BR112020026384A2

BR112020026384A2 - Métodos para tratar um indivíduo com câncer de pulmão e para tratar um indivíduo com câncer de pulmão de pequenas células, kits, anticorpo anti-pd-l1 e composição

Info

Publication number: BR112020026384A2
Application number: BR112020026384-2A
Authority: BR
Inventors: Ariel Lopez-Chavez; Daniel Antonius Waterkamp
Original assignee: Genentech, Inc.
Priority date: 2018-06-23
Filing date: 2019-06-21
Publication date: 2021-03-30
Also published as: KR20210024550A; US20200030443A1; CN112585166A; MA52968A; EP3810653A1; CA3103017A1; SG11202012446UA; CL2020003357A1; TW202015730A; JP7399895B2; IL279548A; TWI819011B; MX2020014091A; AU2019288728A1; JP2021528438A; JP2024028867A; WO2019246557A1

Abstract

a presente divulgação fornece métodos para tratar câncer de pulmão (tal como câncer de pulmão de pequenas células, por exemplo, câncer de pulmão de pequenas células em estágio extensivo) em um indivíduo. os métodos compreendem administrar ao indivíduo um antagonista de ligação ao eixo pd-1 (tal como um anticorpo anti-pd-l1, por exemplo, atezolizumabe), um agente de platina (por exemplo, cisplatina ou carboplatina) e um inibidor da topoisomerase ii (por exemplo, etoposídeo).

Description

“MÉTODOS PARA TRATAR UM INDIVÍDUO COM CÂNCER DE PULMÃO E

PARA TRATAR UM INDIVÍDUO COM CÂNCER DE PULMÃO DE PEQUENAS CÉLULAS, KITS, ANTICORPO ANTI-PD-L1 E COMPOSIÇÃO”

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício dos Pedidos Provisórios dos EUA de nº 62/689.105, depositado em 23 de junho de 2018; 62/719.461, depositado em 17 de agosto de 2018; e 62/736.326, depositado em 25 de setembro de 2018; os conteúdos de cada um dos quais são incorporados neste documento por referência em sua totalidade.

APRESENTAÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS EM ARQUIVO DE TEXTO ASCII

[0002] O conteúdo da seguinte submissão em arquivo de texto ASCII é incorporado neste documento por referência em sua totalidade: uma forma legível por computador (CRF) da Listagem de Sequências (nome do arquivo: 146392044940SEQLIST.TXT, data registrada em 18 de junho de 2019, tamanho: 37 KB).

CAMPO

[0003] A presente divulgação refere-se a métodos para tratar cânceres pela administração de um antagonista de ligação ao eixo PD -1 (por exemplo, atezolizumabe) em combinação com um agente de platina (por exemplo, carboplatina) e um inibidor de topoisomerase II (por exemplo, etoposídeo).

ANTECEDENTES

[0004] O câncer de pulmão continua sendo a principal causa de mortes por câncer em todo o mundo; é o câncer mais comum em homens e foi responsável por aproximadamente 13% de todos os novos cânceres em 2008 (Jemal et al. (2011) CA Cancer J. Clin 61: 69-90). Em 2012, estimou-se que houve 313.000 novos casos de câncer de pulmão e

268.000 mortes por câncer de pulmão na Europa (GLOBOCAN (2012).

Incidência estimada de câncer: mortalidade e prevalência em todo o mundo em 2012. Disponível em: globocan(dot)iarc(dot)fr/Pages/fact_sheets_cancer.aspx.). Dados semelhantes dos Estados Unidos estimaram que haveria 221.200 n ovos casos de câncer de pulmão e 158,040 mortes por câncer de pulmão em 2015 (Siegel et al., (2015) CA Cancer J Clin, 65:5-29).

[0005] O câncer de pulmão de pequenas células (CPPC) é responsável por aproximadamente 13% de todos os casos de câncer de pulmão e se distingue do câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP) por seu rápido tempo de crescimento e desenvolvimento precoce de doença metastática (Govindan et al., (2006) J Clin Oncol, 24:4539-44).

Quase todos os casos de CPPC são atribuíveis ao tabagismo (Pesch et al.

(2012) Int J Cancer, 131:1210-9). Pacientes com CPPC frequentemente apresentam sintomas de doença metastática disseminada e podem apresentar deterioração clínica rápida; portanto, há necessidade de início rápido do tratamento para esses pacientes. Fatores de mau prognóstico para sobrevida em pacientes com CPPC incluem doença em estágio extensivo, baixo performance status, perda de peso e marcadores associados ao volume excessivo da doença (por exemplo, lactato desidrogenase) (Yip et al., (2000) Lung Cancer, 28:173- 85; Foster et al.

(2009) Cancer,115:2721-31.

[0006] Os pacientes com CPPC em estágio limitado podem ser tratados com quimioterapia e radiação com potencial de sobrevida tardia (Stinchcombe et al., (2010) Oncologist. 15:187-95). No entanto, a maioria (aproximadamente 70%) dos pacientes com CPPC são diagnosticados com doença em estágio extensivo (CPPC-EE), que tem perspectivas de sobrevida pobres (média de sobrevida global [SG] de aproximadamente 10 meses) (Socinski et al., (2009). J Clin Oncol.

27:4787-92.). Dor torácica, dispneia e tosse estão entre os sintomas mais frequentes relacionados à doença experimentados por pacientes com câncer de pulmão. A quimioterapia por si só pode aliviar os sintomas e prolongar a sobrevida de pacientes com CPPC-EE, porém a sobrevida tardia é rara (Johnson et al. (2004) Hematol Oncol Clin North Am. 18:309- 22; Demedts et al., (2010) Eur Respir J, 35:202-15).

[0007] A taxa de sobrevida relativa de cinco anos para pessoas com CPPC em estágio I é de aproximadamente 31%, no entanto, no estágio IV, a taxa de sobrevida relativa de cinco anos diminui para aproximadamente 2% (American Cancer Society; Taxas de Sobrevida de câncer de pulmão de pequenas células, por estágio: www(dot)cancer(dot)org/cancer/small-cell-lung-cancer/detection-diagnosis- staging/survival-rates(dot)html. Acessado em junho de 2018).

Consequentemente, existe uma necessidade na técnica de métodos para tratar câncer de pulmão, por exemplo, métodos que estendem a taxa de sobrevida.

[0008] Todas as referências citadas neste documento, incluindo os pedidos de patente, publicações de patentes, e números de acesso UniProtKB/Swiss-Prot são incorporadas aqui por referência em sua totalidade, como se cada referência individual fosse especificamente e individualmente indicada para ser incorporada por referência.

DESCRIÇÃO RESUMIDA

[0009] São fornecidos neste documento métodos e usos de um anticorpo anti-PD-L1 para tratar pacientes com câncer de pulmão. Em particular, os métodos e os usos são baseados em dados de um estudo clínico randomizado de Fase III de atezolizumabe (TECETRIQ®) em combinação com carboplatina e etoposídeo em indívudos com câncer de pulmão de pequenas células em estágio extensivo (CPPC-EE). O estudo demonstrou que o tratamento inicial (de primeira linha) com a combinação de TECENTRIQ ® (atezolizumabe) mais quimioterapia (carboplatina e etoposídeo) ajudou pessoas com câncer de pulmão de pequenas células em estágio extensivo (CPPC-EE) a viver significativamente mais tempo em comparação com a quimioterapia sozinha. A combinação baseada em TECENTRIQ também reduziu o risco de agravamento da doença ou morte (SLP) em comparação com a quimioterapia sozinha. A segurança para o TECENTRIQ e a combinação de quimioterapia pareceu consistente com o perfil de segurança conhecido dos medicamentos individuais, e nenhum novo sinal de segurança foi identificado com a combinação.

[0010] Em um aspecto, são fornecidos neste documento métodos para tratar um indivíduo com câncer de pulmão, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti -PD- L1, um agente de platina e um inibidor de topoisomerase II, em que o tratamento estende a sobrevida livre de progressão (SLP) do indivíduo. Em algumas modalidades, o tratamento estende a sobrevida global (SG) do indivíduo.

[0011] Em outro aspecto, são fornecidos neste documento métodos para tratar um indivíduo com câncer de pulmão, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-PD- L1, um agente de platina e um inibidor de topoisomerase II, em que o tratamento estende a sobrevida global (SG) do indivíduo (por exemplo, por pelo menos cerca de 0,5, 1, 1,25, 1,5, 1,75, 2, 2,25, 2,5, 2,75 ou 3 meses) em comparação a um indivíduo com câncer de pulmão que recebeu tratamento com um agente de platina e um inibidor de topoisomerase II.

Em algumas modalidades, o tratamento estende a SG, por exemplo, em pelo menos cerca de qualquer um de 10,5, 10,75, 11, 11,25, 11,5, 11,75, 12, 12,25, 12,5, 12,75, 13, 13,25, 13,5, 13,75 ou 14 meses. Em algumas modalidades, o tratamento estende a SG por mais de 14 meses, por exemplo, por cerca de 14,25, 14,5, 14,75, 15, 15,25, 15,5, 15,75 ou ma is de 15,75 meses. Em algumas modalidades, o tratamento estende a SG em cerca de 15,9 meses.

[0012] Em algumas modalidades, o tratamento estende a SLP do indivíduo em pelo menos cerca de 5 meses. Em algumas modalidades, o tratamento estende a SLP do indivíduo em pelo menos cerca de 5,2 meses. Em algumas modalidades, o tratamento estende a SLP do indivíduo em pelo menos cerca de 5,5 meses. Em algumas modalidades, o tratamento estende a SLP do indivíduo em pelo menos cerca de 5,6 meses. Em algumas modalidades, o tratamento estende a SLP do indivíduo em pelo menos cerca de 6 meses. Em algumas modalidades, o tratamento estende a SG do indivíduo em pelo menos cerca de 11 meses. Em algumas modalidades, o tratamento estende a SG do indivíduo em pelo menos cerca de 11,5 meses. Em algumas modalidades, o tratamento estende a SG do indivíduo em pelo menos cerca de 12 meses. Em algumas modalidades, o tratamento estende a SG do indivíduo em pelo menos cerca de 12,3 meses.

[0013] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada (V H) que compreende uma HVR-H1 compreendendo uma sequência de aminoácidos de GFTFSDSWIH (SEQ ID NO: 1), uma HVR-2 compreendendo uma sequência de aminoácidos de AWISPYGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), e uma HVR-3 compreendendo um aminoácido RHWPGGFDY (SEQ ID NO: 3), e (b) uma região variável de cadeia leve (V L) que compreende uma HVR-L1 compreendendo uma sequência de aminoácidos de RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 4), uma HVR-L2 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SASFLYS (SEQ ID NO: 5) e uma HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de QQYLYHPAT (SEQ ID NO: 6). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 compreende uma região variável de cadeia pesada (V H) compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve (V L) compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 é atezolizumabe.

[0014] Em algumas modalidades, o agente de platina é carboplatina ou cisplatina. Em algumas modalidades, o agente de platina é carboplatina. Em algumas modalidades, o inibidor de topoisomerase II é etoposídeo, teniposídeo, doxorrubicina, daunorrubicina, mitoxantrona, amsacrina, uma elipticina, ácido aurintricarboxílico ou HU-331. Em algumas modalidades, o inibidor de topoisomerase é etoposídeo. Em algumas modalidades, o agente de platina é carboplatina e o inibidor de topoisomerase II é etoposídeo.

[0015] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 é administrado a uma dose de 1200 mg, o agente de platina é administrado a uma dose suficiente para alcançar uma ASC = 5 mg/ml/min e o inibidor de topoisomerase II é administrado a uma dose de 100 mg/m 2. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1, o agente de platina e o inibidor de topoisomerase II são administrados em quatro ciclos de 21 dias, e em que o anticorpo anti-PD-L1 é administrado a uma dose de 1200 mg no dia 1, o agente de platina é administrado a uma dose suficiente para alcançar uma ASC = 5 mg/ml/min no dia 1 e o inibidor de topoisomerase II é administrado a uma dose de 100 mg/m 2 em cada um dos dias 1, 2 e 3 de cada ciclo de 21 dias para os ciclos 1 a 4. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- PD-L1 é ainda administrado após o ciclo 4, e em que o anticorpo anti -PD- L1 é administrado a uma dose de 1200 mg no dia 1 de cada ciclo de 21 dias para cada ciclo após o ciclo 4. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1, o agente de platina e o inibidor de topoisomerase II são administrados sequencialmente no dia 1 dos ciclos 1 a 4. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 é administrado antes do agente de platina e em que o agente de platina é administrado antes do inibidor de topoisomerase II no dia 1 dos ciclos 1 a 4.

[0016] Em algumas modalidades, o câncer de pulmão é câncer de pulmão de pequenas células (CPPC). Em algumas modalidades, o CPPC é CPPC em estágio extensivo (CPPC-EE). Em algumas modalidades, o indivíduo é sem exposição prévia ao tratamento para CPPC-EE. Em algumas modalidades, o indivíduo tem uma carga mutacional tumoral no sangue (bTMB) de pelo menos cerca de 10. Em algumas modalidades, o indivíduo tem uma bTMB de pelo menos cerca de

16. Em algumas modalidades, o câncer de pulmão metastizou para o cérebro. Em algumas modalidades, o câncer de pulmão metastizou para o fígado. Em algumas modalidades, o câncer de pulmão metastizou para a glândula adrenal. Em algumas modalidades, o câncer de pulmão metastizou para os gânglios linfáticos. Em algumas modalidades, o câncer de pulmão metastizou no pulmão (por exemplo, fora do local original da doença) ou no outro pulmão. Em algumas modalidades, o indivíduo tem pelo menos 65 anos de idade (por exemplo, entre cerca de 65 a cerca de 74 anos de idade, entre cerca de 75 a cerca de 84 anos de idade ou maior que cerca de 85 anos de idade). Em algumas modalidades, o indivíduo é PD-L1 negativo. Em algumas modalidades, o indivíduo é PD-L1 negativo se menos de 1% das células tumorais (CT) e/ou células imunes infiltrantes de tumor (CI) em uma amostra obtida a partir do indivíduo expressam PD - L1, por exemplo, de acordo com um ensaio descrito neste documento.

[0017] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1, o agente de platina e o inibidor de topoisomerase II são, cada um,

administrados por via intravenosa.

[0018] Em outro aspecto, são fornecidos neste documento métodos para tratar um indivíduo com câncer de pulmão de pequenas células em estágio extensivo (CPPC-EE), compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de atezolizumabe, carboplatina e etoposídeo, em que o atezolizumabe é administrado a uma dose de 1200 mg, a carboplatina é administrada a uma dose suficiente para alcançar uma ASC = 5 mg/ml/min, e o etoposídeo é administrado a uma dose de 100 mg/m 2, e em que o tratamento estende a sobrevida livre de progressão (SLP) e sobrevida global (SG) do indivíduo.

[0019] Em algumas modalidades, atezolizumabe, carboplatina e etoposídeo são administrados em quatro ciclos de 21 dias e o atezolizumabe é ainda administrado após o ciclo 4, em que atezolizumabe é administrado a uma dose de 1200 mg no dia 1 de cada ciclo de 21 dias dos ciclos 1 a 4, a carboplatina é administrada a uma dose suficiente para alcançar uma ASC = 5 mg/ml/min no dia 1 de cada ciclo de 21 dias dos ciclos 1 a 4, e o etoposídeo é administrado a uma dose de 100 mg/m 2 em cada um dos dias 1, 2 e 3 de cada ciclo de 21 dias para os ciclos 1 a 4; e em que o atezolizumabe é ainda administrado a uma dose de 1200 mg no dia 1 de cada ciclo de 21 dias para cada ciclo após o ciclo 4.

[0020] Em algumas modalidades, o tratamento estende a SLP do indivíduo em pelo menos cerca de 5 meses. Em algumas modalidades, o tratamento estende a SLP do indivíduo em pelo menos cerca de 5,2 meses. Em algumas modalidades, o tratamento estende a SLP do indivíduo em pelo menos cerca de 5,5 meses. Em algumas modalidades, o tratamento estende a SLP do indivíduo em pelo menos cerca de 5,6 meses. Em algumas modalidades, o tratamento estende a SLP do indivíduo em pelo menos cerca de 6 meses. Em algumas modalidades, o tratamento estende a SG do indivíduo em pelo menos cerca de 11 meses. Em algumas modalidades, o tratamento estende a SG do indivíduo em pelo menos cerca de 11,5 meses. Em algumas modalidades, o tratamento estende a SG do indivíduo em pelo menos cerca de 12 meses. Em algumas modalidades, o tratamento estende a SG do indivíduo em pelo menos cerca de 12,3 meses.

[0021] Em algumas modalidades, o indivíduo é sem exposição prévia ao tratamento para CPPC-EE. Em algumas modalidades, o indivíduo tem uma carga mutacional tumoral no sangue (bTMB) de pelo menos cerca de 10. Em algumas modalidades, o indivíduo tem uma bTMB de pelo menos cerca de 16. Em algumas modalidades, o CPPC-EE metastizou para o cérebro. Em algumas modalidades, o CPPC-EE metastizou para o fígado. Em algumas modalidades, o indivíduo tem pelo menos 65 anos de idade.

[0022] Em algumas modalidades, o atezolizumabe, a carboplatina e o etoposídeo são administrados sequencialmente no dia 1 de cada ciclo de 21 dias para os ciclos 1 a 4. Em algumas modalidades, o atezolizumabe é administrado antes da carboplatina, e em que a carboplatina é administrada antes do etoposídeo no dia 1 de cada ciclo de 21 dias para os ciclos 1 a 4. Em algumas modalidades, o atezolizumabe, a carboplatina e o etoposídeo são, cada um, administrados por via intravenosa.

[0023] Em algumas modalidades, o indivíduo é humano.

[0024] Em outro aspecto, são fornecidos neste documento kits compreendendo um anticorpo anti-PD-L1 para uso em combinação com um agente de platina e um inibidor de topoisomerase II para tratar um indivíduo com câncer de pulmão de acordo com qualquer um dos métodos acima e descritos neste documento. Também são fornecidos neste documento kits compreendendo atezolizumabe para uso em combinação com carboplatina e etoposídeo para tratar um indivíduo com câncer de pulmão de acordo com qualquer um dos métodos acima e descritos neste documento.

[0025] Em outro aspecto, é fornecido neste documento um anticorpo anti-PD-L1 para uso em um método para tratar câncer de pulmão em um indivíduo, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-PD-L1, um agente de platina, e um inibidor de topoisomerase II, em que o tratamento estende a sobrevida livre de progressão (SLP) e/ou sobrevida global (SG) do indivíduo. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 é para uso em um método de acordo com qualquer um dos métodos acima ou descritos neste documento.

[0026] Em outro aspecto, é fornecida neste documento uma composição compreendendo atezolizumabe para uso em um método para tratar câncer de pulmão de pequenas células em estágio extensivo (CPPC - EE), compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de atezolizumabe, carboplatina e etoposídeo, em que o atezolizumabe é administrado a uma dose de 1200 mg, a carboplatina é administrada a uma dose suficiente para alcançar uma ASC = 5 mg/ml/min, e o etoposídeo é administrado a uma dose de 100 mg/m 2, e em que o tratamento estende a sobrevida livre de progressão (SLP) e sobrevida global (SG) do indivíduo.

Em algumas modalidades, a composição é para uso em um método de acordo com qualquer um dos métodos acima ou descritos neste documento.

[0027] Deve ser entendido que uma, algumas, ou todas as propriedades das diferentes modalidades descritas acima e neste documento podem ser combinadas para formar outras modalidades da presente invenção. Estes e outros aspectos da invenção tornarão-se evidentes para um técnico no assunto. Estas e outras modalidades da invenção são ainda descritas pela descrição detalhada a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0028] O arquivo de pedido de patente ou patente contém pelo menos uma Figura executada em cor. As cópias desta patente ou publicação de pedido de patente com desenho(s) colorido(s) serão fornecidas pelo escritório mediante a solicitação e pagamento da taxa necessária.

[0029] A Figura 1 fornece um esquema do projeto de estudo do ensaio clínico descrito no Exemplo 1. O braço A incluiu 201 pacientes. O braço B incluiu 202 pacientes. PCI = irradiação craniana profilática. PD = progressão da doença.

[0030] A Figura 2 fornece um gráfico Kaplan-Meier da sobrevida global (SG) de pacientes no Braço A (atezolizumabe + carboplatina + etoposídeo) vs. Braço B (placebo + carboplatina + etoposídeo).

[0031] A Figura 3 fornece um gráfico Kaplan-Meier da sobrevida livre de progressão (SLP) de pacientes no Braço A (atezolizumabe + carboplatina + etoposídeo) vs. Braço B (placebo + carboplatina + etoposídeo).

[0032] A Figura 4 fornece uma comparação da taxa de resposta objetiva (ORR) e duração da resposta (DOR) em pacientes no Braço A, vs. Braço B, (CR = resposta completa; CR/PR = resposta completa/resposta parcial; SD = doença estável; PD = doença progressiva).

ORR e DOR foram avaliadas de acordo com os critérios RECIST v1.1.

[0033] A Figura 5A fornece um Forest Plot mostrando análises do subgrupo da SG em pacientes com vários fatores de risco da linha de base no Braço A (atezolizumabe + carboplatina + etoposídeo) vs.

Braço B (placebo + carboplatina + etoposídeo). (P = placebo; A = atezolizumabe). As médias foram estimadas a partir do método KM. Índices de perigo relativos a P + CE e os intervalos de confiança associados foram estimados usando regressão de Cox não estratificada. A metástase hepática foi baseada somente nas lesões alvo.

[0034] A Figura 5B também fornece um Forest Plot mostrando análises do subgrupo da SG em pacientes com vários fatores de risco da linha de base no Braço A (atezolizumabe + carboplatina + etoposídeo) vs.

Braço B (placebo + carboplatina + etoposídeo).

[0035] A Figura 6A fornece um Forest Plot mostrando análises do subgrupo da SLP em pacientes com vários fatores de risco da linha de base no Braço A (atezolizumabe + carboplatina + etoposídeo) vs.

[0036] A Figura 6B também fornece um Forest Plot mostrando análises do subgrupo da SLP em pacientes com vários fatores de risco da linha de base no Braço A (atezolizumabe + carboplatina + etoposídeo) vs.

Braço B (placebo + carboplatina + etoposídeo).

[0037] A Figura 7A fornece um gráfico Kaplan Meier da sobrevida global de pacientes com uma bTMB > 16 no Braço A (atezolizumabe + carboplatina + etoposídeo) vs. Braço B (placebo + carboplatina + etoposídeo).

[0038] A Figura 7B fornece um gráfico Kaplan Meier da sobrevida global de pacientes com uma bTMB < 16 no Braço A (atezolizumabe + carboplatina + etoposídeo) vs. Braço B (placebo + carboplatina + etoposídeo).

[0039] A Figura 8A fornece um gráfico Kaplan Meier da sobrevida global de pacientes com uma bTMB > 10 no Braço A (atezolizumabe + carboplatina + etoposídeo) vs. Braço B (placebo + carboplatina + etoposídeo).

[0040] A Figura 8B fornece um gráfico Kaplan Meier da sobrevida global de pacientes com uma bTMB < 10 no Braço A (atezolizumabe + carboplatina + etoposídeo) vs. Braço B (placebo + carboplatina + etoposídeo).

[0041] A Figura 9A fornece um gráfico Kaplan Meier da sobrevida livre de progressão de pacientes com uma bTMB > 16 no Braço A (atezolizumabe + carboplatina + etoposídeo) vs. Braço B (placebo + carboplatina + etoposídeo).

[0042] A Figura 9B fornece um gráfico Kaplan Meier da sobrevida livre de progressão de pacientes com uma bTMB < 16 no Braço A (atezolizumabe + carboplatina + etoposídeo) vs. Braço B (placebo + carboplatina + etoposídeo).

[0043] A Figura 10A fornece um gráfico Kaplan Meier da sobrevida livre de progressão de pacientes com uma bTMB > 10 no Braço A (atezolizumabe + carboplatina + etoposídeo) vs. Braço B (placebo + carboplatina + etoposídeo).

[0044] A Figura10B fornece um gráfico Kaplan Meier da sobrevida livre de progressão de pacientes com uma bTMB < 10 no Braço A (atezolizumabe + carboplatina + etoposídeo) vs. Braço B (placebo + carboplatina + etoposídeo).

[0045] A Figura 11A fornece um Forest Plot mostrando análises do subgrupo da SG em pacientes com vários fatores de risco da linha de base no Braço A (atezolizumabe + carboplatina + etoposídeo) vs.

Braço B (placebo + carboplatina + etoposídeo).

[0046] A Figura 11B fornece outro Forest Plot mostrando análises do subgrupo da SG em pacientes com vários fatores de risco da linha de base no Braço A (atezolizumabe + carboplatina + etoposídeo) vs.

Braço B (placebo + carboplatina + etoposídeo).

[0047] A Figura 11C fornece outro Forest Plot mostrando análises do subgrupo da SG em pacientes com vários fatores de risco da linha de base no Braço A (atezolizumabe + carboplatina + etoposídeo) vs.

Braço B (placebo + carboplatina + etoposídeo).

[0048] A Figura 12A fornece um gráfico Kaplan Meier da sobrevida livre de progressão de pacientes em BEP1 (População Avaliável Quanto ao Biomarcador 1) com níveis de expressão de PD-L1 <1% no Braço A (atezolizumabe + carboplatina + etoposídeo) vs. Braço B (placebo + carboplatina + etoposídeo).

[0049] A Figura 12B fornece um gráfico Kaplan Meier da sobrevida livre de progressão de pacientes em BEP2 (População Avaliável Quanto ao Biomarcador 2) com níveis de expressão de PD-L1 <1% no Braço A (atezolizumabe + carboplatina + etoposídeo) vs. Braço B (placebo + carboplatina + etoposídeo).

[0050] A Figura 13A fornece um gráfico Kaplan Meier da sobrevida global de pacientes em BEP1 (População Avaliável Quanto ao Biomarcador 1) com níveis de expressão de PD-L1 <1% no Braço A (atezolizumabe + carboplatina + etoposídeo) vs. Braço B (placebo + carboplatina + etoposídeo).

[0051] A Figura 13B fornece um gráfico Kaplan Meier da sobrevida global de pacientes em BEP2 (População Avaliável Quanto ao Biomarcador 2) com níveis de expressão de PD-L1 <1% no Braço A (atezolizumabe + carboplatina + etoposídeo) vs. Braço B (placebo + carboplatina + etoposídeo).

DESCRIÇÃO DETALHADA I. DEFINIÇÕES

[0052] Antes da invenção ser descrevida em detalhes, deve ser entendido que essa invenção não está limitada às composições particulares ou sistemas biológicos que podem, é claro, variar. Deve também ser compreendido que a terminologia usada neste documento é para o propósito de descrever somente modalidades particulares, e não se destina a ser limitante.

[0053] Tal como usado neste documento e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o(a)" incluem referentes plurais a menos que o contexto dite claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a "uma molécula" inclui opcionalmente uma combinação de duas ou mais de tais moléculas e similares.

[0054] O termo "cerca de", conforme usado no presente documento, refere-se à faixa de erro usual para o respectivo valor prontamente conhecido pelo técnico no assunto neste campo técnico. A referência a "cerca de" um valor ou parâmetro neste documento inclui (e descreve) modalidades que são direcionadas para esse valor ou parâmetro em si.

[0055] Entende-se que os aspectos e variações da divulgação descritos neste documento incluem "compreendendo", "consistindo" e "consistindo essencialmente em" aspectos e modalidades.

[0056] O termo “antagonista de ligação ao eixo PD-1” é uma molécula que inibe a interação de um parceiro de ligação ao eixo PD-1 com qualquer um ou mais do seu parceiro de ligação, de modo a remover a disfunção de células T, resultante da sinalização no eixo de sinalização PD- 1 – com um resultado que é para restaurar ou aperfeiçoar a função de células T (por exemplo, proliferação, produção de citocinas, morte de células alvo). Tal como usado neste documento, um antagonista de ligação ao eixo PD-1 inclui um antagonista de ligação ao PD-1, um antagonista de ligação ao PD-L1 e um antagonista de ligação ao PD-L2.

[0057] O termo "antagonista de ligação ao PD-1" refere-se a uma molécula que diminui, bloqueia, inibe, revoga ou interfere na transdução de sinal resultante da interação do PD-1 com um ou mais de seus parceiros de ligação, tal como PD-L1, PD-L2. Em algumas modalidades, um antagonista de ligação ao PD-1 é uma molécula que inibe a ligação de PD-1 a um ou mais de seus parceiros de ligação. Em um aspecto específico, o antagonista de ligação ao PD-1 inibe a ligação de PD- 1 ao PD-L1 e/ou PD-L2. Por exemplo, antagonistas de ligação ao PD-1 incluem anticorpos anti-PD-1, fragmentos de ligação a antígenos dos mesmos, imunoadesinas, proteínas de fusão, oligopeptídeos e outras moléculas que diminuem, bloqueiam, inibem, anulam ou interferem na transdução de sinal resultante a da interação de PD- 1 com PD-L1 e/ou PD- L2. Em uma modalidade, um antagonista de ligação ao PD-1 reduz o sinal coestimulatório negativo mediado por ou através de proteínas da superfície celular expresso em sinalização mediada por linfócitos T através de PD-1 de modo a tornar uma célula T disfuncional menos disfuncional (por exemplo, aumentando as respostas efetoras ao reconhecimento do antígeno). Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao PD-1 é um anticorpo anti-PD-1. Exemplos específicos de antagonistas de ligação ao PD-1 são fornecidos infra.

[0058] O termo "antagonista de ligação ao PD-L1" refere-se a uma molécula que diminui, bloqueia, inibe, revoga ou interfere na transdução de sinal resultante da interação do PD-L1 com um ou mais de seus parceiros de ligação, tal como PD-1, B7-1. Em algumas modalidades,

um antagonista de ligação ao PD-L1 é uma molécula que inibe a ligação de PD-L1 aos seus parceiros de ligação. Em um aspecto específico, o antagonista de ligação ao PD-L1 inibe a ligação de PD-L1 ao PD-1 e/ou B7-

1. Em algumas modalidades, os antagonistas de ligação ao PD-L1 incluem anticorpos anti-PD-L1, fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, imunoadesinas, proteínas de fusão, oligopeptídeos e outras moléculas que diminuem, bloqueiam, inibem, anulam ou interferem com a transdução de sinal resultante da interação de PD-L1 com um ou mais dos seus parceiros de ligação, tais como PD-1, B7-1. Em uma modalidade, um antagonista de ligação ao PD-L1 reduz o sinal coestimulatório negativo mediado por ou através de proteínas da superfície celular expressas em linfócitos T mediadas na sinalização através de PD-L1, de modo a tornar uma célula T disfuncional menos disfuncional (por exemplo, aperfeiçoando as respostas efetoras de reconhecimento de antígeno). Em algumas modalidades, um antagonista de ligação ao PD-L1 é um anticorpo anti-PD-L1. Exemplos específicos de antagonistas de ligação ao PD-L1 são fornecidos infra.

[0059] O termo "antagonista de ligação ao PD-L2" refere-se a uma molécula que diminui, bloqueia, inibe, revoga ou interfere na transdução de sinal resultante da interação do PD-L2 com um ou mais de seus parceiros de ligação, tal como PD-1. Em algumas modalidades, um antagonista de ligação ao PD-L2 é uma molécula que inibe a ligação de PD- L2 a um ou mais de seus parceiros de ligação. Em um aspecto específico, o antagonista de ligação ao PD-L2 inibe a ligação de PD-L2 ao PD-1. Em algumas modalidades, os antagonistas de ligação ao PD-L2 incluem anticorpos anti-PD-L2, fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, imunoadesinas, proteínas de fusão, oligopeptídeos e outras moléculas que diminuem, bloqueiam, inibem, revogam ou interferem na transdução de sinal resultante da interação de PD-L2 com um ou mais de seus parceiros de ligação, tal como PD-1. Em uma modalidade, um antagonista de ligação ao PD-L2 reduz o sinal coestimulatório negativo mediado por ou através de proteínas da superfície celular expressas em linfócitos T mediadas na sinalização através de PD-L2, de modo a tornar uma célula T disfuncional menos disfuncional (por exemplo, aperfeiçoando as respostas efetoras de reconhecimento de antígeno). Em algumas modalidades, um antagonista de ligação ao PD-L2 é uma imunoadesina.

[0060] "Resposta sustentada” refere-se ao efeito sustentado na redução do crescimento do tumor após a cessação de um tratamento.

Por exemplo, o tamanho do tumor pode permanecer igual ou menor em comparação com o tamanho no início da fase de administração. Em algumas modalidades, a resposta sustentada tem uma duração pelo menos igual à duração do tratamento, pelo menos 1,5X, 2,0X, 2,5X ou 3,0X o período da duração do tratamento.

[0061] O termo "formulação farmacêutica" refere-se a uma preparação que está em uma forma que permite que a atividade biológica do ingrediente ativo seja eficaz e que não contém componentes adicionais que são inaceitavelmente tóxicos para um sujeito ao qual a formulação seria administrada. Tais formulações são estéreis. Excipientes "farmaceuticamente aceitáveis" (veículos, aditivos) são aqueles que podem ser razoavelmente administrados a um sujeito mamífero para fornecer uma dose eficaz do ingrediente ativo empregado.

[0062] Conforme usado neste documento, o termo "tratamento" refere-se à intervenção clínica projetada para alterar o curso natural do indivíduo ou célula sendo tratada durante o curso da patologia clínica. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem a diminuição da taxa de progressão da doença, melhoria ou paliação do estado da doença e remissão ou melhora do prognóstico. Por exemplo, um indivíduo é "tratado"

com sucesso se um ou mais sintomas associados ao câncer forem mitigados ou eliminados, incluindo, mas não se limitando a, reduzir a proliferação (ou destruição) de células cancerosas, diminuir os sintomas resultantes da doença, aumentar a qualidade de vida de quem sofre da doença, diminuir a dose de outros medicamentos necessários ao tratamento da doença e/ou prolongar a sobrevida dos indivíduos.

[0063] Conforme usado no presente documento, "retardar a progressão de uma doença" significa adiar, impedir, atrasar, retardar, estabilizar e/ou adiar o desenvolvimento da doença (tal como o câncer).

Esse retardamento pode ser de duração variável, dependendo do histórico da doença e/ou do indivíduo a ser tratado. Como é evidente para um técnico no assunto, um retardamento suficiente ou significativo pode, com efeito, abranger a prevenção, na medida em que o indivíduo não desenvolve a doença. Por exemplo, um câncer em estágio avançado, tal como o desenvolvimento de metástases, pode ser retardado.

[0064] Uma "quantidade eficaz" é pelo menos a quantidade mínima necessária para efetuar uma melhoria mensurável ou prevenção de um distúrbio particular. Uma quantidade eficaz neste documento pode variar de acordo com fatores tais como o estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo e a capacidade do anticorpo de provocar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade eficaz é também aquela em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do tratamento são superados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Para uso profilático, os resultados benéficos ou desejados incluem resultados tais como eliminar ou reduzir o risco, diminuir a gravidade ou retardar o início da doença, incluindo sintomas bioquímicos, histológicos e/ou comportamentais da doença, suas complicações e fenótipos patológicos intermediários que se apresentam durante o desenvolvimento da doença. Para uso terapêutico, os resultados benéficos ou desejados incluem resultados clínicos, tais como diminuir um ou mais sintomas resultantes da doença, aumentar a qualidade de vida daqueles que sofrem da doença, diminuir a dose de outros medicamentos necessários para tratar a doença, aperfeiçoar o efeito de outro medicamento, tal como por meio de direcionamento, retardar a progressão da doença e/ou prolongar a sobrevida. No caso de câncer ou tumor, uma quantidade eficaz do fármaco pode ter o efeito de reduzir o número de células cancerígenas; reduzir o tamanho do tumor; inibir (ou seja, desacelerar até certo ponto ou desejavelmente parar) a infiltração de células cancerígenas nos órgãos periféricos; inibir (ou seja, desacelerar até certo ponto e desejavelmente parar) a metástase tumoral; inibir até certo ponto o crescimento tumoral; e/ou aliviar até certo ponto um ou mais dos sintomas associados ao distúrbio. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações. Para os fins desta invenção, uma quantidade eficaz de fármaco, composto ou composição farmacêutica é uma quantidade suficiente para realizar o tratamento profilático ou terapêutico, tanto diretamente ou indiretamente. Como é entendido no contexto clínico, uma quantidade eficaz de um fármaco, composto ou composição farmacêutica pode ou não ser alcançada em conjunto com outro fármaco, composto ou composição farmacêutica. Assim, uma "quantidade eficaz" pode ser considerada no contexto de administrar um ou mais agentes terapêuticos, e um único agente pode ser considerado administrado em uma quantidade eficaz se, em conjunto com um ou mais outros agentes, um resultado desejável puder ser ou é alcançado.

[0065] Conforme usado neste documento, "em conjunto com" refere-se à administração de uma modalidade de tratamento além de outra modalidade de tratamento. Como tal, "em conjunto com" refere-se à administração de uma modalidade de tratamento antes, durante ou após a administração da outra modalidade de tratamento ao indivíduo.

[0066] Um "distúrbio" é qualquer condição que se beneficiaria do tratamento, incluindo, mas não limitado a, distúrbios ou doenças crônicas e agudas, incluindo aquelas condições patológicas que predispõem o mamífero ao distúrbio em questão.

[0067] Os termos “doença proliferativa celular” e “distúrbio proliferativo” referem-se a distúrbios que estão associadas a algum grau de proliferação celular anormal. Em uma modalidade, o distúrbio da proliferação celular é câncer. Em uma modalidade, o distúrbio proliferativo celular é um tumor.

[0068] O termo "tumor", conforme usado neste documento, refere-se a todo crescimento e proliferação de células neoplásicas, malignas ou benignas, e todas as células e tecidos pré-cancerosos e cancerosos. Os termos “câncer”, “cancerígeno”, “doença proliferativa celular”, “distúrbio proliferativo” e “tumorais” não são mutuamente exclusivos, conforme referido neste documento.

[0069] Os termos “câncer” e “cancerígeno” referem-se ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é normalmente distinguida por crescimento celular desregulado. Exemplos de câncer incluem, mas não estão limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia ou malignidades linfoides. Exemplos mais particulares de tais cânceres incluem, mas não se limitando a, câncer de células escamosas (por exemplo, câncer de células escamosas epiteliais), câncer do pulmão incluindo câncer do pulmão de pequenas células, câncer de pulmão de células não pequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou do estômago, incluindo o câncer gastrintestinal e o câncer do estroma gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer do ovário, câncer do fígado, câncer da bexiga, câncer do trato urinário,

hepatoma, câncer da mama, câncer do cólon, câncer retal, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma de glândula salivar,

câncer renal ou dos rins, câncer de próstata, câncer vulval, câncer da tireoide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma peniano,

melanoma, melanoma de disseminação superficial, melanoma lentigo maligno, melanomas lentiginosos acrais, melanomas nodulares, mieloma múltiplo e linfoma de células B (incluindo linfoma não Hodgkin folicular/de baixo grau (LNH); LNH linfocítico pequeno (LP); LNH de grau intermediário/folicular; LNH difuso de grau intermediário; LNH imunoblástico de alto grau; LNH linfoblástico de alto grau; LNH de alto grau de pequenas células não clivadas; LNH de doença volumosa; linfoma de células do manto; linfoma relacionado à AIDS; e Macroglobulinemia de Waldenstrom);

leucemia linfocítica crônica (LLC); leucemia linfoblástica aguda (LLA);

leucemia de células cabeludas; leucemia mieloblástica crônica; e doença linfoproliferativa pós-transplante (DLPT), bem como proliferação vascular anormal associada a facomatoses, edema (tal como aquele associado a tumores cerebrais), síndrome de Meigs, câncer do cérebro,

bem como câncer da cabeça e pescoço e metástases associadas.

Em certas modalidades, cânceres que são susceptíveis de tratamento pelos anticorpos da invenção incluem câncer da mama, câncer colorretal, câncer retal, câncer do pulmão de células não pequenas, glioblastoma, linfoma não

Hodgkin (LNH), câncer de células renais, câncer da próstata, câncer do fígado, câncer do pâncreas, sarcoma de tecidos moles, sarcoma de kaposi,

carcinoma carcinoide, câncer da cabeça e pescoço, câncer do ovário,

mesotelioma e mieloma múltiplo.

Em algumas modalidades, o câncer é selecionado a partir de: câncer do pulmão de pequenas células,

glioblastoma, neuroblastomas, melanoma, carcinoma de mama, câncer gástrico, câncer colorretal (CCR) e carcinoma hepatocelular.

[0070] O termo "agente citotóxico", conforme usado neste documento, refere-se a qualquer agente que é prejudicial às células (por exemplo, causa a morte celular, inibe a proliferação ou de outra forma impede uma função celular). Os agentes citotóxicos incluem, mas não estão limitados a, isótopos radioativos (por exemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu); agentes quimioterápicos; agentes inibidores do crescimento; enzimas e fragmentos dos mesmos, tais como enzimas nucleolíticas; e toxinas tais como toxinas de pequenas moléculas ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes das mesmas. Os agentes citotóxicos exemplares podem ser selecionados a partir de agentes antimicrotúbulos, complexos de coordenação de platina, agentes alquilantes, agentes antibióticos, inibidores da topoisomerase II, antimetabólitos, inibidores da topoisomerase I, hormônios e análogos hormonais, inibidores da via de transdução de sinal, inibidores da angiogênese da tirosina quinase não receptora, agentes imunoterapêuticos, agentes pró-apoptóticos, inibidores de LDH-A, inibidores da biossíntese de ácidos graxos, inibidores da sinalização do ciclo celular, inibidores de HDAC, inibidores da proteassoma e inibidores do metabolismo do câncer.

Em uma modalidade o agente citotóxico é um taxano. Em uma modalidade, o taxano é paclitaxel ou docetaxel. Em uma modalidade, o agente citotóxico é um agente de platina. Em uma modalidade, o agente citotóxico é um antagonista de EGFR. Em uma modalidade, o antagonista de EGFR é N-(3- etinilfenil)-6,7-bis(2-metoxietoxi)quinazolin-4-amina (por exemplo, erlotinibe). Em uma modalidade, o agente citotóxico é um inibidor de RAF. Em uma modalidade, o inibidor de RAF é um inibidor de BRAF e/ou CRAF.

Em uma modalidade, o inibidor de RAF é vemurafenibe. Em uma modalidade, o agente citotóxico é um inibidor de PI3K.

[0071] “Agente quimioterápico” inclui compostos químicos úteis no tratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem erlotinibe (TARCEVA ®, Genentech/OSI Pharm,), bortezomibe (VELCADE®, Millennium Pharm.), dissulfiram, epigalocatequina galato, salinosporamida A, carfilzomibe, 17-AAG (geldanamicina), radicicol, lactato desidrogenase A (LDH-A), fulvestrant (FASLODEX ®, AstraZeneca), sunitibe (SUTENT®, Pfizer/Sugen), letrozole (FEMARA ®,Novartis), mesilato de imatinibe (GLEEVEC ®, Novartis), finasunato (VATALANIB ®, Novartis), oxaliplatina (ELOXATIN ®, Sanofi), 5-FU (5-fluorouracila), leucovorina, Rapamicina (Sirolimus, RAPAMUNE ®, Wyeth), Lapatinibe (TYKERB ®, GSK572016, Glaxo Smith Kline), Lonafamibe (SCH 66336), sorafenibe (NEXAVAR®, Bayer Labs), gefitinibe (IRESSA ®, AstraZeneca), AG1478, agentes alquilantes, tais como tiotepa e ciclosfosfamida CYTOXAN ®; sulfonatos de alquila, tais como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; aziridinas, tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilomelamina; acetogeninas (especialmente bullatacina e bullatacinona); uma camptotecina (incluindo topotecano e irinotecano); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesina); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); adrenocorticosteróides (incluindo prednisona e prednisolona); acetato de ciproterona; 5-redutases incluindo finasterida e dutasterida); vorinostate, romidepsina, panobinostat, ácido valpróico, dolastatina de mocetinostato; aldesleucina, talco duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW -2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictina; espongistatina; mostardas de nitrogênio, tais como clorambucila,

clomafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina,

cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina,

prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila; nitrosoureias, tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina e ranimnustina;

antibióticos, tais como os antibióticos do tipo enedina (por exemplo,

caliqueamicina, especialmente calicheamicina γ1I e calicheamicina ω1I

(Angew Chem.

Intl.

Ed.

Engl. 1994 33:183-186); dinemicina, incluindo dinemicina A; bifosfonatos, tais como clodronato; uma esperamicina; bem como cromóforo de neocarzinostatina e cromóforos antibióticos de cromoproteína do tipo enedina relacionados), aclacinomisinas, actinomicina,

authramicina, azasserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina,

caminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, daunorrubicina,

detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, ADRIAMYCIN® (doxorrubicina),

morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrubinorubicina, 2-

pirrubinorubicina, eubinorubicina, 2-pirrubinorubicinorubicina,

eubicinorubicina, eubinicorubicina, eubicinorubicina, eubinicorubicina,

eubinicina-doxorubicina, eubinicina-doxorubicina, eubicinocirubicina,

eubicinorubicina, eubicinoxorubicina e 2-pirrubinicina-doxorubicina),

marcelomicina, mitomicinas, tais como mitomicina C, ácido micofenólico,

nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina,

quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina,

ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabólitos, tais como metotrexato e

5-fluorouracila (5-FU); análogos de ácido fólico, tais como denopterina,

metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina;

andrógenos, tais como calusterona, propionato de dromostanolona,

epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenais, tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reforçador de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracila; amsacrina; bestrabucila; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfomitina; acetato de eliptínio; uma epotilona; etoglucida; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinan; lonidainina; maitansinóides, tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamnol; nitraerina; pentostatina; fenameto; pirarrubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etil-hidrazida; procarbazina; complexo de polissacarídeo PSK ® (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); razoxano; rizoxina; sizofurano; spirogermanium; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2''-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido (“Ara-C”); ciclofosfamida; tiotepa; taxóides, por exemplo, TAXOL (paclitaxel; Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE ® (sem cremóforo), formulações de nanopartículas de albumina projetadas com albumina de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Ill.) e TAXOTERE ® (docetaxel, doxetaxel; Sanofi-Aventis); clorambucila; GEMZAR® (gencitabina); 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina, tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; etoposídeo (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; NAVELBINE ® (vinorelbina); novantrona; teniposídeo; edatrexato; daunomicina; aminopterina; capecitabina (XELODA ®); ibandronato; CPT-11; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinóides, tais como ácido retinóico; e sais, ácidos e derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos anteriores.

[0072] O agente quimioterápico também inclui (i) agentes anti-

hormonais que atuam para regular ou inibir a ação do hormônio em tumores, tais como antiestrogênios e moduladores seletivos do receptor de estrogênio (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo NOLVADEX®; citrato de tamoxifeno), raloxifeno, droloxifeno, iodoxifeno, 4- hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxifeno, LY117018, onapristona e FARESTON® (citrato de toremifina); (ii) inibidores da aromatase que inibem a enzima aromatase, que regula a produção de estrogênio nas glândulas suprarrenais, tais como, por exemplo, 4(5)-imidazóis, aminoglutetimida, MEGASE® (acetato de megestrol), AROMASIN ® (exemestano; Pfizer), formestânio, fadrozol, RIVISOR ® (vorozol), FEMARA ® (letrozol; Novartis) e ARIMIDEX® (anastrozol; AstraZeneca); (iii) antiandrógenos, tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida e goserelina; buserelina, tripterelina, acetato de medroxiprogesterona, dietilestilbestrol, premarina, fluoximesterona, todo ácido transretiônico, fenretinida, bem como troxacitabina (um análogo da citosina do nucleosídeo de 1,3-dioxolano); (iv) inibidores da proteína quinase; (v) inibidores da quinase lipídica; (vi) oligonucleótidos antissenso, particularmente aqueles que inibem a expressão de genes nas vias de sinalização implicadas na proliferação celular aberrante, tais como, por exemplo, PKC-alfa, Ralf e H-Ras; (vii) ribozimas, tais como inibidores da expressão de VEGF (por exemplo, ANGIOZYME ®) e inibidores da expressão de HER2; (viii) vacinas, tais como vacinas de terapia genética, por exemplo, ALLOVECTIN ®, LEUVECTIN® e VAXID®; PROLEUKIN®, rIL-2; um inibidor de topoisomerase 1, tal como LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX ®; e (ix) sais, ácidos e derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos anteriores.

[0073] O agente quimioterápico também inclui anticorpos, tais como alemtuzumabe (Campath), bevacizumabe (AVASTIN®, Genentech); cetuximabe (ERBITUX®, Imclone); panitumumabe (VECTIBIX®, Amgen),

rituximabe (RITUXAN®, Genentech/Biogen Idec), pertuzumabe (OMNITARG®, 2C4, Genentech), trastuzumabe (HERCEPTIN®, Genentech), tositumomabe (Bexxar, Corixia), o conjugado de anticorpo e fármaco, gemtuzumabe ozogamicina (MYLOTARG®, Wyeth). Anticorpos monoclonais humanizados adicionais com potencial terapêutico como agentes em combinação com os compostos da invenção incluem: apolizumabe, aselizumabe, atlizumabe, bapineuzumabe, bivatuzumabe mertansina, cantuzumabe mertansina, cedelizumabe, certolizumabe pegol, cidfusituzumabe, cidtuzbalizumabe, efatulizumabe, efatulizumabe, erlizumabe, felvizumabe, fontolizumabe, gemtuzumabe ozogamicina, inotuzumabe ozogamicina, ipilimumabe, labetuzumabe, lintuzumabe, matuzumabe, mepolizumabe, motavizumabe, motovizumabe, natalizumabe, nimotuzumabe, nolovizumabe, numavizumabe, ocrelizumabe, omalizumabe, palivizumabe, pascolizumabe, pecfusituzumabe, pectuzumabe, pexelizumabe, ralivizumabe, ranibizumabe, reslivizumabe, reslizumabe, resyvizumabe, rovelizumabe, ruplizumabe, sibrotuzumabe, siplizumabe, sontuzumabe tetraxetano, tadocizumabe, talizumabe, tefibazumabe, tocilizumabe, toralizumabe, tucotuzumabe celmoleucina, tucusituzumabe, umavizumabe, urtoxazumabe, ustecinumabe, visilizumabe, e o anti- interleucina-12 (ABT-874/J695, Wyeth Research e Abbott Laboratories) que é um anticorpo IgG 1 λ de comprimento completo recombinante de sequência exclusivamente humana geneticamente modificado para reconhecer a proteína p40 da interleucina-12.

[0074] O agente quimioterápico também inclui os “inibidores de EGFR”, que referem-se aos compostos que se ligam ou de outra forma interagem diretamente com EGFR, e previnem ou reduzem a sua atividade de sinalização, e são alternativamente referidos como um “antagonista de EGFR”. Exemplos de tais agentes incluem anticorpos e pequenas moléculas que se ligam a EGFR. Exemplos de anticorpos que se ligam a EGFR incluem MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (vide Patente dos EUA de nº 4.943.533, Mendelsohn et al.) e variantes dos mesmos, tais como 225 quimerizado (C225 ou Cetuximabe; ERBUTIX ) e 225 humano com reformatado (H225) (vide, WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); IMC-11F8, um anticorpo direcionado a EGFR totalmente humano (Imclone); anticorpos que se ligam a EGFR mutante do tipo II (patente dos EUA de nº 5.212.290); anticorpos humanizados e quiméricos que se ligam a EGFR conforme descrito na patente dos EUA de nº

5.891.996; e anticorpos humanos que se ligam a EGFR, tais como ABX- EGF ou Panitumumabe (vide WO98/50433, Abgenix/Amgen); EMD 55900 (Stragliotto et al. Eur. J. Cancer 32A: 636-640 (1996)); EMD7200 (matuzumabe) um anticorpo EGFR humanizado dirigido contra EGFR que compete com EGF e TGF-alfa pela ligação de EGFR (EMD/Merck); anticorpo EGFR humano, HuMax-EGFR (GenMab); anticorpos totalmente humanos conhecidos como E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E6. 3 e E7.6. 3 e descritos em US 6.235.883; MDX-447 (Medarex Inc); e mAb 806 ou mAb 806 humanizado (Johns et al., J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004)). O anticorpo anti-EGFR pode ser conjugado com um agente citotóxico, assim, gerando um imunoconjugado (ver, por exemplo, EP659439A2, Merck Patent GmbH). Os antagonistas de EGFR incluem pequenas moléculas, tais como compostos descritos nas patentes dos EUA de nº: 5.616.582, 5.457.105, 5.475.001, 5.654.307, 5.679.683, 6.084.095,

6.265.410, 6.455.534, 6.521.620, 6.596.726, 6.713.484, 5.770.599,

6.140.332, 5.866.572, 6.399.602, 6.344.459, 6.602.863, 6.391.874,

6.344.455, 5.760.041, 6.002.008, e 5.747.498, bem como as seguintes publicações PCT: WO98/14451, WO98/50038, WO99/09016, e

WO99/24037. Antagonistas de EGFR de pequenas moléculas particulares incluem OSI-774 (CP-358774, erlotinibe, TARCEVA  Genentech/OSI farmaceuticals); PD 183805 (CI 1033, 2-propenamida, N-[4-[(3-cloro-4- fluorofenil)amino]-7-[3-(4-morfolinil)propóxi]-6-quinazolinil]-, dicloridrato, Pfizer Inc.); ZD1839, gefitinibe (IRESSA®) 4-(3’-Cloro-4’-fluoroanilino)-7- metóxi-6-(3-morfolinopropóxi)quinazolina, AstraZeneca); ZM 105180 ((6- amino-4-(3-metilfenil-amino)-quinazolina, Zeneca); BIBX-1382 (N8-(3-cloro- 4-fluoro-fenil)-N2-(1-metil-piperidin-4-il)-pirimido[5,4-d]pirimidina-2,8- diamina, Boehringer Ingelheim); PKI-166 ((R)-4-[4-[(1-feniletil)amino]-1H- pirrolo[2,3-d]pirimidin-6-il]-fenol); (R)-6-(4-hidroxifenil)-4-[(1-feniletil)amino]- 7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina); CL-387785 (N-[4-[(3-bromofenil)amino]-6- quinazolinil]-2-butinamida); EKB-569 (N-[4-[(3-cloro-4-fluorofenil)amino]-3- ciano-7-etóxi-6-quinolinil]-4-(dimetilamino)-2-butenamida) (Wyeth); AG1478 (Pfizer); AG1571 (SU 5271; Pfizer); inibidores duplos da tirosina quinase de EGFR/HER2, tais como lapatinibe (TiKERB®, GSK572016 ou N-[3-cloro-4- [(3 fluorofenil)metoxi]fenil]-6[5[[[2metilsulfonil)etil]amino]metil]-2-furanil]-4- quinazolinamina).

[0075] Os agentes quimioterapêuticos também incluem “inibidores da tirosina quinase”, incluindo os fármacos direcionados ao EGFR observados no parágrafo anterior; inibidor da tirosina quinase de pequenas moléculas de HER2, tal como TAK165 disponível da Takeda; CP- 724,714, um inibidor seletivo oral do receptor tirosina quinase ErbB2 (Pfizer e OSI); inibidores duplos de HER, tais como EKB-569 (disponível na Wyeth) que se liga preferencialmente ao EGFR, mas inibe tanto HER2 quanto células que superexpressam EGFR; lapatinibe (GSK572016; disponível na Glaxo-SmithKline), um inibidor oral da tirosina quinase de HER2 e EGFR; PKI-166 (disponível na Novartis); inibidores de pan-HER, tais como canertinibe (CI-1033; Pharmacia); Inibidores de Raf-1, tais como o agente antissenso ISIS-5132 disponível da ISIS Pharmaceuticals que inibe a sinalização de Raf-1; inibidores de TK não direcionados ao HER, tais como mesilato de imatinibe (GLEEVEC®, disponível na Glaxo SmithKline); inibidores da tirosina quinase multidirecionados, tais como sunitinibe (SUTENT®, disponível na Pfizer); inibidores da tirosina quinase do receptor de VEGF, tais como vatalanibe (PTK787/ZK222584, disponível na Novartis/Schering AG); Inibidor da quinase I regulado extracelular de MAPK CI-1040 (disponível na Pharmacia); quinazolinas, tais como PD 153035,4- (3-cloroanilino) quinazolina; piridopirimidinas; pirimidopirimidinas; pirrolopirimidinas, tais como CGP 59326, CGP 60261 e CGP 62706; pirazolopirimidinas, 4-(fenilamino)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidinas; curcumina (diferuloil metano, 4,5-bis(4-fluoroanilino)ftalimida); tirfostinas contendo frações de nitrotiofeno; PD-0183805 (Warner-Lamber); moléculas antissenso (por exemplo, aquelas que se ligam ao ácido nucleico que codifica HER); quinoxalinas (patente dos EUA de nº 5.804.396); trifostinas (patente dos EUA de nº 5.804.396); ZD6474 (Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); inibidores de pan-HER, tais como CI-1033 (Pfizer); Affinitac (ISIS 3521; Isis/Lilly); mesilato de imatinibe (GLEEVEC®); PKI 166 (Novartis); GW2016 (Glaxo SmithKline); CI-1033 (Pfizer); EKB-569 (Wyeth); semaxinibe (Pfizer); ZD6474 (AstraZeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); INC-1C11 (Imclone), rapamicina (sirolimus, RAPAMUNE®); ou conforme descrito em qualquer uma das seguintes publicações de patentes: patente dos EUA de nº 5.804.396; WO 1999/09016 (American Cyanamid); WO 1998/43960 (American Cyanamid); WO 1997/38983 (Warner Lambert); WO 1999/06378 (Warner Lambert); WO 1999/06396 (Warner Lambert); WO 1996/30347 (Pfizer, Inc); WO 1996/33978 (Zeneca); WO 1996/3397 (Zeneca) e WO 1996/33980 (Zeneca).

[0076] Os agentes quimioterápicos incluem dexametasona,

interferons, colchicina, metoprina, ciclosporina, anfotericina, metronidazol, alemtuzumabe, alitretinoína, alopurinol, amifostina, trióxido de arsênio, asparaginase, BCG vivo, bevacuzimabe, bexaroteno, cladribina, clofarabina, darbepoetina alfa, denileucina, dexrazoxano, epoetina alfa, elotinibe, filgrastim, acetato de histrelina, tiuxetano, interferon alfa -2a, interferon alfa-2b, lenalidomida, levamisol, mesna, metoxsalen, nandrolona, nelarabina, nofetumomabe, oprelvekin, palifermina, pamidronato, pegademase, pegaspargase, pegfilgrastim, pemetrexede dissódico, plicamicina, porfímero de sódio, quinacrina, rasburicase, sargramostim, temozolomida, VM-26, 6-TG, toremifeno, tretinoína, ATRA, valrubicina, zoledronato, e ácido zoledrônico, e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

[0077] Os agentes quimioterápicos também incluem hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, acetato de cortisona, pivalato de tixocortol, acetonida de triancinolona, álcool de triancinolona, mom etasona, amcinonida, budesonida, desonida, fluocinonida, acetonida de fluocinolona, betametasona, fosfato de sódio de betametasona, dexametasona, fosfato sódico de dexametasona, fluocortolona, hidrocortisona-17-butirato, hidrocortisona-17-valerato, dipropionato de aclometasona, valerato de betametasona, dipropionato de betametasona, prednicarbato, clobetasona - 17-butirato, clobetasol-17-propionato, fluocortolato, pivalato de fluocortolona e acetato de fluprednideno; peptídeos anti-inflamatórios imunosseletivos (ImSAIDs), tais como fenilalanina-glutamina-glicina (FEG) e sua forma D- isomérica (feG) (IMULAN BioTherapeutics, LLC); fármacos antirreumáticos, tais como azatioprina, ciclosporina (ciclosporina A), D-penicilamina, sais de ouro, hidroxicloroquina, leflunomideminociclina, sulfassalazina, bloqueadores do fator de necrose tumoral alfa (TNFα), tais como etanercepte (Enbrel), infliximabe (Remicade), adalimumabe (Humira),

certolizumabe pegol (Cimzia), golimumabe (Simponi), bloqueadores de interleucina 1 (IL-1), tais como anakinra (Kineret), bloqueadores da coestimulação de células T, tais como abatacepte (Orencia), bloqueadores de Interleucina 6 (IL-6), tais como tocilizumabe (ACTEMERA®);

bloqueadores de interleucina 13 (IL-13), tais como lebrikizumabe;

bloqueadores de interferon alfa (IFN), tais como rontalizumabe;

bloqueadores de integrina Beta 7, tais como rhuMAb Beta7; bloqueadores da via de IgE, tais como Anti-M1 prime; LTa3 homotrimérico segregado e bloqueadores do heterotrímero LTa1/β2 ligado à membrana, tais como antilinfotoxina alfa (LTa); isótopos radioativos (por exemplo, At211, I131, I125,

Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu);

agentes de investigação diversos, tais como tioplatina, PS-341, fenilbutirato,

ET-18-OCH3 ou inibidores da farnesiltransferase (L-739749, L-744832);

polifenóis, tais como quercetina, resveratrol, piceatanol, galato de epigalocatequina, teaflavinas, flavonóides, procianidinas, ácido betulínico e derivados dos mesmos; inibidores de autofagia, tais como cloroquina; delta-

9-tetra-hidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapachona; lapachol;

colchicina; ácido betulínico; acetilcamptotecina, escopolectina e

9-aminocamptotecina); podofilotoxina; tegafur (UFTORAL®); bexaroteno

(TARGRETIN®); bisfosfonatos, tais como clodronato (por exemplo,

BONEFOS® ou OSTAC®), etidronato (DIDROCAL®), NE-58095, ácido zoledrônico/zoledronato (ZOMETA®), alendronato (FOSAMAX®),

pamidronato (AREDIA®), tiludronato (SKELID®) ou risedronato

(ACTONEL®); e receptor do fator de crescimento epidérmico (EGF-R);

vacinas, tais como a vacina THERATOPE®; perifosina, inibidor de COX-2

(por exemplo, celecoxibe ou etoricoxibe), inibidor de proteossoma (por exemplo, PS341); CCI-779; tipifarnibe (R11577); orafenibe, ABT510;

inibidor de Bcl-2, tal como oblimersen de sódio (GENASENSE®);

pixantrona; inibidores da farnesiltransferase, tais como lonafarnibe (SCH 6636, SARASAR TM); e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos anteriores; bem como combinações de dois ou mais dos anteriores, tais como CHOP, uma abreviatura para uma terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisolona; e FOLFOX, uma abreviatura para um regime de tratamento com oxaliplatina (ELOXATINTM) combinado com 5-FU e leucovorina.

[0078] Os agentes quimioterápicos também incluem fármacos anti-inflamatórios não esteróides com efeitos analgésicos, antipiréticos e anti-inflamatórios. AINEs incluem inibidores não seletivos da enzima ciclo - oxigenase. Os exemplos específicos de AINEs incluem aspirina, derivados do ácido propiônico, tais como ibuprofeno, fenoprofeno, cetoprofeno, flurbiprofeno, oxaprozina e naproxeno, derivados do ácido acético, tais como indometacina, sulindac, etodolac, diclofenac, derivados de ácidos enólicos, tais como piroxicam, meloxicam, tenoxicam, droxicam, lornoxicam e isoxicam, derivados do ácido fenâmico, tais como ácido mefenâmico, ácido meclofenâmico, ácido flufenâmico, ácido tolfenâmico, e inibidores de COX-2, tais como celecoxibe, etoricoxibe, lumiracoxibe, parecoxibe, rofecoxibe, rofecoxibe, e valdecoxibe. AINEs podem ser indicados para o alívio sintomático de condições tais como artrite reumatoide, osteoartrite, artropatias inflamatórias, espondilite anquilosante, artrite psoriática, síndrome de Reiter, artrite gotosa aguda, dismenorreia, dor óssea metastática, dor de cabeça e enxaqueca, dor pós-operatória, dor ligeira a moderada devido a inflamação e lesão dos tecidos, pirexia, íleo, e cólica renal.

[0079] Um "agente inibidor de crescimento", quando usado neste documento, refere-se a um composto ou composição que inibe o crescimento de uma célula in vitro ou in vivo. Em uma modalidade, o agente inibidor de crescimento é um anticorpo inibidor de crescimento que previne ou reduz a proliferação de uma célula que expressa um antígeno ao qual o anticorpo se liga. Em outra modalidade, o agente inibidor de crescimento pode ser aquele que reduz significativamente a porcentagem de células na fase S. Exemplos de agentes inibidores do crescimento incluem agentes que bloqueiam a progressão do ciclo celular (em um local diferente da fase S), tais como agentes que induzem a detenção de G1 e a detenção da fase M. Bloqueadores da fase M clássicos incluem as vincas (vincristina e vinblastina), taxanos e inibidores da topoisomerase II, tais como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etoposídeo, e bleomicina. Os agentes que detém G1 também extravasam para a detenção da fase S, por exemplo, agentes alquilantes de DNA, tais como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracila e ara- C. Informações adicionais podem ser encontradas em Mendelsohn e Israel, eds., The Molecular Basis of Cancer, Capítulo 1, intitulado “Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs” por Murakami et al. (W.B.

Saunders, Philadelphia, 1995), por exemplo, p, 13. Os taxanos (paclitaxel e docetaxel) são fármacos anticancerígenos ambos derivados a partir da árvore de teixo. O docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), derivado do teixo europeu, é um análogo semissintético do paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Paclitaxel e docetaxel promovem a montagem de microtúbulos a partir de dímeros de tubulina e estabilizam os microtúbulos por prevenção da despolimerização, o que resulta na inibição da mitose nas células.

[0080] Por "terapia de radiação" entende-se o uso de raios gama direcionados ou raios beta para induzir danos suficientes a uma célula de modo a limitar sua capacidade de funcionar normalmente ou de destruir a célula por completo. Será apreciado que haverá muitas maneiras conhecidas na técnica para determinar a dosagem e a duração do tratamento. Os tratamentos típicos são dados como uma administração única e as dosagens típicas variam de 10 a 200 unidades (Grays) por dia.

[0081] Um "sujeito" ou um "indivíduo" para fins de tratamento refere-se a qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo humanos, animais domésticos e de fazenda, zoológico, esportes, ou animais de estimação, tais como cães, cavalos, gatos, vacas, etc. De preferência, o mamífero é humano.

[0082] O termo "anticorpo" deste documento é usado no sentido mais amplo e especificamente cobre anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento total), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos, desde que eles exibam a atividade biológica desejada.

[0083] Um anticorpo "isolado" é aquele que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Os componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que interfeririam na pesquisa, no diagnóstico ou no uso terapêutico do anticorpo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteicos ou não proteicos. Em algumas modalidades, um anticorpo é purificado (1) para mais de 95% em peso do anticorpo conforme determinado, por exemplo, pelo método de Lowry, e em algumas modalidades, para mais de 99% em peso; (2) em um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos N-terminal ou interna pelo uso de, por exemplo, um sequenador de copo giratório, ou (3) para homogeneidade por SDS- PAGE sob condições redutoras ou não redutoras usando, por exemplo, azul de Coomassie ou coloração de prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ nas células recombinantes, uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Normalmente, no entanto, o anticorpo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.

[0084] "Anticorpos nativos" são geralmente glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostas por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cade cadeia leve está ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfeto covalente, enquanto o número de ligações dissulfeto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isotipos de imunoglobulina. Cade cadeia pesada e leve também tem pontes dissulfeto intracadeia regularmente espaçadas.

Cade cadeia pesada tem em uma extremidade um domínio variável (V H) seguido por uma série de domínios constantes. Cade cadeia leve tem um domínio variável em uma extremidade (V L) e um domínio constante em sua outra extremidade; o domínio constante de cadeia leve está alinhado com o primeiro domínio constante de cadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve está alinhado com o domínio variável de cadeia pesada.

Acredita-se que resíduos de aminoácidos particulares formam uma interface entre os domínios variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada.

[0085] O termo "domínio constante" refere-se à porção de uma molécula de imunoglobulina tendo uma sequência de aminoácidos mais conservada em relação à outra porção da imunoglobulina, o domínio variável, que contém o local de ligação ao antígeno. O domínio constante contém os domínios C H1, CH2 e CH3 (coletivamente, CH) de cadeia pesada e o domínio CHL (ou CL) de cadeia leve.

[0086] A "região variável" ou "domínio variável" de um anticorpo refere-se aos domínios amino-terminais de cadeia pesada ou leve do anticorpo. O domínio variável de cadeia pesada pode ser referido como "VH". O domínio variável de cadeia leve pode ser referido como “V L". Esses domínios são geralmente as partes mais variáveis de um anticorpo e contêm os locais de ligação ao antígeno.

[0087] O termo "variável" refere-se ao fato de que certas porções dos domínios variáveis diferem extensivamente na sequência entre os anticorpos e são usadas na ligação e especificidade de cada anticorpo particular para seu antígeno particular. No entanto, a variabilidade não é uniformemente distribuída pelos domínios variáveis de anticorpos. Ela está concentrada em três segmentos denominados regiões hipervariáveis (HVRs), tanto nos domínios variáveis de cadeia leve como de cadeia pesada. As porções mais conservadas de domínios variáveis são chamadas de regiões framework (FR). Os domínios variáveis das cadeias pesadas e leves nativas compreendem, cada um, quatro FRs, amplamente adotando uma configuração de folha beta, conectada por três HVRs, que formam alças que conectam e, em alguns casos, formando parte da estrutura da folha beta. As HVRs em cada cadeia são mantidas juntas em estreita proximidade pelas regiões FR e, com as HVRs da outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação ao antígeno de anticorpos (vide Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)). Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, tais como a participação do anticorpo na toxicidade celular dependente de anticorpo.

[0088] As "cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) de qualquer espécie de mamífero podem ser atribuídas a um de dois tipos claramente distintos, chamados kappa ("κ") e lambda ("λ"), com base nas sequências de aminoácidos de seus domínios constantes.

[0089] O termo "isótipo" ou "subclasse" de IgG, conforme usado neste documento, significa qualquer uma das subclasses de imunoglobulinas definidas pelas características químicas e antigênicas de suas regiões constantes.

[0090] Dependendo das sequências de aminoácidos dos domínios constantes de suas cadeias pesadas, os anticorpos (imunoglobulinas) podem ser atribuídos a diferentes classes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias dessas podem ser ainda divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, e IgA 2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamados α, γ, ɛ, γ e µ, respectivamente. As estruturas de subunidades e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas e geralmente descritas em, por exemplo, Abbas et al., Cellular and Mol, Immunology, 4ª ed. (W.B. Saunders, Co., 2000). Um anticorpo pode ser parte de uma molécula de fusão maior, formada por associação covalente ou não covalente do anticorpo com uma ou mais outras proteínas ou peptídeos.

[0091] Os termos "anticorpo de comprimento total", "anticorpo intacto" e "anticorpo inteiro" são usados neste documento intercambiavelmente para referirem-se a um anticorpo em sua forma substancialmente intacta, e não fragmentos de anticorpo, conforme definido abaixo. Os termos referem-se particularmente a um anticorpo com cadeias pesadas que contêm uma região Fc.

[0092] Um "anticorpo nu" para os fins deste documento é um anticorpo que não é conjugado a uma fração citotóxica ou radiomarcador.

[0093] "Fragmentos de anticorpos" compreendem uma porção de um anticorpo intacto, de preferência, compreendendo a região de ligação ao antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, o fragmento de anticorpo descrito neste documento é um fragmento de ligação ao antígeno.

Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab') 2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpos de cadeia simples; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.

[0094] A digestão de anticorpos com papaína produz dois fragmentos de ligação ao antígeno idênticos, chamados fragmentos "Fab", cada um com um único local de ligação ao antígeno e um fragmento "Fc" residual, cujo nome reflete sua capacidade de cristalizar prontamente. O tratamento com pepsina produz um fragmento F(ab') 2 que tem dois locais de combinação de antígeno e ainda é capaz de reticular o antígeno.

[0095] “Fv” é o fragmento mínimo de anticorpo que contém um local de ligação ao antígeno completo. Em uma modalidade, uma espécie de Fv de duas cadeias consiste em um dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um de cadeia leve em associação não covalente forte. Em uma espécie de Fv de cadeia simples (scFv), um domínio variável de cadeia pesada e um de cadeia leve podem ser covalentemente ligados por um ligante de peptídeo flexível de tal modo que as cadeias leve e pesada possam se associar em uma estrutura "dimérica" análoga a de uma espécie de Fv de duas cadeias. É nesta configuração que as três HVRs de cada domínio variável interagem para definir um local de ligação ao antígeno na superfície do dímero VH-VL. Coletivamente, as seis HVRs conferem especificidade de ligação ao antígeno para o anticorpo. No entanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três HVRs específicas para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e ligar o antígeno, embora com uma afinidade mais baixa do que todo o local de ligação.

[0096] O fragmento Fab contém os domínios variáveis de cadeia pesada e leve e também contém o domínio constante de cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) de cadeia pesada. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no terminal carbóxi do domínio CH1 de cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab'-SH é a designação deste documento para Fab' em que o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes possuem um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab') 2 foram originalmente produzidos como pares de fragmentos Fab' que têm cisteínas de dobradiça entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos também são conhecidos.

[0097] Fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia simples" ou "scFv" compreendem os domínios VH e VL do anticorpo, em que esses domínios estão presentes em uma cadeia de polipeptídeo simples.

Geralmente, o polipeptídeo scFv compreende ainda um ligante de polipeptídeo entre os domínios VH e VL que permite que o scFv forme a estrutura desejada para ligação ao antígeno. Para uma revisão de scFv, vide, por exemplo, Pluckthün, em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315.

[0098] O termo "diacorpos" refere-se a fragmentos de anticorpos com dois locais de ligação ao antígeno, cujos fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH- VL). Ao usar um ligante que é muito curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois locais de ligação ao antígeno. Diacorpos podem ser bivalentes ou biespecíficos. Os diacorpos são descritos mais detalhadamente, por exemplo, em EP 404.097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-

134 (2003); e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993). Triacorpos e tetracorpos também são descritos em Hudson et al., Nat. Med., 9:129-134 (2003).

[0099] O termo "anticorpo monoclonal", conforme usado neste documento, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, por exemplo, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto para possíveis mutações, por exemplo, mutações de ocorrência natural, que podem estar presentes em pequenas quantidades. Assim, o modificador “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como não sendo uma mistura de anticorpos discretos. Em certas modalidades, tal anticorpo monoclonal inclui normalmente um anticorpo compreendendo uma sequência de polipeptídeo que se liga a um alvo, em que a sequência de polipeptídeo de ligação ao alvo foi obtida por um processo que inclui a seleção de uma única sequência de polipeptídeo de ligação ao alvo a partir de uma pluralidade de sequências de polipeptídeo. Por exemplo, o processo de seleção pode ser a seleção de um clone único de uma pluralidade de clones, tais como um agrupamento de clones de hibridoma, clones de fago ou clones de DNA recombinante. Deve ser entendido que uma sequência de ligação ao alvo selecionada pode ser ainda alterada, por exemplo, para melhorar a afinidade para o alvo, para humanizar a sequência de ligação ao alvo, para melhorar sua produção em cultura de células, para reduzir sua imunogenicidade in vivo, para criar um anticorpo multiespecífico, etc., e que um anticorpo compreendendo a sequência de ligação ao alvo alterada é também um anticorpo monoclonal desta invenção. Em contraste com as preparações de anticorpos policlonais, que normalmente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante em um antígeno. Além de sua especificidade, as preparações de anticorpos monoclonais são vantajosas por serem normalmente não contaminadas por outras imunoglobulinas.

[0100] O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a invenção podem ser feitos por uma variedade de técnicas, incluindo, por exemplo, o métod o de hibridoma (por exemplo, Kohler e Milstein, Nature, 256: 495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14(3):253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies:. A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª ed. 1988); Hammerling et al., em:. Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563- 681 (Elsevier, Nova Iorque, 1981)), métodos de DNA recombinante (vide, por exemplo, patente dos EUA de nº 4.816.567), tecnologias de exibição de fago (vide, por exemplo, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol.

338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); e Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004), e tecnologias para a produção de anticorpos humanos ou semelhantes a humanos em animais que têm partes ou todos os loci de imunoglobulina humana ou genes que codificam sequências de imunoglobulina humana (vide, por exemplo, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol, 7:33 (1993); patentes dos EUA de nº 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825;

5.625.126; 5.633.425; e 5.661.016; Marks et al., Bio/Technology 10:779-783

(1992); Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14:845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14:826 (1996); e Lonberg e Huszar, Intern.

Rev. Immunol. 13:65-93 (1995).

[0101] Os anticorpos monoclonais neste documento incluem especificamente anticorpos "quiméricos" nos quais uma porção de cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpos particular, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada (vide, por exemplo, patente dos EUA de nº 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851- 6855 (1984)). Os anticorpos quiméricos incluem anticorpos PRIMATTZED ® em que a região de ligação ao antígeno do anticorpo é derivada de um anticorpo produzido, por exemplo, pela imunização de primatas macacos com o antígeno de interesse.

[0102] As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) são anticorpos quiméricos que contêm uma sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Em uma modalidade, um anticorpo humanizado é uma imunoglobulina humana (anticorpo receptor) em que os resíduos de uma HVR do receptor são substituídos por resíduos de uma HVR de uma espécie não humana (anticorpo doador), tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano tendo a especificidade, afinidade e/ou capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos de FR da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Essas modificações podem ser feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e normalmente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as alças hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs são aquelas de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), normalmente a de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, vide por exemplo, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr, Op, Struct, Biol, 2:593-596 (1992). Vide também, por exemplo, Vaswani e Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol, 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc.

Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle e Gross, Curr. Op. Biotech, 5:428- 433 (1994); e patentes dos EUA de nº 6.982.321 e 7.087.409.

[0103] Um "anticorpo humano" é aquele que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde àquela de um anticorpo produzido por um humano e/ou foi feito usando qualquer uma das técnicas para a produção de anticorpos humanos conforme divulgado neste documento. Esta definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado compreendendo resíduos de ligação ao antígeno não humanos. Os anticorpos humanos podem ser produzidos usando várias técnicas conhecidas na técnica, incluindo bibliotecas de exibição de fago.

Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). Também estão disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos os métodos descritos em Cole et al.,

Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p, 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol, 147(1):86-95 (1991). Vide também van Dijk e van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001). Os anticorpos humanos podem ser preparados pela administração do antígeno a um animal transgênico que foi modificado para produzir tais anticorpos em resposta a um desafio antigênico, mas cujos locais endógenos foram desativados, por exemplo, xenocamundongos imunizados (vide, por exemplo, as patentes dos EUA de nº 6.075.181 e 6.150.584 em relação à tecnologia XENOMOUSE TM). Vide também, por exemplo, Li et al., Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) em relação a anticorpos humanos gerados por meio de uma tecnologia de hibridoma de células B humanas.

[0104] Um "anticorpo dependente de espécie" é aquele que tem uma afinidade de ligação mais forte para um antígeno de uma primeira espécie de mamífero do que tem para um homólogo desse antígeno de uma segunda espécie de mamífero. Normalmente, o anticorpo dependente de espécie "especificamente se liga" a um antígeno humano (por exemplo, tem um valor de afinidade de ligação (Kd) de não mais do que cerca de 1x10 -7 M, de preferência, não mais do que cerca de 1x10 -8 M e, de preferência, não mais do que cerca de 1x10 -9 M), mas tem uma afinidade de ligação para um homólogo do antígeno de uma segunda espécie de mamífero não humano que é pelo menos cerca de 50 vezes, ou pelo menos cerca de 500 vezes, ou pelo menos cerca de 1000 vezes, mais fraca do que sua afinidade de ligação para o antígeno humano. O anticorpo dependente de espécie pode ser qualquer um dos vários tipos de anticorpos conforme definidos acima, mas de preferência é um anticorpo humanizado ou humano.

[0105] O termo "região hipervariável", "HVR" ou "HV", quando usado neste documento, refere-se às regiões de um domínio variável de anticorpo que são hipervariáveis em sequência e/ou formam alças estruturalmente definidas. Geralmente, os anticorpos compreendem seis HVRs: três na VH (H1, H2, H3) e três na VL (L1, L2, L3). Em anticorpos nativos, H3 e L3 exibem a maior diversidade das seis HVRs, e acredita-se que H3 em particular desempenha um papel único em conferir especificidade precisa a anticorpos. Vide, por exemplo, Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson e Wu, em Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003). De fato, os anticorpos camelídeos de ocorrência natural que consistem em apenas uma cadeia pesada são funcionais e estáveis na ausência de cadeia leve. Vide, por exemplo, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996).

[0106] Uma série de delineamentos de HVR está em uso e é englobada neste documento. As regiões de determinação da complementaridade de Kabat (CDRs) são baseadas na variabilidade da sequência e são as mais comumente usadas (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Chothia refere-se, em vez disso, à localização das alças estruturais (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196:901- 917 (1987)). As HVRs de AbM representam um compromisso entre as HVRs de Kabat e as alças estruturais de Chothia, e são usadas pelo software de modelagem de anticorpos AbM da Oxford Molecular. As HVRs de “contato” são baseadas em uma análise das estruturas cristalinas complexas disponíveis. Os resíduos de cada uma dessas HVRs são indicados abaixo. Alça Kabat AbM Chothia Contato L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36

L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (numeração de Kabat) H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (numeração de Chothia) H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101

[0107] HVRs podem compreender "HVRs estendidas" da seguinte forma: 24-36 ou 24-34 (L1), 46-56 ou 50-56 (L2) e 89-97 ou 89-96 (L3) na VL e 26-35 (H1), 50-65 ou 49-65 (H2) e 93-102, 94-102, ou 95-102 (H3) na VH. Os resíduos do domínio variável são numerados de acordo com Kabat et al., supra, para cada uma destas definições.

[0108] HVRs podem compreender "HVRs estendidas" da seguinte forma: 24-36 ou 24-34 (L1), 46-56 ou 50-56 (L2) e 89-97 ou 89-96 (L3) na VL e 26-35 (H1), 50-65 ou 49-65 (H2) e 93-102, 94-102, ou 95-102 (H3) na VH. Os resíduos do domínio variável são numerados de acordo com Kabat et al., supra, para cada uma destas definições.

[0109] Resíduos de "Framework" ou "FR" são aqueles resíduos de domínio variável que não sejam os resíduos de HVR, conforme definido neste documento,

[0110] Os termos "numeração de resíduo de domínio variável como em Kabat" ou "numeração da posição de aminoácidos como em Kabat" e variações dos mesmos referem-se ao sistema de numeração usado para domínios variáveis de cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve da compilação de anticorpos em Kabat et al., supra. Usando este sistema de numeração, a sequência de aminoácidos linear real pode conter menos ou mais aminoácidos correspondentes a um encurtamento de, ou inserção em, uma FR ou HVR do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incluir uma única inserção de aminoácido (resíduo 52a de acordo com Kabat) após o resíduo 52 de H2 e resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b e 82c, etc. de acordo com Kabat) após o resíduo 82 de FR de cadeia pesada. A numeração de Kabat de resíduos pode ser determinada para um determinado anticorpo por alinhamento em regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência numerada de Kabat "padrão".

[0111] O sistema de numeração de Kabat é geralmente usado quando refere-se a um resíduo no domínio variável (aproximadamente resíduos 1-107 de cadeia leve e resíduos 1-113 de cadeia pesada) (por exemplo, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5ª ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). O "sistema de numeração da UE" ou "índice da UE" é geralmente usado quando refere-se a um resíduo em uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina (por exemplo, o índice da UE relatado em Kabat et al., supra). O “índice da EU como em Kabat” refere-se à numeração de resíduos do anticorpo de IgG1 humano da UE.

[0112] A expressão "anticorpos lineares" refere-se aos anticorpos descritos em Zapata et al. (1995 Protein Eng, 8(10):1057-1062).

Em suma, esses anticorpos compreendem um par de segmentos Fd em tandem (VH-CH1-VH-CH1) que, juntamente com polipeptídeos de cadeia leve complementares, formam um par de regiões de ligação ao antígeno.

Os anticorpos lineares podem ser biespecíficos ou monoespecíficos.

[0113] Conforme usado neste documento, os termos "se liga", "especificamente se liga a" ou é "específico para" referem-se a interações mensuráveis e reproduzíveis, tais como a ligação entre um alvo e um anticorpo, que é determinante da presença do alvo na presença de uma população heterogênea de moléculas, incluindo moléculas biológicas. Por exemplo, um anticorpo que se liga a ou especificamente se liga a um alvo

(que pode ser um epítopo) é um anticorpo que se liga a esse alvo mais prontamente com maior afinidade, avidez e/ou com maior duração do que se liga a outros alvos. Em uma modalidade, a extensão da ligação de um anticorpo a um alvo não relacionado é menos que cerca de 10% da ligação do anticorpo ao alvo, conforme medido, por exemplo, por um radioimunoensaio (RIA). Em certas modalidades, um anticorpo que especificamente se liga a um alvo tem uma constante de dissociação (Kd) de≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ou ≤ 0,1 nM. Em certas modalidades, um anticorpo especificamente se liga a um epítopo em uma proteína que é conservada entre as proteínas de diferentes espécies. Em outra modalidade, a ligação específica pode incluir, mas não requer ligação exclusiva.

[0114] O termo "amostra", conforme usado neste documento, refere-se a uma composição que é obtida ou derivada de um sujeito e/ou indivíduo de interesse que contém uma entidade celular e/ou outra molecular que deve ser caracterizada e/ou identificada, por exemplo com base em características físicas, bioquímicas, químicas e/ou fisiológicas.

Por exemplo, a frase "amostra de doença" e variações da mesma referem - se a qualquer amostra obtida de um sujeito de interesse que seria esperado ou que contenha as entidades celular e/ou molecular que devem ser caracterizadas. As amostras incluem, mas não estão limitadas a, células primárias ou cultivadas ou linhagens celulares, sobrenadantes celulares, lisados celulares, plaquetas, soro, plasma, fluido vítreo, fluido linfático, fluido sinovial, fluido folicular, fluido seminal, fluido amniótico, leite, sangue total, células derivadas do sangue, urina, líquido cefalorraquidiano, saliva, expectoração, lágrimas, transpiração, muco, lisados tumorais e meio de cultura de tecidos, extratos de tecidos, tais como tecido homogeneizado, tecido tumoral, extratos celulares e combinações dos mesmos.

[0115] Por "amostra de tecido" ou "amostra de célula" entende-se uma coleção de células semelhantes obtidas de um tecido de um sujeito ou indivíduo. A fonte da amostra de tecido ou célula pode ser tecido sólido a partir de um órgão fresco, congelado e/ou preservado, amostra de tecido, biópsia e/ou aspirado; sangue ou quaisquer constituintes do sangue, tais como plasma; fluidos corporais, tais como fluido cérebro-espinhal, fluido amniótico, fluido peritoneal ou fluido intersticial; células de qualquer momento da gestação ou desenvolvimento do sujeito. A amostra de tecido também pode ser células primárias ou em cultura ou linhagens celulares. Opcionalmente, a amostra de tecido ou célula é obtida de um tecido/órgão com doença. A amostra de tecido pode conter compostos que não são misturados naturalmente com o tecido na natureza, tais como conservantes, anticoagulantes, tampões, fixadores, nutrientes, antibióticos ou similares.

[0116] Uma "amostra de referência", "célula de referência", "tecido de referência", "amostra de controle", "célula de controle" ou "tecido de controle", conforme usados neste documento, referem-se a uma amostra, célula, tecido, padrão ou nível que são usados para fins de comparação. Em uma modalidade, uma amostra de referência, célula de referência, tecido de referência, amostra de controle, célula de controle ou tecido de controle são obtidos de uma parte saudável e/ou não doente do corpo (por exemplo, tecido ou células) do mesmo sujeito ou indivíduo. Por exemplo, células saudáveis e/ou não doentes ou tecido adjacente às células ou tecido doente (por exemplo, células ou tecido adjacente a um tumor). Em outra modalidade, uma amostra de referência é obtida de um tecido não tratado e/ou célula do corpo do mesmo sujeito ou indivíduo. Em ainda outra modalidade, uma amostra de referência, célula de referên cia,

tecido de referência, amostra de controle, célula de controle ou tecido de controle são obtidos de uma parte saudável e/ou não doente do corpo (por exemplo, tecidos ou células) de um indivíduo que não é o sujeito ou indivíduo. Em ainda outra modalidade, uma amostra de referência, célula de referência, tecido de referência, amostra de controle, célula de controle ou tecido de controle são obtidos de um tecido não tratado e/ou célula do corpo de um indivíduo que não é o sujeito ou indivíduo.

[0117] Uma "resposta eficaz" de um paciente ou "responsividade" de um paciente ao tratamento com um medicamento e redação semelhante referem-se ao benefício clínico ou terapêutico conferido a um paciente em risco de, ou sofrendo de, uma doença ou distúrbio, tal como o câncer. Em uma modalidade, tal benefício inclui qualquer um ou mais de: estender a sobrevida (incluindo sobrevida global e sobrevida livre de progressão); resultar em uma resposta objetiva (incluindo uma resposta completa ou uma resposta parcial); ou melhorar o s sinais ou sintomas do câncer.

[0118] Um paciente que “não tem uma resposta eficaz” ao tratamento refere-se a um paciente que não tem qualquer um de: estender a sobrevida (incluindo sobrevida global e sobrevida livre de progressão); resultar em uma resposta objetiva (incluindo uma resposta completa ou uma resposta parcial); ou melhorar os sinais ou sintomas do câncer.

[0119] Uma "região Fc funcional" possui uma "função efetora" de uma região Fc de sequência nativa. "Funções efetoras" exemplares incluem ligação ao C1q; CDC; ligação ao receptor Fc; ADCC; fagocitose; regulação negativa de receptores da superfície celular (por exemplo, receptor de células B; BCR), etc. Tais funções efetoras geralmente requerem que a região Fc seja combinada com um domínio de ligação (por exemplo, um domínio variável de anticorpo) e podem ser avaliadas usando vários ensaios, conforme divulgado, por exemplo, em definições deste documento.

[0120] “Células efetoras humanas” referem-se a leucócitos que expressam uma ou mais FcRs e realizam funções efetoras. Em certas modalidades, as células expressam pelo menos FcRIII e realizam função(ões) efetor(as) ADCC. Exemplos de leucócitos humanos que medeiam ADCC incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC), células natural killer (NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos. As células efetoras podem ser isoladas de uma fonte nativa, por exemplo, do sangue.

[0121] Um câncer ou amostra biológica que "tem células efetoras humanas" é aquele que, em um teste diagnóstico, tem células efetoras humanas presentes na amostra (por exemplo, células efetoras humanas infiltrantes).

[0122] Um câncer ou amostra biológica que "tem células que expressam FcR" é aquele que, em um teste de diagnóstico, tem expressão FcR presente na amostra (por exemplo, células que expressam FcR infiltrantes). Em algumas modalidades, FcR é FcγR. Em algumas modalidades, FcR é FcγR de ativação.

II. V ISÃO GERAL

[0123] É fornecido neste documento um método para tratar ou retardar a progressão do câncer de pulmão (tal como câncer de pulmão de pequenas células, por exemplo, câncer de pulmão de pequenas células em estágio extensivo) em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um antagonista de ligação ao eixo PD- 1 (por exemplo, um anticorpo anti-PD-L1, tal como atezolizumabe), um agente de platina (por exemplo, carboplatina ou cisplatina) e um inibidor de topoisomerase II (por exemplo, etoposídeo). Também é fornecido neste documento um método para aperfeiçoar a função imunológica em um indivíduo com câncer de pulmão (tal como câncer de pulmão de pequenas células, por exemplo, câncer de pulmão de pequenas células em estágio extensivo) compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um antagonista de ligação ao eixo PD-1 (por exemplo, um anticorpo anti-PD-L1, tal como atezolizumabe), um agente de platina (por exemplo, carboplatina ou cisplatina) e um inibidor de topoisomerase II (por exemplo, etoposídeo). Em algumas modalidades, o tratamento estende a sobrevida livre de progressão (SLP) e/ou a sobrevida global (SG) do indivíduo. Em algumas modalidades, o tratamento estende a sobrevida livre de progressão (SLP) e/ou a sobrevida global (SG) do indivíduo, em comparação a um tratamento que compreende administrar um agente de platina (por exemplo, carboplatina ou cisplatina) e um inibidor de topoisomerase II (por exemplo, etoposídeo).

[0124] Em algumas modalidades, o método compreende tratar um indivíduo com câncer de pulmão de pequenas células em estágio extensivo (CPPC-EE), pela administração ao indivíduo de atezolizumabe em combinação com carboplatina e etoposídeo, em que a administração compreende uma fase de indução e uma fase de manutenção, em que a fase de indução compreende administrar atezolizumabe a uma dose de 1200 mg no dia 1, a carboplatina a uma dose suficiente para alcançar uma ASC = 5 mg/ml/min no dia 1 e o etoposídeo a uma dose de 100 mg/m 2 em cada um dos dias 1, 2 e 3 de cada ciclo de 21 dias para os ciclos 1 a 4 ; e em que a fase de manutenção compreende administrar o atezolizumabe a uma dose de 1200 mg no dia 1 de cada ciclo de 21 dias para cada ciclo após o ciclo 4; em que o indivíduo é sem exposição prévia ao tratamento para CPPC-EE; e em que a administração estende a sobrevida livre de progressão (SLP) e a sobrevida global (SG) do indivíduo.

III. ANTAGONISTAS DE LIGAÇÃO AO EIXO PD-1

[0125] Por exemplo, um antagonista de ligação ao eixo PD-1 inclui um antagonista de ligação ao PDL1, um antagonista de ligação ao PDL1 e um antagonista de ligação ao PDL2. Os nomes alternativos para “PD-1” incluem CD279 e SLEB2. Os nomes alternativos para “PDL1” incluem B7-H1, B7-4, CD274 e B7-H, Os nomes alternativos para “PDL2” incluem B7-DC, Btdc e CD273. Em algumas modalidades, PD-1, PD-L1, e PDL2 são PD-1, PD-L1 e PDL2 humanos.

[0126] Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao PD-1 é uma molécula que inibe a ligação do PD-1 ao(s) seu(s) parceiro(s) de ligação ao ligante. Em um aspecto específico, os parceiros de ligação ao ligante PD-1 são PDL1 e/ou PDL2. Em outra modalidade, um antagonista de ligação ao PDL1 é uma molécula que inibe a ligação de PDL1 a seu(s) parceiro(s) de ligação. Em um aspecto específico, o(s) parceiro(s) de ligação ao PDL1 são PD-1 e/ou B7-1. Em outra modalidade, o antagonista de ligação ao PDL2 é uma molécula que inibe a ligação do PDL2 ao(s) seu(s) parceiro(s) de ligação. Em um aspecto específico, um parceiro de ligação ao PDL2 é PD-1. O antagonista pode ser um anticorpo, um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, uma imunoadesina, uma proteína de fusão ou oligopeptídeo.

[0127] Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao PD-1 é um anticorpo anti-PD-1 (por exemplo, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico).

[0128] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é nivolumabe (Número de registro CAS: 946414-94-4). Nivolumabe (Bristol- Myers Squibb/Ono), também conhecido como MDX-1106-04, MDX-1106, ONO-4538, BMS-936558 e OPDIVO®, é um anticorpo anti-PD-1 descrito em WO2006/121168. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 compreende uma sequência de cadeia pesada e uma sequência de cadeia leve, em que: (a) a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos:

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPG KGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVY YCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNV DHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKN

QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDK SRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:11), e (b) a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos:

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAP RLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTF GQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD

NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:12).

[0129] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 compreende as seis sequências de HVR da SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12 (por exemplo, as três HVRs de cadeia pesada da SEQ ID NO: 11 e as três HVRs de cadeia leve da SEQ ID NO: 12). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 compreende o domínio variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 11 e o domínio variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 12.

[0130] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é pembrolizumabe (Número de Registro CAS: 1374853-91-4).

Pembrolizumabe (Merck), também conhecido como MK-3475, Merck 3475, lambrolizumabw, KEYTRUDA® e SCH-900475, é um anticorpo anti-PD-1 descrito em WO2009/114335. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- PD-1 compreende uma sequência de cadeia pesada e uma sequência de cadeia leve, em que: (a) a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos:

QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPG QGLEWMGG INPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRF DMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDH KPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQ DWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQV

SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSR WQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:13), e (b) a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos:

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKP GQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDL PLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ

WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 14).

[0131] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 compreende as seis sequências de HVR da SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14 (por exemplo, as três HVRs de cadeia pesada da SEQ ID NO: 13 e as três HVRs de cadeia leve da SEQ ID NO: 14). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 compreende o domínio variável de cadeia pesada da

SEQ ID NO: 13 e o domínio variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 14.

[0132] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é MEDI-0680 (AMP-514; AstraZeneca). MEDI-0680 é um anticorpo anti-PD-1 de IgG4 humanizado.

[0133] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é PDR001 (nº de registro CAS 1859072-53-9; Novartis). PDR001 é um anticorpo anti-PD1 de IgG4 humanizado que bloqueia a ligação de PDL1 e PDL2 ao PD-1.

[0134] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é REGN2810 (Regeneron). REGN2810 é um anticorpo anti-PD1 humano.

[0135] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é BGB-108 (BeiGene). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é BGB-A317 (BeiGene).

[0136] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é JS- 001 (Shanghai Junshi). JS-001 é um anticorpo anti-PD1 humanizado.

[0137] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é STI- A1110 (Sorrento). STI-A1110 é um anticorpo anti-PD1 humano.

[0138] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é INCSHR-1210 (Incyte). INCSHR-1210 é um anticorpo anti-PD1 de IgG4 humano.

[0139] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é PF- 06801591 (Pfizer).

[0140] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é TSR-042 (também conhecido como ANB011; Tesaro/AnaptysBio).

[0141] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é AM0001 (ARMO Biosciences).

[0142] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é ENUM 244C8 (Enumeral Biomedical Holdings). ENUM 244C8 é um anticorpo anti-PD1 que inibe a função de PD-1 sem bloquear a ligação de PDL1 ao PD-1.

[0143] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-1 é ENUM 388D4 (Enumeral Biomedical Holdings). ENUM 388D4 é um anticorpo anti-PD1 que inibe competitivamente a ligação de PDL1 ao PD-1.

[0144] Em algumas modalidades, o anticorpo PD-1 compreende as seis sequências HVR (por exemplo, as três HVRs de cadeia pesada e as três HVRs de cadeia leve) e/ou o domínio variável de cadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve de um anticorpo PD -1 descrito em WO2015/112800 (Requerente: Regeneron), WO2015/112805 (Requerente: Regeneron), WO2015/112900 (Requerente: Novartis), US20150210769 (Atribuído à Novartis), WO2016/089873 (Requerente: Celgene), WO2015/035606 (Requerente: Beigene), WO2015/085847 (Requerentes: Shanghai Hengrui Pharmaceutical/Jiangsu Hengrui Medicine), WO2014/206107 (Requerentes: Shanghai Junshi Biosciences/Junmeng Biosciences), WO2012/145493 (Requerente: Amplimmune), US9205148 (Atribuído a MedImmune), WO2015/119930 (Requerentes: Pfizer/Merck), WO2015/119923 (Requerentes: Pfizer/Merck), WO2016/032927 (Requerentes: Pfizer/Merck), WO2014/179664 (Requerente: AnaptysBio), WO2016/106160 (Requerente: Enumeral), e WO2014/194302 (Requerente: Sorrento).

[0145] Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao PD-1 é uma imunoadesina (por exemplo, uma imunoadesina compreendendo uma porção de ligação ao PD-1 ou extracelular de PDL1 ou PDL2 fundida a uma região constante (por exemplo, uma região Fc de uma sequência de imunoglobulina). Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao PD-1 é AMP-224. AMP-224 (nº de registro CAS 1422184-00-6; GlaxoSmithKline/MedImmune), também conhecido como

B7-DCIg, é um receptor solúvel de fusão PDL2-Fc descrito em WO2010/027827 e WO2011/066342.

[0146] Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao PD-1 é um peptídeo ou composto de pequena molécula. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao PD-1 é AUNP-12 (PierreFabre/Aurigene). Vide, por exemplo, WO2012/168944, WO2015/036927, WO2015/044900, WO2015/033303, WO2013/144704, WO2013/132317 e WO2011/161699.

[0147] Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao PDL1 é uma pequena molécula que inibe PD-1. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao PDL1 é uma pequena molécula que inibe PDL1. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao PDL1 é uma pequena molécula que inibe PDL1 e VISTA. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao PDL1 é CA-170 (também conhecido como AUPM-170). Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao PDL1 é uma pequena molécula que inibe PDL1 e TIM3. Em algumas modalidades, a pequena molécula é um composto descrito em WO2015/033301 e WO2015/033299.

[0148] Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo PD-1 é um anticorpo anti-PDL1. Uma variedade de anticorpos anti- PDL1 são contemplados e descritos neste documento. Em qualquer uma das modalidades deste documento, o anticorpo anti-PDL1 isolado pode se ligar a um PDL1 humano, por exemplo, um PDL1 humano como mostrado em UniProtKB/Swiss-Prot nº de acesso Q9NZQ7.1, ou uma variante do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PDL1 é capaz de inibir a ligação entre PDL1 e PD-1 e/ou entre PDL1 e B7-1. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PDL1 é um anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PDL1 é um fragmento de anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em fragmentos Fab, Fab'-SH, Fv, scFv e (Fab')2. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PDL1 é um anticorpo humanizado. Em certas modalidades, um anticorpo anti-PDL1é um anticorpo humano. Exemplos de anticorpos anti-PDL1 úteis para os métodos desta invenção e métodos para a preparação dos mesmos são descritos no pedido de patente PCT WO 2010/077634 A1 e na patente dos EUA de nº 8.217.149, que são incorporados neste documento por referência.

[0149] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PDL1 compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, em que: (a) a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 de GFTFSDSWIH (SEQ ID NO: 1), AWISPYGGSTYYYADSVKG (SEQ ID NO: 2) e RHWPGGFDY (SEQ ID NO: 3), respectivamente, e (b) a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de HVR-L1, HVR-L2 e HVR-L3 de RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 4), SASFLYS (SEQ ID NO: 5) e QQYLYHPAT (SEQ ID NO: 6), respectivamente.

[0150] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PDL1 é MPDL3280A, também conhecido como atezolizumabe e TECENTRIQ® (Número de registro CAS: 1422185-06-5). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PDL1 compreende uma sequência de cadeia pesada e uma sequência de cadeia leve, em que: (a) a sequência da região variável de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFSSYWIEWVRQAP GKGLEWIGEILPGGGDTNYNEIFKGRATFSADTSKNTAYLQMNSLRAEDTA

VYYCTRRVPIRLDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 7), e (b) a sequência da região variável de cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGK

APKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYH PATFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 8).

[0151] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PDL1 compreende uma sequência de cadeia pesada e uma sequência de cadeia leve, em que: (a) a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAP GKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDT AVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK

TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPG (SEQ ID NO:9), e (b) a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGK APKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYH PATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV

QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV THQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:10).

[0152] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PDL1 é avelumabe (Número de Registro CAS: 1537032-82-8). Avelumabe, também conhecido como MSB0010718C, é um anticorpo anti-PDL1 de IgG1 monoclonal humano (Merck KGaA, Pfizer). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PDL1 compreende uma sequência de cadeia pesada e uma sequência de cadeia leve, em que: (a) a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAP GKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT

TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPG (SEQ ID NO:15), e (b) a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos:

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQH PGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSS YTSSSTRVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFY

PGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHR SYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO:16).

[0153] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PDL1 compreende as seis sequências de HVR da SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16 (por exemplo, as três HVRs de cadeia pesada da SEQ ID NO: 15 e as três HVRs de cadeia leve da SEQ ID NO: 16). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PDL1 compreende o domínio variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 15 e o domínio variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 16.

[0154] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PDL1 é durvalumabe (Número de Registro CAS: 1428935-60-7). Durvalumabe, também conhecido como MEDI4736, é um anticorpo anti-PDL1 kappa de IgG1 monoclonal humano (MedImmune, AstraZeneca) descrito em WO2011/066389 e US2013/034559. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PDL1 compreende uma sequência de cadeia pesada e uma sequência de cadeia leve, em que: (a) a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFSSYWIEWVRQAP GKGLEWIGEILPGGGDTNYNEIFKGRATFSADTSKNTAYLQMNSLRAEDTA VYYCTRRVPIRLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLG TQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP

VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 17), e (b) a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos:

DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYEGDSFLNWYQQ KPGKAPKLLIYAASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ SNEDPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY

ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 18).

[0155] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PDL1 compreende as seis sequências de HVR da SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18 (por exemplo, as três HVRs de cadeia pesada da SEQ ID NO: 17 e as três HVRs de cadeia leve da SEQ ID NO: 18). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PDL1 compreende o domínio variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 17 e o domínio variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 18.

[0156] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PDL1 é MDX-1105 (Bristol Myers Squibb). MDX-1105, também conhecido como BMS-936559, é um anticorpo anti-PD-L1 descrito em WO2007/005874.

[0157] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PDL1 é LY3300054 (Eli Lilly).

[0158] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PDL1 é STI-A1014 (Sorrento). STI-A1014 é um anticorpo anti-PDL1 humano.

[0159] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PDL1 é KN035 (Suzhou Alphamab). KN035 é um anticorpo de domínio único (dAB) gerado a partir de uma biblioteca de exibição de fago de came lo.

[0160] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PDL1 compreende uma fração clivável ou ligante que, quando clivada (por exemplo, por uma protease no microambiente tumoral), ativa um domínio de ligação ao antígeno do anticorpo para permitir que ele se ligue ao seu antígeno, por exemplo, removendo um fração estérica de não ligação. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PDL1 é CX-072 (CytomX Therapeutics).

[0161] Em algumas modalidades, o anticorpo PDL1 compreende as seis sequências de HVR (por exemplo, as três HVRs de cadeia pesada e as três HVRs de cadeia leve) e/ou o domínio variável de cadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve de um anticorpo PDL1 descrito em US20160108123 (Atribuído a Novartis), WO2016/000619 (Requerente: Beigene), WO2012/145493 (Requerente: Amplimmune), US9205148 (Atribuído a MedImmune), WO2013/181634 (Requerente: Sorrento), e WO2016/061142 (Requerente: Novartis).

[0162] Em ainda um aspecto específico adicional, o anticorpo compreende ainda uma região constante humana ou murina. Em ainda um aspecto adicional, a região constante humana é selecionada a partir do grupo que consiste em IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4. Em ainda um aspecto específico, a região constante humana é IgG1. Ainda em um aspecto adicional, a região constante murina é selecionada a partir do grupo que consiste em IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3. Em ainda um aspecto adicional, a região constante murina é IgG2A.

[0163] Em ainda um aspecto específico adicional, o anticorpo tem função efetora reduzida ou mínima. Em ainda um aspecto específico adicional, a função efetora mínima resulta de uma "mutação Fc menos efetora" ou mutação de aglicosilação. Em ainda uma outra modalidade, a mutação Fc menos efetora é uma substituição N297A ou D265A/N297A na região constante. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PDL1 isolado é aglicosilado. A glicosilação de anticorpos é normalmente ligada a N ou ligada a O. Ligado a N refere-se à ligação da fração de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências tripeptídicas asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, nas quais X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequências de reconhecimento para a ligação enzimática da fração de carboidrato à cadeia lateral de asparagina.

Assim, a presença de qualquer uma dessas sequências tripeptídicas em um polipeptídeo cria um local de glicosilação potencial. A glicosilação ligada a O refere-se à ligação de um dos açúcares N-aceilgalactosamina, galactose ou xilose a um hidroxiaminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser usados. A remoção dos locais de glicosilação de um anticorpo é convenientemente realizada alterando a sequência de aminoácidos de tal modo que uma das sequências tripeptídicas acima descritas (para locais de glicosilação ligados a N) seja removida. A alteração pode ser feita por substituição de um resíduo de asparagina, serina ou treonina no local de glicosilação por outro resíduo de aminoácido (por exemplo, glicina, alanina ou uma substituição conservativa).

[0164] Em ainda outra modalidade, a presente divulgação fornece composições compreendendo qualquer um dos anticorpos anti- PDL1 descritos acima em combinação com pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0165] Em ainda uma outra modalidade, a presente divulgação fornece uma composição compreendendo um anticorpo anti-PDL1, um anti- PD-1 ou um anti-PDL2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, como fornecido neste documento e pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- PDL1, anti-PD-1 ou anti-PDL2 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo administrado ao indivíduo é uma composição que compreende um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. Qualquer um dos veículos farmaceuticamente aceitáveis descritos neste documentos ou conhecidos na técnica pode ser usado.

IV. AGENTES DE PLATINA E INIBIDORES DA TOPOISOMERASE II AGENTES DE PLATINA

[0166] Os agentes de platina (tais como cisplatina, carboplatina, oxaliplatina e estaraplatina) são fármacos antitumorais amplamente usados que causam a reticulação de DNA como monoaduto, reticulação interfita, reticulação intrafita ou reticulação de proteínas de DNA.

Os agentes de platina normalmente agem na posição N-7 adjacente da guanina, formando uma reticulação intrafita 1, 2 (Poklar et al., (1996). Proc.

Natl. Acad. Sci. EUA. 93 (15): 7606–11; Rudd et al., (1995). Cancer Chemother, Pharmacol, 35 (4): 323–6). A reticulação resultante inibe o reparo de DNA e/ou a síntese de DNA em células cancerosas.

[0167] A carboplatina é um composto de coordenação de platina exemplar usado nos métodos descritos neste documento. O nome químico da carboplatina é platina, diammina[1,1-ciclobutanodicarboxilato (2- )-O,O′]-,(SP-4-2), e a carboplatina tem a seguinte fórmula estrutural:

[0168] A carboplatina é um pó cristalino com a fórmula molecular de C6H12N2O4Pt e um peso molecular de 371,25. É solúvel em água a uma taxa de aproximadamente de 14 mg/mL e o pH de uma solução a 1% é de 5 a 7. É virtualmente insolúvel em etanol, acetona e dimetilacetamida. A carboplatina produz predominantemente reticulações entre reticulações de DNA, e esse efeito é inespecífico do ciclo celular. A carboplatina é comercialmente disponível como PARAPLATIN®, BIOCARN, BLASTOCARB, BLASTOPLATIN, CARBOKEM, CARBOMAX, CARBOPA, CARBOPLAN, CARBOTEEN, CARBOTINAL, CYTOCARB, DUCARB, KARPLAT, KEMOCARB, NAPROPLAT, NEOPLATIN, NISCARBO, ONCOCARBIN, TEVACARB, WOMASTIN, e outros.

INIBIDORES DA TOPOISOMERASE II

[0169] Os inibidores da topoisomerase II (por exemplo, etoposídeo (VP-16), teniposídeo, doxorrubicina, daunorrubicina,

mitoxantrona, amsacrina, elipticinas, ácido aurintricarboxílico e HU-331) também são fármacos antitumorais amplamente usados que estabilizam a topoisomerase II:complexos covalentes de DNA (ou seja, "complexos de clivagem") após a formação de quebras de DNA mediadas por enzimas. A acumulação de tais complexos de clivagem induz vias de morte celular.

[0170] O etoposídeo é um inibidor de topoisomerase II exemplar usado nos métodos descritos neste documento. O etoposídeo é normalmente administrado como o fosfato de etoposídeo pró-fármaco, cujo nome químico é: 4'-Demetilepipodopil-lotoxin 9-[4,6-O-(R)-etilideno-β- Dglucopiranosídeo], 4' (fosfato de di-hidrogênio).

[0171] O fosfato de etoposídeo tem a seguinte estrutura:

[0172] O fosfato de etoposídeo, um éster de fosfato de etoposídeo, é um derivado semissintético da podofilotoxina e é convertido em etoposídeo por desfosforilação. O etoposídeo causa a indução de quebras de fita de DNA por uma interação com a DNA-topoisomerase II ou a formação de radicais livres, levando à detenção do ciclo celular (principalmente no estágio G2 do ciclo celular) e morte celular. O etoposídeo está disponível comercialmente como ETOPOPHOS®, TOPOSAR™, VP-16, VEPESID®, ACTITOP, ASIDE, BIOPOSIDE, CTOP, CYTOP, EPOSed. ESIDE, ETHOPUL, ETOLON, ETONIS, ETOPLAST,

ETOSID, ETOVEL, FYTOP, FYTOSID, LASTET, NZYTOP, ONCOSIDE, PLACID, POSID, RETOPSON, TEVASIDE, TOPOK, TOPOSIDE, e outros.

V. PREPARAÇÃO DO ANTICORPO

[0173] O anticorpo descrito neste documento é preparado usando técnicas disponíveis na técnica para gerar anticorpos, métodos exemplares dos quais são descritos em mais detalhes nas seções seguintes.

[0174] O anticorpo é direcionado contra um antígeno de interesse (por exemplo, PD-L1, tal como um PD-L1 humano). De preferência, o antígeno é um polipeptídeo biologicamente importante e a administração do anticorpo a um mamífero que sofre de um distúrbio pode resultar em um benefício terapêutico nesse mamífero.

[0175] Em certas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento tem uma constante de dissociação (Kd) de ≤ 1μM, ≤ 150 nM, ≤ 100 nM, ≤ 50 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM ou ≤ 0,001 nM (por exemplo, 10-8 M ou menos, por exemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por exemplo, de 10-9 M a 10-13 M).

[0176] Em uma modalidade, a Kd é medida por um ensaio de ligação ao antígeno radiomarcado (RIA) realizado com a versão Fab de um anticorpo de interesse e seu antígeno conforme descrito pelo seguinte ensaio. A afinidade da ligação de solução de Fabs para o antígeno é medida equilibrando Fab com uma concentração mínima de antígeno marcado com (125I) na presença de uma série de titulação de antígeno não marcado, em seguida, capturando o antígeno ligado com uma placa revestida com anticorpo anti-Fab (vide, por exemplo Chen et al., J. Mol.

Biol. 293:865-881 (1999)). Para estabelecer as condições para o ensaio, placas multipoços MICROTITER® (Thermo Scientific) são revestidas durante a noite com 5 μg/ml de um anticorpo anti-Fab de captura (Cappel

Labs) em carbonato de sódio a 50 mM (pH 9,6), e subsequentemente bloqueadas com 2% (p/v) de albumina de soro bovino em PBS por duas a cinco horas à temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C). Em uma placa não adsorvente (Nunc # 269620), 100 pM ou 26 pM de antígeno com [125I] são misturados com diluições em série de um Fab de interesse. O Fab de interesse é então incubado durante a noite; no entanto, a incubação pode continuar por um período mais longo (por exemplo, cerca de 65 horas) para garantir que o equilíbrio seja alcançado. Depois disso, as misturas são transferidas para a placa de captura para incubação à temperatura ambiente (por exemplo, por uma hora). A solução é então removida e a placa lavada oito vezes com 0,1% de polissorbato 20 (TWEEN-20®) em PBS. Quando as placas estiverem secas, 150 μl/poço de cintilante (MICROSCINT-20 TM; Packard) é adicionado, e as placas são contadas em um contador gama TOPCOUNT TM (Packard) por dez minutos. As concentrações de cada Fab que dão menos que ou igual a 20% da ligação máxima são escolhidas para uso em ensaios de ligação competitiva.

[0177] De acordo com outra modalidade, a "Kd" ou "valor da Kd" é medida usando ensaios de ressonância de plásmon de superfície usando um BIAcore®-2000 ou um BIAcore®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) à 25 °C com chips CM5 de antígeno imobilizado em ~ 10 unidades de resposta (UR). Em suma, chips biossensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) são ativados com cloridrato de N- etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodi-imida (EDC) e N-hidroxisuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. O antígeno é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, para 5 μg/ml (~ 0,2 μM) antes da injeção a uma taxa de fluxo de 5 μl/minuto para alcançar aproximadamente 10 unidades de resposta (UR) de proteína acoplada. Após a injeção do antígeno, 1 M de etanolamina é injetado para bloquear os grupos que não reagiram. Para medições cinéticas, diluições em série de duas vezes de Fab (0,78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com 0,05% de polissorbato 20 (TWEEN-20TM) surfactante (PBST) a 25 °C a uma taxa de fluxo de aproximadamente 25 μl/min. As taxas de associação (kon) e as taxas de dissociação (koff) são calculadas usando um modelo de ligação Langmuir simples um-para-um (Software de Avaliação da BIACORE ® versão 3,2) ajustando simultaneamente os sensorgramas de associação e dissociação.

A constante de equilíbrio de dissociação (Kd) é calculada como a razão koff/kon. Vide, por exemplo, Chen et al., J. Mol. Biol., 293:865-881 (1999).

Se a taxa de associação exceder 106 M-1 s-1 pelo ensaio de ressonância de plásmon de superfície acima, então a taxa de associação pode ser determinada usando uma técnica de extinção de fluorescência que mede o aumento ou diminuição na intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, passagem de banda de 16 nm) a 25 °C de um anticorpo antiantígeno de 20 nM (forma Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes de antígeno medidas em um espectrômetro, tais como um espectrofotômetro equipado com stop-flow (Aviv Instruments) ou um espectrofotômetro SLM-AMINCOTM da série 8000 (ThermoSpectronic) com uma cubeta agitada.

(I) PREPARAÇÃO DO ANTÍGENO

[0178] Os antígenos solúveis ou fragmentos dos mesmos, opcionalmente conjugados a outras moléculas, podem ser usados como imunogênios para gerar anticorpos. Para moléculas transmembrana, tais como receptores, fragmentos destas (por exemplo, o domínio extracelular de um receptor) podem ser usados como o imunogênio. Alternativamente, as células que expressam a molécula transmembranar podem ser usadas como o imunogênio. Essas células podem ser derivadas de uma fonte natural (por exemplo, linhagens celulares de câncer) ou podem ser células que foram transformadas por técnicas recombinantes para expressar a molécula transmembranar. Outros antígenos e suas formas úteis para a preparação de anticorpos serão evidentes para os técnicos no assunto.

(II) CERTOS MÉTODOS BASEADOS EM ANTICORPOS

[0179] Os anticorpos policlonais são preferencialmente produzidos em animais por múltiplas injeções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) do antígeno relevante e um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antígeno relevante a uma proteína que é imunogênica na espécie a ser imunizada, por exemplo, hemocianina de lapa buraco de fechadura, albumina sérica, tireoglobulina bovina ou inibidor da tripsina de soja usando um agente bifuncional ou derivatizante, por exemplo, éster maleimidobenzoil sulfossuccinimida (conjugação através de resíduos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (através de resíduos de lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, SOCl2, ou R1N = C = NR, onde R e R1 são grupos alquila diferentes.

[0180] Os animais são imunizados contra o antígeno, conjugados imunogênicos ou derivados combinando, por exemplo, 100 µg ou 5 µg da proteína ou conjugado (para coelhos ou camundongos, respectivamente) com 3 volumes de adjuvante completo de Freund e injetando a solução por via intradérmica em vários locais. Um mês mais tarde, os animais são reforçados com 1/5 a 1/10 da quantidade original de peptídeoou conjugado em adjuvante completo de Freund por injeção subcutânea em múltiplos locais. Sete a 14 dias depois, os animais são deixados a sangrar e o soro é testado quanto ao título de anticorpos. Os animais recebem reforços até que o título estabilize. De preferência, o animal recebe um reforço com o conjugado do mesmo antígeno, mas conjugado com uma proteína diferente e/ou através de um reagente de reticulação diferente. Os conjugados também podem ser feitos em cultura de células recombinantes como fusões de proteínas. Além disso, os agentes de agregação, tais como o alúmen, são adequadamente usados para aperfeiçoar a resposta imune.

[0181] Os anticorpos monoclonais da presente divulgação podem ser feitos usando o método de hibridoma primeiro descrito por Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), e adicionalmente descrito, por exemplo, em Hongo et al., Hybridoma, 14(3):253-260 (1995), Harlow et al., Anticorpos:. A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª ed. 1988); Hammerling et al., em:. Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, Nova Iorque, 1981) e Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) sobre hibridomas humano-humano. Métodos adicionais incluem aqueles descritos, por exemplo, na patente dos EUA de nº 7.189.826 relativa à produção de anticorpos de IgM monoclonais naturais humanos a partir de linhagens celulares de hibridoma. A tecnologia de hibridoma humano (tecnologia de trioma) é descrita em Vollmers e Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) e Vollmers e Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185- 91 (2005).

[0182] Para várias outras técnicas de hibridoma, vide, por exemplo, US 2006/258841; US 2006/183887 (anticorpos totalmente humanos), US 2006/059575; US 2005/287149; US 2005/100546; US 2005/026229; e patentes dos EUA de nº 7.078.492 e 7.153.507. Um protocolo exemplar para a produção de anticorpos monoclonais usando o método de hibridoma é descrito a seguir. Em uma modalidade, um camundongo ou outro animal hospedeiro apropriado, tal como um hamster, é imunizado para induzir linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que especificamente se ligarão à proteína usada para imunização. Os anticorpos são produzidos em animais por múltiplas injeções subcutâneas (sc) ou intraperitoneais (ip) de um polipeptídeo da presente divulgação ou um fragmento do mesmo, e um adjuvante, tal como monofosforil lipídeo A(MPL)/trealose dicrinomicolato (TDM) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, Mont,). Um polipeptídeo da presente divulgação (por exemplo, antígeno) ou um fragmento do mesmo pode ser preparado usando métodos bem conhecidos na técnica, tais como métodos recombinantes, alguns dos quais são descritos neste documento.

O soro de animais imunizados é testado para anticorpos antiantígeno, e imunizações de reforço são opcionalmente administradas. Linfócitos de animais que produzem anticorpos antiantígeno são isolados.

Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro.

[0183] Os linfócitos são então fundidos com células de mieloma usando um agente de fusão adequado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma. Vide, por exemplo, Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986). As células de mieloma podem ser usadas para se fundirem de forma eficiente, suportarem a produção estável de alto nível de anticorpos pelas células produtoras de anticorpos selecionadas e são sensíveis a um meio tal como o meio HAT. As células de mieloma exemplares incluem, mas não estão limitadas a, linhagens de mieloma murino, tais como aquelas derivadas de tumores de camundongo MOPC-21 e MPC-11 disponíveis no Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia, EUA, e células SP-2 ou X63-Ag8-653 disponíveis na American Type Culture Collection, Rockville, Md., EUA. As linhagens celulares de mieloma humano e de heteromieloma camundongo-humano também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque,

1987)).

[0184] As células de hibridoma assim preparadas são semeadas e cultivadas em um meio de cultura adequado, por exemplo, um meio que contém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevida das células de mieloma parentais não fundidas. Por exemplo, se as células de mieloma parentais carecerem da enzima hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas normalmente incluirá hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), cujas substâncias impedem o crescimento de células deficientes em HGPRT. De preferência, métodos de cultura de células de hibridoma sem soro são usados para reduzir o uso de soro derivado de animais, tal como soro fetal bovino, conforme descrito, por exemplo, em Even et al., Trends in Biotechnology, 24(3), 105-108 (2006).

[0185] Os oligopeptídeos como ferramentas para melhorar a produtividade de culturas de células de hibridoma são descritos em Franek, Trends in Monoclonal Antibody Research, 111-122 (2005). Especificamente, os meios de cultura padrão são enriquecidos com certos aminoácidos (alanina, serina, asparagina, prolina) ou com frações de hidrolisado de proteína, e a apoptose pode ser significativamente suprimida por oligopeptídeos sintéticos, constituídos de três a seis resíduos de aminoácidos. Os peptídeos estão presentes em concentrações milimolares ou superiores.

[0186] O meio de cultura no qual as células de hibridoma estão crescendo pode ser testado quanto à produção de anticorpos monoclonais que se ligam a um anticorpo da presente divulgação. A especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma pode ser determinada por imunoprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA). A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode ser determinada, por exemplo, por análise de Scatchard.

Vide, por exemplo, Munson et al., Anal, Biochem, 107:220 (1980).

[0187] Após serem identificadas as células de hibridoma que produzem anticorpos com a especificidade, afinidade e/ou atividade desejadas, os clones podem ser subclonados por procedimentos de diluição limitantes e cultivados por métodos padrão. Vide, por exemplo, Goding, supra. Os meios de cultura adequados para este fim incluem, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo como tumores ascíticos em um animal, Os anticorpos monoclonais segregados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura, fluido ascítico ou soro por procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulina, tais como, por exemplo, proteína A- Sepharose, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade. Um procedimento para o isolamento de proteínas de células de hibridoma é descrito em US 2005/176122 e patente dos EUA de nº 6.919.436. O método inclui o uso de sais mínimos, tais como sais liotrópicos, no processo de ligação e, de preferência, também o uso de pequenas quantidades de solventes orgânicos no processo de eluição.

(III) ANTICORPOS DERIVADOS DE BIBLIOTECA

[0188] Os anticorpos da presente divulgação podem ser isolados por triagem de bibliotecas combinatórias para anticorpos com a atividade ou atividades desejadas. Por exemplo, uma variedade de métodos são conhecidos na técnica para gerar bibliotecas de exibição de fago e triagem de tais bibliotecas para anticorpos possuindo as características de ligação desejadas, tais como os métodos descritos no Exemplo 3. Tais métodos são revisados, por exemplo, em Hoogenboom et al., em Methods in Molecular Biology, 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa,

NJ, 2001) e descrito mais detalhadamente, por exemplo, em McCafferty et al., Nature, 348:552-554; Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1992); Marks e Bradbury, em Methods in Molecular Biology, 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol., 338(2):299-310 (2004); Lee et al., J.

Mol. Biol., 340 (5):1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101 (34):12467-12472 (2004); e Lee et al., J. Immunol. Methods, 284(1- 2):119-132 (2004).

[0189] Em certos métodos de exibição de fago, os repertórios dos genes de VH e VL são clonados separadamente por reação em cadeia da polimerase (PCR) e recombinados aleatoriamente em bibliotecas de fago, que podem então ser rastreadas quanto a fagos de ligação ao antígeno, conforme descrito em Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12:433- 455 (1994). Os fagos apresentam normalmente fragmentos de anticorpo, tanto como fragmentos Fv de cadeia única (scFv) ou como fragmentos Fab.

Bibliotecas de fontes imunizadas fornecem anticorpos de alta afinidade para o imunogênio sem a necessidade de construir hibridomas. Alternativamente, o repertório virgem pode ser clonado (por exemplo, de humano) para fornecer uma única fonte de anticorpos para uma faixa de antígenos não próprios e também próprios sem qualquer imunização, conforme descrito por Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Finalmente, as bibliotecas virgens também podem ser feitas sinteticamente por clonagem de segmentos do gene V não rearranjados a partir de células-tronco e usando iniciadores de PCR contendo sequência aleatória para codificar as regiões CDR3 altamente variáveis e para realizar o rearranjo in vitro, conforme descrito por Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Publicações de patentes que descrevem bibliotecas em fagos de anticorpos humanos incluem, por exemplo: Patente dos EUA de nº 5.750.373 e publicações de patente dos EUA de nº 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 e 2009/0002360.

[0190] Os anticorpos ou fragmentos de anticorpos isolados de bibliotecas de anticorpos humanos são considerados anticorpos humanos ou fragmentos de anticorpos humanos neste documento.

(IV) ANTICORPOS QUIMÉRICOS, HUMANIZADOS E HUMANOS

[0191] Em certas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento é um anticorpo quimérico. Certos anticorpos quiméricos são descritos, por exemplo, na patente dos EUA de nº 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Em um exemplo, um anticorpo quimérico compreende uma região variável não humana (por exemplo, uma região variável derivada de um camundongo, rato, hamster, coelho ou primata não humano, tal como um macaco) e uma região constante humana. Em um outro exemplo, um anticorpo quimérico é um anticorpo de “classe trocada” em que a classe ou a subclasse foi alterada a partir do anticorpo parental. Os anticorpos quiméricos incluem fragmentos de ligação ao antígeno.

[0192] Em certas modalidades, um anticorpo quimérico é um anticorpo humanizado. Normalmente, um anticorpo não humano é humanizado para reduzir a imunogenicidade para humanos, enquanto retém a especificidade e afinidade do anticorpo não humano parental.

Geralmente, um anticorpo humanizado compreende um ou mais domínios variáveis em que HVRs, por exemplo, CDRs, (ou porções das mesmas) são derivadas de um anticorpo não humano, e FRs (ou porções das mesmas) são derivadas de sequências de anticorpos humanos. Um anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante humana. Em algumas modalidades, alguns resíduos de FR em um anticorpo humanizado são substituídos por resíduo s correspondentes de um anticorpo não humano (por exemplo, o anticorpo a partir do qual os resíduos de HVR são derivados), por exemplo, para restaurar ou melhorar a especificidade ou afinidade do anticorpo.

[0193] Anticorpos humanizados e métodos para fabricá-los são revisados, por exemplo, em Almagro e Fransson, Front, Biosci, 13:1619-1633 (2008), e são descritos adicionalmente, por exemplo, em Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 86:10029-10033 (1989); patentes dos EUA de nº

5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 e 7.087.409; Kashmiri et al., Methods, 36:25-34 (2005) (descrevendo enxerto SDR (a-CDR)); Padlan, Mol, Immunol, 28: 489-498 (1991) (descrevendo “recapeamento”); Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (descrevendo “embaralhamento de FR”); e Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) e Klimka et al., Br, J, Cancer, 83: 252-260 (2000) (descrevendo a abordagem de "seleção guiada" para embaralhamento de FR).

[0194] As regiões framework humanas que podem ser usadas para humanização incluem, mas não estão limitadas a: regiões framework selecionadas usando o método de "melhor ajuste" (vide, por exemplo, Sims et al. J. Immunol, 151:2296 (1993)); regiões framework derivadas da sequência de consenso de anticorpos humanos de um subgrupo particular de regiões variáveis de cadeia leve ou pesada (vide, por exemplo, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); e Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); regiões framework humanas maduras (mutadas somaticamente) ou regiões framework da linha germinativa humana (vide, por exemplo, Almagro e Fransson, Front, Biosci, 13:1619-1633 (2008)); e regiões framework derivadas de bibliotecas de FR de triagem (vide, por exemplo, Baca et al., J. Biol. Chem, 272:10678-10684 (1997) e Rosok et al.,

J. Biol. Chem, 271:22611-22618 (1996)).

[0195] Em certas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento é um anticorpo humano. Os anticorpos humanos podem ser produzidos usando várias técnicas conhecidas na técnica. Os anticorpos humanos são descritos geralmente em van Dijk e van de Winkel, Curr. Opin.

Pharmacol. 5:368-74 (2001) e Lonberg, Curr, Opin, Immunol, 20:450-459 (2008).

[0196] Os anticorpos humanos podem ser preparados pela administração de um imunogênio a um animal transgênico que foi modificado para produzir anticorpos humanos intactos ou anticorpos intactos com regiões variáveis humanas em resposta ao desafio antigênico.

Esses animais normalmente contêm todos ou uma parte dos loci de imunoglobulina humana, que substituem os loci de imunoglobulina endógena, ou que estão presentes de forma extracromossal ou integrados aleatoriamente nos cromossomos do animal. Em tais camundongos transgênicos, os loci de imunoglobulina endógena foram geralmente inativados. Para uma revisão de métodos para obter anticorpos humanos a partir de animais transgênicos, vide Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Vide também, por exemplo, as patentes dos EUA de nº 6.075.181 e

6.150.584, que descrevem a tecnologia XENOMOUSETM; patente dos EUA de nº 5.770.429, que descreve a tecnologia HuMab®; Patente dos EUA de nº 7.041.870, que descreve a tecnologia K-M MOUSE® e publicação de pedido de patente dos EUA de nº 2007/0061900, que descreve a tecnologia VelociMouse®). As regiões variáveis humanas de anticorpos intactos geradas por tais animais podem ser adicionalmente modificadas, por exemplo, através da combinação com uma região constante humana diferente.

[0197] Os anticorpos humanos também podem ser produzidos por métodos à base de hibridoma. Linhagens celulares de mieloma humano e de heteromieloma de camundongo-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos foram descritas. (Vide, por exemplo, Kozbor J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987); e Boerner et al., J. Immunol., 147:86 (1991)).

Anticorpos humanos gerados por meio de tecnologia de hibridoma de células B humanas também são descritos em Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 103:3557-3562 (2006). Métodos adicionais incluem aqueles descritos, por exemplo, na patente dos EUA de nº 7.189.826 (descrevendo a produção de anticorpos de IgM humanos monoclonais a partir de linhaagens celulares de hibridoma) e Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (descrevendo hibridomas humano-humano). A tecnologia de hibridoma humano (tecnologia de trioma) também é descrita em Vollmers e Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) e Vollmers e Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185 -91 (2005).

[0198] Os anticorpos humanos também podem ser gerados isolando sequências de domínio variável de clone Fv selecionadas a partir de bibliotecas de exibição de fago derivadas de humanos. Tais sequências de domínio variável podem então ser combinadas com um domínio constante humano desejado. As técnicas para a seleção de anticorpos humanos a partir de bibliotecas de anticorpos são descritas abaixo.

(V) FRAGMENTOS DE ANTICORPO

[0199] Os fragmentos de anticorpos podem ser gerados por meios tradicionais, tais como digestão enzimática ou por técnicas recombinantes. Em certas circunstâncias, há vantagens em usar fragmentos de anticorpos, em vez de anticorpos inteiros. O tamanho menor dos fragmentos permite uma eliminação rápida e pode levar a um melhor acesso a tumores sólidos. Para uma revisão de certos fragmentos de anticorpo, vide Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).

[0200] Várias técnicas foram desenvolvidas para a produção de fragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, esses fragmentos foram derivados por digestão proteolítica de anticorpos intactos (vide, por exemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); e Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). No entanto, esses fragmentos podem agora ser produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Os fragmentos de anticorpos Fab, Fv e ScFv podem todos ser expressos e segregados a partir de E. coli, permitindo assim a produção fácil de grandes quantidades desses fragmentos. Os fragmentos de anticorpos podem ser isolados das bibliotecas de fago de anticorpos discutidas acima. Alternativamente, os fragmentos Fab'-SH podem ser diretamente recuperados a partir de E. coli e acoplados quimicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem, os fragmentos F(ab') 2 podem ser isolados diretamente da cultura de células hospedeiras recombinantes. Os fragmentos Fab e F(ab') 2 com meia-vida in vivo aumentada compreendendo resíduos de epítopo de ligação ao receptor de salvamento são descritos na ´patente dos EUA de nº 5.869.046. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos serão evidentes para o técnico no assunto. Em certas modalidades, um anticorpo é um fragmento Fv de cadeia simples (scFv). Vide WO 93/16185; patentes dos EUA de nº

5.571.894 e 5.587.458. Fv e scFv são as únicas espécies com locais de combinação intactos desprovidos de regiões constantes; assim, eles podem ser adequados para ligação não específica reduzida durante o uso in vivo.

As proteínas de fusão scFv podem ser construídas para produzir a fusão de uma proteína efetora no terminal amino ou carbóxi de um scFv. Vide Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. O fragmento de anticorpo também pode ser um "anticorpo linear", por exemplo, conforme descrito na patente dos EUA de nº 5.641.870, por exemplo. Esses anticorpos lineares podem ser monoespecíficos ou biespecíficos.

(VI) ANTICORPOS MULTIESPECÍFICOS

[0201] Os anticorpos multiespecíficos têm especificidades de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes, em que os epítopos são geralmente de antígenos diferentes. Embora tais moléculas normalmente se liguem somente a dois epítopos diferentes (ou seja anticorpos biespecíficos, BsAbs), anticorpos com especificidades adicionais, tais como anticorpos triespecíficos, são abrangidos por esta expressão quando usados neste documentos. Os anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpo (por exemplo, anticorpos biespecíficos F(ab')2).

[0202] Os métodos para produzir anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. A produção tradicional de anticorpos biespecíficos de comprimento total é baseada na coexpressão de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina, em que as duas cadeias têm especificidades diferentes (Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983)).

Devido ao sortimento aleatório das cadeias pesada e leve de imunoglobulina, esses hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas de anticorpo diferentes, das quais somente uma tem a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, que geralmente é feita por etapas de cromatografia de afinidade, é bastante complicada e os rendimentos do produto são baixos. Procedimentos semelhantes são divulgados em WO 93/08829 e em Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

[0203] Uma abordagem conhecida na técnica para a produção de anticorpos biespecíficos é a abordagem "knobs-into-holes" ou "protuberance-into-cavity”" (vide, por exemplo, patente dos EUA de nº

5.731.168). Nesta abordagem, dois polipeptídeos de imunoglobulina (por exemplo, polipeptídeos de cadeia pesada), cada um compreende uma interface. Uma interface de um polipeptídeo de imunoglobulina interage com uma interface correspondente no outro polipeptídeo de imunoglobulina, permitindo assim que os dois polipeptídeos de imunoglobulina se associem.

Essas interfaces podem ser projetadas de tal modo que um "botão" (knob) ou "protuberância" (protuberance) (estes termos podem ser usados intercambiavelmente neste documento) localizados na interface de um polipeptídeo de imunoglobulina corresponde a um "orifício" (hole) ou "cavidade" (cavity) (estes termos podem ser usados intercambiavelmente neste documento) localizados na interface do outro polipeptídeo de imunoglobulina. Em algumas modalidades, o orifício é de tamanho idêntico ou semelhante ao do botão e adequadamente posicionado de tal modo que, quando as duas interfaces interagem, o botão de uma interface é posicionável no orifício correspondente da outra interface. Sem desejar se limitar à teoria, acredita-se que isso estabilize o heteromultímero e favoreça a formação do heteromultímero em relação a outras espécies, por exemplo, homomultímeros. Em algumas modalidades, esta abordagem pode ser usada para promover a heteromultimerização de dois polipeptídeos de imunoglobulina diferentes, criando um anticorpo biespecífico compreendendo dois polipeptídeos de imunoglobulina com especificidades de ligação para diferentes epítopos.

[0204] Em algumas modalidades, um botão pode ser construído substituindo uma pequena cadeia lateral de aminoácido por uma cadeia lateral maior. Em algumas modalidades, um orifício pode ser construído substituindo uma grande cadeia lateral de aminoácido por uma cadeia lateral menor. Botões ou orifícios podem existir na interface original ou podem ser introduzidos sinteticamente. Por exemplo, botões ou orifícios podem ser introduzidos sinteticamente alterando a sequência de ácido nucleico que codifica a interface para substituir pelo menos um resíduo de aminoácido "original" por pelo menos um resíduo de aminoácido "importado". Os métodos para alterar as sequências de ácido nucleico podem incluir técnicas de biologia molecular padrão bem conhecidas na técnica. Os volumes da cadeia lateral de vários resíduos de aminoácidos são mostrados na Tabela 1 abaixo. Em algumas modalidades, os resíduos originais têm um pequeno volume da cadeia lateral (por exemplo, alanina, asparagina, ácido aspártico, glicina, serina, treonina ou valina) e resíduos de importação para formar um botão são aminoácidos de ocorrência natural e podem incluir arginina, fenilalanina, tirosina e triptofano. Em algumas modalidades, os resíduos originais têm um grande volume da cadeia lateral (por exemplo, arginina, fenilalanina, tirosina e triptofano) e resíduos de importação para formar um orifício são aminoácidos de ocorrência natural e podem incluir alanina, serina, treonina e valina.

TABELA 1. PROPRIEDADES DOS RESÍDUOS DE AMINOÁCIDOS Abreviatura Área de Massaa Volumeb Aminoácido de uma superfície (daltons) (Å3) letra acessívelc (Å2) Alanina (Ala) A 71,08 88,6 115 Arginina (Arg) R 156,20 173,4 225 Asparagina (Asn) N 114,11 117,7 160 Ácido Aspártico D 115,09 111,1 150 (Asp) Cisteína (Cys) C 103,14 108,5 135 Glutamina (Gln) Q 128,14 143,9 180 Ácido Glutâmico E 129,12 138,4 190 (Glu)

Abreviatura Área de Massaa Volumeb Aminoácido de uma superfície (daltons) (Å3) letra acessívelc (Å2) Glicina (Gly) G 57,06 60,1 75 Histidina (His) H 137,15 153,2 195 Isoleucina (Ile) I 113,17 166,7 175 Leucina (Leu) L 113,17 166,7 170 Lisina (Lys) K 128,18 168,6 200 Metionina (Met) M 131,21 162,9 185 Fenilalanina F 147,18 189,9 210 (Phe) Proline (Pro) P 97,12 122,7 145 Serina (Ser) S 87,08 89,0 115 Treonina (Thr) T 101,11 116,1 140 Triptofano (Trp) W 186,21 227,8 255 Tirosina (Tyr) Y 163,18 193,6 230 Valina (Val) V 99,14 140,0 155 a Peso molecular do aminoácido menos o da água. Valores a partir de Handbook of Chemistry and Physics, 43ª ed. Cleveland, Chemical Rubber Publishing Co., 1961.

b Valores a partir de A.A. Zamyatnin, Prog. Biophys, Mol.

Biol. 24: 107-123, 1972.

c Valores a partir de C. Chothia, J. Mol. Biol. 105:1-14, 1975.

A área de superfície acessível é definida nas Figuras 6 a 20 desta referência.

[0205] Em algumas modalidades, os resíduos originais para formar um botão ou orifício são identificados com base na estrutura tridimensional do heteromultímero. As técnicas conhecidas na técnica para obter uma estrutura tridimensional podem incluir cristalografia de raios-X e NMR. Em algumas modalidades, a interface é o domínio CH3 de um domínio constante de imunoglobulina. Nessas modalidades, a interface CH3/CH3 de IgG 1 humana envolve dezesseis resíduos em cada domínio localizado em quatro fitas β anti-paralelas. Sem desejar estar limitado à teoria, os resíduos mutados estão preferencialmente localizados nas duas fitas β anti-paralelas centrais para minimizar o risco de que os botões podem ser acomodados pelo solvente circundante, em vez dos orifícios compensatórios no domínio CH3 parceiro. Em algumas modalidades, as mutações que formam botões e orifícios correspondentes em dois polipeptídeos de imunoglobulina correspondem a um ou mais pares fornecidos na Tabela 2.

TABELA 2. CONJUNTOS EXEMPLARES DE MUTAÇÕES FORMADORAS DE BOTÃO E BURACO (“KNOB-AND HOLE”) CORRESPONDENTES* CH3 da primeira imunoglobulina CH3 da segunda imunoglobulina T366Y Y407T T366W Y407A F405A T394W Y407T T366Y T366Y:F405A T394W:Y407T T366W:F405W T394S:Y407A F405W:Y407A T366W:T394S F405W T394S * As mutações são denotadas pelo resíduo original, seguido pela posição usando o sistema de numeração de Kabat e, em seguida, pelo resíduo de importação (todos os resíduos são dados no código de aminoácidos de uma única letra). Múltiplas mutações são separadas por dois pontos.

[0206] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de imunoglobulina compreende um domínio CH3 compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos listadas na Tabela 2 acima. Em algumas modalidades, um anticorpo biespecífico compreende um primeiro polipeptídeo de imunoglobulina compreendendo um domínio CH3 compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos listadas na coluna esquerda da Tabela 2, e um segundo polipeptídeo de imunoglobulina compreendendo um domínio CH3 compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos correspondentes listadas na coluna direita da Tabela 2.

[0207] Após mutação do DNA como discutido acima, polinucleotídeos que codificam polipeptídeos de imunoglobulina modificados com uma ou mais mutações formadoras de botão ou buraco correspondentes podem ser expressos e purificados usando técnicas recombinantes padrão e sistemas celulares conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, patentes dos EUA de nº

5.731.168; 5.807.706; 5.821.333; 7.642.228; 7.695.936; 8.216.805; publicação de patente dos EUA de nº 2013/0089553; e Spiess et al., Nature Biotechnology 31:753- 758, 2013. Os polipeptídeos de imunoglobulina modificados podem ser produzidos usando células hospedeiras procarióticas, tais como E. coli, ou células hospedeiras eucarióticas, tais como células CHO. Os polipeptídeos de imunoglobulina com botões e orifícios correspondentes podem ser expressos em células hospedeiras em cocultura e purificados juntos como um heteromultímero, ou podem ser expressos em culturas únicas, purificados separadamente e montados in vitro. Em algumas modalidades, duas cepas de células hospedeiras bacterianas (uma expressando um polipeptídeo de imunoglobulina com um botão e a outra expressando um polipeptídeo de imunoglobulina com um orifício) são cocultivadas usando técnicas de cultura bacteriana padrão conhecidas na técnica, Em algumas modalidades, as duas cepas podem ser misturadas em uma razão específica, por exemplo, de modo a alcançar níveis de expressão iguais em cultura. Em algumas modalidades, as duas cepas podem ser misturadas em uma razão de 50:50, 60:40 ou 70:30. Após a expressão do polipeptídeo, as células podem ser lisadas juntas e a proteína pode ser extraída. As técnicas padrão conhecidas na técnica que permitem medir a abundância de espécies homo-multiméricas vs. hetero- multiméricas podem incluir cromatografia de exclusão por tamanho. Em algumas modalidades, cada polipeptídeo de imunoglobulina modificado é expresso separadamente usando técnicas recombinantes padrão e podem ser montados in vitro. A montagem pode ser alcançada, por exemplo, purificando cada polipeptídeo de imunoglobulina modificado, misturando e incubando-os juntos em massa igual, reduzindo dissulfetos (por exemplo, por tratamento com ditiotreitol), concentrando e reoxidando os polipeptídeos. Os anticorpos biespecíficos formados podem ser purificados usando técnicas padrão, incluindo cromatografia de troca catiônica e medidos usando técnicas padrão, incluindo cromatografia de exclusão de tamanho.

Para uma descrição mais detalhada desses métodos, vide Speiss et al., Nat Biotechnol 31:753-8, 2013. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de imunoglobulina modificados podem ser expressos separadamente em células CHO e montados in vitro usando os métodos descritos acima.

[0208] De acordo com uma abordagem diferente, os domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (locais de combinação anticorpo-antígeno) são fundidos a sequências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão é preferencialmente com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, compreendendo pelo menos parte das regiões de dobradiça, CH2 e CH3. É típico ter a primeira região constante de cadeia pesada (CH1) contendo o local necessário para a ligação de cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. Os DNAs que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados e são cotransfectados em um organismo hospedeiro adequado. Isto proporciona grande flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos de polipeptídeo em modalidades quando razões desiguais das três cadeias de polipeptídeo usadas na construção fornecem os rendimentos ideais. É, no entanto, possível inserir as sequências de codificação para duas ou todas as três cadeias de polipeptídeo em um vetor de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias de polipeptídeo em razões iguais resulta em rendimentos elevados ou quando as razões não têm significado particular.

[0209] Em uma modalidade desta abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos por uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação em um braço e um par de cadeia pesada- cadeia leve de imunoglobulina híbrida (fornecendo uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Verificou-se que esta estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado de combinações de cadeia de imunoglobulina indesejadas, uma vez que a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas uma metade da molécula biespecífica fornece uma maneira fácil de separação. Esta abordagem é divulgada em WO 94/04690. Para obter mais detalhes sobre a geração de anticorpos biespecíficos, vide, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).

[0210] De acordo com outra abordagem descrita em WO96/27011, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser projetada para maximizar a porcentagem de heterodímeros que são recuperados da cultura de células recombinantes. Uma interface compreende pelo menos uma parte do domínio CH 3 de um domínio constante de anticorpo. Neste método, uma ou mais pequenas cadeias laterais de aminoácidos da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas por cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). "Cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou semelhante à(s) cadeia(s) lateral(is) grande(s) são criadas na interface da segunda molécula de anticorpo substituindo cadeias laterais grandes de aminoácidos por outras menores (por exemplo, alanina ou treonina). Isso fornece um mecanismo para aumentar o rendimento do heterodímero em relação a outros produtos finais indesejados, tais como homodímeros.

[0211] Os anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou "heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado à avidina e o outro à biotina. Tais anticorpos foram, por exemplo, propostos para direcionar células do sistema imunológico a células indesejadas

(patente dos EUA de nº 4.676.980) e para o tratamento de infecção por HIV (WO 91/00360, WO 92/200373 e EP 03089). Os anticorpos heteroconjugados podem ser produzidos usando quaisquer métodos de reticulação convenientes. Os agentes de reticulação adequados são bem conhecidos na técnica e são divulgados na patente dos EUA de nº 4.676.980, juntamente com uma série de técnicas de reticulação.

[0212] As técnicas para gerar anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpos também foram descritas na literatura. Por exemplo, anticorpos biespecíficos podem ser preparados usando ligação química. Brennan et al., Science, 229:81 (1985) descrevem um procedimento em que anticorpos intactos são clivados proteoliticamente para gerar fragmentos F(ab')2. Esses fragmentos são reduzidos na presença do agente complexante de ditiol arsenito de sódio para estabilizar os ditióis vicinais e prevenir a formação de dissulfeto intermolecular. Os fragmentos Fab' gerados são então convertidos em derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados Fab'-TNB é então reconvertido no Fab'-tiol por redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado Fab'-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser usados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas.

[0213] O progresso recente facilitou a recuperação direta de fragmentos Fab'-SH a partir de E. coli, que podem ser acoplados quimicamente para formar anticorpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992) descreve a produção de uma molécula F(ab')2 de anticorpo biespecífico totalmente humanizado. Cada fragmento Fab' foi secretado separadamente a partir de E. coli e submetido a acoplamento químico direcionado in vitro para formar o anticorpo biespecífico.

[0214] Várias técnicas para produzir e isolar fragmentos de anticorpos biespecíficos diretamente da cultura de células recombinantes também foram descritas. Por exemplo, anticorpos biespecíficos foram produzidos usando zíperes de leucina. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Os peptídeos de zíper de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes por fusão genética. Os homodímeros de anticorpo foram reduzidos na região de dobradiça para formar monômeros e, em seguida, foram reoxidados para formar os heterodímeros de anticorpo. Este método também pode ser usado para a produção de homodímeros de anticorpos. A tecnologia “diacorpo” descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) forneceu um mecanismo alternativo para produzir fragmentos de anticorpos biespecíficos. Os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) por um ligante que é muito curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Consequentemente, os domínios VH e V L de um fragmento são forçados a emparelhar com os domínios VL e VH complementares de outro fragmento, formando assim dois locais de ligação ao antígeno. Outra estratégia para produzir fragmentos de anticorpos biespecíficos pelo uso de dímeros Fv de cadeia única (sFv) também foi relatada. Vide Gruber et al. J. Immunol, 152:5368 (1994).

[0215] Anticorpos com mais de duas valências são contemplados.

Por exemplo, podem ser preparados anticorpos triespecíficos. Tuft et al. J. Immunol, 147: 60 (1991).

(VII) ANTICORPOS DE DOMÍNIO ÚNICO

[0216] Em certas modalidades, um anticorpo da presente divulgação pode ser um anticorpo de domínio único. Os anticorpos de domínio único são fragmentos de anticorpo compreendendo todo ou uma porção do domínio variável de cadeia pesada ou todo ou uma porção do domínio variável de cadeia leve de um anticorpo. Em certas modalidades, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; vide, por exemplo, Patente dos EUA de nº 6.248.516 B1). Em uma modalidade, um anticorpo de domínio único consiste em todo ou uma porção do domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo.

(VIII) VARIANTES DE ANTICORPO

[0217] Em algumas modalidades, a(s) modificação(ões) da sequência de aminoácidos dos anticorpos descritos neste documento são contempladas. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. As variantes da sequência de aminoácidos de um anticorpo podem ser preparadas através da introdução de modificações apropriadas na sequência de nucleotídeo que codifica o anticorpo ou por síntese de peptídeo. Essas modificações incluem, por exemplo, deleções e/ou inserções e/ou substituições de resíduos nas sequências de aminoácidos do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição pode ser feita para chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas. As alterações de aminoácidos podem ser introduzidas na sequência de aminoácidos do anticorpo em questão no momento em que essa sequência é feita.

(IX) VARIANTES DE DELEÇÃO, INSERÇÃO E SUBSTITUIÇÃO

[0218] Em certas modalidades, variantes de anticorpos são fornecidas tendo uma ou mais substituições de aminoácidos. Os locais de interesse para mutagênese substitucional incluem as HVRs e as FRs. As substituições conservativas são mostradas na Table 3. Alterações mais substanciais são fornecidas na Tabela 3 sob o título de "substituições exemplares" e conforme descrito abaixo em referência às classes de cadeia lateral de aminoácidos. As substituições de aminoácidos podem ser introduzidas em um anticorpo de interesse e os produtos selecionados para uma atividade desejada, por exemplo, ligação de antígeno retida/melhorada, imunogenicidade diminuída ou ADCC ou CDC melhoradas.

TABELA 3. SUBSTITUIÇÕES CONSERVATIVAS.

Resíduo Original Substituições exemplares Substituições preferidas Ala (A) Val; Leu; Ile Val Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln Asp (D) Glu; Asn Glu Cys (C) Ser; Ala Ser Gln (Q) Asn; Glu Asn Glu (E) Asp; Gln Asp Gly (G) Ala Ala His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu Leu (L) Norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg Met (M) Leu; Phe; Ile Leu Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Val; Ser Ser Trp (W) Tyr; Phe Tyr Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina Leu

[0219] Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com propriedades comuns de cadeia lateral: a. hidrofóbico: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; b. hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; c. ácido: Asp, Glu; d. básico: His, Lys, Arg; e. resíduos que influenciam orientação da cadeia: Gly, Pro; e f. aromático: Trp, Tyr, Phe.

[0220] As substituições não conservativas implicarão a troca de um membro de uma destas classes por outra classe.

[0221] Um tipo de variante substitucional envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo parental (por exemplo, um anticorpo humanizado ou humano).

Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para estudo posterior terão modificações (por exemplo, aprimoramentos) em certas propriedades biológicas (por exemplo, afinidade aumentada, imunogenicidade reduzida) em relação ao anticorpo parental e/ou terão substancialmente retido certas propriedades biológicas do anticorpo parental. Uma variante de substituição exemplar é um anticorpo maturado por afinidade, que pode ser gerado convenientemente, por exemplo, usando técnicas de maturação por afinidade à base de exibição de fago, tais como aquelas descritas neste documento. Em suma, um ou mais resíduos de HVR são mutados e os anticorpos de variantes exibidos no fago e rastreados para uma atividade biológica específica (por exemplo, afinidade de ligação).

[0222] Alterações (por exemplo, substituições) podem ser feitas em HVRs, por exemplo, para melhorar a afinidade do anticorpo. Tais alterações podem ser feitas em "pontos de acesso" de HVR, ou seja, resíduos codificados por códons que sofrem mutação em alta frequência durante o processo de maturação somática (vide, por exemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), e/ou SDRs (a-CDRs), com a variante VH ou VL resultante testada quanto à afinidade de ligação. A maturação por afinidade através da construção e resseleção de bibliotecas secundárias foi descrita, por exemplo, em Hoogenboom et al., em Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). Em algumas modalidades de maturação por afinidade, a diversidade é introduzida nos genes variáveis escolhidos para a maturação por qualquer um de uma variedade de métodos (por exemplo, por PCR propensa a erros, embaralhamento de cadeias, ou mutagênese direcionada a oligonucleotídeos). É então criada uma biblioteca secundária. A biblioteca é então rastreada para identificar quaisquer variantes de anticorpos com a afinidade desejada. Outro método para introduzir diversidade envolve abordagens direcionadas a HVR, nas quais vários resíduos de HVR (por exemplo, 4 a 6 resíduos de cada vez) são randomizados. Os resíduos de HVR envolvidos na ligação ao antígeno podem ser especificamente identificados, por exemplo, usando modelagem ou mutagênese de varredura de alanina. CDR-H3 e CDR-L3 em particular são frequentemente direcionadas.

[0223] Em certas modalidades, substituições, inserções ou deleções podem ocorrer dentro de uma ou mais HVRs, desde que tais alterações não reduzam substancialmente a capacidade do anticorpo de se ligar ao antígeno. Por exemplo, alterações conservativas (por exemplo, substituições conservativas como fornecidas neste documento) que não reduzem substancialmente a afinidade de ligação podem ser feitas em HVRs. Tais alterações podem estar fora dos “pontos de acesso” de HVR ou SDRs. Em certas modalidades das sequências variantes de VH e VL fornecidas acima, cada HVR está inalterada ou contém não mais do que uma, duas ou três substituições de aminoácidos.

[0224] Um método útil para identificação de resíduos ou regiões de um anticorpo que pode ser direcionado para mutagênese é chamado "mutagênese de varredura de alanina", conforme descrito por Cunningham e Wells, (1989), Science, 244:1081-1085. Nesse método, um resíduo ou grupo de resíduos alvo (por exemplo, resíduos carregados, tais como Arg, Asp, His, Lys e Glu) são identificados e substituídos por um aminoácido neutro ou carregado negativamente (por exemplo, alanina ou polialanina) para determinar se a interação do anticorpo com o antígeno é afetada. Substituições adicionais podem ser introduzidas nos locais de aminoácidos demonstrando sensibilidade funcional às substituições iniciais.

Alternativamente, ou adicionalmente, é fornecida uma estrutura cristalina de um complexo antígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos podem ser direcionados ou eliminados como candidatos para substituição. As variantes podem ser rastreadas para determinar se elas contêm as propriedades desejadas.

[0225] As inserções de sequência de aminoácidos incluem fusões do terminal amino e/ou carboxila variando em comprimento a partir de um resíduo a polipeptídeos contendo cem ou mais resíduos, bem como inserções intrassequência de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos.

Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo de metionila N-terminal. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão ao N-terminal ou C-terminal do anticorpo a uma enzima (por exemplo, para ADEPT) ou um polipeptídeo que aumenta a meia-vida sérica do anticorpo.

(X) V ARIANTES DE GLICOSILAÇÃO

[0226] Em certas modalidades, um anticorpo fornecido neste documento é alterado para aumentar ou diminuir a extensão em que o anticorpo é glicosilado. A adição ou deleção de locais de glicosilação a um anticorpo pode ser convenientemente realizada alterando a sequência de aminoácidos de tal modo que um ou mais locais de glicosilação sejam criados ou removidos.

[0227] Quando o anticorpo compreende uma região Fc, o carboidrato a ela ligado pode ser alterado. Anticorpos nativos produzidos por células de mamíferos normalmente compreendem um oligossacarídeo biantenário ramificado que é geralmente ligado por uma ligação N a Asn297 do domínio CH2 da região Fc. Vide, por exemplo, Wright et al., TIBTECH, 15:26-32 (1997). O oligossacarídeo pode incluir vários carboidratos, por exemplo, manose, N-acetilglicosamina (GlcNAc),

galactose e ácido siálico, bem como uma fucose ligada a um GlcNAc na "haste" da estrutura do oligossacarídeo biantenário. Em certas modalidades, as modificações do oligossacarídeo em um anticorpo da presente divulgação podem ser feitas a fim de criar variantes de anticorpo com certas propriedades melhoradas.

[0228] Em uma modalidade, as variantes de anticorpos são fornecidas compreendendo uma região Fc em que uma estrutura de carboidrato ligada à região Fc tem fucose reduzida ou carece de fucose, o que pode melhorar a função ADCC. Especificamente, são contemplados neste documento anticorpos que têm fucose reduzida em relação à quantidade de fucose no mesmo anticorpo produzido em uma célula CHO do tipo selvagem. Ou seja, eles são caracterizados por terem uma quantidade inferior de fucose do que teriam se fossem produzidos por células CHO nativas (por exemplo, uma célula CHO que produz um padrão de glicosilação nativo, tal como uma célula CHO contendo um gene FUT8 nativo). Em certas modalidades, o anticorpo é aquele em que menos de cerca de 50%, 40%, 30%, 20%, 10% ou 5% dos glicanos ligados a N nele compreendem fucose. Por exemplo, a quantidade de fucose em tal anticorpo pode ser de 1% a 80%, de 1% a 65%, de 5% a 65% ou de 20% a 40%. Em certas modalidades, o anticorpo é aquele em que nenhum dos glicanos ligados a N nele compreende fucose, ou seja, em que o anticorpo está completamente sem fucose, ou não tem fucose ou é fucosilado. A quantidade de fucose é determinada calculando a quantidade média de fucose dentro da cadeia de açúcar em Asn297, em relação à soma de todas as glicoestruturas ligadas a Asn 297 (por exemplo, estruturas complexas, híbridas e de alta manose), conforme medido por espectrometria de massa MALDI-TOF, como descrito em WO 2008/077546, por exemplo. Asn297 refere-se ao resíduo de asparagina localizado próximo da posição 297 na região Fc (numeraçãoda da UE dos resíduos da região Fc); no entanto, Asn297 também pode estar localizado a cerca de ± 3 aminoácidos a montante ou a jusante da posição 297, ou seja, entre as posições 294 e 300, devido a pequenas variações de sequência em anticorpos. Tais variantes de fucosilação podem ter função ADCC melhorada. Vide, por exemplo, publicação de patente dos EUA de nº US 2003/0157108 (Presta, L,); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Exemplos de publicações relacionadas a variantes de anticorpo "desfucosiladas" ou "deficientes em fucose" incluem: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al.

Biotech, Bioeng, 87: 614 (2004). Exemplos de linhagens celulares capazes de produzir anticorpos desfucosilados incluem células CHO Lec13 deficientes em fucosilação de proteínas (Ripka et al., Arch. Biochem.

Biophys. 249:533-545 (1986); patente dos EUA de nº 2003/0157108 A1; e WO 2004/056312 A1, Adams et al., especialmente no Exemplo 11), e linhagens celulares de nocaute, tais como o gene alfa-1,6- fucosiltransferase, FUT8, células CHO de nocaute (vide, por exemplo, Yamane-Ohnuki et al., Biotech, Bioeng, 87:614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94 (4):680-688 (2006); e WO2003/085107).

[0229] As variantes de anticorpo são ainda fornecidas com oligossacarídeos bissectados, por exemplo, em que um oligossacarídeo biantenário ligado à região Fc do anticorpo é bissectado por GlcNAc. Tais variantes de anticorpo podem ter fucosilação reduzida e/ou função ADCC melhorada. Exemplos não limitantes de tais variantes de anticorpo são descritos, por exemplo, em WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); patente dos EUA de nº 6.602.684 (Umana et al.); US 2005/0123546 (Umana et al.), e Ferrara et al., Biotechnology and Bioengineering, 93(5): 851-861 (2006).

Variantes de anticorpo com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo ligado à região Fc também são fornecidas. Tais variantes de anticorpos podem ter uma função CDC aprimorada. Tais variantes de anticorpo são descritas, por exemplo, em WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S,); e WO 1999/22764 (Raju, S.).

[0230] Em certas modalidades, as variantes de anticorpos que compreendem uma região Fc descritas neste documento são capazes de se ligar a um FcγRIII. Em certas modalidades, as variantes de anticorpo compreendendo uma região Fc descrita neste documento têm atividade ADCC na presença de células efetoras humanas ou têm atividade ADCC aumentada na presença de células efetoras humanas em comparação ao mesmo anticorpo compreendendo uma região IgG1Fc do tipo selvagem humana.

(XI) V ARIANTES DA REGIÃO F C

[0231] Em certas modalidades, podem ser introduzidas uma ou mais modificações de aminoácidos na região Fc de um anticorpo fornecido neste documento, gerando assim uma variante da região Fc. A variante da região Fc pode compreender uma sequência da região Fc humana (por exemplo, uma região Fc IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana) compreendendo uma modificação de aminoácidos (por exemplo, uma substituição) em uma ou mais posições de aminoácidos.

[0232] Em certas modalidades, a invenção contempla uma variante de anticorpo que possui algumas mas não todas as funções efetoras, o que a torna uma candidata desejável para aplicações em que a meia-vida do anticorpo in vivo é importante, embora certas funções efetoras (tais como complemento e ADCC) sejam desnecessárias ou deletérias. Os ensaios de citotoxicidade in vitro e/ou in vivo podem ser conduzidos para confirmar a redução/depleção das atividades de CDC e/ou ADCC. Por exemplo, os ensaios de ligação ao receptor Fc (FcR) podem ser conduzidos para garantir que o anticorpo não tenha ligação a FcR (portanto, provavelmente não tenha atividade ADCC), mas retenha a capacidade de ligação a FcRn. As células primárias para mediação de ADCC, células NK, expressam Fc(RIII somente, enquanto monócitos expressam Fc(RI, Fc(RII e Fc(RIII, A expressão de FcR em células hematopoiéticas está em suma na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-492 (1991). Exemplos não limitantes de ensaios in vitro para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse são descritos na patente dos EUA de nº 5.500.362 (vide, por exemplo, Hellstrom, I. et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) e Hellstrom, I et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499 -1502 (1985); 5.821.337 (vide Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351 -1361 (1987)). Como alternativa, métodos de ensaios não radioativos podem ser empregados (vide, por exemplo, ensaio de citotoxicidade não radioativa ACTI™ para citometria de fluxo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; e ensaio de citotoxicidade não radioativa CYTOTOX 96® (Promega, Madison, WI))). Células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células Natural Killer (NK).

Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como o divulgado em Clynes et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652 -656 (1998). Os ensaios de ligação a C1q também podem ser realizados para confirmar que o anticorpo é incapaz de se ligar a C1q e, portanto, carece de atividade de CDC. Vide, por exemplo, ELISA de ligação a C1q e C3c nos documentos WO 2006/029879 e WO 2005/100402. Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio de CDC pode ser realizado (vide, por exemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, MS et al., Blood 101:1045-1052 (2003); e Cragg, MS e MJ Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). A ligação a FcRn e as determinações de eliminação/meia-vida in vivo também podem ser realizadas usando métodos conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Petkova, SB et al., Int'l, Immunol, 18(12):1759-1769 (2006)).

[0233] Anticorpos com função efetora reduzida incluem aqueles com substituição de um ou mais dos resíduos da região Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (patente dos EUA de nº 6.737.056). Tais mutantes Fc incluem mutantes Fc com substituições em duas ou mais posições de aminoácidos 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo o denominado mutante Fc "DANA" com substituição dos resíduos 265 e 297 por alanina (patente dos EUA de nº 7.332.581).

[0234] Certas variantes de anticorpo com ligação a FcRs melhorada ou diminuída são descritas. (Vide, por exemplo, patente dos EUA de nº 6.737.056; WO 2004/056312, e Shields et al., J. Biol. Chem.

9(2): 6591-6604 (2001)).

[0235] Em certos casos, uma variante de anticorpo compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácidos que aprimoram a ADCC, por exemplo, substituições nas posições 298, 333 e/ou 334 da região Fc (numeração da UE de resíduos).

Em uma modalidade exemplar, o anticorpo compreendendo as seguintes substituições de aminoácidos em sua região Fc: S298A, E333A e K334A.

[0236] Em algumas modalidades, são feitas alterações na região Fc que resultam na ligação a C1q alterada (ou seja, aprimorada ou diminuída) e/ou Citotoxicidade Dependente de Complemento (CDC), por exemplo, conforme descrito na patente dos EUA de nº 6.194.551, WO 99/51642 e Idusogie et al., J. Immunol, 164:4178-4184 (2000).

[0237] Anticorpos com meia-vida aumentada e ligação aprimorada ao receptor Fc neonatal (FcRn), que é responsável pela transferência de IgGs maternos para o feto (Guyer et al., J. Immunol, 117:587 (1976) e Kim et al., J. Immunol, 24:249 (1994)), são descritos em US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Esses anticorpos compreendem uma região Fc com uma ou mais substituições na mesma, o que melhora a ligação da região Fc a FcRn. Tais variantes Fc incluem aquelas com substituições em um ou mais dos resíduos da região Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 3 80, 382, 413, 424 ou 434, por exemplo, substituição do resíduo 434 da região Fc (patente dos EUA de nº 7.371.826). Vide também Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); Patente dos EUA de nº 5.648.260; Patente dos EUA de nº 5.624.821; e WO 94/29351 em relação a outros exemplos de variantes da região Fc.

(XII ) DERIVADOS DE ANTICORPOS

[0238] Em certas modalidades, os anticorpos da presente divulgação podem ser ainda modificados para conter frações não proteicas adicionais que são conhecidas na técnica e prontamente disponíveis. Em certas modalidades, as frações adequadas para derivatização do anticorpo são polímeros solúveis em água. Exemplos não limitantes de polímeros solúveis em água incluem, mas não estão limitados a polietilenoglicol (PEG), copolímeros de etilenoglicol/propilenoglicol, carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli- 1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anidrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros ou copolímeros aleatórios) e dextrano ou poli(n-vinil pirrolidona)polietilenoglicol, homopolímeros de propropilenoglicol,

copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol), álcool polivinílico e misturas dos mesmos. O propionaldeído de polietilenoglicol pode apresentar vantagens na fabricação devido à sua estabilidade em água. O polímero pode ter qualquer peso molecular e pode ser ramificado ou não ramificado. O número de polímeros ligados ao anticorpo pode variar, e se mais de um polímero estiver ligado, eles podem ser moléculas iguais ou diferentes, Em geral, o número e/ou tipo de polímeros usados para derivatização pode ser determinado com base em considerações, incluindo, mas não se limitando a, as propriedades ou funções particulares do anticorpo a serem melhoradas, se o derivado de anticorpo será usado em uma terapia sob condições definidas, etc.

(XIII) V ETORES, CÉLULAS HOSPEDEIRAS E MÉTODOS RECOMBINANTES

[0239] Os anticorpos também podem ser produzidos usando métodos recombinantes. Para a produção recombinante de um anticorpo antiantígeno, o ácido nucleico que codifica o anticorpo é isolado e inserido em um vetor replicável para posterior clonagem (amplificação do DNA) ou para expressão. Tal ácido nucleico pode ser facilmente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, pelo uso de sondas de oligonucleotídeo que são capazes de especificamente se ligarem aos genes que codificam as cadeias pesadas e leves do anticorpo).

Muitos vetores estão disponíveis. Os componentes do vetor geralmente incluem, mas não estão limitados a, um ou mais dos seguintes: uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento aperfeiçoador, um promotor e uma sequência de terminação da transcrição.

[0240] Em ainda um aspecto adicional, são fornecidos neste documento ácidos nucleicos que codificam qualquer um dos anticorpos descritos aqui. Em algumas modalidades, o ácido nucleico compreende ainda um vetor adequado para a expressão do ácido nucleico que codifica qualquer um dos anticorpos anti-PDL1, anti-PD-1 ou anti-PDL2 descritos anteriormente. Ainda em um aspecto específico adicional, o vetor compreende ainda uma célula hospedeira adequada para a expressão do ácido nucleico. Ainda em um aspecto específico adicional, a célula hospedeira é uma célula eucariótica ou uma célula procariótica. Em ainda um aspecto específico adicional, a célula eucariótica é uma célula de mamífero, tal como Ovário de Hamster Chinês (CHO).

[0241] Em ainda outra modalidade, é fornecido um ácido nucleico isolado que codifica uma sequência de região variável de cadeia leve ou de cadeia pesada de um anticorpo anti-PDL1, em que: (a) a cadeia pesada compreende ainda uma sequência HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 tendo pelo menos 85% de identidade de sequência a GFTFSDSWIH (SEQ ID NO: 1), AWISPYGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2) e RHWPGGFDY (SEQ ID NO : 3), respectivamente, e/ou (b) a cadeia leve compreende ainda uma sequência HVR- L1, HVR-L2 e HVR-L3 tendo pelo menos 85% de identidade de sequência a RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 4), SASFLYS (SEQ ID NO: 5) e QQYLYHPAT (SEQ ID NO : 6), respectivamente. Em um aspecto específico, a identidade de sequência é 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%.

[0242] O anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser produzido usando métodos conhecidos na técnica, por exemplo, por um processo que compreende cultivar uma célula hospedeira contendo ácido nucleico que codifica qualquer um dos anticorpos anti - PDL1, anti-PD-1 ou -PDL2 anteriormente descritos ou fragmento de ligação ao antígeno em uma forma adequada para expressão, sob condições adequadas para produzir tal anticorpo ou fragmento, e recuperar o anticorpo ou fragmento. Outras técnicas e métodos exemplares são descritos neste documento.

(A) COMPONENTE DE SEQUÊNCIA DE S INAL

[0243] Um anticorpo da presente divulgação pode ser produzido de forma recombinante não somente diretamente, mas também como um polipeptídeo de fusão com um polipeptídeo heterólogo, que é preferencialmente uma sequência de sinal ou outro polipeptídeo tendo um local de clivagem específico no N-terminal da proteína ou polipeptídeo maduro. A sequência de sinal heteróloga selecionada preferencialmente é aquela que é reconhecida e processada (por exemplo, clivada por uma peptidase de sinal) pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procarióticas que não reconhecem e processam uma sequência de sinal de anticorpo nativo, a sequência de sinal é substituída por uma sequência de sinal procariótica selecionada, por exemplo, a partir do grupo dos líderes de fosfatase alcalina, penicilinase, lpp ou enterotoxina estável ao calor II.

Para a secreção de levedura, a sequência de sinal nativa pode ser substituída por, por exemplo, o líder da invertase de levedura, um líder do fator (incluindo líderes do fator α de Saccharomyces e Kluyveromyces) ou líder da fosfatase ácida, o líder da glucoamilase C, albicans ou o sinal descrito em WO 90/13646. Na expressão de células de mamíferos, estão disponíveis sequências de sinal de mamífero, bem como líderes secretores virais, por exemplo, o sinal gD do herpes simplex.

(B) O RIGEM DE REPLICAÇÃO

[0244] Os vetores de expressão e clonagem contêm uma sequência de ácido nucleico que permite que o vetor se replique em uma ou mais células hospedeiras selecionadas. Geralmente, em vetores de clonagem, essa sequência permite que o vetor se replique independentemente do DNA cromossômico do hospedeiro e inclui origens de replicação ou sequências de replicação autônoma. Essas sequências são bem conhecidas para uma variedade de bactérias, leveduras e vírus. A origem de replicação do plasmídeo pBR322 é adequada para a maioria das bactérias Gram-negativas, SG 2µ, a origem do plasmídeo é adequada para levedura e várias origens virais (SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV) são úteis para vetores de clonagem em células de mamíferos. Geralmente, o componente de origem de replicação não é necessário para vetores de expressão de mamíferos (a origem de SV40 pode ser usada normalmente somente porque ela contém o promotor inicial).

(C) COMPONENTE DO GENE DE S ELEÇÃO

[0245] Os vetores de expressão e clonagem podem conter um gene de seleção, também denominado marcador selecionável. Genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas, ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis a partir de meios complexos, por exemplo, o gene que codifica a D-alanina racemase para Bacilli.

[0246] Um exemplo de um esquema de seleção usa um fármaco para deter o crescimento de uma célula hospedeira. As células que são transformadas com sucesso com um gene heterólogo produzem uma proteína que confere resistência ao fármaco e, portanto, sobrevivem ao regime de seleção. Exemplos de tal seleção dominante usam os fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

[0247] Outro exemplo de marcadores selecionáveis adequados para células de mamífero são aqueles que permitem a identificação de células competentes para absorver o ácido nucleico que codifica o anticorpo, tal como DHFR, glutamina sintetase (GS), timidina quinase, metalotioneína-I e -II, de preferência, genes primatas de metalotioneína, adenosina desaminase, ornitina descarboxilase, etc.

[0248] Por exemplo, as células transformadas com o gene DHFR são identificadas cultivando os transformantes em um meio de cultura contendo metotrexato (Mtx), um antagonista competitivo de DHFR.

Sob estas condições, o gene DHFR é amplificado junto com qualquer outro ácido nucleico cotransformado. Uma linhagem celular de ovário de hamster chinês (CHO) deficiente em atividade DHFR endógena (por exemplo, ATCC CRL-9096) pode ser usada.

[0249] Alternativamente, as células transformadas com o gene GS são identificadas pela cultura dos transformantes em um meio de cultura contendo L-metionina sulfoximina (Msx), um inibidor de GS. Sob estas condições, o gene GS é amplificado junto com qualquer outro ácido nucleico cotransformado. O sistema de seleção/amplificação GS pode ser usado em combinação com o sistema de seleção/amplificação DHFR descrito acima.

[0250] Alternativamente, as células hospedeiras (particularmente hospedeiras do tipo selvagem que contêm DHFR endógeno) transformadas ou cotransformadas com sequências de DNA que codificam um anticorpo de interesse, o gene DHFR do tipo selvagem e outro marcador selecionável, tal como 3'-fosfotransferase de aminoglicosídeo (APH), podem ser selecionados por crescimento celular em meio contendo um agente de seleção para o marcador selecionável, tal como um antibiótico aminoglicosídico, por exemplo, canamicina, neomicina ou G418. Vide patente dos EUA de nº 4.965.199.

[0251] Um gene de seleção adequado para uso em levedura é o gene trp1 presente no plasmídeo de levedura YRp7 (Stinchcomb et al.,

Nature, 282:39 (1979)). O gene trp1 fornece um marcador de seleção para uma cepa mutante de levedura sem a capacidade de crescer em triptofano, por exemplo, ATCC de nº 44076 ou PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). A presença da lesão trp1 no genoma da célula hospedeira de levedura fornece, em seguida, um ambiente eficaz para a detecção de transformação por crescimento na ausência de triptofano. Da mesma forma, as cepas de levedura deficientes em Leu2 (ATCC 20.622 ou 38.626) são complementadas por plasmídeos conhecidos portadores do gene Leu2.

[0252] Além disso, os vetores derivados do plasmídeo circular pKD1 de 1,6 µm podem ser usados para a transformação de leveduras Kluyveromyces. Alternativamente, um sistema de expressão para produção em larga escala de quimosina de bezerro recombinante foi relatado para K, lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). Também foram divulgados vetores de expressão de múltiplas cópias estáveis para secreção de albumina de soro humano recombinante maduro por cepas industriais de Kluyveromyces. Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991).

(D) S ELEÇÃO E T RANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS HOSPEDEIRAS

[0253] Células hospedeiras adequadas para clonar ou expressar o DNA nos vetores deste documento são as células procariotas, de levedura ou eucariotas superiores descritas acima. Procariotas adequados para este propósito incluem eubactérias, tais como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae, tal como Escherichia, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescans e Shigella, bem como Bacilli, tal como B. subtilis e B. licheniformis (por exemplo, B. licheniformis 41P divulgado em DD 266.710, publicado em 12 de abril de 1989), Pseudomonas, tais como

P. aeruginosa e Streptomyces. Um hospedeiro de clonagem de E. coli preferido é E. coli 294 (ATCC 31.446), embora outras cepas tais como E.

coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) e E. coli W3110 (ATCC 27.325) sejam adequadas. Esses exemplos são ilustrativos e não limitantes.

[0254] Anticorpos de comprimento total, proteínas de fusão de anticorpos e fragmentos de anticorpos podem ser produzidos em bactérias, em particular, quando a glicosilação e a função efetora de Fc não são necessárias, tal como quando o anticorpo terapêutico é conjugado a um agente citotóxico (por exemplo, uma toxina) que por si só mostra eficácia na destruição de células tumorais. Os anticorpos de comprimento total têm maior meia-vida em circulação. A produção em E. coli é mais rápida e econômica. Para a expressão de fragmentos de anticorpos e polipeptídeos em bactérias, vide, por exemplo, patente dos EUA de nº 5.648.237 (Carter et, Al,), patente dos EUA de nº 5.789.199 (Joly et al.), patente dos EUA de nº 5.840.523 (Simmons et al.), que descreve a região de iniciação da tradução (TIR) e sequências de sinal para otimizar a expressão e secreção.

(Vide também Charlton, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, descrevendo a expressão de fragmentos de anticorpo em E. coli,). Após a expressão, o anticorpo pode ser isolado da pasta celular de E. coli em uma fração solúvel e pode ser purificado através, por exemplo, de uma coluna de proteína A ou G dependendo do isotipo. A purificação final pode ser realizada de forma semelhante ao processo para purificar o anticorpo expresso, por exemplo, em células CHO.

[0255] Além dos procariotas, micróbios eucarióticos, tais como fungos filamentosos ou leveduras, são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vetores que codificam anticorpos.

Saccharomyces cerevisiae, ou fermento de padeiro comum, é o mais comumente usado entre os microrganismos hospedeiros eucarióticos inferiores. No entanto, vários outros gêneros, espécies e cepas estão comumente disponíveis e são úteis neste documento, tais como Schizosaccharomyces pombe; hospedeiros Kluyveromyces, tal como, por exemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K, waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K, thermotolerans e K, marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183.070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, tal como Schwanniomyces occidentalis; e fungos filamentosos, tais como, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium e hospedeiros Aspergillus, tais como A.

nidulans e A. niger. Para uma revisão que discute o uso de leveduras e fungos filamentosos para a produção de proteínas terapêuticas, vide, por exemplo, Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004).

[0256] Certos fungos e cepas de levedura podem ser selecionados nos quais as vias de glicosilação foram "humanizadas", resultando na produção de um anticorpo com um padrão de glicosilação parcial ou totalmente humano. Vide, por exemplo, Li et al., Nat. Biotech.

24: 210-215 (2006) (descrevendo a humanização da via de glicosilação em Pichia pastoris); e Gerngross et al., supra.

[0257] As células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpos glicosilados também são derivadas de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados). Exemplos de células de invertebrados incluem células vegetais e de insetos. Numerosas cepas e variantes de baculovirais e células hospedeiras permissivas de insetos de hospedeiros correspondentes, tais como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca da fruta) e Bombyx mori, foram identificadas. Uma variedade de cepas virais para transfecção estão disponíveis publicamente, por exemplo, a variante L-1 de Autographa californica NPV e a cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, e tais vírus podem ser usados como o vírus deste documento de acordo com a presente divulgação, particularmente para transfecção de células Spodoptera frugiperda.

[0258] Culturas de células vegetais de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate, lentilha d'água (Leninaceae), alfafa (M. truncatula) e tabaco também podem ser usadas como hospedeiros. Vide, por exemplo, as patentes dos EUA de nº 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 e

6.417.429 (descrevendo a tecnologia PLANTIBODIESTM para produzir anticorpos em plantas transgenéticas).

[0259] As células de vertebrados podem ser usadas como hospedeiros e a propagação das células de vertebrados em cultura (cultura de tecidos) tornou-se um procedimento de rotina. Exemplos de linhagens celulares hospedeiras de mamífero úteis são a linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al., J, Gen Virol, 36:59 (1977)); células de rim de hamster bebê (BHK, ATCC CCL 10); células de Sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células renais caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato e de búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci.

383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2). Outras linhagens celulares hospedeiras de mamíferos úteis incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células DHFR-CHO (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); e linhagens celulares de mieloma, tais como NS0 e Sp2/0.

Para uma revisão de certas linhagens celulares hospedeiras de mamíferos adequadas para a produção de anticorpos, vide, por exemplo, Yazaki e Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 255-268.

[0260] As células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão ou clonagem acima descritos para a produção de anticorpos e cultivadas em meio nutriente convencional modificado conforme apropriado para induzir promotores, selecionar transformantes ou amplificar os genes que codificam as sequências desejadas.

(E) CULTIVANDO AS CÉLULAS HOSPEDEIRAS

[0261] As células hospedeiras usadas para produzir um anticorpo da presente divulgação podem ser cultivadas em uma variedade de meios. Os meios comercialmente disponíveis, tais como Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) e Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma) são adequados para a cultura das células hospedeiras. Além disso, qualquer um dos meios descritos em Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal.

Biochem. 102: 255 (1980), patente dos EUA de nº 4.767.704; 4.657.866;

4.927.762; 4.560.655; ou 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; ou publicação de patente dos EUA de nº 30.985 podem ser usados como meio de cultura para as células hospedeiras. Qualquer um desses meios pode ser suplementado conforme necessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (tais como insulina, transferrina ou fator de crescimento epidérmico), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato),

tampões (tais como HEPES), nucleotídeos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tais como o medicamento GENTAMYCIN TM ), oligoelementos (definidos como compostos inorgânicos geralmente presentes em concentrações finais na faixa micromolar) e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários também podem ser incluídos em concentrações apropriadas que seriam conhecidas pelos técnicos no assunto. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e similares, são aquelas previamente usadas com a célula hospedeira selecionada para expressão e serão evidentes para o técnico no assunto.

(XIV ) P URIFICAÇÃO DE ANTICORPO

[0262] Ao usar técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido intracelularmente, no espaço periplasmático, ou diretamente secretado no meio. Se o anticorpo for produzido intracelularmente, como uma primeira etapa, os detritos particulados, sejam células hospedeiras ou fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) descreve um procedimento para isolar anticorpos que são segregados para o espaço periplasmático de E. coli. Em suma, a pasta celular é descongelada na presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA e fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF) por cerca de 30 min, Os detritos celulares podem ser removidos por centrifugação. Quando o anticorpo é segregado para o meio, os sobrenadantes de tais sistemas de expressão são geralmente primeiro concentrados usando um filtro de concentração de proteína disponível comercialmente, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de protease, tal como PMSF, pode ser incluído em qualquer uma das etapas anteriores para inibir a proteólise e antibióticos podem ser incluídos para prevenir o crescimento de contaminantes adventícios.

[0263] A composição de anticorpo preparada a partir das células pode ser purificada usando, por exemplo, cromatografia de hidroxilapatita, cromatografia de interação hidrofóbica, eletroforese em gel, diálise e cromatografia de afinidade, estando a cromatografia de afinidade entre uma das etapas de purificação normalmente preferidas. A adequação da proteína A como um ligante de afinidade depende da espécie e do isotipo de qualquer domínio Fc de imunoglobulina que está presente no anticorpo. A proteína A pode ser usada para purificar anticorpos que são baseados nas cadeias pesadas humanas γ1, γ2 ou γ4 (Lindmark et al., J.

Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). A proteína G é recomendada para todos os isotipos de camundongo e para γ3 humana (Guss et al., EMBO J. 5: 15671575 (1986)). A matriz à qual o ligante de afinidade está ligado é mais frequentemente agarose, mas outras matrizes estão disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis, tais como vidro de poro controlado ou poli(estirenodivinil)benzeno, permitem taxas de fluxo mais rápidas e tempos de processamento mais curtos do que podem ser alcançados com agarose. Quando o anticorpo compreende um domínio CH3, a resina Bakerbond ABXTM (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) é útil para purificação.

Outras técnicas para purificação de proteínas, tais como fracionamento em uma coluna de troca iônica, precipitação com etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina SEPHAROSETM, cromatografia em resina de troca catiônica ou aniônica (tal como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofocalização, SDS - PAGE e precipitação com sulfato de amônio também estão disponíveis dependendo do anticorpo a ser recuperado.

[0264] Em geral, várias metodologias para a preparação de anticorpos para uso em pesquisa, teste e clínica são bem estabelecidas na técnica, consistentes com as metodologias acima descritas e/ou conforme considerado apropriado por um técnico no assunto para um anticorpo particular de interesse.

VI. S ELEÇÃO DE ANTICORPOS BIOLOGICAMENTE ATIVOS

[0265] Os anticorpos produzidos conforme descrito acima podem ser submetidos a um ou mais ensaios de "atividade biológica" para selecionar um anticorpo com propriedades benéficas a partir de uma perspectiva terapêutica ou selecionar formulações e condições que retêm a atividade biológica do anticorpo. O anticorpo pode ser testado quanto à sua capacidade de se ligar ao antígeno contra o qual foi criado. Por exemplo, podem ser usados métodos conhecidos na técnica (tais como ELISA, Western Blot, etc.).

[0266] Por exemplo, para um anticorpo anti-PDL1, as propriedades de ligação ao antígeno do anticorpo podem ser avaliadas em um ensaio que detecta a capacidade de se ligar ao PDL1. Em algumas modalidades, a ligação do anticorpo pode ser determinada por ligação de saturação; ELISA; e/ou ensaios de competição (por exemplo, RIA's), por exemplo. Além disso, o anticorpo pode ser submetido a outros ensaios de atividade biológica, por exemplo, a fim de avaliar sua eficácia como um terapêutico. Tais ensaios são conhecidos na técnica e dependem do antígeno alvo e do uso pretendido para o anticorpo. Por exemplo, os efeitos biológicos do bloqueio de PD-L1 pelo anticorpo podem ser avaliados em células T CD8+, um modelo de camundongo do vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV) e/ou um modelo de tumor singênico, por exemplo, conforme descrito na patente dos EUA de nº 8.217.149.

[0267] Para rastrear anticorpos que se ligam a um epítopo específico no antígeno de interesse (por exemplo, aqueles que bloqueiam a ligação do anticorpo anti-PDL1 do exemplo a PD-L1), pode ser realizado um ensaio de bloqueio cruzado de rotina, tal como o descrito em Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988). Alternativamente, o mapeamento de epítopos, por exemplo, como descrito em Champe et al., J. Biol. Chem, 270:1388- 1394 (1995), pode ser realizado para determinar se o anticorpo se liga a um epítopo de interesse.

VII. COMPOSIÇÕES E FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS

[0268] Também são fornecidas neste documento composições e formulações farmacêuticas, por exemplo, para o tratamento de câncer de pulmão (tal como câncer de pulmão de pequenas células, por exemplo, câncer de pulmão de pequenas células em estágio extensivo) compreendendo um antagonista de ligação ao eixo PD-1 (tal como atezolizumabe), uma platina agente (tal como carboplatina) e um inibidor de topoisomerase II (tal como etoposídeo). Em algumas modalidades, as composições e formulações farmacêuticas compreendem ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0269] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-PDL1 descrito neste documento (tal como atezolizumab) está em uma formulação que compreende o anticorpo em uma quantidade de cerca de 60 mg/mL, acetato de histidina em uma concentração de cerca de 20 mM, sacarose em uma concentração de cerca de 120 mM e polissorbato (por exemplo, polissorbato 20) em uma concentração de 0,04% (p/v), e a formulação tem um pH de cerca de 5,8. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PDL1 descrito neste documento (tal como atezolizumabe) está em uma formulação que compreende o anticorpo em uma quantidade de cerca de 125 mg/mL, acetato de histidina em uma concentração de cerca de 20 mM, sacarose está em uma concentração de cerca de 240 mM e polissorbato (por exemplo, polissorbato 20) em uma concentração de 0,02% (p/v), e a formulação tem um pH de cerca de 5,5.

[0270] Após a preparação do anticorpo de interesse (por exemplo, as técnicas para a produção de anticorpos que podem ser formulados como divulgados neste documeto são elaboradas aqui e são conhecidas na técnica), a formulação farmacêutica que o compreende é preparada. Em certas modalidades, o anticorpo a ser formulado não foi submetido a liofilização prévia e a formulação de interesse deste documento é uma formulação aquosa. Em certas modalidades, o anticorpo é um anticorpo de comprimento total. Em uma modalidade, o anticorpo na formulação é um fragmento de anticorpo, tal como um F(ab')2, caso em que problemas que podem não ocorrer para o anticorpo de comprimento total (tal como clipe do anticorpo para Fab) podem precisar ser endereçados. A quantidade terapeuticamente eficaz de anticorpo presente na formulação é determinada levando em consideração os volumes de dose desejados e o(s) modo(s) de administração, por exemplo. De cerca de 25 mg/mL a cerca de 150 mg/mL, ou de cerca de 30 mg/mL a cerca de 140 mg/mL, ou de cerca de 35 mg/mL a cerca de 130 mg/mL, ou de cerca de 40 mg/mL a cerca de 120 mg/mL, ou de cerca de 50 mg/mL a cerca de 130 mg/mL, ou de cerca de 50 mg/mL a cerca de 125 mg/mL, ou de cerca de 50 mg/mL a cerca de 120 mg/mL, ou de cerca de 50 mg/mL a cerca de 110 mg/mL, ou de cerca de 50 mg/mL a cerca de 100 mg/mL, ou de cerca de 50 mg/mL a cerca de 90 mg/mL, ou de cerca de 50 mg/mL a cerca de 80 mg/mL, ou de cerca de 54 mg/mL a cerca de 66 mg/mL é uma concentração de anticorpo exemplar na formulação.

[0271] Uma formulação aquosa é preparada compreendendo o anticorpo em uma solução tamponada com pH. Em algumas modalidades, a composição da presente divulgação tem um pH de cerca de 5,0 a cerca de 7,0. Em certas modalidades, o pH está na faixa de cerca de

5,0 a cerca de 6,5, o pH está na faixa de cerca de 5,0 a cerca de 6,4, na faixa de cerca de 5,0 a cerca de 6,3, o pH está na faixa de cerca de 5,0 a cerca de 6,2, o pH está na faixa de cerca de 5,0 a cerca de 6,1, o pH está na faixa de cerca de 5,5 a cerca de 6,1, o pH está na faixa de cerca de 5,0 a cerca de 6,0, o pH está na faixa de cerca de 5,0 a cerca de 5,9, o pH está na faixa de cerca de 5,0 a cerca de 5,8, o pH está na faixa de cerca de 5,1 a cerca de 6,0, o pH está na faixa de cerca de 5,2 a cerca de 6,0, o pH está na faixa de cerca de 5,3 a cerca de 6,0, o pH está na faixa de cerca de 5,4 a cerca de 6,0, o pH está na faixa de cerca de 5,5 a cerca de

6,0, o pH está na faixa de cerca de 5,6 a cerca de 6,0, o pH está na faixa de cerca de 5,7 a cerca de 6,0, ou o pH está na faixa de cerca de 5,8 a cerca de 6,0. Em algumas modalidades, a formulação tem um pH de 6,0 ou cerca de 6,0. Em algumas modalidades, a formulação tem um pH de 5,9 ou cerca de 5,9. Em algumas modalidades, a formulação tem um pH de 5,8 ou cerca de 5,8. Em algumas modalidades, a formulação tem um pH de 5,7 ou cerca de 5,7. Em algumas modalidades, a formulação tem um pH d e 5,6 ou cerca de 5,6. Em algumas modalidades, a formulação tem um pH de 5,5 ou cerca de 5,5. Em algumas modalidades, a formulação tem um pH de 5,4 ou cerca de 5,4. Em algumas modalidades, a formulação tem um pH de 5,3 ou cerca de 5,3. Em algumas modalidades, a formulação tem um pH de 5,2 ou cerca de 5,2. Exemplos de tampões que irão controlar o pH dentro desta faixa incluem histidina (tal como L-histidina) ou acetato de sódio.

Em certas modalidades, o tampão contém acetato de histidina ou acetato de sódio na concentração de cerca de 15 mM a cerca de 25 mM.

Em algumas modalidades, o tampão contém acetato de histidina ou acetato de sódio na concentração de cerca de 15 mM a cerca de 25 mM, cerca de 16 mM a cerca de 25 mM, cerca de 17 mM a cerca de 25 mM, cerca de 18 mM a cerca de 25 mM, cerca de 19 mM a cerca de 25 mM, cerca de 20 mM a cerca de 25 mM, cerca de 21 mM a cerca de 25 mM, cerca de 22 mM a cerca de 25 mM, cerca de 15 mM, cerca de 16 mM, cerca de 17 mM, cerca de 18 mM, cerca de 19 mM, cerca de 20 mM, cerca de 21 mM, cerca de 22 mM, cerca de 23 mM, cerca de 24 mM ou cerca de 25 mM.

Em uma modalidade, o tampão é acetato de histidina ou acetato de sódio em uma quantidade de cerca de 20 mM, pH 5,0. Em uma modalidade, o tampão é acetato de histidina ou acetato de sódio em uma quantidade de cerca de

20 mM, pH 5,1. Em uma modalidade, o tampão é acetato de histidina ou acetato de sódio em uma quantidade de cerca de 20 mM, pH 5,2. Em uma modalidade, o tampão é acetato de histidina ou acetato de sódio em uma quantidade de cerca de 20 mM, pH 5,3. Em uma modalidade, o tampão é acetato de histidina ou acetato de sódio em uma quantidade de cerca de

20 mM, pH 5,4. Em uma modalidade, o tampão é acetato de histidina ou acetato de sódio em uma quantidade de cerca de 20 mM, pH 5,5. Em uma modalidade, o tampão é acetato de histidina ou acetato de sódio em uma quantidade de cerca de 20 mM, pH 5,6. Em uma modalidade, o tampão é acetato de histidina ou acetato de sódio em uma quantidade de cerca de

20 mM, pH 5,7. Em uma modalidade, o tampão é acetato de histidina ou acetato de sódio em uma quantidade de cerca de 20 mM, pH 5,8. Em uma modalidade, o tampão é acetato de histidina ou acetato de sódio em uma quantidade de cerca de 20 mM, pH 5,9. Em uma modalidade, o tampão é acetato de histidina ou acetato de sódio em uma quantidade de cerca de

20 mM, pH 6,0. Em uma modalidade, o tampão é acetato de histidina ou acetato de sódio em uma quantidade de cerca de 20 mM, pH 6,1. Em uma modalidade, o tampão é acetato de histidina ou acetato de sódio em uma quantidade de cerca de 20 mM, pH 6,2. Em uma modalidade, o tampão é acetato de histidina ou acetato de sódio em uma quantidade de cerca de

20 mM, pH 6,3. Em uma modalidade, o tampão é acetato de histidina ou acetato de sódio em uma quantidade de cerca de 25 mM, pH 5,2. Em uma modalidade, o tampão é acetato de histidina ou acetato de sódio em uma quantidade de cerca de 25 mM, pH 5,3. Em uma modalidade, o tampão é acetato de histidina ou acetato de sódio em uma quantidade de cerca de 25 mM, pH 5,4. Em uma modalidade, o tampão é acetato de histidina ou acetato de sódio em uma quantidade de cerca de 25 mM, pH 5,5. Em uma modalidade, o tampão é acetato de histidina ou acetato de sódio em uma quantidade de cerca de 25 mM, pH 5,6. Em uma modalidade, o tampão é acetato de histidina ou acetato de sódio em uma quantidade de cerca de 25 mM, pH 5,7. Em uma modalidade, o tampão é acetato de histidina ou acetato de sódio em uma quantidade de cerca de 25 mM, pH 5,8. Em uma modalidade, o tampão é acetato de histidina ou acetato de sódio em uma quantidade de cerca de 25 mM, pH 5,9. Em uma modalidade, o tampão é acetato de histidina ou acetato de sódio em uma quantidade de cerca de 25 mM, pH 6,0. Em uma modalidade, o tampão é acetato de histidina ou acetato de sódio em uma quantidade de cerca de 25 mM, pH 6,1. Em uma modalidade, o tampão é acetato de histidina ou acetato de sódio em uma quantidade de cerca de 25 mM, pH 6,2. Em uma modalidade, o tampão é acetato de histidina ou acetato de sódio em uma quantidade de cerca de 25 mM, pH 6,3.

[0272] Em algumas modalidades, a formulação compreende ainda sacarose em uma quantidade de cerca de 60 mM a cerca de 240 mM. Em algumas modalidades, a sacarose na formulação é de cerca de 60 mM a cerca de 230 mM, cerca de 60 mM a cerca de 220 mM, cerca de 60 mM a cerca de 210 mM, cerca de 60 mM a cerca de 200 mM, cerca de 60 mM a cerca de 190 mM, cerca de 60 mM a cerca de 180 mM, cerca de 60 mM a cerca de 170 mM, cerca de 60 mM a cerca de 160 mM, cerca de 60 mM a cerca de 150 mM, cerca de 60 mM a cerca de 140 mM, cerca de 80 mM a cerca de 240 mM, cerca de 90 mM a cerca de 240 mM, cerca de 100 mM a cerca de 240 mM, cerca de 110 mM a cerca de 240 mM, cerca de 120 mM a cerca de 240 mM, cerca de 130 mM a cerca de 240 mM, cerca de 140 mM a cerca de 240 mM, cerca de 150 mM a cerca de 240 mM, cerca de 160 mM a cerca de 240 mM, cerca de 170 mM a cerca de 240 mM, cerca de 180 mM a cerca de 240 mM, cerca de 190 mM a cerca de 240 mM, cerca de 200 mM a cerca de 240 mM, cerca de 80 mM a cerca de 160 mM, cerca de 100 mM a cerca de 140 mM, ou cerca de 110 mM a cerca de 130 mM. Em algumas modalidades, a sacarose na formulação é de cerca de 60 mM, cerca de 70 mM, cerca de 80 mM, cerca de 90 mM, cerca de 100 mM, cerca de 110 mM, cerca de 120 mM, cerca de 130 mM, cerca de 140 mM, cerca de 150 mM, cerca de 160 mM, cerca de 170 mM, cerca de 180 mM, cerca de 190 mM, cerca de 200 mM, cerca de 210 mM, cerca de 220 mM, cerca de 230 mM ou cerca de 240 mM.

[0273] Em algumas modalidades, a concentração de anticorpo na formulação é de cerca de 40 mg/ml a cerca de 125 mg/ml. Em algumas modalidades, a concentração de anticorpo na formulação é de cerca de 40 mg/ml a cerca de 120 mg/ml, cerca de 40 mg/ml a cerca de 110 mg/ml, cerca de 40 mg/ml a cerca de 100 mg/ml, cerca de 40 mg/ml a cerca de 90 mg/ml, cerca de 40 mg/ml a cerca de 80 mg/ml, cerca de 40 mg/ml a cerca de 70 mg/ml, cerca de 50 mg/ml a cerca de 120 mg/ml, cerca de 60 mg/ml a cerca de 120 mg/ml, cerca de 70 mg/ml a cerca de 120 mg/ml, cerca de 80 mg/ml a cerca de 120 mg/ml, cerca de 90 mg/ml a cerca de 120 mg/ml, ou cerca de 100 mg/ml a cerca de 120 mg/ml. Em algumas modalidades, a concentração de anticorpo na formulação é de cerca de 60 mg/ml. Em algumas modalidades, a concentração de anticorpo na formulação é de cerca de 65 mg/ml. Em algumas modalidades, a concentração de anticorpo na formulação é de cerca de 70 mg/ml. Em algumas modalidades, a concentração de anticorpo na formulação é de cerca de 75 mg/ml. Em algumas modalidades, a concentração de anticorpo na formulação é de cerca de 80 mg/ml. Em algumas modalidades, a concentração de anticorpo na formulação é de cerca de 85 mg/ml. Em algumas modalidades, a concentração de anticorpo na formulação é de cerca de 90 mg/ml. Em algumas modalidades, a concentração de anticorpo na formulação é de cerca de 95 mg/ml. Em algumas modalidades, a concentração de anticorpo na formulação é de cerca de 100 mg/ml. Em algumas modalidades, a concentração de anticorpo na formulação é de cerca de 110 mg/ml. Em algumas modalidades, a concentração de anticorpo na formulação é de cerca de 125 mg/ml.

[0274] Em algumas modalidades, um surfactante é adicionado à formulação de anticorpo. Surfactantes exemplares incluem surfactantes não iônicos, tais como polissorbatos (por exemplo, polissorbatos 20, 80 etc.) ou poloxâmeros (por exemplo, poloxamer 188, etc.). A quantidade de surfactante adicionada é tal que reduz a agregação do anticorpo formulado e/ou minimiza a formação de partículas na formulação e/ou reduz a adsorção. Por exemplo, o surfactante pode estar presente na formulação em uma quantidade de cerca de 0,001% a cerca de 0,5% (p/v). Em algumas modalidades, o surfactante (por exemplo, polissorbato 20) é de cerca de 0,005% a cerca de 0,2%, de cerca de 0,005% a cerca de 0,1%, de cerca de 0,005% a cerca de 0,09%, de cerca de 0,005% a cerca de 0,08%, de cerca de cerca de 0,005% a cerca de 0,07%, de cerca de 0,005% a cerca de 0,06%, de cerca de 0,005% a cerca de 0,05%, de cerca de 0,005% a cerca de 0,04%, de cerca de 0,008% a cerca de 0,06%, de cerca de 0,01% a cerca 0,06%, de cerca de 0,02% a cerca de 0,06%, de cerca de 0,01% a cerca de 0,05%, ou de cerca de 0,02% a cerca de 0,04%. Em certas modalidades, o surfactante (por exemplo, polissorbato 20) está presente na formulação em uma quantidade de 0,005% ou cerca de

0,005%. Em certas modalidades, o surfactante (por exemplo, polissorbato

20) está presente na formulação em uma quantidade de 0,006% ou cerca de 0,006%. Em certas modalidades, o surfactante (por exemplo,

polissorbato 20) está presente na formulação em uma quantidade de

0,007% ou cerca de 0,007%. Em certas modalidades, o surfactante (por exemplo, polissorbato 20) está presente na formulação em uma quantidade de 0,008% ou cerca de 0,008%. Em certas modalidades, o surfactante (por exemplo, polissorbato 20) está presente na formulação em uma quantidade de 0,009% ou cerca de 0,009%. Em certas modalidades, o surfactante (por exemplo, polissorbato 20) está presente na formulação em uma quantidade de 0,01% ou cerca de 0,01%. Em certas modalidades, o surfactante (por exemplo, polissorbato 20) está presente na formulação em uma quantidade de 0,02% ou cerca de 0,02%. Em certas modalidades, o surfactante (por exemplo, polissorbato 20) está presente na formulação em uma quantidade de 0,03% ou cerca de 0,03%. Em certas modalidades, o surfactante (por exemplo, polissorbato 20) está presente na formulação em uma quantidade de 0,04% ou cerca de 0,04%. Em certas modalidades, o surfactante (por exemplo, polissorbato 20) está presente na formulação em uma quantidade de 0,05% ou cerca de 0,05%. Em certas modalidades, o surfactante (por exemplo, polissorbato 20) está presente na formulação em uma quantidade de 0,06% ou cerca de 0,06%. Em certas modalidades, o surfactante (por exemplo, polissorbato 20) está presente na formulação em uma quantidade de 0,07% ou cerca de 0,07%. Em certas modalidades, o surfactante (por exemplo, polissorbato 20) está presente na formulação em uma quantidade de 0,08% ou cerca de 0,08%. Em certas modalidades, o surfactante (por exemplo, polissorbato 20) está presente na formulação em uma quantidade de 0,1% ou cerca de 0,1%. Em certas modalidades, o surfactante (por exemplo, polissorbato 20) está presente na formulação em uma quantidade de 0,2% ou cerca de 0,2%. Em certas modalidades, o surfactante (por exemplo, polissorbato 20) está presente na formulação em uma quantidade de 0,3% ou cerca de 0,3%. Em certas modalidades, o surfactante (por exemplo, polissorbato 20) está presente na formulação em uma quantidade de 0,4% ou cerca de 0,4%. Em certas modalidades, o surfactante (por exemplo, polissorbato 20) está presente na formulação em uma quantidade de 0,5% ou cerca de 0,5%.

[0275] Em uma modalidade, a formulação contém os agentes identificados acima (por exemplo, anticorpo, tampão, sacarose e/ou surfactante) e é essencialmente livre de um ou mais conservantes, tais como álcool benzílico, fenol, m-cresol, clorobutanol e Cl de benzetônio. Em outra modalidade, um conservante pode ser incluído na formulação, particularmente quando a formulação é uma formulação multidose. A concentração de conservante pode estar na faixa de cerca de 0,1% a cerca de 2%, de preferência de cerca de 0,5% a cerca de 1%. Um ou mais outros veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis, tais como os descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edição, Osol, A. ed. (1980), podem estar incluídos na formulação, desde que não afetem adversamente as características desejadas da formulação. Os veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis não são tóxicos aos destinatários nas dosagens e concentrações usadas e incluem: agentes tamponantes adicionais; cossolventes; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metionina; agentes quelantes, tais como EDTA; complexos de metal (por exemplo, complexos de Zn-proteína); polímeros biodegradáveis, tais como poliésteres; e/ou contra-íons formadores de sal. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis exemplares deste documento incluem ainda agentes de dispersão de fármacos instersticiais, tais como glicoproteínas de hialuronidase neutra-ativa solúvel (sHASEGP), por exemplo, glicoproteínas de hialuronidase PH-20 solúveis humanas, tais como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Certos exemplos de sequências e métodos de uso, incluindo rHuPH20, são descritos nas publicações de patente dos EUA de nº 2005/0260186 e 2006/0104968. Em um aspecto, uma sHASEGP é combinada com uma ou mais glicosaminoglicanases adicionais, tais como condroitinases.

[0276] A formulação deste documento também pode conter mais de uma proteína conforme necessário para a indicação particular a ser tratada, de preferência, aquela com atividades complementares que não afetam adversamente a outra proteína. Por exemplo, onde o anticorpo é anti-PDL1 (tal como atezolizumab), ele pode ser combinado com outro agente (por exemplo, um agente quimioterapêutico e um agente antineoplásico).

[0277] As composições e formulações farmacêuticas conforme descritas neste documento podem ser preparadas misturando os ingredientes ativos (tais como um anticorpo ou um polipeptídeo) tendo o grau de pureza desejado com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences 16ª edição, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis são geralmente não tóxicos para os destinatários nas dosagens e concentrações empregues e incluem, mas não estão limitados a: tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzilamónio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquilparabenos, tais como parabeno de metila ou propila; catecol;

resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, tais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal, tais como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou surfactantes não iônicos, tais como polietilenoglicol (PEG). Os veículos farmaceuticamente aceitáveis exemplares deste documento incluem ainda agentes de dispersão de fármacos instersticiais, tais como glicoproteínas de hialuronidase neutra-ativa solúvel (sHASEGP), por exemplo, glicoproteínas de hialuronidase PH-20 solúveis humanas, tais como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Certos exemplos de sequências e métodos de uso, incluindo rHuPH20, são descritos nas publicações de patente dos EUA de nº 2005/0260186 e 2006/0104968. Em um aspecto, uma sHASEGP é combinada com uma ou mais glicosaminoglicanases adicionais, tais como condroitinases.

[0278] Formulações de anticorpos liofilizados exemplares são descritas na patente dos EUA de nº 6.267.958. As formulações de anticorpo aquosas incluem aquelas descritas na patente dos EUA de nº

6.171.586 e WO2006/044908, as últimas formulações incluindo um tampão de acetato de histidina.

[0279] A composição deste documento também pode conter mais do que um ingrediente ativo conforme necessário para a indicação particular a ser tratada, de preferência, aqueles com atividades complementares que não afetam adversamente uns aos outros. Tais ingredientes ativos estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.

[0280] Os ingredientes ativos podem ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de distribuição de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edição, Osol, A, ed. (1980).

[0281] Preparações de liberação sustentada podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo, cujas matrizes estão na forma de artigos moldados, por exemplo, películas ou microcápsulas. As formulações a serem usadas para administração in vivo são geralmente estéreis. A esterilidade pode ser prontamente realizada, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéreis.

[0282] Formulações farmacêuticas de carboplatina e/ou etoposídeo estão disponíveis comercialmente. Por exemplo, a carboplatina é conhecida sob uma variedade de nomes comerciais (conforme descrito em outro lugar neste documento), incluindo PARAPLATIN®. O etoposídeo é conhecido sob uma variedade de nomes comerciais (conforme descrito em outro lugar neste documento), incluindo VP-16, ETOPOPHOS®, TOPOSAR™ e VEPESID®. Em algumas modalidades, a carboplatina e/ou o etoposídeo são fornecidos em recipientes separados. Em algumas modalidades, a carboplatina e/ou o etoposídeo são usados e/ou preparados para administração a um indivíduo conforme descrito na informação de prescrição disponível com o produto comercialmente disponível.

VIII. MÉTODOS DE TRATAMENTO

[0283] São fornecidos neste documento métodos para tratar ou retardar a progressão de câncer (tal como câncer de pulmão, po r exemplo, câncer de pulmão de pequenas células, por exemplo, câncer de pulmão de pequenas células em estágio extensivo) em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um antagonista de ligação ao eixo PD-1 (por exemplo, um anticorpo anti-PD- L1), um agente de platina (por exemplo, carboplatina) e um inibidor de topoisomerase (por exemplo, etoposídeo). Em algumas modalidades, o tratamento resulta em uma resposta sustentada no indivíduo após a cessação do tratamento. Em algumas modalidades, o tratamento estende a sobrevida livre de progressão (SLP) e/ou a sobrevida global (SG) do indivíduo. Os métodos descritos neste documento podem encontrar uso no tratamento de condições onde a imunogenicidade aperfeiçoada é desejada, tal como o aumento da imunogenicidade do tumor para o tratamento de câncer. Também são fornecidos neste documento métodos para aperfeiçoar a função imunológica em um indivíduo com câncer (tal como câncer de pulmão, por exemplo, câncer de pulmão de pequenas células, por exemplo, câncer de pulmão de pequenas células em estágio extensivo) em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um antagonista de ligação ao eixo PD-1 (por exemplo, um anticorpo anti-PD-L1), um agente de platina (por exemplo, carboplatina) e um inibidor de topoisomerase (por exemplo, etoposídeo).

[0284] Em algumas modalidades, o câncer de pulmão é câncer de pulmão de pequenas células (CPPC). Em algumas modalidades,

o CPPC é câncer de pulmão de pequenas células em estágio extensivo (CPPC-EE), também referido como CPPC em estágio 4 (IV). Em algumas modalidades, o CPPC é histologicamente ou citologicamente confirmado CPPC-EE, de acordo com ou conforme definido pelo sistema de estadiamento Veterans Administration Lung Study Group (VALG) (vide, por exemplo, Micke et al., (2002) “Staging small cell lung cancer: Veterans Administration Lung Study Group versus International Association for the Study of Lung Cancer—what limits limited disease?” Lung Cancer 37:271- 6). Em algumas modalidades, o CPPC é classificado como CPPC-EE se o indivíduo está inoperável e não pode ser classificado como tendo CPPC em estágio limitado ou limitado (CPPC-L ou CPPC-EL). Em algumas modalidades, o CPPC-EE é detectável e/ou se espalhou para fora do pulmão originalmente afetado. Em algumas modalidades, o CPPC-EE é detectável e/ou se espalhou para outros órgãos (por exemplo, distantes), tais como (mas não se limitando a) o fígado, glândulas adrenais, nódulos linfáticos e/ou cérebro. Em algumas modalidades, o CPPC-EE é difícil de tratar.

[0285] Em algumas modalidades, o indivíduo tem um prognóstico ruim. Em algumas modalidades, o indivíduo é um indivíduo sem exposição prévia ao tratamento. Em algumas modalidades, um indivíduo sem exposição prévia ao tratamento é um indivíduo que não recebeu tratamento prévio, por exemplo, para câncer, para CPPC ou para CPPC-EE. Em algumas modalidades, o indivíduo sem exposição prévia ao tratamento é um indivíduo que não recebeu tratamento prévio para CPPC - EE. Em algumas modalidades, o indivíduo sem exposição prévia ao tratamento é sem exposição prévia à quimioterapia, por exemplo, um indivíduo que não recebeu quimioterapia prévia para o tratamento de, por exemplo, câncer, CPPC e/ou CPPC-EE. Em algumas modalidades, o indivíduo não recebeu tratamento para CPPC-EE. Em algumas modalidades, o indivíduo não recebeu tratamento sistêmico prévio pa ra CPPC-EE. Em algumas modalidades, o indivíduo recebeu quimiorradioterapia prévia para CPPC em estágio limitado (CPPC-EL) com intenção curativa e experimentou um ciclo sem tratamento de pelo menos 6 meses desde a última quimioterapia, radioterapia ou ciclo de quimiorradioterapia a partir do diagnóstico de CPPC-EE. Em algumas modalidades, o indivíduo tem metástases assintomáticas supratentorial ou cerebelar no sistema nervoso central (SNC). Em algumas modalidades, o indivíduo não tem metástases para o mesencéfalo, ponte, medula ou medula espinhal. Em algumas modalidades, o indivíduo tem doença do SNC e não requer tratamento com corticosteroides para a doença do SNC.

Em algumas modalidades, o indivíduo tem novas metástases assintomáticas e recebeu radioterapia e/ou cirurgia para metástases do SNC. Em algumas modalidades, o indivíduo tem doença mensurável, de acordo com/conforme definido pelos critérios RECIST v1.1 (vide, por exemplo, Eisenhauer et al., (2009) “New response evaluation criteria in solid tumors: Revised RECIST guideline (version 1.1)”. Eur, J, Cancer, 45: 228-247). Em algumas modalidades, o indivíduo não recebeu tratamento prévio com um agonista CD137 ou uma terapia de bloqueio de ponto de controle imunológico, por exemplo, incluindo, sem limitação, um anticorpo anti-PD-1 ou um anticorpo anti-PD-L1.

[0286] Qualquer um dos antagonistas de ligação ao eixo PD- 1, agentes de platina e inibidores de topoisomerase II conhecidos na técnica ou descritos neste documento podem ser usados nos métodos. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo PD-1 é atezolizumabe, o agente de platina é carboplatina ou cisplatina e/ou o inibidor de topoisomerase II é etoposídeo.

[0287] Em algumas modalidades, o tratamento compreende uma fase de indução e uma fase de manutenção (ou "terapia de manutenção"). Em algumas modalidades, a fase de indução compreende administrar o antagonista de ligação ao eixo PD-1 (por exemplo, um anticorpo anti-PD-L1, tal como atezolizumabe) a uma dose de 1200 mg no dia 1, o agente de platina (por exemplo, carboplatina ou cisplatina) a uma dose suficiente para alcançar uma Área sob a curva (ASC) alvo inicial de 5 mg/mL/min no dia 1 e o inibidor de topoisomerase II (por exemplo,

etoposídeo) a uma dose de 100 mg/m 2 em cada um dos dias 1, 2 e 3 de cada ciclo de 21 dias para os ciclos 1 a 4. Em algumas modalidades, a fase de manutenção compreende administrar o antagonista de ligação ao eixo

PD-1 (por exemplo, um anticorpo anti-PD-L1, tal como atezolizumabe) a uma dose de 1200 mg no dia 1 de cada ciclo de 21 dias após o ciclo 4. Um programa de dosagem e administração exemplar que compreende um ciclo de indução e um ciclo de manutenção é fornecido na Tabela 4 abaixo:

TABELA 4: PROGRAMAÇÃO DE ADMINISTRAÇÃO E DOSAGEM EXEMPLAR Indução Manutenção Fase de Fase de

Fármacos Ciclos 1 a 4* > Ciclo 4* (listados em ordem de administração) Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 1

1) anti-PD-L1 Ab 1200 mg 1200 mg (atezolizumabe)

2) agente de platina (carboplatina ou ASC = 5ǂ cisplatina)

3) inibidor da topoisomerase II 100 mg/m2 100 mg/m2 100 mg/m2 (etoposídeo)

* Ciclos de 21 dias.

ǂ mg/ml/min.

[0288] Em algumas modalidades, a dose de 1200 mg de atezolizumabe é equivalente a uma dose média baseada no peso corporal de 15 m/kg. Em algumas modalidades, a dose de carboplatina necessária para alcançar uma ASC de 5 mg/mL/min é calculada de acordo com a fórmula de Calvert (vide, por exemplo, Calvert et al., (1989) “Carboplatin dosage: prospective evaluation of a simple formula based on renal function,”. J. Clin. Oncol. 7: 1748-56; van Warmerdam et al., (1995) J.

Cancer Res. Clin. Oncol. 121(8): 478-486). Para obter mais detalhes, vide Exemplo 1 abaixo.

[0289] Em algumas modalidades, a sobrevida livre de progressão (SLP) do indivíduo é medida de acordo com os critérios RECIST v1.1, conforme descritos em Eisenhauer et al., (2009) “New response evaluation criteria in solid tumors: Revised RECIST guideline (version 1.1)”. Eur J Cancer, 45:228-47). Em algumas modalidades, a SLP é medida como o período de tempo desde o início do tratamento até a primeira ocorrência de progressão da doença, conforme determinado pelos critérios RECIST v1.1. Em algumas modalidades, a SLP é medida como o tempo desde o início do tratamento até o momento da morte. Em algumas modalidades, o tratamento aumenta a sobrevida livre de progressão (SLP) do indivíduo em pelo menos cerca de 4,5, 4,75, 5, 5,25, 5,5, 5,75 ou 6 meses (incluindo qualquer faixa entre esses valores). Em algumas modalidades, o tratamento aumenta a sobrevida livre de progressão (SLP) do indivíduo em pelo menos cerca de 5,6 meses. Em algumas modalidades, o tratamento aumenta a SLP do indivíduo em pelo menos cerca de qualquer um de 0,5, 1, 1,25, 1,5, 1,75, 2, 2,25, 2,5, 2,75 ou 3 meses (incluindo qualquer faixa entre esses valores), em comparação a um indivíduo com câncer de pulmão (tal como câncer de pulmão de pequenas células, por exemplo, câncer de pulmão de pequenas células em estágio extensivo) que recebeu tratamento com um agente de platina (por exemplo, carboplatina ou cisplatina) e um inibidor de topoisomerase II (por exemplo, etoposídeo). Em algumas modalidades, o tratamento aumenta a SLP do indivíduo em pelo menos cerca de 1,1 meses, em comparação com um indivíduo com câncer de pulmão (tal como câncer de pulmão de pequenas células, por exemplo, câncer de pulmão de pequenas células em estágio extensivo) que recebeu tratamento com um agente de platina (por exemplo, carboplatina ou cisplatina) e um inibidor de topoisomerase II (por exemplo, etoposídeo).

[0290] Em algumas modalidades, a sobrevida global (SG) é medida como o período de tempo desde o início do tratamento até a morte.

Em algumas modalidades, o tratamento aumenta a SG do indivíduo em pelo menos cerca de qualquer um de 10,5, 10,75, 11, 11,25, 11,5, 11,75, 12, 12,25, 12,5, 12,75, 13, 13,25, 13,5, 13,75 ou 14 meses (incluindo qualquer faixa entre esses valores). Em algumas modalidades, o tratamento estende a SG por mais de 14 meses, por exemplo, por ce rca de 14,25, 14,5, 14,75, 15, 15,25, 15,5, 15,75 ou mais de 15,75 meses (incluindo qualquer faixa entre esses valores). Em algumas modalidades, o tratamento estende a SG em cerca de 15,9 meses. Em algumas modalidades, o tratamento aumenta a SG do indivíduo em pelo menos cerca de qualquer um de 0,5, 1, 1,25, 1,5, 1,75, 2, 2,25, 2,5, 2,75 ou 3 meses (incluindo qualquer faixa entre esses valores), em comparação a um indivíduo com câncer de pulmão (tal como câncer de pulmão de pequenas células, por exemplo, câncer de pulmão de pequenas células em estágio extensivo) que recebeu tratamento com um agente de platina (por exemplo, carboplatina ou cisplatina) e um inibidor de topoisomerase II (por exemplo, etoposídeo). Em algumas modalidades, o tratamento aumenta a SG do indivíduo em mais de cerca de 3 meses, por exemplo, em pelo menos cerca de 4, 4,25, 4,5, 4,75, 5, 5,25, 5,5, 5,75, 6, 6,25, 6,5, ou 6,75 meses (incluindo qualquer faixa entre esses valores) em comparação com um indivíduo com câncer de pulmão (tal como câncer de pulmão de pequenas células, por exemplo, câncer de pulmão de pequenas células em estágio extensivo) que recebeu tratamento com um agente de platina (por exemplo, carboplatina ou cisplatina) e um inibidor de topoisomerase II (por exemplo, etoposídeo). Em algumas modalidades, o tratamento aumenta a SG do indivíduo em cerca de 6,6 meses, em comparação com um indivíduo com câncer de pulmão (tal como câncer de pulmão de pequenas células, por exemplo, câncer de pulmão de pequenas células em estágio extensivo) que recebeu tratamento com um agente de platina (por exemplo, carboplatina ou cisplatina) e um inibidor de topoisomerase II (por exemplo, etoposídeo).

[0291] Em algumas modalidades, o indivíduo tem 65 anos de idade ou mais (por exemplo, entre cerca de 65 a cerca de 74 anos de idade, entre cerca de 75 a cerca de 84 anos de idade ou > 85 anos de idade). Em algumas modalidades, o indivíduo tem uma carga de mutação tumoral no sangue (bTMB) de pelo menos cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16. Em algumas modalidades, o indivíduo tem uma carga de mutação tumoral no sangue (bTMB) maior que 16. A bTMB representa o número total de mutações por área de codificação de um genoma tumoral calculado por meio do sequenciamento genômico do DNA tumoral circulante (ctDNA) usando métodos bem conhecidos.

[0292] Em algumas modalidades, o indivíduo relata alívio de um ou mais sintomas relacionados ao câncer de pulmão, por exemplo, 12 semanas após o início do tratamento. Em algumas modalidades, os sintomas relacionados ao câncer de pulmão são um ou mais de dor no braço, dor no ombro, dor no peito, tosse e dispneia (ou seja, respiração difícil).

[0293] Em algumas modalidades, o indivíduo é humano.

[0294] Em algumas modalidades, o indivíduo tem câncer que é resistente (foi demonstrado que é resistente) a um ou mais antagonistas do eixo PD-1. Em algumas modalidades, a resistência ao antagonista do eixo PD-1 inclui recorrência de câncer ou câncer refratário. A recorrência pode referir-se ao reaparecimento do câncer, no local de origem ou em um novo local, após o tratamento. Em algumas modalidades, a resistência ao antagonista do eixo PD-1 inclui progressão do câncer durante o tratamento com o antagonista do eixo PD-1. Em algumas modalidades, a resistência ao antagonista do eixo PD-1 inclui câncer que não responde ao tratamento.

O câncer pode ser resistente no início do tratamento ou pode se tornar resistente durante o tratamento. Em algumas modalidades, o câncer está em estágio inicial ou em estágio avançado.

[0295] Em outro aspecto, o indivíduo tem câncer que expressa (foi demonstrado que expressa, por exemplo, em um teste de diagnóstico) o biomarcador PD-L1. Em algumas modalidades, tal indivíduo é "PD-L1 positivo" ou tem câncer que é um "câncer PD-L1 positivo". Em algumas modalidades, o indivíduo é "PD-L1 positivo" ou tem um "câncer PD-L1 positivo" se a expressão de PD-L1 (por exemplo, expressão de proteína) for detectada em células tumorais (CT) em uma amostra do indivíduo, ou se a expressão de PD-L1 (por exemplo, expressão de proteína) for detectada em células imunes infiltrantes de tumor (CI) em uma amostra do indivíduo. Em algumas modalidades, as CT e/ou CI do indivíduo expressam baixos níveis do biomarcador PD-L1. Em algumas modalidades, as CT e/ou CI do indivíduo expressam altos níveis do biomarcador PD-L1. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, ensaios e/ou kits, o indivíduo é "PD-L1 positivo" ou tem câncer que é um "câncer PD-L1 positivo" se o biomarcador PD-L1 estiver presente (por exemplo, detectado, por exemplo, via IHC) em mais de 0% de uma amostra, em pelo menos 1% de uma amostra, em pelo menos 5% de uma amostra, ou em pelo menos 10% de uma amostra do indivíduo (por exemplo, uma amostra do indivíduo que contém as CT e/ou CI do indivíduo). Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, ensaios e/ou kits, a presença do biomarcador PD-L1 em uma amostra (por exemplo, em uma amostra do indivíduo que contém as CT e/ou CI do indivíduo) é detectada como qualquer nível de coloração na amostra.

[0296] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, ensaios e/ou kits, o biomarcador PD-L1 é detectado na amostra usando um método selecionado a partir do grupo que consiste em FACS, Western blot, ELISA, imunoprecipitação, imuno-histoquímica, imunofluorescência, radioimunoensaio, dot blotting, métodos de imunodetecção, HPLC, ressonância de plásmon de superfície, espectroscopia óptica, espectrometria de massa, HPLC, qPCR, RT-qPCR, qPCR multiplex ou RT-qPCR, RNA-seq, análise de microarranjos, SAGE, técnica MassARRAY e FISH e combinações dos mesmos.

[0297] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, ensaios e/ou kits, o biomarcador PD-L1 é detectado na amostra por expressão de proteína. Em algumas modalidades, a expressão da proteína é determinada por imuno-histoquímica (IHC). Em algumas modalidades, o biomarcador PD-L1 é detectado usando um anticorpo anti- PD-L1. Em algumas modalidades, o biomarcador PD-L1 é detectado como uma intensidade de coloração fraca por IHC. Em algumas modalidades, o biomarcador PD-L1 é detectado como uma intensidade de coloração moderada por IHC. Em algumas modalidades, o biomarcador PD-L1 é detectado como uma intensidade de coloração forte por IHC. Em algumas modalidades, o biomarcador PD-L1 é detectado em células tumorais, células imunes infiltrantes de tumor, células estromais e quaisquer combinações das mesmas. Em algumas modalidades, a coloração é a coloração da membrana, coloração citoplasmática ou combinações das mesmas.

[0298] Em algumas modalidades, o biomarcador PD-L1 é detectado usando um anticorpo anti-PD-L1 primário monoclonal de coelho.

Em algumas modalidades, o PD-L1 é detectado em uma amostra fixada em formalina e embebida em parafina. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-PD-L1 primário monoclonal de coelho é detectado com um anticorpo secundário compreendendo um marcador detectável. Em algumas modalidades, o ensaio usado para detectar o PD-L1 é o ensaio VENTANA PD-L1 (SP142) (disponível comercialmente na VENTANTA®).

[0299] Em outro aspecto, o indivíduo tem câncer que não expressa o biomarcador PD-L1 ou expressa níveis muito baixos do biomarcador PD-L1. Em algumas modalidades, tal indivíduo é referido como "PD-L1 negativo" ou como tendo "câncer PD-L1 negativo". Em algumas modalidades, o indivíduo é "PD-L1 negativo" ou tem um "câncer negativo para PD-L1" se a expressão de PD-L1 (por exemplo, expressão de proteína) não for detectada em células tumorais (CT) em uma amostra do indivíduo, se a expressão de PD-L1 (por exemplo, expressão de proteína) não for detectada em células imunes infiltrantes de tumor (CI) em uma amostra do indivíduo, ou se a expressão de PD-L1 (por exemplo, expressão de proteína) é detectada em níveis muito baixos em CT e/ou CI em uma amostra do indivíduo. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, ensaios e/ou kits, o indivíduo é "PD-L1 negativo" ou tem um "câncer PD-L1 negativo" se PD-L1 (por exemplo, expressão de PD-L1) for detectado (por exemplo, por meio de IHC ou outro ensaio) em 0% das CTs e/ou CIs em uma amostra do indivíduo. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, ensaios e/ou kits, o indivíduo é "PD-L1 negativo" ou tem um "câncer PD-L1 negativo" se PD-L1 (por exemplo, expressão de PD-L1) for detectado (por exemplo, por meio de IHC ou outro ensaio) em <1% das CTs e/ou CIs em uma amostra do indivíduo. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, ensaios e/ou kits, "PD- L1 negativo" significa que não há coloração na amostra, por exemplo, em uma amostra do indivíduo que contém CTs e/ou CIs do indivíduo.

[0300] O antagonista de ligação ao eixo PD-1 (tal como atezolizumabe), o agente de platina (tal como carboplatina) e o inibidor de topoisomerase II (tal como etoposídeo) podem ser administrados em qualquer ordem. Por exemplo, o antagonista de ligação ao eixo PD-1 (tal como atezolizumabe), o agente de platina (tal como carboplatina) e o inibidor de topoisomerase II (tal como etoposídeo) podem ser administrados sequencialmente (em momentos diferentes) ou simultaneamente (ao mesmo tempo). Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo PD-1 (tal como o atezolizumabe), o agente de platina (tal como a carboplatina) e o inibidor de topoisomerase II (tal como o etoposídeo) estão em composições separadas. Em algumas modalidades, um ou mais (ou todos os três) do antagonista de ligação ao eixo PD-1 (tal como atezolizumabe), o agente de platina (tal como carboplatina) e o inibidor de topoisomerase II (tal como etoposídeo) estão na mesma composição.

[0301] O antagonista de ligação ao eixo PD-1 (tal como atezolizumabe), o agente de platina (tal como carboplatina) e o inibidor de topoisomerase II (tal como etoposídeo) podem ser administrados pela mesma via de administração ou por diferentes vias de administração. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo PD-1 é administrado por via intravenosa, intramuscular, subcutânea, tópica, oral, transdérmica, intraperitoneal, intraorbital, intratecal, intraventricular, intranasal, por implantação ou por inalação. Em algumas modalidades, o agente de platina (tal como carboplatina) é administrado por via intravenosa, intramuscular, subcutânea, tópica, oral, transdérmica, intraperitoneal, intraorbital, intratecal, intraventricular, intranasal por implantação ou por inalação. Em algumas modalidades, o inibidor de topoisomerase II (tal como etoposídeo) é administrado por via intravenosa, intramuscular, subcutânea, tópica, oral, transdérmica, intraperitoneal, intraorbital, intratecal, intraventricular, intranasal por implantação ou por inalação. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo PD-1 (tal como atezolizumabe), o agente de platina (tal como carboplatina) e o inibidor de topoisomerase II (tal como etoposídeo) são administrados por infusão intravenosa. Uma quantidade eficaz do antagonista de ligação ao eixo PD-1 (tal como atezolizumabe), o agente de platina (tal como carboplatina) e o inibidor de topoisomerase II (tal como etoposídeo) podem ser administrados para prevenção ou tratamento da doença.

[0302] Em algumas modalidades, é fornecido um método para tratar câncer de pulmão de pequenas células em estágio extensivo (CPPC - EE) em um indivíduo (por exemplo, um indivíduo que é sem exposição prévia ao tratamento para CPPC-EE) que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de atezolizumabe, carboplatina e etoposídeo, em que a administração compreende uma fase de indução e uma fase de manutenção, em que a fase de indução compreende a administração de atezolizumabe a uma dose de 1200 mg no dia 1, a carboplatina a uma dose suficiente para alcançar uma área sob a curva (ASC) alvo inicial de 5 mg/mL/min no dia 1 e o etoposídeo a uma dose de

100 mg/m 2 em cada um dos dias 1, 2 e 3 de cada ciclo de 21 dias para os ciclos 1 a 4; em que a fase de manutenção compreende. Em algumas modalidades, a fase de manutenção compreende administrar o atezolizumabe a uma dose de 1200 mg no dia 1 de cada ciclo de 21 dias após o ciclo 4. Em algumas modalidades, o método estende a SLP do indivíduo (por exemplo, em pelo menos cerca de 4,5, 4,75, 5, 5,25, 5,5, 5,75 ou 6 meses, incluindo qualquer faixa entre esses valores) e/ou a SG do indivíduo (por exemplo, por pelo menos cerca de 10,5, 10,75, 11, 11,25, 11,5, 11,75, 12, 12,25, 12,5, 12,75, 13, 13,25, 13,5, 13,75 ou 14 meses, incluindo qualquer faixa entre esses valores). Em algumas modalidades, o método estende a SLP do indivíduo (por exemplo, em pelo menos cerca de 0,5, 1, 1,25, 1,5, 1,75, 2, 2,25, 2,5, 2,75 ou 3 meses, incluindo qualquer faixa entre estes valores) e/ou a SG do indivíduo (por exemplo, por pelo menos cerca de qualquer um de 0,5, 1, 1,25, 1,5, 1,75, 2, 2,25, 2,5, 2,75 ou 3 meses, incluindo qualquer faixa entre esses valores), em comparação a um indivíduo com câncer de pulmão (taç como câncer de pulmão de pequenas células, por exemplo, câncer de pulmão de pequenas células em estágio extensivo) que recebeu tratamento com um agente de platina (por exemplo, carboplatina ou cisplatina) e um inibidor de topoisomerase II (por exemplo, etoposídeo).

[0303] Em algumas modalidades, a administração de atezolizumabe é seguida pela administração de carboplatina e a administração de carboplatina é seguida pela administração de etoposídeo no dia 1 de cada ciclo de 21 dias para os ciclos 1 a 4, por exemplo, como mostrado na Tabela 4 acima.

[0304] Em algumas modalidades, o atezolizumabe é administrado por via intravenosa durante 60 (± 15 minutos) no dia 1, a carboplatina é administrada por via intravenosa durante um período de 30 a 60 minutos no dia 1 e o etoposídeo é administrado por via intravenosa durante um período de 60 minutos nos dias 1, 2 e 3 para o primeiro ciclo de 21 dias (ou seja, para o ciclo 1). Em algumas modalidades, o atezolizumabe é administrado por via intravenosa durante 30 (± 10 minutos) no dia 1, a carboplatina é administrada por via intravenosa durante um período de 30 a 60 minutos no dia 1 e o etoposídeo é administrado por via intravenosa durante um período de 60 minutos nos dias 1, 2 e 3 para cada ciclo de 21 dias para os ciclos 2 a 4. Em algumas modalidades, o atezolizumabe é administrado por via intravenosa durante 30 (± 10 minutos) no dia 1 de cada ciclo de 21 dias após o ciclo 4.

[0305] Como proposição geral, a quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo administrado a humanos estará na faixa de cerca de 0,01 a cerca de 50 mg/kg de peso corporal do paciente por uma ou mais administrações. Em algumas modalidades, o anticorpo usado é cerca de 0,01 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 35 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 25 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 15 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 5 mg/kg, ou cerca de 0,01 a cerca de 1 mg/kg administrados diariamente, por exemplo. Em algumas modalidades, o anticorpo é administrado a 15 mg/kg. No entanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. Em uma modalidade, um anticorpo anti-PDL1 descrito neste documento é administrado a um ser humano a uma dose de cerca de 100 mg, cerca de 200 mg, cerca de 300 mg, cerca de 400 mg, cerca de 500 mg, cerca de 600 mg, cerca de 700 mg, cerca de 800 mg, cerca de 900 mg, cerca de 1000 mg, cerca de 1100 mg, cerca de 1200 mg, cerca de 1300 mg ou cerca de 1400 mg no dia 1 dos ciclos de 21 dias. A dose pode ser administrada com uma dose única ou em doses múltiplas

(por exemplo, 2 ou 3 doses), tais como infusões. A dose do anticorpo administrado em um tratamento de combinação pode ser reduzida em comparação a um único tratamento. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais.

[0306] Em algumas modalidades, os métodos podem compreender ainda uma terapia adicional. A terapia adicional pode ser radioterapia, cirurgia (por exemplo, mastectomia e mastectomia), quimioterapia, terapia genética, terapia de DNA, terapia viral, terapia de RNA, imunoterapia, transplante de medula óssea, nanoterapia, terapia de anticorpo monoclonal ou uma combinação dos anteriores. A terapia adicional pode estar na forma de terapia adjuvante ou neoadjuvante. Em algumas modalidades, a terapia adicional é a administração de inibidor enzimático de pequena molécula ou agente antimetastático. Em algumas modalidades, a terapia adicional é a administração de agentes de efeito secundário limitantes (por exemplo, agentes destinados a diminuir a ocorrência e/ou gravidade de efeitos secundários do tratamento, tais como agentes antináuseas, etc.). Em algumas modalidades, a terapia adicional é radioterapia. Em algumas modalidades, a terapia adicional é cirurgia. Em algumas modalidades, a terapia adicional é uma combinação de radioterapia e cirurgia. Em algumas modalidades, a terapia adicional é a irradiação gama.

[0307] Em algumas modalidades, a terapia adicional compreende CT-011 (também conhecido como Pidilizumabe ou MDV9300; Registro CAS de nº 1036730-42-3; CureTech/Medivation). CT-011, também conhecido como hBAT ou hBAT-1, é um anticorpo descrito em WO2009/101611. Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional compreende um anticorpo que compreende uma sequência de cadeia pesada e uma de cadeia leve, em que:

(a) a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos:

QVQLVQSGSELKKPGASVKISCKASGYTFTNYGMNWVRQAP GQGLQWMGWINTDSGESTYAEEFKGRFVFSLDTSVNTAYLQITSLTAEDT GMYFCVRVGYDALDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT

PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PGK (SEQ ID NO:19), e (b) a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos:

EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCSARSSVSYMHWFQQKPGKA PKLWIYRTSNLASGVPSRFSGSGSGTSYCLTINSLQPEDFATYYCQQRSSF PLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV

QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV THQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:20).

[0308] Em algumas modalidades, o anticorpo terapêutico adicional compreende as seis sequências de HVR da SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 20 (por exemplo, as três HVRs de cadeia pesada da SEQ ID NO: 19 e as três HVRs de cadeia leve da SEQ ID NO: 20). Em algumas modalidades, o anticorpo terapêutico adicional compreende o domínio variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 19 e o domínio variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 20. Outros anticorpos terapêuticos adicionais contemplados para uso neste documento incluem, sem limitação, alemtuzumabe (Campath), bevacizumabe (AVASTIN®, Genentech);

cetuximabe (ERBITUX®, Imclone); panitumumabe (VECTIBIX®, Amgen), rituximabe (RITUXAN®, Genentech/Biogen Idec), pertuzumabe (OMNITARG®, 2C4, Genentech), trastuzumabe (HERCEPTIN®, Genentech), tositumomabe (Bexxar, Corixia), o conjugado de fármaco de anticorpo gemtuzumabe ozogamicina (MYLOTARG®, Wyeth), apolizumabe, aselizumabe, atlizumabe, bapineuzumabe, bivatuzumabe mertansina, cantuzumabe mertansina, cedelizumabe, certolizumabe pegol, cidfusituzumabe, cidtuzumabe, daclizumabe, eculizumabe, efalizumabe, epratuzumabe, erlizumabe, felvizumabe, fontolizumabe, gemtuzumabe ozogamicina, inotuzumabe ozogamicina, ipilimumabe, labetuzumabe, lintuzumabe, matuzumabe, mepolizumabe, motavizumabe, motovizumabe, natalizumabe, nimotuzumabe, nolovizumabe, numavizumabe, ocrelizumabe, omalizumabe, palivizumabe, pascolizumabe, pecfusituzumabe, pectuzumabe, pexelizumabe, ralivizumabe, ranibizumabe, reslivizumabe, reslizumabe, resyvizumabe, rovelizumabe, ruplizumabe, sibrotuzumabe, siplizumabe, sontuzumabe, tacatuzumabe tetraxetano, tadocizumabe, talizumabe, tefibazumabe, tocilizumabe, toralizumabe, tucotuzumabe celmoleucina, tucusituzumabe, umavizumabe, urtoxazumabe, ustekinumabe, visilizumabe, e o anti-interleucina-12 (ABT- 874/J695, Wyeth Research e Abbott Laboratories).

[0309] Em algumas modalidades, a terapia adicional é a terapia de direcionamento da via PI3K/AKT/mTOR, inibidor de HSP90, inibidor de tubulina, inibidor de apoptose, e/ou agente quimiopreventivo.

Em algumas modalidades, a terapia adicional é CTLA-4 (também conhecido como CD152), por exemplo, um anticorpo bloqueador, ipilimumabe (também conhecido como MDX-010, MDX-101 ou Yervoy®), tremelimumabe (também conhecido como ticilimumabe ou CP -675,206), um antagonista direcionado contra B7-H3 (também conhecido como

CD276), por exemplo, um anticorpo bloqueador, MGA271, um antagonista dirigido direcionado um TGF beta, por exemplo, metelimumabe (também conhecido como CAT-192), fresolimumabe (também conhecido como

GC1008) ou LY2157299, um tratamento que compreende a transferência adotiva de uma célula T (por exemplo, uma célula T citotóxica ou CTL)

expressando um receptor de antígeno quimérico (CAR), um tratamento que compreende a transferência adotiva de uma célula T compreendendo um receptor beta TGF dominante negativo, por exemplo, um receptor TGF beta do tipo II dominante negativo, um tratamento que compreende um protocolo HERCREEM (vide, por exemplo, ClinicalTrials,gov Identifier

NCT00889954), um agonista direcionado contra CD137 (também conhecido como TNFRSF9, 4-1BB ou ILA), por exemplo, um anticorpo de ativação, urelumabe (também conhecido como BMS-663513), um agonista direcionado contra CD40, por exemplo, um anticorpo de ativação, CP-

870893, um agonista direcionado contra OX40 (também conhecido como

CD134), por exemplo, um anticorpo de ativação, administrado em conjunto com um anticorpo anti-OX40 diferente (por exemplo, AgonOX), um agonista direcionado contra CD27, por exemplo, um anticorpo de ativação,

CDX-1127, indoleamina-2,3-dioxigenase (IDO), 1-metil-D-triptofano

(também conhecido como 1-D-MT), um conjugado anticorpo-fármaco (em algumas modalidades, compreendendo mertansina ou monometil auristatina E (MMAE)), um conjugado anticorpo anti-NaPi2b-MMAE

(também conhecido como DNIB0600A ou RG7599), trastuzumabe emtansina (também conhecido como T-DM1, ado-trastuzumabe emtansina ou KADCYLA®, Genentech), DMUC5754A, um conjugado anticorpo-

fármaco direcionado ao receptor de endotelina B (EDNBR), por exemplo, um anticorpo direcionado contra EDNBR conjugado com MMAE, um inibidor de angiogênese, um anticorpo direcionado contra um VEGF, por exemplo, VEGF-A, bevacizumabe (também conhecido como AVASTIN®,

Genentech), um anticorpo direcionado contra angiopoietina 2 (também conhecido como Ang2), MEDI3617, um agente antineoplásico, um agente direcionado a CSF-1R (também conhecido como M-CSFR ou CD115), anti-

CSF-1R (também conhecido como IMC-CS4), um interferon, por exemplo,

interferon alfa ou interferon gama, Roferon-A, GM-CSF (também conhecido como fator estimulador de colônias de granulócitos humano recombinante,

rhu GM-CSF, sargramostim ou Leukine®), IL-2 (também conhecido como aldesleucina ou Proleukin®), IL-12, um anticorpo direcionado a CD20 (em algumas modalidades, o anticorpo direcionado a CD20 é obinutuzumabe

(também conhecido como GA101 ou Gazyva®) ou rituximabe), um anticorpo direcionado a GITR (em algumas modalidades, o anticorpo direcionado a GITR é TRX518), em conjunto com uma vacina contra o câncer (em algumas modalidades, a vacina contra o câncer é uma vacina de peptídeo contra o câncer, que em algumas modalidades é uma vacina de peptídeo personalizada; em algumas modalidades, a vacina de peptídeo contra o câncer é um peptídeo longo multivalente, um multipeptídeo, um coquetel de peptídeos, um peptídeo híbrido ou uma vacina de célula dendrítica pulsada com peptídeo (vide, por exemplo, Yamada et al., Cancer

Sci, 104:14-21, 2013)), em conjunto com um adjuvante, um agonista de

TLR, por exemplo, Poly -ICLC (também conhecido como Hiltonol®), LPS,

MPL ou CpG ODN, fator de necrose tumoral (TNF) alfa, IL-1, HMGB1, um antagonista de IL-10, um antagonista de IL-4, um antagonista de IL-13, um antagonista de HVEM, um agonista de ICOS, por exemplo, pela administração de ICOS-L, ou um anticorpo agonístico direcionado contra

ICOS, um tratamento direcionado a CX3CL1, um tratamento direcionado a CXCL10, um tratamento direcionado a CCL5, um agonista de LFA-1 ou

ICAM1, um agonista de Selectina, uma terapia direcionada, um inibidor de

B -Raf, vemurafenibe (também conhecido como Zelboraf®), dabrafenibe (também conhecido como Tafinlar®), erlotinibe (também conhecido como Tarceva®), um inibidor de MEK, tal como MEK1 (também conhecido como MAP2K1) ou MEK2 (também conhecido como MAP2K2), cobimetinibe (também conhecido como GDC-0973 ou XL-518), trametinibe (também conhecido como Mekinist®), um inibidor de K-Ras, um inibidor de c-Met, onartuzumabe (também conhecido como MetMAb), um inibidor de Alk, AF802 (também conhecido como CH5424802 ou alectinibe), um inibidor de uma fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K), BKM120, idelalisibe (também conhecido como GS-1101 ou CAL-101), perifosina (também conhecido como KRX-0401), um Akt, MK2206, GSK690693, GDC-0941, um inibidor de mTOR, sirolimus (também conhecido como rapamicina), temsirolimus (também conhecido como CCI-779 ou Torisel®), everolimus (também conhecido como RAD001), ridaforolimus (também conhecido como AP - 23573, MK-8669 ou deforolimus), OSI-027, AZD8055, INK128, um inibidor de PI3K/mTOR duplo, XL765, GDC-0980, BEZ235 (também conhecido como NVP-BEZ235), BGT226, GSK2126458, PF-04691502, PF-05212384 (também conhecido como PKI-587). A terapia adicional pode ser um ou mais de agentes quimioterápicos descritos aqui anteriormente.

IX. MÉTODOS DE DETECÇÃO E DIAGNÓSTICO

[0310] Em algumas modalidades, a amostra é obtida antes do tratamento com um antagonista de ligação ao eixo PD-1 (por exemplo, atezolizumabe), um agente de platina (por exemplo, carboplatina) e um inibidor de topoisomerase II (por exemplo, etoposídeo). Em algumas modalidades, a amostra de tecido é fixada em formalina e embebida em parafina, arquivada, fresca ou congelada.

[0311] Em algumas modalidades, a amostra é sangue total.

Em algumas modalidades, o sangue total compreende células imunes,

células tumorais circulantes e quaisquer combinações das mesmas.

[0312] A presença e/ou níveis de expressão/quantidade de um biomarcador (por exemplo, PD-L1) podem ser determinados qualitativamente e/ou quantitativamente com base em qualquer critério adequado conhecido na técnica, incluindo, mas não se limitando a DNA, mRNA, cDNA, proteínas, proteínas fragmentos e/ou número de cópia do gene. Em certas modalidades, a presença e/ou níveis de expressão/quantidade de um biomarcador em uma primeira amostra são aumentados ou elevados em comparação com a presença/ausência e/ou níveis de expressão/quantidade em uma segunda amostra. Em certas modalidades, a presença/ausência e/ou níveis de expressão/quantidade de um biomarcador em uma primeira amostra é diminuída ou reduzida em comparação com a presença e/ou níveis de expressão/quantidade em uma segunda amostra. Em certas modalidades, a segunda amostra é uma amostra de referência, célula de referência, tecido de referência, amostra de controle, célula de controle ou tecido de controle. Divulgações adicionais para determinar a presença/ausência e/ou níveis de expressão/quantidade de um gene são descrita neste documento.

[0313] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, a expressão elevada refere-se a um aumento geral de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais, no nível de biomarcador (por exemplo, proteína ou ácido nucleico (por exemplo, gene ou mRNA) detectado por métodos conhecidos da técnica padrão, tais como aqueles descritos neste documento, em comparação a uma amostra de referência, célula de referência, tecido de referência, amostra de controle, célula de controle ou tecido de controle. Em certas modalidades, a expressão elevada refere-se ao aumento no nível/quantidade de expressão de um biomarcador na amostra em que o aumento é de pelo menos cerca de 1,5X, 1,75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X ou 100X o nível/quantidade de expressão do respectivo biomarcador em uma amostra de referência, célula de referência, tecido de referência, amostra de controle, célula de controle ou tecido de controle. Em algumas modalidades, a expressão elevada refere- se a um aumento geral maior do que cerca de 1,5 vezes, cerca de 1,75 vezes, cerca de 2 vezes, cerca de 2,25 vezes, cerca de 2,5 vezes, cerca de 2,75 vezes, cerca de 3,0 vezes ou cerca de 3,25 vezes em comparação a um amostra de referência, célula de referência, tecido de referência, amostra de controle, célula de controle, tecido de controle ou controle interno (por exemplo, gene de manutenção).

[0314] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, a expressão reduzida refere-se a uma redução geral de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais, no nível de biomarcador (por exemplo, proteína ou ácido nucleico (por exemplo, gene ou mRNA) detectado por métodos conhecidos da técnica padrão, tais como aqueles descritos neste documento, em comparação a uma amostra de referência, célula de referência, tecido de referência, amostra de controle, célula de controle ou tecido de controle.

Em certas modalidades, a expressão reduzida refere-se à diminuição no nível/quantidade de expressão de um biomarcador na amostra em que a diminuição é de pelo menos cerca de 0,9X, 0,8X, 0,7X, 0,6X, 0,5X, 0,4X, 0,3X, 0,2X, 0,1X, 0,05X ou 0,01X o nível/quantidade de expressão do respectivo biomarcador em uma amostra de referência, célula de referência, tecido de referência, amostra de controle, célula de controle ou tecido de controle.

[0315] A presença e/ou nível de expressão/quantidade de vários biomarcadores em uma amostra pode ser analisada por uma série de metodologias, muitas das quais são conhecidas na técnica e entendidas pelo técnico no assunto, incluindo, mas não se limitando a, imuno- histoquímica ("IHC"), análise de Western blot, imunoprecipitação, ensaios de ligação molecular, ELISA, ELIFA, classificação de células ativadas por fluorescência ("FACS"), MassARRAY, proteômica, ensaios quantitativos baseados em sangue (tais como por exemplo ELISA em soro), ensaios bioquímicos de atividade enzimática, hibridização in situ, análise de Southern, análise de Northern, sequenciamento do genoma completo, reação em cadeia da polimerase ("PCR") incluindo PCR quantitativa em tempo real ("qRT-PCR") e outros métodos de detecção do tipo de amplificação, tais como, por exemplo, DNA ramificado, SISBA, TMA e similares), RNA-Seq, FISH, análise de microarranjo, perfil de expressão gênica e/ou análise serial da expressão gênica ("SAGE"), bem como qualquer um da ampla variedade de ensaios que podem ser realizados por análise de proteína, gene e/ou arranjo de tecido. Protocolos típicos pa ra avaliar o estado de genes e produtos de gene são encontrados, por exemplo, em Ausubel et al., eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Unidades 2 (Northern Blotting), 4 (Southern Blotting), 15 (Immunoblotting) e 18 (análise de PCR). Os imunoensaios multiplexados, tais como aqueles disponíveis em Rules Based Medicine ou Meso Scale Discovery (“MSD”), também podem ser usados.

[0316] Em algumas modalidades, a presença e/ou nível de expressão/quantidade de um biomarcador é determinada usando um método que compreende: (a) realizar o perfil de expressão gênica, PCR (tal como rtPCR ou qRT-PCR), RNA-seq, análise de microarranjo, SAGE, técnica de MassARRAY ou FISH em uma amostra (tal como uma amostra de câncer de um sujeito); eb) determinar a presença e/ou níve l de expressão/quantidade de um biomarcador na amostra. Em algumas modalidades, o método de microarranjo compreende o uso de um chip de microarranjo tendo uma ou mais moléculas de ácido nucleico que podem hibridizar sob condições rigorosas a uma molécula de ácido nucleico que codifica um gene mencionado acima ou tendo um ou mais polipeptídeos (tais como peptídeos ou anticorpos) que pode se ligar a uma ou mais das proteínas codificadas pelos genes mencionados acima. Em uma modalidade, o método de PCR é qRT-PCR. Em uma modalidade, o método de PCR é multiplex-PCR. Em algumas modalidades, a expressão gênica é medida por microarranjo. Em algumas modalidades, a expressão gênica é medida por qRT-PCR. Em algumas modalidades, a expressão é medida por multiplex-PCR.

[0317] Os métodos para a avaliação de mRNAs em células são bem conhecidos e incluem, por exemplo, ensaios de hibridização usando sondas de DNA complementares (tais como hibridização in situ usando ribossondas marcadas específicas para um ou mais genes, Northern blot e técnicas relacionadas) e vários ensaios de amplificação de ácido nucleico (tais como RT-PCR usando iniciadores complementares específicos para um ou mais dos genes e outros métodos de detecção do tipo de amplificação, tais como, por exemplo, DNA ramificado, SISBA, TMA e similares).

[0318] As amostras de mamíferos podem ser convenientemente testadas para mRNAs usando Northern, dot blot ou análise de PCR. Além disso, tais métodos podem incluir uma ou mais etapas que permitem determinar os níveis de mRNA alvo em uma amostra biológica (por exemplo, examinando simultaneamente os níveis de uma sequência de mRNA de controle comparativa de um gene de "manutenção", tal como um membro da família da actina). Opcionalmente, a sequência do cDNA alvo amplificado pode ser determinada.

[0319] Métodos opcionais incluem protocolos que examinam ou detectam mRNAs, tais como mRNAs alvo, em uma amostra de tecido ou célula por tecnologias de microarranjo. Usando microarranjos de ácido nucleico, amostras de teste e controle de mRNA a partir de amostras de tecido de teste e controle são transcritas reversamente e marcadas para gerar sondas de cDNA. As sondas são então hibridizadas com um arranjo de ácidos nucleicos imobilizado em um suporte sólido. O arranjo é configurado de tal modo que a sequência e a posição de cada membro do arranjo sejam conhecidas. Por exemplo, uma seleção de genes cuja expressão se correlaciona com o benefício clínico aumentado ou reduzido da terapia antiangiogênica pode ser organizada em um suporte sólido. A hibridação de uma sonda marcada com um determinado membro do arranjo indica que a amostra da qual a sonda foi derivada expressa esse gene.

[0320] De acordo com algumas modalidades, a presença e/ou nível de expressão/quantidade são medidos observando os níveis de expressão de proteínas de um gene acima mencionado. Em certas modalidades, o método compreende colocar a amostra biológica em contato com anticorpos a um biomarcador (por exemplo, anticorpos anti- PD-L1) descritos neste documento sob condições permissivas para a ligação do biomarcador, e detectar se um complexo é formado entre os anticorpos e o biomarcador. Tal método pode ser um método in vitro ou in vivo. Em uma modalidade, um anticorpo é usado para selecionar sujeitos elegíveis para terapia com o antagonista de ligação ao eixo PD-L1, por exemplo, um biomarcador para seleção de indivíduos.

[0321] Em certas modalidades, a presença e/ou nível de expressão/quantidade de proteínas biomarcadoras em uma amostra é examinada usando IHC e protocolos de coloração. A coloração de IHC de seções de tecido demonstrou ser um método confiável para determinar ou detectar a presença de proteínas em uma amostra. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, ensaios e/ou kits, o biomarcador PD-L1 é PD-L1. Em algumas modalidades, PD-L1 é detectado por imuno-histoquímica. Em algumas modalidades, a expressão elevada de um biomarcador PD-L1 em uma amostra de um indivíduo é a expressão elevada de proteína e, em outras modalidades, é determinada usando IHC.

Em uma modalidade, o nível de expressão do biomarcador é determinado usando um método que compreende: (a) realizar análise de IHC de uma amostra (tal como uma amostra de câncer do indivíduo) com um anticorpo; eb) determinar o nível de expressão de um biomarcador na amostra. Em algumas modalidades, a intensidade de coloração de IHC é determinada em relação a uma referência. Em algumas modalidades, a referência é um valor de referência. Em algumas modalidades, a referência é uma amostra de referência (por exemplo, amostra de coloração de linhagem celular de controle ou amostra de tecido de paciente não canceroso).

[0322] IHC pode ser realizada em combinação com técnicas adicionais, tais como coloração morfológica e/ou hibridização fluorescente in situ. Dois métodos gerais de IHC estão disponíveis; ensaios diretos e indiretos. De acordo com o primeiro ensaio, a ligação do anticorpo ao antígeno alvo é determinada diretamente. Este ensaio direto usa um reagente marcado, tal como uma etiqueta fluorescente ou um anticorpo primário marcado com enzima, que pode ser visualizado sem interação adicional do anticorpo. Em um ensaio indireto típico, o anticorpo primário não conjugado se liga ao antígeno e, em seguida, um anticorpo secundário marcado se liga ao anticorpo primário. Quando o anticorpo secundário é conjugado a um marcador enzimático, um substrato cromogênico ou fluorogênico é adicionado para fornecer a visualização do antígeno. A amplificação do sinal ocorre porque vários anticorpos secundários podem reagir com diferentes epítopos no anticorpo primário.

[0323] O anticorpo primário e/ou secundário usado para IHC normalmente será marcado com uma fração detectável. Vários marcadores estão disponíveis, os quais geralmente podem ser agrupados nas seguintes categorias: (a) Radioisótopos, tais como 35S, 14C, 125I, 3H e 131I; (b) partículas de ouro coloidal; (c) marcadores fluorescentes incluindo, mas não estão limitados a, quelatos de terras raras (quelatos de európio), Texas Red. rodamina, fluoresceína, dansil, Lissamina, umbeliferona, ficoeritrina, ficocianina, ou fluoróforos comercialmente disponíveis, tais como SPECTRUM ORANGE7 e SPECTRUM GREEN7 e/ou derivados de qualquer um ou mais dos acima; (d) vários marcadores de substrato de enzima estão disponíveis e a patente dos EUA de nº

4.275.149 fornece uma revisão de alguns deles. Exemplos de marcadores enzimáticos incluem luciferases (por exemplo, luciferase do vaga -lume e luciferase bacteriana; patente dos EUA de nº 4.737.456), luciferina, 2,3-di- hidroftalazinedionas, malato desidrogenase, urease, peroxidase, tal como peroxidase de rábano (HRPO), fosfatase alcalina, β-galactosidase, glucoamilase, lisozima, sacarídeo oxidases (por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase e glicose-6-fosfato desidrogenase), oxidases heterocíclicas (tais como uricase e xantina oxidase), lactoperoxidase, microperoxidase e similares.

[0324] Exemplos de combinações enzima-substrato incluem, por exemplo, peroxidase de rábano (HRPO) com peroxidase de hidrogênio como substrato; fosfatase alcalina (AP) com fosfato de para-nitrofenil como substrato cromogênico; e β-D-galactosidase (β-D-Gal) com um substrato cromogênico (por exemplo, p-nitrofenil-β-D-galactosidase) ou substrato fluorogênico (por exemplo, 4-metilumbeliferil-β-D-galactosidase). Para uma revisão geral destes, vide patentes dos EUA de nº 4.275.149 e 4.318.980.

[0325] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, PD-L1 é detectado por imuno-histoquímica usando um anticorpo de diagnóstico anti-PD-L1 (ou seja, anticorpo primário). Em algumas modalidades, o anticorpo de diagnóstico PD-L1 especificamente se liga ao PD-L1 humano. Em algumas modalidades, o anticorpo de diagnóstico PD- L1 é um anticorpo não humano. Em algumas modalidades, o anticorpo de diagnóstico PD-L1 é um anticorpo de rato, camundongo ou coelho. Em algumas modalidades, o anticorpo de diagnóstico PD-L1 é um anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades, o anticorpo de diagnóstico PD-L1 é marcado diretamente.

[0326] As amostras assim preparadas podem ser montadas e cobertas com uma lamela. A avaliação da lâmina é então determinada, por exemplo, usando um microscópio, e podem ser empregados critérios de intensidade de coloração, rotineiramente usados na técnica. Em uma modalidade, entende-se que quando as células e/ou tecido de um tumor são examinados usando IHC, a coloração é geralmente determinada ou avaliada na célula tumoral e/ou tecido (em oposição ao estroma ou tecido circundante que pode estar presente na amostra). Em algumas modalidades, entende-se que quando as células e/ou tecido de um tumor são examinados usando IHC, a coloração inclui a determinação ou avaliação de células imunes infiltrantes de tumor, incluindo células imunes intratumorais ou peritumorais.

[0327] Em algumas modalidades, a expressão de PDL1 é avaliada em um tumor ou amostra tumoral. Tal como usado neste documento, um tumor ou amostra tumoral pode abranger parte ou toda a área do tumor ocupada por células tumorais. Em algumas modalidades, um tumor ou amostra tumoral pode ainda abranger a área do tumor ocupada por células intratumorais associadas ao tumor e/ou estroma associado ao tumor (por exemplo, estroma desmoplásico peritumoral contíguo). Células intratumorais associadas a tumor e/ou estroma associado a tumor podem incluir áreas de infiltrados imunes (por exemplo, células imunes infiltrantes de tumor conforme descritas neste documento) imediatamente adjacentes e/ou contíguas à massa tumoral principal. Em algumas modalidades, a expressão de PDL1 é avaliada em células tumorais. Em algumas modalidades, a expressão de PDL1 é avaliada em células imunes dentro da área do tumor, conforme descrito acima, tais como células imunes infiltrantes de tumor.

[0328] Em métodos alternativos, a amostra pode ser colocada em contato com um anticorpo específico para o referido biomarcador sob condições suficientes para a formação de um complexo anticorpo - biomarcador e, em seguida, detectar o referido complexo. A presença do biomarcador pode ser detectada de várias maneiras, tal como por Western blotting e procedimentos de ELISA para analisar uma ampla variedade de tecidos e amostras, incluindo plasma ou soro. Uma ampla faixa de técnicas de imunoensaio usando esse formato de ensaio estão disponíveis, vide, por exemplo, patentes dos EUA de nº 4.016.043, 4.424.279 e 4.018.653.

Estes incluem ambos os ensaios de local único e de dois locais ou “sanduíche” dos tipos não competitivos, bem como os ensaios tradicionais de ligação competitiva. Estes ensaios também incluem a ligação direta d e um anticorpo marcado a um biomarcador alvo.

[0329] A presença e/ou nível de expressão/quantidade de um biomarcador selecionado em uma amostra de tecido ou célula também podem ser examinados por meio de ensaios funcionais ou baseados em atividade. Por exemplo, se o biomarcador for uma enzima, pode-se realizar ensaios conhecidos na técnica para determinar ou detectar a presença de uma determinada atividade enzimática no tecido ou amostra de célula.

[0330] Em certas modalidades, as amostras são normalizadas para ambas as diferenças na quantidade do biomarcador testado e variabilidade na qualidade das amostras usadas e variabilidade entre as execuções do ensaio. Tal normalização pode ser realizada detectando e incorporando a expressão de certos biomarcadores de normalizaçã o, incluindo genes de manutenção bem conhecidos. Alternativamente, a normalização pode ser baseada no sinal médio ou mediano de todos os genes ensaiados ou um grande subconjunto dos mesmos (abordagem de normalização global). Em uma base de gene por gene, a quantidade normalizada medida de um mRNA ou proteína de tumor do sujeito é comparada à quantidade encontrada em um conjunto de referência. Os níveis de expressão normalizados para cada mRNA ou proteína por tumor testado por sujeito podem ser expressos como uma porcentagem do nível de expressão medido no conjunto de referência. A presença e/ou nível de expressão/quantidade medida em uma amostra particular do sujeito a ser analisada cairá em algum percentil dentro desta faixa, que pode ser determinada por métodos bem conhecidos na técnica.

[0331] Em certas modalidades, a amostra é uma amostra clínica. Em outra modalidade, a amostra é usada em um ensaio de diagnóstico. Em algumas modalidades, a amostra é obtida de um tumor primário ou metastático. A biópsia de tecido é frequentemente usada para obter um pedaço representativo de tecido tumoral. Alternativamente, as células tumorais podem ser obtidas indiretamente na forma de tecidos ou fluidos que são conhecidos ou pensados para conter as células tumorais de interesse. Por exemplo, as amostras de lesões de câncer de pulmão podem ser obtidas por ressecção, broncoscopia, aspiração com agulha fina, escovação brônquica ou de escarro, líquido pleural ou sangue. Os genes ou produtos de gene podem ser detectados a partir de câncer ou tecido tumoral ou de outras amostras corporais, tais como urina, expectoração, soro ou plasma. As mesmas técnicas discutidas acima para a detecção de genes alvo ou produtos de gene em amostras cancerosas podem ser aplicadas a outras amostras corporais. As células cancerosas podem ser eliminadas das lesões cancerosas e aparecer em tais amostras corporais. Ao rastrear tais amostras corporais, um diagnóstico precoce simples pode ser alcançado para esses cânceres. Além disso, o progresso da terapia pode ser monitorado mais facilmente testando tais amostras corporais para genes alvo ou produtos genéticos.

[0332] Em certas modalidades, uma amostra de referência, célula de referência, tecido de referência, amostra de controle, célula de controle ou tecido de controle são uma única amostra ou várias amostras combinadas a partir do mesmo sujeito ou indivíduo que são obtidas em um ou mais pontos de tempo diferentes do que quando o amostra de teste é obtida. Por exemplo, uma amostra de referência, célula de referência, tecido de referência, amostra de controle, célula de controle ou tecido de controle são obtidos em um ponto de tempo anterior a partir do mesmo sujeito ou indivíduo do que quando a amostra de teste é obtida. Tal amostra de referência, célula de referência, tecido de referência, amostra de controle, célula de controle ou tecido de controle podem ser úteis se a amostra de referência for obtida durante o diagnóstico inicial de câncer e a amostra de teste for obtida posteriormente quando o câncer se torna metastático.

[0333] Em certas modalidades, uma amostra de referência, célula de referência, tecido de referência, amostra de controle, célula de controle ou tecido de controle são uma combinação de múltiplas amostras de um ou mais indivíduos saudáveis que não são o sujeito ou indivíduo.

Em certas modalidades, uma amostra de referência, célula de referência, tecido de referência, amostra de controle, célula de controle ou tecido de controle são uma combinação de várias amostras de um ou mais indivíduos com uma doença ou distúrbio (por exemplo, câncer) que não são o sujeito ou indivíduo. Em certas modalidades, uma amostra de referência, célula de referência, tecido de referência, amostra de controle, célula de controle ou tecido de controle são amostras de RNA agrupada s de tecidos normais ou amostras agrupadas de plasma ou soro de um ou mais indivíduos que não são o sujeito ou indivíduo. Em certas modalidades, uma amostra de referência, célula de referência, tecido de referência, amostra de controle, célula de controle ou tecido de controle são amostras de RNA agrupadas de tecidos agrupados tumorais ou de plasma ou amostras de soro de um ou mais indivíduos com uma doença ou distúrbio (por exemplo, câncer) que não são o sujeito ou indivíduo.

[0334] Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de tecido do indivíduo. Em algumas modalidades, a amostra de tecido é uma amostra de tecido tumoral (por exemplo, tecido de biópsia). Em algumas modalidades, a amostra de tecido é tecido pulmonar. Em algumas modalidades, a amostra de tecido é tecido renal. Em algumas modalidades, a amostra de tecido é tecido da pele. Em algumas modalidades, a amostra de tecido é tecido pancreático. Em algumas modalidades, a amostra de tecido é tecido gástrico. Em algumas modalidades, a amostra de tecido é tecido da bexiga. Em algumas modalidades, a amostra de tecido é tecido esofágico. Em algumas modalidades, a amostra de tecido é tecido mesotelial. Em algumas modalidades, a amostra de tecido é tecido mamário. Em algumas modalidades, a amostra de tecido é tecido da tireoide. Em algumas modalidades, a amostra de tecido é tecido colorretal.

Em algumas modalidades, a amostra de tecido é tecido da cabeça e pescoço. Em algumas modalidades, a amostra de tecido é tecido de osteossarcoma. Em algumas modalidades, a amostra de tecido é tecido da próstata. Em algumas modalidades, a amostra de tecido é tecido ovariano, HCC (fígado), células sanguíneas, nódulos linfáticos e/ou tecido ósseo/da medula óssea. Em algumas modalidades, a amostra de tecido é tecido do cólon. Em algumas modalidades, a amostra de tecido é tecido endometrial.

Em algumas modalidades, a amostra de tecido é tecido cerebral (por exemplo, glioblastoma, neuroblastoma e assim por diante).

[0335] Em algumas modalidades, uma amostra de tecido tumoral (o termo "amostra tumoral" é usado intercambiavelmente neste documento) pode abranger parte ou toda a área tumoral ocupada por células tumorais. Em algumas modalidades, um tumor ou amostra tumoral pode ainda abranger a área do tumor ocupada por células intratumorais associadas ao tumor e/ou estroma associado ao tumor (por exemplo, estroma desmoplásico peritumoral contíguo). Células intratumorais associadas a tumor e/ou estroma associado a tumor podem incluir áreas de infiltrados imunes (por exemplo, células imunes infiltrantes de tumor conforme descritas neste documento) imediatamente adjacentes e/ou contíguas à massa tumoral principal.

[0336] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, a doença ou distúrbio é um tumor. Em algumas modalidades, o tumor é um tumor cancerígeno maligno (ou seja, câncer). Em algumas modalidades, o tumor e/ou câncer é um tumor sólido ou um tumor não sólido ou de tecido mole. Exemplos de tumores de tecidos moles incluem leucemia (por exemplo, leucemia mielóide crônica, leucemia mielóide aguda, leucemia linfoblástica aguda adulta, leucemia mielóide aguda, leucemia linfoblástica aguda de células B maduras, leucemia linfocíti ca crônica, leucemia polinfocítica ou leucemia de células pilosas) ou linfoma

(por exemplo, linfoma não Hodgkin, linfoma cutâneo de células T ou doença de Hodgkin). Um tumor sólido inclui qualquer câncer de tecidos corporais que não sejam sangue, medula óssea ou sistema linfático. Os tumores sólidos podem ser divididos em aqueles de origem em células epiteliais e aqueles de origem em células não epiteliais. Exemplos de tumores sólidos de células epiteliais incluem tumores do trato gastrointestinal, cólon, colorretal (por exemplo, carcinoma colorretal basaloide), mama, próstata, pulmão, rim, fígado, pâncreas, ovário (por exemplo, carcinoma endometrioide de ovário), cabeça e pescoço, cavidade oral, estômago, duodeno, intestino delgado, intestino grosso, ânus, vesícula biliar, lábio, nasofaringe, pele, útero, órgão genital masculino, órgãos urinários (por exemplo, carcinoma de urotélio, carcinoma urotélio displásico, carcinoma de células transicionais), bexiga e pele. Os tumores sólidos de origem não epitelial incluem sarcomas, tumores cerebrais e tumores ósseos. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP). Em algumas modalidades, o câncer é câncer de pulmão de células não pequenas de segunda ou terceira linha localmente avançado ou metastático. Em algumas modalidades, o câncer é adenocarcinoma. Em algumas modalidades, o câncer é carcinoma de células escamosas. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP), glioblastoma, neuroblastoma, melanoma, carcinoma de mama (por exemplo, câncer de mama triplo- negativo), câncer gástrico, câncer colorretal (CRC) ou carcinoma hepatocelular. Em algumas modalidades, o câncer é um tumor primário.

Em algumas modalidades, o câncer é um tumor metastático em um segundo local derivado de qualquer um dos tipos de câncer acima.

[0337] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o câncer exibe células efetoras humanas (por exemplo, é infiltrado por células efetoras humanas). Os métodos para detectar células efetoras humanas são bem conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, por IHC. Em algumas modalidades, o câncer exibe altos níveis de células efetoras humanas. Em algumas modalidades, as células efetoras humanas são uma ou mais de células NK, macrófagos, monócitos. Em algumas modalidades, o câncer é qualquer câncer descrito neste documento. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP), glioblastoma, neuroblastoma, melanoma, carcinoma de mama (por exemplo, câncer de mama triplo-negativo), câncer gástrico, câncer colorretal (CRC) ou carcinoma hepatocelular.

[0338] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, o câncer exibe células que expressam FcR (por exemplo, é infiltrado por células que expressam FcR). Os métodos para detectar FcR são bem conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, por IHC. Em algumas modalidades, o câncer exibe altos níveis de células que expressam FcR. Em algumas modalidades, FcR é FcγR. Em algumas modalidades, FcR é FcγR de ativação. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP), glioblastoma, neuroblastoma, melanoma, carcinoma de mama (por exemplo, câncer de mama triplo-negativo), câncer gástrico, câncer colorretal (CRC) ou carcinoma hepatocelular.

[0339] Em algumas modalidades, o biomarcador PD-L1 é detectado na amostra usando um método selecionado a partir do grupo que consiste em FACS, Western blot, ELISA, imunoprecipitação, imuno- histoquímica, imunofluorescência, radioimunoensaio, dot blotting, métodos de imunodetecção, HPLC, ressonância de plásmon de superfície, espectroscopia óptica, espectrometria de massa, HPLC, qPCR, RT-qPCR, qPCR multiplex ou RT-qPCR, RNA-seq, análise de microarranjo, SAGE,

técnica MassARRAY e FISH e combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, o biomarcador PD-L1 é detectado usando a análise FACS.

Em algumas modalidades, o biomarcador PD-L1 é PD-L1. Em algumas modalidades, a expressão de PD-L1 é detectada em amostras de sangue.

Em algumas modalidades, a expressão de PD-L1 é detectada em células do sistema imunológico circulantes em amostras de sangue. Em algumas modalidades, a célula imune circulante é uma célula T CD3 +/CD8 +. Em algumas modalidades, antes da análise, as células imunes são isoladas das amostras de sangue. Qualquer método adequado para isolar/enriquecer tal população de células pode ser usado incluindo, mas não se limitando a, seleção de células. Em algumas modalidades, a expressão de PD-L1 é elevada em amostras de indivíduos que respondem ao tratamento com um inibidor da via do eixo PD-L1/PD-1, tal como um anticorpo anti-PD-L1. Em algumas modalidades, a expressão de PD-L1 é elevada nas células imunes circulantes, tais como as células T CD3 +/CD8 +, em amostras de sangue.

[0340] Certos aspectos da presente divulgação referem-se à medição do nível de expressão de um ou mais genes ou uma ou mais proteínas em uma amostra. Em algumas modalidades, uma amostra pode incluir os leucócitos. Em algumas modalidades, a amostra pode ser uma amostra de sangue periférico (por exemplo, de um paciente com um tumor). Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra tumoral. Uma amostra tumoral pode incluir células cancerosas, linfócitos, leucócitos, estroma, vasos sanguíneos, tecido conjuntivo, lâmina basal e qualquer outro tipo de célula em associação com o tumor. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de tecido tumoral contendo os leucócitos infiltrantes de tumor. Em algumas modalidades, a amostra pode ser processada para separar ou isolar um ou mais tipos de células (por exemplo, leucócitos). Em algumas modalidades, a amostra pode ser usada sem separação ou o isolamento de tipos de células.

[0341] Uma amostra tumoral pode ser obtida a partir de um sujeito por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, sem limitação, uma biopsia, endoscopia, ou procedimento cirúrgico. Em algumas modalidades, uma amostra tumoral pode ser preparada por métodos tais como congelamento, fixação (por exemplo, usando formalina ou um fixador semelhante), e/ou incorporação em cera de parafina. Em algumas modalidades, uma amostra tumoral pode ser seccionada. Em algumas modalidades, uma amostra tumoral fresca (ou seja, uma que não fo i preparada pelos métodos acima descritos) pode ser usada. Em algumas modalidades, uma amostra pode ser preparada por incubação em uma solução para preservar a integridade de mRNA/ou proteína.

[0342] Em algumas modalidades, a amostra pode ser uma amostra de sangue periférico. Uma amostra de sangue periférico pode incluir glóbulos brancos do sangue, PBMCs, e similares. Qualquer técnica conhecida na técnica para o isolamento de leucócitos a partir de uma amostra de sangue periférico pode ser usada. Por exemplo, uma amostra de sangue pode ser extraída, os glóbulos vermelhos podem ser lisados e um grânulo de glóbulos brancos pode ser isolado e usado para a amostra.

Em outro exemplo, a separação por gradiente de densidade pode ser usada para separar leucócitos (por exemplo, PBMCs) de glóbulos vermelhos. Em algumas modalidades, uma amostra de sangue periférico fresca (isto é, uma que não foi preparada pelos métodos acima descritos) pode ser usada. Em algumas modalidades, uma amostra de sangue periférico pode ser preparada por incubação em uma solução para preservar a integridade de mRNA/ou proteína.

[0343] Em algumas modalidades, a capacidade de resposta ao tratamento pode se referir a qualquer um ou mais dos seguintes: estender a sobrevida (incluindo sobrevida global e sobrevida livre de progressão); resultar em uma resposta objetiva (incluindo uma resposta completa ou uma resposta parcial); ou melhorar os sinais ou sintomas do câncer. Em algumas modalidades, a capacidade de resposta pode se referir à melhoria de um ou mais fatores de acordo com o conjunto publicado de diretrizes RECIST para determinar o estado de um tumor em um paciente com câncer, ou seja, responder, estabilizar ou progredir. Para uma discussão mais detalhada dessas diretrizes, vide Eisenhauer et al., Eur J Cancer 2009; 45: 228−47; Topalian et al., N Engl J Med 2012; 366: 2443−54; Wolchok et al., Clin Can Res 2009; 15: 7412−20; e Therasse, P., et al. J. Natl. Cancer Inst. 92:205-16 (2000). Um sujeito responsivo pode referir-se a um sujeito cujo(s) câncer(es) mostram melhora, por exemplo, de acordo com um ou mais fatores com base nos critérios RECIST. Um sujeito não responsivo pode referir-se a um sujeito cujo(s) câncer(es) não mostram melhora, por exemplo, de acordo com um ou mais fatores com base nos critérios RECIST.

[0344] Os critérios de resposta convencionais podem não ser adequados para caracterizar a atividade antitumoral de agentes imunoterapêuticos, os quais podem produzir respostas retardadas que podem ser precedidas por progressão radiológica aparente inicial, incluindo o aparecimento de novas lesões. Portanto, foram desenvolvidos critérios de resposta modificados que respondem pelo possível aparecimento de novas lesões e permitem que a progressão radiológica seja confirmada em uma avaliação subsequente. Por conseguinte, em algumas modalidades, a capacidade de resposta pode referir-se à melhoria de um ou mais fatores de acordo com os critérios de resposta2 relacionados ao sistema imunológico (irRC). See, e.g., Wolchok et al., Clin Can Res 2009;15:7412 −

20. Em algumas modalidades, as novas lesões são adicionadas para a carga tumoral definida e seguidas, por exemplo, para a progressão radiológica em uma avaliação subsequente. Em algumas modalidades, a presença de lesões não alvo é incluída na avaliação da resposta completa e não incluída na avaliação da progressão radiológica. Em algumas modalidades, a progressão radiológica pode ser determinada somente com base na doença mensurável e/ou pode ser confirmada por uma avaliação consecutiva ≥ 4 semanas a partir da data documentada pela primeira vez.

[0345] Em algumas modalidades, a capacidade de resposta pode incluir ativação imune. Em algumas modalidades, a capacidade de resposta pode incluir a eficácia do tratamento. Em algumas modalidades, a capacidade de resposta pode incluir ativação imune e eficácia do tratamento.

X. ARTIGOS DE FABRICAÇÃO OU KITS

[0346] Em outra modalidade da invenção, um artigo de fabricação ou um kit é fornecido compreendendo um antagonista de ligação ao eixo PD-1 (tal como atezolizumabe), um agente de platina (tal como carboplatina) e/ou um inibidor de topoisomerase II (tal como etoposídeo).

Em algumas modalidades, o artigo de fabricação ou kit compreende ainda a bula compreendendo instruções para usar o antagonista de ligação ao eixo PD-1 em conjunto com o agente de platina (tal como carboplatina) e o inibidor de topoisomerase II (tal como etoposídeo) para tratar ou retardar progressão do câncer (por exemplo, câncer de pulmão, tal como câncer de pulmão de pequenas células (CPPC), incluindo câncer de pulmão de pequenas células em estágio extensivo (CPPC-EE)) em um indivíduo ou para aumentar a função imunológica de um indivíduo com câncer (por exemplo, câncer de pulmão,tal como câncer de pulmão de pequenas células (CPPC), incluindo câncer de pulmão de pequenas células em estágio extensivo (CPPC-EE)). Qualquer um do antagonista de ligação ao eixo PD-1, agente de platina e inibidor de topoisomerase II conhecido na técnica pode ser incluído no artigo de fabricação ou kits. Em algumas modalidades, o kit compreende atezolizumabe, carboplatina e etoposídeo.

[0347] Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo PD-1 (tal como atezolizumabe), o agente de platina (tal como carboplatina) e o inibidor de topoisomerase II (tal como etoposídeo) estão no mesmo recipiente ou em recipientes separados. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, sacos e seringas. O recipiente pode ser formado de uma variedade de materiais, tais como vidro, plástico (tal como policloreto de vinila ou poliolefina) ou liga metál ica (tal como aço inoxidável ou hastelloy). Em algumas modalidades, o recipiente contém a formulação e o rótulo no ou associado ao recipiente que pode indicar instruções de uso. O artigo de fabricação ou kit pode incluir ainda outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e bulas com instruções de uso. Em algumas modalidades, o artigo de fabricação inclui ainda um ou mais de outro agente (por exemplo, um agente quimioterapêutico e um agente antineoplásico). Recipientes adequados para um ou mais agentes incluem, por exemplo, garrafas, frascos, sacos e seringas.

[0348] O relatório descritivo é considerado como sendo suficiente para permitir que um técnico no assunto pratique a presente invenção. Várias modificações da invenção em adição às apresentadas e descritas neste documento serão evidentes para os técnicos no assunto a partir da descrição anterior e estão dentro do escopo das reivindicações anexas. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citados neste documento são por meio deste incorporado por referência na sua totalidade para todos os fins.

E XEMPLOS

[0349] A invenção será mais completamente compreendida pela referências aos seguintes exemplos. Eles não devem, no entanto, ser interpretados como limitantes do escopo da invenção. Entende-se que os exemplos e modalidades descritos neste documento são somente para fins ilustrativos, e que várias modificações ou alterações à luz dos mesmos serão sugeridas para técnicos no assunto e devem ser incluídas dentro do espírito e alcance deste pedido e escopo das reivindicações anexas.

E XEMPLO 1: UM ESTUDO DE FASE I/III, RANDOMIZADO , DUPLO-CEGO,

CONTROLADO POR PLACEBO DE CARBOPLATINA MAIS ETOPOSÍDEO COM OU SEM ATEZOLIZUMABE ( ANTICORPO ANTI -PD-L1) EM PACIENTES COM CÂNCER DE PULMÃO DE PEQUENAS CÉLULAS EM ESTÁGIO EXTENSIVO NÃO TRATADO (CPPC- EE).

[0350] Este estudo foi projetado para avaliar se o efeito antitumoral observado em pacientes tratados com atezolizumabe se traduziria em melhora estatisticamente significativa e clinicamente relevante na SLP e SG quando usado em combinação com carboplatina e etoposídeo, em comparação com placebo, carboplatina e etoposídeo em pacientes com CPPC-EE virgens à quimioterapia. Este estudo permitiu a avaliação da eficácia do atezolizumabe na população IDT e para a avaliação de resultados imunes exploratórios, tais como, mas não se limitando a uma avaliação retrospectiva pela expressão de PD-L1 e sua associação com os desfechos do paciente.

O BJETIVOS DO ESTUDO

[0351] Os principais objetivos de eficácia deste estudo foram os seguintes: • Avaliar a eficácia de atezolizumabe + carboplatina + etoposídeo em comparação com placebo + carboplatina + etoposídeo na população com intenção de tratar (IDT) conforme medida pela sobrevida livre de progressão (SLP) avaliada pelo investigador de acordo com RECIST v1.1 (vide, por exemplo, Eisenhauer et al. (2009) “New response evaluation criteria in solid tumors: Revised RECIST guideline (version 1.1)”.

Eur J Cancer, 45:228-47); e • Avaliar a eficácia de atezolizumabe + carboplatina + etoposídeo em comparação com placebo + carboplatina + etoposídeo na população IDT conforme medida pela sobrevida global (SG).

[0352] Os objetivos secundários de eficácia deste estudo foram os seguintes: • Avaliar a eficácia do atezolizumabe + carboplatina + etoposídeo em comparação com placebo + carboplatina + etoposídeo na população IDT, conforme medido pela taxa de resposta objetiva (ORR) avaliada pelo investigador de acordo com RECIST v1.1; • Avaliar a eficácia do atezolizumabe + carboplatina + etoposídeo em comparação com placebo + carboplatina + etoposídeo na população IDT, conforme medida pela duração da resposta (DOR) avaliada pelo investigador de acordo com RECIST v1.1; • Avaliar a taxa de SLP em 6 meses e em 1 ano em cada braço de tratamento para a população IDT. Avaliar a taxa de SG em 1 e 2 anos em cada braço de tratamento para a população IDT; e • Determinar o impacto do atezolizumabe conforme medido pelo tempo de deterioração (TTD) em sintomas de câncer de pulmão relatados por pacientes de tosse, dispneia (subescalas de item único e multi-item), dor no peito, dor no braço/ombro ou fadiga usando o Questionário de Qualidade de Vida da Organização Europeia para a Pesquisa e Tratamento do Câncer (EORTC) - Core 30 (QLQ-C30) e o módulo suplementar de câncer de pulmão (QLQ-LC13) em pacientes tratados com atezolizumabe + carboplatina + etoposídeo em comparação com placebo + carboplatina + etoposídeo na população IDT.

[0353] Os objetivos de segurança para este estudo foram os seguintes: • Avaliar a segurança e tolerabilidade do atezolizumabe em combinação com carboplatina + etoposídeo em comparação com carboplatina + etoposídeo; e • Avaliar a incidência e os títulos de anticorpos antiterapêuticos (ATAs) contra o atezolizumabe e explorar a re lação potencial da resposta de imunogenicidade com a farmacocinética, segurança e eficácia.

[0354] O objetivo farmacocinético deste estudo é caracterizar a farmacocinética do atezolizumabe, carboplatina e etoposídeo em pacientes com CPPC-EE virgens à quimioterapia.

[0355] Os objetivos exploratórios deste estudo foram os seguintes: • Avaliar RECIST modificado por SLP, ORR e DOR avaliados pelo investigador para o braço de tratamento contendo atezolizumabe na população IDT; • Avaliar a relação entre os biomarcadores tumorais (incluindo, mas não se limitando a PD-L1, PD-1, mutações somáticas e outros), conforme definido por imuno-histoquímica (IHC) ou reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa quantitativa (qRT-PCR), sequenciamento de próxima geração (NGS) e/ou outros métodos e medidas de eficácia; • Avaliar biomarcadores exploratórios preditivos, prognósticos e farmacodinâmicos em tecido tumoral arquivado e/ou fresco,

sangue, plasma e soro e sua associação com o estado da doença, mecanismos de resistência e/ou resposta ao tratamento do estudo; • Avaliar e comparar o estado de saúde do paciente conforme avaliado pelo questionário EuroQoL 5 Dimensions 5-Level (EQ- 5D-5L) para gerar pontuações de utilidade para uso em modelos econômicos para reembolso; • Determinar o impacto do atezolizumabe + carboplatina + etoposídeo em comparação com placebo + carboplatina + etoposídeo conforme medido pela alteração da linha de base em desfechos relatados pelo paciente (PRO) de qualidade de vida relacionada à saúde, sintomas relacionados ao câncer de pulmão , funcionamento físico e estado de saúde, conforme avaliado pelos Questionários de Qualidade de Vida da Organização Europeia para a Pesquisa e Tratamento do Câncer EORTC QLQ-C30 e LC13; e • Avaliar o impacto da quimioterapia (carboplatina e etoposídeo) nas populações de células T periféricas e específicas de tumor durante e após a terapia de indução e sua relação com os desfechos de eficácia e segurança.

P ROJETO DO ESTUDO

[0356] Descritos abaixo estão os detalhes de um estudo randomizado, de Fase I/III, multicêntrico, duplo-cego, controlado por placebo, projetado para avaliar a segurança e eficácia de atezolizumabe em combinação com carboplatina + etoposídeo em comparação com o tratamento com placebo + carboplatina + etoposídeo em pacientes que têm CPPC-EE e eram virgens à quimioterapia para sua doença em estágio extensivo. A Figura 1 ilustra o projeto do estudo. Detalhes adicionais sobre o projeto do estudo são fornecidos no esquema abaixo:

Pacientes com CPPC em estágio extensivo que são virgens à quimioterapia n=aproximadamente 400 pacientes Randomização (1:1) Estratificação: Sexo

PS DE ECOG Metástases do cérebro Braço A Braço B Indução Quatro ciclos de 21 dias Placebo + Atezolizumabe + Carboplatina + Etoposídeo Carboplatina + Etoposídeo Manutenção Atezolizumabe Placebo Progressão da doença (RECIST v1.1) O tratamento pode continuar, desde que: • Evidência de benefício clínico avaliado pelo investigador • Nenhum declínio no PS de ECOG atribuído à progressão da doença • Nenhum crescimento tumoral em locais críticos • Os pacientes devem fornecer consentimento por escrito Continue o tratamento até evidência de progressão persistente da doença radiográfica, perda do benefício clínico, deterioração sintomática ou toxicidade inaceitável Acompanhamento da sobrevida PS de ECOG = performance status do Eastern Cooperative Oncology Group; CPPC = câncer de pulmão de pequenas células; RECIST = Critérios de avaliação de resposta em tumores sólidos.

[0357] Os pacientes elegíveis foram estratificados por sexo (masculino vs. feminino), performance status (0 vs. 1) do ECOG (ie, Eastern Cooperative Oncology Group) e presença de metástases cerebrais (sim vs.

não) e randomizados 1:1 para receber um dos seguintes regimes de tratamento, conforme mostrado na Tabela 5. Mais detalhes sobre o performance status do ECOG são fornecidos em Oken et al. (1982) Am J

Clin Oncol. 5:649-655).

TABELA 5: BRAÇOS DE TRATAMENTO DO ESTUDO

FASE DE MANUTENÇÃO

BRAÇO DE FASE DE INDUÇÃO (Todos os ciclos de 21 TRATAMENTO (quatro ciclos de 21 Dias) dias após o ciclo 4)

A atezolizumabe + carboplatina + etoposídeo atezolizumabe (201 pacientes)

B placebo + carboplatina + etoposídeo placebo (202 pacientes)

[0358] O tratamento de indução foi administrado em um ciclo de 21 dias por quatro ciclos. Após a fase de indução, os pacientes continuaram a terapia de manutenção com atezolizumabe (Braço A) ou placebo (Braço B). Durante a fase de manutenção, a irradiação craniana profilática foi permitida de acordo com o padrão de atendimento local e relatada no Formulário de Relato de Caso Eletrônico (eCRF) para Irradiação Craniana Profilática. A radiação torácica com intenção curativa ou a intenção de eliminar a doença residual não foi permitida. A radiação torácica paliativa foi permitida. O cronograma de dosagem e administração para os regimes de tratamento na Tabela 5 são fornecidos na Tabela 6 abaixo: TABELA 6: CRONOGRAMA DE DOSAGEM E ADMINISTRAÇÃO PARA REGIMES DE

TRATAMENTO Indução Manutenção Fase de Fase de Fármacos Ciclos 1 a 4* > Ciclo 4* (listados em ordem de administração) Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 1 1) atezolizumabe (Braço A) ou 1200 mg 1200 mg placebo (Braço B) 2) carboplatina ASC = 5ǂ 3) etoposídeo 100 mg/m2 100 mg/m2 100 mg/m2

* Ciclos de 21 dias.

ǂ mg/ml/min.

[0359] Se clinicamente viável, foi recomendado que os pacientes fossem submetidos a uma coleta de amostra de biópsia do tumor no momento da progressão da doença radiográfica. Esses dados foram usados para explorar se os achados radiográficos eram consistentes com a presença de um tumor. Além disso, esses dados foram analisados para avaliar a associação entre as alterações no tecido tumoral e o resultado clínico e para entender melhor os mecanismos potenciais de progressão e resistência ao atezolizumabe em comparação com esses mecanismos após o tratamento apenas com quimioterapia. Essa avaliação exploratória do biomarcador não foi usada para quaisquer decisões relacionadas ao tratamento.

[0360] Todos os pacientes foram submetidos a avaliações de tumor no início do estudo e a cada 6 semanas (±7 dias) por 48 semanas após o ciclo 1, dia 1, independentemente dos atrasos na dose de tratamento. Após a conclusão da avaliação do tumor da Semana 48, avaliações do tumor foram necessárias a cada 9 semanas (±7 dias) depois disso, independentemente dos atrasos na dose de tratamento. Os pacientes foram submetidos a avaliações de tumor até a progressão da doença radiográfica de acordo com RECIST v1.1, retirada do consentimento, encerramento do estudo pelo patrocinador ou morte, o que ocorresse primeiro.

[0361] Os pacientes que continuaram o tratamento além da progressão da doença radiográfica por RECIST v1.1 continuaram a ser submetidos a avaliações de tumor a cada 6 semanas (±7 dias), ou antes, se ocorresse deterioração sintomática. Para esses pacientes, as avaliações de tumor continuaram a cada 6 semanas (±7 dias), independentemente do tempo no estudo, até o tratamento do estudo ser descontinuado.

[0362] Pacientes que descontinuaram o tratamento por razões diferentes da progressão da doença radiográfica de acordo com RECIST v1.1 (por exemplo, toxicidade, deterioração sintomática) continuaram as avaliações tumorais programadas na mesma frequência que teria sido seguida se o paciente tivesse permanecido no tratamento do estudo (ou seja, a cada 6 semanas [± 7 dias] por 48 semanas após o ciclo 1, fia 1 e, em seguida, a cada 9 semanas [± 7 dias] daí em diante, independentemente dos atrasos da dose de tratamento) até a progressão da doença radiográfica por RECIST v1.1, retirada do consentimento, encerramento do estudo pelo patrocinador, ou morte, o que ocorresse primeiro, independentemente de os pacientes terem iniciado uma nova terapia anticâncer.

[0363] Em caso de encerramento antecipado do estudo, os pacientes que obtiveram benefício clínico do tratamento com atezolizumabe foram autorizados a continuar o tratamento com atezolizumabe a critério do investigador.

MEDIDAS DE RESULTADO

[0364] As medidas de resultados primários de eficácia para este estudo foram: • SLP, definida como o tempo desde a randomização até a primeira ocorrência de progressão da doença, conforme determinado pelo investigador usando RECIST v1.1 ou morte por qualquer causa, o que ocorrer primeiro, • SG, definida como o tempo desde a randomização até a morte por qualquer causa.

[0365] As medidas de resultado de eficácia secundária para este estudo foram:

• Resposta objetiva, definida como PR ou CR conforme determinado pelo investigador de acordo com RECIST v1.1; • Duração da resposta (DOR), definida como a faixa de tempo desde a primeira ocorrência de uma resposta objetiva documentada até o tempo de progressão da doença conforme determinado pelo investigador usando RECIST v1.1 ou morte por qualquer causa, o que ocorresse primeiro; • Taxas de SLP em 6 meses e em 1 ano; • Taxas de sistema operacional em 1 e 2 anos; e • Tempo para deterioração (TTD) em sintomas de câncer de pulmão relatados por pacientes, definidos como o tempo desde a randomização até a deterioração (alteração de 10 pontos) em cada uma das subescalas de sintomas EORTC QLQ-C30 (Questionário de Qualidade de Vida C30 da Organização Europeia para a Pesquisa e Tratamento do Câncer) e EORTC QLQ-LC13 (vide Berman et al. (1994) Eur J Cancer.

30A(5):635-42) mantidas por duas avaliações ou uma avaliação seguida de morte por qualquer causa dentro de 3 semanas.

[0366] As medidas de resultados de segurança para este estudo foram: • Incidência, natureza e gravidade dos eventos adversos classificados de acordo com os Critérios de Terminologia Comum para Eventos Adversos do National Cancer Institute (NCI CTCAE) v4.0; • Alterações nos sinais vitais, achados físicos e resultados laboratoriais clínicos durante e após a administração do tratamento do estudo; e • Incidência de resposta de anticorpos antiterapêuticos (ATA) ao atezolizumabe e correlação potencial com parâmetros farmacodinâmicos, farmacodinâmicos, de segurança e eficácia.

[0367] As medidas de resultados farmacocinéticos para este estudo foram: • Concentração sérica máxima observada de atezolizumabe (C max) após a infusão; • Concentração sérica mínima de atezolizumabe observada (C min) antes da infusão em ciclos selecionados, na descontinuação do tratamento e aos 120 dias (± 30 dias) após a última dose de atezolizumabe; • Concentrações plasmáticas de carboplatina; e • Concentrações plasmáticas de etoposídeo.

[0368] As medidas de resultados exploratórias para este estudo foram: • Resposta objetiva, SLP e DOR, conforme determinado pelo investigador de acordo com RECIST modificado; • Status de PD-L1-, imunológico e relacionado ao CPPC e outros biomarcadores exploratórios em tecidos tumorais arquivados e/ou recentemente obtidos e sangue (ou derivados do sangue) coletados antes, durante ou após o tratamento com atezolizumabe ou na progressão e associação com o estado de doença e/ou resposta ao atezolizumabe; • Pontuações de utilidade do EQ-5D-5L (ou seja, um instrumento padronizado para medir o estado de saúde genérico; vide The EuroQol Group (1990) Health Policy 16(3):199-208); • Alteração da linha de base em PROs de qualidade de vida relacionada à saúde, sintomas relacionados ao câncer de pulmão, funcionamento físico e estado de saúde conforme avaliado pelo EORTC QLQ-C30 e QLQ-LC13; e • Alterações nos níveis e tipo de populações de células T periféricas e específicas do tumor durante e após a terapia de indução e sua relação com os resultados de eficácia e segurança.

PACIENTES

[0369] Os pacientes eram elegíveis para participação neste estudo se fossem virgens à quimioterapia- e tivessem CPPC-EE.

CRITÉRIO DE INCLUSÃO

[0370] Os principais critérios de inclusão foram idade igual ou superior a 18 anos; performance status do ECOG de 0 ou 1; CPPC-EE confirmado histologicamente ou citologicamente (de acordo com o sistema de estadiamento Veterans Administration Lung Study Group (VALG); (Micke et al. (2002) “Staging small cell lung cancer: Veterans Administration Lung Study Group versus International Association for the Study of Lung Cancer—what limits limited disease?” Lung Cancer 37: 271-6); nenhum tratamento sistêmico prévio para CPPC-EE; os pacientes que receberam quimiorradioterapia anterior para CPPC em estágio limitado deviam ter sido tratados com intenção curativa e deviam ter experimentado um intervalo sem tratamento de pelo menos 6 meses desde a última quimioterapia, radioterapia ou ciclo de quimiorradioterapia desde o diagnóstico de CPPC em estágio extensivo; pacientes com história de metástases do SNC assintomáticas tratadas eram elegíveis apenas se (a) as metástases fossem supratentorial e/ou cerebelar (isto é, sem metástases para o mesencéfalo, ponte, medula ou medula espinhal); (b) os pacientes não tivessem necessidade contínua de corticosteroides como terapia para a doença do SNC, (c) os pacientes não tivessem evidência de progressão provisória entre a conclusão da terapia direcionada ao SNC e a randomização, e (d) pacientes com novas metástases assintomáticas do SNC detectadas na varredura de rastreamento devem receber radioterapia e/ou cirurgia para metástases do SNC; doença mensurável, conforme definido pelo RECIST v1.1 (lesões previamente irradiadas só foram consideradas como doença mensurável se a progressão da doença tivesse sido inequivocamente documentada naquele local, uma vez que a radiação e a lesão previamente irradiada não eram o único local da doença); função hematológica e de órgão final adequada, definida pelos seguintes resultados de testes laboratoriais obtidos dentro de 14 dias antes da randomização: o ANC ≥ 1500 células/µL sem colônia de granulócitos estimulando o suporte do fator.

o Contagem de linfócitos ≥ 500/µL; o Contagem de plaquetas ≥ 100.000/µL sem transfusão; o Hemoglobina ≥ 9,0 g/dL. (Os pacientes foram autorizados a receber transfusão para atender a este critério); o INR ou aPTT ≤ 1,5 x limite superior do normal (ULN).

(Isso se aplicava somente a pacientes que não estavam recebendo anticoagulação terapêutica; os pacientes que recebiam anticoagulação terapêutica eram obrigados a tomar uma dose estável); o AST, ALT e fosfatase alcalina ≤ 2,5 x ULN, com as seguintes exceções; • Pacientes com metástases hepáticas documentadas: AST e/ou ALT ≤ 5 x ULN; • Pacientes com metástases hepáticas ou ósseas documentadas: fosfatase alcalina ≤ 5 x ULN; o Bilirrubina sérica ≤ 1,25 x ULN. (Pacientes com doença de Gilbert conhecida que tinham nível de bilirrubina sérica ≤ 3 x ULN foram inscritos); e o Creatinina sérica ≤ 1,5 x ULN.

[0371] Os pacientes foram solicitados a enviar uma amostra de tecido tumoral pré-tratamento antes ou dentro de 4 semanas após a randomização. (Qualquer amostra de tecido tumoral disponível pode ser enviada).

CRITÉRIO DE EXCLUSÃO

[0372] Os principais critérios de exclusão incluíram: metástases do SNC ativas ou não tratadas, conforme determinado por avaliação de tomografia computadorizada (TC) ou ressonância magnética (MRI) durante a triagem e avaliações radiográficas anteriores; compressão da medula espinhal não tratada definitivamente com cirurgia e/ou radiação ou compressão da medula espinhal previamente diagnosticada e tratada sem evidência de que a doença está clinicamente estável por ≥ 1 semana antes da randomização; doença leptomeníngea; derrame pleural não controlado, derrame pericárdico ou ascite que requerem procedimentos de drenagem recorrentes (uma vez por mês ou mais frequentemente, mas os pacientes com cateteres de demora (por exemplo, PleurX ®) foram permitidos independentemente da frequência de drenagem); hipercalcemia não controlada ou sintomática (os pacientes que estavam recebendo denosumabe antes da randomização foram, se elegíveis, obrigados a descontinuar seu uso e substituí-lo por um bifosfonato durante o estudo); malignidades diferentes do CPPC nos 5 anos anteriores à randomização, com exceção daqueles com um risco insignificante de metástase ou morte (por exemplo, SG esperada em 5 anos > 90%) tratados com resultado curativo esperado (tal como carcinoma adequadamente tratado in situ do colo do útero, câncer de pele basal ou de células escamosas, câncer de próstata localizado tratado cirurgicamente com intenção curativa, carcinoma ductal in situ tratado cirurgicamente com intenção curativa); mulheres que estavam grávidas, amamentando ou com intenção de engravidar durante o estudo; história de doença autoimune, incluindo, mas não se limitando a miastenia gravis, miosite, hepatite autoimune, lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatóide, doença inflamatória intestinal, trombose vascular associada à síndrome antifosfolipídica, granulomatose de Wegener,

síndrome de Sjögren, síndrome de Guillain-Barré, esclerose múltipla,

vasculite ou glomerulonefrite (pacientes com história de hipotireoidismo relacionado a autoimune em terapia de reposição hormonal da tireóide eram elegíveis; pacientes com diabetes mellitus tipo I controlada em regime de insulina eram elegíveis); história de fibrose pulmonar idiopática, pneumonia em organização (por exemplo, bronquiolite obliterante), pneumonite induzida por fármacos, pneumonite idiopática ou evidência de pneumonite ativa na triagem de tomografia computadorizada de tórax. (História de pneumonite por radiação no campo de radiação (fibrose) foi permitida);

resultado de teste positivo para HIV; pacientes com hepatite B ativa

(crônica ou aguda; definida como tendo um resultado positivo do teste do antígeno de superfície da hepatite B [HBsAg] na triagem) ou vírus da hepatite C (HCV); tuberculose ativa; infecções graves no momento da randomização, incluindo, mas não se limitando a, hospitalização por complicações de infecção, bacteremia ou pneumonia grave; doença cardiovascular significativa, tal como doença cardíaca da New York Heart

Association (Classe II ou superior), infarto do miocárdio ou acidente vascular cerebral dentro de 3 meses antes da randomização, arritmias instáveis ou angina instável. (Pacientes com doença arterial coronariana conhecida, insuficiência cardíaca congestiva que não atende aos critérios acima ou fração de ejeção do ventrículo esquerdo < 50% foram requeridos a estarem em um regime médico estável que é otimizado na opinião do médico assistente, em consulta com um cardiologista, se apropriado);

procedimento cirúrgico principal que não seja para diagnóstico dentro de 28 dias antes da randomização ou antecipação da necessidade de procedimento cirúrgico principal durante o curso do estudo; transplante de medula óssea alogênico prévio ou transplante de órgão sólido; qualquer outra doença, disfunção metabólica, achado de exame físico ou achado de laboratório clínico que dê suspeita razoável de uma doença ou condição que contra-indica o uso de um fármaco experimental ou que possa ter afetado a interpretação dos resultados ou colocado o paciente em alto risco para o tratamento das complicações; pacientes com doenças ou condições que interferem em sua capacidade de compreender, seguir e/ou cumprir os procedimentos do estudo; tratamento com qualquer outro agente investigacional com intenção terapêutica nos 28 dias anteriores à randomização; administração de uma vacina viva atenuada dentro de 4 semanas antes da randomização ou antecipação de que tal vacina viva atenuada seria necessária durante o estudo; tratamento prévio com agonistas de CD137 ou terapias de bloqueio de ponto de controle imunológico, anticorpos terapêuticos anti-PD-1 e anti-PD-L1; tratamento com medicamentos imunossupressores sistêmicos (incluindo, mas não se limitando a, corticosteroides, ciclofosfamida, azatioprina, metotrexato, talidomida e agentes de fator de necrose antitumoral [anti-TNF]) dentro de 1 semana antes da randomização; história de reações alérgicas graves, anafiláticas ou outras reações de hipersensibilidade a anticorpos quiméricos ou humanizados ou proteínas de fusão; hipersensibilidade ou alergia conhecida a biofármacos produzidos em células de ovário de hamster chinês ou qualquer componente da formulação de atezolizumabe; e histórico de reações alérgicas à carboplatina ou etoposídeo.

MÉTODOS DE TRATAMENTO

[0373] 403 pacientes foram randomizados (1:1) para receber tratamento com atezolizumabe + carboplatina + etoposídeo (Braço A) ou placebo + carboplatina + etoposídeo (Braço B). (Os detalhes dos Braços de Tratamento A e B são mostrados acima na Tabela 5). A disposição do paciente é mostrada na Tabela 7 abaixo, e a demografia do paciente e as características de base de linha são mostradas na Tabela 8 abaixo. (Nas Tabelas 7 e 8, PBO + CE = "placebo + carboplatina + etoposídeo,". Atezo + CE = "atezolizumabe + carboplatina + etoposídeo").

TABELA 7: DISPOSIÇÃO DO PACIENTE IDT PBO+CE ATEZO+CE (N=403) (N=202) (N=201) Tratamento 197 (97,5%) 197 (98,0%) Recebido Em estudo 60 (29,7%) 77 (38,3%) Vivo: em 11 (5,4%) 23 (11,4%) tratamento Vivo: em 49 (24,3%) 54 (26,9%) acompanhamento Estudo 142 (70,3%) 124 (61,7%) Descontinuado Morte 132 (65,3%) 101 (50,2%) Perdido para 1 (0,5%) 3 (1,5%) Acompanhamento Decisão do Médico 0 2 (1,0%) Retirado pelo 9 (4,5%) 18 (9,0%) Sujeito TABELA 8: DEMOGRAFIA E CARACTERÍSTICAS DE LINHA DE BASE DO PACIENTE PBO=CE ATEZO+CE Demografia/Características de (N=202) (N=201) Linha de Base Idade (anos) <65 106 (52,5%) 111 (55,2%) Sexo (IxRS) Masculino 132 (65,3%) 130 (64,7%) Branco 159 (78,7%) 163 (81,1%) Raça Asiático 36 (17,8%) 33 (16,4%) Outro 7 (3,5%) 5 (2,5%) Histórico de uso de Nunca 3 (1,5%) 9 (4,5%) tabaco Metástases cerebrais Sim 16 (7,9%) 16 (8,0%) (IxRS) ECOG de Linha de 1 130 (64,4%) 128 (63,7%) base (IxRS) bTMB >=16 40 (22,5%) 40 (23,1%) >=10 110 (61,8%) 102 (59,0%) SLD na linha de Média (SD) 116,58 (58,28) 120,90 (58,88) base Mediana 105,5 113,0

[0374] Os pacientes receberam sua primeira dose do medicamento do estudo no dia da randomização, se possível. Se isso não foi possível, a primeira dose ocorreu dentro de 5 dias após a randomização.

O atezolizumabe e o placebo foram fornecidos pelo patrocinador.

Carboplatina e etoposídeo foram o tratamento de base e foram considerados medicamentos não -experimentais (NIMPs). Carboplatina e etoposídeo foram usados nas formulações comercialmente disponíveis.

[0375] A fase de indução do estudo consistiu em quatro ciclos de atezolizumabe/placebo mais quimioterapia, com cada ciclo tendo 21 dias de duração. Vide Figura 1. No dia 1 de cada ciclo, todos os pacientes elegíveis foram administrados com infusões de fármacos do estudo na seguinte ordem: Braço A: atezolizumabe → carboplatina → etoposídeo Braço B: placebo → carboplatina → etoposídeo

[0376] Durante a fase de indução, o tratamento do estudo foi administrado da seguinte maneira no dia 1:

1. Atezolizumabe/placebo (1200 mg, equivalente a uma dose média baseada no peso corporal de 15 mg/kg), administrados por via intravenosa por 60 (± 15) minutos (para a primeira infusão e encurtamento para 30 [± 10] minutos para infusões subsequentes), seguidos por

2. Carboplatina, administrada por via intravenosa por 30-60 minutos para alcançar uma área alvo inicial sob a concentração da curva de tempo (ASC) de 5 mg/mL/min (dosagem da fórmula de Calvert), seguida por

3. Etoposídeo (100 mg/m 2), administrado por via intravenosa por 60 minutos.

[0377] A dose de carboplatina de ASC de 5 foi calculada usando a fórmula de Calvert (Calvert et al. (1989) J Clin Oncol 7:1748-56): FÓRMULA CALVERT: Dose total (mg) = (ASC alvo) x (taxa de filtração glomerular [TFG] + 25)

[0378] A TFG usada na fórmula de Calvert para calcular a dosagem com base na ASC não deveria exceder 125 mL/min. Para os fins deste protocolo, a TFG foi considerada equivalente à depuração de creatinina (CRCL). a CRCL é calculada por diretrizes institucionais ou pelo método descrito em Cockcroft e Gault (1976) Nephron 16:31-41, usando a seguinte fórmula: (140-idade) (peso) (x 0,85 se CRCL= feminino) 72 x crS

[0379] Em que: CRCL= depuração de creatinina em mL/min idade= idade do paciente em anos peso= peso do paciente em kg crS= creatinina sérica em mg/dL

[0380] Para pacientes com um nível de creatinina sérica anormalmente baixo, a estimativa de TFG foi estimada por meio do uso de um nível mínimo de creatinina de 0,8 mg/dL ou a TFG estimada foi limitada a 125 mL/min. Foi recomendado que os médicos limitassem a dose de carboplatina para a exposição desejada (ASC) para evitar toxicidade potencial devido à sobredosagem. Com base na fórmula de Calvert descrita no rótulo da carboplatina, as doses máximas foram calculadas como segue: Dose máxima de carboplatina (mg) = ASC alvo (mg x min/mL) x (TFG + 25 mL/min)

[0381] A dose máxima foi baseada em uma estimativa da TFG que é limitada a 125 mL/min para pacientes com função renal normal.

Nenhum valor estimado de TFG superior foi usado. Para uma ASC alvo = 5, a dose máxima foi 5 x 150 = 750 mg. Para uma ASC alvo = 4, a dose máxima foi 4 x 150 = 600 mg. Detalhes adicionais sobre a dosagem de carboplatina são fornecidos em: www.fda.

gov/aboutfda/centersoffices/officeofmedicalproductsandtobacco/cder/ucm22

8974.htm.

[0382] Durante a fase de indução, o etoposídeo (100 mg/m 2)

também foi administrado por via intravenosa por 60 minutos nos dias 2 e 3.

Os ciclos em que nenhuma quimioterapia foi administrada não contaram para o número total de ciclos de quimioterapia de indução. Após a fase de indução, os pacientes começaram a terapia de manutenção com atezolizumabe/placebo (ou seja, 1200 mg, infundido, como descrito acima, no dia 1 de cada ciclo de 21 dias subsequente, vide Figura 1 e o esquema de estudo acima). Não foram permitidas modificações na dose de atezolizumabe/placebo.

AVALIAÇÕES DE TUMOR E RESPOSTA

[0383] As avaliações de triagem incluíram tomografia computadorizada (TC) (com contraste oral/IV, a menos que contra-indicado) ou imagens de ressonância magnética (MRIs) de tórax e abdômen. Uma tomografia computadorizada ou ressonância magnética da pelve foi necessária na triagem e conforme indicação clínica ou de acordo com o padrão-de-atendimento local nas avaliações de resposta subsequentes. As tomografias computadorizadas em espiral do tórax foram obtidas, se possível, mas não eram obrigatórias.

[0384] Uma TC (com contraste, se não contra-indicada) ou ressonância magnética da cabeça foi necessária na triagem para avaliar a metástase do SNC em todos os pacientes. Uma ressonância magnética do cérebro foi necessária para confirmar ou refutar o diagnóstico de metástases do SNC na linha de base no caso de uma varredura duvidosa.

Pacientes com metástases ativas ou não tratadas do SNC não eram elegíveis para o estudo (vide Critérios de Exclusão).

[0385] Se uma tomografia computadorizada para avaliação do tumor foi realizada em uma tomografia por emissão de pósitrons (PET)/tomografia computadorizada, a aquisição da tomografia foi necessária para ser consistente com os padrões para uma tomografia computadorizada com contraste total.

[0386] Exames ósseos e tomografias computadorizadas do pescoço também foram realizados se clinicamente indicado. A critério do investigador, outros métodos de avaliação de doença mensurável de acordo com RECIST v1.1 foram usados.

[0387] Era permitido usar avaliações de tumor realizadas como padrão-de-atendimento antes de obter o consentimento informado e dentro de 28 dias do ciclo 1, dia 1, em vez de repetir os testes. A documentação de todos os locais conhecidos da doença na triagem foi necessária e a documentação reavaliada em cada avaliação subsequente do tumor. O mesmo procedimento radiográfico usado para avaliar os locais da doença na triagem deveria ter sido durante todo o estudo (por exemplo, o mesmo protocolo de contraste para tomografias computadorizadas). A resposta foi avaliada pelo investigador usando RECIST v1.1 (vide Eisenhauer et al. (2009) New response evaluation criteria in solid tumors: Revised RECIST guideline (versão 1.1). Eur J Cancer, 45: 228-47) e critérios RECIST modificados. Os critérios RECIST modificados foram derivados de RECIST v1.1 (Eisenhauer et al.; Topalian et al. (2012) N Engl J Med. 366:2443-54; e Wolchok et al. (2009) Clin Can Res 15:7412-20) e critérios de resposta relacionados ao sistema imunológico (Wolchoik et al.; Nishino et al. (2014) J Immunother Can. 2:17; e Nishino et al. (2013) Clin Can Res, 19:3936-43). As avaliações foram realizadas pelo mesmo avaliador, se possível, para garantir a consistência interna entre as visitas. Os resultados foram revisados pelo investigador antes da dosagem no próximo ciclo.

[0388] Os pacientes foram submetidos a avaliações tumorais no início do estudo e a cada 6 semanas (±7 dias) por 48 semanas após o ciclo 1, dia 1, independentemente dos atrasos na dose de tratamento. Após a conclusão da avaliação do tumor da Semana 48, avaliações do tumor foram necessárias a cada 9 semanas (±7 dias) depois disso, independentemente dos atrasos na dose de tratamento. Os pacientes foram submetidos a avaliações de tumor até a progressão da doença radiográfica de acordo com RECIST v1.1, retirada do consentimento, encerramento do estudo pelo patrocinador ou morte, o que ocorresse primeiro. Os pacientes que continuaram o tratamento além da progressão da doença radiográfica por RECIST v1.1 continuaram a ser submetidos a avaliações de tumor a cada 6 semanas (± 7 dias), ou antes, se ocorresse deterioração sintomática. Para esses pacientes, as avaliações do tumor continuaram a cada 6 semanas (± 7 dias), independentemente do tempo no estudo, até o tratamento do estudo ser descontinuado.

[0389] Os pacientes que descontinuaram o tratamento por razões diferentes da progressão da doença radiográfica de acordo com RECIST v1.1 (por exemplo, toxicidade, deterioração sintomática) continuaram as avaliações tumorais programadas na mesma frequência que teria sido seguida se o paciente tivesse permanecido no tratamento do estudo (ou seja, a cada 6 semanas [± 7 dias] por 48 semanas após o ciclo 1, dia 1 e, em seguida, a cada 9 semanas [± 7 dias] daí em diante, independentemente dos atrasos na dose de tratamento) até a progressão da doença radiográfica por RECIST v1.1, retirada do consentimento, encerramento do estudo pelo patrocinador ou morte, o que ocorresse primeiro, independentemente de os pacientes terem iniciado uma nova terapia anticâncer.

RESULTADOS

[0390] Os resultados do estudo são apresentados na Tabela 9 abaixo: TABELA 9: DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS RESULTADOS DE EFICÁCIA PRIMÁRIOS IDT PBO+CE ATEZO+CE (N=202) (N=201) Mediana (meses) 10,3 12,3 SG HR estratificado (95% de CI) 0,7 (0,54, 0,91) Log rank p estratificado p=0,0069 Mediana (meses) 4,3 5,2 PFS HR estratificado (95% de CI) 0,77 (0,62, 0,96) Log rank p estratificado p= 0,017

[0391] A Tabela 9 mostra que o estudo alcançou seus desfechos coprimários de sobrevida global (SG) e sobrevida livre de progressão (SLP) avaliada pelo investigador por RCECIST v1.1. A melhora da sobrevida global é estatisticamente significativa e clinicamente significativa.

[0392] Os pacientes tratados com Atezo + CE demonstraram sobrevida global estendida em comparação com os pacientes tratados com Placebo + CE. Vide Figura 2. A SG de 6 meses dos pacientes que receberam Atezo + CE foi 85,8% vs. 82,8% nos pacientes que receberam Placebo + CE. A SG de 12 meses dos pacientes que receberam Atezo + CE foi de 51,7% vs. 38,2% em pacientes que receberam placebo + CE. Os pacientes tratados com Atezo + CE também demonstraram sobrevida livre de progressão estendida em comparação com os pacientes tratados com Placebo + CE. Vide Tabela 3. A SLP de 6 meses dos pacientes que receberam Atezo + CE foi de 30,9% vs. 22,4% em pacientes que receberam Placebo + CE. A SLP de 12 meses de pacientes que receberam Atezo + CE foi de 12,6% vs. 5,4% em pacientes que receberam Placebo + CE.

[0393] A taxa de sobrevida global de um ano dos pacientes tratados com Atezo + CE foi de 51,7%, enquanto a taxa de sobrevida global de um ano dos pacientes que receberam Placebo + CE foi de 38,2%.

[0394] Além disso, as taxas de resposta objetiva (ORR) foram semelhantes entre os dois braços de tratamento, com ORR confirmada de 60% em pacientes que receberam atezolizumabe + carboplatina + etoposídeo vs. 64% em pacientes que receberam placebo + carboplatina + etoposídeo (CR: 2,5% no braço do atzeolizumabe + carboplatina + etoposídeo vs. 1% no braço do placebo + carboplatina + etoposídeo). Vide Figura 4 (CR = resposta completa; CR/PR = resposta completa/resposta parcial; SD = doença estável; PD = doença progressiva,). Vide também a Tabela 10 abaixo. A duração da resposta (DOR) também foi semelhante entre os dois braços de tratamento, com uma DOR mediana de 4,2 meses no braço atzeolizumabe + carboplatina + etoposídeo vs. 3,9 meses no braço placebo + carboplatina + etoposídeo. ORR e DOR foram avaliadas de acordo com os critérios RECIST v1.1.

TABELA 10: TAXA DE RESPOSTA OBJETIVA AVALIADA PELO INVESTIGADOR CONFIRMADA E DURAÇÃO DA RESPOSTA (POPULAÇÃO COM INTENÇÃO DE TRATAR COM DOENÇA MENSURÁVEL NA LINHA DE BASE).

Variável Atezolizumabe Placebo Grupo Grupo Resposta† Nº de pacientes avaliáveis 201 202 Resposta objetiva confirmada – nº (%) 121 (60,2 [53,1– 130 (64,4 [57,3– 67,0]) 71,0]) Completo 5 (2,5 [0,8–5,7]) 2 (1,0 [0,1–3,5]) Parcial 116 (57,7 [50,6– 128 (63,4 [56,3– 64,6]) 70,0]) Doença estável – nº (% [95% de IC]) 42 (20,9 [15,5– 43 (21,3 [15,9– 27,2]) 27,6]) Doença progressiva – nº (% [95% de 22 (10,9 [7,0– 14 (6,9 [3,8–11,4]) IC]) 16,1]) Pacientes com dados ausentes ou que 16 (8,0) 15 (7,4) não puderam ser avaliados – nº (%) Duração da resposta ‡ Nº de pacientes avaliáveis 121 130 Duração média da resposta (faixa) 4,2 (1,4+–19,5) 3,9 (2,0–16,1+) - meses Pacientes com resposta contínua 18 (14,9) 7 (5,4) na data de corte de dados – nº (%) † A resposta objetiva foi definida como resposta completa ou resposta parcial, conforme determinado pelo investigador de acordo com os critérios RECIST v1.1.

‡ A duração da resposta foi avaliada entre os pacientes que tiveram uma resposta objetiva e foi definida como o tempo desde a primeira ocorrência de uma resposta objetiva documentada até o tempo de progressão da doença, conforme determinado pelo investigador usando RECIST, ou morte por qualquer causa, o que ocorresse primeiro.

+ denota uma observação censurada; IC denota intervalo de confiança.

[0395] O benefício da SG e o benefício dq SLP foram observados em todos os subgrupos analisados. Vide Figuras 5 e 6, respectivamente. O benefício da SG foi observado independentemente da carga de mutação tumoral no sangue (bTMB). Vide Figura 7A, que mostra um gráfico de Kaplan Meier da SG de pacientes em cada braço de tratamento com uma bTMB > 16, vs. Figura 7B, que mostra um gráfico de Kaplan Meier da SG dos pacientes em cada braço de tratamento com uma bTMB <16. Vide também Figura 8A, que mostra um gráfico de Kaplan Meier da SG de pacientes em cada braço de tratamento com uma bTMB > 10, vs. Figura 8B, que mostra um gráfico de Kaplan Meier da SG dos pacientes em cada braço de tratamento com uma bTMB <10. Da mesma forma, o benefício da SLP foi observado independentemente da carga de mutação tumoral no sangue (bTMB). Vide Figura 9A, que mostra um gráfico de Kaplan Meier da SLP de pacientes em cada braço de tratamento com uma bTMB > 16, vs. Figura 9B, que mostra um gráfico de Kaplan Meier da SLP de pacientes em cada braço de tratamento com uma bTMB <16. Vide também Figura 10A, que mostra um gráfico de Kaplan Meier da SLP de pacientes em cada braço de tratamento com uma bTMB > 10, vs.

Figura 10B, que mostra um gráfico de Kaplan Meier da SLP de pacientes em cada braço de tratamento com uma bTMB <10.

[0396] O perfil de segurança dos indivíduos que receberam atezolizumabe + carboplatina + etoposídeo foi consistente com os riscos conhecidos dos componentes de tratamento do indivíduo. Nenhum novo sinal de segurança foi identificado. A exposição à quimioterapia foi semelhante em ambos os braços de tratamento, sugerindo que a administração de atezolizumabe não comprometeu a administração de carboplatina + etoposídeo no regime de tratamento atezolizumabe + carboplatina + etoposídeo. As toxicidades associadas à mielossupressão (tais como neutropenia e trombocitopenia) foram consistentes entre os dois braços de tratamento e em linha com as taxas associadas à quimioterapia.

[0397] Este estudo demonstrou que o tratamento inicial (de primeira linha) com a combinação de atezolizumabe mais quimioterapia (carboplatina e etoposídeo) ajudou pessoas com câncer de pulmão de pequenas células em estágio extensivo (CPPC-EE) a viver significativamente mais tempo em comparação com a quimioterapia isolada.

A combinação de atezolizumabe mais quimioterapia (carboplatina e etoposídeo) também reduziu o risco de agravamento da doença ou morte (SLP) em comparação com a quimioterapia isolada. Estes são os primeiros resultados positivos da sobrevida para o tratamento simultâneo com uma combinação baseada em imunoterapia no tratamento inicial de câncer de pulmão de pequenas células em estágio extensivo, um tipo de doença particularmente difícil de tratar. Além disso, este é o primeiro estudo em mais de duas décadas a mostrar uma melhora clínica e estatisticamente significativa na sobrevida global em relação à quimioterapia isolada no tratamento inicial de CPPC-EE. A taxa de sobrevida de 1 ano foi 13% maior no grupo do atezolizumabe, sugerindo o potencial do benefício de sobrevida a longo prazo nessa doença letal.

E XEMPLO 2: RESULTADOS RELATADOS PELO PACIENTE (PROS ) DO E XEMPLO 1

[0398] Os pacientes que participaram do estudo descrito no Exemplo 1 completaram o Questionário de Qualidade de Vida C30 da Organização Europeia para Pesquisa e Tratamento do Câncer (EORTC QLQ-C30) e o Questionário de Qualidade de Vida LC13 (QLQ-LC13) no início do estudo e a cada três semanas depois disso. As análises incluíram alteração da linha de base, curvas de função de distribuição cumulativa de alteração até a semana 12 e tempo para deterioração (TTD). A significância clínica foi baseada em uma alteração ≥10 pontos da linha de base (faixa de pontuação de 0–100).

[0399] As taxas de conclusão foram ≥85% no início do estudo e ≥70% até a semana 75 em ambos os braços do estudo. As pontuações dos resultados relatados pelo paciente na linha de base foram comparáveis entre os braços. Os pacientes em ambos os braços relataram melhorias precoces nos sintomas, com uma tendência numérica de maior melhora com Atezo + CE em comparação com Placebo + CE. Vide Tabela 11. Na semana 12, proporções mais altas de pacientes que receberam Atezo + CE relataram alívio dos sintomas relacionados ao câncer de pulmão (CL) em comparação com pacientes que receberam Placebo + CE (vide Tabela 11).

Nenhuma diferença aparente no TTD de tosse ou dor torácica foi observada, mas um atraso numérico no TTD da dispneia favoreceu os pacientes que receberam Atezo + CE (HR de 0,75 [95% de IC 0,55-1,02]).

Os pacientes no braço Atezo + CE relataram melhora da função física e qualidade de vida relacionada à saúde (HRQoL; aumento ≥10 pontos) que persistiu na maioria das visitas até a semana 54. As alterações nos sintomas relacionados ao tratamento (por exemplo, diarréia, náusea/vômito) foram semelhantes entre os braços.

[0400] O tratamento de primeira linha com Atezo + CE forneceu benefícios da SG e SLP, além de melhorias imediatas e tangíveis nos sintomas de câncer de pulmão relatados pelos pacientes em comparação com o tratamento com Placebo + CE. Os resultados relatados pelos pacientes indicam melhoria na função sustentada e na qualidade de vida relacionada à saúde com impacto mínimo das toxicidades do tratamento, além de apoiar o benefício positivo: risco de adicionar Atezo +

CE no CPPC-EE de primeira linha.

TABELA 11: FAIXA DE ALTERAÇÕES MÉDIAS ATÉ A SEMANA 12 (ALTERAÇÃO NEGATIVA INDICA MELHORA DOS SINTOMAS ) Atezo + CE (n = 124) Placebo + CE (n = 131) Dor no -7,0 -2,5 braço/ombro Dor no peito -7,8 -4,1 Tosse -14,8 -15,5 Dispneia -6,5 -2,3 EXEMPLO 3: DADOS ADICIONAIS SOBRE A EFICÁCIA DE ATEZOLIZUMABE + CARBOPLATINA + ETOPOSÍDEO EM COMPARAÇÃO COM PLACEBO + CARBOPLATINA + ETOPOSÍDEO NA POPULAÇÃO IDT MEDIDA PELA SOBREVIDA GLOBAL (SG).

[0401] Resultados adicionais do Exemplo 1 em relação à eficácia de atezolizumabe + carboplatina + etoposídeo em comparação com placebo + carboplatina + etoposídeo na população IDT, conforme medido pela sobrevida global (SG), são descritos abaixo.

SOBREVIDA GLOBAL DE 6, 12, 18 E 24 MESES

[0402] Conforme discutido no Exemplo 1, os pacientes tratados com Atezo + CE demonstraram sobrevida global estendida em comparação com os pacientes tratados com Placebo + CE. Vide Figura 2. A SG de 6 meses dos pacientes que receberam Atezo + CE foi 85,8% vs. 82,8% nos pacientes que receberam Placebo + CE. A SG de 12 meses dos pacientes que receberam Atezo + CE foi de 51,7% vs. 38,2% em pacientes que receberam Placebo + CE. Os pacientes tratados com Atezo + CE também demonstraram sobrevida livre de progressão estendida em comparação com os pacientes tratados com Placebo + CE. Vide Tabela 3. A SLP de 6 meses dos pacientes que receberam Atezo + CE foi de 30,9% vs. 22,4% em pacientes que receberam Placebo + CE. A SLP de 12 meses de pacientes que receberam Atezo + CE foi de 12,6% vs. 5,4% em pacientes que receberam Placebo + CE. A taxa de sobrevida global de um ano dos pacientes tratados com Atezo + CE foi de 51,7%, enquanto a taxa de sobrevida global de um ano dos pacientes que receberam Placebo + CE foi de 38,2%.

[0403] Em uma análise posterior realizada 22,9 meses após a randomização, a SG média tratada com Atezo + CE foi de cerca de 23,3 meses, e a SG média ou pacientes tratados com Placebo + CE foi de 10,3 meses (HR estratificado (95% de IC) = 0,755 (0,601, 0,949); valor-p Log-rank estratificado – 0,0154). As taxas de sobrevida global de 6 meses, 12 meses, 18 meses e 24 meses de pacientes tratados com Atezo + CE versus pacientes tratados com Placebo + CE no acompanhamento de 22,9 meses são fornecidas na Tabela 12 abaixo: TABELA 12: ANÁLISES DA SOBREVIDA GLOBAL ATUALIZADAS PBO+CE ATEZO+CE (n=202) (n=201) 6 meses 82,8% 85,8% (n=160) (n=159) 12 meses 39,0% 51,9% (n=74) (n=93) 18 meses 21,0% 34,0% (=39) (n=61) 24 meses 16,8% 22,0% (n=8) (n=21)

[0404] A SG de 6 meses de pacientes que receberam Atezo + CE foi 85,8% vs. 82,8% em pacientes que receberam Placebo + CE, conforme descrito anteriormente no Exemplo 1. A SG de 12 meses de pacientes que receberam Atezo + CE foi de 51,9% vs. 39% em pacientes que receberam Placebo + CE, ou seja, muito semelhante aos resultados descritos no Exemplo 1. A SG de 18 meses de pacientes que receberam Atezo + CE foi de 34% vs. 21% em pacientes que receberam Placebo + CE. A SG de 24 meses dos pacientes que receberam Atezo + CE foi de 22% vs. 16,8% em pacientes que receberam Placebo + CE.

ANÁLISE DE SUBGRUPO

[0405] Dados de análise de subgrupo atualizados adicionais são fornecidos nas Figuras 11A a 11C. O benefício da SG observado no Exemplo 1 foi confirmado em todos os subgrupos analisados, incluindo, por exemplo, pacientes

<65 anos de idade, entre 65-74 anos de idade, entre 75-84 anos de idade e > 85 anos de idade; em pacientes masculinos e femininos; em pacientes nativos americanos, do Alasca, asiáticos, negros, afro-americanos e brancos; em pacientes que nunca usaram tabaco, que eram usuários atuais de tabaco, e que eram usuários prévios de tabaco; em pacientes com ou sem metástases no cérebro (na inscrição), no pulmão (na inscrição), no fígado (na inscrição), no linfonodo (na inscrição) e/ou na glândula adrenal (na inscrição); e em todos os pacientes, independentemente da bTMB.

ANÁLISE DE SUBGRUPO DE BIOMARCADORES

[0406] Pacientes com CPPC-EE, cuja doença não foi selecionada para a expressão de PD-L1, foram inscritos no ensaio descrito no Exemplo 1.

Conforme descrito no Exemplo 1, quando possível, amostras de tecido tumoral de pré-tratamento foram obtidas de pacientes inscritos no ensaio para análise a fim de avaliar a relação entre os biomarcadores tumorais (por exemplo, PD-L1) e a resposta ao tratamento. A prevalência de PD-L1 entre os pacientes avaliáveis por biomarcadores é mostrada na Tabela 13.

TABELA 13. PREVALÊNCIA DE PD-L1 EM PACIENTES AVALIÁVEIS POR

BIOMARCADORES PBO+CE Atezo + CE Total (n=202) (n=201) (n=403) BEP1 (idade de seção <= 1 ano) 73 (36%) 64 (32%) 137 (34%) TC> = 50% ou IC> = 50% 0 0 0 TC> = 25% ou IC> = 25% 0 1 (1,6%) 1 (0,7%) TC> = 5% ou IC> = 5% 14 (19,2%) 15 (23,4%) 29 (21,2%) TC> = 1% ou IC> = 1% 36 (49,3%) 36 (56,3%) 72 (52,6%) TC <1% e IC <1% 37 (50,7%) 28 (43,8%) 65 (47,4%) BEP2 (qualquer idade de seção) 93 (46%) 75 (37%) 168 (42%) TC> = 50% ou IC> = 50% 0 0 0 TC> = 25% ou IC> = 25% 0 1 (1,3%) 1 (0,6%) TC> = 5% ou IC> = 5% 22 (23,7%) 17 (22,7%) 39 (23,2%) TC> = 1% ou IC> = 1% 51 (54,8%) 42 (56,0%) 93 (55,4%) TC <1% e IC <1% 42 (45,2%) 33 (44,0%) 75 (44,6%)

TC = expressão de PD-L1 em células tumorais.

IC = expressão de PD-L1 em células imunes infiltrantes de tumor.

[0407] BEP1 refere-se aos pacientes avaliáveis por biomarcadores no ensaio com um resultado de imuno-histoquímica (IHC) de PD-L1 válido de uma lâmina de tecido tumoral seccionada < 1 ano antes da coloração de IHC. BEP2 refere-se aos pacientes avaliáveis por biomarcadores no ensaio com um resultado de imuno-histoquímica (IHC) de PD-L1 válido de uma lâmina de tecido tumoral, independentemente da idade da lâmina na coloração de IHC. As porcentagens para a prevalência de PD-L1 em vários pontos de corte são baseadas em BEP1/2. A demografia e características de linha de base de BEP1 e BEP2 foram geralmente equilibradas entre os braços de tratamento. Vide as Tabelas 14A e 14B.

[0408] TABELA 14A. DEMOGRAFIA E CARACTERÍSTICAS DE LINHA DE BASE DE BEP1 PBO+CE ATEZO+CE Demografia/Linha de Base m+n≤73; m+n≤64; Idade (anos) <65 43 (58,9%) 41 (64,1%) SEXO (FCe) Masculino 46 (63,0%) 39 (60,9%) Raça Branco 71 (97,3%) 64 (100,0%) Asiático NA NA Histórico de uso de Nunca 1 (1,4%) 5 (7,8%) tabaco Metástases Sim 4 (5,5%) 3 (4,7%) cerebrais (eCRF) Pontuação do 0 24 (32,9%) 21(32,8%) ECOG (eCRF) bTMB> = 16 Sim 13 (19,1%) 15 (25,9%) bTMB> = 10 Sim 38 (55,9%) 36 (62,1%) SLD na linha de Mediana 123 125,5 base Min-Max 26,0 - 353,0 12,0 - 325,0

TABELA 14B, DEMOGRAFIA E CARACTERÍSTICAS DE LINHA DE BASE DE BEP2 Demografia/Linha de Base PBO + CE (n = 93) Atezo + CE (n = 75) Idade (anos) <65 53 (57,0%) 46 (61,3%) SEXO (FCe) Masculino 60 (64,5%) 44 (58,7%) Raça Branco 81 (87,1%) 73 (97,3%) Asiático 10 (10,8%) 2 (2,7%) Histórico de uso de tabaco Nunca 1 (1,1%) 6 (8,0%) Metástases cerebrais Sim 5 (5,4%) 5 (6,7%) (eCRF) Pontuação do ECOG 0 32 (34,4%) 23 (30,7%) (eCRF) bTMB> = 16 Sim 20 (23,3%) 20 (29,4%) bTMB> = 10 Sim 52 (60,5%) 44 (64,7%) SLD na linha de base Mediana Min- 116 122 Max 26,0 - 353,0 12,0 - 325,0 SLD = soma dos diâmetros mais longos da lesão alvo (tumor).

[0409] Todos os pacientes em BEP1 e BEP2 tratados com Atezo + CE demonstraram um benefício da SLP em comparação com os pacientes em BEP1 e BEP2 que foram tratados com Placebo + CE.

Conforme mostrado nas Fiiguras 12A e 12B, o benefício da SLP também foi observado nos pacientes em BEP1 e BEP que fora tratados com Atezo + CE em comparação com os pacientes que receberam Placebo + CE. Além disso, entre os pacientes em BEP1 e BEP2 que tinham níveis de expressão de PD-L1 <1%, a taxa de resposta objetiva (ORR) em pacientes que receberam Atezo + CE foi maior do que a ORR em pacientes que receberam Placebo + CE. Vide Table 15.

TABELA 15. TAXA DE RESPOSTA OBJETIVA EM PACIENTES COM EXPRESSÃO DE PD-L1 <1% Placebo + CE Atezo + CE BEP1 (n = 73) (n = 64) ORR confirmada 62,2% 75,0% TC <1% e IC <1% ORR confirmada 70,3% 82,1% TC <1% e IC <1% Placebo + CE Atezo + CE BEP2 (n = 73) (n = 64) ORR confirmada 66,7% 78,8% TC <1% e IC <1% ORR confirmada 73,8% 84,8% TC <1% e IC <1%

[0410] Todos os pacientes em BEP1 e BEP2 tratados com Atezo + CE demonstraram um benefício da SG em comparação com os pacientes em BEP1 e BEP2 que foram tratados com Placebo + CE.

Conforme mostrado nas Figuras 13A e 13B, o benefício da SLP também foi observado nos pacientes em BEP1 e BEP que foram tratados com Atezo + CE em comparação com os pacientes que receberam Placebo + CE.

[0411] Assim, o subgrupo PD-L1 negativo (ou seja, pacientes com expressão de PD-L1 <1% em células tumorais ou em células imunes infiltrantes de tumor) obteve benefício clínico do tratamento com Atezo + CE em comparação com pacientes tratados com Placebo + CE. Esse resultado indica um benefício do tratamento para todos os novatos.

[0412] Embora a invenção supracitada foi descrita em alguns detalhes a título de ilustração e exemplo, para fins de clareza de entendimento, as descrições e exemplos não devem ser interpretados como limitantes ao escopo da invenção. As divulgações de toda a literatura científica e de patente citadas neste documento estão expressamente incorporadas em sua totalidade por referência.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. MÉTODO PARA TRATAR UM INDIVÍDUO COM CÂNCER DE PULMÃO, caracterizado por compreender administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-PD-L1, um agente de platina e um inibidor da topoisomerase II, em que o tratamento estende a sobrevida livre de progressão (SLP) do indivíduo.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo tratamento estender a sobrevida global (SG) do indivíduo.

3. MÉTODO PARA TRATAR UM INDIVÍDUO COM CÂNCER DE PULMÃO, caracterizado por compreender administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-PD-L1, um agente de platina e um inibidor da topoisomerase II, em que o tratamento estende a sobrevida global (SG) do indivíduo.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo tratamento estender a SLP do indivíduo por pelo menos cerca de 5 meses.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo tratamento estender a SG do indivíduo por pelo menos cerca de 11 meses.

6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo anticorpo anti-PD-L1 compreender: (a) uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende uma HVR-H1 compreendendo uma sequência de aminoácidos de GFTFSDSWIH (SEQ ID NO: 1), uma HVR-2 compreendendo uma sequência de aminoácidos de AWISPYGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), e HVR-3 compreendendo um aminoácido RHWPGGFDY (SEQ ID NO: 3), e (b) uma região variável de cadeia leve (VL) que compreende uma HVR-L1 compreendendo uma sequência de aminoácidos de RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 4), uma HVR-L2 compreendendo uma sequência de aminoácidos de SASFLYS (SEQ ID NO: 5), e uma HVR-L3 compreendendo uma sequência de aminoácidos de QQYLYHPAT (SEQ ID NO: 6).

7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo anticorpo anti-PD-L1 compreender uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8.

8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo anticorpo anti-PD-L1 ser atezolizumabe.

9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo agente de platina ser carboplatina ou cisplatina.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo agente de platina ser carboplatina.

11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo inibidor da topoisomerase II ser etoposídeo, teniposídeo, doxorrubicina, daunorrubicina, mitoxantrona, amsacrina, uma elipticina, ácido aurintricarboxílico ou HU-331.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo inibidor da topoisomerase ser etoposídeo.

13. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo anticorpo anti-PD-L1 ser administrado a uma dose de 1200 mg, o agente de platina ser administrado a uma dose suficiente para atingir uma ASC = 5 mg/ml/min, e o inibidor da topoisomerase II ser administrado a uma dose de 100 mg/m2.

14. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo anticorpo anti-PD-L1, o agente de platina e o inibidor da topoisomerase II serem administrados em quatro ciclos de 21 dias, e em que o anticorpo anti-PD-L1 é administrado a uma dose de 1200 mg no dia 1, o agente de platina é administrado a uma dose suficiente para atingir uma ASC = 5 mg/ml/min no dia 1, e o inibidor da topoisomerase II é administrado a uma dose de 100 mg/m 2 em cada um dos dias 1, 2 e 3 de cada ciclo de 21 dias para ciclos 1 a 4.

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo anticorpo anti-PD-L1 ser adicionalmente administrado após o ciclo 4, e em que o anticorpo anti-PD-L1 é administrado a uma dose de 1200 mg no dia 1 de cada ciclo de 21 dias para cada ciclo após o ciclo 4.

16. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado pelo anticorpo anti-PD-L1, o agente de platina e o inibidor da topoisomerase II serem administrados sequencialmente no dia 1 dos ciclos 1 a 4.

17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo anticorpo anti-PD-L1 ser administrado antes do agente de platina, e em que o agente de platina é administrado antes do inibidor da topoisomerase II no dia 1 dos ciclos 1 a 4.

18. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo câncer de pulmão ser câncer de pulmão de pequenas células (CPPC).

19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo CPPC ser CPPC em estágio extensivo (CPPC-EE).

20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo indivíduo ser sem exposição prévia ao tratamento para CPPC-EE.

21. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo indivíduo ter uma carga mutacional tumoral no sangue (bTMB) de pelo menos cerca de 10.

22. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo indivíduo ter uma bTMB de pelo menos cerca de 16.

23. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo câncer de pulmão ter se metastizado para o cérebro.

24. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo câncer de pulmão ter se metastizado para o fígado.

25. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo câncer de pulmão ter se metastizado para os nódulos linfáticos.

26. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo câncer de pulmão ter se metastizado para a glândula adrenal.

27. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo indivíduo ter pelo menos 65 anos de idade.

28. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo indivíduo ser PD-L1 negativo.

29. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo paciente ser PD-L1 negativo se menos de 1% das células tumorais ou células imunes infiltrantes de tumor em uma amostra do paciente expressarem PD-L1.

30. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo anticorpo anti-PD-L1, o agente de platina e o inibidor da topoisomerase II serem administrados por via intravenosa.

31. MÉTODO PARA TRATAR UM INDIVÍDUO COM CÂNCER DE PULMÃO DE PEQUENAS CÉLULAS em estágio extensivo (CPPC-EE), caracterizado por compreender administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de atezolizumabe, carboplatina e etoposídeo, em que o atezolizumabe é administrado a uma dose de 1200 mg, a carboplatina é administrada a uma dose suficiente para atingir uma ASC = 5 mg/ml/min, e o etoposídeo é administrado a uma dose de 100 mg/m 2, e em que o tratamento estende a sobrevida livre de progressão (SLP) e a sobrevida global (SG) do indivíduo.

32. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo atezolizumabe, a carboplatina e o etoposídeo serem administrados em quatro ciclos de 21 dias e o atezolizumabe ser ainda administrado após o ciclo 4, em que atezolizumabe é administrado a uma dose de 1200 mg no dia 1 de cada ciclo de 21 dias dos ciclos 1 a 4, a carboplatina é administrada a uma dose suficiente para atingir uma ASC = 5 mg/ml/min no dia 1 de cada ciclo de 21 dias dos ciclos 1 a 4, e o etoposídeo é administrado a uma dose de 100 mg/m2 em cada um dos dias 1, 2 e 3 de cada ciclo de 21 dias para ciclos 1 a 4; e em que o atezolizumabe é ainda administrado a uma dose de 1200 mg no dia 1 de cada ciclo de 21 dias para cada ciclo após o ciclo 4.

33. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizado pelo indivíduo ser sem exposição prévia ao tratamento para CPPC-EE.

34. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 33, caracterizado pelo tratamento estender a SLP do indivíduo em pelo menos cerca de 5 meses.

35. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 34, caracterizado pelo tratamento estender a SG do indivíduo em pelo menos cerca de 11 meses.

36. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 35, caracterizado pelo indivíduo ter uma carga mutacional tumoral no sangue (bTMB) de pelo menos cerca de 10.

37. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo indivíduo ter uma bTMB de pelo menos cerca de 16.

38. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 37, caracterizado pelo CPPC-EE ter se metastizado para o cérebro.

39. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 38, caracterizado pelo CPPC-EE ter se metastizado para o fígado.

40. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 39, caracterizado pelo câncer de pulmão ter se metastizado para os nódulos linfáticos.

41. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 40, caracterizado pelo câncer de pulmão ter se metastizado para a glândula adrenal.

42. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 41, caracterizado pelo indivíduo ter pelo menos 65 anos de idade.

43. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 42, caracterizado pelo indivíduo ser PD-L1 negativo.

44. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo paciente ser PD-L1 negativo se menos de 1% das células tumorais ou células imunes infiltrantes de tumor em uma amostra do paciente expressarem PD-L1.

45. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 44, caracterizado pelo atezolizumabe, a carboplatina e o etoposídeo serem administrados sequencialmente no dia 1 de cada ciclo de 21 dias para ciclos 1 a 4.

46. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo atezolizumabe ser administrado antes da carboplatina e em que a carboplatina é administrada antes do etoposídeo no dia 1 de cada ciclo de 21 dias para ciclos 1 a 4.

47. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 46, caracterizado pelo atezolizumabe, a carboplatina e o etoposídeo serem administrados por via intravenosa.

48. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 47, caracterizado pelo indivíduo ser humano.

49. KIT, caracterizado por compreender um anticorpo anti- PD-L1 para uso em combinação com um agente de platina e um inibidor da topoisomerase II, para tratar um indivíduo com câncer de pulmão de acordo com um método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 30 e 48.

50. KIT, caracterizado por compreender atezolizumabe para uso em combinação com carboplatina e etoposídeo para tratar um indivíduo com câncer de pulmão de acordo com um método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 31 a 48.

51. ANTICORPO ANTI-PD-L1, caracterizado por ser para uso em um método para tratar câncer de pulmão em um indivíduo, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-PD-L1, um agente de platina e um inibidor da topoisomerase II, em que o tratamento estende a sobrevida livre de progressão (SLP) e/ou sobrevida global (SG) do indivíduo.

52. ANTICORPO ANTI-PD-L1, de acordo com a reivindicação

51, caracterizado por ser para uso em um método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 2 a 30 e 48.

53. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender atezolizumabe para uso em um método para tratar câncer de pulmão de pequenas células em estágio extensivo (CPPC-EE), compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de atezolizumabe, carboplatina e etoposídeo, em que o atezolizumabe é administrado a uma dose de 1200 mg, a carboplatina é administrada a uma dose suficiente para atingir uma ASC = 5 mg/ml/min, e o etoposídeo é administrado a uma dose de 100 mg/m2, e em que o tratamento estende a sobrevida livre de progressão (SLP) e a sobrevida global (SG) do indivíduo.

54. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 53, caracterizada por ser para uso em um método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 31 a 48.

Petição 870200160143, de 22/12/2020, pág. 396/420 Indução 4 x ciclos de 21 dias Manutenção

Braço A Atezolizumabe Atezolizumabe + Carboplatina Pacientes com CPPC + Etoposídeo Acompa- em estágio extensivo 1/23

Tratar Até nhamento virgens à PD *# da sobre- quimioterapia vida Braço B (N=403**) Placebo Placebo + Carboplatina + Etoposídeo

FIGURA 1

Gráfico de Kaplan-Meier de Sobrevida Global com Análise Não Estratificada, status de PD-L1 <1%, qualquer Protocolo de Pacientes com Intenção de Tratar com PD-L1: GO30081

Petição 870200160143, de 22/12/2020, pág. 418/420 VALOR-P (LOG-RANK) ATEZO + CE (RANDOMIZADO) (N=33): 0,0264 MÉDIA + 95% de CI PBO + CE (RANDOMIZADO) (N=42): 8,8 (7,2, 9,8) ATEZO + CE (RANDOMIZADO) (N=33): 10,5 (8,0, 16,3) ÍNDICE DE PERIGO + 95% de CI ATEZO + CE (RANDOMIZADO) (N=33): 0,570 (0,345, 0,941)

PBO + CE (RANDOMIZADO) (N=42) ATEZO + CE (RANDOMIZADO) (N=33)

Progressão Censurado 23/23

Probabilidade de Sobrevida Livre de Nº DE PACIENTES EM RISCO

PBO + CE (RANDOMIZADO) ATEZO + CE (RANDOMIZADO)

Tempo (Meses)

FIGURA 13B