KR20200012860A - 글리피칸 3을 특이적으로 인식하는 구축물 및 그의 용도 - Google Patents

글리피칸 3을 특이적으로 인식하는 구축물 및 그의 용도 Download PDF

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쟈비어 모레일스
요코 나카노
홍 리우
징이 시앙
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Abstract

본 출원은 글리피칸 3(GPC3), 예컨대 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티를 포함하는 작제물을 제공한다. 또한, 이러한 작제물의 제조 및 사용 방법이 제공된다.

Description

글리피칸 3을 특이적으로 인식하는 구축물 및 그의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 4월 26일자로 출원된 미국 가출원 제62/490,586호에 대한 우선권을 주장하며, 이의 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
ASCII 텍스트 파일로의 서열 목록의 제출
ASCII 텍스트 파일로의 하기 제출의 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독가능 형태(CRF)(파일명: 750042001240SEQLIST.txt, 기록일: 2018년 4월 24일, 크기: 395 KB).
기술분야
본 발명은 글리피칸 3(GPC3)을 특이적으로 인식하는 항체 작제물, 이의 제조 방법, 및 질병의 치료 및 진단을 포함한 이의 용도에 관한 것이다.
글리피칸 3(GPC3, 이는 SGB, DGSX, MXR7, SDYS, SGBS, OCI-5, SGBS1, GTR2-2로도 알려짐)은 다수의 암 유형에서 과발현되는 세포 표면 단백질로서, 이러한 암 유형에는 많은 고체 종양, 예컨대 간세포 암종(HCC), 흑색종(문헌[Nakatsura T et al., Clin Cancer Res. 2004]), 폐 편평 세포 암종(문헌[Yu X et al., Genet Mol Res. 2015]), 난소 암종(문헌[Stadlmann S et al., Int J Gynecol Pathol. 2007]), 난황낭 종양, 융모막암종(문헌[Zynger DL et al., Am J Surg Pathol. 2006]), 빌름스 종양, 및 지질육종(문헌[Baumhoer D et al., Am J Clin Pathol. 2008])이 포함된다. GPC3을 과발현하는 것들을 포함하는 다양한 암에 대한 요법의 개발에 대한 의학적 요구가 남아 있다.
GPC3 유전자는 X 염색체 상에 위치하며, 580개의 아미노산(aa)의 70 kDa 전구체 단백질을 인코딩한다. 이러한 전구체 단백질은 Arg358과 Cys359 사이에서 푸린(Furin)에 의해 절단되고, 이황화물 결합에 의해 연결된 40 kDa N-말단 하위단위 및 30 kDa C-말단 하위단위를 생성할 수 있다. 성숙 GPC3은 세포막에 가까운 C-말단 영역 상에 2개의 헤파린 설페이트(HS) 사슬을 갖는 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 앵커에 의해 세포 표면에 부착된다. 헤파린 설페이트 프로테오글리칸 패밀리의 구성원으로서, GPC3은 인간 배아에서 널리 발현되는 종양태아성 단백질이며, 신호전달 인자(예컨대, Wnt, 헤지호그 신호전달 등)와의 상호작용을 통해 형태형성 또는 성장을 조절한다. GPC3은 정상 성인 간에서는 발현되지 않지만; 간 발암 동안, GPC3이 HCC 환자에서 재활성화되는 것으로 보고되어 있다. Yamauchi N et al.은 정상 간 조직, 비신생물성 간 조직, 및 신생물성 간 조직에서의 GPC3 발현을 조사하였으며, GPC3은 HCC 환자의 84%(47명/56명)에 존재하였지만, 정상 성인 간, 간경변증 또는 간염에서는 부재하였다(문헌[Yamauchi N et al., Modern Pathology 2005]). 유사한 결과가 다른 그룹에 의해 보고되었다(문헌[Nakatsura T et al., Biochem Biophys Res Commun. 2003]; 문헌[Baumhoer D et al., Am J Clin Pathol. 2008]; 문헌[Shirakawa H et al., Cancer Sci. 2009]; 문헌[Wang L et al., Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 2015]). 연구는 또한 GPC3이 HCC 환자에서 상이한 형태로 세포 표면으로부터 세포외 환경으로 방출될 수 있지만, 건강한 공여자에서는 방출되지 않을 수 있음을 보여주었다. 따라서, GPC3은 HCC에 대한 혈청 진단 마커로서 현재 사용된다(문헌[Hippo Y et al., Cancer Res. 2004]; 문헌[Capurro M et al., Gastroenterology 2003]; 문헌[Haruyama Y and Kataoka H, World J Gastroenterol. 2016]).
간세포 암종(HCC)은 간암의 가장 일반적인 유형이며, 모든 간암의 대략 75%를 차지한다. 간암은 다섯 번째로 가장 일반적인 암이고, 전세계적으로 암으로 인한 사망의 두 번째로 가장 일반적인 원인이다. 간암 발병률은 1980년 이래로 3배 이상 더 많아졌으며, 간암 사망률은 2000년 이래로 연간 거의 3%만큼 증가하였다(https://www.cancer.org/cancer/liver-cancer/about/what-is-key-statistics.html). 간암에 대한 예후는 발병률에 대한 사망률의 전체 비가 0.95로 매우 나쁘다. 현재 간암 치료는 주로 화학요법 또는 수술로 제한된다. 그러나, 화학요법의 효과는 종종 제한되는데, 그 이유는, 간 세포가 ATP 결합 카세트(ABC) 수송체를 발현하고, 이것은 광범위하게 통상적으로 사용되는 화학요법제를 확산시킬 수 있기 때문이다. 다른 선택지인 수술은 단지 초기 병기 암(여기서는, 5년 생존율이 31%임)에서만 이용가능하다. 암이 말기 병기에서 진단되는 경우(5년 생존율: 3 내지 11%), 유일한 승인된 화학요법 치료제는 티로신 키나제 억제제인 소라페닙이다. 이러한 치료는 단지 2 내지 3개월만큼만 생존율을 증가시킨다(문헌[Fleming BD and Ho M, Toxins 2016]). 따라서, 간암을 치료하는 신규한 방법의 개발이 요구된다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 공개된 특허 출원의 개시내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
일 태양에서, 본 출원은 세포 표면-결합된 GPC3(본 명세서에서 "천연 포맷 GPC3" 또는 "천연 GPC3(nGPC3)"으로 지칭됨)을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 작제물(본 명세서에서 "항-GPC3 작제물"로 지칭됨)은 천연 포맷 GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티(본 명세서에서 "항-GPC3 항체 모이어티"로 지칭됨)를 포함한다.
따라서, 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고, 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-GPC3 작제물의 Kd는 약 0.1 nM 내지 약 2 nM(예를 들어, 약 0.1 nM 내지 약 1 nM, 또는 약 0.1 nM 내지 약 1.5 nM)이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물과 세포 표면-결합된 GPC3 사이의 경쟁적 결합에 대한 가용성 GPC3의 IC50은 약 1 ㎍/ml 내지 약 100 ㎍/ml(예를 들어, 약 1 ㎍/ml 내지 약 10 ㎍/ml, 또는 약 2 ㎍/ml 내지 약 5 ㎍/ml)이다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3은 서열 번호 460 또는 서열 번호 462의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3은 HepG2 세포 상에 발현된 GPC3이다. 일부 실시 형태에서, 가용성 GPC3은 서열 번호 461 또는 서열 번호 463의 아미노산 서열을 포함한다.
전술된 임의의 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)에 따른 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 서열을 포함하는 인간 GPC3 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다.
전술된 임의의 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)에 따른 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 서열 번호 461의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다.
전술된 임의의 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)에 따른 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 서열 번호 462의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다.
전술된 임의의 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)에 따른 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 서열 번호 463의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다.
전술된 임의의 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)에 따른 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 GPC3의 N-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 서열 번호 464의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다.
전술된 임의의 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)에 따른 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 헤파린 설페이트 측쇄가 결여된 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다.
전술된 임의의 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)에 따른 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 GC33과 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 GPC3 에피토프에 특이적으로 결합하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 서열 번호 536의 아미노산 서열 내의 에피토프에 결합하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 서열 번호 536의 아미노산 서열을 포함하는 단편에 결합하지 않는다.
전술된 임의의 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)에 따른 일부 실시 형태에서, GPC3은 HepG2, Hep3B, Huh7, JHH-7, 및 293으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포의 표면 상에서 발현된다.
전술된 임의의 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)에 따른 일부 실시 형태에서, GPC3은 암 세포의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, 암 세포는 간암 세포, 예컨대 간세포 암종(HCC)이다.
다른 태양에서, 본 출원은 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)을 제공하며, 항체 모이어티는 i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역(HC-CDR) 1, 또는 최대 약 5개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역(LC-CDR) 1, 또는 최대 약 5개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
전술된 임의의 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)에 따른 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 i) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 또는 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나와 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 및 ii) 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 또는 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나와 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 i) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
다른 태양에서, 본 출원은 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)을 제공하며, 항체 모이어티는 단리된 항-GPC3 작제물의 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
다른 태양에서, 본 출원은 GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티를 포함하는 단리된 항-GPC3 작제물을 제공하며, 항체 모이어티는 i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
전술된 임의의 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)에 따른 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 i) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 또는 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나와 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 및 ii) 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 또는 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나와 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항체 모이어티는 i) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
다른 태양에서, 본 출원은 GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)을 제공하며, 항체 모이어티는 단리된 항-GPC3 작제물의 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
다른 태양에서, 본 출원은 전술된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나의 단리된 항-GPC3 작제물과 경쟁적으로 GPC3에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)을 제공한다.
다른 태양에서, 본 출원은 전술된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나의 단리된 항-GPC3 작제물과 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 GPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)을 제공한다.
전술된 임의의 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)에 따른 일부 실시 형태에서, GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 항체 모이어티이다.
전술된 임의의 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)에 따른 일부 실시 형태에서, GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티는 전장(full-length) 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv(scFv)이다. 일부 실시 형태에서, GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티는 Fab 또는 Fab'이다.
전술된 임의의 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)에 따른 일부 실시 형태에서, GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티는, 선택적으로 링커를 통해, Fc 단편에 융합된다. 일부 실시 형태에서, Fc 단편은 IgG1 Fc 단편이다.
전술된 임의의 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)에 따른 일부 실시 형태에서, 단리된 항-GPC3 작제물은 전장 항체이다.
전술된 임의의 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)에 따른 일부 실시 형태에서, 단리된 항-GPC3 작제물은 단일특이성이다.
전술된 임의의 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)에 따른 일부 실시 형태에서, 단리된 항-GPC3 작제물은 다중특이성, 예컨대 이중특이성이다. 일부 실시 형태에서, 단리된 항-GPC3 작제물은 탠덤 scFv, 다이아바디(Db), 단일쇄 다이아바디(scDb), 이중-친화성 재표적화(dual-affinity retargeting, DART) 항체, F(ab')2, 이중 가변 도메인(DVD) 항체, 노브-인투-홀(knob-into-hole, KiH) 항체, 독 앤드 락(dock and lock, DNL) 항체, 화학적으로 가교결합된 항체, 이종다량체성 항체, 또는 이종접합 항체이다. 일부 실시 형태에서, 단리된 항-GPC3 작제물은 펩티드 링커에 의해 연결된 2개의 scFv를 포함하는 탠덤 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 펩티드 링커는 TSGGGGS(서열 번호 474)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 단리된 항-GPC3 작제물은 제2 항원을 특이적으로 인식하는 제2 항체 모이어티를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제2 항원은 T 세포, 예컨대 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 또는 자연 살해 T 세포의 표면 상의 항원이다. 일부 실시 형태에서, 제2 항원은 B 세포, 자연 살해 세포, 수지상 세포, 대식세포, 단핵구, 또는 호중구의 표면 상의 항원이다. 일부 실시 형태에서, 제2 항원은 CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, CD40L, 및 HVEM으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 제2 항원은 CD3ε이다. 일부 실시 형태에서, 단리된 항-GPC3 작제물은 GPC3을 특이적으로 인식하는 N-말단 scFv 및 CD3ε을 특이적으로 인식하는 C-말단 scFv를 포함하는 탠덤 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물의 발현은 조작된 T 세포의 활성화에 의해 유도된다. 일부 실시 형태에서, 조작된 T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 T 세포이다. 일부 실시 형태에서, 조작된 T 세포는 키메라 항체-T 세포 수용체(TCR) 작제물(caTCR)을 포함하는 T 세포이다.
전술된 임의의 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)에 따른 일부 실시 형태에서, 단리된 항-GPC3 작제물은 키메라 항원 수용체(CAR)이며, CAR은 (a) 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함한다.
전술된 임의의 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)에 따른 일부 실시 형태에서, 단리된 항-GPC3 작제물은 키메라 항체-T 세포 수용체(TCR) 작제물(caTCR)이며, caTCR은 (a) 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인; 및 (b) 제1 T 세포 수용체 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(TCR-associated signaling molecule)의 동원을 촉진시킨다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM은 제1 천연 발생 TCR의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래되고, 제2 TCR-TM은 제1 천연 발생 TCR의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM들 중 적어도 하나는 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 제1 천연 발생 T 세포 수용체의 막관통 도메인을 포함하는 TCRM과 대비하여 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 향상된 동원을 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, 제1 천연 발생 TCR 은 γ/δ TCR이다. 일부 실시 형태에서, 제1 천연 발생 TCR 은 α/β TCR이다. 일부 실시 형태에서, TCR-회합 신호전달 분자는 CD3δε, CD3γε, 및 ζζ(CD3ζ 또는 CD3ζζ로도 알려짐)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
전술된 임의의 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)에 따른 일부 실시 형태에서, 단리된 항-GPC3 작제물은 항체 모이어티 및 이펙터 분자를 포함하는 면역접합체이다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 분자는 약물, 독소, 방사성 동위원소, 단백질, 펩티드, 및 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료제이다. 일부 실시 형태에서, 치료제는 약물 또는 독소이다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 분자는 표지이다.
다른 태양에서, 본 출원은 전술된 단리된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나의 폴리펩티드 성분을 인코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.
다른 태양에서, 본 출원은 전술된 단리된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나의 폴리펩티드 성분을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
다른 태양에서, 본 출원은 전술된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나를 포함하는 단리된 숙주 세포를 제공한다.
다른 태양에서, 본 출원은 전술된 단리된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나의 폴리펩티드 성분을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 단리된 숙주 세포를 제공한다.
다른 태양에서, 본 출원은 전술된 단리된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나의 폴리펩티드 성분을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포를 제공한다.
다른 태양에서, 본 출원은 전술된 단리된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나를 발현하는 이펙터 세포를 제공한다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 세포는 T 세포이다.
다른 태양에서, 본 출원은 전술된 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)들 중 어느 하나, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 전술된 단리된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나, 전술된 단리된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나의 폴리펩티드 성분을 인코딩하는 단리된 핵산, 전술된 단리된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나의 폴리펩티드 성분을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 전술된 단리된 세포들 중 어느 하나, 또는 전술된 이펙터 세포들 중 어느 하나를 포함하는 키트가 제공된다.
다른 태양에서, 본 출원은 샘플에서 GPC3을 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 샘플을 항체 모이어티 및 표지를 포함하는 전술된 단리된 항-GPC3 면역접합체들 중 어느 하나와 접촉시키는 단계, 및 표지의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 세포 표면-결합된 GPC3을 갖는 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 가용성 GPC3을 포함한다.
다른 태양에서, 본 출원은 GPC3-양성 질병을 가진 개체를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 전술된 약제학적 조성물들 중 어느 하나의 유효량; 또는 b) 전술된 이펙터 세포들 중 어느 하나의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 투여는 정맥내 또는 종양내 경로를 통해 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 투여는 제1 질병 부위에 대해 원위에 있는 주사 부위에 대해 이루어진다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병을 가진 개체를 치료하는 방법은 추가의 요법을 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병은 암, 예컨대 HCC, 흑색종, 폐 편평 세포 암종, 난소 암종, 난황낭 종양, 융모막암종, 신경아세포종, 간아세포종, 빌름스 종양, 고환 비정상피종성 생식 세포 종양, 위 암종, 또는 지질육종이다. 일부 실시 형태에서, 암은 HCC, 예컨대 전이성 HCC이다.
다른 태양에서, 본 출원은 GPC3-양성 질병을 가진 개체를 진단하는 방법으로서, 상기 방법은 a) 항체 모이어티 및 표지를 포함하는 전술된 단리된 항-GPC3 면역접합체들 중 어느 하나의 유효량을 투여하는 단계; 및 b) 개체에서 표지의 수준을 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 역치 수준을 초과하는 표지의 수준이 개체가 GPC3-양성 질병을 가짐을 나타낸다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병은 암, 예컨대 HCC, 흑색종, 폐 편평 세포 암종, 난소 암종, 난황낭 종양, 융모막암종, 신경아세포종, 간아세포종, 빌름스 종양, 고환 비정상피종성 생식 세포 종양, 위 암종, 또는 지질육종이다. 일부 실시 형태에서, 암은 HCC, 예컨대 전이성 HCC이다.
다른 태양에서, 본 출원은 GPC3-양성 질병을 가진 개체를 진단하는 방법으로서, 상기 방법은 a) 개체로부터 유래된 샘플을 항체 모이어티 및 표지를 포함하는 전술된 단리된 항-GPC3 면역접합체들 중 어느 하나와 접촉시키는 단계; 및 b) 샘플 내의 단리된 항-GPC3 작제물과 결합된 세포의 수를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 단리된 항-GPC3 작제물과 결합된 세포의 수가 역치 수준을 초과하는 값이 개체가 GPC3-양성 질병을 가짐을 나타낸다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병은 암, 예컨대 HCC, 흑색종, 폐 편평 세포 암종, 난소 암종, 난황낭 종양, 융모막암종, 신경아세포종, 간아세포종, 빌름스 종양, 고환 비정상피종성 생식 세포 종양, 위 암종, 또는 지질육종이다. 일부 실시 형태에서, 암은 HCC, 예컨대 전이성 HCC이다.
또한, 본 명세서에 기재된 임의의 작제물을 제조하는 방법, 제조 물품, 및 본 명세서에 기재된 방법에 적합한 키트가 제공된다.
도 1a 내지 도 1g는 GPC3+ HepG2 세포에 대한 14개의 예시적인 GPC3A 파지 클론의 결합의 FACS 분석을 나타낸다. GPC3+ HepG2 세포에 대한 헬퍼 파지의 결합을 대조군으로 사용하였다.
도 2a 내지 도 2e는 GPC3+ HepG2 세포주 및 HepG2 GPC3-녹아웃(knockout) 세포주(HepG2-GPC3-KO-2 및 HepG2-GPC3-KO-3)에 대한 5개의 예시적인 GPC3A 파지 클론의 결합의 FACS 분석을 나타낸다. 헬퍼 파지를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 3a 내지 도 3d는 GPC3+ HepG2 세포주 및 HepG2-GPC3-KO-2 세포주에 대한 4개의 예시적인 GPC3B 파지 클론의 결합의 FACS 분석을 나타낸다. 헬퍼 파지를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 4a 및 도 4b는 SK-Hep1-GPC3 세포 및 GPC3-음성 SK-Hep1 세포에 대한 예시적인 GPC3A L2K 이중특이성 항체(GPC3A 스크리닝으로부터 유래된 항-GPC3×CD3 다이-scFv)의 결합의 FACS 분석을 나타낸다. y-축은 중위 형광 강도(median fluorescence intensity, MFI)를 나타낸다.
도 5a 및 도 5b는 GPC3+ HepG2 세포에 대한 예시적인 GPC3A L2K 이중특이성 항체(GPC3A 스크리닝으로부터 유래된 항-GPC3×CD3 다이-scFv)의 결합의 FACS 분석을 나타낸다. GPC3+ HepG2 세포에 대한 대조 L2K 이중특이성 항체의 결합을 음성 대조군으로 사용하였다.
도 6은 가용성 GPC3 항원이 존재하거나 존재하지 않는 상태로 제공된 경쟁 검정에서 GPC3+ HepG2 세포에 대한 GPC3A L2K 이중특이성 항체의 결합의 FACS 분석을 나타낸다. 음성 대조군 L2K 이중특이성 항체 및 시판 항-GPC3(1G12) 항체를 비교 목적으로 사용하였다.
도 7a는 GPC3+ HepG2 세포, GPC3-음성 SK-Hep1 세포, SK-Hep1-GPC3 세포, HepG2-GPC3-KO 세포(#2 및 #11) 상에서 시험된, GPC3A L2K 이중특이성 항체에 의한 T 세포-매개 표적 세포 사멸을 나타낸다. 도 7b는 GPC3+ HepG2 세포, GPC3-음성 SK-Hep1 세포, SK-Hep1-GPC3 세포, 및 HepG2-GPC3-KO-2 세포 상에서 시험된, GPC3B L2K 이중특이성 항체에 의한 T 세포-매개 표적 세포 사멸을 나타낸다.
도 8은 시판 마우스 항-인간 GPC3 항체(1G12)를 사용한 HepG2 GPC3-녹아웃 세포주의 FACS 분석을 나타내는데, 이는 HepG2-GPC3-KO 세포주의 성공적인 생성을 입증한다.
도 9a는 GPC3-양성 HepG2 세포에 대한 마우스 불변 도메인/Fc 영역(mIgG1)을 갖는 항-인간 GPC3(hGPC3) 단일특이성 IgG 항체의 결합의 FACS 분석을 나타낸다. 도 9b는 GPC3-음성 SK-Hep1 세포에 대한 항-hGPC3 mIgG1의 결합의 FACS 분석을 나타낸다.
도 10은 가용성 GPC3에 의한 GPC3 L2K 항체(GPC3B-87 L2K 또는 GC33 L2K)의 HepG2-결합을 위한 경쟁을 나타내는 FACS 형광 강도 곡선을 보여준다.
도 11은 HepG2 세포에 대한 GPC3 LK2 클론의 결합 친화도를 나타내는 FACS 형광 강도 곡선을 보여준다.
도 12는 래트 GPC3 및 인간 GPC3(hGPC3)에 대한 GPC3 mIgG1 클론의 반응성의 ELISA 분석을 나타낸다.
도 13은 에피토프 비닝(epitope binning)의 선형 포맷을 사용한 GC33-mIgG, GPC3A-37 mIgG 및 GPC3A-55 mIgG의 GPC3 에피토프 비닝 분석을 나타낸다.
도 14는 에피토프 비닝의 샌드위치 포맷을 사용한 GC33-mIgG, GPC3A-37 mIgG 및 GPC3A-55 mIgG의 GPC3 에피토프 비닝 분석을 나타낸다.
도 15a 및 도 15b는 GPC3A L2K 클론과 GPC3 항원 사이의 결합의 단회-사이클 속도론 분석으로부터의 도표로 나타낸 데이터를 나타낸다.
도 16은 GPC3A 또는 GPC3B CAR T 세포 및 GC33 CAR T 세포에 의해 처리된 GPC3-양성 HepG2 세포, GPC3-음성 SK-Hep1 세포, SK-Hep1-GPC3 세포, 및 HepG2-GPC3-KO 세포에서의 LDH 세포독성 분석을 나타낸다.
도 17a는 GPC3A 또는 GPC3B CAR T 세포 및 GC33 CAR T 세포에 의해 처리된 GPC3+ HepG2 세포, GPC3-음성 SK-Hep1 세포, SK-Hep1-GPC3 세포, 및 HepG2-GPC3-KO 세포에서의 LDH 세포독성 분석을 나타낸다. 도 17b는 GPC3A 또는 GPC3B CAR T 세포 및 GC33 CAR T 세포에 의해 처리된 GPC3-양성 JHH5 세포, GPC3-음성 A-498 세포, 및 GPC3-음성 PANC-1 세포에서의 LDH 세포독성 분석을 나타낸다.
도 18은 지시된 % caTCR 양성(5% 내지 40%)으로 단독으로의 항-AFP158/HLA-A*2:01 caTCR 또는 항-AFP158/HLA-A*2:01 caTCR + 항-CD3/항-GPC3 BsAb에 의해 형질도입된 T 세포에 의해 매개되는, 암 세포주 HepG2(AFP+/GPC3+) 및 HepG2-GPC3-KO(AFP+/GPC3-)의 사멸로부터의 % 특이적 용해를 나타낸다.
도 19는 지시된 % caTCR 양성(5% 내지 40%)으로 단독으로의 항-AFP158/HLA-A*2:01 caTCR 또는 항-AFP158/HLA-A*2:01 caTCR + 항-CD3/항-GPC3 BsAb에 의해 형질도입된 T 세포에 의해 매개되는, 암 세포주 HepG2 및 HepG2-GPC3-KO의 시험관내 사멸 후 상층액에서 발견되는 사이토카인(IL-2, IFN-γ, 및 TNF-α)의 농도를 나타낸다.
도 20은 활성화된 항-AFP158/HLA-A*2:01 caTCR + 항-CD3/항-GPC3 BsAb T 세포로부터 방출된 항-CD3/항-GPC3 BsAb에 의해 매개되는 표적-특이적 암 세포주 사멸의 증강을 나타낸다. 지시된 형질도입된 T 세포와 표적 세포를 함께 인큐베이션하고, BsAb에 대해서는 투과성이지만 T 세포에 대해서는 불투과성인 막에 의해, 지시된 표적 세포 및 모의 T 세포로부터 분리하였다.
도 21은 단독으로의 항-AFP158/HLA-A*2:01 caTCR-1-0, 단독으로의 항-GPC3 CSR, 또는 항-AFP158/HLA-A*2:01 caTCR(1-0 및 1-TM5) + 항-GPC3 CSR에 의해 형질도입된 T 세포에 의해 매개되는, 암 세포주 HepG2(AFP+/GPC3+) 및 HepG2-GPC3.ko(AFP+/GPC3-)의 사멸로부터의 % 특이적 용해를 나타낸다.
도 22는 단독으로의 항-AFP158/HLA-A*2:01 caTCR-1-0, 단독으로의 항-GPC3 CSR, 또는 항-AFP158/HLA-A*2:01 caTCR(1-0 및 1-TM5) + 항-GPC3 CSR에 의해 형질도입된 T 세포에 의해 매개되는, 암 세포주 HepG2 및 HepG2-GPC3-KO의 시험관내 사멸 후 상층액에서 발견되는 사이토카인(IL-2, GM-CSF, IFN-γ, 및 TNF-α)의 농도를 나타낸다.
도 23은 암 세포주 HepG2에 의한 자극 후 단독으로의 항-AFP158/HLA-A*2:01 caTCR-1-0, 단독으로의 항-GPC3 CSR, 또는 항-AFP158/HLA-A*2:01 caTCR(1-0 및 1-TM5) + 항-GPC3 CSR에 의해 형질도입된 T 세포에서 (CD107a 발현에 의해 결정되는 바와 같은) 탈과립 활성을 나타낸다.
도 24는 암 세포주 HepG2에 의한 자극 후 단독으로의 항-AFP158/HLA-A*2:01 caTCR-1-0, 단독으로의 항-GPC3 CSR, 또는 항-AFP158/HLA-A*2:01 caTCR(1-0 및 1-TM5) + 항-GPC3 CSR에 의해 형질도입된 T 세포의 (CFSE 염료 희석에 의해 결정되는 바와 같은) 증식을 나타낸다.
도 25는 모의 처리를 받거나, 또는 항-AFP CAR, 또는 항-GPC3 CSR과 조합된 항-AFP CAR에 의해 형질도입된 T 세포의 단회 종양내 주사를 받은 HepG2의 피하 마우스 모델에서의 종양 성장을 나타낸다.
일 태양에서, 본 출원은 세포 표면-결합된 GPC3(본 명세서에서 "천연 포맷 GPC3" 또는 "천연 GPC3(nGPC3)"으로 지칭됨)을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티(본 명세서에서 "항-GPC3 항체 모이어티"로 지칭됨)를 포함하는 작제물(본 명세서에서 "항-GPC3 작제물"로 지칭됨)(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)을 제공한다. 이들 항-GPC3 작제물은, 세포 표면-비결합된 GPC3(본 명세서에서 "가용성 GPC3(sGPC3)" 또는 "비천연 GPC3"으로 지칭됨), 예컨대 혈청 중의 순환 GPC3 단백질 또는 유리 GPC3 펩티드와 대조적인 것으로서, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식한다.
항-CD3 이중특이성 항체로서 무장되는(armed) 경우 또는 T 세포에 의해 발현되는 키메라 항원 수용체(CAR)에 존재하는 경우, 항-GPC3 항체 모이어티는 인간 T 세포를 특이적으로 방향전환시켜 GPC3-발현 표적 세포(예컨대, GPC3-발현 암 세포)를 사멸시킨다. 이러한 전략은 임의의 포맷의 GPC3(특히, 가용성 GPC3)에 대해 유도된 항체를 사용하는 것에 비해 상당한 기술적 이점을 제공하는데, 그 이유는, 종양 부위에 대한 T 세포 표적화가 훨씬 더 효율적이고 정밀하게 되어, 정상 조직을 손상시키지 않고도 효과적인 T 세포-매개 암 세포 사멸을 가져올 수 있기 때문이다. 더욱이, 검출가능한 모이어티에 융합될 때, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면 상에 GPC3을 발현하는 세포(예컨대, GPC3-양성 종양 세포)의 수 및 분포의 변화에 대해 높은 감수성으로 GPC3-양성 질병 또는 장애의 진단 및 예후를 가능하게 하는데, 이때 상기 세포의 수 및 분포의 변화는 순환 GPC3 수준보다 잠재적으로 더 관련된 질병 진행 척도이다.
본 출원은 또한, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)을 제공한다. 이들 작제물은 또한 항-CD3 이중특이성 항체로서 무장될 수 있거나, 또는 T 세포에 의해 발현되는 CAR에 존재할 수 있다. GPC3은 암 환자(예컨대, HCC 환자)에서 세포 표면 상에서 발현되거나, 또는 상이한 형태로 세포 표면으로부터 세포외 환경으로 방출될 수 있다. 따라서, 이들 항-GPC3 작제물은 또한 검출가능한 모이어티에 융합되어 진단 및 예후 목적으로 사용될 수 있다.
파지 디스플레이 기술을 사용하여, 본 발명자들은 세포 표면-결합된 인간 GPC3에 대해 특이적이고 높은 친화도를 나타내는 다수의 단일클론 항체를 생성하였다. 유세포측정 및 T-세포 매개 세포독성 검정은 이들 항체가 천연 포맷 GPC3-제한된 방식으로 GPC3-발현 암 세포주를 인식함을 입증하였다. 항-CD3 이중특이성 항체 또는 CAR T 세포로서 무장되는 경우, 이들 항체는 인간 T 세포를 방향전환시켜 GPC3-양성 표적 암 세포를 사멸시킨다. 본 명세서에 제시된 데이터는 본 명세서에 기재된 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물이 암 적응증, 예컨대 고형 종양 적응증(예를 들어, HCC)을 위한 효과적인 치료제일 수 있음을 입증한다.
파지 디스플레이 기술을 사용하여, 본 발명자들은 또한 인간 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 대해 특이적이고 높은 친화도를 나타내는 다수의 단일클론 항체를 생성하였다. 유세포측정 및 T-세포 매개 세포독성 검정은 이들 항체가 GPC3을 특이적으로 인식함을 입증하였다.
따라서, 본 출원은 GPC3, 예컨대 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티를 포함하는 작제물(예컨대, 단리된 작제물)을 제공한다. 작제물은, 예를 들어 항-GPC3 scFv, 항-GPC3 Fc 융합 단백질, 전장 항-GPC3 항체, 다중특이성(예컨대, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 탠덤 다이-scFv 이중특이성 T 세포 인게이저(engager)), 항-GPC3 키메라 항원 수용체(CAR), 항-GPC3 키메라 항체-T 세포 수용체(caTCR), 및 항-GPC3 면역접합체일 수 있다.
다른 태양에서, 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물) 또는 작제물의 항-GPC3 항체 모이어티 부분(예컨대, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 것들)을 인코딩하는 핵산이 제공된다.
다른 태양에서, GPC3(예컨대, 세포 표면-결합된 GPC3)을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)을 포함하는 조성물(예컨대, 약제학적 조성물)이 제공된다. 조성물은 항-GPC3 작제물(예컨대, 세포 표면-결합된 GPC3), 또는 항-GPC3 작제물을 발현하거나 이와 회합된 이펙터 세포(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 CAR인 항-GPC3 CAR을 발현하는 T 세포)를 포함하는 약제학적 조성물일 수 있다.
또한, 치료 또는 진단 목적을 위한 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물, 또는 항-GPC3 작제물을 발현하거나 이와 회합된 세포)의 제조 및 사용 방법뿐만 아니라, 그러한 방법에 유용한 키트 및 제조 물품이 제공된다.
정의
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "치료" 또는 "치료하는"은 임상 결과를 포함하는 유익하거나 원하는 결과를 얻기 위한 방법이다. 본 발명의 목적상, 유익하거나 원하는 임상 결과는 하기 중 하나 이상을 포함하지만 이로 한정되지 않는다: 질병에 기인되는 하나 이상의 증상 경감, 질병 정도의 저하, 질병의 안정화(예를 들어, 질병의 악화를 예방 또는 지연), 질병의 확산(예를 들어, 전이)을 예방 또는 지연, 질병 재발의 예방 또는 지연, 질병 진행의 지연 또는 둔화, 질병 상태의 개선, 질병 관해(부분 관해 또는 완전 관해)의 제공, 질병을 치료하는 데 필요한 하나 이상의 다른 의약품 용량의 감소, 질병 진행의 지연, 삶의 질의 상승 또는 개선, 체중 획득의 증가, 및/또는 생존 연장. 또한, "치료"에는 암의 병리학적 결과(예컨대, 종양 부피)의 감소가 포함된다. 본 발명의 방법은 이들 치료 측면 중 임의의 하나 이상을 고려한다.
T 세포와 관련하여 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "활성화"는 검출가능한 세포 증식을 유도하기에 충분히 자극된 T 세포의 상태를 지칭한다. 활성화는 또한 유도된 사이토카인 생성, 및 검출가능한 이펙터 기능과 관련될 수 있다.
용어 "항체 모이어티"는 전장 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 전장 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 항원-결합을 담당한다. 양쪽 사슬 내의 가변 영역은 일반적으로 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 3개의 고도로 가변적인 루프(경쇄(LC)-CDR1, LC-CDR2, 및 LC-CDR3을 포함하는 LC CDR, 중쇄(HC)-CDR1, HC-CDR2, 및 HC-CDR3을 포함하는 HC CDR)를 함유한다. 본 명세서에 개시된 항체 및 항원-결합 단편에 대한 CDR 경계는 카바트(Kabat), 초티아(Chothia), 또는 알-라지카니(Al-Lazikani)의 규약에 의해 정의되거나 확인될 수 있다(문헌[Al-Lazikani 1997]; 문헌[Chothia 1985]; 문헌[Chothia 1987]; 문헌[Chothia 1989]; 문헌[Kabat 1987]; 문헌[Kabat 1991]). 중쇄 또는 경쇄의 3개의 CDR은 프레임워크 영역(framework region, FR)으로 알려진 플랭킹 스트레치(flanking stretch)들 사이에 개재되며, 이들은 CDR보다 더 고도로 보존되고 스캐폴드를 형성하여 초가변 루프를 지탱한다. 중쇄 및 경쇄의 불변 영역은 항원-결합에 관여하지 않지만, 다양한 이펙터 기능을 나타낸다. 항체는 그들의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 기초하여 부류들에 배정된다. 항체의 5개의 주요 부류 또는 동종형(isotype)은 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이며, 이들은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ 중쇄의 존재를 특징으로 한다. 주요 항체 부류들 중 몇몇은 lgG1(γ1 중쇄), IgG2(γ2 중쇄), lgG3(γ3 중쇄), lgG4(γ4 중쇄), lgA1(α1 중쇄), 또는 lgA2(α2 중쇄)와 같은 하위부류로 나누어진다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항원-결합 단편"은 항체 단편을 지칭하며, 이에는, 예를 들어 다이아바디(diabody), Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 이황화물 안정화된 Fv 단편(dsFv), (dsFv)2, 이중특이성 dsFv(dsFv-dsFv'), 이황화물 안정화된 다이아바디(ds 다이아바디), 단일쇄 Fv(scFv), scFv 이량체(2가 다이아바디), 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체의 일부분으로부터 형성된 다중특이성 항체, 낙타화(camelized) 단일 도메인 항체, 나노바디, 도메인 항체, 2가 도메인 항체, 또는 항원에 결합하지만 완전한 항체 구조를 포함하지 않는 임의의 다른 항체 단편이 포함된다. 항원-결합 단편은 모(parent) 항체 또는 모 항체 단편(예를 들어, 모 scFv)이 결합하는 것과 동일한 항원에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 단편은 하나 이상의 상이한 인간 항체로부터의 프레임워크 영역에 그래프팅된 특정 인간 항체로부터의 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "에피토프"는 항체 또는 항체 모이어티가 결합하는, 항원 상의 원자 또는 아미노산의 특정 군을 지칭한다. 2개의 항체 또는 항체 모이어티는 이들이 항원에 대해 경쟁적 결합을 나타낸다면 항원 내의 동일한 에피토프에 결합할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 등몰 농도의 제1 항체 모이어티의 존재 하에서 제1 항체 모이어티가 제2 항체 모이어티의 표적 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3) 결합을 적어도 약 50%(예컨대, 적어도 약 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 중 어느 하나)만큼 억제할 때 제1 항체 모이어티는 표적 GPC3에 결합하기 위하여 제2 항체 모이어티와 "경쟁"하거나, 또는 그 역으로도 성립한다. 항체들을 그들의 교차-경쟁에 기초하여 "비닝"하기 위한 고처리량 프로세스가 PCT 공개 WO 03/48731호에 기재되어 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합한다", "특이적으로 인식하는", 또는 "~에 특이적이다"는 생물학적 분자를 포함한 이종 분자 집단의 존재 하에서 표적의 존재를 결정짓는 측정가능하고 재현가능한 상호작용, 예컨대 표적과 항체 또는 항체 모이어티 사이의 결합을 지칭한다. 예를 들어, (에피토프일 수 있는) 표적을 특이적으로 인식하는 항체 또는 항체 모이어티는 다른 표적에 대한 그의 결합보다 더 큰 친화도, 결합력(avidity)으로, 더 용이하게, 그리고/또는 더 긴 지속기간으로 이러한 표적에 결합하는 항체 또는 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항원을 특이적으로 인식하는 항체 또는 항체 모이어티는 항원(예컨대, 천연 포맷 GPC3)의 하나 이상의 항원 결정기와, 다른 표적(예컨대, 가용성 GPC3)에 대한 그의 결합 친화도의 적어도 약 10배인 결합 친화도로 반응한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "단리된" 항-GPC3 작제물은 (1) 자연계에서 발견되는 단백질과 회합되지 않거나, (2) 동일한 공급원으로부터의 다른 단백질 형태가 없거나, (3) 상이한 종으로부터의 세포에 의해 발현되거나, (4) 자연계에서 발생하지 않는 항-GPC 작제물을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "단리된 핵산"은 게놈의 핵산, cDNA의 핵산, 또는 합성 기원의 핵산 또는 이들의 어떠한 조합을 의미하는 것으로 의도되며, 그의 기원에 의해 "단리된 핵산"은 (1) "단리된 핵산"이 자연계에서 발견되는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부분과 회합되지 않거나, (2) 그것이 자연계에서 연결되지 않은 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결되거나, 또는 (3) 더 큰 서열의 일부로서 자연계에서 발생하지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "CDR" 또는 "상보성 결정 영역"은 중쇄 폴리펩티드 및 경쇄 폴리펩티드 둘 모두의 가변 영역 내에서 발견되는 불연속 항원-결합 부위를 의미하는 것으로 의도된다. 이들 특정 영역은 문헌[Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977)]; 문헌[Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of proteins of immunological interest" (1991)]; 문헌[Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]; 문헌[Al-Lazikani B. et al., J. Mol. Biol., 273: 927-948 (1997)]; 문헌[MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)]; 문헌[Abhinandan and Martin, Mol. Immunol., 45: 3832-3839 (2008)]; 문헌[Lefranc M.P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27: 55-77 (2003)]; 및 문헌[Honegger and
Figure pct00001
, J. Mol. Biol., 309:657-670 (2001)]에 의해 기재되어 있으며, 여기서 이들 정의는 서로에 대해 비교될 때 아미노산 잔기들의 중첩 또는 하위세트를 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 그래프팅된 항체 또는 이들의 변이체의 CDR을 지칭하기 위한 어느 정의의 적용도 본 명세서에 정의되고 사용된 바와 같은 용어의 범주 내에 있는 것으로 의도된다. 상기 인용된 참고문헌들 각각에 의해 정의된 CDR을 포함하는 아미노산 잔기가 비교로서 하기 표 1에 기재되어 있다. CDR 예측 알고리즘 및 인터페이스는 당업계에 알려져 있으며, 이에는, 예를 들어 문헌[Abhinandan and Martin, Mol. Immunol., 45: 3832-3839 (2008)]; 문헌[Ehrenmann F. et al., Nucleic Acids Res., 38: D301-D307 (2010)]; 및 문헌[Adolf-Bryfogle J. et al., Nucleic Acids Res., 43: D432-D438 (2015)]이 포함된다. 본 단락에 인용된 참고문헌의 내용은 본 발명에 사용하기 위하여 그리고 본 명세서의 하나 이상의 청구항에서의 가능한 포함을 위하여 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
[표 1]
Figure pct00002
용어 "키메라 항체"는, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분은 특정 종으로부터 또는 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 것으로부터 유래된 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동인 반면, 사슬(들)의 나머지 부분은 다른 종으로부터 또는 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 것으로부터 유래된 항체뿐만 아니라, 본 발명의 생물학적 활성을 나타내는 한 그러한 항체의 단편 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동인 항체를 지칭한다(미국 특허 제4,816,567호; 및 문헌[Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)] 참조).
항체 또는 항체 모이어티와 관련하여 용어 "반합성"은 항체 또는 항체 모이어티가 하나 이상의 천연 발생 서열 및 하나 이상의 천연 비발생(즉, 합성) 서열을 가짐을 의미한다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 -결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이러한 단편은 긴밀한 비공유적 회합 상태에 있는 1개의 중쇄 가변 영역 도메인과 1개의 경쇄 가변 영역 도메인의 이량체로 이루어진다. 이들 2개의 도메인의 접힘에 의해, 항원 결합을 위한 아미노산 잔기를 제공하고 항체에 항원 결합 특이성을 부여하는 6개의 초가변 루프(중쇄 및 경쇄 각각으로부터의 3개씩의 루프)가 형성된다. 그러나, 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)일지라도 전체 결합 부위보다 친화성이 낮긴 하지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
"sFv" 또는 "scFv"로도 약기되는 "단일쇄 Fv"는 단일쇄 폴리펩티드에 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. 일부 실시 형태에서, scFv 폴리펩티드는, scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있도록 하는, VH 도메인과 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토에 관해서는 문헌[
Figure pct00003
in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994]을 참조한다.
용어 "다이아바디"는, 전형적으로 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 짧은 링커(예컨대, 약 5 내지 약 10개의 잔기)를 사용하여 scFv 단편(이전 단락 참조)을 작제하여, 이들 V 도메인의 사슬간이 아닌 사슬내 쌍형성이 달성되도록 하여, 2가 단편, 즉 2개의 항원-결합 부위를 갖는 단편이 생성되도록 함으로써 제조된 작은 항체 단편을 지칭한다. 이중특이성 다이아바디는 2개의 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인이 상이한 폴리펩티드 사슬에 존재하는 2개의 "크로스오버(crossover)" scFv 단편으로 이루어진 이종이량체이다. 다이아바디는, 예를 들어 유럽 특허 EP 404,097호; 국제 특허 출원 공개 WO 93/11161호; 및 문헌[Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 더 상세히 기재되어 있다.
비인간(예를 들어, 설치류) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 항체로부터 유래된 최소한의 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는, 수용자의 초가변 영역(HVR)으로부터의 잔기가 원하는 항체 특이성, 친화도, 및 능력을 갖는 비인간 종(공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류의 초가변 영역으로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역(FR) 잔기가 상응하는 비인간 잔기에 의해 대체된다. 더욱이, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 추가로 개선하도록 이루어진다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 하나, 그리고 전형적으로는 2개의, 실질적으로 모든 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 면역글로불린의 것들에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 것들이다. 인간화 항체는 선택적으로 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc), 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것의 적어도 일부분을 포함할 것이다. 추가의 상세한 내용에 대해서는, 문헌[Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; 문헌[Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 문헌[Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다.
본 명세서에서 확인된 폴리펩티드 및 항체 서열에 대한 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성" 또는 "상동성"은 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하여 서열을 정렬시킨 후, 비교되는 폴리펩티드 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. % 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 당업계의 기술 범위 내에 있는 다양한 방법으로, 예를 들어 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN, Megalign(DNASTAR), 또는 MUSCLE 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열들의 전장에 걸쳐 최대한의 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적상, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 MUSCLE을 사용하여 생성된다(문헌[Edgar, R.C., Nucleic Acids Research 32(5):1792-1797, 2004]; 문헌[Edgar, R.C., BMC Bioinformatics 5(1):113, 2004]).
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술하는 데 사용된다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 FcR은 IgG 항체에 결합하는 것(γ 수용체)이고, FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 하위부류의 수용체를 포함하며, 이러한 하위부류의 수용체에는 대립유전자 변이체 및 대안적으로 이들 수용체의 스플라이싱된 형태가 포함된다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB("억제 수용체")를 포함하는데, 이들은 유사한 아미노산 서열을 가지되, 이들의 세포질 도메인 내의 아미노산 서열이 주로 상이하다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 이의 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신계 활성화 모티프(ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 이의 세포질 도메인 내에 면역수용체 티로신계 억제 모티프(ITIM)를 함유한다(검토를 위해서는 문헌[M. in
Figure pct00004
, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)] 참조). 이 용어는 동종이인자형, 예컨대 FcγRIIIA 동종이인자형, 즉 FcγRIIIA-Phe158, FcγRIIIA-Val158, FcγRIIA-R131 및/또는 FcγRIIA-H131을 포함한다. FcR은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]; 문헌[Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)]; 및 문헌[de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에 검토되어 있다. 향후에 확인될 것들을 포함한 다른 FcR이 본 명세서에서의 용어 "FcR"에 포함된다. 이 용어는 또한 모체 IgG의 태아로의 전달을 담당하는 신생아 수용체인 FcRn을 포함한다(문헌[Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 문헌[Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)]).
용어 "FcRn"은 신생아 Fc 수용체(FcRn)를 지칭한다. FcRn은 주요 조직적합성 복합체(MHC)와 구조적으로 유사하며, β2-마이크로글로불린에 비공유적으로 결합된 α-사슬로 이루어진다. 신생아 Fc 수용체 FcRn의 다수의 기능은 문헌[Ghetie and Ward (2000) Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766]에 검토되어 있다. FcRn은 엄마로부터 아기로의 면역글로불린 IgG의 수동적 전달 및 혈청 IgG 수준의 조절에 있어서 역할을 한다. FcRn은 구제 수용체(salvage receptor)로서 작용하여, 세포 내에서 그리고 또한 세포를 가로질러 온전한 형태의 음세포작용된(pinocytosed) IgG에 결합하고 이를 수송하고, 이들을 기본 분해 경로로부터 구조할 수 있다.
인간 IgG Fc 영역의 "CH1 도메인"("H1" 도메인의 "C1"로도 지칭됨)은 통상 약 아미노산 118부터 약 아미노산 215(EU 넘버링 체계)까지 연장된다.
"힌지 영역"은 일반적으로 인간 IgG1의 Glu216으로부터 Pro230까지의 스트레칭으로서 정의된다(문헌[Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985)]). 다른 IgG 동종형의 힌지 영역은 동일한 위치에 중쇄간 S-S 결합을 형성하는 처음과 마지막 시스테인 잔기를 위치시킴으로써 IgG1 서열과 정렬될 수 있다.
인간 IgG Fc 영역의 "CH2 도메인"("H2" 도메인의 "C2"로도 지칭됨)은 통상 약 아미노산 231부터 약 아미노산 340까지 연장된다. CH2 도메인은 그것이 다른 도메인과 밀접하게 쌍형성되지 않는다는 점에서 특유하다. 오히려, 2개의 N-연결된 분지형 탄수화물 사슬이 온전한 천연 IgG 분자의 2개의 CH2 도메인 사이에 개재된다. 탄수화물은 도메인-도메인 쌍형성에 대한 대체물을 제공하고 CH2 도메인의 안정화를 도울 수 있는 것으로 추론되어 왔다. 문헌[Burton, Molec Immunol. 22:161-206 (1985)].
"CH3 도메인"("C2" 또는 "H3" 도메인으로도 지칭됨)은 Fc 영역 내의 CH2 도메인에 대해 C-말단에 있는 잔기들의 스트레치(즉, 약 아미노산 잔기 341로부터, 전형적으로 IgG의 아미노산 잔기 446 또는 447의, 항체 서열의 C-종결 말단까지)를 포함한다.
"기능성 Fc 단편"은 천연 서열 Fc 영역의 "이펙터 기능"을 갖는다. 예시적인 "이펙터 기능"은 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC); 식작용; 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 포함한다. 그러한 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인(예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합될 것을 필요로 하며, 당업계에 알려진 다양한 검정을 사용하여 평가될 수 있다.
"변경된" FcR 결합 친화도 또는 ADCC 활성을 갖는 변이체 IgG Fc를 갖는 항체는 모 폴리펩티드 또는 천연 서열 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드에 비하여 향상되거나 감소된 FcR 결합 활성(예를 들어, FcγR 또는 FcRn) 및/또는 ADCC 활성을 갖는 것이다. FcR에 대한 "증가된 결합을 나타내는" 변이체 Fc는 모 폴리펩티드 또는 천연 서열 IgG Fc보다 더 높은 친화도(예를 들어, 더 낮은 겉보기 Kd 또는 IC50 값)로 적어도 하나의 FcR에 결합한다. 일부 실시 형태에 따르면, 모 폴리펩티드와 대비하여 결합 개선은 약 3배, 예컨대 약 5, 10, 25, 50, 60, 100, 150, 200, 또는 최대 500배, 또는 약 25% 내지 1000% 중 어느 하나의 결합 개선이다. FcR에 대한 "감소된 결합을 나타내는" 폴리펩티드 변이체는 모 폴리펩티드보다 더 낮은 친화도(예를 들어, 더 높은 겉보기 Kd 또는 더 높은 IC50 값)로 적어도 하나의 FcR에 결합한다. 모 폴리펩티드와 대비하여 결합 감소는 약 40% 이상의 결합 감소일 수 있다.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 소정의 세포독성 세포(예를 들어, 자연 살해(NK) 세포, 호중구, 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체(FcR)에 결합된, 분비된 Ig가, 이들 세포독성 이펙터 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합할 수 있게 하고, 후속으로 표적 세포를 세포독소로 사멸시킬 수 있게 하는 세포독성 형태를 지칭한다. 항체는 세포독성 세포를 "무장"하고 그러한 사멸에 절대적으로 필요하다. ADCC를 매개하기 위한 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈세포 상에서의 FcR 발현은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464 페이지의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위하여, 시험관내 ADCC 검정, 예컨대 미국 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에 기재된 것이 수행될 수 있다. 그러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌[Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다.
야생형 IgG Fc를 갖는 폴리펩티드 또는 모 폴리펩티드보다 더 효과적으로 인간 이펙터 세포의 존재 하에서 "증가된 ADCC를 나타내거나" 또는 ADCC를 매개하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드는, 검정에서 변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드와 야생형 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드(또는 모 폴리펩티드)의 양이 본질적으로 동일할 때, 시험관내 또는 생체내에서 ADCC를 매개하는 데 실질적으로 더 효과적인 것이다. 일반적으로, 그러한 변이체는 당업계에 알려진 임의의 시험관내 ADCC 검정, 예컨대 ADCC 활성을, 예를 들어 동물 모델 등에서 결정하기 위한 검정 또는 방법을 사용하여 확인될 것이다. 일부 실시 형태에서, 변이체는 야생형 Fc(또는 모 폴리펩티드)보다 ADCC를 매개하는 데 있어서 약 5배 내지 약 100배, 예를 들어 약 25 내지 약 50배 더 효과적이다.
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에서의 표적 세포의 용해를 지칭한다. 고전적 보체 경로의 활성화는 동종 항원에 결합된 (적절한 하위부류의) 항체에 대한 보체 시스템의 제1 성분(C1q)의 결합에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, 예를 들어 문헌[Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 검정이 수행될 수 있다. Fc 영역 아미노산 서열이 변경되고 C1q 결합능이 증가 또는 감소된 폴리펩티드 변이체가 미국 특허 제6,194,551B1호 및 국제 특허 출원 공개 WO99/51642호에 기재되어 있다. 이러한 특허 공보의 내용은 구체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 또한, 문헌[Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]을 참조한다.
달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 축퇴된 버전인 그리고 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 또는 RNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이라는 어구는 또한 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 어떤 버전에서 인트론(들)을 함유할 수 있는 정도까지 인트론을 포함할 수 있다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 조절 서열과 이종 핵산 서열 사이의 기능적 결합을 지칭하는 것으로, 그 결과로서 후자가 발현된다. 예를 들어, 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계에 놓여 있을 때, 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 작동가능하게 연결되어 있다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 주는 경우, 프로모터는 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있다. 일반적으로, 작동가능하게 연결된 DNA 서열들은 인접해 있으며, 2개의 단백질 코딩 영역을 결합시킬 필요가 있는 경우, 동일한 판독 프레임 내에 있다.
"상동성"은 2개의 폴리펩티드들 사이 또는 2개의 핵산 분자들 사이의 서열 유사성 또는 서열 동일성을 지칭한다. 2개의 비교된 양쪽 서열 내의 한 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 하위단위에 의해 점유될 때, 예를 들어 2개의 각각의 DNA 분자 내의 한 위치가 아데닌에 의해 점유되는 경우, 이들 분자는 그 위치에서 상동이다. 2개의 서열들 사이의 "상동성의 %"는 2개의 서열에 의해 공유된 매칭되거나 상동인 위치의 수를 비교되는 위치의 수로 나누어서 100을 곱한 값의 함수이다. 예를 들어, 2개의 서열 내의 위치의 10개 중 6개가 매칭되거나 상동인 경우, 2개의 서열은 60% 상동성이다. 예로서, DNA 서열 ATTGCC와 TATGGC는 50% 상동성을 공유한다. 일반적으로, 비교는 2개의 서열이 최대 상동성을 제공하도록 정렬될 때 이루어진다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 항-GPC3 작제물 또는 조성물의 "유효량"은 구체적으로 언급된 목적을 수행하기에 충분한 양이다. "유효량"은 언급된 목적에 관하여 경험적으로 그리고 알려진 방법에 의해 결정될 수 있다.
용어 "치료적 유효량"은 개체에서 질병 또는 장애를 "치료하는" 데 효과적인, 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-GPC3 작제물 또는 조성물의 양을 지칭한다. 암의 경우에, 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-GPC3 작제물 또는 조성물의 치료적 유효량은 암 세포의 수를 감소시킬 수 있고/있거나; 종양 크기 또는 중량을 감소시킬 수 있고/있거나; 말초 기관 내로의 암 세포 침윤을 억제(즉, 어느 정도까지 둔화, 및 바람직하게는 정지)할 수 있고/있거나; 종양 전이를 억제(즉, 어느 정도까지 둔화, 및 바람직하게는 정지)할 수 있고/있거나; 종양 성장을 어느 정도까지 억제할 수 있고/있거나; 암과 관련된 증상들 중 하나 이상을 어느 정도까지 완화시킬 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-GPC3 작제물 또는 조성물이 기존의 암 세포의 성장을 예방하고/하거나 그것을 사멸시킬 수 있는 한에 있어서, 그것은 세포분열억제성(cytostatic) 및/또는 세포독성일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 치료적 유효량은 성장 억제량이다. 일부 실시 형태에서, 치료적 유효량은 환자의 생존을 연장시키는 양이다. 일부 실시 형태에서, 치료적 유효량은 환자의 무진행 생존율을 개선하는 양이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "약제학적으로 허용되는" 또는 "약리학적으로 적합한"은 생물학적으로 또는 다른 방식으로 바람직한 물질을 의미하며, 예를 들어 이러한 물질은 임의의 유의한 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하지 않거나, 이를 함유한 조성물의 임의의 다른 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않으면서 환자에게 투여되는 약제학적 조성물 내로 혼입될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제는 바람직하게는 독성 시험 및 제조 시험의 요구되는 기준을 충족하고/하거나, 미국 식품의약국(U.S. Food and Drug administration)에 의해 작성된 불활성 성분 지침서(Inactive Ingredient Guide)에 포함되어 있다.
본 명세서에 사용될 때, 용어 "표지"는 항-GPC3 항체 모이어티에 직접적으로 또는 간접적으로 접합될 수 있는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지는 그 자체로 검출가능할 수 있거나(예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소 표지의 경우, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매할 수 있다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 실시 형태는 실시 형태로 "이루어지는" 및/또는 "실질적으로 이루어지는"을 포함하는 것으로 이해된다.
본 명세서에서의 "약" 값 또는 파라미터에 관한 언급은 값 또는 파라미터 그 자체에 관한 변화량을 포함한다(그리고 기술한다). 예를 들어, "약 X"에 관한 기재는 "X"의 기재를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 값 또는 파라미터가 "아닌" 것에 관한 언급은 일반적으로 값 또는 파라미터 "이외의" 것을 의미하고 기재한다. 예를 들어, 본 방법이 유형 X의 암을 치료하는 데 사용되지 않는다는 것은 상기 방법이 X 이외의 유형의 암을 치료하는 데 사용된다는 것을 의미한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용되는 단수형 "부정관사(a)", "또는" 및 "정관사(the)"는 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다.
항-GPC3 작제물
일 태양에서, 본 발명은 GPC3에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티를 포함하는 GPC3-특이적 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)을 제공한다. 항-GPC3 작제물의 특이성은 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티, 예컨대 전장 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, GPC3에 특이적으로 결합하는 모이어티(예컨대, 항체 모이어티)에 대한 언급은 상기 모이어티가 비표적에 대한 그의 결합 친화도의 적어도 약 10배(예를 들어, 적어도 약 10, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107배 중 어느 하나를 포함함)의 친화도로 GPC3에 결합함을 의미한다. 일부 실시 형태에서, 비표적은 GPC3이 아닌 항원이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티의 경우, 비표적은 가용성 GPC3이다. 일부 실시 형태에서, 항-sGPC3 항체 모이어티의 경우, 비표적은 세포 표면-결합된 GPC3이다. 결합 친화도는 ELISA, 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석, 또는 방사면역침전 검정(RIA)과 같은 당업계에 알려진 방법에 의해 결정될 수 있다. Kd는, 예를 들어 (Amersham Biosciences에서 제조된) BIACORE™ 기기를 이용하는 표면 플라즈몬 공명(SPR) 검정, 또는 예를 들어 Sapidyne 기기를 이용하는 속도론적 배제 검정(KinExA)과 같은 당업계에 알려진 방법에 의해 결정될 수 있다.
고려되는 항-GPC3 작제물은, 예를 들어 항-GPC3 scFv, 항-GPC3 Fc 융합 단백질, 전장 항-GPC3 항체, 다중특이성(예컨대, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 탠덤 다이-scFv 이중특이성 T 세포 인게이저(engager)), 항-GPC3 키메라 항원 수용체(CAR), 항-GPC3 키메라 항체-T 세포 수용체(caTCR), 및 항-GPC3 면역접합체를 포함한다.
상이한 태양들이 하기의 다양한 섹션에서 더 상세히 논의된다.
인간 서열(즉, 인간 CDR 서열을 포함하는 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열)을 함유하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물을 사용하는 실시 형태가 본 명세서에 광범위하게 논의되어 있지만, 본 발명은 또한 비인간 항-GPC3 작제물을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 비인간 항체 작용제(antibody agent)는 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 작용제로부터의 인간 CDR 서열 및 비인간 프레임워크 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 비인간 프레임워크 서열은 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 인간 CDR 서열을 사용하여 합성 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 생성하는 데 사용될 수 있는 임의의 서열을 포함하며, 이러한 서열에는, 예를 들어 포유류, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 소(예를 들어, 암소, 황소, 버팔로), 사슴, 양, 염소, 닭, 고양이, 개, 페럿, 영장류(예를 들어, 마모셋, 벵골 원숭이) 등이 포함된다. 일부 실시 형태에서, 제공된 항체 작용제는 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 인간 CDR 서열을 비인간 프레임워크 서열(예를 들어, 마우스 또는 닭 프레임워크 서열) 상에 그래프팅함으로써 생성되는 항체 작용제를 포함한다. 많은 실시 형태에서, 제공된 항체 작용제는 인간 항체 작용제이다.(예를 들어, 인간 단일클론 항체 또는 이의 단편, 인간 항원-결합 단백질 또는 폴리펩티드, 인간 다중특이성 결합제[예를 들어, 인간 이중특이성 항체], 인간 면역글로불린 폴리펩티드의 하나 이상의 구조적 성분을 갖는 인간 폴리펩티드).
항-GPC3 항체 모이어티
항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)은 GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식한다(본 명세서에서 "항-nGPC3 항체 모이어티"로 지칭됨). 일부 실시 형태에서, nGPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 sGPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고, 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 표면 상에 GPC3을 발현하는 세포는 HepG2, Hep3B, Huh7, JHH-7, 또는 293이다. 일부 실시 형태에서, 세포는 비정상적으로 높은 수준의 GPC3을 그의 표면 상에 제시한다. 일부 실시 형태에서, 세포는 암 세포이다. 일부 실시 형태에서, 암 세포는 고형 종양(예컨대, 간암, 예를 들어 HCC) 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 암 세포는 전이성 암 세포(예컨대, 전이성 HCC)이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 가용성 GPC3을 특이적으로 인식한다(본 명세서에서 "항-sGPC3 항체 모이어티"로 지칭됨). 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 nGPC3 및 sGPC3 둘 모두를 특이적으로 인식한다.
글리피칸 3(GPC3)
글리피칸 3(GPC3)은 세포의 표면 상에 존재하는 헤파린 설페이트 프로테오글리칸 패밀리에 속하는 종양태아성 항원으로서, 이는 세포-세포외 기질 계면에서의 세포 신호전달에 관여한다. GPC3은 발달 동안 태아 간 및 태반에서 발현되며, 정상 성인 조직에서 하향 조절되거나 침묵된다. 이러한 발달 단계- 및 조직-특이적 발현 방식은 GPC3이 형태형성에 관여할 수 있음을 시사한다.
GPC3 유전자는 580개의 아미노산의 70 kDa 전구체 단백질을 인코딩한다. 소포체 내로의 전위(translocation) 시에, N-말단 신호 펩티드(SS; 잔기 1 내지 24) 및 C-말단 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 앵커 부가 신호(예측된 절단 부위: S560)가 제거하고, 후자가 GPI 앵커로 대체한다. GPC3 전구체 단백질은 Arg358과 Ser359 사이에서 푸린에 의해 절단되어, 이황화물 결합에 의해 연결된 40 kDa N-말단 하위단위(Q25 내지 R358) 및 30 kDa C-말단 하위단위(S359에서 시작함)를 생성할 수 있다. GPC3의 C-말단은 GPI 앵커를 통해 막에 연결되고, 세포 표면에 가까운 2개의 O-연결된 헤파린 설페이트(HS) 측쇄에 의해 번역후 변형된다. 1차 아미노산 서열에 기초하여, N-말단 하위단위, C-말단 하위단위, 및 2개의 HS 글리칸 사슬은 GPC3의 3개의 기능성 도메인을 형성한다. N-말단 하위단위와 C-말단 하위단위는 GPC3의 코어 단백질을 형성한다.
GPC3 상의 음으로 하전된 HS 사슬은 기능적으로 중요한 글리코사미노글리칸이다. 이들은 양으로 하전된 성장 인자, 예컨대 HGF, 섬유아세포 성장 인자(FGF), Wnt, 헤지호그 및 골 형태형성 단백질에 결합할 수 있다. 따라서, HS 사슬은 세포 상황에 따라 이들 성장 인자에 대한 "도킹 부위(docking site)"로서의 역할을 할 수 있다.
GPC3의 N-말단 하위단위는 GPC3의 N-말단 펩티드이고 약 40 kDa이며, 이는 GPC3 코어 단백질의 가용성 형태로 발견된다. 일부 실시 형태에서, N-말단 하위단위는 Met1 내지 Arg358을 포함하는 아미노산 서열의 펩티드이다. 일부 실시 형태에서, N-말단 하위단위는 Gln25 내지 Arg358을 포함하는 아미노산 서열의 펩티드이다. 본 발명에 따르면, 그러한 N-말단 펩티드의 단편이 또한 사용될 수 있으며, 이는 본 명세서에서 GPC3 N-말단 단편으로 지칭된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 GPC3 단백질의 N-말단 하위단위 상에 존재하는 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 GPC3 단백질의 N-말단 하위단위(또는 이의 단편)를 특이적으로 인식하는 항체 모이어티는 GPC3의 가용성 포맷에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, GPC3 단백질의 N-말단 하위단위(또는 이의 단편)를 특이적으로 인식하는 항체 모이어티는 GPC3의 천연 포맷에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, GPC3 단백질의 N-말단 하위단위(또는 이의 단편)를 특이적으로 인식하는 항체 모이어티는 nGPC3 및 sGPC3 둘 모두에 결합할 수 있다.
GPC3의 C-말단 하위단위는 GPC3의 C-말단 펩티드이고 약 30 kDa이다. 상기 언급된 절단 부위에 기초하여, 일부 실시 형태에서, C-말단 하위단위는 Ser359 내지 His580을 포함하는 아미노산 서열의 펩티드이다. 일부 실시 형태에서, C-말단 하위단위는 Ser359 내지 Ser560을 포함하는 아미노산 서열의 펩티드이다. 본 발명에 따르면, 그러한 C-말단 펩티드의 단편이 또한 사용될 수 있으며, 이는 본 명세서에서 GPC3 C-말단 단편으로 지칭된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 GPC3 단백질의 C-말단 하위단위 상에 존재하는 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 GPC3 단백질의 C-말단 하위단위(또는 이의 단편)를 특이적으로 인식하는 항체 모이어티는 GPC3의 가용성 포맷에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, GPC3 단백질의 C-말단 하위단위(또는 이의 단편)를 특이적으로 인식하는 항체 모이어티는 GPC3의 천연 포맷에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, GPC3 단백질의 C-말단 하위단위(또는 이의 단편)를 특이적으로 인식하는 항체 모이어티는 nGPC3 및 sGPC3 둘 모두에 결합할 수 있다.
본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물은 당업계에 알려진 항체, 예컨대 GC33(문헌[Ishiguro et al., Cancer Res 2008; 68:9832-9838])과 동일한 GPC3 상의 에피토프(예를 들어, 서열 번호 510)에 결합하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 GC33과 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 GPC3 에피토프에 특이적으로 결합하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 536의 아미노산 서열 내의 에피토프에 결합하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 536의 아미노산 서열을 포함하는 단편에 결합하지 않는다.
GPC3은 다양한 암, 특히 HCC, 흑색종, 폐 편평 세포 암종, 난소 암종, 난황낭 종양, 융모막암종, 신경아세포종, 빌름스 종양, 및 지질육종에서 발현되는 것으로 보고되어 있다. 따라서, GPC3은 잠재적으로 항체-기반 면역요법 및 세포-기반 면역요법 둘 모두에 대한 치료 표적으로서의 역할을 할 수 있다. 특히, GPC3이 HCC에서 고도로 발현되고, HCC 종양의 70% 초과에서 발현되지만 정상 간 조직에서는 그렇지 않은 것을 고려하면, GPC3은 간암 요법에 대한 유망한 후보일 수 있다. GPC3-양성 암을 갖는 일부 환자의 경우, GPC3의 가용성 포맷이 혈액 중에 검출될 수 있다. 따라서, GPC3의 가용성 포맷 및 천연 포맷은 둘 모두 암 진단, 예컨대 HCC 진단을 위한 유용한 바이오마커로서의 역할을 할 수 있다. GPC3-양성 HCC 환자는 GPC3-음성 HCC 환자보다 유의하게 더 낮은 5년 생존율을 갖는 것으로 밝혀졌다. 따라서, GPC3 발현은 HCC에서의 불량한 예후와 상관된다.
GPC3 세포 표면 국소화는 HCC에서 세포 성장 및 Wnt 활성화에 중요하다. GPC3은 그의 코어 단백질을 통해 Wnt에 결합한다. GPC3은 Wnt와 그의 신호전달 수용체인 프리즐드(Frizzled, Fz)의 상호작용을 촉진 및/또는 안정화시킴으로써 Wnt 신호전달을 자극하는 것으로 가설화하였다. 흥미롭게도, HCC 환자의 대략 50%가 혈청 중에 분비된 GPC3을 갖는 것으로 나타났다. 그러나, 암 환자의 순환 혈액에 어떤 형태의 GPC3이 존재하는지는 명확하지 않다. 세포외 리파제인 노텀(Notum)은 종양 세포로부터 GPC3을 절단하여 세포외 환경 내로 보내는 것을 담당할 수 있다.
일부 실시 형태에서, (nGPC3 및/또는 sGPC3에 대한) 본 명세서에 기재된 항-GPC3 항체 모이어티는 인간 GPC3 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 예시적인 인간 GPC3의 완전한 아미노산 서열은 UniProt 번호 P51654(서열 번호 460)를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 서열을 포함하는 인간 GPC3 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 1 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 461)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 580개 내의 에피토프(서열 번호 462)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 463)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 GPC3의 N-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 1 내지 358 내의 에피토프(서열 번호 468)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 358 내의 에피토프(서열 번호 464)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 465)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 580 내의 에피토프(서열 번호 466)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 헤파린 설페이트 측쇄가 결여된 GPC3 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 헤파린 설페이트 측쇄(들)를 갖는 GPC3 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 헤파린 설페이트 측쇄가 결여된 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 510 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 467)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 R358/S359에 있는 푸린 절단 부위에 걸쳐 있는 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 전장 성숙 인간 GPC3(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 560 또는 25 내지 580)에는 특이적으로 결합할 수 있지만, 인간 GPC3의 N-말단 단편(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 358) 또는 인간 GPC3의 C-말단 단편(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 560 또는 359 내지 580)에는 결합하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 재조합 인간 GPC3 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고, 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3은 서열 번호 460 또는 서열 번호 462의 아미노산 서열을 포함한다(그리고 일부 실시 형태에서는 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진다). 일부 실시 형태에서, 가용성 GPC3은 혈청 중의 순환 GPC3 단백질 또는 유리 GPC3 펩티드이다. 일부 실시 형태에서, 가용성 GPC3은 용액 중에 존재하는 GPC3 단백질 또는 펩티드이다. 일부 실시 형태에서, 가용성 GPC3은 서열 번호 461 또는 서열 번호 463의 아미노산 서열을 포함한다(그리고 일부 실시 형태에서는 이로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진다). 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 인간 이외의 종으로부터의 GPC3과 교차-반응할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 하나 이상의 인간 GPC3 단백질에 대해 완전히 특이적일 수 있고, 종 또는 다른 유형의 비인간 교차-반응성을 나타내지 않을 수 있다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 GPC3 단백질(또는 이의 단편)의 적어도 하나의 대립유전자 변이체와 교차-반응한다. 일부 실시 형태에서, 대립유전자 변이체는 천연 발생 GPC3(또는 이의 단편)과 대비하여 최대 약 30개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 또는 30개 중 어느 하나)의 아미노산 치환(예컨대, 보존적 치환)을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 GPC3 단백질(또는 이의 단편)의 어떠한 대립유전자 변이체와도 교차-반응하지 않는다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 GPC3 단백질의 적어도 하나의 종간 변이체(interspecies variant)와 교차-반응한다. 일부 실시 형태에서, 예를 들어 GPC3 단백질(또는 이의 단편)은 인간 GPC3이고, GPC3 단백질(또는 이의 단편)의 종간 변이체는 이의 마우스 또는 래트 변이체이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 GPC3 단백질의 어떠한 종간 변이체와도 교차-반응하지 않는다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 HepG2, Hep3B, Huh7, JHH-7, 또는 293 세포의 세포 표면 상에서 발현되는 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 암 세포(예컨대, 고형 종양)의 세포 표면 상에서 발현되는 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 간암(예컨대, HCC), 흑색종, 폐 편평 세포 암종, 난소 암종, 난황낭 종양, 융모막암종, 신경아세포종, 빌름스 종양, 간아세포종, 고환 비정상피종성 생식 세포 종양, 위 암종, 또는 지질육종의 세포 표면 상에서 발현되는 GPC3을 특이적으로 인식한다.
결합 친화도
결합 친화도는 Kd, Koff, Kon, 또는 Ka에 의해 표시될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "Koff"는, 속도론적 선택 설정(kinetic selection set up)으로부터 결정될 때, 항체 모이어티/항원 복합체로부터 항체 모이어티의 해리에 대한 해리 속도 상수(off-rate constant)를 지칭하는 것으로 의도된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "Kon"은 항체 모이어티/항원 복합체를 형성하기 위한 항원에 대한 항체 모이어티의 회합에 대한 결합 속도 상수(on-rate constant)를 지칭하는 것으로 의도된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 평형 해리 상수 "Kd"는 특정 항체 모이어티-항원 상호작용의 해리 상수를 지칭하며, 평형 상태에서 항체 분자의 용액 중에 존재하는 항체-결합 도메인 전부 중 절반을 차지하는 데 필요한 항원의 농도를 기술하고, Koff/Kon과 동일하다. Kd의 측정은 모든 결합제가 용액 상태인 것으로 추정된다. 항체 모이어티가, 예를 들어 효모 발현 시스템에서, 세포벽에 테더링되는 경우, 상응하는 평형 속도 상수는 EC50으로 표현되며, 이는 Kd의 우수한 근사치를 제공한다. 친화도 상수 Ka는 해리 상수 Kd의 역수이다.
해리 상수(Kd)는 항원에 대한 항체 모이어티의 친화성을 나타내는 지표로서 사용된다. 예를 들어, 다양한 마커제로 마킹된 항체를 사용하는 스캐차드(Scatchard) 방법에 의해서뿐만 아니라, 사용자의 매뉴얼 및 부착된 키트에 따른, 표면 플라즈몬 공명에 의한 생체분자 상호작용의 분석인 BIACORE™를 사용함으로써 용이한 분석이 가능하다. 이들 방법을 사용하여 도출될 수 있는 Kd 값은 M(몰) 단위로 표현된다. 표적에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티는, 예를 들어 ≤ 10-7 M, ≤ 10-8 M, ≤ 10-9 M, ≤ 10-10 M, ≤ 10-11 M, ≤ 10-12 M, 또는 ≤ 10-13 M의 Kd를 가질 수 있다.
항체 모이어티의 결합 특이성은 당업계에 알려진 방법에 의해 실험적으로 결정될 수 있다. 그러한 방법은 웨스턴 블롯(Western blot), ELISA-, RIA-, ECL-, IRMA-, EIA-, BIACORE™-시험 및 펩티드 스캔을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 표면 상에 GPC3을 발현하는 세포(예를 들어, HepG2 세포)에 대한 항-GPC3 항체 모이어티의 결합 친화도를 시험함으로써 측정된다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식한다(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항체 모이어티의 결합 친화도는 가용성 GPC3에 대한 것보다 더 높다). 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고, 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는, 예를 들어 유세포측정을 사용하는, 가용성 GPC3 항원과의 경쟁적 결합 검정에서 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는, 항-nGPC3 항체 모이어티가 경쟁적 결합 검정에서 가용성 GPC3 항원과 사전-인큐베이션되었을 때, 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물은 다양한 농도의 가용성 GPC3 항원(예를 들어, 재조합 GPC3 단편)과 사전-인큐베이션될 수 있고, 이어서 GPC3+ 세포(예를 들어, HepG2 세포)가 항체/항원 혼합물에 첨가되고 인큐베이션될 수 있고, 이어서 세포 표면-결합된 항-GPC3 작제물이 검출될 수 있다: GPC3+ 세포에 대한 가용성 GPC3 사전-인큐베이션된 항-GPC3 작제물의 결합은 가용성 GPC3 사전-인큐베이션이 없는 상태에서의 GPC3+ 세포에 대한 항-GPC3 작제물의 결합과 대비하여 유의한 차이를 나타내지 않을 수 있는데, 이는 항-GPC3 항체 모이어티가 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식할 수 있거나, 또는 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 항-GPC3 항체 모이어티가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함을 입증한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M(예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)의 Kd로 표적 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적으로 결합한다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 nGPC3 사이의 결합의 Kd, 항-sGPC3 항체 모이어티와 sGPC3 사이의 결합의 Kd, 또는 항-GPC3 항체 모이어티와 GPC3(임의의 포맷) 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 1×10-7 M 내지 약 5×10-13 M, 약 10-7 M 내지 약 10-12 M, 약 10-7 M 내지 약 10-11 M, 약 10-7 M 내지 약 10-10 M, 약 10-7 M 내지 약 10-9 M, 약 10-8 M 내지 약 10-13 M, 약 1×10-8 M 내지 약 5×10-13 M, 약 10-8 M 내지 약 10-12 M, 약 10-8 M 내지 약 10-11 M, 약 10-8 M 내지 약 10-10 M, 약 10-8 M 내지 약 10-9 M, 약 5×10-9 M 내지 약 1×10-13 M, 약 5×10-9 M 내지 약 1×10-12 M, 약 5×10-9 M 내지 약 1×10-11 M, 약 5×10-9 M 내지 약 1×10-10 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-12 M, 약 10-9 M 내지 약 10-11 M, 약 10-9 M 내지 약 10-10 M, 약 5×10-10 M 내지 약 1×10-13 M, 약 5×10-10 M 내지 약 1×10-12 M, 약 5×10-10 M 내지 약 1×10-11 M, 약 10-10 M 내지 약10-13 M, 약 1×10-10 M 내지 약 5×10-13 M, 약 1×10-10 M 내지 약 1×10-12 M, 약 1×10-10 M 내지 약 5×10-12 M, 약 1×10-10 M 내지 약 1×10-11 M, 약 10-11 M 내지 약 10-13 M, 약 1×10-11 M 내지 약 5×10-13 M, 약 10-11 M 내지 약 10-12 M, 또는 약 10-12 M 내지 약 10-13 M이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 nGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M이다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티와 비표적 사이의 결합의 Kd는 항-GPC3 항체 모이어티와 표적 사이의 결합의 Kd보다 더 크며, 일부 실시 형태에서는 표적(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3)에 대한 항-GPC3 항체 모이어티의 결합 친화도가 비표적(예를 들어, 가용성 GPC3)에 대한 결합 친화도보다 더 높은 것으로 본 명세서에서 지칭된다. 일부 실시 형태에서, 비표적은 GPC3이 아닌 항원이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티의 경우, 비표적은 가용성 GPC3이다. 일부 실시 형태에서, 항-sGPC3 항체 모이어티의 경우, 비표적은 세포 표면-결합된 GPC3이다. 예를 들어, 항-nGPC3 항체 모이어티와 가용성 GPC3 사이의 결합의 Kd는 항-nGPC3 항체 모이어티와 세포 표면-결합된 GPC3의 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배, 예컨대 약 10 내지 100배, 약 100 내지 1000배, 약 103 내지 104배, 약 104 내지 105배, 약 105 내지 106배, 약 106 내지 107배, 약 107 내지 108배, 약 108 내지 109배, 약 109 내지 1010배, 약 1010 내지 1011배, 또는 약 1011 내지 1012배일 수 있다. 또한 예를 들어, 항-sGPC3 항체 모이어티와 세포 표면-결합된 GPC3 사이의 결합의 Kd는 항-sGPC3 항체 모이어티와 가용성 GPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배, 예컨대 약 10 내지 100배, 약 100 내지 1000배, 약 103 내지 104배, 약 104 내지 105배, 약 105 내지 106배, 약 106 내지 107배, 약 107 내지 108배, 약 108 내지 109배, 약 109 내지 1010배, 약 1010 내지 1011배, 또는 약 1011 내지 1012배일 수 있다. 일부 실시 형태에서, (nGPC3 및/또는 sGPC3에 대한) 항-GPC3 항체 모이어티와 GPC3 비표적 사이의 결합의 Kd는 항-GPC3 항체 모이어티와 표적 GPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배, 예컨대 약 10 내지 100배, 약 100 내지 1000배, 약 103 내지 104배, 약 104 내지 105배, 약 105 내지 106배, 약 106 내지 107배, 약 107 내지 108배, 약 108 내지 109배, 약 109 내지 1010배, 약 1010 내지 1011배, 또는 약 1011 내지 1012배일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 가용성 GPC3 사이의 결합의 Kd는 항-nGPC3 항체 모이어티와 세포 표면-결합된 GPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배이다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M(예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)의 Kd로 비표적에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 비표적은 GPC3이 아닌 항원이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티의 경우, 비표적은 가용성 GPC3이다. 일부 실시 형태에서, 항-sGPC3 항체 모이어티의 경우, 비표적은 세포 표면-결합된 GPC3이다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티와 GPC3 비표적 사이의 결합의 Kd, 항-nGPC3 항체 모이어티와 가용성 GPC3 사이의 결합의 Kd, 또는 항-sGPC3 항체 모이어티와 세포 표면-결합된 GPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 1×10-1 M 내지 약 5×10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 약 1×10-1 M 내지 약 5×10-5 M, 약 10-1 M 내지 약 10-4 M, 약 1×10-1 M 내지 약 5×10-4 M, 약 10-1 M 내지 약 10-3 M, 약 1×10-1 M 내지 약 5×10-3 M, 약 10-1 M 내지 약 10-2 M, 약 10-2 M 내지 약 10-6 M, 약 1×10-2 M 내지 약 5×10-6 M, 약 10-2 M 내지 약 10-5 M, 약 1×10-2 M 내지 약 5×10-5 M, 약 10-2 M 내지 약 10-4 M, 약 1×10-2 M 내지 약 5×10-4 M, 약 10-2 M 내지 약 10-3 M, 약 10-3 M 내지 약 10-6 M, 약 1×10-3 M 내지 약 5×10-6 M, 약 10-3 M 내지 약 10-5 M, 약 1×10-3 M 내지 약 5×10-5 M, 약 10-3 M 내지 약 10-4 M, 약 10-4 M 내지 약 10-6 M, 약 1×10-4 M 내지 약 5×10-6 M, 약 10-4 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-5 M 내지 약 10-6 M이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 가용성 GPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M이다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항-nGPC3 항체 모이어티는 가용성 GPC3에 결합하지 않는다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티가 높은 결합 친화도로 표적 GPC3(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3)을 특이적으로 인식하고, 낮은 결합 친화도로 비표적(예를 들어, 가용성 GPC3)에 결합하는 것으로 언급될 때, 항-GPC3 항체 모이어티는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M(예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)의 Kd로 표적 GPC3(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3)에 결합할 것이고, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M(예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)의 Kd로 비표적(예를 들어, 가용성 GPC3)에 결합할 것이다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티가 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 것으로(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항체 모이어티의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높은 것으로) 언급될 때, 또는 항-GPC3 항체 모이어티가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 반면, 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합하는 것으로 언급될 때, 항-GPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 대조 항-GPC3 항체, 예컨대 단일클론 항체 GC33과 대비된다. 일부 실시 형태에서, GC33(예를 들어, 서열 번호 510)과 세포 표면-결합된 GPC3 사이의 결합의 Kd는 본 명세서에 기재된 항-nGPC3 항체 모이어티와 세포 표면-결합된 GPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 2배, 예컨대 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 10 내지 100배, 약 100 내지 1000배, 약 103 내지 104배, 약 104 내지 105배, 약 105 내지 106배, 약 106 내지 107배, 약 107 내지 108배, 약 108 내지 109배, 약 109 내지 1010배, 약 1010 내지 1011배, 또는 약 1011 내지 1012배일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-GPC3 작제물의 Kd는 약 0.1 nM 내지 약 2 nM, 예컨대 약 0.1 nM 내지 약 0.5 nM, 약 0.5 nM 내지 약 1 nM, 또는 약 1.5 내지 약 2 nM이다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 항-nGPC3 항체 모이어티와 가용성 GPC3 사이의 결합의 Kd는 GC33(예를 들어, 서열 번호 510)과 가용성 GPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 2배, 예컨대 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 10 내지 100배, 약 100 내지 1000배, 약 103 내지 104배, 약 104 내지 105배, 약 105 내지 106배, 약 106 내지 107배, 약 107 내지 108배, 약 108 내지 109배, 약 109 내지 1010배, 약 1010 내지 1011배, 또는 약 1011 내지 1012배일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-GPC3 작제물의 Kd는 약 10 nM 내지 약 100 nM, 예컨대 약 10 nM 내지 약 20 nM, 약 20 nM 내지 약 40 nM, 약 40 nM 내지 약 80 nM 또는 약 80 nM 내지 약 100 nM이다. 일부 실시 형태에서, 대조 항-GPC3 항체와 세포 표면-결합된 GPC3 사이의 결합의 Kd는 본 명세서에 기재된 항-nGPC3 항체 모이어티와 세포 표면-결합된 GPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 2배, 예컨대 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 10 내지 100배, 약 100 내지 1000배, 약 103 내지 104배, 약 104 내지 105배, 약 105 내지 106배, 약 106 내지 107배, 약 107 내지 108배, 약 108 내지 109배, 약 109 내지 1010배, 약 1010 내지 1011배, 또는 약 1011 내지 1012배일 수 있으며, 대조 항체는 i) 서열 번호 503의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 또는 서열 번호 503과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 및 ii) 서열 번호 504의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 또는 서열 번호 504와 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 항-nGPC3 항체 모이어티와 가용성 GPC3 사이의 결합의 Kd는 대조 항-nGPC3 항체와 가용성 GPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 2배, 예컨대 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 10 내지 100배, 약 100 내지 1000배, 약 103 내지 104배, 약 104 내지 105배, 약 105 내지 106배, 약 106 내지 107배, 약 107 내지 108배, 약 108 내지 109배, 약 109 내지 1010배, 약 1010 내지 1011배, 또는 약 1011 내지 1012배일 수 있으며, 대조 항체는 i) 서열 번호 503의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 또는 서열 번호 503과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 및 ii) 서열 번호 504의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 또는 서열 번호 504와 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 대조 항-GPC3 항체와 세포 표면-결합된 GPC3 사이의 결합의 Kd는 본 명세서에 기재된 항-nGPC3 항체 모이어티와 세포 표면-결합된 GPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 2배, 예컨대 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 10 내지 100배, 약 100 내지 1000배, 약 103 내지 104배, 약 104 내지 105배, 약 105 내지 106배, 약 106 내지 107배, 약 107 내지 108배, 약 108 내지 109배, 약 109 내지 1010배, 약 1010 내지 1011배, 또는 약 1011 내지 1012배일 수 있으며, 대조 항체는 i) 서열 번호 497의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 498의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 499의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 500의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 501의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 502의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 항-nGPC3 항체 모이어티와 가용성 GPC3 사이의 결합의 Kd는 대조 항-GPC3 항체와 가용성 GPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 2배, 예컨대 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 약 10 내지 100배, 약 100 내지 1000배, 약 103 내지 104배, 약 104 내지 105배, 약 105 내지 106배, 약 106 내지 107배, 약 107 내지 108배, 약 108 내지 109배, 약 109 내지 1010배, 약 1010 내지 1011배, 또는 약 1011 내지 1012배일 수 있으며, 대조 항체는 i) 서열 번호 497의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 498의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 499의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 500의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 501의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 502의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물과 세포 표면-결합된 GPC3 사이의 경쟁적 결합에 대한 가용성 GPC3의 IC50은 약 1 ㎍/ml 내지 약 100 ㎍/ml, 예컨대 약 1 ㎍/ml 내지 약 5 ㎍/ml, 1 ㎍/ml 내지 약 10 ㎍/ml, 약 10 ㎍/ml 내지 약 20 ㎍/ml, 약 20 ㎍/ml 내지 약 50 ㎍/ml, 또는 50 ㎍/ml 내지 약 100 ㎍/ml이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물과 세포 표면-결합된 GPC3 사이의 경쟁적 결합에 대한 가용성 GPC3의 IC50은 대조 항-GPC3 항체(예컨대, GC33)와 세포 표면-결합된 GPC3 사이의 경쟁적 결합에 대한 가용성 GPC3의 IC50의 적어도 약 2x, 3x, 4x, 5x, 10x, 20x, 50x, 100x, 또는 그 이상 중 어느 하나이다.
항-GPC3 항체 모이어티 포맷
본 명세서에 기재된 (예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3에 대한) 항-GPC3 항체 모이어티는 임의의 항체 또는 항원-결합 단편 포맷일 수 있다.
일부 실시 형태에서, (예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3에 대한) 항-GPC3 항체 모이어티는 전장 항체 또는 면역글로불린 유도체이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 항원-결합 단편, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, 이황화물 안정화된 Fv 단편(dsFv), 또는 단일쇄 Fv(scFv)로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원-결합 단편이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 Fab 또는 Fab'이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 항체 모이어티이다.
일부 실시 형태에서, (nGPC3 및/또는 sGPC3에 대한) 항-GPC3 항체 모이어티는 완전 인간 서열 및 하나 이상의 합성 영역을 포함하는 반합성 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 완전 인간 경쇄 가변 도메인 및 반합성 중쇄 가변 도메인을 포함하는 반합성 항체 모이어티이며, 이때 반합성 중쇄 가변 도메인은 완전 인간 FR1, HC-CDR1, FR2, HC-CDR2, FR3, 및 FR4 영역 및 합성 HC-CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 반합성 중쇄 가변 도메인은 약 5 내지 약 25개(예컨대, 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 중 어느 하나)의 아미노산 길이의 서열을 갖는 완전 합성 HC-CDR3을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 반합성 중쇄 가변 도메인 또는 합성 HC-CDR3은, 약 5 내지 약 25개(예컨대, 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 중 어느 하나)의 아미노산 길이의 서열을 가지며, 여기서 서열 내의 각각의 아미노산은 시스테인이 제거된 표준 인간 아미노산으로부터 무작위로 선택되는, 완전 합성 HC-CDR3을 포함하는 반합성 라이브러리(예컨대, 반합성 인간 라이브러리)로부터 획득된다. 일부 실시 형태에서, 합성 HC-CDR3은 약 5 내지 약 19개(예컨대, 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 19개 중 어느 하나)의 아미노산 길이이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 인간 CDR 및 비인간 프레임워크 서열을 포함하는 반합성 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 비인간 프레임워크 서열은 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 인간 CDR 서열을 사용하여 합성 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 생성하는 데 사용될 수 있는 임의의 서열을 포함하며, 이러한 서열에는, 예를 들어 포유류, 예컨대 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 소(예를 들어, 암소, 황소, 버팔로), 사슴, 양, 염소, 닭, 고양이, 개, 페럿, 영장류(예를 들어, 마모셋, 벵골 원숭이) 등이 포함된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 인간 CDR 서열을 비인간 프레임워크 서열(예를 들어, 마우스 또는 닭 프레임워크 서열) 상에 그래프팅함으로써 생성된다.
항-GPC3 항체 모이어티 서열
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 특정 서열 또는 그러한 서열의 소정의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 변이체 서열 내의 아미노산 치환은 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항-nGPC3 항체 모이어티의 능력, 가용성 GPC3을 특이적으로 인식하는 항-sGPC3 항체 모이어티의 능력, 또는 표적 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는다. 예를 들어, 표적 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3) 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 변경이 이루어질 수 있다. 표적 GPC3 결합 친화도를 실질적으로 개선하거나 또는 어떤 다른 특성, 예컨대 표적 GPC3의 관련 변이체와의 교차-반응성 및/또는 특이성에 실질적으로 영향을 미치는 변경이 또한 고려된다.
예시적인 항체 서열이 표 6 내지 표 9에 나타나 있다. 표 6 및 표 8에서의 예시적인 CDR 서열은 IgBLAST 알고리즘을 사용하여 예측된다. 예를 들어, 문헌[Ye J. et al. Nucleic Acids Research, 41: W34-W40 (2013)]을 참조하며, 이의 개시내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 당업자는 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역 내의 CDR 위치를 예측하기 위한 많은 알고리즘이 알려져 있고, 본 명세서에 기재된 항체로부터 유래하지만 IgBLAST 이외의 예측 알고리즘에 기초한 CDR을 포함하는 항체 작용제가 본 발명의 범주 내에 있음을 인식할 것이다.
표 7 및 표 9에서의 예시적인 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열은 IMGT(INTERNATIONAL IMMUNOGENETICS INFORMATION SYSTEM®)에 따라 범위가 정해진다. 예를 들어, 문헌[Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acids Res., 43:D413-422 (2015)]을 참조하며, 이의 개시내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 당업자는 본 명세서에 기재된 항체로부터 유래하지만 IMGT 이외의 알고리즘에 기초한 VH 또는 VL 서열을 포함하는 항체 작용제가 본 발명의 범주 내에 있음을 인식할 것이다.
세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식한다(항-nGPC3 항체 모이어티). 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고, 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및 ii) 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하며, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재하는, VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하며, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재하는, VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함하는 VH, 및 b) 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 중쇄 가변 도메인의 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하는 VH, 및 b) 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 CDR의 경쇄 가변 도메인의 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
중쇄 가변 도메인과 경쇄 가변 도메인은 다양한 쌍별 조합(pair-wise combination)으로 조합되어 다수의 항-nGPC3 항체 모이어티를 생성할 수 있다. 예시적인 항-nGPC3 항체가 표 6 및 표 7에 제공되어 있다.
[표 6]
Figure pct00005
[표 7]
Figure pct00006
Figure pct00007
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 103의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 205의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 256의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 103의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 205의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 256의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 103의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 205의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 256의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 104의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 155의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 206의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 257의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 104의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 155의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 206의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 257의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 104의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 155의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 206의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 257의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 156의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 207의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 258의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 156의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 207의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 258의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 156의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 207의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 258의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 106의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 157의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 208의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 259의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 106의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 157의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 208의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 259의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 55의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 106의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 157의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 208의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 259의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 158의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 209의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 260의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 158의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 209의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 260의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 56의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 107의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 158의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 209의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 260의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 159의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 210의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 261의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 159의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 210의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 261의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 108의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 159의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 210의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 261의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 160의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 211의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 262의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 160의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 211의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 262의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 160의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 211의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 262의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 110의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 161의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 212의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 263의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 110의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 161의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 212의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 263의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 110의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 161의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 212의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 263의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 111의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 162의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 213의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 264의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 111의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 162의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 213의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 264의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 60의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 111의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 162의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 213의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 264의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 163의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 214의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 265의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 163의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 214의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 265의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 112의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 163의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 214의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 265의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 164의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 215의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 266의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 164의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 215의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 266의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 62의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 113의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 164의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 215의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 266의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 165의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 216의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 267의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 165의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 216의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 267의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 165의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 216의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 267의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 166의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 217의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 268의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 166의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 217의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 268의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 166의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 217의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 268의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 167의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 218의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 269의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 167의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 218의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 269의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 167의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 218의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 269의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 168의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 219의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 270의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 168의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 219의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 270의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 117의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 168의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 219의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 270의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 169의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 220의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 271의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 169의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 220의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 271의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 118의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 169의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 220의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 271의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 170의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 221의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 272의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 170의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 221의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 272의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 119의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 170의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 221의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 272의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 222의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 273의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 222의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 273의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 120의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 171의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 222의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 273의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 172의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 223의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 274의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 172의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 223의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 274의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 121의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 172의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 223의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 274의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 173의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 224의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 275의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 173의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 224의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 275의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 122의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 173의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 224의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 275의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 174의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 225의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 276의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 174의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 225의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 276의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 72의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 123의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 174의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 225의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 276의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 175의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 226의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 277의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 175의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 226의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 277의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 124의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 175의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 226의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 277의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 176의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 227의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 278의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 176의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 227의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 278의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 74의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 125의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 176의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 227의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 278의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 126의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 177의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 228의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 279의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 126의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 177의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 228의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 279의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 75의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 126의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 177의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 228의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 279의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 127의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 178의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 229의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 280의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 127의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 178의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 229의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 280의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 127의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 178의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 229의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 280의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 128의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 179의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 230의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 281의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 128의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 179의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 230의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 281의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 77의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 128의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 179의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 230의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 281의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 180의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 231의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 282의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 180의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 231의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 282의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 78의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 180의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 231의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 282의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 181의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 232의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 283의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 181의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 232의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 283의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 79의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 130의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 181의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 232의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 283의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 131의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 182의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 233의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 284의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 131의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 182의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 233의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 284의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 131의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 182의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 233의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 284의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 132의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 183의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 234의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 285의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 132의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 183의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 234의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 285의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 132의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 183의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 234의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 285의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 133의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 184의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 235의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 286의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 133의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 184의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 235의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 286의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 133의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 184의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 235의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 286의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 307의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 307과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 358의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 358과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 307의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 358의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 307의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 358의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 308의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 308과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 359의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 359와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 308의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 359의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 308의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 359의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 309의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 309와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 360의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 360과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 309의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 360의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 309의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 360의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 310의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 310과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 361의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 361과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 310의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 361의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 310의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 361의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 311의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 311과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 362의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 362와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 311의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 362의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 311의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 362의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 312의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 312와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 363의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 363과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 312의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 363의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 312의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 363의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 313의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 313과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 364의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 364와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 313의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 364의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 313의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 364의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 314의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 314와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 365의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 365와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 314의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 365의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 314의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 365의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 315의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 315와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 366의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 366과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 315의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 366의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 315의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 366의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 316의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 316과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 367의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 367과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 316의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 367의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 316의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 367의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 317의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 317과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 368의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 368과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 317의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 368의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 317의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 368의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 318의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 318과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 369의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 369와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 318의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 369의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 318의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 369의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 319의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 319와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 370의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 370과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 319의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 370의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 319의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 370의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 320의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 320과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 371의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 371과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 320의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 371의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 320의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 371의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 321의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 321과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 372의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 372와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 321의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 372의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 321의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 372의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 322의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 322와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 373의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 373과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 322의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 373의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 322의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 373의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 323의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 323과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 374의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 374와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 323의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 374의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 323의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 374의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 324의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 324와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 375의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 375와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 324의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 375의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 324의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 375의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 325의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 325와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 376의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 376과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 325의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 376의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 325의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 376의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 326의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 326과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 377의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 377과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 326의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 377의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 326의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 377의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 327의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 327과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 378의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 378과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 327의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 378의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 327의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 378의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 328의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 328과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 379의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 379와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 328의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 379의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 328의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 379의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 329의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 329와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 380의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 380과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 329의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 380의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 329의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 380의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 330의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 330과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 381의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 381과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 330의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 381의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 330의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 381의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 331의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 331과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 382의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 382와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 331의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 382의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 331의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 382의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 332의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 332와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 383의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 383과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 332의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 383의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 332의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 383의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 333의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 333과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 384의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 384와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 333의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 384의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 333의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 384의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 334의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 334와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 385의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 385와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 334의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 385의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 334의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 385의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 335의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 335와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 386의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 386과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 335의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 386의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 335의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 386의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 336의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 336과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 387의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 387과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 336의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 387의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 336의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 387의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 337의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 337과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 388의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 388과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 337의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 388의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 337의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 388의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 임의의 항-nGPC3 항체 모이어티에 따른 제2 항-nGPC3 항체 모이어티와 경쟁한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 제2 항-nGPC3 항체 모이어티와 동일하거나 실질적으로 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합은 동일한 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 제2 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합을 적어도 약 70%만큼(예컨대, 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 중 어느 하나만큼) 억제하거나, 또는 그 역으로도 성립한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 제2 항-nGPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3에 결합하기 위하여 교차-경쟁하며, 즉 각각의 항-nGPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3에 결합하기 위하여 다른 하나와 경쟁한다.
GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 가용성 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 가용성 GPC3에 대한 항-sGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-sGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 461의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-sGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 510 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 467)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3 및 가용성 GPC3 둘 모두를 특이적으로 인식한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및 ii) 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하며, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재하는, VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하며, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재하는, VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함하는 VH, 및 b) 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 중쇄 가변 도메인의 HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함하는 VH, 및 b) 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 CDR의 경쇄 가변 도메인의 LC-CDR1, LC-CDR2 및 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
중쇄 가변 도메인과 경쇄 가변 도메인은 다양한 쌍별 조합으로 조합되어 다수의 항-GPC3 항체 모이어티를 생성할 수 있다. 예시적인 항-GPC3 항체 모이어티가 표 8 및 표 9에 제공되어 있다.
[표 8]
Figure pct00008
[표 9]
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 134의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 236의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 287의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 134의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 236의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 287의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 32의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 83의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 134의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 236의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 287의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 135의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 186의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 237의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 288의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 135의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 186의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 237의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 288의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 84의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 135의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 186의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 237의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 288의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 187의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 238의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 289의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 187의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 238의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 289의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 136의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 187의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 238의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 289의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 137의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 188의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 239의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 290의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 137의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 188의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 239의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 290의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 86의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 137의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 188의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 239의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 290의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 138의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 189의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 240의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 291의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 138의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 189의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 240의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 291의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 87의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 138의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 189의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 240의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 291의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 190의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 241의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 292의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 190의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 241의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 292의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 88의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 139의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 190의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 241의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 292의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 140의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 191의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 242의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 293의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 140의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 191의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 242의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 293의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 140의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 191의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 242의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 293의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 141의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 192의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 243의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 294의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 141의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 192의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 243의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 294의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 141의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 192의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 243의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 294의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 142의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 193의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 244의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 295의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 142의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 193의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 244의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 295의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 142의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 193의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 244의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 295의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 143의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 194의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 245의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 296의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 143의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 194의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 245의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 296의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 143의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 194의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 245의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 296의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 195의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 246의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 297의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 195의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 246의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 297의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 195의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 246의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 297의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 145의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 196의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 247의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 298의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 145의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 196의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 247의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 298의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 145의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 196의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 247의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 298의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 146의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 197의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 248의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 299의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 146의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 197의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 248의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 299의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 44의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 146의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 197의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 248의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 299의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 147의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 198의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 249의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 300의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 147의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 198의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 249의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 300의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 147의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 198의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 249의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 300의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 97의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 148의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 199의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 250의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 301의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 97의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 148의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 199의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 250의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 301의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 97의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 148의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 199의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 250의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 301의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 98의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 149의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 200의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 251의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 302의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 98의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 149의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 200의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 251의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 302의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 98의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 149의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 200의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 251의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 302의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 99의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 150의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 201의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 252의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 303의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 99의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 150의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 201의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 252의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 303의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 99의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 150의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 201의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 252의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 303의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 100의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 151의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 202의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 253의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 304의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 100의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 151의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 202의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 253의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 304의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 100의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 151의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 202의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 253의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 304의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 152의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 203의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 254의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 305의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 152의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 203의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 254의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 305의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 152의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 203의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 254의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 305의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 153의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 204의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 255의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 306의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 (1) i) 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 153의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 204의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 255의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 306의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 153의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 204의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 255의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 306의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 338의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 338과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 389의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 389와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 338의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 389의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 338의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 389의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 339의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 339와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 390의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 390과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 339의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 390의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 339의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 390의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 340의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 340과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 391의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 391과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 340의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 391의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 340의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 391의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 341의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 341과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 392의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 392와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 341의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 392의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 341의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 392의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 342의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 342와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 393의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 393과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 342의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 393의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 342의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 393의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 343의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 343과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 394의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 394와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 343의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 394의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 343의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 394의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 344의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 344와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 395의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 395와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 344의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 395의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 344의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 395의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 345의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 345와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 396의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 396과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 345의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 396의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 345의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 396의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 346의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 346과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 397의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 397과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 346의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 397의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 346의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 397의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 347의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 347과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 398의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 398과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 347의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 398의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 347의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 398의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 348의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 348과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 399의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 399와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 348의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 399의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 348의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 399의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 349의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 349와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 400의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 400과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 349의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 400의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 349의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 400의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 350의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 350과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 401의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 401과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 350의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 401의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 350의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 401의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 351의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 351과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 402의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 402와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 351의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 402의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 351의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 402의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 352의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 352와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 403의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 403과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 352의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 403의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 352의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 403의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 353의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 353과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 404의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 404와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 353의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 404의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 353의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 404의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 354의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 354와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 405의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 405와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 354의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 405의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 354의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 405의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 355의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 355와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 406의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 406과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 355의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 406의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 355의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 406의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 356의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 356과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 407의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 407과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 356의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 407의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 356의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 407의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 357의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 357과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 408의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 408과 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 a) 서열 번호 357의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 b) 서열 번호 408의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 357의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 408의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 표적 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 임의의 항-GPC3 항체 모이어티에 따른 제2 항-GPC3 항체 모이어티와 경쟁한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 제2 항-GPC3 항체 모이어티와 동일하거나 실질적으로 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 표적 GPC3에 대한 항-GPC3 항체 모이어티의 결합은 표적 GPC3에 대한 제2 항-GPC3 항체 모이어티의 결합을 적어도 약 70%만큼(예컨대, 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 중 어느 하나만큼) 억제하거나, 또는 그 역으로도 성립한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티와 제2 항-GPC3 항체 모이어티는 표적 GPC3에 결합하기 위하여 교차-경쟁하며, 즉 각각의 항-GPC3 항체 모이어티는 표적 GPC3에 결합하기 위하여 다른 하나와 경쟁한다.
일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공되며, 항-nGPC3 항체 모이어티는 본 명세서에 기재된 항-nGPC3 항체 모이어티들 중 어느 하나일 수 있다. 일부 실시 형태에서, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공되며, 항-GPC3 항체 모이어티는 본 명세서에 기재된 항-GPC3 항체 모이어티들 중 어느 하나일 수 있다.
예를 들어, 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공된다(본 명세서에서, "항-nGPC3 항체 모이어티"로 지칭되며; 예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항체 모이어티의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 항체 모이어티가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함). 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 서열을 포함하는 인간 GPC3 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 461의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 462의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 463의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 GPC3의 N-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 1 내지 358 내의 에피토프(서열 번호 468)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 464의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 465)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 580 내의 에피토프(서열 번호 466)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 헤파린 설페이트 측쇄가 결여된 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 510 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 467)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 R358/S359에 있는 푸린 절단 부위에 걸쳐 있는 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 전장 성숙 인간 GPC3(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 560 또는 25 내지 580)에는 특이적으로 결합할 수 있지만, 인간 GPC3의 N-말단 단편(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 358) 또는 인간 GPC3의 C-말단 단편(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 560 또는 359 내지 580)에는 결합하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 헤파린 설페이트 측쇄가 결여된 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, nGPC3에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 항-nGPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 nGPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-nGPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공된다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 HepG2, Hep3B, Huh7, JHH-7, 및 293으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 암 세포(예컨대, 간암 세포, 예를 들어 HCC)의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 Fab 또는 Fab'이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은, 선택적으로 링커를 통해 Fc 단편(예를 들어, IgG1 Fc 단편)에 융합된 항-GPC3 항체 모이어티를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 전장 항체(예를 들어, 단일클론 항체)이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 분자, 예컨대 탠덤 다이-scFv 항-GPC3 T 세포 인게이저(탠덤 다이-scFv 항-GPC3xCD3ε)이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 CAR이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 caTCR이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 면역접합체이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 단일특이성이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 다중특이성(예를 들어, 이중특이성)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 nGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M(예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 항-nGPC3 항체 모이어티와 nGPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배(예컨대, 적어도 약 10, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107배)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M(예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 항체 모이어티이다.
일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공되며, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공되며, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공되며, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공되며, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공되며, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공되며, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다. 일부 실시 형태에서, nGPC3에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 항-nGPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 nGPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-nGPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공된다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 HepG2, Hep3B, Huh7, JHH-7, 및 293으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 암 세포(예컨대, 간암 세포, 예를 들어 HCC)의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 Fab 또는 Fab'이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은, 선택적으로 링커를 통해 Fc 단편(예를 들어, IgG1 Fc 단편)에 융합된 항-GPC3 항체 모이어티를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 전장 항체(예를 들어, 단일클론 항체)이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 분자, 예컨대 탠덤 다이-scFv 항-GPC3 T 세포 인게이저(탠덤 다이-scFv 항-GPC3xCD3ε)이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 CAR이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 caTCR이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 면역접합체이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 단일특이성이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 다중특이성(예를 들어, 이중특이성)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 nGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M(예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 항-nGPC3 항체 모이어티와 nGPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배(예컨대, 적어도 약 10, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107배)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M(예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 항체 모이어티이다.
일부 실시 형태에서, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공된다. 일부 실시 형태에서, GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공되며, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공되며, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3; 또는 상기 HC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3; 또는 상기 LC-CDR 서열 내에 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 아미노산 치환은 LC-CDR1 또는 LC-CDR2 내에 존재한다. 일부 실시 형태에서, GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공되며, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공되며, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나와 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함함) 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공되며, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공되며, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 GPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고, 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 가용성 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 가용성 GPC3에 대한 항-sGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-sGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 461의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-sGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 510 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 467)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3 및 가용성 GPC3 둘 모두를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 HepG2, Hep3B, Huh7, JHH-7, 및 293으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 암 세포(예컨대, 간암 세포, 예를 들어 HCC)의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 Fab 또는 Fab'이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은, 선택적으로 링커를 통해 Fc 단편(예를 들어, IgG1 Fc 단편)에 융합된 항-GPC3 항체 모이어티를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 전장 항체(예를 들어, 단일클론 항체)이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 분자, 예컨대 탠덤 다이-scFv 항-GPC3 T 세포 인게이저(탠덤 다이-scFv 항-GPC3xCD3ε)이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 CAR이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 caTCR이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 면역접합체이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 단일특이성이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 다중특이성(예를 들어, 이중특이성)이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티와 표적 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3) 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M(예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티와 비표적 사이의 결합의 Kd는 항-GPC3 항체 모이어티와 표적 GPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배(예컨대, 적어도 약 10, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107배)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티와 비표적 사이의 결합의 Kd는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M(예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 항체 모이어티이다.
항-GPC3 scFv
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)은 (예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3을 표적화하는) 본 명세서에 기재된 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 scFv(이하, "항-GPC3 scFv"로 지칭됨)이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 scFv는 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식한다. 항-GPC3 scFv는 본 명세서에 기재된 항-GPC3 항체 모이어티들 중 어느 하나를 포함할 수 있다("항-GPC3 항체 모이어티" 섹션 참조). (예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3을 표적화하는) 항-GPC3 scFv는 (N-말단에서 C-말단으로) VL(GPC3)-L-VH(GPC3), 또는 VH(GPC3)-L-VL(GPC3)의 구성을 가질 수 있으며, 여기서 L은 링커(예컨대, 펩티드 링커)이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 scFv는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 scFv이다. 예시적인 항-GPC3 scFv 서열이 표 10 및 표 11에 나타나 있다.
[표 10]
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
[표 11]
Figure pct00016
링커
본 명세서에 기재된 항-GPC3 scFv에 사용될 수 있는 모든 적용가능한 링커에 대해서는 하기의 "항-GPC3 Fc 융합 단백질" 섹션 하의 "링커" 하위섹션을 참조한다. 일부 실시 형태에서, 링커는 SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA(서열 번호 473)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 링커는 (GGGGS)n 서열(서열 번호 471)이거나 이를 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상이다. 일부 실시 형태에서, 링커는 TSGGGGS(서열 번호 474)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 링커는 GEGTSTGSGGSGGSGGAD(서열 번호 490)의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 scFv를 포함하는 항-GPC3 작제물(예를 들어, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공된다(본 명세서에서, "항-nGPC3 scFv"로 지칭되며; 예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 scFv의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 항-nGPC3 scFv가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함). 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv는 서열 번호 460의 아미노산 서열을 포함하는 인간 GPC3 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv는 서열 번호 461의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv는 서열 번호 462의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv는 서열 번호 463의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv는 GPC3의 N-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv는 서열 번호 460의 아미노산 1 내지 358 내의 에피토프(서열 번호 468)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv는 서열 번호 464의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv는 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv는 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 465)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv는 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 580 내의 에피토프(서열 번호 466)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv는 헤파린 설페이트 측쇄가 결여된 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv는 서열 번호 460의 아미노산 510 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 467)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv는 서열 번호 460의 아미노산 R358/S359에 있는 푸린 절단 부위에 걸쳐 있는 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv는 전장 성숙 인간 GPC3(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 560 또는 25 내지 580)에는 특이적으로 결합할 수 있지만, 인간 GPC3의 N-말단 단편(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 358) 또는 인간 GPC3의 C-말단 단편(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 560 또는 359 내지 580)에는 결합하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv는 헤파린 설페이트 측쇄가 결여된 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, nGPC3에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 항-nGPC3 scFv를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공된다(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 scFv의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 항-nGPC3 scFv가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함). 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 nGPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-nGPC3 scFv를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공된다(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 scFv의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 항-nGPC3 scFv가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함). 일부 실시 형태에서, GPC3은 HepG2, Hep3B, Huh7, JHH-7, 및 293으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 암 세포(예컨대, 간암 세포, 예를 들어 HCC)의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv와 nGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M(예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 항-nGPC3 scFv와 nGPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배(예컨대, 적어도 약 10, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107배)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M(예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv의 VH는 항-nGPC3 scFv의 VL에 대해 N-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv의 VH는 항-nGPC3 scFv의 VL에 대해 C-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv의 VH와 VL 사이의 링커는 SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA(서열 번호 473)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv의 VH와 VL 사이의 링커는 (GGGGS)n 서열(서열 번호 471)이거나 이를 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv의 VH와 VL 사이의 링커는 GEGTSTGSGGSGGSGGAD(서열 번호 490)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv는 태그(예를 들어, 정제 목적을 위한 펩티드 태그)를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 태그는 항-nGPC3 scFv에 대해 N-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 태그는 항-nGPC3 scFv에 대해 C-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 태그는 His-태그 및 HA-태그를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 태그는 TSGQAGQHHHHHHGAYPYDVPDYAS(서열 번호 477)의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 scFv를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 scFv를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공되며, 항-GPC3 scFv는 i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 scFv를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공되며, 항-GPC3 scFv는 i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 scFv를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공되며, 항-GPC3 scFv는 i) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 scFv를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공되며, 항-GPC3 scFv는 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다. 일부 실시 형태에서, nGPC3에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 항-nGPC3 scFv를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 nGPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-nGPC3 scFv를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공된다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 HepG2, Hep3B, Huh7, JHH-7, 및 293으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 암 세포(예컨대, 간암 세포, 예를 들어 HCC)의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv와 nGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M(예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 항-nGPC3 항체 모이어티와 nGPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배(예컨대, 적어도 약 10, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107배)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M(예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv의 VH는 항-nGPC3 scFv의 VL에 대해 N-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv의 VH는 항-nGPC3 scFv의 VL에 대해 C-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv의 VH와 VL 사이의 링커는 SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA(서열 번호 473)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv의 VH와 VL 사이의 링커는 (GGGGS)n 서열(서열 번호 471)이거나 이를 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv의 VH와 VL 사이의 링커는 GEGTSTGSGGSGGSGGAD(서열 번호 490)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 scFv를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공되며, 항-nGPC3 scFv는 서열 번호 409 내지 439 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv는 태그(예를 들어, 정제 목적을 위한 펩티드 태그)를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 태그는 항-nGPC3 scFv에 대해 N-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 태그는 항-nGPC3 scFv에 대해 C-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 태그는 His-태그 및 HA-태그를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 태그는 TSGQAGQHHHHHHGAYPYDVPDYAS(서열 번호 477)의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 scFv를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공된다. 일부 실시 형태에서, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 scFv를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공되며, 항-GPC3 scFv는 i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 scFv를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공되며, 항-GPC3 scFv는 i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 scFv를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공되며, 항-GPC3 scFv는 i) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 scFv를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공되며, 항-GPC3 scFv는 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 항-GPC3 scFv를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 GPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 scFv를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 scFv는 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-GPC3 scFv의 결합 친화도는 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 scFv는 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고, 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 scFv는 가용성 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 가용성 GPC3에 대한 항-GPC3 scFv의 결합 친화도는 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-sGPC3 scFv는 서열 번호 461의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-sGPC3 scFv는 서열 번호 460의 아미노산 510 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 467)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 scFv는 세포 표면-결합된 GPC3 및 가용성 GPC3 둘 모두를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 HepG2, Hep3B, Huh7, JHH-7, 및 293으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 암 세포(예컨대, 간암 세포, 예를 들어 HCC)의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 scFv와 표적 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3) 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M(예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 scFv와 비표적 사이의 결합의 Kd는 항-GPC3 scFv와 표적 GPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배(예컨대, 적어도 약 10, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107배)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 scFv와 비표적 사이의 결합의 Kd는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M(예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 scFv는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 scFv의 VH는 항-GPC3 scFv의 VL에 대해 N-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 scFv의 VH는 항-GPC3 scFv의 VL에 대해 C-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 scFv의 VH와 VL 사이의 링커는 SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA(서열 번호 473)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 scFv의 VH와 VL 사이의 링커는 (GGGGS)n 서열(서열 번호 471)이거나 이를 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 scFv의 VH와 VL 사이의 링커는 GEGTSTGSGGSGGSGGAD(서열 번호 490)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 scFv를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)이 제공되며, 항-GPC3 scFv는 서열 번호 440 내지 459 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 scFv는 태그(예를 들어, 정제 목적을 위한 펩티드 태그)를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 태그는 항-GPC3 scFv에 대해 N-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 태그는 항-GPC3 scFv에 대해 C-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 태그는 His-태그 및 HA-태그를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 태그는 TSGQAGQHHHHHHGAYPYDVPDYAS(서열 번호 477)의 아미노산 서열을 포함한다.
항-GPC3 Fc 융합 단백질
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)은 Fc 단편(예컨대, IgG1 Fc 단편)에 융합된 본 명세서에 기재된 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 Fc 융합 단백질(이하, "항-GPC3 Fc 융합 단백질"로 지칭됨)이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 링커(예컨대, 펩티드 링커)를 통해 Fc 단편에 융합된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질은 Fc 단편을 포함하는 항체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질은 전장 항체이다. "항-GPC3 항체 모이어티 섹션"에 기재된 임의의 항-GPC3 항체 모이어티가 항-GPC3 Fc 융합 단백질에 사용될 수 있다.
Fc 단편
용어 "Fc 영역", "Fc 도메인" 또는 "Fc"는 불변 영역의 적어도 일부분을 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 항원 비결합 영역을 지칭한다. 이 용어는 천연 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226부터 중쇄의 카르복실-말단까지 연장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 라이신(Lys447)은 Fc 영역의 구조 또는 안정성에 영향을 주지 않으면서 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. 본 명세서에 달리 명시되지 않는 한, IgG 또는 Fc 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같은 EU 넘버링 체계에 따르며, 이는 EU 인덱스로도 불린다.
일부 실시 형태에서, Fc 단편은 (Cys226에서 시작하는) 힌지 영역, IgG CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린 IgG 중쇄 불변 영역을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "힌지 영역" 또는 "힌지 서열"은 링커와 CH2 도메인 사이에 위치된 아미노산 서열을 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 융합 단백질은 힌지 영역을 포함하는 Fc 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 힌지 영역은 천연 IgG1 힌지 영역에서 발견되는 서열인 아미노산 서열 CPPCP(서열 번호 478)을 포함하여 이량체화를 촉진시킨다. 일부 실시 형태에서, 융합 단백질의 Fc 단편은 힌지 영역에서 시작하여 IgG 중쇄의 C-말단까지 연장된다. 일부 실시 형태에서, 융합 단백질은 힌지 영역을 포함하지 않는 Fc 단편을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 융합 단백질은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, 및 이들의 조합 및 혼성체로부터의 Fc 단편들로 이루어진 군으로부터 선택되는 Fc 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, Fc 단편은 인간 IgG로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, Fc 단편은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 조합 또는 혼성 IgG의 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시 형태에서, Fc 단편은 IgG1 Fc 단편이다. 일부 실시 형태에서, Fc 단편은 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, Fc 단편은 IgG4 Fc 단편이다. 일부 실시 형태에서, Fc 단편은 IgG4의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. IgG4 Fc는 IgG1 Fc보다 더 적은 이펙터 활성을 나타내는 것으로 알려져 있으며, 이에 따라 일부 응용에 바람직할 수 있다. 일부 실시 형태에서, Fc 단편은 마우스 면역글로불린으로부터 유래된다.
일부 실시 형태에서, IgG CH2 도메인은 Ala231에서 시작한다. 일부 실시 형태에서, CH3 도메인은 Gly341에서 시작한다. 인간 IgG의 C-말단 Lys 잔기는 선택적으로 부재할 수 있음이 이해된다. Fc의 원하는 구조 및/또는 안정성에 영향을 미치지 않는 Fc 영역의 보존적 아미노산 치환이 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 고려됨이 또한 이해된다.
추가적으로, 하기에 기재된 임의의 Fc 변이체 또는 이들의 조합을 포함하는 항-GPC3 Fc 융합 단백질이 고려된다. 일부 실시 형태에서, Fc 단편은 향상된 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC) 또는 보체 의존성 세포독성(CDC) 이펙터 기능을 갖도록 변경되거나 달리 변화된 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, Fc 단편의 각각의 사슬은 동일한 실체(entity)에 융합된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질은 (예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3을 특이적으로 인식하는) 본 명세서에 기재된 2개의 동일한 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하며, 이들 각각은 Fc 단편의 하나의 사슬과 융합되어 있다. 일부 실시 형태에서, Fc 단편의 2개의 사슬은 동일하다. 일부 실시 형태에서, Fc 단편을 포함하는 항-GPC3 Fc 융합 단백질(항체를 포함하는 항-GPC3 Fc 융합 단백질을 포함함)은 동종이량체이다.
일부 실시 형태에서, Fc 단편의 각각의 사슬은 상이한 실체에 융합된다. 일부 실시 형태에서, 융합 단백질은 2개의 상이한 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하며, 이들 각각은 Fc 단편의 하나의 사슬에 융합되어 있다. 일부 실시 형태에서, 2개의 항-GPC3 항체 모이어티는 상이하지만, 둘 모두 nGPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 2개의 항-GPC3 항체 모이어티는 상이하지만, 둘 모두 sGPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 하나의 항-GPC3 항체 모이어티는 nGPC3을 특이적으로 인식하고, 다른 하나의 항-GPC3 항체 모이어티는 sGPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질은 1가이며, 즉 단지 하나의 항-GPC3 항체 모이어티만이 Fc 단편의 하나의 사슬에 융합되고, Fc 단편의 제2 사슬은 항-GPC3 항체 모이어티에 융합되지 않는다. 일부 실시 형태에서, Fc 단편을 포함하는 항-GPC3 Fc 융합 단백질(항체를 포함하는 항-GPC3 Fc 융합 단백질을 포함함)은 이종이량체이다.
항-GPC3 Fc 융합 단백질에서의 동일하지 않은 폴리펩티드들의 이종이량체화는, 제한 없이, 노브-인투-홀 기술에 의한 이종이량체화를 포함한 당업계에 알려진 방법에 의해 촉진될 수 있다. 노브-인투-홀 기술의 구조 및 조립 방법은, 예를 들어 미국 특허 제5,821,333호, 미국 특허 제7,642,228호, 미국 특허 출원 공개 제2011/0287009호 및 국제 특허 출원 공개 PCT/US2012/059810호에서 찾아볼 수 있으며, 이들은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 이러한 기술은, 하나의 Fc의 CH3 도메인에서는 작은 아미노산 잔기를 큰 아미노산 잔기로 대체함으로써 "노브"(또는 돌기)를 도입함으로써, 그리고 다른 하나의 Fc의 CH3 도메인에서는 하나 이상의 큰 아미노산 잔기를 더 작은 아미노산 잔기로 대체함으로써 "홀"(또는 공동(cavity))을 도입함으로써 개발하였다. 일부 실시 형태에서, 융합 단백질에서의 Fc 단편의 하나의 사슬은 노브를 포함하고, Fc 단편의 제2 사슬은 홀을 포함한다.
노브의 형성을 위한 바람직한 잔기는 일반적으로 천연 발생 아미노산 잔기이며, 바람직하게는 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 및 트립토판(W)으로부터 선택된다. 트립토판 및 티로신이 가장 바람직하다. 일 실시 형태에서, 노브의 형성을 위한 원래의 잔기는 작은 측쇄 부피를 가지며, 예컨대 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글리신, 세린, 트레오닌 또는 발린이다. 노브를 형성하기 위한 CH3 도메인 내의 예시적인 아미노산 치환은, 제한 없이, T366W, T366Y 또는 F405W 치환을 포함한다.
홀의 형성을 위한 바람직한 잔기는 통상 천연 발생 아미노산 잔기이며, 바람직하게는 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T) 및 발린(V)으로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 홀의 형성을 위한 원래의 잔기는 큰 측쇄 부피를 가지며, 예컨대 티로신, 아르기닌, 페닐알라닌 또는 트립토판이다. 홀을 생성하기 위한 CH3 도메인 내의 예시적인 아미노산 치환은, 제한 없이, T366S, L368A, F405A, Y407A, Y407T 및 Y407V 치환을 포함한다. 소정 실시 형태에서, 노브는 T366W 치환을 포함하고, 홀은 T366S/L368A/Y407V 치환을 포함한다. 이종이량체화를 촉진시키는 당업계에 알려진 Fc 영역에 대한 다른 변형이 또한 본 출원에 의해 고려되고 포함되는 것으로 이해된다.
본 명세서에 기재된 임의의 변이체(예를 들어, Fc 변이체, 이펙터 기능 변이체, 글리코실화 변이체, 시스테인 조작된 변이체), 또는 이들의 조합을 포함하는 다른 항-GPC3 Fc 융합 단백질 변이체(예컨대, 단리된 항-GPC3 Fc 융합 단백질의 변이체, 예를 들어 전장 항-GPC3 항체 변이체)가 고려된다. 항-GPC3 Fc 융합 단백질(예를 들어, 전장 항-GPC3 항체)에 대한 모든 적용가능한 변이에 대해서는 "항-GPC3 변이체" 섹션을 참조한다.
링커
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 Fc 융합 단백질은 링커를 통해 Fc 단편에 융합된 본 명세서에 기재된 항-GPC3 항체 모이어티를 포함한다.
항-GPC3 Fc 융합 단백질에 사용되는 링커의 길이, 가요성 정도 및/또는 다른 특성은 항-GPC3 항체 모이어티에 대한 친화도, 특이성 또는 결합력을 포함하지만 이로 한정되지 않는 특성, 및/또는 항-GPC3 Fc 융합 단백질(예컨대, Fc 단편 및 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항체)의 하나 이상의 특정 항원 또는 에피토프에 어떠한 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 2개의 인접한 항체 모이어티가 서로 입체적으로 방해하지 않는 것을 보장하도록 더 긴 링커가 선택될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 링커(예컨대, 펩티드 링커)는 가요성 잔기(예컨대, 글리신 및 세린)를 포함하여, 인접한 항체 모이어티들이 서로에 대해 자유롭게 이동하도록 한다. 예를 들어, 글리신-세린 이중체는 적합한 펩티드 링커일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 링커는 비-펩티드 링커이다. 일부 실시 형태에서, 링커는 펩티드 링커이다. 일부 실시 형태에서, 링커는 비절단성 링커이다. 일부 실시 형태에서, 링커는 절단성 링커이다.
링커에 대한 다른 고려사항은 생성된 항-GPC3 Fc 융합 단백질의 물리적 또는 약동학적 특성, 예컨대 용해도, 친유성, 친수성, 소수성, 안정성(더 안정하거나 덜 안정한 것뿐만 아니라 계획된 분해), 강성, 가요성, 면역원성, 항체 모이어티 결합의 조절, 미셀 또는 리포좀 내로 도입되는 능력 등에 대한 영향을 포함한다.
비-펩티드 링커
본 명세서에 기재된 링커들 중 어느 하나 또는 전부는, 2개의 분자의 성분 또는 단편이 그들 각각의 활성, 즉 표적 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 대한 결합, FcR에 대한 결합, 또는 ADCC/CDC를 보유하는 한, 이들 2개의 분자를 결합시킬 임의의 화학 반응에 의해 달성될 수 있다. 이러한 결합은 많은 화학적 메커니즘, 예를 들어 공유 결합, 친화성 결합, 삽입(intercalation), 배위 결합 및 복합체 형성(complexation)을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 결합은 공유 결합이다. 공유 결합은 기존의 측쇄의 직접적인 축합에 의해 또는 외부 가교 분자의 도입에 의해 달성될 수 있다. 많은 2가 또는 다가 연결제가 단백질 분자들을 커플링하는 데, 예를 들어 본 발명의 항-GPC3 항체 모이어티에 Fc 단편을 커플링하는 데 유용하다. 예를 들어, 대표적인 커플링제는 유기 화합물, 예컨대 티오에스테르, 카르보다이이미드, 석신이미드 에스테르, 다이아이소시아네이트, 글루타르알데하이드, 다이아조벤젠 및 헥사메틸렌 다이아민을 포함할 수 있다. 이러한 목록은 당업계에 알려진 다양한 부류의 커플링제를 망라하고자 하는 것은 아니며, 오히려 더 일반적인 커플링제의 예시이다(문헌[Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984)]; 문헌[Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216 (1982)]; 및 문헌[Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)] 참조).
본 출원에 적용될 수 있는 링커는 문헌에 기재되어 있다(예를 들어, MBS(M-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스테르)의 사용을 기술하고 있는 문헌[Ramakrishnan, S. et al., Cancer Res. 44:201-208 (1984)] 참조). 일부 실시 형태에서, 본 발명에 사용되는 비-펩티드 링커는 하기를 포함한다: (i) EDC(1-에틸-3-(3-다이메틸아미노-프로필) 카르보다이이미드 하이드로클로라이드; (ii) SMPT(4-석신이미딜옥시카르보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜-다이티오)-톨루엔(Pierce Chem. Co., Cat. (21558G)); (iii) SPDP(석신이미딜-6 [3-(2-피리딜다이티오) 프로피온아미도]헥사노에이트(Pierce Chem. Co., Cat #21651G); (iv) 설포-LC-SPDP(설포석신이미딜 6 [3-(2-피리딜다이티오)-프로피온아미드] 헥사노에이트(Pierce Chem. Co. Cat. #2165-G); 및 (v) EDC에 접합된 설포-NHS(N-하이드록시설포-석신이미드: Pierce Chem. Co., Cat. #24510).
전술된 링커는 상이한 속성을 갖는 성분을 함유하며, 이에 따라 상이한 물리화학적 특성을 갖는 항-GPC3 Fc 융합 단백질을 유도한다. 예를 들어, 알킬 카르복실레이트의 설포-NHS 에스테르는 방향족 카르복실레이트의 설포-NHS 에스테르보다 더 안정하다. NHS-에스테르 함유 링커는 설포-NHS 에스테르보다 덜 가용성이다. 또한, 링커 SMPT는 입체장애 이황화물 결합을 함유하고, 증가된 안정성을 갖는 융합 단백질을 형성할 수 있다. 이황화물 결합은 일반적으로 다른 결합보다 덜 안정한데, 그 이유는, 이황화물 결합은 시험관내에서 절단되어 더 적은 융합 단백질이 이용가능하게 하기 때문이다. 설포-NHS는 특히 카르보다이이미드 커플링제의 안정성을 향상시킬 수 있다. 설포-NHS와 함께 사용될 때 카르보다이이미드 커플링제(예컨대, EDC)는 단독으로의 카르보다이이미드 커플링 반응보다 가수분해에 더 저항성인 에스테르를 형성한다.
펩티드 링커
본 명세서에 기재된 링커들 중 어느 하나 또는 전부는 펩티드 링커일 수 있다. 펩티드 링커는 천연 발생 서열 또는 천연 비발생 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 중쇄만으로 구성된 항체의 힌지 영역으로부터 유래된 서열이 링커로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO1996/34103호를 참조한다. 일부 실시 형태에서, 펩티드 링커는 천연 IgG1 힌지 영역에서 발견되는 서열인 CPPCP(서열 번호 478)의 아미노산 서열을 포함한다.
펩티드 링커는 임의의 적합한 길이를 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 펩티드 링커는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100개 또는 그 이상 중 어느 하나의 아미노산(aa) 길이이다. 일부 실시 형태에서, 펩티드 링커는 약 100, 75, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5개 이하, 또는 그 이하 중 어느 하나의 아미노산 길이이다. 일부 실시 형태에서, 펩티드 링커의 길이는 약 1개의 aa 내지 약 10개의 aa, 약 1개의 aa 내지 약 20개의 aa, 약 1개의 aa 내지 약 30개의 aa, 약 5개의 aa 내지 약 15개의 aa, 약 10개의 aa 내지 약 25개의 aa, 약 5개의 aa 내지 약 30개의 aa, 약 10개의 aa 내지 약 30개의 aa, 약 30개의 aa 내지 약 50개의 aa, 약 50개의 aa 내지 약 100개의 aa, 또는 약 1개의 aa 내지 약 100개의 aa 중 어느 하나이다.
그러한 펩티드 링커의 본질적인 기술적 특징은 상기 펩티드 링커가 어떠한 중합 활성도 포함하지 않는다는 것이다. 2차 구조의 촉진의 부재를 포함하는 펩티드 링커의 특징은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Dall'Acqua et al. (Biochem. (1998) 37, 9266-9273)], 문헌[Cheadle et al. (Mol Immunol (1992) 29, 21-30)] 및 문헌[Raag and Whitlow (FASEB (1995) 9(1), 73-80)]에 기재되어 있다. "펩티드 링커"와 관련하여 특히 바람직한 아미노산은 Gly이다. 더욱이, 어떠한 2차 구조도 촉진시키지 않는 펩티드 링커가 바람직하다. 분자들의 서로에 대한 결합은, 예를 들어 유전자적 조작에 의해 제공될 수 있다. 융합되고 작동가능하게 연결된 항체 작제물을 제조하고 이들을 포유류 세포 또는 세균에서 발현시키기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO 99/54440호, 문헌[Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. 1989 and 1994] 또는 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 2001]).
일부 실시 형태에서, 펩티드 링커는 안정한 링커이며, 이것은 프로테아제에 의해, 예컨대 기질 금속단백질분해효소(MMP)에 의해 절단 불가능하다.
일부 실시 형태에서, 펩티드 링커는 강성 3차원 구조를 채택하지 않고, 오히려 폴리펩티드(예를 들어, 제1 및/또는 제2 성분)에 가요성을 제공하며, 예를 들어 항-GPC3 항체 모이어티와 Fc 단편 사이에 가요성을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 펩티드 링커는 가요성 링커이다. 예시적인 가요성 링커는 글리신 중합체(G)n, 글리신-세린 중합체(예를 들어, (GS)n(서열 번호 469), (GSGGS)n(서열 번호 470), (GSGGS)n(서열 번호 471), 및 (GGGS)n(서열 번호 472)를 포함하며, 여기서 n은 적어도 1의 정수임), 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체, 및 당업계에 알려진 다른 가요성 링커를 포함한다. 글리신 중합체 및 글리신-세린 중합체는 비교적 구조화되지 않으므로, 성분들 사이의 중성 테더(tether)로서의 역할을 할 수 있을 것이다. 글리신은 심지어 알라닌보다 유의하게 더 많은 phi-psi 공간에 접근하며, 더 긴 측쇄를 갖는 잔기보다 훨씬 덜 제한된다(문헌[Scheraga, Rev. Computational Chem. 11 173-142 (1992)]). 당업자는 항-GPC3 Fc 융합 단백질의 설계가, 전부 또는 부분적으로 가요성인 링커를 포함할 수 있으며, 그렇게 해서 링커는 가요성 링커 부분뿐만 아니라 덜 가요성인 구조를 부여하는 하나 이상의 부분을 포함하여 원하는 융합 단백질 구조를 제공하도록 할 수 있음을 인식할 것이다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티와 Fc 단편은, 항-GPC3 Fc 융합 단백질이 표적 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 대한 결합뿐만 아니라 FcR에 대한 결합도 가능하게 할 수 있도록 하는 방식으로 접힐 수 있게 하기에 충분한 길이의 링커에 의해 함께 연결된다. 일부 실시 형태에서, 링커는 SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA(서열 번호 473)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 링커는 (GGGGS)n 서열(서열 번호 471)이거나 이를 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상이다. 일부 실시 형태에서, 링커는 TSGGGGS(서열 번호 474)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 링커는 GEGTSTGSGGSGGSGGAD(서열 번호 490)의 아미노산 서열을 포함한다.
천연 링커는 그들의 기능을 발휘하도록 2차 구조의 다양한 입체구조, 예컨대 나선형, β-가닥, 코일/굽힘 및 회전(turn)을 채택한다. α-나선 구조의 링커는 강성 스페이서(spacer)로서의 역할을 하여 단백질 도메인들을 효과적으로 분리시킬 수 있으며, 이에 따라 그들의 불리한 상호작용을 감소시킬 수 있다. Pro-풍부 서열을 갖는 비나선형 링커는 링커 강성을 증가시킬 수 있으며, 도메인간 간섭을 감소시키는 데 있어서 기능을 할 수 있다. 일부 실시 형태에서, (예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3을 특이적으로 인식하는) 항-GPC3 항체 모이어티와 Fc 단편(또는 Fc 단편을 포함하는 항체)은 α-나선 링커에 의해 A(EAAAK)4A(서열 번호 475)의 아미노산 서열과 함께 연결된다.
항-GPC3 Fc 융합 단백질 서열
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)은, 선택적으로 링커(예컨대, 펩티드 링커)를 통해 Fc 단편(예컨대, IgG1 Fc 단편)에 융합된 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 Fc 융합 단백질이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고, 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 가용성 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 가용성 GPC3에 대한 항-sGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3 및 가용성 GPC3 둘 모두를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, (예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3을 표적화하는) 항-GPC3 항체 모이어티는 Fab, Fab', Fc, 또는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질은 전장 항체이다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체는 단일클론 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질(예컨대, 전장 항-GPC3 항체)은 단일특이성이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질은 1가이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질(예컨대, 전장 항-GPC3 항체)은 다가이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질(예컨대, 전장 항-GPC3 항체)은 다중특이성이다. 일부 실시 형태에서, 링커는 (GGGGS)n(서열 번호 471)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상이다. 일부 실시 형태에서, 링커는 CPPCP(서열 번호 478)의 아미노산 서열을 포함한다.
따라서, 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질이 제공되며, 상기 항-GPC3 Fc 융합 단백질은 a) 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-GPC3 항체 모이어티의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 항-GPC3 항체 모이어티가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함); 및 b) Fc 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 서열을 포함하는 인간 GPC3 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 461의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 462의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 463의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 GPC3의 N-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 1 내지 358 내의 에피토프(서열 번호 468)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 464의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 465)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 580 내의 에피토프(서열 번호 466)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 헤파린 설페이트 측쇄가 결여된 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 510 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 467)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 R358/S359에 있는 푸린 절단 부위에 걸쳐 있는 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 전장 성숙 인간 GPC3(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 560 또는 25 내지 580)에는 특이적으로 결합할 수 있지만, 인간 GPC3의 N-말단 단편(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 358) 또는 인간 GPC3의 C-말단 단편(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 560 또는 359 내지 580)에는 결합하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 헤파린 설페이트 측쇄가 결여된 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질이 제공되며, 상기 항-GPC3 Fc 융합 단백질은 a) nGPC3에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 항-nGPC3 항체 모이어티(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-GPC3 항체 모이어티의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 항-GPC3 항체 모이어티가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함); 및 b) Fc 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질이 제공되며, 상기 항-GPC3 Fc 융합 단백질은 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 nGPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-nGPC3 항체 모이어티(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-GPC3 항체 모이어티의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 항-GPC3 항체 모이어티가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함); 및 b) Fc 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 HepG2, Hep3B, Huh7, JHH-7, 및 293으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 암 세포(예컨대, 간암 세포, 예를 들어 HCC)의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 Fc 단편은 링커(예컨대, 펩티드 링커)를 통해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 링커는 (GGGGS)n(서열 번호 471)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상이다. 일부 실시 형태에서, 링커는 CPPCP(서열 번호 478)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, Fc 단편은 IgG1 Fc 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, Fc 단편은 인간 IgG1 Fc 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, Fc 단편은 마우스 IgG1 Fc 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질은 전장 항체이다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체는 단일클론 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질(예컨대, 전장 항-GPC3 항체)은 단일특이성이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질은 1가이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질(예컨대, 전장 항-GPC3 항체)은 다가이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질(예컨대, 전장 항-GPC3 항체)은 다중특이성이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 Fab 또는 Fab'이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 nGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M(예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 항-nGPC3 항체 모이어티와 nGPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배(예컨대, 적어도 약 10, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107배)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M(예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)이다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질이 제공되며, 상기 항-GPC3 Fc 융합 단백질은 a) i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함하는 항-nGPC3 항체 모이어티; 및 b) Fc 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질이 제공되며, 상기 항-GPC3 Fc 융합 단백질은 a) i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함하는 항-nGPC3 항체 모이어티; 및 b) Fc 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질이 제공되며, 상기 항-GPC3 Fc 융합 단백질은 a) i) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 항-nGPC3 항체 모이어티; 및 b) Fc 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질이 제공되며, 상기 항-GPC3 Fc 융합 단백질은 a) i) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR; 및 ii) 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함하는 항-nGPC3 항체 모이어티; 및 b) Fc 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질이 제공되며, 상기 항-GPC3 Fc 융합 단백질은 a) nGPC3에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 항-nGPC3 항체 모이어티; 및 b) Fc 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질이 제공되며, 상기 항-GPC3 Fc 융합 단백질은 a) 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 nGPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-nGPC3 항체 모이어티; 및 b) Fc 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 nGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M(예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 항-nGPC3 항체 모이어티와 nGPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배(예컨대, 적어도 약 10, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107배)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M(예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 Fc 단편은 링커(예컨대, 펩티드 링커)를 통해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 링커는 (GGGGS)n(서열 번호 471)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상이다. 일부 실시 형태에서, 링커는 CPPCP(서열 번호 478)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, Fc 단편은 IgG1 Fc 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, Fc 단편은 인간 IgG1 Fc 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, Fc 단편은 마우스 IgG1 Fc 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질은 전장 항체이다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체는 단일클론 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질(예컨대, 전장 항-GPC3 항체)은 단일특이성이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질은 1가이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질(예컨대, 전장 항-GPC3 항체)은 다가이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질(예컨대, 전장 항-GPC3 항체)은 다중특이성이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 Fab 또는 Fab'이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 항체 모이어티이다.
일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 Fc 융합 단백질(예컨대, 전장 항-GPC3 항체)은 세포 표면-결합된 GPC3에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 임의의 항-GPC3 Fc 융합 단백질(예컨대, 전장 항-GPC3 항체)에 따른 항-nGPC3 항체 모이어티를 포함하는 제2 항-GPC3 Fc 융합 단백질(예컨대, 제2 전장 항-GPC3 항체)과 경쟁한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 Fc 융합 단백질(예컨대, 전장 항-GPC3 항체)은 항-nGPC3 항체 모이어티를 포함하는 제2 항-GPC3 Fc 융합 단백질(예컨대, 제2 전장 항-GPC3 항체)과 동일한 또는 실질적으로 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 Fc 융합 단백질(예컨대, 전장 항-GPC3 항체)의 결합은 동일한 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티를 포함하는 제2 항-GPC3 Fc 융합 단백질(예컨대, 전장 항-GPC3 항체)의 결합을 적어도 약 70%만큼(예컨대, 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 중 어느 하나만큼) 억제하거나, 또는 그 역으로도 성립한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 Fc 융합 단백질(예컨대, 전장 항-GPC3 항체)과 항-nGPC3 항체 모이어티를 포함하는 제2 항-GPC3 Fc 융합 단백질(예컨대, 제2 전장 항-GPC3 항체)은 세포 표면-결합된 GPC3에 결합하기 위하여 교차-경쟁하며, 즉 각각의 항-GPC3 Fc 융합 단백질(예컨대, 전장 항-GPC3 항체)은 세포 표면-결합된 GPC3에 결합하기 위하여 다른 하나의 항-GPC3 Fc 융합 단백질과 경쟁한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질(예컨대, 전장 항-GPC3 항체)이 제공되며, 상기 항-GPC3 Fc 융합 단백질은 a) i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함하는, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티; 및 b) Fc 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질이 제공되며, 상기 항-GPC3 Fc 융합 단백질은 a) i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함하는, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티; 및 b) Fc 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질이 제공되며, 상기 항-GPC3 Fc 융합 단백질은 a) i) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티; 및 b) Fc 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질이 제공되며, 상기 항-GPC3 Fc 융합 단백질은 a) i) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR; 및 ii) 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함하는, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티; 및 b) Fc 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질이 제공되며, 상기 항-GPC3 Fc 융합 단백질은 a) GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 항-GPC3 항체 모이어티; 및 b) Fc 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질이 제공되며, 상기 항-GPC3 Fc 융합 단백질은 a) 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 GPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티; 및 b) Fc 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고, 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 가용성 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 가용성 GPC3에 대한 항-sGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-sGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 461의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-sGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 510 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 467)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3 및 가용성 GPC3 둘 모두를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티와 표적 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3) 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M(예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티와 비표적 사이의 결합의 Kd는 항-GPC3 항체 모이어티와 표적 GPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배(예컨대, 적어도 약 10, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107배)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티와 비표적 사이의 결합의 Kd는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M(예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티와 Fc 단편은 링커(예컨대, 펩티드 링커)를 통해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 링커는 (GGGGS)n(서열 번호 471)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상이다. 일부 실시 형태에서, 링커는 CPPCP(서열 번호 478)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, Fc 단편은 IgG1 Fc 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, Fc 단편은 인간 IgG1 Fc 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, Fc 단편은 마우스 IgG1 Fc 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질은 전장 항체이다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체는 단일클론 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질(예컨대, 전장 항-GPC3 항체)은 단일특이성이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질은 1가이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질(예컨대, 전장 항-GPC3 항체)은 다가이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질(예컨대, 전장 항-GPC3 항체)은 다중특이성이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 Fab 또는 Fab'이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 항체 모이어티이다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 Fc 융합 단백질(예컨대, 전장 항-GPC3 항체)은 표적 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 임의의 항-GPC3 Fc 융합 단백질(예컨대, 전장 항-GPC3 항체)에 따른 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 제2 항-GPC3 Fc 융합 단백질(예컨대, 제2 전장 항-GPC3 항체)과 경쟁한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 Fc 융합 단백질(예컨대, 전장 항-GPC3 항체)은 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 제2 항-GPC3 Fc 융합 단백질(예컨대, 제2 전장 항-GPC3 항체)과 동일한 또는 실질적으로 동일한 에피토프에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 표적 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 대한 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 Fc 융합 단백질(예컨대, 전장 항-GPC3 항체)의 결합은 표적 GPC3에 대한 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 제2 항-GPC3 Fc 융합 단백질(예컨대, 전장 항-GPC3 항체)의 결합을 적어도 약 70%만큼(예컨대, 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 중 어느 하나만큼) 억제하거나, 또는 그 역으로도 성립한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 Fc 융합 단백질(예컨대, 전장 항-GPC3 항체)과 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 제2 항-GPC3 Fc 융합 단백질(예컨대, 제2 전장 항-GPC3 항체)은 표적 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 결합하기 위하여 교차-경쟁하며, 즉 각각의 항-GPC3 Fc 융합 단백질(예컨대, 전장 항-GPC3 항체)은 표적 GPC3에 결합하기 위하여 다른 하나의 항-GPC3 Fc 융합 단백질과 경쟁한다.
일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체(예컨대, 단리된 전장 항-GPC3 항체)가 제공되며, 상기 전장 항-GPC3 항체는 a) 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-GPC3 항체 모이어티의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 항-GPC3 항체 모이어티가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함); 및 b) Fc 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, Fc 단편은 IgG1 Fc 서열(예를 들어, 인간 또는 마우스 IgG1 Fc 서열)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 서열을 포함하는 인간 GPC3 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 461의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 462의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 463의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 GPC3의 N-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 1 내지 358 내의 에피토프(서열 번호 468)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 464의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 465)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 580 내의 에피토프(서열 번호 466)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 헤파린 설페이트 측쇄가 결여된 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 510 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 467)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 R358/S359에 있는 푸린 절단 부위에 걸쳐 있는 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 전장 성숙 인간 GPC3(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 560 또는 25 내지 580)에는 특이적으로 결합할 수 있지만, 인간 GPC3의 N-말단 단편(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 358) 또는 인간 GPC3의 C-말단 단편(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 560 또는 359 내지 580)에는 결합하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 헤파린 설페이트 측쇄가 결여된 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 Fc 융합 단백질이 제공되며, 상기 전장 항-GPC3 Fc 융합 단백질은 a) nGPC3에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 항-nGPC3 항체 모이어티(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-GPC3 항체 모이어티의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 항-GPC3 항체 모이어티가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함); 및 b) Fc 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 Fc 융합 단백질이 제공되며, 상기 전장 항-GPC3 Fc 융합 단백질은 a) 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 nGPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-nGPC3 항체 모이어티(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-GPC3 항체 모이어티의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 항-GPC3 항체 모이어티가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함); 및 b) Fc 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 HepG2, Hep3B, Huh7, JHH-7, 및 293으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 암 세포(예컨대, 간암 세포, 예를 들어 HCC)의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체는 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체는 단일클론 항체이다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체는 단일특이성이다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체는 다중특이성(예를 들어, 이중특이성)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 nGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M(예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 항-nGPC3 항체 모이어티와 nGPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배(예컨대, 적어도 약 10, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107배)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M(예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체는 서열 번호 507의 아미노산 서열을 포함하는 마우스 IgG1 중쇄 불변 도메인(CH)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체는 서열 번호 508의 아미노산 서열을 포함하는 마우스 λ 경쇄 불변 도메인(CL)을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체는 서열 번호 505의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열 번호 506의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체의 중쇄 및/또는 경쇄는 선택적으로 N-말단 신호 펩티드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 신호 펩티드는 서열 번호 509의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체(예컨대, 단리된 전장 항-GPC3 항체)가 제공되며, 상기 전장 항-GPC3 항체는 a) i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티; 및 b) Fc 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체(예컨대, 단리된 전장 항-GPC3 항체)가 제공되며, 상기 전장 항-GPC3 항체는 a) i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티; 및 b) Fc 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체(예컨대, 단리된 전장 항-GPC3 항체)가 제공되며, 상기 전장 항-GPC3 항체는 a) i) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체(예컨대, 단리된 전장 항-GPC3 항체)가 제공되며, 상기 전장 항-GPC3 항체는 a) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체(예컨대, 단리된 전장 항-GPC3 항체)가 제공되며, 상기 전장 항-GPC3 항체는 a) 본 명세서에 기재된 임의의 항-GPC3 작제물과 경쟁적으로, 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티; 및 Fc 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체(예컨대, 단리된 전장 항-GPC3 항체)가 제공되며, 상기 전장 항-GPC3 항체는 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 nGPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-nGPC3 항체 모이어티; 및 Fc 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, Fc 단편은 IgG1 Fc 서열(예를 들어, 인간 또는 마우스 IgG1 Fc 서열)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 HepG2, Hep3B, Huh7, JHH-7, 및 293으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 암 세포(예컨대, 간암 세포, 예를 들어 HCC)의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체는 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체는 단일클론 항체이다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체는 단일특이성이다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체는 다중특이성(예를 들어, 이중특이성)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 nGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M(예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 항-nGPC3 항체 모이어티와 nGPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배(예컨대, 적어도 약 10, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107배)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M(예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체는 서열 번호 507의 아미노산 서열을 포함하는 마우스 IgG1 중쇄 불변 도메인(CH)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체는 서열 번호 508의 아미노산 서열을 포함하는 마우스 λ 경쇄 불변 도메인(CL)을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체는 서열 번호 505의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열 번호 506의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체의 중쇄 및/또는 경쇄는 선택적으로 N-말단 신호 펩티드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 신호 펩티드는 서열 번호 509의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체(예컨대, 단리된 전장 항-GPC3 항체)가 제공되며, 상기 전장 항-GPC3 항체는 a) i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함하는, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티; 및 b) Fc 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체(예컨대, 단리된 전장 항-GPC3 항체)가 제공되며, 상기 전장 항-GPC3 항체는 a) i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함하는, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티; 및 b) Fc 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체(예컨대, 단리된 전장 항-GPC3 항체)가 제공되며, 상기 전장 항-GPC3 항체는 a) i) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체(예컨대, 단리된 전장 항-GPC3 항체)가 제공되며, 상기 전장 항-GPC3 항체는 a) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함하는, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체(예컨대, 단리된 전장 항-GPC3 항체)가 제공되며, 상기 전장 항-GPC3 항체는 a) 본 명세서에 기재된 임의의 항-GPC3 작제물과 경쟁적으로, 표적 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티; 및 Fc 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체(예컨대, 단리된 전장 항-GPC3 항체)가 제공되며, 상기 전장 항-GPC3 항체는 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 GPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티; 및 Fc 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, Fc 단편은 IgG1 Fc 서열(예를 들어, 인간 또는 마우스 IgG1 Fc 서열)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 HepG2, Hep3B, Huh7, JHH-7, 및 293으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 암 세포(예컨대, 간암 세포, 예를 들어 HCC)의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체는 단일클론 항체이다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체는 단일특이성이다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체는 다중특이성(예를 들어, 이중특이성)이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고, 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 가용성 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 가용성 GPC3에 대한 항-sGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-sGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 461의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-sGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 510 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 467)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3 및 가용성 GPC3 둘 모두를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티와 표적 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3) 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M(예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티와 비표적 사이의 결합의 Kd는 항-GPC3 항체 모이어티와 표적 GPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배(예컨대, 적어도 약 10, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107배)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티와 비표적 사이의 결합의 Kd는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M(예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체는 서열 번호 507의 아미노산 서열을 포함하는 마우스 IgG1 중쇄 불변 도메인(CH)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체는 서열 번호 508의 아미노산 서열을 포함하는 마우스 λ 경쇄 불변 도메인(CL)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체의 중쇄 및/또는 경쇄는 선택적으로 N-말단 신호 펩티드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 신호 펩티드는 서열 번호 509의 아미노산 서열을 포함한다.
다중특이성 항-GPC3 분자
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)은 본 명세서에 기재된 항-GPC3 항체 모이어티들 중 어느 하나에 따른 항-GPC3 항체 모이어티, 및 제2 항원을 특이적으로 인식하는 제2 결합 모이어티(예컨대, 제2 항체 모이어티)를 포함하는 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 항-GPC3 분자는 항-GPC3 항체 모이어티 및 제2 항원을 특이적으로 인식하는 제2 항체 모이어티를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고, 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 가용성 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 가용성 GPC3에 대한 항-sGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3 및 가용성 GPC3 둘 모두를 특이적으로 인식한다.
다중특이성 분자는 적어도 2개의 상이한 항원 또는 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 분자이다(예를 들어, 이중특이성 항체는 2개의 항원 또는 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는다). 2 초과의 결합가(valency) 및/또는 특이성을 갖는 다중특이성 분자가 또한 고려된다. 예를 들어, 삼중특이성 항체가 제조될 수 있다(문헌[Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)]). 당업자는 본 명세서에 기재된 개별 다중특이성 분자들의 적절한 특징을 선택하여 서로 조합하여 본 발명의 다중특이성 항-GPC3 분자를 형성할 수 있음이 이해되어야 한다.
따라서, 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자가 제공되며, 상기 다중특이성 항-GPC3 분자는 a) 표적 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티(예를 들어, scFv), 및 b) 제2 항원을 특이적으로 인식하는 제2 결합 모이어티(예컨대, 제2 항체 모이어티, 예를 들어 scFv)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고, 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 가용성 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 가용성 GPC3에 대한 항-sGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3 및 가용성 GPC3 둘 모두를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제2 결합 모이어티는 항-GPC3 항체 모이어티와 동일한 포맷의 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제2 결합 모이어티는 항-GPC3 항체 모이어티와 대비하여 상이한 GPC3 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제2 결합 모이어티는 항-GPC3 항체 모이어티와 대비하여 상이한 포맷의 GPC3을 특이적으로 인식한다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 제2 결합 모이어티는 sGPC3(또는 sGPC3 및 nGPC3 둘 모두)을 특이적으로 인식하는 반면에, 항-GPC3 항체 모이어티는 (sGPC3에는 전혀 또는 거의 결합하지 않고서) nGPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제2 결합 모이어티는 GPC3이 아닌 제2 항원을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제2 결합 모이어티는 세포, 예컨대 세포독성 세포의 표면 상의 제2 항원을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제2 결합 모이어티는 림프구, 예컨대 T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 호중구, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포의 표면 상의 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, 제2 결합 모이어티는 이펙터 T 세포, 예컨대 세포독성 T 세포(세포독성 T 림프구(CTL) 또는 T 살해 세포로도 알려짐) 또는 자연 살해 T(NKT) 세포에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, 제2 결합 모이어티는 이펙터 세포의 표면 상의 제2 항원에 특이적으로 결합하며, 제2 항원에는, 예를 들어 CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD27, CD28, CD16a, CD40L, CD56, CD68, CD137, OX40, GITR, HVEM 및 GDS2D가 포함된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 전장 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 제2 결합 모이어티는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 결합 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 항-GPC3 분자는 적어도 하나(예컨대, 적어도 약 2, 3, 4, 5개, 또는 그 이상 중 어느 하나)의 추가의 항체 모이어티를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자가 제공되며, 상기 다중특이성 항-GPC3 분자는 a) 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티(예를 들어, scFv)(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 항-nGPC3 항체 모이어티가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함), 및 b) 제2 항원(예를 들어, T 세포 상의 CD3)을 특이적으로 인식하는 제2 결합 모이어티(예컨대, 제2 항체 모이어티, 예를 들어 scFv)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 서열을 포함하는 인간 GPC3 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 461의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 462의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 463의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 GPC3의 N-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 1 내지 358 내의 에피토프(서열 번호 468)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 464의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 465)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 580 내의 에피토프(서열 번호 466)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 헤파린 설페이트 측쇄가 결여된 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 510 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 467)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 R358/S359에 있는 푸린 절단 부위에 걸쳐 있는 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 전장 성숙 인간 GPC3(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 560 또는 25 내지 580)에는 특이적으로 결합할 수 있지만, 인간 GPC3의 N-말단 단편(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 358) 또는 인간 GPC3의 C-말단 단편(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 560 또는 359 내지 580)에는 결합하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 헤파린 설페이트 측쇄가 결여된 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자가 제공되며, 상기 다중특이성 항-GPC3 분자는 a) nGPC3에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 항-nGPC3 항체 모이어티(예를 들어, scFv; 예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 항-nGPC3 항체 모이어티가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함); 및 b) 제2 항원(예를 들어, T 세포 상의 CD3)을 특이적으로 인식하는 제2 결합 모이어티(예컨대, 제2 항체 모이어티, 예를 들어 scFv)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자가 제공되며, 상기 다중특이성 항-GPC3 분자는 a) 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 nGPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-nGPC3 항체 모이어티(예를 들어, scFv; 예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 항-nGPC3 항체 모이어티가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함); 및 b) 제2 항원(예를 들어, T 세포 상의 CD3)을 특이적으로 인식하는 제2 결합 모이어티(예컨대, 제2 항체 모이어티, 예를 들어 scFv)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 HepG2, Hep3B, Huh7, JHH-7, 및 293으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 암 세포(예컨대, 간암 세포, 예를 들어 HCC)의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 nGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M(예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 항-nGPC3 항체 모이어티와 nGPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배(예컨대, 적어도 약 10, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107배)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M(예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)이다. 일부 실시 형태에서, 제1 및/또는 제2 항체 모이어티는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 제1 및/또는 제2 항체 모이어티는 전장 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 제1 및/또는 제2 항체 모이어티는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 제1 항체 모이어티와 제2 항체 모이어티는 링커(예를 들어, 서열 번호 474)에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-GPC3 항체 모이어티는 제2 항체 모이어티에 대해 N-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 세포는 T 세포(예를 들어, 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 또는 자연 살해 T 세포), B 세포, NK 세포, 수지상 세포, 대식세포, 단핵구, 또는 호중구이다. 일부 실시 형태에서, 제2 항원은 CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, CD40L, 또는 HVEM이다.
일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자가 제공되며, 상기 다중특이성 항-GPC3 분자는 a) i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티(예를 들어, scFv); 및 b) 제2 항원(예를 들어, T 세포 상의 CD3)을 특이적으로 인식하는 제2 결합 모이어티(예컨대, 제2 항체 모이어티, 예를 들어 scFv)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자가 제공되며, 상기 다중특이성 항-GPC3 분자는 a) i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티(예를 들어, scFv); 및 b) 제2 항원(예를 들어, T 세포 상의 CD3)을 특이적으로 인식하는 제2 결합 모이어티(예컨대, 제2 항체 모이어티, 예를 들어 scFv)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자가 제공되며, 상기 다중특이성 항-GPC3 분자는 a) i) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티(예를 들어, scFv); 및 b) 제2 항원(예를 들어, T 세포 상의 CD3)을 특이적으로 인식하는 제2 결합 모이어티(예컨대, 제2 항체 모이어티, 예를 들어 scFv)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자가 제공되며, 상기 다중특이성 항-GPC3 분자는 a) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티(예를 들어, scFv); 및 b) 제2 항원(예를 들어, T 세포 상의 CD3)을 특이적으로 인식하는 제2 결합 모이어티(예컨대, 제2 항체 모이어티, 예를 들어 scFv)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자가 제공되며, 상기 다중특이성 항-GPC3 분자는 a) 세포 표면-결합된 GPC3에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 임의의 항-nGPC3 항체 모이어티에 따른 제2 항-nGPC3 항체 모이어티와 경쟁하는, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티(예를 들어, scFv); 및 b) 제2 항원(예를 들어, T 세포 상의 CD3)을 특이적으로 인식하는 제2 결합 모이어티(예컨대, 제2 항체 모이어티, 예를 들어 scFv)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자가 제공되며, 상기 다중특이성 항-GPC3 분자는 a) 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 nGPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-nGPC3 항체 모이어티(예를 들어, scFv); 및 b) 제2 항원(예를 들어, T 세포 상의 CD3)을 특이적으로 인식하는 제2 결합 모이어티(예컨대, 제2 항체 모이어티, 예를 들어 scFv)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 nGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M(예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 항-nGPC3 항체 모이어티와 nGPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배(예컨대, 적어도 약 10, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107배)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M(예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)이다. 일부 실시 형태에서, 제1 및/또는 제2 항체 모이어티는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 제1 및/또는 제2 항체 모이어티는 전장 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 제1 및/또는 제2 항체 모이어티는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 제1 항체 모이어티와 제2 항체 모이어티는 링커(예를 들어, 서열 번호 474)에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-GPC3 항체 모이어티는 제2 항체 모이어티에 대해 N-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 세포는 T 세포(예를 들어, 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 또는 자연 살해 T 세포), B 세포, NK 세포, 수지상 세포, 대식세포, 단핵구, 또는 호중구이다. 일부 실시 형태에서, 제2 항원은 CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, CD40L, 또는 HVEM이다.
일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자가 제공되며, 상기 다중특이성 항-GPC3 분자는 a) i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함하는, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티(예를 들어, scFv); 및 b) 제2 항원(예를 들어, T 세포 상의 CD3)을 특이적으로 인식하는 제2 결합 모이어티(예컨대, 제2 항체 모이어티, 예를 들어 scFv)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자가 제공되며, 상기 다중특이성 항-GPC3 분자는 a) i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함하는, GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티(예를 들어, scFv); 및 b) 제2 항원(예를 들어, T 세포 상의 CD3)을 특이적으로 인식하는 제2 결합 모이어티(예컨대, 제2 항체 모이어티, 예를 들어 scFv)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자가 제공되며, 상기 다중특이성 항-GPC3 분자는 a) i) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티(예를 들어, scFv); 및 b) 제2 항원(예를 들어, T 세포 상의 CD3)을 특이적으로 인식하는 제2 결합 모이어티(예컨대, 제2 항체 모이어티, 예를 들어 scFv)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자가 제공되며, 상기 다중특이성 항-GPC3 분자는 a) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함하는, GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티(예를 들어, scFv); 및 b) 제2 항원(예를 들어, T 세포 상의 CD3)을 특이적으로 인식하는 제2 결합 모이어티(예컨대, 제2 항체 모이어티, 예를 들어 scFv)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자가 제공되며, 상기 다중특이성 항-GPC3 분자는 a) 표적 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 임의의 항-GPC3 항체 모이어티에 따른 제2 항-GPC3 항체 모이어티와 경쟁하는, GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티(예를 들어, scFv); 및 b) 제2 항원(예를 들어, T 세포 상의 CD3)을 특이적으로 인식하는 제2 결합 모이어티(예컨대, 제2 항체 모이어티, 예를 들어 scFv)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자가 제공되며, 상기 다중특이성 항-GPC3 분자는 a) 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 GPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티(예를 들어, scFv); 및 b) 제2 항원(예를 들어, T 세포 상의 CD3)을 특이적으로 인식하는 제2 결합 모이어티(예컨대, 제2 항체 모이어티, 예를 들어 scFv)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고, 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 가용성 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 가용성 GPC3에 대한 항-sGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-sGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 461의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-sGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 510 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 467)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3 및 가용성 GPC3 둘 모두를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티와 표적 GPC3(예를 들어, gGPC3 및/또는 sGPC3) 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M(예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티와 비표적 사이의 결합의 Kd는 항-GPC3 항체 모이어티와 표적 GPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배(예컨대, 적어도 약 10, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107배)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티와 비표적 사이의 결합의 Kd는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M(예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)이다. 일부 실시 형태에서, 제1 및/또는 제2 항체 모이어티는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 제1 및/또는 제2 항체 모이어티는 전장 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 제1 및/또는 제2 항체 모이어티는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 제1 항체 모이어티와 제2 항체 모이어티는 링커(예를 들어, 서열 번호 474)에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-GPC3 항체 모이어티는 제2 항체 모이어티에 대해 N-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 세포는 T 세포(예를 들어, 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 또는 자연 살해 T 세포), B 세포, NK 세포, 수지상 세포, 대식세포, 단핵구, 또는 호중구이다. 일부 실시 형태에서, 제2 항원은 CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, CD40L, 또는 HVEM이다.
일부 실시 형태에서, 다중특이성 항-GPC3 분자는, 예를 들어 다이아바디(Db), 단일쇄 다이아바디(scDb), 탠덤 scDb(Tandab), 선형 이량체 scDb(LD-scDb), 환형 이량체 scDb(CD-scDb), 다이-다이아바디, 탠덤 scFv, 탠덤 다이-scFv(예를 들어, 이중특이성 T 세포 인게이저), 탠덤 트라이-scFv, 트라이(아)바디, 이중특이성 Fab2, 다이-미니항체, 테트라바디, scFv-Fc-scFv 융합체, 이중-친화성 재표적화(DART) 항체, 이중 가변 도메인(DVD) 항체, IgG-scFab, scFab-ds-scFv, Fv2-Fc, IgG-scFv 융합체, 독 앤드 락(DNL) 항체, 노브-인투-홀(KiH) 항체(KiH Technology에 의해 제조된 이중특이성 IgG), 듀오바디(DuoBody)(Duobody Technology에 의해 제조된 이중특이성 IgG), 이종다량체성 항체, 또는 이종접합체 항체이다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 항-GPC3 분자는 탠덤 scFv(예를 들어, 탠덤 다이-scFv, 예컨대 이중특이성 T 세포 인게이저)이다.
제2 항원
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)은 항-GPC3 항체 모이어티(예컨대, 항-nGPC3 항체 모이어티) 및 제2 항원을 특이적으로 인식하는 제2 항체 모이어티(예를 들어, scFv)를 포함하는 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자이다. 일부 실시 형태에서, 제2 항원은 또한 GPC3이지만, 항-GPC3 항체 모이어티에 의해 인식되는 것과 대비하여 상이한 에피토프를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제2 항원은 GPC3이 아니다. 일부 실시 형태에서, 제2 항원은 종양 항원이다. 일부 실시 형태에서, 제2 항원은 세포 표면 분자이다. 일부 실시 형태에서, 제2 항원은 이펙터 세포 상의 세포 표면 분자이다.
본 명세서에 기재된 제2 항체 모이어티에 의해 인식될 수 있는 예시적인 종양 항원은 알파 태아단백질(AFP), CA15-3, CA27-29, CA19-9, CA-125, 칼레티닌, 암배아 항원, CD34, CD99, CD117, 크로모그라닌, 사이토케라틴, 데스민, 상피 막 단백질(EMA), 인자 VIII, CD31 FL1, 아교세포 섬유 산성 단백질(GFAP), 육안적 낭포성 질병 유체 단백질(GCDFP-15), HMB-45, 인간 융모성 성선자극호르몬(hCG), 인히빈, 케라틴, CD45, 림프구 마커, MART-1(Melan-A), Myo Dl, 근육-특이적 액틴(MSA), 신경필라멘트, 뉴런-특이적 에놀라제(NSE), 태반 알칼리성 포스파타제(PLAP), 전립선-특이적 항원, S100 단백질, 평활근 액틴(SMA), 시냅토파이신, 티로글로불린, 갑상선 전사 인자-1, 종양 M2-PK, 및 비멘틴을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자는 이펙터 세포(예컨대, 세포독성 T 세포)를 종양 부위로 유도함으로써(또는 동원함으로써) 종양 세포의 사멸(예를 들어, 세포독성 용해 또는 식세포작용)을 촉진시키도록 조작될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 종양 세포독성은 LDH 세포독성 검정을 사용하여 시험될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자는 면역억제 환경, 예컨대 면역억제 종양 환경에서 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포, CAR T 세포, caTCR T 세포)를 표적 세포로 효과적으로 유도할 수 있다.
예시적인 이펙터 세포는, 제한 없이, T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 수지상 세포(DC), 대식세포, 단핵구, 호중구, 자연 살해 T(NKT) 세포, 항체-의존성 세포독성 세포, 키메라 항원 수용체(CAR) 이펙터 세포(예를 들어, CAR T), 키메라 항체-T 세포 수용체(TCR) 작제물(caTCR) 이펙터 세포(하기 caTCR 섹션 참조) 등을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 세포는 T 세포(예를 들어, 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 또는 NKT 세포)이다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 세포는 세포독성 T 세포이다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 세포는 동종이계(allogenic)이다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 세포는 자가(autologous)이다.
본 발명의 세포 표면 분자는 특정 세포 유형 또는 제한된 수의 세포 유형의 외부 세포벽 또는 원형질 막 상에서 발견되는 분자이다. 세포 표면 분자의 예에는 막 단백질, 예컨대 수용체, 수송체, 이온 채널, 양성자 펌프, 및 G 단백질-커플링된 수용체; 세포외 기질 분자, 예컨대 부착 분자(예를 들어, 인테그린, 카드헤린, 셀렉틴, 또는 NCAMS)가 포함되지만 이로 한정되지 않으며, 예를 들어 미국 특허 제7,556,928호를 참조하며, 이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 이펙터 세포 상의 세포 표면 분자는 CD3(예를 들어, CD3γ, CD3δ, CD3ε, 또는 CD3ζ), CD4, CD5, CD7, CD8, CD13, CD14, CD16, CD27(TNFRSF7), CD28, CD31, CD38, CD40L(TNFSF5 또는 CD154), CD56, CD64, CD68, CD89, CD94, CD137(TNFRSF9 또는 4-1BB), CD278, NKp46, NKp30, NKG2D, MAC-l/MAC-3, IL-2Ra, OX40(TNFRSF4 또는 CD134), GITR, HVEM(TNFRSF14 또는 CD270), Ly49, 또는 불변성 TCR을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
당업자는 면역 세포가 상이한 세포 표면 분자를 갖는다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, CD3은 T 세포 상의 세포 표면 분자이며, 한편 CD16, NKG2D, 또는 NKp30은 NK 세포 상의 세포 표면 분자이고, CD3 또는 불변성 TCR은 NKT-세포 상의 세포 표면 분자이다. 예를 들어 이펙터 세포가 T 세포인 일부 실시 형태에서, 활성화 분자는 CD3(예를 들어, CD3γ, CD3δ 또는 CD3ε), CD27, CD28, CD40, CD134, CD137, 및 CD278 중 하나 이상이다. 예를 들어 이펙터 세포가 NK 세포인 일부 실시 형태에서, 세포 표면 분자는 CD16, NKG2D, 또는 NKp30이거나; 또는 이펙터 세포가 NKT-세포인 일부 실시 형태에서, 세포 표면 분자는 CD3 또는 불변성 TCR이다.
일부 실시 형태에서, 제2 항체 모이어티는 CD3에 특이적으로 결합한다. CD3은 T 세포에 의해 발현되는 항원이며, 3개의 상이한 폴리펩티드 사슬(ε, δ 및 γ 사슬)을 포함한다. 3개의 CD3 폴리펩티드 사슬은 T 세포 수용체(TCR) 및 ζ-사슬과 회합하여 TCR 복합체를 형성하며, 이것은 T 세포에서 신호전달 캐스케이드를 활성화시키는 기능을 갖는다. 현재, 많은 치료 전략은 항-인간 CD3 단일클론 항체를 사용하여 TCR 신호 전달을 표적화하여 질병을 치료한다. 당업자는 TCR 복합체가 가변 TCR α 및 β 사슬과 3개의 이량체 신호전달 모듈 CD3δ/ε, CD3γ/ε 및 CD3ζ/ζ 또는 ζ/η의 팔량체 복합체임을 인식할 것이다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 제2 항체 모이어티(예컨대, scFv)는 CD3ε에 결합하지만, 다른 CD3 분자, 특히 CD3ζ, 또는 TCR α 및 β 사슬을 표적화하는 것이 또한 본 발명에 포함된다.
일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자가 제공되며, 상기 다중특이성 항-GPC3 분자는 a) 표적 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티(예를 들어, scFv), 및 b) CD3에 특이적으로 결합하는 제2 항체 모이어티(예를 들어, scFv)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제2 항체 모이어티는 CD3ε에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, 제2 항체 모이어티는 CD3ε의 효능적 에피토프에 특이적으로 결합한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "효능적 에피토프"는 (a) 다중특이성 분자의 결합 시에, 선택적으로 동일한 세포 상의 몇몇 다중특이성 분자의 결합 시에, 상기 다중특이성 분자가 TCR 신호전달을 활성화시키고 T 세포 활성화를 유도할 수 있게 하는 에피토프, 및/또는 (b) 오로지 CD3의 엡실론 사슬의 아미노산 잔기만으로 구성되고, 그의 천연적인 상황에서 T 세포 상에 제시될 때(즉, TCR, CD3γ 사슬 등에 의해 둘러싸일 때), 다중특이성 분자에 의한 결합을 위하여 접근가능한 에피토프, 및/또는 (c) 다중특이성 분자의 결합 시에, CD3γ에 대한 CD3ε의 공간적 위치의 안정화를 야기하지 않는 에피토프를 의미한다.
일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자가 제공되며, 상기 다중특이성 항-GPC3 분자는 a) 표적 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티(예를 들어, scFv), 및 b) 예를 들어 CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD28, CD16a, CD56, CD68, 및 GDS2D를 포함한, 이펙터 세포의 표면 상의 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항체 모이어티(예를 들어 scFv)를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자가 제공되며, 상기 다중특이성 항-GPC3 분자는 a) 표적 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티(예를 들어, scFv), 및 b) 보체 시스템의 성분, 예컨대 C1q에 특이적으로 결합하는 제2 항체 모이어티(예를 들어, scFv)를 포함한다. C1q는 혈청 보체 시스템을 활성화시키는 C1 효소 복합체의 하위단위이다.
일부 실시 형태에서, 제2 항체 모이어티는 Fc 수용체에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, 제2 항체 모이어티는 Fcγ 수용체(FcγR)에 특이적으로 결합한다. FcγR은 NK 세포의 표면 상에 존재하는 FcγRIII일 수 있거나, 또는 대식세포, 단핵구, 호중구 및/또는 수지상 세포의 표면 상에 존재하는 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIBI, FcγRIIB2, 및 FcγRIIIB 중 하나일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 제2 항체 모이어티는 Fc 영역 또는 이의 기능성 단편이다. 이와 관련하여 사용되는 바와 같이, "기능성 단편"은 FcR, 특히 FcγR에 여전히 결합할 수 있는 항체 Fc 영역의 단편을 지칭하는 것으로, 이것은 FcγR 보유 이펙터 세포, 특히 대식세포, 단핵구, 호중구 및/또는 수지상 세포가 세포독성 용해 또는 식세포작용에 의해 표적 세포를 사멸시킬 수 있게 하기에 충분한 특이성 및 친화성을 갖는다. 기능성 Fc 단편은 FcR, 예컨대 활성화 FcγRI에 대한 원래의 전장 Fc 부분의 결합을 경쟁적으로 억제할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 기능성 Fc 단편은 활성화 FcγR에 대한 그의 친화성의 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%를 보유한다. 일부 실시 형태에서, Fc 영역 또는 이의 기능성 단편은 향상된 Fc 영역 또는 이의 기능성 단편이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "향상된 Fc 영역"은 Fc 수용체-매개 이펙터 기능, 특히 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 보체-의존성 세포독성(CDC), 및 항체-매개 식세포작용을 향상시키도록 변형된 Fc 영역을 지칭한다. 이는 당업계에 알려진 바와 같이, 예를 들어 활성화 수용체(예를 들어, NK 세포 상에서 발현되는 FcγRIIIA(CD16A))에 대한 증가된 친화도 및/또는 억제성 수용체(예를 들어, FcγRIIB1/B2(CD32B))에 대한 감소된 결합을 유도하는 방식으로 Fc 영역을 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 또 다른 실시 형태에서, 제2 항체 모이어티는 FcR, 특히 FcγR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 이것은 FcγR 보유 이펙터 세포, 특히 대식세포, 단핵구, 호중구 및/또는 수지상 세포가 세포독성 용해 또는 식세포작용에 의해 표적 세포를 사멸시킬 수 있게 하기에 충분한 특이성 및 친화성을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자는 GPC3+ 세포(예컨대, HCC 세포)의 사멸을 가능하게 하고/하거나, 표적 세포 표면 상에 GPC3을 발현하는 세포를 용해시키도록 CTL을 효과적으로 방향전환시킬 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 다중특이성 항-GPC3 분자는 10 내지 500 ng/ml 범위의 시험관내 EC50을 나타내며, CTL 대 표적 세포의 비가 약 1:1 내지 약 50:1(예컨대, 약 1:1 내지 약 15:1, 또는 약 2:1 내지 약 10:1)일 때 CTL을 통해 표적 세포의 약 50%의 방향전환된 용해를 유도할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자는 자극 또는 비자극된 CTL과 표적 세포(예컨대, GPC3+ 세포, 예를 들어 HCC 세포)를 표적 세포가 용해되는 방식으로 가교결합시킬 수 있다. 이는, 다중특이성 항-GPC3 분자가 그의 원하는 활성을 발휘하는 데 있어서, 표적-특이적 T 세포 클론의 생성 또는 수지상 세포에 의한 공통 항원 제시가 그것에 대해 요구되지 않는다는 이점을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자는 다른 활성화 신호의 부재 하에서 표적 세포(예를 들어, GPC3+ 세포, 예를 들어 HCC 세포)를 용해시키도록 CTL을 방향전환시킬 수 있다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 항-GPC3 분자의 제2 항체 모이어티는 CD3에 특이적으로 결합하고(예를 들어, CD3ε에 특이적으로 결합하고), 표적 세포를 용해시키도록 CTL을 방향전환시키는 데 있어서 CD28 및/또는 IL-2를 통한 신호전달은 요구되지 않는다.
다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자가 2개의 항원(예를 들어, 2개의 상이한 세포 상의 항원)에 동시에 결합하게 될 선호도를 측정하기 위한 방법은 당업자의 통상적인 능력 범위 내에 있다. 예를 들어, 제2 결합 모이어티(예를 들어, 제2 항체 모이어티)가 CD3에 특이적으로 결합하는 경우, 다중특이성 항-GPC3 분자는 CD3+/GPC3- 세포 및 CD3-/GPC3+ 세포의 혼합물과 접촉될 수 있다. 이어서, 다중특이성 항-GPC3 분자-양성 단일 세포의 수 및 다중특이성 항-GPC3 분자에 의해 가교결합된 세포의 수가 당업계에 알려진 바와 같은 현미경법 또는 형광-활성화 세포 분류(FACS)에 의해 평가될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자는 a) 표적 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티(예를 들어, scFv), 및 b) T 세포 상의 CD3ε에 특이적으로 결합하는 제2 항체 모이어티(예를 들어, scFv)(이하, 본 명세서에서 "항-CD3 항체 모이어티"로 지칭됨)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-CD3 항체 모이어티(예를 들어, scFv)는 i) 서열 번호 479의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 480의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 481의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 482의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 483의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 484의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-CD3 항체 모이어티(예를 들어, scFv)는 i) 서열 번호 485의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 486의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-CD3 항체 모이어티(예를 들어, scFv)는 i) 서열 번호 485의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 486의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-CD3 항체 모이어티는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-CD3 scFv는 서열 번호 487의 아미노산 서열을 포함한다.
링커
일부 실시 형태에서, 표적 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티(예를 들어, scFv) 및 제2 항원(예를 들어, T 세포 상의 CD3)을 특이적으로 인식하는 제2 항체 모이어티(예를 들어, scFv)는 링커(예컨대, 펩티드 링커)에 의해 연결된다. 본 명세서에 기재된 다중특이성 항-GPC3 분자에 사용될 수 있는 모든 적용가능한 링커에 대해서는 "항-GPC3 Fc 융합 단백질" 섹션 하의 "링커" 하위섹션을 참조한다. 일부 실시 형태에서, 링커는 SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA(서열 번호 473)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 링커는 (GGGGS)n 서열(서열 번호 471)이거나 이를 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상이다. 일부 실시 형태에서, 링커는 TSGGGGS(서열 번호 474)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 링커는 GEGTSTGSGGSGGSGGAD(서열 번호 490)의 아미노산 서열을 포함한다.
탠덤 scFv
일부 실시 형태에서, 다중특이성 항-GPC3 분자는, GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 제1 scFv(본 명세서에서 "항-GPC3 scFv"로 지칭되며; nGPC3 및/또는 sGPC3을 인식함) 및 제2 항원을 특이적으로 인식하는 제2 scFv를 포함하는 탠덤 scFv(본 명세서에서 "탠덤 scFv 다중특이성 항-GPC3 항체"로도 지칭됨)이다. 일부 실시 형태에서, 탠덤 scFv 다중특이성 항-GPC3 항체는 적어도 하나(예컨대, 적어도 약 2, 3, 4, 5개, 또는 그 이상 중 어느 하나)의 추가의 scFv를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 탠덤 scFv 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 항체가 제공되며, 상기 탠덤 scFv 다중특이성 항-GPC3 항체는 a) GPC3을 특이적으로 인식하는 제1 scFv; 및 b) 제2 항원(예를 들어, T 세포 상의 CD3)을 특이적으로 인식하는 제2 scFv를 포함하며, 탠덤 scFv 다중특이성 항-GPC3 항체는 탠덤 다이-scFv 또는 탠덤 트라이-scFv이다. 일부 실시 형태에서, 탠덤 scFv 다중특이성 항-GPC3 항체는 탠덤 다이-scFv이다. 일부 실시 형태에서, 탠덤 scFv 다중특이성 항-GPC3 항체는 이중특이성 T-세포 인게이저이다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-GPC3 scFv는 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 제1 항-nGPC3 scFv의 결합 친화도는 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고, 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-GPC3 scFv는 가용성 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 가용성 GPC3에 대한 제1 항-sGPC3 scFv의 결합 친화도는 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-GPC3 scFv는 세포 표면-결합된 GPC3 및 가용성 GPC3 둘 모두를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제2 scFv는 상이한 GPC3 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, 제2 scFv는 GPC3이 아닌 제2 항원을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제2 scFv는 세포, 예컨대 세포독성 세포의 표면 상의 제2 항원을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제2 scFv는 림프구, 예컨대 T 세포(예를 들어, CTL, 헬퍼 T 세포, 또는 NKT), B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 호중구, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포의 표면 상의 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, 제2 scFv는 이펙터 T 세포, 예컨대 CTL 또는 NKT 세포에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, 제2 scFv는 이펙터 세포의 표면 상의 제2 항원에 특이적으로 결합하며, 제2 항원에는, 예를 들어 CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD27, CD28, CD16a, CD40L, CD56, CD68, CD137, OX40, GITR, HVEM 및 GDS2D가 포함된다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-GPC3 scFv는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 제2 scFv는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 제1 scFv 및 제2 scFv 둘 모두는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 탠덤 scFv 다중특이성 항-GPC3 항체는 적어도 하나(예컨대, 적어도 약 2, 3, 4, 5개, 또는 그 이상 중 어느 하나)의 추가의 scFv를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-GPC3 scFv와 제2 scFv는 링커(예를 들어, 펩티드 링커)에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 링커는 (GGGGS)n(서열 번호 471)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상이다. 일부 실시 형태에서, 링커는 TSGGGGS(서열 번호 474)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-GPC3 scFv는 제2 scFv에 대해 N-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-GPC3 scFv는 제2 scFv에 대해 C-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 탠덤 scFv 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 항체는 태그(예를 들어, 정제 목적을 위한 펩티드 태그)를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 태그는 탠덤 scFv 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 항체에 대해 N-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 태그는 탠덤 scFv 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 항체에 대해 C-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 태그는 HHHHHH(서열 번호 476)의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 탠덤 scFv 다중특이성 항-GPC3 항체는 2개의 scFv를 포함하는 탠덤 다이-scFv(본 명세서에서 "탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체"로 지칭됨)이다. 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체는 VH 및 VL이 임의의 구성으로, 예컨대 (N-말단에서 C-말단으로) 하기에 열거된 구성으로 조립될 수 있으며, 여기서 X는 제2 scFv에 의해 특이적으로 결합된 제2 항원이고, L1, L2, 및 L3은 선택적인 링커(예컨대, 펩티드 링커)이다. 모든 적용가능한 링커에 대해서는 "항-GPC3 Fc 융합 단백질" 섹션 하의 "링커" 하위섹션을 참조한다. 일부 실시 형태에서, 링커(L1, L2, 또는 L3)는 SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA(서열 번호 473)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 링커(L1, L2, 또는 L3)는 (GGGGS)n 서열(서열 번호 471)이거나 이를 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상이다. 일부 실시 형태에서, 링커(L1, L2, 또는 L3)는 TSGGGGS(서열 번호 474)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 링커(L1, L2, 또는 L3)는 GEGTSTGSGGSGGSGGAD(서열 번호 490)의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 다중특이성 항-GPC3 항체는 하기 구조들 중 하나를 갖는 탠덤 다이-scFv이다:
VL(GPC3)-L1-VH(GPC3)-L2-VL(X)-L3-VH(X);
VL(GPC3)-L1-VH(GPC3)-L2-VH(X)-L3-VL(X);
VH(GPC3)-L1-VL(GPC3)-L2-VL(X)-L3-VH(X);
VH(GPC3)-L1-VL(GPC3)-L2-VH(X)-L3-VL(X);
VL(X)-L1-VH(X)-L2-VL(GPC3)-L3-VH(GPC3);
VL(X)-L1-VH(X)-L2-VH(GPC3)-L3-VL(GPC3);
VH(X)-L1-VL(X)-L2-VL(GPC3)-L3-VH(GPC3);
VH(X)-L1-VL(X)-L2-VH(GPC3)-L3-VL(GPC3);
VL(GPC3)-L1-VH(X)-L2-VL(X)-L3-VH(GPC3);
VL(GPC3)-L1-VL(X)-L2-VH(X)-L3-VH(GPC3);
VH(GPC3)-L1-VH(X)-L2-VL(X)-L3-VL(GPC3);
VH(GPC3)-L1-VL(X)-L2-VH(X)-L3-VL(GPC3);
VL(X)-L1-VH(GPC3)-L2-VL(GPC3)-L3-VH(X);
VL(X)-L1-VL(GPC3)-L2-VH(GPC3)-L3-VH(X);
VH(X)-L1-VH(GPC3)-L2-VL(GPC3)-L3-VL(X); 또는
VH(X)-L1-VL(GPC3)-L2-VH(GPC3)-L3-VL(X).
일부 실시 형태에서, 탠덤 scFv 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 항체가 제공되며, 상기 탠덤 scFv 다중특이성 항-GPC3 항체는 a) 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 제1 scFv(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 제1 항-nGPC3 scFv의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 제1 항-nGPC3 scFv가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함), 및 b) 제2 항원(예컨대, 이펙터 세포 상의 제2 항원, 예를 들어 T 세포 상의 CD3)을 특이적으로 인식하는 제2 scFv를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 서열 번호 460의 아미노산 서열을 포함하는 인간 GPC3 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 서열 번호 461의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 서열 번호 462의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 서열 번호 463의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 GPC3의 N-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 서열 번호 460의 아미노산 1 내지 358 내의 에피토프(서열 번호 468)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 서열 번호 464의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 465)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 580 내의 에피토프(서열 번호 466)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 헤파린 설페이트 측쇄가 결여된 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 서열 번호 460의 아미노산 510 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 467)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 서열 번호 460의 아미노산 R358/S359에 있는 푸린 절단 부위에 걸쳐 있는 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 전장 성숙 인간 GPC3(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 560 또는 25 내지 580)에는 특이적으로 결합할 수 있지만, 인간 GPC3의 N-말단 단편(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 358) 또는 인간 GPC3의 C-말단 단편(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 560 또는 359 내지 580)에는 결합하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 헤파린 설페이트 측쇄가 결여된 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 탠덤 scFv 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 항체가 제공되며, 상기 탠덤 scFv 다중특이성 항-GPC3 항체는 a) nGPC3에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 제1 항-nGPC3 scFv(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 제1 항-nGPC3 scFv의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 제1 항-nGPC3 scFv가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함), 및 b) 제2 항원(예컨대, 이펙터 세포 상의 제2 항원, 예를 들어 T 세포 상의 CD3)을 특이적으로 인식하는 제2 scFv를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 탠덤 scFv 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 항체가 제공되며, 상기 탠덤 scFv 다중특이성 항-GPC3 항체는 a) 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 nGPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 항-nGPC3 scFv(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 제1 항-nGPC3 scFv의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 제1 항-nGPC3 scFv가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함), 및 b) 제2 항원(예컨대, 이펙터 세포 상의 제2 항원, 예를 들어 T 세포 상의 CD3)을 특이적으로 인식하는 제2 scFv를 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 HepG2, Hep3B, Huh7, JHH-7, 및 293으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 암 세포(예컨대, 간암 세포, 예를 들어 HCC)의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv와 제2 scFv는 링커(예를 들어, 펩티드 링커)에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 링커는 (GGGGS)n(서열 번호 471)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상이다. 일부 실시 형태에서, 링커는 TSGGGGS(서열 번호 474)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 제2 scFv에 대해 N-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 제2 scFv는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 제1 scFv 및 제2 scFv 둘 모두는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv와 nGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M(예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 항-nGPC3 scFv와 nGPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배(예컨대, 적어도 약 10, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107배)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M(예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)이다. 일부 실시 형태에서, 제2 scFv는 림프구, 예컨대 T 세포(예를 들어, CTL, 헬퍼 T 세포, 또는 NKT), B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 호중구, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포의 표면 상의 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, 제2 scFv는 이펙터 T 세포, 예컨대 CTL 또는 NKT 세포에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, 제2 scFv는 이펙터 세포의 표면 상의 제2 항원에 특이적으로 결합하며, 제2 항원에는, 예를 들어 CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD27, CD28, CD16a, CD40L, CD56, CD68, CD137, OX40, GITR, HVEM 및 GDS2D가 포함된다.
일부 실시 형태에서, 탠덤 scFv 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 항체가 제공되며, 상기 탠덤 scFv 다중특이성 항-GPC3 항체는 a) i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 제1 scFv; 및 b) 제2 항원(예컨대, 이펙터 세포 상의 제2 항원, 예를 들어 T 세포 상의 CD3)을 특이적으로 인식하는 제2 scFv를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 탠덤 scFv 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 항체가 제공되며, 상기 탠덤 scFv 다중특이성 항-GPC3 항체는 a) i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 제1 scFv; 및 b) 제2 항원(예컨대, 이펙터 세포 상의 제2 항원, 예를 들어 T 세포 상의 CD3)을 특이적으로 인식하는 제2 scFv를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 탠덤 scFv 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 항체가 제공되며, 상기 탠덤 scFv 다중특이성 항-GPC3 항체는 a) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 제1 scFv; 및 b) 제2 항원(예컨대, 이펙터 세포 상의 제2 항원, 예를 들어 T 세포 상의 CD3)을 특이적으로 인식하는 제2 scFv를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 탠덤 scFv 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 항체가 제공되며, 상기 탠덤 scFv 다중특이성 항-GPC3 항체는 a) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 제1 scFv; 및 b) 제2 항원(예컨대, 이펙터 세포 상의 제2 항원, 예를 들어 T 세포 상의 CD3)을 특이적으로 인식하는 제2 scFv를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 탠덤 scFv 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 항체가 제공되며, 상기 탠덤 scFv 다중특이성 항-GPC3 항체는 a) nGPC3에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 제1 항-nGPC3 scFv; 및 b) 제2 항원(예컨대, 이펙터 세포 상의 제2 항원, 예를 들어 T 세포 상의 CD3)을 특이적으로 인식하는 제2 scFv를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 탠덤 scFv 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 항체가 제공되며, 상기 탠덤 scFv 다중특이성 항-GPC3 항체는 a) 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 nGPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 항-nGPC3 scFv; 및 b) 제2 항원(예컨대, 이펙터 세포 상의 제2 항원, 예를 들어 T 세포 상의 CD3)을 특이적으로 인식하는 제2 scFv를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv와 nGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M(예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 항-nGPC3 scFv와 nGPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배(예컨대, 적어도 약 10, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107배)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M(예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)이다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv와 제2 scFv는 링커(예를 들어, 펩티드 링커)에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 링커는 (GGGGS)n(서열 번호 471)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상이다. 일부 실시 형태에서, 링커는 TSGGGGS(서열 번호 474)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 제2 scFv에 대해 N-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 제2 scFv는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 제1 scFv 및 제2 scFv 둘 모두는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 제2 scFv는 림프구, 예컨대 T 세포(예를 들어, CTL, 헬퍼 T 세포, 또는 NKT), B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 호중구, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포의 표면 상의 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, 제2 scFv는 이펙터 T 세포, 예컨대 CTL 또는 NKT 세포에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, 제2 scFv는 이펙터 세포의 표면 상의 제2 항원에 특이적으로 결합하며, 제2 항원에는, 예를 들어 CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD27, CD28, CD16a, CD40L, CD56, CD68, CD137, OX40, GITR, HVEM 및 GDS2D가 포함된다.
일부 실시 형태에서, 탠덤 scFv 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 항체가 제공되며, 상기 탠덤 scFv 다중특이성 항-GPC3 항체는 a) i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함하는, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)을 특이적으로 인식하는 제1 scFv; 및 b) 제2 항원(예컨대, 이펙터 세포 상의 제2 항원, 예를 들어 T 세포 상의 CD3)을 특이적으로 인식하는 제2 scFv를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 탠덤 scFv 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 항체가 제공되며, 상기 탠덤 scFv 다중특이성 항-GPC3 항체는 a) i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함하는, GPC3을 특이적으로 인식하는 제1 scFv; 및 b) 제2 항원(예컨대, 이펙터 세포 상의 제2 항원, 예를 들어 T 세포 상의 CD3)을 특이적으로 인식하는 제2 scFv를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 탠덤 scFv 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 항체가 제공되며, 상기 탠덤 scFv 다중특이성 항-GPC3 항체는 a) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, GPC3을 특이적으로 인식하는 제1 scFv; 및 b) 제2 항원(예컨대, 이펙터 세포 상의 제2 항원, 예를 들어 T 세포 상의 CD3)을 특이적으로 인식하는 제2 scFv를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 탠덤 scFv 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 항체가 제공되며, 상기 탠덤 scFv 다중특이성 항-GPC3 항체는 a) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함하는, GPC3을 특이적으로 인식하는 제1 scFv; 및 b) 제2 항원(예컨대, 이펙터 세포 상의 제2 항원, 예를 들어 T 세포 상의 CD3)을 특이적으로 인식하는 제2 scFv를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 탠덤 scFv 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 항체가 제공되며, 상기 탠덤 scFv 다중특이성 항-GPC3 항체는 a) GPC3에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 제1 항-GPC3 scFv; 및 b) 제2 항원(예컨대, 이펙터 세포 상의 제2 항원, 예를 들어 T 세포 상의 CD3)을 특이적으로 인식하는 제2 scFv를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 탠덤 scFv 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 항체가 제공되며, 상기 탠덤 scFv 다중특이성 항-GPC3 항체는 a) 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 GPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 항-GPC3 scFv; 및 b) 제2 항원(예컨대, 이펙터 세포 상의 제2 항원, 예를 들어 T 세포 상의 CD3)을 특이적으로 인식하는 제2 scFv를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 제1 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 항체 모이어티는 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고, 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-GPC3 항체 모이어티는 가용성 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 가용성 GPC3에 대한 제1 항-sGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-sGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 461의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-sGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 510 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 467)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3 및 가용성 GPC3 둘 모두를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-GPC3 scFv와 표적 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3) 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M(예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)이다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-GPC3 scFv와 비표적 사이의 결합의 Kd는 항-GPC3 scFv와 표적 GPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배(예컨대, 적어도 약 10, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107배)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 scFv와 비표적 사이의 결합의 Kd는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M(예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)이다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-GPC3 scFv와 제2 scFv는 링커(예를 들어, 펩티드 링커)에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 링커는 (GGGGS)n(서열 번호 471)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상이다. 일부 실시 형태에서, 링커는 TSGGGGS(서열 번호 474)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-GPC3 scFv는 제2 scFv에 대해 N-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-GPC3 scFv는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 제2 scFv는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 제1 scFv 및 제2 scFv 둘 모두는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 제2 scFv는 림프구, 예컨대 T 세포(예를 들어, CTL, 헬퍼 T 세포, 또는 NKT), B 세포, 자연 살해(NK) 세포, 호중구, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포의 표면 상의 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, 제2 scFv는 이펙터 T 세포, 예컨대 CTL 또는 NKT 세포에 특이적으로 결합한다. 일부 실시 형태에서, 제2 scFv는 이펙터 세포의 표면 상의 제2 항원에 특이적으로 결합하며, 제2 항원에는, 예를 들어 CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD27, CD28, CD16a, CD40L, CD56, CD68, CD137, OX40, GITR, HVEM 및 GDS2D가 포함된다.
일부 실시 형태에서, 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체가 제공되며, 상기 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체는 a) GPC3을 특이적으로 인식하는 제1 scFv; 및 b) T 세포의 세포 표면 상의 CD3ε을 특이적으로 인식하는 제2 scFv를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체는 이중특이성 T-세포 인게이저이다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-GPC3 scFv는 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 제1 항-nGPC3 scFv의 결합 친화도는 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고, 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-GPC3 scFv는 가용성 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 가용성 GPC3에 대한 제1 항-sGPC3 scFv의 결합 친화도는 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-GPC3 scFv는 세포 표면-결합된 GPC3 및 가용성 GPC3 둘 모두를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-GPC3 scFv는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 제2 scFv는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 제1 scFv 및 제2 scFv 둘 모두는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-GPC3 scFv와 제2 scFv는 링커(예를 들어, 펩티드 링커)에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 링커는 (GGGGS)n(서열 번호 471)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상이다. 일부 실시 형태에서, 링커는 TSGGGGS(서열 번호 474)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-GPC3 scFv는 제2 항-CD3 scFv에 대해 N-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 항-CD3 scFv는 i) 서열 번호 479의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 480의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 481의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 482의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 483의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 484의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-CD3 scFv는 i) 서열 번호 485의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 486의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-CD3 scFv는 i) 서열 번호 485의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 486의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-CD3 scFv는 서열 번호 487의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체가 제공되며, 상기 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체는 a) 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 제1 scFv(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 제1 항-nGPC3 scFv의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 제1 항-nGPC3 scFv가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함), 및 b) T 세포의 세포 표면 상의 CD3ε을 특이적으로 인식하는 제2 scFv를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 서열 번호 460의 아미노산 서열을 포함하는 인간 GPC3 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 서열 번호 461의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 서열 번호 462의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 서열 번호 463의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 GPC3의 N-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 서열 번호 460의 아미노산 1 내지 358 내의 에피토프(서열 번호 468)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 서열 번호 464의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 465)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 580 내의 에피토프(서열 번호 466)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 헤파린 설페이트 측쇄가 결여된 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 서열 번호 460의 아미노산 510 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 467)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 서열 번호 460의 아미노산 R358/S359에 있는 푸린 절단 부위에 걸쳐 있는 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 전장 성숙 인간 GPC3(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 560 또는 25 내지 580)에는 특이적으로 결합할 수 있지만, 인간 GPC3의 N-말단 단편(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 358) 또는 인간 GPC3의 C-말단 단편(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 560 또는 359 내지 580)에는 결합하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 헤파린 설페이트 측쇄가 결여된 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체가 제공되며, 상기 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체는 a) nGPC3에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 제1 항-nGPC3 scFv(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 제1 항-nGPC3 scFv의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 제1 항-nGPC3 scFv가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함), 및 b) T 세포의 세포 표면 상의 CD3ε을 특이적으로 인식하는 제2 scFv를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체가 제공되며, 상기 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체는 a) 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 nGPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 항-nGPC3 scFv(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 제1 항-nGPC3 scFv의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 제1 항-nGPC3 scFv가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함), 및 b) T 세포의 세포 표면 상의 CD3ε을 특이적으로 인식하는 제2 scFv를 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 HepG2, Hep3B, Huh7, JHH-7, 및 293으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 암 세포(예컨대, 간암 세포, 예를 들어 HCC)의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv와 제2 scFv는 링커(예를 들어, 펩티드 링커)에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 링커는 (GGGGS)n(서열 번호 471)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상이다. 일부 실시 형태에서, 링커는 TSGGGGS(서열 번호 474)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 제2 scFv에 대해 N-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 제2 scFv는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 제1 scFv 및 제2 scFv 둘 모두는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv와 nGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M(예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 항-nGPC3 scFv와 nGPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배(예컨대, 적어도 약 10, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107배)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M(예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-CD3 scFv는 i) 서열 번호 479의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 480의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 481의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 482의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 483의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 484의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-CD3 scFv는 i) 서열 번호 485의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 486의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-CD3 scFv는 i) 서열 번호 485의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 486의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-CD3 scFv는 서열 번호 487의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체는 태그(예를 들어, 정제 목적을 위한 펩티드 태그)를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 태그는 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체에 대해 N-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 태그는 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체에 대해 C-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 태그는 HHHHHH(서열 번호 476)의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체가 제공되며, 상기 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체는 a) i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 제1 scFv; 및 b) T 세포의 세포 표면 상의 CD3ε을 특이적으로 인식하는 제2 scFv를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체가 제공되며, 상기 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체는 a) i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 제1 scFv; 및 b) T 세포의 세포 표면 상의 CD3ε을 특이적으로 인식하는 제2 scFv를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체가 제공되며, 상기 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체는 a) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 제1 scFv; 및 b) T 세포의 세포 표면 상의 CD3ε을 특이적으로 인식하는 제2 scFv를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체가 제공되며, 상기 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체는 a) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 제1 scFv; 및 b) T 세포의 세포 표면 상의 CD3ε을 특이적으로 인식하는 제2 scFv를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체가 제공되며, 상기 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체는 a) nGPC3에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 제1 항-nGPC3 scFv; 및 b) T 세포의 세포 표면 상의 CD3ε을 특이적으로 인식하는 제2 scFv를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체가 제공되며, 상기 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체는 a) 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 nGPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 항-nGPC3 scFv; 및 b) T 세포의 세포 표면 상의 CD3ε을 특이적으로 인식하는 제2 scFv를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv와 nGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M(예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 항-nGPC3 scFv와 nGPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배(예컨대, 적어도 약 10, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107배)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M(예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)이다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv와 제2 scFv는 링커(예를 들어, 펩티드 링커)에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 링커는 (GGGGS)n(서열 번호 471)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상이다. 일부 실시 형태에서, 링커는 TSGGGGS(서열 번호 474)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 제2 scFv에 대해 N-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 scFv는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 제2 scFv는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 제1 scFv 및 제2 scFv 둘 모두는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 scFv는 서열 번호 409 내지 439 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-CD3 scFv는 i) 서열 번호 479의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 480의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 481의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 482의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 483의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 484의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-CD3 scFv는 i) 서열 번호 485의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 486의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-CD3 scFv는 i) 서열 번호 485의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 486의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-CD3 scFv는 서열 번호 487의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체가 제공되며, 상기 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체는 a) 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 제1 scFv; 및 b) T 세포의 세포 표면 상의 CD3ε을 특이적으로 인식하는 제2 scFv를 포함하며, 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체는 서열 번호 488 및 511 내지 515 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체는 태그(예를 들어, 정제 목적을 위한 펩티드 태그)를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 태그는 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체에 대해 N-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 태그는 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체에 대해 C-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 태그는 HHHHHH(서열 번호 476)의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체가 제공되며, 상기 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체는 a) i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함하는, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)을 특이적으로 인식하는 제1 scFv; 및 b) T 세포의 세포 표면 상의 CD3ε을 특이적으로 인식하는 제2 scFv를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체가 제공되며, 상기 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체는 a) i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하며, 아미노산 치환이 HC-CDR1 또는 HC-CDR2 내에 존재하는, VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함하는, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)을 특이적으로 인식하는 제1 scFv; 및 b) T 세포의 세포 표면 상의 CD3ε을 특이적으로 인식하는 제2 scFv를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체가 제공되며, 상기 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체는 a) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)을 특이적으로 인식하는 제1 scFv; 및 b) T 세포의 세포 표면 상의 CD3ε을 특이적으로 인식하는 제2 scFv를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체가 제공되며, 상기 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체는 a) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함하는, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)을 특이적으로 인식하는 제1 scFv; 및 b) T 세포의 세포 표면 상의 CD3ε을 특이적으로 인식하는 제2 scFv를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체가 제공되며, 상기 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체는 a) 표적 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 제1 항-GPC3 scFv; 및 b) T 세포의 세포 표면 상의 CD3ε을 특이적으로 인식하는 제2 scFv를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체가 제공되며, 상기 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체는 a) 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 GPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 항-GPC3 scFv; 및 b) T 세포의 세포 표면 상의 CD3ε을 특이적으로 인식하는 제2 scFv를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 제1 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-nGPC3 항체 모이어티는 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고, 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-GPC3 항체 모이어티는 가용성 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 가용성 GPC3에 대한 제1 항-sGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-sGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 461의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-sGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 510 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 467)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3 및 가용성 GPC3 둘 모두를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 scFv와 표적 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3) 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M(예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 scFv와 비표적 사이의 결합의 Kd는 항-GPC3 scFv와 표적 GPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배(예컨대, 적어도 약 10, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107배)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티와 비표적 사이의 결합의 Kd는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M(예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)이다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-GPC3 scFv와 제2 항-CD3 scFv는 링커(예를 들어, 펩티드 링커)에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 링커는 (GGGGS)n(서열 번호 471)의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상이다. 일부 실시 형태에서, 링커는 TSGGGGS(서열 번호 474)의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-GPC3 scFv는 제2 scFv에 대해 N-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 제1 항-GPC3 scFv는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 제2 scFv는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 제1 scFv 및 제2 scFv 둘 모두는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 scFv는 서열 번호 440 내지 459 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-CD3 scFv는 i) 서열 번호 479의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 480의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 481의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 482의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 483의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 484의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-CD3 scFv는 i) 서열 번호 485의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 486의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-CD3 scFv는 i) 서열 번호 485의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 486의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-CD3 scFv는 서열 번호 487의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체가 제공되며, 상기 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체는 a) GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)을 특이적으로 인식하는 제1 scFv; 및 b) T 세포의 세포 표면 상의 CD3ε을 특이적으로 인식하는 제2 scFv를 포함하며, 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체는 서열 번호 489에 의해 예시되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체는 태그(예를 들어, 정제 목적을 위한 펩티드 태그)를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 태그는 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체에 대해 N-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 태그는 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체에 대해 C-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 태그는 HHHHHH(서열 번호 476)의 아미노산 서열을 포함한다.
유도성 발현
일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)의 발현은 유도성이다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, CAR T 세포, caTCR T 세포)는 본 명세서에 기재된 임의의 유도성 프로모터(예를 들어, "핵산" 섹션 참조)를 포함한 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 이중특이성 T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, CAR T 세포, caTCR T 세포)에서의 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)의 발현은 이펙터 세포(예를 들어, TCR, CAR, caTCR) 상에서 신호전달 수용체를 통한 신호전달 시에 유도가능하다. 일부 그러한 실시 형태에서, CAR T 세포는 CAR을 통한 신호전달에 반응성인 프로모터 또는 조절성 요소에 작동가능하게 연결된 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 그러한 실시 형태에서, caTCR T 세포는 caTCR을 통한 신호전달에 반응성인 프로모터 또는 조절성 요소에 작동가능하게 연결된 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산 서열은 활성화된 T-세포의 핵-인자(NFAT)-유래 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시 형태에서, NFAT-유래 프로모터는 NFAT-유래 최소 프로모터이다(예를 들어, 문헌[Durand, D. et. al., Molec. Cell. Biol. 8, 1715-1724 (1988)]; 문헌[Clipstone, NA, Crabtree, GR. Nature. 1992 357(6380): 695-7]; 문헌[Chmielewski, M., et al. Cancer research 71.17 (2011): 5697-5706]; 및 문헌[Zhang, L., et al. Molecular therapy 19.4 (2011): 751-759] 참조). 전사 인자의 NFAT 패밀리는 T 세포 활성화의 중요한 조절인자이다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산 서열은 IL-2 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시 형태에서, 이량체 caTCR을 표면 상에 발현하고, 본 명세서에 기재된 다중특이성 항-GPC3 분자들 중 어느 하나에 따른 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 이중특이성 항체)를 발현하거나 발현할 수 있는 조작된 면역 세포(예컨대, T 세포)가 제공되며, 상기 조작된 면역 세포는 a) caTCR의 제1 caTCR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제1 caTCR 핵산 서열; b) caTCR의 제2 caTCR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제2 caTCR 핵산 서열; 및 c) 다중특이성 항-GPC3 분자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하며, caTCR은 면역 세포의 표면에 국소화되고, 다중특이성 항-GPC3 분자는 면역 세포로부터 분비될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 제1 caTCR 핵산 서열은 제1 벡터(예컨대, 바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터) 내에 함유되고, 제2 caTCR 핵산 서열은 제2 벡터(예컨대, 바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터) 내에 함유되고, 다중특이성 항-GPC3 분자를 인코딩하는 핵산 서열은 제3 벡터(예컨대, 바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터) 내에 함유된다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 caTCR 핵산 서열 및 다중특이성 항-GPC3 분자를 인코딩하는 핵산 서열 중 일부 또는 전부는 동일한 벡터(예컨대, 바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터) 내에 함유된다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 caTCR 핵산 서열 및 다중특이성 항-GPC3 분자를 인코딩하는 핵산 서열 각각은 개별적으로 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다. 일부 실시 형태에서, 핵산 서열들 중 일부 또는 전부는 단일 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 실시 형태에서, 프로모터들 중 일부 또는 전부는 동일한 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 프로모터들 중 일부 또는 전부는 상이한 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 프로모터들 중 일부 또는 전부는 유도성이다. 일부 실시 형태에서, caTCR을 인코딩하는 핵산 서열은 하나 이상의 구성적 프로모터, 예컨대 EF1-알파 프로모터(예를 들어, 서열 번호 527의 핵산 서열을 포함하는 EF1-알파 프로모터)의 제어 하에 있다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 항-GPC3 분자를 인코딩하는 핵산 서열은 유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 면역 세포의 활성화 시에 유도가능하다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 NFAT-유래 프로모터, 예를 들어 서열 번호 524 또는 526의 핵산 서열을 포함하는 NFAT-유래 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 벡터들 중 일부 또는 전부는 바이러스 벡터(예컨대, 렌티바이러스 벡터)이다. 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 caTCR의 TCR-TM의 유래가 되는 TCR 하위단위를 발현하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 αβ T 세포이고, 도입된 caTCR의 TCR-TM은 TCR δ 및 γ 사슬로부터 유래된 서열을 포함하거나, 또는 면역 세포는 γδ T 세포이고, 도입된 caTCR의 TCR-TM은 TCR α 및 β 사슬로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 그의 내인성 TCR 하위단위들 중 하나 또는 둘 모두의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 TCR α 및/또는 β 사슬의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된 αβ T 세포이거나, 또는 면역 세포는 TCR γ 및/또는 δ 사슬의 발현을 차단하거나 감소시키도록 변형된 γδ T 세포이다. 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 자연 살해 T 세포, 및 억제인자 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 벡터들 중 일부 또는 전부는 면역 세포의 숙주 게놈에 통합된 바이러스 벡터(예컨대, 렌티바이러스 벡터)이다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 AFP/MHC 클래스 I 복합체(예를 들어, AFP158/HLA-A*02:01)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 서열 번호 522의 아미노산 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 서열 번호 523의 아미노산 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 항-GPC3 분자는 서열 번호 511의 아미노산 서열을 포함한다.
키메라 항원 수용체(CAR) 및 CAR 이펙터 세포
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 CAR(본 명세서에서 "항-GPC3 CAR"로도 지칭됨)이다. 본 명세서에 기재된 항-GPC3 항체 모이어티들 중 어느 하나가 항-GPC3 CAR에 사용될 수 있다. 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 CAR을 포함하는 CAR 이펙터 세포(예를 들어, T 세포)(본 명세서에서 "항-GPC3 CAR 이펙터 세포", 예를 들어 "항-GPC3 CAR T 세포"로도 지칭됨)가 또한 제공된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR은 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고, 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR은 가용성 GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함한다.
항-GPC3 CAR은 a) GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, 및 b) 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 막관통 도메인이 세포외 도메인과 세포내 도메인 사이에 존재할 수 있다.
항-GPC3 CAR의 세포외 도메인과 막관통 도메인 사이에, 또는 항-GPC3 CAR의 세포내 도메인과 막관통 도메인 사이에 스페이서 도메인이 존재할 수 있다. 스페이서 도메인은 폴리펩티드 사슬 내의 막관통 도메인을 세포외 도메인 또는 세포내 도메인에 연결하는 기능을 하는 임의의 올리고펩티드 또는 폴리펩티드일 수 있다. 스페이서 도메인은 최대 약 300개의 아미노산을 포함할 수 있으며, 이에는, 예를 들어 약 10 내지 약 100개, 또는 약 25 내지 약 50개의 아미노산이 포함된다.
막관통 도메인은 천연 공급원으로부터 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 천연인 경우, 도메인은 임의의 막-결합 단백질 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 본 발명에서의 특정 용도의 막관통 영역은 T-세포 수용체의 α, β, δ, 또는 γ 사슬, CD28, CD3ε, CD3ζ, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, 또는 CD154로부터 유래될(즉, 적어도 이들의 막관통 영역(들)을 포함할) 수 있다. 일부 실시 형태에서, 막관통 도메인은 합성일 수 있으며, 이 경우에 그것은 주로 소수성 잔기, 예컨대 류신 및 발린을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중체가 합성 막관통 도메인의 각각의 말단에서 발견될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 길이가, 예를 들어 약 2 내지 약 10개(예컨대, 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 중 어느 하나)의 아미노산 길이인 짧은 올리고펩티드 또는 폴리펩티드 링커는 항-GPC3 CAR의 막관통 도메인과 세포내 신호전달 도메인 사이에 결합을 형성할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 링커는 글리신-세린 이중체이다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR의 세포내 도메인 내의 서열들 중 하나와 천연적으로 회합된 막관통 도메인이 사용된다(예를 들어, 항-GPC3 CAR 세포내 도메인이 CD28 공동자극성 서열을 포함하는 경우, 항-GPC3 CAR의 막관통 도메인은 CD28 막관통 도메인으로부터 유래된다). 일부 실시 형태에서, 막관통 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원들과의 상호작용을 최소화하기 위하여 동일한 또는 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 대한 그러한 도메인의 결합을 피하도록 아미노산 치환에 의해 변형되거나 선택될 수 있다.
항-GPC3 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 항-GPC3 CAR이 넣어진 면역 세포의 정상 이펙터 기능들 중 적어도 하나의 활성화를 담당한다. T 세포의 이펙터 기능은, 예를 들어 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있으며, 이에는 사이토카인의 분비가 포함된다. 따라서, 용어 "세포내 신호전달 도메인"은, 이펙터 기능 신호를 전달하고 세포가 특수화된 기능을 수행하도록 유도하는 단백질의 일부분을 지칭한다. 통상 전체 세포내 신호전달 도메인이 사용될 수 있지만, 많은 경우에 전체 사슬을 사용하는 것이 반드시 필요한 것은 아니다. 세포내 신호전달 도메인의 절단된 부분이 사용되는 한에 있어서, 그러한 절단된 부분은 그것이 이펙터 기능 신호를 전달하기만 한다면 온전한 사슬 대신에 사용될 수 있다. 따라서, 용어 "세포내 신호전달 서열"은 이펙터 기능 신호를 전달하기에 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 절단된 부분을 포함하는 것으로 의미된다.
본 발명의 항-GPC3 CAR에 사용하기 위한 세포내 신호전달 도메인의 예에는 항원 수용체 결합 후에 신호 전달을 개시하도록 협력 작용할 수 있는 TCR 및 공동수용체의 세포질 서열뿐만 아니라, 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체, 및 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 합성 서열을 포함한다.
단독으로의 TCR을 통해 발생된 신호가 T 세포의 완전한 활성화에 불충분하며, 그러한 2차 또는 공동자극성 신호가 또한 요구되는 것으로 알려져 있다. 따라서, T 세포 활성화는 다음 2개의 별개의 부류의 세포내 신호전달 서열에 의해 매개되는 것이라 할 수 있다: TCR을 통한 항원-의존성 1차 활성화를 개시하는 것들(1차 신호전달 서열) 및 2차 또는 공동자극성 신호를 제공하도록 항원-비의존성 방식으로 작용하는 것들(공동자극성 신호전달 서열)이다.
1차 신호전달 서열은 자극성 방식으로 또는 억제성 방식으로 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절한다. 자극성 방식으로 작용하는 1차 신호전달 서열은 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려진 신호전달 모티프를 함유할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR 작제물은 하나 이상의 ITAM을 포함한다.
본 발명에서 특정 용도를 갖는 ITAM 함유 1차 신호전달 서열의 예에는 TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터 유래된 것들이 포함된다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR은 CD3ζ로부터 유래된 1차 신호전달 서열을 포함한다. 예를 들어, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ 세포내 신호전달 서열을 단독으로 포함하거나 본 발명의 항-GPC3 CAR과 관련하여 유용한 임의의 다른 원하는 세포내 신호전달 서열(들)과 조합하여 포함할 수 있다. 예를 들어, 항-GPC3 CAR의 세포내 도메인은 CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 공동자극성 신호전달 서열을 포함할 수 있다. 공동자극성 신호전달 서열은 공동자극성 분자의 세포내 도메인의 일부분일 수 있으며, 공동자극성 분자에는, 예를 들어 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등이 포함된다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ의 세포내 신호전달 서열 및 CD28의 세포내 신호전달 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ의 세포내 신호전달 서열 및 4-1BB의 세포내 신호전달 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ의 세포내 신호전달 서열 및 CD28 및 4-1BB의 세포내 신호전달 서열을 포함한다.
따라서, 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR이 제공되며, 상기 항-GPC3 CAR은 a) 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 항-nGPC3 항체 모이어티가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함)를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 서열을 포함하는 인간 GPC3 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 461의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 462의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 463의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 GPC3의 N-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 1 내지 358 내의 에피토프(서열 번호 468)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 464의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 465)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 580 내의 에피토프(서열 번호 466)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 헤파린 설페이트 측쇄가 결여된 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 510 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 467)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 R358/S359에 있는 푸린 절단 부위에 걸쳐 있는 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 전장 성숙 인간 GPC3(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 560 또는 25 내지 580)에는 특이적으로 결합할 수 있지만, 인간 GPC3의 N-말단 단편(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 358) 또는 인간 GPC3의 C-말단 단편(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 560 또는 359 내지 580)에는 결합하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 헤파린 설페이트 측쇄가 결여된 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR이 제공되며, 상기 항-GPC3 CAR은 a) nGPC3에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 항-nGPC3 항체 모이어티(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 항-nGPC3 항체 모이어티가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함)를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR이 제공되며, 상기 항-GPC3 CAR은 a) 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 nGPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-nGPC3 항체 모이어티(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 항-nGPC3 항체 모이어티가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함)를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 HepG2, Hep3B, Huh7, JHH-7, 및 293으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 암 세포(예컨대, 간암 세포, 예를 들어 HCC)의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 면역 세포를 활성화시킬 수 있다. 일부 실시 형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 1차 신호전달 서열 및 공동자극성 신호전달 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 1차 신호전달 서열은 CD3ζ 세포내 신호전달 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 공동자극성 신호전달 서열은 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 세포내 도메인은 CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR은 서열 번호 494의 N-말단에 융합된 본 명세서에 기재된 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 항-nGPC3 항체 모이어티가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함)를 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 Fab 또는 Fab'이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 키메라, 인간, 인간화, 또는 반합성 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 nGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M(예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 항-nGPC3 항체 모이어티와 nGPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배(예컨대, 적어도 약 10, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107배)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M(예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)이다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR이 제공되며, 상기 항-GPC3 CAR은 a) i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR이 제공되며, 상기 항-GPC3 CAR은 a) i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR이 제공되며, 상기 항-GPC3 CAR은 a) i) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR이 제공되며, 상기 항-GPC3 CAR은 a) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR이 제공되며, 상기 항-GPC3 CAR은 a) nGPC3에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 항-nGPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR이 제공되며, 상기 항-GPC3 CAR은 a) 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 nGPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-nGPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR은 서열 번호 494의 N-말단에 융합된 본 명세서에 기재된 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR은 서열 번호 491의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 nGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M(예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 항-nGPC3 항체 모이어티와 nGPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배(예컨대, 적어도 약 10, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107배)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M(예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)이다. 일부 실시 형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 면역 세포를 활성화시킬 수 있다. 일부 실시 형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 1차 신호전달 서열 및 공동자극성 신호전달 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 1차 신호전달 서열은 CD3ζ 세포내 신호전달 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 공동자극성 신호전달 서열은 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 세포내 도메인은 CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 Fab 또는 Fab'이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 키메라, 인간, 인간화, 또는 반합성 항체 모이어티이다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR이 제공되며, 상기 항-GPC3 CAR은 a) GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고, 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 가용성 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 가용성 GPC3에 대한 항-sGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-sGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 461의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-sGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 510 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 467)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3 및 가용성 GPC3 둘 모두를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 HepG2, Hep3B, Huh7, JHH-7, 및 293으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 암 세포(예컨대, 간암 세포, 예를 들어 HCC)의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 면역 세포를 활성화시킬 수 있다. 일부 실시 형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 1차 신호전달 서열 및 공동자극성 신호전달 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 1차 신호전달 서열은 CD3ζ 세포내 신호전달 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 공동자극성 신호전달 서열은 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 세포내 도메인은 CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 Fab 또는 Fab'이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 키메라, 인간, 인간화, 또는 반합성 항체 모이어티이다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR이 제공되며, 상기 항-GPC3 CAR은 a) i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함하는, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR이 제공되며, 상기 항-GPC3 CAR은 a) i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR이 제공되며, 상기 항-GPC3 CAR은 a) i) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR이 제공되며, 상기 항-GPC3 CAR은 a) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR이 제공되며, 상기 항-GPC3 CAR은 a) 표적 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR이 제공되며, 상기 항-GPC3 CAR은 a) 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 GPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고, 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 가용성 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 가용성 GPC3에 대한 항-sGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-sGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 461의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-sGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 510 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 467)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3 및 가용성 GPC3 둘 모두를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 면역 세포를 활성화시킬 수 있다. 일부 실시 형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 1차 신호전달 서열 및 공동자극성 신호전달 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 1차 신호전달 서열은 CD3ζ 세포내 신호전달 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 공동자극성 신호전달 서열은 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 세포내 도메인은 CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 Fab 또는 Fab'이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 키메라, 인간, 인간화, 또는 반합성 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR은 서열 번호 494의 N-말단에 융합된 본 명세서에 기재된 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티와 표적 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3) 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M(예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티와 비표적 사이의 결합의 Kd는 항-GPC3 항체 모이어티와 표적 GPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배(예컨대, 적어도 약 10, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107배)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티와 비표적 사이의 결합의 Kd는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M(예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)이다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR이 제공되며, 상기 항-GPC3 CAR은 a) 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 항-nGPC3 항체 모이어티가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함)를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 서열을 포함하는 인간 GPC3 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 461의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 462의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 463의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 GPC3의 N-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 1 내지 358 내의 에피토프(서열 번호 468)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 464의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 465)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 580 내의 에피토프(서열 번호 466)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 헤파린 설페이트 측쇄가 결여된 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 510 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 467)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 R358/S359에 있는 푸린 절단 부위에 걸쳐 있는 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 전장 성숙 인간 GPC3(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 560 또는 25 내지 580)에는 특이적으로 결합할 수 있지만, 인간 GPC3의 N-말단 단편(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 358) 또는 인간 GPC3의 C-말단 단편(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 560 또는 359 내지 580)에는 결합하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 헤파린 설페이트 측쇄가 결여된 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR이 제공되며, 상기 항-GPC3 CAR은 a) nGPC3에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 항-nGPC3 항체 모이어티(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 항-nGPC3 항체 모이어티가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함)를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR이 제공되며, 상기 항-GPC3 CAR은 a) 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 nGPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-nGPC3 항체 모이어티(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 항-nGPC3 항체 모이어티가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함)를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR은 서열 번호 494의 N-말단에 융합된 본 명세서에 기재된 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 HepG2, Hep3B, Huh7, JHH-7, 및 293으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 암 세포(예컨대, 간암 세포, 예를 들어 HCC)의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 nGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M(예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 항-nGPC3 항체 모이어티와 nGPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배(예컨대, 적어도 약 10, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107배)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M(예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 Fab 또는 Fab'이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 scFv이다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR이 제공되며, 상기 항-GPC3 CAR은 a) i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR이 제공되며, 상기 항-GPC3 CAR은 a) i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR이 제공되며, 상기 항-GPC3 CAR은 a) i) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR이 제공되며, 상기 항-GPC3 CAR은 a) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR이 제공되며, 상기 항-GPC3 CAR은 a) nGPC3에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 항-nGPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR이 제공되며, 상기 항-GPC3 CAR은 a) 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 nGPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-nGPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR은 서열 번호 494의 N-말단에 융합된 본 명세서에 기재된 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR은 서열 번호 491의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 nGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M(예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 항-nGPC3 항체 모이어티와 nGPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배(예컨대, 적어도 약 10, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107배)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M(예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 Fab 또는 Fab'이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 키메라, 인간, 인간화, 또는 반합성 항체 모이어티이다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR이 제공되며, 상기 항-GPC3 CAR은 a) i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함하는, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR이 제공되며, 상기 항-GPC3 CAR은 a) i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함하는, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR이 제공되며, 상기 항-GPC3 CAR은 a) i) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR이 제공되며, 상기 항-GPC3 CAR은 a) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함하는, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR이 제공되며, 상기 항-GPC3 CAR은 a) 표적 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR이 제공되며, 상기 항-GPC3 CAR은 a) 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 GPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고, 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 가용성 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 가용성 GPC3에 대한 항-sGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-sGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 461의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-sGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 510 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 467)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3 및 가용성 GPC3 둘 모두를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 Fab 또는 Fab'이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 키메라, 인간, 인간화, 또는 반합성 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR은 서열 번호 494의 N-말단에 융합된 본 명세서에 기재된 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티와 표적 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3) 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M(예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티와 비표적 사이의 결합의 Kd는 항-GPC3 항체 모이어티와 표적 GPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배(예컨대, 적어도 약 10, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107배)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티와 비표적 사이의 결합의 Kd는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M(예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)이다.
항-GPC3 CAR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, 림프구, 예를 들어 T 세포)가 또한 본 명세서에 제공된다.
항-GPC3 CAR을 발현하는 이펙터 세포를 생성하는 방법이 또한 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 이펙터 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 벡터를 이펙터 세포 내로 도입하는 단계는 벡터에 의해 이펙터 세포를 형질도입시키는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 벡터를 이펙터 세포 내로 도입하는 단계는 벡터에 의해 이펙터 세포를 형질감염시키는 단계를 포함한다. 이펙터 세포 내로의 벡터의 형질도입 또는 형질감염은 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR 이펙터 세포(예컨대, 림프구, 예를 들어 T 세포)가 제공되며, 상기 항-GPC3 CAR 이펙터 세포는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 본 명세서에 기재된 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 이중특이성 T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR 이펙터 세포에서의 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)의 발현은 항-GPC3 CAR을 통한 신호전달 시에 유도가능하다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산 서열은 NFAT-유래 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시 형태에서, NFAT-유래 프로모터는 NFAT-유래 최소 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산 서열은 IL-2 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
키메라 항체-T 세포 수용체(TCR) 작제물(caTCR) 및 caTCR 이펙터 세포
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 키메라 항체-T 세포 수용체 작제물(caTCR)(본 명세서에서 "항-GPC3 caTCR"로도 지칭됨)이다. 예시적인 caTCR이 국제 특허 출원 공개 PCT/US2016/058305호에 제공되어 있으며, 이는 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 명세서에 기재된 (예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3을 표적화하는) 임의의 항-GPC3 항체 모이어티가 항-GPC3 caTCR에 사용될 수 있다. 항-GPC3 caTCR은 GPC3에 특이적으로 결합할 수 있고, 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(예컨대, CD3δε, CD3γε, 및/또는 ζζ)를 동원할 수 있다. 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 caTCR을 포함하는 caTCR 이펙터 세포(예를 들어, T 세포)(본 명세서에서 "항-GPC3 caTCR 이펙터 세포", 예를 들어 "항-GPC3 caTCR T 세포"로도 지칭됨)가 또한 제공된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR은 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR은 가용성 GPC3을 특이적으로 인식하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR이 제공되며, 상기 항-GPC3 caTCR은 a) 본 명세서에 기재된 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티를 포함하는 항원-결합 모듈, 및 b) 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(예컨대, CD3δε, CD3γε, 및/또는 ζζ)의 동원을 촉진시키며, 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR은 천연 발생 TCR 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR은 적어도 하나의 천연 비발생 TCR 도메인을 포함한다. 항-GPC3 caTCR은 항원 특이성을 제공하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항원-결합 모듈 및 CD3 동원 및 신호전달을 가능하게 하는 TCRM을 포함한다. 항원-결합 모듈은 천연 발생 T 세포 수용체 항원-결합 모이어티가 아니다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 TCRM 내의 폴리펩티드 사슬의 N-말단에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 Fab 또는 Fab'이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 scFv이다. TCRM은 하나 이상의 TCR, 예컨대 αβ 및/또는 γδ TCR의 막관통 도메인(TCR-TM)으로부터 유래된 막관통 모듈을 포함하며, 선택적으로 TCR의 연결 펩티드 또는 이의 단편 및/또는 하나 이상의 TCR 세포내 도메인 또는 이의 단편 중 하나 또는 둘 모두를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 각각의 폴리펩티드 사슬은, N-말단에서 C-말단으로, 연결 펩티드, 막관통 도메인, 및 선택적으로 TCR 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 하나 이상의 천연 비발생 TCR 도메인을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, TCRM은 1개 또는 2개의 천연 비발생 TCR 막관통 도메인을 포함한다. 천연 비발생 TCR 도메인은 하나 이상의 아미노산의 치환에 의해 그리고/또는 상응하는 도메인의 일부분을 다른 TCR로부터의 유사한 도메인의 일부분으로 대체함으로써 변형된 천연 발생 TCR의 상응하는 도메인일 수 있다. 항-GPC3 caTCR은 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있으며, 제1 폴리펩티드 사슬과 제2 폴리펩티드 사슬은 함께 항원-결합 모듈 및 TCRM을 형성한다. 일부 실시 형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬과 제2 폴리펩티드 사슬은 별개의 폴리펩티드 사슬이고, caTCR은 다량체, 예컨대 이량체이다. 일부 실시 형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬과 제2 폴리펩티드 사슬은, 예를 들어 펩티드 결합에 의해, 또는 다른 화학적 결합, 예컨대 이황화물 결합에 의해 공유적으로 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬과 제2 폴리펩티드 사슬은 적어도 하나의 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR은 하나 이상의 T 세포 공동자극성 신호전달 서열을 추가로 포함한다. 하나 이상의 공동자극성 신호전달 서열은, 개별적으로, 공동자극성 분자의 세포내 도메인의 전부 또는 일부분일 수 있으며, 공동자극성 분자에는, 예를 들어 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등이 포함된다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 공동자극성 신호전달 서열은 제1 TCR-TM과 제1 TCR 세포내 도메인 사이에 그리고/또는 제2 TCR-TM과 제2 TCR 세포내 도메인 사이에 있다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 공동자극성 신호전달 서열은 제1 TCRD 및/또는 제2 TCRD에 대해 C-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR에는 T 세포 공동자극성 신호전달 서열이 결여되어 있다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 항-GPC3 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 안정화 모듈은 항원-결합 모듈과 TCRM 사이에 위치된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR은 임의의 2개의 caTCR 모듈들 또는 도메인들 사이에 스페이서 모듈을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 스페이서 모듈은 2개의 caTCR 모듈 또는 도메인을 연결하는 하나 이상의 펩티드 링커를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고, 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 가용성 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 가용성 GPC3에 대한 항-sGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-sGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 461의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-sGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 510 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 467)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3 및 가용성 GPC3 둘 모두를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR이 제공되며, 상기 항-GPC3 caTCR은 a) VH 및 CH1 항체 도메인을 포함하는 제1 항원-결합 도메인 및 제1 TCR 하위단위의 제1 막관통 도메인을 포함하는 제1 T 세포 수용체 도메인(TCRD)을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및 b) VL 및 CL 항체 도메인을 포함하는 제2 항원-결합 도메인 및 제2 TCR 하위단위의 제2 막관통 도메인을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 제1 항원-결합 도메인의 VH 및 CH1 도메인과 제2 항원-결합 도메인의 VL 및 CL 도메인은 GPC3에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈을 형성하고, 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 모듈을 동원할 수 있는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 형성한다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 CH1 도메인 내의 잔기와 CL 도메인 내의 잔기 사이에 이황화물 결합을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR이 제공되며, 상기 항-GPC3 caTCR은 a) VH 항체 도메인을 포함하는 제1 항원-결합 도메인 및 제1 TCR 하위단위의 제1 막관통 도메인을 포함하는 제1 TCRD를 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및 b) VL 항체 도메인을 포함하는 제2 항원-결합 도메인 및 제2 TCR 하위단위의 제2 막관통 도메인을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 제1 항원-결합 도메인의 VH 도메인과 제2 항원-결합 도메인의 VL 도메인은 GPC3에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈을 형성하고, 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 모듈을 동원할 수 있는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 형성한다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM은 서열 번호 495의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM은 서열 번호 496의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 TCRM은 a) 제1 T 세포 수용체 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 b) 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 동원을 촉진시킨다. 일부 실시 형태에서, 둘 모두의 TCR-TM은 천연 발생적이다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM들 중 적어도 하나는 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, 둘 모두의 TCR-TM은 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM은 T 세포 수용체(예컨대, αβ TCR 또는 γδ TCR)의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래되고, 제2 TCR-TM은 T 세포 수용체의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 T 세포 수용체의 막관통 도메인을 포함하는 TCRM과 대비하여 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 향상된 동원을 가능하게 한다. TCR-회합 신호전달 분자의 동원은 당업계에 알려진 방법에 의해 결정될 수 있으며, 이러한 방법에는, 예를 들어 TCR-CD3 복합체 표면 발현에 대한 FACS 분석 또는 caTCR과의 CD3 하위단위의 공동-면역침전이 있다.
일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 VH 항체 도메인(예컨대, 항-GPC3 항체 모이어티에 대해 본 명세서에 기재된 임의의 VH 항체 도메인)을 포함하는 제1 항원-결합 도메인 및 VL 항체 도메인(예컨대, 항-GPC3 항체 모이어티에 대해 본 명세서에 기재된 임의의 VL 항체 도메인)을 포함하는 제2 항원-결합 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, VH 항체 도메인 및 VL 항체 도메인 CDR은 동일한 항체 모이어티로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, VH 항체 도메인 및 VL 항체 도메인 CDR 중 일부는 상이한 항체 모이어티로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, VH 항체 도메인 및/또는 VL 항체 도메인은 인간, 인간화, 키메라, 반합성, 또는 완전 합성 항체 도메인이다.
일부 실시 형태에서, caTCR은, 선택적으로 안정화 모듈을 포함하는, 본 명세서에 기재된 TCRM에 연결된 본 명세서에 기재된 항원-결합 모듈을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, caTCR은 TCRD들 중 하나 또는 둘 모두의 N-말단에 연결된 항원-결합 모듈을 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 TCRM과 항원-결합 모듈 사이에 안정화 모듈을 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 임의의 2개의 caTCR 모듈들 또는 도메인들 사이에 스페이서 모듈을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 스페이서 모듈은 약 5 내지 약 70개(예컨대, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 또는 70개(이들 값 사이의 임의의 범위를 포함함) 중 어느 하나)의 아미노산 길이의 하나 이상의 펩티드 링커를 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 하나 이상의 보조 세포내 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 보조 세포내 도메인은 제1 및/또는 제2 TCRD에 대해 카르복시-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 보조 세포내 도메인은 제1 TCR-TM과 제1 TCR 세포내 도메인 사이에 그리고/또는 제2 TCR-TM과 제2 TCR 세포내 도메인 사이에 있다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 보조 세포내 도메인은 개별적으로 TCR 공동자극성 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCR 공동자극성 도메인은 면역 공동자극성 분자(예컨대, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등)의 세포내 도메인의 전부 또는 일부분을 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCR 공동자극성 도메인은 서열 번호 51 내지 56 중 어느 하나의 아미노산 서열 또는 이의 변이체의 전부 또는 일부분을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR이 제공되며, 상기 항-GPC3 caTCR은 a) 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 항-nGPC3 항체 모이어티가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함)를 포함하는 항원-결합 모듈, 및 b) 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(예컨대, CD3δε, CD3γε, 및/또는 ζζ)의 동원을 촉진시키며, 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR이 제공되며, 상기 항-GPC3 caTCR은 a) VH 및 CH1 항체 도메인을 포함하는 제1 항원-결합 도메인 및 제1 TCR 하위단위의 제1 막관통 도메인을 포함하는 제1 T 세포 수용체 도메인(TCRD)을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및 b) VL 및 CL 항체 도메인을 포함하는 제2 항원-결합 도메인 및 제2 TCR 하위단위의 제2 막관통 도메인을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 제1 항원-결합 도메인의 VH 및 CH1 도메인과 제2 항원-결합 도메인의 VL 및 CL 도메인은 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈을 형성하고(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 VH 및 VL의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 VH 및 VL이 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함), 및 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 모듈을 동원할 수 있는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 형성한다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 CH1 도메인 내의 잔기와 CL 도메인 내의 잔기 사이에 이황화물 결합을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR이 제공되며, 상기 항-GPC3 caTCR은 a) VH 항체 도메인을 포함하는 제1 항원-결합 도메인 및 제1 TCR 하위단위의 제1 막관통 도메인을 포함하는 제1 TCRD를 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및 b) VL 항체 도메인을 포함하는 제2 항원-결합 도메인 및 제2 TCR 하위단위의 제2 막관통 도메인을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 제1 항원-결합 도메인의 VH 도메인과 제2 항원-결합 도메인의 VL 도메인은 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈을 형성하고(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 VH 및 VL의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 VH 및 VL이 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함), 및 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 모듈을 동원할 수 있는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 형성한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 서열을 포함하는 인간 GPC3 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 461의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 462의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 463의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 GPC3의 N-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 1 내지 358 내의 에피토프(서열 번호 468)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 464의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 465)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 580 내의 에피토프(서열 번호 466)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 헤파린 설페이트 측쇄가 결여된 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 510 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 467)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 R358/S359에 있는 푸린 절단 부위에 걸쳐 있는 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 전장 성숙 인간 GPC3(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 560 또는 25 내지 580)에는 특이적으로 결합할 수 있지만, 인간 GPC3의 N-말단 단편(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 358) 또는 인간 GPC3의 C-말단 단편(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 560 또는 359 내지 580)에는 결합하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 헤파린 설페이트 측쇄가 결여된 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR이 제공되며, 상기 항-GPC3 caTCR은 a) nGPC3에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 항-nGPC3 항체 모이어티(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 항-nGPC3 항체 모이어티가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함)를 포함하는 항원-결합 모듈, 및 b) 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(예컨대, CD3δε, CD3γε, 및/또는 ζζ)의 동원을 촉진시키며, 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR이 제공되며, 상기 항-GPC3 caTCR은 a) 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 nGPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-nGPC3 항체 모이어티(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 항-nGPC3 항체 모이어티가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함)를 포함하는 항원-결합 모듈, 및 b) 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(예컨대, CD3δε, CD3γε, 및/또는 ζζ)의 동원을 촉진시키며, 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결된다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 HepG2, Hep3B, Huh7, JHH-7, 및 293으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 암 세포(예컨대, 간암 세포, 예를 들어 HCC)의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 nGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M(예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 항-nGPC3 항체 모이어티와 nGPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배(예컨대, 적어도 약 10, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107배)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M(예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 Fab 또는 Fab'이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 인간, 인간화, 키메라, 또는 합성 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD의 N-말단에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 천연 발생 TCR 은 γ/δ TCR이다. 일부 실시 형태에서, 제1 천연 발생 TCR 은 α/β TCR이다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM들 중 적어도 하나는 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 TCR-TM은 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM은 그의 유래가 되는 막관통 도메인과 대비하여 최대 5개(예컨대, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하고/하거나, 제2 TCR-TM은 그의 유래가 되는 막관통 도메인과 대비하여 최대 5개(예컨대, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 하나 이상의 TCR, 예컨대 αβ 및/또는 γδ TCR의 막관통 도메인(TCR-TM)으로부터 유래된 막관통 모듈을 포함하며, 선택적으로 TCR의 연결 펩티드 또는 이의 단편 및/또는 하나 이상의 TCR 세포내 도메인 또는 이의 단편 중 하나 또는 둘 모두를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 각각의 폴리펩티드 사슬은, 아미노-말단에서 카르복시-말단으로, 연결 펩티드, 막관통 도메인, 및 선택적으로 TCR 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR은 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있으며, 제1 폴리펩티드 사슬과 제2 폴리펩티드 사슬은 함께 항원-결합 모듈 및 TCRM을 형성한다. 일부 실시 형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬과 제2 폴리펩티드 사슬은 별개의 폴리펩티드 사슬이고, caTCR은 다량체, 예컨대 이량체이다. 일부 실시 형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬과 제2 폴리펩티드 사슬은, 예를 들어 펩티드 결합에 의해, 또는 다른 화학적 결합, 예컨대 이황화물 결합에 의해 공유적으로 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬과 제2 폴리펩티드 사슬은 적어도 하나의 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 하나 이상의 T 세포 공동자극성 신호전달 서열을 추가로 포함한다. 하나 이상의 공동자극성 신호전달 서열은, 개별적으로, 공동자극성 분자의 세포내 도메인의 전부 또는 일부분일 수 있으며, 공동자극성 분자에는, 예를 들어 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등이 포함된다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 공동자극성 신호전달 서열은 제1 TCR-TM과 제1 TCR 세포내 도메인 사이에 그리고/또는 제2 TCR-TM과 제2 TCR 세포내 도메인 사이에 있다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 공동자극성 신호전달 서열은 제1 TCRD 및/또는 제2 TCRD에 대해 카르복시-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, caTCR에는 T 세포 공동자극성 신호전달 서열이 결여되어 있다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 안정화 모듈은 항원-결합 모듈과 TCRM 사이에 위치된다. 일부 실시 형태에서, 안정화 모듈은 CH1 항체 도메인을 포함하는 제1 안정화 도메인 또는 이의 변이체, 및 CL 항체 도메인을 포함하는 제2 안정화 도메인 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 임의의 2개의 caTCR 모듈들 또는 도메인들 사이에 스페이서 모듈을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 CD3δε, CD3γε, 및 ζζ로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 천연 발생 T 세포 수용체의 막관통 도메인을 포함하는 TCRM과 대비하여 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 향상된 동원을 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 caTCR-CD3 복합체 형성을 촉진시킨다. 일부 실시 형태에서, 임의의 2개의 caTCR 모듈 또는 도메인 사이에 스페이서 모듈이 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR은 이종다량체, 예컨대 이종이량체이다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR은 제1 TCRD를 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 TCRD를 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하는 이종이량체이며, 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 폴리펩티드 사슬에 연결된다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 하나 이상의 천연 비발생 TCR 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM은 서열 번호 495의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM은 서열 번호 496의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR이 제공되며, 상기 항-GPC3 caTCR은 a) 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티를 포함하는 항원-결합 모듈, 및 b) 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(예컨대, CD3δε, CD3γε, 및/또는 ζζ)의 동원을 촉진시키며, 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR이 제공되며, 상기 항-GPC3 caTCR은 a) i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티를 포함하는 항원-결합 모듈, 및 b) 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(예컨대, CD3δε, CD3γε, 및/또는 ζζ)의 동원을 촉진시키며, 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR이 제공되며, 상기 항-GPC3 caTCR은 a) i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티를 포함하는 항원-결합 모듈, 및 b) 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(예컨대, CD3δε, CD3γε, 및/또는 ζζ)의 동원을 촉진시키며, 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR이 제공되며, 상기 항-GPC3 caTCR은 a) i) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티를 포함하는 항원-결합 모듈, 및 b) 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(예컨대, CD3δε, CD3γε, 및/또는 ζζ)의 동원을 촉진시키며, 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR이 제공되며, 상기 항-GPC3 caTCR은 a) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티를 포함하는 항원-결합 모듈, 및 b) 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(예컨대, CD3δε, CD3γε, 및/또는 ζζ)의 동원을 촉진시키며, 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR이 제공되며, 상기 항-GPC3 caTCR은 a) nGPC3에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 항-nGPC3 항체 모이어티를 포함하는 항원-결합 모듈, 및 b) 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(예컨대, CD3δε, CD3γε, 및/또는 ζζ)의 동원을 촉진시키며, 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR이 제공되며, 상기 항-GPC3 caTCR은 a) 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 nGPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-nGPC3 항체 모이어티를 포함하는 항원-결합 모듈, 및 b) 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(예컨대, CD3δε, CD3γε, 및/또는 ζζ)의 동원을 촉진시키며, 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR이 제공되며, 상기 항-GPC3 caTCR은 a) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 CH1 항체 도메인을 포함하는 제1 항원-결합 도메인 및 제1 TCR 하위단위의 제1 막관통 도메인을 포함하는 제1 T 세포 수용체 도메인(TCRD)을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및 b) 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 CL 항체 도메인을 포함하는 제2 항원-결합 도메인 및 제2 TCR 하위단위의 제2 막관통 도메인을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 제1 항원-결합 도메인의 VH 및 CH1 도메인과 제2 항원-결합 도메인의 VL 및 CL 도메인은 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈을 형성하고, 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 모듈을 동원할 수 있는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 형성한다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 CH1 도메인 내의 잔기와 CL 도메인 내의 잔기 사이에 이황화물 결합을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR이 제공되며, 상기 항-GPC3 caTCR은 a) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH 항체 도메인을 포함하는 제1 항원-결합 도메인 및 제1 TCR 하위단위의 제1 막관통 도메인을 포함하는 제1 TCRD를 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및 b) 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL 항체 도메인을 포함하는 제2 항원-결합 도메인 및 제2 TCR 하위단위의 제2 막관통 도메인을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 제1 항원-결합 도메인의 VH 도메인과 제2 항원-결합 도메인의 VL 도메인은 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈을 형성하고, 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 모듈을 동원할 수 있는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 형성한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR은 서열 번호 492 및 서열 번호 493의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 nGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M(예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 항-nGPC3 항체 모이어티와 nGPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배(예컨대, 적어도 약 10, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107배)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M(예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 Fab 또는 Fab'이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 인간, 인간화, 키메라, 또는 합성 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD의 N-말단에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 천연 발생 TCR 은 γ/δ TCR이다. 일부 실시 형태에서, 제1 천연 발생 TCR 은 α/β TCR이다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM들 중 적어도 하나는 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 TCR-TM은 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM은 그의 유래가 되는 막관통 도메인과 대비하여 최대 5개(예컨대, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하고/하거나, 제2 TCR-TM은 그의 유래가 되는 막관통 도메인과 대비하여 최대 5개(예컨대, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 하나 이상의 TCR, 예컨대 αβ 및/또는 γδ TCR의 막관통 도메인(TCR-TM)으로부터 유래된 막관통 모듈을 포함하며, 선택적으로 TCR의 연결 펩티드 또는 이의 단편 및/또는 하나 이상의 TCR 세포내 도메인 또는 이의 단편 중 하나 또는 둘 모두를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 각각의 폴리펩티드 사슬은, 아미노-말단에서 카르복시-말단으로, 연결 펩티드, 막관통 도메인, 및 선택적으로 TCR 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR은 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있으며, 제1 폴리펩티드 사슬과 제2 폴리펩티드 사슬은 함께 항원-결합 모듈 및 TCRM을 형성한다. 일부 실시 형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬과 제2 폴리펩티드 사슬은 별개의 폴리펩티드 사슬이고, caTCR은 다량체, 예컨대 이량체이다. 일부 실시 형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬과 제2 폴리펩티드 사슬은, 예를 들어 펩티드 결합에 의해, 또는 다른 화학적 결합, 예컨대 이황화물 결합에 의해 공유적으로 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬과 제2 폴리펩티드 사슬은 적어도 하나의 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 하나 이상의 T 세포 공동자극성 신호전달 서열을 추가로 포함한다. 하나 이상의 공동자극성 신호전달 서열은, 개별적으로, 공동자극성 분자의 세포내 도메인의 전부 또는 일부분일 수 있으며, 공동자극성 분자에는, 예를 들어 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등이 포함된다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 공동자극성 신호전달 서열은 제1 TCR-TM과 제1 TCR 세포내 도메인 사이에 그리고/또는 제2 TCR-TM과 제2 TCR 세포내 도메인 사이에 있다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 공동자극성 신호전달 서열은 제1 TCRD 및/또는 제2 TCRD에 대해 카르복시-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, caTCR에는 T 세포 공동자극성 신호전달 서열이 결여되어 있다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 안정화 모듈은 항원-결합 모듈과 TCRM 사이에 위치된다. 일부 실시 형태에서, 안정화 모듈은 CH1 항체 도메인을 포함하는 제1 안정화 도메인 또는 이의 변이체, 및 CL 항체 도메인을 포함하는 제2 안정화 도메인 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 임의의 2개의 caTCR 모듈들 또는 도메인들 사이에 스페이서 모듈을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 CD3δε, CD3γε, 및 ζζ로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 천연 발생 T 세포 수용체의 막관통 도메인을 포함하는 TCRM과 대비하여 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 향상된 동원을 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 caTCR-CD3 복합체 형성을 촉진시킨다. 일부 실시 형태에서, 임의의 2개의 caTCR 모듈 또는 도메인 사이에 스페이서 모듈이 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR은 이종다량체, 예컨대 이종이량체이다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR은 제1 TCRD를 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 TCRD를 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하는 이종이량체이며, 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 폴리펩티드 사슬에 연결된다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 하나 이상의 천연 비발생 TCR 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM은 서열 번호 495의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM은 서열 번호 496의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR이 제공되며, 상기 항-GPC3 caTCR은 a) GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티를 포함하는 항원-결합 모듈, 및 b) 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 막관통 도메인으로부터 유래된 제1 및 제2 TCR-TM을 포함하는 TCRM을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR이 제공되며, 상기 항-GPC3 caTCR은 a) i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함하는, GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티를 포함하는 항원-결합 모듈, 및 b) 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(예컨대, CD3δε, CD3γε, 및/또는 ζζ)의 동원을 촉진시키며, 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR이 제공되며, 상기 항-GPC3 caTCR은 a) i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함하는, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티를 포함하는 항원-결합 모듈, 및 b) 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 막관통 도메인으로부터 유래된 제1 및 제2 TCR-TM을 포함하는 TCRM을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR이 제공되며, 상기 항-GPC3 caTCR은 a) i) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티를 포함하는 항원-결합 모듈, 및 b) 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(예컨대, CD3δε, CD3γε, 및/또는 ζζ)의 동원을 촉진시키며, 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR이 제공되며, 상기 항-GPC3 caTCR은 a) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함하는, (예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3을) 특이적으로 인식하는 항체 모이어티를 포함하는 항원-결합 모듈, 및 b) 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(예컨대, CD3δε, CD3γε, 및/또는 ζζ)의 동원을 촉진시키며, 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR이 제공되며, 상기 항-GPC3 caTCR은 a) GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항원-결합 모듈, 및 b) 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(예컨대, CD3δε, CD3γε, 및/또는 ζζ)의 동원을 촉진시키며, 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR이 제공되며, 상기 항-GPC3 caTCR은 a) 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 GPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항원-결합 모듈, 및 b) 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(예컨대, CD3δε, CD3γε, 및/또는 ζζ)의 동원을 촉진시키며, 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR이 제공되며, 상기 항-GPC3 caTCR은 a) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 CH1 항체 도메인을 포함하는 제1 항원-결합 도메인 및 제1 TCR 하위단위의 제1 막관통 도메인을 포함하는 제1 T 세포 수용체 도메인(TCRD)을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및 b) 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 CL 항체 도메인을 포함하는 제2 항원-결합 도메인 및 제2 TCR 하위단위의 제2 막관통 도메인을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 제1 항원-결합 도메인의 VH 및 CH1 도메인과 제2 항원-결합 도메인의 VL 및 CL 도메인은 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈을 형성하고, 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 모듈을 동원할 수 있는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 형성한다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 CH1 도메인 내의 잔기와 CL 도메인 내의 잔기 사이에 이황화물 결합을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR이 제공되며, 상기 항-GPC3 caTCR은 a) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH 항체 도메인을 포함하는 제1 항원-결합 도메인 및 제1 TCR 하위단위의 제1 막관통 도메인을 포함하는 제1 TCRD를 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및 b) 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL 항체 도메인을 포함하는 제2 항원-결합 도메인 및 제2 TCR 하위단위의 제2 막관통 도메인을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 제1 항원-결합 도메인의 VH 도메인과 제2 항원-결합 도메인의 VL 도메인은 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈을 형성하고, 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 모듈을 동원할 수 있는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 형성한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고, 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 가용성 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 가용성 GPC3에 대한 항-sGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-sGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 461의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-sGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 510 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 467)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3 및 가용성 GPC3 둘 모두를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 Fab 또는 Fab'이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티와 표적 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3) 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M(예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티와 비표적 사이의 결합의 Kd는 항-GPC3 항체 모이어티와 표적 GPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배(예컨대, 적어도 약 10, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107배)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티와 비표적 사이의 결합의 Kd는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M(예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)이다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 HepG2, Hep3B, Huh7, JHH-7, 및 293으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 암 세포(예컨대, 간암 세포, 예를 들어 HCC)의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 인간, 인간화, 키메라, 또는 합성 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD의 N-말단에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 천연 발생 TCR 은 γ/δ TCR이다. 일부 실시 형태에서, 제1 천연 발생 TCR 은 α/β TCR이다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM들 중 적어도 하나는 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 TCR-TM은 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM은 그의 유래가 되는 막관통 도메인과 대비하여 최대 5개(예컨대, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하고/하거나, 제2 TCR-TM은 그의 유래가 되는 막관통 도메인과 대비하여 최대 5개(예컨대, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 하나 이상의 TCR, 예컨대 αβ 및/또는 γδ TCR의 막관통 도메인(TCR-TM)으로부터 유래된 막관통 모듈을 포함하며, 선택적으로 TCR의 연결 펩티드 또는 이의 단편 및/또는 하나 이상의 TCR 세포내 도메인 또는 이의 단편 중 하나 또는 둘 모두를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 각각의 폴리펩티드 사슬은, 아미노-말단에서 카르복시-말단으로, 연결 펩티드, 막관통 도메인, 및 선택적으로 TCR 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR은 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬을 포함할 수 있으며, 제1 폴리펩티드 사슬과 제2 폴리펩티드 사슬은 함께 항원-결합 모듈 및 TCRM을 형성한다. 일부 실시 형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬과 제2 폴리펩티드 사슬은 별개의 폴리펩티드 사슬이고, caTCR은 다량체, 예컨대 이량체이다. 일부 실시 형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬과 제2 폴리펩티드 사슬은, 예를 들어 펩티드 결합에 의해, 또는 다른 화학적 결합, 예컨대 이황화물 결합에 의해 공유적으로 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬과 제2 폴리펩티드 사슬은 적어도 하나의 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 하나 이상의 T 세포 공동자극성 신호전달 서열을 추가로 포함한다. 하나 이상의 공동자극성 신호전달 서열은, 개별적으로, 공동자극성 분자의 세포내 도메인의 전부 또는 일부분일 수 있으며, 공동자극성 분자에는, 예를 들어 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등이 포함된다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 공동자극성 신호전달 서열은 제1 TCR-TM과 제1 TCR 세포내 도메인 사이에 그리고/또는 제2 TCR-TM과 제2 TCR 세포내 도메인 사이에 있다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 공동자극성 신호전달 서열은 제1 TCRD 및/또는 제2 TCRD에 대해 카르복시-말단에 있다. 일부 실시 형태에서, caTCR에는 T 세포 공동자극성 신호전달 서열이 결여되어 있다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 제1 안정화 도메인 및 제2 안정화 도메인을 포함하는 안정화 모듈을 추가로 포함하며, 제1 안정화 도메인과 제2 안정화 도메인은 caTCR을 안정화하는 서로에 대한 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 안정화 모듈은 항원-결합 모듈과 TCRM 사이에 위치된다. 일부 실시 형태에서, 안정화 모듈은 CH1 항체 도메인을 포함하는 제1 안정화 도메인 또는 이의 변이체, 및 CL 항체 도메인을 포함하는 제2 안정화 도메인 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, caTCR은 임의의 2개의 caTCR 모듈들 또는 도메인들 사이에 스페이서 모듈을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 CD3δε, CD3γε, 및 ζζ로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자를 동원할 수 있다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 천연 발생 T 세포 수용체의 막관통 도메인을 포함하는 TCRM과 대비하여 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 향상된 동원을 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 caTCR-CD3 복합체 형성을 촉진시킨다. 일부 실시 형태에서, 임의의 2개의 caTCR 모듈 또는 도메인 사이에 스페이서 모듈이 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR은 이종다량체, 예컨대 이종이량체이다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR은 제1 TCRD를 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 TCRD를 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하는 이종이량체이며, 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 폴리펩티드 사슬에 연결된다. 일부 실시 형태에서, TCRM은 하나 이상의 천연 비발생 TCR 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM은 서열 번호 495의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM은 서열 번호 496의 아미노산 서열을 포함한다.
항-GPC3 caTCR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, 림프구, 예를 들어 T 세포)가 또한 본 명세서에 제공된다.
항-GPC3 caTCR을 발현하는 이펙터 세포를 생성하는 방법이 또한 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 caTCR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 이펙터 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 벡터를 이펙터 세포 내로 도입하는 단계는 벡터에 의해 이펙터 세포를 형질도입시키는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 벡터를 이펙터 세포 내로 도입하는 단계는 벡터에 의해 이펙터 세포를 형질감염시키는 단계를 포함한다. 이펙터 세포 내로의 벡터의 형질도입 또는 형질감염은 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR 이펙터 세포(예컨대, 림프구, 예를 들어 T 세포)가 제공되며, 상기 항-GPC3 caTCR 이펙터 세포는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 본 명세서에 기재된 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 이중특이성 T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR 이펙터 세포에서의 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)의 발현은 항-GPC3 caTCR을 통한 신호전달 시에 유도가능하다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산 서열은 NFAT-유래 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시 형태에서, NFAT-유래 프로모터는 NFAT-유래 최소 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산 서열은 IL-2 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
키메라 공동자극성 수용체(CSR) 작제물
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 키메라 공동자극성 수용체(CSR)로서, CSR은 GPC3에 특이적으로 결합하고 면역 세포를 자극할 수 있는데, 이때 그것은 표적 리간드 결합 시에 면역 세포의 표면 상에서 기능적으로 발현된다. CSR은 리간드-결합 특이성을 제공하는 리간드-결합 모듈, 막관통 모듈, 및 면역 세포를 자극할 수 있게 하는 공동자극성 면역 세포 신호전달 모듈을 포함한다. CSR에는 기능성 1차 면역 세포 신호전달 서열이 결여되어 있다. 일부 실시 형태에서, CSR에는 어떠한 1차 면역 세포 신호전달 서열도 결여되어 있다. 일부 실시 형태에서, CSR은 리간드-결합 모듈, 막관통 모듈, 및 공동자극성 신호전달 모듈을 포함하는 단일 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 제1 폴리펩티드 사슬과 제2 폴리펩티드 사슬은 함께 리간드-결합 모듈, 막관통 모듈, 및 공동자극성 신호전달 모듈을 형성한다. 일부 실시 형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬과 제2 폴리펩티드 사슬은 별개의 폴리펩티드 사슬이고, CSR은 다량체, 예컨대 이량체이다. 일부 실시 형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬과 제2 폴리펩티드 사슬은, 예를 들어 펩티드 결합에 의해, 또는 다른 화학적 결합, 예컨대 이황화물 결합에 의해 공유적으로 연결된다. 일부 실시 형태에서, 제1 폴리펩티드 사슬과 제2 폴리펩티드 사슬은 적어도 하나의 이황화물 결합에 의해 연결된다. 일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포에서의 CSR의 발현은 유도가능하다. 일부 실시 형태에서, caTCR + CSR 면역 세포에서의 CSR의 발현은 caTCR을 통한 신호전달 시에 유도가능하다.
일부 실시 형태에서, GPC3에 특이적으로 결합하는 CSR이 제공되며, 상기 CSR은 a) 서열 번호 309의 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인 및 서열 번호 360의 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 scFv; 및 b) 서열 번호 530의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 CD28의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, scFv는 서열 번호 441의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, CSR은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 scFv, 아미노산 서열 AAA를 갖는 펩티드 링커, 및 CD28의 단편을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CSR은 서열 번호 530의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
일부 실시 형태에서, 면역 세포(예컨대, T 세포)가 제공되며, 상기 면역 세포는 caTCR(예컨대, AFP/MHC 클래스 I 분자, 예를 들어 AFP158/HLA-A02에 특이적으로 결합하는 caTCR) 및 본 명세서에 기재된 임의의 CSR에 따른 항-GPC3 CSR을 인코딩하는 핵산을 포함하며, caTCR 및 CSR은 핵산으로부터 발현되고 면역 세포 표면에 국소화된다. 일부 실시 형태에서, 핵산은 caTCR의 제1 caTCR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제1 caTCR 핵산 서열, caTCR의 제2 caTCR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제2 caTCR 핵산 서열, 및 CSR의 CSR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 CSR 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 caTCR 핵산 서열과 제2 caTCR 핵산 서열과 CSR 핵산 서열은 각각 상이한 벡터 내에 함유된다. 일부 실시 형태에서, 핵산 서열들 중 일부 또는 전부는 동일한 벡터 내에 함유된다. 벡터는, 예를 들어, 포유류 발현 벡터 및 바이러스 벡터(예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 및 렌티바이러스로부터 유래된 것들)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 벡터들 중 하나 이상은 면역 세포의 숙주 게놈 내로 통합된다. 일부 실시 형태에서, 제1 caTCR 핵산 서열과 제2 caTCR 핵산 서열과 CSR 핵산 서열은 각각 상이한 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 실시 형태에서, 프로모터들 중 일부 또는 전부는 동일한 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 프로모터들 중 일부 또는 전부는 상이한 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 핵산 서열들 중 일부 또는 전부는 단일 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 실시 형태에서, 프로모터들 중 일부 또는 전부는 유도성이다. 일부 실시 형태에서, 면역 세포는 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 자연 살해 T 세포, 및 억제인자 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
면역접합체
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)은 이펙터 분자에 부착된 본 명세서에 기재된 임의의 항-GPC3 항체 모이어티에 따른 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 면역접합체(본 명세서에서 "항-GPC3 면역접합체"로도 지칭됨)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 분자는 치료제, 예컨대 약물, 독소, 방사성 동위원소, 단백질, 펩티드, 탄수화물, 지질, 또는 핵산이다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 분자는 암 치료제로서, 이것은 세포독성이거나, 세포분열억제성(cytostatic)이거나, 또는 달리 어떠한 치료적 이득을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 치료제는 면역 시스템의 조절 및/또는 T-세포 매개 세포독성의 향상과 관련된 생물학적 활성을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 분자는 표지로서, 이것은 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 생성할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고, 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 가용성 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 가용성 GPC3에 대한 항-sGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3 및 가용성 GPC3 둘 모두를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 전장 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 항체 모이어티이다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 면역접합체가 제공되며, 상기 항-GPC3 면역접합체는 항-GPC3 항체 모이어티 및 치료제를 포함한다(본 명세서에서 "항체-약물 접합체", 또는 "ADC"로도 지칭됨). 일부 실시 형태에서, 치료제는 독소로서, 이것은 세포독성이거나, 세포분열억제성이거나, 또는 달리 표적 세포가 분열되는 능력을 방지하거나 감소시킨다. 세포독성제 또는 세포분열억제제, 즉 암의 치료에서 종양 세포를 사멸시키거나 억제하기 위한 약물의 국소 전달을 위한 ADC의 사용(문헌[Syrigos and Epenetos, Anticancer Research 19:605-614 (1999); Niculescu-Duvaz and Springer, Adv. Drg. Del. Rev. 26:151 -172 (1997)]; 미국 특허 제4,975,278호)은 표적 세포에 대한 약물 모이어티의 표적화된 전달, 및 그 안에서의 세포내 축적을 가능하게 하며, 한편 이들 비접합된 치료제의 전신 투여는 제거하고자 하는 표적 세포뿐만 아니라 정상 세포에 대한 허용 불가능한 수준의 독성을 초래할 수 있다(문헌[Baldwin et al., Lancet (Mar. 15, 1986):603-605 (1986)]; 문헌[Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (eds.), pp. 475- 506]). 이로써, 최소한의 독성으로 최대 효능이 얻어진다.
항-GPC3 면역접합체에 사용되는 치료제는, 예를 들어 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 및 빈데신을 포함한다(문헌[Rowland et al., Cancer Immunol. Immunother. 21:183-187 (1986)]). 항-GPC3 면역접합체에 사용되는 독소는 세균 독소, 예컨대 디프테리아 독소, 식물 독소, 예컨대 리신, 소분자 독소, 예컨대 겔다나마이신(문헌[Mandler et al., J.Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581 (2000)]; 문헌[Mandler et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025- 1028 (2000)]; 문헌[Mandler et al., Bioconjugate Chem. 13:786-791 (2002)]), 메이탄시노이드(유럽 특허 EP 1391213호; 문헌[Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)]), 및 칼리케아미신(문헌[Lode et al., Cancer Res. 58:2928 (1998)]; 문헌[Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)])을 포함한다. 독소는 튜불린 결합, DNA 결합, 또는 토포아이소머라제 억제를 포함하는 기전에 의해 그의 세포독성 및 세포분열억제 효과를 발휘할 수 있다. 일부 세포독성 약물은 큰 항체 또는 단백질 수용체 리간드에 접합될 때 불활성이거나 덜 활성인 경향이 있다.
사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 이의 단편은, 예를 들어 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합성 활성 단편, 외독소 A 사슬(프세우도모나스 아이루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래됨), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, α-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(Momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오프피시날리스(Sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테센을 포함한다. 예를 들어, 1993년 10월 28일자로 공개된 국제 특허 출원 공개 WO 93/21232호를 참조한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 면역접합체는 항-GPC3 항체 모이어티 및 하나 이상의 소분자 독소, 예컨대 칼리케아미신, 메이탄시노이드, 돌라스타틴, 아우로스타틴, 트리코테센, 및 CC1065를 포함하며, 독소 활성을 갖는 이들 독소의 유도체가 또한 본 명세서에서 고려된다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 면역접합체가 제공되며, 상기 항-GPC3 면역접합체는 세포내 활성을 갖는 치료제를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 면역접합체는 내재화되고, 치료제는 세포의 단백질 합성을 차단하여 세포사를 야기하는 세포독소이다. 일부 실시 형태에서, 치료제는 리보솜-불활성화 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 세포독소로서, 이에는, 예를 들어 겔로닌, 보가닌, 사포린, 리신, 리신 A 사슬, 브리오딘, 디프테리아 독소, 제한독소, 슈도모나스 외독소 A 및 이들의 변이체가 포함된다. 치료제가 리보좀-불활성화 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 세포독소인 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 면역접합체는 단백질이 세포에 대해 세포독성이 되기 위하여, 표적 세포에 결합 시에 내재화되어야 한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 면역접합체가 제공되며, 상기 항-GPC3 면역접합체는 DNA를 파괴하도록 작용하는 치료제를 포함한다. 일부 실시 형태에서, DNA를 파괴하도록 작용하는 치료제는, 예를 들어 엔다이인(예를 들어, 칼리케아미신 및 에스페라미신) 및 비-엔다이인 소분자 작용제(예를 들어, 블레오마이신, 메티디움프로필-EDTA-Fe(II))로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 출원에 따라 유용한 다른 암 치료제는, 제한 없이, 다우노루비신, 독소루비신, 디스타마이신 A, 시스플라틴, 미토마이신 C, 엑테이나스시딘, 듀오카르마이신/CC-1065, 및 블레오마이신/페플레오마이신을 포함한다.
본 발명은 항-GPC3 항체 모이어티와 핵산분해 활성을 갖는 화합물(예를 들어, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예컨대 데옥시리보뉴클레아제; DNase) 사이에 형성되는 항-GPC3 면역접합체를 추가로 고려한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 면역접합체는 튜불린을 파괴하도록 작용하는 작용제를 포함한다. 그러한 작용제는, 예를 들어 리족신/메이탄신, 파클리탁셀, 빈크리스틴 및 빈블라스틴, 콜히친, 오리스타틴 돌라스타틴 10 MMAE, 및 펠로루시드 A를 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 면역접합체는 알킬화제를 포함하며, 이러한 알킬화제는, 예를 들어 아살레이(Asaley) NSC 167780, AZQ NSC 182986, BCNU NSC 409962, 부설판 NSC 750, 카르복시프탈레이토백금 NSC 271674, CBDCA NSC 241240, CCNU NSC 79037, CHIP NSC 256927, 클로람부실 NSC 3088, 클로로조토신 NSC 178248, 시스-백금 NSC 119875, 클로메손 NSC 338947, 시아노모르폴리노독소루비신 NSC 357704, 사이클로디손 NSC 348948, 다이안하이드로갈락티톨 NSC 132313, 플루오로도판 NSC 73754, 헵설팜 NSC 329680, 하이칸톤 NSC 142982, 멜팔란 NSC 8806, 메틸 CCNU NSC 95441, 미토마이신 C NSC 26980, 미토졸아미드 NSC 353451, 질소 머스타드 NSC 762, PCNU NSC 95466, 피페라진 NSC 344007, 피페라진다이온 NSC 135758, 피포브로만 NSC 25154, 포르피로마이신 NSC 56410, 스피로하이단토인 머스타드 NSC 172112, 테록시론 NSC 296934, 테트라플라틴 NSC 363812, 티오-테파 NSC 6396, 트라이에틸렌멜라민 NSC 9706, 우라실 질소 머스타드 NSC 34462, 및 요시(Yoshi)-864 NSC 102627을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 출원의 항-GPC3 면역접합체의 암 치료제 부분은 항유사분열제를 포함할 수 있으며, 이에는, 제한 없이, 알로콜히친 NSC 406042, 할리콘드린 B NSC 609395, 콜히친 NSC 757, 콜히친 유도체 NSC 33410, 돌라스타틴 10 NSC 376128(NG - 오리스타틴 유래), 메이탄신 NSC 153858, 리족신 NSC 332598, 탁솔 NSC 125973, 탁솔 유도체 NSC 608832, 티오콜히친 NSC 361792, 트라이틸 시스테인 NSC 83265, 빈블라스틴 설페이트 NSC 49842, 및 빈크리스틴 설페이트 NSC 67574가 포함된다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 면역접합체는 토포이소머라제 I 억제제를 포함하며, 이에는, 제한 없이, 캄포테신 NSC 94600, 캄포테신, Na salt NSC 100880, 아미노캄포테신 NSC 603071, 캄포테신 유도체 NSC 95382, 캄포테신 유도체 NSC 107124, 캄포테신 유도체 NSC 643833, 캄포테신 유도체 NSC 629971, 캄포테신 유도체 NSC 295500, 캄포테신 유도체 NSC 249910, 캄포테신 유도체 NSC 606985, 캄포테신 유도체 NSC 374028, 캄포테신 유도체 NSC 176323, 캄포테신 유도체 NSC 295501, 캄포테신 유도체 NSC 606172, 캄포테신 유도체 NSC 606173, 캄포테신 유도체 NSC 610458, 캄포테신 유도체 NSC 618939, 캄포테신 유도체 NSC 610457, 캄포테신 유도체 NSC 610459, 캄포테신 유도체 NSC 606499, 캄포테신 유도체 NSC 610456, 캄포테신 유도체 NSC 364830, 캄포테신 유도체 NSC 606497, 및 모르폴리노독소루비신 NSC 354646이 포함된다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 면역접합체는 토포이소머라제 II 억제제를 포함하며, 이에는, 제한 없이, 독소루비신 NSC 123127, 아모나피드 NSC 308847, m-AMSA NSC 249992, 안트라피라졸 유도체 NSC 355644, 피라졸로아크리딘 NSC 366140, 비산트렌 HCL NSC 337766, 다우노루비신 NSC 82151, 데옥시독소루비신 NSC 267469, 미톡산트론 NSC 301739, 메노가릴 NSC 269148, N,N-다이벤질 다우노마이신 NSC 268242, 옥산트라졸 NSC 349174, 루비다존 NSC 164011, VM-26 NSC 122819, 및 VP-16 NSC 141540이 포함된다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 면역접합체는 RNA 또는 DNA 항대사물제를 포함하며, 이에는, 제한 없이, L-알라노신 NSC 153353, 5-아자시티딘 NSC 102816, 5-플루오로우라실 NSC 19893, 아시비신 NSC 163501, 아미노프테린 유도체 NSC 132483, 아미노프테린 유도체 NSC 184692, 아미노프테린 유도체 NSC 134033, 안티폴 NSC 633713, 안티폴 NSC 623017, 베이커(Baker)의 가용성 안티폴 NSC 139105, 다이클로르알릴 라우손 NSC 126771, 브레퀴나르 NSC 368390, 프토라푸르(전구약물) NSC 148958, 5,6-다이하이드로-5-아자시티딘 NSC 264880, 메토트렉세이트 NSC 740, 메토트렉세이트 유도체 NSC 174121, N-(포스포노아세틸)-L-아스파르테이트(PALA) NSC 224131, 피라조푸린 NSC 143095, 트라이메트렉세이트 NSC 352122, 3-HP NSC 95678, 2'-데옥시-5-플루오로우리딘 NSC 27640, 5-HP NSC 107392, α-TGDR NSC 71851, 아피디콜린 글리시네이트 NSC 303812, 아라(ara)-C NSC 63878, 5-아자-2'-데옥시시티딘 NSC 127716, β-TGDR NSC 71261, 사이클로로시티딘 NSC 145668, 구아나졸 NSC 1895, 하이드록시우레아 NSC 32065, 이노신 글리코다이알데하이드 NSC 118994, 맥베신 Il NSC 330500, 피라졸로이미다졸 NSC 51143, 티오구아닌 NSC 752, 및 티오퓨린 NSC 755가 포함된다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 면역접합체는 고도로 방사성인 원자를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성 접합된 항체의 생성에 이용가능하다. 예에는 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 212Pb, 및 Lu의 방사성 동위원소가 포함된다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 종양 사전표적화에 이용하기 위하여 "수용체"(예컨대, 스트렙타비딘)에 접합될 수 있는데, 여기서는 항체-수용체 접합체가 환자에게 투여된 후, 제거제(clearing agent)를 사용하여 순환으로부터 결합되지 않은 접합체를 제거하고, 이어서 세포독성제(예를 들어, 방사성 핵종)에 접합된 "리간드"(예를 들어, 아비딘)를 투여하였다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 면역접합체는 전구약물-활성화 효소에 접합된 항-GPC3 항체 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 그러한 실시 형태에서, 전구약물-활성화 효소는 전구약물(예를 들어, 펩티딜 화학요법제, 국제 특허 출원 공개 WO 81/01145호 참조)을 활성 약물, 예컨대 항암 약물로 전환시킨다. 일부 실시 형태에서, 그러한 항-GPC3 면역접합체는 항체-의존성 효소-매개 전구약물 요법("ADEPT")에서 유용하다. 항체에 접합될 수 있는 효소는 하기를 포함하지만 이로 한정되지 않는다: 포스페이트-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는 데 유용한 알칼리성 포스파타제; 설페이트-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는 데 유용한 아릴설파타제; 비독성 5-플루오로시토신을 항암 약물, 5-플루오로우라실로 전환시키는 데 유용한 시토신 데아미나제; 펩티드-함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는 데 유용한 프로테아제, 예컨대 세라티아 프로테아제, 서모라이신(thermolysin), 서브틸리신, 카르복시펩티다제 및 카텝신(예컨대, 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환체를 함유하는 전구약물을 전환시키는 데 유용한 D-알라닐카르복시펩티다제; 글리코실화된 전구약물을 유리 약물로 전환시키는 데 유용한 탄수화물-절단 효소, 예컨대 β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제; β-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는 데 유용한 β-락타마제; 및 페니실린 아미다제, 예컨대 페니실린 V 아미다제 및 페니실린 G 아미다제로서, 이들은, 그들의 아민 질소에서 각각 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸 기로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는 데 유용함. 일부 실시 형태에서, 효소는 당업계에 잘 알려진 재조합 DNA 기법에 의해 항체 모이어티에 공유적으로 결합될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984)]을 참조한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 면역접합체의 치료적 부분은 핵산일 수 있다. 사용될 수 있는 핵산은 안티센스 RNA, 유전자 또는 다른 폴리뉴클레오티드(핵산 유사체, 예컨대 티오구아닌 및 티오퓨린을 포함함)를 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
본 출원은 이펙터 분자에 부착된 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 면역접합체를 추가로 제공하며, 이펙터 분자는 간접적으로 또는 직접적으로 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 표지이다. 이들 항-GPC3 면역접합체는 연구 또는 진단 응용에, 예컨대 암의 생체내 검출에 사용될 수 있다. 표지는 바람직하게는 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 생성할 수 있다. 예를 들어, 표지는 방사선-불투과성이거나 하기와 같은 방사성 동위원소일 수 있다: 3H, 악티늄-225, 아스타틴-211, 비스무트-212, 탄소-14, 크롬-51, 염소-36, 코발트-57, 코발트-58, 구리-67, 유로퓸-152, 갈륨-67, 수소-3, 요오드-123, 요오드-124, 요오드-125, 요오드-131, 인듐-111, 철-59, 납-212, 루테튬-177, 인-32, 라듐-223, 라듐-224, 레늄-186, 레늄-188, 셀레늄-75, 황-35, 테크네튬-99m, 토륨-227, 이트륨-90, 또는 지르코늄-89; 형광 화합물(형광단) 또는 화학발광 화합물(발색단), 예컨대 플루오레세인 아이소티오시아네이트, 로다민, 루시페린, 알렉사(Alexa) 350, 알렉사 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, 캐스케이드 블루(Cascade Blue), Cy3, Cy5,6-FAM, HEX, 6-JOE, 오리건 그린(Oregon Green) 488, 오리건 그린 500, 오리건 그린 514, 퍼시픽 블루(Pacific Blue), REG, 레노그라핀(Renographin), ROX, TAMRA, TET, 테트라메틸로다민, 및/또는 텍사스 레드(Texas Red); 효소, 예컨대 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제 또는 서양고추냉이 퍼옥시다제; 조영제; 또는 금속 이온, 예를 들어 크롬(III), 망간(II), 철(III), 철(II), 코발트(II), 니켈(II), 구리(II), 네오디뮴(III), 사마륨(III), 이테르븀(III), 가돌리늄(III), 바나듐(II), 테르븀(III), 디스프로슘(III), 홀뮴(III), 에르븀(III), 란탄(III), 금(III), 납(II), 및/또는 비스무트(III). 일부 실시 형태에서, 표지는 섬광조영술 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 99Tc 또는 123I, 또는 핵자기 공명(NMR) 이미징(자기 공명 이미징, MRI로도 알려져 있음)을 위한 스핀 표지, 예컨대 지르코늄-89, 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철이다. 지르코늄-89는 다양한 금속 킬레이팅제에 착화되어, 예를 들어 PET 이미징을 위하여 항체에 접합될 수 있다(국제 특허 출원 공개 WO 2011/056983호).
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 면역접합체는 간접적으로 검출가능하다. 예를 들어, 항-GPC3 면역접합체에 특이적이고 검출가능한 표지를 함유하는 2차 항체가 항-GPC3 면역접합체를 검출하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 면역접합체가 제공되며, 상기 항-GPC3 면역접합체는 a) 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 항-nGPC3 항체 모이어티가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함), 및 b) 이펙터 분자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 서열을 포함하는 인간 GPC3 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 461의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 580개 내의 에피토프(서열 번호 463)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 463의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 GPC3의 N-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 1 내지 358 내의 에피토프(서열 번호 468)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 464의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 465)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 580 내의 에피토프(서열 번호 466)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 헤파린 설페이트 측쇄가 결여된 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 510 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 467)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 R358/S359에 있는 푸린 절단 부위에 걸쳐 있는 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 전장 성숙 인간 GPC3(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 560 또는 25 내지 580)에는 특이적으로 결합할 수 있지만, 인간 GPC3의 N-말단 단편(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 358) 또는 인간 GPC3의 C-말단 단편(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 560 또는 359 내지 580)에는 결합하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 헤파린 설페이트 측쇄가 결여된 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 면역접합체가 제공되며, 상기 항-GPC3 면역접합체는 a) nGPC3에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 항-nGPC3 항체 모이어티(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 항-nGPC3 항체 모이어티가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함), 및 b) 이펙터 분자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 면역접합체가 제공되며, 상기 항-GPC3 면역접합체는 a) 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 nGPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-nGPC3 항체 모이어티(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 항-nGPC3 항체 모이어티가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함), 및 b) 이펙터 분자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 HepG2, Hep3B, Huh7, JHH-7, 및 293으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, GPC3은 암 세포(예컨대, 간암 세포, 예를 들어 HCC)의 표면 상에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 nGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M(예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 항-nGPC3 항체 모이어티와 nGPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배(예컨대, 적어도 약 10, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107배)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M(예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)이다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 분자는 항-GPC3 항체 모이어티에 공유적으로 부착된다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 분자는, 예를 들어 약물, 독소, 방사성 동위원소, 단백질, 펩티드, 및 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료제이다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 분자는 암 치료제이다. 일부 실시 형태에서, 암 치료제는 화학요법제이다. 일부 실시 형태에서, 암 치료제는, 예를 들어 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 및 212Pb로 이루어진 군으로부터 선택되는 고도로 방사성인 원자이다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 분자는 표지로서, 이것은 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 생성할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 표지는, 예를 들어 3H, 14C, 32P, 35S, 123I, 125I, 및 131I로 이루어진 군으로부터 선택되는 방사성 동위원소이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 전장 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 Fab 또는 Fab'이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 키메라, 인간, 인간화, 또는 반합성 항체 모이어티이다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 면역접합체가 제공되며, 상기 항-GPC3 면역접합체는 a) i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티, 및 b) 이펙터 분자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 면역접합체가 제공되며, 상기 항-GPC3 면역접합체는 a) i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티, 및 b) 이펙터 분자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 면역접합체가 제공되며, 상기 항-GPC3 면역접합체는 a) i) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티, 및 b) 이펙터 분자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 면역접합체가 제공되며, 상기 항-GPC3 면역접합체는 a) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티, 및 b) 이펙터 분자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 면역접합체가 제공되며, 상기 항-GPC3 면역접합체는 a) nGPC3에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 항-nGPC3 항체 모이어티, 및 b) 이펙터 분자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 면역접합체가 제공되며, 상기 항-GPC3 면역접합체는 a) 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 nGPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-nGPC3 항체 모이어티, 및 b) 이펙터 분자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 nGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M(예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 항-nGPC3 항체 모이어티와 nGPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배(예컨대, 적어도 약 10, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107배)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티와 sGPC3 사이의 결합의 Kd는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M(예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)이다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 분자는 항-GPC3 항체 모이어티에 공유적으로 부착된다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 분자는, 예를 들어 약물, 독소, 방사성 동위원소, 단백질, 펩티드, 및 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료제이다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 분자는 암 치료제이다. 일부 실시 형태에서, 암 치료제는 화학요법제이다. 일부 실시 형태에서, 암 치료제는, 예를 들어 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 및 212Pb로 이루어진 군으로부터 선택되는 고도로 방사성인 원자이다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 분자는 표지로서, 이것은 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 생성할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 표지는, 예를 들어 3H, 14C, 32P, 35S, 123I, 125I, 및 131I로 이루어진 군으로부터 선택되는 방사성 동위원소이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 전장 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 Fab 또는 Fab'이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 키메라, 인간, 인간화, 또는 반합성 항체 모이어티이다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 면역접합체가 제공되며, 상기 항-GPC3 면역접합체는 a) i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함하는, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티, 및 b) 이펙터 분자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 면역접합체가 제공되며, 상기 항-GPC3 면역접합체는 a) i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함하는, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티, 및 b) 이펙터 분자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 면역접합체가 제공되며, 상기 항-GPC3 면역접합체는 a) i) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티, 및 b) 이펙터 분자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 면역접합체가 제공되며, 상기 항-GPC3 면역접합체는 a) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함하는, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티, 및 b) 이펙터 분자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 면역접합체가 제공되며, 상기 항-GPC3 면역접합체는 a) GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 항-GPC3 항체 모이어티, 및 b) 이펙터 분자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 면역접합체가 제공되며, 상기 항-GPC3 면역접합체는 a) 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 GPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티, 및 b) 이펙터 분자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고, 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 가용성 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 가용성 GPC3에 대한 항-sGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-sGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 461의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-sGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 510 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 467)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3 및 가용성 GPC3 둘 모두를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티와 표적 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3) 사이의 결합의 Kd는 약 10-7 M 내지 약 10-13 M(예컨대, 약 10-7 M 내지 약 10-13 M, 약 10-9 M 내지 약 10-13 M, 또는 약 10-10 M 내지 약 10-12 M)이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티와 비표적 사이의 결합의 Kd는 항-GPC3 항체 모이어티와 표적 GPC3 사이의 결합의 Kd의 적어도 약 10배(예컨대, 적어도 약 10, 102, 103, 104, 105, 106, 또는 107배)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티와 비표적 사이의 결합의 Kd는 약 10-1 M 내지 약 10-6 M(예컨대, 약 10-1 M 내지 약 10-6 M, 약 10-1 M 내지 약 10-5 M, 또는 약 10-2 M 내지 약 10-4 M)이다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 분자는 항-GPC3 항체 모이어티에 공유적으로 부착된다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 분자는, 예를 들어 약물, 독소, 방사성 동위원소, 단백질, 펩티드, 및 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료제이다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 분자는 암 치료제이다. 일부 실시 형태에서, 암 치료제는 화학요법제이다. 일부 실시 형태에서, 암 치료제는, 예를 들어 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 및 212Pb로 이루어진 군으로부터 선택되는 고도로 방사성인 원자이다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 분자는 표지로서, 이것은 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 생성할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 표지는, 예를 들어 3H, 14C, 32P, 35S, 123I, 125I, 및 131I로 이루어진 군으로부터 선택되는 방사성 동위원소이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 전장 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 Fab 또는 Fab'이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 키메라, 인간, 인간화, 또는 반합성 항체 모이어티이다.
핵산
항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물) 또는 항-GPC3 항체 모이어티를 인코딩하는 핵산 분자가 또한 고려된다. 일부 실시 형태에서, 전장 항-GPC3 항체를 인코딩하는 핵산(또는 핵산 세트)이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 scFv를 인코딩하는 핵산(또는 핵산 세트)이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 Fc 융합 단백질을 인코딩하는 핵산(또는 핵산 세트)이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성 항-GPC3 분자(예를 들어, 다중특이성 항-GPC3 항체, 이중특이성 항-GPC3 항체, 또는 이중특이성 T-세포 인게이저 항-GPC3 항체), 또는 이의 폴리펩티드 부분을 인코딩하는 핵산(또는 핵산 세트)이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR을 인코딩하는 핵산(또는 핵산 세트)이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR을 인코딩하는 핵산(또는 핵산 세트)이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 면역접합체 또는 이의 폴리펩티드 부분을 인코딩하는 핵산(또는 핵산 세트)이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물을 인코딩하는 핵산(또는 핵산 세트)은 펩티드 태그(예컨대, 단백질 정제 태그, 예를 들어 His-태그, HA 태그)를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
항-GPC3 작제물을 포함하는 단리된 숙주 세포, 항-GPC3 작제물의 폴리펩티드 성분을 인코딩하는 단리된 핵산, 또는 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물의 폴리펩티드 성분을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 또한 본 명세서에서 고려된다.
본 출원은 또한 이들 핵산 서열에 대한 변이체를 포함한다. 예를 들어, 변이체는 적어도 보통 정도로 격한 혼성화 조건 하에서 본 출원의 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물) 또는 항-GPC3 항체 모이어티를 인코딩하는 핵산 서열에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산이 삽입되는 벡터를 제공한다.
간략하게 요약하면, 항-GPC3 작제물(예를 들어, 항-GPC3 CAR, 항-GPC3 caTCR) 또는 이의 폴리펩티드 부분을 인코딩하는 천연 또는 합성 핵산에 의한 항-GPC3 작제물 또는 이의 폴리펩티드 부분의 발현은, 핵산이, 예를 들어 프로모터(예를 들어, 림프구-특이적 프로모터) 및 3' 비번역 영역(UTR)을 포함한 5' 및 3' 조절성 요소에 작동가능하게 연결되도록, 핵산을 적절한 발현 벡터 내로 삽입함으로써 달성될 수 있다. 벡터는 진핵생물 숙주 세포에서의 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 전형적인 클로닝 및 발현 벡터는 전사 및 번역 종결자, 개시 서열, 및 원하는 핵산 서열의 발현의 조절에 유용한 프로모터를 포함한다.
본 발명의 핵산은 또한 표준 유전자 전달 프로토콜을 사용하여 핵산 면역화 및 유전자 요법에 사용될 수 있다. 유전자 전달을 위한 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,399,346호, 제5,580,859호, 제5,589,466호를 참조하며, 이들은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 일부 실시 형태에서, 본 발명은 유전자 요법 벡터를 제공한다.
핵산은 다수의 유형의 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 플라스미드, 파지미드(phagemid), 파지 유도체, 동물 바이러스, 및 코스미드(cosmid)를 포함하지만 이로 한정되지 않는 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 특히 관심 대상이 되는 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터, 및 서열화 벡터를 포함한다.
또한, 발현 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)])에, 그리고 다른 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기재되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 및 렌티바이러스를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 기능성인 복제 기점, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및 하나 이상의 선택가능한 마커를 함유한다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO 01/96584호; 국제 특허 출원 공개 WO 01/29058호; 및 미국 특허 제6,326,193호 참조).
다수의 바이러스 기반 시스템이 포유류 세포 내로의 유전자 전달을 위해 개발되어 왔다. 예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 선택된 유전자는 벡터 내로 삽입되고, 당업계에 알려진 기법을 사용하여 레트로바이러스 입자 내에 패키징될 수 있다. 이어서, 재조합 바이러스가 단리되고, 생체내 또는 생체외에서 대상체의 세포에 전달될 수 있다. 다수의 레트로바이러스 시스템이 당업계에 알려져 있다. 일부 실시 형태에서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 다수의 아데노바이러스 벡터가 당업계에 알려져 있다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다. 레트로바이러스, 예컨대 렌티바이러스로부터 유래된 벡터가 장기간 유전자 전달을 달성하기에 적합한 도구인데, 그 이유는, 이들은 도입유전자의 장기간의 안정한 통합 및 딸 세포에서의 그의 증식을 가능하게 하기 때문이다. 렌티바이러스 벡터는, 이들이 비증식성 세포, 예컨대 간세포를 형질도입시킬 수 있다는 점에서, 발암-레트로바이러스, 예컨대 뮤린 백혈병 바이러스로부터 유래된 벡터에 비해 추가된 이점을 갖는다. 이들은 또한 낮은 면역원성이라는 추가된 이점을 갖는다.
추가의 프로모터 요소, 예를 들어 인핸서는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 이들은 출발 부위의 상류에 30 내지 110 bp의 영역 내에 위치되지만, 다수의 프로모터가 마찬가지로 출발 부위의 하류에 기능성 요소를 함유하는 것으로 최근에 밝혀졌다. 프로모터 요소간의 간격은 빈번하게 가요성이어서, 요소들이 서로에 대해 역전되거나 이동될 때 프로모터 기능이 보존된다. 티미딘 키나제(tk) 프로모터에서는, 활성의 감소가 시작되기 전에 프로모터 요소간의 간격이 증가되어 50 bp로 떨어질 수 있다.
적합한 프로모터의 한 예는 전초기 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 서열이다. 이러한 프로모터 서열은 강력한 구성적 프로모터 서열로서, 이것에 작동가능하게 연결된 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 고수준의 발현을 유도할 수 있다. 적합한 프로모터의 다른 예는 연장 인자-1α(EF-1α)이다. 그러나, 다른 구성적 프로모터 서열이 또한 사용될 수 있으며, 이에는 유인원 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스 전초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터뿐만 아니라, 인간 유전자 프로모터, 예컨대 제한 없이, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 및 크레아틴 키나제 프로모터가 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 또한, 본 발명은 구성적 프로모터의 사용으로 제한되어서는 안 된다. 유도성 프로모터가 또한 본 발명의 일부로서 고려된다. 유도성 프로모터의 사용은, 발현이 요구될 때에는 그것에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 켜거나, 또는 발현이 요구되지 않을 때에는 발현을 끌 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예에는 메탈로티오네인 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터, 및 테트라사이클린 프로모터가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
상기에 언급된 바와 같이, 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)의 발현은 유도가능하다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, CAR T 세포, caTCR T 세포)는 본 명세서에 기재된 임의의 유도성 프로모터를 포함한 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 이중특이성 T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, CAR T 세포, caTCR T 세포)에서의 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)의 발현은 이펙터 세포(예를 들어, TCR, CAR, caTCR) 상에서 신호전달 수용체를 통한 신호전달 시에 유도가능하다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산 서열은 NFAT-유래 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시 형태에서, NFAT-유래 프로모터는 NFAT-유래 최소 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산 서열은 IL-2 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
유도성 프로모터
유도성 프로모터의 사용은, 발현이 요구될 때에는 그것에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 켜거나, 또는 발현이 요구되지 않을 때에는 발현을 끌 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 진핵 세포에서 사용하기 위한 예시적인 유도성 프로모터 시스템은 호르몬-조절 요소(예를 들어, 문헌[Mader, S. and White, J. H. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5603-5607] 참조), 합성 리간드-조절 요소(예를 들어, 문헌[Spencer, D. M. et al 1993) Science 262: 1019-1024] 참조), 및 이온화 방사선-조절 요소(예를 들어, 문헌[Manome, Y. et al. (1993) Biochemistry 32: 10607-10613]; 문헌[Datta, R. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1014-10153] 참조)를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 시험관내 또는 생체내 포유류 시스템에서 사용하기 위한 추가의 예시적인 유도성 프로모터 시스템이 문헌[Gingrich et al. (1998) Annual Rev. Neurosci 21:377-405]에 검토되어 있다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자를 발현하는 데 사용하기 위한 유도성 프로모터 시스템은 Tet 시스템이다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자를 발현하는 데 사용하기 위한 유도성 프로모터 시스템은 E. 콜라이(E. coli)로부터의 lac 억제인자 시스템이다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자를 발현하는 데 사용하기 위한 유도성 프로모터 시스템은 NFAT-유래 프로모터이다.
본 발명에 사용하기 위한 예시적인 유도성 프로모터 시스템은 Tet 시스템이다. 그러한 시스템은 문헌[Gossen et al. (1993)]에 의해 기재된 Tet 시스템에 기초한다. 예시적인 실시 형태에서, 관심 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 Tet 작동자(TetO) 부위를 포함하는 프로모터의 제어 하에 있다. 불활성 상태에서는, Tet 억제인자(TetR)가 TetO 부위에 결합하고 프로모터로부터의 전사를 억제할 것이다. 활성 상태에서, 예를 들어 유도제, 예컨대 테트라사이클린(Tc), 안하이드로테트라사이클린, 독시사이클린(Dox), 또는 이들의 활성 유사체의 존재 하에서, 유도제는 TetO로부터의 TetR의 방출을 야기하여, 전사가 일어날 수 있게 한다. 독시사이클린은 1-다이메틸아미노-2,4a,5,7,12-펜타하이드록시-11-메틸-4,6-다이옥소-1,4a,11,11a,12,12a-헥사하이드로테트라센-3-카르복스아미드의 화학명을 갖는 테트라사이클린 패밀리의 항생제의 구성원이다.
일 실시 형태에서, TetR은 포유류 세포, 예를 들어 뮤린 또는 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 대부분의 아미노산은 유전자 코드의 축퇴로 인해 하나 초과의 코돈에 의해 인코딩되어, 핵산에 의해 인코딩된 아미노산 서열의 어떠한 변경 없이도 주어진 핵산의 뉴클레오티드 서열의 실질적인 변이를 가능하게 한다. 그러나, 많은 유기체는 코돈 사용빈도(codon usage)에 있어서 차이를 나타내는데, 이는 또한 "코돈 편향(codon bias)"(즉, 주어진 아미노산을 위한 특정 코돈(들)의 사용에 대한 편향)으로 알려져 있다. 코돈 편향은 종종 특정 코돈에 대한 tRNA의 우세한 종의 존재와 상관되며, 이는 다시 mRNA 번역의 효율을 증가시킨다. 따라서, 특정 유기체(예를 들어, 원핵생물)로부터 유래된 코딩 서열은 코돈 최적화를 통해 상이한 유기체(예를 들어, 진핵생물)에서 개선된 발현을 위해 조정될 수 있다.
Tet 시스템의 다른 구체적인 변형은 하기의 "Tet-Off" 및 "Tet-On" 시스템을 포함한다. Tet-Off 시스템에서는, 전사가 Tc 또는 Dox의 존재 하에서 불활성이다. 그러한 시스템에서는, 테트라사이클린-제어된 전사활성화 단백질(tTA) - 이는 단순 헤르페스 바이러스로부터의 VP16의 강력한 전사활성화 도메인에 융합된 TetR로 구성됨 - 이 테트라사이클린-반응성 프로모터 요소(TRE)의 전사 제어 하에 있는 표적 핵산의 발현을 조절한다. TRE는 프로모터(통상, 인간 사이토메갈로바이러스(hCMV) 전초기 프로모터로부터 유래된 최소 프로모터 서열)에 융합된 TetO 서열 연쇄체로 구성된다. Tc 또는 Dox의 부재 하에서, tTA는 TRE에 결합하고 표적 유전자의 전사를 활성화시킨다. Tc 또는 Dox의 존재 하에서, tTA는 TRE에 결합할 수 없고, 표적 유전자로부터의 발현은 불활성으로 유지된다.
역으로, Tet-On 시스템에서는, 전사가 Tc 또는 Dox의 존재 하에서 활성이다. Tet-On 시스템은 역 테트라사이클린-제어된 전사활성화인자, rtTA에 기초한다. tTA와 마찬가지로, rtTA는 TetR 억제인자 및 VP16 전사활성화 도메인으로 구성된 융합 단백질이다. 그러나, TetR DNA 결합 모이어티에서의 4개의 아미노산 변화는 rtTA의 결합 특성을 변경시켜, 그것이 단지 Dox의 존재 하에서만 표적 도입유전자의 TRE 내의 TetO 서열을 인식할 수 있도록 한다. 따라서, Tet-On 시스템에서는, TRE-조절된 표적 유전자의 전사가 Dox의 존재 하에서만 rtTA에 의해 자극된다.
다른 유도성 프로모터 시스템은 E. 콜라이(E. coli)로부터의 lac 억제인자 시스템이다(문헌[Brown et al., Cell 49:603-612 (1987)] 참조). lac 억제인자 시스템은 lac 작동자(lacO)를 포함하는 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심 폴리뉴클레오티드의 전사를 조절함으로써 기능한다. lac 억제인자(lacR)는 LacO에 결합하고, 이에 따라 관심 폴리뉴클레오티드의 전사를 방지한다. 관심 폴리뉴클레오티드의 발현은 적합한 유도제, 예를 들어 아이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)에 의해 유도된다.
본 발명에 사용하기 위한 다른 예시적인 유도성 프로모터 시스템은 NFAT 시스템이다. 전사 인자의 NFAT 패밀리는 T 세포 활성화의 중요한 조절인자이다. NFAT 반응 요소는, 예를 들어 IL-2 프로모터에서 발견된다(예를 들어, 문헌[Durand, D. et. al., Molec. Cell. Biol. 8, 1715-1724 (1988)]; 문헌[Clipstone, NA, Crabtree, GR. Nature. 1992 357(6380): 695-7]; 문헌[Chmielewski, M., et al. Cancer research 71.17 (2011): 5697-5706]; 및 문헌[Zhang, L., et al. Molecular therapy 19.4 (2011): 751-759] 참조).
폴리펩티드 또는 이의 일부분의 발현을 평가하기 위하여, 세포 내로 도입되는 발현 벡터는 또한 선택가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 둘 모두를 함유하여, 바이러스 벡터를 통해 형질감염시키거나 감염시키고자 하는 세포 집단으로부터의 발현 세포의 확인 및 선택을 용이하게 할 수 있다. 다른 태양에서, 선택가능한 마커는 별개의 DNA 조각 상에서 운반되어 공동-형질감염 절차에 사용될 수 있다. 선택가능한 마커 및 리포터 유전자 둘 모두에는 숙주 세포에서의 발현을 가능하게 하기에 적절한 조절성 서열이 플랭킹될 수 있다. 유용한 선택가능한 마커는, 예를 들어 항생제-저항성 유전자, 예를 들어 neo 등을 포함한다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 확인하는 데 그리고 조절성 서열의 기능성을 평가하는 데 사용된다. 일반적으로, 리포터 유전자는, 수용자 유기체 또는 조직에 존재하지 않거나 그에 의해 발현되지 않고 어떠한 용이하게 검출가능한 특성, 예를 들어 효소 활성에 의해 발현이 나타나는 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은 DNA가 수용자 세포 내로 도입된 후 적합한 시간에 검정된다. 적합한 리포터 유전자는 루시페라제, β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스페라제, 분비 알칼리성 포스파타제, 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[Ui-Tel et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82]). 적합한 발현 시스템은 잘 알려져 있으며, 알려진 기법을 사용하여 제조되거나 상업적으로 입수될 수 있다. 일반적으로, 최고 수준의 리포터 유전자 발현을 나타내는 최소 5' 플랭킹 영역을 갖는 작제물이 프로모터로서 확인된다. 그러한 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결되어, 프로모터-구동 전사를 조절하는 능력에 대하여 작용제를 평가하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 항-GPC3 CAR 및 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자에 따른 항-GPC3 CAR 및/또는 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 핵산은 항-GPC3 CAR의 모든 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 핵산은 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자의 모든 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 핵산은 항-GPC3 CAR 및 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자의 모든 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 핵산 서열 각각은 별개의 벡터 내에 함유된다. 일부 실시 형태에서, 핵산 서열들 중 적어도 일부는 동일한 벡터 내에 함유된다. 일부 실시 형태에서, 핵산 서열들 전부는 동일한 벡터 내에 함유된다. 벡터는, 예를 들어, 포유류 발현 벡터 및 바이러스 벡터(예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 및 렌티바이러스로부터 유래된 것들)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR은 단일 폴리펩티드 사슬을 포함하는 단량체(예를 들어, 항-GPC3 scFv-CAR)이고, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자는 단일 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 폴리펩티드 사슬을 포함하는 단량체(예를 들어, 항-GPC3xCD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)이고, 핵산은 항-GPC3 CAR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제1 핵산 서열, 및 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제2 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 핵산 서열은 제1 벡터 내에 함유되고, 제2 핵산 서열은 제2 벡터 내에 함유된다. 일부 실시 형태에서, 제1 핵산 서열과 제2 핵산 서열은 동일한 벡터 내에 함유된다. 일부 실시 형태에서, 제1 핵산 서열은 제1 프로모터의 제어 하에 있고, 제2 핵산 서열은 제2 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 실시 형태에서, 제1 프로모터 및 제2 프로모터 중 하나 또는 둘 모두는 동일한 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1 프로모터 및 제2 프로모터 중 하나 또는 둘 모두는 상이한 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열 중 하나 또는 둘 모두는 멀티시스트론(multicistronic) 벡터에서 단일 프로모터의 제어 하에서 단일 전사체로서 발현된다. 예를 들어, 문헌[Kim, JH, et al., PLoS One 6(4):e18556, 2011]을 참조한다. 일부 실시 형태에서, 프로모터들 중 하나 또는 둘 모두는 유도성이다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 핵산 서열을 제어하는 프로모터는 유도성이다(예컨대, 항-GPC3 CAR의 활성화를 통해 유도가능하다). 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 NFAT-유래 프로모터이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 항-GPC3 caTCR 및 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자에 따른 항-GPC3 caTCR 및/또는 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 핵산은 항-GPC3 caTCR의 모든 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 핵산은 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자의 모든 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 핵산은 항-GPC3 caTCR 및 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자의 모든 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 핵산 서열 각각은 별개의 벡터 내에 함유된다. 일부 실시 형태에서, 핵산 서열들 중 적어도 일부는 동일한 벡터 내에 함유된다. 일부 실시 형태에서, 핵산 서열들 전부는 동일한 벡터 내에 함유된다. 벡터는, 예를 들어, 포유류 발현 벡터 및 바이러스 벡터(예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 및 렌티바이러스로부터 유래된 것들)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR은 제1 caTCR 폴리펩티드 사슬 및 제2 caTCR 폴리펩티드 사슬을 포함하는 이량체이고, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자는 단일 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 폴리펩티드 사슬을 포함하는 단량체(예를 들어, 항-GPC3xCD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)이고, 핵산은 제1 caTCR 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제1 핵산 서열, 제2 caTCR 사슬을 인코딩하는 제2 핵산 서열, 및 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 제3 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 핵산 서열은 제1 벡터 내에 함유되고, 제2 핵산 서열은 제2 벡터 내에 함유되고, 제3 핵산 서열은 제3 벡터 내에 함유된다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 핵산 서열은 제1 벡터 내에 함유되고, 제3 핵산 서열은 제2 벡터 내에 함유된다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제3 핵산 서열은 제1 벡터 내에 함유되고, 제2 핵산 서열은 제2 벡터 내에 함유된다. 일부 실시 형태에서, 제2 및 제3 핵산 서열은 제1 벡터 내에 함유되고, 제1 핵산 서열은 제2 벡터 내에 함유된다. 일부 실시 형태에서, 제1, 제2, 및 제3 핵산 서열은 동일한 벡터 내에 함유된다. 일부 실시 형태에서, 제1 핵산 서열은 제1 프로모터의 제어 하에 있고, 제2 핵산 서열은 제2 프로모터의 제어 하에 있고, 제3 핵산 서열은 제3 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 실시 형태에서, 제1, 제2, 및 제3 프로모터 중 일부(예컨대, 전부)는 동일한 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1, 제2, 및 제3 프로모터 중 일부(예컨대, 전부)는 상이한 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 제1, 제2, 및 제3 핵산 서열 중 일부(예컨대, 전부)는 멀티시스트론 벡터에서 단일 프로모터의 제어 하에서 단일 전사체로서 발현된다. 예를 들어, 문헌[Kim, JH, et al., PLoS One 6(4):e18556, 2011]을 참조한다. 일부 실시 형태에서, 프로모터들 중 하나 이상은 유도성이다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 폴리펩티드 사슬을 인코딩하는 핵산 서열을 제어하는 프로모터는 유도성이다(예컨대, 항-GPC3 caTCR의 활성화를 통해 유도가능하다). 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 NFAT-유래 프로모터이다.
세포 내로 유전자를 도입하고 발현시키는 방법은 당업계에 알려져 있다. 발현 벡터와 관련하여, 벡터는 당업계의 임의의 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어 포유류, 세균, 효모, 또는 곤충 세포 내로 용이하게 도입될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 물리적, 화학적, 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다.
숙주 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 리포펙션(lipofection), 입자 충격, 현미주사, 전기천공 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생성하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)]을 참조한다. 일부 실시 형태에서, 숙주 세포 내로의 폴리뉴클레오티드의 도입은 인산칼슘 형질감염에 의해 수행된다.
숙주 세포 내로 관심 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터, 그리고 특히 레트로바이러스 벡터는 유전자를 포유류 세포, 예를 들어 인간 세포 내로 삽입하는 방법들 중 가장 널리 사용되는 방법이 되어 왔다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 1형 단순 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,350,674호 및 제5,585,362호를 참조한다.
숙주 세포 내로 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 화학적 수단은 콜로이드성 분산 시스템, 예컨대 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구체, 비드, 및 지질-기반 시스템 - 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀, 및 리포좀을 포함함 - 을 포함한다. 시험관내 및 생체내에서 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드성 시스템은 리포좀(예를 들어, 인공 막 소포)이다.
비-바이러스 전달 시스템이 이용되는 경우, 예시적인 전달 비히클은 리포좀이다. 지질 제형의 사용이 (시험관내, 생체외 또는 생체내에서의) 숙주 세포 내로의 핵산의 도입을 위해 고려된다. 다른 태양에서, 핵산은 지질과 회합될 수 있다. 지질과 회합된 핵산은 리포좀의 수성 내부 내에 캡슐화되거나, 리포좀의 지질 이중층 내에 산재되거나, 리포좀 및 올리고뉴클레오티드 둘 모두와 회합된 연결 분자를 통해 리포좀에 부착되거나, 리포좀 내에 포획되거나, 리포좀과 복합체화되거나, 지질을 함유하는 용액 중에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 배합되거나, 지질 중 현탁액으로서 함유되거나, 미셀 내에 함유되거나 그와 복합체화되거나, 또는 달리 지질과 회합될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 관련 조성물은 용액 중 임의의 특정 구조로 제한되지 않는다. 예를 들어, 이들은 이중층 구조로, 미셀로서, 또는 "붕괴된" 구조로 존재할 수 있다. 이들은 또한 용액 중에 단순히 산재되어, 가능하게는, 크기 또는 형상이 균일하지 않은 응집체를 형성할 수 있다. 지질은 천연 발생 또는 합성 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예를 들어, 지질은 세포질 내에서 천연적으로 발생하는 지방 소적(fatty droplet)뿐만 아니라, 장쇄 지방족 탄화수소 및 이들의 유도체, 예컨대 지방산, 알코올, 아민, 아미노 알코올, 및 알데하이드를 함유하는 화합물 부류를 포함한다.
외인성 핵산을 숙주 세포 내로 도입하거나 또는 달리 세포를 본 발명의 억제제에 노출시키는 데 사용되는 방법에 관계없이, 숙주 세포 내의 재조합 DNA 서열의 존재를 확인하기 위하여, 다양한 검정이 수행될 수 있다. 그러한 검정은, 예를 들어, 당업자에게 잘 알려진 "분자 생물학적" 검정, 예컨대 서던 및 노던 블롯팅, RT-PCR 및 PCR; "생화학적" 검정, 예컨대 특정 펩티드의 존재 또는 부재를 검출하는 검정(예를 들어, 면역학적 수단(ELISA 및 웨스턴 블롯)에 의해 또는 본 발명의 범주 내에 속하는 작용제를 확인하기 위한 본 명세서에 기재된 검정에 의함)을 포함한다.
항-GPC3 작제물 및 항-GPC3 항체 모이어티의 제조
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물 또는 항-GPC3 항체 모이어티는 단일클론 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 CAR 또는 항-GPC3 caTCR이며, 항-GPC3 항체 모이어티(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 scFv)는 단일클론 항체로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 단일클론 항체로부터의 VH 및 VL 도메인, 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 단일클론 항체로부터의 CH1 및 CL 도메인, 또는 이의 변이체를 추가로 포함한다. 단일클론 항체는, 예를 들어, 문헌[Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)] 및 문헌[Sergeeva et al., Blood, 117(16):4262-4272]에 의해 기재된 것들과 같은 하이브리도마 방법을 사용하여, 본 명세서에 그리고 하기 실시예에 기재된 파지 디스플레이 방법을 사용하여, 또는 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조)을 사용하여 제조될 수 있다.
하이브리도마 방법에서는, 햄스터, 마우스, 또는 다른 적절한 숙주 동물이 전형적으로 면역제(immunizing agent)로 면역화되어, 면역제에 특이적으로 결합할 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유인한다. 대안적으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다. 면역제는 관심 단백질의 폴리펩티드 또는 융합 단백질, 또는 적어도 2개의 분자를 포함하는 복합체, 예컨대 펩티드 및 MHC 단백질을 포함하는 복합체를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간 기원의 세포가 요구되는 경우 말초 혈액 림프구("PBL")가 사용되거나, 비인간 포유류 공급원이 요구되는 경우 비장 세포 또는 림프절 세포가 사용된다. 이어서, 림프구를 적합한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 불멸화 세포주와 융합시켜, 하이브리도마 세포를 형성한다. 예를 들어, 문헌[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (New York: Academic Press, 1986), pp. 59-103]을 참조한다. 불멸화 세포주는 통상 형질전환된 포유류 세포, 특히 설치류, 소, 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 통상, 래트 또는 마우스의 골수종 세포주가 사용된다. 하이브리도마 세포는, 바람직하게는 융합되지 않은 불멸화 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지 중에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 모 세포에 효소 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT)가 결여되어 있는 경우, 하이브리도마를 위한 배양 배지는 전형적으로 하이포잔틴, 아미노프테린, 및 티미딘을 포함할 것인데("HAT 배지"), 이들은 HGPRT-결손 세포의 성장을 방지한다.
일부 실시 형태에서, 불멸화 세포주는, 효율적으로 융합하며, 선택된 항체-생성 세포에 의한 항체의 안정한 고수준의 발현을 지지하고, HAT 배지와 같은 배지에 감수성인 것들이다. 일부 실시 형태에서, 불멸화 세포주는 뮤린 골수종 세포주인데, 이는, 예를 들어 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Salk Institute Cell Distribution Center 및 미국 버지니아주 머내서스 소재의 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 획득될 수 있다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 또한 인간 단일클론 항체의 생성을 위해 기재되어 있다(문헌[Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)]; 문헌[Brodeur et al. Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications (Marcel Dekker, Inc.: New York, 1987) pp. 51-63]).
이어서, 하이브리도마 세포가 배양된 배양 배지는 폴리펩티드에 대해 유도된 단일클론 항체의 존재에 대해 검정될 수 있다. 하이브리도마 세포에 의해 생성된 단일클론 항체의 결합 특이성은 면역침전에 의해, 또는 방사면역검정(RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)과 같은 시험관내 결합 검정에 의해 결정될 수 있다. 그러한 기법 및 검정은 당업계에 알려져 있다. 단일클론 항체의 결합 친화도는, 예를 들어 문헌[Scatchard analysis of Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)]에 의해 결정될 수 있다.
원하는 하이브리도마 세포가 확인된 후, 클론은 제한 희석(limiting dilution) 절차에 의해 하위클로닝되고 표준 방법에 의해 성장될 수 있다(문헌[Goding, 상기 참조]). 이러한 목적에 적합한 배양 배지는, 예를 들어 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 및 RPMI-1640 배지를 포함한다. 대안적으로, 하이브리도마 세포는 포유동물 내의 복수(ascites)와 같이 생체내에서 성장될 수 있다.
하위클론에 의해 분비된 단일클론 항체는, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지 또는 복수로부터 단리되거나 정제될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 본 명세서에 기재된 임의의 항-GPC3 작제물에 따르면, 항-GPC3 항체 모이어티는 항체 모이어티 라이브러리(예컨대, scFv 또는 Fab 단편을 제시하는 파지 라이브러리)로부터 선택되는 클론으로부터의 서열을 포함한다. 클론은 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체 단편들에 대한 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고 원하는 결합 특성을 갖는 항체를 위하여 그러한 라이브러리를 스크리닝하기 위한 다양한 방법이 당업계에 알려져 있다. 그러한 방법은, 예를 들어 문헌[Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, N.J., 2001)]에 검토되어 있으며, 예를 들어 문헌[McCafferty et al., Nature 348:552-554]; 문헌[Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991)]; 문헌[Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)]; 문헌[Marks and Bradbury, Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003)]; 문헌[Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)]; 문헌[Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)]; 문헌[Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)]; 및 문헌[Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)]에 추가로 기재되어 있다.
소정의 파지 디스플레이 방법에서는, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리(repertoire)들이 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 개별적으로 클로닝되고, 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합되고, 이어서 이들은 문헌[Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 scFv 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 나타낸다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 작제할 필요 없이 면역원에 대해 고친화성 항체를 제공한다. 대안적으로, 나이브(
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) 레퍼토리를 (예를 들어, 인간으로부터) 클로닝하여, 어떠한 면역화 없이도 광범위한 비-자가 및 또한 자가 항원에 대한 단일 항체 공급원을 제공할 수 있으며, 이는 문헌[Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 의해 기재된 바와 같다. 마지막으로, 나이브 라이브러리는 또한, 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 세그먼트를 클로닝하고, 랜덤 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 고도로 가변적인 CDR3 영역을 인코딩하고 시험관내에서 재배열을 달성함으로써 합성에 의해 제조될 수 있으며, 이는, 문헌[Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 의해 기재된 바와 같다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하고 있는 특허 공보에는, 예를 들어 미국 특허 제5,750,373호 및 미국 특허 출원 공개 제2005/0079574호, 제2005/0119455호, 제2005/0266000호, 제2007/0117126호, 제2007/0160598호, 제2007/0237764호, 제2007/0292936호, 및 제2009/0002360호가 포함된다.
항-GPC3 작제물은 파지 디스플레이를 사용하여 표적 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적인 항-GPC3 항체 모이어티에 대한 라이브러리를 스크리닝하여 제조될 수 있다. 라이브러리는 적어도 1x109개(예컨대, 적어도 약 1x109, 2.5x109, 5x109, 7.5x109, 1x1010, 2.5x1010, 5x1010, 7.5x1010, 또는 1x1011개 중 어느 하나)의 고유 인간 항체 단편의 다양성을 갖는 인간 scFv 파지 디스플레이 라이브러리일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 라이브러리는, 모든 인간 중쇄 및 경쇄 하위패밀리를 포함하는, 건강한 공여자로부터의 인간 PMBC 및 비장으로부터 추출된 DNA로부터 작제된 나이브 인간 라이브러리이다. 일부 실시 형태에서, 라이브러리는 다양한 질병을 가진 환자, 예컨대 자가면역 질병을 가진 환자, 암 환자, 및 감염성 질병을 가진 환자로부터 단리된 PBMC로부터 추출된 DNA로부터 작제된 나이브 인간 라이브러리이다. 일부 실시 형태에서, 라이브러리는 반합성 인간 라이브러리인데, 여기서 중쇄 CDR3은 완전히 무작위화되며, (시스테인을 제외한) 모든 아미노산은 임의의 주어진 위치에 존재할 가능성이 동일하다(예를 들어, 문헌[Hoet, R.M. et al., Nat. Biotechnol. 23(3):344-348, 2005] 참조). 일부 실시 형태에서, 반합성 인간 라이브러리의 중쇄 CDR3은 약 5 내지 약 24개(예컨대, 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24개 중 어느 하나)의 아미노산 길이를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 라이브러리는 완전-합성 파지 디스플레이 라이브러리이다. 일부 실시 형태에서, 라이브러리는 비인간 파지 디스플레이 라이브러리이다.
높은 친화도로 표적 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 결합하는 파지 클론은 고체 지지체(예컨대, 용액 패닝(solution panning)의 경우 비드, 또는 세포 패닝의 경우 포유류 세포)에 결합된 표적 GPC3에 대한 파지의 반복적 결합을 수행한 후, 결합되지 않은 파지 제거 및 특이적으로 결합된 파지의 용리를 수행함으로써 선택될 수 있다. 용액 패닝의 예에서, GPC3 폴리펩티드는 고체 지지체에 대한 고정화를 위해 비오티닐화될 수 있다. 비오티닐화 GPC3을 파지 라이브러리 및 고체 지지체, 예컨대 스트렙타비딘-접합된 DYNABEADS® M-280과 혼합하고, 이어서 GPC3-파지-비드 복합체를 단리한다. 이어서, 결합된 파지 클론을 용리시키고, 이를 사용하여, 발현 및 정제에 적절한 숙주 세포, 예컨대 E. 콜라이 XL1-Blue를 감염시킨다. 세포 패닝의 예에서는, 세포 표면 상에 GPC3을 과발현하는 SK-Hep1 세포를 파지 라이브러리와 혼합하고, 이후에 세포를 수집하고, 결합된 클론을 용리시키고, 이를 사용하여, 발현 및 정제에 적절한 숙주 세포를 감염시킨다(모두 실시예 참조). 패닝은, 표적 GPC3에 특이적으로 결합하는 파지 클론을 풍부화하기 위해, 용액 패닝, 세포 패닝, 또는 둘 모두의 조합에 대해 다회(예컨대, 약 2, 3, 4, 5, 6회 또는 그 이상 중 어느 하나)의 라운드 동안 수행될 수 있다. 풍부화된 파지 클론은, 예를 들어 ELISA 및 FACS를 포함한 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 표적 GPC3에 대한 특이적 결합에 대해 시험될 수 있다.
단일클론 항체는 또한 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 것들과 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 단일클론 항체를 인코딩하는 DNA는 통상적인 절차를 사용하여(예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리되고 서열분석될 수 있다. 전술된 바와 같은 하이브리도마 세포 또는 본 발명의 GPC3-특이적 파지 클론은 그러한 DNA의 공급원으로서의 역할을 할 수 있다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터 내로 넣어질 수 있으며, 이어서 이는, 달리 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 숙주 세포, 예컨대 유인원 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포 내로 형질감염되어 재조합 숙주 세포 내에서의 단일클론 항체의 합성을 획득한다. DNA는 또한, 예를 들어 상동성 비인간 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 및/또는 프레임워크 영역에 대한 코딩 서열을 치환함으로써(미국 특허 제4,816,567호; 문헌[Morrison et al., 상기 참조]) 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유적으로 결합함으로써 변형될 수 있다. 그러한 비-면역글로불린 폴리펩티드는 본 발명의 항체의 불변 도메인으로 치환될 수 있거나, 또는 본 발명의 항체의 하나의 항원-결합 부위의 가변 도메인으로 치환되어 키메라 2가 항체를 생성할 수 있다.
항체는 1가 항체일 수 있다. 1가 항체의 제조 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 한 가지 방법은 면역글로불린 경쇄 및 변형된 중쇄의 재조합 발현을 수반한다. 중쇄는 중쇄 가교결합을 방지하도록 일반적으로 Fc 영역 내의 임의의 지점에서 절단된다. 대안적으로, 관련 시스테인 잔기는 가교결합을 방지하도록 결실되거나 다른 아미노산 잔기로 치환된다.
시험관내 방법이 또한 1가 항체를 제조하는 데 적합하다. 단편, 특히 Fab 단편을 생성하기 위한 항체의 분해(digestion)는 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 달성될 수 있다.
원하는 결합 특이성(항체-항원-결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인이 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합될 수 있다. 바람직하게는, 융합체는 힌지, CH2, 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역(CH1)이 융합체들 중 적어도 하나에 존재한다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및 필요에 따라 면역글로불린 경쇄를 인코딩하는 DNA가 별개의 발현 벡터 내로 삽입되고, 적합한 숙주 유기물 내로 공동형질감염된다. 이중특이성 항체의 생성에 대한 더 상세한 내용에 관해서는, 예를 들어 문헌[Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986)]을 참조한다.
인간 항체 및 인간화 항체
항-GPC3 작제물(예를 들어, 항-GPC3 CAR 또는 caTCR) 또는 항-GPC3 항체 모이어티는 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있다. 비인간(예를 들어, 뮤린) 항체 모이어티의 인간화 형태는 비인간 면역글로불린으로부터 유래되는 최소한의 서열을 전형적으로 함유하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬 또는 이들의 단편 (예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2, scFv, 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 인간화 항체 모이어티는, 수용자의 CDR로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도, 및 결합능(capacity)을 갖는 비인간 종(공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트, 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 면역글로불린, 면역글로불린 사슬, 또는 이들의 단편(수용자 항체)을 포함한다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 잔기가 상응하는 비인간 잔기에 의해 대체된다. 인간화 항체 모이어티는 또한, 수용자 항체 모이어티 또는 유입된(imported) CDR 또는 프레임워크 서열 어느 곳에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체 모이어티는 적어도 하나, 그리고 전형적으로는 2개의, 실질적으로 모든 가변 도메인을 포함할 수 있으며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비인간 면역글로불린의 것들에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 것들이다. 예를 들어, 문헌[Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986)]; 문헌[Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988)]; 문헌[Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)]을 참조한다.
일반적으로, 인간화 항체 모이어티는 비인간 공급원으로부터 내부에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 종종 "유입" 잔기로 지칭되는데, 이는 전형적으로 "유입" 가변 도메인으로부터 받아들여진다. 일부 실시 형태에 따르면, 인간화는 Winter 및 그 동료들의 방법에 따라 본질적으로 수행될 수 있는데(문헌[Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986)]; 문헌[Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988)]; 문헌[Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)]), 이는, 설치류 CDR 또는 인간 항체 모이어티의 상응하는 서열에 대한 CDR 서열을 치환시킴으로써 행해진다. 따라서, 그러한 "인간화" 항체 모이어티는 비인간 종들로부터의 상응하는 서열에 의해 온전한 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적게 치환된 항체 모이어티(미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제로, 인간화 항체 모이어티는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체 내의 유사 부위 유래의 잔기로 치환된 인간 항체 모이어티이다.
인간화에 대한 대안으로서, 인간 항체 모이어티가 생성될 수 있다. 예를 들어, 면역화 시에 내인성 면역글로불린 생성의 부재 하에서 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성할 수 있는 유전자도입 동물(예를 들어, 마우스)을 생성하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 배선(germ-line) 돌연변이 마우스에서의 항체 중쇄 결합 영역(JH) 유전자의 동형접합성 결실은 내인성 항체 생성의 완전한 억제를 가져오는 것으로 기재되어 있다. 인간 배선 면역글로불린 유전자 배열을 그러한 배선 돌연변이 마우스 내로 전달하면, 항원 시험투여 시에 인간 항체가 생성될 것이다(예를 들어, 문헌[Jakobovits et al., PNAS USA, 90:2551 (1993)]; 문헌[Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)]; 문헌[Bruggemann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993)]; 미국 특허 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,591,669호; 제5,545,807호; 및 국제 특허 출원 공개 WO 97/17852호 참조). 대안적으로, 인간 항체는 유전자도입 동물, 예를 들어 내인성 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 마우스 내로 인간 면역글로불린 유전자좌를 도입하여 제조될 수 있다. 항원 시험투여 시에, 인간 항체 생성이 관찰되는데, 이는 유전자 재배열, 조립(assembly), 및 항체 레퍼토리를 포함하여 모든 점에서 인간에서 관찰되는 것과 매우 흡사하다. 이러한 접근법은, 예를 들어 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 및 제5,661,016호, 및 문헌[Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)]; 문헌[Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994)]; 문헌[Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994)]; 문헌[Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996)]; 문헌[Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996)]; 문헌[Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 시험관내 활성화된 B 세포에 의해(미국 특허 제5,567,610호 및 제5,229,275호 참조) 또는 파지 디스플레이 라이브러리를 포함한 당업계에 알려진 다양한 기법을 사용하여 생성될 수 있다(문헌[Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)]; 문헌[Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]). Cote 등 및 Boerner 등의 기법이 또한 인간 단일클론 항체의 제조를 위해 이용가능하다(문헌[Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)] 및 문헌[Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)]).
다중특이성 항체
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물(예를 들어, 단리된 항-GPC3 작제물)은 다중특이성 항체(예를 들어, 탠덤 다이-scFv 이중특이성 항-GPC3 항체)이다. 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항체를 제조하는 데 적합한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 2개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 동시발현에 기초한 이중특이성 항체의 생성을 들 수 있으며, 여기서는 2개의 각각의 쌍이 상이한 특이성을 가지며, 회합 시에 이종이량체성 항체가 얻어진다(예를 들어, 문헌[Milstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)]; 국제 특허 출원 공개 WO 93/08829호, 및 문헌[Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)] 참조). 면역글로불린 중쇄와 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마(쿼드로마(quadroma))는 10개의 상이한 항체 분자들의 잠재적 혼합물을 생성하며, 이들 중 단지 하나만이 정확한 이중특이성 구조를 갖는다. 정확한 분자의 정제는 친화성 크로마토그래피 단계에 의해 통상 달성된다. 유사한 절차가 국제 특허 출원 공개 WO 93/08829호 및 문헌[Traunecker et al., EMBO, 10: 3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다. 대안적으로, 중쇄와 경쇄의 조합은 종-제한된 쌍형성(species-restricted pairing)을 이용함으로써 유도될 수 있고(예를 들어, 문헌[Lindhofer et al., J. Immunol., 155:219-225 (1995)] 참조), 중쇄들의 쌍형성은 CH3 도메인의 "노브-인투-홀" 조작의 사용에 의해 유도될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,731,168호; 문헌[Ridgway et al., Protein Eng., 9(7):617-621 (1996)] 참조). 다중특이성 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체성 분자를 제조하기 위하여 정전기 스티어링 효과(electrostatic steering effect)를 조작함으로써 제조될 수 있다(예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO 2009/089004A1호 참조). 또 다른 방법에서는, 제어된 Fab-아암 교환에 의해 안정한 이중특이성 항체가 생성될 수 있는데, 여기서는 CH3 도메인 내에 매칭된 점 돌연변이 및 별개의 항원 특이성을 갖는 2개의 모 항체가 환원성 조건에서 혼합되어 분리, 재조립, 및 재산화를 가능하게 하여 고도로 순수한 이중특이성 항체를 형성한다(문헌[Labrigin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 110(13):5145-5150 (2013)]). 중쇄/경쇄 쌍의 혼합물을 포함하는 그러한 항체는 본 명세서에서 "이종다량체성 항체"로도 지칭된다.
상이한 특이성을 갖는 항체들 또는 이의 항원-결합 단편들은 또한 화학적으로 가교결합되어 다중특이성 이종접합체 항체를 생성할 수 있다. 예를 들어, 각각 상이한 항원에 대해 특이성을 갖는 2개의 F(ab')2 분자가 화학적으로 연결될 수 있다(문헌[Pullarkat et al., Trends Biotechnol., 48:9-21 (1999)]). 그러한 항체는, 예를 들어 면역 시스템 세포를 원치 않는 세포에 표적화시키는 데(미국 특허 제4,676,980호), 그리고 HIV 감염의 치료를 위해 제안되어 있다(국제 특허 출원 공개 WO 91/00360호; 국제 특허 출원 공개 WO 92/200373호; 유럽 특허 EP 03089호). 항체는, 가교결합제의 사용을 포함한 합성 단백질 화학에서 알려진 방법을 사용하여 시험관내에서 제조될 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 면역독소는 이황화물-교환 반응을 사용하여, 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 작제될 수 있다. 이러한 목적에 적합한 시약의 예에는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트, 및, 예를 들어 미국 특허 제4,676,980호에 개시된 것들이 포함된다.
일부 실시 형태에서, 재조합 DNA 기법을 사용하여 다중특이성 항체가 제조될 수 있다. 예를 들어, 2개의 scFv를 융합함으로써, 예컨대 펩티드 링커를 통해 이들을 융합함으로써 이중특이성 항체가 조작되어, 탠덤 scFv를 생성할 수 있다. 탠덤 scFv의 한 예는 이중특이성 T 세포 인게이저이다. 이중특이성 T 세포 인게이저는 항-CD3 scFv를 표적 세포의 표면 항원, 예컨대 GPC3에 특이적인 scFv에 연결시킴으로써 제조되며, 그 결과 표적 세포(예를 들어, HCC 세포)로의 T 세포의 방향전환을 가져온다(문헌[Mack et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 92:7021-7025 (1995)]; 문헌[Brischwein et al., Mol. Immunol., 43(8):1129-1143 (2006)]). 2개의 가변 도메인 사이의 펩티드 링커의 길이를 단축시킴으로써, 이들은 자기-조립(self-assembling)이 방지되고, 제2 폴리펩티드 상의 도메인과 강제적으로 쌍을 형성할 수 있게 되어, 다이아바디(Db)로 불리는 콤팩트한 이중특이성 항체가 생성될 수 있다(문헌[Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90:6444-6448 (1993)]). Db의 2개의 폴리펩티드 각각은 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이에 쌍을 형성할 수 있게 하기에는 너무 짧은 링커에 의해 VL에 연결된 VH를 포함한다. 따라서, 하나의 폴리펩티드의 VH 및 VL 도메인은 다른 하나의 폴리펩티드의 상보적 VL 및 VH 도메인과 강제적으로 쌍을 형성하게 되며, 그럼으로써 2개의 항원-결합 부위가 형성된다. 이러한 포맷의 변형에서는, 2개의 폴리펩티드가 다른 펩티드 링커에 의해 연결되어, 단일쇄 다이아바디(scDb)가 생성된다. Db 포맷의 또 다른 변형에서는, 각각의 폴리펩티드의 C-말단에서 시스테인 잔기들 사이에 이황화물 결합을 도입함으로써 이중-친화성 재표적화(DART) 이중특이성 항체가 생성될 수 있으며, 이때 각각의 폴리펩티드는 선택적으로, C-말단 시스테인 잔기 앞에, 원하는 이종이량체성 구조의 조립을 구동시키는 도메인을 포함한다(문헌[Veri et al., Arthritis Rheum., 62(7):1933-1943 (2010)] 참조). 2개의 단일클론 항체의 표적-결합 가변 도메인이 천연 발생 링커를 통해 조합되어 4가 이중특이성 항체를 생성하는 이중-가변-도메인 면역글로불린(DVD-Ig™)이 또한 당업계에 알려져 있다(문헌[Gu and Ghayur, Methods Enzymol., 502:25-41 (2012)]). 또 다른 포맷에서는, 인간 cAMP-의존성 단백질 키나제(PKA)의 조절성 하위단위로부터 유래된 펩티드(DDD2)와 인간 A 키나제 앵커 단백질(AKAP)의 고착 도메인으로부터 유래된 펩티드(AD2)의 이량체화를 이용함으로써 독 앤드 락(DNL) 이중특이성 항체가 제조된다(문헌[Rossi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 103:6841-6846 (2006)]).
이중특이성 항체 단편을 재조합 세포 배양물로부터 직접 제조하고 단리하기 위한 다양한 기법이 또한 기재되어 있다. 예를 들어, 이중특이성 항체는 류신 지퍼를 사용하여 생성되어 왔다(문헌[Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)]). 이 방법은 또한 항체 동종이량체의 생성에 이용될 수 있다.
항-GPC3 변이체
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 제공된 항-GPC3 작제물(예를 들어, 항-GPC3 전장 항체)의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 내로 적절한 변형을 도입함으로써 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형에는, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환이 포함된다. 최종 작제물이 원하는 특성, 예를 들어 항원-결합성을 갖기만 한다면, 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합이 최종 작제물에 획득되도록 할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항-GPC3 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이생성에 대한 관심 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 아미노산 치환이 관심 항체 내로 도입될 수 있고, 생성물은 원하는 활성, 예를 들어 보유된/개선된 항원 결합성, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC를 위해 스크리닝될 수 있다.
보존적 치환이 하기 표 2에 나타나 있다.
[표 2]
Figure pct00018
아미노산은 공통된 측쇄 특성에 따라 상이한 부류로 그룹화될 수 있다:
a. 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
b. 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
c. 산성: Asp, Glu;
d. 염기성: His, Lys, Arg;
e. 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
f. 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.
예시적인 치환 변이체는 친화성 성숙 항체 모이어티인데, 이는, 예를 들어 파지 디스플레이-기반 친화성 성숙 기법을 사용하여 편리하게 생성될 수 있다. 간략하게 말하면, 하나 이상의 CDR 잔기를 돌연변이시키고, 변이 항체 모이어티를 파지 상에 디스플레이하고, 특정 생물학적 활성(예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다. 예를 들어 항체 모이어티 친화도를 개선하기 위해, HVR에서 변경(예를 들어, 치환)이 이루어질 수 있다. 그러한 변경은 HVR "빈발부위(hotspot)", 즉 체세포 성숙 과정 동안 고빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 인코딩된 잔기(예를 들어, 문헌[Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)] 참조), 및/또는 특이성 결정 잔기(SDR)에서 이루어질 수 있으며, 이때 생성된 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화도에 대해 시험된다. 2차 라이브러리로부터의 작제 및 재선택에 의한 친화성 성숙은, 예를 들어 문헌[Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))]에 기재되어 있다.
친화성 성숙의 일부 실시 형태에서, 임의의 다양한 방법(예를 들어, 오류-유발(error-prone) PCR, 사슬 셔플링(chain shuffling), 또는 올리고뉴클레오티드-유도 돌연변이생성)에 의해 성숙을 위해 선택된 가변 유전자 내로 다양성이 도입된다. 이어서, 2차 라이브러리를 생성한다. 이어서, 라이브러리를 스크리닝하여 원하는 친화도를 갖는 임의의 항체 모이어티 변이체를 확인한다. 다양성을 도입하기 위한 다른 방법은 HVR-유도 접근법을 수반하는데, 여기서는 몇몇 HVR 잔기(예를 들어, 한 번에 4 내지 6개의 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 관여하는 HVR 잔기는, 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이생성 또는 모델링을 사용하여 특이적으로 확인될 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3이 특히 종종 표적화된다.
일부 실시 형태에서, 치환, 삽입, 또는 결실이 하나 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있는데, 이는, 그러한 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한에 있어서이다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예를 들어, 본 명세서에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에서 이루어질 수 있다. 그러한 변경은 HVR "빈발부위" 또는 SDR의 외부에서 행해질 수 있다. 상기에 제공된 변이 VH 및 VL 서열의 일부 실시 형태에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 또는 1, 2, 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이생성을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 문헌[Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같은 "알라닌 스캐닝 돌연변이생성"으로 불린다. 이 방법에서는, 표적 잔기 또는 표적 잔기 집단(예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys, 및 glu)을 확인하고, 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 대체하여 항체와 항원의 상호작용에 영향을 주는지의 여부를 결정한다. 초기 치환에 대해 기능적 감수성을 보여준 아미노산 위치에서 추가의 치환이 도입될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 결정하여 항체와 항원 사이의 접점을 확인할 수 있다. 그러한 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기는 치환을 위한 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체는 원하는 특성을 함유하는지의 여부를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 길이가 1개인 잔기부터 100개 이상인 잔기를 함유하는 폴리펩티드에까지 이르는 범위의 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합체뿐만 아니라, 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체에는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드 또는 효소(예를 들어, ADEPT의 경우)에 대한 항체의 N- 또는 C-말단 융합체가 포함된다.
Fc 영역 변이체
일부 실시 형태에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본 명세서에 제공된 전장 항-GPC3 항체 또는 항-GPC3 Fc 융합 단백질의 Fc 영역 내로 도입됨으로써, Fc 영역 변이체를 생성할 수 있다. 일부 실시 형태에서, Fc 영역 변이체는 향상된 ADCC 이펙터 기능을 갖는데, 이는 Fc 수용체(FcR)에 대한 결합과 종종 관련되어 있다. 일부 실시 형태에서, Fc 영역 변이체는 감소된 ADCC 이펙터 기능을 갖는다. Fc 서열에 대한 변화 또는 돌연변이가 이펙터 기능을 변경시킬 수 있는 예가 많이 있다. 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO 00/42072호 및 문헌[Shields et al. J Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)]은 FcR에 대한 결합이 개선되거나 감소된 항체 변이체를 기재한다. 이러한 공보의 내용은 구체적으로 본원에 참고로 명확하게 포함된다.
항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)은 종양 세포에 대한 치료적 항체의 작용 기전이다. ADCC는 면역 시스템의 이펙터 세포가 특이적 항체(예를 들어, 항-GPC3 항체)에 의해 결합된 막-표면 항원을 갖는 표적 세포(예를 들어, 암 세포)를 능동적으로 용해시키는 세포-매개 면역 방어이다. 전형적인 ADCC는 항체에 의한 NK 세포의 활성화를 수반한다. NK 세포는 Fc 수용체인 CD16을 발현한다. 이 수용체는 표적 세포의 표면에 결합된 항체의 Fc 부분을 인식하고 그것에 결합한다. NK 세포의 표면 상의 가장 일반적인 Fc 수용체는 CD16 또는 FcγRIII으로 불린다. 항체의 Fc 영역에 대한 Fc 수용체의 결합은 NK 세포 활성화, 세포용해 과립의 방출 및 그 결과로 인한 표적 세포 아폽토시스를 가져온다. 종양 세포 사멸에 대한 ADCC의 기여는 고친화성 FcR로 형질감염된 NK-92 세포를 사용하는 특정 시험으로 측정될 수 있다. 결과는 FcR을 발현하지 않는 야생형 NK-92 세포와 대비하여 나타낸다.
일부 실시 형태에서, 본 발명은 전부는 아니지만 일부 이펙터 기능을 갖는 Fc 영역을 포함하는 항-GPC3 작제물 변이체(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물 변이체)를 고려하며, Fc 영역은 생체내에서의 항-GPC3 작제물의 반감기가 중요하지만 소정의 이펙터 기능(예컨대, CDC 및 ADCC)이 불필요하거나 유해한 응용에 바람직한 후보가 되게 한다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위하여 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정이 수행될 수 있다. 예를 들어, 항체에 FcγR 결합이 결여되어 있지만(이에 따라, ADCC 활성이 결여되어 있을 가능성이 높음), FcRn 결합 능력을 보유하는 것을 보장하기 위해 Fc 수용체(FcR) 결합 검정이 수행될 수 있다. ADCC를 매개하기 위한 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈세포 상에서의 FcR 발현은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-492 (1991)]의 464 페이지의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적인 예가 미국 특허 제5,500,362호(예를 들어, 문헌[Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)] 참조) 및 문헌[Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)]; 미국 특허 제5,821,337호(문헌[Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기재되어 있다. 대안적으로, 비방사성 검정 방법이 사용될 수 있다(예를 들어, 유세포측정을 위한 ACTI™ 비방사성 세포독성 검정(미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재의 CellTechnology, Inc.; 및 CytoTox 96™ 비방사성 세포독성 검정(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 Promega)). 그러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌[Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다. 항체가 C1q에 결합할 수 없고 이에 따라 CDC 활성이 결여되어 있음을 확인하기 위하여 C1q 결합 검정이 또한 수행될 수 있다. 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO 2006/029879호 및 WO 2005/100402호에서 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, CDC 검정이 수행될 수 있다(예를 들어, 문헌[Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]; 문헌[Cragg, M. S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)]; 및 문헌[Cragg, M. S. and M. J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). FcRn 결합 및 생체내 제거율(clearance)/반감기 결정이 또한 당업계에 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있다(예를 들어, 문헌[Petkova, S. B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)] 참조).
이펙터 기능이 감소된 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것들을 포함한다(미국 특허 제6,737,056호). 그러한 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함하며, 이에는 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 이른바 "DANA" Fc 돌연변이체가 포함된다(미국 특허 제7,332,581호).
FcR에 대한 결합이 개선되거나 감소된 소정의 항체 변이체가 기재되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,737,056호; 국제 특허 출원 공개 WO 2004/056312호, 및 문헌[Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)] 참조).
일부 실시 형태에서, ADCC를 개선하는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물, 예를 들어 항-GPC3 Fc 융합 단백질, 전장 항-GPC3 항체) 변이체가 제공된다. 일부 실시 형태에서, 변이체 Fc 영역은 ADCC를 개선하는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하며, 치환은 변이체 Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334(잔기의 EU 넘버링)에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물(예를 들어, 전장 항-GPC3 항체) 변이체는 그의 변이체 Fc 영역에서 하기 아미노산 치환을 포함한다: S298A, E333A 및 K334A.
일부 실시 형태에서, 변경된(즉, 개선되거나 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 가져오는 변경이 Fc 영역에서 이루어지며, 이는, 예를 들어 미국 특허 제6,194,551호, 국제 특허 출원 공개 WO 99/51642호, 및 문헌[Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]에 기재된 바와 같다.
일부 실시 형태에서, 반감기를 증가시키고/시키거나 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합을 개선하는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 변이체 Fc 영역을 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물, 예를 들어 항-GPC3 Fc 융합 단백질, 전장 항-GPC3 항체) 변이체가 제공된다. 증가된 반감기 및 FcRn에 대한 개선된 결합을 갖는 항체가 미국 특허 출원 공개 제2005/0014934A1호(Hinton et al.)에 기재되어 있다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선하는 하나 이상의 치환이 내부에 존재하는 Fc 영역을 포함한다. 그러한 Fc 변이체는 하기 Fc 영역 잔기들 중 하나 이상에서 치환을 갖는 것들을 포함한다: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434(예를 들어, Fc 영역 잔기 434의 치환)(미국 특허 제7,371,826호).
또한, Fc 영역 변이체의 다른 예에 관해서는 문헌[Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 제5,648,260호; 미국 특허 제5,624,821호; 및 국제 특허 출원 공개 WO 94/29351호를 참조한다.
본 명세서에 기재된 임의의 Fc 변이체 또는 이들의 조합을 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물, 예를 들어 항-GPC3 Fc 융합 단백질, 전장 항-GPC3 항체)이 고려된다.
글리코실화 변이체
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 제공된 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물, 예를 들어 항-GPC3 Fc 융합 단백질, 전장 항-GPC3 항체)은 항-GPC3 작제물이 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 감소시키도록 변경된다. 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 항-GPC3 작제물 또는 이의 폴리펩티드 부분의 아미노산 서열을 변경시킴으로써 항-GPC3 작제물에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실이 편리하게 달성될 수 있다.
항-GPC3 작제물이 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물은 변경될 수 있다. 포유류 세포에 의해 생성되는 천연 항체는 전형적으로 분지형 바이안테나리 올리고당을 포함하며, 이것은 일반적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-결합에 의해 부착되어 있다. 예를 들어, 문헌[Wright et al., TIBTECH 15:26-32 (1997)]을 참조한다. 올리고당은 다양한 탄수화물, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코사민(GlcNAc), 갈락토스, 및 시알산뿐만 아니라, 바이안테나리 올리고당 구조의 "줄기(stem)" 내의 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 소정의 개선된 특성을 갖는 항-GPC3 작제물 변이체를 생성하기 위하여, 본 발명의 항-GPC3 작제물에서의 올리고당의 변형이 이루어질 수 있다.
Fc의 CH2 도메인에 부착된 N-글리칸은 이종이다. CHO 세포에서 생성된 항체 또는 Fc 융합 단백질은 푸코실트랜스퍼라제 활성에 의해 푸코실화된다. 문헌[Shoji-Hosaka et al., J. Biochem. 2006, 140:777- 83]을 참조한다. 통상적으로, 작은 백분율의 천연 발생 어푸코실화된(afucosylated) IgG가 인간 혈청에서 검출될 수 있다. Fc의 N-글리코실화는 FcγR에 결합하는 데 중요하며; N-글리칸의 어푸코실화는 FcγRIIIa에 대한 Fc의 결합 능력을 증가시킨다. 증가된 FcγRIIIa 결합은 ADCC를 향상시킬 수 있으며, 이는 세포독성이 바람직한 소정의 항체 치료적 응용에 유리할 수 있다.
일부 실시 형태에서, Fc-매개 세포독성이 바람직하지 않은 경우, 향상된 이펙터 기능은 해로울 수 있다. 일부 실시 형태에서, Fc 단편 또는 CH2 도메인은 글리코실화되지 않는다. 일부 실시 형태에서, CH2 도메인 내의 N-글리코실화 부위는 글리코실화를 방지하도록 돌연변이된다.
일부 실시 형태에서, Fc 영역에 부착된 탄수화물 구조가 감소된 푸코스를 갖거나 푸코스가 결여되어 있어서 ADCC 기능을 개선할 수 있는, Fc 영역을 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물, 예를 들어 항-GPC3 Fc 융합 단백질, 전장 항-GPC3 항체) 변이체가 제공된다. 구체적으로는, 야생형 CHO 세포에서 생성된 동일한 항-GPC3 작제물 상의 푸코스의 양에 비해 감소된 푸소스를 갖는 항-GPC3 작제물이 본 명세서에서 고려된다. 즉, 이들은, 천연 CHO 세포(예를 들어, 천연 글리코실화 패턴을 생성하는 CHO 세포, 예컨대 천연 FUT8 유전자를 함유하는 CHO 세포)에 의해 생성되는 경우에 달리 가지게 될 것보다 더 낮은 양의 푸코스를 갖는 것을 특징으로 한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은, 그 위에 존재하는 N-연결된 글리칸의 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 5% 미만이 푸코스를 구성하는 것이다. 예를 들어, 그러한 항-GPC3 작제물에서의 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은, 그 위에 존재하는 N-연결된 글리칸의 어느 것도 푸코스를 포함하지 않는 것이며, 즉 이 경우에 항-GPC3 작제물은 완전히 푸코스가 없는 상태이거나, 또는 푸코스를 갖지 않거나 어푸코실화된다. 푸코스의 양은, 예를 들어 국제 특허 출원 공개 WO 2008/077546호에 기재된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분석에 의해 측정될 때, Asn297에 부착된 모든 당구조(예를 들어, 복합, 혼성, 및 고 만노스 구조)의 합계에 대하여, Asn297에서의 당 사슬 내의 푸코스의 평균량을 계산함으로써 결정된다. Asn297은 Fc 영역 내의 대략 위치 297(Fc 영역 잔기의 EU 넘버링)에 위치된 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; Asn297은 또한 항체의 미소한 서열 변이로 인해 위치 297의 상류 또는 하류로 약 ±3 아미노산에, 즉 위치 294와 300 사이에 위치될 수 있다. 그러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2003/0157108호(Presta, L.); 미국 특허 출원 공개 제2004/0093621호(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)를 참조한다. "탈푸코실화된" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체와 관련된 간행물의 예에는 미국 특허 출원 공개 제2003/0157108호; 국제 특허 출원 공개 WO 2000/61739호; 국제 특허 출원 공개 WO 2001/29246호; 미국 특허 출원 공개 제2003/0115614호; 미국 특허 출원 공개 제2002/0164328호; 미국 특허 출원 공개 제2004/0093621호; 미국 특허 출원 공개 제2004/0132140호; 미국 특허 출원 공개 제2004/0110704호; 미국 특허 출원 공개 제2004/0110282호; 미국 특허 출원 공개 제2004/0109865호; 국제 특허 출원 공개 WO 2003/085119호; 국제 특허 출원 공개 WO 2003/084570호; 국제 특허 출원 공개 WO 2005/035586호; 국제 특허 출원 공개 WO 2005/035778호; 국제 특허 출원 공개 WO 2005/053742호; 국제 특허 출원 공개 WO 2002/031140호; 문헌[Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)]; 문헌[Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]이 포함된다. 탈푸코실화된 항체를 생성할 수 있는 세포주의 예에는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포(문헌[Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; 미국 특허 출원 공개 제2003/0157108 A1호, Presta, L; 및 국제 특허 출원 공개 WO 2004/056312 A1호, Adams et al., 특히 실시예 11에서), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 α-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포(예를 들어, 문헌[Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]; 문헌[Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)]; 및 국제 특허 출원 공개 WO2003/085107호 참조)가 포함된다.
이등분된 올리고당을 갖는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물, 예를 들어 항-GPC3 Fc 융합 단백질, 전장 항-GPC3 항체) 변이체가 추가로 제공되며, 예를 들어 여기서는 항-GPC3 작제물의 Fc 영역에 부착된 바이안테나리 올리고당이 GlcNAc에 의해 이등분되어 있다. 그러한 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물, 예를 들어 항-GPC3 Fc 융합 단백질, 전장 항-GPC3 항체) 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 그러한 항체 변이체의 예는, 예를 들어 국제 특허 출원 공개 WO 2003/011878호(Jean-Mairet et al.); 미국 특허 제6,602,684호(Umana et al.); 미국 특허 출원 공개 제2005/0123546호(Umana et al.), 및 문헌[Ferrara et al., Biotechnology and Bioengineering, 93(5): 851-861 (2006)]에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고당 내에 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 갖는 항-GPC3 작제물(예컨대, 전장 항-GPC3 항체) 변이체가 또한 제공된다. 그러한 항-GPC3 작제물 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 그러한 항체 변이체는, 예를 들어 국제 특허 출원 공개 WO 1997/30087호(Patel et al.); 국제 특허 출원 공개 WO 1998/58964호(Raju, S.); 및 국제 특허 출원 공개 WO 1999/22764호(Raju, S.)에 기재되어 있다.
일부 실시 형태에서, Fc 영역을 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물, 예를 들어 항-GPC3 Fc 융합 단백질, 전장 항-GPC3 항체) 변이체는 FcγRIII에 결합할 수 있다. 일부 실시 형태에서, Fc 영역을 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물, 예를 들어 항-GPC3 Fc 융합 단백질, 전장 항-GPC3 항체) 변이체는 인간 이펙터 세포(예를 들어, T 세포)의 존재 하에서 ADCC 활성을 갖거나 또는 인간 야생형 IgG1Fc 영역을 포함하는 달리 동일한 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물, 예를 들어 항-GPC3 Fc 융합 단백질, 전장 항-GPC3 항체)과 대비하여 인간 이펙터 세포의 존재 하에서 증가된 ADCC 활성을 갖는다.
시스테인 조작된 변이체
일부 실시 형태에서, 하나 이상의 아미노산 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 시스테인 조작된 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물, 예를 들어 항-GPC3 Fc 융합 단백질, 전장 항-GPC3 항체)을 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 치환된 잔기는 항-GPC3 작제물의 접근가능한 부위에서 발생한다. 그러한 잔기들을 시스테인으로 치환함으로써, 이로써 반응성 티올 기가 항-GPC3 작제물의 접근가능한 부위에 위치되고, 항-GPC3 작제물을 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합하여 항-GPC3 면역접합체를 생성하는 데 사용될 수 있는데, 이는 본 명세서에서 추가로 기재된 바와 같다. 시스테인 조작된 항-GPC3 작제물(예컨대, 전장 항-GPC3 항체)은, 예를 들어 미국 특허 제7,521,541호에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
유도체
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 제공된 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물, 예를 들어 항-GPC3 Fc 융합 단백질, 전장 항-GPC3 항체)은, 당업계에 알려져 있고 용이하게 이용가능한 추가의 비단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항-GPC3 작제물의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 수용성 중합체의 비제한적인 예에는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-다이옥솔란, 폴리-1,3,6-트라이옥산, 에틸렌/무수 말레산 공중합체, 폴리아미노산(단일중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단일중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올(예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알코올 및 이들의 혼합물이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 물 중에서의 그의 안정성으로 인해 제조 시에 이점이 있을 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있으며, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항-GPC3 작제물에 부착된 중합체의 수는 다양할 수 있으며, 하나 초과의 중합체가 부착되는 경우, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은, 개선하고자 하는 항-GPC3 작제물의 특정 특성 또는 기능, 항-GPC3 작제물 유도체가 규정된 조건 하에서 요법에 사용될지의 여부 등을 포함하지만 이로 한정되지 않는 고려사항에 기초하여 결정될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물, 예를 들어 전장 항-GPC3 항체)과 방사선에 대한 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 일부 실시 형태에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다(문헌[Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)]). 방사선은 임의의 파장을 가질 수 있으며, 이러한 파장에는, 통상의 세포는 손상시키지 않지만, 항-GPC3 작제물-비단백질성 모이어티에 근접한 세포가 사멸되는 온도로 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
CAR 이펙터 세포 및 caTCR 이펙터 세포의 제조
일 태양에서, 본 발명은 항-GPC3 CAR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, 림프구, 예를 들어 T 세포)를 제공한다. 항-GPC3 CAR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포) (항-GPC3 CAR 이펙터 세포, 예컨대 항-GPC3 CAR T 세포)를 제조하는 예시적인 방법이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR 이펙터 세포(예컨대, T 세포)는 항-GPC3 CAR(예를 들어, 항-GPC3 항체 모이어티와 CD28 및 CD3ζ 세포내 신호전달 서열을 포함하는 CAR)을 포함하는 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터를 포함함)를 이펙터 세포(예컨대, T 세포) 내로 도입함으로써 생성될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-GPC3 CAR 이펙터 세포(예컨대, T 세포)는 생체내에서 복제되어, GPC3-양성 질병(예컨대, 암, 예를 들어 HCC)의 지속적인 제어로 이어질 수 있는 장기간 지속성을 가져올 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR 이펙터 세포(예컨대, T 세포)는 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)를 포함하는 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터를 포함함)를 이펙터 세포(예컨대, T 세포) 내로 도입함으로써 본 명세서에 기재된 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자를 추가로 발현한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR을 인코딩하는 핵산과 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자를 인코딩하는 핵산은 동일한 벡터 내에 함유된다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자를 인코딩하는 핵산은 유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자의 발현은 항-GPC3 CAR의 활성화를 통해 유도가능하다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 NFAT-유래 프로모터이다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR T 세포는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 CAR(본 명세서에서 "항-GPC3 CAR T 세포"로도 지칭됨)을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR T 세포는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인 및 CD3ζ 및 CD28의 세포내 신호전달 서열을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 항-GPC3 CAR을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR T 세포는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 CAR, 및 본 명세서에 기재된 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3 × CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)를 발현한다. 본 발명의 항-GPC3 CAR T 세포는 강력한 생체내 T 세포 증폭을 거칠 수 있고, 혈액 및 골수 중에서 연장된 시간 동안 고수준으로 지속되는 GPC3-특이적 기억 세포를 확립할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 환자에게 주입된 본 발명의 항-GPC3 CAR T 세포는 GPC3-양성 질병을 가진 환자에서 생체내에서, GPC3+ 세포, 예컨대 GPC3+ 암 세포(예를 들어, HCC 세포)를 제거할 수 있다.
다른 태양에서, 본 발명은 항-GPC3 caTCR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, 림프구, 예를 들어 T 세포)를 제공한다. 항-GPC3 caTCR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포) (항-GPC3 caTCR 이펙터 세포, 예컨대 항-GPC3 caTCR T 세포)를 제조하는 예시적인 방법이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR 이펙터 세포(예컨대, T 세포)는 항-GPC3 caTCR을 포함하는 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터를 포함함)를 이펙터 세포(예컨대, T 세포) 내로 도입함으로써 생성될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-GPC3 caTCR 이펙터 세포(예컨대, T 세포)는 생체내에서 복제되어, GPC3-양성 질병(예컨대, 암, 예를 들어 HCC)의 지속적인 제어로 이어질 수 있는 장기간 지속성을 가져올 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR 이펙터 세포(예컨대, T 세포)는 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)를 포함하는 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터를 포함함)를 이펙터 세포(예컨대, T 세포) 내로 도입함으로써 본 명세서에 기재된 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자를 추가로 발현한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR을 인코딩하는 핵산과 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자를 인코딩하는 핵산은 동일한 벡터 내에 함유된다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자를 인코딩하는 핵산은 유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자의 발현은 항-GPC3 caTCR의 활성화를 통해 유도가능하다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 NFAT-유래 프로모터이다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR T 세포는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 caTCR(본 명세서에서 "항-GPC3 caTCR T 세포"로도 지칭됨)을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR T 세포는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인 및 제1 T 세포 수용체 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하는 항-GPC3 caTCR을 발현하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 동원을 촉진시킨다. 일부 실시 형태에서, TCR-TM은 αβTCR 또는 γδTCR로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR T 세포는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 caTCR, 및 본 명세서에 기재된 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3 × CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)를 발현한다. 본 발명의 항-GPC3 caTCR T 세포는 강력한 생체내 T 세포 증폭을 거칠 수 있고, 혈액 및 골수 중에서 연장된 시간 동안 고수준으로 지속되는 GPC3-특이적 기억 세포를 확립할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 환자에게 주입된 본 발명의 항-GPC3 caTCR T 세포는 GPC3-양성 질병을 가진 환자에서 생체내에서, GPC3+ 세포, 예컨대 GPC3+ 암 세포(예를 들어, HCC 세포)를 제거할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명은 림프구 주입을 사용하여 GPC3-양성 질병을 갖거나 GPC3-양성 질병을 가질 위험이 있는 환자의 치료를 위하여 항-GPC3 CAR을 발현하는 유전자 변형된 T 세포 또는 항-GPC3 caTCR을 발현하는 유전자 변형된 T 세포를 투여하는 것에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 자가 림프구 주입이 치료에 사용된다. 치료를 필요로 하는 환자로부터 자가 PBMC를 수집하고, 본 명세서에 기재되고 당업계에 공지된 방법을 사용하여 T 세포를 활성화 및 증폭시키고, 이어서 환자에게 다시 주입한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR T 세포는, 심지어 세포 표면 분포를 갖는 항-GPC3 CAR을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR T 세포는, 심지어 세포 표면 분포를 갖는 항-GPC3 caTCR을 발현한다. '심지어 세포 표면 분포'는, 예를 들어, 연속적인 출현 및 심지어는 두께 또는 신호 세기를 갖는 패턴을 염색함으로써 특징지어질 수 있다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR T 세포(또는 항-GPC3 caTCR T 세포)를 포함하는 조성물, 예컨대 약제학적 조성물은 세포 표면 상에 항-GPC3 CAR(또는 항-GPC3 caTCR)의 응집을 갖는 세포가 약 10% 미만(예컨대, 약 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 미만)을 구성한다. 응집은, 예를 들어, 불균일한 두께 또는 신호 세기를 갖는 패턴, 또는 불연속적인, 소괴(lumpy), 반점(punctate), 및/또는 불균일한 분포 패턴을 염색함으로써 특징지어질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR T 세포는 세포 표면 상에의 항-GPC3 CAR의 응집을 약 10% 미만(예컨대, 약 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1% 미만)으로 항-GPC3 CAR을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR T 세포는 세포 표면 상에의 항-GPC3 caTCR의 응집을 약 10% 미만(예컨대, 약 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1% 미만)으로 항-GPC3 caTCR을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR T 세포는 낮은 수준의 항원-비의존성 항-GPC3 CAR 활성화를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR T 세포는 낮은 수준의 항원-비의존성 항-GPC3 caTCR 활성화를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR T 세포 또는 항-GPC3 caTCR T 세포는 낮은 수준의 T 세포 탈진(exhaustion)을 갖는다. T 세포 탈진은, 예를 들어 암 또는 만성 감염에 의한 연장된 면역 활성화의 조건 동안 천연 발생하며, 여기서 T 세포는 기능이상 상태가 된다. T 세포 탈진은 기능성 이펙터 또는 기억 T 세포에 비하여 손상된 이펙터 기능, 억제성 수용체의 연장된 발현, 및/또는 변경된 전사 상태에 의해 특징지어질 수 있다. 종양 세포 및 감염물의 최적의 제거율이 T 세포 탈진에 의해 방해된다. 항-GPC3 CAR T 세포 또는 항-GPC3 caTCR T 세포의 T 세포 탈진은 당업계에 알려진 임의의 수단에 의해, 예를 들어 그의 기능적 및/또는 표현형 프로파일을 결정함으로써 특징지어질 수 있다(문헌[Wherry, E. J., Nature immunology 12(6): 492-499, 2011]; 문헌[Jiang, Y., et al., Cell death & disease 6(6): e1792, 2015]). 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR T 세포 또는 항-GPC3 caTCR T 세포는, 예를 들어 PD-1, LAG-3, TIM-3, CTLA-4, BTLA, 및 TIGIT를 포함한 T 세포 탈진의 하나 이상의 마커를 낮은 수준으로 발현한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR T 세포 또는 항-GPC3 caTCR T 세포는 IL-2 생성, TNF-α 생성, IFN-γ 생성, 및 그랜자임(granzyme) B 생성을 위한 비탈진된 T 세포에 특징적인 수준을 유지하고/하거나, 표적 세포의 존재 하에서 생체외 사멸 능력을 유지하는데, 이는 항-GPC3 CAR T 세포 또는 항-GPC3 caTCR T 세포가 자가-활성화 및 조기 탈진을 겪지 않음을 시사한다.
T 세포의 증폭 및 유전자 변형 전에, T 세포의 공급원을 대상체로부터 획득한다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출물, 비장 조직, 및 종양을 포함한 다수의 공급원으로부터 획득될 수 있다. 본 발명의 일부 실시 형태에서, 당업계에서 이용가능한 다수의 T 세포주가 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 실시 형태에서, T 세포는 당업자에게 알려진 다수의 기법, 예컨대 Ficoll™ 분리를 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 획득될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포가 성분채집술에 의해 획득된다. 성분채집술 생성물은 전형적으로, T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구, 및 혈소판을 포함한 림프구를 함유한다. 일부 실시 형태에서, 성분채집술에 의해 수집된 세포는 세척하여 혈장 분획을 제거하고, 후속 처리 단계를 위하여 적절한 완충액 또는 배지 중에 세포를 넣을 수 있다. 일부 실시 형태에서, 세포는 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척된다. 일부 실시 형태에서, 세척 용액에는 칼슘이 부재하고, 마그네슘이 부재할 수 있거나 전부는 아니지만 다수의 2가 양이온이 부재할 수 있다. 당업자는 세척 단계가 당업자에게 알려진 방법에 의해, 예컨대 제조자의 사용설명서에 따라 반자동화 "관류형" 원심분리기(예를 들어, Cobe 2991 세포 처리기, Baxter CytoMate, 또는 Haemonetics Cell Saver 5)를 사용함으로써 달성될 있음을 용이하게 인식할 것이다. 세척 후에, 세포는 다양한 생체적합성 완충액, 예컨대 Ca2+-무함유, Mg2+-무함유 PBS, PlasmaLyte A, 또는 완충제를 함유하거나 함유하지 않는 다른 식염수 용액 중에 재현탁될 수 있다. 대안적으로, 성분채집술 샘플의 바람직하지 않은 성분을 제거하고, 세포를 배양 배지 중에 직접 재현탁시킬 수 있다.
일부 실시 형태에서, T 세포는, 예를 들어 PERCOLL™ 구배를 통한 원심분리에 의해 또는 역류 원심분리 세정(counterflow centrifugal elutriation)에 의해, 적혈구를 용해시키고 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액 림프구로부터 단리된다. T 세포의 특정 하위집단, 예컨대 CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및 CD45RO+ T 세포가 양성 또는 음성 선택 기법에 의해 추가로 단리될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, T 세포는 원하는 T 세포의 양성 선택에 충분한 기간 동안 항-CD3/항-CD28(즉, 3x28)-접합된 비드, 예컨대 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T와의 인큐베이션에 의해 단리된다. 일부 실시 형태에서, 기간은 약 30분이다. 일부 실시 형태에서, 기간은 30분 내지 36시간 또는 그 이상 및 이들 사이의 모든 정수 값의 범위이다. 일부 실시 형태에서, 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6시간이다. 일부 실시 형태에서, 기간은 10 내지 24시간이다. 일부 실시 형태에서, 인큐베이션 기간은 24시간이다. 백혈병을 가진 환자로부터의 T 세포의 단리를 위하여, 더 긴 인큐베이션 시간, 예컨대 24시간의 사용은 세포 수율을 증가시킬 수 있다. 다른 세포 유형에 비하여 T 세포가 적게 존재하는 어떠한 상황에서 T 세포를 단리하는 데 더 긴 인큐베이션 시간이 사용될 수 있으며, 이는, 예를 들어 종양 조직으로부터 또는 면역-손상된 개체로부터 종양 침윤 림프구(TIL)를 단리하는 경우이다. 또한, 더 긴 인큐베이션 시간의 사용은 CD8+ T 세포의 포획 효율을 증가시킬 수 있다. 따라서, 간단히 시간을 단축 또는 연장함으로써 T 세포가 CD3/CD28 비드에 결합할 수 있게 하고/하거나, 비드 대 T 세포의 비를 증가 또는 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단이 배양 개시 시점에서 또는 프로세스 동안의 다른 시점에서 우선적으로 선택되거나 선택에서 제외될 수 있다. 추가적으로, 비드 또는 다른 표면 상의 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비를 증가 또는 감소시킴으로써, T 세포의 하위집단이 배양 개시 시점에서 또는 다른 원하는 시점에서 우선적으로 선택되거나 선택에서 제외될 수 있다. 당업자는 다회의 선택 라운드가 또한 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 일부 실시 형태에서, 선택 절차를 수행하고, 활성화 및 증폭 프로세스에서 "선택되지 않은" 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. "선택되지 않은" 세포는 또한 추가의 선택 라운드를 거칠 수 있다.
음성 선택에 의한 T 세포 집단의 풍부화는 음성 선택된 세포에 고유한 표면 마커에 대해 유도된 항체들의 조합으로 달성될 수 있다. 한 가지 방법은 음성 선택된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 대해 유도된 단일클론 항체들의 칵테일을 사용하는 음성 자성 면역부착 또는 유세포측정을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 풍부화하기 위하여, 단일클론 항체 칵테일은 전형적으로 CD-14, CD20, CD11b, CD-16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 전형적으로 CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+, 및 FoxP3+를 발현하는 조절성 T 세포를 풍부화하거나 양성 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 일부 실시 형태에서, T 조절성 세포는 항-CD25 접합된 비드 또는 다른 유사한 선택 방법에 의해 고갈된다.
양성 또는 음성 선택에 의해 원하는 세포 집단의 단리를 위하여, 세포 및 표면(예를 들어, 비드와 같은 입자)의 농도가 변동될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 세포와 비드의 최대 접촉을 보장하기 위하여, 비드와 세포가 함께 혼합된 부피를 유의하게 감소시키는(즉, 세포 농도를 유의하게 증가시키는) 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 약 20억 개의 세포/ml의 농도가 사용된다. 일부 실시 형태에서, 약 10억 개의 세포/ml의 농도가 사용된다. 일부 실시 형태에서, 약 1억 개의 세포/ml 초과가 사용된다. 일부 실시 형태에서, 약 1000만, 1500만, 2000만, 2500만, 3000만, 3500만, 4000만, 4500만, 또는 5000만 개의 세포/ml 중 어느 하나의 세포 농도가 사용된다. 일부 실시 형태에서, 약 7500만, 8000만, 8500만, 9000만, 9500만, 또는 1억 개의 세포/ml 중 어느 하나의 세포 농도가 사용된다. 일부 실시 형태에서, 약 1억2500만 또는 약 1억5000만 개의 세포/ml의 농도가 사용된다. 높은 농도를 사용하면, 세포 수율, 세포 활성화, 및 세포 증폭이 증가될 수 있다. 또한, 높은 세포 농도의 사용은 관심 표적 항원, 예컨대 CD28-음성 T 세포를 약하게 발현할 수 있는 세포, 또는 많은 종양 세포가 존재하는 샘플(즉, 백혈병 혈액, 종양 조직 등)로부터의 세포의 더 효율적인 포획을 가능하게 한다. 그러한 세포 집단은 치료적 가치를 가질 수 있고, 획득하기에 바람직할 것이다. 예를 들어, 높은 세포 농도의 사용은, 통상적으로 더 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T 세포의 더욱 효율적인 선택을 가능하게 한다.
본 발명의 일부 실시 형태에서, T 세포는 치료 직후에 환자로부터 획득된다. 이와 관련하여, 소정의 암 치료, 특히 면역 시스템을 손상시키는 약물에 의한 치료 후에, 치료 직후 환자가 통상적으로 치료로부터 회복 중일 기간 동안에, 획득된 T 세포의 품질은 생체외에서 증폭되는 그들의 능력에 대해 최적이거나 개선될 수 있는 것으로 관찰되었다. 마찬가지로, 본 명세서에 기재된 방법을 사용한 생체외 조작 후에, 이들 세포는 향상된 생착 및 생체내 증폭을 위한 바람직한 상태에 있을 수 있다. 따라서, 본 발명의 맥락 내에서, 이러한 회복 단계 동안에 T 세포, 수지상 세포, 또는 조혈 계통의 다른 세포를 포함한 혈액 세포를 수집하는 것이 고려된다. 또한, 일부 실시 형태에서, 동원(예를 들어, GM-CSF에 의한 동원) 및 컨디셔닝 요법이, 특히 치료 후 규정된 시간 범위 동안, 특정 세포 유형의 재분포, 재순환, 재생, 및/또는 증폭이 유리한 대상체에서 조건을 생성하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 세포 유형에는 T 세포, B 세포, 수지상 세포, 및 면역 시스템의 다른 세포가 포함된다.
바람직한 항-GPC3 CAR 또는 항-GPC3 caTCR을 발현시키기 위해(그리고 일부 실시 형태에서는, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자를 추가로 동시발현시키기 위해) T 세포를 유전자 변형시키기 전이든 후이든 상관없이, T 세포는 일반적으로, 예를 들어 미국 특허 제6,352,694호; 제6,534,055호; 제6,905,680호; 제6,692,964호; 제5,858,358호; 제6,887,466호; 제6,905,681호; 제7,144,575호; 제7,067,318호; 제7,172,869호; 제7,232,566호; 제7,175,843호; 제5,883,223호; 제6,905,874호; 제6,797,514호; 제6,867,041호; 및 미국 특허 출원 공개 제20060121005호에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 활성화되고 증폭될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 T 세포는 CD3/TCR 복합체 관련 신호를 자극하는 작용제 및 T 세포의 표면 상에서 공동자극성 분자를 자극하는 리간드가 부착된 표면과의 접촉에 의해 증폭된다. 특히, T 세포 집단은, 예를 들어 표면 상에 고정된 항-CD3 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 항-CD3 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 이오노포어(ionophore)와 함께 단백질 키나제 C 활성화제(예를 들어, 브리오스타틴)와의 접촉에 의해 자극될 수 있다. T 세포의 표면 상의 보조 분자의 공동자극을 위해, 보조 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, T 세포 집단이, T 세포의 증식을 자극하기에 적절한 조건 하에서, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉될 수 있다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포 중 어느 하나의 증식을 자극하기 위하여, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체. 항-CD28 항체의 예에는 9.3, B-T3, XR-CD28(프랑스 브장송 소재의 Diaclone)이 포함되며, 이들은 당업계에 일반적으로 알려진 다른 방법과 마찬가지로 사용될 수 있다(문헌[Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998]; 문헌[Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999]; 문헌[Garland et al., J. Immunol. Meth. 227(1-2):53-63, 1999]).
면역접합체의 제조
항-GPC3 면역접합체는 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO 2009/067800호, WO 2011/133886호, 및 미국 특허 출원 공개 제2014322129호를 참조하며, 이들은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
항-GPC3 면역접합체의 항-GPC3 항체 모이어티는 항-GPC3 항체 모이어티가 이펙터 분자와 회합되게 하거나 그에 연결되게 할 수 있는 임의의 수단에 의해 이펙터 분자에 "부착"될 수 있다. 예를 들어, 항-GPC3 면역접합체의 항-GPC3 항체 모이어티는 화학적 또는 재조합 수단에 의해 이펙터 분자에 부착될 수 있다. 융합체 또는 접합체를 제조하기 위한 화학적 수단이 당업계에 알려져 있으며, 항-GPC3 면역접합체를 제조하는 데 사용될 수 있다. 항-GPC3 항체 모이어티와 이펙터 분자를 접합시키는 데 사용되는 방법은 결합 단백질이 표적 세포 상의 항원에 결합하는 능력을 방해하지 않으면서 결합 단백질을 이펙터 분자와 결합시킬 수 있어야 한다.
항-GPC3 면역접합체의 항-GPC3 항체 모이어티는 이펙터 분자에 간접적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 항-GPC3 면역접합체의 항-GPC3 항체 모이어티는 몇몇 유형들 중 하나의 이펙터 분자를 함유하는 리포좀에 직접적으로 연결될 수 있다. 이펙터 분자(들) 및/또는 항-GPC3 항체 모이어티는 또한 고체 표면에 결합될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 면역접합체의 항-GPC3 항체 모이어티 및 이펙터 분자는 둘 모두 단백질이고, 당업계에 잘 알려진 기법을 사용하여 접합될 수 있다. 2개의 단백질을 접합시킬 수 있는 수백 개의 가교결합제가 이용가능하다. (예를 들어, 문헌["Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking". 1991, Shans Wong, CRC Press, Ann Arbor]을 참조한다). 가교결합제는 일반적으로 항-GPC3 항체 모이어티 및/또는 이펙터 분자 상에 삽입되거나 이용가능한 반응성 작용기에 기초하여 선택된다. 게다가, 반응성 기가 없는 경우, 광활성화성 가교결합제가 사용될 수 있다. 소정 경우에, 항-GPC3 항체 모이어티와 이펙터 분자 사이에 스페이서를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 당업계에 알려진 가교결합제는 동종이작용제(homobifunctional agent): 글루타르알데하이드, 다이메틸아디피미데이트 및 비스(다이아조벤지딘) 및 이종이작용제(heterobifunctional agent): m 말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 및 설포-m 말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 면역접합체의 항-GPC3 항체 모이어티는 이펙터 분자의 화학적 부착을 위하여 특정 잔기로 조작될 수 있다. 당업계에 알려진 분자의 화학적 부착을 위해 사용되는 특정 잔기는 라이신 및 시스테인을 포함한다. 가교결합제는, 항-GPC3 항체 모이어티 상에 삽입되고 이펙터 분자 상에서 이용가능한 반응성 작용기에 기초하여 선택된다.
항-GPC3 면역접합체는 또한 재조합 DNA 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 그러한 경우에, 항-GPC3 항체 모이어티를 인코딩하는 DNA 서열이 이펙터 분자를 인코딩하는 DNA 서열에 융합되어, 키메라 DNA 분자를 생성한다. 키메라 DNA 서열은 숙주 세포 내로 형질감염되고, 숙주 세포는 융합 단백질을 발현한다. 융합 단백질은 세포 배양물로부터 회수되고, 당업계에 알려진 기법을 사용하여 정제될 수 있다.
표지인 이펙터 분자를 결합 단백질에 부착하는 예에는 문헌[Hunter, et al., Nature 144:945 (1962); David, et al., Biochemistry 13:1014 (1974)]; 문헌[Pain, et al., J. Immunol. Meth. 40:219 (1981)]; 문헌[Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30:407 (1982)]; 문헌[Wensel and Meares, Radioimmunoimaging And Radioimmunotherapy, Elsevier, N.Y. (1983)]; 및 문헌[Colcher et al., "Use of Monoclonal Antibodies as Radiopharmaceuticals for the Localization of Human Carcinoma Xenografts in Athymic Mice", Meth. Enzymol., 121:802-16 (1986)]에 기재된 방법이 포함된다.
방사성 표지 또는 다른 표지는 알려진 방법으로 면역접합체 내에 도입될 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 생합성될 수 있거나, 또는, 예를 들어 수소 대신에 불소-19를 포함하는 적합한 아미노산 전구체를 사용하여 화학적 아미노산 합성에 의해 합성될 수 있다. 99Tc 또는 123I, 186Re, 188Re 및 111In과 같은 표지가 펩티드 내의 시스테인 잔기를 통해 부착될 수 있다. 이트륨-90은 라이신 잔기를 통해 부착될 수 있다. 요오도겐(IODOGEN) 방법(문헌[Fraker et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57 (1978)])이 요오드-123을 도입시키는 데 사용될 수 있다. 문헌["Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989)]은 다른 방법을 상세히 기재한다.
항-GPC3 항체 모이어티와 세포독성제의 면역접합체는 다양한 이작용성 단백질-커플링제, 예컨대 N-석신이미딜-3-(2-피리딜다이티오) 프로피오네이트(SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이작용성 유도체(예컨대, 다이메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르(예컨대, 다이석신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예컨대, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예컨대, 비스(p-아지도벤조일)헥산다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예컨대, 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이아이소시아네이트(예컨대, 톨루엔 2,6-다이아이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예컨대, 1,5-다이플루오로-2,4-다이니트로벤젠)을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소가 문헌[Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지 1-아이소티오시아네이토벤질-3-메틸다이에틸렌 트라이아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 항체에 대한 방사성 핵종의 접합을 위한 예시적인 킬레이팅제이다. 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 WO94/11026호를 참조한다. 링커는 세포 내에서 세포독성 약물의 방출을 촉진시키는 "절단성 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-감수성 링커, 광불안정성 링커, 다이메틸 링커 또는 이황화물-함유 링커(문헌[Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992)]; 미국 특허 제5,208,020호)가 사용될 수 있다.
본 발명의 항-GPC3 면역접합체는 가교결합 시약인 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 SVSB(석신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트)를 사용하여 제조된 ADC를 명시적으로 고려하지만 이로 한정되지 않으며, 상기 가교결합 시약은 (예를 들어, 미국 일리노이주 록포드 소재의 Pierce Biotechnology, Inc.로부터) 구매가능하다. 문헌[pages 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog]을 참조한다.
약제학적 조성물
조성물(예컨대, 약제학적 조성물, 이는 본 명세서에서 제형으로도 지칭됨)이 또한 본 명세서에 제공되며, 상기 조성물은 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물), 작제물을 인코딩하는 핵산, 작제물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포, 또는 핵산 또는 벡터를 포함하는 이펙터 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조성물은 항-GPC3 작제물과 회합된 세포(예컨대, 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포)를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물 및 선택적으로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 약제학적 조성물은 항-GPC3 작제물과 회합된 세포(예컨대, 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포, CAR T 세포, caTCR T 세포)를 추가로 포함한다.
원하는 순도를 갖는 항-GPC3 작제물을 선택적인 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제와 혼합함으로써(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]), 동결건조된 제형 또는 수용액 형태로 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)의 적합한 제형이 얻어진다. 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 완충제, 예컨대 인산염, 시트르산염, 및 다른 유기 산; 항산화제(아스코르브산 및 메티오닌을 포함함); 방부제(예컨대, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함한 다른 탄수화물; 킬레이팅제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 TWEEN™, PLURONIC™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 예시적인 제형이 국제 특허 출원 공개 WO 98/56418호에 기재되어 있으며, 이는 명시적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 피하 투여에 적합한 동결건조된 제형이 국제 특허 출원 공개 WO 97/04801호에 기재되어 있다. 그러한 동결건조된 제형은 적합한 희석제를 사용하여 높은 단백질 농도로 재구성될 수 있고, 재구성된 제형은 본 발명에서 치료하고자 하는 개체에게 피하 투여될 수 있다. 본 발명의 항-GPC3 작제물을 세포 내로 전달하기 위해 리포펙틴 또는 리포좀이 사용될 수 있다.
본 발명의 제형은 또한, 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)에 더하여, 치료되는 특정 적응증을 위하여 필요에 따라 하나 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 불리한 영향을 주지 않는 상보적인 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 예를 들어, 항-GPC3 작제물에 더하여 항신생물제, 성장 억제제, 세포독성제, 또는 화학요법제를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 그러한 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 병용하여 적합하게 존재한다. 그러한 다른 작용제의 유효량은 제형에 존재하는 항-GPC3 작제물의 양, 질병 또는 장애 또는 치료의 유형, 및 상기에 논의된 다른 인자에 좌우된다. 이들은 일반적으로 본 명세서에 기재된 것과 동일한 투여량으로 그리고 투여 경로로 사용되거나 또는 지금까지 사용된 투여량의 약 1 내지 99%로 사용된다.
항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)은 또한, 예를 들어 코아세르베이션 기법에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에, 콜로이드상 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에, 또는 매크로에멀젼 내에 봉입될 수 있다. 그러한 기법은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다. 지속-방출 제제가 제조될 수 있다.
항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)의 지속-방출 제제가 제조될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예에는 항체(또는 이의 단편)를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 이러한 매트릭스는 형상화된 물품, 예를 들어 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 하이드로겔(예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 LUPRON DEPOTTM(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사용 미소구체), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 동안에 걸쳐 분자의 방출을 가능하게 하지만, 소정의 하이드로겔은 더 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 항체가 장시간 동안 체내에 남아 있을 때, 그것은 37℃에서의 수분에 대한 노출의 결과로서 변성 또는 응집되어, 생물학적 활성의 손실 및 면역원성의 가능한 변화를 초래할 수 있다. 관여하는 기전에 따라 항-GPC3 작제물의 안정화를 위한 합리적 전략이 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 기전이 티오-이황화물 상호변화를 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지면, 설프하이드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키고, 적절한 첨가제를 사용하여 수분 함량을 제어하고, 특정 중합체 매트릭스 조성물을 개발함으로써 안정화가 달성될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)은 시트르산염, NaCl, 아세트산염, 석신산염, 글리신, 폴리소르베이트 80(Tween 80), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 완충액 중에서 제형화된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 약 100 mM 내지 약 150 mM 글리신을 포함하는 완충액 중에서 제형화된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 약 50 mM 내지 약 100 mM NaCl을 포함하는 완충액 중에서 제형화된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 약 10 mM 내지 약 50 mM 아세트산염을 포함하는 완충액 중에서 제형화된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 약 10 mM 내지 약 50 mM 석신산염을 포함하는 완충액 중에서 제형화된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 약 0.005% 내지 약 0.02%의 폴리소르베이트 80을 포함하는 완충액 중에서 제형화된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 pH가 약 5.1 내지 5.6인 완충액 중에서 제형화된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 10 mM 시트르산염, 100 mM NaCl, 100 mM 글리신, 및 0.01% 폴리소르베이트 80을 포함하는 완충액 중에서 제형화되며, 제형은 pH 5.5이다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 멸균성이어야 한다. 이는, 예를 들어 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
항-GPC3 작제물을 사용한 치료 방법
본 발명의 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물) 및/또는 조성물은, 예를 들어 암(예컨대, 간세포 암종(HCC))을 포함한 비정상적으로 높은 GPC3 발현을 수반하는 질병 및/또는 장애(본 명세서에서 "GPC3-양성" 질병 또는 장애로도 지칭됨)를 치료하기 위하여 개체(예를 들어, 포유동물, 예컨대 인간)에게 투여될 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 본 출원은 개체에서 GPC3-양성 질병(예컨대, 암)을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물, 예컨대 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나를 포함하는 조성물(예컨대, 약제학적 조성물)의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조성물은 항-GPC3 작제물(예를 들어, 항-GPC3 CAR 또는 항-GPC3 caTCR)과 회합된 세포(예컨대, 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포)를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병(예컨대, 암)을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 작제물(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)을 포함하는 조성물(예컨대, 약제학적 조성물)의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 작제물의 발현은 이펙터 세포(예를 들어, T 세포) 상에서 신호전달 수용체(예를 들어, TCR, CAR, caTCR)를 통한 신호전달 시에 유도가능하다. 일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병(예컨대, 암)을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, CAR T 세포, caTCR T 세포)를 포함하는 조성물(예컨대, 약제학적 조성물)의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 이펙터 세포는 이펙터 세포 신호전달 수용체(예를 들어, TCR, CAR, caTCR)의 활성화를 통해 항-GPC3 작제물(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)의 발현을 유도한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)을 인코딩하는 핵산은 유도성 프로모터, 예컨대 신호전달 수용체(예를 들어, TCR, CAR, caTCR)-활성화 의존성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 NFAT-유래 프로모터, 예컨대 NFAT-유래 최소 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 IL-2 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 세포는 항-GPC3 CAR T 세포이다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 세포는 항-GPC3 caTCR T 세포이다.
일부 실시 형태에서, 암은, 예를 들어, HCC, 흑색종, 폐 편평 세포 암종, 난소 암종, 난황낭 종양, 융모막암종, 신경아세포종, 간아세포종, 빌름스 종양, 고환 비정상피종성 생식 세포 종양, 위 암종, 및 지질육종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 암은 HCC이다. 일부 실시 형태에서, 암은 간세포 암종이고, 치료는 암의 확산을 예방하는 것, 예를 들어 암의 전이를 억제(예컨대, 예방)하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 암은 전이성 HCC이다. 일부 실시 형태에서, 개체는 인간이다.
예를 들어, 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병을 가진 개체를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)을 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고, 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 가용성 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 가용성 GPC3에 대한 항-sGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3 및 가용성 GPC3 둘 모두를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 전장 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 다중특이성 분자(예를 들어, 이중특이성 T 세포 인게이저)이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 CAR 또는 caTCR이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 면역접합체이다. 일부 실시 형태에서, 조성물은 항-GPC3 작제물과 회합된 세포(예컨대, 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포)를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조성물은 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, CAR T 세포, caTCR T 세포)를 포함하며, 이펙터 세포는 이펙터 세포 신호전달 수용체(예를 들어, TCR, CAR, caTCR)의 활성화를 통해 항-GPC3 작제물(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)의 발현을 유도한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)을 인코딩하는 핵산은 유도성 프로모터, 예컨대 신호전달 수용체(예를 들어, TCR, CAR, caTCR)-활성화 의존성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 NFAT-유래 프로모터, 예컨대 NFAT-유래 최소 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 IL-2 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 세포는 항-GPC3 CAR T 세포이다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 세포는 항-GPC3 caTCR T 세포이다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병은 암이다. 일부 실시 형태에서, 암은, 예를 들어 HCC, 흑색종, 폐 편평 세포 암종, 난소 암종, 난황낭 종양, 융모막암종, 신경아세포종, 간아세포종, 빌름스 종양, 고환 비정상피종성 생식 세포 종양, 위 암종, 또는 지질육종이다. 일부 실시 형태에서, 암은 HCC이다. 일부 실시 형태에서, 암은 HCC이고, 치료는 암의 확산을 예방하는 것, 예를 들어 암의 전이를 억제(예컨대, 예방)하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 암은 전이성 HCC이다. 일부 실시 형태에서, 개체는 인간이다.
일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병(예를 들어, 암)을 가진 개체를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 항-nGPC3 항체 모이어티가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함)를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)을 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 서열을 포함하는 인간 GPC3 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 461의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 462의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 463의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 GPC3의 N-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 1 내지 358 내의 에피토프(서열 번호 468)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 464의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 465)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 580 내의 에피토프(서열 번호 466)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 헤파린 설페이트 측쇄가 결여된 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 510 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 467)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 R358/S359에 있는 푸린 절단 부위에 걸쳐 있는 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 전장 성숙 인간 GPC3(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 560 또는 25 내지 580)에는 특이적으로 결합할 수 있지만, 인간 GPC3의 N-말단 단편(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 358) 또는 인간 GPC3의 C-말단 단편(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 560 또는 359 내지 580)에는 결합하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 헤파린 설페이트 측쇄가 결여된 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병(예를 들어, 암)을 가진 개체를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 nGPC3에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 항-nGPC3 항체 모이어티(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 항-nGPC3 항체 모이어티가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함)를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)을 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병(예를 들어, 암)을 가진 개체를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 nGPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-nGPC3 항체 모이어티(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 항-nGPC3 항체 모이어티가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함)를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)을 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 전장 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 다중특이성 분자(예를 들어, 이중특이성 T 세포 인게이저)이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 CAR 또는 caTCR이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 면역접합체이다. 일부 실시 형태에서, 조성물은 항-GPC3 작제물과 회합된 세포(예컨대, 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포, CAR T 세포, caTCR T 세포)를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, CAR T 세포, caTCR T 세포)는 이펙터 세포 신호전달 수용체(예를 들어, TCR, CAR, caTCR)의 활성화를 통해 항-GPC3 작제물(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)의 발현을 유도한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)의 발현은 유도성 프로모터, 예컨대 신호전달 수용체(예를 들어, TCR, CAR, caTCR)-활성화 의존성 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 NFAT-유래 프로모터, 예컨대 NFAT-유래 최소 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 IL-2 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 세포는 항-GPC3 CAR T 세포이다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 세포는 항-GPC3 caTCR T 세포이다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병은 암이다. 일부 실시 형태에서, 암은, 예를 들어 HCC, 흑색종, 폐 편평 세포 암종, 난소 암종, 난황낭 종양, 융모막암종, 신경아세포종, 간아세포종, 빌름스 종양, 고환 비정상피종성 생식 세포 종양, 위 암종, 또는 지질육종이다. 일부 실시 형태에서, 암은 HCC이다. 일부 실시 형태에서, 암은 HCC이고, 치료는 암의 확산을 예방하는 것, 예를 들어 암의 전이를 억제(예컨대, 예방)하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 암은 전이성 HCC이다. 일부 실시 형태에서, 개체는 인간이다.
일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병(예를 들어, 암)을 가진 개체를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)을 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병을 가진 개체를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)을 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병을 가진 개체를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)을 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병을 가진 개체를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)을 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병(예를 들어, 암)을 가진 개체를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 nGPC3에 결합하기 위하여,본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 항-nGPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)을 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병(예를 들어, 암)을 가진 개체를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 nGPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-nGPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)을 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 전장 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 다중특이성 분자(예를 들어, 이중특이성 T 세포 인게이저)이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 CAR 또는 caTCR이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 면역접합체이다. 일부 실시 형태에서, 조성물은 항-GPC3 작제물과 회합된 세포(예컨대, 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포, CAR T 세포, caTCR T 세포)를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, CAR T 세포, caTCR T 세포)는 이펙터 세포 신호전달 수용체(예를 들어, TCR, CAR, caTCR)의 활성화를 통해 항-GPC3 작제물(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)의 발현을 유도한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)의 발현은 유도성 프로모터, 예컨대 신호전달 수용체(예를 들어, TCR, CAR, caTCR)-활성화 의존성 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 NFAT-유래 프로모터, 예컨대 NFAT-유래 최소 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 IL-2 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 세포는 항-GPC3 CAR T 세포이다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 세포는 항-GPC3 caTCR T 세포이다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병은 암이다. 일부 실시 형태에서, 암은, 예를 들어 HCC, 흑색종, 폐 편평 세포 암종, 난소 암종, 난황낭 종양, 융모막암종, 신경아세포종, 간아세포종, 빌름스 종양, 고환 비정상피종성 생식 세포 종양, 위 암종, 또는 지질육종이다. 일부 실시 형태에서, 암은 HCC이다. 일부 실시 형태에서, 암은 HCC이고, 치료는 암의 확산을 예방하는 것, 예를 들어 암의 전이를 억제(예컨대, 예방)하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 암은 전이성 HCC이다. 일부 실시 형태에서, 개체는 인간이다.
일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병을 가진 개체를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)을 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병을 가진 개체를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)을 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병을 가진 개체를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)을 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 항체 모이어티는 i) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병을 가진 개체를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)을 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 항체 모이어티는 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병(예를 들어, 암)을 가진 개체를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)을 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병(예를 들어, 암)을 가진 개체를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 GPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-nGPC3 항체 모이어티를 포함하는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)을 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고, 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 가용성 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 가용성 GPC3에 대한 항-sGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-sGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 461의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-sGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 510 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 467)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3 및 가용성 GPC3 둘 모두를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 전장 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 다중특이성 분자(예를 들어, 이중특이성 T 세포 인게이저)이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 CAR 또는 caTCR이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 면역접합체이다. 일부 실시 형태에서, 조성물은 항-GPC3 작제물과 회합된 세포(예컨대, 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포, CAR T 세포, caTCR T 세포)를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, CAR T 세포, caTCR T 세포)는 이펙터 세포 신호전달 수용체(예를 들어, TCR, CAR, caTCR)의 활성화를 통해 항-GPC3 작제물(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)의 발현을 유도한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)의 발현은 유도성 프로모터, 예컨대 신호전달 수용체(예를 들어, TCR, CAR, caTCR)-활성화 의존성 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 NFAT-유래 프로모터, 예컨대 NFAT-유래 최소 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 IL-2 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 세포는 항-GPC3 CAR T 세포이다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 세포는 항-GPC3 caTCR T 세포이다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병은 암이다. 일부 실시 형태에서, 암은, 예를 들어 HCC, 흑색종, 폐 편평 세포 암종, 난소 암종, 난황낭 종양, 융모막암종, 신경아세포종, 간아세포종, 빌름스 종양, 고환 비정상피종성 생식 세포 종양, 위 암종, 또는 지질육종이다. 일부 실시 형태에서, 암은 HCC이다. 일부 실시 형태에서, 암은 HCC이고, 치료는 암의 확산을 예방하는 것, 예를 들어 암의 전이를 억제(예컨대, 예방)하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 암은 전이성 HCC이다. 일부 실시 형태에서, 개체는 인간이다.
일부 실시 형태에서, 개체에서 전이성 HCC를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 전술된 임의의 실시 형태에 따른 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)을 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조성물은 항-GPC3 작제물과 회합된 세포(예컨대, 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포, CAR T 세포, caTCR T 세포)를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 개체는 인간이다.
일부 실시 형태에서, 개체에서 간세포 암종의 전이를 억제(예컨대, 예방)하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 전술된 임의의 실시 형태에 따른 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)을 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 개체는 인간이다.
전술된 GPC3-양성 질병을 치료하기 위한 임의의 상기 방법의 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)은 개체에게 투여되기 전에 세포(예컨대, 면역 세포, 예를 들어 T 세포)에 접합된다. 따라서, 예를 들어, 개체에서 GPC3-양성 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 a) 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나를 세포(예컨대, 면역 세포, 예를 들어 T 세포)에 접합하여 항-GPC3 작제물/세포 접합체를 형성하는 단계, 및 b) 항-GPC3 작제물/세포 접합체를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 세포는 개체로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 세포는 개체로부터 유래되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 세포의 표면 상의 분자에 공유 결합에 의해 세포에 접합된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 세포의 표면 상의 분자에 비공유 결합에 의해 세포에 접합된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 세포의 외부 막 내로의 항-GPC3 작제물의 일부분의 삽입에 의해 세포에 접합된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 전장 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 다중특이성(예컨대, 이중특이성) 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 키메라 항원 수용체이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 caTCR이다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병을 가진 개체를 치료하는 방법은 항-GPC3 CAR T 세포의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병을 가진 개체를 치료하는 방법은 항-GPC3 caTCR T 세포의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 면역접합체이다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병은 암이다. 일부 실시 형태에서, 암은, 예를 들어 HCC, 흑색종, 폐 편평 세포 암종, 난소 암종, 난황낭 종양, 융모막암종, 신경아세포종, 간아세포종, 빌름스 종양, 고환 비정상피종성 생식 세포 종양, 위 암종, 또는 지질육종이다. 일부 실시 형태에서, 암은 HCC이다. 일부 실시 형태에서, 암은 HCC이고, 치료는 암의 확산을 예방하는 것, 예를 들어 암의 전이를 억제(예컨대, 예방)하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 암은 전이성 HCC이다. 일부 실시 형태에서, 개체는 인간이다.
전술된 GPC3-양성 질병을 치료하기 위한 임의의 상기 방법의 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물, 예를 들어 항-GPC3×CD3 이중특이성 T 세포 인게이저)은 신호전달 수용체(예를 들어, TCR, CAR, caTCR)를 통한 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, CAR T 세포, CATCR-T 세포)의 활성화 시에 발현된다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 세포는 유도성 프로모터, 예컨대 신호전달 수용체(예를 들어, TCR, CAR, caTCR)-활성화 의존성 프로모터에 작동가능하게 연결된 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물, 예를 들어 항-GPC3×CD3 이중특이성 T 세포 인게이저)을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 NFAT-유래 프로모터, 예컨대 NFAT-유래 최소 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 IL-2 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 세포는 항-GPC3 CAR T 세포이다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 세포는 항-GPC3 caTCR T 세포이다. 따라서, 예를 들어, 개체에서 GPC3-양성 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 a) 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나를 인코딩하는 핵산을 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, CAR T 세포, CATCR-T 세포)에 도입하는 단계 - 핵산은 유도성 프로모터(예컨대, 신호전달 수용체(예를 들어, TCR, CAR, caTCR)-활성화 의존성 프로모터)에 작동가능하게 연결됨 -, 및 b) 이펙터 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 세포는 개체로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 세포는 개체로부터 유래되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 천연 비발생적이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 전장 항체이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 다중특이성(예컨대, 이중특이성) 분자이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 키메라 항원 수용체이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 caTCR이다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병을 가진 개체를 치료하는 방법은 항-GPC3 CAR T 세포의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병을 가진 개체를 치료하는 방법은 항-GPC3 caTCR T 세포의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물은 면역접합체이다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병은 암이다. 일부 실시 형태에서, 암은, 예를 들어 HCC, 흑색종, 폐 편평 세포 암종, 난소 암종, 난황낭 종양, 융모막암종, 신경아세포종, 간아세포종, 빌름스 종양, 고환 비정상피종성 생식 세포 종양, 위 암종, 또는 지질육종이다. 일부 실시 형태에서, 암은 HCC이다. 일부 실시 형태에서, 암은 HCC이고, 치료는 암의 확산을 예방하는 것, 예를 들어 암의 전이를 억제(예컨대, 예방)하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 암은 전이성 HCC이다. 일부 실시 형태에서, 개체는 인간이다.
일부 실시 형태에서, 개체는 포유동물(예를 들어, 인간, 비인간 영장류, 래트, 마우스, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 등)이다. 일부 실시 형태에서, 개체는 인간이다. 일부 실시 형태에서, 개체는 임상 환자, 임상 시험 지원자, 실험 동물 등이다. 일부 실시 형태에서, 개체는 약 60세보다 어리다(예를 들어, 약 50, 40, 30, 25, 20, 15, 또는 10세 중 어느 하나보다 어린 나이를 포함함). 일부 실시 형태에서, 개체는 약 60세보다 나이가 많다(예를 들어, 약 70, 80, 90, 또는 100세 중 어느 하나보다 많은 나이를 포함함). 일부 실시 형태에서, 개체는 본 명세서에 기재된 질병 또는 장애(예컨대, HCC, 흑색종, 폐 편평 세포 암종, 난소 암종, 난황낭 종양, 융모막암종, 신경아세포종, 간아세포종, 빌름스 종양, 고환 비정상피종성 생식 세포 종양, 위 암종, 또는 지질육종) 중 하나 이상으로 진단되거나 또는 유전자적으로 그것에 걸리기 쉽다. 일부 실시 형태에서, 개체는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 질병 또는 장애와 관련된 하나 이상의 위험 인자를 갖는다.
일부 실시 형태에서 본 출원은 개체에서 또는 가용성 GPC3를 갖는(예를 들어, 혈청 중에 순환 GPC3 단백질 또는 유리 GPC3 펩티드를 갖는) 개체에서 표면 상에 GPC3을 발현하는 세포에 항-GPC3 작제물(예컨대, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 어느 하나, 예를 들어 단리된 항-GPC3 작제물)을 전달하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 항-GPC3 작제물을 포함하는 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 전달하고자 하는 항-GPC3 작제물은 세포(예컨대, 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포)와 회합된다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 항-GPC3 CAR T 세포를 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 항-GPC3 caTCR T 세포를 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
암(예컨대, HCC, 흑색종, 폐 편평 세포 암종, 난소 암종, 난황낭 종양, 융모막암종, 신경아세포종, 간아세포종, 빌름스 종양, 고환 비정상피종성 생식 세포 종양, 위 암종, 또는 지질육종), 또는 비정상적인 GPC3 발현을 나타내는 임의의 다른 질병 및 그러한 질병들의 임상적 양상(clinical delineation)에 대한 많은 진단 방법이 당업계에 알려져 있다. 그러한 방법은, 예를 들어 면역조직화학, PCR, 및 형광 동소 혼성화(FISH)를 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물) 및/또는 조성물은 비정상적인 GPC3 발현을 수반하는 질병 또는 장애를 치료하기 위하여 제2, 제3, 또는 제4 작용제(예를 들어, 항신생물제, 성장 억제제, 세포독성제, 또는 화학요법제를 포함함)와 병용하여 투여된다. 일부 실시 형태에서, 작용제는, 예를 들어 IFN 수용체 효능제, Hsp90 억제제, p53 발현 증강제, 및 화학요법제를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 작용제는 IFN 수용체 효능제이며, 이에는, 예를 들어 IFNγ, IFNβ, 및 IFNα가 포함된다. 일부 실시 형태에서, 작용제는 Hsp90 억제제이며, 이에는, 예를 들어, 타네스피마이신(17-AAG), 알베스피마이신(17-DMAG), 레타스피마이신(IPI-504), IPI-493, CNF2024/BIIB021, MPC-3100, Debio 0932(CUDC-305), PU-H71, 가네테스핍(STA-9090), NVP-AUY922(VER-52269), HSP990, KW-2478, AT13387, SNX-5422, DS-2248, 및 XL888이 포함된다. 일부 실시 형태에서, 작용제는 p53 발현 증강제이며, 이에는, 예를 들어 5-플루오로우라실 및 누틀린-3이 포함된다. 일부 실시 형태에서, 작용제는 화학요법제이며, 이에는, 예를 들어 토포테칸, 에토포시드, 시스플라틴, 파클리탁셀, 및 빈블라스틴이 포함된다.
암 치료는, 예를 들어 종양 퇴행, 종양 중량 또는 크기 수축, 진행까지의 시간, 생존 지속기간, 무진행 생존율, 전체 반응 속도, 반응 지속기간, 삶의 질, 단백질 발현 및/또는 활성에 의해 평가될 수 있다. 요법의 효능을 결정하기 위한 접근법이 사용될 수 있으며, 이에는, 예를 들어 방사선 영상화를 통한 반응의 측정이 포함된다.
일부 실시 형태에서, 치료 효능은 식 100 - (T/C × 100)을 사용하여 계산된 % 종양 성장 억제(%TGI)로서 측정되며, 여기서 T는 처리된 종양의 평균 상대 종양 부피이고, C는 처리되지 않은 종양의 평균 상대 종양 부피이다. 일부 실시 형태에서, %TGI는 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 또는 95% 초과이다.
항-GPC3 작제물 조성물의 투여 및 투여 방법
개체(예컨대, 인간)에게 투여되는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물, 또는 항-GPC3 CAR T 세포 또는 항-GPC3 caTCR T 세포의 포맷으로 투여됨) 조성물의 용량은 특정 조성, 투여 방식, 및 치료되는 질병의 유형에 따라 달라질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 조성물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물, 항-GPC3 CAR T 세포, 또는 항-GPC3 caTCR T 세포를 포함하는 조성물)의 양은 목적 반응(예컨대, 부분 반응 또는 완전 반응)을 가져오기에 효과적이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물 조성물의 양은 개체에서 완전 반응을 가져오기에 충분하다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물 조성물의 양은 개체에서 부분 반응을 가져오기에 충분하다. 일부 실시 형태에서, (예를 들어, 단독으로 투여될 때) 투여되는 항-GPC3 작제물 조성물의 양은 항-GPC3 작제물 조성물로 치료되는 개체 집단 중에서 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 64%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90% 초과 중 어느 하나의 전체 반응 속도를 생성하기에 충분하다. 본 명세서에 기재된 방법의 치료에 대한 개체의 반응은, 예를 들어 RECIST 수준에 기초하여 결정될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 조성물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물, 항-GPC3 CAR T 세포, 또는 항-GPC3 caTCR T 세포를 포함하는 조성물)의 양은 개체의 무진행 생존율을 연장시키기에 충분하다. 일부 실시 형태에서, 조성물의 양은 개체의 전체 생존율을 연장시키기에 충분하다. 일부 실시 형태에서, (예를 들어, 함께 투여될 때) 조성물의 양은 항-GPC3 작제물 조성물로 치료되는 개체 집단 중에서 약 50%, 60%, 70%, 또는 77% 초과 중 어느 하나의 임상 이득을 생성하기에 충분하다.
일부 실시 형태에서, 단독으로의 또는 제2, 제3, 및/또는 제4 작용제와의 병용 시에의 조성물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물, 항-GPC3 CAR T 세포, 또는 항-GPC3 caTCR T 세포를 포함하는 조성물)의 양은 치료 전의 동일한 대상체에서의 상응하는 종양 크기, 암 세포의 수, 또는 종양 성장 속도와 대비하여, 또는 치료를 받지 않은 다른 대상체에서의 상응하는 활성과 대비하여 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 중 어느 하나만큼 종양 크기를 감소시키거나, 암 세포의 수를 감소시키거나, 또는 종양의 성장 속도를 감소시키기에 충분한 양이다. 정제된 효소를 사용하는 시험관내 검정, 세포-기반 검정, 동물 모델, 또는 인간에 의한 시험과 같은 표준 방법이 이러한 효과의 크기를 측정하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 조성물 내의 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물, 예를 들어 항-GPC3 scFv, 전장 항-GPC3 항체, 다중특이성 항-GPC3 분자, 항-GPC3 CAR, 항-GPC3 caTCR, 또는 항-GPC3 면역접합체)의 양은 독성 효과(즉, 임상적으로 허용되는 독성 수준을 초과하는 효과)를 유도하는 수준 미만이거나 또는 조성물이 개체에게 투여될 때 잠재적인 부작용이 제어되거나 견뎌질 수 있는 수준이다.
일부 실시 형태에서, 조성물의 양은 동일한 투여 계획(dosing regimen)을 따른 후의 조성물의 최대 내약 용량(maximum tolerated dose, MTD)에 가깝다. 일부 실시 형태에서, 조성물의 양은 MTD의 약 80%, 90%, 95%, 또는 98% 초과 중 어느 하나이다.
일부 실시 형태에서, 조성물 내의 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물, 예를 들어 전장 항-GPC3 항체, 다중특이성 항-GPC3 분자, 또는 항-GPC3 면역접합체)의 양은 약 0.001 ㎍ 내지 약 1000 ㎍의 범위에 포함된다.
임의의 상기 태양의 일부 실시 형태에서, 조성물 내의 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물, 예를 들어 전장 항-GPC3 항체, 다중특이성 항-GPC3 분자, 또는 항-GPC3 면역접합체)의 유효량은 약 0.1 ㎍/㎏ 총 체중 내지 약 100 mg/㎏ 총 체중의 범위이다.
항-GPC3 작제물 조성물은, 예를 들어 정맥내, 동맥내, 복막내, 폐내, 경구, 흡입, 방광내, 근육내, 기관내, 피하, 안내(intraocular), 경막내, 경점막, 및 경피를 포함한 다양한 경로를 통해 개체(예컨대, 인간)에게 투여될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 조성물의 지속된 연속 방출 제형이 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 조성물은 정맥내 투여된다. 일부 실시 형태에서, 조성물은 문맥내 투여된다. 일부 실시 형태에서, 조성물은 동맥내 투여된다. 일부 실시 형태에서, 조성물은 복막내 투여된다. 일부 실시 형태에서, 조성물은 간내 투여된다. 일부 실시 형태에서, 조성물은 간 동맥 주입에 의해 투여된다. 일부 실시 형태에서, 투여는 제1 질병 부위에 대해 원위에 있는 주사 부위에 대해 이루어진다.
항-GPC3 CAR 이펙터 세포 요법 및 항-GPC3 caTCR 이펙터 세포 요법
본 출원은 또한 항-GPC3 CAR 또는 항-GPC3 caTCR을 사용하여 이펙터 세포(예를 들어, 1차 T 세포)의 특이성을 GPC3(예컨대, 세포 표면-결합된 GPC3 또는 가용성 GPC3)으로 방향전환시키는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 또한 포유동물에서 GPC-발현 세포를 포함하는 표적 세포 집단 또는 조직에 대해 이펙터 세포-매개 반응(예컨대, T 세포-매개 면역 반응)을 자극하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 항-GPC3 CAR 또는 항-GPC3 caTCR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포유동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR 이펙터 세포 또는 항-GPC3 caTCR 이펙터 세포는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 이중특이성 T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR 이펙터 세포 또는 항-GPC3 caTCR 이펙터 세포에서의 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)의 발현은 (각각) 항-GPC3 CAR 또는 항-GPC3 caTCR을 통한 신호전달 시에 유도가능하다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 NFAT-유래 프로모터, 예컨대 NFAT-유래 최소 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 IL-2 프로모터이다.
항-GPC3 CAR을 발현하는(선택적으로, 항-GPC3 이중특이성 T 세포 인게이저를 추가로 발현하는) 항-GPC3 CAR 이펙터 세포(예컨대, T 세포)가 이를 필요로 하는 수용자에게 주입될 수 있다. 항-GPC3 caTCR을 발현하는(선택적으로, 항-GPC3 이중특이성 T 세포 인게이저를 추가로 발현하는) 항-GPC3 caTCR 이펙터 세포(예컨대, T 세포)가 이를 필요로 하는 수용자에게 주입될 수 있다. 주입된 세포는 수용자에서 세포 표면 상에 GPC3을 발현하는 세포를 사멸시킬 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항체 요법과 달리, 항-GPC3 CAR 이펙터 세포(예컨대, T 세포) 또는 항-GPC3 caTCR 이펙터 세포(예컨대, T 세포)는 생체내에서 복제되어, 지속적인 종양 제어로 이어질 수 있는 장기간 지속성을 가져올 수 있다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR 이펙터 세포는, 강력한 생체내 T 세포 증폭을 거칠 수 있고 연장된 시간 동안 지속될 수 있는 항-GPC3 CAR T 세포이다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-GPC3 CAR T 세포는 임의의 추가의 종양 형성 또는 성장을 억제하도록 재활성화될 수 있는 특정 기억 T 세포로 발달된다.
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR 이펙터 세포는, 강력한 생체내 T 세포 증폭을 거칠 수 있고 연장된 시간 동안 지속될 수 있는 항-GPC3 caTCR T 세포이다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-GPC3 caTCR T 세포는 임의의 추가의 종양 형성 또는 성장을 억제하도록 재활성화될 수 있는 특정 기억 T 세포로 발달된다.
본 발명의 항-GPC3 CAR T 세포 또는 항-GPC3 caTCR T 세포는 또한 포유동물에서 생체외 면역화 및/또는 생체내 요법을 위한 백신 유형으로서의 역할을 할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 포유동물은 인간이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR T 세포 또는 항-GPC3 caTCR T 세포는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 이중특이성 T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)의 발현은 항-GPC3 CAR 또는 항-GPC3 caTCR을 통한 신호전달 시에 유도가능하다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 NFAT-유래 프로모터, 예컨대 NFAT-유래 최소 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 IL-2 프로모터이다.
생체외 면역화에 관하여, 세포를 포유동물에게 투여하기 전에 하기 중 적어도 하나가 시험관내에서 일어난다: i) 세포의 증폭, ii) 항-GPC3 CAR 또는 항-GPC3 caTCR을 인코딩하는 핵산을 세포에 도입함, 및/또는 iii) 세포의 동결보존. 일부 실시 형태에서, 세포는, 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 이중특이성 T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산을 도입함으로써 추가로 시험관내에서 조작된다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 NFAT-유래 프로모터, 예컨대 NFAT-유래 최소 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 IL-2 프로모터이다.
생체외 절차는 당업계에 잘 알려져 있으며, 하기에서 더 충분히 논의된다. 간략하게 말하면, 포유동물(바람직하게는, 인간)로부터 세포가 단리되고, 본 명세서에 개시된 항-GPC3 CAR 또는 항-GPC3 caTCR을 발현하는 벡터로 유전자 변형된다(즉, 시험관내에서 형질도입 또는 형질감염된다). 항-GPC3 CAR 이펙터 세포 또는 항-GPC3 caTCR 이펙터 세포는 치료적 효과를 제공하기 위하여 포유류 수용자에게 투여될 수 있다. 포유류 수용자는 인간일 수 있고, 항-GPC3 CAR 세포(또는 항-GPC3 caTCR 세포)는 수용자에 대해 자가일 수 있다. 대안적으로, 세포는 수령자에 대하여 동종이계, 동계(syngeneic) 또는 이종(xenogeneic)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR 이펙터 세포 또는 항-GPC3 caTCR 이펙터 세포는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 이중특이성 T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하며, 유도성 프로모터는 항-GPC3 CAR 또는 항-GPC3 caTCR을 통한 신호전달에 반응한다.
조혈 줄기 및 전구 세포의 생체외 증폭을 위한 절차가 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제5,199,942호에 기재되어 있으며, 본 발명의 세포에 적용될 수 있다. 다른 적합한 방법이 당업계에 알려져 있으며; 이에 따라 본 발명은 세포의 생체외 증폭의 임의의 특정 방법으로 한정되지 않는다. 간략하게 말하면, T 세포의 생체외 배양 및 증폭은 (1) 포유동물의 말초 혈액 수집 또는 골수 외식편으로부터 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포를 수집하는 단계; 및 (2) 그러한 세포를 생체외에서 증폭시키는 단계를 포함한다. 미국 특허 제5,199,942호에 기재된 세포 성장 인자에 더하여, FLT3-L, IL-1, IL-3 및 c-키트 리간드와 같은 다른 인자들이 세포의 배양 및 증폭에 사용될 수 있다.
생체외 면역화의 관점에서 세포-기반 백신을 사용하는 것에 더하여, 본 발명은 또한 환자에서 항원에 대해 유도된 면역 반응을 이끌어내기 위하여 생체내 면역화를 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
본 발명의 항-GPC3 CAR 이펙터 세포(예컨대, T 세포) 또는 항-GPC3 caTCR 이펙터 세포(예컨대, T 세포)는 단독으로 투여될 수 있거나, 또는 희석제와 배합된 그리고/또는 다른 성분, 예컨대 IL-2 또는 다른 사이토카인 또는 세포 집단과 병용된 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다. 간략하게 말하면, 본 발명의 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 배합하여, 항-GPC3 CAR 이펙터 세포(예컨대, T 세포) 또는 항-GPC3 caTCR 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함할 수 있다. 그러한 조성물은 완충액, 예컨대 중성 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 등; 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산, 예컨대 글리신; 산화방지제; 킬레이팅제, 예컨대 EDTA 또는 글루타티온; 애쥬번트(adjuvant)(예를 들어, 수산화알루미늄); 및 방부제를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR 이펙터 세포(예컨대, T 세포) 조성물 또는 항-GPC3 caTCR 이펙터 세포(예컨대, T 세포) 조성물은 정맥내 투여용으로 제형화된다.
투여되는 본 발명의 항-GPC3 CAR 이펙터 세포(예컨대, T 세포) 조성물 또는 항-GPC3 caTCR 이펙터 세포(예컨대, T 세포) 조성물의 정확한 양은 환자(대상체)의 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이의 정도, 및 상태의 개별적 차이를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR 이펙터 세포(예컨대, T 세포) 또는 항-GPC3 caTCR 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 약제학적 조성물은 약 104 내지 약 109개의 세포/㎏ 체중, 예컨대 약 104 내지 약 105, 약 105 내지 약 106, 약 106 내지 약 107, 약 107 내지 약 108, 또는 약 108 내지 약 109개의 세포/㎏ 체중 중 어느 하나(그러한 범위 내의 모든 정수 값을 포함함)의 투여량으로 투여된다. 항-GPC3 CAR 이펙터 세포(예컨대, T 세포) 조성물 또는 항-GPC3 caTCR 이펙터 세포(예컨대, T 세포) 조성물은 또한 이들 투여량으로 다회 투여될 수 있다. 세포는 면역요법에서 일반적으로 알려진 주입 기법을 사용함으로써 투여될 수 있다(예를 들어, 문헌[Rosenberg et al., New Eng. J.of Med. 319:1676, 1988] 참조). 특정 환자에 대한 최적 투여량 및 치료 계획은 질병의 징후에 대해 환자를 모니터링하고, 그에 따라 치료를 조정함으로써 의학 분야의 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 활성화된 항-GPC3 CAR T 세포 또는 활성화된 항-GPC3 caTCR T 세포를 대상체에게 투여하고, 이어서 후속으로 혈액을 재채혈하고(또는 성분채집술이 수행되고), 본 발명에 따른 그로부터의 T 세포를 활성화시키고, 이들 활성화되고 증폭된 T 세포를 환자에게 재주입하는 것이 요구될 수 있다. 이 과정은 매 수주마다 다회 수행될 수 있다. 일부 실시 형태에서, T 세포는 10 cc 내지 400 cc의 채혈물(blood draw)로부터 활성화될 수 있다. 일부 실시 형태에서, T 세포는 20 cc, 30 cc, 40 cc, 50 cc, 60 cc, 70 cc, 80 cc, 90 cc, 또는 100 cc의 채혈물로부터 활성화된다.
항-GPC3 CAR 이펙터 세포(예컨대, T 세포) 또는 항-GPC3 caTCR 이펙터 세포(예컨대, T 세포)의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 삽입 또는 이식에 의한 것을 포함한 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본 명세서에 기재된 조성물은 환자에게 피하, 진피내, 종양내, 결절내, 수내, 근육내, 정맥내(i.v.) 주사에 의해, 또는 복막내 투여될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-GPC3 CAR 이펙터 세포(예컨대, T 세포) 조성물 또는 항-GPC3 caTCR 이펙터 세포(예컨대, T 세포) 조성물은 진피내 또는 피하 주사에 의해 환자에게 투여된다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 항-GPC3 CAR 이펙터 세포(예컨대, T 세포) 조성물 또는 항-GPC3 caTCR 이펙터 세포(예컨대, T 세포) 조성물은 i.v. 주사에 의해 투여된다. 항-GPC3 CAR 이펙터 세포(예컨대, T 세포) 또는 항-GPC3 caTCR 이펙터 세포(예컨대, T 세포)의 조성물은 종양, 림프절, 또는 감염 부위 내로 직접적으로 주사될 수 있다.
따라서, 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병(예컨대, HCC)을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 CAR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 CAR은 a) 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 항-nGPC3 항체 모이어티가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함)를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 서열을 포함하는 인간 GPC3 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 461의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 462의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 463의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 GPC3의 N-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 1 내지 358 내의 에피토프(서열 번호 468)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 464의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 465)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 580 내의 에피토프(서열 번호 466)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 헤파린 설페이트 측쇄가 결여된 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 510 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 467)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 R358/S359에 있는 푸린 절단 부위에 걸쳐 있는 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 전장 성숙 인간 GPC3(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 560 또는 25 내지 580)에는 특이적으로 결합할 수 있지만, 인간 GPC3의 N-말단 단편(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 358) 또는 인간 GPC3의 C-말단 단편(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 560 또는 359 내지 580)에는 결합하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 헤파린 설페이트 측쇄가 결여된 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 CAR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 CAR은 a) nGPC3에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 항-nGPC3 항체 모이어티(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 항-nGPC3 항체 모이어티가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함)를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 CAR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 CAR은 a) 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 nGPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-nGPC3 항체 모이어티(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 항-nGPC3 항체 모이어티가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함)를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR은 서열 번호 494의 N-말단에 융합된 본 명세서에 기재된 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 이중특이성 T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)의 발현은 항-GPC3 CAR을 통한 신호전달 시에 유도가능하다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 NFAT-유래 프로모터, 예컨대 NFAT-유래 최소 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 IL-2 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 Fab 또는 Fab'이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병은 암이다. 일부 실시 형태에서, 암은, 예를 들어 HCC, 흑색종, 폐 편평 세포 암종, 난소 암종, 난황낭 종양, 융모막암종, 신경아세포종, 간아세포종, 빌름스 종양, 고환 비정상피종성 생식 세포 종양, 위 암종, 또는 지질육종이다. 일부 실시 형태에서, 암은 HCC이다. 일부 실시 형태에서, 암은 전이성 HCC이다. 일부 실시 형태에서, 암은 HCC이고, 치료는 암의 확산을 예방하는 것, 예를 들어 암의 전이를 억제(예컨대, 예방)하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 암은 전이성 HCC이다. 일부 실시 형태에서, 투여는 정맥내, 복막내, 또는 종양내 경로를 통해 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 투여는 정맥내 경로를 통해 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 투여는 종양내 경로를 통해 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 투여는 GPC3-양성 질병(예컨대, GPC3-양성 종양)의 부위에 대해 원위에 있는 주사 부위를 국부 주사하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 주사 부위는 제1 GPC3-양성 종양이다(즉, 투여는 종양내 경로를 통해 이루어진다). 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병의 부위는 제2 GPC3-양성 종양이다. 일부 실시 형태에서, 주사 부위는 제1 GPC3-양성 종양이고, GPC3-양성 질병의 부위는 제2 GPC3-양성 종양이다. 일부 실시 형태에서, 개체는 인간이다.
일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병(예를 들어, HCC)을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 CAR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 CAR은 a) i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병(예를 들어, HCC)을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 CAR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 CAR은 a) i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병(예를 들어, HCC)을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 CAR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 CAR은 a) i) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병(예를 들어, HCC)을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 CAR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 CAR은 a) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 CAR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 CAR은 a) nGPC3에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 항-nGPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 CAR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 CAR은 a) 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 nGPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-nGPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR은 서열 번호 494의 N-말단에 융합된 본 명세서에 기재된 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR은 서열 번호 491 및 516 내지 521 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 이중특이성 T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)의 발현은 항-GPC3 CAR을 통한 신호전달 시에 유도가능하다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 NFAT-유래 프로모터, 예컨대 NFAT-유래 최소 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 IL-2 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 Fab 또는 Fab'이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병은 암이다. 일부 실시 형태에서, 암은, 예를 들어 HCC, 흑색종, 폐 편평 세포 암종, 난소 암종, 난황낭 종양, 융모막암종, 신경아세포종, 간아세포종, 빌름스 종양, 고환 비정상피종성 생식 세포 종양, 위 암종, 또는 지질육종이다. 일부 실시 형태에서, 암은 HCC이다. 일부 실시 형태에서, 암은 HCC이고, 치료는 암의 확산을 예방하는 것, 예를 들어 암의 전이를 억제(예컨대, 예방)하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 암은 전이성 HCC이다. 일부 실시 형태에서, 투여는 정맥내, 복막내, 또는 종양내 경로를 통해 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 투여는 정맥내 경로를 통해 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 투여는 종양내 경로를 통해 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 투여는 GPC3-양성 질병(예컨대, GPC3-양성 종양)의 부위에 대해 원위에 있는 주사 부위를 국부 주사하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 주사 부위는 제1 GPC3-양성 종양이다(즉, 투여는 종양내 경로를 통해 이루어진다). 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병의 부위는 제2 GPC3-양성 종양이다. 일부 실시 형태에서, 주사 부위는 제1 GPC3-양성 종양이고, GPC3-양성 질병의 부위는 제2 GPC3-양성 종양이다. 일부 실시 형태에서, 개체는 인간이다.
일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병(예를 들어, HCC)을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 CAR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 CAR은 a) i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함하는, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병(예를 들어, HCC)을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 CAR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 CAR은 a) i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함하는, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병(예를 들어, HCC)을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 CAR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 CAR은 a) i) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병(예를 들어, HCC)을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 CAR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 CAR은 a) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함하는, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 CAR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 CAR은 a) GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 CAR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 CAR은 a) 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 GPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR은 서열 번호 494의 N-말단에 융합된 본 명세서에 기재된 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 이중특이성 T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)의 발현은 항-GPC3 CAR을 통한 신호전달 시에 유도가능하다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 NFAT-유래 프로모터, 예컨대 NFAT-유래 최소 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 IL-2 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고, 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 가용성 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 가용성 GPC3에 대한 항-sGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-sGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 461의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-sGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 510 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 467)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3 및 가용성 GPC3 둘 모두를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 Fab 또는 Fab'이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병은 암이다. 일부 실시 형태에서, 암은, 예를 들어 HCC, 흑색종, 폐 편평 세포 암종, 난소 암종, 난황낭 종양, 융모막암종, 신경아세포종, 간아세포종, 빌름스 종양, 고환 비정상피종성 생식 세포 종양, 위 암종, 또는 지질육종이다. 일부 실시 형태에서, 암은 HCC이다. 일부 실시 형태에서, 암은 HCC이고, 치료는 암의 확산을 예방하는 것, 예를 들어 암의 전이를 억제(예컨대, 예방)하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 암은 전이성 HCC이다. 일부 실시 형태에서, 투여는 정맥내, 복막내, 또는 종양내 경로를 통해 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 투여는 정맥내 경로를 통해 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 투여는 종양내 경로를 통해 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 투여는 GPC3-양성 질병(예컨대, GPC3-양성 종양)의 부위에 대해 원위에 있는 주사 부위를 국부 주사하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 주사 부위는 제1 GPC3-양성 종양이다(즉, 투여는 종양내 경로를 통해 이루어진다). 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병의 부위는 제2 GPC3-양성 종양이다. 일부 실시 형태에서, 주사 부위는 제1 GPC3-양성 종양이고, GPC3-양성 질병의 부위는 제2 GPC3-양성 종양이다. 일부 실시 형태에서, 개체는 인간이다.
일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병(예를 들어, HCC)을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 caTCR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 caTCR은 a) 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 항-nGPC3 항체 모이어티가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함)를 포함하는 항원-결합 모듈, 및 b) 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(예컨대, CD3δε, CD3γε, 및/또는 ζζ)의 동원을 촉진시키며, 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 서열을 포함하는 인간 GPC3 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 461의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 462의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 463의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 GPC3의 N-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 1 내지 358 내의 에피토프(서열 번호 468)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 464의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 465)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 580 내의 에피토프(서열 번호 466)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 헤파린 설페이트 측쇄가 결여된 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 510 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 467)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 R358/S359에 있는 푸린 절단 부위에 걸쳐 있는 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 전장 성숙 인간 GPC3(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 560 또는 25 내지 580)에는 특이적으로 결합할 수 있지만, 인간 GPC3의 N-말단 단편(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 358) 또는 인간 GPC3의 C-말단 단편(예를 들어, 서열 번호 460의 아미노산 359 내지 560 또는 359 내지 580)에는 결합하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 헤파린 설페이트 측쇄가 결여된 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 caTCR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 caTCR은 a) nGPC3에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 항-nGPC3 항체 모이어티(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 항-nGPC3 항체 모이어티가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함)를 포함하는 항원-결합 모듈, 및 b) 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(예컨대, CD3δε, CD3γε, 및/또는 ζζ)의 동원을 촉진시키며, 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 caTCR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 caTCR은 a) 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 nGPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-nGPC3 항체 모이어티(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 항-nGPC3 항체 모이어티가 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함)를 포함하는 항원-결합 모듈, 및 b) 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(예컨대, CD3δε, CD3γε, 및/또는 ζζ)의 동원을 촉진시키며, 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 caTCR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 caTCR은 a) VH 및 CH1 항체 도메인을 포함하는 제1 항원-결합 도메인 및 제1 TCR 하위단위의 제1 막관통 도메인을 포함하는 제1 T 세포 수용체 도메인(TCRD)을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및 b) VL 및 CL 항체 도메인을 포함하는 제2 항원-결합 도메인 및 제2 TCR 하위단위의 제2 막관통 도메인을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 제1 항원-결합 도메인의 VH 및 CH1 도메인과 제2 항원-결합 도메인의 VL 및 CL 도메인은 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈을 형성하고(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 VH 및 VL의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 VH 및 VL이 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함), 및 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 모듈을 동원할 수 있는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 형성한다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 CH1 도메인 내의 잔기와 CL 도메인 내의 잔기 사이에 이황화물 결합을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 caTCR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 caTCR은 a) VH 항체 도메인을 포함하는 제1 항원-결합 도메인 및 제1 TCR 하위단위의 제1 막관통 도메인을 포함하는 제1 TCRD를 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및 b) VL 항체 도메인을 포함하는 제2 항원-결합 도메인 및 제2 TCR 하위단위의 제2 막관통 도메인을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 제1 항원-결합 도메인의 VH 도메인과 제2 항원-결합 도메인의 VL 도메인은 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈을 형성하고(예를 들어, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 VH 및 VL의 결합 친화도가 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높거나, 또는 VH 및 VL이 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합함), 및 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 모듈을 동원할 수 있는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 형성한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 이중특이성 T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)의 발현은 항-GPC3 caTCR을 통한 신호전달 시에 유도가능하다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 NFAT-유래 프로모터, 예컨대 NFAT-유래 최소 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 IL-2 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM은 천연 발생 T 세포 수용체(예컨대, αβ TCR 또는 γδ TCR)의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 Fab 또는 Fab'이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병은 암이다. 일부 실시 형태에서, 암은, 예를 들어 HCC, 흑색종, 폐 편평 세포 암종, 난소 암종, 난황낭 종양, 융모막암종, 신경아세포종, 간아세포종, 빌름스 종양, 고환 비정상피종성 생식 세포 종양, 위 암종, 또는 지질육종이다. 일부 실시 형태에서, 암은 HCC이다. 일부 실시 형태에서, 암은 HCC이고, 치료는 암의 확산을 예방하는 것, 예를 들어 암의 전이를 억제(예컨대, 예방)하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 암은 전이성 HCC이다. 일부 실시 형태에서, 투여는 정맥내, 복막내, 또는 종양내 경로를 통해 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 투여는 정맥내 경로를 통해 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 투여는 종양내 경로를 통해 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 투여는 GPC3-양성 질병(예컨대, GPC3-양성 종양)의 부위에 대해 원위에 있는 주사 부위를 국부 주사하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 주사 부위는 제1 GPC3-양성 종양이다(즉, 투여는 종양내 경로를 통해 이루어진다). 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병의 부위는 제2 GPC3-양성 종양이다. 일부 실시 형태에서, 주사 부위는 제1 GPC3-양성 종양이고, GPC3-양성 질병의 부위는 제2 GPC3-양성 종양이다. 일부 실시 형태에서, 개체는 인간이다.
일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병(예를 들어, HCC)을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 caTCR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 caTCR은 a) i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항원-결합 모듈, 및 b) 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(예컨대, CD3δε, CD3γε, 및/또는 ζζ)의 동원을 촉진시키며, 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병(예를 들어, HCC)을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 caTCR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 caTCR은 a) i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항원-결합 모듈, 및 b) 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(예컨대, CD3δε, CD3γε, 및/또는 ζζ)의 동원을 촉진시키며, 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병(예를 들어, HCC)을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 caTCR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 caTCR은 a) i) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항원-결합 모듈, 및 b) 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(예컨대, CD3δε, CD3γε, 및/또는 ζζ)의 동원을 촉진시키며, 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병(예를 들어, HCC)을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 caTCR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 caTCR은 a) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함하는, 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항원-결합 모듈, 및 b) 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(예컨대, CD3δε, CD3γε, 및/또는 ζζ)의 동원을 촉진시키며, 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 caTCR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 caTCR은 a) nGPC3에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 항-nGPC3 항체 모이어티를 포함하는 항원-결합 모듈, 및 b) 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(예컨대, CD3δε, CD3γε, 및/또는 ζζ)의 동원을 촉진시키며, 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 caTCR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 caTCR은 a) 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 nGPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-nGPC3 항체 모이어티를 포함하는 항원-결합 모듈, 및 b) 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(예컨대, CD3δε, CD3γε, 및/또는 ζζ)의 동원을 촉진시키며, 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 caTCR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 caTCR은 a) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 CH1 항체 도메인을 포함하는 제1 항원-결합 도메인 및 제1 TCR 하위단위의 제1 막관통 도메인을 포함하는 제1 T 세포 수용체 도메인(TCRD)을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및 b) 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 CL 항체 도메인을 포함하는 제2 항원-결합 도메인 및 제2 TCR 하위단위의 제2 막관통 도메인을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 제1 항원-결합 도메인의 VH 및 CH1 도메인과 제2 항원-결합 도메인의 VL 및 CL 도메인은 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈을 형성하고, 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 모듈을 동원할 수 있는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 형성한다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 CH1 도메인 내의 잔기와 CL 도메인 내의 잔기 사이에 이황화물 결합을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 caTCR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 caTCR은 a) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH 항체 도메인을 포함하는 제1 항원-결합 도메인 및 제1 TCR 하위단위의 제1 막관통 도메인을 포함하는 제1 TCRD를 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및 b) 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL 항체 도메인을 포함하는 제2 항원-결합 도메인 및 제2 TCR 하위단위의 제2 막관통 도메인을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 제1 항원-결합 도메인의 VH 도메인과 제2 항원-결합 도메인의 VL 도메인은 세포 표면-결합된 GPC3에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈을 형성하고, 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 모듈을 동원할 수 있는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 형성한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR은 서열 번호 492 및 서열 번호 493의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 이중특이성 T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)의 발현은 항-GPC3 caTCR을 통한 신호전달 시에 유도가능하다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 NFAT-유래 프로모터, 예컨대 NFAT-유래 최소 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 IL-2 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM은 천연 발생 T 세포 수용체(예컨대, αβ TCR 또는 γδ TCR)의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 Fab 또는 Fab'이다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병은 암이다. 일부 실시 형태에서, 암은, 예를 들어 HCC, 흑색종, 폐 편평 세포 암종, 난소 암종, 난황낭 종양, 융모막암종, 신경아세포종, 간아세포종, 빌름스 종양, 고환 비정상피종성 생식 세포 종양, 위 암종, 또는 지질육종이다. 일부 실시 형태에서, 암은 HCC이다. 일부 실시 형태에서, 암은 HCC이고, 치료는 암의 확산을 예방하는 것, 예를 들어 암의 전이를 억제(예컨대, 예방)하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 암은 전이성 HCC이다. 일부 실시 형태에서, 투여는 정맥내, 복막내, 또는 종양내 경로를 통해 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 투여는 정맥내 경로를 통해 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 투여는 종양내 경로를 통해 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 투여는 GPC3-양성 질병(예컨대, GPC3-양성 종양)의 부위에 대해 원위에 있는 주사 부위를 국부 주사하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 주사 부위는 제1 GPC3-양성 종양이다(즉, 투여는 종양내 경로를 통해 이루어진다). 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병의 부위는 제2 GPC3-양성 종양이다. 일부 실시 형태에서, 주사 부위는 제1 GPC3-양성 종양이고, GPC3-양성 질병의 부위는 제2 GPC3-양성 종양이다. 일부 실시 형태에서, 개체는 인간이다.
일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병(예를 들어, HCC)을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 caTCR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 caTCR은 a) i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개(예컨대, 약 1, 2, 또는 3개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개(예컨대, 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 중 어느 하나)의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함하는, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항원-결합 모듈, 및 b) 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(예컨대, CD3δε, CD3γε, 및/또는 ζζ)의 동원을 촉진시키며, 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병(예를 들어, HCC)을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 caTCR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 caTCR은 a) i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함하는, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항원-결합 모듈, 및 b) 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(예컨대, CD3δε, CD3γε, 및/또는 ζζ)의 동원을 촉진시키며, 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병(예를 들어, HCC)을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 caTCR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 caTCR은 a) i) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항원-결합 모듈, 및 b) 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(예컨대, CD3δε, CD3γε, 및/또는 ζζ)의 동원을 촉진시키며, 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병(예를 들어, HCC)을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 caTCR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 caTCR은 a) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함하는, GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항원-결합 모듈, 및 b) 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(예컨대, CD3δε, CD3γε, 및/또는 ζζ)의 동원을 촉진시키며, 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 caTCR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 caTCR은 a) GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 결합하기 위하여, 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항원-결합 모듈, 및 b) 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(예컨대, CD3δε, CD3γε, 및/또는 ζζ)의 동원을 촉진시키며, 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 caTCR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 caTCR은 a) 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물들 중 어느 하나와 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 GPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-GPC3 항체 모이어티를 포함하는 항원-결합 모듈, 및 b) 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된 제1 TCR 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 천연 발생 TCR(예컨대, αβTCR 또는 γδTCR)의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래된 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자(예컨대, CD3δε, CD3γε, 및/또는 ζζ)의 동원을 촉진시키며, 항체 모이어티는 제1 및/또는 제2 TCRD에 연결된다. 일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 caTCR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 caTCR은 a) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH 및 CH1 항체 도메인을 포함하는 제1 항원-결합 도메인 및 제1 TCR 하위단위의 제1 막관통 도메인을 포함하는 제1 T 세포 수용체 도메인(TCRD)을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및 b) 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL 및 CL 항체 도메인을 포함하는 제2 항원-결합 도메인 및 제2 TCR 하위단위의 제2 막관통 도메인을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 제1 항원-결합 도메인의 VH 및 CH1 도메인과 제2 항원-결합 도메인의 VL 및 CL 도메인은 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈을 형성하고, 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 모듈을 동원할 수 있는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 형성한다. 일부 실시 형태에서, 항원-결합 모듈은 CH1 도메인 내의 잔기와 CL 도메인 내의 잔기 사이에 이황화물 결합을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 항-GPC3 caTCR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 항-GPC3 caTCR은 a) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH 항체 도메인을 포함하는 제1 항원-결합 도메인 및 제1 TCR 하위단위의 제1 막관통 도메인을 포함하는 제1 TCRD를 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; 및 b) 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL 항체 도메인을 포함하는 제2 항원-결합 도메인 및 제2 TCR 하위단위의 제2 막관통 도메인을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 제1 항원-결합 도메인의 VH 도메인과 제2 항원-결합 도메인의 VL 도메인은 GPC3(예를 들어, nGPC3 및/또는 sGPC3)에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모듈을 형성하고, 제1 TCRD와 제2 TCRD는 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 모듈을 동원할 수 있는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 형성한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 caTCR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 이중특이성 T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)의 발현은 항-GPC3 caTCR을 통한 신호전달 시에 유도가능하다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 NFAT-유래 프로모터, 예컨대 NFAT-유래 최소 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 IL-2 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 제1 TCR-TM은 천연 발생 T 세포 수용체(예컨대, αβ TCR 또는 γδ TCR)의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 항-nGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 가용성 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-nGPC3 항체 모이어티는 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고, 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 가용성 GPC3을 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 가용성 GPC3에 대한 항-sGPC3 항체 모이어티의 결합 친화도는 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 결합 친화도보다 더 높다. 일부 실시 형태에서, 항-sGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 461의 아미노산 서열 내의 에피토프를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-sGPC3 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 510 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 467)를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 세포 표면-결합된 GPC3 및 가용성 GPC3 둘 모두를 특이적으로 인식한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 항체 모이어티이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 Fab 또는 Fab'이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 항체 모이어티는 scFv이다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병은 암이다. 일부 실시 형태에서, 암은, 예를 들어 HCC, 흑색종, 폐 편평 세포 암종, 난소 암종, 난황낭 종양, 융모막암종, 신경아세포종, 간아세포종, 빌름스 종양, 고환 비정상피종성 생식 세포 종양, 위 암종, 또는 지질육종이다. 일부 실시 형태에서, 암은 HCC이다. 일부 실시 형태에서, 암은 HCC이고, 치료는 암의 확산을 예방하는 것, 예를 들어 암의 전이를 억제(예컨대, 예방)하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 암은 전이성 HCC이다. 일부 실시 형태에서, 투여는 정맥내, 복막내, 또는 종양내 경로를 통해 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 투여는 정맥내 경로를 통해 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 투여는 종양내 경로를 통해 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 투여는 GPC3-양성 질병(예컨대, GPC3-양성 종양)의 부위에 대해 원위에 있는 주사 부위를 국부 주사하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 주사 부위는 제1 GPC3-양성 종양이다(즉, 투여는 종양내 경로를 통해 이루어진다). 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병의 부위는 제2 GPC3-양성 종양이다. 일부 실시 형태에서, 주사 부위는 제1 GPC3-양성 종양이고, GPC3-양성 질병의 부위는 제2 GPC3-양성 종양이다. 일부 실시 형태에서, 개체는 인간이다.
일부 실시 형태에서, 개체에서 전이성 HCC를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 전술된 임의의 실시 형태에 따른 항-GPC3 CAR 또는 항-GPC3 caTCR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 개체는 인간이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR 또는 항-GPC3 caTCR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 이중특이성 T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 이중특이성 T 세포 인게이저)의 발현은 항-GPC3 CAR 또는 항-GPC3 caTCR을 통한 신호전달 시에 유도가능하다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 NFAT-유래 프로모터, 예컨대 NFAT-유래 최소 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 IL-2 프로모터이다.
일부 실시 형태에서, 개체에서 HCC의 전이를 억제(예컨대, 예방)하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 전술된 임의의 실시 형태에 따른 항-GPC3 CAR 또는 항-GPC3 caTCR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 개체는 인간이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 CAR 또는 항-GPC3 caTCR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 이중특이성 T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 이중특이성 T 세포 인게이저)의 발현은 항-GPC3 CAR 또는 항-GPC3 caTCR을 통한 신호전달 시에 유도가능하다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 NFAT-유래 프로모터, 예컨대 NFAT-유래 최소 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 유도성 프로모터는 IL-2 프로모터이다.
일부 실시 형태에서, 개체에서 T 세포를 프라이밍하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 전술된 임의의 항-GPC3 CAR에 따른 항-GPC3 CAR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 개체에서 T 세포를 프라이밍하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 전술된 임의의 항-GPC3 caTCR에 따른 항-GPC3 caTCR을 발현하는 이펙터 세포(예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 개체는 GPC3-양성 질병을 갖는다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병은 암이다. 일부 실시 형태에서, 암은, 예를 들어 HCC, 흑색종, 폐 편평 세포 암종, 난소 암종, 난황낭 종양, 융모막암종, 신경아세포종, 간아세포종, 빌름스 종양, 고환 비정상피종성 생식 세포 종양, 위 암종, 또는 지질육종이다. 일부 실시 형태에서, 암은 HCC이다. 일부 실시 형태에서, 투여는 정맥내, 복막내, 또는 종양내 경로를 통해 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 투여는 정맥내 경로를 통해 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 투여는 종양내 경로를 통해 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 투여는 제1 질병 부위에 대해 원위에 있는 주사 부위에 대해 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 개체는 인간이다.
일부 실시 형태에서, 전술된 임의의 방법에 따르면, 상기 방법은 항원 제시 세포 또는 APC(예컨대, 단핵구 또는 단핵구-분화된 수지상 세포)를 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 수지상 세포는 특정 사이토카인과 함께 단핵구를 배양함으로써 생체외에서 생성될 수 있다(문헌[Palucka and Banchereau, Nature Reviews Cancer 12:265-277, 2012]). 일부 실시 형태에서, APC는 이펙터 세포 조성물과 동시에 투여된다. 일부 실시 형태에서, APC는 이펙터 세포 조성물과 병행적으로 투여된다. 일부 실시 형태에서, APC는 이펙터 세포 조성물과 순차적으로 투여된다. 일부 실시 형태에서, APC는 이펙터 세포 조성물과 동일한 경로를 통해 투여된다. 일부 실시 형태에서, APC는 이펙터 세포 조성물과 동일한 부위에 투여된다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 세포 조성물은 APC를 포함한다.
암
일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물), 항-GPC3 CAR 세포, 및 항-GPC3 caTCR 세포는 암을 치료하는 데 유용할 수 있다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법을 사용하여 치료될 수 있는 암은 혈관화되지 않은 종양, 또는 아직 실질적으로 혈관화되지 않은 종양뿐만 아니라, 혈관화된 종양을 포함한다. 암은 고형 종양을 포함할 수 있다. 본 발명의 항-GPC3 작제물, 항-GPC3 CAR 세포, 및 항-GPC3 caTCR 세포로 치료되는 암의 유형은 암종, 아세포종, 육종, 양성 및 악성 종양, 및 악성 질병, 예를 들어 육종, 암종, 및 흑색종을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 성인 종양/암 및 소아 종양/암이 또한 포함된다.
고형 종양은 낭포 또는 액체 영역을 통상 함유하지 않는 비정상적인 조직 덩어리이다. 고형 종양은 양성 또는 악성일 수 있다. 고형 종양의 상이한 유형은 그들을 형성하는 세포 유형(예컨대, 육종, 암종, 및 림프종)으로 명명된다. 고형 종양, 예컨대 육종 및 암종의 예에는 섬유육종, 점액육종, 지질육종, 연골육종, 골육종, 및 다른 육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 림프계 악성 질병, 췌장암, 유방암, 폐암(예를 들어, 폐 편평 세포 암종), 난소암, 난황낭 종양(내배엽동 종양), 전립선암, 간세포 암종(HCC), 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 수질성 갑상선 암종, 유두상 갑상선 암종, 크롬친화세포종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 수질성 암종, 기관지원성 암종, 신장 세포 암종, 간암종(hepatoma), 담관 암종, 융모막암종, 빌름스 종양, 자궁경부암, 고환 종양, 정상피종, 방광 암종, 흑색종, 및 CNS 종양(예컨대, 신경교종(예컨대, 뇌간 신경교종 및 혼합 신경교종), 교아세포종(다형성 교아세포종(glioblastoma multiforme)으로도 알려짐), 성상세포종, CNS 림프종, 배아종, 수아세포종, 슈반세포종, 두개인두종, 뇌실막종, 송과체종, 혈관아세포종, 청신경종, 핍지교종, 수막종, 신경아세포종, 망막아세포종 및 뇌 전이)이 포함된다.
일부 실시 형태에서, 본 발명에 의해 치료될 수 있는 암은 HCC이다. GPC3은 HCC 및 HCC 세포주, 예를 들어 HepG2, Hep3B, HT17, HuH6, HuH7 및 PLC/PRF/5에서 고도로 발현된다. GPC3 발현은 HCC에서의 불량한 예후와 상관된다. 일부 실시 형태에서, HCC는 초기 병기 HCC, 비전이성 HCC, 원발성 HCC, 진행성 HCC, 국부 진행성 HCC, 전이성 HCC, 관해기에 있는 HCC, 또는 재발성 HCC이다. 일부 실시 형태에서, HCC는 절제가능한 국한성(즉, 완전한 외과적 절제를 가능하게 하는, 간의 일부분에 국한된 종양)이거나, 절제 불가능한 국한성(즉, 중요한 혈관 구조가 침범되어 있기 때문에 또는 간이 손상되어 있기 때문에, 국한성 종양이 절제 불가능할 수 있음)이거나, 또는 절제 불가능할 수 있다(즉, 종양이 간의 모든 엽(lobe)을 침범하고 있고/있거나 종양이 확산되어 다른 기관(예를 들어, 폐, 림프절, 골)을 침범하였음). 일부 실시 형태에서, HCC는 TNM 분류에 따라, I기 종양(혈관 침습이 없는 단발성 종양), II기 종양(혈관 침습이 있는 단발성 종양, 또는 5 cm를 초과하는 것이 없는 다발성 종양), III기 종양(어떠한 것도 5 cm를 초과하는 것인 다발성 종양, 또는 간문맥 또는 간정맥의 주요 가지(branch)를 침범한 종양), IV기 종양(담낭 이외의 인접 기관을 직접 침습하거나 내장 복막을 천공한 종양), N1 종양(부위 림프절 전이), 또는 M1 종양(원격 전이)이다. 일부 실시 형태에서, HCC는 AJCC(American Joint Commission on Cancer, 미국 암 공동 위원회) 병기 기준에 따르면, T1, T2, T3, 또는 T4기 HCC이다. 일부 실시 형태에서, HCC는 간세포 암종, HCC의 섬유층판성 변이종, 및 혼합형 간세포 담관암종 중 어느 하나이다.
일부 실시 형태에서, GPC3-양성 암은 난황낭 종양(YST, 내배엽동 종양)이다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 암은 난소 암종이다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 암은 융모막암종이다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 암은 고환 비정상피종성 생식 세포 종양이다.
YST는 3세 미만의 어린이에서 가장 흔한 고환 종양이며 유아 배아 암종으로도 알려져 있다. 영아에 전형적인 순수한 형태와는 달리, 성인 YST는 종종 다른 종류의 생식 세포 종양, 특히 기형종 및 배아 암종과 함께 발견된다. 순수한 기형종은 통상 양성이지만, YST는 악성이다.
GPC3은 난소 암종에서는 20% 미만으로 발현되지만, 난소 투명-세포 암종에서는 60%를 초과하여 발현되는데, 이는, GPC3이 난소 투명-세포 암종에 대한 잠재적인 바이오마커를 나타낼 수 있음을 시사한다. GPC3 면역염색은 YST 및 융모막암종의 진단에 유익할 수 있다.
융모막암종은 통상 태반에 존재하는 악성 영양아세포성 암이다. 융모막암종은 태반 이외의 원발 위치에서는 거의 발생하지 않으며; 매우 드물게, 그것은 고환에서 발생한다. 성인 고환의 순수한 융모막암종은 희귀하지만, 성인에서 생식 세포 종양(GCT)의 가장 공격적인 병리학적 변이종을 나타낸다. 이것은 조기 혈행성 및 림프관 전이성 확산을 특징으로 한다. 환자는 조기 확산 및 항암 약물에 대한 고유 저항성(inherent resistance)으로 인해 매우 불량한 예후를 갖는다.
GPC3은 흑색종의 (특히 그 질병의 초기 병기에서의) 진단을 위한 종양 마커로서 사용될 수 있는데, 그 이유는, GPC3 mRNA 및 단백질이 흑색종 및 멜라닌세포 모반에서 80%를 초과하여 발견되었기 때문이다.
GPC3의 발현은 또한 신경아세포종, 간아세포종, 빌름스 종양 세포, 고환 비정상피종성 생식 세포 종양, 및 GPC3-GC로 불리는 위 암종의 특유한 군에서 발견된다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 본 발명은 이들 GPC3-양성 질병을 치료 또는 진단하는 데 사용될 수 있다.
암 치료는, 예를 들어 종양 퇴행, 종양 중량 또는 크기 수축, 진행까지의 시간, 생존 지속기간, 무진행 생존율, 전체 반응 속도, 반응 지속기간, 삶의 질, 단백질 발현 및/또는 활성에 의해 평가될 수 있다. 요법의 효능을 결정하기 위한 접근법이 사용될 수 있으며, 이에는, 예를 들어 방사선 영상화를 통한 반응의 측정이 포함된다.
항-GPC3 작제물을 사용한 진단, 검출 및 이미징 방법
GPC3(세포 표면-결합된 GPC3 또는 가용성 GPC3 어느 것이든)에 특이적으로 결합하는, 표지된 항-GPC3 항체 모이어티 및 이의 유도체 및 유사체(예를 들어, 표지를 포함하는 항-GPC3 면역접합체)는 전술된 임의의 질병 및 장애, 예컨대 암(예를 들어, HCC, 흑색종, 폐 편평 세포 암종, 난소 암종, 난황낭 종양, 융모막암종, 신경아세포종, 간아세포종, 빌름스 종양, 고환 비정상피종성 생식 세포 종양, 위 암종, 또는 지질육종)을 포함한, GPC3의 발현, 비정상 발현 및/또는 활성과 관련된 질병 및/또는 장애를 검출, 진단, 또는 모니터링하기 위해 진단 목적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항-GPC3 항체 모이어티는 원위치, 생체내, 생체외, 및 시험관내 진단 검정 또는 이미징 검정에서 사용될 수 있다.
본 발명의 추가의 실시 형태는 샘플에서 GPC3을 검출하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 샘플을 본 명세서에 기재된 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물, 예를 들어 표지를 포함하는 항-GPC3 면역접합체)과 접촉시키는 단계, 및 표지의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 세포 표면-결합된 GPC3을 갖는 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 가용성 GPC3을 포함한다.
본 발명의 추가의 실시 형태는 개체(예를 들어, 포유동물, 예컨대 인간)에서 GPC3의 발현 또는 비정상 발현과 관련된 질병 또는 장애를 진단하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 개체에서 세포 표면-결합된 GPC3 또는 가용성 GPC3을 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 개체(예를 들어, 포유동물, 예컨대 인간)에서 GPC3의 발현 또는 비정상 발현과 관련된 질병 또는 장애를 진단하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 전술된 임의의 실시 형태에 따른 표지된 항-GPC3 항체 모이어티(예를 들어, 표지를 포함하는 항-GPC3 면역접합체)의 유효량을 개체에게 투여하는 단계; 및 (b) 역치 수준을 초과하는 표지의 수준이 개체가 GPC3-양성 질병 또는 장애를 가짐을 나타내도록 개체에서 표지의 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, GPC3-양성 질병 또는 장애는 암이다. 일부 실시 형태에서, 암은, 예를 들어, HCC, 흑색종, 폐 편평 세포 암종, 난소 암종, 난황낭 종양, 융모막암종, 신경아세포종, 간아세포종, 빌름스 종양, 고환 비정상피종성 생식 세포 종양, 위 암종, 및 지질육종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 암은 HCC이다. 일부 실시 형태에서, 암은 전이성 HCC이다. 일부 실시 형태에서, 암은 전이성 HCC이고, 상기 방법은 개체의 혈액 중의 표지의 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 개체(예를 들어, 포유동물, 예컨대 인간)에서 HCC(예를 들어, 전이성 HCC)를 진단하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 전술된 임의의 실시 형태에 따른 표지된 항-GPC3 항체 모이어티(예를 들어, 표지를 포함하는 항-GPC3 면역접합체)의 유효량을 개체에게 투여하는 단계; 및 (b) 역치 수준을 초과하는 표지의 수준이 개체가 HCC(예를 들어, 전이성 HCC)를 가짐을 나타내도록 개체에서 표지의 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 역치 수준은 다양한 방법에 의해 결정될 수 있는데, 이러한 방법에는, 예를 들어, 질병 또는 장애를 가진 제1 세트의 개체 및 질병 또는 장애를 갖지 않는 제2 세트의 개체에서 전술된 진단 방법에 따라 표지를 검출하고, 제1 세트와 제2 세트 사이의 식별을 가능하게 하는 수준으로 역치를 설정함에 의한 것이 포함된다. 일부 실시 형태에서, 역치 수준은 0이고, 상기 방법은 개체에서 표지의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 단계 (a)의 투여 단계 후에 일정 시간 간격 동안 대기하여, 표지된 항-GPC3 항체 모이어티(예를 들어, 표지를 포함하는 항-GPC3 면역접합체)가 개체에서 GPC3이 발현되는 부위(예를 들어, GPC3-양성 종양 부위, 그리고 제거되어야 할 결합되지 않은 표지된 항-GPC3 항체 모이어티의 경우)에 우선적으로 농축될 수 있게 하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 표지의 백그라운드 수준을 차감하는 단계를 추가로 포함한다. 백그라운드 수준은 다양한 방법에 의해 결정될 수 있으며, 이러한 방법에는, 예를 들어, 표지된 항-GPC3 항체 모이어티(예를 들어, 표지를 포함하는 항-GPC3 면역접합체)의 투여 전에 개체에서 표지를 검출하거나, 또는 질병 또는 장애를 갖지 않는 개체에서 전술된 진단 방법에 따라 표지를 검출함에 의한 것이 포함된다. 일부 실시 형태에서, 개체는 인간이다.
일부 실시 형태에서, 개체(예를 들어, 포유동물, 예컨대 인간)에서 GPC3의 발현 또는 비정상 발현과 관련된 질병 또는 장애를 진단하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 전술된 임의의 실시 형태에 따른 표지된 항-GPC3 항체 모이어티(예를 들어, 표지를 포함하는 항-GPC3 면역접합체)를 개체로부터 유래된 샘플(예컨대, 전혈 또는 균질화된 조직)과 접촉시키는 단계; 및 (b) 표지된 항-GPC3 항체 모이어티와 결합된 세포의 수가 역치 수준을 초과하는 값이 개체가 질병 또는 장애를 가짐을 나타내도록, 샘플 내의 표지된 항-GPC3 항체 모이어티와 결합된 세포의 수를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 질병 또는 장애는 암이다. 일부 실시 형태에서, 암은, 예를 들어, HCC, 흑색종, 폐 편평 세포 암종, 난소 암종, 난황낭 종양, 융모막암종, 신경아세포종, 간아세포종, 빌름스 종양, 고환 비정상피종성 생식 세포 종양, 위 암종, 및 지질육종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 암은 HCC이다. 일부 실시 형태에서, 암은 전이성 HCC이고, 샘플은 혈액 샘플(예컨대, 전혈)이다. 일부 실시 형태에서, 암은 전이성 HCC이다. 일부 실시 형태에서, 개체(예를 들어, 포유동물, 예컨대 인간)에서 HCC(예를 들어, 전이성 HCC)를 진단하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 전술된 임의의 실시 형태에 따른 표지된 항-GPC3 항체 모이어티를 개체로부터 유래된 샘플(예컨대, 전혈)과 접촉시키는 단계; 및 (b) 표지된 항-GPC3 항체 모이어티와 결합된 세포의 수가 역치 수준을 초과하는 값이 HCC(예를 들어, 전이성 HCC)를 가짐을 나타내도록, 샘플 내의 표지된 항-GPC3 항체 모이어티와 결합된 세포의 수를 결정하는 단계를 포함한다. 역치 수준은 다양한 방법에 의해 결정될 수 있는데, 이러한 방법에는, 예를 들어, 질병 또는 장애를 가진 제1 세트의 개체 및 질병 또는 장애를 갖지 않는 제2 세트의 개체에서 전술된 진단 방법에 따라 표지된 항-GPC3 항체 모이어티와 결합된 세포의 수를 결정하고, 제1 세트와 제2 세트 사이의 식별을 가능하게 하는 수준으로 역치를 설정함에 의한 것이 포함된다. 일부 실시 형태에서, 역치 수준은 0이고, 상기 방법은 샘플에서 표지된 항-GPC3 항체 모이어티와 결합된 세포의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 표지된 항-GPC3 항체 모이어티와 결합된 세포의 수의 백그라운드 수준을 차감하는 단계를 추가로 포함한다. 백그라운드 수준은 다양한 방법에 의해 결정될 수 있으며, 이러한 방법에는, 예를 들어, 표지된 항-GPC3 항체 모이어티의 투여 전에 개체에서 표지된 항-GPC3 항체 모이어티와 결합된 세포의 수를 결정하거나, 또는 질병 또는 장애를 갖지 않는 개체에서 전술된 진단 방법에 따라 표지된 항-GPC3 항체 모이어티와 결합된 세포의 수를 결정함에 의한 것이 포함된다. 일부 실시 형태에서, 개체는 인간이다.
본 발명의 항-GPC3 항체 모이어티는 당업자에게 알려진 방법을 사용하여 생물학적 샘플에서 GPC3의 수준을 검정하는 데 사용될 수 있다. 적합한 항체 표지는 당업계에 알려져 있으며, 효소 표지, 예컨대 글루코스 옥시다제; 방사성 동위원소, 예컨대 요오드(131I, 125I, 123I, 121I), 탄소(14C), 황(35S), 삼중수소(3H), 인듐(115mIn, 113mIn, 112In, 111In), 테크네튬(99Tc, 99mTc), 탈륨(201Ti), 갈륨(68Ga, 67Ga), 팔라듐(103Pd), 몰리브덴(99Mo), 제논(133Xe), 불소(18F), 사마륨(153Sm), 루테튬(177Lu), 가돌리늄(159Gd), 프로메튬(149Pm), 란탄(140La), 이테르븀(175Yb), 홀뮴(166Ho), 이트륨(90Y), 스칸듐(47Sc), 레늄(186Re, 188Re), 프라세오디뮴(142Pr), 로듐(105Rh), 및 루테늄(97Ru); 루미놀; 형광 표지, 예컨대 플루오레세인 및 로다민; 및 비오틴을 포함한다.
당업계에 알려진 기법이 본 발명의 표지된 항-GPC3 항체 모이어티(예를 들어, 표지를 포함하는 항-GPC3 면역접합체)에 적용될 수 있다. 그러한 기법은 이작용성 접합제의 사용을 포함하지만 이로 한정되지 않는다(예를 들어, 미국 특허 제5,756,065호; 제5,714,631호; 제5,696,239호; 제5,652,361호; 제5,505,931호; 제5,489,425호; 제5,435,990호; 제5,428,139호; 제5,342,604호; 제5,274,119호; 제4,994,560호; 및 제5,808,003호 참조). 상기 검정 이외에도, 다양한 생체내 및 생체외 검정이 당업자에게 이용가능하다. 예를 들어, 대상체의 체내의 세포를 검출가능한 표지, 예를 들어 방사성 동위원소로 선택적으로 표지된 항-GPC3 항체 모이어티에 노출시킬 수 있으며, 세포에 대한 항-GPC3 항체 모이어티의 결합이 평가될 수 있는데, 이는, 예를 들어, 방사능에 대해 외부 스캐닝함으로써 또는 항-GPC3 항체 모이어티에 이전에 노출된 대상체로부터 유래된 샘플(예를 들어, 생검 또는 다른 생물학적 샘플)을 분석함으로써 행해진다.
제조 물품 및 키트
본 발명의 일부 실시 형태에서, 개체에서 GPC3-양성 질병, 예컨대 암(예를 들어, HCC, 흑색종, 폐 편평 세포 암종, 난소 암종, 난황낭 종양, 융모막암종, 신경아세포종, 간아세포종, 빌름스 종양, 고환 비정상피종성 생식 세포 종양, 위 암종, 또는 지질육종)의 치료에 유용하거나, 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)을 표면 상에 GPC3을 발현하는 세포에 전달하는 데 유용하거나, 세포 표면 상에 GPC3을 발현하는 세포의 단리 또는 검출에, 또는 개체에서 가용성 GPC3의 단리 또는 검출에 유용한 물질들이 담긴 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기, 및 용기 상의 또는 용기와 결합된 라벨 또는 첨부 문서(package insert)를 포함할 수 있다. 적합한 용기는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 일반적으로, 용기는 본 명세서에 기재된 질병 또는 장애를 치료하는 데 효과적인 조성물을 보유하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백, 또는 하피(hypodermic) 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 조성물 내의 적어도 하나의 활성제는 본 발명의 항-GPC3 작제물이다. 라벨 또는 첨부 문서는 조성물이 특정 질환을 치료하는 데 사용됨을 나타낸다. 라벨 또는 첨부 문서는 환자에게 항-GPC3 작제물을 투여하기 위한 설명서를 추가로 포함할 것이다. 본 명세서에 기재된 병용 요법을 포함하는 제조 물품 및 키트가 또한 고려된다.
첨부 문서는 해당 치료적 제품의 사용에 관한 표시, 용법, 용량, 투여, 금기 및/또는 경고에 관한 정보가 들어 있는 치료적 제품의 시판용 패키지에 통상적으로 포함된 설명서를 지칭한다. 일부 실시 형태에서, 첨부 문서는 조성물이 암(예컨대, HCC, 흑색종, 폐 편평 세포 암종, 난소 암종, 난황낭 종양, 융모막암종, 신경아세포종, 간아세포종, 빌름스 종양, 고환 비정상피종성 생식 세포 종양, 위 암종, 또는 지질육종)을 치료하는 데 사용됨을 나타낸다.
추가적으로, 제조 물품은 약제학적으로 허용되는 완충액, 예컨대 정세균 주사용수(BWFI), 인산염 완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 그것은 상업적 관점 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 재료를 추가로 포함할 수 있으며, 이에는 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 및 주사기가 포함된다.
또한, 다양한 목적에, 예를 들어 개체에서 본 명세서에 기재된 GPC3-양성 질병 또는 장애의 치료에 유용하거나, 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물)을 표면 상에 GPC3을 발현하는 세포에 전달하는 데 유용하거나, 세포 표면 상에 GPC3을 발현하는 세포의 단리 또는 검출에, 또는 가용성 GPC3의 단리 또는 검출에 유용한 키트가, 선택적으로 제조 물품과 조합하여 제공된다. 본 발명의 키트는 항-GPC3 작제물을 포함하는 하나 이상의 용기(또는 단위 투여 형태 및/또는 제조 물품)를 포함하며, 일부 실시 형태에서는 다른 작용제(예컨대, 본 명세서에 기재된 작용제) 및/또는 본 명세서에 기재된 임의의 방법에 따라 사용하기 위한 설명서를 추가로 포함한다. 키트는 치료에 적합한 개체의 선택에 대한 설명을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 키트에 공급되는 설명서는 전형적으로 라벨 또는 첨부 문서(예를 들어, 키트에 포함된 종이 시트) 상에 쓰여진 설명서이지만, 기계-판독가능한 설명서(예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크 상에 담긴 설명서)가 또한 허용가능하다.
예를 들어, 일부 실시 형태에서, 키트는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물, 예를 들어 항-GPC3 scFv, 전장 항-GPC3 항체, 다중특이성 항-GPC3 분자(예컨대, 이중특이성 항-GPC3 항체), 또는 항-GPC3 면역접합체)을 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 a) 항-GPC3 작제물을 포함하는 조성물, 및 b) 유효량의 적어도 하나의 다른 작용제를 포함하며, 여기서 다른 작용제는 항-GPC3 작제물의 효과(예를 들어, 치료 효과, 검출 효과)를 향상시킨다. 일부 실시 형태에서, 키트는 a) 항-GPC3 작제물을 포함하는 조성물, 및 b) 항-GPC3 작제물 조성물을 GPC3 양성 질병, 예컨대 HCC의 치료를 위하여 개체에게 투여하기 위한 설명서를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 a) 항-GPC3 작제물을 포함하는 조성물, b) 유효량의 적어도 하나의 다른 작용제 - 다른 작용제는 항-GPC3 작제물의 효과(예를 들어, 치료 효과, 검출 효과)를 향상시킴 -, 및 c) 항-GPC3 작제물 조성물 및 다른 작용제(들)를 GPC3-양성 질병, 예컨대 HCC의 치료를 위하여 개체에게 투여하기 위한 설명서를 포함한다. 항-GPC3 작제물과 다른 작용제(들)는 별개의 용기 내에 또는 단일 용기 내에 존재할 수 있다. 예를 들어, 키트는 하나의 별개의 조성물을 포함하거나, 또는 2개 이상의 조성물을 포함할 수 있는데, 여기서 하나의 조성물은 항-GPC3 작제물을 포함하고 다른 조성물은 다른 작용제를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 키트는 a) 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물, 예를 들어 항-GPC3 scFv, 전장 항-GPC3 항체, 다중특이성 항-GPC3 분자(예컨대, 이중특이성 항-GPC3 항체), 또는 항-GPC3 면역접합체)을 포함하는 조성물, 및 b) 항-GPC3 작제물을 세포(예컨대, 이펙터 세포, 예를 들어 개체로부터 유래된 면역 세포, CAR T 세포, 또는 caTCR T 세포)와 배합하여 항-GPC3 작제물/세포 접합체를 포함하는 조성물을 형성하는 것, 및 항-GPC3 작제물/세포 접합체 조성물을 GPC3-양성 질병(예컨대, HCC)의 치료를 위하여 개체에게 투여하는 것에 관한 설명서를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 a) 항-GPC3 작제물을 포함하는 조성물, 및 b) 세포(예컨대, 세포독성 세포, 예를 들어 세포독성 T 세포, CAR T 세포, 또는 CATCR T 세포)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 a) 항-GPC3 작제물을 포함하는 조성물, b) 세포(예컨대, 세포독성 세포, 예를 들어 세포독성 T 세포, CAR T 세포, 또는 CATCR T 세포), 및 c) 항-GPC3 작제물을 세포와 배합하여 항-GPC3 작제물/세포 접합체를 포함하는 조성물을 형성하는 것, 및 항-GPC3 작제물/세포 접합체 조성물을 GPC3-양성 질병, 예컨대 HCC의 치료를 위하여 개체에게 투여하는 것에 관한 설명서를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 세포(예컨대, 세포독성 세포, 예를 들어 세포독성 T 세포, CAR T 세포, 또는 CATCR T 세포)와 회합된 항-GPC3 작제물을 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 a) 세포(예컨대, 세포독성 세포, 예를 들어 세포독성 T 세포, CAR T 세포, 또는 CATCR T 세포)와 회합된 항-GPC3 작제물을 포함하는 조성물, 및 b) 조성물을 GPC3-양성 질병, 예컨대 HCC의 치료를 위하여 개체에게 투여하는 것에 관한 설명서를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 회합은 항-GPC3 작제물을 세포의 표면 상의 분자에 접합시킴으로써 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 회합은 항-GPC3 작제물(예를 들어, 항-GPC3 CAR, 항-GPC3 caTCR)의 일부분을 세포의 외부 막 내로 삽입함으로써 이루어진다.
일부 실시 형태에서, 키트는 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물, 예를 들어 항-GPC3 scFv, 전장 항-GPC3 항체, 다중특이성 항-GPC3 분자(예컨대, 이중특이성 항-GPC3 항체), 항-GPC3 CAR, 항-GPC3 caTCR, 또는 항-GPC3 면역접합체) 또는 이의 폴리펩티드 부분을 인코딩하는 핵산(또는 핵산 세트)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 a) 항-GPC3 작제물(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저) 또는 이의 폴리펩티드 부분을 인코딩하는 핵산(또는 핵산 세트), 및 b) 핵산(또는 핵산 세트)을 발현하기 위한 숙주 세포(예컨대, 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포, CAR T 세포, 또는 caTCR T 세포)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 a) 항-GPC3 작제물(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저) 또는 이의 폴리펩티드 부분을 인코딩하는 핵산(또는 핵산 세트), 및 b) i) 숙주 세포(예컨대, 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포, CAR T 세포, 또는 caTCR T 세포)에서 항-GPC3 작제물을 발현시키는 것, ii) 항-GPC3 작제물을 포함하는 조성물 또는 항-GPC3 작제물을 발현하는 숙주 세포를 제조하는 것, 및 iii) 항-GPC3 작제물을 포함하는 조성물 또는 항-GPC3 작제물을 발현하는 숙주 세포를 GPC3-양성 질병, 예컨대 HCC의 치료를 위하여 개체에게 투여하는 것에 관한 설명서를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 숙주 세포는 개체로부터 유래된다. 일부 실시 형태에서, 키트는 a) 항-GPC3 작제물(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저) 또는 이의 폴리펩티드 부분을 인코딩하는 핵산(또는 핵산 세트), b) 핵산(또는 핵산 세트)을 발현하기 위한 숙주 세포(예컨대, 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포, CAR T 세포, 또는 caTCR T 세포), 및 c) i) 숙주 세포에서 항-GPC3 작제물을 발현시키는 것, ii) 항-GPC3 작제물을 포함하는 조성물 또는 항-GPC3 작제물을 발현하는 숙주 세포를 제조하는 것, 및 iii) 항-GPC3 작제물을 포함하는 조성물 또는 항-GPC3 작제물을 발현하는 숙주 세포를 GPC3-양성 질병, 예컨대 HCC의 치료를 위하여 개체에게 투여하는 것에 관한 설명서를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저) 또는 이의 폴리펩티드 부분의 발현은 유도가능하다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저) 또는 이의 폴리펩티드 부분을 인코딩하는 핵산(또는 핵산 세트)은 유도성 프로모터(들)의 제어 하에 있다. 일부 실시 형태에서, 이펙터 세포(예를 들어, T 세포, CAR T 세포, caTCR T 세포)에서의 항-GPC3 작제물(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저) 또는 이의 폴리펩티드 부분의 발현은 이펙터 세포(예를 들어, TCR, CAR, caTCR) 상에서 신호전달 수용체를 통한 신호전달 시에 유도가능하다. 예를 들어, 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저) 또는 이의 폴리펩티드 부분을 인코딩하는 핵산(또는 핵산 세트)은 항-GPC3 작제물(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저) 또는 이의 폴리펩티드 부분을 인코딩하는 핵산(또는 핵산 세트)을 CAR T 세포 내로 도입 시에, 그리고 항-GPC3 작제물을 포함하는 조성물 또는 항-GPC3 작제물을 발현하는 숙주 세포를 키트 설명서에 따라 GPC3-양성 질병을 가진 개체에게 도입 시에, CAR T 세포 상의 CAR을 통한 신호전달에 반응성인 유도성 프로모터(들)의 제어 하에 있다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저) 또는 이의 폴리펩티드 부분을 인코딩하는 핵산(또는 핵산 세트)은 항-GPC3 작제물(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저) 또는 이의 폴리펩티드 부분을 인코딩하는 핵산(또는 핵산 세트)을 caTCR T 세포 내로 도입 시에, 그리고 항-GPC3 작제물을 포함하는 조성물 또는 항-GPC3 작제물을 발현하는 숙주 세포를 키트 설명서에 따라 GPC3-양성 질병을 가진 개체에게 도입 시에, caTCR T 세포 상의 caTCR을 통한 신호전달에 반응성인 유도성 프로모터(들)의 제어 하에 있다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저) 또는 이의 폴리펩티드 부분을 인코딩하는 핵산(또는 핵산 세트는 NFAT-유래 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시 형태에서, NFAT-유래 프로모터는 NFAT-유래 최소 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 항-GPC3 작제물(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저) 또는 이의 폴리펩티드 부분을 인코딩하는 핵산(또는 핵산 세트는 IL-2 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
일부 실시 형태에서, 키트는 항-GPC3 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 항-GPC3 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 a) 항-GPC3 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 및 b) i) 벡터를 이펙터 세포, 예컨대 개체로부터 유래된 T 세포 내로 도입하는 것, ii) 항-GPC3 CAR 이펙터 세포를 포함하는 조성물을 제조하는 것, 및 iii) 항-GPC3 CAR 이펙터 세포 조성물을 GPC3-양성 질병, 예컨대 HCC의 치료를 위하여 개체에게 투여하는 것에 대한 설명서를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 키트는 항-GPC3 CAR을 인코딩하는 제1 핵산, 및 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)를 인코딩하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 항-GPC3 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터, 및 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 항-GPC3 CAR을 인코딩하는 제1 핵산, 및 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)를 인코딩하는 제2 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 a) 항-GPC3 CAR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터, 및 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터, 및 b) i) 벡터를 이펙터 세포, 예컨대 개체로부터 유래된 T 세포 내로 도입하는 것, ii) 항-GPC3 CAR 이펙터 세포 및 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자를 포함하는 조성물을 제조하는 것, 및 iii) 항-GPC3 CAR 이펙터 세포 및 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자 조성물을 GPC3-양성 질병, 예컨대 HCC의 치료를 위하여 개체에게 투여하는 것에 대한 설명서를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 a) 항-GPC3 CAR을 인코딩하는 제1 핵산, 및 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)를 인코딩하는 제2 핵산을 포함하는 벡터, 및 b) i) 벡터를 이펙터 세포, 예컨대 개체로부터 유래된 T 세포 내로 도입하는 것, ii) 항-GPC3 CAR 이펙터 세포 및 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자를 포함하는 조성물을 제조하는 것, 및 iii) 항-GPC3 CAR 이펙터 세포 및 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자 조성물을 GPC3-양성 질병, 예컨대 HCC의 치료를 위하여 개체에게 투여하는 것에 대한 설명서를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산은 유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)의 발현은 (예를 들어, GPC3-양성 질병 환경에서) 항-GPC3 CAR의 신호전달을 통해 유도가능하다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산은 NFAT-유래 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 실시 형태에서, NFAT-유래 프로모터는 NFAT-유래 최소 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산은 IL-2 프로모터의 제어 하에 있다.
일부 실시 형태에서, 키트는 항-GPC3 caTCR을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 항-GPC3 caTCR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 a) 항-GPC3 caTCR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 및 b) i) 벡터를 이펙터 세포, 예컨대 개체로부터 유래된 T 세포 내로 도입하는 것, ii) 항-GPC3 caTCR 이펙터 세포를 포함하는 조성물을 제조하는 것, 및 iii) 항-GPC3 caTCR 이펙터 세포 조성물을 GPC3-양성 질병, 예컨대 HCC의 치료를 위하여 개체에게 투여하는 것에 대한 설명서를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 키트는 항-GPC3 caTCR을 인코딩하는 제1 핵산, 및 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)를 인코딩하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 항-GPC3 caTCR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터, 및 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 항-GPC3 caTCR을 인코딩하는 제1 핵산, 및 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)를 인코딩하는 제2 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 a) 항-GPC3 caTCR을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터, 및 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터, 및 b) i) 벡터를 이펙터 세포, 예컨대 개체로부터 유래된 T 세포 내로 도입하는 것, ii) 항-GPC3 caTCR 이펙터 세포 및 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자를 포함하는 조성물을 제조하는 것, 및 iii) 항-GPC3 caTCR 이펙터 세포 및 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자 조성물을 GPC3-양성 질병, 예컨대 HCC의 치료를 위하여 개체에게 투여하는 것에 대한 설명서를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키트는 a) 항-GPC3 caTCR을 인코딩하는 제1 핵산, 및 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)를 인코딩하는 제2 핵산을 포함하는 벡터, 및 b) i) 벡터를 이펙터 세포, 예컨대 개체로부터 유래된 T 세포 내로 도입하는 것, ii) 항-GPC3 caTCR 이펙터 세포 및 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자를 포함하는 조성물을 제조하는 것, 및 iii) 항-GPC3 caTCR 이펙터 세포 및 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자 조성물을 GPC3-양성 질병, 예컨대 HCC의 치료를 위하여 개체에게 투여하는 것에 대한 설명서를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산은 유도성 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)의 발현은 (예를 들어, GPC3-양성 질병 환경에서) 항-GPC3 caTCR의 신호전달을 통해 유도가능하다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산은 NFAT-유래 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 실시 형태에서, NFAT-유래 프로모터는 NFAT-유래 최소 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 다중특이성(예를 들어, 이중특이성) 항-GPC3 분자(예를 들어, 항-GPC3×CD3 탠덤 다이-scFv T 세포 인게이저)를 인코딩하는 핵산은 IL-2 프로모터의 제어 하에 있다.
본 발명의 키트는 적합한 포장물 내에 존재한다. 적합한 포장물에는 바이알, 병, 자르(jar), 유연 포장물(예를 들어, 밀봉된 마일러(Mylar) 또는 플라스틱 백) 등이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 키트는 선택적으로 추가의 성분, 예컨대 완충액 및 해석을 제공하는 정보를 제공할 수 있다. 따라서, 본 출원은 또한 바이알(예컨대, 밀봉된 바이알), 병, 자르, 유연 포장물 등을 포함하는 제조 물품을 제공한다.
항-GPC3 작제물의 사용에 관한 설명서는 일반적으로 의도된 치료를 위한 투여량, 투여 스케줄, 및 투여 경로에 대한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지(예를 들어, 다회-용량 패키지) 또는 하위-단위 용량일 수 있다. 예를 들어, 연장된 기간 동안, 예컨대 1주, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 2주, 3주, 4주, 6주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월, 7개월, 8개월, 9개월, 또는 그 이상 동안 중 어느 하나에서 개체의 효과적인 치료를 제공하기에 충분한 투여량으로 본 명세서에 개시된 바와 같은 항-GPC3 작제물(예컨대, 단리된 항-GPC3 작제물, 예를 들어 항-GPC3 scFv, 전장 항-GPC3 항체, 다중특이성 항-GPC3 분자(예컨대, 이중특이성 항-GPC3 항체), 항-GPC3 CAR, 항-GPC3 caTCR, 또는 항-GPC3 면역접합체)이 담긴 키트가 제공될 수 있다. 키트는 또한 약국, 예를 들어, 병원 약국 및 조제 약국에서 보관 및 사용하기에 충분한 양으로 포장된 다회 단위 용량의 항-GPC3 작제물 및 약제학적 조성물 및 사용 설명서를 포함할 수 있다.
당업자는 몇몇 실시 형태가 본 발명의 범주 및 사상 내에서 가능하다는 것을 인식할 것이다. 이제, 본 발명을 하기의 비제한적인 실시예를 참조하여 더 상세히 설명할 것이다. 하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하지만, 물론, 어떠한 방식으로든 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
예시적인 실시 형태
실시 형태 1. 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티를 포함하는, 단리된 항-글리피칸 3(GPC3) 작제물.
실시 형태 2. 실시 형태 1에 있어서, 상기 항체 모이어티는 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고, 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 3. 실시 형태 2에 있어서, 상기 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 상기 항-GPC3 작제물의 Kd는 약 0.1 nM 내지 약 2 nM인, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 4. 실시 형태 2 또는 실시 형태 3에 있어서, 상기 항-GPC3 작제물과 상기 세포 표면-결합된 GPC3 사이의 경쟁적 결합에 대한 가용성 GPC3의 IC50은 약 1 ㎍/ml 내지 약 100 ㎍/ml인, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 5. 실시 형태 1에 있어서, 상기 항체 모이어티는 낮은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고, 높은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 6. 실시 형태 5에 있어서, 상기 세포 표면-결합된 GPC3에 대한 상기 항-GPC3 작제물의 Kd는 약 10 nM 내지 약 100 nM인, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 7. 실시 형태 5 또는 실시 형태 6에 있어서, 상기 항-GPC3 작제물과 상기 세포 표면-결합된 GPC3 사이의 경쟁적 결합에 대한 가용성 GPC3의 IC50은 약 0.01 ㎍/ml 내지 약 1 ㎍/ml인, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 8. 실시 형태 3 내지 실시 형태 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 표면-결합된 GPC3은 HepG2 세포 상에 발현된 GPC3인, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 9. 실시 형태 1 내지 실시 형태 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포 표면-결합된 GPC3은 서열 번호 460 또는 서열 번호 462의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 10. 실시 형태 1 내지 실시 형태 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 가용성 GPC3은 서열 번호 461 또는 서열 번호 463의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 11. 실시 형태 1 내지 실시 형태 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 서열을 포함하는 인간 GPC3 내의 에피토프를 특이적으로 인식하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 12. 실시 형태 11에 있어서, 상기 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 1 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 461)를 특이적으로 인식하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 13. 실시 형태 11에 있어서, 상기 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 580 내의 에피토프(서열 번호 462)를 특이적으로 인식하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 14. 실시 형태 11 또는 실시 형태 12에 있어서, 상기 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 560 내의 에피토프(서열 번호 463)를 특이적으로 인식하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 15. 실시 형태 1 내지 실시 형태 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 모이어티는 GPC3의 N-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 16. 실시 형태 15에 있어서, 상기 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 25 내지 358 내의 에피토프(서열 번호 464)를 특이적으로 인식하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 17. 실시 형태 1 내지 실시 형태 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 모이어티는 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 18. 실시 형태 17에 있어서, 상기 항체 모이어티는 헤파린 설페이트 측쇄가 결여된 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 19. 실시 형태 1 내지 실시 형태 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체 모이어티는 GC33과 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 GPC3 에피토프에 특이적으로 결합하지 않는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 20. 실시 형태 19에 있어서, 상기 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 524 내지 565 내의 에피토프(서열 번호 536)에 결합하지 않는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 21. 실시 형태 19 또는 실시 형태 20에 있어서, 상기 항체 모이어티는 서열 번호 460의 아미노산 524 내지 565를 포함하는 단편(서열 번호 536)에 결합하지 않는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 22. 실시 형태 1 내지 실시 형태 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 GPC3은 HepG2, Hep3B, Huh7, JHH-7, 및 293으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포의 표면 상에서 발현되는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 23. 실시 형태 1 내지 실시 형태 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 GPC3은 암 세포의 표면 상에서 발현되는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 24. 실시 형태 23에 있어서, 상기 암 세포는 간암 세포인, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 25. 실시 형태 24에 있어서, 상기 암 세포는 간세포 암종(HCC)인, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 26. 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티를 포함하는 단리된 항-GPC3 작제물로서, 상기 항체 모이어티는 i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역(HC-CDR) 1, 또는 최대 약 5개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역(LC-CDR) 1, 또는 최대 약 5개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 27. 실시 형태 26에 있어서, 상기 항체 모이어티는 i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 28. 실시 형태 26 또는 실시 형태 27에 있어서, 상기 항체 모이어티는 i) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 또는 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나와 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 및 ii) 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 또는 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나와 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 29. 실시 형태 28에 있어서, 상기 항체 모이어티는 i) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 30. 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티를 포함하는 단리된 항-GPC3 작제물로서, 상기 항체 모이어티는 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 31. 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티를 포함하는 단리된 항-GPC3 작제물로서, 상기 항체 모이어티는 i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 32. GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티를 포함하는 단리된 항-GPC3 작제물로서, 상기 항체 모이어티는 i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 33. 실시 형태 32에 있어서, 상기 항체 모이어티는 i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3을 포함하는 VL을 포함하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 34. 실시 형태 32 또는 실시 형태 33에 있어서, 상기 항체 모이어티는 i) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 또는 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나와 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 및 ii) 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 또는 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나와 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 35. 실시 형태 34에 있어서, 상기 항체 모이어티는 i) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 36. GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티를 포함하는 단리된 항-GPC3 작제물로서, 상기 항체 모이어티는 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH의 HC-CDR, 및 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL의 LC-CDR을 포함하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 37. 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티를 포함하는 단리된 항-GPC3 작제물로서, 상기 항체 모이어티는 i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH; 및 ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 38. 실시 형태 1 내지 실시 형태 37 중 어느 하나의 단리된 항-GPC3 작제물과 경쟁적으로 GPC3에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티를 포함하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 39. 실시 형태 1 내지 실시 형태 37 중 어느 하나의 단리된 항-GPC3 작제물과 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 GPC3 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티를 포함하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 40. 실시 형태 1 내지 실시 형태 39 중 어느 하나에 있어서, 상기 GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티는 키메라, 인간, 부분 인간화, 완전 인간화, 또는 반합성 항체 모이어티인, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 41. 실시 형태 1 내지 실시 형태 40 중 어느 하나에 있어서, 상기 GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티는 전장 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv(scFv)인, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 42. 실시 형태 41에 있어서, 상기 GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티는 scFv인, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 43. 실시 형태 41에 있어서, 상기 GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티는 Fab 또는 Fab'인, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 44. 실시 형태 1 내지 실시 형태 43 중 어느 하나에 있어서, 상기 GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티는, 선택적으로 링커를 통해, Fc 단편에 융합되는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 45. 실시 형태 44에 있어서, 상기 Fc 단편은 IgG1 Fc 단편인, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 46. 실시 형태 1 내지 실시 형태 40 및 실시 형태 44 또는 실시 형태 45 중 어느 하나에 있어서, 상기 단리된 항-GPC3 작제물은 전장 항체인, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 47. 실시 형태 1 내지 실시 형태 46 중 어느 하나에 있어서, 상기 단리된 항-GPC3 작제물은 단일특이성인, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 48. 실시 형태 1 내지 실시 형태 46 중 어느 하나에 있어서, 상기 단리된 항-GPC3 작제물은 다중특이성인, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 49. 실시 형태 48에 있어서, 상기 단리된 항-GPC3 작제물은 이중특이성인, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 50. 실시 형태 48 또는 실시 형태 49에 있어서, 상기 단리된 항-GPC3 작제물은 탠덤 scFv, 다이아바디(Db), 단일쇄 다이아바디(scDb), 이중-친화성 재표적화(DART) 항체, F(ab')2, 이중 가변 도메인(DVD) 항체, 노브-인투-홀(KiH) 항체, 독 앤드 락(DNL) 항체, 화학적으로 가교결합된 항체, 이종다량체성 항체, 또는 이종접합 항체인, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 51. 실시 형태 50에 있어서, 상기 단리된 항-GPC3 작제물은 펩티드 링커에 의해 연결된 2개의 scFv를 포함하는 탠덤 scFv인, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 52. 실시 형태 51에 있어서, 상기 펩티드 링커는 TSGGGGS(서열 번호 474)의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 53. 실시 형태 48 내지 실시 형태 52 중 어느 하나에 있어서, 상기 단리된 항-GPC3 작제물은 제2 항원을 특이적으로 인식하는 제2 항체 모이어티를 추가로 포함하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 54. 실시 형태 53에 있어서, 상기 제2 항원은 T 세포의 표면 상의 항원인, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 55. 실시 형태 54에 있어서, 상기 제2 항원은 CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, CD40L, 및 HVEM으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 56. 실시 형태 55에 있어서, 상기 제2 항원은 CD3ε인, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 57. 실시 형태 56에 있어서, 상기 단리된 항-GPC3 작제물은 GPC3을 특이적으로 인식하는 N-말단 scFv 및 CD3ε을 특이적으로 인식하는 C-말단 scFv를 포함하는 탠덤 scFv인, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 58. 실시 형태 53에 있어서, 상기 제2 항원은 B 세포, 자연 살해 세포, 수지상 세포, 대식세포, 단핵구, 또는 호중구의 표면 상의 항원인, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 59. 실시 형태 1 내지 실시 형태 43 중 어느 하나에 있어서, 상기 단리된 항-GPC3 작제물은 키메라 항원 수용체(CAR)이며, CAR은 (a) 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인; (b) 막관통 도메인; 및 (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 60. 실시 형태 59에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 61. 실시 형태 1 내지 실시 형태 43 중 어느 하나에 있어서, 상기 단리된 항-GPC3 작제물은 키메라 항체-T 세포 수용체(TCR) 작제물(caTCR)이며, caTCR은 (a) 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인; 및 (b) 제1 T 세포 수용체 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 동원을 촉진시키는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 62. 실시 형태 61에 있어서, 상기 제1 TCR-TM은 제1 천연 발생 TCR의 막관통 도메인들 중 하나로부터 유래되고, 상기 제2 TCR-TM은 제1 천연 발생 TCR의 다른 하나의 막관통 도메인으로부터 유래되는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 63. 실시 형태 61에 있어서, 상기 TCR-TM들 중 적어도 하나는 천연 비발생적인, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 64. 실시 형태 63에 있어서, 상기 TCRM은 상기 제1 천연 발생 T 세포 수용체의 막관통 도메인을 포함하는 TCRM과 대비하여 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 향상된 동원을 가능하게 하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 65. 실시 형태 62에 있어서, 상기 제1 천연 발생 TCR은 γ/δ TCR인, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 66. 실시 형태 62에 있어서, 상기 제1 천연 발생 TCR은 α/β TCR인, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 67. 실시 형태 61 내지 실시 형태 66 중 어느 하나에 있어서, 상기 TCR-회합 신호전달 분자는 CD3δε, CD3γε, 및 ζζ로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 68. 실시 형태 1 내지 실시 형태 58 중 어느 하나에 있어서, 상기 단리된 항-GPC3 작제물은 상기 항체 모이어티 및 이펙터 분자를 포함하는 면역접합체인, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 69. 실시 형태 68에 있어서, 상기 이펙터 분자는 약물, 독소, 방사성 동위원소, 단백질, 펩티드, 및 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료제인, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 70. 실시 형태 69에 있어서, 상기 치료제는 약물 또는 독소인, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 71. 실시 형태 68에 있어서, 상기 이펙터 분자는 표지인, 단리된 항-GPC3 작제물.
실시 형태 72. 실시 형태 1 내지 실시 형태 71 중 어느 하나의 단리된 항-GPC3 작제물의 폴리펩티드 성분을 인코딩하는, 단리된 핵산.
실시 형태 73. 실시 형태 72의 단리된 핵산을 포함하는, 벡터.
실시 형태 74. 실시 형태 1 내지 실시 형태 71 중 어느 하나의 항-GPC3 작제물, 실시 형태 72의 단리된 핵산, 또는 실시 형태 73의 벡터를 포함하는, 단리된 숙주 세포.
실시 형태 75. 실시 형태 53 내지 실시 형태 67 중 어느 하나의 단리된 항-GPC3 작제물을 발현하는, 이펙터 세포.
실시 형태 76. 실시 형태 75에 있어서, 상기 이펙터 세포는 T 세포인, 이펙터 세포.
실시 형태 77. 실시 형태 76에 있어서, 상기 T 세포는 세포독성 T 세포, 헬퍼 T 세포, 및 자연 살해 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이펙터 세포.
실시 형태 78. 실시 형태 75 내지 실시 형태 77 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-GPC3 작제물의 발현은 상기 이펙터 세포의 활성화에 의해 유도되는, 이펙터 세포.
실시 형태 79. 실시 형태 75 내지 실시 형태 78 중 어느 하나에 있어서, 상기 이펙터 세포는 키메라 항체-T 세포 수용체(TCR) 작제물(caTCR)을 추가로 포함하는, 이펙터 세포.
실시 형태 80. 실시 형태 1 내지 실시 형태 71 중 어느 하나의 단리된 항-GPC3 작제물 또는 실시 형태 75 내지 실시 형태 79 중 어느 하나의 이펙터 세포, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
실시 형태 81. 실시 형태 1 내지 실시 형태 71 중 어느 하나의 단리된 항-GPC3 작제물, 실시 형태 72의 단리된 핵산, 실시 형태 73의 벡터, 실시 형태 74의 단리된 숙주 세포, 실시 형태 75 내지 실시 형태 79 중 어느 하나의 이펙터 세포, 또는 실시 형태 80의 약제학적 조성물을 포함하는, 키트.
실시 형태 82. 샘플에서 GPC3을 검출하는 방법으로서, 상기 샘플을 실시 형태 71의 단리된 항-GPC3 작제물과 접촉시키는 단계, 및 상기 표지의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
실시 형태 83. 실시 형태 82에 있어서, 상기 샘플은 세포 표면-결합된 GPC3을 갖는 세포를 포함하는, 방법.
실시 형태 84. 실시 형태 83에 있어서, 상기 샘플은 가용성 GPC3을 포함하는, 방법.
실시 형태 85. GPC3-양성 질병을 가진 개체를 치료하는 방법으로서, 실시 형태 80의 약제학적 조성물의 유효량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
실시 형태 86. 실시 형태 85에 있어서, 상기 투여는 정맥내 또는 종양내 경로를 통해 이루어지는, 방법.
실시 형태 87. 실시 형태 85에 있어서, 상기 투여는 제1 질병 부위에 대해 원위에 있는 주사 부위에 대해 이루어지는, 방법.
실시 형태 88. 실시 형태 85 내지 실시 형태 87 중 어느 하나에 있어서, 추가의 요법을 상기 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시 형태 89. GPC3-양성 질병을 가진 개체를 진단하는 방법으로서, a) 상기 개체에게 실시 형태 71의 단리된 항-GPC3 작제물의 유효량을 투여하는 단계; 및 b) 상기 개체에서 표지의 수준을 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 역치 수준을 초과하는 표지의 수준이 상기 개체가 상기 GPC3-양성 질병을 가짐을 나타내는, 방법.
실시 형태 90. GPC3-양성 질병을 가진 개체를 진단하는 방법으로서, 상기 방법은 a) 상기 개체로부터 유래된 샘플을 실시 형태 71의 단리된 항-GPC3 작제물과 접촉시키는 단계; 및 b) 상기 샘플 내의 상기 단리된 항-GPC3 작제물과 결합된 세포의 수를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 단리된 항-GPC3 작제물과 결합된 세포의 수가 역치 수준을 초과하는 값이 상기 개체가 상기 GPC3-양성 질병을 가짐을 나타내는, 방법.
실시 형태 91. 실시 형태 85 내지 실시 형태 90 중 어느 하나에 있어서, 상기 GPC3-양성 질병은 암인, 방법.
실시 형태 92. 실시 형태 91에 있어서, 상기 암은 HCC, 흑색종, 폐 편평 세포 암종, 난소 암종, 난황낭 종양, 융모막암종, 신경아세포종, 간아세포종, 빌름스 종양, 고환 비정상피종성 생식 세포 종양, 위 암종, 및 지질육종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
실시 형태 93. 실시 형태 92에 있어서, 상기 암은 HCC인, 방법.
실시 형태 94. 실시 형태 93에 있어서, 상기 암은 전이성 HCC인, 방법.
실시 형태 95. 단리된 항-GPC3 작제물을 생성하는 방법으로서, (a) 상기 항-GPC3 작제물을 발현하기에 효과적인 조건 하에서 실시 형태 72의 단리된 핵산 또는 실시 형태 73의 벡터를 포함하는 숙주 세포, 또는 실시 형태 74의 단리된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 숙주 세포로부터 발현된 항-GPC3 작제물을 얻는 단계를 포함하는, 방법.
실시 형태 96. 실시 형태 95에 있어서, 단계 (a)는 상기 단리된 핵산 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포를 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시예
재료 및 방법
세포주 HepG2 및 SK-Hep1을 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 입수하였다. HepG2는 인간 간세포 암종 세포주(ATCC HB-8065)이다. SK-Hep1은 간 내피 선암종 세포주(ATCC HTB-52)이다. 세포주를 37℃/5% CO2에서 10% FBS가 보충된 RPMI 1640 또는 DMEM 중에서 배양하였다.
FITC-표지 항-His 항체는 본 명세서에 기재된 이중특이성 항-GPC3 T 세포 인게이저 항체의 검출을 위하여 Thermo Fisher Scientific(Cat MA1-81891)으로부터 구매하였으며, 이는 C-말단에 6×His 태그를 갖는다.
GC33은 아미노산 524 내지 565로 이루어진 인간 C-말단 GPC3 단편으로 면역화된 마우스로부터 유래된 단일클론 항체이다(문헌[Ishiguro et al., Cancer Res 2008; 68:9832-9838]). 도 7b에 사용된 GC33 항체는 Roche Diagnostics(Cat. 790-4564)로부터 구매하였다.
재조합 인간 GPC3 단편의 생성
재조합 인간 GPC3(560) 단백질은 전장 인간 GPC3 전구체 단백질(서열 번호 461)의 아미노산 1 내지 560을 포함하며, 이것은 GPI 앵커 부위가 결여된 인간 GPC3의 세포외 도메인을 포함하고, 그의 C-말단에 6×His 태그를 추가로 융합하였다. 재조합 인간 GPC3(560) 단백질을 렌티바이러스 벡터 pCDH EF1-MCS(System Biosciences)로부터 발현시켰다.
비오티닐화 GPC3(560)(bt-GPC3(560))을 표준 프로토콜에 따라 제조하였다(문헌[Altman, J.D. & Davis, M.M., Current Protocols in Immunology 17.3.1-17.3.33, 2003]). 간략하게 말하면, BirA 기질 펩티드(BSP)를 인코딩하는 DNA를 재조합 인간 GPC3(560) 단백질(서열 번호 461)의 C-말단에 연결시키고, 벡터 pET-27b 내로 클로닝하고, E. 콜라이 BL21 세포 내로 형질전환시키고, 이어서 세균 배양물로부터 봉입체(inclusion body)로서 단리하였다. GPC3(560)-BSP 단백질을 한외여과에 의해 농축시키고, 크기-배제 크로마토그래피를 통해 추가로 정제하였다. 이어서, GPC3(560)-BSP 펩티드를 BirA-매개 효소 반응을 통해 비오티닐화하고, 후속으로 고분해능 음이온-교환 크로마토그래피로 정제하였다.
GPC3-51량체 단편은 전장 인간 GPC3 전구체 단백질(서열 번호 467)의 아미노산 510 내지 560을 나타내며, 이 펩티드 및 이 펩티드의 비오티닐화된 형태는 Elim Biopharmaceuticals에 의해 합성하였다.
SK-Hep1-GPC3 세포의 생성
GPC3 단백질을 과발현하는 SK-Hep1 세포를 렌티바이러스 벡터(pCDH EF1-MCS, System Biosciences) 상에 담지된 전장 인간 GPC3(서열 번호 460)을 사용하여 Eureka Therapeutics에 의해 제조하였으며, 이것은 본 명세서에서 "SK-Hep1-GPC3"으로 지칭된다.
HepG2 GPC3 녹아웃(HepG2-GPC3-KO) 세포의 생성
HepG2 GPC3 녹아웃 세포주 HepG2-GPC3-KO-2, KO-3, 및 KO-11을 기재된 바와 같은 시판 CRISPR-Cas9 벡터(lentiCRISPR-V2, OriGene; 문헌[Sanjana et al., Nat Methods. 2014; 11:783-784])를 사용하여 생성하였다. GPC3-특이적 가이드 RNA(gRNA) 서열을 lentiCRISPR-V2 골격 내로 클로닝하고, 이 벡터를 사용하여 Stb13 세균을 형질전환시켰다. 양성 클론을 서열분석하고, HEK 293FT 세포 내로 형질감염시켜 GPC3-CRISPR 렌티바이러스를 생성하였다. HepG2 세포를 감염시키고 2주 동안 선택 하에서 배양하고, FACS 분석에 의해 GPC3 발현에 대해 측정하였다.
FACS 분석
시판 마우스 항-인간 GPC3 항체(Santa Cruz Biotech sc-65443)를 사용하여 FACS를 수행하였으며, 이때 상기 항체는 GPC3의 C-말단 부분에 결합한다. 50 μl의 IG12 항체를 PBS + 5% FBS 중에 50, 100 및 200배로 희석시키고, 4℃에서 1시간 동안 GPC3+ HepG2 세포와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 PBS 중에 세척하고, PE-접합된 마우스 항-IgG 2차 항체(Vector Labs #EI-2007)를 5% FBS를 함유하는 PBS 중 1:200 희석물로 첨가하고, 암실에서 4℃에서 추가 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하고 고정시켰다.
FACS 분석 결과가 도 8에 요약되어 있다. 생성된 13개의 모든 HepG2-GPC3-KO 세포주는 항-hGPC3 항체(1G12) 결합에 대해 음성이었는데, 이는 HepG2 세포에서의 GPC3 발현의 성공적인 녹아웃을 입증한다. 서열분석의 분석은 HepG2-GPC3-KO 세포주 KO#2, KO#3, 및 KO#11이 GPC3 음성임을 추가로 확인시켜 주었다. 13개의 HepG2-GPC3-KO 세포주 중에서, HepG2-GPC3-KO-2, HepG2-GPC3-KO-3, 및 HepG2-GPC3-KO-11 세포주를 추가 연구에 사용하였다.
파지 디스플레이 라이브러리의 패닝
Eureka Therapeutics E-ALPHA™ 파지 라이브러리(인간 scFv 파지 라이브러리)를 GPC3 반응성 파지 클론에 대한 패닝에 의해 스크리닝하였다. 파지 클론의 단리 및 FACS 분석은 하기 시약을 사용하여 수행하였다: 마우스 항-M13 mAb(Thermo Fisher Scientific(#MA1-12900)), PE-항-마우스 IgG(Vector Labs(#EI-2007)) 및 고정 완충액(Biolegend #420801). 대조 마우스 항-GPC3 항체(클론 1G12)는 Santa Cruz Biotech(#SC-65443)로부터 구매하였다.
ELISA 패닝
ELISA 패닝을 96웰 플레이트에서 수행하였는데, 96웰 플레이트를 스트렙타비딘으로 코팅하고, 블로킹하고, 비오티닐화 GPC3 펩티드 표적(bt-GPC3(560) 또는 bt-GPC3-51량체)으로 코팅하고, 이어서 (인간 scFv가 파지 캡시드 상에 발현된) 파지 라이브러리와 함께 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 파지를 세척 제거한 후에, 결합된 파지를 용리시키고, 증폭시키고, 수회 라운드의 선택 과정에 걸쳐 재패닝하였다. 이어서, ELISA-패닝된 클론을 GPC3-발현 HepG2 세포에 대한 결합에 대해 스크리닝하였다.
비드 패닝
스트렙타비딘 및 bt-GPC3-51량체 펩티드로 코팅된 DYNABEADS® 상에서 비드 패닝을 수행하였다. 파지 라이브러리를 인큐베이션을 위해 첨가하였다. 결합되지 않은 파지를 세척 제거한 후에, 비드-결합된 파지를 트립신으로 용리시키고, 수회 라운드의 비드-GPC3-51량체 인큐베이션, 세척 및 용리를 수행하였다. 양성 파지 클론을 GPC3+ HepG2 세포 및 GPC3-HepG2-GPC3-KO 세포에 대한 결합에 대해 추가로 시험하였다.
세포 패닝
현탁액 중에서 파지 클론을 SK-Hep1-GPC3 세포를 발현하는 GPC3과 인큐베이션함으로써 세포 패닝을 수행하였다. 결합되지 않은 파지를 세척에 의해 제거하였다. 결합된 파지를 갖는 세포를 마우스 항-M13 항체에 이어서 PE-접합된 항-마우스 2차 항체와 함께 인큐베이션하고, 이어서 유세포측정에 의해 확인하였다. SK-Hep1-GPC3 세포에 대해 선택된 파지 클론을 GPC3+ HepG2 세포 및 GPC3- HepG2-GPC3-KO 세포에 대해 추가로 스크리닝하였다.
실시예 1. 인간 GPC3에 특이적인 인간 항체 작제물의 생성 및 선택
본 실시예는 인간 GPC3(hGPC3)에 특이적인 인간 항체 작제물의 생성을 보여준다. 특히, 본 실시예는 천연 포맷의 인간 GPC3(세포 표면-결합된 GPC3)에 특이적으로 결합하는 인간 scFv의 생성을 보여준다. 본 명세서에 기재된 인간 항체 작제물을 정상 공여자 및/또는 자가면역 질병 공여자로부터 생성된 나이브 또는 반합성 인간 항체 라이브러리를 사용하여 개발하고, 천연 입체구조의 세포 표면-결합된 인간 GPC3에 대한 패닝을 통해 인간 GPC3에 대한 높은 특이성에 기초하여 선택하였다. 따라서, 이들 인간 항-GPC3 항체 작제물(예를 들어, 항-GPC3 scFv)은, 예를 들어 전장 IgG, 다중특이성 항-GPC3 항체 분자, 항-GPC3 CAR, 또는 항-GPC3 caTCR의 작제를 위한 항체 성분들의 가치있는 공급원을 제공한다.
항-인간 GPC3 작제물의 개발에 대한 예시적인 개요가 표 3에 기재되어 있다. 이 과정은 Eureka Therapeutics E-ALPHA™ 파지 라이브러리로부터의 인간 GPC3-특이적 및 생물학적으로 활성인 항체 작제물의 확인으로 시작하였다.
[표 3]
Figure pct00019
Eureka Therapeutics에서 작제된 인간 scFv 항체 파지 디스플레이 라이브러리(다양성 = 10×1010개)의 수집물(E-ALPHA™ 파지 라이브러리로서 상표화됨)을 인간 GPC3에 특이적인 인간 항체 작제물(예를 들어, scFv)의 선택에 사용하였다. E-ALPHA™ 파지 라이브러리는 완전 나이브 인간 중쇄 및 경쇄 레퍼토리를 포함하는 나이브 라이브러리, 및 완전 나이브 인간 경쇄 레퍼토리 및 완전히 무작위화된 중쇄 CDR3 영역을 갖는 반합성 중쇄를 함유하는 반합성 라이브러리를 포함하였다. 나이브 항체 레퍼토리를 건강한 공여자의 PBMC 및 비장으로부터, 또는 자가면역 질병(예컨대, 전신 홍반성 루푸스 및 류마티스성 관절염) 공여자의 PBMC로부터 클로닝하였다.
세포 표면-결합된 GPC3(GPC3A)에 대한 패닝 전략 및 파지 라이브러리 스크리닝
GPC3 + 세포에 대한 패닝
E-APLPHA™ scFv 파지 라이브러리를 재조합 GPC3-발현 SK-Hep1 세포(SK-Hep1-GPC3)와의 동시-인큐베이션에 의해 인간 GPC3에 대하여 스크리닝(패닝)하고, 이어서 GPC3+ HepG2 세포에 대한 결합에 의해 확인하였는데, 이때 둘 모두 유세포측정을 사용하였다(방법 참조). 20만 개의 SK-Hep1-GPC3 세포를 4℃에서 1시간 동안 파지 라이브러리(약 1×107 pfu)와 함께 동시-인큐베이션하였다. 세포/파지 혼합물을 PBST 중에 세척하고, 4℃에서 1시간 동안 마우스 항-M13 항체와 함께 인큐베이션하고, PBST 중에 다시 세척하고, 이어서 암실에서 4℃에서 30분 동안 PE-접합된 항-마우스 IgG와 함께 인큐베이션하고, FACS 분석을 거쳤다.
초기 SK-Hep1-GPC3 스크리닝으로부터의 36개의 양성 클론을 동일한 절차를 사용하여 GPC3+ HepG2 세포주에 대한 세포 표면 hGPC3 결합에 대해 추가로 검증하였다. 33개의 파지 클론이 FACS 분석을 사용하여 GPC3+ HepG2 세포에 대한 특이적 결합을 보여주었다(표 4). 방법에 기재된 바와 같이 FACS를 수행하였다. 간략하게 말하면, 시판 마우스 항-인간 GPC3 항체(1G12, Santa Cruz Biotech sc-65443)를 희석시키고, 4℃에서 1시간 동안 GPC3+ HepG2 세포와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 PBS 중에 세척하고, PE-접합된 마우스 항-IgG 2차 항체(Vector Labs #EI-2007)를 첨가하고, 암실에서 4℃에서 추가 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 PBS로 세척하고 고정시켰다. 14개의 예시적인 GPC3+ HepG2 결합된 클론의 FACS 분석이 도 1a 내지 도 1g에 나타나 있는데, 이는 강한 세포 표면-결합된 GPC3 결합을 입증한다. 헬퍼 파지를 또한 GPC3+ HepG2 세포와의 인큐베이션에 사용하였으며, 이는 대조군으로서의 역할을 하였다.
GPC3A 스크리닝으로부터의 파지 클론을 Eureka Therapeutics에 의해 제조된 GPC3 녹아웃 세포주 HepG2-GPC3-KO-2 및 HepG2-GPC3-KO-3에 대한 결합에 대해 추가로 시험하였다(방법에서 "Generation of HepG2 GPC3 녹아웃(HepG2-GPC3-KO) 세포의 생성" 참조). GPC3+ HepG2 세포주에 대한 결합에 의해 확인된 33개의 클론 중에서, 5개의 클론(GPC3A-34, 37, 38, 58 및 62)은 HepG2-GPC3-KO 세포주(HepG2-GPC3-KO-2 및 HepG2-GPC3-KO-3)에 대한 결합을 거의 또는 전혀 나타내지 않았는데, 이는 GPC3 양성 세포 결합에 대한 그들의 높은 특이성을 입증한다. FACS 분석은 도 2a 내지 도 2f에 예시되어 있다: GPC3A-39(도 2a), GPC3A-46(도 2b), GPC3A-56(도 2c), 및 GPC3A-64(도 2e)는 GPC3+ HepG2 세포주에 대한 유의한 결합, 및 HepG2-GPC3-KO 세포주에 대한 비교적 낮은 수준의 결합을 나타내었으며; 한편 GPC3A-58(도 2d)은 GPC3+ HepG2 세포주에 대한 높은 수준의 결합을 보여주고, HepG2-GPC3-KO 세포주에 대한 결합은 거의 없음을 보여주었다. 몇몇 클론은 GPC3+ HepG2 및 HepG2-GPC3-KO 세포주 둘 모두에 대한 높은 수준의 결합을 나타내었다(데이터는 나타내지 않음).
가용성 GPC3에 대한 GPC3A 파지 클론의 결합을 ELISA에 의해 시험하였다. 3가지 형태의 가용성 비오티닐화 GPC3 단백질(GPC3(560), R&D Systems GPC3 단백질[Cat. 2119-GP-0505], 및 GPC3-51량체)을 사용하여, 기재된 바와 같이 96웰 ELISA 플레이트를 코팅하였다(방법 참조). 모든 클론은 GPC3(560) 및 GPC3(R&D Systems)에 결합할 수 있었으며, 이때 클론 GPC3A-37,-42,-43 및 -47은 GPC3(560)에 대한 최소한의 결합을 나타내고, GPC3-51량체에 대한 결합은 나타내지 않았다(데이터는 나타내지 않음).
[표 4]
Figure pct00020
51량체 GPC3 단편(GPC3B)을 사용한 패닝 전략 및 파지 라이브러리 스크리닝
다른 한편으로, 3가지 유형의 파지 라이브러리 패닝을 비오티닐화 C-말단 51량체 hGPC3 단편(bt-GPC3-51량체, 방법 참조)을 사용하여 구현하였다. 이러한 스크리닝 전략은 GPC3B로 명명하였으며, 표 4에 개략적으로 설명되어 있다.
플레이트 패닝
비오티닐화 GPC3-51량체 단편(방법 참조)을 PBS 중 2 ug/ml로 100 μl의 부피로 사용하여 스트렙타비딘 코팅된 96웰 ELISA 플레이트에 첨가하여, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션되게 하여 플레이트 패닝 스크리닝을 수행하였다. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 PBS 중 5% 탈지 분유(NFDM)로 블로킹하였다. 2회의 추가 세척 후에, 100 μl의 파지 라이브러리(2×1012 pfu/ml의 역가를 가짐)를 개별 웰 내로 첨가하였다. 138개의 파지 클론을 시험하였다. 플레이트를 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션하고, PBSTB로 6회 세척하였다. 웰을 실온에서 10분 동안 트립신(1 mg/ml로 100 μl)으로 용리시켰다. 용리된 파지를 표준 방법에 따라 회수하였다. 3회 라운드의 플레이트 패닝을 수행하여 hGPC3-51량체 단편에 대한 특이적 파지 결합을 풍부화하였다. 이러한 스크리닝을 사용하여, 138개의 단리된 파지 클론들 중에서, 99개는 ELISA에 의해 양성이었으며, 53개의 고유 클론이 확인되었다.
플레이트 패닝 + 세포 패닝
차감 패닝(subtraction panning)에 대해서는 SK-Hep1 세포주를 그리고 양성 패닝에 대해서는 SK-Hep1-GPC3 세포주를 사용하여, 2회 라운드의 플레이트 패닝 후에 1회 라운드의 세포 패닝에 의해, 138개의 단리된 파지 클론 상에서 두 번째 패닝 스크리닝을 수행하였다. 제3 라운드의 세포 패닝에서는, 약 4×107개의 SK-Hep1 세포를 실온에서 2시간 동안 동시-인큐베이션함으로써 각각의 파지 라이브러리의 차감 패닝에 사용하였다. 약 1×107개의 SK-Hep1-GPC3 세포를, 또한 4℃에서 2시간 동안 동시-인큐베이션함으로써, 각각의 파지 라이브러리의 양성 패닝에 사용하였다. 세포/파지 혼합물을 PBS 중 10% FBS 중에서 4회 세척하고, 단지 PBS만으로 2회 세척하였다. 특이적으로 결합된 파지를 실온에서 10분 동안 트립신(1 mg/ml로 1 ml)으로 용리시켰다. 용리된 파지를 표준 기법을 사용하여 구조(rescue)하였다. 이러한 패닝 방법을 사용하여, 138개의 클론 중에서 추가 14개의 고유 클론을 단리하였다.
비드 패닝
추가 92개의 단리된 파지 클론에 대해 비드 패닝 스크리닝을 또한 수행하였다. 50 μl의 DYNABEADS®를 PBST 중에 2회 세척하고, 500 μl의 파지 라이브러리(2×1012 pfu/ml의 역가를 가짐) 중에 재현탁하였다. 파지/비드 혼합물을 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하여 파지를 고갈시켰는데, 이는 스트렙타비딘에 대한 비특이적 결합을 보여준다. 동일한 세척 절차를 사용하여 다른 50 μl의 DYNABEADS®를 제조하고, 2.5% PBSM 중 2.4 ㎍/ml로 500 μl의 bt-GPC3-51량체 단편 용액 중에 재현탁시키고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션되게 하고, 이어서 2회 세척하였다. 파지 라이브러리를 흡인하고, bt-GPC3-51량체 단편/비드 혼합물과 혼합하고, 이어서 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션하고, PBSM으로 5 내지 10회 세척하였다. 결합된 파지를 실온에서 10분 동안 트립신(1 mg/ml로 400 μl)을 사용하여 용리시키고, 표준 기법을 사용하여 구조하였다. 3회 라운드의 비드 패닝을 수행하여 hGPC3-51량체 단편에 대한 GPC3-특이적 파지 결합을 풍부화하였다. 비드 패닝 방법을 사용하여 추가 62개의 고유 클론을 단리하였다.
GPC3B 스크리닝으로부터 확인된 이들 모든 129개의 고유 클론 중에서 20개를 유세포측정을 사용하여 GPC3+ HepG2 세포에 결합하는 그들의 능력에 대해 시험하였다. 양성 세포 패닝의 경우, 20만 개의 GPC3+ HepG2 세포를 PBS 중 5% FBS 및 0.05% NaN3 50 μl 중에 현탁하였다. 차감 패닝의 경우, 20만 개의 HepG2-GPC3 녹아웃 세포(HepG2-GPC3-KO-2)를 PBS 중 5% FBS 및 0.05% NaN3 50 μl 중에 현탁하였다. GPC3B 파지 및 음성 대조군 파지(헬퍼 파지)를 PBS 중 약 1.0×1011 pfu/mL로 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 혼합물을 PBST 중에 세척하고, 마우스 항-M13 항체(방법 참조)의 200배 희석물을 (PBS 중) 5% FBS 및 0.05% NaN3 100 μl의 부피에 첨가하고, 4℃에서 추가 1시간 동안 인큐베이션하였다. 혼합물을 PBS 중에 다시 세척하고, 2차 PE-항-마우스 IgG 항체를 PBS 중 5% FBS 및 0.05% NaN3 100 μl 중 200배 희석물로 첨가하고, 암실에서 4℃에서 추가 1시간 동안 인큐베이션하였다. 혼합물을 PBS 중에 2회 세척하고, 150 μl 부피 중 3배 희석물로 고정 완충액 중에 고정시켰다. 시험된 20개의 클론 중에서, 이들 중 어느 것도 HepG2-GPC3-KO-2 세포에 대한 결합을 나타내지 않았다. 도 3a 내지 도 3d에 예시된 바와 같이, GPC3B 파지 클론 #81, #87 및 #115는 GPC3+ HepG2 세포에 대한 강한 결합을 나타내는 반면, GPC3B-80 클론은 약한 결합을 나타내었지만, 이들 중 어느 것도 HepG2-GPC3-KO-2 세포에 대한 어떠한 결합도 나타내지 않았다.
GPC3B 스크리닝으로부터의 이들 20개의 클론을 ELISA 검정(방법 참조)을 사용하여 가용성 비오티닐화 GPC3(560) 및 GPC3-51량체에 대한 그들의 결합에 대해 추가로 시험하였다. 20개의 클론 중 16개의 클론은 bt-GPC3-51량체에 대한 강한 결합 및 가용성 bt-GPC3(560)에 대한 훨씬 더 강한 결합을 나타내었다. 3개의 클론은 bt-GPC3-51량체에 대한 강한 결합을 나타내었지만, 가용성 bt-GPC3(560)에 대한 결합은 나타내지 않았다. 1개의 클론은 어떠한 가용성 단백질에도 결합하는 데 실패하였다(데이터는 나타내지 않음).
실시예 2. 항-GPC3 이중특이성 항체 작제물
인간 항-GPC3 항체를 사용한 이중특이성 항체 작제물의 생성
본 실시예는 인간 GPC3에 특이적인 인간 scFv 단편을 사용한 다중특이성 항-GPC3 분자의 작제를 보여준다. 특히, 본 실시예는 천연 포맷의(세포-표면 발현된) 인간 GPC3에 결합하는 제1 항체 모이어티(예를 들어, scFv) 및 T 세포 상의 CD3에 결합하는 제2 항체 모이어티(예를 들어, scFv)를 갖는 이중특이성 항체의 작제를 보여준다. 본 명세서에 기재된 이들 다중특이성 항-GPC3 분자(예를 들어, 탠덤 다이-scFv 항-GPC3 T 세포 인게이저)는 T 세포를 인간 GPC3을 발현하는 표적 세포를 사멸시키도록 유도하는 데 사용될 수 있다.
(GPC3A 및 GPC3B 스크리닝들 둘 모두로부터의) 특이적 세포 표면-GPC3 결합을 나타내고 GPC3-KO 세포 결합을 거의 또는 전혀 나타내지 않는 인간 GPC3-특이적 파지 클론의 scFv 서열을 사용하여 이중특이성 항체("L2K"로 지칭됨)를 생성하였다. 이중특이성 항체는, N-말단에 인간 GPC3-특이적 파지 클론의 VL-VH scFv 서열을, 그리고 C-말단에 항-인간 CD3ε 마우스 단일클론 scFv를 포함하는 단일쇄 형식을 사용하여 작제하였다(항-GPC3×CD3 다이-scFv; 예를 들어, 문헌[Brischwein, K. et al., Mol. Immunol. 43:1129-1143, 2006] 참조). GPC3A-34, GPC3B-87, GPC3A-37, GPC3A-45, GPC3A-46, GPC3A-55, 및 GPC3A-58 항체 클론으로부터 유래된 예시적인 항-GPC3×CD3 다이-scFv 항체는 각각 서열 번호 488, 489 및 511 내지 515의 아미노산 서열을 포함한다.
항-인간 GPC3 scFv 및 항-인간 CD3ε scFv를 인코딩하는 DNA 단편을 Genewiz 또는 Genscript에 의해 합성하고, 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 포유류 발현 벡터 pQD-T(Eureka Therapeutics, Inc.) 내로 하위클로닝하였다. 정제 및 검출을 위하여 헥사히스티딘 태그를 C-말단에 삽입하였다. HEK293 세포를 이중특이성 항체 발현 벡터에 의해 형질감염시키고, 이중특이성 항-GPC3 항체 생성을 위하여 7일 동안 배양하였다. 세포 배양 부피를 기준으로, FPLC AKTA 시스템에 의한 HisTrap HP 컬럼(GE healthcare) 또는 His GraviTrap 컬럼(GE healthcare)을 사용하여 HEK293 세포 상층액으로부터 이중특이성 항체를 정제하였다. HEK293 세포 배양 상층액을 청징화하고, 낮은 이미다졸 농도(20 mM)를 갖는 컬럼 상에 로딩하고, 이어서 높은 이미다졸 농도의 등용매 용리 완충액(500 mM)을 사용하여 결합된 이중특이성 항-GPC3 항체를 용리시켰다. 정제된 인간 GPC3 이중특이성 항체의 분자량을 겔 전기영동에 의해 비환원성 조건 하에서 측정하였다. 이중특이성 항-GPC3 항체(항-GPC3 scFv-항-CD3 scFv)에 상응하는 밴드(약 98 kD)가 겔 상의 주요 화학종으로서 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음).
종합하면, 본 실시예는 세포 표면 상에서 발현되는(즉, 천연 형태) 인간 GPC3에 특이적인 제1 항체 모이어티 및 CD3에 특이적인 제2 항체 모이어티를 갖는 이중특이성 항-GPC3 분자의 성공적인 작제를 보여준다. 그러한 이중특이성 분자의 추가의 특성화가 하기에 기재되어 있다. GPC3A 스크리닝으로부터의 20개의 고유 클론 및 GPC3B 스크리닝으로부터의 14개의 고유 클론을 이중특이성 항-GPC3 항체의 생성을 위하여 그리고 추가의 특성화를 위하여 선택하였다(표 4).
인간 간세포 암종 세포주에 결합하는 항-GPC3 이중특이성 항체(GPC3A L2K)
GPC3을 발현하는 HCC 세포주를, 2개의 실험에서 인간 GPC3+ HepG2 세포, GPC3-음성 SK-Hep1 세포, 및 SK-HEP1-GPC3(GPC3 과발현) 세포를 사용하여, 유세포측정에 의해 항-GPC3 이중특이성 항체 결합에 대해 시험하였다.
대조-L2K 이중특이성 항체를 GPC3 비결합 scFv를 항-인간 CD3ε scFv와 융합함으로써 상기와 유사하게 생성하였으며, 이때 헥사히스티딘 태그가 정제 및 검출을 위해 C-말단에 삽입되었다. 이 대조-L2K 항체를 음성 GPC3 결합 대조군으로서 사용하였다.
GPC3A L2K 이중특이성 항체 또는 대조-L2K 이중특이성 항체를 0.05% NaN3를 함유하는 PBS 중 5% FBS 중의 5 ㎍/ml의 최종 농도로, 4℃에서 1시간 동안 GPC3-음성 SK-Hep1 세포 및 (별개로) SK-Hep1-GPC3 세포와 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 PBS로 1회 세척하였다. APC-접합된 항-His 태그 마우스 항체(R&D Systems)를 PBS 중 5% FBS 및 0.05% NaN3의 20배 희석물로, 100 μl의 부피로 세척된 세포에 첨가하고, 암실에서 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 세포를 PBS 중 고정 완충액(BioLegend)의 3배 희석물 150 μl의 부피 중에 고정시켰다. 도 4a 및 도 4b에 나타낸 바와 같이, GPC3A L2K 이중특이성 항체는 GPC3-음성 SK-Hep1 세포에 결합하는 데 실패하였으며, SK-Hep1-GPC3 세포를 과발현하는 GPC3에는 잘 결합하였다.
GPC3A L2K 이중특이성 항체 또는 대조-L2K 이중특이성 항체를 PBS 중 5% FBS 및 0.05% NaN3 중의 5 ㎍/ml의 최종 농도로, 4℃에서 1시간 동안 GPC3+ HepG2 세포와 함께 인큐베이션하고, 이어서 PBS로 1회 세척하였다. APC-접합된 항-His 태그 마우스 항체(R&D Systems)를 PBS 중 5% FBS 및 0.05% NaN3의 20배 희석물 100 μl의 부피로 첨가하고, 암실에서 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 PBS로 2회 세척하였다. 세포를 PBS 중 고정 완충액(BioLegend)의 3배 희석물 150 μl의 부피 중에 고정시켰다. 도 5a 및 도 5b는, 대조-L2K 항체와 GPC3+ HepG2 세포 사이의 결합과 대비하여, GPC3+ HepG2 세포에 대한 GPC3A L2K 이중특이성 항체의 유의한 결합을 보여준다.
인간 간세포 암종 세포주에 결합하는 항-GPC3 이중특이성 항체(GPC3B L2K)
B 스크리닝으로부터 유래된 항-GPC3×CD3 다이-scFv 항체(GPC3B L2K 이중특이성 항체)를, 2개의 실험에서 인간 GPC3+ HepG2 세포, HepG2-GPC3-KO 세포, GPC3-음성 SK-Hep1 세포, 및 SK-HEP1-GPC3(GPC3 과발현) 세포를 사용하여, 유세포측정에 의해 유사하게 시험한다.
GPC3B L2K 이중특이성 항체 또는 대조-L2K 이중특이성 항체를 0.05% NaN3를 함유하는 PBS 중 5% FBS 중의 5 ㎍/ml의 최종 농도로, 4℃에서 1시간 동안 GPC3-음성 SK-Hep1 세포 및 (별개로) SK-Hep1-GPC3 세포와 함께 인큐베이션한다. 이어서, 세포를 PBS로 1회 세척한다. APC-접합된 항-His 태그 마우스 항체(R&D Systems)를 PBS 중 5% FBS 및 0.05% NaN3의 20배 희석물로, 100 μl의 부피로 세척된 세포에 첨가하고, 암실에서 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 이어서, 세포를 PBS로 2회 세척한다. 세포를 PBS 중 고정 완충액(BioLegend)의 3배 희석물 150μ l의 부피 중에 고정시킨다. FACS 분석을 수행하여, GPC3-음성 SK-Hep1 세포와 GPC3 과발현 SK-Hep1-GPC3 세포에 대한 GPC3B L2K 이중특이성 항체의 결합을 비교한다. 세포 표면-결합된 인간 GPC3 특이성을 보여준 GPC3B L2K 이중특이성 항체는 SK-Hep1-GPC3 세포에 대한 유의한 결합을 나타내고, GPC3-음성 SK-Hep1 세포에 대한 결합을 거의 또는 전혀 나타내지 않을 것으로 예상된다.
GPC3B L2K 이중특이성 항체 및 대조 L2K 이중특이성 항체를 또한 GPC3+ HepG2 세포에 대한 결합에 대해 시험한다. 2개의 항체 세트를 PBS 중 5% FBS 및 0.05% NaN3 중의 5 ㎍/ml의 최종 농도로, 4℃에서 1시간 동안 GPC3+ HepG2 세포와 함께 인큐베이션하고, 이어서 PBS로 1회 세척한다. APC-접합된 항-His 태그 마우스 항체(R&D Systems)를 PBS 중 5% FBS 및 0.05% NaN3의 20배 희석물 100 μl의 부피로 첨가하고, 암실에서 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 PBS로 2회 세척한다. 세포를 PBS 중 고정 완충액(BioLegend)의 3배 희석물 150 μl의 부피 중에 고정시킨다. FACS 분석을 수행하여, GPC3+ HepG2 세포에 대한 GPC3B L2K 이중특이성 항체와 대조 L2K 이중특이성 항체의 결합을 비교한다. 세포 표면-결합된 인간 GPC3 특이성을 보여준 GPC3B L2K 이중특이성 항체는 GPC3+ HepG2 세포에 대한 유의한 결합을 나타낼 것으로 예상되는 반면, 대조 L2K 이중특이성 항체에 대해서는 이들 세포에 대한 결합이 거의 또는 전혀 관찰되지 않을 것으로 예상된다.
GPC3B L2K 이중특이성 항체 및 대조-L2K 이중특이성 항체를 또한 0.05% NaN3를 함유하는 PBS 중 5% FBS 중의 5 ㎍/ml의 최종 농도로, 4℃에서 1시간 동안 HepG2-GPC3-KO 세포와 인큐베이션한다. 이어서, 세포를 PBS로 1회 세척한다. APC-접합된 항-His 태그 마우스 항체(R&D Systems)를 PBS 중 5% FBS 및 0.05% NaN3의 20배 희석물로, 100 μl의 부피로 세척된 세포에 첨가하고, 암실에서 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 이어서, 세포를 PBS로 2회 세척한다. 세포를 PBS 중 고정 완충액(BioLegend)의 3배 희석물 150 μl의 부피 중에 고정시킨다. FACS 분석을 수행하여, HepG2+ GPC3-KO 세포에 대한 GPC3B L2K 이중특이성 항체와 대조 IgG1 동종형 항체의 결합을 비교한다. 세포 표면-결합된 인간 GPC3 특이성을 보여준 GPC3B L2K 이중특이성 항체는 IgG1 동종형 대조 항체와 유사하게, HepG2-GPC3-KO 세포에 대한 결합을 거의 또는 전혀 나타내지 않을 것으로 예상된다.
실시예 3. 인간 GPC3 이중특이성 항체의 특성화
가용성 GPC3에 의한 인간 간 세포주에 대한 결합을 위한 경쟁
세포 표면-결합된 GPC3에 대해 유도된 항체를 재조합 비오티닐화 GPC3(560) 단백질(방법 참조)을 사용하여 경쟁적 결합 검정에서 GPC3+ HepG2 세포에 결합하는 그들의 능력(IC50)에 대해 시험하였다. 항-GPC3 L2K 항체(GPC3A 스크리닝으로부터 유래됨) 또는 대조-L2K 이중특이성 항체를 다양한 농도의 가용성 bt-GPC3(560) 단백질과 예비혼합하고, 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고; 이어서, HepG2 세포를 첨가하고, 혼합물을 4℃에서 추가 1시간 동안 인큐베이션하였다. APC-접합된 항-His 태그 항체(R&D Systems, #IC050A)를 20배 희석물로 첨가하여 L2K 항체 결합을 검출하였다(L2K 항체는 C-말단 His 태그를 가짐). 스트렙타비딘-PE(Vector Labs EI-2007)를 또한 200배 희석물로 첨가하고, 암실에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하여 가용성 bt-GPC3(560) 단백질을 모니터링하였다. 마우스 항-GPC3 항체 양성 대조군(1G12, Santa Cruz #sc-65443)을 PE-접합된 항-마우스 IgG(H+L)를 사용하여 동일한 조건 하에서 가용성 bt-GPC3(560) 단백질이 존재하거나 존재하지 않는 상태에서 처리하였다. 표 5는 시험된 6개의 GPC3A L2K 항체에 대한 IC50 값을 나타낸다. 모든 GPC3 L2K는 항-GPC3 양성 대조 항체(1G12)보다 훨씬 더 높은 IC50 값을 나타내었으며, 이때 GPC3A-37 및 GPC3A-46이 최고값을 나타내었는데, 즉 가용성 GPC3의 존재에 의해 가장 적은 영향을 받았다. 도 6으로부터 알 수 있는 바와 같이, 모든 GPC3A L2K 이중특이성 항체의 중위 형광 강도(MFI)는 대조-L2K 이중특이성 항체 및 항-GPC3 양성 대조 항체(1G12) 둘 모두보다 HepG2 세포 상에 존재하는 GPC3에 대한 유의하게 더 강한 결합을 나타내었다. 더욱이, 대부분의 GPC3A L2K 이중특이성 항체는 경쟁 검정에서 가용성 bt-GPC3(560) 단백질보다 세포 표면-결합된 GPC3에 대해 훨씬 더 높은 특이성을 보여주었으며, 예컨대 GPC3A-37 및 GPC3A-46 클론이 그러하다.
[표 5]
Figure pct00021
유사하게, 클론 GPC3B-87 L2K를, 전술된 바와 같이 재조합 비오티닐화 GPC3(560) 단백질을 사용하여 경쟁적 결합 검정(IC50)에서 GPC3+ HepG2 세포에 결합하는 그의 능력에 대해 시험하였다. GC33 L2K(L2K로 전환된 GC33 항체) 및 항-CD19 L2K를 대조군으로서 사용하였다. 간략하게 말하면, GPC3B-87 L2K 이중특이성 항체 또는 대조-L2K 이중특이성 항체를 다양한 농도의 가용성 bt-GPC3(560) 단백질과 예비혼합하고, 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고; HepG2 세포를 첨가하고, 혼합물을 4℃에서 추가 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, APC-접합된 항-His 태그 항체(R&D Systems, #IC050A)를 20배 희석물로 첨가하여 L2K 항체 결합을 검출하였다(L2K 항체는 C-말단 His 태그를 가짐). 스트렙타비딘-PE(Vector Labs EI-2007)를 또한 200배 희석물로 첨가하고, 암실에서 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하여 가용성 bt-GPC3(560) 단백질을 모니터링하였다. 마우스 항-GPC3 항체 양성 대조군(1G12, Santa Cruz #sc-65443)을 PE-접합된 항-마우스 IgG(H+L)를 사용하여 동일한 조건 하에서 가용성 bt-GPC3(560) 단백질이 존재하거나 존재하지 않는 상태에서 처리하였다. FACS 분석을 수행하였다.
도 10 및 표 12에 나타낸 바와 같이, GPC3B-87 L2K(IC50 0.12 ㎍/ml) 및 GC33 L2K(IC50 0.86 ㎍/ml) 둘 모두는 시험된 GPC3A L2K(IC50 1.2 내지 4.6 ㎍/ml)보다 훨씬 더 낮은 IC50을 나타내었다. 이는, 세포 표면 GPC3에 대한 GPC3B-87 L2K 및 GC33 L2K의 결합이 세포 표면 GPC3에 대한 GPC3A L2K의 결합보다 가용성 GPC3에 의해 더 용이하게 경쟁에서 밀려날 수 있음을 시사한다.
[표 12]
Figure pct00022
HepG2 세포에 대한 GPC3A 및 GPC3B L2K 클론의 결합 친화도
GPC3을 발현하는 HCC 세포주를, 인간 GPC3+ HepG2 세포를 사용하여, 유세포측정에 의해 항-GPC3 이중특이성 항체(GPC3 L2K 클론) 결합에 대해 시험하였다.
대조-L2K 이중특이성 항체를 GPC3 비결합 scFv를 항-인간 CD3ε scFv와 융합함으로써 생성하였으며, 이때 헥사히스티딘 태그가 정제 및 검출을 위해 C-말단에 삽입되었다. ET-901 L2K로 표기된 이러한 대조-L2K 항체를 GPC3 결합에 대한 음성 대조군으로서 사용하였다. 참조 항-GPC3 이중특이성 항체를 또한 GC33의 scFv를 사용하여 유사하게 생성하였으며, GC33 L2K로 표기하였다.
GPC3A L2K 클론(GPC3A-34 L2K, GPC3A-37 L2K, GPC3A-45 L2K, GPC3A-46 L2K, GPC3A-55 L2K, 및 GPC3A-58 L2K), GPC3B L2K 클론(GPC3B-87 L2K), 참조 GC33 L2K 이중특이성 항체, 또는 음성 대조군 항-CD19 L2K를 4℃에서 PBS 중 5% FBS 및 0.05% NaN3 중의 5 ㎍/ml의 최종 농도로 1시간 동안 GPC3 양성 HepG2 세포와 함께 인큐베이션하고, 이어서 PBS로 1회 세척하였다. APC-접합된 항-His 태그 마우스 항체(R&D Systems)를 PBS 중 5% FBS 및 0.05% NaN3의 20배 희석물 100 μl의 부피로 첨가하고, 암실에서 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 PBS로 2회 세척하였다. 세포를 PBS 중 고정 완충액(BioLegend)의 3배 희석물 150 μl의 부피 중에 고정시켰다. 별도의 대조군으로서, HepG2 세포를 또한 임의의 L2K 이중특이성 항체의 부재 하에서 APC-접합된 항-His 태그 마우스 항체(R&D Systems)와 함께 인큐베이션하였다. 도 11은 GPC3 양성 HepG2 세포에 대한 GPC3A L2K 클론의 유의한 결합을 보여주었다.
구체적으로는, 6개의 GPC3A L2K 이중특이성 항체 클론(GPC3A-34 L2K, GPC3A-37 L2K, GPC3A-45 L2K, GPC3A-46 L2K, GPC3A-55 L2K, GPC3A-58 L2K) 및 1개의 GPC3B L2K 이중특이성 항체 클론(GPC3B-87 L2K)을 참조 항-GPC3 GC33 L2K와 함께, FACS에 의해 검정하여 GPC3+ HepG2 세포에 대한 그들의 결합 친화도를 결정하였다. 6개의 GPC3A L2K 클론은 0.045 내지 0.12 ㎍/ml의 EC50을 나타내었으며, 이때 겉보기 Kd 값은 0.86 내지 2.4 nM이었다. GPC3B L2K 클론(GPC3B-87 L2K)은 훨씬 더 약한 결합을 보여주었는데, 4.3 ㎍/ml의 EC50 및 84 nM의 겉보기 Kd를 가졌다. GC33 L2K는 0.14 ㎍/ml의 EC50을 나타내었으며, 이때 겉보기 Kd는 2.7 nM이었다. GC33 L2K(Kd = 2.7 nM)와 대비하여, 모든 GPC3A L2K 클론은 더 높은 결합 친화도를 보여주었으며, 특히 GPC3A-37 L2K(Kd = 0.92 nM), GPC3A-46 L2K(Kd = 1.0 nM) 및 GPC3A-55 L2K(Kd = 0.86 nM)가 그러하였다(표 13 및 도 11 참조).
[표 13]
Figure pct00023
T 세포-매개 세포독성 검정
종양 세포독성을 LDH 세포독성 검정(Promega)을 사용하여 검정하였다. 인간 T 세포(AllCell) 또는 전혈로부터의 Ficoll-정제된 세포(BCP, Blood Centers of the Pacific)를 제조자의 사양에 따라 CD3/CD28 DYNABEADS®(Invitrogen)로 활성화시키고 증폭시켰다. 활성화된 T 세포를 10% FBS + 100 U/mL IL-2를 함유하는 RPMI1640 배지 중에서 배양 및 유지하고, 활성화 후 일수 7 내지 14에서 사용하였다. T 세포는 FACS 분석에 의해 >99% CD3+였다. 활성화된 T 세포 및 표적 세포를 이중특이성 항체(0.2 ㎍/ml; GPC3A L2K 또는 GPC3B L2K)와 5:1 비로 16시간 동안 공동배양하였다. 배양 상층액 중에서 LDH 활성을 측정함으로써 세포독성을 결정하였다.
도 7a 및 도 7b에 나타낸 바와 같이, GPC3A 및 GPC3B 스크리닝 둘 모두로부터 유래된 이중특이성 항-GPC3×CD3 항체는 인간 GPC3-특이적 방식으로 암 세포의 사멸을 효과적으로 매개하였다. C-말단 인간 GPC3 단편으로 면역화된 마우스로부터 유래된 단일클론 항체 GC33(방법 참조)을 또한 GPC3-특이적 사멸에 대해 시험하였다(도 7 b). 결과는 GC33의 암 세포 사멸 능력이 GPC3 비특이적이었음을 보여주는데, 그 이유는 GPC3 녹아웃 세포주 HepG-GPC3-KO-2뿐만 아니라 GPC3-양성 세포주 HepG2 및 SK-Hep1-GPC의 GC33-매개 사멸 때문이다. 다른 한편으로, GPC3A L2K 이중특이성 항체 #43, #53, #58 및 #61(특히, 도 7a) 및 GPC3B L2K 이중특이성 항체 #87(도 7b)은 GPC3-양성 세포(HepG2 및 SK-Hep1-GPC3)의 강력한 사멸을 매개한 반면, GPC3-음성 세포주(SK-Hep1 및 HepG2-GPC3-KO 세포)에는 유의한 영향을 미치지 않았다.
실시예 4. 마우스 항-hGPC3 단일특이성 IgG 항체의 작제
전장 마우스 항-인간 GPC3(hGPC3) 단일특이성 IgG 항체를, GPC3A-39, 46, 51, 56, 58 및 64의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열(VH 및 VL 각각에 대해 서열 번호 311 및 362, 318 및 369, 323 및 374, 328 및 379, 330 및 381, 336 및 387)을 사용하여, 뮤린 IgG1 중쇄의 Fc 영역을 발현하는 클로닝 플라스미드 및 IgG 경쇄를 발현하는 플라스미드를 사용하여 마우스 IgG1 불변 영역 및 Fc 영역 서열에 융합하여 작제하였다. 생성된 항체 클론을 항-GPC3 mIgG1 클론 A-39, -46, -51, -56, -58, 및 -64로 명명하였다. 예시적인 항-GPC3 mIgG1 A-39의 서열은 서열 번호 505의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열 번호 506의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 전장 GPC3B 단일특이성 IgG 항체 및 전장 GC33 항체를, 각각 GPC3B 클론 87의 중쇄 및 경쇄 가변 영역(서열 번호 350 및 401) 및 항-GPC3 항체 GC33의 중쇄 및 경쇄 가변 영역(서열 번호 503 및 504)을 사용하여 동일한 방식으로 작제하고, 항-GPC3 mIgG1 클론 B-87, 및 항-GPC3 mIgG1-GC33으로 명명한다.
간략하게 말하면, 선택된 파지 클론의 전장 마우스 IgG1을 HEK293 및 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주에서 생성하였으며, 이는 기재된 바와 같다(문헌[Tomimatsu, K. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 73(7):1465-1469, 2009]) (데이터는 나타내지 않음). GPC3 클론 가변 영역을 마우스 IgG1 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 갖는 포유류 발현 벡터 내로 하위클로닝하였다. 정제된 전장 IgG 항체의 분자량을 환원성 조건 및 비환원성 조건 둘 모두 하에서 전기영동에 의해 측정하여 단백질 순도를 결정하였으며, 이는 95%를 초과하는 것으로 계산되었다(데이터는 나타내지 않음).
항-GPC3 mIgG1 항체를 유세포측정에 의해 GPC3-양성 HepG2 및 GPC3-음성 SK-Hep1 세포에 대한 결합에 대해 시험하였다. 10 ㎍/mL의 작제된 항체를 1시간 동안 얼음 상의 세포에 첨가하였다. 세척 후, PE 접합된 항-마우스 IgG(H 및 L)(Vector Labs#EI-2007)를 첨가하여(암실에서 4℃에서 30분, 그리고 2회 세척함) 항체 결합을 검출하였다. 도 9a로부터 알 수 있는 바와 같이, 모든 항-GPC3 mIgG는 GPC3-양성 HepG2 세포에 결합하는 것으로 밝혀진 반면, 2차 항체 및 단독으로의 대조 항체(대조 mIgG1)는 동일한 세포에 결합하지 않았다. 항-GPC3 mIgG 또는 대조 mIgG1 어느 것도 SK-Hep1 세포에 대한 결합을 나타내지 않았다(도 9b). 항-GPC3 mIgG1 클론 B-87 및 mIgG-GC33 항체에 대해 동일한 FACS 분석을 수행한다.
ELISA에 의한 래트 GPC3에 대한 GPC3A mIgG1 항체의 반응성
GPC3-특이적 및 음성 대조군(ET-901) 마우스 키메라 IgG1을 ELISA 검정에서 래트 GPC3 펩티드에 대한 결합에 대해 시험하였다. 총 8개의 농도를 위하여, 100 ng/mL로부터 시작하여 3X 연속 희석물로 항체를 시험하였다. 비오티닐화 래트 GPC3을 PBS 중 2 ug/ml로 100 μL의 부피로 스트렙타비딘 플레이트 상에 코팅하고, 스트렙타비딘 코팅된 96웰 ELISA 플레이트에 첨가하여, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션되게 하였다. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 PBS 중 5% 탈지 분유(NFDM)로 블로킹하였다. PBST 완충액 중 5 ㎍/mL로 구성된 GPC3A mIgG1 클론(A-34, -46, -53, -58, -61)뿐만 아니라 음성 대조군 ET-901 mIgG1 각각을 개별적으로 실온에서 1시간 동안 별도의 래트 bt-GPC3-코팅된 웰과 함께 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 세척하고, 실온에서 30분 동안 항-마우스 Fc(Bethyl Labs #A90-131P, 1:2000 희석물)와 함께 인큐베이션하였다. PBST로 세척한 후, 1-STEP™ 울트라(Ultra) TMB-ELISA 기질 용액(Thermofisher Scientific #34028)을 사용하여 반응을 발생시키고, 2 N 황산으로 정지시켰다. 5개의 GPC3A mIgG1 클론 중 4개(A-34, -46, -58, -61)가 래트 bt-GPC3과 반응하였으며, 이는 음성 대조군 항-CD19 mIgG1과 대비되었다(도 12). GPC3A-53 mIgG1 클론은 래트 bt-GPC3과 반응하지 않았다. 부수된 실험에서, 시험된 모든 GPC3A mIgG1 클론(A-34, -46, -53, -58, -61)은 인간 GPC3과 반응하였다(도 12).
실시예 5. 세포-표면 GPC3 및 가용성 GPC3에 대한 항-hGPC3 단일특이성 및 이중특이성 항체의 결합 프로파일의 결정
본 실시예는 선택된 단일특이성 및 이중특이성 항체에 대한 GPC3 결합 프로파일을 보여준다. 특히, 본 실시예는 (실시예 4에 기재된 바와 같은) 선택된 항-hGPC3 단일특이성 mIgG1 클론의 에피토프-결합 부위 특성화를 설명한다. 다른 한편으로, 본 실시예는 또한 클론 GC33 mIgG1 및 이중특이성 GC33-L2K와 함께, 본 발명의 선택된 항-hGPC3 단일특이성 mIgG1 클론 및 인간 항-hGPC3 항-CD3 이중특이성 항체(실시예 2에 기재된 바와 같은 GPC3A L2K 및 GPC3B L2K)의, 가용성 재조합 인간 GPC3(즉, 인간 GPC3(560), hGPC3의 잔기 1 내지 560 aa) 또는 GPC3-양성 HepG2 및 SK-Hep1-GPC3 세포와 같은 암 세포 표면 상의 GPC3 항원에 대한 결합 프로파일을 설명한다.
GPC3A mIgG 클론에 대한 에피토프-결합 부위 특성화
GPC3 에피토프 비닝을 수행하여, 기준 GC33-mIgG1 및 항-hGPC3 단일특이성 mIgG1 클론 GPC3A-37 mIgG 및 GPC3A-55 mIgG에 의해 별개의 에피토프가 인식되는지를 결정하였다. 제1 쌍의 mIgG 단백질과 GPC3을, 별개의 제2 mIgG의 첨가 전에, 제1 mIgG가 GPC3 상의 그의 결합 에피토프를 점유하도록 반응되게 하였는데, 이는, 이들 2개의 mIgG 단백질이 상이한 에피토프에 결합하는지의 여부를 결정하기 위함이다. 간략하게 말하면, 결합 친화도를 결정하였으며, 1:1 결합 부위 부분 적합 모델(1:1 binding site, partial fit model)을 사용하여 결합 파라미터를 계산하였다. mIgG 단백질과 GPC3의 제1 쌍형성(여기서는, 쌍의 하나의 실체가 스트렙타비딘-바이오센서에 고정화됨) 후에, 바이오센서에 의해 검출된 신호에서의 스파이크는 제1 mIgG와 GPC3 사이의 결합을 반영하고, 세척 후, 제1 쌍의 mIgG/GPC3은 스트렙타비딘-코팅된 플레이트에 결합된 상태로 남아 있다. 후속으로, GPC3/제1 mIgG의 고정화된 쌍에 제2 mIgG를 첨가 시에, 신호에서의 추가의 스파이크는 제2 mIgG와 고정화된 GPC3 사이의 결합을 반영하는데, 이는, 제1 mIgG와의 반응 후에 GPC3 상에 개방된 채로 남아 있는 결합되지 않은 에피토프와 제2 mIgG가 반응하였음을 나타낸다. 따라서, 제2 mIgG의 첨가 시에 신호에서의 스파이크는 제1 mIgG와 제2 mIgG가 별개의 에피토프에 결합함을 입증한다. 대조적으로, 제2 mIgG의 첨가 시에 신호에서의 스파이크의 부재는 제1 mIgG와 제2 mIgG가 동일한 에피토프에 결합함을 입증할 수 있다.
GPC3 에피토프 비닝의 선형 포맷에서는, 5 ㎍/mL의 비오티닐화 GPC3을 스트렙타비딘 바이오센서 상에 로딩하였다. 과량의 항원을 세척 제거한 후, mIgG 단백질들을 순차적으로 첨가하였는데, 여기서는 제1 mIgG를 50 ㎍/mL로 첨가한 후, 제2 mIgG를 100 ㎍/mL로 첨가하였다. 구체적으로는, GC33-mIgG1을 먼저 50 ㎍/mL로 첨가하였으며, 이는 신호에서 스파이크를 촉발하였는데, 그럼으로써 이는 GPC3 에피토프에 대한 GC33-mIgG1의 특이적 결합을 나타낸다(도 13). 후속으로, GPC3A-37 mIgG 또는 GPC3A-55 mIgG 어느 하나를 100 ㎍/mL로 첨가하였다. 두 경우 모두, GPC3A-37 mIgG 또는 GPC3A-55 mIgG 어느 것의 첨가 시에도 제2 스파이크가 기록되었는데(도 13), 이는, GPC3A-37 mIgG와 GC33-mIgG1이 별개의 에피토프에 결합하고, GPC3A-55 mIgG와 GC33-mIgG1이 또한 별개의 에피토프에 결합함을 나타낸다.
추가의 실험에서는, GPC3A-37 mIgG1을 먼저 50 ㎍/mL로 첨가하였으며, 이는 신호에서 스파이크를 촉발하였는데, 그럼으로써 이는 GPC3 에피토프에 대한 GPC3A-37 mIgG1의 특이적 결합을 나타낸다. 후속으로, GPC3A-55 mIgG를 100 ㎍/mL로 첨가하여 제2 스파이크를 촉발하였는데, 이는, GPC3A-37 mIgG와 GPC3A-55 mIgG가 별개의 에피토프에 결합하였음을 나타낸다(도 13). 상기 결과를 조합하면, GC33 mIgG1, GPC3A-37 mIgG 및 GPC3A-55 mIgG 각각은 GPC3 상의 별개의 에피토프에 결합한다.
GPC3 에피토프 비닝의 샌드위치 포맷에서는, mIgG 단백질을 비오티닐화하고, 5 ㎍/mL로 스트렙타비딘 바이오센서 상에 고정화하였다. 과량의 mIgG를 세척 제거한 후, GPC3을 10 ㎍/mL로 고정화된 항체에 첨가하고, 고정화된 mIgG에 결합된 상태로 두었다. 세척 후, 이어서 제2 mIgG를 10 ㎍/mL로 첨가하고 결합을 모니터링하였다.
구체적으로는, (제1 mIgG1로서의) GC33-mIgG, GPC3A-37 mIgG 및 GPC3A-55 mIgG 단백질 각각을 비오티닐화하고, 5 ㎍/mL로 스트렙타비딘 바이오센서 상에 개별적으로 고정화하였다. 과량의 mIgG를 세척 제거한 후, 10 ㎍/mL의 GPC3을 고정화된 항체에 첨가하였으며, 이는 3개의 시험된 mIgG 각각에 대해 스파이크를 촉발하였는데, 그럼으로써 이는 GPC3 에피토프에 대한 GC33-mIgG, GPC3A-37 mIgG 및 GPC3A-55 mIgG 각각의 특이적 결합을 나타낸다. 과량의 GPC3 항원을 세척 제거한 후, 10 ㎍/mL의 제2 mIgG(제1 mIgG와는 상이함)를 첨가하고, 결합을 모니터링하였다. 에피토프 비닝의 선형 포맷과 유사하게, 상이한 제2 mIgG의 후속 첨가는 신호에서의 추가의 스파이크를 촉발하였으며(도 14), 이에 따라 이는 GC33-mIgG1, GPC3A-37 mIgG 및 GPC3A-55 mIgG 각각이 GPC3 상의 별개의 에피토프에 결합함을 나타낸다.
가용성 재조합 인간 GPC3 단백질에 대한 GPC3-L2K 결합
비오티닐화 재조합 GPC3(560)(bt-GPC3(560))에 대한 항-hGPC3 항-hGPC3 L2K 이중특이성 항체(클론 GPC3A-34, GPC3A-37, GPC3A-45, GPC3A-46, GPC3A-55, GPC3A-58로부터 유래된 GPC3A L2K)의 결합 특성을 제조자의 설명서에 따라 단회-사이클 속도론 방식으로 BIACORE™ X100 기기(GE Healthcare) 및 Biotin CAPture 키트(GE Healthcare, Cat# 28-9202-33)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명 기술에 의해 측정하였다. 본 검정에 사용된 모든 단백질은 사용 전에 HBS-E 완충액 중에 희석시켰다. 간략하게 말하면, 5 내지 10 ㎍/ml의 bt-GPC3(560)을 포획 시약으로 사전기능화된 센서 칩 상에 고정화하고, 유세포 상에 주입하였다. 고정화된 항원에 대한 L2K 이중특이성 항체의 친화도를, 30 μl/min의 유량으로 90초 회합 단계 후에 90초 해리 단계를 동반하면서, 0.3 내지 5 mg/ml의 다양한 이중특이성 항체의 주입에 의해 측정하였다. 매 실시마다 종료 시점에서, 센서 칩의 표면을 Biotin CAPture 키트 내에 제공된 시약을 사용하여 재생시켰다. 1:1 결합 모델(BIACORE™ X-100 평가 소프트웨어, 도 15a 및 도 15b)을 사용하여 비선형 회귀 분석에 의해 결합 상수를 결정하였다. 이어서, 각각의 L2K 클론에 대해 회합 결합 속도(association-on-rate)-kon, 친화도 상수-ka, 해리 상수-Kd, 및 평형 해리 상수-Kd를 계산하였다(표 14).
[표 14]
Figure pct00024
HepG2(GPC3-양성) 세포에 대한 결합
HepG2 세포를 용량 의존성으로 항-hGPC3 mIgG1 또는 BsAb 결합에 대해 시험한다. 간략하게 말하면, HepG2 세포를 얼음 상에서 1시간 동안 10, 3.3, 1.1, 0.37, 0.12, 0.041, 0.014 또는 0 ㎍/ml로 항-hGPC3 mIgG1 또는 BsAb와 함께 인큐베이션하였다. PBS 완충액으로 1 라운드의 짧은 세척 후, 2차 항체 APC-표지 항-His 태그 항체를 사용하여 BsAb를 검출한다. PE-표지 항-마우스 2차 항체를 사용하여 mIgG1 항체를 검출한다. 항-GPC3 mIgG1 또는 BsAb를 용량 의존성 곡선(MFI vs. BsAb 농도)의 EC50에 의해 HepG2 세포에 대한 그들의 친화도에 대해 평가한다. 더욱이, 겉보기 Kd는 EC50 값에 기초하여 결정된다. 클론 GC33 mIgG1에 대한 본 발명의 mIgG1 클론의 EC50 또는 겉보기 Kd 비를 계산한다. 클론 GC33 BsAb에 대한 본 발명의 BsAb 클론의 EC50 또는 겉보기 Kd 비를 또한 계산한다.
실시예 6. 항-GPC3 키메라 항원 수용체의 작제 및 특성화
항-GPC3 CAR을 렌티바이러스 CAR 발현 벡터를 사용하여 작제하였다. 항-GPC3 클론(GPC3A-34, GPC3A-37, GPC3A-45, GPC3A-46, GPC3A-55, GPC3A-58 및 GPC3B-87; 본 명세서에서 "GPC3A-CAR" 또는 "GPC3B-CAR"로 지칭됨)으로부터 유래된 scFv 각각을 CAR 발현 벡터 상에 그래프팅하였다. GC33으로부터 유래된 scFv를 또한 사용하여 GC33 CAR을 작제하였다. 각각의 CAR 작제물은 CD28의 세포내 신호전달 도메인 및 CD3ζ의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. GPC3A-34, GPC3A-37, GPC3A-45, GPC3A-46, GPC3A-55, 및 GPC3A-58 항체 클론으로부터 유래된 예시적인 CAR은 각각 서열 번호 491 및 516 내지 521의 아미노산 서열을 포함한다.
인간 1차 T-세포를 1일 동안 인터류킨-7 및 인터류킨-15의 존재 하에서의 CD3/CD28 비드(DYNABEADS®, Invitrogen)를 사용한 자극에 의해 활성화하였다. 농축된 렌티바이러스를 6의 MOI로 레트로넥틴(Takara)-코팅된 6웰 플레이트 내에서 72시간 동안 T-세포에 적용하였다. 형질도입 효율이 표 15에 나타나 있다.
[표 15]
Figure pct00025
형질도입된 CAR T 세포(GPC3A, GPC3B 또는 GC33 CAR T 세포)의 기능적 평가를 LDH 세포독성 검정을 사용하여 수행하였다. CAR T 세포와 표적 세포(HepG2, HepG2-GPC3-KO, SK-Hep1, 또는 SK-Hep1-GPC3)를 2:1의 이펙터 대 표적 비로 혼합하였으며, 여기서는 시험 웰당 100,000개의 표적 세포를 시딩(seeding)하고, 200,000개의 CAR T 세포로 처리하였다(감염된 CAR T 세포는 67% CAR-양성인 것으로 정규화됨). 하룻밤 인큐베이션 후에 LDH 세포독성 검정을 수행하였다.
7개의 GPC3A 또는 GPC3B CAR의 패널뿐만 아니라 GC33 CAR을 T 세포 내로 형질도입시키고, 표적 세포주 HepG2, HepG2-GPC3-KO, SK-Hep1, 및 SK-Hep1-GPC3에 대해 시험하였다. CAR 작제물에 의해 형질도입된 T 세포, GPC3A-CAR-37, GPC3A-CAR-45, GPC3A-CAR-46, GPC3A-CAR-55, GPC3A-CAR-58, GPC3B-CAR-87은 GPC3 양성 세포주, 예컨대 HepG2 및 SK-Hep1-GPC3을 특이적으로 사멸시켰다(도 16). 그러나, GPC3-음성 세포, 예컨대 야생형 SK-Hep1 또는 HepG2-GPC3-KO는 동일한 CAR T 세포에 의해 불량하게 인식되었다. 이들 LDH 세포독성 실험에서, GPC3A-CAR-37, GPC3A-CAR-55, 및 GPC3A-CAR-58 CAR을 포함하는 CAR T는 GPC3-양성 표적 세포를 사멸시키는 데 있어서 높은 효율을 나타내었지만 GPC3 음성 세포의 낮은 비특이적 사멸을 나타내었다(도 16).
LDH 세포독성 검정의 두 번째 배치(batch)에서는, CAR T 세포와 표적 세포(HepG2, HepG2-GPC3-KO, SK-Hep1, SK-Hep1-GPC3, JHH-5, A498 또는 PANC-1)를 2:1의 이펙터 대 표적 비로 혼합하였으며, 여기서는 시험 웰당 100,000개의 세포를 시딩하고, 200,000개의 항-GPC3 CAR 양성 T 세포로 처리하였다(감염된 CAR T 세포는 CAR에 대해 37.1% 양성인 것으로 정규화됨). CAR T 세포의 형질도입 효율이 표 16에 나타나 있다. 하룻밤 인큐베이션 후에 LDH 검정을 수행하였다.
[표 16]
Figure pct00026
도 17a 및 도 17b에 나타낸 바와 같이, CAR 작제물에 의해 형질도입된 T 세포, GPC3A-CAR-37, GPC3A-CAR-45, GPC3A-CAR-46, GPC3A-CAR-55, 및 GPC3B-CAR-87은 GPC3 양성 세포주, HepG2, SK-Hep1-GPC3, 및 JHH-5를 특이적으로 사멸시켰다. 그러나, GPC-음성 표적 세포, 예컨대 A-498, PANC-1, 야생형 SK-Hep1 세포 및 HepG2-GPC3-KO는 동일한 CAR T 세포에 의해 불량하게 인식되었다(도 16a 및 도 16b). 이들 실험은 GPC3 음성 세포에 대한 유의한 영향 없이 GPC3 발현 종양 세포를 특이적으로 표적화함에 있어서 항-GPC3 GPC3A 또는 GPC3B CAR T를 사용하는 데 있어서의 치료적 이득을 입증한다.
실시예 7. 항-AFP caTCR-1 및 항-CD3/항-GPC3 이중특이성 항체에 의해 형질도입된 T 세포의 작제 및 특성화
1차 T 세포를 항-AFP caTCR(서열 번호 522 및 523) 또는 항-AFP caTCR + 항-GPC3/항-CD3 BsAb(서열 번호 511)를 인코딩하는 렌티바이러스에 의해 형질도입시켰다. caTCR-양성 세포의 백분율의 측정치를 결정하여 형질도입 효율을 평가하였다. 항-AFP caTCR은 EF1-알파 프로모터(서열 번호 527)의 제어 하에 있었고, 항-GPC3/항-CD3 BsAb는 6개의 NFAT 반응 요소(서열 번호 524)를 포함하는 NFAT-유래 프로모터(서열 번호 526) 및 최소 TA 프로모터(서열 번호 525)의 제어 하에 있었다. T-세포를 모의 T-세포와 혼합함으로써 지시된 수용체 양성 백분율로 매칭시켰다. 2개의 세포주, HEPG2(AFP+/GPC3+) 및 HepG2-GPC3-KO(AFP+/GPC3-)를 2.5:1의 이펙터 대 표적 비로 사용하였다. 16시간 인큐베이션 후에, Cytox 96 비방사성 세포독성 검정(Promega)을 사용하여 특이적 T-세포 용해를 측정하였다.
시험관내 사멸 데이터는 항-AFP caTCR + 항-GPC3/항-CD3 BsAb에 의해 형질도입된 T-세포에서의 항-GPC3/항-CD3 BsAb의 발현이, T-세포 용량 범위 전체에 걸쳐, GPC3-의존적 방식으로 단지 항-AFP caTCR에 의해서만 형질도입된 T 세포와 대비하여 형질도입된 T-세포의 효력을 증가시켰음을 보여준다(도 18). 세포독성 효력의 증가를 입증한 반응은 또한 방출된 사이토카인(IFNγ, TNFα, 및 IL-2)의 양의 증가를 보여주었다(도 19). 따라서, 항-GPC3/항-CD3 BsAb의 유도된 발현은 T-세포의 효능 및 사이토카인 생성을 증가시켰다.
항-AFP caTCR T-세포 독성 이외에, 항원-유도 항-GPC3/항-CD3 BsAb의 세포독성을 직접 측정하기 위하여, 본 발명자들은 BsAb 투과성 막을 갖는 트랜스웰을 사용하였다. 2.5x105개의 SK-HEP1-GPC3(GPC3+) 또는 SK-HEP1(GPC3-) 종양 세포와 4x106개의 수용체-음성 "모의" T-세포를 하부 챔버 내에 함께 시딩하였다. 2.5x105개의 항-AFP caTCR 형질감염된 T-세포를 2.5x105개의 상응하는 표적 세포 SK-HEP1-MG(AFP+) 또는 SK-HEP1(AFP-)과 함께 상부 챔버 내에 함께 시딩하였다. 항-AFP caTCR + 항-GPC3/항-CD3 BsAb T-세포를 AFP 양성(SK-Hep1-MG) 종양 세포로 자극하였을 때, 분비된 항-GPC3/항-CD3 BsAb를 트랜스웰 막에 통과시키고 GPC3-양성 SK-Hep1-GPC3 종양 세포의 용해를 자극할 수 있었다(도 20). 이들 결과는 항-AFP caTCR + 항-GPC3/항-CD3 BsAb T-세포가 caTCR 수용체 결합에 반응하여 특이적 완전 기능성 항-GPC3/항-CD3 BsAb를 분비할 수 있었으며, 그러한 BsAb의 치료적 효과는 caTCR 요법에 상가적 방식으로 사용될 수 있음을 입증한다.
실시예 8. 항-AFP caTCR-1 및 항-GPC3 키메라 자극성 수용체에 의해 형질도입된 T 세포의 작제 및 특성화
항-AFP 결합 모이어티(서열 번호 528 및 529)를 인코딩하는 핵산 단편을 사용하여 caTCR-1 작제물(caTCR-1-0 또는 caTCR-1-TM5)을 생성하였다. 항-GPC3 결합 모이어티(서열 번호 309 및 360)를 인코딩하는 핵산 단편을 사용하여 CD28 막관통 및 세포내 신호전달 서열(서열 번호 530)을 포함하는 CSR(즉, CSR1)을 생성하였다.
시험관내 사멸
HEPG2 세포(AFP 및 GPC3을 발현하는 인간 간 암 세포) 및 HEPG2-GPC3-KO 세포를 T-세포 자극을 위한 표적 세포로서 2.5:1의 이펙터 대 표적 비로 사용하였다. 16시간 인큐베이션 후에, Cytox 96 비방사성 세포독성 검정(Promega)을 사용하여 특이적 T-세포 용해를 측정하였다.
항-AFP-caTCR-1-0(서열 번호 532, 533) 또는 항-AFP-caTCR-1-TM5(서열 번호 534, 535) 중 어느 하나와 함께 항-GPC3-CSR(서열 번호 531)의 발현은 시험관내에서 HEPG2 세포를 용해시킬 수 있는 완전히 기능적인 세포독성 T-세포를 생성하였다(도 21). 단지 caTCR-1-0만을 발현하는 T 세포는 caTCR-1(caTCR-1-0 또는 caTCR-1-TM5) 및 CSR 둘 모두를 발현하는 것들(약 55% 내지 약 65%)보다 훨씬 더 적은 특이적 사멸(약 15%)을 가졌다. 대조적으로, HEPG2-GPC3-KO 표적 세포를 사용할 때, 특이적 사멸은 caTCR 및 CSR 둘 모두를 발현하는 T 세포에 대해 약 10%로 감소되었는데(도 21), 이는 CSR과 그의 표적 리간드의 결합이 증가된 세포독성을 담당함을 나타낸다.
사이토카인 분비
시험관내 사멸 실험의 상층액 내로 방출된 사이토카인의 농도를 Bio-plex Pro 인간 사이토카인 8-plex 키트(BioRad)를 사용하여 Bioplex200(Luminex)으로 측정하였다. CSR-양성 및 caTCR-양성 T-세포는 caTCR 표적 항원 및 CSR 표적 리간드 둘 모두를 발현하는 HEPG2 표적 세포에 대해 ca-TCR-1-0을 단독으로 발현하는 T-세포보다 더 많은 세포독성 사이토카인을 방출하였다(도 22). 대조적으로, CSR 표적 리간드가 결여되어 있는 HEPG2-GPC3-KO 표적 세포에 대해서는 ca-TCR-1-0을 단독으로 발현하거나 caTCR 및 CSR 둘 모두를 발현하는 T 세포들 사이에 차이가 거의 또는 전혀 없었다(도 22).
세포내 사이토카인 발현
분비 억제제 브레펠딘 A(BFA)의 존재 하에서 T-세포를 표적 세포(HEPG2)로 1:2의 E:T 비로 4시간 동안 자극하였다. T-세포를 투과화시키고 사이토카인 특이적 항체를 사용하여, 종양 자극에 반응하여 발현되는 사이토카인을 검출하였다. 유세포측정을 사용하여 사이토카인-양성 세포의 백분율을 결정하였다. CSR-양성 및 caTCR-양성 T-세포는 ca-TCR-1-0을 단독으로 발현하는 T-세포보다 더 많은 세포내 사이토카인을 발현하였다(표 17).
[표 17]
Figure pct00027
종합하면, 결과는 CSR의 첨가가, 상이한 caTCR 표적 항원 및 CSR 표적 리간드를 갖는 caTCR + CSR T-세포의 감수성 및 반응성을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 이들 CSR-caTCR 이중 양성 T 세포 내에서 발현되고 그로부터 방출된 사이토카인의 증가된 양은 caTCR-1 및 CSR 둘 모두의 공동자극이 T-세포의 세포독성능(cytotoxic potential)을 상승시킨다는 추가의 증거를 제공한다.
탈과립
T 세포를 형광-접합된 항-CD107a와 혼합하고, 세포내이입 억제제 모넨신의 존재 하에서 HEPG2 표적 세포를 1:2의 E:T 비로 사용하여 4시간 동안 자극하였다. caTCR T-세포 상에의 CSR의 결합은 T-세포 탈과립을 증가시켰는데, 이는 CSR이 치료적 T-세포를 의도된 종양 세포에 대해 더 반응성이 되게 함을 추가로 입증한다(도 23).
증식
T 세포를 세포내 염료 CFSE로 표지하고, 염료 희석 및 지정된 날에 남아 있는 CFSE-양성 세포의 수를 측정하였다.
각각의 T-세포들을 하룻밤 혈청 기아상태에 두고, CellTrace CFSE(Thermo Fisher C34554)를 사용하여 CFSE로 표지하였다. 100,000개의 T-세포를 2:1의 E:T 비로 인큐베이션하고, 유세포측정을 사용하여, 지정된 날에 T-세포가 분열됨에 따라 CFSE 염료의 연속 희석을 관찰하였다. T-세포의 총수를 FAC에 의해 계수하였다.
CFSE 희석은 CSR 자극에 의해 증가하였는데, 이는 이들 T-세포가 더 높은 증식능을 가졌음을 나타낸다(도 24). 중요한 점으로, 세포수의 증가가 또한 있는데, 이는, 세포가 더 우수하게 증식할 뿐만 아니라 그들의 지속성이 또한 유지됨을 의미한다(표 18).
[표 18]
Figure pct00028
결과는, 리간드 양성 종양 세포로 CSR 및 caTCR 둘 모두를 동시에 자극할 수 있었고, CSR과 caTCR의 공동자극이 caTCR T-세포의 세포독성, 증식능, 및 지속성을 향상시켰음을 보여준다. 이들은 입양 전달을 사용하여 caTCR-기반 요법의 치료 잠재력을 증가시킬 모든 특성이다.
실시예 9: 항-AFP caTCR-1 및 항-GPC3 CSR에 의해 형질도입된 T 세포의 생체내 효능 연구
항-AFP caTCR-1 및 항-GPC3 CSR-1 둘 모두를 발현하는 T 세포(예를 들어, 작제물 정보에 대해서는 실시예 8 참조)의 생체내 항-종양 활성을 확립된 인간 AFP+/HLA-A2+ Hep G2 간암 이종이식편 모델에서 시험하였다. Hep G2 세포를 SCID-베이지 마우스의 우측 옆구리에 피하(s.c.) 이식하였다. 종양이 약 100 ㎣에 도달하였을 때, 마우스에 하기 중 하나를 종양내(i.t.) 주사하였다: (1) 5×106개의 형질도입되지 않은 공여자-매칭된(모의) T 세포, (2) 동일한 항-AFP 결합 모이어티(서열 번호 528 및 529)를 포함하는 항-AFP CAR을 발현하는 2×106개의 T 세포, 또는 (3) 항-AFP caTCR-1 및 항-GPC3 CSR-1 둘 모두를 발현하는 2×106개의 T 세포(n = 6 마리의 마우스/군). 마우스에서 T 세포 주입으로부터 생기는 건강 효과를 그들의 전반적인 외관, 체중, 및 유해 반응의 다른 임상 징후(저체온, 호흡 곤란, 및 뒷다리 마비/약화를 포함함)를 모니터링함으로써 평가하였다.
도 25에 나타낸 바와 같이, 항-AFP CAR T 세포 처리 및 항-AFP caTCR-1/항-GPC3 CSR-1 T 세포 처리 둘 모두는 현저하고 유의한(**** P < 0.0001; 던넷(Dunnett)의 다중 비교 검정) 종양 성장 억제로 이어졌다. 항-AFP CAR T 처리된 마우스 및 항-AFP caTCR-1/항-GPC3 CSR-1 T 세포-처리된 마우스 전부는 연구 지속기간 동안 정상 보행, 자세, 및 활동/반응성을 나타내었다. 게다가, 항-AFP CAR T 처리된 마우스 및 항-AFP caTCR-1/항-GPC3 CSR-1 T 세포-처리된 마우스는 연구 동안 체중 손실이 없었다. 전체적으로, 처리된 마우스에서 관찰가능한 비정상적인 파라미터의 부재는 항-AFP caTCR-1/항-GPC3 CSR-1 T 세포 요법의 안전성을 입증한다.
SEQUENCE LISTING <110> Eureka Therapeutics, Inc. Zhang, Pengbo Xu, Yiyang Morales, Javier Nakano, Yoko Liu, Hong Xiang, Jingyi Acker, Timothy <120> CONSTRUCTS SPECIFICALLY RECOGNIZING GLYPICAN 3 AND USES THEREOF <130> 75004-20012.40 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/490,586 <151> 2017-04-26 <160> 536 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GPC3A-034 HCDR1 <400> 1 Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GPC3A-035 HCDR1 <400> 2 Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GPC3A-037 HCDR1 <400> 3 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GPC3A-038 HCDR1 <400> 4 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr 1 5 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GPC3A-039 HCDR1 <400> 5 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Thr Leu 85 90 95 Asn Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser 100 105 110 Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Leu Glu Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 130 135 140 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr 145 150 155 160 Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 165 170 175 Leu Glu Trp Val Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr 180 185 190 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys 195 200 205 Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 210 215 220 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Ser Tyr Leu Asn His Gly Asp Tyr Trp 225 230 235 240 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile Glu Val 245 250 255 Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile 260 265 270 Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly 275 280 285 Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala 290 295 300 Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg 305 310 315 320 Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro 325 330 335 Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro 340 345 350 Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 355 360 <210> 532 <211> 288 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-AFP158/HLA-A*02:01-caTCR-1-0 delta <400> 532 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Met Ser Gly Gly Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ile Asp Lys Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu His Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Val Ser Leu Val Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 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15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Glu Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Thr Gly 85 90 95 Ser Arg Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser Pro Ile Lys Thr Asp Val Ile Thr 210 215 220 Met Asp Pro Lys 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Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Glu Val Lys Thr 210 215 220 Asp Ser Thr Asp His Val Lys Pro Lys Glu Thr Glu Asn Thr Lys Gln 225 230 235 240 Pro Ser Lys Ser Cys His Lys Pro Lys Ala Ile Val His Thr Glu Lys 245 250 255 Val Asn Met Met Ser Leu Thr Val Leu Gly Leu Arg Val Leu Phe Ala 260 265 270 Lys Thr Val Ala Val Asn Phe Leu Leu Thr Ala Lys Leu Phe Phe Leu 275 280 285 <210> 535 <211> 283 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-AFP158/HLA-A*02:01-caTCR-1-TM5 gamma <400> 535 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val 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235 240 Leu Gln Leu Thr Asn Thr Ser Ala Tyr Leu Val Tyr Leu Leu Leu Leu 245 250 255 Leu Lys Ser Val Val Tyr Phe Val Ile Val Thr Cys Cys Leu Leu Arg 260 265 270 Arg Thr Ala Phe Cys Cys Asn Gly Glu Lys Ser 275 280 <210> 536 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GPC33 fragment <400> 536 Leu Ala Glu Leu Ala Tyr Asp Leu Asp Val Asp Asp Ala Pro Gly Asn 1 5 10 15 Ser Gln Gln Ala Thr Pro Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe His Asn 20 25 30 Leu Gly Asn Val His Ser Pro Leu Lys Leu Leu 35 40

Claims (40)

  1. 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티를 포함하는, 단리된 항-글리피칸 3(GPC3) 작제물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 모이어티는 높은 결합 친화도로 세포 표면-결합된 GPC3을 특이적으로 인식하고, 낮은 결합 친화도로 가용성 GPC3에 결합하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 항-GPC3 작제물과 상기 세포 표면-결합된 GPC3 사이의 경쟁적 결합에 대한 가용성 GPC3의 IC50은 약 1 ㎍/ml 내지 약 100 ㎍/ml인, 단리된 항-GPC3 작제물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 모이어티는 서열 번호 460 내지 464 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 인간 GPC3 내의 에피토프를 특이적으로 인식하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 모이어티는 헤파린 설페이트 측쇄가 결여된 GPC3의 C-말단 단편 내의 에피토프를 특이적으로 인식하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 모이어티는 GC33과 경쟁적으로, 동일한 또는 실질적으로 동일한 GPC3 에피토프에 특이적으로 결합하지 않는, 단리된 항-GPC3 작제물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GPC3은 암 세포의 표면 상에서 발현되는, 단리된 항-GPC3 작제물.
  8. GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티를 포함하는 단리된 항-GPC3 작제물로서,
    상기 항체 모이어티는
    (a) i) 서열 번호 1 내지 31 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역(HC-CDR) 1, 또는 최대 약 5개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 52 내지 82 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 103 내지 133 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및
    ii) 서열 번호 154 내지 184 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역(LC-CDR) 1, 또는 최대 약 5개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 205 내지 235 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 256 내지 286 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하거나; 또는
    (b) i) 서열 번호 32 내지 51 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR1, 또는 최대 약 5개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 83 내지 102 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR2, 또는 최대 약 5개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 134 내지 153 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 HC-CDR3, 또는 최대 약 5개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VH; 및
    ii) 서열 번호 185 내지 204 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR1, 또는 최대 약 5개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 서열 번호 236 내지 255 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR2, 또는 최대 약 3개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체, 및 서열 번호 287 내지 306 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 LC-CDR3, 또는 최대 약 5개의 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체를 포함하는 VL을 포함하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항체 모이어티는
    (a) i) 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 또는 서열 번호 307 내지 337 중 어느 하나와 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 및 ii) 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 또는 서열 번호 358 내지 388 중 어느 하나와 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 또는
    (b) i) 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 또는 서열 번호 338 내지 357 중 어느 하나와 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체; 및 ii) 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 VL, 또는 서열 번호 389 내지 408 중 어느 하나와 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 단리된 항-GPC3 작제물과 경쟁적으로 GPC3에 특이적으로 결합하는 항체 모이어티를 포함하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티는 전장(full-length) 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 단일쇄 Fv(scFv)인, 단리된 항-GPC3 작제물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 다중특이성인, 단리된 항-GPC3 작제물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GPC3을 특이적으로 인식하는 항체 모이어티는, 선택적으로 링커를 통해, Fc 단편에 융합되는, 단리된 항-GPC3 작제물.
  14. 제13항에 있어서, 펩티드 링커에 의해 연결된 2개의 scFv를 포함하는 탠덤(tandem) scFv인, 단리된 항-GPC3 작제물.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 제2 항원을 특이적으로 인식하는 제2 항체 모이어티를 추가로 포함하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 제2 항원은 T 세포의 표면 상의 항원인, 단리된 항-GPC3 작제물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 제2 항원은 CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, CD40L, 및 HVEM으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단리된 항-GPC3 작제물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 제2 항원은 CD3ε인, 단리된 항-GPC3 작제물.
  19. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항원 수용체(CAR)이며, 상기 CAR은
    (a) 상기 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인;
    (b) 막관통 도메인; 및
    (c) 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ 세포내 신호전달 서열 및 CD28 세포내 신호전달 서열을 포함하는, 단리된 항-GPC3 작제물.
  21. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항체-T 세포 수용체(TCR) 작제물(caTCR)이며, 상기 caTCR은
    (a) 상기 항체 모이어티를 포함하는 세포외 도메인; 및
    (b) 제1 T 세포 수용체 막관통 도메인(TCR-TM)을 포함하는 제1 TCR 도메인(TCRD) 및 제2 TCR-TM을 포함하는 제2 TCRD를 포함하는 T 세포 수용체 모듈(TCRM)을 포함하며, 상기 TCRM은 적어도 하나의 TCR-회합 신호전달 분자의 동원을 촉진시키는, 단리된 항-GPC3 작제물.
  22. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 모이어티 및 이펙터 분자를 포함하는 면역접합체인, 단리된 항-GPC3 작제물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 이펙터 분자는 약물, 독소, 방사성 동위원소, 단백질, 펩티드, 및 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료제인, 단리된 항-GPC3 작제물.
  24. 제22항에 있어서, 상기 이펙터 분자는 표지인, 단리된 항-GPC3 작제물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 단리된 항-GPC3 작제물의 폴리펩티드 성분을 인코딩하는, 단리된 핵산.
  26. 제25항의 단리된 핵산을 포함하는, 벡터.
  27. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 항-GPC3 작제물, 제25항의 단리된 핵산, 또는 제26항의 벡터를 포함하는, 단리된 숙주 세포.
  28. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항의 단리된 항-GPC3 작제물을 발현하는, 이펙터 세포.
  29. 제28항에 있어서, T 세포인, 이펙터 세포.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 항-GPC3 작제물의 발현은 상기 이펙터 세포의 활성화에 의해 유도되는, 이펙터 세포.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항체-T 세포 수용체(TCR) 작제물(caTCR)을 추가로 포함하는, 이펙터 세포.
  32. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 단리된 항-GPC3 작제물 또는 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항의 이펙터 세포, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  33. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 단리된 항-GPC3 작제물, 제25항의 단리된 핵산, 제26항의 벡터, 제27항의 단리된 숙주 세포, 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항의 이펙터 세포, 또는 제32항의 약제학적 조성물을 포함하는, 키트.
  34. 샘플에서 GPC3을 검출하는 방법으로서,
    상기 샘플을 제24항의 단리된 항-GPC3 작제물과 접촉시키는 단계, 및 상기 표지의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  35. GPC3-양성 질병을 가진 개체를 치료하는 방법으로서,
    제32항의 약제학적 조성물의 유효량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  36. GPC3-양성 질병을 가진 개체를 진단하는 방법으로서,
    a) 제24항의 단리된 항-GPC3 작제물의 유효량을 상기 개체에게 투여하는 단계; 및
    b) 상기 개체에서 상기 표지의 수준을 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 역치 수준을 초과하는 상기 표지의 수준이 상기 개체가 상기 GPC3-양성 질병을 가짐을 나타내는, 방법.
  37. GPC3-양성 질병을 가진 개체를 진단하는 방법으로서,
    a) 상기 개체로부터 유래된 샘플을 제24항의 단리된 항-GPC3 작제물과 접촉시키는 단계; 및
    b) 상기 샘플 내의 상기 단리된 항-GPC3 작제물과 결합된 세포의 수를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 단리된 항-GPC3 작제물과 결합된 세포의 수가 역치 수준을 초과하는 값이 상기 개체가 상기 GPC3-양성 질병을 가짐을 나타내는, 방법.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GPC3-양성 질병은 암인, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 암은 HCC, 흑색종, 폐 편평 세포 암종, 난소 암종, 난황낭 종양, 융모막암종, 신경아세포종, 간아세포종, 빌름스 종양, 고환 비정상피종성 생식 세포 종양, 위 암종, 및 지질육종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  40. 단리된 항-GPC3 작제물을 생성하는 방법으로서,
    (a) 상기 항-GPC3 작제물을 발현하기에 효과적인 조건 하에서 제25항의 단리된 핵산 또는 제26항의 벡터를 포함하는 숙주 세포, 또는 제27항의 단리된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 숙주 세포로부터 발현된 항-GPC3 작제물을 얻는 단계를 포함하는, 방법.
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