BR112020010753A2 - anticorpos anti-cxcr5 e composições e usos dos mesmos - Google Patents

anticorpos anti-cxcr5 e composições e usos dos mesmos Download PDF

Info

Publication number
BR112020010753A2
BR112020010753A2 BR112020010753-0A BR112020010753A BR112020010753A2 BR 112020010753 A2 BR112020010753 A2 BR 112020010753A2 BR 112020010753 A BR112020010753 A BR 112020010753A BR 112020010753 A2 BR112020010753 A2 BR 112020010753A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
antibody
amino acid
antigen
seq
acid sequence
Prior art date
Application number
BR112020010753-0A
Other languages
English (en)
Inventor
Rachel Groth
William Brian Snyder
Xianjun Cao
Robert Joseph Dunn
Joseph Dal Porto
Michael Karin
Original Assignee
The Regents Of The University Of California
Pfizer Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The Regents Of The University Of California, Pfizer Inc. filed Critical The Regents Of The University Of California
Publication of BR112020010753A2 publication Critical patent/BR112020010753A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

A presente invenção propõe anticorpos, e fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos, que ligam-se especificamente ao CXCR5. Os anticorpos podem ser afucosilados e exibir maior ADCC do que anticorpos que são fucosilados, mas fora isso idênticos. A presente invenção inclui usos e métodos associados para usar os anticorpos.

Description

"ANTICORPOS ANTI-CXCR5 E COMPOSIÇÕES E USOS DOS MESMOS"
PEDIDOS RELACIONADOS
[001]O presente pedido reivindica prioridade ao pedido dos EUA de nº de série 62/593.830, depositado no dia 1º de dezembro de 2017, e ao pedido dos EUA de nº de série 62/732.985, depositado no dia 18 de setembro de 2018, cujos conteúdos incorporam-se ao presente documento por referência na íntegra.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[002]O presente relatório descritivo incorpora por referência ainda a Listagem de Sequências entregue junto com o mesmo no dia 28 de novembro de
2018. De acordo com o título 37 $ 1.52(e) (5) do Código de Regulamentos Federais dos EUA, o arquivo de texto da Listagem de Sequências, identificado como PC72320A Segq Listing ST25.txt, tem 112.891 bytes e foi criado no dia 15 de novembro de 2018. A Listagem de Sequências, depositada eletronicamente, não se estende além do âmbito do presente relatório descritivo e, portanto, não contém nenhuma matéria nova.
PARTES PARA UM ACORDO DE PESQUISA CONJUNTA
[003]A invenção aqui reivindicada foi elaborada pelas partes para um acordo de pesquisa conjunta listadas abaixo e em nome das mesmas. O acordo de pesquisa conjunta encontra-se em vigência na data ou antes da data em que a invenção reivindicada foi elaborada, e a invenção reivindicada foi elaborada como resultado de atividades empreendidas dentro do âmbito do referido acordo de pesquisa conjunta. As partes do acordo de pesquisa conjunta são OS REGENTES DA UNIVERSIDADE DA CALIFÓRNIA em nome de seu CAMPUS de SAN DIEGO e a PFIZER INC.
CAMPO DA INVENÇÃO
[004]A presente invenção refere-se a anticorpos, e a fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos, que ligam-se especificamente ao receptor de quimiocinas C-X-C do tipo 5 (CXCR5) e a composições, métodos e usos dos mesmos. Os anticorpos são fucosilados e/ou afucosilados e podem ter uma função efetora alterada.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[005]O receptor de quimiocinas C-X-C do tipo 5 (CXCR5), também conhecido como CD185 ou receptor do linfoma de Burkitt 1 (BLR1), é um receptor acoplado à proteína G de ocorrência natural expresso por células B, células T auxiliares foliculares (Tfh) bona fide e células similares a Tfh circulantes (chamadas intercambiavelmente neste documento de "células cTfh" e "células similares a Tfh"). O CXCR5 exerce importante papel na resposta imunológica e é um alvo em potencial para tratar doenças autoimunes, tais como o lúpus eritematoso sistêmico (LES).
[006]Os centros germinativos (GCs), um componente crítico da resposta imunológica humoral, são os locais onde as células B ativadas por antígeno se proliferam, se diferenciam e passam por hipermutação somática e pela mudança de classe das imunoglobulinas (iG) dos anticorpos que produzem. As células Tfh bona fide emitem sinais instrutivos para ajudar nesse processo, que culmina na produção de anticorpos maturados por afinidade. A "memória" humoral da reação dos GCs é mantida por células plasmáticas longevas, que sustentam os níveis de anticorpos, e por células B de memória que, quando desafiadas novamente com um antígeno, desencadeiam reações secundárias dos GCs com a ajuda cognata de células Tfh de memória, o que leva à produção de mais células plasmáticas de alta afinidade (McHeyzer-Williams et a/., 2011, Nature Rev. Immunol. 12(1):24-34). Acredita-se que as células similares a Tfh circulantes (doravante chamadas de "similares a Tfh" ou "cTfh") diferenciam-se em células Tfh bona fide ao se reencontrarem com um antígeno para que também ajudem com essas respostas da memória (Crotty et al., 2011, Annu. Rev. Immmunol. 29:621-663).
[007]lmportantemente, a geração de células B autorreativas também pode decorrer de reações dos GCs, com consequências indesejadas. Na verdade, inúmeras doenças autoimunes sistêmicas crônicas, tais como LES, artrite reumatoide, miosite, síndrome de Sjógren, vasculite associada ao ANCA e esclerodermia, exibem evidência de respostas humorais autorreativas. Por exemplo, muitos dos autoanticorpos que caracterizam essas doenças são de alta afinidade, somaticamente mutados e de lg trocada, sugerindo que derivam de reações de GCs autorreativos (Vinuesa et al., 2009, Nature Rev. Immunol. 9(12):845-857). Além disso, frequências maiores de células similares a Tfh circulantes foram detectadas no sangue periférico de pacientes com muitas dessas doenças autoimunes, cujos níveis geralmente têm relação com as titulações de autoanticorpos e/ou a gravidade da doença (Tangye et al., 2013, Nature Rev. Immunol. 13(6):412-426). Tidos juntos, esses dados dão destaque às células B, células Tfh bona fíde e células similares a Tfh circulantes como possíveis alvos terapêuticos para muitas doenças autoimunes sistêmicas.
[008]O CXCR5 é expresso por células B, células Tfh bona fide e células similares a Tfh circulantes e medeia o tráfego e participação das mesmas nas reações dos GCs junto com um gradiente do ligante do CXCR5 CXCL13 (Vinuesa e Cyster, 2011, Immunity 35(5):671-680; Ansel et a/., 1999, J. Exp. Med. 190(8):1123- 1134; Ansel et a/., 2000, Nature 406(6793):309-314; Cyster et a/., 1999, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 246:87-92; Hardtke et al., 2005, Blood 106(6):1924-1931; Haynes et al., 2007, J. Immunol. 179(8):5099-5108). Em si, mirar o CXCR5 pode trazer benefícios terapêuticos para o tratamento de doenças autoimunes.
[0O09]Além disso, mirar o CXCR5 também pode trazer benefícios terapêuticos no caso de cânceres caracterizados pela proliferação de células que expressam o CXCRS5, tais como cânceres de pâncreas, intestino e bexiga, leucemia de células Te leucemia de células B.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[010]O presente pedido revela anticorpos isolados, e fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos, que ligam-se especificamente ao CXCR5 (receptor de quimiocinas C-X-C do tipo 5). Em certos aspectos, os anticorpos, e fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos, ligam-se ao CXCR5 e reduzem a ligação do CXCR5 com o CXCL13. Em outros aspectos, os anticorpos podem ser fucosilados, porém, mais preferivelmente, são afucosilados. Em certos aspectos, os anticorpos, e fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos, têm uma função efetora alterada. Em certos aspectos, os anticorpos, e fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos, são afucosilados e exibem maior citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) em comparação a anticorpos, e fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos, que são fucosilados, mas fora isso idênticos.
[011]Em certos aspectos, a presente invenção propõe anticorpos isolados, e fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos, que ligam-se especificamente ao CXCRS5, em que o anticorpo, e fragmento de ligação com antígeno do mesmo, liga- se a um epítopo que compreende leucina (Leu; L) no resíduo de aminoácido número 11 (L11), de acordo com a numeração do SEQ ID Nº: 32.
[012JEmM outro aspecto, a invenção propõe anticorpos isolados, ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos, que ligam-se especificamente ao CXCRS5, em que o anticorpo, e fragmento de ligação com antígeno do mesmo, liga- se a um epítopo que compreende aspartato (Asp; D) no resíduo de aminoácido número 22, de acordo com a numeração do SEQ ID Nº: 32.
[013]Os versados na técnica reconhecerão, ou poderão determinar usando não mais do que a experimentação rotineira, vários equivalentes às modalidades específicas da invenção descrita neste documento. Tenciona-se que esses equivalentes sejam abraçados pelas modalidades (E) a seguir.
E1. Anticorpo isolado, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga-se especificamente ao receptor de quimiocinas C-X-C 5 (CXCR5), em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, liga-se a um epítopo dentro do domínio N do CXCR5 humano (hCXCR5) ou CXCR5 do macaco cinomolgo (cinoCXCR5).
E2. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com a modalidade E1, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, liga-se a um epítopo dentro dos resíduos de aminoácido 1 a 50 do hOXCR5, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32, ou liga-se a um epítopo dentro dos resíduos de aminoácido 1 a 50 do cinoCXCR5, de acordo com a numeração do SEQ ID Nº: 33.
E3. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E2, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, liga-se a um epítopo que compreende leucina no resíduo de aminoácido número 11, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32.
E4. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E2, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, liga-se a um epítopo que compreende leucina no resíduo de aminoácido número 22, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32.
E5. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E4, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, liga-se a um epítopo que compreende leucina no resíduo de aminoácido número 11 e aspartato no resíduo de aminoácido número 22, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32.
E6. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E5, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, liga-se a um epítopo que compreende leucina no resíduo de aminoácido número 11, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32, mas não se liga ao hoXCR5 quando o referido resíduo não é leucina.
E7. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E6, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, liga-se a um epítopo que compreende leucina no resíduo de aminoácido número 11, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32, mas não se liga ao hoXCR5 quando o referido resíduo é treonina.
E8. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E7, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, liga-se a um epítopo que compreende aspartato no resíduo de aminoácido número 22, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32, mas não se liga ao hoXCR5 quando o referido resíduo não é aspartato.
E9. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E8, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, liga-se a um epítopo que compreende aspartato no resíduo de aminoácido número 22, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32, mas não se liga ao hoXCR5 quando o referido resíduo é alanina.
E10. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E9, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, liga-se a um epítopo que compreende leucina no resíduo de aminoácido número 11 e aspartato no resíduo de aminoácido número 22, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32, mas não se liga ao referido epítopo quando a leucina é substituída por treonina e/ou o aspartato é substituído por alanina.
E11. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E10, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, liga-se ao hoXCR5 expresso em células B humanas com uma afinidade aparente de uma EC50 de cerca de 6,60 pM com um desvio padrão de cerca de mais ou menos 2,33 pM.
E12. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E11, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, liga-se ao hoXCR5 expresso em células similares a células T auxiliares foliculares humanas (similares a Tfh) circulantes com uma afinidade aparente de uma EC50 de cerca de 5,89 pM com um desvio padrão de cerca de mais ou menos 1,40 pM.
E13. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E12, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, liga-se ao hOoXCR5 expresso em células T auxiliares foliculares humanas (Tfh) com uma afinidade aparente de uma EC50 de cerca de 10,6 pM.
E14. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E13, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, liga-se ao cinoCXCR5 expresso em células B do macaco cinomolgo com uma afinidade aparente de uma EC50 de cerca de 1,32 PM.
E15. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E14, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, liga-se ao cinoCXCR5 expresso em células similares a Tfh do macaco cinomolgo com uma afinidade aparente de uma EC50 de cerca de 10,5 pM.
E16. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E15, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, antagoniza a sinalização de CXCR5-CXCL13 em um ensaio-repórter com CAMP com uma ECB50 de cerca de 961 pM.
E17. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E16, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, exibe atividade de ADCC contra células B humanas que expressam o hoXCR5 com uma ECB50 de cerca de 2,01 pM com um desvio padrão de cerca de mais ou menos 2,28 pM.
E18. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E17, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, exibe atividade de ADCC contra células similares a Tfh humanas que expressam o hCXCR5 com uma ECB50 de cerca de 4,28 pM com um desvio padrão de cerca de mais ou menos 2,88 pM.
E19. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E18, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, exibe atividade de ADCC contra células Tfh humanas que expressam o hoXCR5 com uma ECB50 de cerca de 0,11 pM.
E20. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E19, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, exibe atividade de ADCC contra células B do macaco cinomolgo que expressam o cinoCXCR5 com uma EC50 de cerca de 15,3 PM com um desvio padrão de cerca de mais ou menos 11,7 pM.
E21. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E20, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, liga-se ao nOCXCR5 mas não se liga de maneira detectável aos receptores de quimiocinas humanos CCR1, CCR2, CCR3, CCRA, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR1I0, CMKLR1, CXCR3R1, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCRA4, CXCR6, CXCR7 e XCR1.
E22. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E21, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, depleta células B no sangue periférico.
E23. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com a modalidade E22, em que a depleção de células B no sangue periférico é reversível.
E24. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E23, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, depleta células similares a Tfh no sangue periférico.
E25. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E24, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, depleta células Tfh no baço.
E26. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E24, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, debilita a resposta da memória imunológica humoral.
E27. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com a modalidade E26, em que a resposta da memória imunológica humoral debilitada é contra o toxoide tetânico em macacos cinomolgos.
E28. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E27, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, inibe a ligação do CXCR5 com o CXCL13.
E29. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E28, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, inibe a inibição do CXCL13 à produção de CAMP em uma célula do contrário provocada pela forscolina, levando assim a um aumento no nível de CAMP em comparação ao nível de CAMP na ausência do anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo.
E30. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E29, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, inibe a inibição do CXCL13 à produção de CAMP com uma ECB50 de cerca de 961 pM.
E31. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com a modalidade E30, em que a inibição máxima à inibição do CXCL13 é de ao menos cerca de 60%, 70% ou 80%.
E32. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E10, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, liga-se a células B humanas que expressam o CXCRS5 (por exemplo, células B humanas CXCR5+) com uma afinidade aparente de uma EC50 de menos que cerca de 26 pM, mas não se liga a células que expressam ortólogos de camundongo, rato ou coelho do CXCR5.
E33. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E32, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, provoca a ADCC de células que expressam o CXCR5 em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de doadores humanos e cinomolgas e em células mononucleares tonsilares de doadores humanos.
E34. Anticorpo isolado que liga-se especificamente ao hOoXCR5 e compete com o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E33.
E35. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E34, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, liga-se a células B humanas CXCR5+ com uma afinidade aparente de uma EC50 de menos que cerca de 26 pM, mas não se liga substancialmente a células que expressam ortólogos do CXCR5. Em algumas modalidades, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, exibe ligação indetectável com células que expressam ortólogos do CXCR5, por exemplo, com base em qualquer um dos ensaios descritos neste documento; ou liga-se a células que expressam ortólogos do CXCR5 com uma afinidade aparente de uma EC50 ao menos 10.000 vezes maior que a da ligação com o hOoXCRS5.
E36. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E35, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2; uma CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 3; uma CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 4; uma CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 7; uma CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 8; e uma CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 9.
E37. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E36, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2; uma CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 3; uma CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 4; uma CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 7; uma CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 8; e uma CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 11.
E38. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E37, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 14; uma CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 15; uma CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 16; uma CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 19; uma CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 20; e uma CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 21.
E39. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E38, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo composto pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1, 5, 13, 35, 37, 48-51, 39 e 58-62 e uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo composto pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID Nº: 6, 10, 12, 17, 18, 36, 40, 53-57 e
63.
E40. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E39, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo composto pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1, 5, 13, 35, 37, 48-51, 39 e 58-62 e uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo composto pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID Nº: 6, 10, 12, 17, 18, 36, 40, 53-57 e
63.
E41. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E40, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos codificada pelo inserto do plasmídeo depositado junto à ATCC e com nº de Acesso PTA-124324 e uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos codificada pelo inserto do plasmídeo depositado junto à ATCC e com nº de Acesso PTA-124323.
E42. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E35 e de E39 a E40, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 13 e uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 17.
E43. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E35 e de E38 a E40, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 13 e uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 18.
E44. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E35 e de E38 a E40, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 37 e uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 38.
E45. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E3S6 e de E39 a E41, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 35 e uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 36.
E46. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E36 e de E39 a E41, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 47 e uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 52.
E47. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E36 e de E39 a E41, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 5 e uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 6.
E48. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E36 e de E39 a E41, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 5 e uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 10.
E49. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E36 e de E39 a E41, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1 e uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 6.
E50. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E35, E37 e de E39 a E41, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1 e uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 12.
E51. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E35, E37 e de E39 a E41, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 39 e uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 40.
E52. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E35, E37 e de E39 a E41, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma LC que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 22 e uma HC que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 23.
E53. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E35 e de E38 a E40, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma LC que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 24 e uma HC que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 25.
E54. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E35, E37 e de E39 a E41, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma LC que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 26 e uma HC que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 27.
E55. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E35, E37 e de E39 a E41, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma LC que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 28 e uma HC que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 29.
E56. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E35, E37 e de E39 a E41, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma VL codificada pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nº: 95 e uma VH codificada pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nº: 96.
E57. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E35, E37 e de E39 a E41, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma LC codificada pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nº: 97 e uma HC codificada pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nº: 98.
E58. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E57, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma sequência de framework de VL e uma sequência de framework de VH, e em que uma ou ambas a sequência de framework de VL ou a sequência de framework de VH é ao menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de linha germinativa humana da qual deriva e em que a sequência de VL de linha germinativa humana da qual a sequência de framework de VL deriva é selecionada dentre o grupo composto por DPK9, DPK12, DPK18, DPK24, HK102 V1, DPK1, DPK8, DPK3, DPK21, Vg 38K, DPK22, DPK15, DPL16, DPL8, V1-22, consenso VA, consenso VM, consenso VA3, consenso VK, consenso VK1, consenso VK2 e VK3, e em que a sequência de VH de linha germinativa humana da qual a sequência de framework de VH deriva é selecionada dentre o grupo composto por DP54, DP47, DP50, DP31, DP46, DP71, DP75, DP10, DP7, DP49, DP51, DP38, DP79, DP78, DP73, VH3, VH5, VH1 e VHA4.
E59. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E58, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, é afucosilado.
E60. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com a modalidade E59, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, exibe uma ADCC intensificada.
E61. Anticorpo isolado, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreendendo as sequências de CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 de uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo composto pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID Nº: 6, 7, 8, 25, 17, 18, 23, 27, 52, 53, 54,55, 56, 57 e 63.
E62. Anticorpo isolado, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreendendo as sequências de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 de uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo composto pelas sequências de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1, 2, 13, 22, 24, 26, 47, 48, 49, 50, 51, 58, 59, 60, 61 e 62.
E63. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E62, compreendendo as sequências de CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3, conforme definidas na sequência de aminoácidos de SEQID Nº: 6.
E64. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E62, compreendendo as sequências de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 da sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1.
E65. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E64, compreendendo uma ou mais das substituições de aminoácidos a seguir:
1, 2, 3, 4, 5 ou 6 substituições na CDR-L1 pelo resíduo correspondente de uma sequência de VL de linha germinativa humana, 1, 2, 3,4 ou 5 substituições na CDR-L2 pelo resíduo correspondente de uma sequência de VL de linha germinativa humana, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 substituições na CDR-L3 pelo resíduo correspondente de uma sequência de VL de linha germinativa humana, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 substituições na CDR-H1 pelo resíduo correspondente de uma sequência de VH de linha germinativa humana, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 substituições na CDR-H2 pelo resíduo correspondente de uma sequência de VH de linha germinativa humana, em que a sequência de VL de linha germinativa humana é selecionada dentre o grupo composto por DPK9, DPK12, DPK18, DPK24, HK102 V1, DPK1, DPK8, DPK3, DPK21, Vg. 38K, DPK22, DPK15, DPL16, DPL8, V1-22, consenso VK1, consenso VK2 e VK3, e a VH de linha germinativa humana é selecionada pelo grupo composto por DP54, DP47, DP50, DP31, DP46, DP71, DP75, DP10, DP7, DP49, DP51, DP38, DP79, DP78, DP73, VH3, VH5, VH1 e VHA4.
E66. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E61 a E65, compreendendo uma sequência de framework de VH derivada de uma sequência de VH de linha germinativa humana selecionada dentre o grupo composto por DP54, DP47, DP50, DP31, DP46, DP71, DP75, DP10, DP7, DP49, DP51, DP38, DP79, DP78, DP73, VH3, VH5, VH1 e VHA4.
E67. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E61 a E66, compreendendo uma sequência de framework de VH derivada de uma sequência de linha germinativa VH3 humana.
E68. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E61 a E67, compreendendo uma sequência de framework de VH derivada de uma sequência de VH de linha germinativa humana selecionada dentre o grupo composto por DP54, DP47, DP50, DP31, DP46, DP49 e DP51.
E69. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E61 a E68, compreendendo uma sequência de framework de VH derivada de uma sequência de VH de linha germinativa humana selecionada dentre o grupo composto por DP54, DP47, DP50 e DP31.
E70. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E61 a E69, compreendendo uma sequência de framework de VH derivada de uma sequência DP54 de linha germinativa humana.
E71. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E61 a E70, compreendendo uma sequência de framework de VL derivada de uma sequência de VL de linha germinativa humana selecionada dentre o grupo composto por DPK9, DPK12, DPK18, DPK24, HK102 V1, DPK1, DPK8, DPK3, DPK21, Vg. 38K, DPK22, DPK15, DPL16, DPLS8, V1-22, consenso VK, consenso VK1, consenso VK2 e consenso VK3.
E72. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E61 a E71, compreendendo uma sequência de framework de VL derivada de uma sequência de VL de linha germinativa humana selecionada dentre o grupo composto por DPK9, DPK12, DPK18, DPK24, HK102 V1, DPK1, DPK8, DPK3, DPK21, Vg 38K, DPK22, DPK15, consenso VK, consenso VK1, consenso VK2 e VK3.
E73. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E61 a E72, compreendendo uma sequência de framework de VL derivada de uma sequência VK1 de linha germinativa humana.
E74. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E61 a E73, compreendendo uma sequência de framework de VL derivada de uma sequência de VL de linha germinativa humana selecionada dentre o grupo composto por DPK9, HK102 V1, DPK1 e DPK8.
E75. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E61 a E74, compreendendo uma sequência de framework de VH derivada de uma sequência de DPK9 de linha germinativa humana.
E76. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E61 a E75, compreendendo uma sequência de framework de VL e uma sequência de framework de VH, e em que uma ou ambas a sequência de framework de VL ou a sequência de framework de VH são ao menos 90% idênticas à sequência de linha germinativa humana da qual derivam.
E77. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E61 a E76, compreendendo uma sequência de framework de VL e uma sequência de framework de VH, e em que uma ou ambas a sequência de framework de VL ou a sequência de framework de VH são ao menos 66%, 76%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas à sequência de linha germinativa humana da qual derivam.
E78. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E61 a E77, compreendendo uma sequência de framework de VL e uma sequência de framework de VH, e em que uma ou ambas a sequência de framework de VL ou a sequência de framework de VH são idênticas à sequência de linha germinativa humana da qual derivam.
E79. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E61 a E78, compreendendo uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos ao menos 90% idêntica ao SEQ ID Nº:
6.
E80. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E61 a E79, compreendendo uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos ao menos 92% idêntica ao SEQ ID Nº:
6.
E81. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E61 a E80, compreendendo uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 6.
E82. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E61 a E81, compreendendo uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos ao menos 66% idêntica ao SEQ ID Nº:
1.
E83. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E61 a E82, compreendendo uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos ao menos 66%, 76%, 80%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ao SEQ ID Nº: 1.
E84. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E61 a E83, compreendendo uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1.
E85. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E84, compreendendo um domínio Fc.
E86. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com a modalidade E85, em que o domínio Fc é o domínio Fc de uma IgA (por exemplo, IgA1 ou IgA2), IgD, IgE, IgM ou IgG (por exemplo, I9G1, IgG2, I9G3 ou 19G4).
E87. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com a modalidade E86, em que o domínio Fc é o domínio Fc de uma IgG.
E88. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com a modalidade E87, em que a IgG é selecionada dentre o grupo composto por 19G1, IgG2, IgG3 ou IgG4.
E89. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com a modalidade E88, em que a IgG é IgG1.
E90. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E89, compreendendo uma cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos ao menos 90% idêntica ao SEQ ID Nº: 29.
E91. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E61 a E89, compreendendo uma cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos ao menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ao SEQ ID Nº: 29.
E92. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E61 a E89, compreendendo uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 29.
E93. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E93, compreendendo uma LC que compreende uma sequência de aminoácidos ao menos 90% idêntica ao SEQ ID Nº:
28.
E94. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E93, compreendendo uma LC que compreende uma sequência de aminoácidos ao menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ao SEQ ID Nº: 28.
E95. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E94, compreendendo uma LC que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 28.
E96. Anticorpo isolado, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreendendo a sequência de VH codificada pelo inserto do plasmídeo depositado junto à ATCC e com nº de Acesso PTA-124323.
E97. Anticorpo isolado, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreendendo a sequência de VL codificada pelo inserto do plasmídeo depositado junto à ATCC e com nº de Acesso PTA-124324.
E98. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que compete para ligar-se ao CXCR5 humano com um dentre 11G2 de camundongo, 11G2 quimérico, VH (XC152/VL (XC151) do h11G2, VH (XKC152)/VL (XC153) do h11G2, VH (XC152)/VL (XC154) do h11G2, VH (XC152)/VL (XC346) do h11G2, VÁ (XC152)/VL (XC347) do h11G2, VH (XC152)/VL (XC348) do h11G2, VH (XKC152)/VL (XC349) do h11G2, VH (KXC155)/VL (XC151) do h11G2, VH (XC155)/VL (XC153) do h11G2, VH (XC155)/VL (XC154) do h11G2, VH (XC155)/VL (XC346) do h11G2, VÁ (XC155)/VL (XC347) do h11G2, VH (KC1I55)/VL (XC3484) do h11G2, VH (XC155)/VL (XC349) do h11G2, VH (XC156)/VL (XC151) do h11G2, VH (XC156)/VL (XC153) do h11G2, VH (XKC156)/VL (XC154) do h11G2, VH (XC156)/VL (XC346) do h11G2, VH (XC156)/VL (XC347) do h11G2, VH (XC156)/VL (XC348) do h11G2, VH (XC156)/VL (XC349) do h11G2, VH (XC157)/VL (XC151) do h11G2, VH (XKC157)/VL (XC153) do h11G2, VH (XKC157)/VL (XC154) do h11G2, VH (XC157)/VL (XC346) do h11G2, VH (XC157)/ VL (XC347) do h11G2, VH (XC157)/ VL (XC348) do h11G2, VÁ (XC157)/ VL (XC349) do h11G2, VH (XC350)/ VL (XC151) do h11G2, VH (XC350)/ VL (XC153) do h11G2, VH (XC350)/ VL (XKC154) do h11G2, VH (XC350)/ VL (XC346) do h11G2, VH (XC350)/ VL (XC347) do h11G2, VH (XC350)/ VL (XC348) do h11G2, VH (XC350)/ VL (XC349) do h11G2, VH (XC351)/ VL (XC151) do h11G2,
VH (XC351)/ VL (XC153) do h11G2, VH (XC351)/ VL (XKC154) do h11G2, VH (XC351)/ VL (XC346) do h11G2, VH (XC351)/ VL (XC347) do h11G2, VH (XC351)/ VL (XC348) do h11G2, e VH (XC351)/ VL (XC349) do h11G2, VH (XC352)/ VL (XC151) do h11G2, VH (XC352)/ VL (XC153) do h11G2, VH (XC352) VL (XC154) do h11G2, VH (XC352)/ VL (XC346) do h11G2, VH (XC352)/ VL (XC347) do h11G2, VH (XC352)/ VL (XKC348) do h11G2, VH (XC352) VL (XC349) do h11G2, VH (XC353)/ VL (XC151) do h11G2, VH (XC353)/ VL (XC153) do h11G2, VH (XC353)/ VL (XC154) do h11G2, VH (XC353)/ VL (XC346) do h11G2, VH (XC353)/ VL (XC347) do h11G2, VH (XC353)/ VL (XC348) do h11G2, VH (XC353)/ VL (XKC349) do h11G2, VH (XC354)/ VL (XC151) do h11G2, VH (XC354)/ VL (XC153) do h11G2, VH (XC354)/ VL (XKC154) do h11G2, VH (XC354) VL (XC346) do h11G2, VH (XC354)/ VL (XC347) do h11G2, VH (XC354)/ VL (XC348) do h11G2, VH (XKC354)/ VL (XC349) do h11G2, 41A10 de camundongo, 41A10 quimérico, VH (XKC147)/ VL (XC142) do h41A10, VH (XC147)/ VL (XC143) do h41A10, VH (XC147)/ VL (XKC144) do h41A10, VH (XC147)/ VL (XKC145) do h41A10, VH (XC147)/ VL (XKC146) do h41A10, VH (XC147)/ VL (XC149) do h41A10, VH (XKC148)/ VL (XC142) do h41A10, VH (XC148)/ VL (XKC143) do h41A10, VH (XKC148)/ VL (XC144) do h41A10, VH (XC148)/ VL (XKC145) do h41A10, VH (XC148)/ VL (XC146) do h41A10, VH (XC148)/ VL (XC149) do h41A10, VH (XKC150)/ VL (XC142) do h41A10, VH (XC150)V VL (XC143) do h41A10, VH (XC150)/ VL (XC144) do h41A10, VH (XC150)/ VL (XC145) do h41A10, VH (XC150)/ VL (XC146) do h41A10, VH (XKC150)/ VL (XKC149) do h41A10, 5H7 de camundongo, e 5H7 quimérico.
E99. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que compete para ligar-se ao CXCR5 humano com o CXCL13 com o anticorpo de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E98.
E100. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E99, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, é uma proteína de fusão com Fc, um monocorpo, um maxicorpo, um anticorpo bifuncional, um scFab, um scFv, um pepticorpo.
E101. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E100, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, liga-se ao CXCR5 humano com uma KD de cerca de ou menos de um valor selecionado dentre o grupo composto por cerca de 10 nM, 5 nM, 2 nM, 1 nM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 600 pM, 500 pM, 400 PM, 300 pM, 250 pM, 200 pM, 150 pM, 100 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 25 pM, 20 pM, pM, 10 pM, 5 pM e 1 pM.
E102. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E101, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, liga-se ao CXCR5 do macaco cinomolgo com uma KD de cerca de ou menos de um valor selecionado dentre o grupo composto por cerca de 10 nM, 5 nM, 2 nM, 1 nM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 300 pM, 250 pM, 200 pM, 150 pM, 100 pM, 50 pM, 40 pM, pM, 25 pM, 20 pM, 15 pM, 13pM,10 pM, 5 pM e 1 pM.
E103. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E102, em que a KD da ligação do anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, com o CXCR5 cinomolgo é dentro da ordem de grandeza 1 da KD da ligação do anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, com o CXCR5 humano.
E104. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E103, em que a razão da KD da ligação do anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, com o CXCR5 humano para a ligação com o CXCR5 cinomolgo é entre 5:1 e 1:5.
E105. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E104, em que a razão da KD da ligação do anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, com o CXCR5 humano para a ligação com o CXCR5 cinomolgo é entre 2:1 e 1:2.
E106. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E105, em que a razão da KD da ligação do anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, com o CXCR5 cinomolgo para a ligação com o CXCR5 humano é entre uma faixa cujo menor valor é selecionado dentre o grupo composto por 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7,1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 24, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5 e 6,2 e cujo maior valor é selecionado dentre o grupo composto por 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 24, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 6,2, 9, 9,2€ 10.
E107. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E106, em que a razão da KD da ligação do anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, com o CXCRS5 cinomolgo de SEQ ID Nº: 33 para a ligação com o CXCR5 humano de SEQ ID Nº: 32 é entre cerca de 1,0 e cerca de 10,0.
E108. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a 107, em que a meia-vida prevista em seres humanos varia de cerca de um (1) dia a vinte e um (21) dias.
E109. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a 108, em que a meia-vida prevista em seres humanos é de cerca de dezessete (17) dias.
E110. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreendendo as CDRs de um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, selecionadas dentre o grupo composto por VH do 11G2 de camundongo, VL do 11G2 de camundongo, VH do 11G2 quimérico, VL do 11G2 quimérico, VH do 11G2 humanizado (XC152), VH do h11G2 (XC155), VH do h11G2 (XC156), VH do h11G2 (XC157), VH do h11G2 (XC350), VH do h11G2 (XC351), VH do h11G2 (XC352), VH do h11G2 (XC353), VH do h11G2 (XC354), VL do h11G2 (XC151), VL do h11G2 (XC153), VL do h11G2 (XC154), VL do h11G2 (XC346), VL do h11G2 (XC347), VL do h11G2 (XC348), VL do h11G2 (XC349), VH do 41A10 de camundongo, VL do 41A10 de camundongo, VH do 41A10 quimérico, VL do 41A10 quimérico, VH do 41A10 humanizado (XC147), VH do h41A10 (XC148), VH do h41A10 (XC150), VL do h41A10 (XC142), VL do h41A10 (XC143), VL do h41A10 (XC144), VL do h41A10 (XC145), VL do h41A10 (XC146), VL do h41A10 (XC149), VH do 5H7 de camundongo, VL do 5H7 de camundongo, VH do 5H7 quimérico, e VL do 5H7 quimérico.
E111. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreendendo uma VL e uma VH de um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, selecionadas dentre o grupo composto por VH do 11G2 de camundongo, VL do 11G2 de camundongo, VH do 11G2 quimérico, VL do 11G2 quimérico, VH do h11G2 (XC152), VH do h11G2 (XC155), VH do h11G2 (XC156), VH do h11G2 (XC157), VH do h11G2 (XC350), VH do h11G2 (XC351), VH do h11G2 (XC352), VH do h11G2 (XC353), VH do h11G2 (XC354), VL do h11G2 (XC151), VL do h11G2 (XC153), VL do h11G2 (XC154), VL do h11G2 (XC346), VL do h11G2 (XC347), VL do h11G2 (XC348), VL do h11G2 (XC349), VH do 41A10 de camundongo, VL do 41A10 de camundongo, VH do 41A10 quimérico, VL do 41A10 quimérico, VH do 41A10 humanizado (XC147), VH do h41A10 (XKC148), VH do h41A10 (XC150), VL do h41A10 (XC142), VL do h41A10 (XC143), VL do h41A10 (XC144), VL do h41A10 (XKC145), VL do h41A10 (XC146), VL do h41A10 (XC149),
VH do 5H7 de camundongo, VL do 5H7 de camundongo, VH do 5H7 quimérico e VL do 5H7 quimérico.
E112. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, selecionado dentre o grupo composto por: a. um anticorpo que compreende uma VH do 11G2 de camundongo e uma VL do 11G2 de camundongo; b. um anticorpo que compreende uma VH do 11G2 quimérico e uma VL do 11G2 quimérico; c. um anticorpo que compreende uma VH do 11G2 humanizado (XC152) e uma VL selecionada dentre o grupo composto por VL do 11G2 de camundongo, VL do 11G2 quimérico, VL do h11G2 (XC151), VL do h11G2 (XC153), VL do h11G2 (XC154), VL do h11G2 (XC346), VL do h11G2 (XC347), VL do h11G2 (XKC348) e VL do h11G2 (XC349); d. um anticorpo que compreende uma VH do 11G2 humanizado (XKC155) e uma VL selecionada dentre o grupo composto por VL do 11G2 de camundongo, VL do 11G2 quimérico, VL do h11G2 (XC151), VL do h11G2 (XC153), VL do h11G2 (XC154), VL do h11G2 (XC346), VL do h11G2 (XC347), VL do h11G2 (XC348) e VL do h11G2 (XC349); e. um anticorpo que compreende uma VH do 11G2 humanizado (XKC156) e uma VL selecionada dentre o grupo composto por VL do 11G2 de camundongo, VL do 11G2 quimérico, VL do h11G2 (XC151), VL do h11G2 (XC153), VL do h11G2 (XC154), VL do h11G2 (XC346), VL do h11G2 (XC347), VL do h11G2 (XKC348) e VL do h11G2 (XC349); f. um anticorpo que compreende uma VH do 11G2 humanizado (XKC157) e uma VL selecionada dentre o grupo composto por VL do 11G2 de camundongo, VL do 11G2 quimérico, VL do h11G2 (XC151), VL do h11G2 (XC153), VL do h11G2
(XC154), VL do h11G2 (XC346), VL do h11G2 (XC347), VL do h11G2 (XKC348) e VL do h11G2 (XC349);
9. um anticorpo que compreende uma VH do 11G2 humanizado (XC350) e uma VL selecionada dentre o grupo composto por VL do 11G2 de camundongo, VL do 11G2 quimérico, VL do h11G2 (XC151), VL do h11G2 (XC153), VL do h11G2 (XC154), VL do h11G2 (XC346), VL do h11G2 (XC347), VL do h11G2 (XKC348) e VL do h11G2 (XC349); h. um anticorpo que compreende uma VH do h11G2 (XC351) e uma VL selecionada dentre o grupo composto por VL do 11G2 de camundongo, VL do 11G2 quimérico, VL do h11G2 (XC151), VL do h11G2 (XC153), VL do h11G2 (XC154), VL do h11G2 (XC346), VL do h11G2 (XC347), VL do h11G2 (XC348) e VL do h11G2 (XC349); i. um anticorpo que compreende uma VH do h11G2 (XC352) e uma VL selecionada dentre o grupo composto por VL do 11G2 de camundongo, VL do 11G2 quimérico, VL do h11G2 (XC151), VL do h11G2 (XC153), VL do h11G2 (XC154), VL do h11G2 (XC346), VL do h11G2 (XC347), VL do h11G2 (XKC348) e VL do h11G2 (XC349); j: um anticorpo que compreende uma VH do h11G2 (XC353) e uma VL selecionada dentre o grupo composto por VL do 11G2 de camundongo, VL do 11G2 quimérico, VL do h11G2 (XC151), VL do h11G2 (XC153), VL do h11G2 (XC154), VL do h11G2 (XC346), VL do h11G2 (XC347), VL do h11G2 (XC348) e VL do h11G2 (XC349); k. um anticorpo que compreende uma VH do h11G2 (XC354) e uma VL selecionada dentre o grupo composto por VL do 11G2 de camundongo, VL do 11G2 quimérico, VL do h11G2 (XC151), VL do h11G2 (XC153), VL do h11G2 (XC154), VL do h11G2 (XC346), VL do h11G2 (XC347), VL do h11G2 (XKC348) e VL do h11G2 (XC349);
|. um anticorpo que compreende uma VL do h11G2 (XC151) e uma VH selecionada dentre o grupo composto por VH do 11G2 de camundongo, VH do 11G2 quimérico, VH do h11G2 (XC152), VH do h11G2 (XC155), VH do h11G2 (XC156), VH do h11G2 (XC157), VH do h11G2 (XC350), VH do h11G2 (XC351), VH do h11G2 (XC352), VH do h11G2 (XC353) e VH do h11G2 (XC354);
m. um anticorpo que compreende uma VL do h11G2 (XKC153) e uma VH selecionada dentre o grupo composto por VH do 11G2 de camundongo, VH do 11G2 quimérico, VH do h11G2 (XC152), VH do h11G2 (XC155), VH do h11G2 (XC156), VH do h11G2 (XC157), VH do h11G2 (XC350), VH do h11G2 (XC351), VH do h11G2 (XC352), VH do h11G2 (XC353) e VH do h11G2 (XC354);
n. um anticorpo que compreende uma VL do h11G2 (XC154) e uma VH selecionada dentre o grupo composto por VH do 11G2 de camundongo, VH do 11G2 quimérico, VH do h11G2 (XC152), VH do h11G2 (XC155), VH do h11G2 (XC156), VH do h11G2 (XC157), VH do h11G2 (XC350), VH do h11G2 (XC351), VH do h11G2 (XC352), VH do h11G2 (XC353) e VH do h11G2 (XC354);
o. um anticorpo que compreende uma VL do h11G2 (XKC346) e uma VH selecionada dentre o grupo composto por VH do 11G2 de camundongo, VH do 11G2 quimérico, VH do h11G2 (XC152), VH do h11G2 (XC155), VH do h11G2 (XC156), VH do h11G2 (XC157), VH do h11G2 (XC350), VH do h11G2 (XC351), VH do h11G2 (XC352), VH do h11G2 (XC353) e VH do h11G2 (XC354);
p. um anticorpo que compreende uma VL do h11G2 (XKC347) e uma VH selecionada dentre o grupo composto por VH do 11G2 de camundongo, VH do 11G2 quimérico, VH do h11G2 (XC152), VH do h11G2 (XC155), VH do h11G2 (XC156), VH do h11G2 (XC157), VH do h11G2 (XC350), VH do h11G2 (XC351), VH do h11G2 (XC352), VH do h11G2 (XC353) e VH do h11G2 (XC354);
q. um anticorpo que compreende uma VL do h11G2 (XKC348) e uma VH selecionada dentre o grupo composto por VH do 11G2 de camundongo, VH do 11G2 quimérico, VH do h11G2 (XC152), VH do h11G2 (XC155), VH do h11G2 (XC156), VH do h11G2 (XC157), VH do h11G2 (XC350), VH do h11G2 (XC351), VH do h11G2 (XC352), VH do h11G2 (XC353) e VH do h11G2 (XC354);
r. um anticorpo que compreende uma VL do h11G2 (XC349) e uma VH selecionada dentre o grupo composto por VH do 11G2 de camundongo, VH do 11G2 quimérico, VH do h11G2 (XC152), VH do h11G2 (XC155), VH do h11G2 (XC156), VH do h11G2 (XC157), VH do h11G2 (XC350), VH do h11G2 (XC351), VH do h11G2 (XC352), VH do h11G2 (XC353) e VH do h11G2 (XC354);
s. um anticorpo que compreende uma VH do 41A10 de camundongo e uma VL selecionada dentre o grupo composto por VL do 41A10 de camundongo, VL do 41A10 quimérico, VL do h41A10 (XC142), VL do h41A10 (XC143), VL do h41A10 (XC144), VL do h41A10 (XC145), VL do h41A10 (XC146) e VL do h41A10 (XC149);
t. um anticorpo que compreende uma VH do 41A10 quimérico e uma VL selecionada dentre o grupo composto por VL do 41A10 de camundongo, VL do 41A10 quimérico, VL do h41A10 (XC142), VL do h41A10 (XC143), VL do h41A10 (XC144), VL do h41A10 (XC145), VL do h41A10 (XC146) e VL do h41A10 (XC149);
u. um anticorpo que compreende uma VH do 41A10 humanizado (XC147) e uma VL selecionada dentre o grupo composto por VL do 41A10 de camundongo, VL do 41A10 quimérico, VL do h41A10 (XC142), VL do h41A10 (XC143), VL do h41A10 (XC144), VL do h41A10 (XC145), VL do h41A10 (XC146) e VL do h41A10 (XC149);
v. um anticorpo que compreende uma VH do h41A10 (XKC148) e uma VL selecionada dentre o grupo composto por VL do 41A10 de camundongo, VL do 41A10 quimérico, VL do h41A10 (XC142), VL do h41A10 (XKC143), VL do h41A10 (XC144), VL do h41A10 (XC145), VL do h41A10 (XC146) e VL do h41A10 (XC149);
w.
VH do h41A10 (XKC150) e uma VL selecionada dentre o grupo composto por VL do 41A10 de camundongo, VL do 41A10 quimérico, VL do h41A10 (XKC142),
VL do h41A10 (XKC143), VL do h41A10 (XKC144), VL do h41A10 (XKC145), VL do h41A10 (XC146), VL do h41A10 (XC149) e VL do h41A10 (XC142);
x. um anticorpo que compreende uma VL do 41A10 de camundongo e uma VH selecionada dentre o grupo composto por VH do 41A10 de camundongo, VH do 41A10 quimérico, VH do h41A10 (XKC147), VL do h41A10 (XKC148) e VH do h41A10 (XC150);
y. um anticorpo que compreende uma VL do 41A10 quimérico e uma VH selecionada dentre o grupo composto por VH do 41A10 de camundongo, VH do 41A10 quimérico, VH do h41A10 (XKC147), VL do h41A10 (XKC148) e VH do h41A10 (XC150);
z. um anticorpo que compreende uma VL do h41A10 (XKC143) e uma VH selecionada dentre o grupo composto por VH do 41A10 de camundongo, VH do 41A10 quimérico, VH do h41A10 (XKC147), VL do h41A10 (XKC148) e VH do h41A10 (XC150);
aa. um anticorpo que compreende uma VL do h41A10 (XC144) e uma VH selecionada dentre o grupo composto por VH do 41A10 de camundongo, VH do 41A10 quimérico, VH do h41A10 (XKC147), VL do h41A10 (XKC148) e VH do h41A10 (XC150);
bb. um anticorpo que compreende uma VL do h41A10 (XKC145) e uma VH selecionada dentre o grupo composto por VH do 41A10 de camundongo, VH do 41A10 quimérico, VH do h41A10 (XKC147), VL do h41A10 (XKC148) e VH do h41A10 (XC150);
cc. um anticorpo que compreende uma VL do h41A10 (XKC146) e uma VH selecionada dentre o grupo composto por VH do 41A10 de camundongo, VH do 41A10 quimérico, VH do h41A10 (XKC147), VL do h41A10 (XKC148) e VH do h41A10 (XC150);
dd. um anticorpo que compreende uma VL do h41A10 (XKC149) e uma VH selecionada dentre o grupo composto por VH do 41A10 de camundongo, VH do 41A10 quimérico, VH do h41A10 (XC147), VL do h41A10 (XKC148) e VH do h41A10 (XC150);
ee. um anticorpo que compreende uma VH do 5H7 de camundongo e uma VL selecionada dentre o grupo composto por 5H7 de camundongo e VL do 5H7 quimérico;
ff.
VL do 5H7 de camundongo e uma VH selecionada dentre o grupo composto por VH do 5H7 de camundongo e VH do 5H7 quimérico;
gg. um anticorpo que compreende uma VH do h11G2 (XC152) e VL do h11G2 (XC151);
hh. um anticorpo que compreende uma VH do h11G2 (XC155) e VL do h11G2 (XC153);
ii. um anticorpo que compreende uma VH do h11G2 (XC155) e VL do h11G2 (XC154);
jj- um anticorpo que compreende uma VH do h11G2 (XC156) e VL do h11G2 (XC153);
kk. um anticorpo que compreende uma VH do h11G2 (XKC157) e VL do h11G2 (XC154);
Il. um anticorpo que compreende uma VH do 11G2 de camundongo e uma VL do 11G2 de camundongo;
mm. um anticorpo que compreende uma HC do 11G2 quimérico e uma LC do 11G2 quimérico;
nn. um anticorpo que compreende uma VH do h11G2 (XKC152) e uma VL do h11G2 (XC151);
oo. um anticorpo que compreende uma VH do h11G2 (XC155) e uma VL do h11G2 (XC154);
pp. um anticorpo que compreende uma VH do h11G2 (XC156) e uma VL do h11G2 (XC153);
qq. um anticorpo que compreende uma VH do h11G2 (XC157) e uma VL do h11G2 (XC154);
rr. um anticorpo que compreende uma VH do 41A10 de camundongo e uma VL do 41A10 de camundongo;
ss. um anticorpo que compreende uma HC do 41A10 quimérico e uma LC do 41A10 quimérico;
tt. um anticorpo que compreende uma VH do h41A10 (XKC147) e uma VL do h41A10 (XC142);
uu. um anticorpo que compreende uma VH do h41A10 (XC147) e uma VL do h41A10 (XC143);
vw. um anticorpo que compreende uma VH do h41A10 (XKC147) e uma VL do h41A10 (XKC144);
ww. um anticorpo que compreende uma VH do h41A10 (XKC147) e uma VL do h41A10 (XKC145);
xx. um anticorpo que compreende uma VH do h41A10 (XKC148) e uma VL do h41A10 (XC142);
yy. um anticorpo que compreende uma VH do h41A10 (XC148) e uma VL do h41A10 (XKC143);
zz. um anticorpo que compreende uma VH do h41A10 (XC148) e uma VL do h41A10 (XKC144);
aaa. um anticorpo que compreende uma VH do 5H7 de camundongo e uma VL do 5H7 de camundongo; e bbb. um anticorpo que compreende uma HC do 5H7 quimérico e uma LC do 5H7 quimérico.
E113. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, selecionado dentre o grupo composto por:
(a) um anticorpo com uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 36 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 35;
(b) um anticorpo com uma CDR-H1 que compreende a sequência de SEQ ID Nº:7, uma CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 8, uma CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 9, uma CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2, uma CDR- L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 3, e uma CDR-L3 que compreende a sequência de SEQ ID Nº: 4;
(c) um anticorpo com uma CDR-H1 que compreende a sequência de SEQ ID Nº: 7, uma CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 8, uma CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 11, uma CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2, uma CDR- L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 3, e uma CDR-L3 que compreende a sequência de SEQ ID Nº: 4;
(d) um anticorpo com uma CDR-H1 que compreende a sequência de SEQ ID Nº: 19, uma CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 20, uma CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 21, uma CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 14, uma CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 15, e uma CDR-L3 que compreende a sequência de SEQ ID Nº: 16;
(e) um anticorpo com uma CDR-H1, uma CDR-H2 e uma CDR-H3, conforme definidas na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 6, e uma CDR-L1, uma CDR- L2 e uma CDR-L3, conforme definidas na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1
(f) um anticorpo que compreende uma CDR-H1, uma CDR-H2 e uma CDR- H3, codificadas pelo inserto do plasmídeo depositado junto à ATCC e com nº de Acesso PTA-124323, e uma CDR-L1, uma CDR-L2 e uma CDR-L3, codificadas pelo inserto do plasmídeo depositado junto à ATCC e com nº de Acesso PTA-124324;
(g) anticorpo com uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 52 (XC152) e uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo composto pelos SEQ ID Nº: 1, 5, 35, 47, 48, 49, 50 e 51;
(h) um anticorpo com uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 6 (XKC155) e uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo composto pelos SEQ ID Nº: 1, 5, 35, 47, 48,49, 50 e 51;
(i) um anticorpo com uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 10 (XKC156) e uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo composto pelos SEQ ID Nº: 1, 5, 35, 47, 48,49, 50 e 51;
(]) um anticorpo com uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 12 (XKC157) e uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo composto pelos SEQ ID Nº: 1, 5, 35, 47, 48,49, 50 e 51;
(k) um anticorpo com uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 53 (XC350) e uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo composto pelos SEQ ID Nº: 1, 5, 35, 47, 48,49, 50 e 51;
(1) um anticorpo com uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 54 (XC351) e uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo composto pelos SEQ ID Nº: 1, 5, 35, 47, 48,49, 50 e 51;
(m) um anticorpo com uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 55 (XC352) e uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo composto pelos SEQ ID Nº: 1, 5, 35, 47, 48,49, 50 e 51;
(n) um anticorpo com uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 56 (XC353) e uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo composto pelos SEQ ID Nº: 1, 5, 35, 47, 48,49, 50 e 51;
(o) um anticorpo com uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 55 (XKC354) e uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo composto pelos SEQ ID Nº: 1, 5, 35, 47, 48,49, 50 e 51;
(p) um anticorpo com uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 47 (XC151) e uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo composto pelos SEQ ID Nº: 6, 10, 12, 36, 52, 53, 54, 55, 56 e 57;
(q) um anticorpo com uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 5 (XKC153) e uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo composto pelos SEQ ID Nº: 6, 10, 12, 36, 52, 53, 54, 55, 56 e 57;
(r) um anticorpo com uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1 (XKC154) e uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo composto pelos SEQ ID Nº: 6, 10, 12, 36, 52, 53, 54, 55, 56 e 57;
(s) um anticorpo com uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 48 (XC346) e uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo composto pelos SEQ ID Nº: 6, 10, 12, 36, 52, 53, 54, 55, 56 e 57;
(t) um anticorpo com uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 49 (XC347) e uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo composto pelos SEQ ID Nº: 6, 10, 12, 36, 52, 53, 54, 55, 56 e 57;
(u) um anticorpo com uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 50 (XKC348) e uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo composto pelos SEQ ID Nº: 6, 10, 12, 36, 52, 53, 54, 55, 56 e 57;
(v) um anticorpo com uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 51 (XC349) e uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo composto pelos SEQ ID Nº: 6, 10, 12, 36, 52, 53, 54, 55, 56 e 57;
(w) um anticorpo com uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 38 (m 41A10 VH) e uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo composto pelos SEQ ID Nº: 13, 37, 58, 59, 60,61 e 62;
(x) um anticorpo com uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 17 (XKC148) e uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo composto pelos SEQ ID Nº: 13, 37, 58, 59, 60, 61 e 62;
(y) um anticorpo com uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 18 (XKC147) e uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo composto pelos SEQ ID Nº: 13, 37, 58, 59, 60,61 e 62;
(z) um anticorpo com uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 63 (XC150) e uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo composto pelos SEQ ID Nº: 13, 37, 58, 59, 60, 61 e 62;
(aa) um anticorpo com uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 37 (VL do h41A10 de camundongo) e uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo composto pelos SEQ ID Nº: 17, 18, 38 e 63;
(bb) um anticorpo com uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 13 (VL XC142 do h41A10) e uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo composto pelos SEQ ID Nº: 17, 18, 38 e 63;
(cc) um anticorpo com uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 58 (VL XC143 do h41A10) e uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo composto pelos SEQ ID Nº: 17, 18, 38 e 63;
(dd) um anticorpo com uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 59 (VL XC144 do h41A10) e uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo composto pelos SEQ ID Nº: 17, 18, 38 e 63;
(ee) um anticorpo com uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 60 (VL XC145 do h41A10) e uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo composto pelos SEQ ID Nº: 17, 18, 38 e 63;
(ff) um anticorpo com uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 61 (VL XC1446 do h41A10) e uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo composto pelos SEQ ID Nº: 17, 18,38 e 63;
(gg) um anticorpo com uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 62 (VL XC149 do h41A10) e uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo composto pelos SEQ ID Nº: 17, 18, 38 e 63;
(hh) um anticorpo com uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 40 (VH do 5H7 de camundongo) e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 39;
(ii) um anticorpo com uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 52 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 47;
(j]) um anticorpo com uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 6 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 5;
(kk) um anticorpo com uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 6 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1;
(1) um anticorpo com uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 10 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 5;
(mm) um anticorpo com uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 10 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 5; e
(nn) um anticorpo com uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 12 e uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1.
E114. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que compete para ligar-se ao CXCR5 humano com um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E113.
E115. Ácido nucleico isolado que codifica o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E114.
E116. Molécula de ácido nucleico isolado compreendendo ao menos uma sequência de ácido nucleico que codifica o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E109.
E117. Molécula de ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico selecionada dentre o grupo composto pela sequência definida como SEQ ID Nº: 95, 96, 97 e 98.
E118. Molécula de ácido nucleico isolada compreendendo a sequência de ácido nucleico conforme definida pelo SEQ ID Nº: 95.
E119. Molécula de ácido nucleico isolada compreendendo a sequência de ácido nucleico conforme definida pelo SEQ ID Nº: 96.
E120. Molécula de ácido nucleico isolada compreendendo a sequência de ácido nucleico conforme definida pelo SEQ ID Nº: 95 e a sequência de ácido nucleico conforme definida pelo SEQ ID Nº: 96.
E121. Molécula de ácido nucleico isolada compreendendo a sequência de ácido nucleico conforme definida pelo SEQ ID Nº: 97.
E122. Molécula de ácido nucleico isolada compreendendo a sequência de ácido nucleico conforme definida pelo SEQ ID Nº: 98.
E123. Molécula de ácido nucleico isolada compreendendo a sequência de ácido nucleico conforme definida pelo SEQ ID Nº: 97 e a sequência de ácido nucleico conforme definida pelo SEQ ID Nº: 98.
E124. Molécula de ácido nucleico isolado compreendendo a sequência de ácido nucleico do inserto do plasmídeo depositado junto à ATCC e com nº de Acesso PTA-124323.
E125. Molécula de ácido nucleico isolado compreendendo a sequência de ácido nucleico do inserto do plasmídeo depositado junto à ATCC e com nº de Acesso PTA-124324.
E126. Ácido nucleico isolado que codifica a VH, VL ou ambas de um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga-se especificamente ao CXCR5, em que o referido ácido nucleico compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nº: 95, a sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nº: 107 ou ambas.
E127. Ácido nucleico isolado que codifica a cadeia pesada, cadeia leve ou ambas de um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se especificamente ao CXCR5, em que o referido ácido nucleico compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nº: 97, a sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nº: 98 ou ambas.
E128. Ácido nucleico isolado que codifica a VH de um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga-se especificamente ao CXCR5, em que o referido ácido nucleico compreende a sequência de ácido nucleico do inserto do plasmídeo depositado junto à ATCC e com nº de Acesso PTA-
124323.
E129. Ácido nucleico isolado que codifica a VL de um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga-se especificamente ao CXCR5, em que o referido ácido nucleico compreende a sequência de ácido nucleico do inserto do plasmídeo depositado junto à ATCC e com nº de Acesso PTA-
124324.
E130. Ácido nucleico isolado que codifica a VL e VH de um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga-se especificamente ao CXCR5, em que o referido ácido nucleico compreende a sequência de ácido nucleico do inserto do plasmídeo depositado junto à ATCC e com nº de Acesso PTA- 124324 e a sequência de ácido nucleico do inserto do plasmídeo depositado junto à ATCC e com nº de Acesso PTA-124323.
E131. Vetor compreendendo a molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das modalidades de E115 a E130.
E132. Célula hospedeira compreendendo a molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das modalidades de E115 a E130 ou o vetor de acordo com a modalidade E131.
E133. Célula hospedeira, de acordo com a modalidade E132, em que a referida célula é uma célula de um mamífero.
E134. Célula hospedeira, de acordo com a modalidade E133, em que a referida célula hospedeira é uma célula CHO, uma célula COS, uma célula HEK-293, uma célula NSO, uma célula PER.C6€ ou uma célula Sp2.0.
E135. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das modalidades de E132 a 134, em que a referida célula hospedeira carece de uma alfa-1,6- fucosiltransferase (FUT8) funcional.
E136. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das modalidades de E132 a E135, em que a referida célula não expressa uma enzima alfa-1,6- fucosiltransferase (FUT8) funcional.
E137. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das modalidades de E132 a E136, em que a referida célula carece de um gene da FUT8 que codifique uma enzima funcional.
E138. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das modalidades de E132 a E137, em que a referida célula carece de um gene que codifique um gene da FUTB8 funcional.
E139. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das modalidades de E132 a E139, em que a referida célula é uma célula CHOK1ISV Potelligent& ou uma célula CHO Lec13.
E140. Célula hospedeira, de acordo com a modalidade E139, em que a referida célula é uma célula CHOK1ISV PotelligentO.
E141. Método para produzir um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreendendo cultivar a célula hospedeira de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E114, sob uma condição em que o referido anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, é expresso pela referida célula hospedeira.
E142. Método, de acordo com a modalidade E141, compreendendo ainda isolar o referido anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo.
E143. Método para produzir um anticorpo anti-CXCR5 afucosilado, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, o referido método compreendendo cultivar uma célula hospedeira que compreende a molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das modalidades de E115 a E130 ou o vetor de acordo com a modalidade E131, em que a referida célula hospedeira carece de uma FUT8 funcional.
E144. Método, de acordo com a modalidade E143, em que a célula hospedeira é uma célula CHOK1SV PotelligentO.
E145. Anticorpo isolado, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, produzido usando o método de acordo com qualquer uma das modalidades de E141 a E114.
E146. Anticorpo isolado, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E114, em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, é afucosilado.
E147. Anticorpo afucosilado, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com a modalidade E 146, em que o referido anticorpo afucosilado, ou fragmento de ligação com antígeno, exibe uma citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) intensificada em comparação a um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que é fucosilado, mas fora isso idêntico.
E148. Anticorpo afucosilado, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com a modalidade E 146, em que o referido anticorpo afucosilado, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, exibe uma ADCC cerca de 2 vezes, cerca de 5 vezes, cerca de 7 vezes, cerca de 10 vezes, cerca de 20 vezes, cerca de 30 vezes, cerca de 40 vezes, cerca de 50 vezes, cerca de 60 vezes, cerca de 70 vezes, cerca de 80 vezes, cerca de 90 vezes, cerca de 100 vezes, cerca de 110 vezes, cerca de 120 vezes, cerca de 130 vezes, cerca de 140 vezes e cerca de 143 vezes maior em comparação a um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que é fucosilado, mas fora isso idêntico.
E149. Composição farmacêutica compreendendo um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E114 e de E145 a E148 e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
E150. Composição farmacêutica, de acordo com a modalidade E149, em que o referido anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, é afucosilado.
E151. Método para reduzir a atividade do CXCR5 compreendendo administrar a um paciente que dele necessita uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E114 e de E145 a E148, ou da composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das modalidades E149 e E150.
E152. Método para tratar uma doença inflamatória compreendendo administrar a um paciente que dele necessita uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E114 e de E145 a E148, ou da composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das modalidades E149 e E150.
E153. Método para tratar um paciente que necessita de imunossupressão compreendendo administrar a um paciente que dele necessita uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E114 e de El45 a E148, ou da composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das modalidades E149 e E150.
E154. Método para tratar uma doença, transtorno ou condição autoimune compreendendo administrar a um paciente que dele necessita uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E114 e de El45 a E148, ou da composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das modalidades E149 e E150.
E155. Método para reduzir o número de células que expressam o CXCR5 em um paciente que dele necessita, o referido método compreendendo administrar a um paciente que dele necessita uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E114 e de E145 a E148, ou da composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das modalidades E149 e E150.
E156. Método, de acordo com a modalidade E155, em que as células expressam o CXCR5 em sua superfície.
E157. Método, de acordo com a modalidade E156, em que as células são células B e células similares a Thf.
E158. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades de E151 a E157, em que o referido paciente é um ser humano.
E159. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades de E151 a E158, compreendendo administrar o referido anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, ou composição farmacêutica, por via intravenosa.
E160. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades de E151 a E158, compreendendo administrar o referido anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, ou composição farmacêutica, por via subcutânea.
E161. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades de E151 a E160, em que o referido anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, ou composição farmacêutica, é administrado cerca de duas vezes por semana, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez a cada cinco semanas, uma vez a cada seis semanas, uma vez a cada sete semanas, uma vez a cada oito semanas, uma vez a cada nove semanas, uma vez a cada dez semanas, duas vezes ao mês, uma vez ao mês, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada três meses, uma vez a cada quatro meses, uma vez a cada cinco meses, uma vez a cada seis meses, uma vez a cada sete meses, uma vez a cada oito meses, uma vez a cada nove meses, uma vez a cada dez meses, uma vez a cada onze meses ou uma vez a cada doze meses.
E162. Método para reduzir o número de células CXCR5+ em uma amostra, o referido método compreendendo colocar a referida célula em contato com o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E114 e de E145 a E148, ou com a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das modalidades E149 e E150.
E163. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E114 e de E145 a E148, ou composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das modalidades de E149 e E150, para uso como um medicamento.
E164. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E114 e de E145 a E148, ou composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das modalidades de E149 e E150, para uso na redução da atividade do CXCR5 em um paciente.
E165. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E114 e de E145 a E148, ou composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das modalidades de E149 e E150, para uso no tratamento de um paciente que necessita de imunossupressão.
E166. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E114 e de E145 a E148, ou composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das modalidades de E149 e E150, para uso no tratamento de uma doença, transtorno ou condição autoimune em um paciente.
E167. Uso de um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E114 e de El45 a E148, na fabricação de um medicamento para tratar uma doença, transtorno ou condição imunológica.
E168. Uso de uma composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das modalidades E149 e E150, na fabricação de um medicamento para tratar uma doença, transtorno ou condição imunológica.
E169. Método para tratar uma condição médica compreendendo administrar a um paciente que dele necessita uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E114 e de E145 a E148, ou da composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das modalidades E149 e E150.
E170. Método, de acordo com a modalidade E169, em que a condição é selecionada dentre o grupo composto por respostas inflamatórias, tais como doenças inflamatórias da pele incluindo psoríase e dermatite (por exemplo, dermatite atópica); dermatomiosite; esclerodermia e esclerose sistêmica; respostas associadas a doença inflamatória intestinal (tal como doença de Crohn e colite ulcerativa); síndrome do desconforto respiratório (incluindo síndrome do desconforto respiratório adultaá, ARDS); dermatite; meningite; encefalite; uveíte; colite; gastrite; glomerulonefrite; condições alérgicas tais como eczema e asma e outras condições que envolvem infiltração de células T e respostas inflamatórias crônicas; aterosclerose; deficiência na adesão leucocitária; artrite reumatoide; lúpus eritematoso sistêmico (LES); diabetes melito (por exemplo, diabetes melito tipo | ou diabetes melito dependente de insulina); esclerose múltipla; síndrome de Raynaud; tireoidite autoimune; encefalomielite alérgica; síndrome de Sjógren; diabetes com início na juventude; e respostas imunológicas associadas a hipersensibilidade aguda e retardada mediada por citocinas e T-linfócitos encontrados tipicamente na tuberculose, sarcoidose, polimiosite, granulomatose e vasculite; doença de Wegener; anemia perniciosa (doença de Addison); doenças que envolvem a diapedese leucocitária; transtorno inflamatório do sistema nervoso central (SNC); síndrome da lesão de múltiplos órgãos; anemia hemolítica (incluindo, entre outras, crioglobinemia ou anemia positiva para Coombs); miastenia grave; doenças mediadas pelo complexo antígeno-anticorpo; doença anti-membrana basal glomerular; síndrome antifosfolipídica; neurite alérgica; doença de Graves; síndrome miastênica de Lambert-Eaton; penfigoide bolhoso; penfigoide; poliendocrinopatias autoimunes; vitiligo; doença de Reiter; síndrome da pessoa rígida; doença de Bechet; arterite de células gigantes; nefrite do complexo imunológico; nefropatia por IgA; polineuropatias por IgM; púrpura trombocitopênica imune (ITP) ou trombocitopenia autoimune e doenças hemolíticas autoimunes; tireoidite de Hashimoto; hepatite autoimune; hemofilia autoimune; síndrome linfoproliferativa autoimune (ALPS); uveoretinite autoimune; síndrome de Guillain-Barré; síndrome de Goodpasture; doença mista do tecido conjuntivo; infertilidade associada a autoimunidade; poliarterite nodosa; alopecia areata; mixedema idiopático; doença do enxerto contra hospedeiro; distrofia muscular (Duchenne, Becker, Miotônica, Cinturas, Facioscapulohumeral, Congênita, Oculofaríngea, Distal, Emery-Dreifuss) e controle da proliferação de células do câncer que expressam o CXCRS5, tais como os cânceres de pâncreas, intestino e bexiga, leucemia de células T e leucemia de células B.
E171. Método para detectar o CXCR5 em uma amostra, tecido ou célula usando o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E1 a E114 e de E145 a E148, ou a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das modalidades E149 e E150, o método compreendendo colocar a amostra, tecido ou célula em contato com o anticorpo e detectar o anticorpo.
E172. Anticorpo isolado, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga-se especificamente ao CXCR5, em que o anticorpo é ao menos um anticorpo selecionado dentre o grupo composto por: (a) um anticorpo com uma CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2; uma CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 3; uma CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 4; uma CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 7; uma CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 8; e uma CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 9;
(b) um anticorpo com uma CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2; uma CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 3; uma CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 4; uma CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 7; uma CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 8; e uma CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 11;
(c) um anticorpo com uma CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 14; uma CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 15; uma CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 16; uma CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 19; uma CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 20; e uma CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 21;
(d) um anticorpo com uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos codificada pelo inserto do plasmídeo depositado junto à ATCC e com nº de Acesso PTA-124324 e uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos codificada pelo inserto do plasmídeo depositado junto à ATCC e com nº de Acesso PTA-124323;
(e) um anticorpo com uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1 e uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 6;
(f) um anticorpo com uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 13 e uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 18;
(g) um anticorpo com uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 47 e uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 52;
(h) um anticorpo com uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 5 e uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 6;
(i) um anticorpo com uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 5 e uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 10;
(]) um anticorpo com uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 13 e uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 17;
(k) um anticorpo com uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1 e uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 12;
(1) um anticorpo com uma LC que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 22 e uma HC que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 23;
(m) um anticorpo com uma LC que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 24 e uma HC que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 25;
(n) um anticorpo com uma LC que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 26 e uma HC que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 27;
(o) um anticorpo com uma LC que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 28 e uma HC que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 29; (p) um anticorpo com uma VL codificada pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nº: 95 e uma VH codificada pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nº: 96; e (q) um anticorpo com uma LC codificada pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nº: 97 e uma HC codificada pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nº: 98.
E173. Anticorpo isolado, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga-se especificamente ao receptor de quimiocinas C-X-C 5 (CXCR5), em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, é ao menos um anticorpo selecionado dentre o grupo composto por: (a) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se a um epítopo do hoXCR5 que compreende leucina no resíduo de aminoácido número 11, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32, mas não se liga ao referido epítopo quando o referido resíduo não é leucina; (b) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se a um epítopo do hoXCR5 que compreende leucina no resíduo de aminoácido número 11, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32, mas não se liga ao referido epítopo quando o referido resíduo é treonina; (c) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se a um epítopo do hOoXCR5 que compreende aspartato no resíduo de aminoácido número 22, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32, mas não se liga ao referido epítopo quando o referido resíduo não é aspartato;
(d) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se a um epítopo do hoXCR5 que compreende aspartato no resíduo de aminoácido número 22, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32, mas não se liga ao referido epítopo quando o referido resíduo é alanina;
(e) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se a um epítopo do hOoXCR5 que compreende leucina no resíduo de aminoácido número 11 e aspartato no resíduo de aminoácido número 22, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32, mas não se liga ao referido epítopo quando a referida leucina é substituída por treonina e/ou o referido aspartato é substituído por alanina;
(f) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se a um hoXCR5, ou fragmento do mesmo, que compreende leucina no resíduo de aminoácido número 11, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32, mas não se liga a um hoXCRS5, ou fragmento do mesmo, em que o referido resíduo não é leucina;
(g) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se a um hoXCR5, ou fragmento do mesmo, que compreende leucina no resíduo de aminoácido número 11, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32, mas não se liga a um hoXCR5, ou fragmento do mesmo, em que o referido resíduo é treonina;
(h) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se a um hoXCR5, ou fragmento do mesmo, que compreende aspartato no resíduo de aminoácido número 22, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32, mas não se liga a um hOCXCR5, ou fragmento do mesmo, em que o referido resíduo não é aspartato;
(i) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se a um hoXCR5, ou fragmento do mesmo, que compreende aspartato no resíduo de aminoácido número 22, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32, mas não se liga a um hOXCR5, ou fragmento do mesmo, em que o referido resíduo é alanina; e (]) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se a um hoXCR5, ou fragmento do mesmo, que compreende leucina no resíduo de aminoácido número 11 e aspartato no resíduo de aminoácido número 22, de acordo com a sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32, mas não se liga a um hOCXCRS5, ou fragmento do mesmo, em que a referida leucina é substituída por treonina e/ou o referido aspartato é substituído por alanina.
E174. Anticorpo isolado, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga-se especificamente ao receptor de quimiocinas C-X-C 5 (CXCR5), em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, é ao menos um anticorpo selecionado dentre o grupo composto por: (a) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se ao hoXCR5 expresso em células B humanas com uma afinidade aparente de uma EC50 de cerca de 6,60 pM com um desvio padrão de cerca de mais ou menos 2,33 pM; (b) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se ao hoXCR5 expresso em células similares a células T auxiliares foliculares humanas circulantes com uma afinidade aparente de uma EC50 de cerca de 5,89 PM com um desvio padrão de cerca de mais ou menos 1,40 pM; (c) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se ao hoXCR5 expresso em células similares a células T auxiliares foliculares humanas (Tfh) com uma afinidade aparente de uma EC50 de cerca de 10,6 pM; (d) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se ao cinoCXCR5 expresso em células B do macaco cinomolgo com uma afinidade aparente de uma EC50 de cerca de 1,32 pM;
(e) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se ao cinoCXCR5 expresso em células similares a Tfh do macaco cinomolgo com uma afinidade aparente de uma EC50 de cerca de 10,5 pM;
(f) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que antagoniza a sinalização de CXCR5-CXCL13 em um ensaio-repórter com CAMP com uma ECB50 de cerca de 961 pM;
(g) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que exibe atividade de ADCC contra células B humanas que expressam o hoXCR5 com uma EC50 de cerca de 2,01 pM com um desvio padrão de cerca de mais ou menos 2,28 pM;
(h) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que exibe atividade de ADCC contra células similares a Tfh humanas que expressam o hCXCR5 com uma EC50 de cerca de 4,28 pM com um desvio padrão de cerca de mais ou menos 2,88 pM;
(i) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que exibe atividade de ADCC contra células Tfh humanas que expressam o hoXCR5 com uma ECB50 de cerca de 0,11 pM;
(]) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que exibe atividade de ADCC contra células B do macaco cinomolgo que expressam o cinoCXCR5 com uma EC50 de cerca de 15,3 pM com um desvio padrão de cerca de mais ou menos 11,7 pM;
(k) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se ao hoXCR5 mas não se liga de maneira detectável aos receptores de quimiocinas humanos CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CMKLR1, CXCR3R1, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCRA4, CXCRG, CXCR7 e XCR1;
(1) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que inibe a ligação do CXCR5 com o CXCL13.
(m) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga-se a células B humanas CXCR5+ com uma afinidade aparente de uma EC50 de menos que cerca de 26 pM, mas não se liga a células que expressam ortólogos de camundongo, rato ou coelho do CXCR5; (n) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que antagoniza a inibição do CXCL13 à liberação de CAMP provocada pela forscolina; (o) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que provoca a ADCC de células que expressam o CXCR5 em PBMCs de doadores humanos e cinomolgas e TMCs de doadores humanos; (p) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se ao CXCR5 humano mas não se liga aos receptores de quimiocinas humanos CCR1, CCR2, CCR3, CCRA4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CMKLRI1, CXCR3R1, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCRA4, CXCR6, CXCR7 ou XCR1; (q) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que depleta células B no sangue periférico; (r) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que depleta células similares a Tfh no sangue periférico; (s) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que depleta células Tfh bona fide no baço; e (t) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que debilita a resposta da memória imunológica humoral.
E175. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E172 a E174, em que o referido anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, exibe ao menos uma das atividades biológicas a seguir:
(a) liga-se a células B humanas CXCR5+ com uma afinidade aparente de uma EC50 de menos que cerca de 26 pM, mas não se liga a células que expressam ortólogos de camundongo, rato ou coelho do CXCR5; (b) antagoniza a inibição do CXCL13 à liberação de CAMP provocada pela forscolina; (c) provoca a ADCC de células que expressam o CXCR5 em PBMCs de doadores humanos e cinomolgas e TMCs de doadores humanos; (d) liga-se ao CXCR5 humano mas não se liga aos receptores de quimiocinas humanos CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR1I0, CMKLR1, CXCR3R1, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCRA4, CXCRG6, CXCR7 ou XCR1; (e) depleta células B no sangue periférico; (f) depleta células similares a Tfh no sangue periférico; (g) depleta células Tfh bona fide no baço; ou (h) debilita a resposta da memória imunológica humoral.
E176. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E172 a E175, em que o referido anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, é afucosilado.
E177. Ácido nucleico isolado que codifica o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E172 a E176.
E178. Ácido nucleico isolado que codifica a VH, VL ou ambas de um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga-se especificamente ao CXCR5, em que o referido ácido nucleico compreende: a sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nº: 95, a sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nº: 96, ou ambas.
E179. Ácido nucleico isolado que codifica a cadeia pesada, cadeia leve ou ambas de um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se especificamente ao CXCR5, em que o referido ácido nucleico compreende: a sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nº: 97, a sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nº: 98, ou ambas.
E180. Ácido nucleico isolado que codifica a VH, VL ou ambas de um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga-se especificamente ao CXCR5, em que o referido ácido nucleico compreende a sequência de ácido nucleico do inserto do plasmídeo depositado junto à ATCC e com nº de Acesso PTA-124323, a sequência de ácido nucleico do inserto do plasmídeo depositado junto à ATCC e com nº de Acesso PTA-124324, ou ambas.
E181. Vetor compreendendo o ácido nucleico de acordo com qualquer uma das modalidades de E177 a E180.
E182. Célula hospedeira compreendendo o vetor de acordo com a modalidade E181.
E183. Célula hospedeira, de acordo com a modalidade E182, em que a referida célula hospedeira é uma célula de um mamífero selecionada dentre o grupo composto por uma célula CHO, uma célula COS, uma célula HEK-293, uma célula NSO, uma célula PER.C60 ou uma célula Sp2.0.
E184. Célula hospedeira, de acordo com a modalidade E183, em que a referida célula carece de uma alfa-1,6-fucosiltransferase (FUT8) funcional.
E185. Célula hospedeira, de acordo com a modalidade E184, em que a referida célula é uma célula CHOK1SV Potelligent& ou uma célula CHO Lec13.
E186. Método para produzir um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreendendo a célula CHOK1ISV Potelligent&O, de acordo com a modalidade E185, sob uma condição em que o referido anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, é expresso pela referida célula hospedeira e é afucosilado.
E187. Método, de acordo com a modalidade E186, compreendendo ainda isolar o referido anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo.
E188. Anticorpo afucosilado, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com a modalidade E186, em que o referido anticorpo exibe uma atividade de ADCC intensificada em comparação a um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que é fucosilado, mas fora isso idêntico.
E189. Composição farmacêutica compreendendo um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E172 a E176 e E148, e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
E190. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E172 a E176 e E188, e composição farmacêutica, de acordo com a modalidade E189, para uso no tratamento de uma doença, transtorno ou condição autoimune.
E191. Uso de um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E172 a E176 e E188, ou composição farmacêutica de acordo com a modalidade E189 para tratar uma doença, transtorno ou condição imunológica.
E192. Método para tratar ou prevenir uma doença, transtorno ou condição imunológica mediada pelo CXCR5 em um paciente humano que dele necessita, o referido método compreendendo administrar ao paciente uma quantidade eficaz da composição farmacêutica de acordo com a modalidade E189, em que a referida doença, transtorno ou condição é selecionada dentre o grupo composto por respostas inflamatórias tais como doenças inflamatórias da pele incluindo psoríase e dermatite (por exemplo, dermatite atópica); dermatomiosite; esclerodermia e esclerose sistêmica; respostas associadas a doença inflamatória intestinal (tal como doença de Crohn e colite ulcerativa); síndrome do desconforto respiratório (incluindo síndrome do desconforto respiratório adulta; ARDS); dermatite; meningite; encefalite; uveite; colite; gastrite; glomerulonefrite; condições alérgicas tais como eczema e asma e outras condições que envolvem a infiltração de células T e respostas inflamatórias crônicas; aterosclerose; deficiência na adesão leucocitária; artrite reumatoide (RA); lúpus eritematoso sistêmico (LES); diabetes melito (por exemplo, diabetes melito tipo 1 ou diabetes melito dependente de insulina); esclerose múltipla; síndrome de Raynaud; tireoidite autoimune; encefalomielite alérgica; síndrome de Sjógren; diabetes com início na juventude; e respostas imunológicas associadas a hipersensibilidade aguda e retardada mediada por citocinas e linfócitos T encontrados tipicamente na tuberculose, sarcoidose, polimiosite, granulomatose e vasculite; doença de Wegener; anemia perniciosa (doença de Addison); doenças que envolvem a diapedese leucocitária; transtorno inflamatório no sistema nervoso central (SNC); síndrome da lesão de múltiplos órgãos; anemia hemolítica (incluindo, entre outras, crioglobinemia ou anemia positiva para Coombs); miastenia grave; doenças mediadas pelo complexo antígeno-anticorpo; doença anti-membrana basal glomerular; síndrome antifosfolipídica; neurite alérgica; doença de Graves; síndrome miastênica de Lambert-Eaton; penfigoide bolhoso; penfigoide; poliendocrinopatias autoimunes; vitiligo; doença de Reiter; síndrome da pessoa rígida; doença de Bechet; artrite de células gigantes; nefrite do complexo imunológico; nefropatia por IgA; polineuropatias por IgM; púrpura trombocitopênica imunológica (ITP) ou trombocitopenia autoimune e doenças hemolíticas autoimunes; tireoide de Hashimoto; hepatite autoimune; hemofilia autoimune; síndrome linfoproliferativa autoimune (ALPS); uveoretinite autoimune; síndrome de Guillain-Barré; síndrome de Goodpasture; doença mista do tecido conjuntivo; infertilidade associada a autoimunidade; poliarterite nodosa; alopecia areata; mixedema idiopático; doença do enxerto contra hospedeiro; distrofia muscular (Duchenne, Becker, Miotônica, Cinturas, Facioscapulohumeral, Congênita, Oculofaríngea, Distal, Emery-Dreifuss) e controle da proliferação de células do câncer que expressam o CXCRS5, tais como os cânceres de pâncreas, intestino grosso e bexiga, leucemia de células T e leucemia de células B.
E193. Método, de acordo com a reivindicação E192, em que a referida doença é o LES ou a artrite reumatoide.
E194. Uso de um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E172 a E176 ou E188, na fabricação de um medicamento para tratar uma doença, transtorno ou condição imunológica.
E195. Método para detectar o CXCR5 em uma amostra, tecido ou célula usando o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E172 a E176, o método compreendendo colocar a amostra, tecido ou célula em contato com o anticorpo e detectar o anticorpo.
E196. Método para reduzir a atividade biológica do CXCR5 em um paciente que dele necessita, o referido método compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E172 a E176 ou E188, ou da composição farmacêutica de acordo com qualquer a modalidade E189.
E197. Método, de acordo com a modalidade E196, em que o anticorpo medeia a depleção de ao menos uma célula que expressa o CXCR5 selecionada dentre o grupo composto por uma célula Tfh no baço, uma célula B no sangue periférico e uma célula similar a Tfh no sangue periférico.
E198. Método para inibir uma resposta imunológica humoral em um paciente que dele necessita, o método compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades de E172 a E176 ou E188, ou da composição farmacêutica de acordo com qualquer a modalidade E189.
E199. Método, de acordo com a modalidade E198, em que o anticorpo medeia a depleção de ao menos uma célula que expressa o CXCR5 selecionada dentre o grupo composto por uma célula Tfh no baço, uma célula B no sangue periférico e uma célula similar a Tfh no sangue periférico.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[014]O sumário acima, bem como a descrição detalhada da invenção a seguir, será mais bem entendido quando lido tomando como referência os desenhos anexos. Com vistas a ilustrar a invenção, nos desenhos são representadas modalidades da mesma. Deve-se ter em mente, contudo, que a invenção não se limita às disposições e meios exatamente como representados.
[015]JA FIG. 1 é um diagrama que ilustra uma glicoforma biantenária canônica que se faz presente tipicamente em regiões constantes da cadeia pesada da imunoglobulina. O diagrama ilustra uma glicoforma ligada por asparagina (ligada por N) em um domínio constante da IgG no resíduo de aminoácido número 297 (Asparagina 297; Asn297) de acordo com a numeração Eu de Edelman et a/., 1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63(1):78-85, conforme descrita em Kabat et a/., 1991.
[016]As FIGs. 2A a 2G são um diagrama que ilustra exemplos de glicoformas biantenárias tipicamente presentes em regiões constantes da cadeia pesada da imunoglobulina. "GO" refere-se a uma estrutura biantenária em que nenhum ácido siálico (NeuAc) ou Gal terminal se faz presente, "G1" refere-se a uma estrutura biantenária com uma Gal e nenhum NeuAc, e "G2" refere-se a uma estrutura biantenária com duas Gals terminais e sem NeuAc. Em cada glicoforma, uma fucose se faz presente tipicamente em anticorpos produzidos em células de mamíferos, por exemplo, células CHO. A FIG. 2A ilustra G28S2, a FIG. 2B ilustra
G2S1, a FIG. 2C ilustra G2, a FIG. 2D ilustra G1, a FIG. 2E ilustra GO, a FIG. 2F ilustra G-1, e a FIG. 2G ilustra G-2.
[017]FIG. 3 ilustra um gráfico de barras que representa a ligação de vários anticorpos monoclonais (indicados no eixo x) com células HEK 293 que expressam o CXCR5 humano (hCXCR5 293) (barras mais claras) e/ou com células HEK 293 que expressam o CXCR5 cinomolgo (cinoCXCR5 293) (barras mais escuras). Os anticorpos monoclonais ilustrados na FIG. 3 são, da esquerda para a direita, 11B9, 18C7, 21A3, 23F1, 30C3, 31F3, 39H4, 47D11, 51D11, 52E7, 56A9, 56G2, 57H5, 58C12, 59F3, 4F1, 6E9, 12E11, 16D10, 18G4, 19D9, 19F8, 20G4, 26E2, 41A10, 48A10, 13F4, 17D5, 18H9, 23C6, 1A11, 1D10, 1011, 3A1, 5H3, 6D6, 9G11, 10G2, 12C1, 12C3, 15A11, 15C10, 15D5, 18A11, 19C11, 20D10, 21B2, 21G3, 25D4, 25E1, 5H7, 1162, 18B11, 23D5, 23F7, 31E5, 19G2 e 31G7.
[018]A FIG. 4A ilustra um diagrama que representa a ausência de ligação detectável de vários anticorpos anti-CXCR5 com células que expressam o CXCR1.
[019]A FIG. 4B ilustra um diagrama que representa a ausência de ligação de vários anticorpos anti-CXCR5 com células que expressam o CXCR?2.
[020]A FIG. 4C ilustra um diagrama que representa a ausência de ligação de vários anticorpos anti-CXCR5 com células que expressam o CXCR3.
[021]A FIG. 4D ilustra um diagrama que representa a ligação de vários anticorpos anti-cCXCR5 com células Jurkat que expressam naturalmente o CXCRA4.
[022]A FIG. 5 ilustra um gráfico que representa a afinidade de ligação com células de anticorpos que expressam o CXCR5: XC154/XKC155 do h11G2 afucosilado (círculos vazios), XC154/XC155 do h11G2 fucosilado (círculos pintados), 2C9 (triângulos pintados), 16D7 (quadrados pintados) e 11A7 (losangos pintados).
[023]A FIG. 6 ilustra o alinhamento de uma sequência de aminoácidos do CXCR5 humano e uma sequência de aminoácidos do CXCR5 de camundongo. À figura também ilustra vários domínios extracelulares do CXCRS5, indicados por "N," "L1", "L2" e "L3", que foram sublinhados.
[024]A FIG. 7 ilustra um gráfico de barras que demonstra que certos resíduos de aminoácido foram fundamentais para a ligação do anticorpo com o hCXCR5. Ou seja, trocar D10G ou introduzir SI na sequência humana aboliu a ligação com o anticorpo 2C9 mas não afetou a ligação com os outros três anticorpos. Mais importantemente, substituir L11T ou D22A aboliu a ligação com o 11G2 mas não afetou a ligação com 2C9, 16D7 ou 11A7. Trocar W por K no resíduo de aminoácido número 19 (W19K) aboliu a ligação com os anticorpos 16D7 e 11A7 mas não afetou a ligação com 11G2 e 2C9. Esses dados demonstram que esses quatro anticorpos não compartilham o mesmo epítopo no hoXCR5.
[025]A FIG. 8A ilustra um gráfico que representa a depleção e reconstrução de células B do sangue periférico em macacos cinomolgos machos. O número de células B do sangue periférico por ul de sangue nos machos é dado até o Dia 352 em um estudo de toxicidade exploratório. As células B foram definidas como CD3-CD20+. São exibidos os dados individuais dos animais. A variação histórica de células B em macacos machos (272 a 2.503 células por uL) é indicada em linhas pontilhadas.
[026]A FIG. 8B ilustra um gráfico que representa a depleção e reconstrução de células B do sangue periférico em macacos cinomolgos fêmeos. O número de células B do sangue periférico por pl de sangue nas fêmeas é dado até o Dia 352 em um estudo de toxicidade exploratório. As células B foram definidas como CD3-CD20+. São exibidos os dados individuais dos animais. A variação histórica de células B em macacos fêmeos (233 a 1.700 células por uL) é indicada em linhas pontilhadas.
[027]A FIG. 8C ilustra um gráfico que representa a depleção e reconstrução de células similares a Tfh (também chamadas de células "cTfh" ou células "Tfh circulantes") em macacos cinomolgos machos. O número de células similares a Tfh do sangue periférico por ul de sangue nos machos é dado até o Dia 352 em um estudo de toxicidade exploratório. As células similares a Tfh foram definidas pela soma de células CD3+CD4+CD95+CXCR5+ e células CD3+CD4+CD95+hlgG+, porque o artigo de teste interfere no anticorpo do CXCR5 usado para imunofenotipagem. São exibidos os dados individuais dos animais.
[028]A FIG. 8D ilustra um gráfico que representa a depleção e reconstrução de células similares a Tfh (também chamadas de células "cTfh" ou células "Tfh circulantes") em macacos cinomolgos fêmeos. O número de células similares a Tfh do sangue periférico por ul de sangue nas fêmeas é dado até o Dia 352 em um estudo de toxicidade exploratório. As células similares a Tfh foram definidas pela soma de células CD3+CD4+CD95+CXCR5+ e células CD3+CD4+CD95+hlIgG+, porque o artigo de teste interfere no anticorpo do CXCR5 usado para imunofenotipagem. São exibidos os dados individuais dos animais.
[029]A FIG. 9A ilustra um gráfico que representa a depleção e reconstrução de células B do sangue periférico em macacos cinomolgos. O número de células B do sangue periférico por ul de sangue em macacos é dado até o Dia 393 em um estudo de toxicidade GLP pivô. As células B foram definidas como células CD3- CD20+ HLA-DR+. São exibidos os dados de média dos grupos (machos e fêmeas combinados) + desvio padrão.
[030]A FIG. 9B ilustra um gráfico que representa a depleção e reconstrução de células B do sangue periférico CXCR5+ em macacos cinomolgos. O número de células B do sangue periférico CXCR5+ por ul de sangue em macacos é dado até o Dia 393 em um estudo de toxicidade GLP pivô. As células B foram definidas como células CD3-CD20+ HLA-DR+. São exibidos os dados de média dos grupos (machos e fêmeas combinados) + desvio de padrão.
[031]A FIG. 9C ilustra um gráfico que representa a depleção e reconstrução de células T auxiliares foliculares circulantes (cTfh; também chamadas em outras partes de "células similares a Tfh") do sangue periférico em macacos cinomolgos. O número de células cTfh do sangue periférico por ul de sangue em macacos é dado até o Dia 393 em um estudo de toxicidade GLP pivô. As células cTfh foram definidas como células CD3+CD4+CD95+. São exibidos os dados de média dos grupos (machos e fêmeas combinados) + desvio de padrão.
[032]A FIG. 9D ilustra um gráfico que representa a depleção e reconstrução de células cTfh (também chamadas em outras partes de "células similares a Tfh") do sangue periférico CXCR5+ com o CXCR5 detectável na superfície em macacos cinomolgos. O número de células cTfh do sangue periférico CXCR5+ por ul de sangue em macacos é dado até o Dia 393 em um estudo de toxicidade GLP pivô. As células cTfh foram definidas como células CD3+CD4+CD95+. São exibidos os dados de média dos grupos (machos e fêmeas combinados) + desvio de padrão.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[033]Neste — documento, são revelados anticorpos que ligam-se especificamente ao CXCR5 e também anticorpos que antagonizam a atividade do CXCR5 ou sua interação com o CXCL13. São propostos métodos para produzir anticorpos do CXCR5, composições compreendendo esses anticorpos e métodos para usar esses anticorpos.
[034]São propostos anticorpos fucosilados e afucosilados que ligam-se ao CXCR5. Em algumas modalidades, também são propostas cadeias pesadas e cadeias leves de anticorpos afucosilados que são capazes de formar anticorpos que ligam-se ao CXCR5. Em algumas modalidades, são propostos anticorpos afucosilados, cadeias pesadas e cadeias leves compreendendo uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) específicas. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-cCXCR5 afucosilados têm uma função efetora alterada. Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção têm a atividade de ADCC intensificada em relação a anticorpos anti-cOCXCR5 da invenção que são fucosilados, mas fora isso idênticos.
[035]São propostos polinucleotídeos que codificam anticorpos que ligam-se ao CXCR5, ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos. Também são propostos polinucleotídeos que codificam cadeias pesadas ou cadeias leves de anticorpo. São propostas células hospedeiras que expressam anticorpos anti- CXCRS5 fucosilados e/ou afucosilados. São propostos métodos de tratamento que usam anticorpos do CXCR5 afucosilados e fucosilados. Esses métodos incluem, entre outros, métodos para tratar doenças associadas à ou mediadas pela expressão e/ou ligação do CXCR5 com o CXCL13, incluindo, entre outras, doenças inflamatórias e imunológicas.
[036]Os títulos das seções usados neste documento servem somente para fins de organização e não devem ser interpretados de modo a limitar a matéria inventiva descrita.
[037]Todas as referências citadas neste documento, inclusive pedidos de patente, publicações de patente e números de Acesso no Genbank, incorporam-se ao presente documento por referência como se cada uma delas fosse indicada individual e especificamente como incorporada por referência ao presente documento na íntegra.
[038]As técnicas e procedimentos descritos ou aludidos neste documento são geralmente bem entendidos e comumente empregados usando metodologias convencionais pelos versados na técnica, tais como, por exemplo, as metodologias difundidamente usadas descritis em Sambrook et al, Molecular Cloning. À Laboratory Manual, 3º edição (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et a/. ed., (2003)); a série METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press,
Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames e G. R. Taylor ed. (1995)), Harlow e Lane, ed. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R. |. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. |. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather e P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, e D. G. Newell, ed., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weire C. C. Blackwell, eds); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller e M. P. Calos, ed., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et a/., ed., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et a/., ed., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley e Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway e P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd e C. Dean, ed., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: À Laboratory Manual (E. Harlow e D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)); The Antibodies (M. Zanetti e J. D. Capra, ed., Hanwood Academic Publishers, 1995); e Cancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita et a/l., ed., J.B. Lippincott Company, 1993); e versões atualizadas dos mesmos.
[039]Os anticorpos do CXCR5, sejam eles fucosilados ou afucosilados, podem ser usados na prevenção, tratamento e/ou melhoria de doenças, transtornos ou condições causados por e/ou associados à atividade do CXCR5. Essas doenças, transtornos ou condições incluem, entre outros, respostas inflamatórias tais como lúpus eritematoso sistêmico (LES); respostas inflamatórias crônicas; aterosclerose; deficiência na adesão leucocitária; artrite reumatoide; diabetes melito (por exemplo, diabetes melito tipo | ou diabetes melito dependente de insulina); esclerose múltipla;
síndrome de Raynaud; tireoide autoimune; encefalomielite alérgica; síndrome de Sjôgren; diabetes com início na juventude; e respostas imunológicas associadas a hipersensibilidade aguda e retardada mediada por citocinas e linfócitos T encontrados tipicamente na tuberculose, sarcoidose, polimiosite, granulomatose e vasculite; doença de Wegener; anemia perniciosa (doença de Addison); doenças que envolvem a diapedese leucocitária; transtorno inflamatório no sistema nervoso central (SNC); síndrome da lesão de múltiplos órgãos; anemia hemolítica (incluindo, entre outras, crioglobulinemia ou anemia positiva para Coombs); miastenia grave; doenças mediadas pelo complexo antígeno-anticorpo; doença anti-membrana basal glomerular; síndrome antifosfolipídica; neurite alérgica; doença de Graves; síndrome miastênica de Lambert-Eaton; penfigoide bolhoso; penfigoide; poliendocrinopatias autoimunes; vitiligo; doença de Reiter; síndrome da pessoa rígida; doença de Bechet; arterite de células gigantes; nefrite do complexo imunológico; nefropatia por IgA; polineuropatias por IgM; púrpura trombocitopênica imunológica (ITP) ou trombocitopenia autoimune e doenças hemolíticas autoimunes; tireoidite de Hashimoto; hepatite autoimune; hemofilia autoimune; síndrome linfoproliferativa autoimune (ALPS); uveorretinite autoimune; síndrome de Guillain-Barré; síndrome de Goodpasture; doença mista do tecido conjuntivo; infertilidade associada a autoimunidade; poliarterite nodosa; alopecia areata; mixedema idiopático; doença do enxerto contra hospedeiro; distrofia muscular (Duchenne, Becker, Miotônica, Cinturas, Facioscapulohumeral, Congênita, Oculofaríngea, Distal, Emery-Dreifuss), e controle da proliferação de células do câncer que expressam o CXCRS5, tais como os cânceres de pâncreas, intestino e bexiga, leucemia de células T e leucemia de células B, como apreciarão os versados na técnica a que pertencem os ensinamentos revelados neste documento. |. Definições
[040]A presente invenção pode ser entendida mas prontamente mediante referência à descrição detalhada a seguir de modalidades exemplificativas da invenção e aos exemplos nela incluídos.
[041]Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado de conhecimento geral por parte dos versados na técnica a que pertence a presente invenção. Em caso de conflito, o presente documento, incluindo suas definições, prevalecerá.
[042]Além disso, salvo quando o contexto ditar o contrário ou indicação expressa em contrário, os termos no singular incluem o plural e os termos no plural incluem o singular.
[043]Deve-se ter em mente que os aspectos e modalidades da invenção descritos neste documento incluem "consistir em" e/ou "consistir essencialmente em" aspectos e modalidades. Conforme usadas neste documento, as formas no singular "um", "uma", "o" e "a" incluem as referências no plural, salvo indicação em contrário.
[044]Neste pedido, o uso de "ou" significa "e/ou", salvo menção em contrário ou entendimento em contrário pelos versados na técnica. No contexto de uma reivindicação com múltiplas dependências, o uso de "ou" remete a mais de uma reivindicação independente ou dependente anterior.
[045]"Cerca de" ou "aproximadamente", quando usados em conexão a uma variável numérica mensurável, referem-se ao valor indicado da variável e a todos os valores da variável que enquadrem-se dentro do erro experimental do valor indicado (por exemplo, dentro do intervalo de confiança de 95% da média) ou dentro de 10% do valor indicado, o que for maior. As faixas numéricas incluem os números-limite que as definem.
[046]Não obstante as faixas numéricas e parâmetros que definem o vasto âmbito da invenção serem aproximações, os valores numéricos definidos nos exemplos específicos são dados com o máximo de precisão possível. Qualquer valor numérico, contudo, contém inerentemente certos erros necessariamente decorrentes do desvio padrão encontrado em suas respectivas medições de teste. Ademais, todas as faixas reveladas neste documento devem ser interpretadas de modo a abranger toda e qualquer subfaixa incluída dentro delas. Por exemplo, uma faixa mencionada de "1 a 10" deve ser considerada de modo a incluir toda e qualquer subfaixa entre o valor mínimo de 1 (inclusive) e o valor máximo de 10 (inclusive); ou seja, todas as subfaixas que comecem com um valor mínimo de 1 ou mais, por exemplo, 1 a 6,1, e terminem com um valor máximo de 10 ou menos, por exemplo, 5,5a10.
[047]AÃo longo de todo o relatório descritivo e reivindicações, deve-se interpretar a palavra "compreender", ou variações como "compreende" ou "compreendendo", de modo a implicar na inclusão de um número inteiro mencionado ou grupo de números inteiros mencionados, mas não na exclusão de nenhum outro número inteiro ou grupo de números inteiros. Além disso, salvo quando o contexto ditar o contrário, os termos no singular incluirão o plural e os termos no plural incluirão o singular. Quaisquer um ou mais exemplos após o termo "por exemplo" não visam a ser exaustivos ou limitantes.
[048]Deve-se ter em mente que, sempre que as modalidades forem descritas neste documento com o sintagma "compreender", modalidades descritas em termos de "consistir em" e/ou "consistir essencialmente em", fora isso análogas, também são propostas.
[049] Quando aspectos ou modalidades da invenção são descritos nos termos de um grupo de Markush ou de outros conjuntos de alternativas, a presente invenção abrange não só o grupo listado como um todo mas também cada membro do grupo individualmente e todos os possíveis subgrupos do grupo principal, bem como o grupo principal sem um ou mais membros do grupo. A presente invenção também contempla a exclusão explícita de um ou mais de quaisquer membros de um grupo na invenção reivindicada.
[050]Deve-se ter em mente que a terminologia usada na presente invenção serve apenas para fins de descrever modalidades específicas e não tem a intenção de limitá-la. Neste relatório descritivo, e nas reivindicações que o seguem, far-se-á referência a uma série de termos que serão definidos com os significados seguir:
[051]o termo "molécula isolada" (quando a molécula é, por exemplo, um polipeptídeo, um polinucleotídeo, ou um anticorpo ou fragmento do mesmo) é uma molécula que, em virtude de sua origem ou fonte de derivação, (1) não se associa a componentes naturalmente associados que acompanham-na em seu estado nativo, (2) é substancialmente isenta de outras moléculas da mesma espécie, (3) é expressa por uma célula de uma espécie diferente ou (4) não ocorre na natureza. Sendo assim, uma molécula que é quimicamente sintetizada, ou expressa em um sistema celular diferente da célula da qual se origina naturalmente, será "isolada" de seus componentes naturalmente associados. Uma molécula também pode se tornar substancialmente isenta de componentes naturalmente associados por isolamento usando técnicas de purificação bem conhecidas no setor. A pureza ou homogeneidade da molécula podem ser examinadas por uma variedade de meios bem conhecidos no setor. Por exemplo, a pureza de uma amostra de polipeptídeo pode ser examinada por eletroforese em gel de poliacrilamida e coloração do gel para visualizar o polipeptídeo usando técnicas bem conhecidas no setor. Para certas finalidades, uma resolução mais alta pode ser obtida por HPLC ou outro meio de purificação bem conhecido no setor.
[052]Conforme usado neste documento, "substancialmente pura" significa que uma espécie objeto é a espécie predominantemente presente (isto é, em base molar, é mais abundante do que qualquer outra espécie individual na composição), e, de preferência, uma fração substancialmente purificada é uma composição em que a espécie objeto (por exemplo, uma glicoproteína, incluindo um anticorpo ou receptor) compreende ao menos 50% (em base molar) de todas as espécies macromoleculares presentes. Em termos gerais, uma composição substancialmente pura compreenderá mais que cerca de 80% de todas as espécies macromoleculares presentes na composição, mais preferivelmente mais que cerca de 85%, 90%, 95% e 99%. Mais preferivelmente ainda, a espécie objeto é purificada à homogeneidade essencial (a espécie contaminante não pode ser detectada na composição por métodos de detecção convencionais), em que a composição é composta essencialmente por uma única espécie macromolecular. Em certas modalidades, um material substancialmente puro é ao menos 50% puro (isto é, isento de contaminantes), mais preferivelmente ao menos 90% puro, mais preferivelmente ao menos 95% puro, ainda mais preferivelmente ao menos 98% puro, e mais preferivelmente ainda ao menos 99% puro.
[053]O termo "identidade", como é de conhecimento na técnica, refere-se a uma relação entre as sequências de duas ou mais moléculas de polipeptídeo ou duas ou mais moléculas de ácido nucleico, conforme determinada comparando-se as sequências. Na técnica, "identidade" também significa o grau de relação de sequência entre sequências de moléculas de polipeptídeo ou ácido nucleico, como for o caso, conforme determinado pelo número de correspondências entre fileiras de sequências de nucleotídeos ou aminoácidos. "Identidade" mede a porcentagem de correspondências idênticas entre duas ou mais sequências com o alinhamento das lacunas resolvido por um modelo matemático específico de programas de computador (isto é, "algoritmos").
[054]O termo "similaridade" é um conceito relativo, mas, à diferença de "identidade", refere-se a uma medida de similaridade que inclui tanto correspondências idênticas quanto correspondências de substituição conservadora. Visto que substituições conservadoras aplicam-se a polipeptídeos e não a moléculas de ácido nucleico, a similaridade só se refere a comparações de sequências de polipeptídeo. Se duas sequências de polipeptídeo tiverem, por exemplo, 10 de 20 aminoácidos idênticos, e todos os demais forem substituições não conservadoras, logo os percentuais de identidade e similaridade seriam ambos de 50%. Se, no mesmo exemplo, houver mais 5 posições onde há substituições conservadoras, logo o percentual de identidade permanecerá de 50%, mas o percentual de similaridade seria de 75% (15 de 20). Sendo assim, nos casos em que há substituições conservadoras, o grau de similaridade entre duas sequências de polipeptídeo será mais alto do que a porcentagem de identidade entre essas duas sequências.
[055]"Fragmentos" ou "porções" de polipeptídeo ou anticorpo, de acordo com a presente invenção, podem ser obtidos pelo truncamento, por exemplo, pela remoção de um ou mais aminoácidos das extremidades N- e/ou C-terminais de um polipeptídeo. Até 10, até 20, até 30, até 40 ou mais aminoácidos podem ser removidos do terminal N e/ou C dessa maneira. Fragmentos ou porções também podem ser gerados por uma ou mais deleções internas.
[056]Um anticorpo variante pode compreender 1, 2, 3, 4, 5, até 10, até 20, até 30 ou mais substituições e/ou deleções e/ou introduções de aminoácidos nas sequências e fragmentos específicos discutidos acima. Variantes por "deleção" podem compreender a deleção de aminoácidos individuais, a deleção de pequenos grupos de aminoácidos, tais como de 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos, ou a deleção de regiões de aminoácidos maiores, tal como a deleção de domínios de aminoácidos específicos ou com outras características. Variantes por "introdução" podem compreender a introdução de aminoácidos individuais, a introdução de pequenos grupos de aminoácidos, tais como de 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos, ou a introdução de regiões de aminoácidos maiores, tal como a introdução de domínios de aminoácidos específicos ou com outras características. Variantes por "substituição" envolvem, de preferência, a substituição de um ou mais aminoácidos pelo mesmo número de aminoácidos e à realização de substituições de aminoácido conservadoras. Por exemplo, um aminoácido pode ser substituído por um aminoácido alternativo com propriedades semelhantes, por exemplo, por outro aminoácido básico, por outro aminoácido ácido, por outro aminoácido neutro, por outro aminoácido carregado, por outro aminoácido hidrófilo, por outro aminoácido hidrófobo, por outro aminoácido polar, por outro aminoácido aromático ou por outro aminoácido alifático. Algumas propriedades dos 20 aminoácidos principais que podem ser usadas para selecionar substituintes adequados são de acordo com o seguinte.
[057]As variantes por substituição têm ao menos um resíduo de aminoácido na molécula do anticorpo removido e um resíduo diferente introduzido em seu lugar. Os locais de maior interesse para a mutagênese substitutiva incluem as regiões hipervariáveis, mas alterações de framework também são contempladas. Substituições conservadoras são dadas na Tabela 1 na coluna de "substituições conservadoras". Se essas substituições resultaraem em uma mudança na atividade biológica, logo mudanças mais significativas, denominadas "substituições exemplificativas" na tabela abaixo, ou conforme descritas em mais detalhes abaixo com referência às classes de aminoácido, podem ser introduzidas e os produtos, triados.
TABELA 1 Aminoácidos e Substituições Resíduo original conservadoras exemplificativas va Gl; so ao EE EEE Resíduo original conservadoras exemplificativas ms o E isoleucina lle (1) Leu Norleucina a o EA leucina Leu (L) Ala; Phe eme de ESTA valina Val (V) Leu Norleucina
[058]Modificações significativas nas propriedades biológicas do anticorpo são consumadas selecionando substituições que diferem significativamente em seu efeito sobre manter (a) a estrutura do backbone de polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma conformação em folha-beta ou beta-helicoidal, (b) a carga ou hidrofobia da molécula no sítio alvo, ou (c) o grosso da cadeia lateral. Os resíduos de ocorrência natural são divididos em grupos com base nas propriedades em comum das cadeias laterais:
i. Apolares: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lle; ii. Polares sem carga: Cys, Ser, Thr, Asn, GIn; ii. Ácidos (de carga negativa): Asp, Glu; iv. Básicos (de carga positiva): Lys, Arg; v. Resíduos que influenciam na orientação das cadeias: Gly, Pro; e vi. Aromáticos: Trp, Tyr, Phe, His.
[059]Substituições não conservadoras são obtidas trocando um membro de uma dessas classes por outra.
[060]Um tipo de substituição, por exemplo, que pode ser feita consiste em trocar uma ou mais cisteínas no anticorpo, que podem ser quimicamente reativas, por outro resíduo, tal como, entre outros, alanina ou serina. Por exemplo, pode haver uma substituição de uma cisteína não canônica. A substituição pode ser feita em uma CDR ou região de framework de um domínio variável ou na região constante de um anticorpo. Em algumas modalidades, a cisteína é canônica. Qualquer resíduo de cisteína não envolvido em manter a conformação apropriada do anticorpo também pode ser substituído, geralmente por serina, para aprimorar a estabilidade oxidativa da molécula e prevenir a reticulação anômala. Inversamente, uma ou mais ligações de cisteína podem ser adicionadas ao anticorpo para melhorar sua estabilidade, em particular quando o anticorpo for um fragmento de anticorpo, tal como um fragmento Fv.
[061]Um "anticorpo" é uma molécula de imunoglobulina capaz da ligação específica com um alvo, tal como um carboidrato, polinucleotídeo, lipídio, polipeptídeo etc., através de ao menos um sítio de reconhecimento de antígeno, localizado na região variável da molécula de imunoglobulina. Conforme usado neste documento, o termo abrange não só anticorpos policlonais ou monoclonais intactos, mas também, salvo especificação em contrário, qualquer fragmento de ligação com antígeno dos mesmos que compita com o anticorpo intacto pela ligação específica,
proteínas de fusão compreendendo um fragmento de ligação com antígeno, e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreenda um sítio de reconhecimento de antígeno. Fragmentos de ligação com antígeno incluem, por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, anticorpos de domínio (dAbs, por exemplo, anticorpos de tubarões e camelídeos), fragmentos com regiões determinantes de complementaridade (CDRs), anticorpos em fragmento variável de cadeia única (scFv), maxicorpos, minicorpos, intracorpos, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, v-NAR e bis-scFv, e polipeptídeos contendo ao menos um fragmento de uma imunoglobulina suficiente para prover uma ligação com antígeno específica do polipeptídeo. Um anticorpo inclui um anticorpo de qualquer classe, tal como IgG, IgA ou IgM (ou subclasse das mesmas), e o anticorpo não precisa ser de nenhuma classe em particular. Dependendo da sequência de aminoácidos de anticorpo da região constante de suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes. Há cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, 1gD, IgE, IgG e IgM, e muitas dessas podem ser adicionalmente divididas em subclasses (isótipos), por exemplo, IgG1, IgG2, I9G3, IgGa, IgA: e IgÃ2. As regiões constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulina são chamadas de alfa, delta, épsilon, gama e mu, respectivamente. As estruturas de subunidade e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.
[062]Os termos "porção de ligação com antígeno" ou "fragmento de ligação com antígeno" de um anticorpo (ou simplesmente "porção de anticorpo"), conforme usados de maneira intercambiável neste documento, referem-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que mantêm a capacidade de ligar-se especificamente a um antígeno (por exemplo, CXCRS5). Foi demonstrado que a função de ligação com antígeno de um anticorpo pode ser consumada por fragmentos de um anticorpo de comprimento total. Exemplos de fragmentos de ligação abrangidos pelo termo
"fragmento de ligação com antígeno" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, fragmento monovalente composto pelos domínios de VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab')2, fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fd composto pelos domínios de VH e CH1; (iv) um fragmento Fv composto pelos domínios de VL e VH de um único braço de um anticorpo; (v) um fragmento dAb (Ward et a/., (1989) Nature 341:544-546), que consiste em um domínio de VH; e (vi) uma região determinante de complementaridade (CDR) isolada, Fvs ligados por dissulfeto (dsFv) e anticorpos e intracorpos anti-idiotípicos (anti-ld). Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes distintos, eles podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um ligante sintético que permita que eles sejam produzidos como uma cadeia de proteína única na qual as regiões de VL e VH pareiam-se para formar moléculas monovalentes (conhecida como Fv de cadeia única (scFv)); vide, por exemplo, Bird et al. Science 242:423-426 (1988) e Huston et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)). Também tenciona-se que esses anticorpos de cadeia única sejam abrangidos pelo termo "fragmento de ligação com antígeno" de um anticorpo. Outras formas de anticorpos de cadeia única, tais como diacorpos, também são contempladas. Diacorpos são anticorpos bivalentes e biespecíficos nos quais os domínios de VH e VL são expressos em uma cadeia de polipeptídeo única, mas usando um ligante que é curto demais para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, forçando assim os domínios a parear com domínios complementares de outra cadeia e criando dois sítios de ligação com antígeno (vide, por exemplo, Holliger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993); Poljak et a/., 1994, Structure 2:1121- 1123).
[063]Os anticorpos podem ser derivados de qualquer mamífero, incluindo, entre outros, seres humanos, macacos, porcos, cavalos, coelhos, cães, gatos,
camundongos etc. ou outros animais como aves (por exemplo, frangos), peixes (por exemplo, tubarões) e camelídeos (por exemplo, lhamas).
[064]Uma "região variável" de um anticorpo refere-se à região variável da cadeia leve (VL) do anticorpo ou à região variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo, ou à parte ou em combinação. Como é de conhecimento na técnica, cada uma das regiões variáveis das cadeias pesada e leve consiste em quatro regiões de framework (FRs) conectadas por três "regiões determinantes de complementaridade (CDRs)", também conhecidas como regiões hipervariáveis (HVR), e contribuem para a formação do sítio de ligação com antígeno dos anticorpos. Se variantes de dada região variável forem desejadas, em particular com substituição nos resíduos de aminoácido fora de uma região CDR (isto é, na região de framework), uma substituição de aminoácidos apropriada, de preferência uma substituição de aminoácidos conservadora, pode ser identificada comparando-se a dada região variável às regiões variáveis de outros anticorpos que contenham sequências de CDR1 e CDR2 na mesma classe canônica que a dada região variável (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196(4): 901-917, 1987).
[065]EmM certas modalidades, a delineação definitiva de uma CDR e identificação dos resíduos que compõem o sítio de ligação de um anticorpo são obtidas resolvendo a estrutura do anticorpo e/ou resolvendo a estrutura do complexo anticorpo-ligante. Em certas modalidades, isso pode ser obtido por qualquer variedade de técnicas conhecidas pelos versados no setor, tais como cristalografia de raios X. Em certas modalidades, vários métodos de análise podem ser empregados para identificar ou aproximar as regiõês CDR. Em certas modalidades, vários métodos de análise podem ser empregados para identificar ou aproximar as regiões CDR. Exemplos desses métodos incluem, entre outros, a definição por Kabat, a definição por Chothia, a definição por ADM, a definição por contato e a definição conformacional.
[066]A definição por Kabat é um padrão para numerar os resíduos em um anticorpo e é tipicamente usada para identificar regiões CDR. Vide, por exemplo, Johnson & Wu, 2000, Nucleic Acids Res., 28: 214-8. A definição por Chothia é semelhante à definição por Kabat, mas leva em consideração posições de certas regiões de loop estrutural. Vide, por exemplo, Chothia et a/., 1986, J. Mol. Biol., 196: 901-17; Chothia et a/., 1989, Nature, 342: 877-83. A definição por ADM utiliza um conjunto integrado de programas de computador produzido pela Oxford Molecular Group que modela a estrutura dos anticorpos. Vide, por exemplo, Martin et a/., 1989, Proc Natl Acad Sci (USA), 86:9268-9272; "ADbM'Y, A Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies," Oxford, UK; Oxford Molecular, Ltd. À definição por ADM modela a estrutura terciária de um anticorpo a partir da sequência primária usando uma combinação de banco de dados de conhecimento e métodos ab initio, como os descritos por Samudrala et a/., 1999, "Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach" em PROTEINS, Structure, Function and Genetics Suppl., 3:194-198.
[067]A definição por contato baseia-se em uma análise das estruturas cristalinas disponíveis dos complexos. Vide, por exemplo, MacCallum et a/., 1996, J. Mol. Biol., 5:732-45. Em outra abordagem, chamada neste documento de "definição conformacional" das CDRs, as posições das CDRs podem ser identificadas como os resíduos que fazem contribuições entálpicas à ligação com o antígeno. Vide, por exemplo, Makabe et a/., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166. Ainda outras definições de limites das CDRs podem não seguir estritamente nenhuma das abordagens acima, mas ainda assim sobrepor-se-ão a ao menos parte das CDRs de Kabat, embora possam ser encurtadas ou alongadas à luz da predição ou de descobertas experimentais de quais resíduos específicos ou grupos de resíduos específicos não impactam significativamente na ligação com o antígeno. Conforme usado neste documento, uma CDR pode referir-se a CDRs definidas por qualquer abordagem conhecida no setor, inclusive por combinações de abordagens. O método adotado neste documento pode fazer uso de CDRs definidas de acordo com qualquer uma dessas abordagens. Para qualquer dada modalidade que contenha mais de uma CDR, as CDRs podem ser definidas de acordo com qualquer uma das definições por Kabat, Chothia, estendida, ADM, por contato e/ou conformacional.
[068]"Resíduo de contato", conforme usado neste documento em associação a um anticorpo ou antígeno ligado especificamente ao mesmo, refere-se a um resíduo de aminoácido presente em um anticorpo/antígeno que compreende ao menos um átomo pesado (isto é, não hidrogênio) que encontra-se a 4 À ou menos de um átomo pesado de um resíduo de aminoácido presente no anticorpo/antígeno cognato.
[069]Resíduos de "framework" (FR) são resíduos de domínio variável do anticorpo diferentes dos resíduos da CDR. Um framework de domínio de VH ou VL compreende quatro sub-regiões de framework, FR1, FR2, FR3 e FRA, intercaladas com CDRs na estrutura a seguir: FR1 — CDR1 — FR2 — CDR2 — FR3 — CDR3 — FRA.
[070]Conforme mencionado previamente, os resíduos em um domínio variável são tipicamente numerados de acordo com Kabat, que é um sistema de numeração usado para domínios variáveis de cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve da compilação de anticorpos. Vide, Kabat et a/., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. Usando esse sistema de numeração, a sequência de aminoácidos linear real pode conter menos ou mais aminoácidos correspondentes ao encurtamento de, ou à introdução em, um FR ou CDR do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incluir um inserto de aminoácidos simples (resíduo 52a de acordo com Kabat) após o resíduo 52 de H2 e resíduos introduzidos (por exemplo, resíduos 82a, 82b e 82c, de acordo com Kabat) após o resíduo 82 do FR de cadeia pesada. A numeração de Kabat dos resíduos pode ser determinada para dado anticorpo pelo alinhamento em regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência numerada por Kabat "padrão". Vários algoritmos para atribuir a numeração de Kabat encontram-se disponíveis. O algoritmo implementado na versão 2.3.3 do Abysis (www.abysis.org) pode ser usado para atribuir a numeração de Kabat a regiões variáveis CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H2 e CDR-H3, e a definição por ADM pode ser então usada para CDR-H1.
[07 1]Conforme usado neste documento, "anticorpo monoclional" refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compõem a população são idênticos, salvo por possíveis mutações de ocorrência natural que podem se fazer presentes em quantidades ínfimas. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo direcionados contra um mesmo sítio antigênico. Além disso, à diferença dos preparados de anticorpos policlonais, que tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclional é direcionado contra um único determinante no antígeno. O modificador "monoclonal" indica a característica de o anticorpo ser obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como se exigisse a produção do anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclionais que serão usados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos pelo método do hibridoma, descrito pela primeira vez por Kohler e Milstein, 1975, Nature 256:495, ou podem ser produzidos por métodos de DNA recombinante, como descrito na Patente dos EUA nº 4.816.567. Os anticorpos monoclonais também podem ser isolados de bibliotecas de fagos geradas usando técnicas descritas em McCafferty et a/., 1990, Nature 348:552-554, por exemplo. Conforme usado neste documento, anticorpo "humanizado" refere-se a formas de anticorpos não humanos (por exemplo, murídeos) que são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina, ou fragmentos das mesmas (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de ligação com antígeno dos anticorpos) que contêm uma sequência mínima derivada de uma imunoglobulina não humana. De preferência, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo destinatário) em que resíduos de uma CDR do receptor são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador), tal como de um camundongo, rato ou coelho, com a especificidade, afinidade e/ou capacidade desejadas. O anticorpo humanizado pode compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo destinatário nem nas sequências de CDR ou framework importadas, mas são incluídos para refinar e otimizar ainda mais o desempenho do anticorpo.
[072]O anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, da invenção pode ser maturado por afinidade. Por exemplo, um anticorpo maturado por afinidade pode ser produzido por procedimentos conhecidos na técnica (Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10:779-783; Barbas et a/., 1994, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813; Schier et a/., 1995, Gene, 169:147-155; Yelton et al., 1995, J. Immunol., 155:1994-2004; Jackson et a/., 1995, J. Inmunol., 154(7):3310-9; Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol., 226:889-896; e WO2004/058184).
[073]UmM "anticorpo humano" é tal que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde à de um anticorpo produzido por um ser humano e/ou que foi produzido usando qualquer uma das técnicas para produzir anticorpos humanos conforme reveladas neste documento. Essa definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado que compreenda resíduos de ligação com antígeno não humanos.
[074] Tenciona-se que o termo "anticorpo quimérico" refira-se a anticorpos nos quais as sequências de região variável derivam de uma espécie e as sequências de região constante derivam de outra espécie, tal como um anticorpo no qual as sequências de região variável derivam de um anticorpo de camundongo e as sequência de região constante derivam de um anticorpo humano, ou vice-versa. O termo também contempla um anticorpo que compreende uma região variável de um indivíduo de uma espécie (por exemplo, um primeiro camundongo) e uma região constante de outro indivíduo da mesma espécie (por exemplo, um segundo camundongo).
[075]O termo "antígeno (Ag)" refere-se à entidade molecular usada na imunização de um vertebrado imunocompetente para produzir o anticorpo (Ab) que reconhece o Ag ou para triar uma biblioteca de expressões (por exemplo, biblioteca de exibição de fagos, leveduras ou ribossomos, entre outros). Neste documento, Ag é usado de maneira mais aberta e tenciona-se em geral que inclua moléculas alvo que sejam reconhecidas especificamente pelo Ab, incluindo assim fragmentos ou imitadores da molécula em um processo de imunização para criar o Ab ou na triagem de bibliotecas para selecionar o Ab. Sendo assim, para anticorpos da invenção que ligam-se ao CXCR5, o CXCR5 de comprimento total de uma espécie mamífera (por exemplo, CXCR5 humano, de macaco ou de camundongo), incluindo monômeros e multímeros, tais como dímeros, trímeros etc. dos mesmos, bem como variantes truncadas e outras variantes do mesmo, é citado como um antígeno.
[076]Em linhas geral, o termo "epítopo" refere-se à área ou região de um antígeno (por exemplo, de uma proteína, ácido nucleico, caboidrato ou lipídio etc.) à qual um anticorpo liga-se especificamente, isto é, uma área ou região em contato físico com o anticorpo. Sendo assim, o termo "epítopo" refere-se à porção de uma molécula que é capaz de ser reconhecida e ligada por um anticorpo em uma ou mais regiões de ligação com antígeno do mesmo. Tipicamente, um epítopo é definido no contexto de uma interação molecular entre um "anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo", (Ab) e seu antígeno correspondente. Os epítopos muitas vezes consistem em um conjunto superficial de moléculas, tal como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar, e têm características estruturais tridimensionais específicas, bem como característica de carga específicas. Em algumas modalidades, o epítopo pode ser um epítopo de uma proteína. Os epítopos de proteína podem ser lineares ou conformacionais. Em um epítopo linear, todos os pontos de interação entre a proteína e a molécula interagente (tal como um anticorpo) ocorrem linearmente ao longo da sequência de aminoácidos primária da proteína. Um "epítopo não linear" ou "epítopo conformacional" compreende polipeptídeos (ou aminoácidos) não contíguos dentro da proteína antigênica à qual um anticorpo específico ao epítopo se liga. O termo "epítopo antigênico", conforme usado neste documento, é definido como uma porção de um antígeno à qual um anticorpo pode ligar-se especificamente, conforme determinado por qualquer método consagrado, por exemplo, por imunoensaios convencionais. Como alternativa, durante o processo de descoberta, a geração e caracterização dos anticorpos pode elucidar informações acerca de epítopos desejáveis. Com base nessas informações, é então possível triar competitivamente anticorpos quanto à ligação com um mesmo epítopo. Uma abordagem para tanto consiste em conduzir estudos de competição e competição cruzada para descobrir anticorpos que competem ou competem cruzadamente uns com os outros para ligar-se ao CXCR5, por exemplo, os anticorpos competem para ligar-se ao antígeno.
[077]Um anticorpo que "liga-se preferivelmente" ou "liga-se especificamente" (usados de maneira intercambiável neste documento) a um epítopo é um termo bem conhecido no setor, e métodos para determinar essa ligação específica ou preferencial também são bem conhecidos no setor. Diz-se que uma molécula exibe "ligação específica" ou "ligação preferencial" se ela reage ou associa-se mais frequentemente, mais rapidamente, por mais tempo e/ou com maior afinidade a uma célula ou substância específica do que com células ou substâncias alternativas. Um anticorpo "liga-se especificamente" ou "liga-se preferivelmente" a um alvo se ele liga-
se a ele com maior afinidade, maior avidez, mais prontamente e/ou por mais tempo do que liga-se a outras substâncias.
Ademais, um anticorpo "liga-se especificamente" ou "liga-se preferivelmente" a um alvo se ele liga-se com maior afinidade, maior avidez, mais prontamente e/ou por mais tempo a esse alvo em uma amostra do que liga-se a outras substâncias presentes na amostra.
Por exemplo, um anticorpo que liga-se específica ou preferivelmente a um epítopo do CXCR5 é um anticorpo que liga-se a esse epítopo com maior afinidade, maior avidez, mais prontamente e/ou por mais tempo do que liga-se a outros epítopos do CXCR5 ou epítopos não CXCR5. Subentende-se também, ao ler essa definição, por exemplo, que um anticorpo (ou grupamento ou epítopo) que liga-se específica ou preferivelmente a um primeiro alvo pode ou não ligar-se específica ou preferivelmente a um segundo alvo.
Como tal, os termos "ligação específica" ou "ligação preferencial" não requerem necessariamente (embora possam incluir) a ligação exclusiva.
Em linhas gerais, mas não necessariamente, uma referência a ligação significa ligação preferencial. "Ligação específica" ou "ligação preferencial" incluem um composto, por exemplo, uma proteína, um ácido nucleico, um anticorpo, e seus semelhantes, que reconhece e liga-se a uma molécula específica, mas não reconhece ou liga-se substancialmente a outras moléculas em uma amostra.
Por exemplo, um anticorpo ou receptor de peptídeo que reconhece e liga-se a um ligante ou parceiro de ligação cognato (por exemplo, um anticorpo anti-CXCR5 que liga-se ao CXCR5) em uma amostra, mas não reconhece ou liga-se substancialmente a outras moléculas na amostra, liga-se especificamente ao ligante ou parceiro de ligação cognato.
Sendo assim, nas condições de ensaio designadas, o grupamento de ligação especificado (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, ou um receptor ou fragmento de ligação com ligante do mesmo) liga-se preferiveimente a uma molécula alvo específica mas não liga-se em quantidade significativa a outros componentes presentes em uma amostra de teste.
[078]Uma variedade de formatos de ensaio pode ser usada para selecionar um anticorpo ou peptídeo que liga-se especificamente a uma molécula de interesse. Por exemplo, imunoensaio ELISA de fase sólida, imunoprecipitação, Biacore"" (GE Healthcare, Piscatavay, NJ), KinExA, separação de células ativadas por fluorescência (FACS), Octet"" (FortéBio, Inc, Menlo Park, CA) e análise por Western blot estão entre os muitos ensaios que podem ser usados para identificar um anticorpo que reage especificamente a um antígeno ou receptor, ou fragmento de ligação com ligante do mesmo, que liga-se especificamente a um ligante ou parceiro de ligação cognato. Tipicamente, uma reação específica ou seletiva terá ao menos duas vezes o sinal ou ruído de fundo, mais tipicamente mais de 10 vezes o sinal ou ruído de fundo, ainda mais tipicamente mais de 50 vezes o sinal ou ruído de fundo, mais tipicamente mais de 100 vezes o sinal ou ruído de fundo, ainda mais tipicamente mais de 500 vezes o sinal ou ruído de fundo, ainda mais tipicamente mais de 1.000 vezes o sinal ou ruído de fundo, e ainda mais tipicamente mais de
10.000 vezes o sinal ou ruído de fundo. Em aditamento, diz-se que um anticorpo "liga-se especificamente" a um antígeno quando a constante de dissociação de equilíbrio (Ko) é €< 1 uM, de preferência < 100 nM, mais preferivelmente < 10 nM, ainda mais preferivelmente < 100 pM, mais preferivelmente ainda < 10 pM, e ainda mais preferivelmente < 1 pM. Em algumas modalidades, diz-se que um anticorpo "liga-se especificamente" a um antígeno quando a constante de dissociação de equilíbrio (Ko) é < 7 nM.
[079]O termo "afinidade de ligação" é usado neste documento como uma medida da força de uma interação covalente entre duas moléculas, por exemplo, um anticorpo, ou fragmento do mesmo, e um antígeno. O termo "afinidade de ligação" é usado para descrever interações monovalentes (atividade intrínseca).
[080]Além disso, para determinar a afinidade de ligação de anticorpos do CXCR5 com células que expressam o CXCR5, é possível realizar experimentos de ligação com células para determinar a afinidade aparente. A afinidade aparente da ligação do anticorpo com células que expressam o alvo pode ser calculada pela ECs5o das curvas de titulação de ligação de equilíbrio, em que a média geométrica da intensidade de fluorescência (gMFI) da população de ligação com antígeno é quantificada por citometria de fluxo.
[081]A afinidade de ligação entre duas moléculas, por exemplo, um anticorpo, ou fragmento do mesmo, e um antígeno, através de uma interação monovalente, pode ser quantificada determinando-se a constante de dissociação (Ko). Por sua vez, a Ko pode ser determinada medindo-se a cinética da formação e dissociação de complexos usando, por exemplo, o método da ressonância de plásmons de superfície (SPR) (Biacore) As constantes de velocidade correspondentes à associação e dissociação de um complexo monovalente são chamadas de constante de velocidade de associação ka (ou Kon) e constante de velocidade de dissociação ka (ou kom), respectivamente. A Kp é relacionada a ka e ka pela equação Ko = ka / ka. O valor da constante de dissociação pode ser determinado diretamente por métodos bem conhecidos, e pode ser computado até mesmo para misturas de complexos por meio de métodos tais como, por exemplo, os definidos em Caceci et a/. (1984, Byte 9: 340-362). Por exemplo, a Ko pode ser aferida usando um ensaio de ligação com filtro de nitrocelulose de filtro duplo, tal como o revelado por Wong & Lohman (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5428- 5432). Outros ensaios padrão para avaliar a capacidade de ligação de ligantes, tais como anticorpos, com antígenos alvo são conhecidos no setor, incluindo, por exemplo, ELISA, Western blot, RIA e análise por citometria de fluxo, além de outros ensaios exemplificados em outras partes neste documento. A cinética de ligação e afinidade de ligação do anticorpo também podem ser avaliadas por ensaios padrão conhecidos no setor, tais como Ressonância de Plásmons de Superfície (SPR), por exemplo, usando um sistema Biacore"Y, ou KinExA.
[082]É possível realizar um ensaio de ligação competitiva no qual a ligação do anticorpo com o antígeno é comparada à ligação do alvo por outro ligante desse alvo, tal como outro anticorpo, ou um receptor solúvel que, em outros contextos, liga- se ao alvo. A concentração à qual ocorrem 50% de inibição é conhecida como K;. Em condições ideais, a Ki é equivalente à Kp. O valor de Ki nunca será menor que Kp, logo a medida de Ki pode ser convenientemente substituída para obter um limite- superior para Ko.
[083]Seguindo a definição acima, afinidades de ligação associadas a diferentes interações moleculares, por exemplo, comparação da afinidade de ligação de diferentes anticorpos por dado antígeno, podem ser comparadas por comparação dos valores de Kp para os complexos anticorpo/antígeno individuais. Os valores de Kp para anticorpos ou outros parceiros de ligação podem ser determinados usando métodos consagrados no setor. Um método para determinar a Kp consiste em usar a ressonância de plásmons de superfície, tipicamente usando um sistema biossensor, tal como um sistema Biacore€.
[084]ÀÃ semelhança, a especificidade de uma interação pode ser avaliada determinando-se e comparando-se o valor de Kp para a interação de interesse, por exemplo, uma interação específica entre um anticorpo e um antígeno, ao valor de Ko de uma interação que não é de interesse, por exemplo, um anticorpo controle conhecido por não ligar-se ao CXCR5.
[085]Um anticorpo que liga-se especificamente a seu alvo pode ligar-se a seu alvo com alta afinidade, ou seja, exibindo uma Kp baixa, conforme discutido acima, e pode ligar-se a outras moléculas não alvo com menor afinidade. Por exemplo, o anticorpo pode ligar-se a moléculas não alvo com uma Kp de 1 x 10:ºM ou mais, mais preferivelmente de 1 x 10 M ou mais, mais preferivelmente de 1 x 10 4 M ou mais, mais preferivelmente de 1 x 103 M, ou ainda mais preferivelmente de 1 x 10º M ou mais. Um anticorpo da invenção é preferivelmente capaz de ligar-se a seu alvo com uma afinidade que é ao menos duas vezes, 10 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 500 vezes, 1.000 vezes ou 10.000 vezes maior ou mais do que sua afinidade por ligar-se a outra molécula não CXCRS5.
[086]O termo "competir", conforme usado neste documento em associação a um anticorpo, significa que um primeiro anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, liga-se a um epítopo de uma maneira suficientemente semelhante à ligação de um segundo anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de tal modo que o resultado da ligação do primeiro anticorpo com seu epítopo cognato é detectavelmente menor na presença do segundo anticorpo em comparação à ligação do primeiro anticorpo na ausência do segundo. O oposto, quando a ligação do segundo anticorpo com seu epítopo também é detectavelmente menor na presença do primeiro anticorpo, pode ser o caso, mas não necessariamente o é. Ou seja, um primeiro anticorpo pode inibir a ligação de um segundo anticorpo com seu epítopo sem que o segundo anticorpo iniba a ligação do primeiro com seu respectivo epítopo. No entanto, quando cada anticorpo inibe detectavelmente a ligação do outro com seu epítopo ou ligante cognato, seja no mesmo grau, em maior grau ou em menor grau, diz-se que os anticorpos "competem cruzadamente" um com o outro pela ligação de seu(s) respectivo(s) epítopo(s). À presente invenção contempla tanto anticorpos competindo quanto anticorpos competindo cruzadamente. Independentemente do mecanismo pelo qual essa competição ou competição cruzada ocorre (por exemplo, impedimento estérico, mudança conformacional ou ligação com um epítopo em comum, ou com parte dele), os versados na técnica apreciarão, com base nos ensinamentos propiciados neste documento, que esses anticorpos competindo e/ou competindo cruzadamente são contemplados e podem ser úteis nos métodos revelados neste documento.
[087]Ensaios de competição padrão podem ser usados para determinar se dois anticorpos competem um com o outro. Um ensaio adequado para a competição dos anticorpos envolve o uso da tecnologia Biacore, que é capaz de medir a gama de interações usando a tecnologia de ressonância de plásmons de superfície (SPR), tipicamente usando um sistema biossensor (tal como um BIACOREG). Por exemplo, a SPR pode ser usada em um ensaio de inibição à ligação competitivo in vitro para determinar a capacidade de um anticorpo inibir a ligação de um segundo anticorpo. Outro ensaio para medir a competição dos anticorpos utiliza uma abordagem baseada em ELISA.
[088]Ademais, um processo de alto rendimento para "binar" anticorpos com base em sua competição é descrito no Pedido de Patente Internacional nº WOZ2003/48731. A competição se faz presente se um anticorpo (ou fragmento) reduzir a ligação de outro anticorpo (ou fragmento) com o CXCR5. Por exemplo, é possível usar um ensaio de competição por ligação sequencial, com diferentes anticorpos sendo adicionados em sequência. O primeiro anticorpo pode ser adicionado para atingir a ligação que está próxima da saturação. Em seguida, adiciona-se o segundo anticorpo. Se a ligação do segundo anticorpo com o CXCR5 não for detectada, ou for significativamente reduzida (por exemplo, ao menos cerca de 10%, ao menos cerca de 20%, ao menos cerca de 30%, ao menos cerca de 40%, ao menos cerca de 50%, ao menos cerca de 60%, ao menos cerca de 70%, ao menos cerca de 80%, ou ao menos cerca de 90% menor) em comparação a um ensaio paralelo na ausência do primeiro anticorpo (cujo valor pode ser definido como 100%), os dois anticorpos são considerados competindo um com o outro.
[089]Além disso, um ensaio de binagem de epítopos de anticorpo exemplificativo que usa o intercâmbio de domínio entre proteínas CXCR5 humanas e de camundongo para avaliar possíveis epítopos entre vários anticorpos é dado no Exemplo 8. Os versados na técnica apreciarão, à luz dos ensinamentos propiciados neste documento, que há uma ampla variedade de ensaios conhecidos no setor que podem ser usados para determinar a ligação com um alvo por ao menos dois anticorpos um em relação ao outro, e esses ensaios incluem-se neste documento.
[090]Os anticorpos do CXCR5 podem ser caracterizados usando métodos bem conhecidos no setor. Por exemplo, um método consiste em identificar o epítopo ao qual ele se liga, ou "mapeamento de epítopo". Há muitos métodos conhecidos na técnica para mapear e caracterizar a localização dos epítopos nas proteínas, incluindo resolver a estrutura cristalina de um complexo anticorpo-antígeno, ensaios de competição, ensaios de expressão de fragmentos gênicos e ensaios à base de peptídeos sintéticos, conforme descrito, por exemplo, no Capítulo 11 de Harlow e Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova York, 1999. Em um exemplo adicional, o mapeamento de epítopo pode ser usado para determinar a sequência à qual um anticorpo do CXCR5 se liga. O mapeamento de epítopo é disponibilizado comercialmente por várias fontes, por exemplo, pela Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, Países Baixos). O epítopo pode ser um epítopo linear, isto é, contido em um único trecho de aminoácidos, ou um epítopo conformacional, formado por uma interação tridimensional de aminoácidos que pode não estar necessariamente contida em um único trecho. Peptídeos de comprimentos variantes (por exemplo, com ao menos 4 a 6 aminoácidos de comprimento) podem ser isolados ou sintetizados (por exemplo, de maneira recombinante) e usados em ensaios de ligação com o anticorpo do CXCRS5.
[091]Além disso, o epítopo ao qual o anticorpo do CXCR5 se liga pode ser determinado em uma triagem sistemática por sobreposição de peptídeos derivados da sequência do CXCRS5 e determinação da ligação pelo anticorpo. De acordo com os ensaios de expressão de fragmentos gênicos, a fase de leitura aberta que codifica o CXCR5 pode ser fragmentada ou aleatoriamente ou por construções genéticas específicas, e a reatividade dos fragmentos expressos do CXCR5 com o anticorpo a ser testado é determinada. Os fragmentos gênicos podem ser produzidos, por exemplo, por PCR e, então, transcritos e traduzidos em proteína in vitro, na presença de aminoácidos radioativos. A ligação do anticorpo com os fragmentos do CXCR5 radioativamente marcados é então determinada por imunoprecipitação e eletroforese em gel.
[092]Certos epítopos também podem ser identificados usando grandes bibliotecas de sequências de peptídeo aleatórias exibidas na superfície de partículas de fago (bibliotecas de fago) ou levedura (exibição de leveduras). Como alternativa, uma biblioteca definida de fragmentos de peptídeo sobrepostos pode ser testada quanto à ligação com o anticorpo de teste em ensaios de ligação simples. Em um exemplo adicional, a mutagênese de um antígeno, experimentos de intercâmbio de domínio e a mutagênese por varredura de alanina podem ser realizados para identificar os resíduos necessários, suficientes e/ou exigidos para a ligação com o epítopo. Por exemplo, experimentos de mutagênese por varredura de alanina podem ser realizados usando um CXCR5 mutante onde vários resíduos do polipeptídeo do CXCR5 foram substituídos por alanina. Ao avaliar a ligação do anticorpo com o CXCR5 mutante, a importância dos resíduos de CXCR5 específicos para a ligação com o anticorpo pode ser estimada.
[093]Ainda outro método que pode ser usado para caracterizar um anticorpo do CXCR5 consiste em usar ensaios de competição com outros anticorpos conhecidos por ligar-se ao mesmo antígeno, isto é, vários fragmentos no CXCR5, para determinar se o anticorpo do CXCRS5 liga-se ao mesmo epítopo que outros anticorpos. Ensaios de competição são bem conhecidos pelos versados na técnica.
[094]Além disso, o epítopo para dado par de ligação anticorpo/antígeno pode ser definido e caracterizado em diferentes níveis de detalhe usando uma variedade de métodos de mapeamento de epítopo experimentais e computacionais. Os métodos experimentais incllem a mutagênese, cristalografa de raios X,
espectroscopia por Ressonância Magnética Nuclear (RMN), Espectrometria de Massas com troca de hidrogênio/deutério (H/D-MS) e vários métodos de ligação por competição bem conhecidos no setor. Como cada método conta com um princípio próprio, a descrição de um epítopo está intimamente vinculada ao método pelo qual ele foi determinado. Sendo assim, um epítopo para dado par anticorpo/antígeno será definido de diferentes maneiras dependendo do método de mapeamento de epítopo empregado.
[095]Em seu nível mais detalhado, o epítopo para a interação entre o Age o Ab pode ser dado pelas coordenadas espaciais que definem os contatos atômicos presentes na interação Ag-Ab, bem como pelas informações acerca de suas contribuições relativas para a termodinâmica da ligação. Em um nível menos detalhado, o epítopo pode ser caracterizado pelas coordenadas espaciais que definem os contatos atômicos entre o Ag e o Ab. Em um nível ainda menos detalhado, o epítopo pode ser caracterizado pelos resíduos de aminoácido que compreende conforme definidos por um critério específico, por exemplo, pela distância entre átomos (por exemplo, átomos pesados, isto é, não hidrogênio) no Ab e no Ag. Em um nível ainda menos detalhado, o epítopo pode ser caracterizado pela função, por exemplo, pela ligação por competição com outros Abs. O epítopo também pode ser definido mais genericamente como compreendendo resíduos de aminoácido para os quais a substituição por outro aminoácido alterará as características da interação entre o Ab e o Ag (por exemplo, usando a varredura de alanina).
[096]Com base no fato de que as descrições e definições dos epítopos, dependendo do método de mapeamento de epítopo usado, são obtidas em diferentes níveis de detalhe, deduz-se que a comparação de epítopos para diferentes Abs no mesmo Ag pode ser, à semelhança, conduzida em diferentes níveis de detalhe.
[097]Diz-se que os epítopos descritos no nível dos aminoácidos, por exemplo, determinados com base em uma estrutura de raios X, são idênticos se contiverem o mesmo conjunto de resíduos de aminoácido. Diz-se que os epítopos sobrepõem-se se ao menos um aminoácido for compartilhado por eles. Diz-se que os epítopos são distintos (exclusivos) se nenhum resíduo de aminoácido for compartilhado por eles.
[098]Diz-se que os epítopos caracterizados por ligação competitiva sobrepõem-se se a ligação com os anticorpos correspondentes for mutuamente exclusiva, isto é, se a ligação com um anticorpo excluir a ligação simultânea ou consecutiva com o outro. Diz-se que os epítopos são distintos (exclusivos) se o antígeno for capaz de acomodar a ligação de ambos os anticorpos correspondentes simultaneamente.
[099]A definição do termo "parátopo" deriva da definição acima de "epítopo" invertendo-se a perspectiva. Sendo assim, o termo "parátopo" refere-se à área ou região no anticorpo que liga-se especificamente a um antígeno, isto é, os resíduos de aminoácido no anticorpo que fazem contato com o antígeno (CXCR5) de acordo com a definição de "contato" em outra parte neste documento.
[0100]O epítopo e o parátopo para dado par anticorpo/antígeno podem ser identificados por métodos rotineiros. Por exemplo, a localização geral de um epítopo pode ser determinada avaliando a capacidade de um anticorpo de ligar-se a diferentes fragmentos ou polipeptídeos de CXCR5 variantes. Os aminoácidos específicos dentro do CXCR5 que fazem contato com um anticorpo (epítopo) e os aminoácidos específicos em um anticorpo que fazem contato com o CXCR5 (parátopo) também podem ser determinados usando métodos rotineiros, como os descritos nos exemplos. Por exemplo, o anticorpo e a molécula alvo podem ser combinados, e o complexo anticorpo/antígeno pode ser cristalizado. A estrutura cristalina do complexo pode ser determinada e usada para identificar sítios de interação específicos entre o anticorpo e seu alvo.
[0101]Um anticorpo de acordo com a presente invenção pode ligar-se ao mesmo epítopo ou domínio do CXCR5 que os anticorpos da invenção que são revelados especificamente neste documento. Análises e ensaios que podem ser usados para fins dessa identificação incluem ensaios que avaliam a competição por ligação com o CXCR5 entre o anticorpo de interesse e o receptor CXCR5 em ensaios da atividade biológica, conforme descritos nos Exemplos de 1 a 10, e na análise da estrutura cristalina do anticorpo.
[0102]Um anticorpo da invenção pode ter a capacidade de competir ou competir cruzadamente com outro anticorpo da invenção para ligar-se ao CXCR5 conforme descrito neste documento. Por exemplo, um anticorpo da invenção pode competir ou competir cruzadamente com anticorpos descritos neste documento para ligar-se ao CXCR5, ou a um fragmento adequado ou variante do CXCR5, que é ligado pelos anticorpos revelados neste documento.
[0103]Ou seja, se um primeiro anticorpo compete com um segundo para ligar-se ao CXCR5, mas não compete quando o segundo anticorpo liga-se primeiramente ao CXCRS5, considera-se que ele "compete" com o segundo anticorpo (também chamada competição unidirecional). Quando um anticorpo compete com outro anticorpo independentemente de qual anticorpo ligou-se primeiramente ao CXCRS5, logo o anticorpo "compete cruzadamente" com o outro anticorpo para ligar- se ao CXCR5. Esses anticorpos competindo ou competindo cruzadamente podem ser identificados com base em sua capacidade de competir/competir cruzadamente com um anticorpo conhecido da invenção em ensaios de ligação padrão. À guisa de exemplo, SPR, por exemplo, usando um sistema Biacore"Y, ensaios ELISA ou citometria de fluxo podem ser usados para demonstrar a competição/competição cruzada. Essa competição/competição cruzada pode sugerir que os dois anticorpos ligam-se a epítopos idênticos, sobrepostos ou similares.
[0104]Um anticorpo da invenção pode ser identificado, portanto, por um método que compreende um ensaio de ligação que avalia se um anticorpo de teste é ou não é capaz de competir/competir cruzadamente com um anticorpo de referência por um sítio de ligação na molécula alvo. Métodos para realizar ensaios de ligação competitiva são revelados neste documento e/ou bem conhecidos no setor. Por exemplo, eles podem envolver ligar um anticorpo de referência da invenção a uma molécula alvo usando condições nas quais o anticorpo pode ligar-se à molécula alvo. O complexo anticorpo/alvo pode ser então exposto a um segundo anticorpo/anticorpo de teste, e o grau com que o anticorpo de teste é capaz de deslocar o anticorpo de referência da invenção de complexos anticorpo/alvo pode ser avaliado. Um método alternativo pode envolver colocar um anticorpo de teste em contato com uma molécula alvo em condições que permitam a ligação do anticorpo, em seguida adicionar um anticorpo de referência da invenção capaz de ligar-se a essa molécula alvo e avaliar o grau com que o anticorpo de referência da invenção é capaz de deslocar o anticorpo de teste de complexos anticorpo/alvo ou ligar-se simultaneamente ao alvo (isto é, anticorpo não competitivo).
[0105]A capacidade de um anticorpo de teste de inibir a ligação de um anticorpo de referência da invenção com o alvo demonstra que o anticorpo de teste pode competir com um anticorpo de referência da invenção para ligar-se ao alvo e, portanto, que o anticorpo de teste liga-se ao mesmo, ou substancialmente ao mesmo, epítopo ou região na proteína CXCR5 que o anticorpo de referência da invenção. Um anticorpo de teste que é identificado como competindo com um anticorpo de referência da invenção em um método desse tipo também é um anticorpo da presente invenção. O fato de que o anticorpo de teste pode ligar-se ao CXCR5 na mesma região que um anticorpo de referência da invenção e pode competir com o anticorpo de referência da invenção sugere que o anticorpo de teste pode atuar como um ligante no mesmo sítio de ligação que o anticorpo da invenção e que o anticorpo de teste pode, portanto, reproduzir a ação do anticorpo de referência e é, portanto, um anticorpo da invenção. Isso pode ser confirmado comparando-se a atividade do CXCR5 na presença do anticorpo de teste à atividade do CXCRS5 na presença do anticorpo de referência em condições fora isso idênticas usando um ensaio coforme descrito mais plenamente em outra parte neste documento.
[0106]O anticorpo de referência da invenção pode ser um anticorpo conforme descrito neste documento, tal como 11G2, 41A10, 5H7, e qualquer variante ou porção dos mesmo, conforme descritas neste documento, que mantenham a capacidade de ligar-se ao CXCR5. Um anticorpo da invenção pode ligar-se ao mesmo epítopo que os anticorpos de referência descritos neste documento, ou a qualquer variante ou porção dos mesmos, conforme descritas neste documento, que mantenham a capacidade de ligar-se ao CXCR5.
[0107]Conforme mencionado previamente em outra parte neste documento, a ligação específica pode ser avaliada com referência à ligação do anticorpo com uma molécula que não é o alvo. Essa comparação pode ser feita comparando-se a capacidade de um anticorpo em ligar-se ao alvo e a outra molécula. Essa comparação pode ser feita conforme descrito acima em uma avaliação de Kp ou K;. A outra molécula usada em uma comparação desse tipo pode ser uma molécula que não é a molécula alvo. De preferência, a outra molécula não é idêntica à molécula alvo. De preferência, a molécula alvo não é um fragmento da molécula alvo.
[0108]A outra molécula usada para determinar a ligação específica pode ter relação alguma com o alvo no que diz respeito à estrutura ou função. Por exemplo, a outra molécula pode ser um material não relacionado ou um material concomitante no ambiente.
[0109]A outra molécula usada para determinar a ligação específica pode ser outra molécula envolvida na mesma via in vivo que a molécula alvo, isto é, CXCR5. Ao garantir que o anticorpo da invenção tem especificidade pelo CXCR5 em relação a outra molécula do tipo, evita-se a indesejada reatividade cruzada in vivo.
[0110]O anticorpo da invenção pode manter a capacidade de ligar-se a algumas moléculas relacionadas à molécula alvo.
[0111]Como alternativa, o anticorpo da invenção pode ter especificidade por uma molécula alvo em particular. Por exemplo, ele pode ligar-se a uma molécula alvo conforme descrita neste documento, mas pode não ligar-se, ou ligar-se com afinidade significativamente reduzida, a uma molécula alvo diferente conforme descrita neste documento. Por exemplo, um CXCR5 humano maduro de comprimento total pode ser usado como alvo, mas o anticorpo que liga-se a esse alvo pode ser incapaz de ligar-se ou pode ligar-se com menos afinidade, por exemplo, a outras proteínas CXCR5 de outras espécies, tais como o CXCR5 de outro mamífero. Em algumas modalidades, o anticorpo liga-se tanto ao CXCR5 humano quanto ao CXCR de camundongo.
[0112]Uma proteína "de fusão com Fc" é uma proteína em que um ou mais polipeptídeos ligam-se operacionalmente a um polipeptídeo de Fc. Uma fusão com Fc combina a região Fc de uma imunoglobulina com um parceiro de fusão.
[01 13]Uma "região Fc de sequência nativa" compreende uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos de uma região Fc encontrada na natureza. Uma "região Fc variante" compreende uma sequência de aminoácidos que difere de uma região Fc de sequência nativa em virtude de ao menos uma modificação de aminoácido, mas mesmo assim mantém ao menos uma função efetora da região Fc de sequência nativa. De preferência, a região Fc variante possui ao menos uma substituição de aminoácidos em comparação a uma região Fc de sequência nativa ou à região Fc de um polipeptídeo-pai, por exemplo, de cerca de um a cerca de dez substituições de aminoácidos, e, de preferência, de cerca de uma a cerca de cinco substituições de aminoácidos, em uma região Fc de sequência nativa ou na região Fc do polipeptídeo-pai. A região Fc variante neste documento possuirá de preferência ao menos cerca de 80% de identidade de sequência com uma região Fc de sequência nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo-pai, e mais preferivelmente ao menos cerca de 90% de identidade de sequência com elas, mais preferivelmente ao menos cerca de 95%, ao menos cerca de 96%, ao menos cerca de 97%, ao menos cerca de 98%, ao menos cerca de 99% de identidade de sequência com elas.
[0114]Como é de conhecimento na técnica, uma "região constante" de um anticorpo refere-se à região constante da cadeia leve do anticorpo ou à região constante da cadeia pesada do anticorpo, ou à parte ou em combinação.
[0115]Os termos "região Fc da IgG", "região Fc", "domínio Fc" e "Fc", conforme usados de maneira intercambiável neste documento, referem-se à porção de uma molécula de IgG que correlaciona-se a um fragmento cristalizável obtido pela digestão de papaína por uma molécula de IgG. Conforme usados neste documento, os termos referem-se à região constante de um anticorpo, excluindo-se o primeiro domínio de imunoglobulina da região constante, e referem-se ainda a porções dessa região. Sendo assim, Fc refere-se aos dois últimos domínios de imunoglobulina da região constante da IgA, IgD e IgG, e aos três últimos domínios de imunoglobulina da região constante da IgE e IgM, e à dobradiça flexível N- terminal a esses domínios, ou a porções dos mesmos. Para IgA e IgM, Fc pode incluir a cadeia J. Para IgG, Fc compreende os domínios de imunoglobulina Cy2 e Cy3 (C gama 2 e C gama 3) e a dobradiça entre Cy1 (C gama 1) e Cy2 (C gama 2). Embora os limites da região Fc possam variar, a região Fc de cadeia pesada da IgG humana comumente é definida como compreendendo os resíduos C226 ou P230 em seu terminal carboxila, cujas numerações são de acordo com o índice EU de
Edelman et a/., 1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63(1):78-85 conforme descrito em Kabat et al., 1991. Tipicamente, o domínio Fc compreende desde cerca do resíduo de aminoácido 236 a cerca de 447 do domínio constante da I9G1 humana. Um exemplo de sequência de aminoácidos do domínio Fc da IgG1 humana do tipo selvagem é dado no SEQ ID Nº: 31. Polipeptídeo de Fc pode referir-se a essa região em isolamento, ou a essa região no contexto de um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, ou de uma proteína de fusão com Fc.
[0116]O domínio constante da cadeia pesada compreende a região Fc e compreende ainda o domínio CH1 e a dobradiça, bem como os domínios CH2 e CH3 (e, como opção, CH4 da IgA e IgE) da cadeia pesada da IgG.
[0117]Uma "região Fc funcional" possui ao menos uma função efetora de uma região Fc de sequência nativa. Exemplos de "funções efetoras" incluem ligação com C1q; citotoxicidade dependente do complemento; ligação com receptor de Fc; citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos; fagocitose; sub- regulação dos receptores de superfície celular (por exemplo, receptores de células B) etc. Essas funções efetoras geralmente requerem que a região Fc seja combinada a um domínio de ligação (por exemplo, um domínio variável de um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo) e podem ser avaliadas usando vários ensaios conhecidos na técnica para avaliar essas funções efetoras nos anticorpos.
[0118]Uma "região Fc de sequência nativa" compreende uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos de uma região Fc encontrada na natureza. Regiões FC humanas de sequência nativa incluem uma região Fc da I9gG1 humana de sequência nativa (alótipos A e não A); região Fc da IgG2 humana de sequência nativa; região Fc da IgG3 humana de sequência nativa; e região Fc da I9G4 humana de sequência nativa, bem como variantes de ocorrência natural das mesmas.
[0119]Uma "região Fc variante" compreende uma sequência de aminoácidos que difere da de uma região Fc de sequência nativa em virtude de ao menos uma modificação de aminoácidos.
[0120]"Receptor de Fc" ou "FcR" descrevem um receptor que liga-se à região Fc de um anticorpo. Em algumas modalidades, um FcyR é um FcR humano nativo. Em algumas modalidades, um FcR é tal que liga-se a um anticorpo da IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcyRI, FcyRII e FeyRill, incluindo variantes alélicas e, como alternativa, formas spliced desses receptores. Os receptores FcyRIl incluem FCyRIIA (um receptor "ativador") e FCcyRIIB (um "receptor inibidor"), que têm sequências de aminoácidos semelhantes que diferem principalmente quanto aos domínios citoplasmáticos dos mesmos. O receptor ativador FCyRIIA contém um motivo de ativação do imunorreceptor à base de tirosina (ITAM) em seu domínio citoplasmático. O receptor inibidor FCcyRIIB contém um motivo de inibição do imunorreceptor à base de tirosina (ITIM) em seu domínio citoplasmático (vide, por exemplo, Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Os FcRs são analisados, por exemplo, em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Inmunomethods 4:25-34 (1994); e de Haas et al, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Outros FcRs, incluindo os que serão identificados no futuro, são abrangidos pelo termo "FcR" neste documento.
[0121]O termo "receptor de Fc" ou "FcR" também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternas ao feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et a/., J. Immunol. 24:249 (1994)) e pela regulação da homeostase das imunoglobulinas. Métodos para medir a ligação com o FcRn são conhecidos (vide, por exemplo, Ghetie e Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et a/., Nature Biotechnology, 15(7):637- 640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); WO 2004/92219 (Hinton et a/.).
[0122]"Funções efetoras" referem-se a atividades biológicas atribuíveis à região Fc de um anticorpo, que variam de acordo com o isótipo dele. Exemplos de funções efetoras dos anticorpos incluem: ligação com C1q e citotoxicidade dependente do complemento (CDC); ligação com receptor de Fc; citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC); fagocitose; sub-regulação de receptores de superfície celular (por exemplo, receptores de células B); e ativação de células B.
[0123]"Células efetoras humanas" são leucócitos que expressam um ou mais FcRs e desempenham funções efetoras. Em certas modalidades, as células expressam ao menos FcyRIll e desempenham uma ou mais funções efetoras de ADCC. Exemplos de leucócitos humanos que medeiam a ADCC incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC), células exterminadoras humanas (NK), monócitos, macrófagos, células T citotóxicas e neutrófilos. As células efetoras podem ser isoladas de uma fonte nativa, por exemplo, do sangue.
[0124]"Citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos" ou "ADCC" refere-se a uma forma de citotoxicidade na qual a Ig secretada ligada a receptores de Fc (FcRs) presentes em certas células citotóxicas (por exemplo, células NK, neutrófilos e macrófagos) permite que essas células efetoras citotóxicas liguem-se especificamente a uma célula alvo que carrega o antígeno e, subsequentemente, exterminem a célula alvo com citotoxinas. As células primárias para mediar a ADCC, células NK, só expressam FcyRiIll, ao passo que os monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRiIll. A expressão de FcR em células hematopoiéticas é sumarizada na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, um ensaio de ADCC in vitro, tal como o descrito nas Patentes dos EUA nº 5.500.362 ou 5.821.337 ou na Patente dos EUA nº 6.737.056 (Presta), pode ser realizado. Células efetoras úteis para esses ensaios incluem células PBMC e NK. Como alternativa, ou em aditamento, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal, tal como o revelado em Clynes et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656 (1998). Outros anticorpos com sequências de aminoácidos da região Fc alteradas e maior ou menor atividade de ADCC são descritos, por exemplo, na Patente dos EUA nº 7.923.538 e na Patente dos EUA nº 7.994.290.
[0125]Um anticorpo com a "atividade de ADCC intensificada" refere-se a um anticorpo que é mais eficaz em mediar a ADCC in vitro ou in vivo em comparação ao anticorpo-pai, em que o anticorpo e o anticorpo-pai diferem em ao menos um aspecto estrutural, e quando as quantidades desse anticorpo e anticorpo-pai usadas no ensaio são fundamentalmente as mesmas. Em algumas modalidades, o anticorpo e o anticorpo-pai têm a mesma sequência de aminoácidos, mas o anticorpo é afucosilado, ao passo que o anticorpo-pai é fucosilado. Em algumas modalidades, a atividade de ADCC será determinada usando o ensaio de ADCC in vitro conforme revelado neste documento, mas outros ensaios ou métodos para determinar a atividade de ADCC, por exemplo, em um modelo animal etc., são contemplados. Em algumas modalidades, um anticorpo com a atividade de ADCC intensificada aprimorou a afinidade pelo Fc gama RIIIA. Em algumas modalidades, um anticorpo com a atividade de ADCC intensificada aprimorou a afinidade pelo Fc gama RIIIA (V158). Em algumas modalidades, um anticorpo com a atividade de ADCC intensificada aprimorou a afinidade pelo Fc gama RIIIA (F158).
[0126]Um anticorpo com afinidade de ligação com FcR ou atividade de ADCC "alteradas" é tal que ou intensificou ou diminuiu a afinidade de ligação com FcR e/ou a atividade de ADCC em comparação ao anticorpo-pai, em que o anticorpo e o anticorpo-pai diferem em ao menos um aspecto estrutural. Um anticorpo que "exibe maior ligação" com um FcR liga-se a ao menos um FcR com melhor afinidade do que o anticorpo-pai. Um anticorpo que "exibe menor ligação" com um FcR liga-se a ao menos um FcR com menor afinidade do que o anticorpo-pai. Esses anticorpos que exibem menor ligação com um FcR podem exibir menos ligação (ou uma ligação não apreciável) com um FcR, por exemplo, 0% a 20% de ligação com o FcR em comparação a uma região Fc da IgG de sequência nativa.
[0127]"Afinidade intensificada pelo Fc gama RIIIA" refere-se a um anticorpo que possui maior afinidade pelo Fc gama RIIIA (também chamado, em alguns casos, de CD16a) do que o anticorpo-pai, em que o anticorpo e o anticorpo-pai diferem em ao menos um aspecto estrutural. Em algumas modalidades, o anticorpo e o anticorpo-pai têm a mesma sequência de aminoácidos, mas o anticorpo é afucosilado, ao passo que o anticorpo-pai é fucosilado. Qualquer método adequado para determinar a afinidade pelo Fc gama RIIIA pode ser usado. Em algumas modalidades, a afinidade pelo Fc gama RIIIA é determinada por um método descrito neste documento. Em algumas modalidades, um anticorpo com afinidade pelo Fc gama RIIIA intensificada exibe uma atividade de ADCC intensificada. Em algumas modalidades, um anticorpo com afinidade pelo Fc gama RIIIA intensificada exibe afinidade pelo Fc gama RIIIA (V158) intensificada. Em algumas modalidades, um anticorpo com afinidade pelo Fc gama RIIIA intensificada exibe afinidade pelo Fc gama RIIIA (F158) intensificada.
[0128]A L-fucose, também chamada de G6-desóxi-L-galactose, é um monossacarídeo que é um componente de alguns glicanos e glicolipídios ligados por Ne oO em animais. Vide Becker e Lowe, Glycobiology 13:41R-51R (2003). A fucose é tipicamente adicionada como uma modificação terminal a glicanos, inclusive glicanos ligados a antígenos, selectinas e anticorpos do grupo sanguíneo. A fucose pode ser ligada a glicanos através de ligações a(1,2)-, a(1,3)-, a(1,4)- e a(1,6)- por fucosiltransferases específicas. Ligações a(1,2)-fucose são tipicamente associadas aos antígenos do grupo sanguíneo H. As ligações a(1,3)- e a(1,4)-fucose são associadas à modificação de antígenos LewisX. As ligações a(1,6)-fucose são associadas a moléculas GIcNAc ligadas por N, tal como aquelas em anticorpos.
[0129]Os grupamentos carboidrato da presente invenção serão descritos com referência à nomenclatura comumente adotada para a descrição de oligossacarídeos. Um exame da química dos carboidratos que utiliza essa nomenclatura é encontrado em Hubbard e Ivatt (1981) Ann. Rev. Biochem. 50:555-
583. Essa nomenclatura inclui, por exemplo, Man, que representa manose; GICcNAc, que representa 2-N-acetilglicosamina; Gal, que representa galactose; Fuc para fucose; e Glc, que representa glicose. Ácidos siálicos são descritos pela notação abreviada NeuNAc para ácido 5-N-acetilneuramínico e NeuNGc para ácido 5- glicolilheuramínico (IUB-IUPAC Joint Commission on Biochemical Nomencliature, 1982, J. Biol. Chem. 257: 3347-3351; (1982) J. Biol. Chem. 257: 3352).
[0130]As estruturas de carboidrato da presente invenção ocorrem na proteína expressa como oligossacarídeos ligados por N. "Glicosilação ligada por N" refere-se à ligação do grupamento carboidrato, através de GICNAc, com um resíduo de asparagina em uma cadeia de polipeptídeo. Todos os carboidratos ligados por N contêm uma estrutura de núcleo Man 1-6(Man1-3)Mang1-4GIcNAcB1-4GICNACE-R. Logo, na estrutura de núcleo descrita, R representa um resíduo de asparagina da glicoproteína produzida. A sequência da proteína produzida conterá uma asparagina-X-serina, asparagina-X-treonina e asparagina-X-cisteína, em que X é qualquer aminoácido exceto prolina (Asn-Xaa-Ser/Thr). Os "carboidratos ligados por O", por outro lado, são caracterizados por uma estrutura de núcleo em comum, que é a GalNAc ligada ao grupo hidroxila de uma treonina ou serina, mas nenhuma sequência consenso se faz necessária. Dos carboidratos ligados por N, os mais importantes são os carboidratos ligados por N "complexos", tal como as estruturas "biantenárias" descritas neste documento.
[0131]Os versados na técnica reconhecerãoo que a glicoproteína imunoglobulina G (IG) é associada a três tipos de estruturas biantenárias complexas que contêm zero, um ou dois resíduos de galactose (Wormland et al.,
1997, Biochemistry 36:1370-1380), comumente conhecidas como GO, G1 e G2, respectivamente. No que diz respeito a moléculas de anticorpo humanas da classe IgG, cada uma possui um oligossacarídeo ligado por N na cadeia lateral amida de Asn 297 da dobra 8-4 da face interna do domínio CH2 da região Fc (Beale and Feinstein, 1976, Q. Rev. Biophys. 9:253-259; Jefferis et al., 1995, Immunol. Letts. 44:111-117). O grupamento oligossacarídeo em Asn 297 do domínio CH2 da IgG é do tipo biantenário complexo com a estrutura de núcleo hexassacarídea identificada e resíduos de açúcar externos variáveis (vide Jefferis et a/., 1997, supra; Wyss e Wagner, 1996, Current Opinions in Biotech. 7:409-416). A estrutura de núcleo (GICNAc2Man3GIcNAc) é típica de oligossacarídeos biantenários e é representada esquematicamente na FIG. 1.
[0132]Visto que cada estrutura de núcleo pode ter uma N-acetilglicosamina bissectadora, fucose de núcleo e ou galactose ou sacarídeos externos de ácido Siálico, há um total de 36 oligossacarídeos estruturalmente singulares que podem ocupar o sítio de Asn 297 (Jefferis e Lund, supra). Reconhecer-se-á também que, dentro de um domínio CH2 específico, a glicosilação em Asn 297 pode ser assimétrica graças a diferentes cadeias de oligossacarídeos ligadas em qualquer um dos resíduos de Asn 297 dentro do domínio Fc de duas cadeias. Por exemplo, embora a cadeia pesada sintetizada dentro de uma única célula secretora de anticorpo possa ser homogênea em sua sequência de aminoácidos, ela geralmente é glicosilada de maneira diferente, resultando assim em um grande número de glicoformas de Ig estruturalmente singulares.
[0133]Os principais tipos de estrutura de oligossacarídeos complexos, todos chamados de "glicoformas", encontrados no domínio CH2 da IgG são representados na Publicação de Patente Internacional nº WO 99/22764 na página 7.
[0134]De acordo com a presente invenção, GO refere-se a uma estrutura biantenária em que nenhum ácido siálico (NeuÃcs) ou Gal terminal se faz presente,
G1 refere-se a uma estrutura biantenária com uma Gal e nenhuma NeuAc, e G2 refere-se a uma estrutura biantenária com duas Gals terminais e sem NeuAc. Vide, por exemplo, as FIGs. 2A a 2G, que representam estruturas exemplificativas de GO, G1,G-1e G2.
[0135]Anticorpo "afucosilado" ou anticorpo "sem fucose" refere-se a um anticorpo de isótipo IIG1 ou IgG3 que carece de fucose na glicosilação de sua região constante. A glicosilação da IgG1 ou IgG3 humana ocorre na Asn297 como uma dglicosilação de oligossacarídeos complexos biantenários fucosilados que termina com até 2 resíduos de Gal. Em algumas modalidades, um anticorpo afucosilado carece de fucose na Asn297. Esses estruturas são designadas como resíduos de glicano GO, G1 (1,6 ou 1,3) ou G2, dependendo da quantidade de resíduos de Gal terminais. Vide, por exemplo, Raju, T. S., BioProcess Int. 1: 44-53 (2003). A glicosilação de tipo CHO do anticorpo Fc é descrita, por exemplo, em Routier, F. FL, Glycoconjugate J. 14: 201-207 (1997). Várias glicoformas de anticorpo são ilustradas nas FIGs. 2A a 2G.
[0136]EM algumas modalidades, anticorpo "afucosil" ou "afucosilado", conforme usados de maneira intercambiável neste documento, refere-se a um anticorpo que foi glicoelaborado para carecer da fucose de núcleo. Anticorpos com o teor de fucose reduzido em grupamentos glicano têm maior afinidade pelo FeyRllla (CD16) e, como resultado, possuem citotoxicidade celular dependente da complementaridade (ADCC) intensificada. Os anticorpos afucosilados podem ser produzidos usando a linha celular CHOKISV Potelligent& (Lonza Biologics), que carece de ambos os alelos do gene responsável pela adição de fucose (a1,6- fucosiltransferase). Anticorpos afucosilados ou de fucose reduzida também podem ser gerados modificando as atividades de biossíntese de oligossacarídeos de diversas maneiras. Por exemplo, a superexpressão de N-acetilglicosamina- transferase Ill (GnTIIl) no aparelho de Golgi da linha celular produtora gera estruturas de oligossacarídeos bipartidos associadas à região constante Fc do anticorpo e suprime a fucosilação. Nesses sistemas de expressão, o nível de expressão de GnTIIl correlaciona-se à geração de glicoformas de IgG1 afucosiladas, resultando em atividade de ADCC intensificada. A fucosilação também pode ser reduzida na estrutura celular pelo uso de análogos de açúcar, tais como, entre outros, análogos da fucose conforme descritos na WO 2012/019165. Sendo assim, anticorpos afucosilados, ou de fucose reduzida, podem ser produzidos usando uma ampla variedade de métodos bem conhecidos no setor.
[0137]Em algumas modalidades, um anticorpo afucosilado tem a afinidade pelo Fc gama RIIIA intensificada. Em algumas modalidades, um anticorpo afucosilado tem a afinidade pelo Fc gama RIIIA (V158) intensificada. Em algumas modalidades, um anticorpo afucosilado tem a afinidade pelo Fc gama RIIIA (F158) intensificada.
[0138]"Glicoforma" refere-se a uma estrutura de oligossacarídeos complexos que compreende ligações de várias unidades de carboidrato. Essas estruturas são descritas, por exemplo, em Essentials of Glycobiology Varki et a/., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1999), que também oferece o exame da nomenclatura de glicobiologia padrão. Essas glicoformas incluem, entre outras, G2, G1, GO, G-1 e G-2 (vide, por exemplo, a Publicação de Patente Internacional nº WO 99/22764).
[0139]Define-se "padrão de glicosilação" como o padrão de unidades de carboidrato que ligam-se covalentemente a uma proteína (por exemplo, a glicoforma), bem como sítio(s) a que a(s) glicoforma(s) ligam-se covalentemente ao backbone de peptídeo de uma proteína, mais especificamente a uma proteína de imunoglobulina.
[0140]Em algumas modalidades, ao menos 85% de uma batelada de anticorpos expressos de maneira recombinante em células hospedeiras CHO não glicomodificadas são fucosilados na Asn297. Quando da referência a uma composição que compreende vários anticorpos, os anticorpos são considerados afucosilados se menos que cerca de 5% dos anticorpos na composição compreenderem fucose em ao menos uma Asn297. Ainda mais preferivelmente, o nível de afucosilação é de cerca de 100%, ou seja, nenhuma fucose é detectada em nenhuma Asn297 da cadeia pesada usando métodos conhecidos para medir a fucosilação de um anticorpo. Métodos para medir a fucose incluem quaisquer métodos conhecidos no setor, incluindo os métodos descritos neste documento. Em algumas modalidades, a fucose é indetectável em uma composição que compreende vários anticorpos afucosilados. Em algumas modalidades, um anticorpo afucosilado possui a atividade de ADCC intensificada.
[0141]"Citotoxicidade dependente do complemento" ou "CDC" refere-se à lise de uma célula alvo na presença do complemento. A ativação da via de complemento clássica é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema complementar (Clg) com anticorpos (da subclasse apropriada), que ligam-se a seu antígeno cognato. Para avaliar a ativação complementar, é possível realizar um ensaio CDC, por exemplo, conforme descrito em Gazzano-Santoro et al, J. Immunol. Methods 202: 163 (1996). Anticorpos com sequências de aminoácidos da região Fc alteradas e maior ou menor capacidade de ligação com Clq são descritos, por exemplo, na Patente dos EUA nº 6, 194.551 B |, na Patente dos EUA nº
7.923.538, na Patente dos EUA nº 7.994.290 e na WO 1999/51642. Vide também, por exemplo, Idusogie et a/., J.
[0142]Conforme usados neste documentos, os termos "aminoácido do tipo selvagem", "IgG do tipo selvagem", "anticorpo do tipo selvagem" ou "mAb do tipo selvagem" referem-se a uma sequência de aminoácidos ou ácido nucleico que ocorre naturalmente dentro de certa população (por exemplo, seres humanos, camundongos, ratos, células etc.).
[0143]"Receptor de quimiocinas C-X-C do tipo 5" ou "CXCR5", usados de maneira intercambiável neste documento, também chamados na técnica de "CD185" e "receptor do linfoma de Burkitt 1 (BLR1)", são um receptor acoplado à proteína G expresso em certas células. O termo CXCRS5 inclui homólogos e ortólogos do CXCRS5, incluindo de seres humanos, do macaco cinomolgo, de ratos, de coelhos e de camundongos, entre outros. Conforme usado neste documento, "CXCRS5" refere- se a um CXCR5 de um mamífero, tal como de ser humano, rato ou camundongo, bem como a um CXCR5 não humano de primata, bovino, ovino ou suíno. Exemplos não exaustivos de CXCR5 incluem o CXCR5 humano (vide, por exemplo, o Número de Acesso no Genbank P60568, SEQ ID Nº: 32), o CXCR5 do macaco cinomolgo (vide, por exemplo, o Número de Acesso no Genbank Q29615, SEQ ID Nº: 33) e o CXCR5 de camundongo (SEQ ID Nº: 34). O termo "CXCR5" também abrange fragmentos, variantes, isoformas e outros homólogos dessas moléculas de CXCR5. Moléculas de CXCR5 variantes geralmente serão caracterizadas por ter o mesmo tipo de atividade que o CXCR5 de ocorrência natural, tal como a capacidade de ligar-se ao receptor CXCR5, a capacidade de induzir a atividade mediada pelo receptor, e a capacidade de ligar-se, ou não, ao anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, da invenção.
[0144]O CXCR5 pode compreender um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, dez ou mais, doze ou mais ou quinze ou mais resíduos acessíveis pela superfície do CXCR5. A FIG. 6 ilustra as sequências de aminoácidos do CXCR5 humano do tipo selvagem e do CXCR5 de camundongo, onde exemplos de resíduos acessíveis pela superfície são sublinhados. Quando o CXCR5 compreende uma forma homomultimérica do CXCRS5, o alvo pode compreender um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, dez ou mais, doze ou mais, quinze ou mais resíduos acessíveis pela superfície de uma primeira subunidade do CXCRS5, e um ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, dez ou mais, doze ou mais, ou quinze ou mais resíduos acessíveis pela superfície de uma segunda subunidade do CXCR5. À molécula alvo pode compreender um epítopo conhecido do CXCR5.
[0145]Conforme mencionado previamente, sequências de aminoácidos do CXCR5 humano do tipo selvagem (hOCXCR5) e do CXCR5 de camundongo (MCXCR5) alinhadas, indicando (por meio de sublinhado) várias regiões extracelulares exemplificativas (rotuladas "N," "L1," "L2" e "3") das proteínas, são ilustradas na FIG. 5.
[0146]Conforme delineado em outra parte neste documento, certas posições da molécula do anticorpo podem ser alteradas. Entende-se por "posição", conforme usado neste documento, uma localização na sequência de uma proteína. As posições podem ser numeradas em sequência, ou de acordo com um formato consagrado, por exemplo, o índice EU e o índice Kabat podem ser usados para numerar os resíduos de aminoácido de um anticorpo. Por exemplo, a posição 297 é uma posição no anticorpo IgG1 humano. As posições correspondentes são determinadas conforme esboçado acima, geralmente por alinhamento com outras sequências-pai.
[0147]Entende-se por "resíduo", conforme usado neste documento, uma posição em uma proteína e sua identidade de aminoácidos associada. Por exemplo, a Asparagina 297 (também chamada de Asn297, também chamada de N297) é um resíduo no anticorpo IgG1 humano.
[0148]Os termos "célula Tfh" ou "Tfh" ou "Tfh bona fide" ou "célula Tfh de centro germinativo" ou "célula Tfh de GC", conforme usados neste documento, referem-se a células T auxiliares foliculares dentro do centro germinativo (GC), que é uma estrutura composta por células Tfh de GC, células B de GC, células dendríticas foliculares (FDCs), macrófagos, e estroma. Vide Crotty, 2014, Immunity 41(4):529-
542. As células Tfh são identificadas pela expressão constitutiva do receptor CXCR5 homing do folículo de células B. Funcionalmente, as células Tfh emitem sinais instrutivos a células B para orientar a troca de isótipos, hipermutações somáticas e a rápida divisão celular para semear centros germinativos.
[0149]Os termos "células similares a Tfh", "células Tfh circulantes" e "cTfh", usados de maneira intercambiável neste documento, referem-se a células Tfh que deixaram o centro germinativo. Ao deixar o GC, as células adquirem um fenótipo menos ativado e menos polarizado e são chamadas de "células T auxiliares foliculares circulantes" (cTfh) ou "células similares a Tfh". Vide Crotty, 2014, Immunity 41(4):529-542. Essas células expressam o CXCR5. Em comparação a células Tfh de centro germinativo (isto é, "células Tfh bona fide" ou "células Tfh de GC" ou "Tfh"), as células cTfh (isto é, células similares a Tfh) expressam níveis reduzidos de ICOS, Bcl-6 e marcadores de ativação celular, tais como CD69 e HLA- DR, mas mantêm a capacidade de estimular a produção do Ab e a troca de classe de lg em células B in vitro quando da reativação com antígenos cognatos.
[0150]Como é de conhecimento na técnica, "polinucleotídeo" ou "ácido nucleico", conforme usados de maneira intercambiável neste documento, referem-se a cadeias de nucleotídeos de qualquer comprimento e incluem DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos ou bases modificados, e/ou seus análogos, ou qualquer substrato que possa ser incorporado a uma cadeia por DNA ou RNA polimerase. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e seus análogos. Se presente, uma modificação à estrutura de um nucleotídeo pode ser realizada antes ou após a montagem da cadeia. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídeos. Um polinucleotídeo pode ser adicionalmente modificado após a polimerização, tal como por conjugação com um componente marcador.
Outros tipos de modificações incluem, por exemplo, "caps", substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural por um análogo, modificações entre nucleotídeos como, por exemplo, aqueles com ligações não carregadas (por exemplo, fosfonatos de metila, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos etc) e com ligações carregadas (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos etc.), os que contêm grupamentos pendentes, tais como, por exemplo, proteínas (por exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeos de sinal, poli-L-lisina etc.), os que contêm intercaladores (por exemplo, acridina, psoraleno etc.), os que contêm queladores (por exemplo, metais, metais radioativos, boro, metais oxidativos etc.), os que contêm alquiladores, os que contêm ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos etc.), bem como formas não modificadas do(s) polinucleotídeo(s). Além disso, qualquer um dos grupos hidroxila normalmente presentes nos açúcares pode ser substituído, por exemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegido por grupos protetores padrão, ou ativado para preparar ligações adicionais com nucleotídeos adicionais, ou pode ser conjugado a suportes sólidos.
O OH 5º e 3' terminal pode ser fosforilado ou substituído com aminas ou grupamentos de grupos de capeamento de cadeia orgânicos de 1 a 20 átomos de carbono.
Outras hidroxilas também podem ser derivatizadas em grupos protetores padrão.
Os polinucleotídeos também podem conter formas análogas de açúcares de ribose ou desoxirribose que são amplamente conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, 2'-O-metil-, 2'-O-alil, 2'-flúor- ou 2'- azido-ribose, análogos de açúcar carbocíclico, açúcares alfa- ou beta-anoméricos, açúcares epiméricos, tais como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares de piranose, açúcares de furanose, sedoheptuloses, análogos acíclicos e análogos de nucleosídeo abásicos, tais como metil ribosídeo.
Uma ou mais ligações de fosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligação alternativos.
Esses grupos de ligação alternativos incluem, entre outros, modalidades em que o fosfato é substituído por P(O)S("ticato"”), P(S)S ("ditivato”), (ONR2 ("amidato"), P(OJR, P(O)OR', CO ou CH>2 ("formacetal"), em que cada R ou R' é independentemente H ou alquila (1-20 C) substituída ou não substituída contendo uma ligação éter (-O-), arila, alquenila, cicloalquila, cicloalquenila ou araldila. Nem todas as ligações em um polinucleotídeo precisam ser idênticas. A descrição precedente aplica-se a todos os polinucleotídeos citados neste documento, incluindo RNA e DNA.
[0151]Conforme usado neste documento, "vetor" significa um constructo que é capaz de distribuir, e de preferência expressar, um ou mais genes ou sequências de interesse em uma célula hospedeira. Exemplos de vetores incluem, entre outros, vetores virais, vetores de expressão de DNA ou RNA nus, plasmídeos, vetores de cosmídeos ou fagos, vetores de expressão de DNA ou RNA associados a agentes condensadores catiônicos, vetores de expressão de DNA ou RNA encapsulados em lipossomas, e certas células eucarióticas, tais como células produtoras.
[0152]Uma "célula hospedeira" inclui uma célula individual, ou cultura de células, que pode ser ou foi receptora de vetor(es) para a incorporação de insertos de polinucleotídeo. Células hospedeiras incluem a progênie de uma célula hospedeira simples, e a progênie pode não necessariamente ser totalmente idêntica (no que diz respeito à morfologia ou ao complemento de DNA genômico) à célula-pai original devido a mutação natural, acidental ou deliberada. Uma célula hospedeira inclui células transfectadas e/ou transformadas in vivo com um polinucleotídeo da presente invenção.
[0153]As células hospedeiras podem ser procariontes ou eucariontes. Exemplos de células eucariontes incluem células de mamíferos, tais como células de animais primatas ou não primatas; células de fungos, tal como de leveduras; células de vegetais; e células de insetos.
[0154]Qualquer célula hospedeira susceptível à cultura celular, e à expressão de proteínas ou polipeptídeos, pode ser utilizada de acordo com a presente invenção.
Em certas modalidades, a célula hospedeira é de um mamífero.
Linhas de células mamiíferas disponíveis como hospedeiras para expressão são conhecidas no setor e incluem muitas linhas de células imortalizadas disponíveis pela American Type Culture Collection (ATCC). Exemplos não exaustivos de células mamiíferas incluem, entre outros, células NSO0, HEK 293 e células do ovário do hamster chinês (CHO), e seus derivados, tais como células 293-6E e CHO DG44, CHO DXB11 e células CHOKISV Potelligentê (BioWa/Lonza, Allendale, NJ). Células hospedeiras mamíferas também incluem, entre outras, células do carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2), células renais de hamster bebê (BHK, ATCC CCL 10), células renais de macaco (COS) e células do carcinoma hepatocelular humano (por exemplo, Hep G2). Outros exemplos não exaustivos de células mamíferas que podem ser usadas de acordo com a presente invenção incluem retinoblastos humanos (PER.C66; CruCell, Leiden, Países Baixos); linha de células CV1 renais de macaco transformadas por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linha de células renais embrionárias humanas 293 (HEK 293) ou células 293 subclonadas para crescimento na cultura de suspensão (Graham et al., 1977, J.
Gen Virol. 36:59); células de Sertoli de camundongo (TM4, Mather, 1980, Biol.
Reprod. 23:243-251); células renais de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células renais do macaco-verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1 587); células renais caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células hepáticas do rato-búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TR1 (Mather et al., 1982, Annals N.Y.
Acad.
Sci. 383:44-68); células MRC 5; células FS4; uma linha de hepatoma humano (Hep G2); e várias linhas células de mieloma, inclusive, entre outras, linha de mieloma de camundongo BALB/c (NS0/1, ECACC No: 85110503), células NSO e células Sp2/0.
[0155]Além disso, qualquer número de linhas celulares comercialmente disponíveis ou não que expressem polipeptídeos ou proteínas pode ser utilizado de acordo com a presente invenção. Os versados na técnica apreciarão que diferentes linhas celulares podem ter diferentes requisitos de nutrição e/ou podem exigir diferentes condições de cultura para o crescimento e expressão ideais de polipeptídeos ou proteínas, e serão capazes de modificar as condições de acordo com o necessário.
[0156]A invenção inclui qualquer sistema de expressão eucarionte conhecido na técnica ou revelado neste documento para a produção de proteínas de interesse, tal como expressão em um sistema de células de inseto, um sistema de expressão em leveduras, ou um sistema de células mamíferas, tal como, entre outras, células CcHO.
[0157]Conforme usado neste documento, "sequência de controle de expressão" significa uma sequência de ácido nucleico que orienta a transcrição de um ácido nucleico. Uma sequência de controle de expressão pode ser um promotor, tal como um promotor constitutivo ou induzível, ou um intensificador. A sequência de controle de expressão liga-se operacionalmente à sequência de ácido nucleico que será transcrita.
[0158]Conforme usado neste documento, "tratamento" é uma abordagem para obter resultados clínicos benéficos ou desejados. Para fins da presente invenção, resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, entre outros, um ou mais dos seguintes: taxa de sobrevivência aprimorada (mortalidade reduzida), redução na resposta inflamatória à doença, redução na quantidade de fibrose de tecido, melhora na aparência física das lesões da doença, limitação das lesões patológicas a sítios focais, menor extensão do dano da doença, menor duração da doença, e/ou redução no número, grau ou duração de sintomas relacionados à doença. O termo inclui a administração dos compostos ou agentes da presente invenção para prevenir ou retardar o princípio dos sintomas, complicações ou indícios bioquímicos de uma doença, atenuando assim os sintomas ou detendo ou inibindo novo desenvolvimento da doença, condição ou transtorno. O tratamento pode ser a supressão profiláctica (para prevenir ou retardar o início da doença, ou para prevenir a manifestação de sintomas clínicos ou subclínicos da mesma) ou a supressão terapêutica ou melhora dos sintomas após a manifestação da doença.
[0159]"Melhora" significa a atenuação ou aprimoramento de um ou mais sintomas em comparação à não administração de um anticorpo do CXCR5. "Melhora" também inclui o encurtamento ou redução na duração de um sintoma.
[0160]Conforme usado neste documento, uma "dosagem eficaz" ou "quantidade eficaz" de um fármaco, composto ou composição farmacêutica é uma quantidade suficiente para desempenhar quaisquer um ou mais resultados benéficos ou desejados. Em aspectos mais específicos, uma quantidade eficaz previne, atenua ou melhora os sintomas de uma doença ou infecção e/ou prolonga a sobrevivência do paciente em tratamento. No uso profiláctico, resultados benéficos ou desejados incluem eliminar ou reduzir o risco, diminuir a gravidade ou retardar o início da doença, incluindo sintomas bioquímicos, histológicos e/ou comportamentais da doença, suas complicações, e fenótipos patológicos intermediários que se apresentem durante o desenvolvimento da doença. No uso terapêutico, resultados benéficos ou desejados incluem resultados clínicos como reduzir um ou mais sintomas de uma doença, transtorno ou condição mediada pelo CXCR5, reduzir a dose de outros medicamentos necessários para tratar a doença, intensificar o efeito de outro medicamento, e/ou retardar a progressão da doença no paciente. Uma dosagem eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações. Para fins da presente invenção, uma dosagem de fármaco, composto ou composição farmacêutica eficaz é uma quantidade suficiente para consumar o tratamento profiláctico ou terapêutico, seja direta ou indiretamente. Como é entendido no contexto clínico, uma dosagem eficaz de um fármaco, composto ou composição farmacêutica pode ou não ser obtida junto com outro fármaco, composto ou composição farmacêutica. Sendo assim, uma "dosagem eficaz" pode ser considerada no contexto da administração de um ou mais agentes terapêuticos, e um agente simples pode ter sua administração em uma quantidade eficaz considerada se, junto com um ou mais outros agentes, um resultado desejável puder ser obtido ou for obtido.
[0161]Um "indivíduo" ou "paciente" é um mamífero, mais preferivelmente um ser humano. Mamíferos também incluem, entre outros, animais de fazenda (por exemplo, vacas, porcos, cavalos, frangos etc.), animais esportivos, animais de estimação, primatas, cavalos, cães, gatos, camundongos e ratos. Em algumas modalidades, o indivíduo é considerado com risco de contrair uma doença, transtorno ou condição mediada pela ou associada à ligação do CXCR5 com seu receptor e à sinalização mediada pela mesma. Em certas modalidades, o paciente possui uma doença, transtorno ou condição autoimune, tal como diabetes tipo 1. Em certas modalidades, o paciente necessita de uma terapia de imunossupressão.
[0162]Conforme usado neste documento, "veículo farmaceuticamente aceitável" ou "excipiente farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer material que, quando combinado a um ingrediente ativo, permite que o ingrediente mantenha sua atividade biológica e não é reativo ao sistema imunológico do paciente. Exemplos incluem, entre outros, qualquer um dos veículos farmacêuticos padrão, tais como soro fisiológico tamponado com fosfato, água, emulsões como emulsão óleo/água, e vários tipos de agentes umectantes. Diluentes preferidos para administração por aerossol ou administração parentérica incluem soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) ou soro fisiológico normal (0,9%). Composições compreendendo esses veículos são formuladas por métodos convencionais familiares (vide, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18º edição, A. Gennaro, ed., Mack Publishing
Co., Easton, PA, 1990; e Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20º Ed., Mack Publishing, 2000).
[0163]Exemplos de métodos e materiais são descritos neste documento, embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento também possam ser usados na prática ou em testes da presente invenção. Os materiais, métodos e exemplos são meramente ilustrativos e não exaustivos.
Il. ANTICORPOS ANTI-CXCR5
[0164]A presente invenção refere-se a anticorpos que ligam-se ao CXCRS5. De preferência, os anticorpos ligam-se especificamente ao CXCRS5, isto é, ligam-se ao CXCR5 mas não se ligam de maneira detectável, ou ligam-se com menor afinidade, a outras moléculas. A invenção refere-se ainda a anticorpos anti-CXCR5 que exibem uma função efetora alterada. Em algumas modalidades, a função efetora alterada é aumento na ADCC. Em algumas modalidades, os anticorpos carecem de fucose, ou contêm níveis detectavelmente menores dela (isto é, são afucosilados). A invenção também se refere a composições que compreendem esses anticorpos, bem como a usos para esses anticorpos, inclusive usos terapêuticos e farmacêuticos.
[0165]EmM uma modalidade, a presente invenção propõe qualquer um dos seguintes, ou composições (inclusive composições farmacêuticas) que compreendem, um anticorpo com uma sequência de cadeia leve, ou um fragmento da mesma, e uma cadeia pesada, ou um fragmento da mesma, derivado de qualquer um dos seguintes anticorpos: 11G2, 41A10 e 5H7.
[0166]Os anticorpos úteis na presente invenção podem abranger anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, fragmentos de anticorpo (por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc etc.), anticorpos quiméricos, anticorpos biespecíficos, anticorpos heteroconjugados, cadeia única (ScFv), mutantes dos mesmos, proteínas de fusão compreendendo um fragmento de anticorpo (por exemplo, um anticorpo de domínio), anticorpos humanizados, e qualquer configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreenda um sítio de reconhecimento de antígeno da especificidade necessária, inclusive variantes de anticorpo por glicosilação, variantes de anticorpo por sequência de aminoácidos, e anticorpos covalentemente modificados. Os anticorpos podem ser anticorpos de camundongos, ratos, seres humanos ou de qualquer outra origem (inclusive anticorpos quiméricos ou humanizados). Em algumas modalidades, o anticorpo CXCR5 é um anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humano ou humanizado.
[0167]Os anticorpos do CXCR5 da invenção podem ser produzidos por qualquer método conhecido no setor. Técnicas gerais para a produção de anticorpos humanos e de camundongo são conhecidas no setor e/ou são descritas neste documento.
[0168]Após a identificação inicial, a atividade de um anticorpo do CXCR5 candidato pode ser adicionalmente confirmada e refinada por bioensaios, conhecidos por testar as atividades biológicas almejadas. Em algumas modalidades, utiliza-se um ensaio de células in vitro para caracterizar adicionalmente um anticorpo do CXCR5 candidato. Por exemplo, bioensaios podem ser usados para triar diretamente os candidatos. Alguns dos métodos para identificar e caracterizar um anticorpo do CXCRS5 são descritos em detalhes nos Exemplos.
[0169]EmM alguns aspectos, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende ao menos uma sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo composto pela sequência de VH do 11G2 de camundongo, VL do 11G2 de camundongo, VH do h11G2 (XC155), VH do h11G2 (XC156), VH do h11G2 (XC157), VH do h11G2 (XC350), VH do h11G2 (XC351), VH do h11G2 (XC352), VH do h11G2 (XC353), VH do h11G2 (XC354), VL do h11G2
(XC151), h11G2 VL (XC153), VL do h11G2 (XC154), VL do h11G2 (XC346), VL do h11G2 (XC347), VL do h11G2 (XC348), VL do h11G2 (XC349), VH do 41A10 de camundongo, VL do 41A10 de camundongo, VH do h41A10 (XC147), VH do h41A10 (XC148), VH do h41A10 (XC150), VL do h41A10 (XKC142), VL do h41A10 (XKC143), VL do h41A10 (XKC144), VL do h41A10 (XKC145), VL do h41A10 (XKC146), VL do h41A10 (XC149), VH do 5H7 de camundongo, e VL do 5H7 de camundongo.
[0170]Em alguns aspectos, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compete com qualquer um dos anticorpos acima para ligar-se ao CXCRS5.
[0171JEmM alguns aspectos, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma sequência de aminoácidos de VH e uma sequência de aminoácidos de VL compreendendo as combinações a seguir: Um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que compete para ligar- se ao CXCR5 humano com um dentre 11G2 de camundongo, 11G2 quimérico, VH (XC152)/VL (XC151) do h11G2, VH (XKC152)/VL (XC153) do h11G2, VH (XC152)/VL do h11G2 (XC154), VH (XC152)/VL do h11G2 (XC346), VM (XC152)/VL do h11G2 (XC347), VH (KC152)/VL (XC348) do h11G2, VH (XC152)/VL (XC349) do h11G2, VH (XC155)/VL (XC151) do h11G2, VH (XC155)VL (XC153) do h11G2, VH (XC155)/VL (XC154) do h11G2, VH (XKC155)/VL (XC346) do h11G2, VH (XC155)/VL (XC347) do h11G2, VH (XC155)/VL (XC3484) do h11G2, VH (KC155)/VL (XC349) do h11G2, VH (KC156)/VL (XC151) do h11G2, VH (KC156)/VL (XC153) do h11G?2, VH (XC156)/VL (XC154) do h11G2, VH (XC156)VL (XC346) do h11G2, VH (XC156)/VL (XC347) do h11G2, VH (XKC156)/VL (XC348) do h11G2, VH (XC156)/VL (XC349) do h11G2, VH (XKC157)/VL (XKC151) do h11G2, VH (XC157)/VL (XC153) do h11G2, VH (XC157)/VL (XC154) do h11G2, VH (XC157)/VL (XC346) do h11G2, VM (XC157)/ VL (XC347) do h11G2, VH (XC157)/ VL (XC348) do h11G2, VH (XC157)/ VL (XC349) do h11G2, VH (XC350)/ VL (XC151) do h11G2, VH (XC350)/ VL
(XC153) do h11G2, VH (XC350)/ VL (XKC154) do h11G2, VH (XC350)/ VL (XKC346) do h11G2, VH (XC350) VL (XC347) do h11G2, VH (XC350)/ VL (XC348) do h11G2, VH (XC350)/ VL (XC349) do h11G2, VH (XC351)/ VL (XC151) do h11G2, VH (XC351)/ VL (XC153) do h11G2, VH (XC351)/ VL (XC154) do h11G2, VH (XC351)/ VL (XC346) h11G2, VH (XC351)/ VL (XC347) h11G2, VH (XC351) VL (XC348) h11G2, e VH (XC351)/ VL (XC349) h11G2, VH (XC352)/ VL (XC151) h11G2, VÁ (XC352)/ VL (XKC153) h11G2, VH (XC352) VL (XC154) h11G2, VH (XC352)/ VL (XC346) h11G2, VH (XKC352)/ VL (XC347) do h11G2, VH (XC352) VL (XC348) do h11G2, VH (XC352)/ VL (XC349) do h11G2, VH (XC353)/ VL (XC151) do h11G2, VÁ (XC353)/ VL (XC153) do h11G2, VH (XC353)/ VL (XC154) do h11G2, VH (XC353)/ VL (XC346) do h11G2, VH (XC353)/ VL (XC347) do h11G2, VH (XC353)/ VL (XC348) do h11G2, VH (XC353)/ VL (XC349) do h11G2, VH (XC354) VL (XC151) do h11G2, VH (XC354)/ VL (XC153) do h11G2, VH (XC354)/ VL (XC154) do h11G2, VH (XC354)/ VL (XKC346) do h11G2, VH (XKC354) VL (XC347) do h11G2, VH (XC354)/ VL (XKC348) do h11G2, VH (XC354) VL (XC349) do h11G2, 41A10 de camundongo, 41A10 quimérico, VH (XC147)/ VL (XC142) do h41A10, VH (XC147)/ VL (XC143) do h41A10, VH (KC147)/ VL (XKC144) do h41A10, VH (XC147)/ VL (XC145) do h41A10, VH (XC147)/ VL (XC146) do h41A10, VH (XC147)/ VL (XC149) do h41A10, VH (XKC148)/ VL (XKC142) do h41A10, VH (XC148)/ VL (XKC143) do h41A10, VH (XC148)/ VL (XC144) do h41A10, VH (XC148)/ VL (XC145) do h41A10, VH (XC148)/ VL (XC146) do h41A10, VH (XC148)/ VL (XKC149) do h41A10, VH (XC150)/ VL (XKC142) do h41A10, VH (XC150)/ VL (XC143) do h41A10, VH (XC150)/ VL (XC144) do h41A10, VH (XKC150)/ VL (XC145) do h41A10, VH (XC150)/ VL (XC146) do h41A10, VH (XC150)/ VL (XC149) do h41A10, 5H7 de camundongo e 5H7 quimérico.
[0172]Em alguns aspectos, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compete com qualquer um dos anticorpos acima para ligar-se ao CXCRS5.
[0173]EmM alguns aspectos, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma CDR-L1, uma CDR-L2 e uma CDR-L3, conforme definidas na sequência de aminoácidos de ao menos um dos SEQ ID Nº: 1, 5, 35, 47, 48, 49, 50 e 51.
[0174]EM alguns aspectos, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende ainda uma CDR-H1, uma CDR-H2 e uma CDR- H3, conforme definidas na sequência de aminoácidos de ao menos um dos SEQ ID Nº: 6, 10, 12, 36, 52, 53, 54, 55, 56, 57.
[0175]EmM alguns aspectos, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma CDR-L1, uma CDR-L2, uma CDR-L3, conforme definidas na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1, e uma CDR-H1, uma CDR-H2 e uma CDR-H3, conforme definidas na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 6.
[0176]Em alguns aspectos, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma CDR-L1, uma CDR-L2, uma CDR-L3, conforme definidas na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1, e uma CDR-H1, uma CDR-H2 e uma CDR-H3, conforme definidas na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 10.
[0177]EmM alguns aspectos, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma CDR-L1, uma CDR-L2, uma CDR-L3, conforme definidas na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1, e uma CDR-H1, uma CDR-H2 e uma CDR-H3, conforme definidas na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 12.
[0178]EmM alguns aspectos, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma CDR-L1, uma CDR-L2, uma CDR-L3, conforme definidas na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1, e uma CDR-H1, uma CDR-H2 e uma CDR-H3, conforme definidas na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 52.
[0179]Em alguns aspectos, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende ainda uma CDR-H1, uma CDR-H2 e uma CDR- H3, conforme definidas na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 6, e uma CDR- L1, uma CDR-L2 e uma CDR-L3, conforme definidas na sequência de aminoácidos de ao menos um dos SEQ ID Nº: 1, 5, 35, 47, 48, 49, 50 e 51.
[0180]Em alguns aspectos, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende ainda uma CDR-H1, uma CDR-H2 e uma CDR- H3, conforme definidas na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 10, e uma CDR-L1, uma CDR-L2 e uma CDR-L3, conforme definidas na sequência de aminoácidos de ao menos um dos SEQ ID Nº: 1, 5, 35, 47, 48, 49, 50 e 51.
[0181]EmM alguns aspectos, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende ainda uma CDR-H1, uma CDR-H2 e uma CDR- H3, conforme definidas na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 12, e uma CDR-L1, uma CDR-L2 e uma CDR-L3, conforme definidas na sequência de aminoácidos de ao menos um dos SEQ ID Nº: 1, 5, 35, 47, 48, 49, 50 e 51.
[0182]EmM alguns aspectos, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende ainda uma CDR-H1, uma CDR-H2 e uma CDR- H3, conforme definidas na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 52, e uma CDR-L1, uma CDR-L2 e uma CDR-L3, conforme definidas na sequência de aminoácidos de ao menos um dos SEQ ID Nº: 1, 5, 35, 47, 48, 49, 50 e 51.
[0183]EmM alguns aspectos, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende ainda uma CDR-H1, uma CDR-H2 e uma CDR-
H3, conforme definidas na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 27, e uma CDR-L1, uma CDR-L2 e uma CDR-L3, conforme definidas na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 26.
[0184]Em alguns aspectos, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma CDR-L1, uma CDR-L2 e uma CDR-L3, conforme definidas na sequência de aminoácidos codificada pelo inserto do plasmídeo depositado junto à ATCC com o número de Acesso PTA-124324.
[0185]JEmM alguns aspectos, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma CDR-H1, uma CDR-H2 e uma CDR-H3, conforme definidas na sequência de aminoácidos codificada pelo inserto do plasmídeo depositado junto à ATCC com o número de Acesso PTA-124323.
[0186]Em alguns aspectos, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma CDR-L1, uma CDR-L2 e uma CDR-L3, conforme definidas na sequência de aminoácidos codificada pelo inserto do plasmídeo depositado junto à ATCC com o número de Acesso PTA-124324, e uma CDR-H1, uma CDR-H2e uma CDR-H3, conforme definidas na sequência de aminoácidos codificada pelo inserto do plasmídeo depositado junto à ATCC com número de Acesso PTA-124323.
[0187]EmM alguns aspectos, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compete com qualquer um dos anticorpos acima para ligar-se ao CXCRS5.
[0188]EmM alguns aspectos, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma CDR-L1 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2, uma CDR-L2 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 3, uma CDR-L3 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 4, uma CDR-H1 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 7, uma CDR-H2 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 8, e uma CDR-H3 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 9.
[0189]Em alguns aspectos, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma CDR-L1 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2, uma CDR-L2 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 3, uma CDR-L3 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 4, uma CDR-H1 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 7, uma CDR-H2 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 8, e uma CDR-H3 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 11.
[0190]Em alguns aspectos, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma CDR-L1 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2, uma CDR-L2 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 3, uma CDR-L3 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 4, uma CDR-H1 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 19, uma CDR-H2 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 20, e uma CDR-H3 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 21.
[0191]Em alguns aspectos, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma CDR-L1 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 14, uma CDR-L2 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 15, uma CDR-L3 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 16, uma CDR-H1 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 19, uma CDR-H2 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 20, e uma CDR-H3 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 21.
[0192]EmM alguns aspectos, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma CDR-L1 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 14, uma CDR-L2 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 15, uma CDR-L3 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 16, uma CDR-H1 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 7, uma CDR-H2 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 8, e uma CDR-H3 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 9.
[0193]Em alguns aspectos, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende uma CDR-L1 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 14, uma CDR-L2 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 15, uma CDR-L3 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 16, uma CDR-H1 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 8, uma CDR-H2 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 9, e uma CDR-H3 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 10.
[0194]Em alguns aspectos, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende as sequências de aminoácidos de CDR-H1, CDR- H2 e CDR-H3, conforme definidas em ao menos uma das sequências de SEQ ID Nº: 6, 10, 12, 36, 52, 53, 54, 55, 56 e 57.
[0195JEmM alguns aspectos, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende as sequências de aminoácidos de CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3, conforme definidas em ao menos uma das sequências de SEQ ID Nº: 1,5, 35, 47, 48, 49, 50 e 51.
[0196]Em alguns aspectos, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende as sequências de aminoácidos de CDR-L1, CDR- L2 e CDR-L3 conforme definidas no SEQ ID Nº: 5.
[0197]O anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, pode compreender uma VH com uma sequência de aminoácidos ao menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 6. A VH pode compreender uma sequência de aminoácidos ao menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 6. A VH pode compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 6.
[0198]O anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, pode compreender uma VH com uma sequência de aminoácidos ao menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 10. A VH pode compreender uma sequência de aminoácidos ao menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 10. A VH pode compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 10.
[0199]O anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, pode compreender uma VH com uma sequência de aminoácidos ao menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 12. A VH pode compreender uma sequência de aminoácidos ao menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 12. A VH pode compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 12.
[0200]O anticorpo, ou fragmento de ligação com anticorpo do mesmo, pode compreender uma VL com uma sequência de aminoácidos ao menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1. A VL pode compreender uma sequência de aminoácidos ao menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1. A VL pode compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1.
[0201]O anticorpo, ou fragmento de ligação com anticorpo do mesmo, pode compreender uma VL com uma sequência de aminoácidos ao menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 5. A VL pode compreender uma sequência de aminoácidos ao menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 5. A VL pode compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 5.
[0202]O anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, pode compreender uma VH com uma sequência de aminoácidos ao menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 17. A VH pode compreender uma sequência de aminoácidos ao menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 17. A VH pode compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 17.
[0203]O anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, pode compreender uma VH com uma sequência de aminoácidos ao menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 18. A VH pode compreender uma sequência de aminoácidos ao menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 18. A VH pode compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 18.
[0204]O anticorpo, ou fragmento de ligação com anticorpo do mesmo, pode compreender uma VL com uma sequência de aminoácidos ao menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 13. A VL pode compreender uma sequência de aminoácidos ao menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 13. A VL pode compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 13.
[0205]O anticorpo, ou fragmento de ligação com anticorpo do mesmo, pode compreender uma VL com uma sequência de aminoácidos ao menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 58. A VL pode compreender uma sequência de aminoácidos ao menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 58. A VL pode compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 58.
[0206]Em um aspecto, o anticorpo afucosilado, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, pode compreender uma cadeia pesada com uma VH selecionada dentre uma VH compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 10, SEQ ID Nº: 12, SEQ ID Nº: 36, SEQ ID Nº: 52, SEQ ID Nº: 53, SEQ ID Nº: 54, SEQ ID Nº: 55, SEQ ID Nº: 56 ou SEQ ID Nº: 57, e compreendendo ainda o domínio constante da IgG1 (SEQ ID Nº: 31). Em um aspecto, a referida variante de anticorpo compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 substituições conservadoras ou não conservadoras e/ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 adições e/ou deleções à cadeia pesada de comprimento total. Em outro aspecto, a referida variante compartilha ao menos 65%, ao menos 75%, ao menos 85%, ao menos 90%, ao menos 95%, ao menos 96%, ao menos 97%, ao menos 98% ou ao menos 99% de identidade de sequência com a cadeia pesada de comprimento total, em que o referido anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, liga-se especificamente ao CXCR5.
[0207]Um anticorpo afucosilado da invenção pode compreender uma cadeia leve com uma VL compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1, SEQ ID Nº: 5, SEQ ID Nº: 35, SEQ ID Nº: 47, SEQ ID Nº: 48, SEQ ID Nº: 49, SEQ ID Nº: 50 ou SEQ ID Nº: 51, em que o anticorpo compreende ainda um domínio constante de cadeia leve. Conforme exposto mais plenamente em outra parte neste documento, o domínio constante de cadeia leve do anticorpo afucosilado pode ser selecionado dentre uma região constante CK ou CA, por exemplo, a região constante CK de SEQ ID Nº: 30. Em um aspecto, a referida variante de anticorpo compreende 1, 2,3, 4,5, 6,7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 substituições conservadoras ou não conservadoras e/ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 adições e/ou deleções à cadeia leve de comprimento total. Em outro aspecto, a referida variante compartilha ao menos 65%, ao menos 75%, ao menos 85%, ao menos 90%, ao menos 95%, ao menos 96%, ao menos 97%, ao menos 98% ou ao menos 99% de identidade de sequência com a cadeia leve de comprimento total, em que o referido anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, liga-se especificamente ao CXCRS5.
[0208]O anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, pode compreender uma HC com uma sequência de aminoácidos ao menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 29. A HC pode compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 29. De preferência, o anticorpo é afucosilado.
[0209]O anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, pode compreender uma LC com uma sequência de aminoácidos ao menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ao SEQ ID Nº: 28. ALC pode compreender a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 28. De preferência, o anticorpo é afucosilado.
[0210]De preferência, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, da invenção é afucosilado. Ainda mais preferivelmente, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, é afucosilado e exibe aumento na função efetora da ADCC em comparação a um anticorpo que é fucosilado, mas fora isso idêntico.
Substituições de linha germinativa
[0211]JEm certas modalidades, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende as sequências de CDR de cadeia pesada a seguir: (i) CDR-H1 compreendendo o SEQ ID Nº: 7, CDR-H2 compreendendo o SEQ ID Nº: 8, e CDR-H3 compreendendo o SEQ ID Nº: 9 ou 11; e/ou (ii) as sequências de CDR de cadeia leve a seguir: CDR-L1 compreendendo o SEQ ID Nº: 2, CDR-L2 compreendendo o SEQ ID Nº: 3, e CDR-L3 compreendendo o SEQ ID Nº: 4. Essas são CDRs de camundongo e, de preferência, são enxertadas ou adicionadas de alguma outra forma no contexto de um domínio de VH e VL humano. Uma ampla variedade de sequências de linha germinativa humana aceitantes encontram-se ao dispor, e o processo para "humanizar" um anticorpo de espécie não humana para uso em seres humanos será reconhecido pelos versados na técnica e também discutido em outra parte neste documento. Logo, os versados na técnica apreciarão que as sequências de CDR de camundongo acima podem ser colocadas no contexto de sequências de aminoácidos do domínio V humano. Ao fazê-lo, geralmente efetuam-se mudanças às sequências de linha germinativa humana aceitantes para preservar a ligação do anticorpo e outras características desejáveis do anticorpo-pai original (isto é, doador). Tanto as CDRs quanto as regiões de framework (FW) podem ser desenvolvidas de acordo com o seguinte.
[0212]Em certas modalidades, não mais que 11, ou não mais que 10, não mais que 9, não mais que 8, não mais que 7, não mais que 6, não mais que 5, não mais que 4, não mais que 3, não mais que 2 ou não mais que 1 substituição é feita na CDR-L1 em relação à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2. Em certas modalidades, não mais que 6, não mais que 5, não mais que 4, não mais que 3, não mais que 3, não mais que 2 ou não mais que uma substituição é feita na CDR-L2 em relação à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 3. Em certas modalidades, não mais que 8, não mais que 7, não mais que 6, não mais que 5, não mais que 4, não mais que 3, não mais que 3, não mais que 2 ou não mais que uma substituição é feita na CDR-L3 em relação à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 4. Em algumas modalidades, não mais que 10, não mais que 9, não mais que 8, não mais que 7, não mais que 6, não mais que 5, não mais que 4, não mais que 3, não mais que 2 ou não mais que 1 substituição é feita na CDR-H1 em relação à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 7. Em algumas modalidades, não mais que 17, não mais que 16, não mais que 15, não mais que 14, não mais que 13, não mais que 12, não mais que 11 ou não mais que 10, não mais que 9, não mais que 8, não mais que 7, não mais que 6, não mais que 5, não mais que 4, não mais que 3, não mais que 2 ou não mais que 1 substituição é feita na CDR-H2 em relação à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 8. Em algumas modalidades, não mais que 12, não mais que 11 ou não mais que 10, não mais que 9, não mais que 8, não mais que 7, não mais que 6, não mais que 5, não mais que 4, não mais que 3, não mais que 2 ou não mais que 1 substituição é feita na CDR-H3 em relação à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 9 ou em relação à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 11. Em certas modalidades, as uma ou mais substituições não mudam o valor de afinidade de ligação (Ko) em mais de 1.000 vezes, mais de 100 vezes, ou 10 vezes. Em certas modalidades, a substituição é uma substituição conservadora de acordo com a Tabela 1.
[0213]Em certas modalidades, a substituição é uma substituição de linha germinativa humana em que um resíduo de CDR (doador) é substituído pelo resíduo de linha germinativa humana correspondente (aceitante) para aumentar o teor de aminoácidos humanos e potencialmente reduzir a imunogenicidade do anticorpo conforme descrito, por exemplo, na Publicação de Pedido de Patente dos EUA nº 2017/0073395 e em Townsend et al. 2015, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 112(50):15354-15359). Por exemplo, se o framework de DPK9 de linha germinativa humana for usado e o anticorpo exemplificativo VL do 11G2 (XC154) de camundongo ou humanizado forem comparados a ele, logo o alinhamento da CDR- L1 do anticorpo VL do 11G2 (XC154) (de camundongo ou humanizado) (SEQ ID Nº: 2) e do DPKA9 de linha germinativa humana é o seguinte:
Posição 27 28 29 30 31 32 33 34 35 DPK9 de Linha GerminativxaHumana =Q S | Ss S Y L NNW VL do 11G2 (SEQ ID Nº: 2) E S VE Y H GTS
[0214]Para o aminoácido na posição número 28 (itálico), o resíduo da linha germinativa humana (aceitante) e o resíduo da VL do 11G2 (XC154) correspondente (doador) são iguais, e uma substituição na linha germinativa não é possível. No caso das posições 27, 29, 30, 31, 32, 33, 34 e 35 (negritas e sublinhadas), o resíduo da linha germinativa humana (aceitante) e o resíduo da VL do 11G2 (XC154) correspondente (doador) são diferentes. Os resíduos da VL do 11G2 (XC154) nessas posições podem ser substituídos pelo resíduo do DPK9 de linha germinativa humana correspondente para aumentar ainda mais o teor de resíduos humanos. O mesmo processo pode ser seguido para cada CDR de cadeia pesada e leve a fim de aumentar o teor de resíduos de aminoácido humanos ao mesmo tempo em que conservam-se as características de ligação, por exemplo, ligação com epítopo, afinidade e seus semelhantes, e ao mesmo tempo em que minimiza-se o teor de resíduos de camundongo, reduzindo assim qualquer imunogenicidade em potencial, por exemplo, resposta imunológica do anticorpo humano anti-camundongo (HAMA), ao anticorpo em um ser humano.
[0215]Métodos e bibliotecas para introduzir resíduos de linha germinativa humana em CDRs de anticorpo são descritos em detalhes na Publicação de Pedido de Patente dos EUA nº 2017/0073395 e em Townsend et a/l., 2015, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112(50):15354-15359, ambos os quais incorporam-se ao presente documento por referência na íntegra.
[0216]O anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, pode compreender um framework de VH com uma sequência de framework de VH de linha germinativa humana. A sequência do framework de VH pode ser de uma linha germinativa VH3 humana, uma linha germinativa VH1 humana, uma linha germinativa VH5 humana ou uma linha germinativa VH4 humana. Frameworks de cadeia pesada de linha germinativa humana preferidos são frameworks derivados das linhas germinativas VH1, VH3 ou VH5. Por exemplo, os frameworks de VH das linhas germinativas a seguir podem ser usados: IGHV3-23, IGHV3-7 ou IGHV1-69 (os nomes das linhas germinativas baseiam-se na definição de linhas germinativas do IMGT). Frameworks de cadeia leve de linha germinativa humana preferidos são frameworks derivados das linhas germinativas VK ou VX. Por exemplo, os frameworks de VL das linhas germinativas a seguir podem ser usados: IGKV1-39 ou IGKV3-20 (os nomes das linhas germinativas baseiam-se na definição de linhas germinativas do IMGT). Como alternativa, ou em aditamento, a sequência de framework pode ser uma sequência de framework consenso de linha germinativa humana, tal como o framework da sequência consenso VX1 humana, sequência consenso VK1 humana, sequência consenso VK2 humana, sequência consenso VK3 humana, sequência consenso de linha germinativa VH3 humana, sequência consenso de linha germinativa VH1 humana, sequência consenso de linha germinativa VH5 humana, ou sequência consenso de linha germinativa VH4 humana. Sequências de frameworks de linha germinativa humana são disponibilizadas por vários bancos de dados públicos, tais como V-base, IMGT, NCBI ou Abysis.
[0217]O anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, pode compreender um framework de VL com uma sequência de framework de VL de linha germinativa humana. O framework de VL pode compreender uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácidos, ao mesmo tempo em que mantém similaridade funcional e estrutural com a linha germinativa da qual deriva. Em alguns aspectos, o framework de VL é ao menos 90%, ao menos 91%, ao menos 92%, ao menos 93%, ao menos 94%, ao menos 95%, ao menos 96%, ao menos 97%, ao menos 98%, ao menos 99% ou 100% idêntico a uma sequência de framework de VL de linha germinativa humana. Em alguns aspectos, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende um framework de VL com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 substituições, adições ou deleções de aminoácidos em relação à sequência de framework de VL de linha germinativa humana. Em alguns aspectos, as 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substituições, adições ou deleções de aminoácidos dão-se apenas nas regiões de framework. Em alguns aspectos, a % de identidade baseia-se na similaridade com a VL, excluindo-se os fragmentos definidos neste documento como CDRs.
[0218]O framework de VL de linha germinativa humana pode ser o framework de DPK9 (nome IMGT: IGKV1-39). O framework de VL de linha germinativa humana pode ser o framework de DPK12 (nome IMGT: IGKV2D-29). O framework de VL de linha germinativa humana pode ser o framework de DPK18 (nome IMGT: IGKV2-30). O framework de VL de linha germinativa humana pode ser o framework de DPK24 (nome IMGT: IGKV4-1). O framework de VL de linha germinativa humana pode ser o framework de HK102 V1 (nome IMGT: IGKV1-5). O framework de VL de linha germinativa humana pode ser o framework de DPK1 (nome IMGT: IGKV1-33). O framework de VL de linha germinativa humana pode ser o framework de DPK8 (nome IMGT: IGKV1-9). O framework de VL de linha germinativa humana pode ser o framework de DPK3 (nome IMGT: IGKV1-6). O framework de VL de linha germinativa humana pode ser o framework de DPK21 (nome IMGT: IGKV3-15). O framework de VL de linha germinativa humana pode ser o framework de Vg 38K (nome IMGT: IGKV3-11). O framework de VL de linha germinativa humana pode ser o framework de DPK22 (nome IMGT: IGKV3-20). O framework de VL de linha germinativa humana pode ser o framework de DPK15 (nome IMGT: IGKV2-28). O framework de VL de linha germinativa humana pode ser o framework de DPK16 (nome IMGT: IGLV3-19). O framework de VL de linha germinativa humana pode ser o framework de DPL8 (nome IMGT: IGLV1-40). O framework de VL de linha germinativa humana pode ser o framework de V1-22 (nome IMGT: IGLV6-57). O framework de VL de linha germinativa humana pode ser o framework da sequência consenso V* humana. O framework de VL de linha germinativa humana pode ser o framework da sequência consenso V11 humana. O framework de VL de linha germinativa humana pode ser o framework da sequência consenso V13 humana. O framework de VL de linha germinativa humana pode ser o framework da sequência consenso VK humana. O framework de VL de linha germinativa humana pode ser o framework da sequência consenso VK1 humana. O framework de VL de linha germinativa humana pode ser o framework da sequência consenso VK2 humana. O framework de VL de linha germinativa humana pode ser o framework da sequência consenso VK3 humana.
[0219]Em alguns aspectos, o framework de VL é DPK9. Espera-se que outras regiões de framework similares também distribuam anticorpos vantajosos da invenção compreendendo CDRs de SEQ ID Nº: 2, 3, 4, 7, 8, 9, 11, 14, 15, 16; e CDRs especificadas pelas sequências de aminoácidos de VL a seguir: 1, 5, 13, 28, 35, 37, 39, 47, 48, 48, 50, 51, 58, 59, 60, 61, 62, 97, 98, incluindo DPK5, DPKA, DPK1, IGKV1-5*01, DPK24, DPK21, DPK15, IGKV1-13*02, IGKV1-17*01, DPKS8, IGKV3-11*01 e DPK22 que compreendem 99%, 97%, 97%, 96%, 80%, 76%, 66%, 97%, 97%, 96%, 76% e 74% de identidade, respectivamente, com a região FW de DPK-9 e uma ou menos diferenças de aminoácidos em elementos estruturais em comum (Numeração Kabat) (A) resíduos diretamente sob a CDR (Zona de Vernier), L2, L4, L35, L36, L46, L47, L48, L49, L64, L66, L68, L69, L71, (B) Resíduos de embalagem de Cadeia VH/VL: L36, L38, L44, L46, L87 e (C) Resíduos de suporte estrutural de CDR canônicos L2, L48, L64, L71 (vide Lo, "Antibody Humanization by CDR Grafting", (2004) Antibody Engineering, Vol. 248, Methods in Molecular Biology, págs.135-159 e O'Brien and Jones, "Humanization of Monoclonal Antibodies by CDR
Grafting", (2003) Recombinant Antibodies for Cancer Therapy, Vol. 207, Methods in Molecular Biology, págs. 81-100). As regiões de framework de DPK5, DPKA4, DPK1, IGKV1-5*01, DPK24, DPK21 e DPK15 compartilhando 99%, 97%, 97%, 96%, 80%, 76%, 66% de identidade com o DPK9, respectivamente, são particularmente preferidas e não têm diferenças de aminoácidos nesses elementos estruturais comuns. Em alguns aspectos, a % de identidade baseia-se na similaridade com a VL, excluindo-se os fragmentos definidos neste documento como CDRs.
[0220]O anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, pode compreender um framework de VH com uma sequência de framework de VH de linha germinativa humana. O framework de VH pode compreender uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácidos, ao mesmo tempo em que mantém similaridade funcional e estrutural com a linha germinativa da qual deriva. Em alguns aspectos, o framework de VH é ao menos 90%, ao menos 91%, ao menos 92%, ao menos 93%, ao menos 94%, ao menos 95%, ao menos 96%, ao menos 97%, ao menos 98%, ao menos 99% ou 100% idêntico a uma sequência de framework de VH de linha germinativa humana. Em alguns aspectos, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compreende um framework de VH com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 substituições, adições ou deleções de aminoácidos em relação à sequência de framework de VH de linha germinativa humana. Em alguns aspectos, as 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substituições, adições ou deleções de aminoácidos dão-se apenas nas regiões de framework. Em alguns aspectos, a % de identidade baseia-se na similaridade com a VH, excluindo-se os fragmentos definidos neste documento como CDRs.
[0221]O framework de VH de linha germinativa humana pode ser o framework de DP54 ou IGHV3-7. O framework de VH de linha germinativa humana pode ser o framework de DP47 ou IGHV3-23. O framework de VH de linha germinativa humana pode ser o framework de DP71 ou IGHV4-59. O framework de
VH de linha germinativa humana pode ser o framework de DP75 ou IGHV1-2 02. O framework de VH de linha germinativa humana pode ser o framework de DP10 ou IGHV1-69. O framework de VH de linha germinativa humana pode ser o framework de DP7 ou IGHV1-46. O framework de VH de linha germinativa humana pode ser o framework de DP49 ou IGHV3-30. O framework de VH de linha germinativa humana pode ser o framework de DP51 ou IGHV3-48. O framework de VH de linha germinativa humana pode ser o framework de DP38 ou IGHV3-15. O framework de VH de linha germinativa humana pode ser o framework de DP79 ou IGHV4-39. O framework de VH de linha germinativa humana pode ser o framework de DP78 ou IGHV4-30-4. O framework de VH de linha germinativa humana pode ser o framework de DP73 ou IGHV5-51. O framework de VH de linha germinativa humana pode ser o framework de DP50 ou IGHV3-33. O framework de VH de linha germinativa humana pode ser o framework de DP46 ou IGHV3-30-3. O framework de VH de linha germinativa humana pode ser o framework de DP31 ou IGHV3-9. O framework de VH de linha germinativa humana pode ser o framework da sequência consenso VH humana. O framework de VH de linha germinativa humana pode ser o framework da sequência consenso VH3 humana. O framework de VH de linha germinativa humana pode ser o framework da sequência consenso VH5 humana. O framework de VH de linha germinativa humana pode ser o framework da sequência consenso VH1 humana. O framework de VH de linha germinativa humana pode ser o framework da sequência consenso VH4 humana.
[0222]Em alguns aspectos, o framework de VH é DP-54. Espera-se que outras regiões de framework similares também distribuam anticorpos vantajosos da invenção compreendendo CDRs de SEQ ID Nº: 7, 8, 9, 11,19, 20, 21, e CDRs especificadas pelas sequências de aminoácidos de VH a seguir: 6, 10, 12, 17, 18, 36, 38, 40, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 63, 96, incluindo DP-50, IGHV3-30*09, IGHV3- 30*15, IGHV3-48*01, DP-77, DP-51, IGHV3-66*01, DP-53, DP-48, IGHV3-53*01,
IGHV3-30*02 e DP-49 que compreendem 93%, 92%, 92%, 99%, 97%, 97%, 96%, 96%, 94%, 94%, 93%, 92% de identidade, respectivamente, com a região FW de DP-54 e uma ou menos diferenças de aminoácidos em elementos estruturais em comum (Numeração Kabat) (A) resíduos diretamente sob a CDR (Zona de Vernier), H2, H47, H48 e H49, H67, H69, H71, H73, H93, H94 , (B) Resíduos de embalagem de Cadeia VH/VL: H37, H39, H45, H47, H91, H93 e (C) resíduos de suporte estrutural de CDR canônicos H24, H71, H94 (vide Lo 2004, e O'Brien and Jones 2003). Regiões de framework de DP-50, IGHV3-30*09, IGHV3-30*15 compartilhando 93%, 92% e 92% de identidade com DP-54, respectivamente, são particularmente preferidas e não têm diferenças de aminoácidos nesses elementos estruturais comuns. Em alguns aspectos, a % de identidade baseia-se na similaridade com a VH, excluindo-se os fragmentos definidos neste documento como CDRs.
[0223]Em certas modalidades, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, descrito neste documento compreende (i) uma VH com uma sequência de aminoácidos que é ao menos 50%, ao menos 60%, ao menos 70%, ao menos 75%, ao menos 80%, ao menos 85%, ao menos 90%, ao menos 91%, ao menos 92%, ao menos 93%, ao menos 94%, ao menos 95%, ao menos 96%, ao menos 97%, ao menos 98%, ao menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 8, e/ou (ii) uma VL com uma sequência de aminoácidos que é ao menos 50%, ao menos 60%, ao menos 66%, ao menos 70%, ao menos 75%, ao menos 76%, ao menos 80%, ao menos 85%, ao menos 90%, ao menos 91%, ao menos 92%, ao menos 93%, ao menos 94%, ao menos 95%, ao menos 96%, ao menos 97%, ao menos 98%, ao menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1 Qualquer combinação dessas sequências de VL e VH também é contemplada pela invenção.
[0224]Em certas modalidades, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, descrito neste documento compreende (i) uma HC com uma sequência de aminoácidos que é ao menos 50%, ao menos 60%, ao menos 70%, ao menos 75%, ao menos 80%, ao menos 85%, ao menos 90%, ao menos 91%, ao menos 92%, ao menos 93%, ao menos 94%, ao menos 95%, ao menos 96%, ao menos 97%, ao menos 98%, ao menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 29; e/ou (ii) uma LC com uma sequência de aminoácidos que é ao menos 50%, ao menos 60%, ao menos 70%, ao menos 75%, ao menos 80%, ao menos 85%, ao menos 90%, ao menos 91%, ao menos 92%, ao menos 93%, ao menos 94%, ao menos 95%, ao menos 96%, ao menos 97%, ao menos 98%, ao menos 99% ou 100% idêntica à sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 28. Qualquer combinação dessas sequências de HC e LC também é contemplada pela invenção.
[0225]Em certas modalidades, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, descrito neste documento compreende um domínio Fc. O domínio Fc pode ser derivado da IgA (por exemplo, IgA: ou IgÃz), IgG, IgE ou IgG (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 ou I9G4).
[0226]A invenção também propõe um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que compete para ligar-se ao CXCR5 humano com qualquer anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, descrito neste documento, tal como qualquer um dos anticorpos propostos neste documento (ou fragmento de ligação com antígeno dos mesmos). Por exemplo, se a ligação de um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, com o CXCR5 humano impede a ligação subsequente com o CXCR5 humano pelo CXCL13, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, compete com o CXCL13 pela ligação com o CXCR5 humano.
[0227]Os anticorpos, e fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos, propostos pela invenção incluem anticorpos monocionais, anticorpos policlonais, fragmentos de anticorpo (por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2a, Fv, Fc etc.), anticorpos quiméricos, anticorpos biespecíficos, anticorpos heteroconjugados, cadeia única (ScFv), mutantes dos mesmos, proteínas de fusão compreendendo uma porção de anticorpo, anticorpos de domínio (dAbs), anticorpos humanizados, e qualquer configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreenda um sítio de reconhecimento de antígeno da especificidade necessária, incluindo variantes de anticorpos por glicosilação, variantes de anticorpos por sequência de aminoácidos, e anticorpos covalentemente modificados. Os anticorpos, e fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos, podem ser anticorpos de camundongos, ratos, seres humanos ou de qualquer outra origem (inclusive anticorpos quiméricos ou humanizados). Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo quimérico, humanizado ou humano. Em certas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humano. Em certas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humanizado.
Mapeamento dos epítopos
[0228]A invenção também propõe um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga-se ao mesmo epítopo do CXCR5 humano que um anticorpo, ou fragmento de ligação com o mesmo, descrito neste documento. Por exemplo, ensaios de competição de anticorpos (e a análise dos epítopos sobrepostos) podem ser avaliados por SPR, citometria de fluxo e qualquer outro ensaio conhecido no setor.
[0229]Em um aspecto, a invenção abrange um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga-se ao CXCR5 humano e ao CXCR5 cinomolgo mas não se liga ao CXCR5 de camundongo.
[0230]A invenção também inclui um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga-se especificamente à região N-terminal ("N") do CXCR5 humano. O terminal N do CXCR5 compreende os resíduos de aminoácido de número 1 a 51 com base na numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 31.
[0231]A invenção inclui um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga-se especificamente ao CXCR5 em um epítopo que compreende leucina (L) na posição de resíduo de aminoácido número 11, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32.
[0232]Em um aspecto, a invenção inclui um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga-se especificamente ao CXCR5 em um epítopo que compreende aspartato (D) na posição de resíduo de aminoácido número 22, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32.
[0233]Em um aspecto, a invenção inclui um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga-se especificamente ao CXCR5 em um epítopo que compreende leucina na posição de resíduo de aminoácido número 11 e aspartato na posição de resíduo de aminoácido número 22, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32.
[0234]A invenção inclui um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga-se especificamente ao CXCR5 quando o resíduo de aminoácido na posição número 11 é leucina, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32.
[0235]A invenção inclui um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga-se especificamente ao CXCR5 quando o resíduo de aminoácido na posição número 11 é leucina, mas não se liga ao CXCR5 em que o resíduo de aminoácido na posição número 11 é treonina, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32.
[0236]EmM um aspecto, a invenção inclui um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga-se especificamente ao CXCR5 humano do tipo selvagem, mas não se liga ao mesmo quando a posição de resíduo de aminoácido número 11, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32, não é leucina.
[0237]A invenção inclui um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga-se especificamente ao CXCR5 quando o resíduo de aminoácido na posição número 22 é aspartato, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32.
[0238]EmM um aspecto, a invenção inclui um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga-se especificamente ao CXCR5 humano do tipo selvagem, mas não se liga ao mesmo quando o resíduo de aminoácido na posição número 22 não é aspartato, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32.
[0239]Em um aspecto, a invenção inclui um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga-se especificamente ao CXCR5 humano do tipo selvagem, mas não se liga ao mesmo quando a posição de resíduo de aminoácido número 22 é alanina, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32.
[0240]A invenção inclui um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga-se especificamente ao CXCR5 quando o resíduo de aminoácido na posição número 11 é leucina e o resíduo de aminoácido na posição número 22 é aspartato, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº:
32.
[0241]JEmM um aspecto, a invenção inclui um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga-se especificamente ao CXCR5 humano, mas não se liga ao mesmo quando o resíduo de aminoácido na posição número 11 não é leucina e o resíduo de aminoácido na posição número 22 não é aspartato, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32.
[0242]EmM um aspecto, a invenção inclui um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga-se especificamente ao CXCR5 humano, mas não se liga ao mesmo quando o resíduo de aminoácido na posição número 11 é leucina e o resíduo de aminoácido na posição número 22 é alanina, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32.
[0243]Os versados na técnica apreciarão, à luz dos ensinamentos da presente invenção, que o resíduo de aminoácido na posição número 11 e/ou na posição número 22, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32, são fundamentais para a ligação de um anticorpo da invenção. Mais especificamente, esses resíduos de aminoácido são fundamentais para a ligação do anticorpo 11G2 com o CXCRS5, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo. Sendo assim, os versados na técnica entenderão que a invenção inclui um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga-se especificamente ao CXCR5 quando o resíduo de aminoácido na posição 11 é leucina e o resíduo de aminoácido na posição 22 é aspartato. A substituição ou deleção desses resíduos de aminoácido podem resultar na perda de ligação com o CXCR5. Certas substituições do resíduo de aminoácido na posição 11 podem preservar a ligação, mas não a substituição desse resíduo de aminoácido (leucina) por treonina. À semelhança, certas substituições ou a deleção do resíduo de aminoácido na posição 22 podem preservar a ligação, mas não a substituição do aspartato nesse resíduo de aminoácido número por alanina. Logo, uma característica do anticorpo 11G2, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, ou de um anticorpo que compete com ele para ligar-se, é que o anticorpo liga-se ao CXCR5 humano quando leucina 11 e aspartato 22 fazem-se presentes, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32, mas não se liga ao mesmo quando a leucina 11 é substituída por treonina, ou por outro resíduo de aminoácido, e não se liga ao mesmo quando o aspartato 22 é substituído por alanina, ou por outro resíduo de aminoácido. Testes para averiguar a perda de ligação após uma substituição de aminoácidos na posição resíduo de aminoácido número 11 e/ou número 22 podem ser realizados usando uma ampla variedade de métodos bem conhecidos no setor, incluindo análise de ligação usando polipeptídeos com mutação pontual de acordo com os métodos exemplificados neste documento.
[0244])Com base nos ensinamentos propostos neste documento, os versados na técnica apreciarão que um anticorpo da invenção pode competir, por exemplo, com o 11G2, e mesmo assim não compreender um epítopo com leucina no resíduo de aminoácido número 11 e/ou aspartato no resíduo de aminoácido número 22, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32. Ou seja, um anticorpo pode competir com um anticorpo da invenção para ligar-se ao CXCR5, mas a ligação do anticorpo competidor não é afetada quando a leucina no resíduo de aminoácido número 11 ou o aspartato no resíduo de aminoácido número 22 forem substituídos por um aminoácido diferente (por exemplo, treonina por leucina e/ou alanina por aspartato), por exemplo, 2C9, 11A7 e 16D7. Sendo assim, o anticorpo da invenção compete para ligar-se ao CXCR5 e também não se liga ao CXCR5 quando o resíduo de aminoácido número 11 não é leucina, e, mais especificamente, é treonina, e/ou quando o resíduo de aminoácido número 22 não é aspartato, e mais especificamente, é alanina. Conforme mencionado previamente em outra parte neste documento, a produção de proteínas CXCR5 mutantes e ensaios para avaliar a ligação de anticorpos em competição são bem conhecidos no setor, incluindo os métodos descritos neste documento. Sendo assim, com base nos ensinamentos propostos neste documento, os versados na técnica seriam prontamente capazes de identificar anticorpos que ligam-se ao CXCR5, competem para ligar-se a um anticorpo da invenção e perdem a capacidade de ligar-se a muteínas do CXCR5 quando certos aminoácidos foram substituídos, por exemplo,
leucina 11, aspartato 22 ou ambos, todos de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32.
[0245]Em outro aspecto, a invenção inclui um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que compete com o anticorpo 11G2, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, para ligar-se, sendo que o anticorpo não se liga ao CXCR5 quando o resíduo de aminoácido número 11 não é leucina, de acordo com a numeração da sequência de aminoácido de SEQ ID Nº: 32.
[0246]Em outro aspecto, a invenção inclui um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que compete com o anticorpo 11G2, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, para ligar-se, sendo que o anticorpo não se liga ao CXCR5 quando o resíduo de aminoácido número 22 não é aspartato, de acordo com a numeração da sequência de aminoácido de SEQ ID Nº: 32.
[0247]Em outro aspecto, a invenção inclui um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que compete com o anticorpo 11G2, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, para ligar-se, sendo que o anticorpo não se liga ao CXCR5 quando o resíduo de aminoácido número 11 não é leucina e o resíduo de aminoácido número 22 não é aspartato, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32.
[0248]Em outro aspecto, a invenção inclui um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que compete com o anticorpo 11G2, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, para ligar-se, sendo que o anticorpo não se liga ao CXCR5 quando o resíduo de aminoácido número 11 é treonina, de acordo com a numeração da sequência de aminoácido de SEQ ID Nº: 32.
[0249]Em outro aspecto, a invenção inclui um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que compete com o anticorpo 11G2, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, para ligar-se, sendo que o anticorpo não se liga ao CXCR5 quando o resíduo de aminoácido número 22 é alanina, de acordo com a numeração da sequência de aminoácido de SEQ ID Nº: 32.
[0250]Em outro aspecto, a invenção inclui um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que compete com o anticorpo 11G2, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, para ligar-se, sendo que o anticorpo não se liga ao CXCR5 quando o resíduo de aminoácido número 11 é treonina e quando o resíduo de aminoácido número 22 é alanina, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 32.
Atividade biológica de anticorpos anti-CXCR5
[0251]Além de ligar-se a um epítopo no CXCRS5, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, da invenção pode mediar uma atividade biológica. Ou seja, a invenção inclui um anticorpo isolado, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga-se especificamente ao CXCR5 e medeia ao menos uma atividade detectável selecionada dentre as seguintes: (a) liga-se a células CXCR5+ com alta afinidade aparente, mas não se liga a células que expressam órtologos de camundongo, rato ou coelho do CXCR5; (b) antagoniza a inibição do CXCL13 à liberação de CAMP provocada pela forscolina; (c) provoca a ADCC de células que expressam o CXCR5 em PBMCs de doadores humanos e cinomolgas e TMCs de doadores humanos; (d) liga-se ao CXCR5 humano mas não se liga aos receptores de quimiocinas humanos CCR1, CCR2, CCR3, CCRA4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR1I0, CMKLR1I, CXCR3R1, CXCR1I, CXCR?2, CXCR3, CXCR4, CXCR6, CXCR7 ou XCR1; (e) depleta células B no sangue periférico e/ou em órgãos linfoides secundários (isto é, linfonodos, baço, placas de Peyer e tecido linfoide associado à mucosa); (f) depleta células similares a Tfh no sangue periférico; (g) depleta células Tfh bona fide nos órgãos linfoides secundários; e (h) debilita a resposta da memória imunológica humoral.
[0252]Em um aspecto, a invenção inclui um anticorpo que liga-se a células CXCR5+ com alta afinidade aparente, mas não se liga a células expressando órtologos de camundongo, rato ou coelho do CXCRS5; A ligação por afinidade aparente pode ser avaliada por citometria de fluxo para detectar a ligação do anticorpo com células expressando a proteína alvo (por exemplo, CXCR5). As células podem ser transfectadas transiente ou estavelmente com um ácido nucleico que codifica o CXCR5. Como alternativa, as células podem ser células que expressam naturalmente o CXCR5 em sua superfície. Independentemente da fonte de células CXCR5+, a ligação do anticorpo com as células pode ser prontamente avaliada por uma variedade de métodos reconhecidos na técnica. O anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, liga-se ao CXCR5 humano, ou CXCRS5 cinomolgo, mas não se liga de maneira detectável, ou liga-se em grau muito menor, com o CXCR5 de camundongo, rato ou coelho.
[0253]A invenção inclui um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga-se especificamente ao CXCR5 e antagoniza uma atividade mediada pela ligação do CXCL13 com o CXCR5. Há muitos ensaios conhecidos na técnica para determinar a inibição de uma atividade mediada pela sinalização de CXCR5-CXCL13. Um ensaio desse tipo é o ensaio-repórter com cAMP. Nesse ensaio, a forscolina induz à produção de cAMP, que é inibida pela sinalização de CXCR5-CXCL13 em uma célula que expressa estavelmente o CXCR5. A capacidade do anticorpo anti-CXCR5 de ligar-se ao CXCR5 e antagonizar o efeito da sinalização de CXCR5-CXCL13 é determinada, portanto, medindo o nível de cAMP produzido na presença ou ausência do anticorpo. De preferência, o anticorpo pode mediar um aumento dependente da dose nos níveis de CAMP com uma EC50 de cerca de 50 pM, cerca de 100 pM, cerca de 200 pM, cerca de 400 pM, cerca de 600 PM, cerca de 700 pM, cerca de 750 pM, cerca de 790 pM, cerca de 800 pM, cerca de 850 pM, cerca de 900 pM, cerca de 950 pM, cerca de 960 pM, cerca de 970 pM,
cerca de 980 pM, cerca de 990 pM ou cerca de 1.000 pM. Mais preferivelmente, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, inibe a inibição do CXCL13 à produção de cAMP provocada pela forscolina com uma EC50 de cerca de 961 pM.
[0254]A invenção inclui um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga-se especificamente ao CXCR5 e que provoca a ADCC de células que expressam o CXCR5 em PBMCs de doadores humanos e cinomolgas e em células mononucleares tonsilares (TMCs) humanas. Muitos ensaios de ADCC podem ser usados para avaliar a atividade de ADCC de um anticorpo. Um ensaio exemplificativo desse tipo é descrito neste documento nos Exemplos 6 e 7, mas a presente invenção não se limita a esse ensaio de ADCC específico. A invenção inclui um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que exibe uma atividade de ADCC sobre células B humanas, células similares a Tfh humanas, células Tfh humanas e células B de macaco cinomolgo com uma EC50 de cerca de 0,11 pM, 0,2 pM, 0,5 pM, 1 pM, 1,5 pM, 2,0 pM, 2,5 pM, 3,0 pM, 4,5 pM, 4,8 pM, 5,0 PM, 6,0 pM, 7,0 pM, 8,0 pM, 9,0 pM, 10 pM, 11 pM, 12 pM, 15 pM, 20, pM, 25 pM, 30 PM, 35 pM ou 40 pM. Mais preferivelmente, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, exibe atividade de ADCC com uma EC50 de cerca de 2,01 + 2,28 pM contra células B humanas, cerca de 4,82 + 2,88 pM contra células similares a Tfh humanas, cerca de 0,11 pM contra células Thf humanas, e cerca de 15,3 + 11,7 pM contra células B cinomolgas. Ainda mais preferivelmente, o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, é afucosilado.
[0255]A invenção abrange um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga-se ao CXCR5 humano mas não se liga de maneira detectável às proteínas humanas CCR1, CCR2, CCR3, CCRA4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR1I0, CMKLR1, CXCR3R1, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCRA, CXCR6, CXCR7 ou XCR1.
[0256]A invenção abrange um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga-se especificamente ao CXCR5 e exibe depleção dependente da dose de células B no sangue periférico. A depleção pode ser permanente, ou, mais preferivelmente, a depleção é transiente e/ou reversível. Em um aspecto, uma dose de anticorpo suficiente para mediar a depleção de células B pode variar de 0,001 a cerca de 0,2 mg, em que 0,0001 mg/kg pode mediar uma depleção de células B e células similares a Tfh no sangue periférico de macacos cinomolgos de cerca de 50% em comparação à porcentagem de células B ou células similares a Tfh no sangue periférico quando o anticorpo não é administrado. Além disso, o anticorpo pode mediar a depleção máxima de células B e células similares a Tfh no sangue periférico de um macaco cinomolgo que recebeu uma dose menor que 5 mg/kg administrados por via intravenosa (IV). De preferência, a recuperação parcial a total de células B, células similares a Tfh e células Tfh ocorre após a administração do anticorpo.
[0257]A invenção inclui um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga-se especificamente ao CXCRS5 e debilita a resposta da memória imunológica humoral. Em um aspecto, a resposta da memória humoral é avaliada usando um ensaio de revogação de vacina. Ou seja, o anticorpo é administrado a um paciente que foi vacinado previamente com um antígeno, por exemplo, toxoide tetânico (TT). O paciente recebe uma segunda administração do antígeno, e a resposta imunológica, por exemplo, titulações da IgM e IgG, é comparada à resposta imunológica em um paciente a quem o anticorpo não foi administrado, mas fora isso idêntico. Os versados na técnica apreciarão, uma vez absorvidos os ensinamentos revelados neste documento, que muitos ensaios para determinar a resposta da memória humoral podem ser usados para avaliar a capacidade de o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, debilitar a resposta da memória humoral. Além disso, os versados na técnica apreciarão que a capacidade de debilitar a resposta de memória humoral é uma característica desejada para um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, para uso como produto terapêutico no tratamento ou prevenção de uma doença imunológica em um paciente que dele necessita.
[0258]A invenção abrange um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que exibe ao menos uma, de preferência duas, ainda mais preferivelmente três, ainda mais preferivelmente quatro, mais preferivelmente ainda cinco, ainda mais preferivelmente seis, mais preferivelmente sete, e ainda mais preferivelmente todas as atividades biológicas discutidas acima.
Ill. ANTICORPOS ANTI-CXCR5 AFUCOSILADOS
[0259]Em uma modalidade, são propostos anticorpos com uma estrutura de carboidrato que carece de fucose ligada (direta ou indiretamente) a uma região Fc (isto é, anticorpos afucosilados). Por exemplo, a quantidade de fucose em uma composição que compreende vários desses anticorpos pode ser de 0% a cerca de 30%, de 0% a cerca de 20%, de 0% a cerca de 15%, de 0% a cerca de 10%, e mais preferivelmente de 0% a cerca de 5%. Em algumas modalidades, uma composição compreendendo vários desses anticorpos compreende ao menos 80%, mais preferivelmente ao menos 85%, ainda mais preferivelmente ao menos 90%, mais preferivelmente ainda ao menos 95% de anticorpos afucosilados, ainda mais preferivelmente ao menos 99% e mais preferivelmente ainda ao menos 99,5% de anticorpos afucosilados. Em algumas modalidades, os anticorpos são 100% afucosilados; ou seja, a fucose não é detectada na Asn297 por um método reconhecido no setor para detectar a fucose em um anticorpo. A quantidade de fucose é determinada calculando-se a quantidade média de fucose dentro da cadeia de açúcar na Asn297 em relação à soma de todas as glicoestruturas ligadas à Asn 297 (por exemplo, estruturas de manose complexas, híbridas e em alta quantidade).
[0260]Em algumas modalidades, o nível de fucosilação é de não mais que
0,5%, com base no limite de quantificação (LOQ) para o método de teste. Sendo assim, em algumas modalidades, o nível de afucosilação é superior ou igual a 99,5%. O método do perfil dos oligossacarídeos ligados por N pode ser usado para determinar o nível de fucosilação, sialilação, manosilação e galactosilação em uma amostra. O método dos oligossacarídeos ligados por N pode ser usado para avaliar glicanos ligados por N. Em suma, glicanos ligados por N são liberados enzimaticamente pela proteína com peptídeo-N-glicosidase F. Em seguida, os glicanos são derivatizados por um agente fluorescente e analisados por cromatografia líquida de interação hidrófila e detecção da fluorescência. O perfil cromatográfico é então comparado ao do material de referência. Esse método e muitos outros são conhecidos no setor para avaliar a fucosilação de um anticorpo, e podem ser usados para determinar o nível de fucosilação presente no anticorpo da presente invenção.
[0261]Exemplos não exaustivos de métodos para detectar a fucose em um anticorpo incluem espectrometria de massas MALDI-TOF (vide, por exemplo, o WO 2008/077546), medição por HPLC de oligossacarídeos fluorescentemente marcados recuperados (vide, por exemplo, Schneider et a/., "N-Glycan analysis of monoclonal antibodies and other glycoproteins using UHPLC with fluorescence detection", Agilent Technologies, Inc. (2012); Lines, J. Pharm. Biomed. Analysis, 14: 601-608 (1996); Takahasi, J. Chrom., 720: 217-225 (1996)), medição por eletroforese capilar de oligosscarídeos fluorescentemente marcados liberados (vide, por exemplo, Ma et al., Anal. Chem., 71: 5185-5192 (1999)), e HPLC com detecção amperométrica pulsada para medir a composição dos monossacarídeos (vide, por exemplo, Hardy, et al., Analytical Biochem., 170: 54-62 (1988)). Asn297 refere-se ao resíduo de asparagina localizado por volta da posição 297 na região Fc (numeração EU de resíduos da região Fc); contudo, a Asn297 também pode situar-se por volta de mais ou menos 3 aminoácidos a montante ou a jusante da posição 297, isto é, entre as posições 294 e 300, devido a variações de sequência ínfimas nos anticorpos. Em um anticorpo do CXCRS5 descrito neste documento, a Asn297 encontra-se na sequência QYNST e pode ser visualizada em negrito e sublinhada na Tabela 16 (por exemplo, SEQ ID Nº: 31 do domínio Fc da IgG1 humana do tipo selvagem).
[0262]Variantes de fucosilação podem ter a função de ADCC intensificada. Vide, por exemplo, as Publicações de Patente dos EUA nº US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd). Exemplos de publicações relacionadas a anticorpos "afucosilados" ou "deficientes em fucose" incluem: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WOZ2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al., J. Mol. Biol., 336: 1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et a/., Biotech. Bioeng., 87: 614 (2004). Exemplos de linhas celulares capazes de produzir anticorpos afucosilados incluem células CHO Lec13 deficientes na fucosilação de proteínas (Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys., 249:533-545 (1986); Pedido de Patente dos EUA nº US 2003/0157108 Al, Presta, L; e WO 2004/056312, Adams et al., em especial no Exemplo 11), e linhas de células nocaute, tal como linhas celulares sem um gene da alfa-1,6-fucosiltransferase funcional, FUT8, por exemplo, células CHO nocaute (vide, por exemplo, Yamane-Ohnuki et a/., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng, 94(4):680-688 (2006); e WO2003/085107).
[0263]Os anticorpos são munidos ainda de oligossacarídeos bipartidos, por exemplo, nos quais um oligossacarídeo biantenário ligado à região Fc do anticorpo é bipartido por GICNAc. Esses anticorpos podem ter a fucosilação reduzida e/ou a função de ADCC intensificada. Exemplos de anticorpos desse tipo são descritos, por exemplo, na WO 2003/011878 (Jean-Mairet et a/.); na Patente dos EUA nº 6.602.684 (Umaha et al); e na US 2005/0123546 (Umaha et al). Também são propostos anticorpos com ao menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo ligado à região Fc. Esses anticorpos podem ter a função de CDC aprimorada. Esses anticorpos são descritos, por exemplo, na WO 1997/30087 (Patel et al); WO 1998/58964 (Raju, S.); e WO 1999/22764 (Raju, S.).
[0264]EmM algumas modalidades da invenção, um anticorpo afucosilado medeia a ADCC na presença de células efetoras humanas com mais eficácia do que um anticorpo-pai que compreende fucose. Em termos gerais, a atividade de ADCC pode ser determinada usando o ensaio de ADCC in vitro conforme revelado neste documento, mas outros ensaios ou métodos para determinar a atividade de ADCC, por exemplo, em um modelo animal etc., são contemplados.
[0265]Em algumas modalidades, anticorpos anti-CXCR5 afucosilados têm a atividade de ADCC intensificada in vitro e/ou in vivo. Em algumas modalidades, anticorpos anti-CXCR5 afucosilados têm a atividade de ADCC intensificada in vitro. Em algumas modalidades, a atividade de ADCC in vitro é determinada por um método descrito neste documento. Em suma, diluições seriadas de anticorpos anti- CXCR5 ou de um isótopo controle são incubadas com células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de doadores humanos ou macacos cinomolgos saudáveis. Nesse ensaio, as PBMCs são a fonte das células efetoras exterminadoras naturais (NK), e o alvo células B e células similares a Tfh CXCR5+. A citometria de fluxo é usada para quantificar o número de células B e células similares a Tfh remanescentes após cerca de 20 h. As curvas de titulação da citotoxicidade foram geradas plotando a porcentagem de citotoxicidade da população de ligação com o antígeno em relação ao log de concentração do anticorpo PF-06835375. Os valores de EC5o foram determinados por ajustes de curvas por regressão não linear no GraphPad Prism& (versão 6.0, GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) e um log sigmoide do modelo dose agonista- resposta, de acordo com a equação a seguir:
Log (agonista) vs. resposta — inclinação variável (quatro parâmetros) Y = Base + (Topo — Base / (1 + 10º((LogECso — X)*Coeficiente de Hill) Onde Y é a porcentagem de citotoxicidade, X é a concentração do anticorpo, Topo é o valor Y máximo correspondente ao patamar mais alto da curva sigmoide, Base é o valor Y mínimo correspondente ao patamar mais baixo da curva sigmoide (limitado a O), e LogEC5o é o log da concentração do anticorpo no ponto de inflexão da curva.
[0266]Os valores de EC5so foram sumarizados para todos os experimentos usando a média e desvios padrão (STDEV). Em algumas modalidades, a capacidade de os mAbs humanizados induzirem à ADCC de células Tfh bona fide da amígdala humana foi avaliada da mesma maneira, mas usando células T CD4+ isoladas de células mononucleares tonsilares com a adição de células NK isoladas de PBMCs. Em algumas modalidades, células Ba/F3 expressando o CXCR5 são usadas como células alvo. Em algumas modalidades, a citotoxicidade é determinada quantificando a liberação de LDH pelo Ensaio de Citotoxicidade Não Radioativo CytoTox (Promega, Madison, WI).
[0267]Em algumas modalidades, a lise máxima é determinada usando 5% de Triton X-100, e a liberação espontânea é determinada na ausência do anticorpo. Em algumas modalidades, a porcentagem de lise específica pode ser determinada usando a fórmula: (liberação experimental - espontânea) / (liberação máxima - espontânea) x 100 = porcentagem de lise específica. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CXCR5 afucosilado com a atividade de ADCC intensificada resulta em uma lise específica que é ao menos 10, ao menos 15, ao menos 20, ao menos 25, ao menos 30, ao menos 35, ao menos 40, ao menos 45, ao menos 50, ao menos 60, ao menos 65, ao menos 70 ou ao menos 75 pontos percentuais maior que a lise específica com a mesma quantidade de um anticorpo fucosilado, a ao menos uma concentração do anticorpo testado. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-
CXCRS5 afucosilado com a atividade de ADCC intensificada resulta em uma lise específica que é ao menos 10, ao menos 15, ao menos 20, ao menos 25, ao menos 30, ao menos 35, ao menos 40, ao menos 45, ao menos 50, ao menos 60, ao menos 65, ao menos 70 ou ao menos 75 pontos percentuais maior que a lise específica com um anticorpo fucosilado, onde cada anticorpo é contido a uma concentração entre 0,01 e 1 microg/ml, e as células alvo são células Ba/F3 que expressam o CXCR5. Em algumas modalidades, os anticorpos são testados a concentrações que variam de 0,000005 microg/ml a 5 microg/ml.
[0268]Em algumas modalidades, anticorpos anti-CXCR5 afucosilados têm afinidade intensificada pelo Fc gama RIIIA. Em algumas modalidades, anticorpos anti-CXCR5 afucosilados têm afinidade intensificada pelo Fc gama RIIIA (V158). Em algumas — modalidades, anticorpos anticCXCR5 afucosilados têm afinidade intensificada pelo Fc gama RIIIA (F158). Em algumas modalidades, a afinidade do anticorpo pelo Fc gama RIIIA é determinada por resonância de plásmons de superfície e/ou de acordo com o seguinte, que é descrito com referência ao Fc gama RIIIA (V158), mas que também é adequado para determinar a afinidade pelo Fc gama RIIIA (F158). Em suma, em algumas modalidades, o anticorpo anti-CXCR5 fucosilado ou afucosilado é capturado sobre um chip de dextrano revestido com proteína A. Fc gama RIIIA (V158) (disponibilizado, por exemplo, pela R and D Systems) é injetado a várias concentrações. A constante de associação, constante de dissociação e afinidade do Fc gama RIIIA (V158) pelo anticorpo anti-cCXCR5 fucosilado e afucosilado podem ser determinadas, por exemplo, usando o software fornecido junto com o sistema de ressonância de plásmons de superfície (por exemplo, Biacore T200 Evaluation Software, modelo de ligação 1:1). Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CXCR5 afucosilado pode ter afinidade aprimorada pelo Fc gama RIIIA (tal como Fc gama RIIIA (V158) ou Fc gama RIIIA (F158)) e pode ligar-se ao Fc gama RIIIA com ao menos 2 vezes, ao menos 3 vezes, ao menos 4 vezes, ao menos 5 vezes, ao menos 7 vezes, ao menos 10 vezes, ao menos 12 vezes, ao menos 15 vezes, ao menos 17 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 500 vezes ou ao menos 1.000 vezes mais afinidade do que um anticorpo anti-CXCR5 fucosilado.
IV. EXPRESSÃO E PRODUÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-CXCR5 ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAM ANTICORPOS ANTI-CXCR5
[0269]A invenção também propõe polinucleotídeos que codificam qualquer um dos anticorpos, inclusive fragmentos de anticorpo e anticorpos modificados, descritos neste documento. A invenção também propõe um método para produzir qualquer um dos polinucleotídeos descritos neste documento. Polinucleotídeos podem ser produzidos e expressos por procedimentos conhecidos na técnica.
[0270]A sequência de um anticorpo desejado, fragmento de anticorpo definido, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, e ácido nucleico que codifica o referido anticorpo, ou fragmento do mesmo, pode ser determinada por técnicas de sequenciamento padrão. Uma sequência de ácido nucleico que codifica um anticorpo desejado, fragmento de anticorpo definido, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, pode ser inserida em vários vetores (tal como vetores de clonagem e expressão) para a produção recombinante e caracterização. Um ácido nucleico que codifica a cadeia pesada, fragmento de anticorpo definido, ou fragmento de ligação com antígeno da cadeia pesada, e um ácido nucleico que codifica a cadeia leve, fragmento de anticorpo definido, ou fragmento de ligação com antígeno da cadeia leve, podem ser clonados no mesmo vetor, ou em vetores diferentes.
[0271]Em um aspecto, a invenção propõe polinucleotídeos que codificam as sequências de aminoácidos de qualquer um dos anticorpos do CXCRS5, e fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos, a seguir: VH do 11G2 de camundongo, VL do 11G2 de camundongo, VH do 11G2 quimérico, VL do 11G2 quimérico, VH do h11G2
(XC152), VH do h11G2 (XC155), VH do h11G2 (XC156), VH do h11G2 (XC157), VÁ do h11G2 (XC350), VH do h11G2 (XC351), VH do h11G2 (XC352), VH do h11G2 (XC353), VH do h11G2 (XC354), VL do h11G2 (XC151), VL do h11G2 (XC153), VL do h11G2 (XC154), VL do h11G2 (XC346), VL do h11G2 (XC347), VL do h11G2 (XC348), VL do h11G2 (XC349), VH do 41A10 de camundongo, VL do 41A10 de camundongo, VH do 41A10 quimérico, VL do 41A10 quimérico, VH do 41A10 (XC147) humanizado, VH do h41A10 (XC148), VH do h41A10 (XC150), VL do h41A10 (XC142), VL do h41A10 (XC143), VL do h41A10 (XC144), VL do h41A10 (XC145), VL do h41A10 (XC146), VL do h41A10 (XC149), VH do 5H7 de camundongo, VL do 5H7 de camundongo, VH do 5H7 quimérico, e VL do 5H7 quimérico. O polinucleotídeo que codifica as sequências de aminoácidos acima codifica uma sequência de aminoácidos ao menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%, e mais preferivelmente idêntica, à sequência de aminoácidos dos anticorpos, ou fragmento de ligação com antígeno dos mesmos, da presente invenção conforme revelado neste documento.
[0272]A invenção propõe polinucleotídeos que codificam as sequências de aminoácidos de um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga-se substancialmente ao mesmo epítopo que um anticorpo selecionado dentre o grupo composto por: 41A10 Quimérico, 41A10 (142/147) Humanizado, 41A10 (142/148) Humanizado, 11G2 Quimérico, 11G2 Quimérico Afucosilado, 11G2 (151/152) Humanizado, 11G2 (153/155) Humanizado, 11G2 (153/156) Humanizado, 11G2 (154/155) Humanizado, 1162 (154/157) Humanizado e 11G2 (154/155) Humanizado Afucosilado.
[0273]A invenção propõe polinucleotídeos que codificam as sequências de aminoácidos de um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que compete para ligar-se ao CXCR5 com um anticorpo selecionado dentre o grupo composto por: 41A10 Quimérico, 41A10 (142/147) Humanizado, 41A10 (142/148)
Humanizado, 1162 Quimérico, 11G2 Quimérico Afucosilado, 11G2 (151/152) Humanizado, 11G2 (153/155) Humanizado, 11G2 (153/156) Humanizado, 11G2 (154/155) Humanizado, 11G2 (154/157) Humanizado e 11G2 (154/155) Humanizado Afucosilado.
[0274]A invenção propõe polinucleotídeos que codificam uma ou mais proteínas compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada dentre o grupo composto por: SEQ ID Nº: 1-29, SEQ ID Nº: 35-40 e SEQ ID Nº: 47-63.
[0275]A invenção propõe polinucleotídeos que compreendem a sequência de ácido nucleico conforme definida por um ou mais dos SEQ ID Nº: 106, 107, 108 e
109. A invenção propõe um polinucleotídeo que compreende a sequência de ácido nucleico conforme definida pelo SEQ ID Nº: 95. A invenção propõe um polinucleotídeo que compreende a sequência de ácido nucleico conforme definida pelo SEQ ID Nº: 96. A invenção propõe um polinucleotídeo que compreende a sequência de ácido nucleico conforme definida pelo SEQ ID Nº: 97. A invenção propõe um polinucleotídeo que compreende a sequência de ácido nucleico conforme definida pelo SEQ ID Nº: 98.
[0276]A invenção propõe um polinucleotídeo que compreende uma ou ambas as sequências de ácido nucleico do inserto de DNA do plasmídeo depositado junto à ATCC e com nº de Acesso PTA-124323, e o nº de Acesso PTA-124324.
[0277]A invenção propõe um polinucleotídeo que compreende a sequência de ácido nucleico do inserto no plasmídeo depositado junto à ATCC e com nº de Acesso PTA-124323.
[0278]A invenção propõe um polinucleotídeo que compreende a sequência de ácido nucleico do inserto no plasmídeo depositado junto à ATCC e com nº de Acesso PTA-124324.
[0279]A invenção propõe um polinucleotídeo que compreende a sequência de ácido nucleico do inserto no plasmídeo depositado junto à ATCC e com nº de Acesso PTA-124323 e o nº de Acesso PTA-124324.
[0280]A invenção propõe um polinucleotídeo que compreende a sequência de ácido nucleico do inserto no plasmídeo depositado junto à ATCC e com nº de Acesso PTA-124323.
[0281]A invenção propõe um polinucleotídeo que compreende a sequência de ácido nucleico do inserto no plasmídeo depositado junto à ATCC e com nº de Acesso PTA-124324.
[0282]A invenção propõe células que compreendem uma ou mais moléculas de ácido nucleico conforme definidas em um ou mais dos SEQ ID Nº: 106, 107, 108 e 109. A invenção propõe células que compreendem uma ou mais moléculas de ácido nucleico conforme definidas nos SEQ ID Nº: 106 e 107. A invenção propõe células que compreendem uma ou mais moléculas de ácido nucleico conforme definidas nos SEQ ID Nº: 108 e 109.
[0283]Em outro aspecto, a invenção propõe polinucleotídeos e variantes dos mesmos que codificam um anticorpo anti-CXCR5, sendo que esses polinucleotídeos variantes compartilham ao menos 70%, ao menos 75%, ao menos 80%, ao menos 85%, ao menos 87%, ao menos 89%, ao menos 90%, ao menos 91%, ao menos 92%, ao menos 93%, ao menos 94%, ao menos 95%, ao menos 96%, ao menos 97%, ao menos 98%, ou ao menos 99% de identidade de sequência com qualquer uma das sequências de ácido nucleico específicas reveladas neste documento. Essas quantidades não visam a ser exaustivas, e incrementos entre as porcentagens citadas são especificamente contemplados como parte da revelação.
[0284]A invenção propõe polipeptídeos codificados pelas moléculas de ácido nucleico descritas neste documento.
[0285]JEM uma modalidade, os domínios de VH e VL, ou fragmento de ligação com antígeno dos mesmos, ou a HC ou a LC de comprimento total, são codificados por polinucleotídeos distintos. Como alternativo, ambas a VH e a VL, ou um fragmento de ligação com antígeno das mesmas, ou a HC e a LC, são codificadas por um polinucleotídeo único.
[0286]Polinucleotídeos complementares a qualquer uma dessas sequências também são contemplados pela presente invenção. Os polinucleotídeos podem ser de fita simples (codificadores ou antissentido) ou de fita dupla, e podem ser moléculas de DNA (genômico, cDNA ou sintético) ou RNA. Moléculas de RNA incluem moléculas de HnRNA, que contêm íntrons e correspondem a uma molécula de DNA de maneira de uma para uma, e moléculas de mRNA, que não contêm íntrons. Sequências codificadoras ou não codificadoras adicionais podem, mas não precisam, se fazer presentes dentro de um polinucleotídeo da presente invenção, e um polinucleotídeo pode, mas não precisa, ligar-se a outras moléculas e/ou materiais de apoio.
[0287]Os polinucleotídeos podem compreender uma sequência nativa (isto é, uma sequência endógena que codifica um anticorpo ou uma porção do mesmo) ou podem compreender uma variante dessa sequência. As variantes de polinucleotídeo contêm uma ou mais substituições, adições, deleções e/ou introduções de tal modo que a imunorreatividade do polipeptídeo codificado não seja reduzida em relação a uma molécula imunorreativa nativa. O efeito sobre a imunorreatividade do polipeptídeo codificado pode ser avaliado em geral conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades, as variantes exibem ao menos cerca de 70% de identidade, em algumas modalidades ao menos cerca de 80% de identidade, em algumas modalidades ao menos cerca de 90% de identidade, e em algumas modalidades ao menos cerca de 95% de identidade com uma sequência de polinucleotídeo que codifica um anticorpo nativo ou uma porção do mesmo. Essas quantidades não visam a ser exaustivas, e incrementos entre as porcentagens citadas são especificamente contemplados como parte da revelação.
[0288]Diz-se que duas sequências de polinucleotídeo ou polipeptídeo são "idênticas" se as sequências de nucleotídeos ou aminoácidos nas duas forem iguais quando alinhadas visando máxima correspondência, conforme descrito abaixo. As comparações entre duas sequências são feitas tipicamente comparando-se as sequências sobre uma janela de comparação para identificar e comparar regiões locais de similaridade de sequência. Uma "janela de comparação", conforme usado neste documento, refere-se a um segmento de ao menos cerca de 20 posições contíguas, tipicamente 30 a cerca de 75, ou 40 a cerca de 50, em que uma sequência pode ser comparada a uma sequência de referência com o mesmo número de posições contíguas depois de alinhar as duas sequências de maneira ideal.
[0289]O alinhamento ideal de sequências para comparação pode ser realizado usando o programa MegAlignº no pacote de software de bioinformática Lasergeneº (DNASTARº, Inc., Madison, WI), usando os parâmetros padrão. Esse programa incorpora vários esquemas de alinhamento descritos nas referências a seguir: Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes, pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman
Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730.
[0290]EmM algumas modalidades, a "porcentagem de identidade de sequência" é determinada comparando duas sequências idealmente alinhadas em uma janela de comparação de ao menos 20 posições, em que a porção da sequência de polinucleotídeo ou polipeptídeo na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) de 20% ou menos, tipicamente de 5% a 15%, ou de 10% a 12%, em comparação às sequências de referência (que não compreendem adições ou deleções) para o alinhamento ideal das duas sequências. A porcentagem é calculada determinando-se o número de posições em que ocorrem bases de ácidos nucleicos ou resíduos de aminoácido idênticos em ambas as sequências para obter o número de posições correspondentes, dividindo- se o número de posições correspondentes pelo número total de posições na sequência de referência (isto é, o tamanho da janela) e multiplicando-se os resultados por 100 para obter a porcentagem de identidade de sequência.
[0291]As variantes podem em aditamento, ou como alternativa, ser substancialmente homólogas a um gene nativo, ou a uma porção ou complemento do mesmo. Essas variantes de polinucleotídeo são capazes de hibridizar em condições moderadamente estringentes em uma sequência de DNA de ocorrência natural que codifica um anticorpo nativo (ou uma sequência complementar).
[0292]"Condições moderadamente estringentes" incluem pré-lavagem em uma solução de 5X de SSC, 0,5% de SDS, 1,0 mM de EDTA (pH 8,0); hibridização a 50º C a 65º C, 5X de SSC, de um dia para o outro; seguidas por lavagem por duas vezes a 65º C por 20 minutos com cada um de 2X, 0,5X e 0,2X de SSC contendo 0,1% SDS.
[0293]Conforme — usado — neste “documento, "condições altamente estringentes" ou "condições de alta estringência" são aquelas que: (1) empregam baixa resistência iônica e alta temperatura para lavar, por exemplo, 0,015 M de cloreto de sódio/0,0015 M de citrato de sódio/0,1% de dodecil sulfato de sódio a 50º C; (2) empregam, durante a hibridização, um agente desnaturante, tal como formamida, por exemplo, 50% (v/v) de formamida com 0,1% de albumina do soro bovino/0,1% de Ficoll/0,1% de polivinilpirrolidona/50 mM de tampão fosfato de sódio a pH 6,5 com 750 mM de cloreto de sódio, 75 mM de citrato de sódio a 42º C; ou (3) empregam 50% de formamida, 5X de SSC (0,75 M de NaCl, 0,075 M de citrato de sódio), 50 mM de fosfato de sódio (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato de sódio, 5X de solução de Denhardt, DNA de esperma de salmão sonicado (50 ug/mL), 0,1% de SDS, e 10% de sulfato de dextrano a 42º C, com lavagens a 42º C em 0,2X de SSC (cloreto de sódio/citrato de sódio) e 50% de formamida a 55º C, seguidas por uma lavagem de alta estringência com 0,1X de SSC contendo EDTA a 55º C. Os versados na técnica reconhecerão como ajustar a temperatura, a resistência iônica etc. de acordo com o necessário para acomodar fatores tais como comprimento da sonda e seus semelhantes.
[0294]Os versados na técnica apreciarão que, como resultado da degeneração do código genético, há muitas sequências de nucleotídeo que codificam um polipeptídeo conforme descrito neste documento. Alguns desses polinucleotídeos dispõe de mínima homologia com a sequência de nucleotídeo de qualquer gene nativo. Ainda assim, polinucleotídeos que variam devido a diferenças na utilização dos códons são especificamente contemplados pela presente invenção. Além disso, alelos dos genes que compreendem as sequências de polinucleotídeo propostas neste documento encontram-se dentro do âmbito da presente invenção. Os alelos são genes endógenos que são alterados em decorrência de uma ou mais mutações, tal como deleções, adições e/ou substituições de nucleotídeos. O MRNA e proteína resultantes podem, mas não precisam, ter uma estrutura ou função alterada. Os alelos podem ser identificados por técnicas padrão (tais como hibridização, amplificação e/ou comparação de sequências em bancos de dados).
[0295]Os polinucleotídeos da presente invenção podem ser obtidos por síntese química, métodos recombinantes ou PCR. Os métodos de síntese química de polinucleotídeos são bem conhecidos no setor e não precisam ser descritos em detalhes neste documento. Os versados na técnica podem usar as sequências propostas neste documento e um sintetizador de DNA comercial para produzir uma sequência de DNA desejada.
[0296]Para preparar polinucleotídeos por meio de métodos recombinantes, um polinucleotídeo compreendendo uma sequência desejada pode ser introduzido em um vetor adequado, e o vetor, por sua vez, pode ser introduzido em uma célula hospedeira adequada para replicação e amplificação, conforme discutido mais a fundo neste documento. Os polinucleotídeos podem ser introduzidos em células hospedeiras por meio de qualquer método conhecido no setor. As células são transformadas introduzindo um polinucleotídeo exógeno por absorção direta, endocitose, transfecção, F-mating ou eletroporação. Uma vez introduzido, o polinucleotídeo exógeno pode ser mantido dentro da célula como um vetor não integrado (tal como um plasmídeo) ou integrado ao genoma da célula hospedeira. O polinucleotídeo assim amplificado pode ser isolado da célula hospedeira por métodos bem conhecidos no setor. Vide, por exemplo, Sambrook et a/., 1989.
[0297]Como alternativa, a PCR permite a reprodução de sequências de DNA. A tecnologia PCR é bem conhecida no setor e é descrita nas Patentes dos EUA nº 4.683.195, 4.800.159, 4.754.065 e 4.683.202, bem como em PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et a/. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994.
[0298]O RNA pode ser obtido usando o DNA isolado em um vetor apropriado e inserindo-o em uma célula hospedeira adequada. Quando a célula replica e o DNA é transcrito no RNA, o RNA pode ser então isolado por métodos familiares aos versados no setor, conforme delineados em Sambrook et a/l., 1989, por exemplo.
[0299]EM algumas modalidades, um primeiro vetor compreende um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada, e um segundo vetor compreende um polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve. Em algumas modalidades, o primeiro vetor e o segundo vetor são transfectados em células hospedeiras em quantidades semelhantes (tais como quantidades molares semelhantes ou quantidades em massa semelhantes). Em algumas modalidades, uma razão molar ou razão em massa entre 5:1 e 1:5 do primeiro vetor e segundo vetor é transfectada em células hospedeiras. Em algumas modalidades, utiliza-se uma razão em massa entre 1:1 e 1:5 para o vetor que codifica a cadeia pesada e o vetor que codifica a cadeia leve. Em algumas modalidades, utiliza-se uma razão em massa de 1:2 e 1:5 para o vetor que codifica a cadeia pesada e o vetor que codifica a cadeia leve.
Vetores
[0300]Em algumas modalidades, é selecionado um vetor que é otimizado para a expressão de polipeptídeos em células CHO ou derivadas de CHO, ou em células NSO. Exemplos desses vetores são descritos, por exemplo, em Running Deer et al., Biotechnol. Prog. 20:880-889 (2004).
[0301]Vetores de clonagem e expressão adequados podem incluir uma variedade de componentes, tais como sequências promotoras, sequências intensificadoras e outras sequências reguladoras transcricionais. O vetor também pode ser construído para permitir a clonagem subsequente de um domínio variável de anticorpo em diferentes vetores. Vetores de clonagem adequados podem ser construídos de acordo com técnicas padrão ou podem ser selecionados dentre um grande número de vetores de clonagem disponíveis no setor. Embora o vetor de clonagem selecionado possa variar de acordo com a célula hospedeira que tenciona-se usar, vetores de clonagem úteis em geral terão a capacidade de autorreplicar-se, podem possuir um único alvo para uma endonuclease de restrição específica, e/ou podem transportar genes para um marcador que pode ser usado para selecionar clones que contêm o vetor. Exemplos adequados incluem plasmídeos e vírus bacterianos, por exemplo, pUC18, pUC19, Bluescript (por exemplo, pBS SK+) e seus derivados, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, DNAs de fago, e vetores bifuncionais como pSA3 e pAT28. Esses e muitos outros vetores de clonagem são disponibilizados por fornecedores comerciais como a BioRad, Strategene e Invitrogen. Vetores de expressão são adicionalmente propostos. Em geral, os vetores de expressão são constructos de polinucleotídeos replicáveis que contêm um polinucleotídeo de acordo com a invenção. Fica subentendido que um vetor de expressão deve ser replicável nas células hospedeiras ou como epissomos ou como parte integrante do DNA cromossômico. Vetores de expressão adequados incluem, entre outros, plasmídeos, vetores virais, incluindo adenovírus, vírus adenoassociados, retrovírus, cosmídeos e vetor(es) de expressão revelados na Publicação PCT nº WO 87/04462. Componentes de vetor podem incluir em geral, entre outros, um ou mais dos seguintes: uma sequência de sinal; uma origem de réplica; um ou mais genes marcadores; elementos de controle transcricional adequados (tais como promotores, intensificadores e terminadores). Para a expressão (isto é, tradução), um ou mais elementos de controle translacional fazem-se tipicamente necessários, tais como sítios de ligação com ribossomo, sítios de início de tradução e códons de parada.
[0302]Os vetores contendo os polinucleotídeos de interesse e/ou os próprios polinucleotídeos podem ser introduzidos na célula hospedeira por qualquer um de vários meios apropriados, inclusive eletroporação, transfecção usando cloreto de cálcio, cloreto de rubídio, fosfato de cálcio, DEAE-dextrano, ou outras substâncias; bombardeio de microprojéteis; lipofecção; e infecção (por exemplo, quando o vetor é um agente infeccioso, tal como vaccinia vírus). A opção por introduzir vetores ou polinucleotídeos em muitos casos dependerá das características da célula hospedeira.
Células hospedeiras
[0303]O anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, pode ser produzido de maneira recombinante usando uma célula hospedeira adequada. Um ácido nucleico que codifica o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, pode ser clonado em um vetor de expressão, que pode ser então introduzido em uma célula hospedeira, tal como uma célula de E. coli, uma célula de levedura, uma célula de inseto, uma célula COS símia, uma célula do ovário de hamster chinês (CHO), ou uma célula de mieloma, em que a célula, em outros contextos, não produz uma proteína de imunoglobulina, para obter a síntese de um anticorpo na célula hospedeira recombinante. Células hospedeiras preferidas incluem uma célula CHO, uma célula HEK-293 renal embrionária humana, ou uma célula Sp2.0, entre muitas células bem conhecidas no setor. Um fragmento de anticorpo pode ser produzido por degradação proteolítica ou outro tipo de degradação de um anticorpo de comprimento total, por métodos recombinantes, ou por síntese química. Um fragmento de polipeptídeo de um anticorpo, em especial polipeptídeos mais curtos de até cerca de 50 aminoácidos, pode ser produzido de maneira conveniente por síntese química. Métodos de síntese química para proteínas e peptídeos são conhecidos no setor e disponibilizados na praça.
[0304]Em várias modalidades, cadeias pesadas anti-CXCR5 e/ou cadeias leves anti-cCXCR5 podem ser expressas em células procariontes, tais como células bacterianas; ou em células eucariontes, tais como células de fungos (tais como de leveduras), células de vegetais, células de insetos, e células de mamíferos. Essa expressão pode ser obtida, por exemplo, de acordo com procedimentos conhecidos no setor. Exemplos de células eucariontes que podem ser usadas para expressar polipeptídeos incluem, entre outros, células COS, incluindo células COS 7; células
293, incluindo células 293-6E; células CHO, incluindo CHO-S, DG44; células CHO Lecl3, e células CHO FUT8; células PER.C608 (Crucell); e células NSO. Em algumas modalidades, cadeias pesadas anti-CXCR5 e/ou cadeias leves anti-cCXCR5 podem ser expressas em uma levedura. Vide, por exemplo, a Publicação dos EUA nº US 2006/0270045 Al. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira eucarionte específica é selecionada com base em sua capacidade de fazer modificações pós- transcricionais às cadeias pesadas anti-CXCR5 e/ou cadeias leves anti-CXCR5. Por exemplo, em algumas modalidades, células CHO produzem polipeptídeos que têm um nível de sialilação mais alto do que o mesmo polipeptídeo produzido em células
293.
[0305]A introdução de um ou mais ácidos nucleicos em uma célula hospedeira desejada pode ser consumada por qualquer método, incluindo, entre outros, transfecção por fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção mediada por lipídio catiônico, eletroporação, transdução, infecção etc. Exemplos de métodos não exaustivos são descritos, por exemplo, em Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3º ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001). Ácidos nucleicos podem ser transfectados de maneira transiente ou estável nas células hospedeiras desejadas, de acordo com qualquer método adequado.
[0306]Em algumas modalidades, anticorpos anti-cCXCR5 afucosilados são produzidos em células capazes de produzir anticorpos afucosilados, tais como células CHO Lec3 deficientes na fucosilação de proteínas (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); Pedido de Patente dos EUA nº US 2003/0157108; e WO 2004/056312, em especial no Exemplo 11), e linhas de células nocaute, tal como linhas celulares sem um gene da alfa-1,6-fucosiltransferase funcional, FUT8, por exemplo, células CHO nocaute (vide, por exemplo, Yamane- Ohnuki et a/. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda et a/., Biotechnol. Bioeng,
94(4):680-688 (2006); e WO2003/085107). Em algumas modalidades, anticorpos anti-CXCR5 afucosilados são produzidos em células CHO sem um gene FUT8 funcional. Em algumas modalidades, anticorpos anti-cCXCR5 afucosilados são produzidos em células CHOK1SV Potelligent& (BioWa/Lonza, Allendale, NJ).
[0307]Anticorpos anti-cCXCR5 podem ser purificados por qualquer método adequado. Esses métodos incluem, entre outros, o uso de matrizes de afinidade ou cromatografia de interação hidrófoba. Ligantes de afinidade adequados incluem o ECD do CXCRS5 e ligantes que ligam-se a regiões constantes do anticorpo. Por exemplo, uma Proteína A, Proteína G, Proteína A/G ou uma coluna de afinidade para anticorpos podem ser usadas para ligar a região constante e purificar um anticorpo anti-CXCR5. A cromatografia interativa hidrófoba, por exemplo, uma coluna de butila ou fenila, também pode ser adequada para purificar alguns polipeptídeos. Muitos métodos para purificar polipeptídeos são conhecidos no setor.
[0308]Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CXCR5 é produzido em um sistema isento de células. Exemplos não exaustivos de sistemas isentos de células são descritos, por exemplo, em Sitaraman et al., Methods Mol. Biol. 498: 229-44 (2009); Spirin, Trends Biotechnol. 22: 538-45 (2004); Endo et a/., Biotechnol. Adv. 21: 695-713 (2003).
V. USOS E TERAPIAS MÉDICAS
[0309]EmM alguns aspectos, a presente invenção propõe métodos terapêuticos para remover, inibir ou reduzir a atividade ou sinalização do CXCR5 usando um anticorpo anti-CXCR5, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, em que os métodos terapêuticos compreendem administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-CXCR5, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo. Um transtorno tratado refere-se a qualquer doença ou condição que é atenuada,
melhorada, inibida ou prevenida pela remoção, inibição ou redução da atividade ou sinalização do CXCRS5.
[0310]Em alguns aspectos, a presente invenção propõe um anticorpo anti- CXCRS5, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, para uso na remoção, inibição ou redução da atividade ou sinalização do CXCR5. Em algumas modalidades, o uso pode compreender administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo anti-CXCR5, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo. Em algumas modalidades, a inibição ou redução da atividade ou sinalização do CXCR5 pode tratar qualquer doença ou condição que seja atenuada, melhorada, inibida ou prevenida pela remoção, inibição ou redução da atividade ou sinalização do CXCR5.
[0311]Essas doenças, transtornos ou condições incluem, entre outros, respostas inflamatórias tais como lúpus eritematoso sistêmico (LES); respostas inflamatórias crônicas; aterosclerose; deficiência na adesão leucocitária; artrite reumatoide; diabetes melito (por exemplo, diabetes melito tipo | ou diabetes melito dependente de insulina); esclerose múltipla; síndrome de Raynaud; tireoide autoimune; encefalomielite alérgica; síndrome de Sjógren; diabetes com início na juventude; e respostas imunológicas associadas a hipersensibilidade aguda e retardada mediada por citocinas e linfócitos T encontrados tipicamente na tuberculose, sarcoidose, polimiosite, granulomatose e vasculite; doença de Wegener; anemia perniciosa (doença de Addison); doenças que envolvem a diapedese leucocitária; transtorno inflamatório no sistema nervoso central (SNC); síndrome da lesão de múltiplos órgãos; anemia hemolítica (incluindo, entre outras, crioglobulinemia ou anemia positiva para Coombs); miastenia grave; doenças mediadas pelo complexo antígeno-anticorpo; doença antimembrana basal glomerular; síndrome antifosfolipídica; neurite alérgica; doença de Graves; síndrome miastênica de Lambert-Eaton; penfigoide bolhoso; penfigoide; poliendocrinopatias autoimunes; vitiligo; doença de Reiter; síndrome da pessoa rígida; doença de Bechet; arterite de células gigantes; nefrite do complexo imunológico; nefropatia por IgA; polineuropatias por IgM; púrpura trombocitopênica imunológica (ITP) ou trombocitopenia autoimune e doenças hemolíticas autoimunes; tireoidite de Hashimoto; hepatite autoimune; hemofilia autoimune; síndrome linfoproliferativa autoimune (ALPS); uveorretinite autoimune; síndrome de Guillain-Barré; síndrome de Goodpasture; doença mista do tecido conjuntivo; infertilidade associada a autoimunidade; poliarterite nodosa; alopecia areata; mixedema idiopático; doença do enxerto contra hospedeiro; distrofia muscular (Duchenne, Becker, Miotônica, Cinturas, Facioscapulohumeral, Congênita, Oculofaríngea, Distal, Emery-Dreifuss), e controle da proliferação de células do câncer que expressam o CXCRS5, tais como os cânceres de pâncreas, intestino e bexiga, leucemia de células T e leucemia de células B, como apreciarão os versados na técnica a que pertencem os ensinamentos revelados neste documento.
[0312]Os anticorpos anti-CXCR5, ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos, da presente invenção também podem ser usados para detectar e/ou medir o CXCR5, ou células que expressam o CXCR5, em uma amostra, por exemplo, para fins diagnósticos. Por exemplo, um anticorpo anti-CXCR5, ou fragmento do mesmo, pode ser usado para diagnosticar uma condição ou doença caracterizada pela expressão anômala (por exemplo, superexpressão, sub- expressão, ausência de expressão etc.) do CXCR5. Exemplos de ensaios diagnósticos para o CXCR5 podem compreender, por exemplo, colocar uma amostra, obtida de um paciente, em contato com um anticorpo anti-CXCR5 da invenção, em que o anticorpo anti-CXCR5 é marcado com um marcador detectável ou molécula repórter.
[0313]Conforme usado neste documento, "veículo farmaceuticamente aceitável" ou "excipiente farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer material que,
quando combinado a um ingrediente ativo, permite que o ingrediente mantenha sua atividade biológica e não é reativo ao sistema imunológico do paciente. Exemplos incluem, entre outros, qualquer um dos veículos farmacêuticos padrão, tais como soro fisiológico tamponado com fosfato, água, emulsões como emulsão óleo/água, e vários tipos de agentes umectantes. Diluentes preferidos para administração por aerossol ou administração parentérica incluem soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) ou soro fisiológico normal (0,9%). As composições compreendendo esses veículos são formuladas por métodos convencionais bem conhecidos (vide, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18º edição, A. Gennaro, ed,., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; e Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20º Ed., Mack Publishing, 2000).
VI. COMPOSIÇÕES
[0314]A invenção também propõe composições farmacêuticas que compreendem uma quantidade eficaz de um anticorpo do CXCRS5, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, descrito neste documento. Exemplos dessas composições, além de como formulá-las, também são descritos neste documento. Em algumas modalidades, a composição compreende um ou mais anticorpos do CXCR5. Em outras modalidades, o anticorpo do CXCR5 reconhece o CXCR5. Em outras modalidades, o anticorpo do CXCR5 é um anticorpo humano. Em outras modalidades, o anticorpo do CXCR5 é um anticorpo humanizado. Em algumas modalidades, o anticorpo do CXCR5 compreende uma região constante que é capaz de provocar uma resposta imunológica desejada, tal como lise mediada por anticorpos ou ADCC. Em outras modalidades, o anticorpo do CXCR5 compreende uma região constante que é afucosilada e produz uma ADCC intensificada em comparação a outro anticorpo que é fucosilado, mas fora isso idêntico. Em outras modalidades, o anticorpo do CXCR5 compreende uma ou mais CDRs do anticorpo
(tal como uma, duas, três, quatro, cinco ou, em algumas modalidades, todas as seis CDRs).
[0315]Deve-se ter em mente que as composições podem compreender mais de um anticorpo do CXCRS5, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo (por exemplo, uma mistura de anticorpos do CXCR5 que reconhecem diferentes epítopos do CXCR5). Outros exemplos de composições compreendem mais de um anticorpo do CXCR5 que reconhece os mesmos epítopos, ou diferentes espécies de anticorpos do CXCR5 que ligam-se a diferentes epítopos do CXCR5. Em algumas modalidades, as composições compreendem uma mistura de anticorpos do CXCR5 que reconhecem diferentes variantes do CXCRS5.
[0316]A composição usada na presente invenção pode compreender ainda veículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis (Remington: The Science and practice of Pharmacy 20th Ed., 2000, Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover) na forma de fórmulas liofilizadas ou soluções aquosas. Os veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são atóxicos aos beneficiados quando administrados às dosagens e concentrações recomendadas, e podem compreender tampões tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, inclusive ácido ascórbico e metionina; conservantes, tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; álcool fenólico, butílico ou benzílico; alquil parabenos, tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m- cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (com menos que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, inclusive glicose, manose ou dextranos; agentes quelantes, tais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trehalose ou sorbitol;
contraíons formadores de sal, tais como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos de proteína Zn); e/ou agentes tensoativos não iônicos, tais como TWEEN'TY, “PLURONICS'"! ou polietileno glicol (PEG) Excipientes farmaceuticamente aceitáveis são adicionalmente descritos neste documento.
[0317]O anticorpo do CXCR5, fragmento de ligação com antígeno do mesmo, e composições do mesmo também podem ser usados junto com outros agentes a fim de intensificar e/ou complementar a eficácia dos agentes.
[0318]Em certas modalidades, o anticorpo do CXCR5, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, é complexado com o CXCR5 antes da administração. Em certas modalidades, o anticorpo do CXCR5 não é complexado com o CXCRS5 antes da administração.
[0319]A invenção também propõe composições, incluindo composições farmacêuticas, que compreendem qualquer um dos polinucleotídeos da invenção. Em algumas modalidades, a composição compreende um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica o anticorpo conforme descrito neste documento. Em outras modalidades, a composição compreende um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica qualquer um dos anticorpos descritos neste documento. Em ainda outras modalidades, a composição compreende ou um ou ambos os polinucleotídeos que codificam a sequência representada nos SEQ ID Nº: 1 e SEQ ID Nº: 6, ou um ou ambos os polinucleotídeos que codificam a sequência representada nos SEQ ID Nº: 1 e SEQ ID Nº: 10, ou um ou ambos os polinucleotídeos que codificam a sequência representada nos SEQ ID Nº: 1 e SEQ ID Nº: 12, ou um ou ambos os polinucleotídeos que codificam a sequência representada nos SEQ ID Nº: 5 e SEQ ID Nº: 6, ou um ou ambos os polinucleotídeos que codificam a sequência representada nos SEQ ID Nº: 5 e SEQ ID Nº: 10, ou um ou ambos os polinucleotídeos que codificam a sequência representada nos SEQ ID Nº: 5 e SEQ ID Nº: 12, ou um ou ambos os polinucleotídeos que codificam a sequência representada nos SEQ ID Nº: 13 e SEQ ID Nº: 17, ou um ou ambos os polinucleotídeos que codificam a sequência representada nos SEQ ID Nº: 13 e SEQ ID Nº: 18, ou um ou ambos os polinucleotídeos que codificam a sequência representada nos SEQ ID Nº: 13 e SEQ ID Nº: 63, ou um ou ambos os polinucleotídeos que codificam a sequência representada nos SEQ ID Nº: 1 e SEQ ID Nº: 52, ou um ou ambos os polinucleotídeos que codificam a sequência representada nos SEQ ID Nº: 1 e SEQ ID Nº: 53, ou um ou ambos os polinucleotídeos que codificam a sequência representada nos SEQ ID Nº: 1 e SEQ ID Nº: 54, ou um ou ambos os polinucleotídeos que codificam a sequência representada nos SEQ ID Nº: 1 e SEQ ID Nº: 55, ou um ou ambos os polinucleotídeos que codificam a sequência representada nos SEQ ID Nº: 1 e SEQ ID Nº: 56, ou um ou ambos os polinucleotídeos que codificam a sequência representada nos SEQ ID Nº: 1 e SEQ ID Nº: 57, ou um ou ambos os polinucleotídeos que codificam a sequência representada nos SEQ ID Nº: 6 e SEQ ID Nº: 48, ou um ou ambos os polinucleotídeos que codificam a sequência representada nos SEQ ID Nº: 6 e SEQ ID Nº: 49, ou um ou ambos os polinucleotídeos que codificam a sequência representada nos SEQ ID Nº: 6 e SEQ ID Nº: 50, ou um ou ambos os polinucleotídeos que codificam a sequência representada nos SEQ ID Nº: 6 e SEQ ID Nº: 51, ou um ou ambos os polinucleotídeos que codificam a sequência representada nos SEQ ID Nº: 17 e SEQ ID Nº: 58, ou um ou ambos os polinucleotídeos que codificam a sequência representada nos SEQ ID Nº: 17 e SEQ ID Nº: 59, ou um ou ambos os polinucleotídeos que codificam a sequência representada nos SEQ ID Nº: 17 e SEQ ID Nº: 60, ou um ou ambos os polinucleotídeos que compreendem a sequência representada nos SEQ ID Nº: 17 e SEQ ID Nº: 61, ou um ou ambos os polinucleotídeos que codificam a sequência representada nos SEQ |D Nº: 17 e SEQ ID Nº: 62, ou um ou ambos os polinucleotídeos que codificam a sequência representada nos SEQ ID Nº: 52 e SEQ ID Nº: 1, ou um ou ambos os polinucleotídeos que codificam a sequência representada nos SEQ ID Nº: 52 e SEQ ID Nº: 5, ou um ou ambos os polinucleotídeos que codificam a sequência representada nos SEQ ID Nº: 52 e SEQ ID Nº: 47, ou um ou ambos os polinucleotídeos que codificam a sequência representada nos SEQ |D Nº: 52 e SEQ ID Nº: 48, ou um ou ambos os polinucleotídeos que codificam a sequência representada nos SEQ ID Nº: 52 e SEQ ID Nº: 49, ou um ou ambos os polinucleotídeos que codificam a sequência representada nos SEQ ID Nº: 52 e SEQ ID Nº: 50, ou um ou ambos os polinucleotídeos que codificam a sequência representada nos SEQ ID Nº: 52 e SEQ ID Nº: 51, ou um ou ambos os polinucleotídeos que codificam a sequência representada nos SEQ ID Nº: 35 e SEQ ID Nº: 36.
[0320]Em outro aspecto, o polinucleotídeo pode codificar a VH, VL e/ou ambas a VH e a VL do anticorpo da invenção. Ou seja, a composição compreende um único polinucleotídeo ou mais de um polinucleotídeo que codifica o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, da invenção.
[0321]Composições farmacêuticas da invenção também podem ser administradas em terapia combinada, tal como, em combinação a outros agentes. Por exemplo, a terapia combinada pode incluir um anticorpo do CXCR5, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, da presente invenção combinado a ao menos uma outra terapia, em que a terapia pode ser cirurgia, imunoterapia ou terapia com fármaco.
[0322]As composições farmacêuticas da invenção podem incluir um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos desses sais incluem sais por adição de ácido e sais por adição de base. Sais por adição de ácido incluem os derivados de ácidos inorgânicos atóxicos, tais como ácido clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromídrico, iodídrico, fosforoso e seus semelhantes, bem como de ácidos orgânicos atóxicos, tais como ácidos mono e dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos substituídos com fenila, ácidos hidróxi alcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfônicos alifáticos e aromáticos e seus semelhantes. Sais por adição de base incluem os derivados de metais alcalinoterrosos, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio e seus semelhantes, bem como de aminas orgânicas atóxicas, tais como N .N'-dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína e seus semelhantes.
[0323]Uma composição farmacêutica da invenção também pode incluir um antioxidante — farmaceuticamente — aceitável. — Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfeto de sódio, sulfeto de sódio e seus semelhantes; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbila, hidroxianisol betilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lectina, galato de propila, alfa-tocoferol, e seus semelhantes; e (3) agentes quelantes de metal, tais como ácido cítrico, ácido etilenodiamina tetra-acético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, e seus semelhantes.
[0324]Exemplos de veículos aquosos e não aquosos adequados que podem ser usados nas composições farmacêuticas da invenção incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, e seus semelhantes), e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, tais como óleo de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, tais como lecitina, pela manutenção do tamanho das partículas necessário no caso de dispersões, e pelo uso de agentes tensoativos.
[0325]Essas composições também podem conter adjuvantes, tais como conservantes, umectantes, emulsificantes e dispersantes. A prevenção à presença de micro-organismos pode ser garantida tanto por procedimentos de esterilização quanto pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, e seus semelhantes. Também pode ser desejável incluir agentes isotônicos, tais como açúcares, cloreto de sódio, e seus semelhantes, nas composições. Além disso, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser promovida pela inclusão de agentes que retardem a absorção, tais como monoestearato de alumínio e gelatina.
[0326]Tipicamente, as composições farmacêuticas devem ser estéreis e estáveis nas condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma ou outra estrutura adequada para uma alta concentração do fármaco. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão que contém, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, polietileno glicol líquido, e seus semelhantes), e misturas adequadas desses. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como de lecitina, pela manutenção do tamanho das partículas necessário no caso de dispersões e pelo uso de agentes tensoativos. Em muitos casos, será adequado incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser viabilizada incluindo na composição um agente que retarde a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.
[0327]Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando o composto ativo, na quantidade desejada, a um solvente adequado com um dos ingredientes citados acima, ou uma combinação dos ingredientes citados acima, conforme a necessidade, e, depois, microfiltrando para esterilização.
[0328]Em geral, as dispersões são preparadas incorporando o composto ativo a um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os demais ingredientes necessários dentre os citados acima. No caso de pós estéreis para o preparo de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparo preferidos são secagem a vácuo e secagem por congelamento (liofilização), que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional a partir de uma solução estéril previamente filtrada dos mesmos.
[0329]Uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser preparada, embalada ou vendida em uma fórmula adequada para a administração oftálmica. Essas fórmulas podem ser, por exemplo, na forma de colírios, incluindo, por exemplo, uma solução ou suspensão a 0,1% a 1,0% (w/w) do ingrediente ativo em um veículo líquido aquoso ou oleoso. Esses colírios podem compreender ainda agentes tamponantes, sais ou um ou mais outros agentes adicionais descritos neste documento. Outras fórmulas oftalmicamente administráveis que são úteis incluem as que compreendem o ingrediente ativo em forma microcristalina ou em um preparado lipossômico.
[0330]Conforme usado neste documento, "ingredientes adicionais" inclui, entre outros, um ou mais dos seguintes: excipientes; agentes tensoativos; agentes dispersantes; diluentes inertes; agentes granulantes e desintegrantes; agentes ligantes; agentes lubrificantes; agentes edulcorantes; agentes aromatizantes; corantes; conservantes; composições fisiologicamente degradáveis tais como gelatina; veículos e solventes aquosos; veículos e solventes oleosos; agentes suspensores; agentes dispersantes ou umectantes; agentes emulsificantes, demulcentes; tampões; sais; agentes espessantes; enchimentos; agentes emulsificantes; antioxidantes; antibióticos; agentes antifúngicos;s agentes estabilizantes; e materiais poliméricos ou hidrófobos farmaceuticamente aceitáveis. Outros "ingredientes adicionais" que podem ser incluídos nas composições farmacêuticas da invenção são conhecidos no setor e descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences, Genaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1985), que se incorpora ao presente documento por referência.
[0331]Em uma modalidade, o anticorpo do CXCR5, ou fragmento de ligação com antígeno, é administrado em uma fórmula intravenosa como uma solução aquosa estéril contendo 5 mg/mL do anticorpo, ou, em algumas modalidades, cerca de 10 mg/mL, ou, em algumas modalidades, cerca de 15 mg/mL, ou, em algumas modalidades, cerca de 20 mg/mL do anticorpo, ou, em algumas modalidades, cerca de 25 mg/mL, ou, em algumas modalidades, cerca de 50 mg/mL, com acetato de sódio, polissorbato 80, e cloreto de sódio a um pH na faixa de cerca de 5a 6. Em algumas modalidades, a fórmula intravenosa é uma solução aquosa estéril contendo ou 10 mg/mL do anticorpo, com 20 mM de acetato de sódio, 0,2 mg/ml de polissorbato 80, e 140 mM de cloreto de sódio a pH 5,5. Além disso, uma solução compreendendo um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, inclui entre muitos outros compostos, histidina, manitol, sacarose, trehalose, glicina, poli(etileno)glicol, EDTA, metionina, e qualquer combinação desses, e muitos outros compostos conhecidos na técnica relevante.
[0332]EM uma modalidade, uma composição farmacêutica da presente invenção compreende os componentes a seguir: 50 mg/mL do anticorpo do CXCRS5, ou fragmento de ligação com antígeno, da presente invenção, 20 mM de histidina, 8,5% de sacarose, e 0,02% de polissorbato 80, 0,005% de EDTA a pH 5,8; em outra modalidade, uma composição farmacêutica da presente invenção compreende os componentes a seguir: 100 mg/mL do anticorpo do CXCRS5, ou fragmento de ligação com antígeno, da presente invenção, 10 mM de histidina, 5% de sacarose, e 0,01% de polissorbato 80 a pH 5,8. A presente composição pode ser fornecida como uma fórmula líquida ou como um pó liofilizado. Quando o pó é reconstituído em volume total, a composição mantém a mesma fórmula. Como alternativa, o pó pode ser reconstituído a meio volume, caso esse em que a composição compreende 100 mg do anticorpo do CXCR5, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, da presente invenção, 20 mM de histidina, 10% de sacarose, e 0,02% de polissorbato 80 a pH 5,8.
[0333]Em uma modalidade, parte da dose é administrada por um bólus intravenoso, e o restante por infusão da fórmula de anticorpo. Por exemplo, uma injeção intravenosa de 0,01 mg/kg do anticorpo do CXCRS5, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, pode ser administrada como um bólus, e o restante da dose de anticorpo pode ser administrada por injeção intravenosa. Uma dose predeterminada do anticorpo do CXCRS5, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, pode ser administrada, por exemplo, ao longo de um período de uma hora e meia a duas horas a cinco horas.
[0334]No que diz respeito a um agente terapêutico, em que o agente é, por exemplo, uma molécula pequena, ele pode se fazer presente em uma composição farmacêutica na forma de um éster ou sal farmaceuticamente aceitável, tal como em combinação a um cátion ou ânion fisiologicamente aceitável, como é bem conhecido no setor.
[0335]As fórmulas das coposições farmacêuticas descritas neste documento podem ser preparadas por qualquer método conhecido ou desenvolvido doravante na técnica da farmacologia. Em termos gerais, esses métodos preparatórios incluem a etapa de associar o ingrediente ativo a um veículo ou a um ou mais outros ingredientes acessórios, e, em seguida, se necessário ou desejável, conformar ou embalar o produto em uma unidade de dose única ou múltipla desejada.
[0336]EmM uma modalidade, as composições da invenção são fórmulas sem pirogênio que são substancialmente isentas de endotoxinas e/ou substâncias pirogênicas relacionadas. Endotoxinas incluem toxinas que são confinadas dentro de um micro-organismo e liberadas quando o micro-organismo se decompõe ou morre. As substâncias pirogênicas também incluem substâncias termoestáveis causadores de febre (glicoproteínas) oriundas da membrana externa de bactérias e de outros micro-organismos. Ambas essas substâncias podem causar febre, hipotensão e choque se administradas a seres humanos. Devido aos efeitos potencialmente nocivos, é vantajoso remover até mesmo quantidades baixas de endotoxinas das soluções farmacêuticas de fármacos administrados por via intravenosa. A Food and Drug Administration ("FDA") definiu um limite superior de 5 unidades de endotoxina (EU) por dose por quilograma do peso corporal em um período de uma única hora para aplicações intravenosas de fármacos (The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1):223 (2000)) Quando as proteínas terapêuticas são administradas em quantidades de várias centenas ou milhares de miligramas por quilograma do peso corporal, é vantajoso remover até mesmo quantidades residuais de endotoxina. Em uma modalidade, os níveis de endotoxina e pirogênio na composição são inferiores a 10 EU/mg, ou inferiores a 5 EU/mg, ou inferiores a 1 EU/mg, ou inferiores a 0,1 EU/mg, ou inferiores a 0,01 EU/mg, ou inferiores a 0,001 EU/mg. Em outra modalidade, os níveis de endotoxina e pirogênio na composição são inferiores a cerca de 10 EU/mg, ou inferiores a cerca de 5 EU/mg, ou inferiores a cerca de 1 EU/mg, ou inferiores a cerca de 0,1 EU/mg, ou inferiores a cerca de 0,01 EU/mg, ou inferiores a cerca de 0,001 EU/mg.
[0337]EmM uma modalidade, a invenção compreende administrar uma composição em que a referida administração é oral, parentérica, intramuscular, intranasal, vaginal, retal, lingual, sublingual, bucal, intrabucal, intravenosa, cutânea, subcutânea ou transdérmica.
[0338]Em outra modalidade, a invenção compreende ainda administrar uma composição em combinação a outras terapias, tais como cirurgia, quimioterapia, terapia hormonal, terapia biológica, imunoterapia ou radioterapia.
VII. DOSAGEM/ADMINISTRAÇÃO
[0339]Para preparar composições farmacêuticas ou estéreis incluindo um anticorpo do CXCRS5, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, o anticorpo é misturado a um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Fórmulas de agentes terapêuticos e diagnósticos podem ser preparadas pela mistura com veículos, excipientes ou estabilizantes fisiologicamente aceitáveis na forma, por exemplo, de pós liofilizados, pastas, soluções aquosas, loções ou suspensões (vide, por exemplo, Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, Nova York, N. Y.; Avis, et al. (eds.)) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et a/. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.).
[0340]A seleção de um regime de administração para um produto terapêutico depende de diversos fatores, incluindo a taxa de rotatividade no soro ou tecido do beneficiário, o nível de sintomas, a imunogenicidade do beneficiário, e a acessibilidade das células alvo na matriz biológica. Em certas modalidades, um regime de administração maximiza a quantidade do produto terapêutico distribuída ao paciente em consonância com um nível aceitável de efeitos colaterais. Logo, a quantidade do produto terapêutico distribuída depende em parte do beneficiário em questão e da gravidade da condição em tratamento. Orientações para selecionar doses apropriadas de anticorpos, citocinas e pequenas moléculas encontram-se à disposição (vide, por exemplo, Wawrzynczak, 1996, Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.), 1991, Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, N.Y.; Bach (ed.), 1993, Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, N. Y.; Baert, et a/., 2003, New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom, et a/., 1999, New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamon, et a/., 2001, New Engl. J. Med. 344:783-792;
Beniaminovitz, et a/., 2000, New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh, et a/., 2003, New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky, et a/., 2000, New Engl. J. Med. 343:1594- 1602).
[0341]A determinação da dose apropriada é feita pelo médico, por exemplo, usando parâmetros ou fatores conhecidos ou suspeitos na técnica de afetar o tratamento ou previstos para afetar o tratamento. Em termos gerais, a dose começa com uma quantidade um tanto menor que a dose ideal e é aumentada em pequenos incrementos depois disso até que o efeito desejado ou ideal seja obtido em relação a quaisquer efeitos colaterais negativos. Medidas diagnósticas importantes incluem as de sintomas, por exemplo, da inflamação ou do nível de citocinas inflamatórias produzidas.
[0342]Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados a fim de obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para atingir a resposta terapêutica desejada para um paciente, composição e modo de administração específicos, sem que ela seja tóxica ao paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos, incluindo a atividade das composições específicas da presente invenção empregadas, ou éster, sal ou amida das mesmas, a via de administração, o horário de administração, a taxa de evacuação do composto específico sendo usado, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação às composições específicas empregadas, a idade, o sexo, o peso, a condição, a saúde geral e o histórico médico pregresso do paciente em tratamento, e fatores semelhantes bem conhecidos na medicina.
[0343]Composições que compreendem anticorpos do CXCR5, ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos, da invenção podem ser administradas por infusão contínua, ou por doses em intervalos, por exemplo, de um dia, uma semana ou 1 a 7 vezes por semana. As doses podem ser administradas por via intravenosa, subcutânea, tópica, oral, nasal, retal, intramuscular, intracerebral ou por inalação. Um protocolo de dose específico é tal que envolve a dose máxima ou uma frequência de dose que evite efeitos colaterais indesejáveis significativos. Uma dose semanal total pode ser de ao menos 0,05 upg/kg do peso corporal, ao menos 0,2 ug/kg, ao menos 0,5 ug/Kkg, ao menos 1 ug/kg, ao menos 10 ug/kg, ao menos 100 ug/Kkg, ao menos 0,2 mg/kg, ao menos 1,0 mg/kg, ao menos 2,0 mg/kg, ao menos 10 mg/kg, ao menos 15 mg/kg, ao menos 20 mg/Kg, ao menos 25 mg/kg, ou ao menos 50 mg/kg (vide, por exemplo, Yang, et a/., 2003, New Engl. J. Med. 349:427-434; Herold, et a/., 2002, New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liu, et al, 1999, J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456; Portielji, et a/., 2003, Cancer. Immunol. Immunother. 52: 133-144). A dose pode ser de ao menos 15 ug, ao menos ug, ao menos 25 ug, ao menos 30 ug, ao menos 35 ug, ao menos 40 ug, ao menos 45 ug, ao menos 50 ug, ao menos 55 ug, ao menos 60 ug, ao menos 65 ug, ao menos 70 ug, ao menos 75 ug, ao menos 80 ug, ao menos 85 ug, ao menos 90 ug, ao menos 95 ug, ou ao menos 100 ug. As doses administradas a um paciente podem somar ao menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12, ou mais.
[0344]No caso de anticorpos do CXCR5, ou fragmentos de ligação com anticorpo dos mesmos, da invenção, a dosagem administrada a um paciente pode ser de 0,0001 mg/kg a 100 mg/kg do peso corporal do paciente. A dosagem pode ser entre 0,0001 mg/kg e 20 mg/kg, 0,0001 mg/kg e 10 mg/kg, 0,0001 mg/kg e 5 mg/kg, 0,0001 e 2 mg/kg, 0,0001 e 1 mg/kg, 0,0001 mg/kg e 0.75 mg/kg, 0,0001 mg/kg e 0,5 mg/kg, 0,0001 mg/kg a 0.25 mg/kg, 0,0001 a 0,15 mg/kg, 0,0001 a 0,10 mg/kg, 0,001 a 0,5 mg/kg, 0,01 a 0,25 mg/kg ou 0,01 a 0,10 mg/kg do peso corporal do paciente.
[0345]A dosagem do anticorpo do CXCR5, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, pode ser calculada usando o peso do paciente em quilogramas
(kg) multiplicado pela dose a ser administrada em mg/kg. A dosagem dos anticorpos da invenção pode ser de 150 ug/kg ou menos, 125 ug/kg ou menos, 100 ug/Kkg ou menos, 95 ug/kg ou menos, 90 ug/kg ou menos, 85 ug/kg ou menos, 80 ug/kg ou menos, 75 ug/kg ou menos, 70 ug/kg ou menos, 65 ug/kg ou menos, 60 ug/kg ou menos, 55 ug/kg ou menos, 50 ug/kg ou menos, 45 ug/kg ou menos, 40 ug/kg ou menos, 35 ug/kg ou menos, 30 ug/kg ou menos, 25 ug/kg ou menos, 20 ug/kg ou menos, 15 ug/kg ou menos, 10 ug/kg ou menos, 5 ug/kg ou menos, 2,5 ug/kg ou menos, 2 ug/kg ou menos, 1,5 ug/kg ou menos, 1 ug/kg ou menos, 0,5 ug/kg ou menos, ou 0,1 ug/kg ou menos do peso corporal do paciente.
[0346]A dose unitária dos anticorpos do CXCRS5, ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos, pode ser de 0,1 mg a 200 mg, 0,1 mg a 175 mg, 0,1 mg a 150 mg, 0,1 mg a 125 mg, 0,1 mg a 100mg, 0,1 mg a 75 mg, 0,1 mg a 50 mg, 0,1 mg a 30 mg, 0,1 mg a 20 mg, 0,1 mg a 15 mg, 0,1 mg a 12 mg, 0,1 mg a 10 mg, 0,1 mg a 8 mg, 0,1 mg a 7 mg, 0,1 mg a 5 mg, 0,1 to 2,5 mg, 0,25 mg a 20 mg, 0,25 to mg, 0,25 to 12 mg, 0,25 to 10 mg, 0,25 to 8 mg, 0,25 mg a 7 mg, 0,25mga5mg, 0,5 mg a 2,5 mg, 1 mg a 20 mg, 1 mg a 15 mg, 1 mg a 12 mg, 1 mg a 10 mg, 1 mga 8 mg, 1 mg a 7 mg, 1 mg a 5 mg, ou 1 mg a 2,5 mg.
[0347]A dosagem dos anticorpos do CXCR5, ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos, da invenção pode atingir uma titulação no soro de ao menos 0,1 ug/mL, ao menos 0,5 ug/mL, ao menos 1 ug/mL, ao menos 2 ug/mL, ao menos 5 Vg/mL, ao menos 6 ug/mL, ao menos 10 ug/mL, ao menos 15 pg/mL, ao menos 20 Vg/mL, ao menos 25 ug/mL, ao menos 50 ug/mL, ao menos 100 ug/mL, ao menos 125 pg/mL, ao menos 150 pg/mL, ao menos 175 pg/mL, ao menos 200 upg/mL, ao menos 225 ug/mL, ao menos 250 pg/ml, ao menos 275 pg/ml, ao menos 300 Vg/mL, ao menos 325 pg/ml, ao menos 350 pg/mL, ao menos 375 pg/mL, ou ao menos 400 pg/mL em um paciente. Como alternativa, a dosagem dos anticorpos da invenção pode atingir uma titulação no soro de ao menos 0,1 ug/mL, ao menos 0,5 uVg/mL, ao menos 1 pug/mL, ao menos 2 pug/mL, ao menos 5 pg/mL, ao menos 6 uVg/mL, ao menos 10 ug/mL, ao menos 15 ug/mL, ao menos 20 ug/mL, ao menos 25 Vg/mL, ao menos 50 ug/mL, ao menos 100 ug/mL, ao menos 125 pug/mL, ao menos 150 upg/mL, ao menos 175 pg/mL, ao menos 200 pg/mL, ao menos 225 upg/mL, ao menos 250 ug/mL, ao menos 275 pg/ml, ao menos 300 ug/mL, ao menos 325 Vg/mL, ao menos 350 ug/mL, ao menos 375 pg/mL, ou ao menos 400 pg/ml no paciente.
[0348]As doses de anticorpos do CXCR5, ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos, da invenção podem ser repetidas, e as administrações podem ser espaçadas em ao menos 1 dia, 2 dias, 3 dias, 5 dias, 10 dias, 15 dias, 30 dias, 45 dias, 2 meses, 75 dias, 3 meses, ou ao menos 6 meses.
[0349]Uma quantidade eficaz para um paciente específico pode variar dependendo de fatores tais como a condição em tratamento, a saúde geral do paciente, a via e dose de administração do método e a gravidade dos efeitos colaterais (vide, por exemplo, Maynard, et a/., 1996, A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpoharm Press, Boca Raton, Fla.; Dent, 2001, Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ, Londres, UK).
[0350]A via de administração pode ser, por exemplo, por aplicação tópica ou cutânea, injeção ou infusão por via intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intra-arterial, intracerebroespinhal, intralesional, ou por sistemas de liberação sustentada ou um implante (vide, por exemplo, Sidman et al., 1983, Biopolymers 22:547-556; Langer, et a/., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167- 277; Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105; Epstein, et al/., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692; Hwang, et a/., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030- 4034; Patentes dos EUA nº 6.350.466 e 6.316.024) Quando necessário, a composição também pode incluir um agente solubilizante e um anestésico local, tal como lidocaína, para aliviar a dor no local da injeção. Em aditamento, a administração pulmonar também pode ser empregada, por exemplo, pelo uso de um inalador ou nebulizador, e formulação com um agente aerossol. Vide, por exemplo, as Patentes dos EUA nº 6.019.968. 5.985.320. 5.985.309. 5.934.272. 5.874.064.
5.855.913. 5.290.540 e 4.880.078; e as Publicações PCT nº WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 e WO 99/66903, cada uma das quais incorpora-se ao presente documento por referência na íntegra. Em uma modalidade, o anticorpo do CXCR5, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, ou uma composição da invenção é administrado usando a tecnologia para a distribuição pulmonar de fármacos Alkermes AIRTY (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.).
[0351]UmMa “composição da presente invenção também pode ser administrada através de uma ou mais vias de administração por uma ou mais de uma variedade de métodos conhecidos no setor. Como os versados na técnica perceberão, a via e/ou modo de administração variará dependendo dos resultados desejados. Vias de administração selecionadas para os anticorpos da invenção incluem as vias de administração intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutânea, espinhal ou outras vias de administração parentéricas, por exemplo, por injeção ou infusão. A administração parentérica pode representar modos de administração que não a administração entérica e tópica, tipicamente por injeção, e inclui, entre outros, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intra- arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraespinhal, epidural e intraesternal. Como alternativa, uma composição da invenção pode ser administrada através de uma via não parentérica, tal como uma via de administração tópica, epidérmica ou mucosal, por exemplo, por via intranasal, oral, vaginal, retal, sublingual ou tópica.
[0352]Se os anticorpos do CXCR5, ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos, da invenção forem administrados em um sistema de liberação controlada ou sustentada, uma bomba pode ser usada para obter a liberação controlada ou sustentada (vide, Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et a/., 1980, Surgery 88:501; Saudek et a/., 1989, N. Engl. J. Med. 321:514).
[0353]Materiais poliméricos podem ser usados para obter a liberação controlada ou sustentada das terapias da invenção (vide, por exemplo, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. ScL Rev. Macromol. Chem. 23:61; see also Levy et al/., 1985, Science 11 225:190; During et a/., 1929, Ann. Neurol. 25:351; Howard et a/., 1989, J. Neurosurg. 71: 105); Patente dos EUA nº 5.679.377; Patente dos EUA nº 5.916.597; Patente dos EUA nº 5.912.015; Patente dos EUA nº 5.989.463; Patente dos EUA nº
5.128.326; Publicação PCT nº WO 99/15154; e Publicação PCT nº WO 99/20253. Exemplos de polímeros usados em fórmulas de liberação sustentada incluem, entre outros, poli(2-hidróxi etil metacrilato), poliímetil metacrilato), polifácido acrílico), poli(acetato de etileno-co-vinila), polilácido metacrílico), poliglicolídeos (PLG), polianidridos, poli(N-vinil pirrolidona), poli(álcool vinílico), poliacrilamida, poli(etileno glicol), polilactídeos (PLA), polilactídeo-co-glicolídeos (PLGA), e poliortoésteres. Em uma modalidade, o polímero usado em uma fórmula de liberação sustentada é inerte, isento de impurezas lixiviáveis, estável em armazenamento, estéril e biodegradável. Um sistema de liberação controlada ou sustentada pode ser colocado em proximidade ao alvo profiláctico ou terapêutico, exigindo assim somente uma fração da dose sistêmica (vide, por exemplo, Goodson, em Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)).
[0354]Sistemas de liberação controlada são discutidos no estudo de Langer, 1990, Science 249:1527-1533. Qualquer técnica conhecida pelos versados no setor pode ser usada para produzir fórmulas de liberação sustentada compreendendo um ou mais anticorpos da invenção ou conjugados dos mesmos. Vide, por exemplo, a Patente dos EUA nº 4.526.938, a Publicações de Patente Internacional nº WO 91/05548, a WO 96/20698, Ning et a/l., 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy and Oncology 59:179-189, Song et a/., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 50:372-397, Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. MI. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, e Lam et al, 1997, "Microencapsulation of. Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. MI. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-160, cada um dos quais incorpora-se ao presente documento por referência na íntegra.
[0355]Se o anticorpo do CXCRS5, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, da invenção for administrado por via tópica, ele pode ser formulado na forma de uma pomada, creme, adesivo transdérmico, loção, gel, xampu, spray, aerossol, solução, emulsão, ou outra forma bem conhecida pelos versados na técnica. Vide, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19º ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995). No caso de formas de dosagem tópicas não pulverizáveis, empregam-se tipicamente formas viscosas a semissólidas ou sólidas compreendendo um veículo ou um ou mais excipientes compatíveis com a aplicação tópica e tendo uma viscosidade dinâmica, em alguns casos, superior à da água. Fórmulas adequadas incluem, entre outras, soluções, suspensões, emulsões, cremes, pomadas, pós, linimentos, unguentos e seus semelhantes, que são, se desejado, esterilizados ou misturados a agentes auxiliares (por exemplo, conservantes, estabilizantes, umectantes, tampões, ou sais) para influenciar várias propriedades, tais como, por exemplo, a pressão osmótica. Outras formas de dosagem tópica adequadas incluem preparados de aerossol pulverizáveis em que o ingrediente ativo, em alguns casos, em combinação a um veículo inerte sólido ou líquido, é embalado em uma mistura com uma substância volátil pressurizada (por exemplo, um propelente gasoso, tal como freon) ou em um frasco de apertar. Cremes hidratantes ou umectantes também podem ser adicionados a composições farmacêuticas e formas de dosagem, se desejado. Exemplos desses ingredientes adicionais são bem conhecidos no setor.
[0356]Se as composições compreendendo anticorpos do CXCR5, ou fragmentos de ligação com antígeno do mesmo, forem administradas por via intranasal, elas podem ser formuladas em forma de aerossol, spray, névoa ou na forma de gotas. Em particular, agentes profilácticos ou terapêuticos para uso de acordo com a presente invenção são convenientemente distribuídos na forma de uma aplicação por spray de aerossol a partir de embalagens pressurizadas ou de um nebulizador, com o uso de um propelente adequado (por exemplo, diclorodifluormetano, triclorofluormetano, diclorotetrafluoretano, dióxido de carbono ou outro gás adequado). No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada incorporando-se uma válvula para administrar uma quantidade sob medida. É possível formular cápsulas ou cartuchos (compostos, por exemplo, por gelatina) para uso em um inalador ou insuflador, que contenham uma mistura em pó do composto e uma base em pó adequada, tal como lactose ou amido.
[0357]Métodos para a coadministração ou tratamento com um segundo agente terapêutico, por exemplo, uma citocina, esteroide, agente quimioterapêutico, antibiótico ou radiação, são bem conhecidos no setor (vide, por exemplo, Hardman, et al. (eds.) (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10 th ed., McGraw-Hill, New York, N.Y.; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach,
Lippincott, Williams and Wilkins, Phila., Pa.; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams and Wilkins, Phila., Pa.). Uma quantidade eficaz da substância terapêutica pode reduzir os sintomas em ao menos 10%; em ao menos 20%; em ao menos cerca de 30%; ao menos 40%, ou ao menos 50%.
[0358]Terapias adicionais (por exemplo, agentes profilácticos ou terapêuticos), que podem ser administradas em combinação aos anticorpos do CXCR5, ou fragmentos de ligação com antígeno da invenção, podem ser administradas espaçadas em menos de 5 minutos, espaçadas em menos de 30 minutos, espaçadas em 1 hora, espaçadas em cerca de 1 hora, espaçadas em cerca de 1 a cerca de 2 horas, espaçadas em cerca de 2 horas a cerca de 3 horas, espaçadas em cerca de 3 horas a cerca de 4 horas, espaçadas em cerca de 4 horas a cerca de 5 horas, espaçadas em cerca de 5 horas a cerca de 6 horas, espaçadas em cerca de 6 horas a cerca de 7 horas, espaçadas em cerca de 7 horas a cerca de 8 horas, espaçadas em cerca de 8 horas a cerca de 9 horas, espaçadas em cerca de 9 horas a cerca de 10 horas, espaçadas em cerca de 10 horas a cerca de 11 horas, espaçadas em cerca de 11 horas a cerca de 12 horas, espaçadas em cerca de 12 horas a cerca de 18 horas, espaçadas em 18 horas a 24 horas, espaçadas em 24 horas a 36 horas, espaçadas em 36 horas a 48 horas, espaçadas em 48 horas a 52 horas, espaçadas em 52 horas a 60 horas, espaçadas em 60 horas a 72 horas, espaçadas em 72 horas a 84 horas, espaçadas em 84 horas a 96 horas, ou espaçadas em 96 horas a 120 horas do anticorpo da invenção. As duas ou mais terapias podem ser administradas em uma mesma visita do paciente.
[0359]Os anticorpos do CXCRS5, ou fragmentos de ligação com antígeno do mesmo, da invenção e as demais terapias podem ser administrados ciclicamente. À terapia de ciclagem envolve a administração de uma primeira terapia (por exemplo, um agente profiláctico ou terapêutico) por certo período de tempo, seguida pela administração de uma segunda terapia (por exemplo, um segundo agente profiláctico ou terapêutico) por certo período de tempo, opcionalmente seguida pela administração de uma terceira terapia (por exemplo, agente profiláctico ou terapêutico) por certo período de tempo e assim por diante, e a repetição dessa administração em sequência, isto é, em ciclo, a fim de reduzir o desenvolvimento de resistência a uma das terapias, a fim de evitar ou reduzir os efeitos colaterais de uma das terapias, e/ou a fim de intensificar a eficácia das terapias.
[0360]Em uma modalidade, os anticorpos do CXCRS5 da invenção podem ser coadministrados junto com composições para tratar doenças e transtornos autoimunes, incluindo, entre outras, adriamicina, azatiopurina,y bussulfano, ciclofosfamida, ciclosporina A, Citoxano, fludarabina, 5-fluorouracila, metotrexato, micofenolato de mofetila, 6-mercaptopurina, um corticosteroide, um anti-inflamatório não esteroidal, sirolimo (rapamicina) e tacrolimo (FK-506) Em modalidades alternativas, o agente imunomodulador ou imunossupressor é um anticorpo selecionado dentre o grupo composto por muromonabe-CD3, alemtuzumabe (CampathO), basilikimabe, daclizumabe, muromonabe (OKT30O), rituximabe, globulina antitimócito e IVlg, e outros, que são conhecidos pelos versados na técnica.
[0361]Em uma modalidade, os anticorpos do CXCRS5 da invenção podem ser coadministrados junto com composições para tratar o diabetes, incluindo, entre outras, biguanidas (por exemplo, buformina, metformina, e fenform), hormônios e análogos dos mesmos (amilina, insulina, aspartato de insulina, detemir de insulina, glargina de insulina, glulisina de insulina, lispro de insulina, liraglutida, e pramlintide), derivados de sulfonilureia (acetohexamida, carbutamida, clorpropamida, glibornurida, gliclazida, glimepirida, glipizida, gliquidona, glisoxepide, gliburida, glibutiazol, glibuzol, glihexamida, glimidinay tolazamida, tolbutamida, e tolciclamida), tiazolidinedionas (pioglitazona, rosiglitazona, e troglitazona), acarbose, exenatida,
miglitol, mitiglinida, muraglitazar, nateglinida, repaglinida, sitagliptina, tesaglitazar, vildagliptina, e voglibose.
[0362]Em certas modalidades, os anticorpos do CXCRS5, ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos, da invenção podem ser formulados para garantir a distribuição apropriada in vivo. Por exemplo, a barreira hematoencefálica (BBB) exclui muitos compostos altamente hidrófilos. Para garantir que os compostos terapêuticos da invenção cruzem a BBB (se desejado), eles podem ser formulados, por exemplo, em lipossomas. Para métodos para fabricar lipossomas, vide, por exemplo, as Patentes dos EUA 4.522.811; 5.374.548; e 5.399.331. Os lipossomas podem compreender um ou mais grupamentos que são transportados seletivamente a células ou órgãos específicos, aprimorando assim a distribuição almejada do fármaco (vide, por exemplo, V.V. Ranade, 1989, J. Clin. Pharmacol. 29:685). Exemplos de grupamentos de direcionamento incluem folato ou biotina (vide, por exemplo, Patente dos EUA 5.416.016); manosídeos (Umezawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); anticorpos (P. G. Bloeman et a/., 1995, FEBS Lett. 357: 140; M. Owais et a/., 1995, Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); receptor da proteína tensoativa A (Briscoe et a/. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134); plI20 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); vide também K. Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994, FEBS Lett. 346:123; Killion; Fidler, 1994; Immunomethods 4:273.
[0363]A invenção propõe protocolos para a administração da composição farmacêutica compreendendo anticorpos do CXCRS5, ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos, da invenção à parte ou em combinação a outras terapias a um paciente que dela necessite. As terapias (por exemplo, agentes profilácticos ou terapêuticos) das terapias combinadas da presente invenção podem ser administradas concomitante ou sequencialmente ao paciente. A terapia (por exemplo, agentes profilácticos ou terapêuticos) das terapias combinadas da presente invenção também pode ser administrada ciclicamente. A terapia de ciclagem envolve a administração de uma primeira terapia (por exemplo, um primeiro agente profiláctico ou terapêutico) por certo período de tempo, seguida pela administração de uma segunda terapia (por exemplo, um segundo agente profiláctico ou terapêutico) por certo período de tempo, e a repetição dessa administração em sequência, isto é, em ciclo, a fim de reduzir o desenvolvimento de resistência a uma das terapias (por exemplo, agentes), a fim de evitar ou reduzir os efeitos colaterais de uma das terapias (por exemplo, agentes), e/ou a fim de aprimorar a eficácia das terapias.
[0364]As terapias (por exemplo, agentes profilácticos ou terapêuticos) das terapias combinadas da invenção podem ser administradas ao paciente concomitantemente. O termo "concomitantemente" não se limita à administração de terapias (por exemplo, agentes profilácticos ou terapêuticos) exatamente ao mesmo tempo, mas, em vez disso, significa que uma composição farmacêutica compreendendo anticorpos do CXCRS5, ou fragmentos de ligação com antígeno dos mesmos, da invenção é administrada a um paciente em uma sequência e dentro de um intervalo de tempo tal que os anticorpos da invenção ou conjugados dos mesmos atuem junto com a(s) outra(s) terapia(s) a fim de prover um benefício terapêutico superior a se administrados de outra forma. Por exemplo, cada terapia pode ser administrada a um paciente ao mesmo tempo ou em sequência em qualquer ordem em diferentes pontos no tempo; porém, se não administradas ao mesmo tempo, elas podem ser administradas suficientemente próximas no tempo a fim de prover o efeito terapêutico ou profiláctico desejado. Cada terapia pode ser administrada a um paciente em separado, em qualquer forma apropriada e por qualquer via adequada. Em várias modalidades, as terapias (por exemplo, agentes profilácticos ou terapêuticos) são administradas a um paciente espaçadas em menos de 15 minutos, espaçadas em menos de 30 minutos, espaçadas em menos de 1 hora, espaçadas em cerca de 1 hora, espaçadas em cerca de 1 hora a cerca de 2 horas, espaçadas em cerca de 2 horas a cerca de 3 horas, espaçadas em cerca de 3 horas a cerca de 4 horas, espaçadas em cerca de 4 horas a cerca de 5 horas, espaçadas em cerca de 5 horas a cerca de 6 horas, espaçadas em cerca de 6 horas a cerca de 7 horas, espaçadas em cerca de 7 horas a cerca de 8 horas, espaçadas em cerca de 8 horas a cerca de 9 horas, espaçadas em cerca de 9 horas a cerca de 10 horas, espaçadas em cerca de 10 horas a cerca de 11 horas, espaçadas em cerca de 11 horas a cerca de 12 horas, espaçadas em 24 horas, espaçadas em 48 horas, espaçadas em 72 horas, ou espaçadas em 1 semana. Em outras modalidades, duas ou mais terapias (por exemplo, agentes profilácticos ou terapêuticos) são administradas em uma mesma visita do paciente.
[0365]Os agentes profilácticos ou terapêuticos das terapias combinadas podem ser administrados a um paciente na mesma composição farmacêutica. Como alternativa, os agentes profilácticos ou terapêuticos das terapias combinadas podem ser administrados concomitantemente a um paciente em composições farmacêuticas distintas. Os agentes profilácticos ou terapêuticos podem ser administrados a um paciente por uma mesma via de administração ou por vias de administração diferentes.
VII. KITS
[0366]A presente invenção também propõe Kkits compreendendo qualquer um dos anticorpos descritos neste documento, ou todos eles. Os Kkits da invenção incluem um ou mais recipientes compreendendo um anticorpo do CXCR5 descrito neste documento e instruções para uso de acordo com qualquer um dos métodos da invenção descritos neste documento. Em termos gerais, essas instruções compreendem uma descrição da administração do anticorpo para os tratamentos terapêuticos descritos acima. Em algumas modalidades, são propostos Kkits para produzir uma unidade de administração de dose única. Em certas modalidades, o kit pode conter tanto um primeiro recipiente com uma proteína seca quanto um segundo recipiente com uma fórmula aquosa. Em certas modalidades, são incluídos Kkits contendo um aplicador, por exemplo, seringas pré-preenchidas de câmara única ou de múltiplas câmaras (por exemplo, seringas de líquido ou liosseringas).
[0367]As instruções referentes ao uso de um anticorpo do CXCRS5 incluem em geral informações quanto à dosagem, ao cronograma de dosagem e à via de administração para o tratamento tencionado. Os recipientes podem ser doses unitárias, embalagens a granel (por exemplo, embalagens multidose) ou doses subunitárias. As instruções fornecidas nos Kits da invenção são tipicamente instruções redigidas no rótulo ou bula (por exemplo, uma folha de papel incluída no Kit), mas instruções legíveis por máquina (por exemplo, instruções contidas em um disco de armazenamento magnético ou óptico) também são aceitáveis.
[0368]Os Kkits da presente invenção são fornecidos em uma embalagem adequada. Embalagens adequadas incluem, entre outros, ampolas, frascos, jarros, embalagens flexíveis (por exemplo, bolsas de Mylar ou bolsas plásticas vedadas), e seus semelhantes. Também são contempladas embalagens para uso em combinação a um dispositivo específico, tal como um inalador, um dispositivo de administração nasal (por exemplo, um atomizador) ou um dispositivo de infusão, tal como uma minibomba. Um Kit pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou uma ampola com um batente perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). O recipiente também pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou uma ampola com um batente perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Ao menos um agente ativo na composição é um anticorpo do CXCRS5 da invenção. O recipiente pode compreender ainda um segundo agente farmaceuticamente ativo.
[0369]Os kits podem prover opcionalmente ainda componentes adicionais como tampões e informações explicativas. Normalmente, o Kkit compreende um recipiente e um rótulo ou bula no ou associado ao recipiente.
[0370]A presente invenção também propõe kits diagnósticos compreendendo qualquer um dos anticorpos descritos neste documento, ou todos eles. Os Kkits diagnósticos são úteis, por exemplo, para detectar a presença do CXCR5 em uma amostra. Em algumas modalidades, um Kit diagnóstico pode ser usado para identificar um indivíduo com uma doença, transtorno ou condição latente que colocá-lo-ia em risco de desenvolver uma doença, transtorno ou condição mediada pelo CXCR5 ou uma doença, transtorno ou condição por deficiência do CXCR5. Em algumas modalidades, um Kkit diagnóstico pode ser usado para detectar a presença e/ou o nível de CXCR5 em um indivíduo suspeito de ter contraído uma doença mediada pelo CXCR5 ou uma doença, transtorno ou condição por deficiência do CXCR5.
[0371]Os kits diagnósticos da invenção incluem um ou mais recipientes compreendendo um anticorpo do CXCR5 descrito neste documento e instruções para uso de acordo com qualquer um dos métodos da invenção descritos neste documento. Em termos gerais, essas instruções compreendem uma descrição do uso do anticorpo do CXCRS5 para detectar a presença do CXCR5 em indivíduos com risco de contrair, ou com suspeita de ter contraído, uma doença mediada pelo CXCR5 ou uma doença, transtorno ou condição por deficiência do CXCR5. Em algumas modalidades, um Kit diagnóstico exemplificativo pode ser configurado para conter reagentes como, por exemplo, um anticorpo do CXCR5, uma amostra controle negativa, uma amostra controle positiva, e instruções para usar o kit.
IX. EQUIVALENTES
[0372]A descrição acima e os Exemplos a seguir detalham certas modalidades específicas da invenção e descrevem o melhor modo contemplado pelos inventores. Ficará evidente, contudo, que, não importa o quão detalhado o disposto acima pareça em texto, a presente invenção pode ser praticada de várias formas e deve ser interpretada de acordo com as reivindicações anexas e quaisquer equivalentes delas.
[0373]Embora os ensinamentos revelados tenham sido descritos com referência a várias aplicações, métodos, kits e composições, apreciar-se-á que várias mudanças e modificações podem ser feitas sem divergir dos ensinamentos neste documento nem da invenção reivindicada abaixo. Os exemplos a seguir são dados para melhor ilustrar os ensinamentos revelados e não visam a limitar o âmbito dos ensinamentos apresentados neste documento. Embora tenham-se descrito os presentes ensinamentos em termos dessas modalidades exemplificativas, os versados na técnica entenderão prontamente que inúmeras variações e modificações “dessas “modalidades exemplificativas são possíveis sem experimentação indevida. Todas essas variações e modificações encontram-se dentro do âmbito dos presentes ensinamentos.
[0374]Todas as referências citadas neste documento, incluindo patentes, pedidos de patente, artigos, livros e seus semelhantes, e as referências citadas nesses, na medida em que ainda não tenham sido incorporadas, são incorporadas ao presente documento por referência na íntegra. Caso uma ou mais literaturas ou materiais semelhantes incorporados difiram deste pedido ou o contradigam; incluindo, entre outros, com relação a termos definidos, uso de termos, técnicas descritas, ou algo do gênero, este pedido prevalecerá.
X. TÉCNICAS GERAIS
[0375]Deve-se ter em mente que a presente invenção não se limita a métodos sintéticos específicos, que podem, decerto, variar. Salvo definição em contrário neste documento, os termos científicos e técnicos usados com relação à presente invenção terão os significados comumente entendidos pelos versados na técnica. Além disso, a não ser que o contexto dite o contrário, termos no singular incluem o plural, e termos no plural incluem o singular. Em termos gerais, as técnicas de cultura celular e tecidual, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e química e hibridização de proteínas e ácidos nucleicos descritas neste documento, e a nomenclatura relativa às mesmas, são aquelas familiares e comumente usadas no setor.
[0376]A prática da presente invenção empregará, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, que encontram-se dentro da capacidade dos versados na técnica. Essas técnicas são explicadas na íntegra na literatura, tal como, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição (Sambrook et a/., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.l. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et a/., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et a/., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (JE. Coligan et a/., eds., 1991); Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1998);
Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY (2003); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).
[0377]As reações enzimáticas e técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações da fabricante, como é de praxe na técnica ou conforme descrito neste documento. As nomenclaturas empregadas com relação aos procedimentos e técnicas de laboratório de química analítica, bioquímica, imunologia, biologia molecular, química orgânica sintética e química medicinal e farmacêutica descritos neste documento, bem como os próprios, são as bem conhecidas e comumente usadas no ramo. Técnicas padrão são usadas para sínteses químicas, análises químicas, preparo farmacêutico, formulação e distribuição, bem como no tratamento dos pacientes.
XI. DEPÓSITO BIOLÓGICO
[0378]Materiais representativos da presente invenção foram depositados junto à American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, EUA, em 26 de julho de 2017. O vetor h11G2-VH (XC155), cujo nº de Acesso na ATCC é PTA-124323, compreende um inserto de DNA que codifica a região variável de cadeia pesada do anticorpo h11G2 (XC155), e o vetor h11G2-VL (XC154), cujo nº de Acesso na ATCC é PTA-124324, compreende um inserto de DNA que codifica a região variável de cadeia leve do anticorpo h11G2 (XC154). Os depósitos foram feitos de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste no que diz respeito ao Reconhecimento Internacional do Depósito de Micro-organismos para Efeitos do Procedimento em Matéria de Patentes e Regulações no mesmo (Tratado de Budapeste). Isso garante a manutenção de uma cultura viável do depósito por 30 anos desde a data do mesmo. O depósito será disponibilizado pela ATCC nos termos do Tratamento de Budapeste e está sujeito a um acordo entre a Pfizer Inc. e a ATCC, que garante a disponibilidade permanente e irrestrita da progênie da cultura do depósito ao público mediante emissão da patente dos EUA pertinente ou mediante abertura ao público de qualquer pedido de patente estrangeiro ou dos EUA, o que acontecer primeiro, e garante a disponibilidade da progênie à pessoa determinada pelo Comissário de Patentes e Marcas dos EUA como tendo direito a tanto de acordo com o Código dos Estados Unidos Título 35, Seção 122 e as regras do Comissário referentes ao mesmo (incluindo o Código de Regulamentos Federais dos EUA Título 37, Seção 1.14 com referência específica a 886 OG 638).
[0379]O titular do pedido de patente concordou que, se uma cultura dos materiais no depósito perecer ou for perdida ou destruída enquanto cultivada em condições adequadas, os materiais serão prontamente substituídos, mediante aviso, por outros da mesma ordem. A disponibilidade do material depositado não deve ser interpretada como permissão para praticar a invenção em violação aos direitos deferidos pela autoridade de qualquer governo de acordo com suas leis de patente.
EXEMPLOS
[0380]A invenção é adicionalmente descrita em detalhes com referência aos exemplos experimentais a seguir. Esses exemplos são dados somente à guisa de ilustração e não visam a ser exaustivos, salvo especificação em contrário. Sendo assim, a invenção não deve ser interpretada de modo a restringi-la aos exemplos a seguir, mas, em vez disso, deve-se interpretá-la de modo que abranja toda e qualquer variação que transpareça com base nos ensinamentos dados neste documento.
Exemplo 1: Hibridomas que ligam-se ao CXCR5 humano e CXCRS5 cino
[0381] Camundongos BALB/c fêmeos foram imunizados por três vezes com uma mistura contendo 1x10º células BaF3 superexpressando o CXCR5 humano (SEQ ID Nº: 32) ou células 300.19 expressando o CXCR5 humano (SEQ ID Nº: 32) com 5 ug do adjuvante CPG (ODN1826) (Invivogen) em séries espaçadas em três semanas. No reforço final, os camundongos foram imunizados com 20 ug de partículas similares a vírus (VLP) feitas de células HEK-293 superexpressando o CXCR5 humano (SEQ ID Nº: 32) usando o Sistema de Expressão de Proteínas Funcionais MembranePro'"" (Thermo Fisher). Cinco rodadas de fusão foram realizadas e produziram oitenta e oito clones que ligaram-se a células HEK-293 expressando o CXCR5 humano (hCXCR5-293). Esses anticorpos monocilonais foram purificados pela proteína A e testados quanto à ligação com células nCXCR5 HEK-293 e HEK-293 expressando o CXCR5 do macaco cinomolgo (SEQ ID Nº: 33), isto é, cinoCXCR5-293. As células nOCXCR5-293 ou cinoCXCR5-293 foram tingidas com anticorpos monoclonais a 10 pg/ml antes de tingilas com PE anti-lgG de camundongo (Southern Biotech). As células foram analisadas por citometria de fluxo usando um Analisador FACSVerse (BD Biosciences). A triagem da ligação com células hoXCR5 HEK-293 e cinoCXCR5 HEK-293 identificou trinta e quatro anticorpos que ligaram-se ao CXCR5 tanto humano quanto do macaco cinomolgo (FIG. 3).
Exemplo 2: Anticorpos anti-CXCR5 que ligam-se a células Raji e atividade antagonista no ensaio de fluxo de cálcio
[0382]Os anticorpos que ligaram-se tanto a células hnoCXCR5-293 quanto a células cinoCXCR5-293 foram adicionalmente analisados quanto à ligação celular com células Raji por citometria de fluxo usando um Analisador FACSVerse (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). A afinidade aparente da ligação dos anticorpos com células Raji foi calculada pela ECso de curvas de titulação de ligação de equilíbrio, em que a média geométrica da intensidade de fluorescência (gMFI) da população de ligação com antígeno foi quantificada por citometria de fluxo, e os resultados são dados na Tabela 2.
[0383]Os dados demonstram que certos anticorpos ligaram-se a células Raji em maior/menor grau do que outros anticorpos. Esses dados demonstram que os anticorpos reconhecem o CXCR5 endógeno nas células Raji, que são derivadas de um paciente com linfoma de Burkitt, sugerindo que os anticorpos podem ligar-se a células B in vivo. Além disso, a afinidade do anticorpo 11G2 pelo CXCR5 em células Raji é maior que a do anticorpo anti-cCXCR5 16D7 (WO 2009/032661), sugerindo assim que o 11G2 seria mais potente do que o 16D7.
[0384]Os anticorpos que ligaram-se tanto ao hoXCR5-293 quanto ao cinoCXCR5-293 também foram testados em um ensaio de fluxo de cálcio no que diz respeito à atividade antagonística. Além disso, anticorpos anti-CXCR5 de referência 16D7 (WO 2009/032661) foram incluídos como controle. Em suma, células nOCXCR5 HEK-293 foram plaqueadas em uma placa de 96 poços em meio de alta glicose DMEM. Após incubação de um dia para o outro, o meio foi removido e adicionaram- se 100 ul de 1X Fluo-4 NW (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) às células. Em seguida, as células foram incubadas a 37º C por uma hora. Diluições seriadas de anticorpos monoclonais foram adicionadas às células e incubadas a temperatura ambiente por uma hora. O fluxo de cálcio foi medido em uma Flexstation (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) a 485 nM de excitação e 525 nM de emissão adicionando 111 nM de hoXCL13 recombinante (BPS Bioscience, San Diego, CA). Os dados foram coletados em intervalos de 1,52 segundos. O instrumento determinou o fluxo de cálcio ao subtrair a menor leitura da maior. Os valores de IC50 para a inibição ao fluxo de cálcio induzido por ligante foram determinados usando ajustes de curvas por regressão não linear no GraphPad PrismO (versão 6.0, GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) e um log sigmoide do modelo dose agonista-resposta (Tabela 2). A inibição ao fluxo de cálcio é uma demonstração de antagonismo funcional.
Sendo assim, o anticorpo 11G2 não só é um depletor robusto, via ADCC, mas também um antagonista que oferece um segundo mecanismo de ação.
O antagonismo do anticorpo 11G2 está no nível dos anticorpos comparativos, por exemplo, 2C9 (anticorpo de referência, vide, por exemplo, a WO 2012/010582) e 16D7 (anticorpo de referência, vide, por exemplo, a WO 2009/032661). Os dados do ensaio-repórter com cAMP também demonstram antagonismo funcional (vide abaixo). TABELA 2 hibridoma células Raji (nM Ca2+ (nM
39H4 | 0,3154 | Não testado
15D5 0,7949 11,21 hibridoma células Raji (nM Ca2+ (nM Exemplo 3: Clonagem de regiões variáveis de cadeia pesada e leve do anticorpo anti-CXCR5
[0385]Os hibridomas que produzem os anticorpos avaliados no Exemplo 2 foram lisados usando o mini-kit RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemanha) e, em seguida, a primeira fita de cCDNA foi sintetizada usando o sistema de síntese da primeira fita superscript Ill (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). As regiões variáveis de cadeia leve e pesada (VL e VH) foram amplificadas por PCR usando iniciadores de degeneração de cadeia leve e pesada de camundongo compreendendo as sequências de ácido nucleico dos SEQ ID Nº: 64 a 88 representadas na Tabela 16. Depois da PCR, a VL e a VH foram clonadas nos vetores TA Zero blunt (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) e, em seguida, foram sequenciadas. As sequências de aminoácidos para a VL e a VH de camundongo dos anticorpos 11G2, 5H7 e 41A10 são dadas na Tabela 16 nos SEQ ID Nº: 35 a 40. As CDRs foram sublinhadas.
Exemplo 4: Geração de Anticorpos Quiméricos Afucosilados e Fucosilados
[0386]Para avaliar o efeito da afucolisação e da fucolisação sobre a atividade dos anticorpos, produziram-se versões fucosiladas e afucosiladas dos anticorpos do Exemplo 3 em células mamíferas.
[0387]A VL e a VH dos anticorpos de interesse foram adicionalmente clonadas em vetores contendo a região constante kappa humana e a região constante da IgG1 humana, respectivamente. As regiões pesadas variáveis foram clonadas no vetor de expressão mamífero PSMED?2 contendo a região constante da I9G1 humana (SEQ ID Nº: 89) para produzir cadeias pesadas de comprimento total de camundongo-humanas quiméricas. As regiões leves variáveis foram clonadas no vetor de expressão mamífero pSMEN3 contendo a região constante kappa humana (CK) (SEQ ID Nº: 90) para produzir cadeias leves de comprimento total de camundongo-humanas quiméricas.
[0388]Os vetores contendo genes de anticorpo quiméricos foram transfectados transientemente em células HEK-293F (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) para produzir o anticorpo quimérico fucosilado. Os anticorpos quiméricos fucosilados foram então purificados usando colunas de proteína A. À afinidade aparente (EC50 de ligação celular) do anticorpo quimérico ligando-se a células Raji foi determinada por citometria de fluxo usando um Analisador FACSVerse (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ) e é dada na Tabela 3. TABELA 3 Anticorpo ECB50 da ligação com | EC50 de células (quimérico) células Raji (nM) cinoCXCR5-300.19 (nM) fucosilados fucosilados 12C3 | 0,1035 0,1767 23D5 0,03410 4,168
Anticorpo ECB50 da ligação com | EC50 de células (quimérico) células Raji (nM) cinoCXCR5-300.19 (nM) fucosilados fucosilados
[0389]Anticorpos quiméricos afucosilados foram gerados usando a linha celular CHOK1ISV Potelligent& (BioWa/Lonza, Allendale, NJ), que carece de ambos os alelos do gene responsável pela adição de fucose (a-1,6-fucosiltransferase, FUT8). A cadeia leve quimérica contendo uma região constante kappa humana foi clonada no vetor GS Lonza pEE12.4 (Lonza Biologics, Basel, Suíça) e a cadeia pesada quimérica contendo uma região constante da I9gG1 humana foi clonada no vetor GS Lonza pEE6.4 (Lonza Biologics, Basel, Suíça). O cassete de expressão de cadeia pesada do pEE6.4 foi purificado pela digestão de Notl e Pvul e, em seguida, clonado em sítios de Notl e Pvul no pEE12.4 contendo uma cadeia leve quimérica. O vetor final DGV contendo ambos os cassetes de expressão de cadeia pesada e leve foi linearizado com Pvul e, em seguida, eletroporado em células CHOK1ISV PotelligentO. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células Potelligent& foram plaqueadas em placas de 96 poços a 3-5 mil células/poço em meio CDCHO (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) suplementado com 1XHT (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), 1 mM de uridina (Sigma, St. Louis, MO) e 50 uM de MSX (EMD Millipore, Billerica, MA). Após três a quatro semanas de incubação, os sobrenadantes dos clones foram avaliados quanto à titulação do anticorpo em Octet (Pall Fortebio, Fremont, CA). Os clones de alta expressão foram adicionalmente ampliados para a produção de anticorpos. Os anticorpos quiméricos afucosilados foram então purificados em colunas de proteína A.
[0390]A fim de determinar a especificidade dos anticorpos pelo CXCRS5, avaliou-se a ligação dos anticorpos com células expressando outras citocinas. Em suma, linhas celulares de receptores de quimiocinas FlowCellect expressando o CXCR1, CXCR2 ou CXCR3 (EMD Millipore, Billerica, MA) e Jurkat (ATCC, Manassas, VA), expressando o CXCRA, foram tingidas com 5 ug/ml ou 10 pg/ml de cada anticorpo quimérico anti-CXCR5. As células foram então incubadas com anticorpos de bode anti-humanos conjugados com PE (Southern Biotech, Birmingham, AL) antes da análise por citometria de fluxo usando um Analisador FACSVerse (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Conforme ilustram as FIGs. 4A a 4D, todos os anticorpos quiméricos exibiram baixíssima ligação com células expressando o CXCR1 (FIG. 4A), CXCR2 (FIG. 4B), CXCR3 (FIG. 4C) ou CXCRA4/células Jurkat (FIG. 4D) em comparação aos controles positivos.
Exemplo 5: Humanização de anticorpos monoclonais de camundongo
[0391]Para evitar qualquer imunogenicidade do HAMA (anticorpo humano anti-camundongo) em potencial, os anticorpos quiméricos 41A10 (C-41A10) e 11G2 (C-11G2) foram humanizados usando sequências de framework de linha germinativa humana do IGKV1 a 39 (domínio variável de cadeia leve DPK9, nº de Acesso GenBank X93627.1, SEQ ID Nº: 93) e uma sequência de framework de linha germinativa humana do IGHV3 (domínio variável de cadeia pesada DP54, nº de Acesso GenBank ABO 19440, SEQ ID Nº: 91)
[0392]Versões humanizadas dos anticorpos quiméricos 11G2 (C-11G2) e 41A10 (C-41A10) foram geradas enxertando uma região determinante de complementaridade (CDR) (chamadas doravante de "enxertadas com CDR"). Ou seja, CDRs de cadeia pesada foram enxertadas em uma região de framework de DP-54 humana (subgrupo VH3; SEQ ID Nº: 91) com um segmento JH4 (SEQ ID Nº: 92), ao passo que as CDRs de cadeia leve foram enxertadas em um framework de
DPKS9 humano (subgrupo VKI; SEQ ID Nº: 93) com um segmento JK4 (SEQ ID Nº: 94).
[0393]As regiões de VH humanizadas foram unidas à região constante da I9G1 humana (SEQ ID Nº: 89) e, em seguida, subclonadas em um vetor de expressão interno para gerar as cadeias pesadas enxertadas com CDR, incluindo, entre outras, o SEQ ID Nº: 96 (VH do 11G2 enxertada com CDR ). As regiões de VL humanizadas foram fusionadas à região constante kappa humana (SEQ ID Nº: 90) e, em seguida, subclonadas em um vetor de expressão interno para criar as cadeias leves enxertadas com CDR, incluindo, entre outras, o SEQ ID Nº: 97 (VL do 11G2enxertada com CDR).
Exemplo 6: Afinidade de ligação de anticorpos anti-CXCR5 afucosilados ou fucosilados
[0394]Avaliou-se a afinidade aparente de anticorpos do CXCR5 humanizados fucosilados e afucosilados pelo CXCR5 de superfície celular. Mais especificamente, para determinar a afinidade aparente de anticorpos do CXCR5 quiméricos e humanizados por células expressando o CXCRS5, realizaram-se experimentos de ligação celular em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) humanas e de macaco cinomolgo e células mononucleares tonsilares (TMCs) humanas. A afinidade de ligação aparente do mab do CXCR5 com células CXCR5+ (células B, células Tfh bona fide, e células similares a Tfh circulantes) foi calculada pela EC50 de curvas de titulação de ligação de equilíbrio, em que a média geométrica da intensidade de fluorescência (QMFI) da população de ligação com antígeno foi quantificada por citometria de fluxo.
[0395]Resíduos Trima& de doadores humanos saudáveis, do acervo de aférese Trima€ e enriquecidos para PBMCs, foram obtidos junto à Blood Centers of the Pacific (San Francisco, CA). As PBMCs foram isoladas por centrifugação por gradiente de densidade usando tubos SepMatet“ e Lymphoprep'Y de acordo com as instruções da fabricante (STEMCELL Technologies, Vancouver, BC, Canadá).
[0396]Células mononucleares tonsilares (TMCs) foram isoladas de uma amígdala humana obtida junto à BioOptions (Brea, CA). Em suma, a amígdala foi dissecada em pequenos fragmentos (3 a 4 mm) em meio RPM! 1640 frio usando um bisturi estéril. O tecido da amígdala foi então digerido por 30 minutos a 37º C em meio de digestão (3 mL de 10x de Colagenase, 300 ul de 100x de Desoxirribonuclease (DNase), 6,7 mL de RPMI 1640). Adicionou-se RPMI 1640 suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) para neutralizar a atividade enzimática e, em seguida, o tecido foi filtrado sequencialmente através de coadores de células de filtro de náilon (tamanho de 70 um e 40 um meshes de náilon). Após a centrifugação, a lise dos glóbulos vermelhos foi realizada sobre o pélete usando o tampão de lise cloreto de amônio. As plaquetas foram removidas por centrifugação em baixa velocidade (200 x g) durante 10 minutos em Soro Fisiológico Tamponado com Fosfato (PBS)/2% de FBS/2 mM de Ácido Etilenodiaminatetracético (EDTA). Células T CD4+ foram purificadas da mistura TMC usando um Kit de Enriquecimento de Células T CD4+ Humanas EasySep'tY de acordo com as instruções da fabricante (STEMCELL Technologies, Vancouver, BC, Canadá).
[0397]Após o isolamento, as PBMCs foram plaqueadas a uma densidade de 1,0 X 10º células por poço e as TMCs CD4+ foram plaqueadas a uma densidade de 2,0 X 10º células por poço em tampão de isolamento (PBS contendo 1% de FBS e 1 mM de EDTA) em placas de 96 poços com fundo em U. Depois disso, as placas foram centrifugadas a 1.500 rpm durante 5 minutos em temperatura ambiente. As PBMCs e TMCs CD4+ foram ressuspensas em tampão de separação de células ativadas por fluorescência (FACS) (PBS com 1% de FBS) contendo um bloco de fragmento cristalizado Fc humano (2 ul por poço; Biolegend) e diluições seriadas quádruplas dos anticorpos (séries de diluição em 11 pontos, começando em 5.000 ng/mL para PBMCs e 312,5 ng/mL para TMCs CD4+) e então incubadas em gelo por 2 horas. Em seguida, as PBMCs e TMCs CD4+ foram lavadas com tampão de FACS por 3 vezes e ressuspensas em 50-100 uL de tampão de FACs contendo anticorpos conjugados fluorescentes para tingir subconjuntos de linfócitos e um anticorpo secundário conjugado fluorescente contra a lg humana a fim de detectar anticorpos monoclonais do CXCR5 (mAbs). Após incubação por 30 minutos a 4º C, as PBMCs e TMCs CD4+ foram lavadas com tampão de FACS por 2 vezes e ressuspensas em 125 ul de paraformaldeído (PFA) a 0,5% em PBS. As placas foram armazenadas a 4º C até o momento da análise por citometria de fluxo (Analisador de Células BD LSRFortessa"”, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ).
[0398]As curvas de titulação de ligação celular foram geradas plotando a gMFI da população de ligação com antígeno em relação ao log de concentração do anticorpo do CXCR5. Os valores de EC5o foram determinados por ajustes de curva por regressão não linear no GraphPad Prism& (versão 6.0, GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) e um log sigmoide do modelo dose agonista-resposta, de acordo com a equação a seguir: Log (agonista) vs. resposta — inclinação variável (quatro parâmetros) Y = Base + (Topo — Base / (1 + 10º((LogEC5so — X)*Coeficiente de Hill))
[0399]Onde Y é a gMFI, X é a concentração do anticorpo, Topo é o valor Y máximo correspondente ao patamar mais alto da curva sigmoide, Base é o valor Y mínimo correspondente ao patamar mais baixo da curva sigmoide, e LogECr5o é o log da concentração do anticorpo no ponto de inflexão da curva.
[0400]Os valores de ECso foram sumarizados para todos os experimentos usando a média e desvios padrão (STDEV) nos casos em que realizaram-se várias réplicas. Os resultados (isto é, a afinidade aparente média de mAbs do CXCR5 quiméricos e humanizados, que são fucosilados ou afucosilados, por células expressando o CXCR5) são dados na Tabela 4. Os resultados também incluem dados de ligação por afinidade obtidos usando anticorpos anti-CXCR5 controle 2C9 (WO 2012/010582), 16D7 (WO 2009/032661) e 11A7 (WO 2016/028573), que foram incluídos para fins de comparação.
Note-se que os anticorpos 11G2 quiméricos e humanizados fucosilados e afucosilados com uma variedade de combinações de VL e VH (isto é, h11G2 XC51/XC152 , h11G2 XC153/XKC155, h11G2 XC153/XC156, h11G2 XC154/XKC155 e h11G2 XC154/XC157 ) têm uma afinidade aparente por células B humanas que é aproximadamente igual.
Ou seja, os dados demonstram que a afucosilação aparentemente não afeta a afinidade do anticorpo por células expressando o CXCR5. Além disso, os dados demonstram que anticorpos h11G2 XC154/XC155 (fucosilados e afucosilados) exibiram aproximadamente uma afinidade 10 vezes maior que o anticorpo anti-CXCR5 controle 2C9 e uma afinidade cerca de 100 vezes maior que o 11A7. O anticorpo anti-CXC5 controle 16D7 não exibiu uma ligação saturável.
Esses dados demonstram que a afucosilação não afetou a afinidade dos anticorpos 11G2 por ligar-se a células expressando o CXCR5. Como a afinidade é uma medida da força de interação entre um epítopo e o sítio de ligação com antígeno do anticorpo (isto é, parátopo), esses dados indicam que mesmo que os anticorpos liguem-se a um epítopo semelhante, eles não se ligam ao epítopo com a mesma força que 11G2. TABELA 4 EC50 média + STDEV (pM Células mAb do CXCR5 Similares Células Células Humanas | Humanas | Humanas NHP Tfh NHP io EO 41A10 quimérico ND 548,55 ND 33,41
Afinidade Aparente EC50 média + STDEV (pM Células mAb do CXCR5 Similares Células Células Células B a Tfh Tfh Células B | Similares a Humanas | Humanas | Humanas NHP Tfh NHP 41A10 142/147 153,38 + ND ND 2049,50 ND humanizado 57,21 41A10 142/148 152,29 + ND 1961,00 ND humanizado 75,51 17,94 + 11G2 quimérico ND 8,46 6,95 ND 8,48 11G2 quimérico 8,09 + ND 45,59 ND ND afucosilado 2,93 1162 151/152 13,05 + ND 3,33 10,06 ND humanizado 10,9 1162 153/155 7,79 + ND 4,82 7,03 ND humanizado 6,89 1162 153/156 8,88 + ND 3,23 7,06 ND humanizado 6,39 11G2 154/155 7,08 + 5,92 + 8,25 4,13 5,65 humanizado 4,48 1,55 1162 154/157 19,12 + ND 7,24 8,65 ND humanizado 16,83 11G2 154/155 6,60 + 5,89 + humanizado 10,59 1,32 10,47 2,33 1,40 afucosilado
EC50 média + STDEV (pM Células mAb do CXCR5 Similares Células Células Humanas | Humanas | Humanas NHP Tfh NHP Em ECO.
ND ND ND referência 37,95 Fmmauãos = =
ND ND ND referência saturáveis EEE ss
ND ND ND referência 249,39 Exemplo 7: Ligação dependente da concentração de anticorpos 11G2 humanizados afucosilados ou afucosilados em comparação a anticorpos de referência afucosilados
[0401]A ligação dependente da concentração com células B de PBMCs humanas do 11G2 humanizado fucosilado (h11G2 VL XC154/VH XC155 também chamado de h11G2 154/155 ou h11G2 XC154/XC155) e do 11G2 humanizado afucosilado (h11G2 154/155 afucosilado) foi comparada à ligação dos mAbs comparativos 2C9, 16D7 e 11A7. As curvas de titulação de ligação celular foram geradas plotando a gMFI da população de ligação com antígeno em relação ao log de concentração do anticorpo do CXCRS5 e são dadas na FIG. 5.
[0402]Os dados demonstram que os h11G2 154/155 fucosilado e afucosilado têm uma curva idêntica, o que indica que a presença ou ausência de fucose na glicoforma ligada por N presente na Asn297 em ao menos uma das cadeias constantes do anticorpo, de preferência ambas, não afeta a afinidade dos anticorpos pelo CXCR5 presente nas células.
[0403]Além disso, os dados demonstram ainda que a EC50 dos anticorpos h11G2 154/155 fucosilados (círculos pintados, 9,630 x 10? M) e afucosilados (círculos vazios, 1,188x10* M) foi muito menor do que a EC50 dos anticorpos comparativos: 2C9 (triângulos pintados, 6,24 x10!), 11A7 (losangos pintados, 9,265x10º) e 16D7 (quadrados pintados, aproximadamente 0,004945 e não saturável). Esses dados demonstram que os anticorpos h11G2 154/155 têm características de ligação diferentes das dos anticorpos comparativos. Esses dados indicam, portanto, que os anticorpos 11G2 e 2C9, 11A7 e 16D7 não se ligam ao mesmo epítopo no CXCRS5.
Exemplo 8: Atividade de ADCC de anticorpos do CXCR5 quiméricos e humanizados
[0404]Para determinar a potência e eficácia com que um coorte de anticorpos do CXCR5 quiméricos e humanizados estimulou a atividade de citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), diluições seriadas dos anticorpos do CXCR5 ou de um isótipo controle foram incubadas com células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de doadores humanos saudáveis ou macacos cinomolgos. Nesse ensaio, as PBMCs são a fonte das células efetoras exterminadoras naturais (NK) e o alvo, células B e células similares a Tfh. À citometria de fluxo foi usada para quantificar o número de células B e células similares a Tfh remanescentes após cerca de 20 h. À semelhança, a capacidade de os anticorpos humanizados induzirem à ADCC de células Tfh bona fide da amígdala humana foi avaliada usando células T CD4+ isoladas de células mononucleares tonsilares com a adição de células NK isoladas de PBMCs.
[0405]Conforme descrito no Exemplo 6, resíduos Trima& de doadores humanos saudáveis, do acervo de aférese Trima€O e enriquecidos para PBMCs, foram obtidos junto à Blood Centers of the Pacific (San Francisco, CA). As PBMCs foram isoladas por centrifugação por gradiente de densidade usando tubos
SepMate'y e Lymphoprep'Y de acordo com as instruções da fabricante (STEMCELL Technologies, Vancouver, BC, Canadá). Após o isolamento, as PBMCs foram plaqueadas em meio RPM! completo a uma densidade de 2,0 X 105 células por poço em placas de 86 poços com fundo em U.
[0406]Nesse ensaio, as PBMCs são a fonte das células efetoras exterminadoras naturais (NK) e o alvo, células B e células similares a Tfh. Diluições seriadas de mAbs do CXCRS5 ou isótopos controle foram adicionadas aos poços, e as células foram incubadas a 37º C, 5% de CO? por cerca de 20 horas. Em seguida, as placas foram centrifugadas a 1.800 rpm durante 5 minutos em temperatura ambiente (RT). Depois disso, as PBMCs foram lavadas com tampão de FACs gelado e ressuspensas em 50 ul de tampão de FACs gelado contendo anticorpos conjugados por fluorescência para tingir subconjuntos de linfócitos. Após incubação por 15 a 30 minutos a 4º C, as PBMCs foram lavadas com tampão de FACS gelado por duas vezes e ressuspensas em 100 uL de paraformaldeído (PFA) a 0,5% em PBS. Contas de Contagem Absoluta CountBright"< (Thermo Fisher Scientific) foram adicionadas a cada poço (15 ul por poço). As placas foram armazenadas a 4º C até a hora da análise por citometria de fluxo (Analisador de Células BD LSRFortessaTY).
[0407]As células mononucleares tonsilares (TMCs) também foram isoladas conforme previamente descrito no Exemplo 6.
[0408]As curvas de titulação de citotoxicidade foram obtidas de acordo com os métodos descritos para o Exemplo 6. Os valores de EC5o foram sumarizados para todos os experimentos usando a média e desvios padrão (STDEV) nos casos em que realizaram-se várias réplicas. Os resultados são dados na Tabela 5. Os dados obtidos usando os anticorpos de referência anti-cCXCR5 2C9, 16D7 e 11A7 foram incluídos para fins de comparação.
TABELA 5 Citotoxicidade média de mAbs do CXCR5 quiméricos e humanizados para células expressando o CXCR5 Atividade de ADCC EC50 média + STDEV (pM mAb do CXCR5 Células B Células Células | Células B Humanas Similares a Tfh NHP Tfh Humanas | Humanas 11732,28 + 41A10 quimérico ND ND ND 24781,14 41A10 quimérico 54,47 + 89,71 ND ND ND afucosilado 41A10 142/147 1245 + 881,03 ND ND ND humanizado 41A10 142/148 1109,25 +
ND ND ND humanizado 1081,15 11G2 quimérico 564,01 + 1643,77 115,26 11G2 quimérico 4,39 + 3,08 ND 0,07 ND afucosilado 1162 151/152 376,74 + 606,13 ND ND 43,61 humanizado 1162 153/155 463,17 + 670,85 ND ND 20,72 humanizado 1162 153/156 567,68 + 847,34 ND ND 28,06 humanizado 11G2 154/155 253,72 + 672,14 7,978 0,77 39,14 humanizado
EC50 média + STDEV (pM mMAb do CXCR5 Células B Células Células | Células B Humanas Similares a Tfh NHP Tfh Humanas | Humanas 517,33 + 1062,82 ND ND 54,02 humanizado EEEoas cre as 6 E 2,01 +2,28| 4682+2,88 0,11 humanizado afucosilado 11,65 = E =: 16D7 ND ND ND 6343,88
[0409]Os dados revelados neste documento demonstram que até mesmo o anticorpo h11G2 154/155 fucosilado teve uma atividade de ADCC (253,72 + 672,14) maior que os anticorpos comparativos 2C9 (380,31 + 757,04) e 16D7 (2.590,61 +
6.343,88). O anticorpo fucosilado 11A7 demonstrou maior atividade de ADCC do que qualquer anticorpo fucosilado testado. No entanto, os dados demonstram que o h11G2 154/155 afucosilado exibiu maior atividade de ADCC do que qualquer anticorpo testado, inclusive o 11A7 fucosilado. Os estudos de caracterização apresentados neste documento demonstraram que os mAbs do CXCR5 quiméricos 41A10 e 11G2 provocaram a ADCC de células B com uma EC50 de 11,73 nM e 0,56 NM, respectivamente. As versões afucosiladas dos mAbs do CXCR5 41A10 e 11G2 aumentaram a potência da atividade de ADCC em ao menos cerca de 100 vezes. As variantes humanizadas provocaram a ADCC de células B humanas com potências equiparáveis ou superiores a suas contrapartes quiméricas correspondentes. Assim como aconteceu com os mAbs do CXCR5 quiméricos, a variante humanizada afucosilada aumentou a potência da ADCC em comparação à sua contraparte normalmente fucosilada em ao menos cerca de 100 vezes. O h11G2 afucosilado foi mais potente, no que diz respeito à ADCC, do que as versões fucosiladas do 2C9 e 16D7, e o h11G2 afucosilado ficou ao menos no mesmo nível que o 11A7 fucosilado.
Exemplo 9: Os anticorpos 11G2 antagonizam a sinalização do CXCL13
[0410]Para determinar se os anticorpos do CXCR5 antagonizam funcionalmente o CXCL13, utilizou-se um ensaio-repórter com monofosfato cíclico de adenosina (CAMP) em uma linha celular desenvolvida em laboratório expressando estavelmente o CXCR5 humano. Nessas células, o CXCL13 inibe a produção de cAMP provocada pela forscolina de uma maneira dependente da concentração.
[0411]Para determinar se os anticorpos do CXCR5 antagonizam funcionalmente a sinalização do CXCL13, realizou-se um ensaio com cAMP Hit Hunter& (DiscoveRx Corporation, Fremont, CA) em células CHO-K1 expressando estavelmente o CXCR5 humano. Nesse ensaio, a B-galactosidase (B-gal) ativa é formada por Complementação do Fragmento Enzimático quando o cAMP é gerado. A B-gal pode converter então um substrato quimioluminescente, gerando assim um sinal de saída detectável em um leitor de microplacas padrão. O ligante do CXCR5 CXCL13 inibe a produção de cAMP provocada pela forscolina (20 uM) de uma maneira dependente da concentração. Para testar a potência e eficácia de anticorpos do CXCR5 em inibir a produção de cAMP provocada pela forscolina mediada pelo CXCL13, adicionaram-se diluições seriadas de cada anticorpo do CXCRS5 a células CHO-K1 expressando o CXCRS5 na presença de forscolina (20 uM) e CXCL13 (usado a sua ICsao de 600 pM).
[0412]As curvas de titulação de antagonismo funcional foram obtidas de acordo com o descrito no Exemplo 6, incluindo a determinação do valor de EC5o. Os resultados são dados na Tabela 6.
TABELA 6 Estímulo in vitro à produção de cAMP inibida pelo CXCL13 em células CHO-K1 CXCR5+ mes [| mAb do CXCR5 ECs5o (pM) CXCL13 11G2 154/155 humanizado | 209
[0413]Em um estudo distinto, o 11G2 154/155 humanizado afucosilado foi testado quanto ao antagonismo funcional e comportou-se à semelhança do 11G2 154/155 fucosilado humanizado (isto é, EC5so = 961,4 pM).
[0414]Os dados demonstram que o h11G2 154/155 inibiu a sinalização do CXCL13 ao menos tão bem quanto os anticorpos de referência 2C9, 16D7, 11A7. Na verdade, o h11G2 inibiu a sinalização do CXCL13 (120,6%) em uma medida significativamente maior que o 16D7 (102,4%) e o 11A7 (105,9%). Esses dados sugerem que os anticorpos 11G2 podem ser um novo produto terapêutico útil para tratar uma doença, transtorno ou condição mediada por ou associada à sinalização do CXCL13 mediada pelo CXCR5.
Exemplo 10: Mapeamento do sítio de ligação no hoXCRS5 do anticorpo 11G2
[0415]O sítio de ligação do 11G2 154/155 humanizado no CXCR5 foi identificado enxertando aminoácidos do terminal N extracelular do CXCR5 de camundongo no CXCR5 humano.
[0416]Mais especificamente, a estratégia de mapeamento tirou proveito do fato de que o 11G2 liga-se ao CXCR5 humano (SEQ ID Nº: 32) mas não se liga ao CXCR5 de camundongo (SEQ ID Nº: 34). O alinhamento das sequências de aminoácidos do CXCR5 humano (hCXCR5) e CXCR5 de camundongo (mMCXCR5) é ilustrado na FIG. 6. Os resíduos de aminoácido dos domínios extracelulares do CXCRS5 são indicados por sublinhado. Os domínios extracelulares (ECDs) de ambas as proteinas CXCR5 de camundongo e humana são indicados em negrito e rotulados "N", "L1"," L2" e "L3" sob a sequência de cada região na FIG. 6. Esses ECDs foram trocados entre as proteínas de camundongo e humanas para identificar as uma ou mais regiões responsáveis pela especificidade do 11G2 pelo CXCR5 humano e pela ausência de ligação com o MCXCR5. Cada uma dessas regiões do CXCR5 de camundongo foi trocada pela mesma região no CXCR5 humano para produzir as proteínas quiméricas designadas XC251, XC252, XC253, XC254, XC255 e XC256, em que uma proteína CXCR5 humana contém o domínio do CXCR5 de camundongo correspondente especificado. A Tabela 7 traz o código que indica quais regiões de camundongo (m) foram trocadas no CXCR5 humano. TABELA 7 (proteínas CXCR5 quiméricas de camundongo/humanas com ECDs trocados)
[0417]Mais especificamente, o domínio L3 de camundongo foi trocado pelo domínio L3 humano correspondente para produzir uma proteína quimérica XC251 compreendendo o domínio L3 de camundongo no contexto da proteína CXCR5 humana (hCXCR5-mL3). À semelhança, o L2 de camundongo foi trocado pelo domínio humano correspondente para produzir a proteína quimérica XC252 (hOXCR5-mL2); o domínio N de camundongo foi trocado pelo domínio N humano correspondente para produzir a proteína quimérica XC253 (hOCXCR5-mN); os domínios L2 e L3 de camundongo foram trocados pelos domínios humanos correspondentes para produzir a proteína quimérica XC254 (hCXCR5-mL2-mL3); os domínios mN e L3 de camundongo foram trocados pelos domínios humanos correspondentes para produzir a proteína quimérica XC255 (hOXCR5-mMN-mL3); e os domínios mN e L2 de camundongo foram trocados pelos domínios humanos correspondentes para produzir a proteína quimérica XC255 (hCXCR5-mMN-mL2).
[0418]A ligação do 11G2 com o CXCR5 de camundongo, o CXCR5 humano e as várias proteínas CXCR5 quiméricas de camundongo-humanas com ECDs trocados (XC251-XC256) foi avaliada e comparada à ligação de vários anticorpos, isto é, CXCR5 anti-camundongo de rato (rat) (catálogo MAB6198, R&D systems, Minneapolis, MN), CXCR5 anti-humano de coelho (Rb) (catálogo, ab46218, Abcam, Cambridge, MA), 2C9, 16D7. Os resultados são dados na Tabela 8. Os números em negrito indicam a ligação do anticorpo com a proteína.
TABELA 8 (Análise de FACs da ligação do anticorpo com proteínas quiméricas CXCR5 de camundongo-humanas com ECDs trocados 2C9 16D7 1162 (PCXCR5) | (MCXCR5) (GMFI) | (GMFI) | (GMFI)
GMFI GMFI | hcXxcR5 18575 2457 117099 | 149936 | 138584 XC252 | nOoXCR5-mL2 12496 3842 22383 |26963 21650
[0419]Os dados demonstram que, quando o anticorpo foi específico ao CXCR5 de camundongo, ele ligou-se ao CXCR5 quimérico de camundongo-humano com ECDs trocados contanto que a quimera contivesse o domínio N de camundongo. À semelhança, no caso dos anticorpos que ligaram-se ao CXCR5 humano (11G2, 2C9, 16D7, e Rb), os anticorpos ligaram-se ao CXCR5 quimérico quando o domínio N humano se fez presente na quimera. Logo, a especificidade de espécie dos anticorpos parece ser orientada pela ligação localizada no domínio N. Mais importantemente, esses dados demonstram que o domínio N do CXCR5 humano foi necessário para a ligação dos anticorpos 11G2, 2C9 e 16D7.
Exemplo 11: Identificação de resíduos de aminoácido próprios da ligação do anticorpo 11G2 com o hoXCR5
[0420]Para determinar com mais precisão os resíduos de aminoácido específicos cruciais para a ligação do anticorpo com o hCXCR5 e para adicionalmente diferenciar entre os anticorpos anti-CXCR5 humano, providenciaram- se estudos mais detalhados acerca do domínio N do CXCR5. Mais especificamente, fizeram-se mutações pontuais no fragmento de domínio N do CXCR5 humano (aminoácidos 1 a 58 de acordo com a numeração do SEQ ID Nº: 32) para produzir proteínas mutantes pontuais, cada uma contendo um resíduo de aminoácido de camundongo correspondente do CXCR5. Geraram-se transfectantes estáveis expressando cada muteína, e as células foram examinadas quanto à ligação do anticorpo por citometria de fluxo. Ou seja, produziram-se dezenove (19) proteínas mutantes com o domínio N do CXCR5 humano, chamadas de XC276-XC294, cada uma delas contendo uma única substituição de aminoácido na qual um resíduo humano do CXCRS5 foi substituído pelo resíduo de camundongo correspondente conforme ilustra a Tabela 9. As muteínas CXCR5 humanas compreenderam ainda um epítopo FLAG (DYKDDDDK), representado na Tabela 9 usando letras em caixa baixa, no terminal N para permitir a normalização com base no nível de expressão; o marcador FLAG não afetou a ligação do anticorpo com as muteínas. Tipicamente, não fizeram-se substituições quando a substituição do resíduo de aminoácido humano pelo resíduo de aminoácido de camundongo teria sido uma substituição conservadora, sendo esses resíduos indicados em itálico.
[0421]A Tabela 9 ilustra a sequência de aminoácidos da região N do hCXCR5 (são representados os primeiros 58 aminoácidos) em comparação à sequência de aminoácidos da região N do CXCR5 de camundongo. Os aminoácidos que diferem entre as duas sequências são sublinhados. A figura também ilustra os vários constructos (XC276-XC294) produzidos quando o resíduo de aminoácido de camundongo foi substituído pelo aminoácido humano correspondente no hCXC5. Por exemplo, o XC276 é o CXCR5 humano com uma única substituição de aminoácido trocando D (humano) por G (de camundongo). O restante da sequência de aminoácidos do hoXCR5 (SEQ ID Nº: 32) não é ilustrado porque não mudou. Produziram-se muteínas para determinar quais resíduo(s) de aminoácido foram cruciais para a ligação do anticorpo com o hoXCR5 uma vez que os anticorpos testados não se ligaram ao CXCR5 de camundongo.
> < =| & =
U $ uu 7) fã o — cs — É õ > 3 Ú < 9 e. 8 | EB Do À) sa | 38 se S < o ç =|) Ss ii) 2 Si E 2/2 o jo sE | a Ss SS us DI wW mIE 2X) </ u Fo íifa| P Des no S SS nz o 1 ZÉ 2 o Z)& lr 2 = 5/6 un JO £ 42 < 2 PCS x o — OO Ss n 2/2 o uPR o ZE Sol Ze ” 22 ojos Ss = 5)> 8 832 2 BO Bu 8 Fi = 22 o Du o 232 o? $ O E; e 282 ê ê oo o a OB = x : Seo | BEERENS RARE SERES SS : = SE Ê 2603 alo Sus a e Se Z 2 OS 2/23/28) $ o o z â s É | 5 e e oo = a o e o o no o o = ao e 3 o oO PEDNIPDIDH Ed ES ESSES ES E SESESIES ES ESET FABI RA 7 sv x NININNINN|NINN TNT | NI NINTNNO = 2 o Jo ojolojolo o e oleo lo oleo ooo oloioio F & E E XXX ><|[<X|[>X|>|>X[>X >> || >| X| >>> | z 8 8 Ss 2
[0422]Ácidos —nucleicos codificando cada peptídeo mutante foram transfectados transientemente em células HEK-293T. Dois dias após a transfecção, as células foram coletadas e tingidas com 1 ug/ml de PE anti-FLAG (Biolegend) ou 1 ug/ml ou 3 ug/ml de 11G2 154/155 humanizado afucosilado; 2C9; S16D7 ou 11A7, seguidos por PE anti-lgG humana (Southern Biotech, Birmingham, AL). As células foram analisadas por citometria de fluxo usando um Accuri (BD Biosciences Franklin Lakes, NJ). Determinou-se a média geométrica da intensidade de fluorescência (gMFI), e calculou-se a razão para a gMFI de cada anticorpo do CXCR5 e antimarcador.
[0423]Conforme ilustra a FIG. 7, todos os quatro anticorpos ligaram-se ao CXCR5 humano do tipo selvagem (XC275; WT). Os anticorpos, por sua vez, produziram diferentes padrões de ligação com os peptídeos mutantes pontuais. Ou seja, o 2C9 não se ligou ao XC276 (contendo a mutação D10GO0) ou XC277 (contendo uma introdução de resíduos de aminoácido S e | no domínio N do CXCR5 humano), ao passo que o 11G2, 16D7 e 11A7 ligaram-se a essas proteínas. Esses dados sugerem que a introdução desses dois aminoácidos na sequência do hCXCR5 anulou a ligação do 2C9 mas não afetou a ligação dos três outros anticorpos, sugerindo que o epítopo para o 2C9 difere do de 11G2, 16D7 e 11A7. Mais importantemente, a mutação da leucina (L) em treonina (T) na posição de resíduo de aminoácido 11 (com base na numeração da sequência do SEQ ID Nº: 32) anulou por completo a ligação somente do 11G2 com o XC278 mas não afetou a ligação dos anticorpos 2C9, 16D7 ou 11A7 com essa proteína. Sendo assim, o resíduo de Leucina presente na posição número 11 (em relação à sequência de aminoácidos definida no SEQ ID Nº: 32) parece crucial para a ligação do 11G2 com o CXCR5 humano, mas não é importante para a ligação do 2C9, 16D7 ou 11A7 com o hoXCR5. Esses dados demonstram que o epítopo do 11G2 não é o mesmo que o epítopo para esses anticorpos. Além disso, a FIG. 7 ilustra que todos os quatro anticorpos ligaram-se ao XC279 de tal modo que a substituição de E por Y no resíduo de aminoácido número 12 (em relação à sequência de SEQ ID Nº: 32) não foi crucial para a ligação de nenhum desses anticorpos com o hoXCR5.
[0424]A ligação desses quatro anticorpos com o XC280, que compreende uma substituição de W por lisina (K) no resíduo de aminoácido número 19 (de acordo com a numeração da sequência do SEQ ID Nº: 32) resultou em perda da ligação com o XC280 pelos anticorpos 16D7 e 11A7, mas não afetou a ligação dos anticorpos 11G2 e 2C9 com a muteína (FIG. 7). Esses resultados demonstram ainda que esses quatro anticorpos não se ligam ao mesmo epítopo no hoXCR5.
[0425]A FIG. 7 também demonstra que trocar D na posição 22 (de acordo com a numeração da sequência do SEQ ID Nº: 32) por alanina (A) anula por completo a ligação do 1162 com a muteína XC281, mas não afeta a ligação dos anticorpos 2C9, 16D7 e 11A7. Isso enfatiza ainda que o epítopo para o 11G2 não é o mesmo que o(s) epítopo(s) dos anticorpos 2C9, 16D7 e 11A7.
[0426]Todos os quatro anticorpos ligaram-se ao XC285-294 por igual e sua ligação não foi afetada por nenhuma das substituições de aminoácido nessas muteínas. Esses dados sugerem que os resíduos de aminoácido nessas posições (27, 28, 30, 31, 33, 35, 36, 37, 39 e 40; vide a Tabela 9) não participaram na ligação do anticorpo com o CXCR5 para os anticorpos 11G2, 2C9, 11A7 e 16D7.
[0427]Sendo assim, esses dados demonstram que o resíduo de leucina (L) na posição de aminoácido número 11 e o resíduo de aspartato (D) na posição de aminoácido número 22 (ambos em relação à numeração da sequência de aminoácido do SEQ ID Nº: 32) são fundamentais para a ligação do anticorpo 11G2 com o hoXCR5 uma vez que a substituição de qualquer um desses resíduos (ou ambos) pelo resíduo de aminoácido de camundongo correspondente nessas posições anulou a ligação do anticorpo com o hOXCR5. Esses dados também demonstram que o anticorpo 11G2 não tem o mesmo epítopo que os anticorpos
2C9, 16D7 ou 11A7 uma vez que a troca de L11 e/ou W22 não afeta a ligação desses anticorpos com o hCXCR5.
[0428]A FIG. 7 também demonstra que todos os quatro anticorpos ligaram- se às proteínas CXCR5 mutantes de XC282 a XC284. Todos os quatro anticorpos também ligaram-se às proteínas de XC285 a XC294. Esses dados sugerem que o epítopo para os anticorpos 11G2, 2C9, 16D7 e 11A7 não encontra-se na região do domínio N do hOCXCRS5 indicada pelas muteínas de XC282 a XC294.
Exemplo 12: O 11G2 é seletivo para o CXCR5 e não se liga a outros membros da família de GPCRs de quimiocinas
[0429]A seletividade do 11G2 154/155 humanizado afucosilado foi avaliada em comparação a vinte (20) membros da família de GPCRs de quimiocinas usando um ensaio de acoplamento com a B-Arrestina (DiscoveRx). Esse ensaio utiliza células inteiras transfectadas estavelmente com cada receptor e mede diretamente a atividade do GPCR detectando a interação da B-Arrestina com o GPCR ativado. Como o recrutamento da Arrestina independe da sinalização da proteína G, esses ensaios oferecem uma plataforma de triagem e perfilagem universal que pode ser usada para praticamente qualquer receptor acoplado a Gi, Gs ou Gq, oferecendo assim uma comparação padronizada e eficaz entre receptores e famílias de receptores (independentemente do acoplamento da proteína G). O ensaio foi realizado nos modos agonista (sem nenhum ligante presente) e antagonista (na presença de ligante a EC90). Os receptores de quimiocinas a seguir foram incluídos no painel de seletividade: CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CMKLR1, CXCR3R1, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCRA, CXCR5, CXCR6, CXCR7, XCR1.
[0430]Não observou-se nenhuma atividade significativa do 1162 154/155 humanizado afucosilado (testado a 200 nM) sobre nenhum outro receptor de quimiocinas quando testado no modo agonista, e ele só foi significativamente ativo como antagonista do CXCR5 (92% de acoplamento com a B-arrestina induzido pelo ligante), em comparação ao modo antagonista para todos os receptores de quimiocinas avaliados, isto é, não observou-se nenhuma inibição significativa para nenhum outro receptor de quimiocinas testado.
Exemplo 13: O h11G2 não demonstrou polirreatividade contra o DNA, insulina ou LPS
[0431]O ensaio de polirreatividade serve para determinar se os anticorpos podem reagir potencialmente a uma variedade de antígenos não relacionados in vivo. A ausência de polirreatividade sugere que o 11G2 é um anticorpo específico do CXCRS5 e que ele não se liga fora dos alvos in vivo.
[0432]Placas DELFIA negras (Thermoscientific) foram revestidas com 10 pg/ml de DNA de fita dupla (dsDNA; Millipore), 5 ug/ml de lipopolissacarídeos (LPS; Sigma), 10 pg/ml de insulina (Sigma, St. Louis, MO) ou soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) e incubadas a 4º C de um dia para o outro. As placas foram então lavadas com água usando uma lavadora de microplacas Biotek ELx405 (Biotek, Winooski, VT) e, em seguida, foram bloqueadas com 200 ul de tampão de ensaio contendo 1x de PBS, 0,05% de Tween 20 e 1 mM de EDTA em temperatura ambiente por uma hora. Após uma etapa de lavagem adicional, as placas foram incubadas em temperatura ambiente por uma hora com diluições seriadas de anticorpos anti-CXCR5 (todos eles fucosilados). Para a detecção, 100 ul de DELFIA- Eu-N1-anti-lgG humana (50 pg/ml; Perkin Elmer, Waltham, MA) foram adicionados às placas e incubados em temperatura ambiente por uma hora. Por fim, adicionaram-se 100 ul de solução intensificadora DELFIA a cada placa, e as placas foram agitadas em temperatura ambiente por 15 minutos antes de ser lidas em um Leitor de Placas VictorX4 Multilabel (PerkinElmer, Waltham, MA) sob fluorescência de európio. Os dados são relacionados na Tabela 10.
TABELA 10 Fluorescência (contagens) para a polirreatividade de mAbs do CXCR5 e mAb do (nM) mento de mento de mento de mento de CXCR5 insulina DNA LPS PBS | 11G2 1,2 161 1099 190 1788 | 154/155 1 305 1780 829 1145 humanizado 2 | 100 Deo na
[0433]Em um estudo distinto, o 11G2 154/155 humanizado afucosilado foi testado quanto à polirreatividade e não exibiu ligação com a insulina, DNA, LPS ou PBS, em consonância, portanto, com os resultados para o 11G2 154/155 humanizado fucosilado representado na Tabela 10 acima.
[0434]Esses dados demonstram que o 11G2 não é reativo com a insulina, DNA ou LPS e é menos reativo do que os anticorpos comparativos 2C9, 16D7 e 11A7. Esses dados sugerem que o 11G2 é um novo produto terapêutico útil em potencial. Os anticorpos polirreativos, por definição, ligam-se de maneira não específica a uma variedade de moléculas biológicas. O fato de que o 11G2 não reage com um ensaio de polirreatividade genérico sustenta ainda que o 11G2 é específico para o CXCR5. Os dados de PK, TK e tox também sustentam que o 11G2 possui especificidade pelo CXCR5.
Exemplo 14: Sumário de diferenças entre o 11G2 e os anticorpos comparativos
[0435]A Tabela 11 abaixo sumariza as características do 11G2 e vários anticorpos comparativos descritos previamente em outra parte neste documento. ND significa não determinado.
[0436]Esses dados demonstram que o anticorpo 11G2, tanto fucosilado quanto afucosilado, é um tanto diferente dos anticorpos comparativos 2C9, 16D7 e 11A7. Ou seja, a ligação do 11G2 é anulada pela substituição do resíduo de aminoácido de camundongo nas posições 11 e 22, ao passo que a ligação dos anticorpos comparativos não é afetada pela substituição desses resíduos (numerados de acordo com a sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32). Além disso, a ligação do 2C9 requer a presença dos resíduos de aminoácido W19, D22 e R23 para ligar-se ao hoXCR5, mas nenhum dos anticorpos requer todos os três, embora a ligação do 11A7 com o hoXCR5 seja anulada pela substituição da alanina por W na posição 19 (de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32). À diferença de todos os demais anticorpos, a ligação do 16D7 com o hoXCRS5 é anulada pela introdução dos dois resíduos de camundongo entre D10 e L11 do CXCR5 humano (de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32) (vide a FIG. 7). Sendo assim, os dados fornecidos neste documento sugerem que o 11G2 não tem o mesmo epítopo que os anticorpos 2C9, 16D7 e 11A7 e que esses anticorpos também têm diferentes epítopos entre eles.
[0437]Além disso, os dados fornecidos neste documento demonstram que o 11G2 tem uma afinidade (expressa por EC50) pelo hoXCR5 (7,08 pM) que é ao menos 10 vezes maior do que a do 2C9 (65,59 pM) e ao menos 100 maior do que a do 11A7 (563,63 pM), e muito diferente da do 16D7, que não pôde ser comparado porque não é saturável. TABELA 11 Epítopo Antago- (resíduos Afinidade mAb do Polirrea- ADCC nismo cruciais Aparente CXCR5 tividade (EC50o, PM) funcional para (ECs5o, pM) (EC50o, pM) ligação 1162 154/155 L11, D22 Não 7,08 253,72 752,9 humanizado 1162 154/155 ND Não 2,38 961,4 humanizado afucosilado W19, D22, 2C9 Não 65,59 380,31 793,1 R23 Sem Introdução 16D7 Não ligação 2590,61 1104 de D10, SI saturável Reatividade 11A7 W19 563,63 4,35 1401 ao DNA
[0438]Todos esses dados sugerem que o 11G2 é substancialmente diferente dos anticorpos comparativos 2C9, 16D7 e 11A7 e é um novo produto terapêutico útil em potencial para o tratamento ou prevenção de uma doença, transtorno ou condição mediada pela ou associada à atividade biológica do CXCRS5, incluindo, entre outras, a sinalização do CXCL13 mediada pelo CXCR5. Esse é especialmente
O caso para a versão afucosilada do 11G2, que demonstrou em grande medida uma atividade de ADCC intensificada, aumentando assim sua utilidade em potencial como um produto terapêutico para tratar, por exemplo, doenças imunológicas mediadas pela ou associadas à expressão celular do CXCR5. Exemplo 15: Farmacodinâmica in vivo do h11G2 XC154/XC155 afucosilado
[0439]Doses in vivo variando de 0,001 a 400 mg/kg/dose IV ou SC foram exploradas em múltiplos estudos em macacos cinomolgos para o 11G2 154/155 humanizado afucosilado. Conforme usado ao longo deste experimento, as fórmulas IV e SC contiveram os seguintes componentes: 50 mg/mL do anticorpo do CXCRS5, ou fragmento de ligação de antígeno, da presente invenção, 20 mM de histidina, 8,5% de sacarose e 0,02% de polissorbato 80, 0,005% de EDTA a pH 5,8. A Tabela 12 abaixo traz o esquema do estudo in vivo do 11G2 XC154/XC155 afucosilado em macacos cinomolgos. TABELA 12 Administração Estudo farmacodinâmico (PD) | 0,001, 0,002, 0,005, Dose única de dose única em macacos 0,1 e 0,2 mg/kg (IV) cinomolgos Estudo de toxicidade 40 e 400 mg/kg/dose Três doses semanais exploratório com doses (IV), nos Dias 1,8 e 15 repetidas (com uma fase de 260 (SC) recuperação de 48 semanas)
Administração Estudo de toxicidade GLP 5 e 200 mg/kg/dose Cinco doses com doses repetidas em (IV), quinzenais nos dias macacos cinomolgos 20 (SC) 1,15,29,43 e 57 (com uma fase de recuperação de 11 meses Estudo de imunocompetência | 2e10mg/kg/dose (IV) | Duas doses PK/PD (Resposta à semanais nos dias 1 Revogação da Vacina) do e8 h11G2 VL XC154/VH XC155 afucosilado em macacos cinomolgos
[0440]A depleção dependente da dose de células B e células similares a Tfh no sangue periférico foi observada em macacos cinomolgos a doses únicas de h11G2 VL XC1I54/VH XC155 afucosilado (h11G2 XC154/KC155 afucosilado) variando de 0,001 a 0,2 mg/kg; a menor dose testada (0,001 mg/kg) resultou em aproximadamente 50% de depleção de células B e células similares a Tfh (isto é, cTfh) no sangue periférico.
[0441]Nos estudos de toxicidade GLP exploratório e pivô em macacos cinomolgos, doses de > 5 mg/kg IV de h11G2 XC154/XKC155 afucosilado levaram à depleção notável de B células e células similares a Tfh no sangue periférico e a menor celularidade dos folículos linfoides no baço e em outros tecidos linfoides (linfonodos auxiliares e mesentéricos e tecido linfoide associado ao intestino); esses efeitos correlacionados à celularidade farmacologicamente mediada reduziram a celularidade das áreas de células B observadas imuno-histoquimicamente. Nos estudos exploratório e pivô, observou-se a recuperação parcial ou completa de células B, células similares a Tfh e células Tfh. A cinética de depleção e subsequente repleção tiveram relação com os níveis de exposição do h11G2 XC154/XC155 afucosilado.
[0442]Para determinar se o h11G2 XC154/XC155 afucosilado debilita as respostas da memória humoral, um estudo de resposta à revogação da vacina foi conduzido em macacos cinomolgos. Em suma, o h11G2 XC154/XKC155 afucosilado foi administrado por injeção IV de bólus nos dias 1 e 8 em níveis de 2 e 10 mg/kg/dose a macacos cinomolgos (N = 6 por grupo), que foram vacinados contra o TT (toxoide tetânico) antes do estudo. A administração do h11G2 XC154/XKC155 afucosilado foi bem tolerada e levou à farmacologia esperada (isto é, redução nas células B e células similares a Tfh circulantes). Aumentos nas respostas de memória da imunoglobulina M (IgM) e IgG, em comparação ao dia 15, foram observados em todos os animais em todos os grupos de dose no Dia 22 7 dias após a imunização secundária contra o TT. Essas respostas foram atenuadas em animais que receberam a administração de H11G2 XC154/XC155 afucosilado (10 mg/kg/dose) com um pico de titulação média da IgG anti-TT de 42.667 em comparação a 72.000 para o grupo controle e um pico de titulação média da IgM anti-TT de 1.583 em comparação a 3.500 para o grupo controle. RituxanO (rituximabe), um anticorpo depletor de células B usado como comparativo, não afetou as respostas de memória da IgG anti-TT. Em conclusão, esses dados demonstram que o h11G2 XC154/XC155 afucosilado debilita as respostas da memória humoral in vivo.
Farmacologia de Segurança:
[0443]Eletrocardiograma e medições dos batimentos cardíacos foram incorporados ao esquema do estudo de toxicidade pivô. Não houve descobertas eletrocardiográficas anormais atribuíveis à administração do h11G2 XC154/XKC155 afucosilado.º Todas as eletrocardiograffas —provaram-se qualitativa e quantitativamente dentro dos limites normais e nenhum tipo de arritmia se fez presente.
Exemplo 16: Farmacocinética e metabolismo in vivo do h11G2 XC154/XC155 afucosilado
[0444]Um ensaio eletroquimioluminescente (ECL) foi validado para detectar a presença de ADA no soro de macacos cinomolgos na plataforma de ensaio Meso Scale Discovery* (MSD). Um controle positivo, anticorpo anti-CXCR5 anti-idiotípico, introduzido no soro de macacos cinomolgos, e um controle negativo, composto pelo soro de macacos cinomolgos normais misturado, foram incluídos em cada placa para monitorar o desempenho do ensaio. O h11G2 XC154/KC155 afucosilado marcado com biotina e o h11G2 XC154/XKC155 afucosilado marcado com rutênio foram co-incubados com amostras do estudo, o controle positivo e o controle negativo. Os anticorpos para o h11G2 XC154/XC155 afucosilado presentes nas amostras devem ligar-se a ambas as versões marcadas com biotina e com rutênio do h11G2 XC154/XKC155 afucosilado a ser detectadas no ensaio. Os complexos foram capturados através do h11G2 XC154/XKC155 afucosilado biotinilado para placas multimatriz de MSD revestidas com estreptavidina, que foram lidas no instrumento MSD Sector Imager. A detecção final foi realizada usando o h11G2 XC154/XC155 afucosilado marcado com rutênio e tripropilamina para produzir um sinal de ECL (RLUs) dentro do instrumento MSD Sector Imager.
[0445]As amostras de teste foram testadas quanto a ADA usando uma estratégia multinível. As amostras foram testadas inicialmente em um ensaio de triagem a um fator de diluição de 75. As amostras que geraram uma RLU abaixo do ponto de corte do ensaio foram divulgadas como negativas (< 1,88). As amostras que geraram uma RLU no ou acima do ponto de corte do ensaio foram reanalisadas em uma série de diluição completa para determinar a titulação do anticorpo. À titulação do anticorpo foi definida como a diluição recíproca da amostra que geraria uma RLU igual à RLU do ponto de corte. O log (base 10) dessa titulação foi divulgado.
[0446]As conclusões referentes à indução de ADA foram tiradas com base na comparação de amostras coletadas antes da dosagem no Dia de Estudo 1 e nos resultados de amostras pós-dose. Se a amostra pré-dose testasse negativo para ADA e a amostra pós-dose correspondente testasse positivo, o animal era considerado positivo para a indução de ADA. Se ambas as amostras pré-dose e pós- dose testassem positivo para ADA, o animal era considerado positivo para a indução de ADA somente se a titulação da amostra pós-dose fosse ao menos 0,48 (log 3, o fator de diluição seriada) ou mais a titulação da amostra pré-dose.
Farmacocinética de dose única
[0447]Os h11G2 XC154/XKC155 PK afucosilados foram caracterizados após dosagem IV única a 0,001, 0,002, 0,005, 0,1 ou 0,2 mg/kg de h11G2 XC154/XKC155 afucosilado como parte de um estudo para avaliar a depleção e a repleção de células B do sangue periférico e células similares a células auxiliares T foliculares (Tfh) (similares a Tfh) em macacos cinomolgos machos e fêmeos (n = 1/sexo/grupo de dose). Conforme usado ao longo deste experimento, as fórmulas IV e SC contiveram os seguintes componentes: 50 mg/ml do anticorpo do CXCR5, ou fragmento de ligação de antígeno, da presente invenção, 20 mM de histidina, 8,5% de sacarose e 0,02% de polissorbato 80, 0,005% de EDTA a pH 5,8.
[0448]Após a dosagem IV única, as exposições sistêmicas aumentaram à medida que a dose aumentou, e os h11G2 XC154/XKC155 PK afucosilados foram caracterizados por baixa CL e baixo Vss, com os valores médios variando entre os diferentes níveis de dose de cerca de 0,2 a 2,6mL/h/kg e 0,03 a 0,1 L/kg, respectivamente. Os valores médios de t, entre os diferentes níveis de dose variaram de cerca de 1 a 4 dias. A doses baixas (0,001 a 0,005 mg/kg), houve evidência de maior CL, possivelmente devido à depleção de células mediada por citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), o que também pode resultar na depuração do complexo h11G2 XC154/KC155/CXCR5 afucosilado (Kryzanski et al., 2016, J. Pharmacokinet. Pharmacodyn. 43(5):513-527; Wang et al., 2010, AAPS J. 12(4):729-740). Um mecanismo de depuração/não linearidade similar pode ser observado nos seres humanos a doses baixas. Conforme descrito previamente em outra parte neste documento, observou-se a depleção dependente da dose de células B e células similares a Tfh no sangue periférico, e a depleção de células B circulantes foi mais robusta do que a depleção de células similares a Tfh.
Toxicocinética (TK) com doses repetidas em macacos cinomolgos
[0449]Avaliações da TK e ADA foram conduzidas após a dosagem |V ou SC quinzenal (a cada 2 semanas) de h11G2 XC154/XC155 afucosilado a 5 (IV), 20 (SC) ou 200 (IV) mg/kg (por um total de 5 doses) a macacos cinomolgos machos e fêmeos (n=3 ou 4/sexo/grupo de dose) como parte de um estudo de toxicidade GLP com doses repetidas.
[0450]Não houve concentrações quantificáveis do h11G2 XC154/XKC155 afucosilado nas amostras coletadas e analisadas do grupo controle veículo. Não houve diferenças relacionadas ao sexo aparentes nas exposições sistêmicas entre os grupos de dose; logo, os parâmetros de TK médios dos grupos são dados usando dados combinados de macacos cinomolgos tanto machos quanto fêmeos (Tabela 13).
[0451]Seguindo-se a dosagem quinzenal a 5 (IV), 20 (SC) ou 200 (IV) mg/kg, a exposição sistêmica foi maior após a dosagem repetida, com razões acumuladas (Dia de Estudo 43/Dia de Estudo 1) variando de cerca de 1,4 a 1,7. Além disso, as exposições sistêmicas aumentaram proporcionalmente à dose após a dosagem |V. As últimas concentrações quantificáveis de h11G2 XC154/XKC155 afucosilado nos animais recuperados do grupo de dose de 5 mg/kg (IV) foram observadas do Dia de Estudo 148 ao Dia 281 do período de recuperação de 11 meses. Após a dosagem
SC, estimou-se a biodisponibilidade de h11G2 XC154/XKC155 afucosilado em ao menos cerca de 50%.
[0452]A incidência de ADA no h11G2 XC154/XC155 afucosilado foi de 19% (3/16 animais), 17% (1/6 animal) e 0% (0/6 animal) após a dosagem de h11G2 XC154/XC155 afucosilado a 5 (IV), 20 (SC) ou 200 (IV) mg/kg, respectivamente, e as concentrações no soro no Dia de Estudo 43 foram em geral menores em animais positivos para ADA em comparação a animais negativos para ADA. Deve-se ter em mente que as concentrações circulantes de h11G2 XC154/KC155 afucosilado podem ter interferido na depleção de ADA.
TABELA 13 mg/kg/semana)/Via (ug/mL) horas (ug-h/mL) Los eo so so | Los ho jo ls | AUC'168 = Área sob a curva concentração de fármaco-tempo de zero a 168 horas após a dose; Cmax = Concentração máxima observada; IV = Intravenosa; NA = Não aplicável; SC = Subcutânea; Tmax = Tempo para a primeira ocorrência de Cmax.
Distribuição
[0453]Estudos de ligação da proteína e distribuição nos tecidos foram realizados para o h11G2 XC154/XC155 afucosilado em espécies não clínicas. O Vss do h11G2 XC154/XKC155 afucosilado em macacos cinomolgos variou de cerca de 0,03 a 0,1 L/kg após uma única dosagem |V, em consonância com a distribuição limitada esperada para uma IgG (Lin et a/., 1999, J. Pharmacol. Exp. Ther. 288(1):371-378; Mascelli et al., 2007, J. Clin. Pharmacol. 47(5):553-565).
Metabolismo
[0454]Não foram realizados estudos sobre o metabolismo com o h11G2 XC154/XC155 afucosilado. À semelhança de outras proteínas terapêuticas com pesos moleculares acima do corte de filtragem glomerular, espera-se que o h11G2 XC154/XKC155 afucosilado seja metabolizado primariamente por degradação catabólica (Lobo et a/., 2004, J. Pharm. Sci. 93(11):2645-2668; Mascelli et al., 2007, supra; Vugmeyster et a/., 2012, World J. Biol. Chem. 3(4):73-95).
Interações farmacocinéticas dos fármacos
[0455]Não foram realizados estudos sobre a interação farmacocinética dos fármacos in vitro ou in vivo. O h116G2 XC154/XKC155 afucosilado é um anticorpo monoclonal humanizado (mMAb) direcionado contra o CXCR5 e provou modular a liberação de citocinas in vitro mas não in vivo. As citocinas provaram modular a expressão das enzimas e transportadores do citocromo P450 (CYP) (Lee et al. 2010, Clin. Pharmacokinet. 49(5):295-310; Mahmood & Green, 2007, J. Clin. Pharmacol. 47(12):1540-1554). Portanto, o tratamento com o h11G2 XC154/XC155 afucosilado pode afetar potencialmente os níveis das enzimas e transportadores de CYP e, por conseguinte, modular a depuração de medicamentos concomitantes que sejam substratos para essas enzimas ou transportadores. Porém, as interações com fármacos mediados por citocinas observadas na clínica para outros fármacos foram modestas, resultando em mudanças de menos de 2 vezes na exposição de um fármaco de moléculas pequenas coadministrado (Huang et al, 2010, Clin. Pharmacol. Ther. 87(4):497-503; Evers et al., 2013, Drug Metab. Dispos. 41(9):1598- 1609). Sendo assim, sem a intenção de nos prender a nenhuma teoria específica, se um medicamento concomitante alterar a expressão do alvo, ele potencialmente impactará a PK do h11G2 XC154/XC155 afucosilado.
Predição da farmacocinética humana
[0456]Os perfis PK do h11G2 XC154/KC155 afucosilado no macaco cinomolgo foram típicos para um mAb da IgG1 humana em macacos. Logo, espera- se que os valores do parâmetro PK bicompartimentais previstos em seres humanos sejam os mesmos que os de um mAb da IgG1 terapêutico típico e sejam presumidamente lineares ao longo da faixa de doses a ser testada. Os valores do parâmetro PK foram semelhantes aos divulgados anteriormente (Singh et a/l., 2015, In: Developability of Biotherapeutics: Computational Approaches, S. Kumar, Singh S. Kumar, Eds., CRC Press). Esses parâmetros são conforme o seguinte: 3,2 L para o volume central (Vc), 2,2 L para o volume periférico (Vp), 0,25 L/dia para a depuração central (CLc), 0,45 L/dia para a depuração distributiva (Q), 0,26 Lídia para a constante da taxa de absorção de SC (ka) e 60% para a biodisponibilidade de SC. Com base nos dados revelados neste documento, a meia-vida no soro humano prevista do h11G2 XC154/XC155 afucosilado é de cerca de 17 dias Predição da dose humana eficaz
[0457]Uma abordagem baseada em modelo foi adotada para caracterizar a relação entre a dose, as concentrações de h11G2 XC154/XKC155 afucosilado e a modulação de células B e células similares a Tfh no soro de macacos cinomolgos. Subsequentemente, os dados de farmacocinética/farmacodinâmica (PK/PD) em macacos e em seres humanos publicados para o SBI-087, um produto imunofarmacêutico modular pequeno (SMIP) humanizado que, assim como o RITUXIMABE, liga-se ao CD-20 e depleta células B, foram usados para traduzir os parâmetros de depleção de células B para o h11G2 XC154/XKC155 afucosilado de macacos para seres humanos (Cohen et a/., 2016, Clin. Ther. 38(6):1417-1434; Dunussi-Joannopoulos et a/., 2008, Ann. Rheum. Dis. 64(Suppl 11):190 (Abstr THUO171). À diferenças das células B, nenhum dado humano acerca da depleção de células similares a Tfh foi disponibilizado; logo, a tradução da depleção de células similares a Tfh foi presumidamente semelhante à de células B. Usando as contagens de células B e similares a Tfh de referência em pacientes com LES (Belouski et a/., 2010, Cytometry B Clin. Cytom. 78(1):49-58) e os parâmetros de depleção de células humanas previstos, simulou-se a cinética de depleção para células B e células similares a Tfh após a administração do h11G2 XC154/XC155 afucosilado em seres humanos.
[0458]A dose humana eficaz prevista do h11G2 XC154/XKC155 afucosilado é de cerca de 10 a 30 mg (IV) e baseia-se na suposição de que as células B no sangue precisam ser depletadas para <1 célula/uL por cerca de 8 semanas para que obtenha-se eficácia clínica. As concentrações de h11G2 XC154/XKC155 afucosilado no sangue após a segunda dose de 10 a 30 mg IV (doses no Dia 1 e Dia 29) foram estimadas conforme observado acima, e a Cmax prevista foi de cerca de 5 a pug/mL, a área sob a curva do tempo de concentração sobre o intervalo de dosagem tau (AUCtau) prevista foi de cerca de 38 a 114 pg/dia/mL, e a concentração média prevista (Cav; calculada por AUCtau/28) foi de 1,36 a 4,06 ug/mL.
Exemplo 17: Estudos de toxicologia do h11G2 XC154/XKC155 afucosilado
[0459]O h11G2 XC154/XKC155 afucosilado foi avaliado em uma série de estudos de toxicidade não clínicos no panorama dos estudos de teste de toxicidade conforme sumarizados na Tabela 14. As vias de administração intravenosa (IV) ou subcutânea (SC) foram selecionadas porque são as vias para administração clínica tencionadas. Conforme usado ao longo deste experimento, as fórmulas IV e SC contiveram os seguintes componentes: 50 mg/ml do anticorpo do CXCR5, ou fragmento de ligação de antígeno, da presente invenção, 20 mM de histidina, 8,5% de sacarose e 0,02% de polissorbato 80, 0,005% de EDTA a pH 5,8. Conforme discutido previamente em outra parte neste documento, estudos usando células mononucleares do sangue periférico humano ou de macacos cinomolgos demonstraram que o h11G2 XC154/KC155 afucosilado liga-se a células que expressam o CXCR5 com afinidade equiparável e provoca a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) de maneira semelhante entre células humanas e de macaco.
Também conforme previamente demonstrado em outra parte neste documento, o h11G2 XC154/XKC155 afucosilado não se liga a ortólogos de camundongo, rato ou coelho do CXCR5. Logo, estudos de toxicidade não clínicos só foram realizados em macacos cinomolgos.
TABELA 14 Dose GLP
| Toxicidade com doses repetidas — ||
Estudo de toxicidade exploratório O (IV, SC), 40 (IV), Não intravenoso e subcutâneo com duração 260 (SC),
de 17 dias do h11G2 XC154/XC155 400 IV afucosilado em macacos cinomolgos (uma vez por com um período de recuperação semana
Estudo de toxicidade intravenoso e O (IV, SC), 5 (IV), 20 Sim subcutâneo com duração de 2 meses (SC), 200 (IV)
do h11G2 XC154/XC155 afucosilado (a cada 2 semanas)
em macacos cinomolgos com um período de recuperação
Outros estudos de toxicidade
Estudo preliminar para determinar o 0,5 a 25 ug/mL Não método de coloração imuno-
histoquímica para o h11G2
XC154/XC155 afucosilado
Estudo de reatividade cruzada nos 1,5 po/mL Sim tecidos do h11G2 XC154/XC155 afucosilado biotinilado em tecidos de seres humanos e macacos cinomolgos normais Ensaio de liberação de citocinas 1a 1000 ug/mL Não humanas in vitro do h11G2 ou 1 a 100 ug/g XC154/XC155 afucosilado
[0460]As abreviações na Tabela 14 são conforme o seguinte: GLP = Boas Práticas de Laboratório; IV = Intravenosa; OECD = Organização para Cooperação e Desenvolvimento Econômico; PBMC = Células mononucleares do sangue periférico; SC = Subcutânea.
[0461]Todos os estudos GLP foram realizados em um estado-membro complacente com a aceitação mútua de dados da OECD. Todos os estudos in vivo foram realizados com animais machos e fêmeos. Salvo especificação em contrário, todas as doses são expressas por mg de proteína por kg do peso corporal por dose. O sangue total humano foi avaliado a 1, 10, 100 ou 1.000 ug/mL (fase solúvel), ou as PBMCs humanas foram avaliadas a 1, 10 ou 100 ug/poço (fase sólida).
[0462]O h11G2 XC154/XC155 afucosilado foi administrado a macacos em estudos IV e SC com uma dosagem semanal de até 400 mg/kg/dose (IV) por 17 dias (3 doses ao todo) ou quinzenal de até 200 mg/kg/dose (IV) por 2 meses (5 doses ao todo). O estudo exploratório de 17 dias de duração em macacos incluiu uma fase de recuperação até o Dia 352. O estudo-pivô (GLP) de 2 meses de duração em macacos teve uma fase de recuperação de 11 meses (Dia 401). O h11G2 XC154/XC155 afucosilado induziu à liberação de citocinas em um ensaio in vitro. O órgão alvo identificado nesses estudos foi o sistema hemolinfopoiético. O nível de efeitos adversos não observados (NOAEL) no estudo de 2 meses de duração em macacos deu-se à dose testada mais alta de 200 mg/kg/dose (IV) com uma Cmax de
5.220 ug/mL e AUC168 de 438.000 ug*h/mL no Dia 43.
Toxicidade com doses repetidas
[0463]Estudos de toxicidade exploratório e pivô com doses repetidas foram realizados com o h11G2 XC154/XC155 afucosilado em macacos cinomolgos.
Estudo de Toxicidade Exploratório
[0464]O h11G2 XC154/XKC155 afucosilado foi administrado em um estudo não GLP exploratório por injeção IV ou SC em macacos (1-2 sexo/dose) uma vez por semana a O (IV, veículo SC), 40 (IV), 260 (SC) ou 400 (IV) mg/kg/dose (3 doses totais), seguida por uma fase de recuperação no veículo, grupos de 40 (IV) e 400 (IV) (1/sexo/grupo) até o Dia 352. Todos os animais sobreviveram até sua autópsia agendada no Dia 17 ou no Dia 352. Não houve nenhum sinal clínico relacionado ao artigo de teste nem nenhum efeito no peso corporal, no consumo de alimentos ou nas citocinas séricas.
[0465]Durante a fase de dosagem, houve reduções nas células B totais, células B CXCR5+ e células similares à Tfh circulantes no sangue periférico em relação à referência (0,00x-0,02x, 0,00x-0,02x, e 0,03x-0,09x, respectivamente) começando nos Dias 2 ou 3, com as maiores reduções em relação à referência ocorrendo no Dia 17. A grandeza de depleção foi semelhante em todas as doses. No baço, observaram-se números notadamente menores de células B, células B CXCR5+ e células Tfh bona fide (0,018x-0,144x, 0,003x-0,033x, e 0,037x-0,245x, respectivamente) a todas as doses em comparação aos controles. No sangue periférico, observaram-se reduções (0,33x-0,67x a referência) nos linfócitos absolutos em todos menos um animal a >40 mg/kg/dose até o Dia 2 e aumentos (1,11x-1,81x a referência) na imunoglobulina (Ig) G em animais a >40 mg/kg/dose no Dia 17. Houve reduções transientes nas contagens de células exterminadoras naturais (NK) no Dia 2 (0,05x-0,14x a referência) com recuperação parcial a completa até o Dia 6 na maioria dos animais. Houve uma redução de moderada a notória na celularidade dos fólicos linfoides esplênicos, redução ínfima na celularidade dos folículos linfoides nos linfonodos submandibulares, axilares e inguinais, e, na amígdala a >40 mg/kg/dose e a 260 mg/kg/dose (SC), houve a infiltração celular mista a sítios de injeção microscópicos. A imuno-histoquímica demonstrou menos células CD20-positivas não dependentes da dose e células CXCR5-positivas no baço, e menos células CD20-positivas nos linfonodos submandibulares e inguinais. Os efeitos nos tecidos linfoides correlacionam-se às reduções em células B e células similares a Tfh, bem como nos linfócitos totais no sangue periférico, e condizem com a farmacologia do h11G2 XC154/KC155 afucosilado, que é um anticorpo depletor que mira células expressando o CXCRS5.
[0466]Durante a fase de recuperação, reduções nos números de células B, células B CXCR5+ e células similares a Tfh no sangue periférico aumentaram (lentamente) até o Dia 199, e, ao fim da fase de recuperação no Dia 352, todos os animais exibiram a recuperação parcial ou total desses tipos de células. As células NK e IgG voltaram à faixa de referência durante a fase recuperação (FIGs. 8A-8D). Não houve descobertas microscópicas relacionadas ao artigo de teste (incluindo a avaliação imuno-histoquímica de CD20 e CXCR5 no baço e nos linfonodos submandibulares e inguinais) e, no baço, os números de células B, células B CXCR5+ e células Tfh bona fide foram semelhantes ou superiores aos valores para os animais controle veículo, sugerindo a recuperação total.
[0467]Não houve efeitos observados sobre as citocinas séricas ou em células T, células T auxiliares ou células T citotóxicas no sangue periférico ou baço a nenhuma dose. Não houve nenhum anticorpo antifármaco (ADA) aparente detectado neste estudo.
[0468]As FIGs. 8A a 8D trazem gráficos que representam a depleção e reconstrução de células B do sangue periférico e células similares a Tfh em macacos cinomolgos. Os níveis de células B (FIG. 8A e FIG. 8B) e células similares a Tfh (FIG. 8C e FIG. 8D) no sangue periférico por ul do sangue em machos (FIG. 8A and FIG. 8C) e fêmeas (FIG. 8B and FIG. 8D) são ilustrados até o Dia 352 do estudo de toxicidade exploratório. As células B foram definidas como CD3-CD20+. As células similares a Tfh foram definidas pela soma de células CD3+CD4+CD95+CXCR5+ e células CD3+CD4+CD95+hlgG+, porque o artigo de teste interfere no anticorpo do CXCR5 usado para a imunofenotipagem. As faixas históricas de células B em macacos machos (FIG. 8A, 272 a 2.503 células por uL) e macacos fêmeos (FIG. 8B, 233 a 1.700 células por uL) são indicadas por linhas pontilhadas.
Estudo de Toxicidade Pivô (GLP)
[0469]O h11G2 XC154/XKC155 afucosilado foi administrado em um estudo- pivô por injeção IV ou SC a macacos (3-8/sexo/grupo) a cada 2 semanas a O (IV, SC), 5 (IV), 20 (SC) ou 200 (IV) mg/kg/dose (5 doses totais), seguida por uma fase de recuperação de 11 meses (Dia 401). Os macacos receberam injeção de hemocianina de keyhole limpet (KLH) e toxoide tetânico (TT) no Dia 22 (fase de dosagem) e no Dia 253 (fase de recuperação) para avaliar as respostas dependentes de células T do anticorpo (TDAR) primária e secundária, respectivamente. Os animais haviam sido imunizados contra o TT mas eram virgens à KLH antes do início do estudo. Amostras sanguíneas foram coletadas antes do início do estudo (para referência) nos Dias 22, 25, 29, 36, 43, 58, 253 (antes da imunização na fase de recuperação), 256, 260, 267, 274 e 281 e avaliadas quanto à produção de IgM anti-KLH, IgG anti-KLH, IgM anti-TTe IgG anti-TT.
[0470]Todos os animais na fase de dosagem sobreviveram até sua autópsia agendada no Dia 58. Não houve sinais clínicos relacionados ao artigo de teste nem nenhum efeito no peso corporal, no consumo de alimento, nas citocinas plasmáticas, na coagulação, na química clínica, nos parâmetros TDAR-KLH, ou nos parâmetros de eletrocardiograma. Todas as descobertas relacionadas ao h11G2 XC154/XC155 afucosilado neste estudo incluíram mudanças adversas e reversíveis em parâmetros hematológicos de imunofenotipagem no sangue periférico, reduções independentes da dose nos valores de TDAR-TT IgG, e descobertas microscópicas e mudanças de imunofenotipagem no baço e/ou linfonodos em machos e fêmeas a 5 e 200 mg/kg/dose IV e 20 mg/kg/dose SC. Durante a fase de recuperação, uma fêmea controle foi eutanasiada no Dia 330, devido a uma complicação na coleta de sangue. Todos os demais animais da fase recuperação sobreviveram até a autópsia no Dia
401.
[047 1]Mudanças na hematologia relacionadas ao h11G2 XC154/KC155 afucosilado incluíram reduções leves a moderadas substancialmente independentes da dose nos linfócitos (0,34x-0,60x a referência) a todas as doses, com a maior incidência no Dia 2 e a menor incidência em pontos no tempo subsequentes, as quais contribuíram para reduções nos números de glóbulos brancos totais (0,25x-0,59x a referência) para animais individuais a todas as doses. Os linfócitos aproximaram-se dos valores de referência e/ou controle dentro dos primeiros 1 a 2 meses da fase de recuperação. Também houve leve redução no número de basófilos (0,17x-0,50x) a 200 mg/kg/dose IV no Dia 2 e, para animais individuais, a mg/kg/dose IV e 20 mg/kg/dose SC em pontos no tempo subsequentes com a recuperação subsequente dentro dos primeiros 1 a 3 meses da fase de recuperação, e redução transiente ínfima (0,79x-0,82x) na massa de glóbulos vermelhos (hemoglobina, contagem de glóbulos vermelhos, e hematócrito) para fêmeas a 200 mg/kg/dose IV no Dia 6.
[0472]Houve reduções notáveis relacionadas ao h11G2 XC154/KC155 afucosilado nas células B totais, células B CXCR5+ e células similares a Tfh (0,00x- 0,56x) no sangue periférico em relação à referência em todos os animais e grupos de dose já no Dia 2, que persistiram até o fim da fase de dosagem (Dia 58), com o retorno aos níveis de referência ou valores absolutos para cada subconjunto que foram dentro da faixa de valores observados em animais controle veículo em animais dosados com 5 mg/kg/dose IV durante a fase de recuperação até o Dia 393 (FIGs. 9A a 9D). Também houve reduções notáveis no número de células NK no sangue periférico no Dia 2 em todos os animais em relação à referência (0,04X-0,46x); porém, observou-se a recuperação parcial a total até o Dia 6 para a maioria dos animais, embora as células NK tenham permanecido abaixo dos níveis de referência em um ou mais pontos no tempo mais adiante para alguns animais, com retorno aos níveis de referência ao fim da fase de recuperação. Também houve reduções transientes em alguns animais nas células T totais, células T auxiliares e células T citotóxicas no Dia 2 (0,45x-0,66x); porém, essas populações de células retornaram aos níveis de referência até o Dia 6 na maioria dos animais e até o Dia 36 em todos os animais. Não houve mudanças relacionadas ao h11G2 XC154/XC155 afucosilado na interleucina (IL)-2, IL-6, I1L-10, 11-13, interferon(IFN)-y, e fator de necrose tumoral (TNF)-a a nenhuma dose.
[0473] Observou-se redução na celularidade relacionada ao h11G2 XC154/XKC155 afucosilado independentemente da dose em folículos linfoides esplênicos, e, em folículos linfoides nos linfonodos axilares e mesentéricos, e no tecido linfoide associado ao intestino (GALT), a >5 mg/kg/dose IV e a 20 mg/kg/dose SC. Isso foi associado à celularidade folicular linfoide reduzida das células CD20+ e CXCR5+ no baço avaliadas por imuno-histoquímica, salvo 1 macho a 20 mg/kg/dose SC; porém, a exposição ao h11G2 XC154/XC155 afucosilado nesse animal pode ter sofrido impacto devido à prevalência de ADA do Dia 15 em diante. Além disso, houve menores números de células B, células CXCR5+ e células Tfh no baço quando da autópsia no Dia 58 em comparação aos controles veículo. Alguns animais exibiram menores números de células NK no baço em comparação aos controles. Ao fim da recuperação no Dia 401, os valores absolutos para cada subconjunto examinado em todos os animais que receberam a administração de h11G2 XC154/XC155 afucosilado foram dentro da faixa de valores para animais no grupo controle veículo, indicando a recuperação dos menores números relacionados ao h11G2 XC154/XC155 afucosilado durante a fase de dosagem do estudo.
[0474]A menor celularidade linfoide no baço e folículos linfoides nos linfonodos junto com os menores números de células B, células B CXCR5+ e células Tfh no baço tem relação com as reduções nos linfócitos e células B totais, células B CXCR5+ e células Tfh no sangue periférico a >5 mg/kg/dose IV e a 20 mg/kg/dose SC. Ao fim da fase de recuperação (Dia 401), não houve descobertas microscópicas relacionadas ao h11G2 XC154/XKC155 afucosilado no grupo de dose IV de 5 mg/kg, indicando assim a recuperação total. Essas descobertas condizem com a farmacologia do h11G2 XC154/XC155 afucosilado, cuja expectativa é que deplita células expressando o CXCR5. Os menores números de células NK no sangue periférico e/ou baço podem dever-se à morte de células efetoras NK, que foi descrita em células NK após a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (Warren et al., 2011, J. Immunol. Meth. 370:86-92) e/ou redistribuição nos tecidos; porém, outros mecanismos não podem ser excluídos.
[0475]Não houve nenhum efeito relacionado ao h11G2 XC154/KC155 afucosilado sobre a resposta dependente de células T do anticorpo (TDAR) primária à hemocianina de keyhole limpet (KLH). Observaram-se respostas da imunoglobulina (Ig)M e IgG anti-KLH em todos os grupos. Todos os macacos foram vacinados contra o toxoide tetânico (TT) antes de ser estudados. Maiores respostas de memória da IgM e IgG foram observadas em todos os animais em todos os grupos de dose. Reduções independentes da dose relacionadas ao h11G2 XC154/XC155 afucosilado na TDAR secundária contra o TT (valores de titulação de ponto central da IgG) foram observadas tanto em animais machos quanto em animais fêmeos nos grupos de 5 IV, 20 SC e/ou 200 IV mg/kg/dose 7, 14, 21 e 36 dias após a imunização. Reduções estatisticamente significativas no grupo significam que anticorpos IgG anti-TT foram observados para os grupos de 5 e 200 mg/kg/dose |V 7 dias após a imunização.
[0476]Após a imunização na fase de recuperação, houve respostas de memória da IgM e IgG anti-KLH em todos os animais no grupo de dose de 5 mg/kg de h11G2 XC154/XC155 afucosilado em 1 ou mais pontos no tempo que ficaram dentro da faixa do grupo controle veículo. Durante os pontos no tempo de recuperação, houve uma redução relacionada ao h11G2 XC154/XC155 afucosilado estatisticamente significativa nos valores de titulação no ponto central (CPT) grupais da IgG anti-TT observados nos animais do grupo de dose de 5 mg/kg 7 dias após a imunização na fase de recuperação. Todos os valores de CPT dos animais na fase de recuperação ficaram dentro da faixa do grupo controle com a exceção de 2 de 8 animais no grupo de dose de 5 mg/kg, que exibiram valores de CPT menores que a faixa controle em todos os pontos no tempo de recuperação até 28 dias após a imunização contra o TT na fase de recuperação. Não houve mudanças nos valores de IgM anti-TT que foram atribuídos à administração de h11G2 XC154/XKC155 afucosilado durante as fases de dosagem ou recuperação.
[0477]Houve respostas primárias da IgM e IgG anti-KLH em todos os grupos; alguns animais nos grupos de 5 e 200 mg/kg/dose exibiram as CPTs acima da faixa controle em 1 ou mais pontos no tempo após a imunização primária. Não houve diferenças estatisticamente significativas na média grupal de anticorpos da IgM ou IgG anti-KLH em nenhum um dos grupos em nenhum ponto no tempo. Como as mudanças nos animais individuais foram esporádicas, careceram de dependência da dose, e exibiram valores de CPT grupais na faixa dos animais controle, elas não foram consideradas relacionadas ao h11G2 XC154/XC155 afucosilado. Durante os pontos no tempo de recuperação, todos os animais mantiveram-se dentro da faixa controle com a exceção de 1 de 8 animais no grupo de dose de 5 mg/kg, que exibiram valores de CPT levemente abaixo da faixa controle em 14, 21 e 28 dias após a imunização contra a KLH. Esses dados (fase de dose ou recuperação) demonstram que todos os animais que receberam doses de h11G2 XC154/XC155 afucosilado (tanto machos quanto fêmeos) foram capazes de gerar respostas primárias da IgM e IgG para a imunização contra a KLH semelhantes aos animais controle.
[0478]Apesar das reduções notórias nas células B totais, células B CXCR5+, células similares a Tfh e células NK no sangue periférico e dos números notadamente menores de células B, células B CXCR5+ e células Tfh no baço, conforme detectado por imunofenotipagem, bem como das reduções na contagem de linfócitos e celularidade linfoide reduzida no baço, linfonodos e GALT, nenhum das descobertas foi não adversa devido à ausência de sinais clínicos associados e ausência de um efeito sobre a TDAR primária. Outras descobertas hematológicas, incluindo reduções nos parâmetros de glóbulos brancos totais, basófilos e glóbulos vermelhos, não foram adversas devido à gravidade limitada e ausência de correlatos microscópicos. Nenhuma descoberta microscópica e imuno-histoquímica relacionada ao h11G2 XC154/XC155 afucosilado foi observada no Dia 401, indicando assim a recuperação total.
[0479]O NOAEL para o h11G2 XC154/XKC155 afucosilado em macacos após a administração SC ou IV semana sim semana não por 2 meses foi de 200 mg/kg/dose. As exposições sistêmicas (Cmax e AUC'168) no NOAEL foram de 5.220 ugiml e 438.000 ug-h/mL, respectivamente. Anticorpos h11G2 XC154/KC155 afucosilados foram detectados neste estudo, e os dados são sumarizados em outra parte neste documento. Uma avaliação de risco das toxicidades no órgão alvo observadas no programa de toxicidade com doses repetidas é dada em outra parte neste documento. Concentrações limite do h11G2 XC154/KC155 afucosilado associadas a respostas chave em macacos podem ser encontradas em outra parte neste documento.
Toxicidade reprodutiva e desenvolvimental
[0480]Não houve efeitos relacionados ao artigo de teste nos tecidos reprodutores machos ou fêmeos avaliados no estudo de toxicidade com doses repetidas em macacos cinomolgos.
Tolerância local [0481 ]Estudos de tolerância local isolados com o h11G2 XC154/KC155 afucosilado não foram realizados, embora os sítios de injeção tenham sido examinados macroscópica e microscopicamente nos estudos de toxicidade in vivo.
[0482]No estudo exploratório em macacos, no sítio de injeção SC a 260 mg/kg/dose, houve infiltração perivascular moderada de diversas células leucocíticas (leucócitos mononucleares, netrófilos e, em menor número, eosinófilos) em comparação a infiltrados ínfimos a leves nos sítios de injeção SC dos animais controle. No 260 mg/kg/dose SC macho, o infiltrado estendeu-se multifocalmente na tônica muscular dos pequenos vasos. No 260 mg/kg/dose SC fêmeo, várias células gigantes multinucleadas infiltraram o colágeno subcutâneo, e não houve fragmentos intracitoplasmáticos basófilos e eosinófilos de material fibrilar nessas células. No estudo-pivô de 2 meses de duração em macacos, as descobertas microscópicas nos sítios de administração IV e SC não foram consideradas relacionadas ao artigo de teste.
Antigenicidade
[0483]A imunogenicidade foi avaliada medindo os níveis de ADA nos estudos de toxicidade com doses repetidas em macacos cinomolgos; esses dados foram descritos previamente neste documento.
Imunotoxicidade
[0484]Estudos in vitro e in vivo caracterizaram o efeito do h11G2 XC154/XC155 afucosilado sobre o sistema imunológico. O potencial do h11G2 XC154/XC155 afucosilado para induzir à liberação de citocinas (TNF-a, IL-6 e IFN-y)
foi determinado em ensaios de liberação de citocinas com seres humanos usando 2 formatos in vitro diferentes: um ensaio em fase solúvel usando sangue total e um ensaio em fase sólida usando h11G2 XC154/XKC155 afucosilado imobilizado e células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). Amostras de 8 doadores humanos saudáveis foram avaliadas em cada um desses formatos. Em ambos os formatos do ensaio de liberação de citocinas, observou-se a liberação de citocinas (TNF-a, IL-6 e IFN-y) induzida pelo h11G2 XC154/XKC155 afucosilado. Estudos de toxicidade exploratórios e pivô com doses repetidas in vivo em macacos caracterizaram o perfil de liberação de citocinas in vivo, bem como os efeitos do h11G2 XC154/XKC155 afucosilado sobre as células do sistema imunológico e os tecidos. O h11G2 XC154/XC155 afucosilado não induziu citocinas in vivo. Observou- se a depleção de linfócitos, células B, células B CXR5+ e células similares a Tfh/Tfh no sangue periférico e no baço de macacos que receberam a administração de h11G2 XC1I54/KC155 afucosilado, conforme descrito em outra parte neste documento, efeitos esses condizentes com o mecanismo de ação esperado de um anticorpo depletor do CXCR5. Após a fase de recuperação nos estudos de toxicidade exploratório e pivô, os parâmetros de linfócitos no baço e nos linfonodos foram equiparáveis aos controles veículo.
[0485]As respostas TDAR primária e secundária à KLH e ao TT, respectivamente, foram avaliadas no estudo de toxicidade pivô de 2 meses de duração conforme discutido em outra parte neste documento. Não houve efeitos relacionados ao h11G2 XC154/XC155 afucosilado sobre a TDAR primária à KLH. Todos os animais produziram uma resposta TDAR secundária ao TT, mas observaram-se reduções relacionadas ao h11G2 XC154/KC155 afucosilado nas titulações pontuais centrais para os grupos de 5 e 200 mg/kg/dose IV 7 dias após a imunização durante as fases de dosagem e recuperação do estudo.
Reatividade cruzada nos tecidos (TCR
[0486]O vasto trabalho de desenvolvimento do método preliminar, incluindo múltiplas rodadas e métodos, foi conduzido no estudo do método de coloração preliminar com o h11G2 XC154/XKC155 afucosilado. Nenhuma dessas condições de ensaio demonstrou uma coloração da membrana consistente nas células e tecidos esperados. No estudo de reatividade cruzada nos tecidos complacente com as GLP, avaliou-se a ligação do h11G2 XC154/XKC155 afucosilado biotinilado (h11G2 XC154/XKC155 afucosilado-Bio; 1 e 5 ugml) com criosseções de tecidos de macacos cinomolgos e seres humanos. Os padrões de coloração sobrepuseram-se entre os tecidos de macacos cinomolgos e seres humanos. A coloração comum tanto aos seres humanos quanto aos macacos foi observada em células mononucleares, células reticuloendoteliais, vários epitélios, células gliais e/ou pituícitos, representando a reatividade esperada do h11G2 XC154/KC155 afucosilado (Breitfeld et a/., 2000, J Exp Med 192(11):1545-1552; Carlsen et al, 2002, Gut 51(3):364-371;Flynn et al., 2003, J. Neuroimmunol. 136(1-2):84-93; Schaerli et a/., 2000, J. Exp. Med. 192(11):1553-1562; Schmutz et al., 2005, Arthritis Res. Ther. 7(2):R217-R229), bem como o coloide da tireoide. Observou-se a coloração positiva do h11G2 XC154/XKC155 afucosilado para outros tecidos de macacos ou seres humanos. No caso de tecidos humanos, observou-se a coloração para fibras nervosas no nervo óptico e neurônios nas raízes nervosas espinhais, miócitos lisos da próstata, células intersticiais nos testículos, e fibras do cristalino ocular.
[0487]Os tecidos que só coraram no macaco cinomolgo foram células precursoras hematopoiéticas na medula óssea, mastócitos da pele e colo do útero, neurófilos no cérebro e medula espinhal, miócitos cardíacos, e células fusoides na placenta e na bainha dos nervos ópticos. Embora isso possa representar uma reatividade cruzada inesperada do artigo de teste, a coloração foi de natureza citoplasmática, não exibiu especificidade microanatômica e careceu de uma clara coloração da membrana plasmática. Essa coloração citoplasmática diferencia precariamente células e tecidos que expressam e não expressam o CXCR5. Não era esperado que a coloração citoplasmática fosse acessível ao artigo de teste in vivo, e geralmente ela é considerada de pouca a nenhuma significância toxicológica (Hall et al., 2008, In: Preclinical Safety Evaluation of Biopharmaceuticals: A Science-Based Approach to Facilitating Clinical Trials, p. 208-240, Cavagnaro, J.A., ed., Wiley- Interscience; Leach et al., 2010, Toxicol. Pathol. 38(7):1138-1166). A carência de uma clara coloração da membrana sugere que um método robusto não foi obtenível para fazer uma avaliação completa. A carência de descobertas adversas no estudo de toxicidade de 2 meses de duração com doses repetidas sustenta que a coloração observada no estudo de reatividade cruzada nos tecidos ex vivo não se traduz em efeitos in vivo. Embora tenham-se feito múltiplas tentativas para obter um método de TCR robusto, a ligação observada não produziu nenhum problema de segurança além do esperado com base na farmacologia tencionada.
Relação de descobertas para a farmacocinética
[0488]As concentrações no soro do h11G2 XC154/XC155 afucosilado foram determinadas após a administração SC ou IV a macacos machos e fêmeos a doses de 5 (IV), 20 (SC), ou 200 (IV) mg/kg/dose a cada 2 semanas por 2 meses (total de 5 doses). Não houve diferenças relacionadas ao sexo aparentes nas exposições sistêmicas entre os grupos de dose; logo, os parâmetros de TK médios dos grupos são dados usando dados combinados de macacos cinomolgos tanto machos quanto fêmeos. A exposição sistêmica foi mais alta após a dosagem repetida, as razões de acúmulo (Dia de Estudo 43/Dia de Estudo 1) variando de cerca de 1,4 a 1,7. Além disso, as exposições sistêmicas aumentaram de maneira proporcional à dose após a dosagem IV. Após a dosagem SC, estimou-se a biodisponibilidade do h11G2 XC154/XC155 afucosilado em >50%.
[0489]As concentrações séricas limite do h11G2 XC154/XC155 afucosilado associadas a respostas chave e as margens de exposição calculadas contra essas respostas chave são dadas na Tabela 15. TABELA 15 Respostas chave Dose Cav Cmax Margem de (mg/kg/dose) | (ug/mL) | (ugh/mL) | exposição Estudos de toxicidade com doses repetidas Estudo de toxicidade de 17 dias de duração em macacos (1-2/sexo/dose) — Dosagem semanal (todas as descobertas não adversas Sangue periférico: | células B totais, | células B CXCR5+, | células similares a Tfh, | células NK; baço: | células B totais, | células B CXCR5+ totais, | células Tfh bona fide; | linfócitos; 1 laG; 40 (IV) 844 1020 208 baço: | celularidade (células CD20-positivas foliculares e células CXCR5-positivas); linfonodos e amígdala: | celularidade (nos linfonodos: células CD20-positivas foliculares Como acima ou mais, local de injeção: infiltração perivascular de células 260 (SC) 2810 3340 692 leucocíticas Como em 40 mg/kg/dose 400 (IV) 7500 9610 1850 Lo
Respostas chave Dose Cav Cmax Margem de (mg/kg/dose) | (ug/mL) | (ugh/mL) | exposição Estudo de toxicidade de 2 meses de duração em macacos (3-8/sexo/dose) — Dosagem quinzenal (todas as descobertas não adversas Sangue periférico: | células B totais, | células B CXCR5+, | células similares a Tfh, | células NK, | células T, | células T auxiliares, | células T citotóxicas, | WBC, | linfócitos, | basófilos, baço: | células B, | células B CXCR5+ totais, | células Tfh 5 (IV) 67,3 142 17 bona fide, | células NK; baço: | celularidade (células CD20+ foliculares e células CXCR5+); linfonodos e GALT: | celularidade linfoide; TDAR: resposta (de memória) secundária da IgG anti-TT Como acima ou mais, | ' 200 (IV) massa de glóbulos NOAEL 2610 5220 643 vermelhos
[0490]As abreviações usadas na Tabela 15 são conforme o seguinte: AUC = Área sob a curva concentração-tempo; Cay = Concentração média; Cmax = Concentração máxima (média) no plasma; células similares a Tfh (como alternativa, cTfh); CXCR5 = Receptor de quimiocinas do tipo 5; GALT = Tecido linfoide associado ao intestino; IgG = Imunoglobulina G; IV = Intravenosa; NK = Exterminadora natural; NOAEL = Nenhum nível de efeitos adversos observado; SC= Subcutânea; TDAR = Resposta dependente de células T do anticorpo; Tfh = Células T auxiliares foliculares; TT = Toxoide tetânico; WBC = Glóbulos brancos.
[0491]Nos estudos com doses repetidas, os valores de Cmax indicam concentrações médias no plasma. Os valores de Cav são calculados dividindo a AUC pelo intervalo de amostragem (48 ou 168 horas). Os valores divulgados foram obtidos próximos ao fim da fase de dosagem.
[0492]As margens de exposição foram calculadas dividindo os valores de Cav nos estudos de toxicidade em animais pela Cay humana prevista de 4,06 ug/mL à dose humana eficaz prevista de 30 mg, IV.
Toxicidade no órgão alvo
[0493]Com base nos estudos não clínicos realizados, o sistema hemolinfopoiético (baço, linfonodos, GALT, amígdala, linfócitos circulantes, glóbulos brancos, parâmetros de glóbulos vermelhos, liberação de citocinas in vitro) foi identificado como órgãos/tecidos alvo em potencial. No estudo não pivô de 17 dias de duração em macacos realizado com o h11G2 XC154/XKC155 afucosilado, as mudanças relacionadas ao artigo de teste nesses tecidos foram condizentes com as observadas no estudo de toxicidade pivô de 2 meses de duração. Todas as descobertas relacionadas ao h11G2 XC154/KC155 afucosilado retornaram de maneira parcial ou total aos valores de referência ou do grupo controle veículo durante a fase de recuperação nos estudos de toxicidade não pivô e pivô. Nenhum dos efeitos relacionados ao artigo de teste foi considerado adverso, devido à ausência de quaisquer descobertas clínicas ou infecções oportunistas, e devido ao ínfimo impacto sobre a função imunológica medida pelo ensaio de TDAR. Logo, estabeleceu-se um NOAEL de 200 mg/kg/dose IV em macacos para efeitos relacionados ao h11G2 XC154/XC155 afucosilado.
Sistema hemolinfopoiético
[0494]EmM estudos de toxicidade com doses repetidas em macacos cinomolgos, observaram-se reduções relacionadas ao h11G2 afucosilado XC154/XC155 nos linfócitos do sangue periférico a doses de >5 mg/Kkg/dose (IV) e mg/kg/dose (SC), a começar no Dia de Estudo 2. Essas reduções correlacionam- se a reduções observadas nas células B totais, células B CXCR5+ e células similares a Tfh, que persistiram até o Dia 57. Reduções nesses subconjuntos de linfócitos demonstraram o retorno total ou parcial aos valores de referência até o fim da fase de recuperação no estudo de toxicidade exploratório. Houve também reduções relacionadas ao h11G2 XC154/XC155 afucosilado em células NK, células T totais, células T auxiliares e células T citotóxicas a >5 mg/kg/dose, começando no Dia 2, mas o retorno parcial a total aos valores de referência foi obtido até o fim da fase de dosagem. Além de reduções nas populações de linfócitos no sangue periférico, observaram-se reduções transientes ínfimas na massa de RBCs para macacos fêmeos que receberam 200 mg/kg/dose no Dia 6.
[0495]A redução das populações de linfócitos no sangue periférico está atrelada à redução da celularidade linfoide relacionada ao h11G2 XC154/XKC155 afucosilado no baço e linfonodos a >5 mg/kg/dose. A redução da celularidade linfoide refletiu em menores números de células B totais, células B CXCR5+, células Tfh bona fide e células NK, e em menores células CD20+ e CXCR5+ foliculares no baço. Observou-se menor celularidade linfoide folicular nos linfonodos e GALT a >5 mg/kg/dose e nas amígdalas a >40 mg/kg/dose.
[0496]Após a fase de recuperação nos estudos de toxicidade exploratório e pivô, os parâmetros de linfócitos no baço e nos linfonodos foram equiparáveis aos controles veículo.
[0497]As reduções nas células B totais, células B CXCR5+ e células Tfh/similares a Tfh condizem com o mecanismo de ação esperado do h11G2 XC154/XC155 afucosilado, cuja expectativa é que deplita células expressando o CXCR5. Os menores números de células NK no sangue periférico e no baço devem- se provavelmente à morte de células efetoras, que sabidamente ocorre nas células NK após a ADCC.
[0498]Embora tenham-se observado reduções nos parâmetros de linfócitos no sangue periférico e no baço de macacos que receberam o h11G2 XC154/XKC155 afucosilado, não houve nenhum efeito relacionado ao h11G2 XC154/KC155 afucosilado na TDAR primária à KLH. Todos os animais produziram uma TDAR secundária ao TT, mas observaram-se reduções estatisticamente significativas a doses de >5 mg/kg/dose.
[0499]Todas as descobertas relacionadas ao h11G2 XC154/KC155 afucosilado foram consideradas não adversas devido à falta de sinais clínicos associados ou infecções oportunistas. Os efeitos do h11G2 XC154/KC155 afucosilado nos linfócitos do sangue periférico, células B totais, células B CXCR5+, células similares a Tfh e células NK, bem como nas respostas TDAR primária e secundária, podem ser monitorados em seres humanos na clínica.
[0500]Em ambos os formatos de ensaio de liberação de citocinas in vitro solúvel e sólido, observou-se a liberação de citocinas (TNF-a, IL-6 e IFN-y) induzida pelo h11G2 XC154/XC155 afucosilado. A liberação de citocinas induzida pelo h11G2 XC154/XC155 afucosilado in vitro é esperada devido à farmacologia que se espera dessa molécula. O h11G2 XC154/XKC155 afucosilado não induziu à liberação de citocinas nos estudos exploratório ou pivô em macacos in vivo. As citocinas no soro e indicadores clínicos da liberação sistêmica de citocinas são prontamente monitorados na clínica.
TABELA 16 (SEQUÊNCIAS) Os resíduos de aminoácido nas CDRs são sublinhados Nome Número do Sequência Identificador de Sequência 1162 VL SEQ ID Nº: 1 | DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASESVEY. humanizado (h) HGTSLMHWYQQKPGKAPKLLIVAASNVESGV (XC154) PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQ
QOSRKVPWTFGQGTKVEIK
Nome Número do Sequência Identificador de Sequência CDR-L1 do SEQ ID Nº: 2 | ESVEYHGTS h11G2 VL XC154 CDR-L2 do SEQ ID Nº: 3 ) AASNVESG h11G2 VL (XC154) CDR-L3 do SEQ ID Nº: 4º) QOSRKVPWT h11G2 VL XC154 h11G2 VL SEQ ID Nº: 5 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVEY (XC153) HGTSLMHWYQQKPGKAPKLLIYAASNVESGV
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLAQPEDFATYFCQ
OQOSRKVPWTFGQGTKVEIK h11G2 VH SEQ ID Nº: 6 | EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTD (XC155) FYMSWVRQAPGKGLEWVGFIRNKANGYTTE
YSASVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAED
TAVYYCARVYGSTLHYWGQGTLVTVSS CDR-H1 do SEQ ID Nº: 7 | GETFTDFY h11G2 VH (XC155) também XC156
Nome Número do Sequência Identificador de Sequência CDR-H2 do SEQ ID Nº: 8 | IRNKANGYT h11G2 VH (XC155) também XC156 CDR-H3 do SEQ ID Nº: 9º! ARVYGSTLHY h11G2 VH (XC155) h11G2 VH SEQ ID Nº: 10 |) EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTD (XC156) FYMSWVRQAPGKGLEWVGFIRNKANGYTTE
YSASVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAED
TAVYYCVRVYGSTLHYWGQGTLVTVSS CDR-H3 do SEQ ID Nº: 11 VRVYGSTLHY h11G2 VH (XC156) h11G2 VH SEQ ID Nº: 12 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTD (XC157) FYMSWVRQAPGKGLEWVGFIRNKANGYTTE
YSASVKGRFTISRDNAKSSLYLQMNSLRAED
TAVYYCVRVYGSTLHYWGQGTLVTVSS h41A10 VL SEQ ID Nº: 13 | DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVNY| (XC142) HWYQQKPGKAPKRLIYETSRLASGVPSRFSG
SGSGTDYTLTISSLAQPEDFATYYCQQWSSNP LTFGQGTKVEIK
Nome Número do Sequência Identificador de Sequência CDR-L1 do SEQ ID Nº: 14 | SSVNY h41A10 VL XC142 CDR-L2 do SEQ ID Nº: 15 ETSRLASG h41A10 VL (XC142) CDR-L3 do SEQ ID Nº: 16 QOWSSNPLT h41A10 VL XC142 h41A10 VH SEQ ID Nº: 17 EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFR (XC148) SYGMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGTYTFY
PDILKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTA
VYYCARRGEDYRGALEHWGQGTLVTVSSA h41A10 VH SEQ ID Nº: 18) EVOQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFR (XC147) SYGMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGTYTFY
PDILKGRITISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTA
VYYCARRGEDYRGALEHWGQGTLVTVSSA CDR-H1 do SEQ ID Nº: 19 | GETFRSYG h41A10 VH (XC147) igual a XC148
Nome Número do Sequência Identificador de Sequência CDR-H2 do SEQ ID Nº: 20 ISSGGTY h41A10 (XC147) igual a XC148 CDR-H3 do SEQ ID Nº: 21 ARRGEDYRGALEH h41A10 (XC147) igual a XC148 Cadeia Leve SEQ ID Nº: 22 | DVWVVVTOSPDSLAVSLGQRATISCRASESVEY quimérica de HGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNVESG comprimento total VPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEGDIAMYFC (cLC) do c11G2 QQASRKVPWTFGGGTKLEIKrtvaapsvfifppsdeq! ksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalgsgnsqgesvteqd (VL de skdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnra camundongo em ec* caixa alta e região constante kappa humana em caixa baixa) * indica o códon de parada
Nome Número do Sequência Identificador de Sequência
Cadeia pesada SEQ ID Nº: 23 |) EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTD quimérica de FEYMSWVRQPPGRALEWLGFIRNKANGYTTE comprimento total YSASVKGRFTISRDNSQSILYLQMNTLRAGDS (cHC) do c11G2 ATYYCVRVYGSTLHYWGQGTILTVSSastkgps vfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvht (VH de fpavlgssalysIssvvtvpssslIgtgtyicnvnhkpsntkvdkk camundongo em vepkscdkthtcppcpapellggpsvfifopkpkdtimisrtpev caixa alta e região tevvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreegynstyr constante da IgG1 vvsvltulhgdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqpre humana em caixa pavytippsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesnggpe baixa) nnykttppvidsdasfflyskIltvdksnwaggnvíscsvmheal hnhytakslslspg* * indica o códon de parada cadeia leve SEQ ID Nº: 24 | QIVLTASPAVMSASPGEKVTMTCSASSSVNY| quimérica do HWYQQKSGTSPKRWIYETSRLASGVPVRFS C41A10 GSGSGTSYSLTISTMEAEDAATYYCQQWSS
NPLTFGAGTKLELKrtvaapsvfifppsdeglksgtasvv * indica o códon cllnnfypreakvqwkvdnalgsgnsqgesvtegdskdstysls de parada stltiskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec*
Nome Número do Sequência Identificador de Sequência cadeia pesada SEQ ID Nº: 25, EVOLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFRS quimérica do YGMSWVRQTPDKRLEWVATISSGGTYTFYP C41A10 DILKGRITISRDNAKNTLYLQMSNLKSEDTAM
YYCARRGEDYRGALEHWGQGTSVTVSSastk (VH de gpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgalts camundongo em gvhtfpavlgssalysIssvvtvpssslgtatyicnvnhkpsntkv caixa alta e região dkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvfIfppkpkdtimisrt constante da IgG1 pevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyn humana em caixa styrvvsvltvlhadwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgq baixa) prepqvytlippsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesng qpennykttppvldsdasfflyskltvdksrnwgggnvísesvm * indica o códon healhnhytakslsIspg* de parada Cadeia leve SEQ ID Nº: 26 | DVWVVWVVTQSPDSLAVSLGQRATISCRASESVEY quimérica de HGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNVESG comprimento total VPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEGDVSMFFC (cLC) do c5H7 QQASRKVPWTFGGGTKLEIKrtvaapsvfifppsdeq!
ksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalgsgnsqgesvteqd * indica o códon skdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnra de parada ec*
Nome Número do Sequência Identificador de Sequência
Cadeia pesada SEQ ID Nº: 27 EVKLVESGGGLVQPGDSLRLSCATSGFTFTD quimérica de FYMSWVRQPPGRALEWLGFIRNKANGYTTE comprimento total YSASVKGRFTISRDNSQSILYLQMNTLRAGDS (cHC) do c5H7 ATYYCVRVYGSTLHYWGQGTILTVSSastkgps vfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvht (VH de fpavlgssalysIssvvtvpssslIgtgtyicnvnhkpsntkvdkk camundongo em vepkscdkthtcppcpapellggpsvfifopkpkdtimisrtpev caixa alta e região tevvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreegynstyr constante da IgG1 vvsvltulhgdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqpre humana em caixa pavytippsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesnggpe baixa) nnykttppvidsdasfflyskIltvdksnwaggnvíscsvmheal hnhytakslslspg* * indica o códon de parada Cadeia leve SEQ ID Nº: 28 | DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASESVEY completa do HGTSLMHWYQQKPGKAPKLLIYAASNVESGV h11G2 (XKC154) PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ
SRKVPWTFGQGTKVEIKrtvaapsvfifppsdeqlksg (VL indicada tasvvcllnnfypreakvqwkvdnalgsgnsqgesvtegdskd pelas letras em styslsstltlskadyekhkvyacevthqaglsspvtksfnrgec caixa alta e CK indicada pelas letras em caixa baixa
Nome Número do Sequência Identificador de Sequência
CADEIA PESADA | SEQ ID Nº: 29 EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTD de comprimento EYMSWVRQAPGKGLEWVGFIRNKANGYTTE total do h11G2 YSASVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAED (XC155) TAVYYCARVYGSTLHYWGQGTLVTVSSastkg psvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsg (VL indicada vhtfpavigssalysIssvvtvpsssligtatyicnvnhkpsntkvd pelas letras em kkvepkscdkthtcppcpapellggpsvfifpopkpkdtImisrtp caixa alta e Fc da evtevvwvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreegyns IgG1 indicado tyrvvsvltulhgdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgq pelas letras em prepqvytlippsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesng caixa baixa) qpennykttppvldsdasfflyskltvdksrwaggnvíscsvm healhnhytaksls!spg Domínio de SEQ ID Nº: 30 | rtivaapsvfifopsdeglksgtasvvcllnnfypreakvqwkvd Cadeia Leve nalgsgnsqesvtegdskdstyslsstltlskadyekhkvyace Constante kappa vthaglsspvtksfnrgec (CK) humano
Nome Número do Sequência Identificador de Sequência Fc da IgG SEQ ID Nº: 31 | astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsg humana do tipo altsgvhtfpavigssglysIssvvtvpssslgtatyicnvnhkps selvagem (inclui ntkvdkkvepkscdkthtcppcpape//ggpsvfIfppkpkdtl uma porção da misrtpevtevvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpre CrHlea eqyNSTyrvvsvltvlhgdwlngkeykckvsnkalpapiekti dobradiça, Ch2 e skakgaprepavytlppsreemtkngvsltclvkgfypsdiave CH3) wesngapennykttppvldsdasfflyskltvdksrwaggnvf scsvmhealhnhytakslslspg A sequência de função efetora da LLGG do tipo selvagem é indicada em itálico Sítio de glicosilação ligado por N da Asn297
NST
Nome Número do Sequência Identificador de Sequência CXCR5 humano SEQ ID Nº: 32 MNYPLTLEMDLENLEDLFWELDRLDNYNDTS
LVENHLCPATEGPLMASFKAVFVPVAYSLIFL (os resíduos de LGVIGNVLVLVILERHRQTRSSTETFLFHLAVA aminoácidos de DLLLVFILPFAVAEGSVGWVLGTFLCKTVIALH ligação com KVNFYCSSLLLACIAVDRYLAIVHAVHAYRHR epítopo cruciais RLLSIHITCEGTIWLVGFLLALPEILFAKVSQGH do h11G2L1I1 e HNNSLPRCTFSQENQAETHAWFTSRFLYHV D22 são AGFLLPMLVMGWCYVGVVHRLRQOAQRRPQ indicados em RQKAVRVAILVTSIFFLOCWSPYHIVIFLDTLARL itálico e negrito) KAVDNTCKLNGSLPVAITMCEFLGLAHCCLN
PMLYTFAGVKFRSDLSRLLTKLGCTGPASLC
QLFPSWRRSSLSESENATSLTTF CXCR5 SEQ ID Nº: 33 | MNYPLMLEMDLENLEDLFLEFDKFDNYNDTS cinomolgo LVENHLCPATEGPLMASFKAVFVPVAYSLIFL
LGVIGNVLVLVILERHRQTRSSTETFLFHLAVA DLLLVFILPFAVAEGSVGWVLGTFLCKTVIALH KVNFYCSSLLLACIAVDRYLAIVHAVHAYRHR RLLSIHITCEGTIWLVGFLFALPEILFAKVSQAHP NNSLPRCTFSQENQAETHAWFTSRFLYHVA GFLLPMLVMGWCYVGVVHRLROAQRRPOR QKAVRVAILVTSIFFLOCWSPYHIVIFLDTLVRLK AVDNTCELNGSLPVAITMCEFLGLAHCCLNP MLYTFAGVKFRSDLSRLLTKLGCTGPASLCQ LFPSWRKSSLSESENATSLTTF
Nome Número do Sequência Identificador de Sequência CXCR5 de SEQ ID Nº: 34. MNYPLTLDMGSITYNMDDLYKELAFYSNSTEI| camundongo PLQDSNFCSTVEGPLLTSFKAVFMPVAYSLIF
LLGMMGNILVLVILERHRHTRSSTETFLFHLA VADLLLVFILPFAVAEGSVGWVLGTFLCKTVIA LHKINFYCSSLLLACIAVDRYLAIVHAVHAYRR RRLLSIHITCTAIWLAGFLFALPELLFAKVGQP HNNDSLPQCTFSQENEAETRAWFTSRFLYHI GGFLLPMLVMGWCYVGVVHRLLOAQRRPQ RQKAVRVAILVTSIFFLOCWSPYHIVIFLDTLERL KAVNSSCELSGYLSVAITLCEFLGLAHCCLNP MLYTFAGVKFRSDLSRLLTKLGCAGPASLCQ
LFPNWRKSSLSESENATSLTTF 11G2 VL de SEQ ID Nº: 35 DVVVTOSPDSLAVSLGQRATISCRASESVEY camundongo HGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNVESG
VPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEGDIAMYFC
QQASRKVPWTFGGGTKLEIK 11G2 VH de SEQ ID Nº: 36, EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTD camundongo FYMSWVRQPPGRALEWLGFIRNKANGYTTE
YSASVKGRFTISRDNSQSILYLQMNTLRAGDS
ATYYCVRVYGSTLHYWGQGTILTVSSA 41A10 VL de SEQ ID Nº: 37 | QIVLTASPAVMSASPGEKVTMTCSASSSVNY| camundongo HWYQQKSGTSPKRWIYETSRLASGVPVRFS
GSGSGTSYSLTISTMEAEDAATYYCQQWSS NPLTFGAGTKLELK
Nome Número do Sequência Identificador de Sequência 41A10 VH de SEQ ID Nº: 388) EVOLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFRS camundongo YGMSWVRQTPDKRLEWVATISSGGTYTFYP
DILKGRITISRDNAKNTLYLQMSNLKSEDTAM
YYCARRGEDYRGALEHWGQGTSVTVSSA 5H7 VL de SEQ ID Nº: 39 | DVWVVVTASPDSLAVSLGQRATISCRASESVEY. camundongo HGTSLMHWYQQKPGQPPKLLIYAASNVESG
VPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEGDVSMFFC
QQASRKVPWTFGGGTKLEIK 5H7 VH de SEQ ID Nº: 40) EVKLVESGGGLVQPGDSLRLSCATSGFTFTD camundongo FYMSWVRQPPGRALEWLGFIRNKANGYTTE
YSASVKGRFTISRDNSQSILYLQMNTLRAGDS
ATYYCVRVYGSTLHYWGQGTILTVSSA 2C9 SEQ ID Nº: 41 | DIVNMTOSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYS
SNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRDS Cadeia Leve GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLOAEDVAVYY CHQYLSSYTFGGGTKVE|Krtvaapsvflfppsdeg! (VL indicada ksgtasvvcliInnfypreakvqwkvdnalgsgnsqgesvteqd pelas letras em skdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqgglsspvtksfnrg caixa alta e o ec* domínio CK indicado pelas letras em caixa baixa
Nome Número do Sequência Identificador de Sequência cadeia pesada do | SEQ ID Nº: 42 | EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFST 2C9 NAMNWVRQAPGKGLERVARIRSKSNNYATY (VL indicada YADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTED pelas letras em TAVYYCVTMIPEAYWGQGTLVTVSSastkgpsvf caixa alta e a plapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfp região constante avlgssalysIssvvtvpssslgtatyicnvnhkpsntkvdkkve indicada pelas pkscdkthtcppcpapellggpsvfIfpopkpkdtlImisrtpevte letras em caixa vvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreegynstyrv baixa) vsvltvlhgdwIingkeykckvsnkalpapiektiskakggprep qvytlippsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqgpen nykttppvldsdgsfflyskltvdksrwaggnvíscsvmhealh nhytaksls|spg* Cadeia leve do SEQ ID Nº: 43 | DIVNMTOAAPSVAVTPGASVSISCRSSKSLLHS 16D7 SGKTYLYWFLORPGQOSPAQLLIYRLSSLASGV
PDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCM QHLEYPYTFGGGTKLEIKrtvaapsvfifopsdeglks gtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalgsgnsqgesvtegdsk dstyslsstltiskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec*
Nome Número do Sequência Identificador de Sequência Cadeia pesada do | SEQ ID Nº: 44 | QVQLKESGPGLVAPSESLSITCTVSGFSLIDY 16D7 GVNWIRQPPGKGLEWLGVIWGDGTTYYNPS (VL indicada LKSRLSISKDNSKSQVFLKVTSLTTDDTAMYY pelas letras em CARIVYWGQGTLVTVSAastkgpsvfplapsskstsg caixa alta e a gtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlassalys! região constante ssvvtvpsssligtatyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtc indicada pelas ppcpapellggpsvfIfopkpkdtimisrtpevtcvvvdvshed letras em caixa pevkfnwyvdgvevhnaktkpreegynstyrvvsvltvulhgd baixa) wingkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsr eemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqgpennykttppvl dsdgsfflyskltvdksnwgggnvíscsvmhealhnhytaksls Ispg* Cadeia leve do SEQ ID Nº: 45 | QPVLTAQPPSVSKDLRQTATLTCTGNSNNVGN 11A7 QGATWLAOQHAGHPPKLLSYKNNNRPSGISE
RFSASRSGNTASLTITGLQPEDEADYYCSAW DSSLSAWVFGGGTQLTVLGAPKaapsvtlfppsse elgankatlvclisdfypgavivawkadsspvkagvetttpskq snnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvapte cs*
Nome Número do Sequência Identificador de Sequência Cadeia pesada do | SEQ ID Nº: 46 EVQOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVS 11A7 SNYMSWVRQOAPGKGLEWVSVIYSGGSTYYA
DSVKGRFTISRHNSKNTLYLQMNSLRAEDTA WVYYCARGYVVWGOQGTLVTVSSastkgpsvíplap sskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlq ssglysLssvvtvpsssligtatyicnvnhkpsntkvdkkvepks cdkthtcppcepapellggpsvflfppkpkdtimisrtpevtevvv dvshedpEvkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvl twlhgdwIngkeykckvsnkalpapiektiskakggprepqvyt Ippsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesnggpennykt tppvldsdasfflyskltvdksrwaggnvfscsvmhealhnhyt qgkslIslspg h11G2 VL SEQ ID Nº: 47 | DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASESVEY (XC151) HGTSLMHWYQQKPGKAPKLLIYAASNVESGV
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQOPEDFATYYCQ
QSRKVPWTFGQGTKVEIK h116G2 VL SEQ ID Nº: 48 | DVOMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASESVEY (XC346) HGTSLMHWYQQKPGKAPKLLIYAASNVESGV
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLAOPEDFATYYCQ OQOSRKVPWTFGQGTKVEIK
Nome Número do Sequência Identificador de Sequência h11G2 VL SEQ ID Nº: 49” DVQOVTOAOSPSSLSASVGDRVTITCRASESVEY (XC347) HGTSLMHWYQQKPGKAPKLLIYAASNVESGV
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQOPEDFATYYCQ
QOSRKVPWTFGQGTKVEIK h11G6G2 VL SEQ ID Nº: 50 DVQVTOAOSPSSLSASVGDRVTITCRASESVEY (XC348) HGTSLMHWYQQKPGKAPKLLIYAASNVESGV
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLAPEDFATYFCQ
QOSRKVPWTFGQGTKVEIK h11G2 VL SEQ ID Nº: 51 | DIQVTAOSPSSLSASVGDRVTITCRASESVEYH (XC349) GTSLMHWYQQKPGKAPKLLIYAASNVESGVP
SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ
SRKVPWTFGQGTKVEIK h11G2 VH SEQ ID Nº: 52) EVOLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTD (XC152) FYMSWVRQAPGKGLEWLGFIRNKANGYTTE
YSAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTED
TAVYYCVRVYGSTLHYWGQGTLVTVSSAS h11G2 VH SEQ ID Nº: 53) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTD (XC350) FYMSWVRQAPGKGLEWVAFIRNKANGYTTE
YSASVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAED
TAVYYCARVYGSTLHYWGQGTLVTVSS 11G2 VH (XKC351) | SEQID Nº: 54 | EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTD
FYMSWVRQAPGKGLEWLGFIRNKANGYTTE YSASVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAED TAVYYCVRVYGSTLHYWGQGTLVTVSS
Nome Número do Sequência Identificador de Sequência 11G2 VH (XC352) | SEQID Nº: 55, EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTD
FYMSWVRQAPGKGLEWVAFIRNKANGYTTE YSASVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAED
TAVYYCARVYGSTLHYWGQGTLVTVSS h11G2 VH SEQ ID Nº: 56, EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTD (XC353) FYMSWVRQAPGKGLEWVAFIRNKANGYTTE
YSASVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAED
TAVYYCVRVYGSTLHYWGQGTLVTVSS h11G2 VH SEQ ID Nº: 57 EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTD (XC354) FYMSWVRQAPGKGLEWLGFIRNKANGYTTE
YSASVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAED
TAVYYCARVYGSTLHYWGQGTLVTVSS h41A10 VL SEQ ID Nº: 58! DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVNY| (XC143) HWYQQAKPGKAPKRWIYETSRLASGVPSRFS
GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSN
PLTFGQGTKVEIK h41A10 VL SEQ ID Nº: 59 DIQLTASPSSLSASVGDRVTITCSASSSVNY| (XKC144) HWYQQKPGKAPKRLIYETSRLASGVPSRFSG
SGSGTDYTLTISSLOPEDFATYYCQQWSSNP
LTFGQGTKVEIK h41A10 VL SEQ ID Nº: 60 | digltaspsslsasvadrvtitesasssvnyihwyggkpgkapk (XKC145) mniyetsrlasgvpsrísgsgasg Tdytitiss|gpedfatyycaa wssnpltfgggtkveik
Nome Número do Sequência Identificador de Sequência h41A10 VL SEQ ID Nº: 61 | digmtaspsslIsasvadrvtitesasssvnyihwyggkpgkap (XC146) krliyetsrlasgvpsrfsgsgsgtadftitisslapedfatyycaqw ssnpltfgggtkveik h41A10 VL SEQ ID Nº: 62 | digmtaspssIsasvgadrvtitesasssvnyihwyggkpgkap (XC149) Klliyetsrlasgvpsrfsgsgsgtdftitiss|gpedfatyycaqws snpltfgggtkveik h41A10 VH SEQ ID Nº: 63 | evalvesggalvapagsiriscaasgftfrsygmswvrgapgk (XC150) glewvatissgatytfypdsvkgrftisrdnaknslylgmnslrae dtavyycarrgedyrgalehwgggtlvtvssas
TGTTAGGCTGTTGGTGCTG AGACACACTCCTG(C/T)TATGGGT CACTCAGGTCCTGG(C/G)GTTG Iniciador 5' VL4 SEQ ID Nº: 67 | ATCACGCGGCCGCCTCACCATGAGG(A/G)C CCCTGCTCAG(AIT)TT(C/IT)TTGG(A/C)(AIT)T cTTG | Iniciador 5' VL5 | SEQ ID Nº: 688 ATCACGCGGCCGCCTCACCATGGATTT(A/T) CAGGTGCAGATT(A/T)TCAGCTTC Iniciador 5' VL6 SEQ ID Nº: 69 | ATCACGCGGCCGCCTCACCATGAGGT(G/T) C(CIT(CIT)TS(C/IT)T(G/C)AG(CIT)T(CIT)ICTG( G/AJGG
Nome Número do Sequência Identificador de Sequência Iniciador 5' VL7 SEQ ID Nº: 70 | ATCACGCGGCCGCCTCACCATGGGC(AIT)T CAAGATGGAGTCACA(G/T)(A/T(C/T)(C/T)C( AIT)GG Iniciador 5' VL8 SEQ ID Nº: 71 | ATCACGCGGCCGCCTCACCATGTGGGGA(C IT)CT(G/T)TTT(C/T)C(A/C(A/C)TTTTTCAATT
G C(ATD)CA(C/G)CTCAGTTCCOTTG TTTGTTGTCTATTTCT CAGCTCAGCTTCTCTTCC
CCAG CAT(C/G)TTCTTC ATCAT(C/G)(C/D)TCT | Iniciador 5º VH3 | SEQ ID Nº: 78, ACTAGCGGCCGCATGAAG(A/T)TGTGGTTA
AACTGGGTTTTTT Iniciador 5 VH4 SEQ ID Nº: 79 | ACTAGCGGCCGCATG(A/G)ACTTTGGG(C/T) TCAGCTTG(A/G)TTT
TTTAGTTTTCCTT
Nome Número do Sequência Identificador de Sequência Iniciador 5' VH6 SEQ ID Nº: 81 | ACTAGCGGCCGCATGGCTGTC(C/T)T(G/AJG C/G)GCT(G/A)JCTETTCETGC | Iniciador 5' VH7 | SEQ ID Nº: 82 ACTAGCGGCCGCATGG(A/G)ATGGAGC(G/T GG(A/G)TCTTT(C/A)TCTT
TITGTG A(A/C)ICTTGCTATTCCOTG TITTITATITG TCATTCCTG
CTGTACCTG Iniciador 3' VH SEQ ID Nº: 88 | GCGGGGTGTCGTCGACGCTG(A/C)(G/AJGAG AC(G/AJGTGA
Nome Número do Sequência Identificador de Sequência Região constante | SEQID Nº: 89º ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD da IgG1 humana YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGL
YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV DKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS
VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Região constante | SEQ ID Nº: 90 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNF da cadeia leve YPREAKVQWKVDNALQOSGNSQESVTEQDSK kappa humana DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQOG
CK LSSPVTKSFNRGEC Linha germinativa | SEQ ID Nº: 91 | EVOLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS DP-54 VH YWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYY humana exibindo VDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDT a região de AVYYCARYFDYWGQGTLVTVSS framework (subgrupo VH3 ) com um segmento JH4
Nome Número do Sequência Identificador de Sequência framework de SEQ ID Nº: 93) DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSY DPK9 de linha LNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLAOSGVPSRFS germinativa VL GSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCQQOSYST humana PLTFGGGTKVEIK (subgrupo VKI) com um segmento JK4 Sequência de SEQ ID Nº: 95 | ACATCCAGATGACCCAGAGCCCTTCCAGCC ácido nucleico TGAGCGCTTCCGTGGGAGATAGGGTGACC que codifica o ATCACCTGCAGGGCCAGCGAGTCCGTGGA h11G2 VL GTACCACGGCACCAGCCTGATGCACTGGT (XC154) ACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAG
CTGCTGATCTACGCCGCCAGCAACGTGGA GAGCGGCGTGCCTAGCAGATTCAGCGGCA GCGGAAGCGGCACCGACTTCACCCTGACC ATTAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGC CACCTACTACTGTCAGCAGAGCAGGAAGGT GCCCTGGACCTTCEGGCCAGGGCACCAAGG TCGAGATCAAG
Nome Número do Sequência Identificador de Sequência Sequência de SEQ ID Nº: 96 | GAGEGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAG ácido nucleico GACTGGTGCAGCCTGGCGGAAGCCTGAGA que codifica o CTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCOTT h11G2 VH TACCGACTTCTACATGAGCTGGGTGAGGCA (XC155) GGCTCCCGGCAAAGGACTGGAGTGGGTGG
GTTTCATCAGGAACAAGGCCAACGGCTACA CCACCGAGTATAGCGCCTCCGTGAAGGGC AGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAA GAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCT GAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACT GCGCCAGAGTGTACGGCAGCACACTGCAC TACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGT GAGCAGCGCG
Nome Número do Sequência Identificador de Sequência Sequência de SEQ ID Nº: 97 | GACATCCAGATGACCCAGAGCCCTTCCAG ácido nucleico CCTGAGCGCTTCCGTGGGAGATAGGGTGA que codifica a CCATCACCTGCAGGGCCAGCGAGTCCGTG Cadeia Leve de GAGTACCACGGCACCAGCCTGATGCACTG comprimento total GTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCA (LC) do h11G2 AGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAACGTG (XC154) GAGAGCGGCGTGCCTAGCAGATTCAGCGG
CAGCGGAAGCGGCACCGACTTCACCCTGA o domínio CCATTAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTC constante é GCCACCTACTACTGTCAGCAGAGCAGGAA indicado pelas GGTGCCCTGGACCTTCGGCCAGGGCACCA letras em caixa AGGTCGAGATCAAGcgtacggtgagctacaccatetat baixa cttcatettecegecatctgatgagcagttgaaatctagaactge ctcetgttatatacctgctgaataacttctateccagagaggecaa agtacagtggaaggtggataacgccctecaategggtaactec caggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacct acagccteagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactac gagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatraggg cetgagctegecegtcacaaagagcettcaacagaggagagta ttag
Nome Número do Sequência Identificador de Sequência Sequência de SEQ ID Nº: 98 ) GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAG Ácido Nucleico GACTGGTGCAGCCTGGCGGAAGCCTGAGA que codifica a CTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACCOTT cadeia pesada de TACCGACTTCTACATGAGCTGGGTGAGGCA comprimento total GGCTCCCGGCAAAGGACTGGAGTGGGTGG (HC) do h11G2 GTTTCATCAGGAACAAGGCCAACGGCTACA (XC155) CCACCGAGTATAGCGCCTCCGTGAAGGGC
AGGTTCACCATCAGCAGGGACAACGCCAA o domínio GAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCT constante é GAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACT indicado pelas GCGCCAGAGTGTACGGCAGCACACTGCAC letras em caixa TACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGT baixa GAGCAGCgcgtcegaccaagggccecateggtettececeta gcacccetectecaagagcacetetaggggcacageggeccta gactgcctggteaaggactacttececcegaacegagtgacagtat cgtggaactcaggegeccetgaccageggegtgcacacetice cagctgtectacagitccteaggactetacteceteageagegta gtgacegtgecectecagcagetigggcacecagacctacatet gcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggatggacaa gaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgceca cegtgeccagcacetgaactectaggagggacegtceagtettect cttccecececaaaacecaaggacacccteatgateteceggace cetgaggteacatgcgtagtagtagacgtgagecacgaagac cctgaggteaagtteaactagtacgtagacgagegtagaggtac ataatgccaagacaaagcegegggaggagcagtacaacag cacgtaccgtgtaggtcagegtecteacegicetacaccaggact
Nome Número do Sequência Identificador de Sequência sequência de SEQ ID Nº: 99 | gegtegaccaagggcececateggatetteceectageacectecte ácido nucleico caagagcacctetaggggcacageggcecctaggactaccetagt que codifica o Fc caaggactacttccecgaaceggtgacggtategtggaactea da IgG humana ggcgeccetgaccageggegtgcacaccttcecagetatectac do tipo selvagem agtccteaggactetacteceteagcagegtagtgacegigece tccagcagcettgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatc acaagcccagcaacaccaaggtagacaagaaagttgagec caaatcttgtgacaaaactcacacatgcccacegigeceagea cetgaactectagggggacegtcagtettectettecececaaa acccaaggacacccteatgatetececggacecetgaggteac atgcgtagtggtagacgtgagecacgaagaccctgaggtceaa gtteaactaggtacgtagacggcgtagagatacataatgccaag acaaagccegegggaggagcagtacaacagcacgtaccegta taggtcagegtecteacegtectagcaccaggactagctgaatag caaggagtacaagtgcaaggtctecaacaaageceteceag cccccategagaaaaccatetecaaagecaaagggeagece cgagaaccacaggtgtacaccetgceeecatcecgggagga gatgaccaagaaccaggtcagcctgacctacctggtcaaagg cttctateccagegacategeegtagagtaggagagcaataga cagcceggagaacaactacaagaccacacctecegtaetaga cteegacggctecttettectetatagcaageteacegtggacaa gagcaggtggcagcaggggaacgtcetteteatgctecgtaata catgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagectetec ctgtcccegggttga
Nome Número do Sequência Identificador de Sequência sequência de SEQIDN*º: | cgtacggtagetacaccatetgatetteatettecegecatetgata ácido nucleico 100 agcagttgaaatctggaactgacctctattgtatacctactgaata que codifica o acttctateceagagaggccaaagtacagtggaaggtagata domínio constante acgcccetecaategagtaacteccaggagagtgteacagage Kappa humano do aggacagcaaggacagcacctacagccteageageacect tipo selvagem gacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtetac (CK) gcctgegaagteacecateagggectgagetegecegticaca aagagcttcaacaggggagagtattag
[0500]Embora os ensinamentos revelados tenham sido descritos com referência a várias aplicações, métodos, kits e composições, apreciar-se-á que várias mudanças e modificações podem ser feitas sem divergir dos ensinamentos neste documento nem da invenção reivindicada abaixo. Os exemplos acima foram dados para melhor ilustrar os ensinamentos revelados e não visam a limitar o âmbito dos ensinamentos introduzidos neste documento. Embora tenham-se descrito os presentes ensinamentos em termos dessas modalidades exemplificativas, os versados na técnica entenderão prontamente que inúmeras variações e modificações — dessas “modalidades exemplificativas são possíveis sem experimentação indevida. Todas essas variações e modificações encontram-se dentro do âmbito dos presentes ensinamentos.
[0501]Todas as referências citadas neste documento, incluindo patentes, pedidos de patente, artigos, livros e seus semelhantes, e as referências citadas nesses, na medida em que ainda não tenham sido incorporadas, são incorporadas ao presente documento por referência na íntegra para todos os fins. Caso uma ou mais literaturas ou materiais semelhantes incorporados difiram deste pedido ou o contradigam; incluindo, entre outros, com relação a termos definidos, uso de termos, técnicas descritas, ou algo do gênero, este pedido prevalecerá.
[0502]Ficará evidente aos versados na técnica que várias modificações e variações podem ser feitas à presente invenção sem divergir do âmbito nem da essência da mesma. Outras modalidades da invenção transparecerão aos versados na técnica levando-se em consideração o relatório descritivo e a prática da invenção revelada neste documento. Tenciona-se que o relatório descritivo e os exemplos sejam considerados meramente à guisa de exemplo, sendo o verdadeiro âmbito e essência da invenção indicados nas reivindicações a seguir.

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Anticorpo isolado, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, CARACTERIZADO por ligar-se especificamente ao CXCR5, em que o anticorpo é ao menos um anticorpo selecionado dentre o grupo composto por: a) um anticorpo com uma CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2; uma CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 3; uma CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 4; uma CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 7; uma CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 8; e uma CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 9; b) um anticorpo com uma CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 2; uma CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 3; uma CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 4; uma CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 7; uma CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 8; e uma CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 11; c) um anticorpo com uma CDR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 14; uma CDR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 15; uma CDR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 16; uma CDR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 19; uma CDR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 20; e uma CDR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 21; d) um anticorpo com uma VL que compreende uma sequência de aminoácidos codificada pelo inserto do plasmídeo depositado junto à ATCC com nº de Acesso PTA-124324 e uma VH que compreende uma sequência de aminoácidos codificada pelo inserto do plasmídeo depositado junto à ATCC com nº de Acesso PTA-124323;
    e) um anticorpo com uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1 e uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 6;
    f) um anticorpo com uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 13 e uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 18;
    g) um anticorpo com uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 47 e uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 52;
    h) um anticorpo com uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 5 e uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 6;
    i) um anticorpo com uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 5 e uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 10;
    j) um anticorpo com uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 13 e uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 17;
    k) um anticorpo com uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1 e uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 12;
    1) um anticorpo com uma LC que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 22 e uma HC que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 23;
    m) um anticorpo com uma LC que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 24 e uma HC que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 25; n) um anticorpo com uma LC que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 26 e uma HC que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 27; o) um anticorpo com uma LC que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 28 e uma HC que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 29; Pp) um anticorpo com uma VL codificada pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nº: 95 e uma VH codificada pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nº: 9%; e q) um anticorpo com uma LC codificada pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nº: 97 e uma HC codificada pela sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nº:
    98.
    2. Anticorpo isolado, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, CARACTERIZADO por ligar-se especificamente ao receptor de quimiocinas C-X-C 5 (CXCR5), em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, é ao menos um anticorpo selecionado dentre o grupo composto por: a) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se a um epítopo do hoXCR5 que compreende leucina no resíduo de aminoácido número 11, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32, mas não se liga ao referido epítopo quando o referido resíduo não é leucina; b) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se a um epítopo do hCXCR5 que compreende leucina no resíduo de aminoácido número 11, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32, mas não se liga ao referido epítopo quando o referido resíduo é treonina;
    c) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se a um epítopo do hoXCR5 que compreende aspartato no resíduo de aminoácido número 22, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32, mas não se liga ao referido epítopo quando o referido resíduo não é aspartato;
    d) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se a um epítopo do hoXCR5 que compreende aspartato no resíduo de aminoácido número 22, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32, mas não se liga ao referido epítopo quando o referido resíduo é alanina;
    e) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se a um epítopo do hoXCR5 que compreende leucina no resíduo de aminoácido número 11 e aspartato no resíduo de aminoácido número 22, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32, mas não se liga ao referido epítopo quando a referida leucina é substituída por treonina e/ou o referido aspartato é substituído por alanina;
    f) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se a um hoXCRS5, ou fragmento do mesmo, que compreende leucina no resíduo de aminoácido número 11, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32, mas não se liga a um hOCXCR5, ou fragmento do mesmo, em que o referido resíduo não é leucina;
    9) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se a um hoXCR5, ou fragmento do mesmo, que compreende leucina no resíduo de aminoácido número 11, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32, mas não se liga a um hCXCR5, ou fragmento do mesmo, em que o referido resíduo é treonina;
    h) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se a um hoXCRS5, ou fragmento do mesmo, que compreende aspartato no resíduo de aminoácido número 22, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32, mas não se liga a um hoXCR5, ou fragmento do mesmo, em que o referido resíduo não é aspartato; i) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se a um hoXCRS5, ou fragmento do mesmo, que compreende aspartato no resíduo de aminoácido número 22, de acordo com a numeração da sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32, mas não se liga a um hoXCRS5, ou fragmento do mesmo, em que o referido resíduo é alanina; e j) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se a um hoXCRS5, ou fragmento do mesmo, que compreende leucina no resíduo de aminoácido número 11 e aspartato no resíduo de aminoácido número 22, de acordo com a sequência de aminoácidos do SEQ ID Nº: 32, mas não se liga a um hOCXCRS5, ou fragmento do mesmo, em que a referida leucina é substituída por treonina e/ou o aspartato é substituído por alanina.
    3. Anticorpo isolado, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, CARACTERIZADO por ligar-se especificamente ao receptor de quimiocinas C-X-C 5 (CXCRS5), em que o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, é ao menos um anticorpo selecionado dentre o grupo composto por: a) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se ao hoXCR5 expresso em células B humanas com uma afinidade aparente de uma EC50 de cerca de 6,60 pM com um desvio padrão de cerca de mais ou menos 2,33 pM; b) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se ao hoXCR5 expresso em células similares a células T auxiliares foliculares humanas circulantes com uma afinidade aparente de uma EC50 de cerca de 5,89 pM com um desvio padrão de cerca de mais ou menos 1,40 pM;
    c) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se ao hoXCR5 expresso em células similares a células T auxiliares foliculares humanas (Tfh) com uma afinidade aparente de uma EC50 de cerca de 10,6 pM;
    d) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se ao cinoCXCR5 expresso em células B do macaco cinomolgo com uma afinidade aparente de uma EC50 de cerca de 1,32 pM;
    e) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se ao cinoCXCR5 expresso em células similares a Tfh do macaco cinomolgo com uma afinidade aparente de uma EC50 de cerca de 10,5 pM;
    f) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que antagoniza a sinalização de CXCR5-CXCL13 em um ensaio-repórter com CAMP com uma ECB50 de cerca de 961 pM;
    g) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que exibe atividade de ADCC contra células B humanas que expressam o hoXCR5 com uma ECB50 de cerca de 2,01 pM com um desvio padrão de cerca de mais ou menos 2,28 pM;
    h) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que exibe atividade de ADCC contra células similares a Tfh humanas que expressam o hCXCR5 com uma EC50 de cerca de 4,28 pM com um desvio padrão de cerca de mais ou menos 2,88 pM;
    i) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que exibe atividade de ADCC contra células Tfh humanas que expressam o hoXCR5 com uma ECB50 de cerca de 0,11 pM;
    j) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que exibe atividade de ADCC contra células B do macaco cinomolgo que expressam o cinoCXCR5 com uma EC50 de cerca de 15,3 pM com um desvio padrão de cerca de mais ou menos 11,7 pM;
    k) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se ao hoXCR5 mas não se liga de maneira detectável aos receptores de quimiocinas humanos CCR1, CCR2, CCR3, CCRA4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CMKLR1, CXCR3R1, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR6, CXCR7 e XCR1; 1) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que inibe a ligação do CXCR5 com o CXCL13.
    m) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se a células B humanas CXCR5+ com uma afinidade aparente de uma EC50 de menos que cerca de 26 pM, mas não se liga a células que expressam ortólogos de camundongo, rato ou coelho do CXCR5; n) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que antagoniza a inibição do CXCL13 à liberação de CAMP provocada pela forscolina; o) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que provoca a ADCC de células que expressam o CXCR5 em PBMCs de doadores humanos e cinomolgas e TMCs de doadores humanos; Pp) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se ao CXCR5 humano mas não se liga aos receptores de quimiocinas humanos CCR1, CCR2, CCR3, CCRA4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR1I0, CMKLRI1, CXCR3R1, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCRA4, CXCR6, CXCR7 ou XCR1; q) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que depleta células B no sangue periférico; r) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que depleta células similares a Tfh no sangue periférico; s) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que depleta células Tfh bona fide no baço; e t) um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que debilita a resposta da memória imunológica humoral.
    4. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, exibe ao menos uma das atividades biológicas a seguir: a) liga-se a células B humanas CXCR5+ com uma afinidade aparente de uma EC50 de menos que cerca de 26 pM, mas não se liga a células que expressam ortólogos de camundongo, rato ou coelho do CXCR5; b) antagoniza a inibição do CXCL13 à liberação de CAMP provocada pela forscolina; c) provoca a ADCC de células que expressam o CXCR5 em PBMCs de doadores humanos e cinomolgas e TMCs de doadores humanos; d) liga-se ao CXCR5 humano mas não se liga aos receptores de quimiocinas humanos CCR1, CCR2, CCR3, CCRA4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCRIO, CMKLR1, CXCR3R1, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR6, CXCR7 ou XCR1; e) depleta células B no sangue periférico; f) depleta células similares a Tfh no sangue periférico; g) depleta células Tfh bona fide no baço; ou h) debilita a resposta da memória imunológica humoral.
    5. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, é afucosilado.
    6. Ácido nucleico isolado CARACTERIZADO por codificar o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5.
    7. Ácido nucleico isolado CARACTERIZADO por codificar a VH, VL ou ambas de um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga-
    se especificamente ao CXCR5, em que o referido ácido nucleico compreende: a sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nº: 95, a sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nº: 96, ou ambas.
    8. Ácido nucleico isolado CARACTERIZADO por codifica a cadeia pesada, cadeia leve ou ambas de um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga-se especificamente ao CXCR5, em que o referido ácido nucleico compreende: a sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nº: 97, a sequência de ácido nucleico de SEQ ID Nº: 98, ou ambas.
    9. Ácido nucleico isolado CARACTERIZADO por codificar a VH, VL ou ambas de um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que liga- se especificamente ao CXCR5, em que o referido ácido nucleico compreende a sequência de ácido nucleico do inserto do plasmídeo depositado junto à ATCC e com nº de Acesso PTA-124323, a sequência de ácido nucleico do inserto do plasmídeo depositado junto à ATCC e com nº de Acesso PTA-124324, ou ambas.
    10. Vetor CARACTERIZADO por compreender o ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações de 6 a 9.
    11. Célula hospedeira CARACTERIZADA por compreender o vetor de acordo com a reivindicação 10.
    12. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADA por ser uma célula de um mamífero selecionada dentre o grupo composto por uma célula CHO, uma célula COS, uma célula HEK-293, uma célula NSO, uma célula PER.C6€ ou uma célula Sp2.0.
    13. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADA por carecer de uma alfa-1,6-fucosiltransferase (FUT8) funcional.
    14. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADA por ser uma célula CHOK1ISV Potelligent& ou uma célula CHO Lec13.
    15. Método CARACTERIZADO por produzir um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que compreende a célula CHOK1ISV Potelligent& de acordo com a reivindicação 14, sob uma condição em que o referido anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, é expresso pela referida célula hospedeira e é afucosilado.
    16. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO por compreender ainda isolar o referido anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo.
    17. Anticorpo afucosilado, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO por exibir uma atividade de ADCC intensificada em comparação a um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, que é fucosilado, mas fora isso idêntico.
    18. Composição farmacêutica CARACTERIZADA por compreender um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 e 17, e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
    19. Anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 e 17, e composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADOS por ser usados no tratamento de uma doença, transtorno ou condição autoimune.
    20. Uso de um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 e 17, ou de uma composição farmacêutica, de acordo com a revindicação 18, CARACTERIZADO por tratar uma doença, transtorno ou condição imunológica.
    21. Método para tratar ou prevenir uma doença, transtorno ou condição imunológica mediada pelo CXCR5 em um paciente humano que dele necessita, o referido método sendo CARACTERIZADO por compreender administrar ao paciente uma quantidade eficaz da composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 18, em que a referida doença, transtorno ou condição é selecionada dentre o grupo composto por respostas inflamatórias tais como doenças inflamatórias da pele incluindo psoríase e dermatite (por exemplo, dermatite atópica); dermatomiosite; esclerodermia e esclerose sistêmica; respostas associadas a doença inflamatória intestinal (tal como doença de Crohn e colite ulcerativa); síndrome do desconforto respiratório (incluindo síndrome do desconforto respiratório adultaá ARDS); dermatite; meningite; encefalite; uveite; colite; gastrite; glomerulonefrite; condições alérgicas tais como eczema e asma e outras condições que envolvem infiltração de células T e respostas inflamatórias crônicas; aterosclerose; deficiência na adesão leucocitária; artrite reumatoide (RA); lúpus eritematoso sistêmico (LES); diabetes melito (por exemplo, diabetes melito tipo 1 ou diabetes melito dependente de insulina); esclerose múltipla; síndrome de Raynaud; tireoidite autoimune; encefalomielite alérgica; síndrome de Sjógren; diabetes com início na juventude; e respostas imunológicas associadas a hipersensibilidade aguda e retardada mediada por citocinas e linfócitos T encontrados tipicamente na tuberculose, sarcoidose, polimiosite, granulomatose e vasculite; doença de Wegener; anemia perniciosa (doença de Addison); doenças que envolvem diapedese leucocitária; transtorno inflamatório no sistema nervoso central (SNC); síndrome da lesão de múltiplos órgãos; anemia hemolítica (incluindo, entre outros, crioglobinemia ou anemia positiva para Coombs); miastenia grave; doenças mediadas pelo complexo antígeno- anticorpo; doença anti-membrana basal glomerular; síndrome antifosfolipídica; neurite alérgica; doença de Graves; síndrome miastênica de Lambert-Eaton; penfigoide bolhoso; penfigoide; poliendocrinopatias autoimunes; vitiligo; doença de Reiter; síndrome da pessoa rígida; doença de Bechet; artrite de células gigantes; nefrite do complexo imunológico; nefropatia por IgA; polineuropatias por IgM; púrpura trombocitopênica imunológica (ITP) ou trombocitopenia autoimune e doenças hemolíticas autoimunes; tireoide de Hashimoto; hepatite autoimune; hemofilia autoimune; síndrome linfoproliferativa autoimune (ALPS); uveoretinite autoimune; síndrome de Guillain-Barré; síndrome de Goodpasture; doença mista do tecido conjuntivo; infertilidade associada a autoimunidade; poliarterite nodosa; alopecia areata; mixedema idiopático; doença do enxerto contra hospedeiro; distrofia muscular (Duchenne, Becker, Miotônica, Cinturas, Facioscapulohumeral, Congênita, Oculofaríngea, Distal, Emery-Dreifuss) e controle da proliferação de células do câncer que expressam o CXCRS5, tais como os cânceres de pâncreas, intestino grosso e bexiga, leucemia de células T e leucemia de células B.
    22. Método, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida doença é o LES ou a artrite reumatoide.
    23. Uso de um anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 ou 17, CARACTERIZADO por se dar na fabricação de um medicamento para tratar uma doença, transtorno ou condição imunológica.
    24. Método para detectar o CXCR5 em uma amostra, tecido ou célula usando o anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, o método sendo CARACTERIZADO por colocar a amostra, tecido ou célula em contato com o anticorpo e detectar o anticorpo.
    25. Método para reduzir a atividade biológica do CXCR5 em um paciente que dele necessita, o referido método sendo CARACTERIZADO por administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 ou 17, ou da composição farmacêutica de acordo com qualquer a reivindicação 18.
    26. Método, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo medeia a depleção de ao menos uma célula que expressa o
    CXCR5 selecionada dentre o grupo composto por uma célula Tfh no baço, uma célula B no sangue periférico e uma célula similar a Tfh no sangue periférico.
    27. Método para inibir uma resposta imunológica humoral em um paciente que dele necessita, o método sendo CARACTERIZADO por compreender administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo, ou fragmento de ligação com antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 ou 17, ou da composição farmacêutica de acordo com qualquer a reivindicação 18.
    28. Método, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo medeia a depleção de ao menos uma célula que expressa o CXCRS5 selecionada dentre o grupo composto por uma célula Tfh no baço, uma célula B no sangue periférico e uma célula similar a Tfh no sangue periférico.
BR112020010753-0A 2017-12-01 2018-11-28 anticorpos anti-cxcr5 e composições e usos dos mesmos BR112020010753A2 (pt)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762593830P 2017-12-01 2017-12-01
US62/593,830 2017-12-01
US201862732985P 2018-09-18 2018-09-18
US62/732,985 2018-09-18
PCT/US2018/062829 WO2019108639A1 (en) 2017-12-01 2018-11-28 Anti-cxcr5 antibodies and compositions and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112020010753A2 true BR112020010753A2 (pt) 2020-11-24

Family

ID=64734144

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112020010753-0A BR112020010753A2 (pt) 2017-12-01 2018-11-28 anticorpos anti-cxcr5 e composições e usos dos mesmos

Country Status (16)

Country Link
US (2) US10875915B2 (pt)
EP (1) EP3717516A1 (pt)
JP (2) JP7391839B2 (pt)
KR (1) KR20200092328A (pt)
CN (1) CN111615520A (pt)
AU (1) AU2018375331A1 (pt)
BR (1) BR112020010753A2 (pt)
CA (1) CA3025536A1 (pt)
CO (1) CO2020006453A2 (pt)
IL (1) IL274809A (pt)
MX (2) MX2020005662A (pt)
PE (1) PE20210554A1 (pt)
PH (1) PH12020550908A1 (pt)
SG (1) SG11202003930YA (pt)
TW (1) TWI830711B (pt)
WO (1) WO2019108639A1 (pt)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200092328A (ko) 2017-12-01 2020-08-03 화이자 인코포레이티드 항-cxcr5 항체 및 그의 조성물 및 용도
WO2023010483A1 (en) * 2021-08-05 2023-02-09 Hifibio (Hk) Limited Anti-human cxcr5 antibody and uses thereof
US10822379B1 (en) * 2020-03-12 2020-11-03 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Molecules that bind to SARS-CoV-2
CN111995674B (zh) * 2020-09-03 2022-02-11 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 抗COVID-19病毒中和抗体mhC3及其人源化抗体与应用
CN112684185B (zh) * 2020-12-25 2024-01-12 苏州旭光科星抗体生物科技有限公司 一种可溶性b7-h4定量检测试剂盒及其应用
EP4288455A1 (en) 2021-02-03 2023-12-13 Mozart Therapeutics, Inc. Binding agents and methods of using the same
WO2023076876A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 Mozart Therapeutics, Inc. Modulation of immune responses to viral vectors

Family Cites Families (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0092918B1 (en) 1982-04-22 1988-10-19 Imperial Chemical Industries Plc Continuous release formulations
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5128326A (en) 1984-12-06 1992-07-07 Biomatrix, Inc. Drug delivery systems based on hyaluronans derivatives thereof and their salts and methods of producing same
US4754065A (en) 1984-12-18 1988-06-28 Cetus Corporation Precursor to nucleic acid probe
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US4880078A (en) 1987-06-29 1989-11-14 Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha Exhaust muffler
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
WO1991005548A1 (en) 1989-10-10 1991-05-02 Pitman-Moore, Inc. Sustained release composition for macromolecular proteins
CA2071867A1 (en) 1989-11-06 1991-05-07 Edith Mathiowitz Method for producing protein microspheres
CA2109528A1 (en) 1991-05-01 1992-11-02 Gregory A. Prince A method for treating infectious respiratory diseases
CA2103059C (en) 1991-06-14 2005-03-22 Paul J. Carter Method for making humanized antibodies
US5912015A (en) 1992-03-12 1999-06-15 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Modulated release from biocompatible polymers
US5934272A (en) 1993-01-29 1999-08-10 Aradigm Corporation Device and method of creating aerosolized mist of respiratory drug
US6132764A (en) 1994-08-05 2000-10-17 Targesome, Inc. Targeted polymerized liposome diagnostic and treatment agents
ATE252894T1 (de) 1995-01-05 2003-11-15 Univ Michigan Oberflächen-modifizierte nanopartikel und verfahren für ihre herstellung und verwendung
US6019968A (en) 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
EP0850051A2 (en) 1995-08-31 1998-07-01 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Composition for sustained release of an agent
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
AU2063197A (en) 1996-03-04 1997-09-22 Massachusetts Institute Of Technology Materials and methods for enhancing cellular internalization
US5985309A (en) 1996-05-24 1999-11-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US5874064A (en) 1996-05-24 1999-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Aerodynamically light particles for pulmonary drug delivery
US5855913A (en) 1997-01-16 1999-01-05 Massachusetts Instite Of Technology Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery
US6056973A (en) 1996-10-11 2000-05-02 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic liposome composition and method of preparation
ATE287257T1 (de) 1997-01-16 2005-02-15 Massachusetts Inst Technology Zubereitung von partikelhaltigen arzneimitteln zur inhalation
DE69830315T2 (de) 1997-06-24 2006-02-02 Genentech Inc., San Francisco Galactosylierte glykoproteine enthaltende zusammensetzungen und verfahren zur deren herstellung
US5989463A (en) 1997-09-24 1999-11-23 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Methods for fabricating polymer-based controlled release devices
SE512663C2 (sv) 1997-10-23 2000-04-17 Biogram Ab Inkapslingsförfarande för aktiv substans i en bionedbrytbar polymer
WO1999022764A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
JP2002510481A (ja) 1998-04-02 2002-04-09 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗体変異体及びその断片
ATE458007T1 (de) 1998-04-20 2010-03-15 Glycart Biotechnology Ag Glykosylierungs-engineering von antikörpern zur verbesserung der antikörperabhängigen zellvermittelten zytotoxizität
JP2002518432A (ja) 1998-06-24 2002-06-25 アドバンスト インハレーション リサーチ，インコーポレイテッド 吸入器から放出される大多孔性粒子
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
CA2704600C (en) 1999-04-09 2016-10-25 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. A method for producing antibodies with increased adcc activity
JP4668498B2 (ja) 1999-10-19 2011-04-13 協和発酵キリン株式会社 ポリペプチドの製造方法
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
HU231090B1 (hu) 2000-10-06 2020-07-28 Kyowa Kirin Co., Ltd. Antitest-kompozíciót termelő sejt
CA2838062C (en) 2001-08-03 2015-12-22 Roche Glycart Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
WO2003048731A2 (en) 2001-12-03 2003-06-12 Abgenix, Inc. Antibody categorization based on binding characteristics
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
JPWO2003085118A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物の製造方法
US20040259150A1 (en) 2002-04-09 2004-12-23 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method of enhancing of binding activity of antibody composition to Fcgamma receptor IIIa
JPWO2003084569A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物含有医薬
BR0309145A (pt) 2002-04-09 2005-02-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk Células das quais o genoma é modificado
AU2003236020B2 (en) 2002-04-09 2009-03-19 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Cell with depression or deletion of the activity of protein participating in GDP-fucose transport
WO2003084570A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Medicament contenant une composition d'anticorps appropriee au patient souffrant de polymorphisme fc$g(g)riiia
AU2003251471A1 (en) * 2002-08-06 2004-02-25 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with human cxc chemokine receptor 5(cxcr5)
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
US8512701B2 (en) * 2002-11-15 2013-08-20 Morehouse School Of Medicine Anti-CXCL13 and anti-CXCR5 antibodies for the prevention and treatment of cancer and cancer cell migration
TWI335821B (en) 2002-12-16 2011-01-11 Genentech Inc Immunoglobulin variants and uses thereof
KR101250818B1 (ko) 2002-12-24 2013-04-15 리나트 뉴로사이언스 코프. 항-ｎｇｆ 항체 및 그것을 이용하는 방법
US20080241884A1 (en) 2003-10-08 2008-10-02 Kenya Shitara Fused Protein Composition
EP1705251A4 (en) 2003-10-09 2009-10-28 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd PROCESS FOR PRODUCING ANTIBODY COMPOSITION BY RNA INHIBITION OF FUNCTION OF $ G (A) 1,6-FUCOSYLTRANSFERASE
CN1871359B (zh) 2003-10-22 2010-11-17 凯克研究生院 使用单倍体交配策略在酵母中合成异聚多亚基多肽的方法
WO2005044859A2 (en) 2003-11-05 2005-05-19 Glycart Biotechnology Ag Cd20 antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function
JPWO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
US7923538B2 (en) 2005-07-22 2011-04-12 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Recombinant antibody composition
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
JP5071942B2 (ja) 2007-01-24 2012-11-14 協和発酵キリン株式会社 エフェクター活性が増強された遺伝子組換え抗体組成物
US20080199481A1 (en) 2007-02-21 2008-08-21 Astrazeneca Ab Compounds
NO2195023T3 (pt) * 2007-08-29 2018-08-04
WO2010028795A1 (en) * 2008-09-10 2010-03-18 F. Hoffmann-La Roche Ag Multivalent antibodies
WO2012010582A1 (en) 2010-07-21 2012-01-26 Roche Glycart Ag Anti-cxcr5 antibodies and methods of use
MX356671B (es) 2010-08-05 2018-06-08 Seattle Genetics Inc Métodos para inhibir fucosilación de proteína in vivo utilizando análogos de fucosa.
JP6097690B2 (ja) 2010-09-02 2017-03-15 ヴァクシネックス， インコーポレイテッド 抗ｃｘｃｌ１３抗体およびそれを用いる方法
US9534054B2 (en) 2013-05-02 2017-01-03 Ares Trading S.A. Monoclonal antibody directed against CXCR5
EP3683314A1 (en) 2013-10-07 2020-07-22 Prestige Biopharma Pte. Ltd. Bicistronic expression vector for antibody expression and method for producing antibody using same
SG11201701375TA (en) * 2014-08-22 2017-03-30 Sorrento Therapeutics Inc Antigen binding proteins that bind cxcr5
US10647756B2 (en) 2015-05-18 2020-05-12 Pfizer Inc. Humanized antibodies
KR20200092328A (ko) 2017-12-01 2020-08-03 화이자 인코포레이티드 항-cxcr5 항체 및 그의 조성물 및 용도

Also Published As

Publication number Publication date
KR20200092328A (ko) 2020-08-03
AU2018375331A1 (en) 2020-05-14
MX2020005662A (es) 2020-08-20
CO2020006453A2 (es) 2020-06-09
CA3025536A1 (en) 2019-06-01
US20190169283A1 (en) 2019-06-06
JP2021503888A (ja) 2021-02-15
US11958901B2 (en) 2024-04-16
MX2022015258A (es) 2023-01-11
IL274809A (en) 2020-07-30
CN111615520A (zh) 2020-09-01
US10875915B2 (en) 2020-12-29
WO2019108639A1 (en) 2019-06-06
JP2024020194A (ja) 2024-02-14
TWI830711B (zh) 2024-02-01
JP7391839B2 (ja) 2023-12-05
SG11202003930YA (en) 2020-05-28
RU2020121591A (ru) 2022-01-04
US20210101970A1 (en) 2021-04-08
PE20210554A1 (es) 2021-03-17
PH12020550908A1 (en) 2021-05-17
TW201925226A (zh) 2019-07-01
EP3717516A1 (en) 2020-10-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11958901B2 (en) Anti-CXCR5 antibodies and compositions and uses thereof
US11474112B2 (en) Tumor necrosis factor-like ligand 1A specific antibodies and compositions and uses thereof
JP6230488B2 (ja) アンタゴニスト抗ｉｌ−７受容体抗体および方法
US11359024B2 (en) Anti-AVB8 antibodies and compositions and uses thereof
JP7449390B2 (ja) 抗ｅ－セレクチン抗体、組成物および使用の方法
US20220112291A1 (en) CD1a ANTIBODIES AND USES THEREOF
RU2798422C2 (ru) Антитела против cxcr5 и их композиции и применение
US20240117030A1 (en) Multispecific antibodies and uses thereof
US20240052047A1 (en) Anti- il27r antibodies and methods of use thereof
US20230406951A1 (en) Anti-tnfr2 antibodies and methods of use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]
B25G Requested change of headquarter approved

Owner name: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA (US) ; PFIZER, INC. (US)