KR20110129990A - 증가된 ｆｃ 수용체 결합 친화성 및 효과기 기능을 가진 ｃｄ20 항체 - Google Patents

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Abstract

쥐과동물 B-Ly1 항체의 결합 특이성을 갖고, Fc 수용체 결합 친화성 및 효과기 기능을 증진시키도록 글리코엔지니어링된 항원 결합 분자 (ABM) 의 광범위한 치료적 잠재성을 인지하여, 본 발명자들은 상기 ABM 의 제조 방법을 개발하였다. 즉, 상기 방법은 재조합, 키메라 항체 또는 그의 키메라 절편의 생성을 포함한다. 상기 ABM 의 효능은 항체 Fc 영역의 글리코실화 프로파일을 엔지니어링함으로써 추가로 증진된다.
[색인어]
Fc 수용체, B-Ly1 항체, 키메라 항체, 항원 결합 분자, 결합 특이성

Description

증가된 ＦＣ 수용체 결합 친화성 및 효과기 기능을 가진 ＣＤ20 항체 {CD20 ANTIBODIES WITH INCREASED FC RECEPTOR BINDING AFFINITY AND EFFECTOR FUNCTION}
본 발명은 항원 결합 분자 (ABM) 에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인간 CD20 에 특이적인 키메라성, 영장류화 (primatized) 또는 인간화 항체를 포함한 재조합 단일클론 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 그러한 ABM 을 인코딩하는 핵산 분자, 및 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 본 발명의 ABM 의 생성 방법, 및 질병의 치료에 상기 ABM 을 사용하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 증가된 Fc 수용체 결합력 및 증가된 효과기 기능을 가진 항체를 포함하여, 향상된 치료적 특성을 갖는 변형 글리코실화된 (modified glycosylation) ABM 분자에 관한 것이다.
면역계 및 항- CD20 항체
인간을 포함한 척추동물의 면역계는, 침범하는 외부 미생물체 ("항원") 를 정확하고도 특이적으로 인지하고, 결합하여 파괴하도록 진화된 여러 기관 및 세포 유형으로 이루어진다. 림프구는 면역계의 적절한 기능에 있어서 중요하다. 상기 세포는 흉선, 비장 및 골수 (성인) 에서 생성되며, 성인 인간의 순환계에 존재하는 총 백혈구의 약 30% 를 차지한다. 두 가지 주요한 림프구의 하위 집단이 존재한다 : T 세포 및 B 세포. T 세포가 세포 매개성 면역을 담당하는 반면, B 세포는 항체 생성 (체액성 면역) 을 담당한다. 그러나, 통상적인 면역 반응에서, T 세포 및 B 세포는 상호의존적으로 작용한다 : T 세포 수용체가 항원 제시 세포 표면상의 주 조직적합성 복합체 ("MHC") 당단백질에 결합된 항원 절편에 결합하는 경우 T 세포가 활성화되며 ; 그러한 활성화는, B 세포를 자극하여 항원에 대한 항체 ("면역글로불린") 를 분화 및 생성하는 생물학적 매개체 ("인터루킨") 의 방출을 유도한다.
숙주 내의 각 B 세포는 한 가지 특정한 유형 및 특이성의 항체를 발현하고, 상이한 B 세포는 상이한 항원들에 특이적인 항체들을 발현한다. B 세포 증식 및 항체 생성이 외부 항원에 대한 반응으로서 급격히 증가하고, 일단 외부 항원이 중성화되면 둘 다 통상적으로 정지 (또는 실질적으로 감소) 된다. 그러나, 이따금 특정 B 세포의 증식이 계속해서 줄어들지 않는데 ; 그러한 증식은 "B 세포 림프종" 이라 불리는 암을 유발할 수 있다.
T 세포 및 B 세포 모두 분화 및 식별을 위한 "마커(marker)" 로서 사용될 수 있는 세포 표면 단백질을 포함한다. 상기 인간 B 세포 마커 중 하나가 인간 B 림프구-제한적 분화 항원 Bp35 로서, "CD20" 으로 불린다. CD20 은 초기 예비-B 세포 발생 중에 발현되며, 원형질 세포 분화시까지 남아 있다. 구체적으로는, CD20 분자는 세포 주기의 개시 및 분화에 필요한 활성화 과정의 단계를 조절할 수 있으며, 보통 신생물성 ("종양") B 세포에서 매우 높은 수준으로 발현된다. CD20 이 "악성" B 세포, 즉, 증식이 줄어들지 않아 B 세포 림프종으로 진행될 수 있는 B 세포 상에 높은 수준으로 존재하기 때문에, CD20 표면 항원은 B 세포 림프종의 "표적화" 를 위한 후보로서의 잠재력을 가진다.
본질적으로, 상기 표적화는 하기와 같이 일반화될 수 있다 : B 세포의 CD20 표면 항원에 특이적인 항체를 예컨대 주사에 의해 환자에 도입한다. 상기 항-CD20 항체는 (표면적으로는) 정상 및 악성 B 세포 모두의 CD20 세포 표면 항원에 특이적으로 결합한다 ; CD20 표면 항원에 결합된 항-CD20 항체가 신생물성 B 세포의 파괴 및 고갈을 초래할 수 있다. 또한, 종양을 파괴하는 잠재력을 지닌 화학적 제제 또는 방사성 표지를 항-CD20 항체에 콘쥬게이션하여, 상기 제제가 예컨대 신생물성 B 세포에 특이적으로 "전달" 되게 할 수 있다. 접근법에 관계없이, 일차적 목표는 종양을 파괴하는 것이다 : 구체적인 접근법은 사용되는 특정 항-CD20 항체에 의해 결정될 수 있으며, 따라서 CD20 항원을 표적화하는데 사용가능한 접근법은 상당히 다양할 수 있다.
CD20 양성 B-세포, 저등급 또는 소포성 비-호지킨(Non-Hodgkin's) 림프종의 치료를 위한 리툭시마브 (RituxanTM ; IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA, 및Genentech Inc., San Francisco, CA), 진행성 유방암의 치료를 위한 트라스투주마브 (HerceptinTM ; Genentech Inc,) (Grillo-Lopez, A.-J., 등, Semin . Oncol . 26 : 66 - 73 (1999) ; Goldenberg, M. M., Clin . Ther . 21 : 309 - 18 (1999)), 재발된 급성 골수성 백혈병의 치료를 위한 겜투주마브 (MylotargTM, Celltech/Wyeth-Ayerst), 및 B 세포 만성 림프구성 백혈병의 치료를 위한 알렘투주맙 (CAMPATHTM, Millenium Pharmaceuticals/Schering AG) 에 대한 미국 식품의약품 안정청의 승인으로 드러나듯이, 비(非)콘쥬게이션 단일클론 항체 (mAb) 는 유용한 암치료용 의약이 될 수 있다. 이들 제품의 성공은 그 효능 뿐만 아니라 그의 뛰어난 안전성 프로파일에 기인한다 (Grillo-Lopez, A.-J., 등, Semin . Oncol . 26 : 66 - 73 (1999) ; Goldenberg, M.M., Clin . Ther . 21 : 309 - 18(1999)). 이들 약물의 성공에도 불구하고, 비콘쥬게이션 mAb 요법에 의해 통상적으로 얻을 수 있는 것보다 특이성이 더 높은 항체 활성을 수득하는 데 현재 많은 관심이 집중되고 있다. 쥐과동물 단일클론 항체, B-Ly1 은 인간 CD20 에 대하여 특이적인 것으로 알려진 또다른 항체이다 (Poppema, S. 및 Visser, L., Biotest Bulletin 3: 131-139 (1987)).
여러 연구 결과는, Fc-수용체-의존적 기작이 종양에 대한 세포독성 항체의 작용에 실질적으로 기여함을 암시하며, 종양에 대한 최적의 항체는 우선적으로 활성화 Fc 수용체에 결합하고 저해성 파트너인 FcγRⅡB 에는 최소한으로 결합하는 것을 나타낸다 (Clynes, R. A., 등, Nature Medicine 6 (4): 443-446 (2000); Kalergis, A. M., and Ravetch, J. V., J. Exp . Med . 195 (12): 1653-1659 (June 2002)). 예를 들어, 최소한 하나 이상의 연구 결과는, 특정 FcγRⅢa 수용체가 항체 치료법의 효능과 밀접하게 연관되어 있음을 제시하고 있다 (Cartron, G., 등, Blood 99 (3): 754-757 (February 2002)). 상기 연구는, FcγRⅢa 에 동종접합성인 환자가 이종접합성인 환자에 비해 리툭시마브에 대한 반응이 더 양호함을 보여주었다. 그 저자들은, 상기 우수한 반응성이, 항체의 FcγRⅢa 에 대한 생체 내 더 우수한 결합으로 인하여 림프종 세포에 대한 더 나은 ADCC 활성을 가져오기 때문인 것으로 결론지었다 (Cartron, G., 등, Blood 99 (3): 754-757 (February 2002)).
CD20 표면 항원을 표적화하려는 다양한 시도가 보고되어 왔다. 쥐과동물 (마우스) 단일클론 항체 1F5 (항-CD20 항체) 가 연속적 정맥내 주입에 의해 B 세포 림프종 환자에게 투여된 것으로 보고되었다. 순환하는 종양 세포를 고갈시키기 위해서는 극히 높은 수준 (> 2 그램) 의 1F5 가 필요한 것으로 보고되었으며, 그 결과는 "일시적인" 것으로 설명되었다 ("Press 등, "Monoclonal Antibody 1F5 (Anti-CD20) Serotherapy of Human B-Cell Lymphomas" Blood 69/2: 584-591 (1987)). 상기 접근법의 잠재적 문제점은, 비인간 단일클론 항체 (예컨대, 쥐과동물 단일클론 항체) 는 전형적으로 인간 효과기(effector) 기능성을 결여한다는 점, 즉 이들은 특히 보체 의존적 파쇄를 매개하거나 항체 의존적 세포 독성 또는 Fc-수용체 매개 식균작용을 통해 인간 표적 세포를 파쇄하지 못한다는 점이다. 더욱이, 비-인간 단일클론 항체는 인간 숙주에 의해 외부 단백질로 인지될 가능성이 있다 ; 따라서, 상기 외부 항체의 반복적 주사는, 면역 반응을 유도하여 해로운 과민 반응을 초래할 수 있다. 쥐과동물-유래의 단일클론 항체에 있어서, 이를 종종 인간 항-마우스 항체 반응, 또는 "HAMA" 반응이라 부른다. 또한, 이들 "외부" 항체는 숙주의 면역계에 의해 공격을 당하여, 그 표적 부위에 도달하기도 전에 사실상 중화될 수 있다.
B-세포 장애의 치료에 효과적인 쥐과동물 단일클론 항체의 능력을 향상시키기 위한 또다른 접근법으로서, 항체에 방사성 표지 또는 독소를 콘쥬게이션하여 표지 또는 독소가 종양 부위에 위치하도록 하는 방법이 보고되었다. 예를 들어, 상기 1F5 항체를 요오드-131 ("131I") 로 "표지(labeled)" 하여, 두 명의 환자에서의 생체내 분포를 측정한 것이 보고되었다. [Eary, J. F. 등, "Imaging and Treatment of B-Cell Lymphoma" J. Nuc. Med. 31/8 : 1257 - 1268 (1990) ; 및, Press, O. W. 등, "Treatment of Refractory Non-Hodgkin's Lymphoma with Radiolabeled MB-1 (Anti-CD37) Antibody" J. Clin. Onc. 7/8 : 1027 - 1038 (1989) (131I-표지된 IF-5 로 치료된 한 환자에게서 "부분적 반응" 을 얻었음을 제시함) ; Goldenberg, D. M. 등, "Targeting, Dosimetry and Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphomas with Iodine-131-Labeled LL2 Monoclonal Antibody" J. Clin . Onc. 9/4 : 548 - 564 (1991) (여러번 주사 투여받은 환자 8명 중 3명이 HAMA 반응을 나타낸 것으로 보고됨); Appelbaum, F. R."Radiolabeled Monoclonal Antibodies in the Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma" Hem ./ Onc . Clinics of N. A. 5/5: 1013-1025 (1991) (review article); Press, O. W. 등 "Radiolabeled-Antibody Therapy of B-Cell Lymphoma with Autologous Bone Marrow Support." New England J. Med . 329/17: 1219-1223 (1993) (요오드-131 표지된 항-CD20 항체 IF5 및 B1); 및 Kaminski, M. G. 등 "Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphoma with 131I Anti-B1 (Anti-CD20) Antibody". New England J. Med . 329/7 (1993) (요오드-131 표지된 항-CD20 항체 B1; 이하 "Kaminski")] 참조. 독소 (즉, 독소루비신 또는 마이토마이신 C 와 같은 화학요법제) 또한 항체에 콘쥬게이션되었다. 예를 들어, PCT 공개 공보 WO 92/07466 (공개일 1992년 5월 14일) 참조.
2 이상의 상이한 종 (예컨대, 마우스와 인간) 에서 유래된 항체 일부를 포함하는 키메라 항체가 "콘쥬게이션" 항체에 대한 대안으로서 개발되었다. 예를 들어, [Liu, A. Y. 등 "Production of a Mouse-Human Chimeric Monoclonal Antibody to CD20 with Potent Fc-Dependent Biologic Activity" J. Immun. 139/10: 3521-3526 (1987)] 은 CD20 항원에 대한 마우스/인간 키메라 항체를 기술하고 있다. PCT 공개 번호 WO 88/04936 역시 참조. 예를 들어, 키메라 항-CD20 항체인 리툭시마브 (RITUXAN®) 는 비-호지킨 림프종의 치료용으로 승인되었다.
B 세포 림프종에 의해 CD20 이 발현되는 경우, 상기 항원은 상기 림프종의 "표적화" 를 위한 후보로서 기능할 수 있다. 본질적으로, 상기 표적화는 하기와 같이 일반화될 수 있다 : B 세포 상의 CD20 표면 항원에 특이적인 항체를 환자에 투여함. 이들 항-CD20 항체는 (표면적으로는) 정상 및 악성 B 세포 모두의 CD20 항원에 특이적으로 결합하고, 세포 표면 상의 CD20 에 결합된 항체는 종양성 B 세포의 파괴 및 고갈을 가져올 수 있다. 또한, 화학적 제제, 세포독성제 또는 방사성 제제를 항-CD20 항체에 직접 또는 간접적으로 부착하여, 상기 제제가 CD20 항원을 발현하는 B 세포에 선별적으로 "전달" 되게 할 수 있다. 이러한 두 접근법으로, 일차적 목표는 종양을 파괴하는 것이다. 구체적인 접근법은 사용되는 특정 항-CD20 항체에 따라 상이할 것이다. 따라서, CD20 항원의 표적화의 다양한 접근 방법은 상당히 다양할 수 있음이 명백하다.
리툭시마브 (RITUXAN®) 항체는, 유전적으로 엔지니어링된 키메라성 인간 감마 1 쥐과동물 불변 영역(a genetically engineered chimeric human gamma 1 murine constant domain)을 함유한, 인간 CD20 항원에 대한 단일클론 항체이다. 상기 키메라 항체는 인간 감마 1 불변 영역을 포함하며, IDEC Pharmaceuticals Corporation 에 양도된 미국 특허 번호 5,736,137 (Andersen 등, 1998년 4월 17일 발행) 에서 "C2B8" 이란 명칭으로 분류되었다. RITUXAN® 은 재발성 또는 굴절성(refracting) 저등급 또는 소포성의 CD20 양성 B 세포 비-호지킨 림프종 환자의 치료용으로 승인되었다. 작용 기작에 대한 시험관내 연구는, RITUXAN® 이 인간 보체-의존적 세포독성 (CDC) 을 나타냄을 밝혔다 (Reff 등, Blood 83 (2): 435-445 (1994)). 또한, 이는, 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC) 을 측정하는 어세이 (assay) 에서 상당한 활성을 나타낸다. RITUXAN® 은, 사이미딘 혼입 어세이에서 항-증식 활성을 지니고 직접 세포자멸사를 유도하는 제한적 능력을 지니는 것으로 (반면 CD20 항체는 그렇지 않음) 나타났다 (Maloney 등, Blood 88 (10): 637a (1996)).
항체의 글리코실화
올리고사카라이드 성분은 물리적 안정성, 프로테아제 공격에 대한 저항성, 면역계와의 상호작용, 약동학, 및 특이적 생물학적 활성을 포함한 치료적 당단백질의 효능과 관계된 특성에 상당한 영향을 줄 수 있다. 상기 특성은 올리고사카라이드의 존부 뿐만 아니라, 이의 특정한 구조에 따라 상이할 수 있다. 올리고사카라이드 구조 및 당단백질 기능 사이에 일부 일반화가 이루어질 수 있다. 예를 들어, 특정 올리고사카라이드 구조는 특정한 탄수화물 결합 단백질과의 상호작용을 통하여 혈류로부터 당단백질을 빠르게 제거하는 작업을 매개하는 반면, 다른 것은 항체에 결합되어 원치않는 면역 반응을 유발할 수 있다 (Jenkins 등, Nature Biotechnol . 14 : 975 - 81 (1996)).
포유류 세포는, 단백질을 인간에의 적용을 위한 가장 적합한 형태로 글리코실화하는 그 능력으로 인하여, 치료적 당단백질의 생성을 위한 바람직한 숙주이다 (Cumming 등, Glycobiology 1 :115 - 30 (1991) ; Jenkins 등, Nature Biotechnol . 14 : 975 - 81 (1996)). 박테리아는 매우 드물게 단백질을 글리코실화하고, 효모, 사상진균류, 곤충 및 식물 세포와 같은 다른 일반적인 유형의 숙주처럼, 혈류로부터의 신속한 제거, 원치 않는 면역 상호 작용, 및 일부 특이한 경우, 생물학적 활성의 감소와 관련된 글리코실화 패턴을 만들어낸다. 포유류 세포 중에서, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포가 지난 이십년간 가장 흔히 사용되어 왔다. 상기 세포는 적절한 글리코실화 패턴을 제공할 뿐만 아니라, 유전적으로 안정적인, 높은 생산성의 클론 세포주의 지속적 생성을 가능하게 한다. 이는, 혈청이-없는 배지를 사용하여 간단한 생물 반응기 (bioreactor) 에서 고밀도로 배양될 수 있고, 안전하고도 재현가능한 바이오프로세스(bioprocess) 개발을 가능하게 한다. 기타 흔히 사용되는 동물 세포에는 베이비 햄스터 신장 (BHK) 세포, NS0- 및 SP2/0-마우스 골수종 세포가 포함된다. 가장 최근에는, 형질전환 동물로부터의 생성 또한 실험 중이다 (Jenkins 등, Nature Biotechnol . 14 : 975 - 81 (1996)).
모든 항체는 중쇄 불변 영역의 보존된 위치에 탄수화물 구조를 함유하고, 각 아이소타입(isotype)이 단백질 어셈블리, 분비 또는 기능적 활성에 다양하게 영향을 미치는 독특한 배열의 N-연결 탄수화물 구조를 보유한다 (Wright, A., 및 Morrison, S. L., Trends Biotech . 15 : 26 - 32 (1997)). 부착된 N-연결 탄수화물의 구조는 가공(processing) 정도에 따라 상당히 다양하고, 고(高)-만노스, 다(多)-분지 및 이촉각성(biantennary) 복합 올리고사카라이드를 포함할 수 있다 (Wright, A., 및 Morrison, S. L., Trends Biotech . 15 : 26 - 32 (1997)). 전형적으로, 특정 글리코실화 부위에 부착된 핵심 올리고사카라이드 구조의 균질하지 않은(heterogenous) 가공이 존재하여, 단일클론 항체조차도 다중의 단백당형(glycoform)으로서 존재한다. 마찬가지로, 항체 글리코실화에 있어서 주요한 차이가 세포주 간에 발생하고, 심지어 경미한 차이도 상이한 배양 조건 하에 생장된 소정의 세포주에서 보여지는 것으로 나타났다 (Lifely, M. R. 등, Glycobiology 5(8) : 813 - 22 (1995)).
효능을 크게 증가시키는 한편, 간단한 제조 공정을 유지하면서 심각한, 바람직하지 않은 부작용을 잠재적으로 피할 수 있는 한 방법은, 본원에 그 전체가 참조로서 삽입된 [Umana, P. 등, Nature Biotechnol . 17 : 176 - 180 (1999) 및 미국 특허 번호 6,602,684] 에 기재된 바와 같이 단일클론 항체의 올리고사카라이드 성분을 엔지니어링함으로써 이의 천연, 세포-매개적 효과기 기능을 증강시키는 것이다. 암의 면역요법에서 가장 널리 사용되는 항체인 IgG1 유형 항체는, 각 CH2 도메인의 Asn297 에 보존된 N-연결 글리코실화 부위를 갖는 당단백질이다. Asn297 에 부착된 두 개의 복합 이촉각성 올리고사카라이드는 CH2 도메인 사이에 파묻혀서, 폴리펩티드 골격과 광범위한 접촉을 형성하고, 이의 존재는 항체가 항체 의존적 세포의 세포독성 (ADCC) 과 같은 효과기 기능을 매개하는 데 필수적이다 (Lifely, M. R., 등, Glycobiology 5 : 813 - 822 (1995) ; Jefferis, R., 등, Immunol Rev . 163 : 59-76(1998) ; Wright, A. 및 Morrison, S. L., Trends Biotechnol. 15 : 26 - 32 (1997)).
본 발명자들은 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 내에서의, 이등분된(bisected) 올리고사카라이드의 형성을 촉매하는 글리코실트랜스퍼라제인 β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 Ⅲ ("GnTⅢ") 의 과발현이, 엔지니어링된 CHO 세포에 의해 생성된 항-신경모세포종 키메라성 단일클론 항체 (chCE7) 의 시험관 내 ADCC 활성을 현저히 증가시킴을 이미 밝혀낸 바 있다 (Umana, P. 등, Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999); 및 국제공개번호 WO 99/54342 참조, 전체 내용이 본원에 인용 포함됨). chCE7 항체는, 높은 종양 친화성 및 특이성을 갖지만 GnTⅢ 효소가 결핍된 표준 산업적 세포주에서 생성될 경우 임상적으로 유용할 가능성이 극히 미미한 비콘쥬게이션 mAb 의 큰 클래스(large class)에 속한다 (Umana, P., 등, Nature Biotechnol . 17:176-180 (1999)). 상기 연구는, 항체-생성 세포가 GnTⅢ 을 발현하도록 엔지니어링하여, 이것이 이등분된 비푸코실화 (nonfucosylated) 올리고사카라이드를 포함하는, 불변 영역 (Fc) 과 결합된 이등분된 올리고사카라이드의 비율을 천연-발생의 항체에서 발견되는 수준보다 높게 증가시키도록 함으로써 ADCC 활성을 상당히 증가시킬 수 있음을 처음으로 제시하였다.
인간을 포함하는 (그러나 이에 한정되지 않음) 영장류에 있어서 B 세포 림프종의 치료를 위하여 CD20 항원을 표적화하는 강화된 치료적 접근법에 대한 요구가 상존한다.
발명의 개요
쥐과동물 B-Ly1 항체의 결합 특이성을 갖고, Fc 수용체 결합 친화성 및 효과기 기능이 증진되도록 글리코엔지니어링된 항원 결합 분자 (ABM) 의 막대한 치료적 잠재력을 인지하고서, 본 발명자들은 상기 ABM 의 생성 방법을 개발하였다. 특히, 상기 방법은 재조합된 키메라 항체 또는 이의 키메라성 절편의 생성을 포함한다. 이들 ABM 의 효능은, 항체 Fc 영역의 글리코실화 프로파일을 엔지니어링함으로써 더욱 증진된다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다: (a) 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열: SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 6 및 SEQ ID NO.: 7. (CDR VH -1); (b) 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열: SEQ ID NO.: 21, SEQ ID NO.: 22 및 SEQ ID NO.: 23. (CDR VH -2); 및 SEQ ID NO: 24. 또다른 측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO.: 8, SEQ ID NO.: 9 및 SEQ ID NO.: 10. (CDR VL) 을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 한 구현예에서, 임의의 상기 폴리뉴클레오티드는 융합 폴리펩티드를 인코딩한다.
추가적 측면에서, 본 발명은 SEQ ID No.:3 을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 또다른 측면에서, 본 발명은 SEQ ID No.:4 를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 추가의 측면에서, 본 발명은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다: SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 47; SEQ ID NO: 49; SEQ ID NO: 51; SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 67; SEQ ID NO: 69 및 SEQ ID NO: 71. 또다른 측면에서, 본 발명은 SEQ ID No.: 75 를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 융합 폴리펩티드를 인코딩한다.
본 발명은 또한, SEQ ID NO: 3 과 80% 이상의 동일성을 지닌 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이며, 여기서 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 융합 폴리펩티드를 인코딩한다. 추가의 측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 4 와 80% 이상의 동일성을 지닌 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이며, 여기서 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 융합 폴리펩티드를 인코딩한다. 본 발명은 또한, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 80% 이상의 동일성을 지닌 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이며: SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 31; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 47; SEQID No: 49; SEQ ID NO: 51; SEQ ID NO: 53; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 57; SEQ ID NO: 59; SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 63; SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 67; SEQ ID NO: 69 및 SEQ ID NO: 71 (여기서, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 융합 폴리펩티드를 인코딩함). 추가의 측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 75 와 80% 이상의 동일성을 지닌 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이며, 여기서 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 융합 폴리펩티드를 인코딩한다.
또한, 본 발명은 SEQ ID NO: 11 (전체 중쇄) 을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 SEQ ID NO: 11 과 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 의 동일성을 지닌 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한, SEQ ID NO: 12 (전체 경쇄) 를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 SEQ ID NO: 12 와 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 의 동일성을 지닌 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한, SEQ ID No.: 1 의 서열을 갖는 키메라성 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID No.: 1 의 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열; 및 마우스 이외의 종에서 유래된 항체 Fc 영역의 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 이의 절편을 인코딩하는 서열을 포함한다. 본 발명은 또한, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 키메라성 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다: SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 44; SEQID No: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 64; SEQ ID No : 66; SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 70; 및 SEQ ID NO: 72. 한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열 및 마우스 이외의 종에서 유래된 항체 Fc 영역의 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 이의 절편을 인코딩하는 서열을 포함한다: SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 66; SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 70; 및 SEQ ID NO: 72.
또다른 측면에서, 본 발명은 SEQ ID No.: 2 의 서열을 갖는 키메라성 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID No.: 2 의 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열; 및 마우스 이외의 종에서 유래된 항체 Fc 영역의 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 이의 절편을 인코딩하는 서열을 포함한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 SEQ ID No.: 76 의 서열을 갖는 키메라성 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID No.: 76 의 서열을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 서열; 및 마우스 이외의 종에서 유래된 항체 Fc 영역의 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 이의 절편을 인코딩하는 서열을 포함한다.
본 발명은 또한, 쥐과동물 B-Ly1 항체의 VH 영역을 갖는 폴리펩티드, 또는 이의 기능적 변이체를 인코딩하는 서열, 및 마우스 이외의 종에서 유래된 항체 Fc 영역의 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 이의 절편을 인코딩하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 다른 측면에서, 본 발명은 쥐과동물 B-Ly1 항체의 VL 영역을 갖는 폴리펩티드, 또는 이의 기능적 변이체를 인코딩하는 서열, 및 마우스 이외의 종에서 유래된 항체 Fc 영역의 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 이의 절편을 인코딩하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상술된 임의의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 추가의 측면에서, 본 발명은 상술한 임의의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이며 : (a) SEQ ID NO.: 15, SEQ ID NO.: 16 및 SEQ ID NO.: 17. 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열(CDR VH -1); (b) SEQ ID NO.: 25, SEQ ID NO.: 26 및 SEQ ID NO.: 27 로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열(CDR VH -2); 및 SEQ ID NO: 28, 여기서 상기 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드이다. 또다른 측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO.: 18, SEQ ID NO.: 19 및 SEQ ID NO.: 20. (CDR VL) 을 포함하는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이며, 상기 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드이다.
본 발명은 또한, SEQ ID NO.: 1 서열을 포함하는 키메라성 폴리펩티드 또는 이의 변이체에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 SEQ ID NO.: 2 의 서열을 포함하는 키메라성 폴리펩티드 또는 이의 변이체에 관한 것이다. 한 구현예에서, 상기 폴리펩티드 중 임의의 하나는 인간 Fc 영역을 추가로 포함한다. 본 발명은 또한 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 키메라성 폴리펩티드, 또는 이의 변이체에 관한 것이다 : SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 66; SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 70; 및, SEQ ID NO: 72. 본 발명은 또한, SEQ ID NO.: 76 의 서열을 포함하는 키메라성 폴리펩티드 또는 이의 변이체에 관한 것이다. 한 구현예에서, 상기 폴리펩티드 중 임의의 하나는 인간 Fc 영역을 추가로 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 쥐과동물 B-Ly1 항체에서 유래된 서열 및 이종 폴리펩티드로부터 유래된 서열을 포함하는 폴리펩티드 및 그러한 폴리펩티드를 포함하는 항원-결합 분자에 관한 것이다. 한 구현예에서, 상기 항원-결합 분자는 항체이다. 바람직한 구현예에서, 상기 항체는 키메라성이다. 또다른 바람직한 구현예에서, 항체는 인간화 또는 영장류화된다.
추가의 측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 13 을 포함하는 단리된 폴리펩티드 또는 이의 변이체에 관한 것이다. 또다른 측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 14 를 포함하는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 ABM 에 관한 것이고, 이 ABM은 CD20 에의 결합에 대해서 쥐과동물 B-Ly1 항체와 경합할 수 있으며 키메라성이다. 한 구현예에서, ABM 은 항체 또는 그의 절편이다. 추가의 구현예에서, ABM 은 SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 30; SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 46; SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 50; SEQ ID NO: 52; SEQ ID NO: 54; SEQ ID NO: 56; SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 60; SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 64; SEQ ID NO: 66; SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 70; 및 SEQ ID NO: 72 로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VH 영역을 포함하는 재조합 항체이다. 또다른 구현예에서, ABM 은 SEQ ID NO.: 2 및 SEQ ID NO: 76 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 VL 영역을 포함하는 재조합 항체이다. 추가의 구현예에서, ABM 은 영장류화된 재조합 항체이다. 보다 추가의 구현예에서, ABM 은 인간화된 재조합 항체이다. 또다른 구현예에서, ABM 은 인간 Fc 영역을 포함하는 재조합 항체이다. 추가의 구현예에서, 상기 논의된 ABM 중 임의의 것은 독소 또는 방사성표지와 같은 부분에 콘쥬게이션될 수 있다.
본 발명은 또한 ABM 에 관한 것이고, 이 ABM 이 변형 올리고사카라이드(modified oligosaccharide)를 갖는다. 한 구현예에서, 변형 올리고사카라이드는 비-변형 올리고사카라이드에 비해 감소된 푸코실화를 가진다. 다른 구현예에서, 변형 올리고사카라이드는 하이브리드 또는 복합체이다. 추가의 구현예에서, ABM 은 상기 분자의 Fc 영역 내에 증가된 비율의 비푸코실화 올리고사카라이드 또는 이등분된 비푸코실화 올리고사카라이드를 가진다. 한 구현예에서, 이등분된 비푸코실화 올리고사카라이드는 하이브리드이다. 추가의 구현예에서, 이등분된 비푸코실화 올리고사카라이드는 복합체이다. 한 구현예에서, 상기 폴리펩티드의 Fc 영역 내 올리고사카라이드의 20% 이상은 비푸코실화 또는 이등분, 비푸코실화되어 있다. 더욱 바람직한 구현예에서, 올리고사카라이드의 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 또는 75% 이상이 비푸코실화 또는 이등분, 비푸코실화되어 있다.
본 발명은 추가로 상기 논의된 ABM 중 임의의 것을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함한 발현 벡터 및 세포에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 CD20 에의 결합에 대해서 쥐과동물 B-Ly1 항체와 경합할 수 있는 ABM 의 제조 방법에 관한 것으로서, 여기서 상기 ABM 은 키메라성이고; 상기 방법은 하기 단계를 포함한다 : (a) 본 발명의 ABM 을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 가능케 하는 조건 하에, 상기 ABM 을 인코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 배지 중에서 배양하는 단계 ; 및 (b) 생성 배양물로부터 상기 ABM 을 회수하는 단계.
또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 ABM 을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 상기 약학적 조성물은 추가로 약학적으로 허용가능한 담체, 아쥬반트 또는 그의 조합을 포함할 수 있는 것으로 계획된다.
추가의 측면에서, 본 발명은 B-세포 고갈에 의해 치료가능한 질환의 치료 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 본 발명의 ABM 의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상 인간에게 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 질환은 키메라 항체 또는 항체의 키메라 절편인 ABM 을 투여함으로써 치료된다.
보다 또다른 측면에서, 본 발명은, 숙주 세포에 의해 생성된 Fc 영역 내 올리고사카라이드를 변형시키기에 충분한 양으로 GnTⅢ 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 발현하도록 엔지니어링된 숙주 세포에 관한 것으로서, 여기서 ABM 은 CD20 에의 결합에 대해서 쥐과동물 B-Ly1 항체와 경합할 수 있으며 키메라성이다. 한 구현예에서, GnTⅢ 활성을 갖는 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드이다. 또다른 구현예에서, 숙주 세포에 의해 생성되는 ABM 은 항체 또는 항체 절편이다. 추가의 구현예에서, ABM 은 인간 IgG 의 Fc 영역과 동등한 영역을 포함한다.
본 발명은 또한 쥐과동물 B-Ly1 항체의 하나 이상의 상보성 결정 영역, 또는 상기 상보성 결정 영역에 대한 특이성 결정 잔기를 하나 이상 함유하는 그의 변이체 또는 절단된 형태를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로서, 여기서 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 융합 폴리펩티드를 인코딩한다. 바람직하게는, 이러한 단리된 폴리뉴클레오티드는 항원 결합 분자인 융합 폴리펩티드를 인코딩한다. 한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 쥐과동물 B-Ly1 항체의 상보성 결정 영역 3 곳, 또는 상기 3 곳의 상보성 결정 영역 각각에 대한 특이성 결정 잔기를 하나 이상 함유하는 그의 변이체 또는 절단된 형태를 포함한다. 또다른 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 키메라 (예를 들면, 인간화된) 항체의 경쇄 또는 중쇄의 전체 가변 영역을 인코딩한다. 본 발명은 추가로 이러한 폴리뉴클레오티드에 의해 인코팅되는 폴리펩티드에 관한 것이다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 쥐과동물 B-Ly1 항체의 하나 이상의 상보성 결정 영역, 또는 상기 상보성 결정 영역에 대한 하나 이상의 특이성 결정 잔기를 함유하는 그의 변이체 또는 절단된 형태를 포함하고, 이종 폴리펩티드로부터 유래된 서열을 포함하는 항원 결합 분자에 관한 것이다. 한 구현예에서, 항원 결합 분자는 쥐과동물 B-Ly1 항체의 상보성 결정 영역 3 곳, 또는 상기 3 곳의 상보성 결정 영역 각각에 대한 특이성 결정 잔기를 하나 이상 함유하는 그의 변이체 또는 절단된 형태를 포함한다. 또다른 측면에서, 항원 결합 분자는 항체 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역을 포함한다. 특히 유용한 한 구현예에서, 항원 결합 분자는 키메라성, 예를 들면, 인간화된 항체이다. 본 발명은 또한 이러한 항원 결합 분자의 제조 방법, 및 B 세포 림프종을 포함하는 질환의 치료에서의 그의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 유형 Ⅱ 항-CD20 항체를 ADCC 와 같은 효과기 기능을 증가시키면서, 강력한 세포자멸사 능력을 유지하도록 엔지니어링시키는 최초의 공지된 예이다. 따라서, 본 발명은 상기 엔지니어링의 결과로서 증가된 ADCC 를 가지면서 세포자멸사를 유도하는 실질적 능력의 손실은 없는 엔지니어링된 유형 Ⅱ 항-CD20 항체에 관한 것이다. 한 구현예에서, 유형 Ⅱ 항-CD20 항체는 Fc 영역에서 변화된 글리코실화 패턴을 갖도록 엔지니어링된다. 특정한 구현예에서, 변경된 글리코실화에는 Fc 영역에서의 이등분 복합체 잔기의 수준의 증가가 포함된다. 또다른 특정한 구현예에서, 변경된 글리코실화에는 Fc 영역에서의 푸코스 잔기의 수준의 감소가 포함된다. 또다른 구현예에서, 유형 Ⅱ 항-CD20 항체는 폴리펩티드 엔지니어링된다. 본 발명은 추가로 이러한 엔지니어링된 유형 Ⅱ 항체의 제조 방법 및 B 세포 림프종을 포함한 다양한 B 세포 장애의 치료에서 이러한 항체의 사용 방법에 관한 것이다.
본 발명의 숙주 세포는 CHO 세포, BHK 세포, NSO 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 군에서 선택될 수 있다. 한 구현예에서, 본 발명의 숙주 세포는 추가로 쥐과동물 B-Ly1 항체의 VL 영역 또는 그의 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 인간 면역글로불린의 Fc 영역과 동등한 영역을 인코딩하는 서열을 포함하는 유전자도입된(transfected) 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또다른 구현예에서, 본 발명의 숙주 세포는 추가로 쥐과동물 B-Ly1 항체의 VH 영역 또는 그의 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 인간 면역글로불린의 Fc 영역과 동등한 영역을 인코딩하는 서열을 포함하는 유전자도입된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 그의 올리고사카라이드 변형의 결과로서 증가된 Fc 수용체 결합 친화성 및/또는 증가된 효과기 기능을 나타내는 ABM 을 생성하는 숙주 세포에 관한 것이다. 한 구현예에서, 증가된 결합 친화성은 Fc 수용체, 특히, FcγRⅢA 수용체에 대한 것이다. 본원에서 계획된 효과기 기능은 Fc-매개 세포독성의 증가 ; NK 세포로의 결합 증가 ; 대식세포에의 결합 증가 ; 다형핵 세포에의 결합 증가 ; 단핵구에의 결합 증가 ; 직접적 신호전달 유도성 세포자멸사의 증가 ; 수지상 세포 성숙의 증가 ; 및 T 세포 프라이밍의 증가를 포함하지만 이에 제한되지 않는 군에서 선택될 수 있다.
추가의 구현예에서, 본 발명의 숙주 세포는 구조성 프로모터 요소(prmoter element)에 작동가능하게 연결된 GnTⅢ 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 하나 이상 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 숙주 세포에서의 ABM 의 생성 방법에 관한 것이다 : (a) 상기 ABM 의 생성을 가능케 하고 상기 ABM 의 Fc 영역 상에 존재하는 올리고사카라이드의 변형을 가능하게 하는 조건 하에 GnTⅢ 활성을 갖는 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 하나 이상 발현하도록 엔지니어링된 숙주 세포를 배양하는 단계 ; 및 (b) 상기 ABM 을 단리하는 단계로서, 여기서 상기 ABM 은 CD20 에의 결합에 대해서 쥐과동물 B-Ly1 항체와 경합할 수 있으며 키메라성이다. 한 구현예에서, GnTⅢ 활성을 갖는 폴리펩티드는 융합 폴리펩티드이고, 바람직하게는 GnTⅢ 의 촉매 도메인, 및 만노시다제 Ⅱ 의 편재화 도메인, β(1,2)-N-아실글루코사미닐트렌스퍼라제 I ("GnTⅠ") 의 편재화 도메인, 만노시다제 I 의 편재화 도메인, β(1,2)-N-아세틸글루코사미닐트렌스퍼라제 Ⅱ ("GnTⅡ") 의 편재화 도메인, 및 α1-6 코어 푸코실트랜스퍼라제의 편재화 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 이종 골지 (Golgi) 내재 폴리펩티드의 골지 편재화 도메인을 포함한다. 바람직하게는, 골지 편재화 도메인은 만노시다제 Ⅱ 또는 GnTⅠ 로부터의 것이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 숙주 세포에 본 발명의 핵산 또는 발현 벡터를 하나 이상 도입시키는 것을 포함하는, 숙주 세포에 의해 생성되는 항-CD20 ABM 의 글리코실화 프로파일 변형 방법에 관한 것이다. 한 구현예에서, ABM 은 항체 또는 그의 절편이고 ; 바람직하게는 IgG 의 Fc 영역을 포함한 것이다. 대안적으로는, 폴리펩티드는 인간 IgG 의 Fc 영역과 동등한 영역을 포함하는 융합 단백질이다.
한 측면에서, 본 발명은 CD20 에의 결합에 대해서 쥐과동물 B-Ly1 항체와 경합할 수 있으며 감소된 푸코실화를 갖는 재조합 키메라 항체 또는 그의 절편에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 GnTⅢ 활성을 갖고 이종 골지 내재 폴리펩티드의 골지 편재화 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드를 사용하여, 본 발명의 재조합 항체 또는 그의 절편의 글리코실화를 변형시키는 방법에 관한 것이다. 한 구현예에서, 본 발명의 융합 폴리펩티드는 GnTⅢ 의 촉매 도메인을 포함한다. 또다른 구현예에서, 골지 편재화 도메인은 만노시다제 Ⅱ 의 편재화 도메인, GnTⅠ 의 편재화 도메인 , 만노시다제 I 의 편재화 도메인, GnTⅡ 의 편재화 도메인 및 α1-6 코어 푸코실트랜스퍼라제의 편재화 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 골지 편재화 도메인은 만노시다제 Ⅱ 또는 GnTⅠ 로부터의 것이다.
한 구현예에서, 본 발명의 방법은 변형 올리고사카라이드가 있는 재조합 키메라 항체 또는 그의 절편의 제조에 관한 것으로서, 여기서 상기 변형 올리고사카라이드는 비-변형 올리고사카라이드에 비해서 감소된 푸코실화를 가진다. 본 발명에 따르면, 상기 변형 올리고사카라이드는 하이브리드 또는 복합체일 수 있다. 또다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 상기 폴리펩티드의 Fc 영역 내에 증가된 비율의 이등분된 비푸코실화 올리고사카라이드를 갖는 재조합 키메라 항체 또는 그의 절편의 제조에 관한 것이다. 한 구현예에서, 이등분된 비푸코실화 올리고사카라이드는 하이브리드이다. 또다른 구현예에서, 이등분된 비푸코실화 올리고사카라이드는 복합체이다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 방법은 상기 폴리펩티드의 Fc 영역 내 이등분되고 비푸코실화된 올리고사카라이드를 20% 이상 갖는 재조합 키메라 항체 또는 그의 절편의 제조에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 상기 폴리펩티드의 Fc 영역 내 올리고사카라이드의 30% 이상은 이등분되고 비푸코실화되어 있다. 바람직한 또다른 구현예에서, 상기 폴리펩티드의 Fc 영역 내 올리고사카라이드의 35% 이상은 이등분되고 비푸코실화되어 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 그의 올리고사카라이드 변형의 결과로서 증가된 Fc 수용체 결합 친화성 및/또는 증가된 효과기 기능을 나타내는 재조합 키메라 항체 또는 그의 절편에 관한 것이다. 한 구현예에서, 증가된 결합 친화성은 Fc 활성화 수용체에 관한 것이다. 추가의 구현예에서, Fc 수용체는 Fcγ 활성화 수용체, 특히, FcγRⅢA 수용체이다. 본원에서 계획된 효과기 기능은 Fc-매개 세포독성의 증가 ; NK 세포에의 결합 증가 ; 대식세포에의 결합 증가 ; 다형핵 세포에의 결합 증가 ; 단핵구에의 결합 증가 ; 직접적 신호전달 유도성 세포자멸사의 증가 ; 수지상 세포 성숙의 증가 ; 및 T 세포 프라이밍의 증가를 포함하나 이에 제한되지 않는 군으로부터 선택될 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법 중 임의의 것에 의해서 생성된, 쥐과동물 B-Ly1 항체의 결합 특이성을 갖고, Fc 영역을 함유하며, 증가된 효과기 기능을 갖도록 엔지니어링된 재조합 키메라 항체 절편에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 의 서열을 갖는 폴리펩티드 및 면역글로불린의 Fc 영역과 동등한 영역을 포함하고, 본 발명의 방법 중 임의의 것에 의해서 생성된 증가된 효과기 기능을 갖도록 엔지니어링된 융합 단백질에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 2 의 서열을 갖는 폴리펩티드 및 면역글로불린의 Fc 영역과 동등한 영역을 포함하고, 본 발명의 방법 중 임의의 것에 의해서 생성된 증가된 효과기 기능을 갖도록 엔지니어링된 융합 단백질에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법 중 임의의 것에 의해서 생성되는 재조합 키메라 항체, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법 중 임의의 것에 의해서 생성되는 재조합 키메라 항체 절편, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 또다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법 중 임의의 것에 의해서 생성되는 융합 단백질, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 본 발명의 방법 중 임의의 것에 의해서 생성되는 재조합 키메라 항체 또는 그의 절편의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상 인간에게 투여하는 것을 포함하는, B-세포 고갈에 의해 치료가능한 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
도 1. 쥐과동물 B-Ly1 의 VH 영역의 뉴클레오티드 (SEQ ID NO: 3) 및 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 1).
도 2. 쥐과동물 B-Ly1 의 VL 영역의 뉴클레오티드 (SEQ ID NO: 4) 및 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 2).
도 3. Raji B-림프종 세포 상의 CD20 에 대한 Rituximab® (○) 및 ch-B_Ly1 (Δ) 의 결합.
도 4. 하기 3 가지 상이한 부류의 FcγRⅢA-158V/F 유전형의 전혈에서의 Rituximab® (○) 및 ch-B_Ly1 (Δ) 에 의한 B-세포 고갈: (A) 저 친화성 수용체에 대해 동형인 F/F 공여체로부터의 전혈 ; (B) 친화성 수용체에 대해 이형인 F/V 공여체로부터의 전혈 ; 및 (C) 고 친화성 수용체에 대해 동형인 V/V 공여체로부터의 전혈.
도 5. 키메라성 항-CD20 항체의 중쇄의 뉴클레오티드 (SEQ ID NO: 11) 및 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 13).
도 6. 키메라성 항-CD20 항체의 경쇄의 뉴클레오티드 (SEQ ID NO: 12) 및 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 14).
도 7. 쥐과동물 B-Ly1 항체 CDR 의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열. (A) VH 영역에 대한 예상 CDR. (B) VL 영역에 대한 예상 CDR.
도 8. 글리코엔지니어링된 키메라성 B-Ly1 항체의 MALDI-TOF 프로파일. (a) 특정 피크의 백분율을 상술한 표 ; (b) 글리코엔지니어링된 키메라성 B-Ly1 에 대한 스펙트럼 ; (c) Endo-H 로 처리된 글리코엔지니어링된 키메라성 B-Ly1 에 대한 스펙트럼.
도 9. Raji B-세포에 대한 상이한 인간화 항-CD20 항체의 결합. B-HH2 구조체와, B-HL8 및 B-HL11 구조체 사이의 차이는 프레임워크 1 및 2 영역에 위치하며, 3 개의 CDR 은 모두 동일하다. B-HL8 및 B-HL11 은 인간 VH3 클래스로부터 유래된 그의 FR1 및 FR2 서열을 갖는 반면, 완전한 B-HH2 프레임워크는 인간 VH1 으로부터 유래된 것이다. B-HL11 은 단일 돌연변이 Glu1Gln 이 있는 B-HL8 의 유도체로, Gln 은 B-HH2 구조체 내의 아미노산 잔기이다. 이는 Glu1Gln 교환이 결합 친화성 또는 세기를 변화시키지 않음을 의미한다. B-HH2 와 B-HL8 사이의 다른 차이는 14 FR 잔기인데, 이들 중 하나 이상은 상기 항체의 항원 결합 거동에 영향을 줄 것이다.
도 10. Raji 표적 세포 상에서 인간화 항-CD20 항체 BHL4-KV1 의 결합. B-HL4 구조체는 B-HH2 의 FR1 을 인간 생식선 서열 VH1_45 의 것으로 대체함으로써 B-HH2 항체로부터 유도된다. 상기 구조체는 FR1 내 오직 3 개의 위치에서 상이한 아미노산을 가짐에도 불구하고, 크게 감소된 항원 결합 능력을 나타낸다. 이들 잔기는 Kabat 넘버링에 따라 위치 2, 14, 및 30 에 위치한다. 이들 중에서, 위치 30 이 CDR1 의 Chothia 정의의 일부이기 때문에 가장 영향력 있는 위치인 것으로 여겨진다.
도 11. B-HH1, B-HH2, B-HH3, 및 모 항체 B-Ly1 사이의 결합 거동 비교. 데이터는 모든 항체들이 유사한 EC50 값을 나타내지만, B-HH1 구조체는 변이체 B-HH2 및 B-HH3 보다 더 낮은 세기/화학량론으로 결합함을 보여준다. B-HH1 은 그의 부분적 인간 CDR1 및 CDR2 영역 (Kabat 정의), 뿐만 아니라 위치 28 (Kabat 넘버링) 에서의 Ala/Thr 다형에 의해서 B-HH2 및 B-HH3 과 구별될 수 있다. 이는 위치 28, 완전한 CDR1, 및/또는 완전한 CDR2 가 항체/항원 상호작용에 중요함을 나타낸다.
도 12. B-HL1, B-HH1, 및 B-Ly1 모항체의 비교. 데이터는 B-HL1 구조체 내 임의 결합 활성의 부재, 및 B-Ly1 에 비해 약 1/2 인 B-HH1 의 결합 세기/화학량론을 보여주었다. B-HL1 뿐만 아니라 B-HH1 둘 다, 인간 VH1 부류로부터 유래된 수용체 프레임워크를 기준으로 디자인된다. 다른 차이 중에서도, B-HL1 구조체의 위치 71 (Kabat 넘버링) 은 현저한 차이를 나타내는데, 이는 항원 결합에 대한 그의 추정적인 중요성을 나타낸다.
도 13. 항-CD20 항체의 그의 항원에 대한 수용력의 형광세포측정 분석. 데이터는 B-HL2 및 B-HL3 구조체가 CD-20 결합 활성을 나타내지 않음을 보여주었다.
도 14. Z-138 MCL 세포 상에서의 항-CD20 항체의 세포자멸사.
도 15. 항-CD20 항체에 의한 세포자멸사. 분석 세부사항 : 5 × 105 세포/웰을 배양 배지 내 24-웰 플레이트에 접종하였다 (5 × 105 세포/㎖). 각각의 Ab, 음성 대조군을 위한 PBS 또는 양성 대조군으로 5 mM 캄포테신 (Camptothecin, CPT) 의 10 mg 을 웰에 첨가하였다. 샘플을 밤새도록 (16 시간) 인큐베이션시키고, AnnV-FITC 로 염색하고, FACS 로 분석하였다. 분석은 3 중으로 수행하였다. (*): PBS 단독에 대한 신호는 감산되었다 (PBS 단독은 PR-1 및 Z-138 세포 각각에 대해서 8% 및 2% AnnV+ 를 부여하였음). 사용된 항체 : C2B8 (키메라성 비-글리코엔지니어링된 것) ; BHH2-KV1 (인간화 비-글리코엔지니어링된 것). 주의 : 이 분석은 임의의 추가의 효과기 세포가 아니라 단지 표적 + 항체 또는 대조군을 포함한다.
도 16. 면역 효과기 세포와 항-CD20 항체에 의한 표적 세포 살해. 분석 세부사항 : 밤새 인큐베이션시킨 정상 전혈에서의 B-세포 고갈 및 FACS 에 의한 CD19+/CD3+ 분석. 효과기로서 PBMC 를 사용한 ADCC, 4 시간 인큐베이션, 25 : 1 효과기 : 표적 비율, 계면활성제-용해 (100%) 및 Ab 없는 용해 (0%) 와 비교한 칼세인 (Calcein)-체류에 의해 측정된 표적 살해. 사용된 항체 : C2B8 (키메라성 비-글리코엔지니어링된 형태) ; BHH2-KV1-wt (BHH2-KV1 의 인간화 비-글리코엔지니어링된 형태) ; BHH2-KV1-GE (BHH2-KV1 의 인간화 글리코엔지니어링된 형태).
도 17. 비변형 비글리코엔지니어링된 BHH2-KV1 인간화 IgG1 B-Ly1 항-인간 CD20 항체의 PNGaseF-방출 Fc-올리고사카라이드의 MALDI/TOF-MS 프로파일.
도 18. 글리코엔지니어링된 BHH2-KV1g1 인간화 IgG1 B-Ly1 항-인간 CD20 항체의 PNGaseF-방출 Fc-올리고사카라이드의 MALDI/TOF-MS 프로파일. 글리코엔지니어링은 항체 유전자 및 β-1,4-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 Ⅲ (GnT-Ⅲ) 촉매 활성을 가진 효소를 인코딩하는 유전자를 숙주 세포에서 공동-발현하여 수행되었다.
도 19. 글리코엔지니어링된 BHH2-KV1g2 인간화 IgG1 B-Ly1 항-인간 CD20 항체의 PNGaseF-방출 Fc-올리고사카라이드의 MALDI/TOF-MS 프로파일. 글리코엔지니어링은 항체 유전자 및 β-1,4-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 Ⅲ (GnT-Ⅲ) 촉매 활성을 가진 효소를 인코딩하고 골지 α-만노시다제 Ⅱ 촉매 활성을 가진 효소를 인코딩하는 유전자를 숙주 세포에서 공동-발현하여 수행되었다.
도 20. 재조합 CHO-CD16 세포의 표면 상에 나타난 인간 FcgammaRⅢa 수용체에 대한 비-글리코엔지니어링된 항체 및 글리코엔지니어링된 항체의 결합.
도 21. Z-138 MCL 세포 상에서의 비-Fc 엔지니어링된 및 Fc-엔지니어링된 항-CD20 항체의 세포자멸사. 분석 세부사항 : 5 × 105 세포/웰을 배양 배지 내 24-웰 플레이트에 접종하였다 (5 × 105 세포/㎖). 각각의 Ab, 음성 대조군을 위한 PBS 10 mg 을 웰에 첨가하였다. 샘플을 밤새도록 (16 시간) 인큐베이션시키고, AnnV-FITC 로 염색하고, FACS 로 분석하였다. 분석을 3 중으로 수행하였다. 사용된 항체 : C2B8 = 리툭시마브 (시판형과 동일한 키메라성 비-글리코엔지니어링된 형태) ; BHH2-KV1 (인간화 비-글리코엔지니어링된 형태 - 글리코실화 프로파일에 대한 도 6 참조) ; BHH2-KV1g1 (인간화 글리코엔지니어링된 형태 - 글리코실화 프로파일에 대한 도 7 참조) ; BHH2-KV1g2 (인간화 글리코엔지니어링된 형태 - 글리코실화 프로파일에 대한 도 8 참조). 주의 : 이 분석은 임의의 추가의 효과기 세포가 아니라 단지 표적 + 항체 또는 대조군만을 포함한다. (*) : PBS 단독에 대한 신호는 감산되었다.
본원에서 사용되는 용어는 하기와 같이 달리 정의되지 않는 한, 당업계에서 일반적으로 사용되는 바와 같다.
본원에서 사용되는 용어 항체는 용어는 단일클론, 다클론 및 다중특이성 (예를 들면, 이중특이성) 항체를 포함하는 전체의 항체 분자 뿐만 아니라 Fc 영역을 갖고 결합 특이성을 유지하는 항체 절편, 및 면역글로불린의 Fc 영역과 동등한 영역을 포함하고 결합 특이성을 유지하는 융합 단백질을 포함하고자 하는 것이다. 또한 인간화, 영장류화 및 키메라 항체가 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 Fc 영역은 IgG 중쇄의 C-말단 영역을 말한다. IgG 중쇄의 Fc 영역의 경계는 약간 다를 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 보통 위치 Cys226 의 아미노산 잔기부터 카르복실-말단까지 뻗어 있는 것으로 정의된다.
본원에서 사용되는 용어 면역글로불린의 Fc 영역과 동등한 영역은 면역글로불린의 Fc 영역의 천연 발생적 대립유전자적 변이체 뿐만 아니라, 치환, 첨가, 또는 삭제를 생성하는 변화를 갖지만 효과기 기능을 매개하는 면역글로불린의 능력(예컨대 항체 의존성 세포독성)을 실질적으로 감소시키지는 않는 변이체를 포함하고자 하는 것이다. 예를 들면, 하나 이상의 아미노산을 생물학적 기능의 실질적인 손실 없이 면역글로불린의 Fc 영역의 N-말단 또는 C-말단으로부터 삭제할 수 있다. 상기 변이체는 활성에 대해 최소한의 효과를 갖도록 당업계에 공지된 일반 규칙에 따라 선택될 수 있다 (예를 들면, Bowie, J. U. 등, Science 247 : 1306 - 10 (1990) 참조).
본원에서 사용되는 용어 항원 결합 분자는 그 최광의 개념에서 항원 결정소에 특이적으로 결합하는 분자를 가리킨다. 보다 구체적으로, CD20 에 결합하는 항원 결합 분자는 통상 CD20 으로 지칭되는, 인간 B 림프구 한정 분화 항원 Bp35 로서 전형적으로 명시된, 35,000 달톤의 세포 표면 비-글리코실화 인단백질에 특이적으로 결합하는 분자이다. "특이적으로 결합함" 이란 결합이 항원에 대해 선택적이며, 원하지 않거나 비특이적인 상호작용과 구별될 수 있음을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 융합 및 키메라성은, ABM 과 같은 폴리펩티드에 관하여 사용되는 경우, 상이한 종의 항체의 부분 등의 2 개 이상의 이종 폴리펩티드로부터 유래된 아미노산 서열을 포함한 폴리펩티드를 말한다. 키메라 ABM 에 대해서, 예를 들면, 비-항원 결합 성분은 침팬지 및 인간과 같은 영장류를 포함한 매우 다양한 종으로부터 유래될 수 있다. 키메라 ABM 의 불변 영역은 가장 바람직하게는 천연 인간 항체의 불변 영역과 실질적으로 동일하고 ; 키메라 항체의 가변 영역은 가장 바람직하게는 쥐과동물 B-Ly1 가변 영역의 아미노산 서열을 갖는 재조합 항 CD-20 항체의 것과 실질적으로 동일하다. 인간화 항체는 융합 또는 키메라 항체의 특히 바람직한 형태이다.
본원에서 사용되는 용어 " GnT Ⅲ 활성" 을 갖는 폴리펩티드는 N-연결 올리고사카라이드의 트리만노실 코어의 β-연결 만노시드에 β-1-4 연결 내의 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc) 잔기를 첨가하는 것을 촉매할 수 있는 폴리펩티드를 말한다. 이는 특정한 생물학적 분석법으로 측정한 경우, 투여량 의존성이 있거나 또는 없고, Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB) 에 따라 β-1,4-만노실-당단백질 4-베타-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 (EC 2.4.1.144) 로도 알려진, β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 Ⅲ 의 활성과 유사하나, 동일할 필요는 없는 효소 활성을 나타내는 융합 폴리펩티드가 포함된다. 투여량 의존성이 존재하는 경우에는, GnTⅢ 의 것과 동일할 필요는 없으나, 오히려 GnTⅢ 와 비교할 때 주어진 활성에서 투여량 의존성에 실질적으로 유사하다 (즉, 후보 폴리펩티드는 GnTⅢ 에 비해 더 큰 활성 또는 약 25 배 이하 낮고, 바람직하게는 약 10 배 이하 낮은 활성, 및 가장 바람직하게는 약 3 배 이하 낮은 활성을 나타낼 것임).
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 변이체 (또는 유사체) 는, 예를 들어 재조합 DNA 기술을 사용하여 제작된, 아미노산 삽입, 결실, 및 치환에 의해 구체적으로 언급된 본 발명의 폴리펩티드와 상이한 폴리펩티드를 말한다. 본 발명의 ABM 의 변이체에는, 하나 또는 수 개의 아미노산 잔기가 항원 (예컨대, CD20) 결합 친화성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 방식으로 치환, 첨가 및/또는 결실에 의해 변형된 키메라, 영장류화 또는 인간화된 항원 결합 분자가 포함된다. 관심의 대상이 되는 활성을 소멸시키지 않고 어떤 아미노산 잔기를 대체, 첨가 또는 결실시킬 수 있는지의 결정에 대한 지침은, 특정 폴리펩티드의 서열을 상동성 펩티드와 비교하고 높은 상동성의 영역 (보존된 영역) 에서 이루어진 아미노산 서열 변화의 수를 최소화하거나, 또는 아미노산을 공통 서열(consensus sequence)로 대체함으로써 알아낼 수 있다.
이와 달리, 상기 동일하거나 또는 유사한 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 변이체는 유전자 코드에서 "과잉물 (redundancy)" 을 사용함으로써 합성 또는 선택될 수 있다. 다양한 제한 부위를 생성하는 고요한 변화(silent changes)와 같은 다양한 코돈 치환을, 특정 원핵 또는 진핵 시스템에서의 발현 또는 플라스미드 또는 바이러스 벡터 내로의 클로닝을 최적화하기 위해 도입할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열의 변이는 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드에 첨가된 다른 펩티드의 도메인에 반영되어 폴리펩티드의 임의의 부분의 특성을 변형시켜, 리간드 결합 친화성, 사슬간 친화성, 또는 분해/대사회선 속도(degradation/turnover rate)와 같은 특징을 변화시킬 수 있다.
바람직하게는, 아미노산 "치환" 은 하나의 아미노산을, 유사한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 또다른 아미노산으로 대체하는 것, 즉, 보존적 아미노산 대체의 결과이다. "보존적" 아미노산 치환은 관련된 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성, 및/또는 양친매성 성질의 유사성에 기초하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 비극성 (소수성) 아미노산에는 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 및 메티오닌이 포함되고; 극성 중성 아미노산에는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민이 포함되고; 양전하를 띤 (염기성) 아미노산에는 아르기닌, 리신, 및 히스티딘이 포함되고; 음전하를 띤 (산성) 아미노산에는 아스파르트산 및 글루탐산이 포함된다. "삽입" 또는 "결실" 은 바람직하게는 약 1 내지 20 개의 아미노산의 범위, 더욱 바람직하게는 1 내지 10 개의 아미노산의 범위이다. 허용된 변이는, 재조합 DNA 기술을 사용하여 폴리펩티드 분자 내에서 아미노산의 삽입, 결실, 또는 치환을 시스템적으로 형성하고, 생성된 재조합 변이체의 활성에 대해 측정함으로써 실험적으로 결정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인간화된" 은 모 (parent) 분자의 항원-결합 특성을 보유하거나 또는 실질적으로 보유하지만 인간에서는 덜 면역원성인, 비인간 항원-결합 분자 유래의 항원-결합 분자, 예를 들어, 쥐과동물의 항체를 말한다. 이는 (a) 전체 비-인간 가변 도메인을 인간 불변 영역에 이식하여 키메라 항체를 발생시키는 것, (b) 중요한 프레임워크(framework) 잔기 (예를 들어, 양호한 항원 결합 친화성 또는 항체 기능을 보유하는 데 있어서 중요한 것) 를 갖거나 갖지 않는 인간 프레임워크 또는 불변 영역에 비-인간 CDR 만을 이식하는 것, 또는 (c) 전체 비-인간 가변 도메인을 이식하지만, 표면 잔기의 대체에 의해 인간과 유사한 분획으로 그것들을 "클로킹" 하는 것을 포함하여, 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 상기 방법은 문헌 [Jones 등, Morrison 등, Proc . Natl . Acad. Sci ., 81: 6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv . Immunol ., 44: 65-92(1988) ; Verhoeyen 등, Science, 239: 1534-1536 (1988); Padlan, Molec . Immun., 28: 489-498 (1991); Padlan, Molec . Immun ., 31 (3): 169-217 (1994)] 에 개시되어 있으며, 상기 문헌들은 그 전체 개시내용이 모두 본원에 참조로써 삽입된다. 일반적으로, 항체의 각각의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인에는 3 개의 상보성 결정 영역, 즉 CDR(CDR1, CDR2 및 CDR3)이 있으며, 이들은 항체의 각각의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인에서 4 개의 프레임워크 하위영역 (즉, FR1, FR2, FR3, 및 FR4) 과 인접되어 있다:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. 인간화된 항체에 대한 논의는 특히, U.S. 특허 No. 6,632,927 및 공개된 미국 출원 No. 2003/0175269 에서 확인할 수 있으며, 이들은 둘 다 그 전체 개시내용이 본원에 참조로서 삽입된다.
유사하게는, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "영장류화된" 은 모 분자의 항원-결합 특성을 보유하거나 또는 실질적으로 보유하지만 영장류에서는 덜 면역원성인 비-영장류 항원-결합 분자, 예를 들어, 쥐과동물 항체 유래의 항원 결합 분자를 일컫기 위해 사용된다.
당 기술분야에서 사용되고/되거나 또는 허용되는 한 용어의 2 개 이상의 정의가 존재할 경우, 본원에서 사용된 바와 같은 용어의 정의는 명백히 상반되게 기술되지 않는 한 그러한 의미를 모두 포함하는 것으로 의도된다. 구체적인 예는, 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 2 가지 모두의 가변 영역 내에서 발견되는 불연속 (non-contiguous) 항원 조합 부위를 기술하기 위한 용어 "상보성 결정 영역" ("CDR") 을 사용하는 것이다. 상기 특정 영역은 본원에 참조로써 삽입된 문헌 [Kabat 등, U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983), 및 Chothia 등, J. Mol . Biol . 196: 901-917 (1987)] 에 기술되어 있으며, 여기서 상기 정의는 서로 비교될 경우 아미노산 잔기의 중복 또는 서브셋 (subset) 을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 이의 변이체의 CDR 을 칭하기 위하여 상기 정의 중 어느 하나를 적용하는 것은 본원에서 정의되고 사용된 바와 같은 용어의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다. 상기 인용된 각각의 참조문헌에 의해 정의된 바와 같은 CDR 을 포함하는 적절한 아미노산 잔기는 하기 표 1 에 비교로서 나타나 있다. 특정 CDR 을 포함하는 정확한 잔기 번호는 CDR 의 서열 및 크기에 따라 다양할 것이다. 당업자는, 항체의 가변 영역 아미노산 서열을 부여받는다면, 어떤 잔기가 특정 CDR 을 포함하는지를 통상적으로 결정할 수 있다.
CDR 정의1
Kabat Chothia AbM
VH CDR1 31 - 35 26 - 32 26 - 35
VH CDR2 50 - 65 52 - 58 50 - 58
VH CDR3 95 - 102 95 - 102 95 - 102
VL CDR1 24 - 34 26 - 32
VL CDR2 50 - 56 50 - 52
VL CDR3 89 - 97 91 - 96
1표 1 의 모든 CDR 정의의 넘버링은 앞서의 Kabat 등에 의한 넘버링 컨벤션에 따른 것임 (하기 참조).
Kabat 등은 또한 임의의 항체에 적용가능한 가변 도메인 서열에 대한 넘버링 시스템 (numbering system) 을 정의하였다. 당업자는, 서열 그 자체를 벗어나는 임의의 실험적 데이터에 의존하지 않고, 상기 체계의 "Kabat 넘버링 (Kabat numbering)" 을 임의의 가변 도메인 서열에 명확히 지정할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "Kabat 넘버링" 은 문헌 [Kabat 등, U. S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)] 에 기술된 넘버링 시스템을 말한다. 달리 기술되지 않는 한, ABM 내의 특정 아미노산 잔기 위치의 넘버링에 대한 참조는 Kabat 넘버링 시스템에 따른다. 서열 목록의 서열 (즉, SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:78) 은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 넘버링되지 않는다.
본 발명의 참조 뉴클레오티드 서열과 예를 들어, 95% 이상 "동일한" 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는, 폴리뉴클레오티드 서열이 참조 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 각 100 개 당 5 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 것을 제외하고는, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 참조 서열과 동일함을 의미한다. 즉, 참조 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위해서는, 참조 서열 내의 5% 이하의 뉴클레오티드를 결실시키거나 또는 또다른 뉴클레오티드로 치환할 수 있거나, 또는 참조 서열 내의 총 뉴클레오티드의 5% 이하의 수의 뉴클레오티드를 참조 서열 내로 삽입시킬 수 있다. 쿼리 서열 (query sequence) 은 도 24 또는 도 25 에 나타낸 전체 서열이 될 수 있다.
실제적인 문제로서, 임의의 특정 핵산 분자 또는 폴리펩티드가 본 발명의 뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한가의 여부는 공지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 통상적으로 결정될 수 있다. 통합적인 서열 정렬(global sequence alignment)이라고도 하는, 쿼리 서열 (본 발명의 서열) 및 대상 서열 (subject sequence) 간의 최적의 전체적인 일치를 결정하는 바람직한 방법은 문헌 [Brutlag 등, Comp . App . Biosci . 6:237-245 (1990)] 의 알고리즘에 기초한 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다. 서열 정렬에서, 쿼리 서열 및 대상 서열은 둘 다 DNA 서열이다. U 를 T 로 전환함으로써 RNA 서열을 비교할 수 있다. 상기 통합적인 서열 정렬의 결과는 % 동일성으로 나타낸다. % 동일성을 계산하기 위해 DNA 서열의 FASTDB 정렬에 사용되는 바람직한 척도는 : 매트릭스 (Matrix) = 일원 (Unitary), k - 터플 (tuple) = 4, 미스매치 페널티 (Mismatch Penalty) = 1, 조이닝 페널티 (Joining Penalty) = 30, 랜덤화 군 길이 (Randomization Group Length) = 0, 컷오프 (Cutoff) 스코어 = 1, 갭 페널티 (Gap Penalty) = 5, 갭 크기 페널티 (Gap Size Penalty) = 0.05, 윈도우 크기 (Window Size) = 500 또는 더 짧은 쪽의 대상 뉴클레오티드 서열의 길이이다.
내부적인 결실이 아닌 5' 또는 3' 결실로 인해 대상 서열이 쿼리 서열보다 더 짧을 경우, 결과를 수동적으로 보정해야 한다. 이는, FASTDB 프로그램이 % 동일성을 계산할 때 대상 서열의 5' 및 3' 절단을 계산하지 않기 때문이다. 쿼리 서열과 비교해, 5' 또는 3' 말단에서 절단된 대상 서열에 대해, % 동일성은 쿼리 서열의 총 염기의 퍼센트로서 매치/정렬되지 않은 대상 서열의 5' 및 3' 인 쿼리 서열의 염기의 수를 계산함으로써 보정된다. 뉴클레오티드가 매치/정렬되었는지를 FASTDB 서열 정렬의 결과에 의해 결정한다. 다음, 상기 % 를 구체화된 척도를 사용하는 상기 FASTDB 프로그램에 의해 계산된, % 동일성으로부터 감산하여, 최종 % 동일성 스코어를 수득한다. 상기 보정된 스코어는 본 발명의 목적에 사용되는 것이다. FASTDB 정렬에 의해 나타내어진 바와 같이, 쿼리 서열과 매치/정렬되지 않는, 대상 서열의 5' 및 3' 염기의 외부에 있는 염기만이 % 동일성 스코어를 수동적으로 조정하기 위해 계산된다.
예를 들어, 90 개의 염기 대상 서열은 % 동일성을 결정하기 위해 100 개의 염기 쿼리 서열에 정렬된다. 결실이 대상 서열의 5' 말단에서 일어나고, 따라서 FASTDB 정렬이 5' 말단에 있는 처음의 10 개의 염기의 매치된/정렬을 나타내지 않는다. 10 개의 짝지어지지 않은 염기는 상기 서열의 10% (매치되지 않은 5' 및 3' 말단에 있는 염기의 수/쿼리 서열에 있는 염기의 총 수) 를 나타내고, 10% 는 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 % 동일성 스코어로부터 감산된다. 남아 있는 90 개의 염기가 완전히 매치된다면, 최종 % 동일성은 90% 일 것이다. 또다른 예에서, 90 개의 염기 대상 서열은 100 개의 염기 쿼리 서열과 비교된다. 이 경우, 결실이 내부 결실이라서, 쿼리와 매치/정렬되지 않는 대상 서열의 5' 또는 3' 상에 염기가 없다. 이 경우, FASTDB 에 의해 계산된 % 동일성이 수동적으로 보정되지 않는다. 다시 한 번, 쿼리 서열과 매치/정렬되지 않은 대상 서열의 염기 5' 및 3' 만이 수동적으로 보정된다. 기타 수동적인 보정은 본 발명의 목적을 위해 행해지지 않는다.
예를 들어, 본 발명의 쿼리 아미노산 서열에 95% 이상 "동일한" 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 의해, 대상 폴리펩티드 서열이 쿼리 아미노산 서열의 각 100 개의 아미노산 당 5 개 이하의 아미노산 변경을 포함할 수 있다는 것을 제외하고는, 대상 폴리펩티드의 아미노산 서열은 쿼리 서열과 동일하다. 즉, 쿼리 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 수득하기 위해, 대상 서열에 있는 아미노산 잔기의 5% 이하가 삽입, 결실, 또는 또다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 참조 서열의 상기 변경은, 참조 아미노산 서열의 아미노 또는 카르복시 말단 위치에서 또는 개별적으로 참조 서열 내의 하나 이상의 연속적인 군 또는 참조 서열에 있는 잔기 사이에 산재하여, 상기 말단 위치 사이의 어느 곳에서나 발생할 수 있다.
실용적인 방식으로서, 임의의 특정 폴리펩티드가 참조 폴리펩티드와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한지는, 공지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 통상적으로 결정할 수 있다. 통합 서열 정렬 (global sequence alignment) 이라고도 하는, 쿼리 서열 (본 발명의 서열) 및 대상 서열 사이의 최선의 전체적인 매치를 결정하는 바람직한 방법은 [Brutlag 등, Comp . App . Biosci . 6 : 237-245 (1990)] 의 알고리즘을 바탕으로 한 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정할 수 있다. 서열 정렬에서, 쿼리 및 대상 서열은 둘 다 뉴클레오티드 서열이거나 또는 둘 다 아미노산 서열이다. 상기 통합 서열 정렬의 결과는 % 동일성으로 나타낸다. FASTDB 아미노산 정렬에서 사용되는 바람직한 척도는 : 매트릭스 = PAM 0, k - 터플 = 2, 미스매치 페널티 = 1, 조이닝 페널티 = 20, 랜덤화 군 길이 = 0, 컷오프 스코어 = 1, 윈도우 크기 = 서열 길이, 갭 페널티 = 5, 갭 크기 페널티 = 0.05, 윈도우 크기 = 500 또는 어느 쪽이던지 더 짧은, 대상 아미노산 서열의 길이이다.
내부 결실 때문이 아니라 N- 또는 C-말단 결실로 인해, 대상 서열이 쿼리 서열보다 더 짧다면, 결과를 수동적으로 보정해야 한다. 이는 FASTDB 프로그램이 통합 % 동일성을 계산하는 경우, 대상 서열의 N- 및 C-말단 절단을 계산하지 않기 때문이다. 쿼리 서열과 비교해, N- 및 C-말단에서 잘린 대상 서열에 대해, 상응하는 대상 잔기와 매치/정렬되지 않는, 대상 서열의 N- 및 C-말단인 쿼리 서열의 잔기의 수를 쿼리 서열의 총 염기의 % 로서 계산함으로써 % 동일성을 보정한다. 잔기가 매치/정렬되는지를 FASTDB 서열 정렬의 결과에 의해 결정한다. 다음, 상기 % 를 구체화된 척도를 사용하여 상기 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 % 동일성으로부터 감산하여, 최종 % 동일성 스코어를 수득한다. 상기 최종 % 동일성 스코어는 본 발명의 목적에 사용되는 것이다. 쿼리 서열에 매치/정렬되지 않는, 대상 서열의 N- 및 C-말단에 대한 잔기만이 % 동일성 스코어를 수동적으로 조정하기 위해 고려된다. 즉, 단지 쿼리 잔기만이 대상 서열의 가장 먼 N- 및 C-말단 잔기 외부에 위치한다.
예를 들어, 90 개의 아미노산 잔기 대상 서열은 100 개의 잔기 쿼리 서열과 정렬되어, % 동일성을 결정한다. 대상 서열의 N-말단에서 결실이 발생하고, 따라서, FASTDB 정렬은 N-말단에서 처음의 10 개의 잔기의 매치/정렬을 나타내지 않는다. 10 개의 짝지어지지 않은 염기는 상기 서열의 10% (매치되지 않은 N- 및 C- 말단에 있는 잔기의 수/쿼리 서열에 있는 잔기의 총 수) 를 나타내고, 10% 는 FASTDB 프로그램에 의해 계산된 % 동일성 스코어로부터 감산된다. 남아 있는 90 개의 잔기가 완전히 매치된다면, 최종 % 동일성은 90% 일 것이다. 또다른 예에서, 90 개의 잔기 대상 서열은 100 개의 잔기 쿼리 서열과 비교된다. 이 경우, 결실이 내부 결실이라서, 쿼리와 매치/정렬되지 않는 대상 서열의 N- 또는 C- 말단에 잔기가 없다. 이 경우, FASTDB 에 의해 계산된 % 동일성은 수동적으로 보정된다. 다시 한 번, FASTDB 정렬에서 나타낸 바와 같이, 쿼리 서열과 매치/정렬되지 않은 대상 서열의 염기 N- 및 C- 말단 외부의 잔기 위치만이 수동적으로 보정된다. 기타 수동적인 보정은 본 발명의 목적을 위해 행해지지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 본 발명의 핵산 서열에 "엄격한 조건 하에 혼성화하는" 핵산은, 50% 포름아미드, 5 × SSC (750 mM NaCl, 75 mM 나트륨 시트레이트), 50 mM 나트륨 포스페이트 (pH 7.6), 5 × Denhardt's 용액, 10% 덱스트란 술페이트, 및 20 ㎍/㎖ 변성, 잘려진 연어 정자 DNA 를 포함하는 용액 중에서 42℃ 에서 밤새 인큐베이션시켜 혼성화하고, 이어서 약 65℃ 에서 O.1 × SSC 중에서 필터를 세척하는 폴리뉴클레오티드를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "골지 편재화 도메인" 은 골지 복합체 내에 폴리펩티드가 위치하도록 고정하는 역할을 하는 골지 내재 폴리펩티드의 아미노산 서열을 말한다. 일반적으로, 편재화 도메인은 효소의 아미노 말단 "꼬리" 를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "효과기 기능"은 항체의 Fc 영역 (고유 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역) 에 기여가능한 생물학적 활성을 말한다. 항체 효과기 기능의 예는 Fc 수용체 결합 친화성, 항체-의존성 세포의 세포독성 (ADCC), 항체-의존성 세포의 식균작용 (ADCP), 사이토카인 분비, 항원-제시 세포에 의한 면역-복합체-매개 항원 흡수, 세포 표면 수용체의 하위-조절 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "엔지니어, 엔지니어링된 , 엔지니어링하는 및 글리코실화 엔지니어링"은 자연 발생 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드 또는 그의 절편의 글리코실화 패턴의 임의의 조작 (manipulation) 을 포함하는 것으로 여겨진다. 글리코실화 엔지니어링은 세포 내에서 발현되는 당단백질의 변경된 글리코실화를 달성하기 위한 올리고사카라이드 합성 경로의 유전적 조작을 포함하여, 세포의 글리코실화 기구의 대사적 엔지니어링을 포함한다. 더욱이, 글리코실화 엔지니어링은 글리코실화에 대한 돌연변이 및 세포 환경의 효과를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 폴리펩티드 및 항원-결합 분자를 발생하도록 엔지니어링될 수 있는 임의의 종류의 세포 시스템을 포함한다. 한 구현예에서, 숙주 세포는 엔지니어링되어서, 변형된 단백당형을 가진 항원 결합 분자를 생성할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 항원 결합 분자는 항체, 항체 절편, 또는 융합 단백질이다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 추가로 조작되어서, GnTⅢ 활성을 가진 하나 이상의 폴리펩티드를 증가된 수준으로 발현한다. 숙주 세포는 배양된 세포, 단지 일부를 들자면, 예를 들어, CHO 세포, BHK 세포, NSO 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포와 같은 배양된 포유류 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 및 식물 세포뿐만 아니라, 유전자 도입된 동물, 유전자 도입된 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "Fc -매개 세포의 세포독성"은 인간 Fc-영역을 함유하는 용해성 Fc-융합 단백질에 의해 매개되는 세포의 세포독성 및 항체-의존성 세포의 세포독성을 포함한다. 상기는 "인간 면역 효과기 세포" 에 의한 "항체-표적화된 세포" 의 용해(lysis)를 유도하는 면역 기작으로, 여기서 :
인간 면역 효과기 세포는, 그것들이 항체 또는 Fc-융합 단백질의 Fc-영역에 결합하는 것을 통해 그의 표면 상에 Fc 수용체를 제시하고, 효과기 기능을 수행하는 백혈구 집단이다. 상기 집단은 말초혈액 단핵구 세포 (PBMC) 및/또는 자연 살해 (NK) 세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
항체- 표적화된 세포는 항체 또는 Fc-융합 단백질에 의해 결합된 세포이다. 항체 또는 Fc 융합 단백질은 Fc 영역으로의 N-말단인 단백질 부분을 통해 표적 세포에 결합한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "증가된 Fc -매개 세포의 세포독성"은, 상기 정의된 Fc-매개 세포의 세포독성의 기작에 의해 표적 세포를 둘러싼 배지 내에서, 주어진 항체 또는 Fc-융합 단백질의 농도에서, 주어진 시간 내에 용해된 "항체-표적화된 세포" 수의 증가, 및/또는 Fc-매개 세포의 세포독성의 기작에 의해 주어진 시간 내에 주어진 수의 "항체-표적화된 세포" 를 용해하는데 필요한, 표적 세포를 둘러싼 배지 내의 항체 또는 Fc-융합 단백질의 농도의 감소로서 정의된다. Fc-매개 세포의 세포독성의 증가는, 당업자에게 공지된 동일한 표준 생성, 정제, 제형 및 저장 방법을 사용하여, 동일한 유형의 숙주 세포에 의해 생성되나, 본원에서 기술된 방법에 의해 글리코트랜스퍼라제 GnTⅢ 을 발현하도록 엔지니어링된 숙주 세포에 의해서는 생성되지 않는 동일한 항체, 또는 Fc-융합 단백질에 의해 매개되는 세포의 세포독성과 비교한 것이다.
"증가된 항체 의존성 세포의 세포독성 ( ADCC ) 을 가진 항체"는 본원에서 정의된 용어로서, 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 결정된 바와 같은 증가된 ADCC 를 가진 항체를 의미한다. 한 수용된 시험관내 ADCC 어세이는 하기와 같다 :
1) 상기 어세이는 항체의 항원-결합 영역에 의해 인지되는 표적 항원을 발현하는 것으로 알려진 표적 세포를 사용함 ;
2) 상기 어세이는 효과기 세포로서 랜덤하게 선택된 건강한 공여자의 혈액으로부터 단리된 인간 말초혈액 단핵구 세포 (PBMC) 를 사용함 ;
3) 상기 어세이는 하기 프로토콜에 따라 수행됨 :
i) PBMC 를 표준 밀도 원심분리 과정을 사용하여 단리하고, RPMI 세포 배양 배지 중에 5 × 106 세포/㎖ 로 현탁함 ;
ⅱ) 표적 세포를 표준 조직 배양 방법에 의해 키우고, 90% 초과의 생존율을 가진 지수 성장기에서 수확하고, RPMI 세포 배양 배지에서 세척하고, 51Cr 100 마이크로-큐리로 표지하고, 세포 배양 배지로 2 회 세척하고, 105 세포/㎖ 의 밀도로 세포 배양 배지에 재현탁시킴 ;
ⅲ) 상기 최종 표적 세포 현탁액 100 ㎕ 를 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 옮김 ;
ⅳ) 항체를 세포 배양 배지 중에 4000 ng/㎖ 에서 0.04 ng/㎖ 로 단계-희석시키고, 생성 항체 용액 50 ㎕ 를 96-웰 마이크로타이터 플레이트 내의 표적 세포에 첨가하여, 상기 전체 농도 범위를 포함하여 3 중의 다양한 항체 농도에서 테스트함 ;
ⅴ) 최대 방출 (MR) 대조군용으로, 표지된 표적 세포를 함유하는 플레이트 중의 3 개의 추가 웰에 항체 용액 (상기 포인트 ⅳ) 대신에 비-이온성 계면활성제 (Nonidet, Sigma, St. Louis) 의 2% (V/V) 수용액 50 ㎕ 를 넣음 ;
ⅵ) 자발성 방출 (SR) 대조군용으로, 표지된 표적 세포를 함유하는 플레이트 중의 3 개의 추가 웰에, 항체 용액 (상기 포인트 ⅳ) 대신에 RPMI 세포 배양 배지 50 ㎕ 를 넣음 ;
ⅶ) 다음, 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 50 × g 에서 1 분 동안 원심분리하고, 4℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션시킴 ;
ⅷ) PBMC 현탁액 (상기 포인트 i) 50 ㎕ 를 효과기 : 표적 세포 비율이 25 : 1 이 되도록 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 5% C02 분위기 하 37℃ 인큐베이터 내에서 4 시간 동안 놔둠 ;
ⅸ) 각 웰로부터 세포-없는 상청액을 수확하고, 실험적으로 방출된 방사성 (ER) 을 감마 계수기를 사용하여 정량화함 ;
ⅹ) 특정 용해의 % 를 공식 (ER-MR)/(MR-SR) × 100 (여기서, ER 은 상기 항체 농도에 대해 정량화된 평균 방사성 (상기 포인트 ⅸ 참조) 이고, MR 은 MR 대조군 (상기 포인트 ⅴ 참조) 에 대해 정량화된 평균 방사성 (상기 포인트 ⅸ 참조) 이고, SR 은 SR 대조군 (상기 포인트 ⅵ 참조) 에 대해 정량화된 평균 방사성 (상기 포인트 ⅸ 참조) 임) 에 따라 각 항체 농도에 대해 계산함 ;
4) "증가된 ADCC" 는 상기 테스트된 항체 농도 범위 내에서 관찰된 특정 용해의 최대 % 의 증가, 및/또는 상기 테스트된 항체 농도 범위 내에서 관찰된 특정 용해의 최대 % 의 반을 달성하는데 필요한 항체 농도의 감소로서 정의된다. ADCC 의 증가는 상기 어세이로 측정되고, 당업자에게 공지된 동일한 표준 생성, 정제, 제형 및 저장 방법을 사용하여 동일한 유형의 숙주 세포에 의해 생성되나, GnTⅢ 을 과발현하도록 엔지니어링된 숙주 세포에 의해서는 생성되지 않는 동일한 항체에 의해 매개되는 ADCC 와 비교된다.
한 측면에서, 본 발명은 쥐과동물 B-Ly1 항체의 결합 특이성을 가진 항원 결합 분자에 관한 것이고, 그의 효과기 기능이 변경된 글리코실화에 의해 증가될 수 있다는 발견에 관한 것이다. 한 구현예에서, 항원 결합 분자는 키메라 항체이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 도 7 에 나타낸 CDR 을 포함하는, 키메라 항체, 또는 그의 절편에 관한 것이다. 구체적으로는, 바람직한 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다 :
(a) 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 (CDR VH -1):
SEQ ID NO.:5, SEQ ID NO.:6 및 SEQ ID NO.:7. ; 및
(b) 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 (CDR VH -2):
SEQ ID NO.:21, SEQ ID NO.:22 및 SEQ ID NO.:23. ; 및 SEQ ID NO: 24. 또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO.:8, SEQ ID NO.:9 및 SEQ ID NO.:10. 을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드(CDR VL)에 관한 것이다. 한 구현예에서, 임의의 상기 폴리뉴클레오티드는 융합 폴리펩티드를 인코딩한다.
또다른 구현예에서, 항원 결합 분자는 도 1 에서 나타낸 쥐과동물 B-Ly1 항체의 VH 도메인, 또는 그의 변이체 ; 및 비-쥐과동물 폴리펩티드를 포함한다. 또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 도 2 에서 나타낸 쥐과동물 B-Ly1 항체의 VL 도메인, 또는 그의 변이체 ; 및 비-쥐과동물 폴리펩티드를 포함하는 항원 결합 분자에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 BLy-1 의 하나 이상의 절단된 CDR 을 포함하는 항원 결합 분자에 관한 것이다. 상기 절단된 CDR 은 최소한 소정의 CDR 에 대한 특이성-결정 아미노산 잔기를 함유할 것이다. "특이성-결정 잔기" 는 항원과의 상호작용에 직접 관여하는 잔기를 의미한다. 일반적으로, 소정의 CDR 내의 잔기 중 단지 약 1/5 내지 1/3 만이 항원에의 결합에 참여한다. 특정 CDR 내의 특이성-결정 잔기는, 예를 들어, 그 전체가 참조로써 본원에 삽입된 내용인, [Padlan 등, FASEB J. 9 (1) : 133 - 139 (1995)] 에서 기술된 방법에 따라 소정의 잔기 위치에서의 서열 변이성의 결정 및 3-차원 모델링으로부터 내부원자 접촉의 컴퓨터화에 의해 규정될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 쥐과동물 B-Ly1 항체의 하나 이상의 상보성 결정 영역을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 상보성 결정 영역에 대한 하나 이상의 특이성 결정 영역을 함유하는 그의 변이체 또는 절단 형태에 관한 것으로, 여기서 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 융합 폴리펩티드를 인코딩한다. 바람직하게는, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 항원 결합 분자인 융합 폴리펩티드를 인코딩한다. 한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 쥐과동물 B-Ly1 항체의 3 개의 상보성 결정 영역, 또는 상기 3 개의 상보성 결정 영역 각각에 대한 하나 이상의 특이성-결정 잔기를 함유하는 그의 변이체 또는 절단된 형태를 포함한다. 또다른 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 키메라 (예를 들어, 인간화된) 항체의 경쇄 또는 중쇄의 전체 가변 영역을 인코딩한다. 본 발명은 추가로 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드에 관한 것이다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 쥐과동물 B-Ly1 항체의 하나 이상의 상보성 결정 영역, 또는 상기 상보성 결정 영역에 대한 하나 이상의 특이성-결정 잔기를 함유하는 변이체 또는 절단된 형태를 포함하고, 이종 폴리펩티드로부터 유래하는 서열을 포함하는 분자 조합 항원에 관한 것이다. 한 구현예에서, 상기 항원 결합 분자는 쥐과동물 B-Ly1 항체의 3 개의 상보성 결정 영역, 또는 상기 3 개의 상보성 결정 영역 각각에 대한 하나 이상의 특이성 결정 잔기를 함유하는 그의 변이체 또는 절단된 형태를 포함한다. 또다른 측면에서, 상기 항원 결합 분자는 항체 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역을 포함한다. 한 특별히 유용한 구현예에서, 항원 결합 분자는 키메라성, 예를 들어 인간화된 항체이다. 본 발명은 또한 상기 항원 결합 분자의 생성 방법, 및 B 세포 림프종을 포함하는 질환의 치료에서의 그의 용도에 관한 것이다.
항체 의존성 세포의 세포독성 (ADCC), 보체-의존성 세포독성 (CDC) 및 성장 정지 또는 세포자멸사의 유도를 포함하는, 항-CD20 항체의 치료 효능과 관련된 몇 가지 기작이 공지되어 있다. 예를 들어, 대다수의 실험적 증거는 리툭시마브가 CDC 및 ADCC 어세이에 의해 측정되는 통상적인 효과기 기작을 통해 작용한다는 것을 나타낸다. 유사하게는, 생체 내에서 리툭시마브에 대한 다른 림프종 세포의 내성은 시험관 내에서 CDC 에 대한 그의 민감성의 함수라고 알려져 있다. 대조적으로는, 치료 용도에 관해 공인된 또다른 항체의 생체내 작용의 형태인 B1 은 보체 또는 자연 살해 (NK) 세포 활성의 어느 것도 필요로 하지 않는다. 오히려, 생체내 B1 의 효능은 강력한 세포자멸사를 유도하는 그의 능력으로 인한 것이다.
일반적으로, 항-CD20 단일클론 항체는 림프종 세포 박멸에 대한 그의 작용 기작을 근거로 2 가지 상이한 범주로 분류된다. 유형 I 항-CD20 항체는 표적 세포를 죽이기 위해 주로 보체를 사용하며, 반면 유형 Ⅱ 항체는 상이한 기작, 주로 세포자멸사에 의해 작동한다. 리툭시마브 및 1F5 는 유형 I 항-CD20 항체의 예이며, 반면 B1 은 유형 Ⅱ 항체의 예이다. 전체 내용이 본원에 참고문헌으로 삽입된, 예를 들어, [Cragg, M.S. 및 Glennie, M.J., Blood 103(7): 2738-2743 (April 2004); Teeling, J.L. 등, Blood 104(6): 1793-1800 (September 2004)] 참조.
본 발명은, 강력한 세포자멸사 능력을 보유하면서도, ADCC 와 같은 효과기 기능을 증가시키도록 유형 Ⅱ 항-CD20 항체를 엔지니어링시킨 최초의 공지된 경우이다. 따라서, 본 발명은 세포자멸사를 유도하는 실질적인 능력의 손실 없이도 상기 엔지니어링의 결과로서 ADCC 가 증가된 엔지니어링된 유형 Ⅱ 항-CD20 항체에 관한 것이다. 한 구현예에서, 유형 Ⅱ 항-CD20 항체는 Fc 영역 내에 변경된 패턴의 글리코실화를 갖도록 엔지니어링되었다. 특별한 구현예에서, 변경된 글리코실화는 Fc 영역 내에 증가된 수준의 이분된 복합체 잔기를 포함한다. 또다른 특별한 구현예에서, 변경된 글리코실화는 Fc 영역 내에 감소된 수준의 푸코스 잔기를 포함한다. 전체 내용이 본원에 참고문헌으로 삽입된, Shitara 등에게 허여된 U.S. 특허 출원 공보 제 2004 0093621 호 참조. 또다른 구현예에서, 유형 Ⅱ 항-CD20 항체는, Presta 에게 허여된 US 특허 제 6,737,056 호 또는 U.S. 특허 출원 공보 제 2004 0185045 호 (Macrogenics) 또는 U.S. 특허 출원 공보 제 2004 0132101 호 (Xencor) 에서 교시된 바와 같은 폴리펩티드 엔지니어링을 수행하였으며, 상기 각각의 문헌의 전체 내용은 참고로써 본원에 삽입된다. 본 발명은 추가로 상기 엔지니어링된 유형 Ⅱ 항체의 제조 방법 및 B 세포 림프종을 포함하여 다양한 B 세포 장애의 치료에 있어 상기 항체의 사용 방법에 관한 것이다.
키메라 마우스/인간 항체가 기술되어 있다. 예를 들어 [Morrison, S. L. 등, PNAS I1: 6851-6854 (November 1984); 유럽 특허 공보 제 173494 호; Boulianna, G. L, 등, Nature 312: 642 (December 1984); Neubeiger, M. S. 등, Nature 314: 268 (March 1985); 유럽 특허 공보 제 125023 호; Tan 등, J. Immunol. 135: 8564 (November 1985); Sun, L. K 등, Hybridoma 5(1): 517 (1986); Sahagan 등, J. Immunol . 137: 1066-1074 (1986)] 참조. 일반적으로, [Muron, Nature 312: 597 (December 1984); Dickson, Genetic Engineering News 5(3) (March 1985); Marx, Science 229: 455 (August 1985); 및 Morrison, Science 229: 1202-1207 (September 1985)] 참조. Robinson 등의 PCT 공개 번호 WO/88104936 은 인간 불변 영역 및 쥐과동물 가변 영역이 있고 CD20 의 에피토프에 대한 특이성을 가진 키메라 항체를 기술하고 있는데 ; Robinson 의 참고문헌의 키메라 항체의 상기 쥐과동물 부분은 2H7 마우스 단일클론 항체 (감마 2b, 카파) 유래이다. 상기 참고문헌은, 상기 기술된 키메라 항체가 B 세포 장애의 치료에 대한 "최상의 후보" 임을 주지시키고 있지만, 상기 진술은 당업자에게 특정 항체에 대해 이러한 제안이 정확한지 여부를 결정하게 하는 단지 제안에 불과하다고 볼 수 있는데, 이는 특히 상기 참고문헌이 치료 유효성의 주장을 뒷받침할 어떤 데이터도 없고, 중요하게는 영장류 또는 인간과 같은 고등 포유동물을 사용한 데이터가 없기 때문이다.
키메라 항체 제조를 위한 방법론은 당업자에게는 사용가능하다. 예를 들어, 경쇄 및 중쇄는 예를 들어, 별도의 플라스미드 내에서 또는 단일 (예를 들어, 폴리시스트론성) 벡터 상에서 면역글로불린 경쇄 및 면역글로불린 중쇄를 사용하여 각각 발현될 수 있다. 다음, 이들을 정제하여 시험관 내에서 완전한 항체로 어셈블리할 수 있으며 ; 상기 어셈블리 수행 방법은 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어 [Scharff, M., Harvey Lectures 69:125 (1974)] 참조. 감소된 단리된 경쇄 및 중쇄로부터의 IgG 항체의 형성을 위한 시험관내 반응 파라미터 또한 기술되어 있다. 예를 들어 [Sears 등, Biochem . 16(9):2016-25 (1977)] 참조.
특별히 바람직한 구현예에서, 본 발명의 키메라 ABM 은 인간화된 항체이다. 비-인간 항체의 인간화 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 인간화된 ABM 은 Winter 에게 허여된 US 특허 제 5,225,539 호, Queen 등에게 허여된 US 특허 제 6,180,370 호, 또는 Adair 등에게 허여된 US 특허 제 6,632,927 호에 따라 제조될 수 있으며, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참고문헌으로 삽입된다. 바람직하게는, 인간화된 항체는 비-인간 근원으로부터 항체 내로 도입되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 상기 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "임포트 (import)" 잔기로서 지칭되며, 이들은 일반적으로 "임포트" 가변 도메인으로부터 취해진다. 인간화는 본질적으로 Winter 및 그의 동료의 방법에 따라, 초가변 영역 서열(hypervariable region sequence)을 인간 항체의 상응하는 서열 대신 치환함으로써 수행될 수 있다 (Jones 등, Nature , 321: 522-525 (1986); Riechmann 등, Nature , 332: 323-327 (1988); Verhoeyen 등, Science , 239: 1534-1536 (1988)). 따라서, 상기 "인간화된" 항체는, 온전한 것보다는 실질적으로 더 적은 인간 가변 도메인이 비-인간 종 유래의 상응하는 서열에 의해 치환된 키메라 항체이다 (US 특허 제 4,816,567 호). 실제로는, 인간화된 항체는 통상적으로, 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위 유래의 잔기로 치환된 인간 항체이다. 대상 인간화된 항-CD20 항체는 인간 면역글로불린의 불변 영역을 포함할 것이다.
인간화된 항체 제조에 사용될 경쇄 및 중쇄 모두의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성 감소에 매우 중요하다. 소위 "베스트-핏 (best-fit)" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열은 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 다음, 설치류의 것과 가장 근접한 인간 서열은 인간화된 항체에 대한 인간 프레임워크 영역 (FR) 으로서 수용된다 (Sims 등, J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia 등, J. Mol . Biol ., 196: 901 (1987)). 인간 프레임워크 서열의 또다른 선택 방법은, 전장 설치류 프레임워크의 각각의 개별적인 하위영역 (즉, FR1, FR2, FR3 및 FR4) 또는 개별적인 하위영역 일부의 조합 (예를 들어, FR1 및 FR2) 을 상기 프레임워크 하위 영역에 상응하는 공지된 인간 가변 영역의 라이브러리 (예를 들어, Kabat 넘버링에 의해 결정된 것) 와의 비교하고, 설치류의 것에 가장 근접한 각각의 하위영역 또는 조합을 위한 인간 서열을 선택하는 것이다 (Leung U.S. 특허 출원 공보 제 2003/0040606 A1 호, 2003 년 2 월 27 일 발행). 또다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특별한 하위군의 모든 인간 항체의 공통 서열 유래의 특별한 프레임워크 영역을 사용한다. 동일한 프레임워크는 다수의 상이한 인간화된 항체에 대해 사용될 수 있다 (Carter 등, Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 89:4285 (1992); Presta 등, J. Immunol ., 151:2623 (1993)).
항원에 대한 높은 친화성 및 기타 바람직한 생물학적 특성을 보유하도록 항체가 인간화되는 것이 더욱 중요하다. 상기 목적 달성을 위해, 바람직한 방법에 따르면, 인간화된 항체는, 모 서열 및 인간화된 서열의 3 차원 모델을 사용한 모 서열 및 다양한 개념의 인간화된 생성물의 분석 공정에 의해 제조된다. 3 차원 면역글로불린 모델은 일반적으로 이용가능하며, 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 적당한 3 차원 배치 구조를 설명하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 사용가능하다. 상기 디스플레이를 점검하면, 후보 면역글로불린 서열의 기능에서의 잔기의 역할 분석, 즉 후보 면역글로불린의 그의 항원에 대한 결합 능력에 영향을 주는 잔기를 분석할 수 있게 한다. 상기 방식으로, FR 잔기는 수용자(recipient) 및 임포트 서열로부터 선택되고 조합되어, 원하는 항체 특징, 예컨대 표적 항원에 대한 증가된 친화성이 달성될 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 항원 결합에 직접적으로 및 가장 실질적으로 관여한다.
또다른 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 분자는, 예를 들어, Balint 등에게 허여된 U.S. 특허 출원 제 2004/0132066 호에 개시된 방법에 따라 증강된 결합 친화성을 갖도록 엔지니어링되며, 상기 문헌의 전체 내용은 본원에 참고문헌으로 삽입된다.
한 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 분자는 방사선표지 또는 독소와 같은 추가의 부분에 콘쥬게이션된다. 상기 콘쥬게이션된 ABM 은 당업계에 잘 공지된 다수의 방법에 의해 생성될 수 있다.
다양한 방사선핵종이 본 발명에 적용되며, 당업자는 다수의 상황 하에 어떤 방사선핵종이 가장 적당한지 용이하게 결정하는 능력을 갖는다고 믿어지고 있다. 예를 들어, 131요오드는 표적 면역치료법을 위해 사용되는 잘 공지된 방사선핵종이다. 그러나, 131요오드의 임상적인 유용성은 하기를 포함하는 다수의 인자에 의해 제한될 수 있다: 8 일간의 물리적 반감기; 혈액 및 종양 부위 모두에서의 요오드화 항체의 탈할로겐화; 및 종양 중에 국재화한 용량 침착을 위해 최적 이하일 수 있는 발광 특징 (예를 들어, 큰 감마 성분). 월등한 킬레이트화제의 출현으로, 단백질에 금속 킬레이트기를 부착하는 기회가, 111인듐 및 90이트륨과 같은 기타 방사선핵종을 사용하는 기회를 증가시켰다. 90이트륨은 방사 면역치료 적용에서의 용도에 대한 다수의 장점을 제공한다: 90이트륨의 64 시간 반감기는 종양에 의한 항체 축적을 허용하기 위해 충분히 길고, 131요오드와는 달리 90이트륨은 100 내지 1,000 세포 직경의 조직의 범위에서 그의 붕괴시 감마 방사를 동반하지 않는 고에너지의 순수한 베타 방출자이다. 더욱이, 최소 방사선 침투량은 90이트륨-표지 항체의 외래환자에 대한 투여를 가능하게 한다. 추가로, 표지된 항체의 내재화 (internalization) 는 세포 살해에 필요하지 않으며, 이온화된 방사선의 국소적인 방출은 표적 항원이 결핍된 근접한 종양 세포에 대해 치명적이 될 것이다.
90이트륨 표지 항-CD20 항체의 유효한 단독 치료 투여량 (즉, 치료적 유효량) 은 약 5 내지 약 75 mCi, 더욱 바람직하게는 약 10 내지 약 40 mCi 의 범위이다. 131요오드 표지 항-CD20 항체의 유효한 단독 치료 비-골수 제거 (ablative) 투여량은 약 5 내지 약 70 mCi, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 약 40 mCi 의 범위이다. 131요오드 표지 항-CD20 항체의 유효한 단독 치료 제거 투여량 (즉, 동종 골수 이식을 필요로 할 수 있음) 은 약 30 내지 약 600 mCi, 더욱 바람직하게는 약 50 내지 약 500 mCi 미만의 범위이다. 키메라성 항-CD20 항체와 함께, 마주한 (vis-a-vis) 쥐과동물 항체의 더 긴 순환 반감기로 인해, 131요오드 표지 키메라 항-CD20 항체의 유효한 단독 치료 비-골수 제거 투여량은 약 5 내지 약 40 mCi, 더욱 바람직하게는 약 30 mCi 미만이다. 예를 들어, 111인듐 표지에 대한 조영 기준은 일반적으로 약 5 mCi 미만이다.
방사선표지 항-CD20 항체에 대하여, 본원에서의 치료법은 또한 일회 요법 치료 또는 복수 치료를 사용하여 수행될 수 있다. 방사선핵종 성분 때문에, 방사선 조사로 인한 잠재적으로 치명적인 골수 독성을 겪는 환자를 위해 치료에 앞서 말초 줄기 세포 ("PSC") 또는 골수 ("BM") 가 "수합" 되는 것이 바람직하다. BM 및/또는 PSC 는 표준 기술을 사용하여 수합된 후, 재주입가능하도록 일소(purge) 및 동결된다. 추가로, 치료 전에 환자에 대한 진단 표지 항체 (예를 들어, 111인듐) 를 사용한 진단 선량 측정 연구가 수행되는 것이 가장 바람직한데, 그의 목적은 치료 표지 항체 (예를 들어, 90이트륨) 가 임의의 정상적인 장기 또는 조직에 불필요하게 "농축" 되지 않음을 확인하기 위한 것이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은 하기 표 3 에 나타낸 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 하기 표 2 에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다. 또다른 구현예에서, 본 발명은 표 3 에서의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 또한 보존성 아미노산 치환을 가진 표 3 에서의 임의의 구축물의 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산을 포함한다.
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또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 도 1 또는 도 2 에 나타낸 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 도 5 또는 도 6 에 나타낸 뉴클레오티드 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다. 또다른 구현예에서, 본 발명은 도 5 또는 도 6 의 아미노산 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 보존성 아미노산 치환기를 가진, 도 1, 도 2, 도 5 또는 도 6 중 임의의 것의 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산을 포함한다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및/또는 숙주 세포에 관한 것이다.
일반적으로, 임의의 유형의 배양된 세포주가 본 발명의 ABM 의 발현에 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, CHO 세포, BHK 세포, NSO 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 기타 포유류 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 식물 세포가 본 발명의 엔지니어링된 숙주 세포 제조에 대한 백그라운드 세포주로서 사용된다.
본 발명의 ABM 의 치료 효능은 GnTⅢ 활성을 가진 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 발현하는 숙주 세포에서 이들을 생성시킴으로써 증가될 수 있다. 바람직한 구현예에서, GnTⅢ 활성을 가진 폴리펩티드는 골지 (Golgi) 내재 폴리펩티드의 골지 국재화 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 또다른 바람직한 구현예에서, GnTⅢ 활성을 가진 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 숙주 세포에서의 본 발명의 ABM 의 발현은 증가된 Fc 수용체 결합 친화성 및 증가된 효과기 기능을 가진 ABM 을 초래한다. 따라서, 한 구현예에서, 본 발명은 : (a) GnTⅢ 활성을 가진 폴리펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하는 단리된 핵산 ; 및 (b) 인간 CD20 에 결합하는 키메라성, 영장류화 (primatized) 또는 인간화된 항체와 같은 본 발명의 ABM 을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, GnTⅢ 활성을 가진 폴리펩티드는 GnTⅢ 의 촉매 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드이며, 골지 국재화 도메인은 만노시다아제 Ⅱ 의 국재화 도메인이다. 상기 융합 폴리펩티드의 제조 방법 및 이들을 사용하여 증가된 효과기 기능을 가진 항체의 생성 방법은 U.S. 임시 특허 출원 제 60/495,142 호에 개시되어 있으며, 그의 내용 전체가 본원에 참조로서 포함된다. 또다른 바람직한 구현예에서, 키메라 ABM 은 쥐과동물 B-Ly1 항체의 결합 특이성을 가진 키메라 항체 또는 그의 절편이다. 특별히 바람직한 구현예에서, 키메라 항체는 인간Fc 를 포함한다. 또다른 바람직한 구현예에서, 항체는 영장류화되거나 또는 인간화된다.
한 구현예에서, 본 발명의 ABM 을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 항시성 프로모터 (constitutive promoter) 의 조절 하에, 또는 대안적으로 조절된 발현 시스템 하에 발현될 수 있다. 적합한 조절된 발현 시스템에는, 테트라사이클린-조절 발현 시스템, 엑디손-유도성 발현 시스템, lac-스위치 발현 시스템, 글루코코르티코이드-유도성 발현 시스템, 온도-유도성 프로모터 시스템 및 메탈로티오네인 금속-유도성 발현 시스템이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 ABM 을 인코딩하는 다수의 상이한 핵산이 숙주 세포 시스템에 포함되어 있는 경우, 이들 중 일부는 항시성 프로모터의 조절 하에 발현될 수 있는 반면, 다른 것들은 조절된 프로모터(regulated promoter)의 조절 하에 발현된다. 최대 발현 수준은 세포 성장률에 현저한 악영향을 미치지 않는 안정한 폴리펩티드의 최대 가능한 발현 수준으로 간주되며, 일반적인 실험을 사용하여 결정될 것이다. 발현 수준은, ABM 에 특이적인 항체 또는 ABM 에 융합된 펩티드 태그에 특이적인 항체를 사용하는 웨스턴 블랏 분석; 및 노던 블랏 분석을 포함하여 일반적으로 당업계에 공지된 방법에 의해 결정된다. 추가의 대안으로서, 폴리뉴클레오티드는 리포터 유전자에 작동가능하게 연결될 수 있으며; 쥐과동물 B-Ly1 항체와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 가진 키메라 ABM 의 발현 수준은 리포터 유전자의 발현 수준과 연관된 신호를 측정함으로써 결정된다. 리포터 유전자는 단독 mRNA 분자로서의 상기 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산과 함께 전사될 수 있으며 ; 그의 각각의 코딩 서열은 내부 리보솜 유입 부위 (IRES) 또는 캡-독립적 번역 인핸서 (CITE) 에 의해 연결될 수 있다. 리포터 유전자는 쥐과동물 B-Ly1 항체와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 가진 키메라 ABM 을 인코딩하는 하나 이상의 핵산과 함께 번역되어, 단일 폴리펩티드 사슬이 형성되도록 할 수 있다. 본 발명의 AMB 을 인코딩하는 핵산은 단일 프로모터의 조절 하에 리포터 유전자에 작동적으로 연결되어, 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 및 리포터 유전자는 2 개의 개별적인 메신저 RNA (mRNA) 분자 내로 선택적으로 스플라이싱되는 RNA 분자로 전사될 수 있으며 ; 생성된 mRNA 중 하나는 상기 리포터 단백질로, 다른 하나는 상기 융합 폴리펩티드로 번역된다.
당업자에게 널리 공지된 방법은 적당한 전사/번역 조절 신호와 함께 쥐과동물 B-Ly1 항체의 동일한 결합 특이성을 실질적으로 가진 ABM 의 코딩 서열을 함유하는 발현 벡터 구축에 사용될 수 있다. 상기 방법에는 시험관 내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체 내 재조합/유전자 재조합이 포함된다. 예를 들어, [Maniatis 등, MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.(1989) 및 Ausubel 등, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)] 에 기술된 기술을 참조.
다양한 숙주-발현 벡터 시스템이 본 발명의 ABM 의 코딩 서열 발현에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 포유류 세포가, 관심대상의 단백질의 코딩 서열 및 융합 폴리펩티드의 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 트랜스펙션된 숙주 세포 시스템으로서 사용된다. 가장 바람직하게는, CHO 세포, BHK 세포, NSO 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 기타 포유류 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 식물 세포가 숙주 세포 시스템으로서 사용된다. 발현 시스템 및 선택된 방법의 일부 예는 하기 참고문헌 및 그의 참고문헌에 기술되어 있다: Borth 등, Biotechnol . Bioen . 71.4):266-73 (2000-2001), Werner 등, Arzneimittelforschung/Drug Res 48(8):870-80 (1998), Andersen end Krummen, Curr. Op . Biotechnol . 13: 117-123 (2002), Chadd and Chamow, Curr . Op . Biotechnol. 12: 188-194 (2001), 및 Giddings, Curr . Op . Biotechnol. 12: 450-454 (2001)]. 대안적인 구현예에서, 하기를 포함하는 기타 진핵성 숙주 세포 시스템이 고려될 수 있다: 본 발명의 ABM 의 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모 세포; 쥐과동물 B-Ly1 항체와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 가진 키메라 ABM 의 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 바쿨로바이러스) 로 감염된 곤충 세포 시스템; 본 발명의 ABM 의 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV) 로 감염되거나 또는 재조합 플라스미드 발현 벡터 (예를 들어, Ti 플라스미드) 로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 중복기형 (double-minute) 염색체 (예를 들어, 쥐과동물 세포주) 에서 안정하게 증폭되거나 (CHO/dhfr) 또는 불안정하게 증폭된 쥐과동물 B-Ly1 항체의 실질적으로 동일한 결합 특이성을 가진 키메라 ABM 을 인코딩하는 DNA 의 다수의 카피를 함유하도록 엔지니어링된 세포주를 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스) 로 감염된 동물 세포 시스템. 한 구현예에서, 본 발명의 ABM 을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)를 포함하는 벡터는 폴리시스트론성이다. 또한, 한 구현예에서 상기 논의된 ABM 은 항체 또는 그의 절편이다. 바람직한 구현예에서, ABM 은 인간화된 항체이다.
본 발명의 방법에 대하여, 안정한 발현은 일반적으로 일시적인 발현보다 선호되는데, 이는 이것이 전형적으로 더욱 재현가능한 결과를 달성하며 또한 대규모의 생산에 대해 더욱 다루기 쉽기 때문이다. 바이러스성 기원의 복제를 함유하는 발현 벡터를 사용하는 것보다, 숙주 세포는 적절한 발현 조절 구성원들 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위 등) 에 의해 조절되는 각각의 코딩 핵산, 및 선별가능한 마커로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA 의 도입 후, 엔지니어링된 세포는 증균용 배지 (enriched media) 중에 1 내지 2 일 동안 성장하도록 놔둔 후, 선택 배지 (selective media) 로 바꿔줄 수 있다. 재조합 플라스미드 중의 선별가능한 마커는 선별에 대한 저항성을 부여하며, 그들의 염색체에 안정하게 혼입된 플라스미드를 가진 세포의 선별을 가능하게 하며, 포사이 (foci) 를 형성하도록 성장하여 이후 클로닝되고 세포주로 확장될 수 있도록 한다.
이에 한정되지 않으나, 하기의 것을 포함하는 다수의 선별 시스템이 사용될 수 있다 : 헤르페스 심플렉스 바이러스 사이미딘 키나아제 (Wigler 등, Cell 11:223 (1977)), 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (Szybalska & Szybalski, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 48:2026 (1962)), 및 tk-, hgprt- 또는 aprt- 세포에 각각 사용될 수 있는 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (Lowy 등, Cell 22:817 (1980)) 유전자. 또한, 항대사물질 내성이 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr 유전자에 대한 선별의 근거로서 사용될 수 있고 (Wigler 등, Natl. Acad . Sci . USA 77:3567 (1989); O'Hare 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 78:1527 (1981)); 미코페놀산에 대한 내성을 나타내는 gpt 유전자에 대한 선별의 근거로서 사용될 수 있고 (Mulligan & Berg, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 78:2072 (1981)); 아미노글리코시드 G-418 에 대한 내성을 나타내는 neo 유전자에 대한 선별의 근거로서 사용될 수 있고 (Colberre-Garapin 등, J. Mol . Biol . 150:1 (1981)); 히그로마이신에 대한 내성을 나타내는 hygro 유전자에 대한 선별의 근거로서 사용될 수 있다 (Santerre 등, Gene 30: 147 (1984)). 최근, 추가의 선별가능한 유전자, 즉 세포로 하여금 트립토판 대신 인돌을 사용할 수 있도록 하는 trpB; 히스티딘 대신 히스티놀을 사용할 수 있도록 하는 hisD (Hartman & Mulligan, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:8047 (1988)); 글루타민 합성효소 시스템; 및 오르니틴 디카르복실라아제 억제제인 2-(디플루오로메틸)-DL-오르니틴, DFMO 에 대한 내성을 나타내는 ODC (오르니틴 디카르복실라아제) (McConlogue: Current Communications in Molecular Biology , Cold Spring Harbor Laboratory ed.(1987)) 이 기재되었다.
본 발명은 추가로, 숙주 세포에 의해 제조되는 본 발명의 ABM 의 글리코실화 프로필을 변형시키는 방법에 관한 것이며, 이는 본 발명의 ABM 을 인코딩하는 핵산 및 GnTⅢ 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산, 또는 그러한 핵산을 포함하는 벡터를, 상기 숙주 세포 내에 발현시키는 것을 포함한다. 바람직하게는, 변형된 폴리펩티드는 IgG 또는 Fc 부분을 포함하는 그의 절편이다. 특히 바람직한 구현예에서는, ABM 은 인간화 항체 또는 그의 절편이다.
본 발명의 숙주 세포에 의해 제조된 변형된 ABM 은 변형을 결과로 증가된 Fc 수용체 결합 친화도 및/또는 증가된 효과기 기능을 나타낸다. 특히 바람직한 구현예에서는 ABM 이 인간화 항체 또는 Fc 부분을 포함하는 그의 절편이다. 바람직하게는, 증가된 Fc 수용체 결합 친화도는 FcγRⅢA 수용체와 같은 Fcγ 활성 수용체로의 증가된 결합이다. 증가된 효과기 기능은 바람직하게 하기의 하나 이상의 증가이다: 증가된 항체-의존성 세포 독성, 증가된 항체-의존성 세포 식균작용 (phagocytosis; ADCP), 증가된 사이토카인 분비, 항원제시 세포에 의한 증가된 면역복합체-매개 항원 수용(uptake), 증가된 Fc-매개 세포 독성, NK 세포로의 증가된 결합, 대식세포로의 증가된 결합, 다행핵세포 (PMN) 로의 증가된 결합, 단핵구로의 증가된 결합, 표적-결합된 항체의 증가된 가교결합, 증가된 직접 신호 유도 세포자멸사, 증가된 가지세포 성숙, 및 증가된 T 세포 프라이밍 (priming).
본 발명은 또한 하기를 포함하는, 숙주 세포 내의 변형된 올리고사카리드를 갖는, 본 발명의 ABM 을 제조하는 방법에 관한 것이다: (a) 본 발명에 따른 ABM 의 제조를 허용하는 조건 하에서, GnTⅢ 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 발현하도록 엔지니어링된 숙주 세포를 배양함 (여기서 GnTⅢ 활성을 갖는 상기 폴리펩티드는 상기 숙주 세포에 의해 생산된 상기 ABM 의 Fc 영역 내의 올리고사카리드를 변형시키기에 충분한 양으로 발현됨); 및 (b) 상기 ABM 을 단리시킴. 바람직한 구현예에서는, GnTⅢ 활성을 갖는 폴리펩티드는 GnTⅢ 의 촉매 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 특히 바람직한 구현예에서는, 융합 폴리펩티드는 추가로 골지 내재 폴리펩티드의 골지 편재화 도메인 (Golgi localization domain) 을 포함한다.
바람직하게는, 골지 편재화 도메인은 만노시다제 Ⅱ 또는 GnTⅠ 의 편재화 도메인이다. 대안적으로, 골지 편재화 도메인은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 만노시다제 I 의 편재화 도메인, GnTⅡ 의 편재화 도메인, 및 α 1-6 코어 푸코실트랜스퍼라제 (fucosyltransferase) 의 편재화 도메인. 본 발명의 방법으로 제조된 ABM 은 증가된 Fc 수용체 결합 친화도 및/또는 증가된 효과기 기능을 갖는다. 바람직하게는, 증가된 효과기 기능은 하기의 하나 이상이다: 증가된 Fc-매개형 세포성 세포독성 (증가된 항체-의존성 세포성 세포독성 포함), 증가된 항체-의존성 세포상 식균작용 (ADCP), 증가된 사이토카인 분비, 항원제시 세포에 의한 증가된 면역복합체-매개형 항원 수용, NK 세포로의 증가된 결합, 대식세포로의 증가된 결합, 단핵구로의 증가된 결합, 다행핵세포로의 증가된 결합, 증가된 직접 신호 유도 세포자멸사, 표적-결합된 항체의 증가된 가교결합, 증가된 가지세포 성숙, 또는 증가된 T 세포 프라이밍. 증가된 Fc 수용체 결합 친화도는 바람직하게 FcγRⅢA 와 같은 Fc 활성 수용체로의 증가된 결합이다. 특히 바람직한 구현예에서는 ABM 이 인간 항체 또는 그의 절편이다.
또다른 구현예에서는, 본 발명은, 상기 폴리펩티드의 Fc 부분의 이등분된 올리고사카리드의 증가된 비율을 갖는, 본 발명의 방법에 의해 제조된 쥐과동물 B-Ly1 항체와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 키메라 ABM 에 관한 것이다. 이러한 ABM 은 항체 및 Fc 부위를 포함하는 그의 절편을 포함하는 것으로 생각된다. 바람직한 구현예에서는, ABM 은 인간화 항체이다. 하나의 구현예에서는, ABM 의 Fc 부위의 이등분된 올리고사카리드의 백분율이 총 올리고사카리드의 50% 이상, 더욱 바람직하게는 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상이며, 가장 바람직하게는 90~95% 이상이다. 또다른 구현예에서는, 본 발명의 방법으로 제조된 ABM 은, 본 발명의 방법에 의한 그 올리고사카리드의 변형의 결과로서, Fc 부위의 비(非)푸코실화 올리고사카리드의 증가된 비율을 갖는다. 하나의 구현예에서는, 비푸코실화 올리고사카리드의 백분율은 50% 이상, 바람직하게는 60% 내지 70% 이상, 가장 바람직하게는 75% 이상이다. 비푸코실화 올리고사카리드는 하이브리드 또는 복합체 유형일 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서는, 숙주 세포 및 본 발명의 방법에 의해 제조된 ABM 은 Fc 부위 내에 이등분된 비푸코실화 올리고사카리드의 증가된 비율을 갖는다. 이등분된, 비푸코실화 올리고사카리드는 하이브리드 또는 복합체일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 방법은 ABM 의 Fc 부위 내의 올리고사카리드의 15% 이상, 더욱 바람직하게는 20% 이상, 더욱 바람직하게는 25% 이상, 더욱 바람직하게는 30% 이상, 더욱 바람직하게는 35% 이상이 이등분, 비푸코실화된 ABM 을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 폴리펩티드의 Fc 부위 내의 올리고사카리드의 15% 이상, 더욱 바람직하게는 20% 이상, 더욱 바람직하게는 25% 이상, 더욱 바람직하게는 30% 이상, 더욱 바람직하게는 35% 이상이 이등분된 하이브리드 비푸코실화된 폴리펩티드를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은, 또다른 구현예에서는 본 발명의 방법으로 제조된, 증가된 효과기 기능 및/또는 증가된 Fc 수용체 결합 친화도를 갖도록 엔지니어링된 쥐과동물 B-Ly1 항체와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 키메라 ABM 에 관한 것이다. 바람직하게는, 증가된 효과기 기능은 하기의 하나 이상이다: 증가된 Fc-매개형 세포성 세포독성 (증가된 항체-의존성 세포성 세포독성 포함), 증가된 항체-의존성 세포성 식균작용 (ADCP), 증가된 사이토카인 분비, 항원제시 세포에 의한 증가된 면역복합체-매개형 항원 수용, NK 세포로의 증가된 결합, 대식세포로의 증가된 결합, 단핵구로의 증가된 결합, 다형핵세포로의 증가된 결합, 증가된 직접 신호 유도 세포자멸사, 표적-결합된 항체의 증가된 가교결합, 증가된 가지세포 성숙, 또는 증가된 T 세포 프라이밍. 바람직한 구현예에서는, 증가된 Fc 수용체 결합 친화도는 Fc 활성 수용체, 가장 바람직하게는 FcγRⅢa 로의 증가된 결합이다. 하나의 구현예에서는, ABM 은 항체, Fc 부위를 포함하는 항체 절편, 또는 면역굴로불린의 Fc 부위와 동등한 부위를 포함하는 융합 단백질이다. 특히 바람직한 구현예에서는, ABM 은 인간화 항체이다.
본 발명은 추가로 본 발명의 ABM 및 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 상기 약학적 조성물의, 암의 치료 방법에서의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은, 본 발명의 약학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명은 추가로, 증가된 Fc 수용체 결합 친화도, 바람직하게는 Fc 활성 수용체로의 증가된 결합, 및/또는 항체-의존성 세포성 세포독성을 포함하는, 증가된 효과기 기능을 갖는, 본 발명의 ABM 의 단백당형의 제조를 위한 숙주 세포 시스템의 생성 및 사용을 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 ABM 에 사용될 수 있는 글리코엔지니어링 방법은 미국 특허 제 6,602,684 호 및 미국 가특허출원 제 60/441,307 호 및 WO 2004/065540 에 보다 상세하게 기술되어 있으며, 각각의 전체적인 내용은 여기에 그대로 참조로서 포함되어 있다. 본 발명의 ABM 은 선택적으로, 그 전체적인 내용이 여기에 참조로서 포함된 EP 1 176 195 에 개시된 기법에 따라, 글리코엔지니어링되어 Fc 부위 내에 감소된 푸코스 잔기를 갖는다.
변경된 글리코실화 패턴을 갖는 단백질 제조를 위한 세포주의 생성
본 발명은 변형된 글리코실화 패턴을 갖는, 본 발명의 ABM 의 생성을 위한 숙주 세포 발현 시스템을 제공한다. 특히, 본 발명은 개선된 치료적 가치를 갖는, 본 발명의 ABM 의 단백당형의 생성을 위한 숙주 세포 시스템을 제공한다. 따라서, 본 발명은 GnTⅢ 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현하도록 선택되거나 엔지니어링된 숙주 세포 발현 시스템을 제공한다. 하나의 구현예에서는, GnTⅢ 활성을 갖는 폴리펩티드는 이종 골지 내재 폴리펩티드의 골지 편재화 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 구체적으로, 이러한 숙주 세포 발현 시스템은 항시성 프로모터 (constitutive promoter) 또는 조절된 프로모터 (regulated promoter) 시스템에 작동가능하게 연결된, GnTⅢ 를 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하도록 엔지니어링될 수 있다.
하나의 특정 구현예에서는, 본 발명은 이종 골지 내재 폴리펩티드의 골지 편재화 도메인을 함유하고 GnTⅢ 활성을 갖는 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 발현하도록 엔지니어링된 숙주 세포를 제공한다. 한 측면에서는, 숙주 세포가 이종 골지 내재 폴리펩티드의 골지 편재화 도메인을 함유하고 GnTⅢ 활성을 갖는 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함하는 핵산 분자로 엔지니어링된다.
일반적으로, 상기에 언급된 세포주를 포함하는 배양 세포주의 임의의 유형이 본 발명의 숙주 세포주를 엔지니어링하기 위한 백그라운드로 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서는, CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 기타 포유류 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 또는 식물 세포가 본 발명의 엔지니어링된 숙주 세포를 생성하기 위한 백그라운드 세포주로 사용된다.
본 발명은 여기에 정의된 이종 골지 내재 폴리펩티드의 골지 편재화 도메인을 함유하는 융합 폴리펩티드를 포함하는, GnTⅢ 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현하는 임의의 엔지니어링된 숙주 세포를 포함하려한다.
GnTⅢ 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 하나 또는 여러개의 핵산은 항시성 프로모터, 또는 대안적으로, 조절 발현 시스템의 제어 하에서 발현될 수 있다. 이러한 시스템은 종래기술에 잘 알려져 있고, 상기에 논의된 시스템을 포함한다. 이종 골지 내재 폴리펩티드의 골지 편재화 도메인을 포함하고 GnTⅢ 활성을 갖는 융합 폴리펩티드를 인코딩하는 몇개의 상이한 핵산이 숙주 세포 시스템 내에 포함된다면, 그 중 일부는 구성적 프로모터의 제어 하에서 발현되는 한편, 그 밖의 것들은 조절된 프로모터의 제어 하에서 발현된다. GnTⅢ 활성을 갖는 융합 폴리펩티드의 발현 수준은 웨스턴 블럿 분석, 노던 블럿 분석, 리포터 유전자 발현 분석 또는 GnTⅢ 활성의 측정을 포함하는, 당업계에 일반적으로 공지된 방법에 의해 측정된다. 대안적으로, GnTⅢ 의 생합성 산물에 결합하는 렉틴, 예를 들어 E4-PHA 렉틴이 사용될 수 있다. 대안적으로, GnTⅢ 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산으로 엔지니어링된 세포에 의해 제조된 항체로 매개된, 증가된 효과기 기능 또는 증가된 Fc 수용체 결합을 측정하는 기능 분석이 사용될 수 있다.
변형된 글리코실화 패턴을 갖는 단백질을 발현하는 유전자도입체 또는 형질전환체의 확인
쥐과동물 B-Ly1 항체와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 가지며 생물학적 활성의 유전자 산물을 발현하는 키메라 ABM 의 코딩 서열을 함유하는 숙주 세포는 4 개 이상의 일반적인 방법에 의해 확인될 수 있다: (a) DNA-DNA 또는 DNA-RNA 교잡반응(hybridization); (b) "마커" 유전자 기능의 존재 또는 부재; (c) 숙주 세포 내의 각각의 mRNA 전사체의 발현에 의해 측정된 전사 수준 평가; 및 (d) 면역분석 또는 그 생물학적 활성에 의해 측정되는 유전자 산물의 검출.
첫번째 방법에서는, 쥐과동물 B-Ly1 항체와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 키메라 ABM 의 코딩 서열 및 GnTⅢ 활성을 갖는 폴리펩티드의 코딩 서열의 존재는, 각각의 코딩 서열 또는 그의 일부 또는 유도체 각각에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 함유하는 프로브를 사용한 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 교잡반응 각각에 의해 검출될 수 있다.
두번째 방법에서는, 재조합 발현 벡터/숙주 시스템이 특정 "마커" 유전자 기능 (예를 들어, 티미딘 키나제 활성, 항생제 내성, 메토트렉세이트 내성, 형질전환 표현형, 바큘로바이러스 내의 폐쇄체 (occlusion body) 형성 등) 의 존재 또는 부재에 기초하여 확인되고 선택될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 ABM 의 코딩 서열, 또는 그의 절편, 및 GnTⅢ 활성을 갖는 폴리펩티드의 코딩 서열이 벡터의 마커 유전자 서열 내에 삽입되면, 각 코딩 서열을 함유하는 재조합체는 마커 유전자 기능의 부재에 의해 확인될 수 있다. 대안적으로, 마커 유전자는 코딩 서열의 발현의 제어를 위해 사용되는, 동일하거나 상이한 프로모터의 제어 하에서 코딩 서열과 일렬로 위치할 수 있다. 유도 또는 선택에 대한 마커의 발현은 본 발명의 ABM 의 코딩 서열 및 GnTⅢ 활성을 갖는 폴리펩티드의 코딩 서열의 발현을 나타낸다.
세번째 방법에서는, 본 발명의 ABM 의 코딩 부위 또는 그의 절편, 및 GnTⅢ 활성을 갖는 폴리펩티드의 코딩 서열에 대한 전사 활성은 교잡반응 분석에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, RNA 는 본 발명의 ABM 의 코딩 서열 또는 그의 절편, 및 GnTⅢ 활성을 갖는 폴리펩티드의 코딩 서열 또는 그의 특정 부분에 상동성인 프로브를 사용한 노던 블럿에 의해 단리되고 분석될 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포의 총 핵산은 추출되고 상기와 같은 프로브로의 교잡반응을 위해 분석될 수 있다.
네번째 방법에서는, 단백질 산물의 발현이, 예를 들어, 웨스턴 블럿, 방사면역침전법, 효소-결합 면역어세이와 같은 면역어세이에 의해 면역학적으로 분석될 수 있다. 발현 시스템의 성공의 최종의 검사는 생물학적으로 활성인 유전자 산물의 검출을 포함한다.
항체-의존성 세포 독성을 포함하는 증가된 효과기 기능을 갖는 AMB 의 생성 및 사용
바람직한 구현에서는, 본 발명은 쥐과동물 B-Ly1 항체와 실질적으로 동일한 결합 특이성 및 항체 의존성 세포성 세포독성을 포함하는, 증가된 효과기 기능을 갖는 키메라 ABM 의 단백당형을 제공한다. 항체의 글리코실화 엔지니어링은 이전에 기술되었다. 여기에 그대로 포함된, 미국 특허 제 6,602,684 호 참조.
몇가지 유형의 암의 치료를 위한 비콘쥬게이션 단일클론 항체 (mAb) 의 임상 실험은 최근에 유망한 결과를 제공했다. Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12:223-25 (1997); Dep et al., Immunology Today 18:127 (1997). 키메라 비콘쥬게이션 IgG1 은 저등급 또는 소포성 B-세포 비-호지킨 림프종에 대한 승인을 얻었다. Dillmann, Cancer Biother & Radiopharm. 12:223-25 (1997). 한편 또다른 비콘쥬게이션 mAb, 인간화 IgG1 표적 고체 유방 종양은 단계 Ⅲ 임상 실험에서 유망한 결과를 나타내고 있다. Deo et al ., Immunology Today 18:127 (1997). 이러한 2개의 mAb 의 항원은 그 각각의 종양 세포 내에서 고도로 발현되고, 항체는 시험관내 및 생체내에서 작용 세포에 의해 강력한 종양 파괴를 매개한다. 이에 반해, 우수한 종양 특이성을 갖는 여러 기타 비콘쥬게이션 mAb 는 임상적으로 유용하기에 충분히 강력한 작용 기능을 유발할 수 없다. Frost et al., Cancer 80:317-33 (1997); Surfus et al ., J. Inmunother . 19:184-91 (1996). 이러한 보다 약한 mAb 중 일부를 위해, 부가적인 사이토카인 치료법이 현재 실험중이다. 사이토카인의 첨가는 순환하는 림프구의 활성 및 수를 증가시켜 항체-의존성 세포 독성 (ADCC) 을 자극시킬 수 있다. Frost et al ., Cancer 80:317-33 (1997); Surfus et al ., J. Immunother. 19:184-91 (1996). ADCC, 항체-표적 세포에 대한 용해성 공격은 백혈구 수용체의, 항체의 불변 부위 (Fc) 로의 결합에 의해 유발된다. Deo et al ., Immunology Today 18:127 (1997).
비콘쥬게이션 IgG1s 의 ADCC 활성을 증가시키는, 상이하지만 보완적인 방법은 항체의 Fc 부위를 엔지니어링하는 것이다. 단백질 엔지니어링 연구는 FcγR 가 IgG CH2 도메인 하부의 경첩 부위와 상호작용하는 것을 나타냈다. Lund et al., J. Immunol. 157:4963-69 (1996). 그러나, FcγR 결합은 CH2 부위 내의 보존성 Asn297 에 공유 결합된 올리고사카리드의 존재를 필요로한다. Lund et al., J. Immunol . 157:4963-69 (1996); Wright and Morrison, Trends Biotech. 15:26-31 (1997) 는 어느 하나의 올리고사카리드 및 폴리펩티드 모두 상호작용 부위에 직접 기여하거나, 올리고사카리드가 활성 CH2 폴리펩티드 형태를 유지하기 위해 필요하다고 제안한다. 따라서 올리고사카리드 구조의 변형은 상호작용의 친화성을 증가시키기 위한 방법으로 탐구될 수 있다.
IgG 분자는 그의 Fc 부위에 2개의 N-결합 올리고사카리드를 지니고, 각 중쇄에 하나씩이다. 임의의 당단백과 마찬가지로, 항체는 동일한 폴리펩티드 백본 (backbone) 을 공유하나 상이한 올리고사카리드가 글리코실화 부위에 부착된 단백당형의 개체군(population)으로 제조된다. 보통 혈청 IgG 의 Fc 부위에서 발견되는 올리고사카리드는 낮은 수준의 말단 시알산 및 이등분된 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc), 및 가변도의 말단 갈락토실화 및 코어 푸코실화를 갖는, 복합 이촉각성 유형 (complex bi-antennary type) 이다 (Wormald et al ., Biochemistry 36:130-38 (1997)). 몇몇의 연구는 FcγR 결합을 위해 필요한 최소의 탄수화물 구조는 올리고사카리드 코어에 있다고 제안한다. Lund et al ., J. Immunol . 157:4963-69 (1996).
비콘쥬게이션 치료용 mAb 의 제조를 위해 산업 및 학계에서 사용되는 마우스- 또는 햄스터-유래 세포주는 일반적으로 필요한 올리고사카리드 결정소를 Fc 부위에 부착시킨다. 그러나 이러한 세포주에서 발현되는 IgG 는 혈청 IgG 에서 소량으로 발견되는 이등분된 GlcNAc 가 결핍되어 있다. Lifely et al ., Glycobiology 318:813-22(1995). 이에 반해, 래트 골수종-제조된 인간화 IgG1 (CAMPATH-1H) 이 몇 개의 그 단백당형들에 이등분된 GlcNAc 를 지니는 것이 최근에 관찰되었다. Lifely et al ., Glycobiology 318:813-22 (1995). 래트 세포-유래 항체는 표준 세포주에서 제조된 CAMPATH-1H 항체와 유사한 최대 시험관내 ADCC 활성에 도달했으나, 현저히 낮은 항체 농도였다.
CAMPATH 항체는 보통 림프종 세포 상에서 높은 수준으로 존재하며, 이러한 키메라 mAb 는 이등분 GlcNAc 의 부재 중에서 높은 ADCC 활성을 갖는다. Lifely et al ., Glycobiology 318:813-22 (1995). N-결합 글리코실화 경로에서, 이등분 GlcNAc 가 GnTⅢ 에 의해 첨가된다. Schachter, Biochem . Cell Biol. 64:163-81 (1986).
이전의 연구는, 상이한 수준의 클로닝된 GnTⅢ 유전자 효소를 외부적으로 조절되는 방식으로 발현시키도록 미리 엔지니어링된, 단일의 항체-생성 CHO 세포주를사용했다 (Umana, P., et al ., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999)). 이러한 방법은 변형된 항체의 ADCC 활성과 GnTⅢ 의 발현의 엄밀한 상관 관계를 처음으로 입증했다. 따라서, 본 발명은 증가된 GnTⅢ 활성으로부터 기인하는 변경된글리코실화를 갖는, 쥐과동물 B-Ly1 항체의 결합 특이성을 갖는, 재조합 키메라 항체 또는 그의 절편을 고찰한다. 증가된 GnTⅢ 활성은 ABM 의 Fc 부위 내의, 이등분 올리고사카리드의 백분율의 증가, 및 푸코스 잔기의 백분율의 감소를 초래한다. 이러한 항체, 또는 그의 절편은 증가된 Fc 수용체 결합 친화도 및 증가된 효과기 기능을 갖는다. 부가적으로, 본 발명은 면역글로불린의 Fc 부위와 동등한 부위를 함유하는 항체 절편 및 융합 단백질에 관한 것이다.
본 발명의 방법에 따라 제조된 ABM 의 치료 적용
본 발명의 ABM 은 생체내에서 종양 세포를 표적으로 하고 죽이기 위해 단독으로 사용될 수 있다. ABM 은 또한 인간 암종을 치료하기 위해 적절한 치료제와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, ABM 은 치료제를 암종의 부위로 전달하기 위해, 화학치료법, 방사선치료법과 같은 표준 또는 통상적인 치료 방법과 함께 사용되거나, 치료 약물, 또는 독소, 및 림포카인 또는 종양-억제 성장 인자에 콘쥬게이션되거나 결합될 수 있다. 본 발명의 ABM 의 콘쥬게이트 중 가장 중요한 것은 (1) 면역독소 (ABM 및 세포독성 부분의 콘쥬게이트) 및 (2) 표지된 (예를 들어, 방사성 표지, 효소-표지 또는 형광염색-표지) ABM 이며, 여기서 표지는 표지된 ABM 을 포함하는 면역 복합체를 확인하기 위한 방법을 제공한다. ABM 은 또한 천연 보체 과정을 통해 용해를 유도하고, 일반적으로 존재하는 항체 의존성 세포독성 세포와 상호작용하기 위해 사용될 수 있다.
면역독성의 세포독성 부분은 세포독성 약물 또는 박테리아 또는 식물 원천의 효소 활성 독소, 또는 그러한 독소의 효소 활성 절편 ("A 쇄") 일 수 있다. 사용되는 효소 활성 독소 및 그의 절편은 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 절편, 외독소 A 쇄 (수도모나스 아루지노사 (Pseudomonas aeruginosa) 로 부터의), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알루라이츠 포르디 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이토라카 아메리카나 (Phytolacca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 차란티아 억제제, 커르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스토릭토신, 페노마이신, 및 에노마이신이다. 또다른 구현예에서는, ABM 이 저분자 항암 약물에 콘쥬게이션된다. ABM 및 그러한 세포독성 부분의 콘쥬게이트는 다양한 2기능의 단백질 커플링제를 사용하여 제조된다. 이러한 시약의 예는 SPDP, IT, 디메틸 아디피미데이트 HCl 과 같은 이미도에스테르의 2기능 유도체, 디석시니미딜 수베레이트와 같은 활성 에스테르, 글루타르알데하이드와 같은 알데하이드, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민과 같은 비스-아지도 화합물, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민과 같은 비스-디아조늄 유도체, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트와 같은 디이소시아네이트, 및 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠과 같은 비스-활성 플루오린 화합물이다. 독소의 용해 부분은 ABM 의 Fab 절편에 결합되어 있어도 된다. 부가적인 적합한 독소는, 예를 들어 여기에 그대로 참조로서 포함된, 미국 특허 출원 제 2002/0128448 호에 공개된 바와 같이, 당업계에 잘 알려져 있다.
하나의 구현예에서는, 쥐과동물 B-Ly1 항체와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 키메라 글리코엔지니어링된 ABM 이 리신 A 쇄에 콘쥬게이션된다. 가장 유리하게는, 리신 A 쇄은 탈글리코실화되고 재조합 방법을 통해 제조된다. 리신 면역독소을 제조하는 유리한 방법은 여기에 참조로서 포함된, Vitetta et al., Science 238, 1098 (1987) 에 기술되어 있다.
진단 목적을 위해 시험관 내에서 인간 암 세포를 죽이기 위해 사용되는 경우, 콘쥬게이트는 전형적으로 약 10 nM 의 농도로 세포 배양 배지에 첨가될 것이다. 시험관내 용도를 위한 제형 및 투여 방법은 결정적이지 않다. 일반적으로 배양물 또는 관류 배지와 친화성인 수성 제형이 사용된다. 세포독성은 통상적인 기법으로 읽어 암의 존재 또는 정도를 측정한다.
상기에 기술된 바와 같이, 암을 치료하기 위한 세포독성 방사성약제는 방사성 동위원소 (예를 들어, I, Y, Pr) 를 쥐과동물 B-Ly1 항체와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 갖는 키메라 글리코엔지니어링된 ABM 에 콘쥬게이션시켜 제조될 수 있다. 여기에 사용된 용어 "세포독성 부분" 은 상기 동위원소를 포함하는 것을 의미한다.
또다른 구현예에서는, 리포솜은 세포독성 약물로 충전되어 있고, 그 리포좀은 본 발명의 ABM 으로 코팅되어 있다. 악성 B-세포의 표면 상에 다수의 CD20 분자가 있기 때문에, 이러한 방법은 정확한 세포 유형에, 다량의 약물 전달을 허용한다.
상기 치료제를 항체에 콘쥬게이션시키기 위한 기법은 잘 알려져 있다 (예를 들어, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al ., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp.623-53 (Marcel Dekker, Inc.1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); and Thorpe et al ., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol . Rev ., 62:119-58 (1982) 참조).
본 발명의 ABM 의 또 다른 치료 용도는, 예를 들어, 재조합 DNA 기법에 의한, 약물전구체를 세포독성 약물로 전환시킬 수 있는 효소로의 콘쥬게이션 또는 연결, 및 그러한 항체-효소 콘쥬게이트를 약물전구체와 함께 사용하여, 그 약물전구체를 종양 부위에서 세포독성 제제로 전환시키는 것을 포함한다 (예를 들어, Senter et al., "Anti-Tumor Effects of Antibody-alkaline Phosphatase", Proc . Natl. Acad . Sci . USA 85:4842-46 (1988); "Enhancement of the in vitro and in vivo Antitumor Activites of Phosphorylated Mitocycin C and Etoposide Derivatives by Monoclonal Antibody-Alkaline Phosphatase Conjugates", Cancer Research 49:5789-5792 (1989); and Senter, "Activation of Prodrugs by Antibody-Enzyme Conjugates: A New Approach to Cancer Therapy," FASEB J. 4:188-193 (1990) 참조).
본 발명의 ABM 의 또다른 치료 용도는 암 환자의 골수로부터 종양 세포를 제거하기 위해, 보체의 존재 하에서 비콘쥬게이션되어, 또는 항체-약물 또는 항체-독소 콘쥬게이트의 일부로서 사용하는 것을 포함한다. 이러한 방법에 따라, 자가 골수가 항체로의 처리에 의해 생체외로 제거되고, 골수가 환자에 다시 주입될 수 있다 [예를 들어, Ramsay et al., "Bone Marrow Purging Using Monoclonal Antibodies", J. Clin . Immunol., 8(2):81-88 (1988) 참조].
추가로, 본 발명은 쥐과동물 B-Ly1 항체와 실질적으로 동일한 결합 특이성을 허용하는 항체 결합 도메인 (예를 들어, 쥐과동물 B-Ly1 항체의 CDR 을 함유하는 폴리펩티드) 을 포함하고, 추가로 독소 폴리펩티드를 함유하는 단쇄 면역독소를 포함한다. 본 발명의 단쇄 면역독소는 인간 암종을 생체내에서 치료하기 위해 사용될 수 있다.
마찬가지로, 항-종양 활성, 예컨대 림포카인 또는 온코스타틴을 가진 제 2 의 단백질 중 하나 이상의 관능활성부분에 결합된 본 발명의 ABM 의 항원-결합 영역을 하나 이상 포함하는 융합 단백질이 사용되어 생체내 인간 암종을 치료할 수 있다.
본 발명은 CD20을 발현하는 종양 세포의 선택적 살상 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 면역콘쥬게이트(예를 들면, 면역 독소)를 상기 종양세포와 반응시키는 것을 포함한다. 상기 종양세포는 인간 암종 유래일 수 있다.
추가로, 본 발명은 생체내 암종(예를 들면, 인간 암종) 치료 방법을 제공한다. 상기 방법에는 대상체에 본 발명의 면역콘쥬게이트(예를 들면, 면역 독소) 하나 이상을 포함하는 조성물의 약학적 유효량을 투여하는 것이 포함된다.
추가로, 본 발명은, 치료학적 유효량의 본 발명의 ABM 을 이를 필요로 하는 인간 대상에게 투여하는 것을 포함하는, B-세포 고갈을 기초로 하는 병원성 자기항체에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 야기된 자기면역질환뿐 아니라, B-세포 림프종을 포함하는 B-세포 증식 장애의 향상된 치료 방법에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, ABM 은 쥐과동물 B-Ly1 항체의 것과 실질적으로 동일한 결합 특이성을 가진 글리코엔지니어링된 항-CD20 항체이다. 또다른 바람직한 구현예에서, 항체는 인간화된다. 자기면역 질환 또는 장애의 예에는, 이에 한정되지 않지만 하기가 포함된다: 면역-매개 저혈소판증, 예컨대 급성 특발성 자혈소판성 자반증 및 만성 특발성 저혈소판성 자반증, 피부근육염, 시든햄 무도증, 루프스 신장염, 류마티스열, 다분비선 증후군, 헤노호쉔라인자반증, 연쇄구균감염후 신장염, 결절홍반, 타카야수 동맥염, 에디슨병, 다형홍반, 결절다발동맥염, 강지척추염, 굿파스처증후군, 폐쇄성 혈전혈관염, 원발쓸개관간경화중, 하시모토 갑상선염, 갑상샘중독증, 만성활동간염, 다발근육염/피부근육염, 다발연골염, 보통천포창(pamphigus vulgaris), 베게너육아종증, 막성콩팥병증, 근육위축가쪽경화증, 척수매독, 다발근육통증, 악성빈혈, 급성진행사구체신염 및 섬유성 폐포염, 염증성 반응, 예컨대 건선 및 피부염 (예를 들면, 아토피 피부염)을 포함하는 염증성 피부 질환; 전신피부경화증 및 경화증; 염증성창자병과 연관된 반응 (예컨대, 크론병 및 궤양대장염); 호흡곤란증후군 (성인성 호흡곤란증후군; ARDS 포함); 피부염; 수막염; 뇌염; 포도막염; 대장염; 사구체신염; 알레르기성 상태, 예컨대 습진 및 천식 및 T 세포의 침윤 및 만성 염증 반응을 포함하는 기타 상태; 죽상동맥경화증; 백혈구부착결핍증; 류마티스관절염; 전신홍반루푸스 (SLE); 당뇨병 (예를 들면, 유형 1 당뇨병 또는 인슐린 의존성 당뇨병); 다발 경화증; 레이나우드 증후군(Reynaud's syndrome); 자기면역성 갑상샘염; 알레르기성 뇌척수염; 쇼그렌 증후군; 연소자형 당뇨병; 및 전형적으로 결핵, 사코이드증, 다발근육염, 육아종증 및 혈관염에서 발견되는 사이토킨 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연형 과민형 연관 면역 반응; 악성빈혈 (에디슨병); 백혈구누출(leukocyte diapedesis)을 포함하는 질환; 중추신경계 (CNS) 염증 장애; 다발성 장기 손상 증후군; 용혈빈혈 (이에 한정되지는 않지만, 크라이오글로빈혈증(cryoglobinemia) 또는 쿰스 양성 빈혈(Coombs positive anemia) 포함); 중증근육무력증; 항원-항체 복합 매개 질환; 항-사구체 기저막 질환; 항인지질증후군; 알레르기성 신경염; 그레이브스병; 람버트-이튼 근무력증증후군; 유천포창; 천포창; 자기면역 다발성 내분비장애증(autoimmune polyendocrinopathies); 라이터병; 근육강직 증후군; 베체트병; 거세포동맥염; 면역 복합 신장염; 면역글로불린에이 신장병증; IgM 다발신경병증; 면역혈소판감소자색판(ITP) 또는 자가면역 저혈소판증 등. 본 발명의 상기 국면에서, 본발명의 ABM 은 연장 기간 동안 정상 B-세포의 혈류를 소멸하는데 사용된다.
본 발명의 실시에 의하면, 대상체는 인간, 말, 돼지, 소, 쥐과동물, 개과 동물, 고양이과 동물, 및 조류 대상체일 수 있다. 기타 온혈 동물이 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명은 추가로 인간 종양 세포의 성장 저해, 대상체 내 종양 치료, 및 대상체 내 증식 유형의 질환 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 유효량의 본 발명의 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함한다.
따라서, 본 발명에는 약학적 조성물, 조합물 및 인간 암종, 예컨대 B 세포 림프종 치료 방법이 포함되는 것이 자명하다. 예를 들면, 본 발명에는 약학적 유효량의 본 발명의 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 인간 암종 치료 용도의 약학적 조성물이 포함된다.
본 발명의 ABM 조성물은 이에 한정되지는 않지만, 정맥내 투여, 복막내 투여, 경구투여, 림프액내(intralymphatic) 투여 또는 종양으로의 직접 투여를 포함하는 종래의 투여 방식을 사용해 투여될 수 있다. 정맥내 투여가 바람직하다.
본 발명의 한 국면에서, 본 발명의 ABM 을 함유하는 치료학적 제형물은 임의적으로는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제와 원하는 정도의 순도를 가진 항체를 혼합함으로써, 동결건조된 제형물 또는 수용액의 형태로 저장하기 위해 제조된다(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A.Ed.(1980)). 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자(recipients)에게 비독성이고, 하기를 포함한다: 완충용액, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10 미만 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 단당류, 이당류, 및, 글루코오스, 만노오스, 또는 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨; 염형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물(예를 들면, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 TWEENTM, PLURONICTM 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG).
에시적 항-CD20 ABM 제형물은 WO98/56418 에 기재되어 있고, 이는 본원에서 참고로써 포함되어 있다. 상기 문헌은 2-8℃에서 2년 저장의 최소 저장수명을 가진, pH 5.0 의 0.02% 폴리소르베이트 20, 40 mg/㎖ 리툭시마브, 25 mM 아세테이트, 150 mM 트레할로오스, 0.9% 벤질 알코올을 포함하는 액형 다중투여(multidose) 제형물을 기재했다. 또다른 관심있는 항-CD20 제형물에는 pH 6.5 의 주사용 멸균수, 9.0 mg/㎖ 염화나트륨 내 10 mg/㎖ 리툭시마브, 7.35 mg/㎖ 나트륨 시트레이트 디하이드레이트 및 0.7 mg/㎖ 폴리소르베이트 80이 포함된다. 본 발명에서, RITUXAN® 은 본 발명의 ABM 으로 대체될 수 있다.
피하 투여용으로 적당한 동결건조된 제형물은 WO97/04801 에 기재되어 있다. 상기 동결건조된 제형물은 적합한 희석제로 고 단백질 농도로 재구성될 수 있고, 재구성된 제형물은 본원에서 치료될 포유동물에 피하 투여될 수 있다.
또한 본원에서 제형물은 치료될 특정 징후에 필수적인 하나 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 부작용을 일으키지 않는 보완적인 활성을 가진 것을 함유할 수 있다. 예를 들면, 추가로 세포독성제, 화학요법제, 사이토킨 또는 면역억제제(예를 들면, T 세포상에 작용하는 것, 예컨대 시클로스포린 또는 T 세포에 결합하는 항체, 예컨대 LFA-1 에 결합하는 것)를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 유효량의 상기 기타 작용제는 제형물 내에 존재하는 안타고니스트의 양, 질환 또는 장애 또는 치료 유형 및 상기에서 논의되는 기타 인자에 좌우된다. 이들은 일반적으로 상기에서 사용된 바와 동일 투여량 및 같은 투여 경로로 사용되거나 또는 종래까지 사용된 투여량의 약 1 내지 99% 로 사용된다.
활성 성분은 또한 예컨대 코르아세르베이션 기술 또는 계면 중합으로써, 제조된 마이크로캡슐, 예컨대 각각 콜로이드성 약물전달계(예컨대, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노 입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼 내의 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내로 트랩(trap) 될 수 있다. 상기 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에 개시된다.
서방성 제제는 제조될 수 있다. 적합한 서방성 제제의 예에는 안타고니스트를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투성 매트릭스가 포함되며, 여기서 매트릭스는 모양지어진 성형품, 예컨대, 필름 또는 마이크로캡슐 형태이다. 서방성 매트릭스의 예에는 하기가 포함된다: 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들면, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드 (U.S. 특허 제 3,773,919 호), L-글루타민산 및 γ에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 LUPRON DEPOTTM (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 이루어진 주사가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산.
생체내 투여에 사용될 제형물은 멸균되어야 한다. 이것은 멸균 여과막을 통해 여과함으로써 용이하게 성취된다.
본 발명의 조성물은 이에 제한되지는 않지만 하기를 포함하는 각종 투약 형태일 수 있다: 액체 용액 또는 현탁액, 정제, 환약, 분말, 좌제 중합체성 마이크로캡슐 또는 마이크로소낭, 리포솜 및 주사가능한 또는 주입가능한 용액. 바람직한 형태는 투여 양태 및 치료학적 적용에 좌우된다.
본 발명의 조성물은 또한 바람직하게 당기술에 공지된 종래의 약학적으로 허용가능한 담체 및 아쥬반트, 예컨대 인간 혈청 알부민, 이온 교환제, 알루미나, 레시틴, 완충 물질, 예컨대 포스페이트, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트 및 염 또는 전해물, 예컨대 프로타민 술페이트를 포함한다.
가장 효과적인 본 발명의 약학적 조성물의 투여 양태 및 투약 양생법은 질환의 위독성 및 진행과정, 환자의 건강 및 치료에 대한 반응 및 치료 의사의 판단에 좌우된다. 따라서, 조성물의 투여량은 개인 환자에 맞게 적정되어야 한다. 그럼에도 불구하고 본 발명의 조성물의 유효 투여량은 일반적으로 약 0.01 내지 약 2000 mg/kg 일 것이다.
본원에서 기재된 분자는 이에 제한되지 않으나 하기를 포함하는 각종 투약 형태일 수 있다: 액체 용액, 또는 현탁액, 정제, 환약, 분말, 좌제, 중합체성 마이크로캡슐 또는 마이크로소낭, 리포솜, 및 주사가능한 또는 주입가능한 용액. 바람직한 형태는 투여 양태 및 치료학적 적용에 좌우된다.
본 발명의 ABM 을 포함하는 조성물은 양호한 의약 관행에 따른 방식으로 제형화, 투약 및 투여될 것이다. 본 문맥에서 고려해야 할 요소는 특히 치료될 질환 또는 장애, 특히 치료할 포유동물, 각 환자의 임상 상태, 질환 또는 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄 및 의학 수행자에게 공지된 기타 인자가 포함된다. 투여될 치료학적 유효량의 안타고니스트는 상기 고려사항에 의해 통제받을 것이다.
일반적인 제안으로서, 투여량 당 비경구적으로 투여된 항체의 치료학적 유효량의 범위는 1일당 약 0.1 내지 20 mg/환자 체중 kg이고, 사용된 안타고니스트의 전형적인 초기 범위는 약 2 내지 10 mg/kg 이다.
바람직한 구현예에서, ABM 은 항체, 바람직하게는 인간화된 항체이다. 적합한 상기 비콘쥬게이션된 항체용 투여량의 범위는 예를 들면 약 20 mg/m2 내지 약 1000 mg/m2 이다. 한 구현예에서, 항체 투여량은 RITUXAN® 용으로 현재 제안된 것과 상이하다. 예를 들면, 이는 환자에게 실질적으로 375 mg/m2 미만의 항체 하나 이상의 투여량으로 환자에게 투여할 수 있고, 여기서 예를 들면, 상기 투여량의 범위는 약 20 mg/m2 내지 약 250 mg/m2, 예를 들면 약 50 mg/m2 내지 약 200 mg/m2 이다.
더욱이, 이는 항체 하나 이상의 초기 투여량 후에 하나 이상의 후속적인 투여량으로 투여할 수 있고, 여기서 후속적인 투여량 내 항체의 mg/m2 투여량은 초기 투여량내 항체 mg/m2 투여량을 초과한다. 예를 들면, 초기 투여량의 범위는 약 20 mg/m2 내지 약 250 mg/m2 (예컨대 약 50 mg/m2 내지 약 200 mg/m2 )이고, 후속적인 투여량의 범위는 약 250 mg/m2 내지 약 1000 mg/m2 일 수 있다.
그러나, 상기에 언급된 바와 같이, 상기 제안된 양의 ABM 은 치료학적 측면으로 매우 신중해야 한다. 적절한 투여량을 선별하고 계획하는데 있어서 주요 요소는 상기에서 언급된 바와 같이 수득된 결과이다. 예를 들면, 비교적으로 고 투여량은 진행중이고 급발성인 질환 치료용으로 처음에 요구될 수 있다. 가장 효능있는 결과를 수득하기 위해, 질환 또는 장애에 따라, 안타고니스트는 질환 또는 장애의 첫번째 증상, 진단, 외형 또는 발생에 가능한 근접하여 투여되거나, 또는 질환 또는 장애의 완화 동안에 투여된다.
본 발명의 ABM 은 비경구, 피하, 복막내, 폐내 및 비강내를 포함하는 임의의 적합한 수단으로써, 국소 면역억제성 치료용으로 원하는 경우에는, 병변내 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복막내 또는 피하 투여를 포함한다. 게다가, 안타고니스는 맥박 주입, 예를 들면 안타고니스트의 투여량을 하락시키면서 적합하게 투여될 수 있다. 바람직하게는 투여는 주사, 가장 바람직하게는 정맥내 주사 또는 피하 주사로써 제공되고, 부분적으로 투여가 단기성 또는 만성인지에 의존한다.
기타 화합물, 예컨대 본원에서 안타고니스트와 함께 사이토킨, 세포 독성제, 화학요법제 및/또는 면역억제제와 같은 기타 화합물을 투여할 수 있다. 조합된 투여에는 분리된 제형물 또는 단일 약제학적 제형물을 사용한 공동투여 및 임의의 순서로의 연속 투여가 포함되며, 여기서 바람직하게는 양자(또는 모든) 활성제가 동시에 그것의 생물학적 활성을 발휘하는 시간의 기간이 존재한다.
치유를 달성하기 위해 요구되는 본 발명의 조성물의 투여량은 스케쥴 최적화로 더욱 감소될 수 있음이 분명하다.
본 발명의 실시에 따라, 약학적 담체는 지질 담체일 수 있다. 지질 담체는 인지질일 수 있다. 추가로, 지질 담체는 지방산일 수 있다. 또한 지질 담체는 계면활성제일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 계면활성제는 지질의 표면 장력을 변경, 일반적으로는 그것을 낮추는 임의의 물질이다.
본 발명의 한 실시예에서, 계면활성제는 비이온성 계면활성제일 수 있다. 비이온성 계면활성제의 예에는 이에 한정되지는 않지만, 폴리소르베이트 80 (또한 Tween 80 또는 (폴리옥시에틸렌소르비탄 모노올레이트), Brij, 및 Triton (예를 들면 Triton WR-1339 및 Triton A-20)이 포함된다.
대안적으로, 계면활성제는 이온성 계면활성제일 수 있다. 이온성 계면활성제의 예에는 이에 한정되지는 않지만 알킬트리메틸암모늄 브로마이드를 포함한다.
추가로, 본 발명에 따라, 지질 담체는 리포솜일 수 있다. 본 적용에서 사용된 바와 같이, "리포솜"은 본 발명의 임의 분자 또는 그의 조합물을 함유하는 소낭 결합의 임의의 막이다.
하기의 실시예는 본 발명을 더욱 자세히 설명한다. 하기의 제제 및 실시예는 당업자가 더 분명히 이해하고 본 발명을 실시할 수 있도록 제공된다. 본 발명은 그러나 실례가 되는 구현예에 의해 그 범위가 한정되지 않으며, 이는 본 발명의 단지 단일 국면의 설명으로써 의도된 것이며, 기능적으로 동등한 방법은 본 발명의 범위 내에 있다. 실제로, 본원에 기재된 것에 더하여 본 발명의 다양한 개정은 당업자에게는 상기의 설명 및 수반되는 도면으로부터 분명해질 것이다. 상기 개정은 첨가된 청구항의 범위 내에서 이르도록 의도된다.
[실시예]
[주의: 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 하기 실시예에서의 특정 아미노산 잔기 위치의 넘버링(numbering)은 Kabat 넘버링 시스템에 부합한다].
실시예 1
재료 및 방법
재조합 항체 B- Ly1 의 클로닝 및 발현
B-Ly1를 발현하는 하이브리도마 세포를 10% FBS 및 4 mM L-글루타민을 함유하는 RPMI 에서 증식시켰다. 생존능력 > 90% 인 6 x 106 개의 세포를 수확하고 총 RNA 를 Qiagen RNAeasy 미니 키트(midi kit)를 사용해 단리했다. B-Ly1 의 가변 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 cDNA를 RT-PCR로써 증폭시켰다. RT-PCR 반응을 하기 조건을 사용해 실시했다: 제 1 가닥 cDNA 합성용으로는 30 분 50 ℃; 15 분 95 ℃ 초기 변성; 30 주기의 1 분 94 ℃, 1 분 45 ℃, 1.5 분 72 ℃; 및 10분, 72 ℃ 에서 최종 연장(elongation) 단계. PCR 생성물의 기대되는 크기를 겔 전기영동으로써 확인했다. PCR 생성물을 적합한 대장균 벡터내로 클로닝하고, 유전자를 인코딩하는 가변 경쇄 및 중쇄가 단리되는 것을 DNA 서열로 확인했다.
키메라 B-Ly1 발현 벡터의 구축을 위해, 합성 시그널 서열 및 적절한 제한 부위를 추가의 PCR 반응으로써 가변쇄로 융합했다. 가변 쇄의 정확한 DNA 서열의 최종 확인 후에, 그것을 상응하는 인간 IgG1 불변 영역과 조합했다. 일단 유전자가 구축되면, 그것을 각 쇄에 하나씩 2 개의 상이한 벡터를 사용하고, MPSV 프로모터 및 상류의 합성 폴리A 부위의 통제하에서 클로닝하여, 플라스미드 pETR1808(중쇄 발현 벡터) 및 pETR1813(경쇄 발현 벡터)를 만들었다. 각 벡터는 EBV OriP 서열을 운반했다.
키메라 B-Ly1 을 칼슘 포스페이트-트랜스펙션 접근법을 사용해 벡터 pETR1808 및 pETR1813을 가진 HEK293-EBNA 세포를 공동-트랜스펙션하여 생산했다. 지수 성장기의 HEK293-EBNA 세포를 칼슘 포스페이트 방법으로써 트랜스펙션했다. 세포를 10% FCS 로 보완된 DMEM 배양 배지를 사용한 T 플라스크 내에서 점착성 단일층 배양으로서 키우고 그것이 50 내지 80% 융합성일 때 트랙스펙션했다. T75 플라스크의 트랜스펙션을 위해, 8백만 개의 세포를 트랜스펙션하기 24 시간 전에 FCS(10% V/V 최종), 250 ㎍/㎖ 네오마이신으로 보충된 DMEM 배양 배지 14 ㎖ 에서 심고, 세포를 5% CO2 분위기를 가진 인큐베이터에서 밤새 37℃로 놓았다. 트랜스펙션될 각각의 T75 플라스크 당, 동등하게 경쇄 및 중쇄 발현 벡터로 나눈 47 ㎍ 총 플라스미드 벡터 DNA, 235 ㎕ 의 1M CaCl2 용액을 혼합하고 물을 최종 부피 469 ㎕로 첨가함으로써, DNA, CaCl2 및 물의 용액을 제조했다. 상기 용액에, 469 ㎕ 의 50mM HEPES, 280 mM NaCl, pH 7.05 의 1.5 mM Na2HPO4 용액을 첨가하고 10 초 동안 즉시 혼합하고 20 초 동안 실온에 방치했다. 현탁액을 12 ㎖ 의 2% FCS 로 보충된 DMEM으로 희석하고, 기존 배지 대신하여 T75에 첨가했다. 세포를 37℃, 5% CO2 에서 약 17 내지 20 시간동안 인큐베이션시키고, 이어서 배지를 12 ㎖ DMEM, 10% FCS 로 대체했다. 비개질된 항체, "chB-Ly1"의 생산을 위해, 세포를 오직 항체 발현 벡터 pETR1808 및 pETR1813 을 비율 1:1 로하여 트랜스펙션하였다. 글리코엔지니어링된 항체인 "chB-Ly1-ge"의 생산을 위해, 각각 비율 4:4:1:1 로 항체 발현용 2개 (pETR1808 및 pETR1813), 융합 GnTⅢ폴리펩티드 발현용 1개(pETR1519), 및 만노시다아제II 발현용 1개(pCLF9)인 4개의 플라스미드로 세포를 공동트랜스펙션시켰다. 트랜스팩션후 5일째에, 상청액을 수확해 5 분 동안 1200 rpm 에서 원심분리한 후 10 분 동안 4000 rpm에서 두 번째 원심분리하고 4℃에서 유지했다.
3 개의 순차 크로마토그래프 단계인, 단백질 A 크로마토그래프, 양이온 교환 크로마토그래프 및 Superdex 200 컬럼(Amersham Pharmacia사) 상의 크기 배제 크로마토그래프 (완충액을 포스페이트 완충 염수로 교환하고 단량체성 항체 피크를 상기 마지막 단계에서 수집) 를 사용하여, chB-Ly1 및 chB-Ly1-ge 를 배양 상청액에서 정제했다. 항체 농축물을 분광광도계를 사용해 280 nm 에서 흡수도로부터 평가했다.
올리고사카라이드 분석
올리고사카라이드를 PNGaseF 소화에 의해 항체로부터 효소작용적으로 방출시키고, 이 때 상기 항체는 PVDF 막에 고정되거나 또는 용액 내에서 있었다.
방출된 올리고사카라이드를 함유하여 얻어진 소화 용액을 MALDI/TOF-MS 분석용으로 직접 제조하거나 MALDI/TOF-MS 분석용 샘플 제조 전에 EndoH 글리코시다아제로 추가로 소화시켰다.
PVDF 막-고정 항체용 올리고사카라이드 방출 방법
PVDF (Immobilon P, Millipore, Bedford Massachusetts) 막으로 만들어진 96 웰 플레이트의 웰을 100 ㎕ 의 메탄올으로 적시고 액체를 다중스크린 진공 매니폴드(Multiscreen vacuum manifold: Millipore, Bedford, Massachusetts)에 적용된 진공을 사용하여 PVDF 막을 통해 가져왔다. PVDF 막을 3회 300 ㎕ 물로 세척했다. 웰을 이어서 50 ㎕ RCM 완충액(8M 우레아, 360mM Tris, 3.2mM EDTA, pH 8.6)으로 세척했다. 30 내지 40 ㎍ 항체를 10 ㎕ RCM 완충액을 함유하는 웰에 로딩했다. 웰 내 액체를 진공을 적용시켜 막을 통해 끌어내고, 상기 막을 이어서 2 회 50 ㎕ RCM 완충액으로 세척했다. 디술파이드 가교의 환원을, RCM 내 50 ㎕ 의 0.1 M 디티오트레이톨을 첨가하고 1시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션시켜 실시했다.
환원 후에, 웰로부터 디티오트레이톨 용액을 제거하기 위해 진공을 적용시켰다. 웰을 RCM 완충액 중 50 ㎕ 0.1 M 요오도아세트산의 첨가 및 실온 어두운 곳에서 30 분간 인큐베이션시켜 시스테인 잔기를 카르복시메틸화하기 전에 3 회 300 ㎕ 물로 세척했다.
카르복시메틸화 후, 웰을 진공으로 가져오고 후속적으로 3 회 300 ㎕ 물로 세척했다. 이어서 엔도글리코시다아제의 흡수를 막기위해, 실온에서 1 시간 동안 1% 폴리비닐피롤리돈 360 수용액 100㎕ 를 인큐베이션시킴으로써 PVDF 막을 차단시켰다. 차단 시약을 이어서 온화한 진공(gentle vacuum) 으로써 제거한 후 3 회 300 ㎕ 물로 세척했다.
임의의 잠재 충전된(charged) 단당류 잔기를 제거하기 위해, 2.5 mU 펩티드-N-글리코시다아제 F (재조합체 N-글리카나아제, GLYKO, Novato, CA) 및 0.1 mU 시알리다아제(GLYKO, Novato, CA)를 첨가함으로써 20mM NaHCO3, pH7.0, 최종 부피 25 ㎕으로 N-결합된 올리고사카라이드를 방출시켰다. 소화작용을 3 시간 동안 37℃에서 실시했다.
용액 내 항체에 대한 올리고사카라이드 방출 방법
40 내지 50 ㎍ 의 항체를 최종부피 25 마이크로리터로 2mM Tris, pH7.0 중 2.5 mU PNGaseF(Glyko, U. S. A.)과 혼합하고, 혼합물을 3 시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다.
하이브리드 이분된 올리고사카라이드 구조의 MALDI / TOF - MS 중성 올리고사카라이드 피크로 할당되기 위한 PNGaseF-방출 올리고사카라이드의 엔도글리코시다아제 H 소화 사용
PGNaseF 방출 올리고사카라이드를 후속적으로 엔도글리코시다아제 H (EC 3.2.1.96) 로 소화시켰다. EndoH 소화를 위해, 15 mU 의 EndoH (Roche, 스위스)를 PNGaseF 소화물(상기 용액 방법 내 항체)로 첨가해 최중 부피 30 ㎕ 을 제공하고 혼합물을 3 시간 동안 37℃ 에서 인큐베이션시켰다. EndoH 는 N-연결된 올리고사카라이드의 키토바이오스(chitobiose) 코어의 N-아세틸글리코사민 잔기 사이를 절단한다. 상기 효소는 오직 올리고만노오스 및 대부분의 하이브리드 유형 글리칸을 소화할 수 있는 반면에 복합 유형 올리고사카라이드는 가수분해되지 않는다.
MALDI / TOF - MS 용 샘플 제조
방출된 올리고사카라이드를 함유하는 효소작용 소화물을 최종 농도 150 mM 로 아세트산 첨가 후에 실온에서 추가 3시간 동안 인큐베이션시키고, 후속적으로 마이크로-바이오-스핀 크로마토그래프 컬럼(BioRad, 스위스)에 패킹된 0.6 ㎖ 의 양이온 교환 수지(AG50W-X8 수지, 수소 형태, 100-200 메시, BioRad, 스위스)를 통해 통과시켜 양이온 및 단백질을 제거했다. 1 ㎕ 의 생성 시료를 스테인레스 스틸 표적 플레이트로 적용하고 플레이트 상에서 1 ㎕ 의 sDHB 매트릭스와 혼합했다. sDHB 매트릭스는 1 ㎖ 의 에탄올/10 mM 수성 나트륨 클로라이드 1:1(v/v) 내 2 mg 의 2,5-디히드록시벤조산 + 0.1 mg 의 5-메톡시살리실산을 용해함으로써 제조했다. 시료를 공기중 건조시키고 0.2 ㎕ 에탄올을 적용하고 시료를 최종적으로 공기 하에서 재결정화시켰다.
MALDI / TOF - MS
질량 스펙트럼을 수득하기 위해 사용한 MALDI-TOF 질량 분석기는 Voyager Elite(Perspective Biosystems)이었다. 이 기계는, 20 kV 의 가속 및 80 ns 의 지체(delay)와 함께 선형 배열로 조작되었다. 올리고사카라이드 표준을 사용한 외부 측정은 이온의 질량 할당(mass assignment)에 사용되었다. 200 레이저 쇼트로부터의 스펙트럼들을 종합하여 최종 스펙트럼을 수득하였다.
전혈 B 세포 고갈
건강한 공여자로부터의 495 ㎕ 헤파린화 혈액을 5 ㎖ 폴리스티렌 튜브에 분취하고, 5 ㎕ 100-배 농축시킨 항체 샘플을(1-1000 ng/㎖ 최종 농도) 또는 PBS 를 단독으로 첨가하고, 튜브를 37℃ 에서 인큐베이션시켰다. 24 시간 후 50 ㎕ 혈액을 새 튜브로 옮기고, 15 분 동안 어두운 실온에서 항-CD3-FITC, 항-CD19-PE 및 항-CD45-CyChrome (Becton-Dickinson)으로 염색하였다. 분석 전, 500 ㎕ FACS 완충액 (2% FCS 및 5 mM EDTA 함유 PBS)를 튜브에 첨가하였다. 혈액 샘플의 CD3-FITC 및 CD19-PE 형광을, CD45-CyChrome을 역치로 하여 유세포분석으로(flowcytometrically) 분석하였다. B 세포-고갈은 CD19+ B 세포 대 CD3+ T 세포 비율을 플롯하여 결정하였다.
Raji 세포에 항-CD20 항체의 결합
180 ㎕ FACS 완충액 (2% FCS 및 5 mM EDTA 함유 PBS) 중의 500.000 을 5 ㎖ 폴리스티렌 튜브에 옮기고 20 ㎕ 10 배 농축 항-CD20 항체 샘플(1-5000 ng/㎖ 최종 농도) 또는 PBS를 단독으로 첨가하고 튜브를 4℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서 샘플을 FACS 완충액으로 2회 세척하고, 300 × g 에서 3 분 동안 펠릿화하였다. 상청액을 흡인 제거하고, 세포를 100Φ1FACS 완충액 중에 넣고, 1 ㎕ 항-Fc-특정 F(ab')2-FITC 절편(Jackson Immuno Research Laboratories, USA)을 첨가하고 튜브를 4℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션시켰다. 샘플을 FACS 완충액으로 2 회 세척하고, 유세포분석에 의한 분석을 위해 0.5 ㎍/㎖ PI 함유 FACS 완충액에 500 ㎕ 에 넣었다. 결합은 항체 농도에 대해 기하 평균 형광을 플롯하여 결정하였다.
실시예 2
고 상동성 어셉터 ( acceptor ) 접근
고 상동성 항체 어셉터 프레임워크 조사는, 마우스 B-Ly1 단백질 서열을 인간 생식선 서열의 수합에 정렬시켜 가장 높은 서열 동일성을 보이는 인간 서열을 골라냄으로써 수행되었다. 여기서, VBase 데이터베이스로부터의 서열 VH1_10이 중쇄 프레임워크 수용체 서열로서 선택되었고, VK_2_40 서열이 경쇄에 대한 프레임워크 수용체로 선택되었다. 이러한 2 개의 수용체 프레임워크에, 마우스 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 상보성 결정영역 (CDR) 3 개를 이식시켰다. 프레임워크 4 영역이 생식선 V 유전자의 가변 영역의 일부가 아니기 때문에, 위치 정렬이 개별적으로 수행되었다. 중쇄로는 JH4 영역이, 경쇄로는 JK4 영역이 선택되었다. 디자인된 면역글로불린 도메인의 분자 모델링은, CDR 의 밖에 인간의 아미노산 잔기 대신에 쥐과동물의 아미노산 잔기를 잠재적으로 필요로 하는 하나의 스팟을 밝혀 내었다. 인간 프레임워크에 쥐과동물 아미노산 잔기를 재도입하는 것은 소위 역돌연변이를 일으킬 것이다. 예를 들어, Kabat 위치 27 에 있는 인간 어셉터 아미노산 잔기는 타이로신 잔기로 역돌연변이 되었다. 인간화 항체 변이체는 역돌연변이를 포함하거나 또는 생략하도록 디자인되었다. 인간화 항체 경쇄는 임의의 역돌연변이를 필요로 하지 않았다. 단백질 서열을 디자인 한 후, 이러한 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 하기와 같이 합성하였다.
혼합 프레임워크 접근
인간 어셉터 프레임워크의 결정적인 아미노산 잔기 위치(양호한 항원 결합 친화성 또는 항체 기능을 유지한는 데 결정적인)에 역돌연변이를 도입하는 것을 피하기 위해, 전체 프레임워크 영역 1 (FR1), 또는 프레임워크 영역 1(FR1) 및 2(FR2)가 함께, 천연 인간 생식선 서열의 중요한 위치에서 이미 공여자 잔기를 갖는 인간 항체 서열로 교체되거나 또는 기능적으로 동등한 것으로 교체될 수 있는지 알아보았다. 이러한 목적을 위해, 마우스 Bly1 서열의 VH 프레임워크 1 및 2를 인간 생식선 서열에 개별적으로 정렬시켰다. 여기서, 가장 높은 서열 동일성은 중요하지 않고, 어셉터 프레임워크를 선택하는데 사용되지 않았으나 대신 다수의 주요한 잔기의 매칭이 더 중요하게 고려되었다. 이러한 주요한 잔기는 잔기 24, 71 및 94 (Kabat 넘버링)가 포함되고, 또한 위치 27, 28, 및 30 (Kabat 넘버링) 에 있는 잔기를 포함되며, 이들은 Kabat 에 의한 CDR1 정의의 외부에 위치하지만 종종 항원 결합에 관여한다. IMGT 서열 VH_3_15 가 적합한 것으로 선택되었다. 단백질 서열을 디자인한 후, 이러한 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 하기와 같이 합성하였다. 이러한 접근을 사용하면, 양호한 수준의 항원 결합을 유지하기 위해, 경쇄 또는 중쇄에 역돌연변이가 필요하지 않았다.
항체 유전자의 합성
인간화 항체 V 영역의 아미노산 서열을 디자인 한 후, DNA 서열을 발생시켜야 했다. 개별적 프레임워크 영역의 DNA 서열 데이터를 인간 생식선 서열의 데이터베이스에서 찾았다. CDR 영역의 DNA 서열은 상응하는 쥐과동물 cDNA 데이터로부터 취했다. 이러한 서열로, 전체 DNA 서열을 실질적으로 어셈블리하였다. 이러한 DNA 서열 데이타를 가지고, 침묵 돌연변이 (silent mutation) 의 도입, 내부제한효소에 대한 제한 부위 생성에 의해 진단 제한 부위를 실질적인 서열에 도입하였다. 물리적 DNA 사슬을 수득하기 위해, 유전자 합성을 수행하였다(예, Wheeler 등 1995). 이 방법에서, 올리고뉴클레오티드를 관심유전자로부터 디자인하였는데, 일련의 올리고뉴클레오티드는 코딩 가닥으로부터 유도되고, 다른 하나의 일련의 올리고뉴클로에티드는 비(non)-코딩 가닥으로부터 유도된다. 각 올리고뉴클레오티드의 3' 및 5' 말단 (열에서 가장 처음 및 마지막을 제외) 은 항상 반대 가닥으로부터 유래된 2 개의 프라이머에 상보적인 서열을 보인다. 이러한 올리고뉴클레오티드를 임의의 열 안정성 중합효소에 적합한 반응 완충액에 넣고, Mg2 +, dNTP 및 DNA 중합효소를 첨가하면, 각 올리고뉴클레오티드가 그의 3' 말단에서부터 연장된다. 다음, 하나의 프라이머의 새로 형성된 3' 말단은 반대 가닥의 다음 프라이머에 어닐링되어, 템플레이트 의존성 DNA 사슬 신장에 적합한 조건 하에 추가로 그의 서열을 연장시킨다. 최종 생성물은 E. coli 에서의 증식을 위한 통상적인 벡터에 클로닝되었다.
항체 생성
표준 분자생물학 기술을 사용하여, 인간 중쇄 및 경쇄 선도 서열 (분비를 위한) 을 상기 가변 영역 서열의 상류에 첨가한 다음, 이것을 인간 IgG1 카파 불변 중쇄 및 경쇄 서열의 상류에 각각 연결시켰다. 상기 실시예 1 에 기술된 바와 같이, 생성 전체 항체 중쇄 및 경쇄 DNA 서열을, MPSV 프로모터 및 합성 폴리A 부위의 상류의 조절 하에 각각 EBV OriP 서열을 지니는 벡터인 포유류 발현 벡터들 (하나는 경쇄용, 하나는 중쇄용임) 로 서브클로닝 (subclone) 하였다. 항체를 상기 실시예 1 에 기술된 바와 같이 생성하였는데, 즉, HEK293-EBNA 를 포유류 항체 중쇄 및 경쇄 발현 벡터와 함께 공동트랜스펙션시키고, 트랜스펙션한 지 5 내지 7 일 후 조건화된 배양 배지를 수합하고, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 및 이어서 양이온 교환 크로마토그래피 및 최종적으로 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 분비된 항체를 정제하여, 순수한 단량체성 IgG1 항체를 단리하였다. 항체를 25 mM 인산칼륨, 125 mM 염화나트륨, pH 6.7의 100 mM 글리신 용액 중에 제형하였다. 인간화 항체 변이체의 글리코엔지니어링된 변이체를, 상기 실시예 1 에서 키메라 항체에 대해 기술된 바와 같이, GnT-Ⅲ 글리코실트랜스퍼라제 발현 벡터와 함께, 또는 GnT-Ⅲ 발현 벡터 + 골지 만노시다제 Ⅱ 발현벡터와 함께, 항체 발현 벡터를 공동트랜스펙션시켜 생성하였다. 글리코엔지니어링된 항체를 상기 비-글리코엔지니어링된 항체에 대해 상기에 기술된 바와 같이 정제 및 제형화하였다. 항체의 Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드를 하기와 같이 MALDI/TLF-MS로 분석하였다.
올리고사카라이드 분석
용액 내 항체에 대한 올리고사카라이드 방출 방법
40 내지 50 ㎍ 의 항체를, 최종 부피 25 ㎕ 로 pH 7.0, 2mM Tris 중의 2.5 mU 인 PNGaseF(Glyko, USA) 와 혼합시키고, 상기 혼합물을 37℃ 에서 3 시간 동안 인큐베이션시켰다.
MALDI / TLF - MS 용 샘플 제조
방출된 올리고사카라이드를 함유하는 효소 소화물을 최종 농도 150 mM 이 되도록 아세트산을 첨가한 후, 실온에서 추가로 3 시간 동안 인큐베이션시키고, 이어서, 이것을 마이크로-바이오-스핀 크로마토그래피 칼럼 (BioRad, 스위스) 에 패킹된 0.6 ㎖ 양이온 교환 수지 (AG50W-X8 수지, 수소 형태, 100-200 메쉬, BioRad, 스위스) 를 통해 통과시켜 양이온 및 단백질을 제거하였다. 생성 샘플 1 ㎕ 를 스테인레스 스틸 표적 플레이트에 적용하고, 플레이트 상에서 1 ㎕의 sDHB 매트릭스와 함께 혼합하였다. sDHB 매트릭스를, 2,5-디히드로벤조산 2 mg + 5-메톡시살리실산 0.1 mg 을 에탄올/10 mM 수성 염화나트륨 1:1(v/v) 1 ㎖ 에 용해시켜 제조하였다. 샘플을 공기 중에서 건조시키고, 0.2 ㎕ 에탄올을 적용하고, 최종적으로 공기 중에서 재결정화되도록 샘플을 방치하였다.
MALDI / TOF - MS
질량 스펙트럼을 수득하는데 사용된 MALDI-TOF 질량 분석기는 Voyager Elite(Perspective Biosystems)이었다. 상기 기계는, 20 kV 의 가속 및 80 ns 의 지체로 선형 배열로 조작되었다. 올리고사카라이드 표준을 사용한 외부 측정을 이온의 질량 할당에 사용하였다. 200 레이저 쇼트로부터의 스펙트럼들을 종합하여 최종 스펙트럼을 수득하였다.
항원 결합 어세이
상기 실시예 1 의 키메라 B-Ly1 항체에 대해 기술된 바와 같이 유세포분석-기재 어세이를 사용하여, 정제된 단량체성 인간화 항체 변이체를 Raji B-세포 림프종 표적 세포 상의 인간 CD20 과의 결합에 대해 시험하였다.
NK세포 및 FcγRⅢA-발현 CHO 세포주에 대한 단량체성 IgG1 글리코변이체의 결합
갓 단리된 말초혈액 단핵구 세포 (PBMC) 로부터 CD16- 및 CD56-양성 세포 (MACS 시스템, Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach/Germany) 가 풍부한 네거티브 선별을 하여 인간 NK 세포를 단리하였다. CD56 발현에 의해 결정된 순도는 88-95% 사이였다. 갓 단리된 NK 세포를 칼슘 및 마그네슘 이온(3 × 105 세포/㎖) 이 없는 PBS 에서 37℃ 에서 20 분 동안 인큐베이션시켜, NK 세포-결합 IgG를 제거하였다. 세포를 PBS, 0.1% BSA 중 상이한 농도 (0, 0.1, 0.3, 1, 3, 10 ㎍/㎖) 의 항-CD20 항체에서 106 세포/㎖ 로 인큐베이션시켰다. 수 차례의 세척 후, 1:200 FITC-컨쥬게이션된 F(ab')2 염소 항-인간, F(ab')2 특이적 IgG (Jackson Immune Research, West Grove PA/USA) 및 항-인간 CD-56 PE (BD Biosciences, Allschwil/Switzerland) 와 인큐베이션시켜 항체 결합을 검출하였다. 항-FcγRⅢA 3G8 F(ab')2 절편 (Ancell, Bayport, MN/USA) 을 10 ㎍/㎖의 농도로 첨가하여, 항체 글리코변이체(3 ㎍/㎖)의 결합을 경합시켰다. 결합된 항체 변이체를 나타내는 형광 강도를 FACSCalibur (BD Biosciences, Allschwil/Switzerland) 상에서 CD56-양성 세포에 대해 결정하였다. CHO 세포를, FcγRⅢA-Val158 α-사슬 및 γ-사슬을 인코딩하는 발현 벡터로 전기천공법 (280 V,950 μF, 0.4 cm) 에 의해 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션된 것을 6 ㎍/㎖ 푸로마이신을 첨가하여 선별하였고, 안정한 클론을 106 세포에 대해 10 ㎕ FITC-컨쥬게이션된 항-FcγRⅢ 3G8 단일클론 항체(BD Biosciences, Allschwil/Switzerland)를 사용하여 FACS 에 의해 분석하였다. IgG1의 FcγRⅢA-Val158-발현 CHO 세포에의 결합을 상기 기술된 NK 세포 결합과 유사하게 수행하였다.
ADCC 어세이
인간 말초혈액 단핵구 세포 (PBMC) 를 효과기 세포로 사용하였고, Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, M063178 USA) 를 사용하여, 본질적으로 제조업자의 설명에 따라 제조하였다. 간단히, 정맥혈을 지원자들로부터 헤파린화시킨 주사기로 취하였다. 혈액을 PBS(Ca++ 또는 Mg++ 미함유) 와 1 : 0.75 - 1.3 이 되도록 희석시키고, Histopaque-1077에 층으로 놓았다. 구배를 실온 (RT) 에서 400 × g 에서 30 분 동안 쉬지 않고 원심분리하였다. PBMC 를 함유하는 중간상을 수합하고, PBS (두 구배로부터 세포 당 50 ㎖) 로 세척하고, 실온에서 300 × g 에서 10 분 동안 원심분리하여 수확하였다. 펠렛을 PBS 로 재현탁시킨 후, PBMC 를 계수하고, 실온에서 200 × g 에서 10 분 동안 원심분리하여, 두 번째로 세척하였다. 다음, 후속한 과정을 위해 세포를 적절한 배지에 재현탁시켰다.
ADCC 어세이에 사용되는 효과기 대 표적의 비율은 PBMC 및 NK 세포에 대해 각각 25 : 1 및 10 : 1 이었다. 효과기 세포를 AIM-V 배지에서 적절한 농도로 제조하여, 둥근 바닥 96 웰 플레이트에 웰 당 50 ㎕ 로 첨가하였다. 표적 세포는 10% FCS 함유 DMEM 에서 배양된 인간 B 림프종 세포 (예, Raji 세포) 였다. 표적 세포를 PBS 중에서 세척, 계수하고, ㎖ 당 30 만 개로 AIM-V 에 재현탁시켜, 마이크로 웰 당 100 ㎕ 중에 30,000 개의 세포를 첨가하였다. 항체를 AIM-V 에 희석시키고, 미리-플레이트시킨 표적 세포에 50 ㎕ 로 첨가하고, 실온에서 10 분 동안 방치하여 표적에 결합하도록 하였다. 다음, 효과기 세포를 첨가하고, 플레이트를 5% CO2 함유 습한 대기 중 37℃에서 4 시간 동안 인큐베이션시켰다. 손상된 세포로부터 방출된 락테이트 디히드로게나제 (LDH) 를 세포독성 검출 키트 (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Switzerland) 를 사용하여 측정함으로써, 표적 세포 사멸을 평가하였다. 인큐베이션 4 시간 후, 플레이트를 800×g 에서 원심분리하였다. 각 웰의 100 ㎕ 상청액을 새로운 투명한 평바닥 96 웰 플레이트에 옮겼다. 키트의 색상 기질 완충액을 웰 당 100 ㎕ 첨가하였다. 색 반응의 Vmax 수치를, SOFTmax PRO 소프트웨어 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA94089, USA) 를 사용하는 ELISA 리더기 내 490 nm 에서 10 분 이상 측정하였다. 자발적인 LDH 방출을 표적 및 효과기 세포만 함유하고, 항체는 없는 웰에서 측정하였다. 최대 방출은 오직 표적 세포 및 1% Triton X-100 만을 함유하는 웰에서 측정되었다. 특정 항체-매개 살해 백분율을 하기와 같이 계산하였다 : ((x-SR)/(MR-SR)*100 (여기서, x 는 특정 항체 농도에서의 Vmax 평균이고, SR은 자발적인 방출의 Vmax 의 평균이고, MR은 최대 방출의 Vmax 의 평균임).
보체 의존성 세포독성 어세이
표적 세포를 계수, PBS 로 세척하고, AIM-V (Invitrogen) 에 ㎖ 당 1 백만 개의 세포로 재현탁시켰다. 평바닥 96 웰 플레이트에 웰 당 세포 50 ㎕ 를 플레이팅하였다. 항체 희석물을 AIM-V 중에서 제조하고, 세포에 50 ㎕ 로 첨가하였다. 항체가 세포에 결합하도록 10 분 동안 실온에 놔두었다. 인간 혈청 보체 (Quidel) 를 새로 해동시키고, AIM-V로 3-배 희석시키고, 웰 당 50 ㎕ 로 첨가하였다. 래빗 보체 (Cedarlane Laboratories) 를 제조업자 설명문에 따라 제조하고, AIM-V로 3 배 희석시키고, 웰 당 50 ㎕ 로 첨가하였다. 대조군으로서, 어세이 첨가 전에 보체원을 30 분 동안 56 ℃ 에서 가열하였다.
어세이 플레이트를 37 ℃ 에서 2 시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포의 살해를 LDH 방출을 측정함으로써 결정하였다. 간단히, 플레이트를 300×g 에서 3 분 동안 원심분리하였다. 웰 당 50 ㎕ 상청액을 새로운 96 웰 플레이트에 옮기고, 세포독성 키트 (Roche) 의 어세이 시약 50 ㎕ 를 첨가하였다. ELISA 리더기로 반응속도록적 (kinetic) 측정은 상청액 중의 LDH 농도에 상응하는 Vmax 를 결정하였다. 최대 방출을 1% Triton X-100의 존재 하에서 세포를 인큐베이션시킴으로써 결정하였다.
전혈 B-세포 고갈 어세이
항-CD20 항체에 의한 전혈에서의 정상 B-세포 고갈은 상기 실시예 1 에서 기술된 바와 같이 수행하였다.
세포자멸사 어세이
항체의 세포자멸 효력은 10 ㎍/㎖의 항체 (항원 결합에 대한 포화 조건) 를 표적 세포 (표적 세포 농도 5×105 세포/㎖) 와 밤새 (16 - 24 시간) 인큐베이션시켜 어세이하였다. 샘플을 AnnV-FITC로 염색하고, FACS로 분석하였다. 어세이를 3 중으로 수행하였다.
검출을, 아넥신 V 및 포스파티디 세린 (phosphatidy serine) 과 같은 세포자멸사 마커를 출현시켜 유세포분석에 의해 수행하였다. 음성 대조군 (세포자멸 유도되지 않음) 은 임의의 항체를 함유하지 않고, 오직 포스페이트 완충 식염수만 함유한다. 양성 대조군 (최대 세포자멸사) 은 강한 세포자멸사 유도체인 캄포테신 (Camptothecin, CPT) 5 μM 을 함유한다.
결과 및 토의
키메라 B-Ly1 경쇄 (상기 실시예 1 에 기술된 바와 같은 mVL) 또는 인간화 B-Ly1 경쇄(KV1)와 복합된 항체 변이체 B-HH1, B-HH2, B-HH3, 및 모 (parent), 키메라 항체 chB-Ly1 (상기 실시예 1 에서 기술됨) 과 인간 CD20 항원과의 결합을 비교하면, 모든 항체가 유사한 EC50 값을 가지나, B-HH1 구축물은 변이체 B-HH2 및 B-HH3에 비해 더 낮은 강도/화학양론으로 결합한다는 것을 나타낸다 (도 11). B-HH1 은 그의 부분적 인간 CDR1 및 CDR2 영역 (Kabat 정의) 뿐만 아니라, 위치 28 (Kabat 넘버링)에서의 Ala/Thr 다형성 (polymorphism) 에 의해, B-HH2 및 B-HH3 와구별될 수 있다. 이는, 위치 28, 완전 CDR1 및/또는 완전 CDR2의 어느 하나가 항체/항원 상호작용에 중요함을 가리킨다.
B-HL1, B-HH1, 및 키메라 chB-Ly1 모 항체의 비교는, B-HL1 구축물에는 임의의 결합 활성이 없음을 보여주고, B-Ly1 와 비교해 B-HH1 의 결합 강도/화학양론은 약 절반임을 보여준다 (도 12). B-HH1 뿐만 아니라 B-HL1 도 인간 VH1 클래스로부터 유도된 어셉터 프레임워크를 토대로 디자인된다. 기타 차이점 중, B-HL1 구축물의 위치 71 (Kabat 넘버링 ; Kabat 위치 71 은 SEQ ID NO:48 의 위치 72 에 상응함) 이 가장 차이가 나는데, 이는 항체 결합에 대한 그의 잠재적인 중요성을 나타낸다.
도 9 내지 13 의 항원 결합 데이터를 비교할 때, 테스트된 상이한 인간화 항체 변이체 중에서, BHH2-KV1, BHL8-KV1, 및 BHL11-KV1 변이체는, 인간 세포의 표면 상에 있는 인간 CD20 에 최고의 결합 친화성을 보여준다. 반면, B-HH2 및 B-HL8 와 B-HL11 사이에는, 모든 3 개의 CDR은 동일한 채 오직 FR1 및 FR2 영역에만 차이가 존재한다 (예를 들어, SEQ ID NO: 32, 56 및 60 을 비교, 여기서 넘버링은 Kabat 를 따르지 않았지만, 숙련자에 의해 쉽게 Kabat 넘버링될 수 있음). B-HL8 및 B-HL11은 인간 VH3 클래스 유래의 그의 FR1 및 FR2 서열을 가지나, 완전 B-HH2 프레임워크는 인간 VH1에서 유도된다. B-HL11은 단일 돌연변이 Glu1Gln (위치 1 은 Kabat 넘버링 및 서열 목록에서 사용하는 통상적인 넘버링 모두에서 동일함) 이 있는 B-HL8의 유도체이고, Gln 은 B-HH2 구축물의 아미노산 잔기이다. 이는, Glu1Gln 교환이 결합 친화성 또는 강도 모두를 변경시키지 않는다는 것을 의미한다. B-HH2 및 B-HL8 사이의 기타 차이점은 14 프레임워크 잔기인데, 이의 하나 이상은 본 항체의 항원 결합 거동에 영향을 줄 것이다.
B-HL4 구축물은, B-HH2의 FR1 을 인간 생식선 서열 VH1_45 의 것으로 대체함으로써 B-HH2 항체로부터 유도된다. 상기 구축물은, FR1 중의 오직 3 개의 위치에서 상이한 아미노산을 가짐에도 불구하고, 현저하게 감소된 항원 결합력을 나타낸다. 이러한 잔기는 위치 2, 14 및 30 에 위치한다 (Kabat 넘버링). 이 중에서, 위치 30 은, 그것이 CDR1 의 Chothia 정의의 일부이기 때문에, 영향력있는 위치이다. 도 9 내지 13 으로부터의 결합 곡선의 전체적인 분석은, 하기의 인간화 B-Ly1 중쇄 잔기(Kabat 넘버링)가 CD20:N35(Kabat CDR1의 말단), 전체 Kabat CDR1, 전체 Kabat CDR2 및 전체 Kabat CDR3, 잔기 A71 및 R94 (이 경우 R94는 트레오닌으로 대체될 수 없음) 및 Y27에의 결합에 중요함을 나타낸다. A28 및 S30 또한 더 적은 정도로 기여한다. 또한, Kabat CDR3 및 모든 규범적인 잔기는 항원 결합에 중요하다. 전체 Kabat CDR1, CDR2 및 CDR3 가 이식된 인간화 경쇄에 역돌연변이가 도입되지 않았다. 세포자멸사의 유도에서 (도 14, 15 및 21), 가장 강력한 변이체는 인간화 B-Ly1 변이체 BHH2-KV1(오리지날 chB-Ly1에 비해 훨씬 더 강력하고, 리툭시마브에 동일한 서열이 있는 항체 C2B8 보다 더 강력함) 이었다. 증가된 세포자멸사를 회복할 수 있는 기타 인간화 변이체 (BHL8 의 유도체) 는 : B-HL12 내지 B-HL17 (표 참고) 및 BHH8 (혼합 프레임워크) 및 BHH9 (하나의 역돌연변이가 있는 "혼합된 프레임워크", S30T) 이다. 위치 9 및 48 (Kabat 넘버링) 은 항원과 접촉할 수 있다. 변이체 BHH4 내지 BHH7 은 추가의 비-인간 서열을 도입하지 않은 기타 인간화 B-Ly1 변이체이다.
인간화 B-Ly1 항체의 중요한 특성은, 그것이 [Cragg, M.S 및 Glennie, M.J., Blood 103(7) : 2738 - 2743 (2004 년 4 월)] 에 정의된 유형 Ⅱ 항-CD20 항체라는 것이다. 따라서, 이는 CD20 에 결합하여도, CD20+ 인간 세포의 표면으로부터 CD20 의 비-이온성 계면활성제 추출 (이를 위해, [Polyak, M. J. 및 Deans, J. P., Blood 99(9): 3256-3262(2002)] 에 기술된 어세이를 사용함) 에 대한 임의의 분명한 내성을 유도하지 않았다. 이는 확실히 C2B8 항체 (리투시마브에 동일한 서열을 가지는 또다른 항-CD20 항체, Reff 에게 허여된 미국 특허 출판 번호 제 2003 0003097 호 참조) 보다 현저히 낮은, CD20 의 비-이온성 계면활성제 추출에 대한 내성을 유도하였다. 유형 Ⅱ 항-CD20 항체에서 기대되는 바와 같이, 인간화 B-Ly1 은 임의의 분명한 보체 매개 용해 활성을 가지지 않았고, 항-CD20 항체 C2B8 (리투시마브에 동일한 서열을 가진 키메라 IgG1) 보다는 확실히 더 많은 보체 매개 용해 활성을 가지지 않았다. 인간화 B-Ly1 항체의 또다른 중요한 특성은, 그것이 동형 응집 어세이 (homotypic aggregation assay) 에서 매우 강력하다는 것이었다. 상기 어세이에서 CD20-양성 인간 세포인 Daudi 세포를, Deans 참조 문헌에 자세히 설명된 바와 같이, 포유류 세포 인큐베이터 내 5% CO2 대기 중, 37℃ 에서 24 시간까지 세포 배양 배지에서, 1 ㎍/㎖ 농도의 항체 및 평행하게 5 ㎍/㎖ 농도의 항체와 인큐베이션시켰다. 비교로, 대조군, 세포의 평행 인큐베이션을, 항-CD20 항체 C2B8을 사용한 것을 제외하고 동일한 조건 하에 수행하였다. 인큐베이션 8 시간 및 24 시간을 포함하여 상이한 시점에서, 현미경을 사용하여 세포를 시각적으로 검사하였다. 인간화 B-Ly1 항체는 강한 동형 응집을 야기한다는 것을 발견하였는데, 여기서 상기 응집물은 C2B8 대조군 항체를 첨가하여 유도된 것보다 확실히 더 컸다. 또한, 항체가 항-CD20 유형 Ⅱ인 것과 일치하게, 이는 CD20-양성 인간 세포를 인간화 B-Ly1 항체와 인큐베이션시킬 때, 리투시마브와 동일한 서열을 가진 C2B8 키메라 IgG1 항체를 사용하여 동일한 조건 하에서 대조군과 비교하여, 더 높은 수준의 세포자멸사를 유도하였다.
인간화 항체의 글리코엔지니어링된 변이체를, 포유류 세포에서 항체 유전자와 함께 GnTⅢ 글리코실트랜스페라제를 공동발현시켜서 생성하였다. 이는, WO 2004/065540 에 기술된 바와 같이, 이분된 비푸코실화 올리고사카라이드를 포함하여 항체의 Fc 영역에 부착된 비푸코실화 올리고사카라이드의 분획을 증가시켰다 (도 17~19). 글리코엔지니어링된 항체는, 비-글리코엔지니어링된 항체 및 C2B8 항체에 비해, 인간 FcγRⅢ 수용체로의 확실히 더 높은 수준의 결합(도 20), 및 ADCC 활성을 가졌다 (도 16). 인간화 B-Ly1 항체는 또한 대조군 C2B8 항체보다 전혈 어세이에서 인간 B-세포 고갈의 유도에 있어서 더욱 강력하다 (도 16). 이는, 비-글리코엔지니어링된 B-Ly1 항체 및 글리코엔지니어링된 B-Ly1 항체 모두에 대해 사실이었다. 글리코엔지니어링된 항체는 전혈에서의 B-세포 고갈에 있어서, C2B8 대조군 항-CD20 항체보다 약 1000-배 더 강력했다. 이러한 비교는 비-글리코엔지니어링된 및 글리코엔지니어링된 인간화 형태의 B-Ly1 항체에 모두에 있어서 중요한데, 이는 ADCC, 보체 매개 파쇄, 세포자멸사 유도와 같은 Fc 수용체-의존성 활성을 조합한 어세이에서, B-Ly1의 두 형태 모두 극적으로 더 낮은 보체 매개 용해 활성을 가짐에도 불구하고, B-Ly1의 두 형태 모두 현저하게 C2B8 보다 더 강력했기 때문이었다. ADCC, Fc 수용체-의존성 세포 살해 활성 및 세포자멸사 유도는 이러한 인간화 B-Ly1 항체 변이체의 우수한 활성에 존재하였다. 또한, 세포자멸사 어세이에서 비-글리코엔지니어링된 및 글리코엔지니어링된 형태의 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체는 모두 강력하였는데, 이는 비-Fc-엔지니어링된 변이체보다 Fc-엔지니어링된 변이체의 Fcγ 수용체에 대한 증가된 결합 친화성이, 세포자멸사 유도에 있어서 훨씬 더 강력하고, 모든 변이체가 대조군 항체 C2B8 보다 확실히 더 강력했기 때문이다. 증강된 동형 응집 및 유형 Ⅱ 항-CD20 항체에 의해 매개된 세포자멸사 유도의 정확한 기작은 공지되지 않지만, Fc 감마 수용체와 같은 CD20-양성 세포의 표면 상의 다른 분자에의 동시적인 결합은 이러한 중요한 특성에 영향을 줄 수 있다. 따라서, FcγRⅢ를 포함하는 Fcγ 수용체에 대한 증가된 결합 친화성 및 ADCC 활성에서의 관련된 증가를 위해 Fc 영역에서 엔지니어링된 유형 Ⅱ의 항-CD20 항체가 비-Fc-엔지니어링된 것보다 더욱 더 강력한 세포자멸사 및 동형 응집을 유도할 수 있었음을 나타내는 것은 중요하다. 세포자멸사 유도는 생체 내에서 중요한데, 이는 표적 CD20-양성 세포가 발견될 수 있는 위치가 몸 속에 있으나, FcγRⅢ-양성 세포에의 접근이 혈액에서보다 어려운 위치에 있어서이고, 예를 들어 그러한 위치는 림프절이다. 이러한 위치에서, 항-CD20 항체 그 자체에 의한 세포자멸사의 유도는 B-세포 고갈 접근을 통해 비-호지킨 림프종 및 B-세포 만성 림프구성 백혈병과 같은 혈액 악성종양의 치료, 및 류마티스성 관절염 및 루푸스와 같은 자가면역성 질환 모두에 있어서, 인간에서의 항-CD20 항체 치료의 양호한 효과를 위해 중요할 수 있다. FcγRⅢ에 대한 증가된 결합 친화성 및 인간화, Fc-엔지니어링된 유형 Ⅱ 항-CD20 항체의 더 높은 ADCC 또한 이러한 치료에 매우 중요한 특성일 수 있다. 최종적으로, 인간화 및 Fc-엔지니어링된 변이체를 포함하여, 상기 유형 Ⅱ 항-CD20 항체의 감소된 또는 사소한 보체 매개 파쇄 활성 또한 중요한데, 이는 항-CD20 항체에 의한 더 높은 보체 활성이 증가된 바람직하지 않은 부작용과 관련되어있기 때문이다.
<110> GlycArt Biotechnology AG Umana, Pablo Bruenker, Peter Suter, Tobias Puentener, Ursula Moessner, Ekkehard Ferrara, Claudia <120> Antigen Binding Molecules with Increased Fc Receptor Binding Affinity and Effector Function <130> 1975.029PC01 <160> 78 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 112 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 1 Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys 1 5 10 15 Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Leu 20 25 30 Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp 35 40 45 Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr 50 55 60 Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln Leu Thr Ser Leu Thr 65 70 75 80 Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly 85 90 95 Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 100 105 110 <210> 2 <211> 336 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 2 ggacctgaac tggtgaagcc tggggcctca gtgaagattt cctgcaaagc ttctggctac 60 gcattcagtt actcttggat gaactgggtg 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Mouse-human chimeric polypeptide <400> 42 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser 20 25 30 Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 43 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse-human chimeric DNA <400> 43 caggtgcaat tggtgcagtc tggcgctgaa gttaagaagc ctggcgcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttccggata caccttcaca tacagctgga tgaactgggt gcggcaggcc 120 cctggacaag ggctcgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180 aatgggaaat tcaagggcag agtcacaatt accgccgaca aatccactag cacagcctat 240 atggagctga gcagcctgag 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Sequence <220> <223> Mouse-human chimeric DNA <400> 47 caggtgcaat tggtgcagtc tggcgctgaa gttaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttccggata caccttcacc tattcttgga tgcactgggt gcggcaggcc 120 cctggacaag ggctcgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180 gcacagaaat tccaaggaag agtcacaatg acacgggaca cgtccacttc caccgtctat 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagaaatgtc 300 tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357 <210> 48 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse-human chimeric polypeptide <400> 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Ser 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 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Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 59 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse-human chimeric DNA <400> 59 caggtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttggtcaagc ctggcgggtc cctgcggctc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacatttagc tattcttgga tgaactgggt gcggcaggct 120 cctggaaagg gcctcgagtg ggtgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180 aatgggaaat tcaagggcag agtcacaatt accgccgaca aatccactag cacagcctat 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagaaatgtc 300 tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357 <210> 60 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse-human chimeric polypeptide <400> 60 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly 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Artificial Sequence <220> <223> Mouse-human chimeric polypeptide <400> 62 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 63 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse-human chimeric DNA <400> 63 cggaattcgg cccaccggtg gccaccatgg actggacctg gaggatcctc ttcttggtgg 60 cagcagccac aggagctcac tccgaagtgc agctcgtcga gtctggagga ggcgtggtca 120 agcctggcgg gtccctgcgg ctctcctgcg cagcctctgg attcacattt agctattctt 180 ggatgaactg ggtgcggcag gctcctggaa agggcctcga gtgggtggga cggatctttc 240 ccggcgatgg ggatactgac tacaatggga aattcaaggg cagagtcaca attaccgccg 300 acaaatccac tagcacagcc tatatggagc tgagcagcct gagatctgag gacacggccg 360 tgtattactg tgcaagaaat gtctttgatg gttactggct tgtttactgg ggccagggaa 420 ccctggtcac cgtctcctca gctagcgaat tctcga 456 <210> 64 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse-human chimeric polypeptide <400> 64 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 65 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse-human chimeric DNA <400> 65 cggaattcgg cccaccggtg gccaccatgg actggacctg gaggatcctc ttcttggtgg 60 cagcagccac aggagctcac tccgaagtgc agctggtcga gtccggagga ggcttgaaga 120 agcctggcgg gtccctgcgg ctctcctgcg cagcctctgg attcacattt agctattctt 180 ggatgaactg ggtgcggcag gctcctggaa agggcctcga gtgggtggga cggatctttc 240 ccggcgatgg ggatactgac tacaatggga aattcaaggg cagagtcaca attaccgccg 300 acaaatccac tagcacagcc tatatggagc tgagcagcct gagatctgag gacacggccg 360 tgtattactg tgcaagaaat gtctttgatg gttactggct tgtttactgg ggccagggaa 420 ccctggtcac cgtctcctca gctagcgaat tctcga 456 <210> 66 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse-human chimeric polypeptide <400> 66 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Lys Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 67 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse-human chimeric DNA <400> 67 cggaattcgg cccaccggtg gccaccatgg actggacctg gaggatcctc ttcttggtgg 60 cagcagccac aggagcccac tccgaagtgc agctggtgga gtctggagga ggcttggtca 120 agcctggctc ttccctgcgg ctctcctgcg cagcctctgg attcacattt agctattctt 180 ggatgaactg ggtgcggcag gctcctggaa agggcctcga gtgggtggga cggatctttc 240 ccggcgatgg ggatactgac tacaatggga aattcaaggg cagagtcaca attaccgccg 300 acaaatccac tagcacagcc tatatggagc tgagcagcct gagatctgag gacacggccg 360 tgtattactg tgcaagaaat gtctttgatg gttactggct tgtttactgg ggccagggaa 420 ccctggtcac cgtctcctca gctagcgaat tctcga 456 <210> 68 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse-human chimeric polypeptide <400> 68 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 69 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse-human chimeric DNA <400> 69 cggaattcgg cccaccggtg gccaccatgg actggacctg gaggatcctc ttcttggtgg 60 cagcagccac aggagcccac tccgaagtgc agctggtgga gtctggagga ggcttggtca 120 agcctggcgg gtccctgcgg gtcagctgcg cagcctctgg attcacattt agctattctt 180 ggatgaactg ggtgcggcag gctcctggaa agggcctcga gtgggtggga cggatctttc 240 ccggcgatgg ggatactgac tacaatggga aattcaaggg cagagtcaca attaccgccg 300 acaaatccac tagcacagcc tatatggagc tgagcagcct gagatctgag gacacggccg 360 tgtattactg tgcaagaaat gtctttgatg gttactggct tgtttactgg ggccagggaa 420 ccctggtcac cgtctcctca gctagcgaat tctcga 456 <210> 70 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse-human chimeric polypeptide <400> 70 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 71 <211> 456 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse-human chimeric DNA <400> 71 cggaattcgg cccaccggtg gccaccatgg actggacctg gaggatcctc ttcttggtgg 60 cagcagccac aggagcccac tccgaagtgc agctggtgga gtctggagga ggcttggtca 120 agcctggcgg gtccctgcgg ctctcctgcg cagcctctgg attcacattt agctattctt 180 ggatgaactg ggtgcggcag gctcctggaa agggcctcga gtgggtggga cggatctttc 240 ccggcgatgg ggatactgac tacaatggga aattcaaggg cagagtcaca attaccgccg 300 acaaatccac tagcacagcc tatatggagc tgagcagcct gagatctgag gacacggccg 360 tgtattactg tgcaagaaat gtctttgatg gttactggct tgtttactgg ggccagggaa 420 ccctggtcac cgtctcctca gctagcgaat tctcga 456 <210> 72 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse-human chimeric polypeptide <400> 72 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 73 <211> 57 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 73 atggactgga cctggaggat cctcttcttg gtggcagcag ccacaggagc ccactcc 57 <210> 74 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser <210> 75 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse-human chimeric DNA <400> 75 gatatcgtga tgacccagac tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gcccgccagc 60 attagctgca ggtctagcaa gagcctcttg cacagcaatg gcatcactta tttgtattgg 120 tacctgcaaa agccagggca gtctccacag ctcctgattt atcaaatgtc caaccttgtc 180 tctggcgtcc ctgaccggtt ctccggatcc gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240 agcagggtgg aggctgagga tgttggagtt tattactgcg ctcagaatct agaacttcct 300 tacaccttcg gcggagggac caaggtggag atcaaacgta cggtg 345 <210> 76 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse-human chimeric polypeptide <400> 76 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val 115 <210> 77 <211> 66 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 77 atggacatga gggtccccgc tcagctcctg ggcctcctgc tgctctggtt cccaggtgcc 60 aggtgt 66 <210> 78 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Phe Pro Gly Ala Arg Cys 20

Claims (50)

  1. SEQ ID NO:32의 중쇄 가변 영역을 포함하는 인간화 유형 Ⅱ 항-CD20 항원 결합 분자 또는 그의 변이체로서, 상기 변이체는 카밧(Kabat) 시스템에 따라 넘버링된 잔기인 S16A, A24V, A28T, S30T, M34I, N35S 및 Y91L로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함하고, 상기 항원 결합 분자는 CD20-양성 인간 세포와 인큐베이션될 때, 동일한 조건 하에서 리툭시마브와 동일한 서열을 갖는 C2B8 키메라성 IgG1 항체를 사용한 대조군과 비교하여 더 높은 수준의 세포자멸사를 유도하는 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  2. SEQ ID NO:56의 중쇄 가변 영역을 포함하는 인간화 유형 Ⅱ 항-CD20 항원 결합 분자 또는 그의 변이체로서, 상기 변이체는 카밧(Kabat) 시스템에 따라 넘버링된 잔기인 E1Q, G9A, L11V, V12K, G16S, L20V, A24V, F27Y, T28A, S30T, N35S, V48M 및 Y91L로부터 선택된 하나 이상의 치환을 포함하고, 상기 항원 결합 분자는 CD20-양성 인간 세포와 인큐베이션될 때, 동일한 조건 하에서 리툭시마브와 동일한 서열을 갖는 C2B8 키메라성 IgG1 항체를 사용한 대조군과 비교하여 더 높은 수준의 세포자멸사를 유도하는 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 변이체가 Y91L 치환을 포함하는 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 변이체가 S16A 치환을 포함하는 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 변이체가 A24V 치환을 포함하는 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 변이체가 N35S 치환을 포함하는 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 변이체가 M34I 치환을 포함하는 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 변이체가 M34I 치환을 포함하는 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  9. 제 4 항에 있어서, 상기 변이체가 A28T 치환을 포함하는 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 변이체가 S30T 치환을 포함하는 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  11. 제 2 항에 있어서, 상기 변이체가 N35S 치환을 포함하는 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  12. 제 2 항에 있어서, 상기 변이체가 T28A 치환을 포함하는 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  13. 제 2 항에 있어서, 상기 변이체가 E1Q 치환을 포함하는 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  14. 제 2 항에 있어서, 상기 변이체가 V48M 치환을 포함하는 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 변이체가 G9A 치환을 포함하는 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  16. 제 14 항에 있어서, 상기 변이체가 L11V 치환을 포함하는 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  17. 제 14 항에 있어서, 상기 변이체가 V12K 치환을 포함하는 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  18. 제 14 항에 있어서, 상기 변이체가 G16S 치환을 포함하는 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  19. 제 14 항에 있어서, 상기 변이체가 L20V 치환을 포함하는 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항의 중쇄 가변 영역과 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  21. 제 20 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  22. 제 21 항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  23. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 인간화 유형 Ⅱ 항-CD20 항원 결합 분자 또는 그의 변이체의 제조 방법으로서, 상기 항원 결합 분자를 생성하도록 하는 조건 하에 제 22 항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 배양물로부터 상기 항원 결합 분자를 회수하는 단계를 포함하는 제조 방법.
  24. 제 22 항에 따른 숙주 세포에 의해 생성된, 인간화 유형 Ⅱ 항-CD20 항원 결합 분자.
  25. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자 또는 그의 변이체, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  26. 제 23 항에 따른 제조 방법에 의해 제조된 항원 결합 분자 또는 그의 변이체, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  27. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, B-세포 장애를 치료하기 위한 의약으로서 사용되는 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  28. 제 23 항에 따른 제조 방법에 의해 제조된 항원 결합 분자 또는 그의 변이체로서, B-세포 장애를 치료하는 의약으로서 사용되는 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  29. 제 27 항에 있어서, 상기 B-세포 장애가 B 세포 림프종인 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  30. 제 28 항에 있어서, 상기 B-세포 장애가 B 세포 림프종인 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  31. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 항원 결합 분자 또는 그의 변이체를 포함하는 약학적 조성물로서, B-세포 고갈에 의해 치료가능한 장애의 치료용 약학적 조성물.
  32. 제 23 항에 따른 제조 방법에 의해 제조된 항원 결합 분자 또는 그의 변이체를 포함하는 약학적 조성물로서, B-세포 고갈에 의해 치료가능한 장애의 치료용 약학적 조성물.
  33. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, B-세포 고갈에 의해 치료가능한 장애의 치료용 의약으로서 사용되는 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  34. 제 23 항에 있어서, B-세포 고갈에 의해 치료가능한 장애의 치료용 의약으로서 사용되는 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  35. 제 31 항에 있어서, 상기 장애는 혈액 악성종양 또는 자가면역성 질환인 약학적 조성물.
  36. 제 33 항에 있어서, 상기 장애는 혈액 악성종양 또는 자가면역성 질환인 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  37. 제 32 항에 있어서, 상기 장애는 혈액 악성종양 또는 자가면역성 질환인 약학적 조성물.
  38. 제 34 항에 있어서, 상기 장애는 혈액 악성종양 또는 자가면역성 질환인 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  39. 제 35 항 또는 제 37 항에 있어서, 상기 혈액 악성종양이 B-세포 림프종, 비-호지킨(Non-Hodgkin's) 림프종, 또는 B-세포 만성 림프구성 백혈병이고, 상기 자가면역성 질환이 류마티스성 관절염 또는 루푸스인 약학적 조성물.
  40. 제 36 항 또는 제 38 항에 있어서, 상기 혈액 악성종양이 B-세포 림프종, 비-호지킨(Non-Hodgkin's) 림프종, 또는 B-세포 만성 림프구성 백혈병이고, 상기 자가면역성 질환이 류마티스성 관절염 또는 루푸스인 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  41. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 분자가 글리코엔지니어링된 Fc 영역을 포함하는 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  42. 제 23 항에 따른 제조 방법에 의해 제조된 항원 결합 분자 또는 그의 변이체로서, 상기 항원 결합 분자가 글리코엔지니어링된 Fc 영역을 포함하는 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  43. 제 41 항에 있어서, 상기 항원 결합 분자가 상기 글리코엔지니어링된 Fc 영역에 부착된 비푸코실화 올리고사카라이드의 증가된 분획을 갖는 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  44. 제 42 항에 있어서, 상기 항원 결합 분자가 상기 글리코엔지니어링된 Fc 영역에 부착된 비푸코실화 올리고사카라이드의 증가된 분획을 갖는 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  45. 제 41 항에 있어서, 상기 항원 결합 분자가 상기 글리코엔지니어링된 Fc 영역에 부착된 이등분된 비푸코실화 올리고사카라이드의 증가된 분획을 갖는 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  46. 제 42 항에 있어서, 상기 항원 결합 분자가 상기 글리코엔지니어링된 Fc 영역에 부착된 이등분된 비푸코실화 올리고사카라이드의 증가된 분획을 갖는 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  47. 제 41 항에 있어서, 상기 항원 결합 분자가 비-글리코엔지니어링된 항원 결합 분자에 비해 인간 FcγRⅢ 수용체에 대해 현저히 더 높은 결합 수준을 갖는 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  48. 제 42 항에 있어서, 상기 항원 결합 분자가 비-글리코엔지니어링된 항원 결합 분자에 비해 인간 FcγRⅢ 수용체에 대해 현저히 더 높은 결합 수준을 갖는 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  49. 제 41 항에 있어서, 상기 항원 결합 분자가 비-글리코엔지니어링된 항원 결합 분자에 비해 현저히 더 높은 ADCC 활성 수준을 갖는 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
  50. 제 42 항에 있어서, 상기 항원 결합 분자가 비-글리코엔지니어링된 항원 결합 분자에 비해 현저히 더 높은 ADCC 활성 수준을 갖는 항원 결합 분자 또는 그의 변이체.
KR1020117027731A 2003-11-05 2004-11-05 증가된 ｆｃ 수용체 결합 친화성 및 효과기 기능을 가진 ｃｄ20 항체 KR101364902B1 (ko)

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