. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 180-188, la molécula de enlace a antígenos caracterizada porque tiene una región Fe con oligosacáridos modificados. 190. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 189, caracterizada porque la región Fe se ha modificado para tener residuos reducidos en fucosa en comparación con la molécula de enlace a antígenos no modificada . 191. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 189, caracterizada porque la región Fe tiene una proporción incrementada de oligosacáridos biseccionados . 192. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 189, caracterizada porque los oligosacáridos modificados están biseccionados en complejo. 193. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 189, caracterizada porque los oligosacáridos modificados tienen una proporción incrementada de oligosacáridos biseccionados, no fucosilados en la región Fe de la molécula de enlace a antlgenos. 194. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 193, caracterizada porque los oligosacáridos biseccionados, no fucosilados son híbridos. 195. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 193, caracterizada porque los oligosacáridos biseccionados, no fucosilados son complejos. 196. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 189, caracterizada porque al menos 20% de los oligosacáridos en la región Fe del polipéptido están biseccionados, no fucosilados. 197. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 189, caracterizada porque al menos 30% de los oligosacáridos en la región Fe del polipéptido están biseccionados, no fucosilados. 198. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 189, caracterizada porque al menos 35% de los oligosacáridos en la región Fe del polipéptido están biseccionados, no fucosilados. 199. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 189, caracterizada porque al menos 70% de los oligosacáridos en la región Fe del polipéptido están biseccionados, no fucosilados. 200. Un método de producción de la molécula de enlace a antígenos, la cual puede competir con el anticuerpo murino B-Lyl para enlace a CD20 humano, y en donde la molécula de enlace a antígenos es quimérica; el método caracterizado porgue comprende : a) cultivar la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 173 o reivindicación 174 en un medio bajo condiciones que permitan la expresión del polinucleótido que codifica la molécula de enlace a antígenos; y b) recuperar la molécula de enlace a antigenos. 201. El método de conformidad con la reivindicación 200, caracterizado porque la molécula de enlace a antígenos es un anticuerpo . 202. El método de conformidad con la reivindicación 200, caracterizado porque la molécula quimérica de enlace a antígenos está humanizada. 203. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende la molécula de enlace a antígenos de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 189-199 y un portador farmacéuticamente aceptable. 204. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 203, caracterizada porque la composición comprende además un portador farmacéuticamente aceptable. 205. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 203, caracterizada porque la composición comprende además un adyuvante . 206. Un método de tratamiento de un trastorno tratable por supresión de células B, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica de conformidad con cualesquiera de la reivindicaciones 203-205 a un sujeto humano que necesita del mismo. 207. Una célula hospedera preparada por ingeniería para expresar al menos un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene actividad de ß(1,4)-?-acetilglucosaminil transferasa III en una cantidad suficiente para modificar los oligosacáridos en la región Fe de un polipéptido producido por la célula hospedera, caracterizada porque el polipéptido es la molécula de enlace a antigenos de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 180-197. 208. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 207, caracterizada porque el polipéptido que tiene actividad de ß (1 , 4) -N-acetilglucosaminil transferasa III es un polipéptido de fusión. 209. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 207, caracterizada porque la molécula de enlace a antígenos es un anticuerpo. 210. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 207, caracterizada porque la molécula de enlace a antígenos es un fragmento de anticuerpos. 211. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 207, caracterizada porque la molécula de enlace a antígenos comprende una región equivalente a la región Fe de una IgG humana. 212. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 207, caracterizada porque la molécula de enlace a antígenos producida por la célula hospedera muestra afinidad de enlace incrementada al receptor Fe como un resultado de la modificación. 213. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 207, caracterizada porque la molécula de enlace a antígenos producida por la célula hospedera muestra una función incrementada del efector como un resultado de la modificación . 214. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 208, caracterizada porque el polipéptido de fusión comprende el dominio catalítico de ß(1,4)-?-acetilglucosaminil transferasa III. 215. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 208, caracterizada porque el polipéptido de fusión comprende además el dominio de localización de Golgi de un polipéptido heterólogo residente en Golgi. 216. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 215, caracterizada porque el dominio de localización de Golgi es el dominio de localización de manosidasa II . 217. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 215, caracterizada porque el dominio de localización de Golgi es el dominio de localización' de ß (1 , 2) -N-acetilglucosaminil transferasa I. 218. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 215, caracterizada porque el dominio de localización de Golgi es el dominio de localización de ß (1, 2) -N-acetilglucosaminil transferasa II. 219. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 215, caracterizada porque el dominio de localización de Golgi es el dominio de localización de manosidasa I . 220. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 215, caracterizada porque el dominio de localización de Golgi es el dominio de localización de a-1-ß núcleo fucosiltransferasa . 221. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 213, caracterizada porque la función incrementada del efector es citotoxicidad celular incrementada mediada por Fe. 222. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 213, caracterizada porque la función incrementada del efector es un enlace creciente a células N . 223. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 213, caracterizada porque la función incrementada del efector es un enlace creciente a macrofagos. 224. La célula hospedera, de conformidad con la reivindicación 213, caracterizada porque la función incrementada del efector es un enlace creciente a células polimorfonucleares . 225. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 213, caracterizada porque la función incrementada del efector es un enlace creciente a monocitos . 22S. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 213, caracterizada porque la función incrementada del efector es apoptosis inductora de la señalización directa creciente. 227. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 213, caracterizada porque la función incrementada del efector es la maduración de células dendríticas incrementada. 228. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 213, caracterizada porque la función incrementada del efector es cebado de células T incrementado. 229. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 212, caracterizada porque el receptor Fe es el receptor activador Fcy. 230. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 212, caracterizada porque el receptor Fe es el receptor FcyRIIIA. 231. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 207, caracterizada porque la célula hospedera es una célula CHO, una célula BHK, una célula NSO, una célula SP2/0, una célula de mieloma YO, una célula de raieloma de ratón P3X63 , una célula PER, una célula PER.C6 o una célula de hibridoma. 232. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 207, caracterizada porque comprende además al menos un polinucleótido transfectado que codifica un polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 28 y 35-41, y en donde el ácido nucleico comprende una secuencia que codifica una región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina humana. 233. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 207, caracterizada porque el al menos un ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene actividad de ß (1, ) -N-acetilglucosaminil transferasa III se liga operativamente a un elemento promotor constitutivo. 234. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 207, caracterizada porque el polipéptido que tiene actividad de ß (1, 4) -N-acetilglucosaminil transferasa III es un polipéptido de fusión. 235. La molécula de enlace a antigenos de conformidad con la reivindicación 189, caracterizada porque al menos 50% de los oligosacáridos en la región Fe están biseccionados. 236. La molécula de enlace a antigenos de conformidad con la reivindicación 189, caracterizada porque al menos 60% de los oligosacáridos en la región Fe están biseccionados . 237. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 189, caracterizada porque al menos 70% de los oligosacáridos en la región Fe están biseccionados. 238. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 189, caracterizada porque al menos 80% de los oligosacáridos en la región Fe están biseccionados. 239. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 189, caracterizada porque al menos 90% de los oligosacáridos en la región Fe están biseccionados. 240. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 189, caracterizada porque al menos 50% de los oligosacáridos en la región Fe no están fucosilados. 241. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 189, caracterizada porque al menos 60% de los oligosacáridos en la región Fe no están fucosilados. 242. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 189, caracterizada porque al menos 70% de los oligosacáridos en la región Fe no están fucosilados. 243. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 189, caracterizada porque al menos 75% de los oligosacáridos en la región Fe no están fucosilados. 244. Un método de conformidad con la reivindicación 206, caracterizado porque el trastorno es un linfoma de células B. 245. Un polinucleótido aislado que comprende al menos una región determinante de la complementariedad del anticuerpo murino B-Lyl, o una variante o forma truncada de la misma que contiene al menos los residuos determinantes de la especificidad para la región determinante de la complementaráedad, caracterizado porque el polinucleótido aislado codifica un polipeptido de fusión. 246. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 245, caracterizado porque la región determinante de la complementariedad es seleccionada del grupo que consiste de : [LISTA DE TODAS LAS SECUENCIAS CDR] . 247. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 245, caracterizado porque el polinucleótido aislado codifica la molécula de enlace a antigenos. 248. Un polinucleótido aislado caracterizado porque comprende al menos tres regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo murino B-Lyl, o variantes o fromas truncadas del mismos, que contiene al menos los residuos determinantes de la especificidad para cada una de las tres regiones determinantes de la complementariedad, en donde el polinucleótido aislado codifica un polipeptido de fusión. 249. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 248, caracterizado porque las regiones determinantes de la complementariedad comprenden al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7; y al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, y SEQ ID NO: 23; y SEQ ID NO: 24, o variantes o formas truncadas de las secuencias que contienen al menos los residuos determinantes de la especificidad para cada una de las regiones determinantes de la complementariedad. 250. El polipeptido aislado caracterizado porque se codifica por los polinucleótidos aislados de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 245-249. 251. La molécula de enlace a antígenos caracterizada porque comprende al menos una región determinante de la complementariedad del anticuerpo murino B-Lyl, o una variante o forma truncada de la misma que contiene al menos los residuos determinantes de la especificidad para la región determinante de la complementariedad, y que comprende además una secuencia derivada de un polipeptido heterologo . 252. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 251, caracterizada porque la molécula de enlace a antígenos comprende al menos tres regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo murino B-Lyl, o variantes o formas truncadas del mismo que contienen al menos los residuos determinantes de la especificidad para cada una de las regiones determinantes de la complementariedad. 253. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 252, caracterizada porque la molécula de enlace a antígenos comprende la región variable de un anticuerpo de cadena pesada o ligera. 254. La molécula de enlace a antígenos de conformidad con la reivindicación 252, caracterizada porque la molécula de enlace a antigenos es un anticuerpo quimérico o humanizado . 255. Un anticuerpo anti-CD20 de Tipo II preparado por ingeniería caracterizado porque tiene ADCC incrementada como un resultado de la ingeniería sin pérdida substancial de la capacidad para inducir la apoptosis de células objetivo. 256. Un anticuerpo anti-CD20 de Tipo II preparado por ingeniería de conformidad con la reivindicación 255, caracterizado porque el anticuerpo se ha preparado por ingeniería para tener un patrón alterado de glicosilacion en la región Fe. 257. Un anticuerpo anti-CD20 de Tipo II preparado por ingeniería de conformidad con la reivindicación 256, caracterizado porque la glicosilacion alterada es un incremento en la cantidad de oligosacáridos complejos biseccionados . 258. Un anticuerpo anti-CD20 de Tipo II preparado por ingeniería de conformidad con la reivindicación 256, caracterizado porque la glicosilación alterada es una disminución en la cantidad de los residuos de fucosa. 259. Un anticuerpo anti-CD20 de Tipo II preparado por ingeniería de conformidad con la reivindicación 255, caracterizado porque el anticuerpo se ha preparado por ingeniería para tener una secuencia de aminoácidos alterada en la región Fe.
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